ES2649862T3 - Sistemas y procedimientos de producción de proteínas - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de aumento del rendimiento de una proteína de interés en una célula animal o vegetal que comprende la transfección o la transducción de dicha célula con al menos un casete de expresión recombinante que codifica dicha proteína de interés; y al menos otro casete de expresión recombinante que codifica: (i) una proteína XBP1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 o un fragmento de la misma, en el que dicha proteína o fragmento de la misma se une a un elemento RPD (ERPD) o a un elemento de respuesta al estrés del RE (ERERE) de dicha célula; o (ii) una proteína ATF6 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o los restos de aminoácidos 1- 366 de SEQ ID NO:9, en el que dicha proteína se une a un elemento RPD (ERPD) o a un elemento de respuesta al estrés del RE (ERERE) de dicha célula; en el que la relación entre el número total de dicho al menos un casete de expresión recombinante y el número total de dicho al menos otro casete de expresión recombinante es al menos 3:1.
Description
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25
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55
otra por tener una secuencia conservada como se ilustra en SEQ ID NO:4 (TGACGTGA).
Las secuencias codificantes de la proteína XBP1 pueden ser obtenidas a partir de una variedad de fuentes. Por ejemplo, las secuencias codificantes para las proteínas XBP1 de humano, ratón, rata, pollo, mosca de la fruta y pez cebra se pueden obtener de la base de datos de nucleótidos Entrez en el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (CNIB) (Bethesda, Md.). Estas secuencias tienen números de acceso a Entrez NM_005080, NM_013842, NM _001004210, NM_001006192, NM_079983 o NM_131874, respectivamente.
Un fragmento biológicamente activo de una proteína XBP1 retiene al menos una porción sustancial de la actividad de activación de la transcripción de la proteína XBP1p. Por ejemplo, un fragmento de XBP1 empleado en la invención puede retener al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o más de la actividad de activación de la transcripción de XBP1p. Los fragmentos de XBP1 activos transcripcionalmente pueden ser seleccionados por numerosos medios. En un ejemplo, se selecciona un fragmento de XBP1 transcripcionalmente activo en base a su capacidad para activar la transcripción de genes corriente abajo de una secuencia ERERE o ERPD.
En otra realización, la proteína ATF6 o un fragmento biológicamente activo de la misma se utiliza para mejorar el rendimiento de una proteína de interés en las células huésped. ATF6 es una proteína transmembranal que incluye un dominio de “detección”, ubicado en el lumen del RE y un dominio de transactivación de la transcripción citosólica. Tras el estrés del RE, el dominio citosólico de ATF6 se escinde y se transporta al núcleo en el que se une a las secuencias ERERE y de este modo activa los genes de RPD aguas abajo. Al menos dos proteínas ATF6 han sido identificadas, a saber, ATF6α y ATF6β. ATF6α y ATF6β están estructuralmente relacionadas y comparten similitud significativa en sus dominios b-zip. Las secuencias de codificación a modo de ejemplo para proteínas ATF6 de humano, ratón, ovejas y pollo tienen números de acceso a Entrez NM_007348, XM_129579, AY942654 y XM_422208, respectivamente.
De manera similar a los fragmentos XBP1 empleados en la invención, un fragmento biológicamente activo de una proteína ATF6 retiene al menos una poción sustancial de la actividad de activación de la transcripción de la proteína ATF6 activada o su dominio citosólico. Un fragmento de ATF6 biológicamente activo se puede seleccionar mediante el control de su unión a una secuencia ERERE y la capacidad del fragmento para activar la transcripción de genes corriente abajo de la secuencia ERERE.
En otra realización, una enzima o chaperona de procesamiento residente en RE se utiliza para aumentar el rendimiento de una proteína de interés en las células huésped. Ejemplos de enzimas/chaperonas ubicadas en el RE adecuados incluyen, entre otros, GRP78, GRP94, GRP58, la proteína disulfuro isomerasa, calnexina y calrecticulina. En un ejemplo, la contraparte endógena de una enzima (o chaperona) del RE empleada en la presente invención tiene una región promotora que incluye una o más secuencias ERERE-I o ERERE-II. En otro ejemplo, la contraparte endógena de una enzima (o chaperona) del RE empleada en la presente invención tiene una región promotora que incluye una o más secuencias ERPD.
La presente divulgación también presenta el uso de un componente de RPD que es una variante de una proteína endógena. Una variante de un componente de RPD endógeno puede ser de origen natural, tal como mediante la variación alélica o polimorfismo o modificada por ingeniería genética deliberadamente. La actividad de RPD de una variante no disminuye esencialmente en comparación con la proteína original (p. ej., una XBP1p, una proteína ATF6 transcripcionalmente activa o un fragmento biológicamente activo de la misma). En muchas realizaciones, las variantes empleadas en la presente invención retienen al menos el 50 % de la actividad de RPD de las proteínas originales correspondientes. Por ejemplo, una variante puede retener al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %
o 100 % de la actividad de RPD de la proteína original. En una realización, una variante empleada en la presente invención exhibe una actividad aumentada de RPD en comparación con la proteína original. Una variante deseable de un componente de RPD puede seleccionarse de manera que la expresión o la activación de la variante potencie la secreción de una proteína co-transfectada en las células huésped.
La secuencia de aminoácidos de una variante es esencialmente idéntica a la de la proteína original. En muchos casos, la secuencia de aminoácidos de una variante tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia global o similar a la proteína original. La identidad de secuencia o similitud puede ser determinada por una variedad de procedimientos. En una realización, la identidad o similitud de secuencia se determina usando un algoritmo de alineamiento de secuencias. Los algoritmos adecuados para este fin incluyen, entre otros, la herramienta básica de búsqueda por alineamiento local (BLAST) descrita en Altschul, y col., J. MOL. BIOL., 215:403410 (1990), el algoritmo de Needleman, y col, J. MOL. BIOL., 48:444-453 (1970), el algoritmo de Myers y Miller, COMPUTER. APPLE. BIOSCI., 4:11-17 (1988), y el análisis de la matriz de puntos. Los programas informáticos adecuados para este fin incluyen, entre otros, los programas BLAST proporcionados por CNIB, MegAlign proporcionado por DNASTAR (Madison, WI), y el programa GAP de Genetics Computer Group (GCG) (algoritmo de Needleman-Wench). Para el programa GAP, se pueden utilizar valores por defecto (p. ej., la penalización por apertura de huecos en una de las secuencias es 11 y por extensión de huecos es 8). Aminoácidos similares pueden ser definidos por la matriz de sustitución BLOSSOM.
Existen numerosos procedimientos disponibles para la preparación de una variante deseable de un componente de RPD. Por ejemplo, una variante puede derivarse de la proteína original en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 o más
sustituciones, deleciones, inserciones, u otras modificaciones de aminoácidos. Las sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras. En muchos casos, las sustituciones conservativas de aminoácidos se pueden introducir en una secuencia de proteínas sin cambiar significativamente la estructura o la actividad biológica de la proteína. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden efectuarse sobre la base de similitud de 5 polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, pueden efectuarse sustituciones conservadoras de aminoácidos entre aminoácidos con cadenas laterales básicas, tales como lisina (Lys o K), arginina (Arg o R) e histidina (His o H); aminoácidos con cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico (Asp o D) y ácido glutámico (Glu o E); aminoácidos con cadenas laterales polares sin carga, tales como asparagina (Asn o N), glutamina (Gln o Q), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), y tirosina (Tyr o Y); o
10 aminoácidos con cadenas laterales no polares, tales como alanina (Ala o A), glicina (Gly o G), valina (Val o V), leucina (Leu o L), isoleucina (Ile o I), prolina (Pro o P ), fenilalanina (Phe o F), metionina (Met o M), triptófano (Trp o W) o cisteína (Cys o C). Ejemplos de sustituciones de aminoácidos comúnmente utilizados se ilustran en la Tabla 1.
Tabla 1. Ejemplo de sustituciones de aminoácidos
- Residuos originales
- Sustituciones a modo de ejemplo Sustituciones más conservadoras
- Ala (A)
- Val, Leu, Ile Val
- Arg (R)
- Lys, Gln, Asn lista
- Asn (N)
- Gln Gln
- Asp (D)
- Glu Glu
- Cys (C)
- Ser, Ala Ser
- Gln (Q)
- Asn Asn
- Gly (G)
- Pro, Ala Ala
- His (H)
- Asn, Gln, Lys, Arg Arg
- Ile (I)
- Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu
- Leu (L)
- Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile
- Lys (K)
- Arg, ácido 1,4 diamino-butírico, Gln, Asn Arg
- Met (M)
- Leu, Phe, Ile Leu
- Phe (F)
- Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu
- Pro (P)
- Ala Gly
- Ser (S)
- Thr, Ala, Cys Thr
- Thr (T)
- Ser Ser
- Trp (W)
- Tyr, Phe Tyr
- Tyr (Y)
- Trp, Phe, Thr, Ser Phe
- Val (V)
- Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu
15 Otras sustituciones deseables de aminoácidos también se pueden introducir en un componente de RPD. Por ejemplo, la sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un componente de RPD para aumentar su estabilidad. Para otro ejemplo, la sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden introducirse para aumentar o disminuir la actividad de RPD de un componente de RPD.
Además, la presente divulgación presenta el uso de polipéptidos que pueden unirse a las secuencias ERPD o
20 ERERE de las células huésped. Estos polipéptidos, solos o en combinación con otra proteína o proteínas, pueden funcionar como factores de transcripción para activar la transcripción de los genes que tienen las regiones promotoras ERPD o ERERE.
C. Casetes de expresión recombinantes y células huésped
Un casete de expresión recombinante típico empleado en la presente invención comprende una secuencia
25 codificante de la proteína unida operativamente a una región reguladora no traducida en 5ʼ y a una región reguladora no traducida en 3ʼ. La secuencia codificante de la proteína puede ser una secuencia genómica, una secuencia de ADNc, una combinación de las mismas u otras secuencias expresables.
En una realización, un casete de expresión recombinante incluye todos los elementos reguladores necesarios para dirigir la expresión de la proteína codificada. Los ejemplos de elementos reguladores no traducidos en 5ʼ adecuados
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farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o modelos de animales experimentales. Por ejemplo, se pueden determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación de DL50/DE50. En muchos casos, se seleccionan proteínas terapéuticas que exhiben grandes índices terapéuticos.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificaciones para su uso en seres humanos. En una realización, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo que exhibe eficacia terapéutica en al menos 50 % de la población con escasa o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada.
El régimen de dosificación para la administración de una proteína terapéutica producida por la presente invención puede ser determinada por el médico tratante en base a varios factores tales como la acción de la proteína, el sitio de la patología, la gravedad de la enfermedad, la edad del paciente, el sexo y la dieta, la gravedad de cualquier inflamación, el tiempo de administración y otros factores clínicos. En un ejemplo, la administración sistémica o inyectable se inicia con una dosis que es mínimamente efectiva, y la dosis se aumenta durante un transcurso temporal pre-seleccionado hasta que se observa un efecto positivo. Posteriormente, los aumentos graduales en la dosificación se limitan a niveles que producen un aumento correspondiente en efecto, teniendo en cuenta que puede aparecer cualquier efecto adverso.
El progreso de un tratamiento se puede controlar mediante la evaluación periódica de una progresión de la enfermedad. El progreso puede monitorizarse, por ejemplo, por rayos X, IRM u otras modalidades de formación de imágenes, análisis de líquido sinovial o examen clínico.
Una proteína terapéutica o profiláctica de interés también se puede introducir en un humano o animal mediante el uso de un vector de administración de genes. Los vectores adecuados para este fin incluyen, entre otros, vectores virales tales como vectores de retrovirus, lentiviral, adenoviral, viral adenoasociado (AAV), herpes viral, alfavirus, astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus o togavirus. Los vectores de expresión encapsulados en liposomas también se pueden utilizar para la administración génica. En muchas realizaciones, el vector de administración de genes codifica tanto la proteína de interés como un modulador de RPD. La co-expresión del modulador de RPD potencia la producción de la proteína de interés en las células objetivo (p. ej., células tumorales u otras células disfuncionales). La proteína de interés y el modulador de RPD también se pueden administrar a las células objetivo mediante el uso de diferentes vectores. La administración de genes puede llevarse a cabo in vivo o ex vivo.
En una realización, se emplean procedimientos de administración de genes específicos de células para la introducción de una proteína terapéutica/profiláctica de interés o un modulador de RPD en las células objetivo. Muchos procedimientos de administración de genes específicos de células conocidos en la técnica se pueden usar para la presente invención. Por ejemplo, un ligando específico de célula (p. ej., un anticuerpo específico a un antígeno de superficie de la célula objetivo) se puede incorporar o conjugar en la envoltura de un vector viral que codifica una proteína terapéutica/profiláctica o un modulador de RPD. Este ligando puede mediar la entrada del vector viral en un tipo celular específico. Los liposomas conjugados con anticuerpo también se pueden utilizar para la administración de vectores de terapia génica a células objetivo específicas.
Queda entendido que las realizaciones descritas anteriormente y los siguientes ejemplos se dan a modo de ilustración, no de limitación. Diversos cambios y modificaciones dentro del ámbito de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la presente descripción.
E. Ejemplos
Ejemplo 1. Estirpes celulares COS-1 y DUKX
Las células COS-1 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (CACT), Manassas, VA, con el número CACT CRL-1650. Las células CHO DUKX y las células PA DUKX se derivaron de CHO-K1 (número CACT CCL-61), que es un derivado de células de ovario de hámster chino (CHO).
Las células CHO DUXK, que también se refieren como células DUXK B11 o DXB11, son deficientes en la producción de la dihidrofolato reductasa (dhfr), una enzima crítica en el proceso de replicación del ADN. Para seleccionar células en las que ambos alelos de dhfr fueron mutados, Urlaub y Chasin, PROC. NATL. ACAD. SCI. EE.UU., 77:4216-4220 (1980), llevaron a cabo la mutagénesis y la selección en dos etapas. El agente selectivo utilizado contra células dhfr+ era desoxiuridina tritiada. La desoxiuridina tritiada es tóxica para las células debido a su incorporación en el ADN y la desintegración radiactiva posterior. La incorporación de desoxiuridina en ADN requiere su conversión a ácido timilídico, un proceso para el que DHFR es esencial. Las células mutantes dhfr-no son capaces de incorporar desoxiuridina en su ADN y por lo tanto son capaces de sobrevivir en presencia de desoxiuridina tritiada. Una determinada cantidad de células dhfr+, así como mutantes deficientes en alguna otra enzima necesaria para la incorporación de desoxiuridina en ADN, puede sobrevivir también. Los mutantes dhfr-se pueden distinguir ya que no son capaces de llevar a cabo la biosíntesis de glicina de novo, hipoxantina y timidina;
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Ejemplo 2. Inducción de estrés del RE por la sobreexpresión de BMP6 en células PA DUKX
El vector pSMED2/XBP1 y pSMED2/BMP6 (+) o pSMED2 vacío (-) se co-transfectaron en células PA DUKX. Los vectores de expresión pSMED2/XBP1 y pSMED2/BMP6 codifican XBP1 y BMP6, respectivamente. Ambos vectores son estimulados por un promotor CMV. Las transfecciones se llevaron a cabo en placas de 6 pocillos usando Fugene6 (Roche, Indianápolis, IN). El medio de crecimiento para las células fue el medio Alfa (Gibco) suplementado con nucleósidos y SFB al 10 % (inactivado por calor y dializado) y penicilina/estreptomicina/glutamina (Gibco).
Las células se lisaron en tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) con la adición de NaCl 400 mM y 1 Complete Mini (un comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa de Roche, Indianápolis, IN). Los lisados se recogieron a los 7, 24, 31 y 48 h después de la transfección y se ejecutaron en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western (Figura 1). El análisis de membrana Western se realizó usando un tampón de bloqueo de leche en polvo sin grasa al 4 %, ASB al 1 % y Tween 20 al 0,1 % en TFS, y un tampón de lavado de 0,1 % de Tween 20 en TFS. Los anticuerpos se diluyeron en el tampón de bloqueo. La titulación para Western fue anti-XBP1 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology) seguido de anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante 1:5000 (The Jackson Laboratory). La Figura 1 indica que la sobreexpresión de BMP6 en células PA DUKX causó estrés del RE, tal como se mide por el aumento de la proteína XBP1p (aproximadamente 54 kD).
Ejemplo 3. Estirpes celulares transfectadas de manera estable con XBP1
El vector pSMED2/XBP1 se transfectó en células CHO DUKX para crear estirpes celulares estables. El gen DFHR en el vector pSMED2 permite la resistencia a metotrexato (MTX). Las células transfectadas se sembraron en placas en concentraciones de MTX 5, 10, o 20 nM. Se aislaron tres colonias de MTX 5nM (5-2, 5-4, 5-5), una colonia 10 nM (10-3), y una colonia 20 nM (20-10). Las células de cada colonia se trataron con (+) o sin (-) tunacimicina (Tu), una sustancia química conocida por causar estrés del RE. Los lisados se ejecutaron en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western (Figura 2) utilizando el anticuerpo policlonal de conejo anti-Xbp1 (Santa Cruz Biotechnology). La Figura 2 demuestra que se produjo una XBP1 más madura en estirpes celulares estables cuando las células se estresaron por medio del tratamiento con Tu.
pSMED2/BMP6 se transfectó de manera transitoria a estirpes celulares estables XBP1 (5-2,5-4, y 20-10) y parentales (CHO DUKX). Los medios acondicionados recogidos 48 h después de la transfección se ejecutaron en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western. La membrana Western (Figura 3) se sondó con un anticuerpo monoclonal anti-BMP5 de ratón (1:2000), que reacciona de forma cruzada fuertemente con BMP6. El anticuerpo secundario fue un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:5000) (The Jackson Laboratory). Cada carril en la Figura 3 representa un experimento separado para una estirpe celular respectiva. Como se demuestra en la Figura 3, se secretó más BMP6 en estirpes celulares estables XBP1 seleccionadas con MTX 5 nM y 10 nM que en las células parentales.
pSMED2/IL11RFc, que codifica una proteína IL11RFc, también se transfectó transitoriamente en estirpes celulares estables XBP1y parentales. Los medios acondicionados recogidos 48 h después de la transfección se ejecutaron en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western. Las membranas Western (Figura 4) se sondaron con anticuerpo Fc anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (The Jackson Laboratory). Se secretó más IL11RFc en la mayoría de estirpes celulares XBP1 seleccionadas con MTX 5 nM que en las células CHO DUKX.
Ejemplo 4. Comparación de la transfección, eficiencias transcripcionales y traduccionales entre estirpes celulares estables XBP1 y sus células parentales CHO
Las células CHO DUKX 5-2, 20-10 se contaron y cantidades iguales se transfectaron transitoriamente con una construcción que codifica la proteína fluorescente verde (PFV). Las células se visualizaron en un aumento 10 x 10 y la eficiencia de la transfección (% de células que expresan PFV) se determinó comparando las células fluorescentes PFV con respecto a las células totales en tres campos visuales por estirpe celular. El resultado de la comparación indica que la eficiencia de la transfección de PFV es similar en todas las estirpes celulares XBP1 y CHO DUKX ensayadas (Figura 5).
En un experimento adicional, las construcciones que codifican (+) o no codifican (-) PFV se transfectaron transitoriamente en estirpes celulares estables XBP1 y parentales. El lisado celular recogido 48 h después de la transfección se llevó a cabo en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western (Figura 6). Cada carril de la Figura 6 representa un experimento separado. La membrana Western se sondó con un anticuerpo policlonal de conejo anti-PFV y anticuerpo monoclonal de ratón anti-actina para el control de carga. Como se ha demostrado en la Figura 6, la suma de las eficiencias de transcripción y traducción para PFV es similar en todas las estirpes celulares investigadas.
Ejemplo 5. Células transfectadas transitoriamente con ATF6
El ADNc etiquetado con Flag del dominio soluble activo de ATF6 se clonó en un vector de expresión inducible Tet/off ptTATOP6 y se transfectó transitoriamente en células COS-1. El vector ptTATOP6 incluye un promotor inducible que controla la expresión de la proteína de fusión que comprende ATF6 y la etiqueta Flag. El lisado celular recogido a las
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18, 48 y 60 h después de la transfección se llevó a cabo en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western. La membrana Western (Figura 7) se sondó con un anticuerpo anti-Flag. “V” indica un vector ptTATOP6 vacío, y “P” representa un control positivo de flag. Como se ilustra en la Figura 7, la proteína ATF6 se expresó con éxito en células COS-1 en ausencia de doxiciclina.
Ejemplo 6. La co-expresión de los genes objetivo con XBP1 o ATF6 en relaciones adecuadas potencia la secreción de los genes objetivo en células HEK293
HEK293-FT y HEK293-EBNA se cultivaron y mantuvieron en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % a 37 ºC en medio 293 estilo libre (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero fetal bovino al 5 %.
La expresión transitoria se realizó en centrifugadoras de 50 ml o placas de 24 pocillos, o centrifugadoras de 1 l. Para el volumen de cultivo de 50 ml (o 1 l), se mezclaron 25 µg (o 0,5 mg para 1 l) de ADN plásmido con 400 µg (8 mg para 1 l) de polietilenimina (PEI, 25 kDa, lineal, neutralizada a pH 7,0 por HCl, 1 mg/ml, Polysciences, Warrington, PA) en 2,5 ml (50 ml para 1 l) de medio 293 libre de suero. Las centrifugadoras se incubaron a 37 ºC con una velocidad de rotación de 170 rpm en un agitador P2005 (Bellco) durante 72-144 horas antes de la recogida. Para un formato de placa de 24 pocillos, se mezcló 1 µg de ADN con 8 µg de PEI en 0,5 ml de medio 293 libre de suero. A continuación, las mezclas se mezclaron con 0,5 ml de células HEK293 en medio 293 con SFB al 10 % en la densidad celular de 0,5 x 106 células/ml. Las placas se incubaron a 37 ºC en un agitador orbital (BellCo) con una velocidad de rotación de 300 rpm durante 72 horas antes de la recogida.
pSMED2 y pSMEDA se utilizaron para la construcción de ADN. La proteína 1 relacionada con la familia frizzled secretada y etiquetada con His6 en el extremo C-terminal (sFRP-1) y agrecanasa-2 etiquetada con Flag en el extremo C-terminal (Agg-2) se subclonaron en pSMEDA. El receptor tipo 2 de tirosina quinasa neurotrófico etiquetado con His6 en el extremo C-terminal (TrkB) se subclonó en pSMED2. Estos genes subclonados no tenían ningún dominio transmembranal o citoplásmico, permitiendo de este modo la secreción de los productos expresados.
Prop1 y Prop34-LBD etiquetados con His6 en el extremo C-terminal se subclonaron en pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Prop1 y Prop34-LBD se derivaron de la proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP5) con deleción de los dominios transmembranales y citoplásmicos. Las secuencias de aminoácidos de Prop1 y Prop34-LBD se representan en SEQ ID NOs:10 y 11, respectivamente. SEQ ID NO:10 incluye una etiqueta His6 en los aminoácidos 342-347 y una etiqueta Flag en los aminoácidos 348-356. SEQ ID NO:11 incluye una etiqueta His6 en los aminoácidos 795-800 y una etiqueta V5 en los aminoácidos 778-794.
1 µg de Prop1-His6-Flag en pcDNA3.1 se co-transfectó con 0,3 µg (1:3) o 1 µg (1:1) de XBP1p en un vector pSMED2 en células HEK293T. Tanto pcDNA3.1 como pSMED2 son estimulados por un promotor CMV. Los medios acondicionados se recogieron a las 72 h después de la transfección de ADN. Las muestras se separaron por SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-HIS4. Se llevaron a cabo experimentos duplicados (conjunto n.º 1 y conjunto n.º 2). Como se demuestra en la Figura 8A, la co-transfección de XBP1 con Prop1 en las relaciones de 1:1 o 1:3 mejoró drásticamente la expresión de Prop1.
En otro experimento, 1 µg de Prop34-LBD-V5-His6 en pcDNA3.1 se co-transfectó con 0,3 µg (1:3) o 1 µg (1:1) de ATF6 en un vector ptTATOP6 en células HEK293T. Al igual que pSMED2, ptTATOP6 también es estimulado por un promotor CMV. Los medios acondicionados recogidos a las 72 h después de transfección de ADN se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo anti-His4. La Figura 8B muestra que la co-transfección de ATF6 con Prop34-LBD-V5-His6 en la relación de 1:1 o 1:3 potenció significativamente la expresión de Prop34-LBD.
La Figura 9 ilustra los efectos de XBP1p o ATF6 en la expresión de diferentes proteínas objetivo. Prop1-His6-Flag o Prop34-LBD-V5-His6 en pcDNA3.1 se co-transfectaron con XBP1p en un vector pSMED2 o ATF-6 en un vector ptTATOP6 en células HEK293T. Los medios acondicionados recogidos a las 72 h después de la transfección de ADN se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo anti-His4. Las señales se cuantificaron por densitometría como se muestra en la Figura 9. Los resultados indican que XBP1p y ATF-6 tienen diferentes efectos sobre la expresión de Prop1 y Prop34-LBD. Diferentes efectos de potenciación también se observaron para TrkB, sFRP1 y Agg-2 cuando estas proteínas se co-expresaron con XBP1p frente a ATF-6. Por ejemplo, la co-expresión con XBP1p aumentó el rendimiento de TrkB en aproximadamente 5 veces, mientras que solo se observó un aumento de aproximadamente 2 veces cuando TrkB se co-expresó con ATF6.
La descripción anterior de la presente invención proporciona una ilustración y una descripción, pero no tiene por objeto ser exhaustiva o limitar la invención con respecto a la desvelada de forma exacta. Las modificaciones y variaciones acordes con las enseñanzas anteriores son posibles o pueden adquirirse a partir de la práctica de la invención. De este modo, cabe destacar que el ámbito de la invención se define por las reivindicaciones y sus equivalentes.
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<221 > NOMBRE/CLAVE: misc_feature
<222> LOCALIZACIÓN: (6)..(6)20 <223> OTRA INFORMACIÓN: n es a, c, g o t
<400> SECUENCIA: 2 attggnccac g 11
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- TIPO: ADN 25 <213> ORGANISMO: mamífero
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