ES2528663T3

ES2528663T3 - Composiciones de tirosil-ARNt sintetasa angiogénicas y procedimientos

Info

Publication number: ES2528663T3
Application number: ES06838844.6T
Authority: ES
Inventors: Xiang-Lei Yang
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2005-12-02
Filing date: 2006-12-01
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2026-12-01
Also published as: CN101336299B; EP1977004A4; US20120014938A1; EP1977004B1; US8481296B2; AU2006320361B2; CN101336299A; AU2006320361A1; EP1977004A2; JP5036725B2; CA2631765A1; WO2007064941A3; WO2007064941A2; JP2009519241A; CA2631765C; US20090110672A1; US8026088B2

Abstract

Variante polipeptídica de tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) aislada, que comprende: (a) una región de plegamiento de Rossmann o una porción de la misma que incluye una hélice α5; y (b) un dominio de reconocimiento de anticodón o una porción del mismo que incluye una hélice α14; en la que la variante tiene una identidad de secuencia de residuos de aminoácido de por lo menos el 50% en comparación con la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana (SEC ID nº: 3), incluye por lo menos una sustitución no conservativa de residuos de aminoácidos de un residuo de aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 46, 340 y 341 de la SEC ID nº: 3 y presenta una actividad angiogénica que es mayor que la actividad angiogénica de la TyrRS humana.

Description

Composiciones de tirosil-ARNt sintetasa angiogénicas y procedimientos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones de tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) angiogénicas. Más particularmente, esta invención se refiere a variantes de la proteína TyrRS angiogénicas y fragmentos angiogénicos de las mismas, y a su uso para la estimulación de la angiogénesis.

Antecedentes de la invención

Las aminoacil-ARNt sintetasas son enzimas esenciales que catalizan la adición de aminoácidos a sus ARNt afines, como primera etapa en la síntesis de proteína. Estas enzimas esenciales están separadas en dos clases en base a la presencia de motivos de secuencia únicos y a la estructura global de sus dominios catalíticos. Las sintetasas de Clase I tienen dos motivos de aminoácidos muy conservados en los dominios catalíticos de sus diez miembros, por ejemplo, las secuencias HIGH (SEC ID nº: 1) y KMSKS (SEC ID nº: 2). En contraste, las sintetasas de Clase II tienen tres motivos de secuencia muy degenerados, denominados motivos 1-3. Durante los últimos veinte años, varios roles adicionales para las ARNt sintetasas han sido descubiertos, incluyendo el splicing de ARN, la exportación nuclear y la regulación de la transcripción génica. Estas funciones adicionales han sido adquiridas durante la larga evolución de estas enzimas antiguas. Muchas de estas funciones adicionales son el resultado de dominios adjuntos que se han fusionado a las secuencias de sintetasa principales. En los eucariotas superiores, se ha demostrado que los dominios adjuntos de dos sintetasas tienen roles biológicos funcionales no relacionados con la función de la enzima principal. Por ejemplo, se ha demostrado que fragmentos de dos ARNt sintetasas humanas, por ejemplo, la tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) y la triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS), tienen actividades de tipo citoquina. Dos fragmentos relacionados de la TrpRS humana, conocidos como mini-TrpRS y T2-TrpRS, son reguladores negativos de la angiogénesis. La TyrRS humana (SEC ID nº: 3) puede separarse fácilmente en dos fragmentos activos. Un fragmento de dominio adjunto C-terminal tiene una actividad similar a la citoquina proinflamatoria polipéptido II activador del monocito endotelial (EMAP II), mientras que un fragmento N-terminal (mini-TyrRS, residuos 1-364 de SEC ID nº: 3) induce la angiogénesis.

La angiogénesis es un proceso estrechamente regulado en el que debe mantenerse un meticuloso balance entre factores proangiogénicos y antiangiogénicos. La perturbación de este balance, que conlleva un excesivo o insuficiente crecimiento de vasos sanguíneos, está asociada con enfermedades como la degeneración macular relacionada con la edad, la artritis reumatoide, curación retardada de heridas, así como muchas otras condiciones. La regulación está controlada a través de una variedad de procesos que incluyen un control transcripcional y traduccional, modificaciones postraduccionales y procesamiento de ligando. Otras citoquinas proangiogénicas, incluyendo el factor alfa de necrosis tumoral y el factor de crecimiento de hepatocitos, se generan por división de proteínas precursoras. De forma similar, la división mediante proteasas libera fragmentos de citoquinas a partir de la TrpRS y la TyrRS humanas.

Las enzimas TrpRS y TyrRS de los eucariotas superiores están compuestas por una región central catalítica que incluye un plegamiento de Rossmann que tiene varias hélices alfa intercaladas en segmentos de hoja beta. El dominio catalítico de plegamiento de Rossmann de la TyrRS humana (residuos 1 a 230 de SEC ID nº: 3) incluye una fijación por puente de hidrógeno de la hélice α5 del dominio de plegamiento de Rossmann y la hélice α14 del dominio de reconocimiento de anticodón (ver Fig. 3, Panel Inferior, y Fig. 4 Panel Superior). La fijación bloquea parcialmente el motivo Glu-Leu-Arg (ELR) en la hélice α5 del dominio de sitio activo de la proteína.

Los dominios catalíticos de la TyrRS y la TrpRS humanas son cada uno homólogos a los dominios catalíticos de sus respectivas enzimas bacterianas y de eucariotas inferiores correspondientes, adjuntos a una extensión C-terminal o N-terminal, respectivamente. La extensión C-terminal de la TyrRS humana comparte aproximadamente 51% de identidad de secuencia con la citoquina proinflamatoria EMAP II. En cada caso, las enzimas de longitud completa son inactivas como citoquinas pero funcionales como sintetasas. Cuando las extensiones únicas de eucariotas superiores se eliminan, las enzimas se vuelven citoquinas activas capaces de controlar la angiogénesis.

Actualmente, se ha descubierto que abriendo la separación entre la hélice α5 del dominio catalítico de plegamiento de Rossmann y la hélice α14 del dominio de reconocimiento de anticodón con respecto a la separación de estas hélices en la TyrRS humana nativa, se transforma la proteína en angiogénica. La presente invención se refiere a variantes de la proteína TyrRS y fragmentos de las mismas, que son útiles para estimular la angiogénesis en tejidos de mamífero.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a variantes polipeptídicas de TyrRS biológicamente activas y fragmentos angiogénicos de las mismas (colectivamente denominados en la presente memoria “variantes polipeptídicas de TyrRS”) que son adecuados para estimular la angiogénesis en tejidos de mamífero. Las variantes polipeptídicas de

tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) aisladas de la invención comprenden una región de plegamiento de Rossmann o una porción de la misma; un dominio de reconocimiento de anticodón o una porción del mismo; e incluyen por lo menos una sustitución no conservativa de un residuo de aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 46, 340 y 341 de la TyrRS humana (SEC ID nº: 3). Las variantes presentan una actividad que es mayor que la actividad angiogénica de la TyrRS humana nativa. Las variantes polipeptídicas de TyrRS de la invención tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 50% comparado con la secuencia de residuos de aminoácidos de la TyrRS humana (SEC ID nº: 3), más preferentemente de por lo menos 80% de identidad de secuencia y aún más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia comparado con SEC ID nº: 3.

La región de plegamiento de Rossmann o una porción de la misma incluye una hélice α5, y el dominio de reconocimiento de anticodón o una porción del mismo incluye una hélice α14.

En una forma de realización, dicha por lo menos una sustitución no conservativa de un residuo de aminoácido con respecto a la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana abre la separación entre la hélice α5y la hélice α14, con respecto a la separación de la hélice α5 y la hélice α14 en la TyrRS humana nativa. Preferentemente, la hélice α14 se separa de por lo menos 6 angstroms de la hélice α5 en la estructura terciaria de la variante, según lo determinado por la separación espacial entre el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α14 y el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α5. Preferentemente, la variante está libre de puentes de hidrógeno entre la hélice α5 y la hélice α14.

En otra forma de realización específica de la variante polipeptídica de TyrRS de la invención, la hélice α5 incluye un motivo ELR, y la hélice α14 está espaciada por lo menos 6 Ángstrom del motivo ELR de la hélice α5 en la estructura terciaria de la variante, según lo determinado por la separación espacial entre el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α14 y el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α5. La variante presenta un motivo ELR expuesto en una porción externa de la estructura terciaria del polipéptido.

En una forma de realización, dicha por lo menos una sustitución no conservativa de un residuo de aminoácido con respecto a la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana evita la formación de una fijación por puentes de hidrógeno entre el motivo ELR de la hélice α5 y los residuos de aminoácido de la hélice α14 de la variante polipeptídica de TyrRS que resulta en la exposición del motivo ELR en la estructura terciaria de la variante.

Una sustitución particularmente preferida es el reemplazo del aminoácido correspondiente a la tirosina en posición 341 de SEC ID nº: 3 por un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral alifática, preferentemente una cadena lateral alifática no polar, como un residuo de alanina.

Las variantes polipeptídicas de TyrRS de la invención son adecuadas para estimular la angiogénesis en tejidos de mamífero (por ejemplo, humano).

La presente invención también se refiere a las variantes polipeptídicas de TyrRS de la invención para su uso en la estimulación de la angiogénesis y de la migración de células endoteliales en un tejido de un mamífero poniendo en contacto el tejido con una variante polipeptídica de TyrRS de la invención.

Breve descripción de los Dibujos

La Fig. 1 muestra la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana (SEC ID nº: 3).

La Fig. 2 muestra la secuencia de residuos de aminoácido de una variante de TyrRS humana de la invención preferida (SEC ID nº: 4).

La Fig. 3 muestra un diagrama esquemático de la secuencia de la TyrRS humana de tipo salvaje, que está compuesta por 3 dominios: el dominio catalítico de plegamiento de Rossmann (residuos 1-230), el dominio de reconocimiento de anticodón (residuos 231-364) y el dominio C-terminal (residuos 364-528). Los dos primeros dominios forman la enzima principal activa, que se denomina mini TyrRS (residuos 1-364). El Panel Inferior muestra un modelo dimérico de la TyrRS humana basado en estructuras cristalina de ambos, de mini TyrRS y del dominio Cterminal, que fueron determinadas experimentalmente.

La Fig. 4 (Panel Superior) muestra detalles de la interacción de la región ELR con otros residuos, incluyendo Y341. El Panel Inferior muestra el alineamiento de secuencia parcial de la TyrRS de un rango de organismos en el cual los residuos correspondientes a las tres regiones de la TyrRS humana están alineados, por ejemplo, residuos 39-55 (Región 1), residuos 87-97 (Región 2) y residuos 337-346 (Región 3). Los residuos conservados, implicados en los contactos entre dominios, están resaltados. La Fila 1 incluye residuos de aminoácido de la TyrRS humana en la que la Región 1 corresponde con SEC ID nº: 5, la Región 2 corresponde con SEC ID nº: 6 y la Región 3 corresponde con SEC ID nº: 7. La Fila 2 muestra el alineamiento de la TyrRS murina, en la que la Región 1 corresponde con SEC ID nº: 5, la Región 2 corresponde con SEC ID nº: 6 y la Región 3 corresponde con SEC ID nº 7, como en la TyrRS humana. La Fila 3 muestra el alineamiento de la TyrRS bovina en la que la Región 1 corresponde con SEC ID nº: 5,

la Región 2 corresponde con SEC ID nº: 8 y la Región 3 corresponde con SEC ID nº 9. La Fila 4 muestra el alineamiento de la TyrRS de Drosophila melanogaster en la que la Región 1 corresponde con SEC ID nº: 5, la Región 2 corresponde con SEC ID nº: 10 y la Región 3 corresponde con SEC ID nº 11. La Fila 5 muestra el alineamiento de la TyrRS de Caenorhabditis elegans en la que la Región 1 corresponde con SEC ID nº: 12, la Región 2 corresponde con SEC ID nº: 13 y la Región 3 corresponde con SEC ID nº 14. La Fila 6 muestra el alineamiento de la TyrRS de Saccharomyces cerevisiae en la que la Región 1 corresponde con SEC ID nº: 15, la Región 2 corresponde con SEC ID nº: 16 y la Región 3 corresponde con SEC ID nº 17. La Fila 7 muestra el alineamiento de la TyrRS de Saccharomyces pombe en la que la Región 1 corresponde con SEC ID nº: 18, la Región 2 corresponde con SEC ID nº: 19 y la Región 3 corresponde con SEC ID nº 20. La Fila 8 muestra el alineamiento de la TyrRS de Escherichia coli en la que la Región 1 corresponde con SEC ID nº: 21, la Región 2 corresponde con SEC ID nº: 22 y la Región 3 corresponde con SEC ID nº 23. La Fila 9 muestra el alineamiento de la TyrRS de Bacillus subtilis en la que la Región 1 corresponde con SEC ID nº: 24, la Región 2 corresponde con SEC ID nº: 25 y la Región 3 corresponde con SEC ID nº 26.

La Fig. 5 muestra una distribución de difracción de rayos X para la TyrRS humana y la TyrRS-Y341A. Las funciones de distribución de distancias entre pares de electrones se calcularon para la TyrRS humana y para la mutación Y341A de la TyrRS utilizando sus gráficas de difracción de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) medidas. El Radio de Giro (Rg) y la Distancia máxima (Dmax) se calcularon para ambas moléculas. Y341A tiene un Rg que es aproximadamente 4 angstroms mayor, y una Dmax que es aproximadamente 20 angstroms mayor que los de la TyrRS de tipo salvaje.

La Fig. 6 ilustra esquemáticamente el efecto de apertura de la mutación Y341A en la estructura terciaria global de la TyrRS humana que expone el motivo ELR. Se demostró, mediante análisis SAXS y estudios de digestión por proteasas, que la mutación Y341A abre la estructura de la TyrRS tal como se muestra.

La Fig. 7 ilustra la actividad de la TyrRS-Y341A en el modelo de angiogénesis en Matrigel en ratón. Los ratones recibieron una inyección subcutánea de 400 µL de Matrigel reducido en factor de crecimiento solo o mezclado con 250 nM de proteínas TyrRS. Se utilizó VEGF165 (20 nM) humano como control positivo. Después de una incubación de 5 días, se inyectó lectina de unión a endotelio Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia I marcada con fluoresceína, isolectina B4 por vía intravenosa a los ratones. Los implantes fueron extirpados, disueltos y se evaluó su contenido en fluoresceína mediante espectrometría. Se observó que la variante TyrRS Y341A abierta tiene una actividad de angiogénica aumentada con respecto a la TyrRS de tipo salvaje.

La Fig. 8 ilustra la actividad de la TyrRS humana y de la TyrRS-Y341A en el ensayo en membrana corioalantoidea de pollo. La actividad angiogénica de las proteínas TyrRS se probó in vivo mediante el ensayo en membrana corioalantoidea de pollo. Las variantes de TyrRS (1 µM), un control positivo consistiendo en una combinación de VEGF y bFGF, así como un control negativo consistiendo de tampón solo, se aplicaron sobre la CAM en un implante de colágeno con una malla de nylon embebida.

La Fig. 9 muestra un gráfico del porcentaje de área (eje vertical) entre el área libre de células restante comparado con el área de la herida inicial en cultivos de células endoteliales heridos tratados con variantes de TyrRS de la invención y tratamientos control.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

Los residuos de aminoácido en proteínas se han clasificado de una gran variedad de formas, principalmente en base a las características físico-químicas impartidas por las cadenas laterales de los aminoácidos. Por ejemplo, una clasificación corriente incluye tres categorías de aminoácidos: (1) aminoácidos hidrofóbicos (no polares), incluyendo glicina, alanina, valina, fenilalanina, prolina, metionina, isoleucina y leucina; (2) aminoácidos cargados, incluyendo ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y arginina; y (3) aminoácidos polares, incluyendo serina, treonina, tirosina, histidina, cisteina, asparagina, glutamina y triptófano; la glicina se incluye a veces en su propia, cuarta categoría (ver Capítulo 1 de Branden y Tooze, Introduction to Protein Structure, Segunda Edición, Garland Publishing, Inc. 1998, páginas 3-12).

Los residuos de aminoácido pueden asimismo ser clasificados en base a si sus cadenas laterales son alifáticas o aromáticas, pequeñas o voluminosas, polares o no polares, cargadas o no cargadas, combinaciones de las mismas y similares. Tal como se utiliza en la presente memoria, los aminoácidos no polares alifáticos incluyen glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina y prolina; los aminoácidos voluminosos no cargados incluyen tirosina, triptófano, fenilalanina, leucina, isoleucina y metionina; los aminoácidos pequeños no polares incluyen glicina, alanina y prolina.

Tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, el término “no conservativa”, cuando se utiliza en relación con sustituciones de un residuo de aminoácido, significa la sustitución de un residuo de aminoácido en una proteína de tipo salvaje o natural por un residuo de aminoácido de una categoría estructural diferente, por ejemplo, que tenga una clasificación de polaridad significativamente diferente (por ejemplo, no polar versus polar), una clasificación de tamaño diferente, una clasificación de carga diferente, una combinación de las

anteriores, y similares. Por ejemplo, para una sustitución no conservativa, un aminoácido polar como la tirosina puede ser remplazado por un aminoácido no polar, un aminoácido relativamente pequeño no polar, y similares; mientras que un aminoácido pequeño no polar, como la glicina o la alanina, puede ser remplazado por un aminoácido voluminoso, un aminoácido cargado, y similares.

Una variante polipeptídica de TyrRS aislada preferida, como forma de realización de la presente invención, es adecuada para estimular la angiogénesis en tejidos de mamífero. La variante tiene una separación entre la hélice α5 y la hélice α14 en la variante, que es mayor que la separación entre la hélice α5 y la hélice α14 en la TyrRS humana nativa. Preferentemente, la hélice α14 está separada de la hélice α5 por al menos 6 angstroms en la estructura terciaria de la variante, según lo determinado por la separación espacial entre el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α14 y el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α5. La variante polipeptídica está preferentemente libre de puentes de hidrógeno entre la hélice α5 y la hélice α14. La variante polipeptídica de TyrRS tiene una identidad de secuencia de residuos de aminoácido de por lo menos 50% en comparación con la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana nativa (SEC ID nº: 3, Fig. 1), más preferentemente una identidad de secuencia de por lo menos 80%, aún más preferentemente una identidad de secuencia de por lo menos 95%. La variante incluye por lo menos una sustitución no conservativa de un residuo de aminoácido con respecto a la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana, que abre la separación entre la hélice α5 y la hélice α14, en comparación con la separación de la hélice α5 y la hélice α14 en la TyrRS humana nativa, y confiere una actividad angiogénica a la variante.

En otra forma de realización preferida de la invención, la variante de TyrRS de la invención comprende una región de plegamiento de Rossmann o una porción de la misma que presenta un motivo ELR expuesto en una porción externa de la estructura terciaria del polipéptido, y que tiene una identidad de secuencia de residuos de aminoácido de por lo menos 50% con respecto a la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana (SEC ID nº: 3), preferentemente una identidad de secuencia de por lo menos 80%, más preferentemente una identidad de secuencia de aproximadamente 95%. La variante polipeptídica de TyrRS incluye por lo menos una sustitución no conservativa de un residuo de aminoácido, con respecto a la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana, que expone el motivo ELR de la hélice α5 del dominio catalítico de plegamiento de Rossmann, haciendo que el polipéptido sea angiogénico. En las variantes de la invención, los residuos ELR de la hélice α5 están preferentemente espaciados de por lo menos aproximadamente 6 angstroms de los residuos de la hélice α14 en la estructura terciaria de la variante, según lo determinado por la separación espacial entre el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α14 y el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido del motivo ELR de la hélice α5.

Dicha por lo menos una sustitución no conservativa de un residuo de aminoácido es una sustitución de un residuo de aminoácido por lo menos en una o más posiciones correspondientes a los residuos de aminoácido 46, 340 y 341 de SEC ID nº: 3. Por ejemplo, la tirosina en la posición 341 de SEC ID nº: 3 está reemplazada preferentemente por un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral no polar (por ejemplo, un aminoácido alifático no polar, como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina y prolina). El residuo de aminoácido correspondiente a la glicina en la posición 46 y/o la alanina en la posición 340 de SEC ID nº: 3 está reemplazado preferentemente por una residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral voluminosa no polar (por ejemplo, un aminoácido voluminoso, no cargado hidrofóbico como tirosina, triptófano, fenilalanina, leucina, isoleucina o metionina). Tal como se utiliza en la presente memoria, una referencia a un aminoácido en una variante polipeptídica de TyrRS “correspondiente a” un residuo de aminoácido en una secuencia especificada, tal como SEC ID nº: 3, significa el aminoácido en una posición en la secuencia homóloga de la variante polipeptídica de TyrRS, que se alinea con (por ejemplo, corresponde a) la posición especificada en SEC ID nº: 3, cuando la secuencia homóloga se compara con la secuencia especificada. El experto en la materia en el campo de las proteínas entenderá que la numeración del residuo de aminoácido en la secuencia homóloga puede ser diferente de la numeración en la secuencia especificada (por ejemplo, SEC ID nº: 3).

En otra forma de realización, una variante polipeptídica de TyrRS aislada de la presente invención comprende una región de plegamiento de Rossmann o una porción de la misma que presenta un motivo ELR expuesto en una porción externa de la proteína o fragmento, y que tiene una identidad de secuencia de residuos de aminoácido de por menos 50% en comparación con la secuencia de residuos de aminoácidos de la TyrRS humana (SEC ID nº: 3). Preferentemente, la secuencia de residuos de aminoácido de la variante tiene una identidad de secuencia de por lo menos 80%, más preferentemente una identidad de secuencia de aproximadamente 95%, e incluye por lo menos un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral no polar en la posición correspondiente a la posición 341 de SEC ID nº: 3. Preferentemente, el residuo de aminoácido tiene una cadena lateral no polar alifática. Por ejemplo, el residuo de aminoácido de la variante correspondiente al residuo de tirosina 341 en la TyrRS humana puede ser un residuo de glicina, un residuo de alanina, un residuo de fenilalanina, un residuo de valina, un residuo de leucina, un residuo de isoleucina, un residuo de metionina o un residuo de prolina. En alguna forma de realización, el residuo de aminoácido correspondiente a la tirosina 341 de la TyrRS humana es un residuo de glicina, un residuo de alanina o un residuo de prolina, preferentemente un residuo de alanina.

En otra forma de realización preferida, la variante polipeptídica de TyrRS aislada comprende la secuencia de residuos de aminoácidos de SEC ID nº: 4 (Fig. 2) o un fragmento de la misma, en la que el residuo X en la posición

341 de SEC ID nº: 4 es un residuo de glicina, un residuo de alanina, un residuo de fenilalanina, un residuo de valina, un residuo de leucina, un residuo de isoleucina, un residuo de metionina o un residuo de prolina, preferentemente un residuo de glicina, un residuo de alanina o un residuo de prolina, más preferentemente un residuo de alanina. Preferentemente, la variante polipeptídica de TyrRS comprende la región N-terminal entera (por ejemplo, residuos 1341) de SEC ID nº: 4. Preferentemente, un fragmento incluye por lo menos los residuos de la cadena α5 de la región de plegamiento de Rossmann, por ejemplo, los residuos correspondientes a las posiciones 87 a 104 de SEC ID nº:

4. Más preferentemente, el fragmento comprende la región de plegamiento de Rossmann entera (residuos 1-230 de SEC ID nº: 4).

Una variante polipeptídica de TyrRS angiogénica de la invención particularmente preferida consiste en la secuencia de residuos de aminoácido de SEC ID nº: 4, en la que el residuo X en la posición 341 de SEC ID nº: 4 se selecciona de entre el grupo formado por un residuo de glicina, un residuo de alanina, un residuo de fenilalanina, un residuo de valina, un residuo de leucina, un residuo de isoleucina, un residuo de metionina y un residuo de prolina. Más preferentemente, el residuo X en posición 341 de SEC ID nº: 4 se selecciona de entre el grupo formado por un residuo de glicina, un residuo de alanina y un residuo de prolina, aún más preferentemente es un residuo de alanina.

La presente invención también se refiere a una variante polipeptídica de TyrRS de la invención para su uso en la estimulación de la angiogénesis en el tejido de un mamífero. El procedimiento comprende poner en contacto el tejido con una cantidad angiogénica de una variante polipeptídica de TyrRS de la invención tal como de describe en detalle en la presente memoria.

Además, la presente invención se refiere a una variante polipeptídica de TyrRS de la invención para su uso en un procedimiento de estimulación de la migración de células endoteliales en el tejido de un mamífero. El procedimiento comprende poner en contacto el tejido con una cantidad de una variante polipeptídica de TyrRS de la invención estimuladora de la migración de células endoteliales tal como se describe en detalle en la presente memoria.

Métodos y procedimientos

Construcción de plásmidos. Los plásmidos de TyrRS-Y341A y mini-TyrRS-Y341A se construyeron utilizando el kit de mutagénesis dirigida QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA). Los moldes fueron vectores pET20b(+) (Novagen, Masdison, WI) conteniendo la TyrRS de tipo salvaje y la mini TyrRS respectivamente.

Todas las proteínas se expresaron con una cola de histidinas (His-Tag) C-terminal para facilitar el aislamiento del polipéptido. Los oligonucleótidos sintéticos se adquirieron de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA).

Producción de proteína y eliminación de endotoxinas. Los polipéptidos recombinantes se expresaron en células de

E. coli Bl21-CodonPlus (DE3)-RIL (Stratagene, La Jolla, CA). Las células se crecieron hasta una OD600 de 0,8 y se indujeron durante 3 horas con 1 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (Roche, Basilea, Suiza). Las células fueron entonces peletizadas y resuspendidas en Tampón A (20 mM Tris-HCl, pH 7,9, 30 mM imidazol, 500 mM NaCl). Después de una lisis por sonicación, los restos celulares de separaron mediante centrifugación a 74.000 g durante 30 minutos. Los polipéptidos marcados con His-Tag se purificaron mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA. El sobrenadante se cargó en una columna de afinidad Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA), se lavó con 100 mL de Tampón B (Tampón A con 0,1% de Triton-X114 (Sigma, St. Louis, MO)) y 150 mL de Tampón A. Los polipéptidos se eluyeron con un gradiente lineal de Tampón A y Tampón C (20 mM Tris-HCl, pH 7,9, 250 mM imidazol, 500 mM NaCl). Se juntaron las fracciones conteniendo polipéptidos con una pureza >95%, se concentraron y se dializaron en tampón de almacenamiento (50% tampón salino fosfato, PBS, pH 7,4, 50% glicerol, 2 mM ditiotreitol, DTT). La concentración de proteínas se determinó mediante un ensayo de Bradford utilizando el reactivo de ensayo de Proteína de Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA) con albúmina de suero bovino (BSA, Sigma, St. Louis, MO) como estándar. La concentración de endotoxina se determinó utilizando el ensayo de lisado de amebocitos del Limulus (LAL) (BioWhittaker, Walkersville, MD).

Difracción de rayos X de ángulo pequeño. Mediciones de difracción de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) se realizaron para la TyrRS de tipo salvaje y la variante TyrRS-Y341A de la invención en la línea de luz 4-2 en el Laboratorio de Radiación Sincrotrón de Stanford (SSRL). Las curvas de difracción de rayos X se midieron para muestras a varias concentraciones (2-20 g/L). La longitud de onda de los rayos X (λ) fue de 1,38 Å y los números de canal del detector fueron convertidos a la transferencia de momentum Q=4π*sinθ/λ, en donde 2*θ es el ángulo de difracción. Se utilizaron dos distancias de muestra a detector diferentes para cubrir desde ángulos de difracción muy pequeños hasta ángulos de difracción medianos, por ejemplo, 2,5 metros cubriendo un rango de Q de aproximadamente 0,01-0,25 Å-1 y 0,5 metros para cubrir un rango de Q de aproximadamente 0,03-0,93 Å-1 .

Se llenó una cubeta de policarbonato con ventanas de mica con una alícuota de muestra y se mantuvo a 20ºC durante las mediciones. Se utilizó un detector MarCCD165 durante toda la recolección de datos. Un conjunto de datos típico consistió en 24 imágenes de difracción bidimensionales tomadas en series durante 10 segundos cada una. Las series de datos fueron procesadas junto con los correspondientes datos de difracción de los tampones, típicamente adquiridos inmediatamente después o antes de la medición de la solución de proteína. Se ajustó la escala de los datos respecto a la intensidad del haz de luz integrada, se promediaron azimutalmente, se inspeccionaron para cambios dependientes del tiempo y se analizaron estadísticamente. Durante el promediado se

permitieron variaciones estadísticas hasta 1,5 veces mayores en relación con la variación de los datos de los tampones correspondientes. Más allá de este nivel, cualquier conjunto de datos que mostrara un nivel de desviación superior con respecto al primer conjunto de datos de difracción de proteína fue rechazado. Las curvas de difracción de los tampones procesadas se sustrajeron de las correspondientes curvas de difracción de proteína después del procesado de los datos arriba mencionado.

El ajuste de escala para los datos de ángulo pequeño y de ángulo grande se realizó con el software PRIMUS (Konarev et al. 2003. “PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis”, J. Appl. Crystallogr. 36:1277-1282), que también fue utilizado para computar Rg e I(Q=0) mediante un diagrama de Guinier en el rango de Q*Rg de 0,45-1,3. La función de distribución de las distancias entre pares de electrones P(r) se obtuvo mediante una transformada indirecta de Fourier de los datos experimentales utilizando el programa de procesado de datos de difracción de ángulo pequeño GNOM de Svergun et al. (disponible en el sitio Web de emblhamburg(punto)de), inicialmente sólo con los datos de ángulo pequeño para obtener un estimado preciso de la distancia máxima (Dmax). Posteriormente, para la construcción del modelo, P(r) se recalculó incluyendo los datos de ángulo grande con los valores de Dmax especificados arriba.

Digestión por proteasa. La TyrRS de tipo salvaje y la TyrRS-Y341A se mezclaron con plasmina o elastasa de leucocito, con una proporción de proteína con respecto a proteasa de aproximadamente 32 µg por µg de plasmina, y 2500 µg por unidad para la elastasa. Las mezclas se incubaron a 20ºC durante aproximadamente 2 horas antes de parar las reacciones mediante la adición de ácido fórmico hasta una concentración final de 0,1%. Los fragmentos de rotura en las mezclas se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI TOF y por secuenciación N-terminal utilizando la degradación de Edman.

Ensayo de angiogénesis CAM. Los ensayos de angiogénesis en membrana corioalantoidea de pollo se realizaron mediante el siguiente procedimiento. Se incubaron huevos fertilizados, negativos para la prueba de fijación de complemento del virus de la leucosis aviar (COFAL) (Charles River Labs, Storrs, CT) durante 3,5 días a 38ºC / 60% de humedad. A continuación se abrieron los huevos y se transfirieron los embriones a navecillas de plástico estériles. Los embriones se cubrieron y se incubaron a 37,5ºC / 90% de humedad. Después de cinco días, se colocaron implantes de colágeno/malla conteniendo aproximadamente 30 µL de PBS, VEGF y bFGF (aproximadamente 0,15 y 0,5 µg, respectivamente) o polipéptidos TyrRS (1µM) sobre la membrana CAM de los embriones, y se incubaron durante 66 horas adicionales. Las capas superiores de la malla de los implantes se examinó bajo un microscopio estéreo y puntuada en función de la proporción de “cajas” (por ejemplo, regiones tridimensionales definidas por las fibras de la malla) que contienen un vaso sanguíneo con respecto al número total de cajas.

Ensayo de angiogénesis en Matrigel murino. Se implantaron de forma subcutánea, en ratones wehi atímicos, 400 µL de Matrigel desprovisto de factor de crecimiento (Becton Dickinson) suplementado con PBS, 20 nM VEGF o 250 nM de TyrRS, mini TyrRS, TyrRS-Y341A o mini TyrRS-Y341A. Cinco días después, se inyectó lectina de unión a endotelio Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia I marcada con fluoresceína, isolectina B4 (GSL-B4) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de forma intravenosa a los ratones. Los implantes de Matrigel se extirparon y se homogeneizaron en tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) (10 nM fosfato de sodio, pH 7,4, 150 nM cloruro de sodio, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoxicolato de sodio, 0,1% dodecilsulfato de sodio). Después de la homogeneización, se cuantificó el contenido de fluoresceína de cada implante mediante análisis espectrofotométrico.

Ensayo de migración de células endoteliales. Se sembraron células endoteliales de la vena del cordón umbilical humanas (HUVEC) (Cambrex) a una densidad de aproximadamente 3x105 células/pocillo de una placa de 6 pocillos en medio EGM (Cambrex) conteniendo 10% de suero fetal bovino (FBS) y se crecieron hasta obtener monocapas confluentes. Las células fueron privadas de suero en medio no conteniendo FBS durante 16 horas y heridas transversalmente a través del pocillo con una punta de pipeta. Las capas heridas se lavaron dos veces con medio libre de suero para eliminar los restos celulares, y se dejó que las células migraran en presencia y ausencia de variantes de TyrRS y de factores de control. Imágenes del área de la herida libre de células fueron tomadas a 0 y 6 horas tras la herida y se analizaron utilizando un software de análisis de imagen (NIH ImageJ 1.33). La migración de células endoteliales se calculó como el porcentaje del área libre de células restante en comparación con el área de la herida inicial, a partir del cual se determinó el porcentaje de área cerrada para cada condición.

Activación de aminoácidos. La activación de aminoácidos se probó mediante una reacción de intercambio de ATPpirofosfato (PPi). Las reacciones se llevaron a cabo a 37ºC en un tampón conteniendo Tris-HCl (100 mM, pH 7,8), KF (10 mM), MgCl2 (2 mM), ATP (1 mM), BSA (0,1 mg/mL), NaPPi (2 mM, 130 cpm/nmol), beta-mercaptoetanol (5 mM), tirosina (2 mM) y 200 nM del polipéptido.

Resultados y discusión

El residuo Y341 de TyrRS aseguró la estructura alrededor del motivo ELR. Se sabe que mini-TyrRS (por ejemplo, residuos de aminoácido 1-364 de la TyrRS humana), pero no la TyrRS de longitud completa, actúa como una citoquina proangiogénica. La actividad proangiogénica es dependiente de la presencia de un motivo ELR que también está presente en las quimioquinas CXC como IL-8, y es un requisito para su actividad. En el Panel Superior

de la Figura 3 se muestra una representación esquemática de la secuencia de aminoácidos de TyrRS que comprende 3 dominios, el dominio catalítico de plegamiento de Rossmann (amarillo, residuos 1-230), el dominio de reconocimiento de anticodón (verde, residuos 231-364) y el dominio C-terminal (violeta, residuos 364-528). Los dos primeros dominios forman la enzima principal activa que se denomina mini TyrRS (1-364). La estructura terciaria de mini-TyrRS, resuelta recientemente, revela una red de uniones de puente de hidrógeno alrededor del motivo ELR que sujeta los dominios de reconocimiento de anticodón y de sitio activo de la proteína (ver Figura 3, Panel Inferior). Hay dos interacciones por puente de hidrógeno entre la cadena lateral de R63 del motivo ELR y la cadena principal de A340 del dominio de reconocimiento de anticodón que sujetan la hélice α5 a la hélice α14. Adicionalmente, interacciones de apilamiento entre el anillo aromático de Y341 y la cadena principal de G46 crean un contacto entre estos dominios. De entre estos cuatro residuos, R93, G46 y Y341 están conservados en todas las proteínas TyrRS eucarióticas que han sido identificadas hasta la fecha. Como se muestra en la Figura 3 (Panel Inferior), la complementariedad de la superficie electroestática de cada fragmento proporciona una prueba de la sujeción entre la hélice α5 y la hélice α14. El motivo ELR (en la hélice α5) está enmascarado por el dominio C-terminal y está expuesto cuando el dominio C-terminal se elimina. Por esta razón, la mini TyrRS es activa, mientras que la TyrRS de longitud completa es inactiva en cuanto a angiogénesis. El residuo Tyr341 (en la hélice α14 del dominio de reconocimiento de anticodón) interacciona con el ELR y juega un papel importante sujetando el dominio C-terminal para bloquear el ELR. La A340 también está muy conservada, estando remplazada únicamente por otro aminoácido pequeño, la glicina, en S. cerevisiae.

Se utilizaron dos procedimientos independientes para demostrar la apertura de la estructura tridimensional de TyrRS debido a la mutación Y341A. El primer procedimiento fue la difracción de rayos X de ángulo pequeño (SAXS). Cuando la longitud de onda de la radiación electromagnética está en la misma escala que la de una partícula de la muestra, la partícula va a difractar la radiación. La detección y el análisis de esta difracción pueden proporcionar información valiosa sobre el tamaño, la forma y la estructura interna de la partícula. La técnica SAXS es una técnica poderosa para detectar cambios conformacionales globales en macromoléculas (como proteínas) en solución. A partir de las curvas de difracción medidas en ambas, la TyrRS humana de tipo salvaje y la mutación Y341A, la función de distribución de las distancias entre pares de electrones (Dmax) se calculó para cada muestra (Figura 5). Los valores del Radio de Giro (Rg) y de Distancia máxima (Dmax) se derivaron subsiguientemente de las funciones de distribución, P(r).

La Figura 4 muestra la sujeción por puente de hidrógeno entre R93 y Y341. La disrupción de la sujeción por puente de hidrógeno abre la estructura terciaria y expone el motivo ELR. Estudios de difracción de rayos X de ángulo pequeño en la TyrRS humana de tipo salvaje y en una variante en la que Y341 ha sido reemplazado por una alanina (TyrRS-Y341A) proporciona una prueba directa de tal apertura (ver Figura 5). Los estudios de difracción de rayos X mostraron que la distribución de las distancias entre pares de electrones se ensanchó en la variante con respecto a la proteína de tipo salvaje. La TyrRs Y341A tiene un Rg aproximadamente 4 angstroms mayor que el de la TyrRs de tipo salvaje, y una Dmax aproximadamente 20 angstroms mayor. Esto demuestra que la TyrRS Y341A tiene una conformación más abierta y más extendida con respecto a la TyrRS de tipo salvaje.

A partir de estudios de digestión utilizando plasmina y elastasa se obtuvo un sustento adicional para la hipótesis de una estructura abierta en la TyrRS-Y341A con respecto a la TyrRS humana de tipo salvaje. Generalmente, las proteasas cortan las proteínas en regiones de bucle flexibles en las que no hay definidas estructuras secundarias como hélices alfa o láminas beta. Las presencia de una apertura estructural para exponer el motivo ELR asociada con la mutación Y341A fue confirmada por los fragmentos de rotura adicionales que se observaron como resultado de sitio(s) de corte adicionales en la estructura abierta más relajada. Utilizando ambas, la plasmina y la elastasa de leucocito, se observaron sitios de corte adicionales en la mutación Y341A con respecto a la TyrRS de tipo salvaje. Los sitios de corte adicionales observados fueron L333, K334 y A337, todos ellos localizados en la hélice alfa 14 del dominio de reconocimiento de anticodón, cerca del sitio de mutación 341. Esto confirmó que en la mutación Y341A, alfa 14 está relajada y se presenta como un bucle flexible que ya no está unido a la región ELR. La Figura 6 ilustra esquemáticamente el efecto de apertura de la mutación Y341A sobre la estructura terciaria global de la TyrRS humana.

La mutación Y341A confirió una actividad angiogénica a la TyrRS de longitud completa. Y341 es una diana ideal para una mutación dada su conservación entre los eucariotas y su implicación en la estabilidad de la estructura terciaria en la región alrededor del motivo ELR. Este residuo se mutó a alanina en la TyrRS de longitud completa y en mini-TyrRS para determinar hasta que punto la disrupción de la fijación altera las actividades citoquina y enzimática. La actividad citoquina se probó en la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) y ensayos de angiogénesis en Matrigel.

La inclusión de la mutación Y341A en mini-TyrRS no produjo un efecto observable sobre su actividad en el ensayo CAM – la angiogénesis fue promovida por ambos, el polipéptido normal y la variante. La TyrRS humana de tipo salvaje y de longitud completa es inactiva en este ensayo. Sin embargo, la mutación de Y341A de la TyrRS humana a alanina (por ejemplo, TyrRS-Y341A) convirtió esta enzima en una citoquina proangiogénica. Para confirmar los resultados observados en el ensayo CAM, también se probaron los polipéptidos en el modelo de ratón con implantes de Matrigel. En este ensayo, un implante de colágeno o de otra proteína conteniendo PBS se inyectó de forma subcutánea. Cuando el implante contiene un factor proangiogénico, los vasos sanguíneos se extienden dentro del

implante. Mediante la inyección de una lectina de unión a células endoteliales fluorescente, la densidad de los vasos sanguíneos en cada implante puede ser cuantificada mediante análisis espectrofotométrico. En este modelo, VEGF y la mini-TyrRS fueron ambos positivos para actividad angiogénica. La TyrRS de tipo salvaje fue inactiva, con niveles de angiogénesis similares al PBS. En contraste, la TyrRS-Y341A indujo angiogénesis. Estos datos confirmaron de forma independiente los resultados de los ensayos CAM.

La variante de TyrRS que tiene la mutación Y341A provocó un aumento marcado de la vascularización del área de la membrana CAM que contenía el implante mientras que ni el polipéptido de tipo salvaje, ni el PBS, indujeron una respuesta (los polipéptidos se aplicaron a una concentración de 1 µM en un implante de colágeno con una malla de nylon embebida).

Asimismo, la Figura 7 caracteriza la actividad in vivo de los polipéptidos de TyrRS en el ensayo de implantes de Matrigel en ratón. Se administró a ratones una inyección de 400 µL de Matrigel desprovisto de factor de crecimiento solo o mezclado con 250 nM de proteína. Después de una incubación de cinco días, los implantes se retiraron y se evaluó la presencia de vasos sanguíneos. VEGF165 (20 nM) fue utilizado como control positivo. Como se ha reportado anteriormente, en este ensayo la mini-TyrRS promovió una respuesta angiogénica. La mutación de Y341 a alanina en la mini-TyrRS (por ejemplo, mini-TyrRS-Y341A) no afectó a esta respuesta. Sin embargo, cuando la mutación Y341 se realiza en la TyrRS de longitud completa, se notó un aumento del doble en la respuesta angiogénica en comparación con la TyrRS de tipo salvaje.

La mutación Y341A inactivó la habilidad de TyrRS de activar la tirosina. La activación de aminoácidos se evaluó mediante la medición de la reacción de intercambio de ATP-PPi dependiente de tirosina. Como se muestra en la Figura 8, la mutación puntual Y341A suprime la habilidad de la TyrRS de longitud completa, así como de mini-TyrRS, de formar el tirosil-adenilato. De este modo, los elementos estructurales que están implicados en la aminoacilación de ARNt son diferentes de los que están implicados en la función citoquina.

Se utilizó un ensayo de migración de células endoteliales para evaluar la habilidad de las variantes de TyrRS de la invención para estimular la migración de células endoteliales, que está asociada con la curación de heridas. Células endoteliales de la vena del cordón umbilical humanas (HUVECs) se sembraron en placa en medio EGM conteniendo 10% de FBS y se crecieron hasta obtener monocapas confluentes. Las células fueron privadas de suero en medio no conteniendo FBS y, posteriormente, se hirieron transversalmente a través del pocillo con una punta de pipeta. Las capas heridas se lavaron con medio libre de suero para eliminar restos celulares, y se dejó que las células migraran en presencia y ausencia de variantes TyrRS y de factores de control. Se tomaron imágenes del área libre de células a las 0 y 6 horas tras la herida y se analizaron utilizando un software de análisis de imagen (NIH ImageJ, versión 1.33). La migración de células endoteliales se calculó como porcentaje del área libre de células restante en comparación con el área de la herida inicial, a partir del cual se determinó el porcentaje de área cerrada para cada condición. La Figura 9 muestra un gráfico de los porcentajes (eje vertical) del área libre de células restante comparado con el área inicial de la herida en cultivos de células endoteliales heridos tratados con las variantes de TyrRS de la invención y con tratamientos control. Un porcentaje relativamente pequeño de área libre de células indica una migración de células endoteliales y una curación de la herida mejoradas. Como se muestra en la Figura 9, las variantes de TyrRS de la invención estimularon la migración de células endoteliales a un nivel comparable con la mini-TyrRS, y a un nivel superior que la TyrRS de tipo salvaje.

Listado de secuencias

<110> YANG, Xiang-Lei

5 <120> tirosil-ARNt sintetasa angiogénica Composiciones y procedimientos

<130> TSRI 1163.1 PCT

10 <150> US 60/741,580

<151> 2005-12-02

<160> 26

15 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 4

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 1 His Ile Gly His 1

25 <210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 2 Lys Met Ser Lys Ser 15

<210> 3 35 <211> 528

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4 5 <211> 528

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Variante de la TyrRS humana

<221> VARIANTE

<222> 341

<223> Xaa = Gly, Ala, Phe, Val, Leu, Ile, Met, o Pro

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 6

<210> 7 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 8

<211> 11

<212> PRT 30 <213> Bos taurus

35 <210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 10

<211> 11 45 <212> PRT

<213> Drosophila melanogaster

50

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Drosophila melanogaster

55

<210> 12 5 <211> 17

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<210> 13

<211> 11

<212> PRT 15 <213> Caenorhabditis elegans

20 <210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<210> 15

<211> 17 30 <212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

35

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

40

<400> 16

<210> 17 45 <211> 10

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<210> 18

<211> 17

<212> PRT 55 <213> Saccharomyces pombe

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> Saccharomyces pombe

<210> 20

<211> 10

<212> PRT 15 <213> Saccharomyces pombe

20 <210> 21

<211> 18

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<210> 22

<211> 11 30 <212> PRT

<213> Escherichia coli

35

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Escherichia coli

40

<400> 23

<210> 24 45 <211> 18

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<210> 25

<211> 11

<212> PRT 55 <213> Bacillus subtilis

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

Claims

REIVINDICACIONES

1. Variante polipeptídica de tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) aislada, que comprende:

5 (a) una región de plegamiento de Rossmann o una porción de la misma que incluye una hélice α5;

y

(b) un dominio de reconocimiento de anticodón o una porción del mismo que incluye una hélice α14;

10 en la que la variante tiene una identidad de secuencia de residuos de aminoácido de por lo menos el 50% en comparación con la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana (SEC ID nº: 3), incluye por lo menos una sustitución no conservativa de residuos de aminoácidos de un residuo de aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 46, 340 y 341 de la SEC ID nº: 3 y presenta una actividad

15 angiogénica que es mayor que la actividad angiogénica de la TyrRS humana.
2. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 1, que incluye un residuo de aminoácido no polar en la posición correspondiente al residuo 341 de la SEC ID nº: 3.

20 3. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 1, que incluye un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral voluminosa no polar en la posición correspondiente a la posición 46 de la SEC ID nº: 3.
4. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 1, que incluye un residuo de aminoácido que tiene una

cadena lateral voluminosa no polar en la posición correspondiente a la posición 340 de la SEC ID nº: 3. 25
5. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 2, en la que la hélice α5 incluye un motivo ELR, cuyo motivo ELR está espaciado por lo menos aproximadamente 6 angstroms de la hélice α14 en la estructura terciaria de la variante, según lo determinado por la separación espacial entre el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α14 y el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido del motivo ELR de la hélice α5;

30 y en la que la variante presenta un motivo ELR expuesto en una porción externa de la estructura terciaria del polipéptido.
6. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 5, en la que el residuo de aminoácido no polar tiene una

cadena lateral alifática. 35
7. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 5, en la que el residuo de aminoácido no polar se selecciona de entre el grupo formado por un residuo de glicina, un residuo de alanina, un residuo de fenilalanina, un residuo de valina, un residuo de leucina, un residuo de isoleucina, un residuo de metionina y un residuo de prolina.

40 8. Variante polipeptídica de TyrRS según las reivindicaciones 1 o 5, en la que la variante tiene una identidad de secuencia de residuos de aminoácido de por lo menos 80% en comparación con la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana (SEC ID nº: 3).
9. Variante polipeptídica de TyrRS según las reivindicaciones 1 o 5, en la que la variante tiene una identidad de

45 secuencia de residuos de aminoácido de por lo menos 95% en comparación con la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana (SEC ID nº: 3).
10. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de residuos de aminoácido de SEC ID nº: 4 o un fragmento de la misma, incluyendo por lo menos los residuos 1 a 364 de SEC ID

50 nº: 4, siendo el residuo X en la posición 341 de SEC ID nº: 4 seleccionado de entre el grupo formado por un residuo de glicina, un residuo de alanina, un residuo de valina, un residuo de leucina, un residuo de isoleucina, un residuo de metionina y un residuo de prolina.
11. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de residuos de

55 aminoácidos de SEC ID nº: 4, siendo el residuo X en la posición 341 de SEC ID nº: 4 seleccionado de entre el grupo formado por un residuo de glicina, un residuo de alanina, un residuo de fenilalanina, un residuo de valina, un residuo de leucina, un residuo de isoleucina, un residuo de metionina y un residuo de prolina.
12. Variante polipeptídica de TyrRS según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en la estimulación 60 de la angiogénesis en un tejido de un mamífero.
13. Variante polipeptídica de TyrRS según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el favorecimiento de la migración de células endoteliales en un tejido de un mamífero.