ES2668207T3

ES2668207T3 - Descubrimiento innovador de composiciones terapéuticas, de diagnóstico y de anticuerpos relacionadas con fragmentos de proteínas de metionil-ARNt sintetasas

Info

Publication number: ES2668207T3
Application number: ES11778207.8T
Authority: ES
Inventors: Leslie Ann Greene; Kyle P. Chiang; Fei Hong; Alain P. Vasserot; Wing-Sze Lo; Jeffry D. Watkins; John D. Mendlein; Cheryl L. Quinn
Original assignee: Pangu Biopharma Ltd; aTyr Pharma Inc
Current assignee: Pangu Biopharma Ltd; aTyr Pharma Inc
Priority date: 2010-05-03
Filing date: 2011-05-03
Publication date: 2018-05-17
Anticipated expiration: 2031-05-03
Also published as: US8981045B2; US20170058048A1; EP2566496A2; AU2011248230B2; WO2011140135A3; CA2797978A1; US9422538B2; JP6008841B2; EP2566496B1; US20150284705A1; WO2011140135A2; WO2011140135A9; AU2011248230A1; CA2797978C; CN103140233A; US20200140571A1; CN103140233B; JP2013532957A; US20130236440A1; EP2566496A4

Abstract

Una composición terapéutica, que comprende un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud y que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, 98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 137, en donde el polipéptido de AARS tiene al menos una actividad de señalización extracelular y una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en donde la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente el 95 % en proteínas y menos de aproximadamente UE de endotoxina/mg de proteína.

Description

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DESCRIPCION

Descubrimiento innovador de composiciones terapéuticas, de diagnóstico y de anticuerpos relacionadas con fragmentos de proteínas de metionil-ARNt sintetasas

Referencia a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad según 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.° 61/330.596 presentada el 3 de mayo de 2010 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.° 61/331.282 presentada el 4 de mayo de 2010.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a composiciones que comprenden fragmentos de proteínas de nueva identificación de aminoacil-ARNt sintetasas y otras proteínas, polinucleótidos que los codifican y complementos de los mismos, agentes relacionados y métodos de uso de los mismos en diagnóstico, descubrimiento de fármacos, investigación y aplicaciones terapéuticas.

Antecedentes

Durante más de cuatro décadas, se ha considerado a las aminoacil-ARNt sintetasas (AARS) proteínas constitutivas esenciales que catalizan la aminoacilación de moléculas de ARNt como parte de la decodificación de la información genética durante el proceso de traducción de proteínas. Las AARS se han estudiado exhaustivamente a este respecto, y muchas de sus secuencias de longitud completa se han clonado para análisis de secuencias y para proporcionar una fuente rica de experimentación bioquímica. Algunos fragmentos de AARS y otras proteínas, sin embargo, poseen actividades inesperadas no asociadas con la aminoacilación, incluyendo actividades de señalización extracelular que modulan rutas más allá de la traducción de proteínas. En general, estas actividades inesperadas no se han observado en el contexto de las secuencias de proteínas de longitud completa o parentales; en su lugar, se han observado después de la retirada o resección de fragmentos proteicos de AARS de sus secuencias parentales, o expresando y purificando suficientemente secuencias de AARS de fragmentos y después ensayando con respecto a nuevas actividades no relacionadas con sintetasa.

Se conocen varios fragmentos de MetRS de bases de datos en línea, por ejemplo los números de referencia UPI0000E00904, UPI0000E4C913 y A6MJU3 en la base de datos UniProt y el número de referencia AI368577 en la base de datos de EMBL.

Aunque las secuencias de longitud completa de AARS se han conocido durante algún tiempo, no se ha realizado un análisis experimental sistemático para dilucidar dichos fragmentos de proteínas AARS, o fragmentos proteicos de proteínas relacionadas o asociadas, o para evaluar el papel potencial de las proteínas de AARS de longitud completa para nuevas actividades biológicas fuera del contexto de la síntesis de aminoácidos. En partes de la presente memoria descriptiva, dichos fragmentos proteicos de AARS, dominios de AARS o variantes de corte y empalme alternativo de AARS se denominan en el presente documento "resectinas". En su contexto más amplio, el término "resectina" se refiere a una parte de una proteína que se ha escindido o restringido (bien por medio de proteólisis, corte y empalme alternativo, mutagénesis o ingeniería genética recombinante) a partir del contexto de su secuencia de proteínas parental o de longitud completa nativa, que con frecuencia enmascara de otro modo sus nuevas actividades biológicas. De forma similar, no se ha realizado ningún análisis experimental sistemático para explorar el uso de dichas resectinas como agentes bioterapéuticos, agentes de diagnóstico o dianas farmacológicas en el tratamiento de diversas afecciones médicas, o su asociación potencial a enfermedades humanas. Como genes constitutivos esenciales con una función conocida en los mamíferos que es crítica para la vida, las AARS no se han considerado dianas farmacológicas en mamíferos, ni se han analizado por secuenciación genómica convencional, bioinformática o esfuerzos similares para identificar resectinas que tengan actividades no sintetasa. De forma similar la dirección de los esfuerzos de investigación bioquímica convencionales se ha alejado de la caracterización de las propiedades biológicas de resectinas AARS y su relevancia terapéutica y de diagnóstico potencial, principalmente debido al papel previamente entendido de sus AARS parentales de longitud completa correspondientes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la estructura de dominio de metionil aminoacil ARNt sintetasa superpuesta con las posiciones relativas y tamaños de los polipéptidos de MetRS N-terminales identificados mostrados esquemáticamente. La Figura 1A representa fragmentos identificados a partir de análisis de espectrometría de masas, la Figura 1B representa los fragmentos identificados a partir de secuenciación profunda de transcriptomas, y la Figura 1C representa fragmentos identificados a partir de análisis bioinformáticos.

La Figura 2 muestra la estructura de dominio de la metionil aminoacil ARNt sintetasa superpuesta con las posiciones relativas y tamaños de los polipéptidos de MetRS C-terminales mostrados esquemáticamente. La Figura 2A representa fragmentos identificados a partir de análisis de espectrometría de masas. La Figura 2B representa los fragmentos identificados a partir de secuenciación profunda de transcritomas y la Figura 2C

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representa fragmentos identificados a partir de análisis bioinformático.

Breve sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Las realizaciones de la presente divulgación se refieren en general al descubrimiento de fragmentos proteicos de metionil ARNt sintetasa (MetRS), que poseen actividades biológicas no canónicas, tales como actividades de señalización extracelular, y/u otras características de relevancia terapéutica y de diagnóstico. Las AARS son elementos universales y esenciales de la maquinaria de síntesis de proteínas hallada en todos los organismos, pero las AARS humanas y sus proteínas asociadas tienen variantes resecadas de origen natural, con potentes actividades de señalización celular que contribuyen al funcionamiento normal de seres humanos. Las actividades de estos fragmentos proteicos son distintas de las actividades de síntesis de proteínas habitualmente conocidas para AARS, y la presente divulgación incluye el descubrimiento y desarrollo de estas proteínas resecadas como nuevos agentes bioterapéuticos, nuevos reactivos de investigación de descubrimiento y como nuevos antígenos/dianas para biologías y agentes de diagnóstico dirigidos que pueden usarse para potencialmente tratar o diagnosticar una amplia diversidad de enfermedades humanas, tales como enfermedades o trastornos inflamatorios, hematológicos, neurodegenerativos, autoinmunitarios, hematopoyéticos, cardiovasculares y metabólicos.

El fragmento o los fragmentos proteicos de MetRS de la presente divulgación pueden por lo tanto denominarse "resectinas", o como alternativa "apendacrinas". Como se ha indicado anteriormente, el término "resectina" deriva del proceso de escindir o resecar un fragmento proteico de MetRS dado del contexto de su secuencia de MetRS parental de longitud completa, que normalmente enmascara sus actividades no canónicas. En ciertos casos, los fragmentos proteicos de MetRS y polinucleótidos de la presente invención se identificaron mediante la aparición de este proceso de resección, bien de origen natural (por ejemplo, proteolítico, variante de corte y empalme), inducido artificialmente o predicho. El término "apendacrina" deriva de una combinación de "añadir" (del latín-appendere) y "separar" o "distinguir" (del griego -crines), y también refleja la separación de uno o más dominios adjuntos de los fragmentos proteicos de MetRS de sus secuencias de MetRS de longitud completa o parentales correspondientes.

Aunque se ha mostrado previamente que algunos fragmentos de AARS tienen actividades no sintetasa, la expresión, el aislamiento, la purificación y la caracterización de dichos fragmentos para utilidad bioterapéutica, de descubrimiento o de diagnóstico está limitada y los expertos en la materia no apreciarían fácilmente que dichas actividades se asocien con cada miembro de la familia completa de AARS, o con fragmentos alternativos. Aquí, se utilizó el enfoque metódico para descubrir y verificar fragmentos proteicos de AARS para las 20 AARS mitocondriales y las 20 AARS citosólicas (y proteínas asociadas) para el descubrimiento bioterapéutico y utilidad de diagnóstico. Por ejemplo, algunos de los fragmentos proteicos de MetRS presentes y polinucleótidos que los codifican se identifican de muestras biológicas usando espectrometría de masas (Em), principalmente para identificar fragmentos proteolíticos, y se identificaron otros por técnicas de secuenciación profunda, principalmente para identificar variantes de corte y empalme. Otro fragmento u otros fragmentos proteicos de MetRS se identifican usando predicciones por ordenador de secuencias de aminoácidos, tales como comparando computacionalmente sintetasas de seres humanos y organismos inferiores junto con demarcaciones clave (por ejemplo, sitios de proteasa); este enfoque utilizó análisis de secuencias de la MetRS de longitud completa basándose en criterios específicos para distinguir fragmentos proteolíticos y dominios funcionales que poseen actividades biológicas no canónicas.

Las nuevas resectinas de las AARS son inesperadas, y su expresión diferencial también es inesperada. Se ven resecciones específicas en diferentes tratamientos (por ejemplo, de células cultivadas en medios con o sin suero), en diferentes estadios de crecimiento (por ejemplo, cerebro adulto frente a cerebro fetal) y para diferentes tipos tisulares (por ejemplo, páncreas frente a hígado). El patrón de expresión no es igual para todas las aminoacil ARNt sintetasas a pesar del hecho de que las funciones canónicas para todas las aminoacil ARNt sintetasas son necesarias en las mismas localizaciones celulares y en cantidades relativamente proporcionales. No se esperaría que los niveles de una actividad aminoacil ARNt sintetasa aumentaran sin un aumento en las cantidades de otras actividades de aminoacil ARNt sintetasa al mismo tiempo. Los datos de espectrometría de masas y secuenciación profunda indican que las resectinas de aminoacil ARNt sintetasa no tienen diversos niveles y aparecen en diferentes sitios y en diferentes estadios.

Además, los fragmentos proteicos de AARS pueden expresarse y purificarse hasta una pureza suficientemente alta para discernir sus propiedades biológicas. Previamente, los fragmentos no eran con frecuencia de suficiente pureza, plegamiento y estabilidad para permitir la caracterización biológica apropiada de actividades no sintetasa. Se usan ensayos basados en células, por ejemplo, junto con resectinas suficientemente puras, estables, solubles y plegadas para revelar sus actividades bioterapéuticas, de descubrimiento o de diagnóstico importantes.

En particular, las realizaciones de la presente divulgación se refieren a fragmentos proteicos de metionil ARNt sintetasas, agentes relacionados y composiciones de utilidad bioterapéutica, de descubrimiento o de diagnóstico, y métodos de uso de los mismos. Las composiciones de la presente divulgación son útiles en diversas aplicaciones de diagnóstico, de descubrimiento de fármacos y terapéuticas, como se describe en el presente documento.

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Preferentemente, las proteínas de MetRS y fragmentos se purifican y almacenan en condiciones adecuadas en la medida requerida para dichos usos bioterapéuticos, de descubrimiento o de diagnóstico.

Ciertas realizaciones incluyen composiciones que comprenden un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislado de al menos aproximadamente 50 a aproximadamente 100 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 137, y tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en el que la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas, y menos de aproximadamente 10 UE/mg de proteína endotoxina. En un aspecto, la composición es una composición terapéutica. En realizaciones específicas, la composición está sustancialmente sin suero. En algunas realizaciones el fragmento proteico de MetRS comprende una actividad no canónica. En algunas realizaciones, la actividad biológica no canónica se selecciona de modulación de señalización extracelular, modulación de

proliferación celular, modulación de diferenciación celular, modulación de la transcripción génica, modulación de la producción o actividad de citocinas, modulación de la actividad receptora de citocinas y modulación de la inflamación. En algunas realizaciones, el fragmento proteico de MetRS tiene una CE50 de menos de

aproximadamente 1 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 100 nM o aproximadamente 200 nM para una actividad biológica no canónica basada en células.

En ciertas realizaciones, el fragmento proteico de MetRS se fusiona con un polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de MetRS conserva sustancialmente una actividad no canónica del fragmento proteico de MetRS. En algunas realizaciones, la proteína de fusión MetRS suprime una actividad no canónica del fragmento proteico de MetRS. En algunas realizaciones, el polipéptido heterólogo se une al extremo N terminal del

fragmento proteico de MetRS. En algunas realizaciones, el polipéptido heterólogo se une al extremo C terminal del

fragmento proteico de MetRS. En un aspecto de cualquiera de estas realizaciones el polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en marcadores de purificación, marcadores epitópicos, secuencias de dirección, péptidos señal, secuencias de translocación de membrana y modificadores de PK.

En ciertas realizaciones, la composición comprende un fragmento proteico de MetRS a una concentración de al menos aproximadamente 10 mg/ml. En ciertas realizaciones, la composición comprende un fragmento proteico de MetRS que es al menos 90 % monodisperso. En ciertas realizaciones la composición comprende menos de aproximadamente 3 % de proteínas agregadas de alto peso molecular. En ciertas realizaciones la composición muestra menos del 3 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos aproximadamente 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 °C. En ciertas realizaciones la composición muestra menos de 3 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a temperatura ambiente.

Se describen en el presente documento diversos ensayos para medir dichas características de las resectinas y pueden usarse para definir aspectos de la invención. En ciertos aspectos, estas características serán preferibles para la utilidad bioterapéutica de los fragmentos proteicos de MetRS descritos en el presente documento.

Ciertas realizaciones incluyen composiciones que comprenden un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislado de al menos 50 aminoácidos que difieren de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 137 por sustitución, deleción y/o adición de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos, en el que el fragmento proteico alterado sustancialmente conserva una actividad no canónica de la proteína ninalterada, o tiene un fenotipo negativo dominante en relación con la actividad no canónica, en el que el fragmento proteico tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en el que la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas y menos de aproximadamente 10 UE/mg de proteínas de endotoxina. En realizaciones específicas, la composición está sustancialmente sin suero.

Otras realizaciones incluyen composiciones que comprenden un anticuerpo aislado que se une específicamente con un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislado como se expone en SEQ ID NO: 137, en el que la afinidad del anticuerpo por el fragmento proteico de MetRS es aproximadamente 10 por mayor que su afinidad por un polipéptido de MetRS de longitud completa correspondiente. Uno de los aspectos sorprendentes de la presente invención incluye ciertas resectinas que poseen "nuevas" superficies accesibles a anticuerpo u otros productos biológicos dirigidos, mientras que la MetRS de longitud completa "oculta" o cubre estas superficies con otras secuencias o dominios adyacentes. El proceso de resecado también puede crear mayor accesibilidad acuosa para revelar actividades biológicas previamente no identificadas. Algunas realizaciones incluyen composiciones, que comprenden un anticuerpo aislado que se une específicamente con un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislado como se expone en SEQ ID NO: 137, en el que el anticuerpo tiene una afinidad de al menos aproximadamente 10 nM por el fragmento proteico de MetRS, y una afinidad de al menos aproximadamente 100 nM por un polipéptido de MetRS de longitud completa correspondiente. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un epítopo localizado dentro de un punto de unión de corte y empalme único de polipéptido de MetRS como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 137, o con una secuencia de aminoácidos en dirección C-terminal de este sitio de corte y empalme. En ciertas realizaciones, el anticuerpo antagoniza la actividad no canónica del fragmento proteico de MetRS. Dichos antagonistas pueden unirse opcionalmente con la MetRS de longitud completa o parental correspondiente.

Otros aspectos se refieren a sistemas de bioensayo, que comprenden un fragmento proteico de metionil ARNt

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sintetasa (MetRS) sustancialmente puro de al menos 50 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 137 y un compañero de unión que se une al fragmento proteico de MetRS. En un aspecto, el compañero de unión se selecciona del grupo que consiste en una proteína de receptor de superficie celular, ácido nucleico, membrana lipídica, proteína reguladora celular, enzima y factor de transcripción. Opcionalmente, dicho receptor puede ser parte de una célula, preferentemente una célula relevante para la biología revelada de la resectina.

Ciertas realizaciones incluyen composiciones celulares, que comprenden un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislado de al menos 50 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 137, y una población modificada técnicamente de células en las que al menos una célula comprende un polinucleótido que codifica dicho fragmento proteico de AARS. En un aspecto, las células pueden crecer en un ambiente sin suero.

También se incluyen sistemas de detección, que comprenden un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) sustancialmente puro de al menos 50 o 100 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 137, una célula que comprende un receptor de superficie celular o una parte extracelular del mismo que se une al fragmento proteico, y una molécula de menos de aproximadamente 2.000 dalton, o un segundo polipéptido, que modula la unión o interacción entre el fragmento proteico de MetRS y el receptor extracelular.

Realizaciones particulares incluyen sistemas de diagnóstico, que comprenden un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) sustancialmente puro de al menos 50 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 137, y una célula que comprende un receptor de superficie celular o una parte extracelular del mismo que se une al fragmento proteico de MetRS, en el que el sistema o la célula comprende una molécula indicadora que permite la detección de un cambio en los niveles o actividad del receptor de superficie celular o parte extracelular del mismo.

Ciertas realizaciones incluyen dispositivos de crecimiento celular, que comprenden un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislado de al menos 50 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 137, una población modificada técnicamente de células en la que al menos una célula comprende un polinucleótido que codifica dicho fragmento proteico de MetRS, al menos aproximadamente 10 litros de medio celular sin suero y un recipiente estéril. En realizaciones específicas, las células utilizadas para cualquiera de los métodos o composiciones descritos en este documento pueden crecer en medios sin suero, opcionalmente con un antibiótico y un inductor.

Algunas realizaciones se refieren a agentes antisentido o de interferencia de ARN (ARNi), que comprenden una secuencia que se dirige contra un punto de unión de corte y empalme único de una variante de corte y empalme de MetRS como se expone en SEQ ID NO: 137.

También se incluyen composiciones terapéuticas, que comprenden un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislado de al menos 35 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 137, en el que el fragmento proteico se une específicamente con un compañero de unión y tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en el que la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas. En algunos aspectos, la composición puede tener menos de 10 UE de endotoxina/mg de proteína

También se incluyen composiciones que comprenden un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislado de al menos 50 aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % Idéntico a una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 137, en el que el fragmento proteico tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en el que la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas y menos de 10 UE de endotoxina/mg de proteína. En cualquiera de estas realizaciones, las composiciones pueden comprender un fragmento proteico de MetRS que es al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o aproximadamente 95 % monodisperso con respecto a su masa molecular aparente. En otro aspecto de cualquiera de estas realizaciones, las composiciones comprenden menos de aproximadamente 10 % (en proteínas), de proteínas agregadas de alto peso molecular, o menos de aproximadamente 5 % de proteínas agregadas de alto peso molecular, o menos de aproximadamente 4 % de proteínas agregadas de alto peso molecular, o menos de aproximadamente 3 % de proteínas agregadas de alto peso molecular, o menos de 2 % de proteínas agregadas de alto peso molecular, o menos de aproximadamente 1 % de proteínas agregadas de alto peso molecular.

En otro aspecto de cualquiera de estas realizaciones, las composiciones muestran menos de aproximadamente 10 % de agregación cuando se almacenan a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 °C, o menos de aproximadamente 5 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 °C, o menos de aproximadamente 3 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 °C, o menos de aproximadamente 2 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 °C, o

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menos de aproximadamente 1 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 °C.

Ciertas realizaciones incluyen composiciones que comprenden un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) sustancialmente puro de al menos 50 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 137, y al menos un resto unido de forma covalente o no covalente con el mismo. En algunas realizaciones, el resto es un marcador detectable. En algunas realizaciones, el resto es un polímero soluble en agua. En algunas realizaciones, el resto es PEG. En un aspecto de cualquiera de estas realizaciones, el resto se une al extremo N terminal del fragmento proteico. En un aspecto de cualquiera de estas realizaciones, el resto se une al extremo C terminal del fragmento proteico.

Las realizaciones particulares incluyen composiciones, que comprenden un sustrato sólido unido a un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislado de al menos 50 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 137, o un fragmento biológicamente activo o variante del mismo, en el que el fragmento proteico tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas.

También se incluyen composiciones, que comprenden un agente de unión que se une específicamente con un fragmento proteico de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislado como se expone en SEQ ID NO: 137, en el que el agente de unión tiene una afinidad de al menos aproximadamente 1 nM por el fragmento proteico. En un aspecto, el agente de unión se une a un epítopo localizado dentro de un punto de unión de corte y empalme único de polipéptido de MetRS como se expone en SEQ ID NO: 137, o con una secuencia de aminoácidos en dirección C- terminal de este sitio de corte y empalme. En algunas realizaciones, el agente de unión antagoniza una actividad no canónica del polipéptido de MetRS.

Ciertas realizaciones incluyen polipéptidos de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislados, que comprenden una secuencia de aminoácidos de un fragmento proteico de MetRS como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de MetRS como se describe en el presente documento, o una variante o fragmento del mismo. Ciertos polipéptidos de MetRS comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de referencia de MetRS como se desvela en SEQ ID NO: 137. Ciertos polipéptidos de MetRS consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de referencia de MetRS como se desvela en SEQ ID NO: 137. En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende una actividad biológica no canónica. En realizaciones específicas, la actividad biológica no canónica se selecciona de modulación de la señalización celular (por ejemplo, señalización extracelular), modulación de la proliferación celular, modulación de la migración celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de la apoptosis o muerte celular, modulación de la angiogénesis, modulación de la unión celular, modulación del metabolismo celular, modulación de la captación celular, modulación de la transcripción génica, o secreción, modulación de la producción o actividad de citocinas, modulación de la actividad receptora de citocinas y modulación de la inflamación.

Otros aspectos incluyen anticuerpos y otros agentes de unión que muestran especificidad de unión por un polipéptido de MetRS aislado como se describe en el presente documento, un compañero de unión del polipéptido de MetRS, o el complejo de ambos. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo o agente de unión por el polipéptido de MetRS es aproximadamente 10 veces más fuerte que su afinidad por un polipéptido de MetRS de longitud completa correspondiente. En realizaciones específicas, el agente de unión se selecciona de un péptido, peptidomimético, una adnectina, un aptámero, y una molécula pequeña. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o agente de unión antagoniza una actividad no canónica del polipéptido MetRS. En otras realizaciones, el anticuerpo o agente de unión es agonista de una actividad no canónica del polipéptido de MetRS.

Ciertas realizaciones incluyen polinucleótidos de metionil ARNt sintetasa (MetRS) aislados, que comprenden una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de MetRS como se describe en el presente documento, una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento proteico de MetRS como se describe en el presente documento, o una variante, un fragmento o un complemento de los mismos. Ciertos polinucleótidos de MetRS comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a un polinucleótido de referencia de MetRS, o un complemento del mismo, como se desvela en SEQ ID NO: 137. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene codones optimizados para expresión bacteriana.

Polinucleótidos de MetRS específicos consisten esencialmente en una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a un polinucleótido de referencia de MetRS, o un complemento del mismo, como se desvela en SEQ ID NO: 137. Otros polinucleótidos de MetRS comprenden o consisten esencialmente en una secuencia de nucleótidos que hibrida específicamente con un polinucleótido de referencia de MetRS, como se desvela en SEQ ID NO: 137. En ciertas realizaciones, el polinucleótido se selecciona de un cebador, una sonda y un oligonucleótido antisentido. En las realizaciones específicas, el cebador, la sonda o el oligonucleótido antisentido se dirige a un punto de unión de corte y empalme específico o único y/o la secuencia 3' de este sitio de corte y empalme dentro de un polinucleótido de MetRS.

Ciertas realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de un fragmento proteico de

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MetRS en una muestra, que comprenden poner en contacto la muestra con uno o más agentes de unión que se unen específicamente con un fragmento proteico de MetRS como se describe en el presente documento, detectar la presencia o ausencia del agente de unión y determinar de este modo la presencia o los niveles del fragmento proteico de MetRS. Otras realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de un fragmento proteico de MetRS en una muestra, que comprenden analizar la muestra con un detector que es capaz de identificar específicamente un fragmento proteico como se describe en el presente documento, y determinar de este modo la presencia o los niveles del fragmento proteico de MetRS. En realizaciones específicas, el detector es un espectrómetro de masas (EM), un citómetro de flujo, un dispositivo de captura de imágenes de proteínas, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) o una micromatriz de proteínas. Ciertas realizaciones comprenden comparar la presencia o los niveles del fragmento proteico de MetRS con una muestra de control o un valor predeterminado. Ciertas realizaciones comprenden caracterizar el estado de la muestra para distinguirla del control. En realizaciones específicas, la muestra y el control comprenden una célula o un tejido, y el método comprende distinguir entre células o tejidos de diferentes especies, células de diferentes tejidos u órganos, células en diferentes estados del desarrollo celular, células en diferentes estados de diferenciación celular, células en diferentes estados fisiológicos o células sanas y enfermas. Por ejemplo, las resectinas seleccionadas pueden ser más abundantes en condiciones tales como tensión o lesión.

Ciertas realizaciones incluyen métodos de descubrimiento de, y composiciones relacionadas para, identificar un compuesto que se une específicamente con un polipéptido de metionil ARNt sintetasa (MetRS) como se describe en el presente documento, o uno o más de sus compañeros de unión celular, que comprenden a) combinar el polipéptido de MetRS o su compañero de unión celular o ambos con al menos un compuesto de ensayo en condiciones adecuadas, y b) detectar la unión del polipéptido de MetRS o su compañero de unión celular o ambos con el compuesto de ensayo, identificando de este modo un compuesto que se una específicamente con el polipéptido de MetRS o su compañero de unión celular o ambos. En ciertas realizaciones, el compuesto de ensayo es un polipéptido o péptido, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo, un peptidomimético, o una molécula pequeña. En ciertas realizaciones, el compuesto de ensayo es agonista de una actividad biológica no canónica del polipéptido de MetRS o su compañero de unión celular. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo antagoniza una actividad biológica no canónica del polipéptido de MetRS o su compañero de unión celular. Ciertas realizaciones incluyen un compuesto identificado por el método anterior, tal como un agonista (por ejemplo, molécula pequeña, péptido).

Ciertas realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de una secuencia polinucleotídica de una variante de corte y empalme de MetRS en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con uno o más oligonucleótidos que hibridan específicamente con un polinucleótido de MetRS como se describe en el presente documento, detectar la presencia o ausencia de los oligonucleótidos en la muestra y determinar de este modo la presencia o los niveles de la secuencia polinucleotídica de la variante de corte y empalme de MetRS. Otras realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de una secuencia polinucleotídica de una variante de corte y empalme de MetRS en una muestra, que comprenden poner en contacto la muestra con al menos dos oligonucleótidos que amplifican específicamente un polinucleótido de MetRS como se describe en el presente documento, realizar una reacción de amplificación, detectar la presencia o ausencia de un producto amplificado, y determinar de este modo la presencia o los niveles de la secuencia polinucleotídica de la variante de corte y empalme de MetRS. En realizaciones específicas, el oligonucleótido o los oligonucleótidos se hibridan específicamente con o amplifican específicamente un punto de unión de corte y empalme que es único de la variante de corte y empalme de MetRS. Ciertas realizaciones incluyen comparar la presencia o los niveles del fragmento de proteína de MetRS o variante de corte y empalme con una muestra de control o un valor predeterminado. Ciertas realizaciones incluyen caracterizar el estado de la muestra para distinguirlo del control. En realizaciones específicas, la muestra y el control comprenden una célula o un tejido, y el método comprende distinguir entre células o tejidos de diferentes especies, células de diferentes tejidos u órganos, células en diferentes estados del desarrollo celular, células en diferentes estados de diferenciación celular o células sanas y enfermas.

Algunas realizaciones incluyen composiciones farmacéuticas, que comprenden un polinucleótido de MetRS descrito en el presente documento, un polipéptido de MetRS descrito en el presente documento, un agente de unión como se describe en el presente documento, o un compuesto identificado por el método anterior o descrito en el presente documento, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Ciertas realizaciones incluyen métodos para modular una actividad celular de una célula, que comprenden poner en contacto la célula con un polinucleótido de MetRS descrito en el presente documento, un polipéptido de MetRS descrito en el presente documento, un agente de unión descrito en el presente documento, un compuesto del método anterior o descrito en el presente documento, o una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En realizaciones específicas, la actividad celular se selecciona de proliferación celular, migración celular, diferenciación celular, apoptosis o muerte celular, señalización celular, angiogénesis, unión celular, captación celular, secreción celular, metabolismo, producción o actividad de citocinas, actividad receptora de citocinas, transcripción génica e inflamación. En un aspecto, la célula se selecciona del grupo que consiste en preadipocitos, médula ósea, neutrófilos, células sanguíneas, hepatocitos, astrocitos, células madre mesenquimales y células del músculo esquelético.

En ciertas realizaciones, la célula está en un sujeto. Ciertas realizaciones comprenden tratar el sujeto, en el que el

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sujeto tiene una afección asociada con una enfermedad neoplásica, una enfermedad o afección del sistema inmunitario, una enfermedad infecciosa, una enfermedad metabólica, un trastorno inflamatorio, enfermedad neuronal/neurológica, una enfermedad muscular/cardiovascular, una enfermedad asociada con hematopoyesis aberrante, una enfermedad asociada con angiogénesis aberrante o una enfermedad asociada con supervivencia celular aberrante.

También se incluyen procesos para fabricar un compuesto farmacéutico, que comprenden: a) realizar un cribado in vitro de uno o más compuestos candidatos en presencia de un fragmento proteico de MetRS de al menos 50 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:137, para identificar un compuesto que se une específicamente con el fragmento proteico de MetRS; b) realizar un ensayo basado en células o bioquímico o de receptores con el compuesto identificado en la etapa a), para identificar un compuesto que modula una o más actividades no canónicas del fragmento proteico de MetRS; c) opcionalmente evaluar la relación de estructura-actividad (SAR) del compuesto identificado en la etapa b), para correlacionar su estructura con la modulación de la actividad no canónica, y opcionalmente derivatizar el compuesto para alterar su capacidad para modular la actividad no canónica; y d) producir suficientes cantidades del compuesto identificado en la etapa b), o el compuesto derivatizado en la etapa c), para su uso en seres humanos, fabricando de este modo el compuesto farmacéutico.

Otras realizaciones incluyen procesos para fabricar un compuesto farmacéutico, que comprenden: a) realizar un cribado in vitro de uno o más compuestos candidatos en presencia de un receptor de superficie celular o una parte extracelular del mismo que se une específicamente con un fragmento proteico de MetRS de SEQ ID NO: 137, para identificar un compuesto que se une específicamente con el receptor de superficie celular o parte extracelular del mismo; b) realizar un ensayo basado en células o bioquímico o de receptores con el compuesto identificado de la etapa a), para identificar un compuesto que modula una o más actividades no canónicas del fragmento proteico de MetRS; c) evaluar opcionalmente la relación de estructura-actividad (SAR) del compuesto identificado en la etapa b), para correlacionar su estructura con la modulación de la actividad no canónica, y opcionalmente derivatizar el compuesto para alterar su capacidad para modular la actividad no canónica; y d) producir suficientes cantidades del compuesto identificado en la etapa b), o el compuesto derivatizado en la etapa c), para su uso en seres humanos, fabricando de este modo el compuesto farmacéutico.

Algunas realizaciones incluyen una composición celular, que comprende una población modificada técnicamente de células en las que al menos una célula comprende un polinucleótido que codifica una proteína de metionil ARNt sintetasa (MetRS) de longitud completa heteróloga, en la que las células son capaces de crecer en un medio sin suero. En un aspecto, la proteína de metionil ARNt sintetasa (MetRS) de longitud completa comprende una purificación heteróloga o un marcador epitópico para facilitar la purificación de un fragmento proteico de MetRS. En otro aspecto, la proteína de metionil ARNt sintetasa (MetRS) de longitud completa comprende un sitio de proteólisis heterólogo para permitir la producción del fragmento proteico de MetRS tras su escisión.

Algunas realizaciones incluyen un método para producir un polipéptido de MetRS como se expone en SEQ ID NO: 137 in situ dentro de una célula, que comprende: i) expresar una proteína de metionil ARNt sintetasa (MetRS) de longitud completa heteróloga dentro de la célula, en la que la célula comprende una proteasa capaz de escindir la proteína de metionil ARNt sintetasa (MetRS) de longitud completa heteróloga para producir el polipéptido de MetRS.

Algunas realizaciones incluyen un método para producir un polipéptido de MetRS como se expone en SEQ ID NO: 137 que comprende poner en contacto una proteína de metionil ARNt sintetasa (MetRS) de longitud completa aislada con una proteasa que es capaz de escindir la proteína de la metionil ARNt sintetasa (MetRS) de longitud completa y producir un polipéptido de MetRS.

Algunas realizaciones incluyen una proteína de metionil ARNt sintetasa (MetRS) de longitud completa modificada técnicamente que comprende un sitio de proteólisis heterólogo para permitir la generación proteolítica de un fragmento proteico de MetRS como se expone en SEQ ID NO: 137.

Algunas realizaciones incluyen una composición, que comprende una proteína de metionil ARNt sintetasa de longitud completa aislada, en la que la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas, menos de aproximadamente 10 UE de endotoxina/mg de proteína, y está sustancialmente sin suero. En un aspecto, la proteína de metionil ARNt sintetasa de longitud completa está presente a una concentración de al menos 10 mg/ml y está al menos 90 % monodispersa.

Una realización adicional incluye un método para tratar una enfermedad o un trastorno mediado por la desregulación de la expresión, actividad o localización espaciotemporal de una ARNt sintetasa mediante la administración de un fragmento proteico de MetRS, o un ácido nucleico que codifica el fragmento proteico de ARRS, como se expone en SEQ ID NO: 137. En un aspecto de esta realización, la enfermedad se selecciona de cáncer, neuropatía, diabetes y trastornos inflamatorios.

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Descripción detallada de la invención

TABLA DE CONTENIDOS

I. VISIÓN DE CONJUNTO.................................................................................................... 15

II. DEFINICIONES......................................................................................16

III. FRAGMENTOS PROTEICOS DE METRS PURIFICADOS Y VARIANTES......28

IV. POLINUCLEÓTIDOS DE METRS...................................................97

V. ANTICUERPOS....................................................................................... 110

VI. ALTERNATIVAS A ANTICUERPOS Y OTROS AGENTES DE UNIÓN................ 115

VII. BIOENSAYOS Y ENSAYOS ANALÍTICOS.............................................119

VIII. SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN........................................ 122

IX. MÉTODOS Y COMPOSICIONES DE DIAGNÓSTICO.................................... 135

X. AGENTES ANTISENTIDO Y DE ARNI....................................................... 151

A. AGENTES ANTISENTIDO................................................................152

B. AGENTES DE INTERFERENCIA DE ARN................................................. 160

XI. DESCUBRIMIENTO DE FÁRMACOS........................................................................... 168

XII. MÉTODOS DE USO............................................................................176

XIII. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS, ADMINISTRACIÓN Y KITS .... 180

XIV. EJEMPLOS....................................................................................... 189

I. VISION DE CONJUNTO

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se dirige, al menos en parte, al descubrimiento de nuevos polipéptidos de MetRS, y métodos para su preparación y uso, que representan la transformación de proteínas de tipo silvestre nativas en nuevas formas que muestran características notablemente diferentes en comparación con los genes de metionil ARNt sintetasa de longitud completa de origen natural. Dichos polipéptidos de MetRS se identificaron basándose en secuencia extensiva y análisis de espectro de masas de metionil ARNt sintetasa expresada en diferentes tejidos, seguido de la producción sistemática y el ensayo de cada polipéptido de MetRS potencial para identificar secuencias proteicas que representan dominios proteicos estables y solubles que muestran nuevas actividades biológicas, y características farmacológicas terapéuticas favorables.

Basándose en este análisis, se han identificado al menos dos familias nuevas de polipéptidos de MetRS derivados de metionil ARNt sintetasa.

En un aspecto, dichos polipéptidos de MetRS derivados de metionil ARN sintetasa comprenden secuencias polipeptídicas que comprenden aproximadamente los aminoácidos 1-197 de metionil ARNt sintetasa.

En un segundo aspecto, dichos polipéptidos de MetRS derivados de metionil ARNt sintetasa comprenden secuencias polipeptídicas que comprenden aproximadamente los aminoácidos 846-900 de metionil ARNt sintetasa.

Estas nuevas familias de polipéptidos de MetRS representan nuevos productos proteicos previamente desconocidos que muestran entre otros i) nueva actividad biológica, ii) características de estabilidad y agregación de proteínas favorables, y iii) la capacidad de expresarse y producirse a alto nivel en sistemas de expresión procariotas, que son características materialmente diferentes no halladas en la proteína de tipo silvestre intacta.

II. DEFINICIONES

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por los expertos habituales en la materia a la que pertenece la invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen posteriormente.

Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Como ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

Por “aproximadamente” se entiende una cantidad, un nivel, un valor, un número, una frecuencia, un porcentaje, una dimensión, un tamaño, una cantidad, un peso o una longitud que varía en hasta 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % con respecto a una cantidad, un nivel, un valor, un número, una frecuencia, un porcentaje, una dimensión, un tamaño, una cantidad, un peso o una longitud de referencia.

Un “agonista” se refiere a una molécula que intensifica o imita una actividad, por ejemplo, una actividad biológica no canónica de una MetRS u otra proteína. Los agonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos,

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moléculas pequeñas o cualquier otro compuesto o composición que module la actividad de una MetRS bien interaccionando directamente con la MetRS o con su compañero de unión, o bien actuando sobre componentes de la ruta biológica en la que participa la MetRS. Se incluyen agonistas parciales y completos.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término “aminoácido” significa aminoácidos tanto de origen natural como de origen no natural así como análogos y miméticos de aminoácidos. Los aminoácidos de origen natural incluyen los 20 (L)-aminoácidos utilizados durante la biosíntesis de proteínas así como otros tales como 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, homocisteína, citrulina y ornitina, por ejemplo. Los aminoácidos de origen no natural incluyen, por ejemplo, (D)-aminoácidos, norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, etionina y similares, que conocen los expertos en la materia. Los análogos de aminoácidos incluyen formas modificadas de aminoácidos de origen natural y no natural. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, sustitución o reemplazo de grupos químicos y restos en el aminoácido o por derivatización del aminoácido. Los miméticos de aminoácidos incluyen, por ejemplo, estructuras orgánicas que muestran propiedades funcionalmente similares tales como carga y separación de cargas características del aminoácido de referencia. Por ejemplo, una estructura orgánica que imita a arginina (Arg o R) tendría un resto de carga positiva localizado en espacio molecular similar y que tiene el mismo grado de movilidad que el grupo e-amino de la cadena lateral del aminoácido Arg de origen natural. Los miméticos también incluyen estructuras restringidas para mantener la separación y las interacciones de carga óptimas del aminoácido o de los grupos funcionales de aminoácidos. Los expertos en la materia saben o pueden determinar qué estructuras constituyen análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos funcionalmente equivalentes.

En ciertos aspectos, el uso de aminoácidos no naturales puede utilizarse para modificar (por ejemplo, aumentar) una actividad no canónica seleccionada de un fragmento proteico de MetRS, o para alterar la semivida in vivo o in vitro de la proteína. También pueden utilizarse aminoácidos no naturales para facilitar las modificaciones químicas (selectivas) (por ejemplo, pegilación) de una proteína MetRS. Por ejemplo, ciertos aminoácidos no naturales permiten la unión selectiva de polímeros tales como PEG con una proteína dada, y mejoran de este modo sus propiedades farmacocinéticas.

Pueden encontrarse ejemplos específicos de análogos y miméticos de aminoácidos descritos en, por ejemplo, Roberts y Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross y Meinhofer, Vol. 5, pág. 341, Academic Press, Inc., Nueva York, N. Y. (1983). Otros ejemplos incluyen aminoácidos peralquilados, particularmente aminoácidos permetilados. Véase, por ejemplo, Combinatorial Chemistry, Eds. Wilson y Czarnik, Ch. 11, pág. 235, John Wiley & Sons Inc., Nueva York, N. Y. (1997). Otros ejemplos más incluyen aminoácidos cuya parte de amida (y, por lo tanto, la cadena principal de amida del péptido resultante) se ha reemplazado, por ejemplo, por un anillo de azúcar, esteroide, benzodiazepina o carbociclo. Véase, por ejemplo, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, Ed. Manfred E. Wolff, C. 15, págs. 619-620, John Wiley & Sons Inc., Nueva York, N. Y. (1995). Se conocen bien en la técnica métodos para sintetizar péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos y proteínas (véanse, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 5.420.109, M. Bodanzsky, Principles of Peptide Synthesis (1a ed. & 2a rev. ed.), Springer-Verlag, Nueva York, N. Y. (1984 y 1993), véase Capítulo 7; Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (2a ed.), Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)). En consecuencia, los polipéptidos de MetRS de la presente invención pueden estar compuestos de aminoácidos de origen natural y de origen no natural así como análogos y miméticos de aminoácidos.

El término “antagonista” se refiere a una molécula que reduce o atenúa una actividad, por ejemplo, una actividad biológica no canónica de una MetRS, u otra proteína. Los antagonistas pueden incluir proteínas tales como anticuerpos, ácidos nucleicos, carbohidratos, moléculas pequeñas o cualquier otro compuesto o composición que module la actividad de una MetRS o su compañero de unión, bien interaccionando directamente con la MetRS o su compañero de unión o bien actuando en componentes de la ruta biológica en la que participa la MetRS. Se incluyen antagonistas parciales y completos.

La expresión “aminoacil ARNt sintetasa” (AARS) se refiere en general a enzimas que en su forma natural o de tipo silvestre son capaces de catalizar la esterificación de un aminoácido específico o su precursor a uno de todos sus ARNt afines compatibles para formar un aminoacil-ARNt. En esta actividad “canónica”, las aminoacil ARNt sintetasas catalizan una reacción de dos etapas: en primer lugar, activan su aminoácido respectivo formando un aminoacil- adenilato, en el que el carboxilo del aminoácido se une al fosfato alfa de ATP desplazando pirofosfato, y después, cuando se une el ARNt correcto, el grupo aminoacilo del aminoacil-adenilato se transfiere al OH 2' o 3' terminal del ARNt.

Las aminoacil ARNt sintetasas de clase I normalmente tienen dos motivos de secuencia altamente conservados. Estas enzimas aminoacilan en el 2'-OH de un nucleótido de adenosina, y son habitualmente monoméricos o diméricos. Las aminoacil ARNt sintetasas de clase II normalmente tienen tres motivos de secuencia altamente conservados. Estas enzimas aminoacilan en el 3'-OH de la misma adenosina, y son habitualmente diméricas o tetraméricas. Los sitios activos de enzimas de clase II se componen principalmente de una lámina p antiparalela de siete cadenas flanqueada por hélices a. Aunque la fenilalanina ARNt sintetasa es de clase II, aminoacila en el 2'-OH.

Los polipéptidos de AARS incluyen fuentes de formas mitocondriales y citoplásmicas de tirosil ARNt sintetasa

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(TyrRS), una triptofanil ARNt sintetasa (TrpRS), una glutaminil ARNt sintetasa (GlnRS), una glicil ARNt sintetasa (GlyRS), una histidil ARNt sintetasa (HisRS), una seril ARNt sintetasa (SerRS), una fenilalanil ARNt sintetasa (PheRS), una alanil ARNt sintetasa (AlaRS), una asparaginil ARNt sintetasa (AsnRS), un aspartil ARNt sintetasa (AspRS), una cisteinil ARNt sintetasa (CysRS), una glutamil ARNt sintetasa (GluRS), un prolil ARNt sintetasa (ProRS), una arginil ARNt sintetasa (ArgRS), un isoleucil ARNt sintetasa (IleRS), un leucil ARNt sintetasa (LeuRS), una lisil ARNt sintetasa (LysRS), una treonil ARNt sintetasa (ThrRS), un metionil ARNt sintetasa (MetRS) o una valil ARNt sintetasa (ValRS). Las secuencias de tipo silvestre o parentales de estos polipéptidos de AARS se conocen en la técnica.

Por “secuencia codificante” se entiende cualquier secuencia de ácido nucleico que contribuya al código para el producto polipeptídico de un gen. Por el contrario, la expresión “secuencia no codificante” se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que no contribuya al código para el producto polipeptídico de un gen.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, a no ser que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que las palabras “comprender”, “comprende” y “comprendiendo” implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicados pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.

Por “que consiste en” se entiende incluyendo, y limitado a, lo que esté a continuación de la frase “que consiste en”. Por lo tanto, la frase “que consiste en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por “que consiste esencialmente en” se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase “que consistente esencialmente en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden estar o no presentes dependiendo de si afectan o no materialmente a la actividad o acción de los elementos enumerados.

La indicación “sin endotoxinas” o “sustancialmente sin endotoxinas” se refiere en general a composiciones, disolventes y/o vasos que contienen como máximo cantidades traza (por ejemplo, cantidades que no tienen efectos fisiológicos clínicamente adversos para un sujeto) de endotoxina, y preferentemente cantidades indetectables de endotoxina. Las endotoxinas son toxinas asociadas con ciertas bacterias, normalmente bacterias gram negativas, aunque pueden encontrarse endotoxinas en bacterias gram positivas, tales como Listeria monocytogenes. Las endotoxinas más prevalentes son lipopolisacáridos (LPS) o lipo-oligosacáridos (LOS) hallados en la membrana externa de diversas bacterias gram negativas, y que representan un elemento patógeno central en la capacidad de estas bacterias para provocar enfermedad. Cantidades pequeñas de endotoxina en seres humanos pueden producir fiebre, una reducción de la tensión arterial, y activación de inflamación y coagulación, entre otros efectos fisiológicos adversos.

Por lo tanto, en la producción farmacéutica de polipéptidos de MetRS, es con frecuencia deseable retirar la mayoría de o todas las trazas de endotoxina de productos farmacológicos y/o recipientes farmacológicos, porque incluso cantidades pequeñas pueden provocar efectos adversos en seres humanos. Puede usarse un horno de despirogenización para este fin, ya que se requieren normalmente temperaturas de más de 300 °C para degradar la mayoría de endotoxinas. Por ejemplo, basándose en el material de envasado primario tal como jeringas o viales, la combinación de una temperatura de vidrio de 250 °C y un tiempo de mantenimiento de 30 minutos es con frecuencia suficiente para conseguir una reducción 3 log de los niveles de endotoxina. Se contemplan otros métodos para retirar endotoxinas, incluyendo, por ejemplo, métodos de cromatografía y filtración, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. También se incluyen métodos para producir polipéptidos de MetRS en y aislarlos de células eucariotas tales como células de mamífero para reducir, si no eliminar, el riesgo de que estén presentes endotoxinas en una composición de la invención. Se prefieren métodos para producir polipéptidos de MetRS en y aislarlos de células sin suero. Dichas composiciones que comprenden polipéptidos de MetRS representan nuevas formulaciones que muestran características biológicas y terapéuticas nuevas y novedosas no halladas en composiciones polipeptídicas de MetRS contaminadas con suero o endotoxina que tienen el potencial de unirse a y alterar las propiedades biológicas novedosas de los polipéptidos de MetRS.

Pueden detectarse endotoxinas usando técnicas rutinarias conocidas en este campo. Por ejemplo, el ensayo de Lisado de Amebocitos de Limulus, que utiliza sangre del cangrejo herradura, es un ensayo muy sensible para detectar la presencia de endotoxina, y los reactivos, kits e instrumentación para la detección de endotoxinas basándose en este ensayo están disponibles en el mercado, por ejemplo del Grupo Lonza. En este ensayo, niveles muy bajos de LPS pueden provocar coagulación detectable del lisado de Limulus debido a una potente cascada enzimática que amplifica esta reacción. Las endotoxinas también pueden cuantificarse por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Para ser sustancialmente sin endotoxinas, los niveles de endotoxinas pueden ser menos de aproximadamente 0,00l, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 UE/mg de proteína. normalmente, 1 ng de lipopolisacárido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 UE.

En ciertas realizaciones, la “pureza” de cualquier agente dado (por ejemplo, fragmento proteico de MetRS) en una

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composición puede definirse específicamente. Por ejemplo, ciertas composiciones pueden comprender un agente que es al menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % puro, incluyendo todos los decimales entre medias, como se mide, por ejemplo, y en ningún modo limitante, mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC), una forma bien conocida de cromatografía en columna usada frecuentemente en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos.

Como se usa en el presente documento, los términos “función” y “funcional” y similares se refieren a una función biológica, enzimática o terapéutica.

Por “gen” se entiende una unidad de herencia que puede ocupar un locus específico en un cromosoma y consiste en secuencias reguladoras de la transcripción y/o de la traducción y/o una región codificante y/o secuencias no traducidas (es decir, intrones, secuencias no traducidas 5' y 3').

“Homología” se refiere al porcentaje del número de aminoácidos que son idénticos o constituyen substituciones conservativas. La homología puede determinarse usando programas de comparación de secuencias tales como GAP (Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). De esta manera podrían compararse secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente a las citadas en el presente documento por inserción de huecos en el alineamiento, determinándose dichos huecos, por ejemplo, por el algoritmo de comparación usado por GAP.

La expresión “célula hospedadora” incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de cualquier vector o vectores recombinantes, polinucleótido aislado o polipéptido de la invención. Las células hospedadoras incluyen descendencia de una única célula hospedadora, y la descendencia puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula parental original debido a mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado. Una célula hospedadora incluye células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido de la invención. Una célula hospedadora que comprende un vector recombinante de la invención es una célula hospedadora recombinante.

Por “aislado” se entiende material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Por ejemplo, un “polinucleótido aislado”, como se usa en el presente documento, incluye un polinucleótido que se ha purificado a partir de las secuencias que lo flanquean en su estado de origen natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha retirado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento. Como alternativa, un “péptido aislado” o un “polipéptido aislado” y similares, como se usa en el presente documento, incluye el aislamiento y/o la purificación in vitro de una molécula peptídica o polipeptídica de su ambiente celular natural, y de asociación con otros componentes de la célula; es decir, no se asocia significativamente con sustancias in vivo.

El término “ARNm” o denominado en ocasiones “transcritos de ARNm” como se usa en el presente documento, incluye, pero sin limitación, transcrito o transcritos de preARNm, intermedios de procesamiento de transcritos, ARNm maduros listos para traducción y transcritos del gen o los genes, o ácidos nucleicos derivados del transcrito o los transcritos de ARNm. El procesamiento de transcritos puede incluir corte y empalme, edición y degradación. Como se usa en el presente documento, un ácido nucleico derivado de un transcrito de ARNm se refiere a un ácido nucleico para cuya síntesis el transcrito de ARNm o una subsecuencia del mismo ha actuado en última instancia como un molde. Un ADNc inverso transcrito a partir de un ARNm, un ARN transcrito a partir de ese ADNc, un ADN amplificado del ADNc, un ARN transcrito del ADN amplificado, etc., derivan todos del transcrito de ARNm y la detección de dichos productos derivados es indicativa de la presencia y/o abundancia del transcrito original en una muestra. Por lo tanto, las muestras derivadas de ARNm incluyen, pero sin limitación, transcritos de ARNm del gen o los genes, ADNc inverso transcrito del ARNm, ARNc transcrito del ADNc, ADN amplificado de los genes, ARN transcrito de ADN amplificado y similares.

La actividad “no canónica” como se usa en el presente documento, se refiere en general a i) una nueva actividad poseída por un polipéptido de MetRS de la invención que no posee en ningún grado significativo la proteína parental de longitud completa nativa intacta, o ii) una actividad que poseía la proteína parental de longitud completa nativa intacta, en la que el polipéptido de MetRS muestra una actividad específica significativamente mayor (es decir al menos 20 % mayor) en comparación con la proteína parental de longitud completa nativa intacta o muestra la actividad en un nuevo contexto; por ejemplo aislando la actividad de otras actividades poseídas por la proteína parental de longitud completa nativa intacta. En el caso de polipéptidos de MetRS, los ejemplos no limitantes de actividades no canónicas incluyen señalización extracelular, unión a ARN, unión a aminoácidos, modulación de la proliferación celular, modulación de la migración celular, modulación de la diferenciación celular (por ejemplo, hematopoyesis, neurogénesis, miogénesis, osteogénesis y adipogénesis), modulación de la transcripción génica, modulación de la apoptosis u otras formas de muerte celular, modulación de la señalización celular, modulación de la captación celular o secreción, modulación de la angiogénesis, modulación de la unión celular, modulación del metabolismo celular, modulación de la producción o actividad de citocinas, modulación de la actividad receptora de citocinas, modulación de la inflamación y similares.

La expresión “concentración eficaz semimáxima” o “CE50” se refiere a la concentración de un fragmento proteico de MetRS, anticuerpo u otro agente descrito en el presente documento a la que induce una respuesta a medio camino

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entre la línea basal y el máximo después de algún tiempo de exposición especificado; la CE50 de una curva de respuesta a dosis graduada representa por lo tanto la concentración de un compuesto a la que se observa 50 % de su efecto máximo. En ciertas realizaciones, la CE50 de un agente proporcionado en el presente documento se indica en relación con una actividad “no canónica”, como se ha indicado anteriormente. CE50 también representa la concentración en plasma requerida para obtener el 50 % de un efecto máximo in vivo. De forma similar, la “CE90” se refiere a la concentración de un agente o composición a la que se observa el 90 % de su efecto máximo. La “CE90” puede calcularse a partir de la “CE50” y la pendiente de Hill, o puede determinarse a partir de los datos directamente, usando conocimiento rutinario en la técnica. En algunas realizaciones, la CE50 de un fragmento proteico de MetRS, anticuerpo u otro agente es menor de aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nM. Preferentemente, la composición bioterapéutica tendrá un valor de CE50 de aproximadamente 1 nM o menos.

El término “modular” incluye “aumentar” o “estimular”, así como “reducir” o “disminuir”, normalmente en una cantidad estadísticamente significativa o una fisiológicamente significativa en comparación con un control. En consecuencia un “modulador” puede ser un agonista, un antagonista, o cualquier mezcla de los mismos dependiendo de las condiciones usadas. Una cantidad “aumentada” o “potenciada” es normalmente una cantidad “estadísticamente significativa”, y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los números enteros y puntos decimales entre medias y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la cantidad producida por ausencia de composición (la ausencia de un agente o compuesto) o una composición de control. Una cantidad “disminuida” o reducida es normalmente una cantidad “estadísticamente significativa”, y puede incluir una disminución de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % en la cantidad producida por ausencia de composición (la ausencia de un agente o compuesto) o una composición de control, incluyendo todos los números enteros entre medias. Como un ejemplo no limitante, un control en la comparación de actividades canónicas y no canónicas podría incluir el fragmento de interés de proteína MetRS en comparación con su MetRS de longitud completa correspondiente, o un fragmento de MetRS que tiene actividad canónica comparable a su MetRS de longitud completa correspondiente. Se describen en el presente documento otros ejemplos de cantidades “estadísticamente significativas”.

Por “obtenerse de” se entiende que una muestra tal como, por ejemplo, un extracto polinucleotídico o extracto polipeptídico se aísla de, o deriva de, una fuente particular del sujeto. Por ejemplo, el extracto puede obtenerse a partir de un tejido o un fluido biológico aislado directamente del sujeto. “Derivado” u “obtenido de” también puede referirse a la fuente de una secuencia polipeptídica o polinucleotídica. Por ejemplo, una secuencia de MetRS de la presente invención puede “derivar” de la información de secuencia de un fragmento proteolítico de MetRS o variante de corte y empalme de MetRS, o una parte del mismo, bien de origen natural o bien generado artificialmente, y puede por lo tanto comprender, consistir esencialmente en o consistir en esa secuencia.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a un polímero de restos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos y de origen natural de los mismos. Por lo tanto, estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son aminoácidos de origen no natural sintéticos, tales como un análogo químico de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y derivados químicos de origen natural de los mismos. Dichos derivados incluyen, por ejemplo, modificaciones postraduccionales y productos de degradación que incluyen variantes de piroglutamilo, isoaspartilo, proteolíticas, fosforiladas, glucosiladas, oxidadas, isomerizadas y desaminadas del fragmento de referencia de MetRS.

Las indicaciones “identidad de secuencia” o, por ejemplo, que comprende una “secuencia 50 % idéntica a”, como se usa en el presente documento, se refieren a la medida en que las secuencias son idénticas nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido sobre una ventana de comparación. Por lo tanto, un “porcentaje de identidad de secuencia” puede calcularse comparando dos secuencias alineadas de forma óptima sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo A, T, C, G, I) o el resto de aminoácido idéntico (por ejemplo Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) aparece en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos usados para describir relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen “secuencia de referencia”, “ventana de comparación”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” e “identidad sustancial”. Una “secuencia de referencia” es de al menos 12, pero frecuentemente de 15 a 18 y con frecuencia de al menos 25 unidades monoméricas, incluyendo restos de nucleótidos y aminoácidos, de longitud. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solamente una parte de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan normalmente comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una “ventana de comparación” para

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identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación” se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en el que se compara una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinearse óptimamente las dos secuencias. La ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de aproximadamente 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics Versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE.UU.) o mediante inspección y puede seleccionarse el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generado por cualquiera de los diversos métodos. También puede hacerse referencia a la familia de programas BLAST como por ejemplo se desvela en Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389. Puede encontrarse discusión detallada del análisis de secuencia en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.

Se realizan cálculos de similitud de secuencia o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se usan indistintamente en el presente documento) de la siguiente manera. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden descartarse para fines de comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación es de al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, más preferentemente al menos 50 %, 60 %, e incluso más preferentemente al menos 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Los restos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes se comparan después. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede conseguirse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización preferida más, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto particularmente preferido de parámetros (y el que debería usarse a no ser que se especifique de otro modo) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco de desplazamiento de fase de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (1989, Cabios, 4: 11-17) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos de pesos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y proteínas descritas en el presente documento pueden usarse como una “secuencia de consulta” para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al., (1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10). Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos de BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas de moléculas de ácido nucleico de la invención. Pueden realizarse búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas de moléculas proteicas de la invención. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, puede utilizarse BLAST con huecos como se describe en Altschul et al., (1997, Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402). Cuando se utilizan programas BLAST y BLAST con huecos, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).

El término “solubilidad” se refiere a la propiedad de un agente proporcionado en el presente documento para disolverse en un disolvente líquido y formar una solución homogénea. La solubilidad se expresa normalmente como una concentración, bien por masa de soluto por unidad de volumen de disolvente (g de soluto por kg de disolvente, g por dl (100 ml), mg/ml, etc.), molaridad, molalidad, fracción molar u otras descripciones similares de concentración.

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La cantidad en equilibrio máxima de soluto que puede disolverse por cantidad de disolvente es la solubilidad de ese soluto en ese disolvente en las condiciones especificadas, incluyendo temperatura, presión, pH y la naturaleza del disolvente. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide a pH fisiológico. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide en agua o un tampón fisiológico tal como PBS. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide en un fluido biológico (disolvente) tal como sangre o suero. En ciertas realizaciones, la temperatura puede ser aproximadamente temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25 °C) o aproximadamente temperatura corporal (37 °C). En ciertas realizaciones, un agente tal como un fragmento proteico de MetRS tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 mg/ml a temperatura ambiente o a 37 °C.

Un “punto de unión de corte y empalme” como se usa en el presente documento incluye la región en un transcrito de ARNm maduro o el polipéptido codificado en el que el extremo 3' de un primer exón se une al extremo 5' de un segundo exón. El tamaño de la región puede variar, y puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más (incluyendo todos los números enteros entre medias) restos de nucleótidos o aminoácidos en uno de los lados de los restos exactos donde el extremo 3' de un exón se une al extremo 5' de otro exón. Un “exón” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está representada en la forma madura de una molécula de ARN después de haberse retirado por corte y empalme en cis partes de un ARN precursor (intrones) o haberse ligado por corte y empalme en trans dos o más moléculas de ARN precursoras. La molécula de ARN madura puede ser un ARN mensajero o una forma funcional de un ARN no codificante tal como ARNr o ARNt. Dependiendo del contexto, un exón puede referirse a la secuencia en el ADN o su transcrito de ARN. Un “intrón” se refiere a una región de ácido nucleico no codificante dentro de un gen, que no se traduce a una proteína. Se transcriben secciones intrónicas no codificantes a ARNm precursor (preARNm) y algunos otros ARN (tales como ARN no codificantes largos) y posteriormente se retiran por corte y empalme durante el procesamiento a ARN maduro.

Una “variante de corte y empalme” se refiere a un ARNm maduro y su proteína codificada que se producen por corte y empalme alternativo, un proceso por el que los exones del aRn (un transcrito génico primario o preARNm) se reconectan de múltiples maneras durante el corte y empalme de ARN. Los ARNm diferentes resultantes pueden traducirse a diferentes isoformas proteicas, lo que permite que un único gen codifique múltiples proteínas.

Un “sujeto”, como se usa en el presente documento, incluye cualquier animal que muestre un síntoma, o esté en riesgo de mostrar un síntoma, que puede tratarse o diagnosticarse con un polinucleótido o polipéptido de MetRS de la invención. También se incluyen sujetos para los que es deseable perfilar niveles de polipéptidos y/o polinucleótidos de MetRS de la invención, para fines de diagnóstico u otros. Los sujetos adecuados (pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo o cobaya), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como gato o perro). Se incluyen primates no humanos y, preferentemente, pacientes humanos.

“Tratamiento” o “tratar”, como se usa en el presente documento, incluye cualquier efecto deseable en los síntomas o la patología de una enfermedad o afección que puede efectuarse por las actividades no canónicas de un polinucleótido o polipéptido de MetRS, como se describe en el presente documento, y pueden incluir incluso cambios mínimos o mejoras en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se trate. También se incluyen tratamientos que están relacionados con terapias no MetRS, en los que una secuencia de MetRS descrita en el presente documento proporciona un marcador clínico de tratamiento. “Tratamiento” o “tratar” no indican necesariamente la erradicación completa o cura de la enfermedad o afección, o síntomas asociados con la misma. El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier sujeto que lo necesite. Los marcadores a modo de ejemplo de mejora clínica resultarán evidentes para los expertos en la materia.

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica, muchos de los cuales se describen posteriormente con el fin de ilustrar. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a Edición, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin y Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R. I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Techniques, 5a Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3a Edición 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3a Edición 2005), Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-3,4-2), 1855. Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, Nueva York, N. Y., Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); y Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams y Linda Rodgers, (2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3).

III. FRAGMENTOS PROTEICOS DE METRS PURIFICADOS Y VARIANTES PARA PRODUCTOS TERAPÉUTICOS Y OTRAS APLICACIONES

Sorprendentemente, y a diferencia de sus secuencias parentales de longitud completa que se conocen solamente 5 por sus actividades de aminoacilación, se ha descubierto que los fragmentos de MetRS poseen actividades biológicas importantes para aplicaciones bioterapéuticas, de descubrimiento y de diagnóstico. Las realizaciones de la presente invención incluyen por lo tanto proteínas de longitud completa, isoformas de proteínas maduras y fragmentos proteicos de metionil ARNt sintetasas (MetRS), además de variantes biológicamente activas y fragmentos de las mismas. En ciertas realizaciones, las proteínas y fragmentos pueden surgir mediante proteólisis 10 endógena, proteólisis in vitro, variación de corte y empalme o predicción por ordenador, entre otros mecanismos.

Los fragmentos proteicos de MetRS descritos en el presente documento, y variantes de los mismos, pueden poseer al menos una actividad biológica “no canónica”. El fragmento o los fragmentos proteicos de MetRS de la presente invención también se indican en el presente documento como “polipéptidos de MetRS” o “polipéptidos de referencia 15 de MetRS”. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de MetRS proporcionados en el presente documento comprenden o consisten esencialmente en todas o una parte de las “secuencia o secuencias de referencia” de polipéptidos de MetRS como se expone en SEQ ID NO: 137, que representan la secuencia o las secuencias de aminoácidos de diversos fragmentos de metionil ARNt sintetasas. Las secuencias proteicas de MetRS de ratón y de seres humanos están altamente relacionadas, difiriendo normalmente en no más de unos pocos aminoácidos dentro 20 de una secuencia completa, un dominio particular o un fragmento proteico particular.

Polipéptidos de MetRS N terminales: (Tablas 1, 2 y 3)

: Tabla 1A Polipéptidos de MetRS identificados por EM

Nombre: Tipo / especie / Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ. ID. NO.

MetRSN1: Proteína / Humana / 1231 MRLFVSDGVPGCLPVLAAAGRARGRAEV LISTVGPEDCVVPFLTRPKVPVLQLDSGNY LFSTSAICRYFFLLSGWEQDDLTNQWLEW EATELQPALSAALYYLVV QGKKGEDVLGS VRRALTHIDHSLSRQNCPFLAGETESLADI VLWGALYPLLQDPAYLPEELSALHSWFQT LSTQEPCQRAAETVLKQQGVLALRPYLQK QPQPSPAEGRAVTNEPEEEELATLSEE SEQ. ID. NO.12

MetRSN1: ADN / Humana/ ATGAGACTGTTCGTGAGTGATGGCGTCC CGGGTTGCTTGCCGGTGCTGGCCGCCGC CGGGAGAGCCCGGGGCAGAGCAGAGGT GCTCATCAGCACTGTAGGCCCGGAAGAT T GTGTGGTCCCGTTCCT GACCCGGCCT AA GGTCCCTGTCTTGCAGCT GGATAGCGGC AACTACCTCTT CT CCACTAGTGCAATCT G CCGATATTTTTTTTTGTT ATCTGGCT GGG AGCAAGATGACCTCACT AACCAGT GGCT GGAAT GGGAAGCGACAGAGCT GCAGCC AGCTTT GT CTGCTGCCCTGTACT ATTT AG TGGTCCAAGGCAAGAAGGGGGAAGATG TTCTTGGTTCAGTGCGGAGAGCCCTGACT CACATTGACCACAGCTT GAGTCGTCAGA ACT GTCCTTTCCTGGCTGGGGAGACAGA ATCTCTAGCCGACATTGTTTrGTGGGGAG SEQ. ID. NO.13

CCCTATACCCATTACTGCAAGATCCCGCC

T ACCTCCCTGAGGAGCT GAGTGCCCTGC

ACAGCTGGTTCCAGACACTGAGT ACCCA

GGAACCATGTCAGCGAGCTGCAGAGACT

GTACTGAAACAGCAAGGTGTCCTGGCTC

TCCGGCCTTACCTCCAAAAGCAGCCCCA

GCCCAGCCCCGCTGAGGGAAGGGCTGTC

ACCAATGAGCCTGAGGAGGAGGAGCTG

GCTACCCTATCTGAGGAG

Tabla 1B Péptidos de enlace inferidos y péptidos detectados por espectrometría de masas de MetRSN1

Tipo / especie: Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína / ratón: LFVSEGSPGSLPVLAAAAR SEQ. ID. NO.14

Proteína / ratón: GRAELLISTVG PEECWPFLTR SEQ. ID. NO.15

Proteína / ratón: VPVLQLDSGNYLFSASAICR SEQ. ID. NO.16

Proteína / ratón: YFFLLCGWEQDDLTNQWLEWEATELQPVLSAALHCL VVQGKKGEDILGPLRRVLTHIDHSLSRQNCPFLAGDTE SLADIVLWGALYPLLQDPAYLPEELGALQSWFQTLST OEPCORAAETVLKOOGVLALRLYLOK SEQ. ID. NO.17

Proteína / ratón: QPQPQPPPPEGR SEQ. ID. NO.18

Tabla 1C Secuencias concatenadas de MetRSN1 basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / especie: Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína / ratón: LFVSEGSPGSLPVLAAAARARGRAELLISTV GPEEC W SEQ. ID. NO.19

PFLTRPKVPVLOLDSGNYLFSASAICRYFFLLCGWEOD

DLTNQWLEWEATELOPVLSAALHCLVVOGKKGEDIL

: GPLRRVLTHIDHSLSRQNCPFLAGDTESLADIVLWGAL YPLLQDPAYLPEELGALQSWFQTLSTQEPCQRAAETV LKOOGVLALRLYLOKOPOPOPPPPEGR

Poli: Tabla 2 péptidos de MetRS y transcritos alternativos identificados por Secuenciación Profunda

MetRSN3: Proteína / Humana / 1-67 + 48 aa MRLFVSDGVPGCLPVLAAAGRARGRAEV LISTVGPEDCVVPFLTRPKVPVLQLDSGN YLFSTS AICRY SMSGLMPLLAICPSQPTTQ TSGRDGGRTQSKWTCISSWPKTMFLSIA SEQ. ID. NO.20

MetRSN3: ADN / Humana AT GAGACT GTTCGT GAGTGATGGCGTCC CGGGTTGCTTGCCGGTGCTGGCCGCCGC CGGGAGAGCCCGGGGCAGAGCAGAGGT GCTCATCAGCACTGTAGGCCCGGAAGA TTGTGTGGTCCCGTTCCTGACCCGGCCT AAGGTCCCTGT CTTGC AGCTGGATAGCG GCAACTACCTCTTCTCCACTAGTGCAAT CT GCCGGT ATTCTAT GT CTGGTTTGAT G CCACTATTGGCTAT CTGTCCAT CAC AGC CAACTACACAGACCAGTGGGAGAGATG GTGGAAGAACCCAGAGCAAGTGGACCT GT ATCAGTTCAT GGCCAAAGACAATGTT CCTTTCCATAGCTTAG SEQ. ID. NO.21


: CAGAGCGAGCTT AT GCGACT GCCC AGT GGCAAAGTGGGCTTCAGCAAGGCCATG TCCAACAAGTGGATTCGGGTGGACAAG AGTGCGGCT GACGGGCCCCGGGT GTTC CG AGT GG ACTCT GÁ AG ACCT ACTGGGT GAGGAAAGGCA GTGGCTTT A G

MetRSN4: Proteína / Humana / 1364 + 63 aa MRLFVSDGVPGCLPVLAAAGRARGRAEV LISTVGPEDCVVPFLTRPKVPVLQLDSGN YLFSTSAICRYFFLLSGWEQDDLTNQWLE WEATELQPALSAALYYLVVQGKKGEDVL GSVRRALTHIDHSLSRQNCPFLAGETESLA DIVLWGALYPLLQDPAYLPEELSALHSWF QTLSTQEPCQRAAETVLKQQGVLALRPYL QKQPQPSPAEGRAVTNEPEEEELATLSEEE IAMAVTAWEKGLESLPPLRPQQNPVLPVA GERNVLITSALPYVNNVPHLGNIIGCVLSA DVFARYSRLRQWNTLYLCGTDEYGTATE TKALEEGLTPQEICDKYHIIHADIYRWFNI SFDIFGRTTTPQQTKSLSVKSADHALWCS RASTCFWTCLSWRSDWRSGWGGHCLAV SEQ. ID. NO.22


: TGHPMPSLSPVLGFGMASSHAA

MetRSN4: ADN / Humana ATGAGACTGTTCGTGAGTGATGGCGTCC CGGGTTGCTTGCCGGTGCTGGCCGCCGC CGGGAGAGCCCGGGGCAGAGCAGAGGT GCTCATCAGCACTGTAGGCCCGGAAGA TTGTGTGGTCCCGTTCCTGACCCGGCCT AAGGTCCCTGTCTTGCAGCTGGATAGCG GCAACTAC CTCTTCT CCACT AGTGCAAT GGGAGCAAGATG ACCT CACT AACCAGT GGCTGGAATGGGAAGCGACAGAGCTGC AGCCAGCTTTGT CTGCTGCCCTGT ACT A TTTAGTGGTCCAAGGCAAGAAGGGGGA AGATGTTCTTGGTTCAGTGCGGAGAGCC CT GACTCACATT GACCACAGCTTGAGTC GTCAGAACTGTCCTTTCCTGGCTGGGGA GACAGAATCTCTAGCCGACATTGTTTTG TGGGGAGCCCTAT ACCC ATT ACTGCAAG ATCCCGCCT ACCTCCCT GAGGAGCT GAG TGCCCTGCACAGCTGGTTCCAGACACTG AGTACCCAGGAACCATGTCAGCGAGCT GCAGAGACTGTACTGAAACAGCAAGGT GTCCT GGCTCTCCGGCCTT ACCTCC AAA AGCAGCCCCAGCCC AGCCCCGCT GAGG GAAGGGCTGTCACCAATGAGCCTGAGG AGGAGGAGCTGGCTACCCTATCTGAGG AGGAGATTGCTATGGCTGTTACTGCTTG GGAGAAGGGCCTAGAAAGTTTGCCCCC GCTGCGGCCCCAGC AGAATCCAGT GTT G CCTGTGGCTGGAGAAAGGAATGTGCTC ATCACCAGTGCCCTCCCTTACGTCAACA AT GTCCCCCACCTT GGGAAC ATCATTGG TTGT GTGCTCAGTGCCGATGTCTTT GCC AGGT ACTCTCGCCTCCGCCAGT GGAACA CCCTCTATCTGT GTGGGACAGAT GAGTA TGGTACAGCAACAGAGACCAAGGCTCT GGAGGAGGGACTAACCCCCCAGGAGAT CT GCGAC AAGTACC ACATCATCCAT GCT GACATCTACCGCTGGTTTAACATTTCGT TTGAT ATTTTTGGT CGCACCACCACTCC ACAGCAGACCAAAAGCCTCAGTGT AAA GT CTGCCGAT CATGCCCTGT GGTGCAGT SEQ. ID. NO.23


: CGAGCCAGCACCTGTTTCTGGACCTGCC T AAGCT GGAGAAGCGACT GGAGGAGTG GTTGGGGAGGACATTGCCTGGCAGTGA CTGGACAC CCAATGCCCAGTTT ATCACC CGTTCTT GGCTTCGGGAT GGCCT CAAGC CACGCTGCAT AA

MetRSN5

Proteína / Humana / 1513 + 546-900

MRLFVSDGVPGCLPVLAAAGRARGRAEV

LISTVGPEDCVVPFLTRPKVPVLQLDSGN

YLFSTSAICRYFFLLSGWEQDDLTNQWLE

WEATELQPALSAALYYLVVQGKKGEDVL

GSVRRALTHIDHSLSRQNCPFLAGETESLA

DIVLWGALYPLLQDPAYLPEELSALHSWF

QTLSTQEPCQRAAETVLKQQGVLALRPYL

QKQPQPSPAEGRAVTNEPEEEELATLSEEE

SEQ. ID. NO.24

IAMAVTAWEKGLESLPPLRPQQNPVLPVA

GERNVLITSALPYVNNVPHLGNIIGCVLSA

DVFARYSRLRQWNTLYLCGTDEYGTATE

TKALEEGLTPQEICDKYHIIHADIYRWFNI

SFDIFGRTTTPQQTKITQDIFQQLLKRGFV

LQDTVEQLRCEHCARFLADRFVEGVCPFC

GYEEARGDQCDKCGKLINAVELKKPQCK

VCRSCPVVQSSQHLFLDLPKLEKRLEEWL

GRTLPGSDWTPNAQFITRSWLRDGLKPRC

ITRDLKWGTPVPLEGFEDKVDLYQFMAK

DNVPFHSLVFPCSALGAEDNYTLVSHLIA

TEYLNYEDGKFSKSRGVGVFGDMAQDTG

IPADIWRFYLLYIRPEGQDSAFSWTDLLLK

NN SELLNNLGNFINRAGMFY SKFF GGYVP

EMVLTPDDQRLLAHVTLELQHYHQLLEK

VRJRDALRSILTISRHGNQYIQVNEPWKRJ

KGSEADRQRAGTVTGLAVNIAALLSVML

QPYMPTVSATIQAQLQLPPPACSILLTNFL

CTLPAGHQIGTVSPLFQKLENDQIESLRQR

FGGGQAKTSPKPAVVETVTTAKPQQIQAL

MDEVTKQGNIVRELKAQKADKNEVAAE

VAKLLDLKKQLAVAEGKPPEAPKGKKKK

MetRSN5

ADN

Humana

' ATGAGACTGTTCGTGAGTGATGGCGTCC CGGGTTGCTTGCCGGTGCTGGCCGCCGC CGGGAGAGCCCGGGGCAGAGCAGAGGT GCTCATCAGCACTGTAGGCCCGGAAGA TTGT GTGGT CCCGTT CCTGACCCGGCCT

SEQ. ID. NO.25

AAGGTCCCTGTCTTGCAGCTGGATAGCG

GCAACTACCTCTTCTCCACTAGTGCAAT

imagen1

GGGAGCAAGATGACCTCACTAACCAGT GGCTGGAAT GGGAAGCGACAGAGCTGC AGCCAGCTTTGT CTGCTGCCCTGT ACT A TTTAGTGGTCCAAGGCAAGAAGGGGGA AGAT GTTCTTGGTT C AGT GCGGAGAGCC CTGACTCACATTGACCACAGCTTGAGTC GTCAGAACTGTCCTTTCCTGGCTGGGGA GACAGAATCTCT AGCCGACATTGTTTT G TGGGGAGCCCTAT ACCC ATT ACTGCAAG ATCCCGCCT ACCTCCCT GAGGAGCTGAG TGCCCTGC ACAGCT GGTTCC AGACACTG AGT ACCCAGGAACC ATGTCAGCGAGCT GCAGAGACTGTACTGAAACAGCAAGGT GTCCT GGCTCTCCGGCCTT ACCTCC AAA AGCAGCCCCAGCCC AGCCCCGCT GAGG

GAAGGGCTGTCACCAATGAGCCTGAGG

AGGAGGAGCTGGCTACCCTATCTGAGG

AGGAGATTGCTATGGCTGTTACTGCTTG

GGAGAAGGGCCTAGAAAGTTTGCCCCC

GCTGCGGCCCCAGCAGAATCCAGTGTTG

CCT GT GGCTGGAGAAAGGAATGTGCTC

ATCACCAGTGCCCTCCCTTACGTCAACA

AT GTCCCCCACCTT GGGAAC ATCATTGG

TTGT GTGCTCAGTGCCGATGTCTTT GCC

AGGT ACTCTCGCCTCCGCCAGT GGAAC A

CCCTCTATCTGTGTGGGACAGATGAGTA

TGGTACAGCAACAGAGACCAAGGCTCT

GGAGGAGGGACTAACCCCCCAGGAGAT

CTGCGAC AAGTACC ACATCATCCAT GCT GACATCT ACCGCTGGTTTAACATTT CGT TTGAT ATTTTTGGT CGCACCACCACTCC ACAGCAGACCAAAATCACCCAGGACAT

TTTCCAGCAGTTGCTGAAACGAGGTTTT GT GCTGCAAGAT ACT GT GGAGC AACT G CGATGTGAGCACTGTGCTCGCTTCCTGG CTGACCGCTTCGTGGAGGGCGTGTGTCC CTTCT GT GGCT AT G AGGAGGCTCGGGGT GACCAGTGTGAC AAGTGTGGCAAGCT C ATCAATGCTGTCGAGCTTAAGAAGCCTC AGTGTAAAGTCTGCCGATCATGCCCTGT

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

1. Una composición terapéutica, que comprende un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud y que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, 98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 137, en donde el polipéptido de AARS tiene al menos una actividad de señalización extracelular y una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en donde la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente el 95 % en proteínas y menos de aproximadamente 10 UE de endotoxina/mg de proteína.
2. La composición terapéutica de la reivindicación 1, en la que el polipéptido de AARS está fusionado con un polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en marcadores de purificación, marcadores epitópicos, secuencias de dirección, péptidos señal, secuencias de traslocación de membrana y modificadores PK.
3. La composición terapéutica de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicho polipéptido de AARS consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 137 o difiere de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 137 por sustitución, deleción y/o adición de aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos.
4. La composición terapéutica de la reivindicación 3, en la que al menos un resto o un sustrato sólido se unen de forma covalente o no covalente a dicho polipéptido, donde el al menos un resto es un marcador detectable o un polímero soluble en agua.
5. Un anticuerpo que muestra especificidad de unión por un polipéptido de AARS aislado de SEQ ID NO: 137, en donde la afinidad del anticuerpo por el polipéptido de AARS es aproximadamente 10X más fuerte que su afinidad por un polipéptido de AARS de longitud completa correspondiente.
6. Una composición terapéutica, que comprende un anticuerpo de la reivindicación 5, en la que el anticuerpo tiene una afinidad de al menos aproximadamente 1 nM por el polipéptido.
7. Un método para identificar un compuesto que se une específicamente a un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) como se expone en SEQ ID NO: 137, que comprende

a) combinar en condiciones adecuadas el polipéptido de AARS con al menos un compuesto de ensayo, y

b) detectar la unión del polipéptido de AARs al compuesto de ensayo, identificando de este modo un compuesto que se une específicamente al polipéptido de AARS.
8. Una proteína de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) de longitud completa modificada técnicamente que comprende un sitio de proteólisis heterólogo para permitir la generación proteolítica de un polipéptido de AARS como se expone en SEQ ID NO: 137.
9. Una composición terapéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para su uso en el tratamiento de caquexia, un estado de debilitamiento o una enfermedad musculoesquelética.

259

MetRSIN1

80

218

Dominio de unión a anticodón

658 806

GST_N GST_C

844 897

—( >900

1

273 283

593 597

231

Dominio

WHEP

FIG. 1A

MetRSIM3 MetRSIN4 MetRSIM5 MetRSIm MetRSIM7 MetRSIM8

8 81

D 218

GST_N GST_C 1 68 + 47 aa

1

í

1

í

1

266 658

804 5 844 897 —( >900

273 283

593 597

Dominio

WHEP

364 + 63 aa

514 547 900

__________/ \________________________________

545 + 2 aa ------------------- «

735 + 15 aa

----------------------------------------------■

821 853 900

/X

________________________________________________/ N_____*

FIG. IB

261

8 8

3 218 i

266

GST_N GST_C

658 806 844 897

i________i

—( >900

MetRSIN2

1

273 283 263

593 597

Dominio

WHEP

FIG. 1C

262

imagen1

194

900

MetRS1c1

FIG. 2A

263

1J

8( ) 218

!_

GST.N

GST_C

266

658

806

844

897

i

—(>900

273 283

593 597

Dominio

WHEP

552

900

s + 586

900

846 900

MetRSt

MetRSI

MetRSI

C3

C4

05

FIG. 2B

264

.,8 80________218

GST.N GST_C

266 658

o co 3 844 897 —( >900

273 283 593 597

Dominio WHEP

773 900

•--------------■ MetRS1C2

900

FIG. 2C