MX2007002379A

MX2007002379A - Sistemas y metodos para la produccion de proteinas.

Info

Publication number: MX2007002379A
Application number: MX2007002379A
Authority: MX
Inventors: Stephen H Herrmann; Zhijian Lu; Yijie Gao; Nicole M Piche; Mei Geng; Xiaotian Zhong; Ronald Kriz
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2004-09-02
Filing date: 2005-09-01
Publication date: 2007-04-23
Also published as: KR20070053732A; WO2006028889A2; WO2006028889A3; ECSP077295A; US20090221035A1; RU2007106442A; JP2012161318A; EP1784490B1; ES2649862T3; EP1784490A2; US20120322104A1; ES2653843T3; US20060053502A1; JP5508460B2; CR8927A; EP2316955B1; CA2577073A1; NO20071221L; JP2008511335A; EP2316955A1

Abstract

La invencion se refiere a sistemas y metodos para producir proteinas de interes. La invencion emplea celulas animales o vegetales geneticamente manipuladas que tienen capacidades modificadas de doblamiento o procesamiento de proteinas. En un aspecto, la invencion incorpora celulas geneticamente modificadas que comprenden uno o mas casetes de expresion recombinantes los cuales codifican para (1) una proteina de interes y (2) un polipeptido que es funcional en la via de respuesta de proteinas no dobladas (UPR) de las celulas. La co-expresion del polipeptido incrementa significativamente el rendimiento de la proteina de interes en las celulas geneticamente manipuladas. En un ejemplo, las celulas geneticamente manipuladas con celulas animales, y el polipeptido co-expresado es un componente o modulador de una via de UPR mediada por XBP1 o ATF6.

Description

SISTEMAS Y MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Campo de la invención La invención se refiere a sistemas de expresión y a métodos para usar los mismos en la producción de proteínas de interés .

Antecedentes de la invención Las proteínas secretadas y de membrana sufren el doblez y otras modificaciones post-traduccionales en el sistema de retículo endoplásmico (ER) -Golgi. La interrupción de la homeostasis de este sistema ocasiona estrés celular que puede llevar a apoptosis. La homeostasis del ER puede ser alterada por cambios en la concentración de Ca2+ o el estado de óxido reducción, glicosilación alterada o acumulación de proteínas desdobladas o mal dobladas en el lumen del ER.

Para superar el estrés, el sistema secretor ha desarrollado un mecanismo de respuesta a estrés adaptivo conocido como la respuesta de proteína desdoblada (UPR) . La activación de la UPR de mamífero da como resultado al menos tres respuestas: (1) la cantidad de proteína nueva translocalizada al lumen del ER a se reduce través de una reducción en traducción; (2) la proteína acumulada en el lumen del ER es retrotranslocalizada al citosol y degradada y (3) el sistema secretor ER-Golgi es remodelado de tal manera que las REF.: 179704 capacidades de doblez y procesamiento de la proteína en el sistema sean incrementadas. El incremento en capacidad del sistema ER-Golgi en respuesta a estrés implica la sobrerregulación de enzimas de doblez y procesamiento. Estas enzimas incluyen chaperones del ER, enzimas implicadas en la glicosilación y formación de enlaces de disulfuro, y enzimas que participan en la transportación de vesículas. En células de mamífero, las proteínas IREI y ATF6 son los principales transductores de esta rama de la vía UPR. La proteína IRE1 es una glicoproteína de transmembrana ER con actividades cinasa y endonucleasa en su dominio citosólico C-terminal. Al menos dos genes IRE1 han sido identificados en ratones, IREla e IRElß. IREla es esencial para la viabilidad y se expresa ampliamente. IRElß ha sido detectado sólo en la mucosa gastrointestinal. El estrés del ER lleva a la oligomerización de proteínas IRE1 y a la trans-autofosforilación de sus dominios citosólicos. La fosforilación de IRE1 activa su actividad endonucleasa lo cual extirpa un intrón del ARNm del factor de transcripción en la proteína de unión a la caja X 1 (XBPl) . Este evento de empalme da como resultado la conversión de una isoforma XBPl inactiva en transcripción (es decir, XBPlu) por una isoforma XBPl activa en transcripción (es decir, XBPls o XBPlp) viaja después al interior del núcleo, en donde se une a sus secuencias objetivo incluyendo elemento de respuesta a estrés del ER (ERSE) y elemento UPR (UPRE) , en las regiones reguladoras de los genes de la enzima/chaperón ER-Golgi, para inducir su transcripción. Muchos genes objetivo del UPR tienen una o más copias de secuencia ERSE o UPRE en sus regiones promotoras. ATF6 (factor de transcripción de activación 6) es otra proteína de transmembrana del ER. El estrés del ER lleva al tránsito de la proteína ATF6 al compartimiento de Golgi en donde su dominio citosólico es cortado por proteasas de Sitio 1 y Sitio 2. El dominio citosólico cortado viaja al núcleo y actúa como un factor de transcripción al unirse a secuencias ERSE, las cuales a su vez sobrerregulan una variedad de chaperones y enzimas procesadoras en la vía secretora. La activación de la vía UPR en células de mamífero lleva también a una inhibición transitoria de la traducción de proteínas a través de la vía de señalización PERK. PERK es una cinasa de transmembrana del ER la cual puede fosforilar el factor de inicio de traducción eucariótico eIF2a en respuesta al estrés del ER. La fosforilación de eIF2a evita el ensamble del complejo de preinicio ribosómico 43S y por lo tanto da como resultado atenuación de la traducción. Paradójicamente, la fosforilación de eIF2a también da como resultado una rápida síntesis del factor de transcripción ATF4, lo cual a su vez incrementa la expresión de un factor de transcripción proapoptósico CHOP. CHOP potencia la muerte celular cuando los efectos dañinos del estrés ER ya no pueden ser superados. La sobre-expresión de proteínas recombinantes secretadas en células de mamífero comúnmente lleva a un rendimiento de baja producción. Un método comúnmente usado para memorar la producción de proteínas es incrementar las velocidades de transcripción, tal como mediante el uso de promotores más fuertes o números de copias de genes cada vez más altos. Sin embargo, las velocidades de transcripción incrementadas pueden exacerbar la tensión del ER y, por lo tanto, comúnmente fallan en mejorar significativamente el rendimiento. En algunos casos, podrían incluso reducir más el rendimiento de producción.

Breve descripción de la invención La presente invención proporciona sistemas de expresión con rendimientos de producción mejorados para proteínas secretadas o de membrana. Los sistemas emplean células animales o vegetales genéticamente manipuladas que han sido modificadas, y en muchos casos, capacidades de doblez o procesamiento de proteínas incrementadas. En un aspecto, la presente invención incorpora células animales o vegetales genéticamente modificadas que comprenden uno o más casetes de expresión recombinantes los cuales codifican para (1) una proteína de interés y (2) un componente o modulador de una vía UPR. Los componentes o moduladores UPR adecuados incluyen, pero no están limitados a, moléculas no IREl que son funcionales en las vías UPR. Pueden ser componentes UPR endógenos de las células huésped, o variantes o equivalentes funcionales de las mismas. También pueden ser moléculas que ocurran naturalmente o que ocurran no naturalmente las cuales modulen la actividad o expresión de un componente UPR endógeno ya sea directa o indirectamente. En muchos casos, los componentes/moduladores de UPR se seleccionan de tal manera que su expresión o activación incremente la capacidad de doblez o procesamiento de las proteínas de las células huésped. Los componentes/moduladores de UPR ejemplares incluyen, pero no están limitados a, factores de transcripción, tales como XBPl o ATF6 o sus fragmentos o variantes biológicamente activos. Otros componentes en las vías UPR mediadas por XBPl o ATF6 también pueden usarse. Además, pueden usarse chaperones o enzimas procesadoras residentes en ER. Las proteínas que pueden producirse de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, eritropoyetinas, hormonas de crecimiento, insulinas, interferones, factores de crecimiento, proteínas de membrana u otras proteínas terapéuticas, profilácticas o diagnósticas. En muchas modalidades, las proteínas de interés son expresadas por las células huésped como proteínas secretadas o de membrana. Las células genéticamente manipuladas de la invención pueden derivarse de líneas de células, cultivos primarios u otras células aisladas o cultivadas. Las células genéticamente modificadas también pueden ser células híbridas. En muchos casos, las células híbridas son generadas al fusionar una célula animal y una célula cancerosa (tal como una célula de mieloma) . Los casetes de expresión recombinantes que codifican para una proteína de interés o un componente/modulador del UPR pueden ser incorporados o introducidos en las células híbridas antes o después del evento de fusión. Además, las células genéticamente manipuladas de la presente invención pueden ser células de animales o plantas transgénicos. En una modalidad, la célula genéticamente modificada es una célula de mamífero. Un cásete de expresión recombinante puede incorporarse en una célula huésped mediante una variedad de medios. Por ejemplo, un cásete de expresión puede ser integrado establemente en un cromosoma o genoma de una célula huésped. La integración puede ser ya sea aleatoria o dirigida (por ejemplo, usando el sistema de recombinación Cre-lox de bacteriófago Pl) . Un cásete de expresión también puede ser introducido en una célula huésped por medio de un vector de expresión no integrado. Un cásete de expresión recombinante puede ser controlado por medio de un promotor constitutivo o inducible.

También puede ser controlado por un promotor específico de tejido o regulado en desarrollo. Otros tipos de promotores también pueden usarse para la presente invención. En otro aspecto, la presente invención incorpora células animales o vegetales genéticamente modificadas que comprenden uno o más casetes de expresión recombinantes los cuales codifican para (1) una proteína de interés y (2) una proteína capaz de unirse a un UPRE o ERSE de las células huésped. En una modalidad, el polipéptido de unión a UPRE o ERSE es un factor de transcripción, tal como XBPl o ATF6. En otra modalidad, el polipéptido de unión a UPRE o ERSE puede reclutar otra proteína a las regiones promotoras de genes UPR, y ésta última proteína comprende un dominio de transactivación capaz de activar la transcripción de genes UPR (por ejemplo, el dominio de activación de transcripción de XBPl o ATF6) . Una célula genéticamente manipulada de la invención puede expresar una proteína de interés y un componente/modulador del UPR de la misma o diferentes casetes de expresión recombinantes. La proteína de interés y el componente/modulador del UPR pueden ser controlados por el mismo o diferentes promotores. En una modalidad, una célula genéticamente manipulada de la invención comprende (1) un primer cásete de expresión recombinante que codifica para una proteína de interés y (2) un segundo cásete de expresión recombinante que codifica para un componente o modulador de UPR o una proteína de unión a UPRE o ERSE (por ejemplo, XBPl o ATF6) . La relación del número total del primer cásete de expresión recombinante sobre el número total del segundo cásete de expresión recombinante en la célula puede variar, sin limitación, de no más de 0.1:1 a por lo menos 10:1. En muchos casos, el promotor empleado por el primer cásete recombinante puede tener la misma o similar potencia que el promotor empleado por el segundo cásete recombinante, y la relación del número total del primer cásete recombinante sobre el número total del segundo cásete recombinante daría de 0.5:1 a 10:1 (tal como por lo menos 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 ó 9:1). Los promotores en el primero y segundo casetes recombinantes también pueden tener diferentes potencias. Por ejemplo, el promotor en el primer cásete recombinante puede ser más fuerte que el promotor en el segundo cásete recombinante, tal como por al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. En otro aspecto más, la presente invención incorpora animales o plantas que incluyen una célula genéticamente manipulada de la presente invención. Los métodos para incorporar una célula genéticamente modificada en un animal o planta se conocen bien en la técnica. En muchas modalidades, los animales o plantas son animales o plantas transgénicos. En otro aspecto más, la presente invención incorpora cultivos de células que son transfectados o transducidos con uno o más vectores de expresión que codifican para (1) una proteína de interés y (2) un componente o modulador no IREl de una vía de UPR. En muchas modalidades, los vectores de expresión comprenden un primer cásete de expresión recombinante que codifica para la proteína de interés y un segundo cásete de expresión recombinante que codifica para el componente o modulador de UPR. (por ejemplo, XBPl o ATF6) . El primero y el segundo casetes de expresión pueden ser portados por los mismos o diferentes vectores de expresión. La relación molar del primer cásete de expresión recombinante sobre el segundo cásete de expresión recombinante en el cultivo de células puede variar, por ejemplo, de no más de 0.1:1 a por lo menos 10:1, tal como al menos 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, o más. El cultivo de células puede ser un cultivo de células de mamífero, un cultivo de células de insecto, un cultivo de células vegetales u otro cultivo que sea adecuado para la producción de la proteína de interés. La presente invención incorpora también métodos para usar células, animales, plantas u otros cultivos de células genéticamente manipulados en la producción de proteínas de interés. Además, la presente invención incorpora un vector de expresión que codifica para (1) una proteína de interés y (2) un componente o modulador no-IREl y una vía de UPR. Otras características objetivos y ventajas de la presente invención son aparentes en la siguiente descripción detallada, sin embargo, se debe entender que la descripción detallada, aunque indique modalidades preferidas de la invención, se da a manera de ilustración únicamente y no de limitación. Varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.

Breve descripción de las figuras Las figuras se proporcionan por ilustración, no limitación. La figura 1 demuestra que la sobre-expresión de BVP6 en células PA DUKX causa estrés del ER. La figura 2 indica la expresión de XBPl exógeno en líneas de células establemente transfectadas bajo condiciones no estresadas o estresadas.

La figura 3 muestra la secreción incrementada de BMP6 en varias líneas de células XBPl que en células CHO DUKX progenitoras . La figura 4 ilustra secreción incrementada de ILllRFc en varias líneas de células XBPl que en células CHO DUKX progenitoras . La figura 5 demuestra que la eficiencia de transfección de GFP es similar en líneas de células CHO DUKX progenitoras y XBPl seleccionadas. La figura 6 muestra que la eficiencia de transcripción y traducción de GFP es similar en líneas de células CHO CUKX progenitoras y XBPl seleccionadas. La figura 7 ilustra la expresión exitosa de proteína ATF6 inducible en células COS-1. Las figuras 8A y 8B ilustran los efectos de XBPl o ATF6 en diferentes relaciones con moléculas de ADNcs de proteínas objetivo en la producción de proteínas de objetivo. La figura 9 demuestra los efectos de XBPl o ATF6 en la expresión de diferentes proteínas objetivo.

Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona sistemas y métodos para producir proteínas de interés. Los sistemas de expresión de la presente invención emplean células animales o vegetales genéticamente manipuladas que tienen capacidades de doblez o procesamiento de proteína modificadas o mejoradas.

En muchas modalidades, las células genéticamente manipuladas de la presente invención comprenden uno o más casetes de expresión recombinantes que codifican para una proteína de interés y un componente o modulador de una vía de UPR. La co-expresión del componente/modulador del UPR incrementa significativamente el rendimiento de la proteína de interés.

Los componentes/moduladores de UPR adecuados para la presente invención incluyen, pero no están limitados a, factores de transcripción, tales como XBPl o ATF6, o sus fragmentos o variantes biológicamente activos. También se pueden usar chaperones o enzimas asociados a ER. Varios aspectos de la presente invención se describen en mayor detalle en las siguientes subtítulos. El uso de subtítulos no intenta limitar la invención. Cada subtítulo puede aplicar a cualquier aspecto de la invención.

Según se usa en la presente, el término "o" significa "y/o" a menos que e indique lo contrario.

A. Proteínas de Interés Las proteínas que pueden producirse de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, proteínas terapéuticas, profilácticas o diagnósticas, tales como eritropoyetinas, hormonas de crecimiento, insulinas, interlecuinas, factores de crecimiento, interferones, factores estimuladores de colonia, factores hematológicos, vacunas, colágenos, fibrinógenos, albúminas de suero humano, activadores de plasminógeno tisular, glucosidasas, alglucerasas, proteínas básicas de mielina, hipoxantina guanina fosforribosil transferasas, tirosina hidroxilasas, dopadescarboxilasas o anticuerpos. Los anticuerpos ejemplares que pueden producirse para la presente invención incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos mono-específicos, anticuerpos poli-específicos, anticuerpos no específicos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena individual, anticuerpos quiméricos, anticuerpos sintéticos, anticuerpos recombinantes, anticuerpos híbridos, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, o fragmentos funcionales de los mismos. Los aglutinantes de alta afinidad seleccionados usando tecnologías de despliegue in ' vi tro o estrategias evolutivas también pueden producirse de acuerdo con la presente invención. Estos aglutinantes de alta afinidad incluyen, pero no están limitados a, péptidos, anticuerpos e imitadores de anticuerpos. Véase, por ejemplo, Binz, et al., NAT BIOTECHNOL, 22:575-582 (2004); y Lipovsek y Pluckthun, J IMMUNOL METHODS, 290:51-67 (2004). Otras proteínas de interés, tales como cinasas, fosfatasas, receptores acoplados a proteína G, receptores de factor de crecimiento, receptores de citosinas, receptores de quimiocinas, anticuerpos de superficie celular (inmunoglobulina unida a membrana), receptores de BMP/GDF, receptores neuronales, canales iónicos, proteasas, factores de transcripción o polimerasas, también se pueden producir por la presente invención. En muchas modalidades, las proteínas producidas por la presente invención son proteínas recombinantes. Según se usa en la presente, una proteína recombinante se refiere a una proteína que es construida o producida usando tecnología de ADN recombinante. Una proteína recombinante puede tener una secuencia que ocurra naturalmente o una secuencia genéticamente manipulada. Puede ser expresada, por ejemplo, a partir de un vector recombinante o a partir de un gen que sea endógeno a las células huésped pero que tenga una secuencia reguladora genéticamente manipulada. Por ejemplo, una proteína recombinante puede producirse a partir de un gen endógeno pero con un promotor viral genéticamente manipulado. En muchos casos, las proteínas recombinantes son proteínas de fusión que incluyen un marcador de polipéptido para facilitar el aislamiento, purificación, detección, inmovilización, estabilización, doblez o dirección de los productos expresados. En muchos otros casos, las proteínas recombinantes incluyen péptidos de señal. Un péptido de señal puede ser endógeno o heterólogo para la proteína que esté siendo producida. Un péptido de señal comúnmente determina si una proteína será formada sobre el ER completo o sobre ribosomas libres. Un péptido de señal puede interactuar con la partícula de reconocimiento de señal y dirigir el ribosoma al ER en donde tiene lugar la inserción co-traduccional . Muchos péptidos de señal son altamente hidrofóbicos con residuos positivamente cargados. Un péptido de señal puede ser removido de la cadena de péptidos en crecimiento por una peptidasa de señal, una proteasa específica localizada en la cara cisternal del ER. Las proteínas dirigidas al ER por secuencias de señal pueden ser liberadas en el espacio extracelular como proteínas secretadas. Por ejemplo, vesículas que contengan proteínas secretadas pueden fusionarse con la membrana celular y luego liberar sus contenidos en el espacio extracelular -un proceso llamado exocitosis. La exocitosis puede ocurrir constitutivamente después de la recepción de una señal de desencadenamiento. En el último caso, las proteínas son almacenadas en vesículas secretoras (o granulos secretores) hasta que se desencadene la exocitosis. En forma similar, las proteínas que residen en la membrana celular pueden ser secretadas en el espacio extracelular por corte proteolítico de un "enlazador" que sostenga la proteína a la membrana. Una proteína de interés puede ser aislada de un sistema de expresión mediante una variedad de medios.

Ejemplos de materiales iniciales del aislamiento de proteínas incluyen, pero no están limitados a, medio de cultivo o lisado de células. Los métodos de aislamiento adecuados incluyen, pero no están limitados a, cromatografía de afinidad (incluyendo cromatografía de inmunoafinidad) , cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de exclusión de tamaño, HPLC, precipitación de proteínas (incluyendo inmunoprecipitación), solubilización diferencial, electroforesis, centrifugación, cristalización o una combinación de los mismos. Un marcador polipéptido, tal como un marcador de estreptavidina, un marcador FLAG, un marcador de poli-histidina, una glutationa-S-transferasa o un fragmento Fc, puede ser fusionado a una proteína de interés para facilitar su aislamiento o purificación. En un ejemplo, el marcador polipéptido puede ser cortado de la proteína de interés por una proteasa. En muchas modalidades, una proteína de interés aislada de acuerdo con la presente invención está sustancialmente libre de otras proteínas o contaminantes. Por ejemplo, una proteína aislada puede ser al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ó 99% pura de otras proteínas. En un ejemplo, una proteína aislada contiene no más de una cantidad insignificante de contaminantes que pudieran interferir con su uso deseado.

Una proteína de interés aislada de acuerdo con la presente invención puede ser verificada mediante el uso de técnicas estándares tales como SDS-PAGE o inmunoensayos. Un SDS-PAGE puede ser teñido con azul de coommassie, plata u otros agentes adecuados para visualizar la proteína aislada. Los inmunoensayos adecuados incluyen, pero no están limitados a, Western blots, ELISAs, RIAs, ensayos de emparedado o inmunométricos, látex u otra aglutinación de partículas o fragmentos proteómicos. Las secuenciación de proteínas y espectrometría de masas también se pueden usar para verificar o analizar una proteína aislada.

B. Componentes/Moduladores del UPR Los componentes/moduladores del UPR que son producibles por la presente invención incluyen moléculas que son funcionales en las vías del UPR. Pueden ser de ocurrencia natural o de ocurrencia no natural. Pueden ser genéticamente manipuladas, químicamente sintetizadas o biológicamente aisladas. Un componente/modulador del UPR puede derivarse de la misma o diferentes especies que las células huésped. La expresión del componente/modulador del UPR mejora la secreción o capacidad de procesamiento del ER de las células huésped. En muchos casos, la co-expresión de un componente/modulador del UPR con una proteína de interés en las células huésped mejora el rendimiento de la proteína de interés en al menos 2, 3, 4, 5, 10 o más veces. Ejemplos de componentes/moduladores del UPR que son adecuados para la presente invención incluyen, pero no están limitados a, factores de transcripción, tales como XBPl o ATF6. Los equivalentes funcionales de estos factores de transcripción, tales como fragmentos de XBPl o ATF6, también pueden usarse. Estos fragmentos conservan al menos una porción sustancial de la actividad de transcripción de la proteína XBPl o ATF6 activada transcripcionalmente. Los efectores hacia el extremo tres prima de XBPl o ATF6, tales como chaperones o enzimas de ER implicados en la glicosilación de proteínas o translocalización de vesículas, también pueden ser usados. Además, los moduladores no IREl que pueden activar la expresión o función biológica de un componente de una vía UPR mediada por XBPl o ATF6 pueden ser usados. Este modulador puede modular la vía de UPR mediante un mecanismo que no sea la auto sobre-expresión. Por ejemplo, este modulador puede activar la función de un componente UPR al unirse directamente al componente, o modular la expresión del componente al unirse una secuencia reguladora en el gen que codifique para el componente. Más aún, pueden usarse moduladores que pueden inhibir la expresión o funciones biológicas de componentes de la vía de señalización PERK. Estos moduladores incluyen, sin limitación, anticuerpos, ARN antisentido o secuencias de ARNi. Además, pueden usarse mutantes negativos dominantes de los componentes de la vía PERK. Un ejemplo de estos mutantes negativos dominantes es un mutante eIF2a S51A con el reemplazo de serina en la posición 51 (secuencia de murino) por alanina. Esta sustitución elimina la capacidad de la proteína para ser fosforilada y por lo tanto detiene su efecto inhibidor en la velocidad de traducción de proteínas durante el estrés del ER. En forma similar, pueden introducirse mutaciones en el dominio de cinasa de PERK para eliminar o reducir su actividad cinasa para fosforilar eIF2a, al prevenir la inducción de la atenuación de traducción o apoptosis durante el estrés del ER. En una modalidad, la proteína XBPl o un fragmento biológicamente activo de la misma se emplea para incrementar el rendimiento de una proteína de interés en las células huésped. La proteína XBPl incluye dos dominios encontrados comúnmente en factores de transcripción que confieren capacidad de unión y dimerización de ADN. XBPl se conoce como un factor de transcripción que regula genes MHC clase II al unirse a un elemento promotor referido como una caja X. XBPl también se une a un potenciador en el promotor del virus de la leucemia de células T tipo 1. La activación de la vía de UPR lleva al empalme dependiente de IREl de un pequeño intrón de ARNm de XBPl en sistemas modelo tanto de Caenorhabdi tis elegans como de mamífero. Los exones resultantes son unidos por una ARNt ligasa. Este evento de empalme da como resultado un desplazamiento de marco en el ARNm de XBPl, el cual produce una proteína que tiene el dominio de unión a ADN N-terminal original pero un nuevo dominio de transactivación C-terminal. En células de murino, el evento de empalme convierte una isoforma de XBPl de 267 aminoácidos en una isoforma de XBPl de 371 aminoácidos (XBPls o XBPlp). Véase Calfon, et al . , NATURE, 415:92-96 (2002). La proteína XBPlp se une a las secuencias de ERSE o UPRE en las regiones promotoras de muchos genes chaperones de ER o UPR, activando la transcripción de estos genes. En mamíferos, al menos dos secuencias de ERSE han sido identificadas, ERSE-I y ERSE-II. ERSE-I tiene una secuencia conservada como la mostrada en SEQ ID NO : 1 (CCAATNNNNNNNNNCCACG) . ERSE-II tiene una secuencia conservada como la ilustrada en SEQ ID NO: 2 (ATTGGNCCACG) .

Además, por lo menos dos secuencias de UPRE de mamífero han sido identificadas, una que tiene una secuencia conservada como la mostrada en SEQ ID NO: 3 (TGAGTGG) y la otra que tiene una secuencia conservada como la ilustrada en SEQ ID NO: 4 (TGACGTGA) . Las secuencias de codificación de proteína XBPl pueden obtenerse de una variedad de fuentes. Por ejemplo, las secuencias de codificación para proteínas XBPl humanas, de ratón, rata, pollo, mosca de la fruta y pez cebra pueden obtenerse de la base de datos de nucleótidos Entrez en el Centro Nacional para la Información de Biotecnología (NCBl) (Bethesda, MD) . Estas secuencias tienen los números de registro Entrez NM_005080, NM_013842, NM_001004210, NM_001006192, NM_079983 o NM_131874, respectivamente. Un fragmento biológicamente activo de una proteína XBPl conserva al menos una porción sustancial de la actividad de activación de transcripción de la proteína XBPlp. Por ejemplo, un fragmento de XBPl empleado en la invención puede conservar al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más de la actividad de activación de transcripción de XBPlp. Los fragmentos de XBPl transcripcionalmente activos pueden ser seleccionados mediante numerosos medios. En un ejemplo, un fragmento de XBPl transcripcionalmente activo se selecciona con base en su capacidad para activar la transcripción de genes hacia el extremo tres prima de una secuencia de ERSE o UPRE. En otra modalidad, la proteína ATF6 es un fragmento biológicamente activo de la misma se usa para mejorar el rendimiento de una proteína de interés en las células huésped. ATF6 es una proteína de transmembrana que incluye un dominio de "detección" localizado en el lumen del ER y un dominio de transactivación de transcripción citosólica.

Después del estrés del ER, el dominio citosólico de ATF6 es cortado y transportado al núcleo en donde se une a las secuencias de ERSE y de esta manera activa los genes UPR hacia el extremo 3' . Por lo menos dos proteínas ATF6 han sido identificadas -en particular, ATF6a y ATF6ß. ATFda y ATFdß están estructuralmente emparentadas y comparten similitud significativa en sus dominios b-zip. Las secuencias de codificación ejemplares para proteínas ATF6 humanas, de ratón, borrego y pollo tienen los números de registro Entrez NM_007348, XM_129579, AY942654 y XM_422208, respectivamente. De manera similar a los fragmentos XBPl empleados en la invención, un fragmento biológicamente activo de una proteína ATF6 conserva al menos una porción sustancial de la actividad de activación de transcripción de la proteína ATF6 activada o su dominio citosólico. Un fragmento de ATF6 biológicamente activo puede seleccionarse al monitorear su unión a una secuencia de ERSE y la capacidad del fragmento para activar la transcripción de genes hacia el extremo tres prima desde la secuencia de ERSE. En otra modalidad más, una enzima o chaperón de procesamiento residente en el ER se usa para incrementar el rendimiento de una proteína de interés en las células huésped. Ejemplos de enzimas/chaperones localizados en ER adecuados incluyen, pero no están limitados a, GRP78, GRP94, GRP58, la proteína disulfuro isomerasa, calnexina y calrecticulina. En un ejemplo, la contraparte endógena de una enzima ER (o chaperón) empleado en la presente invención tiene una región promotora que incluye una o más secuencias de ERSE-I o ERSE-II. En otro ejemplo, la contraparte endógena de una enzima ER (o chaperón) empleada en la presente invención tiene una región promotora que incluye una o más secuencias de UPRE. La presente invención incorpora también el uso de un componente UPR que es una variante de una proteína endógena. Una variante de un componente UPR endógeno puede ser de ocurrencia natural, tal como mediante variación alélica o polimorfismo, o manipulada deliberadamente. La actividad UPR de una variante no reduce sustancialmente en comparación con la proteína original (por ejemplo, una XBPlp, una proteína ATF6 activada transcripcionalmente o un fragmento biológicamente activo de la misma) . En muchas modalidades, las variantes empleadas en la presente invención conservan al menos 50% de la actividad UPR de las proteínas originales correspondientes. Por ejemplo, una variante puede conservar al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ó 100% de la actividad UPR de la proteína original. En una modalidad, una variante empleada en la presente invención exhibe una actividad UPR incrementada en comparación con la proteína original. Una variante deseable de un componente UPR puede seleccionarse de tal manera que la expresión o activación de la variante incremente la secreción de una proteína co-transfectada en las células huésped. La secuencia de aminoácidos de una variante es sustancialmente idéntica a la de la proteína original. En muchos casos, la secuencia de aminoácidos de una variante tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95% ó 99% de identidad o similitud de secuencia completa con la proteína original. La identidad o similitud de secuencia se pueden determinar mediante una variedad de métodos. En una modalidad, la identidad o similitud de secuencias se determina usando un algoritmo de alineación de secuencias. Los algoritmos adecuados para este propósito incluyen, pero no están limitados a, Basic Local Alignment Tool (BLAST) descrita en Altschul, et al . , J. MOL. Biol.., 215:403-410 (1990), el algoritmo de Needleman, et al . , J. MOL. Biol.., 48:444-453 (1970), el algoritmo de Myers y Miller, COMPUTE, APPLE, BIOSCI., 4:11-17 (1988), y análisis de matriz por puntos. Los programas de computadora adecuados para este propósito incluyen, pero no están limitados a, los programas BLAST provistos por NCBl, MegAlign provisto por DNASTAR (Madison, Wl) y el programa GAP del Genetics Computer Group (GCG) (algoritmo de Needleman-Wench) . Para el programa GAP, pueden usarse valores de omisión (por ejemplo, la penalidad para la abertura de un espacio en una de las secuencias es 11 y para la extensión del espacio es 8). Aminoácidos similares pueden definirse por la matriz de sustitución BLOSSOM. Están disponibles numerosos métodos para preparar una variante deseable de un componente UPR. Por ejemplo, una variante puede derivarse de la proteína original mediante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, o más sustituciones, supresiones, inserciones de aminoácidos u otras modificaciones. Las sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras. En muchos casos, pueden introducirse sustituciones de aminoácidos conservadoras en una secuencia de proteínas sin cambiar significativamente la estructura o actividad biológica de la proteína. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden hacerse sobre la base de similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad o la naturaleza anfifática de los residuos. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden hacerse entre aminoácidos con las cadenas laterales básicas, tales como lisina (Lys o K) , arginina (Arg o R) e histidina (His o H) ; aminoácidos con cadenas laterales acidas, tales como ácido aspártico (Asp o D) y ácido glutámico (Glu o E) ; aminoácidos con cadenas laterales polares no cargadas, tales como asparagina (Asn o N) , glutamina (Gln o Q) , serina (Ser o S) , treonina (Thr o T) y tirosina (Tyr o Y) ; o aminoácidos con cadenas laterales no polares, tales como alanina (Ala o A) , glicina (Gly o G) , valina (Val o V), leucina (Leu o L) , isoleucina (lie o I), prolina (Pro o P) , fenlalanina (Phe o F) , metionina (Met o M) , triptófano (Trp o W) o cisteína (Cys o C) . Ejemplos de sustituciones de aminoácidos usadas comúnmente se ilustran en la tabla 1.

Tabla 1 Ejemplo de sustituciones de aminoácidos Otras sustituciones de aminoácidos deseables también pueden introducirse en un componente UPR. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un componente UPR para incrementar su estabilidad. Para otro caso, las sustituciones de aminoácidos pueden introducirse para incrementar o reducir la actividad UPR de un componente UPR. Además, la presente invención incorpora el uso de polipéptidos que pueden unirse a las secuencias de UPRE o ERSE de las células huésped. Estos polipéptidos, ya sea solos o en combinación con otras proteínas, pueden funcionar como factores de transcripción para activar la transcripción de los genes que tengan las regiones promotoras de UPRE o ERSE.

C. Casetes de Expresión Recombinantes y Células Huésped Un cásete de expresión recombinante típico empleado en la presente invención comprende una secuencia de codificación de proteínas enlazada operablemente a una región reguladora no traducida 5' y a una región reguladora traducida 3' . La secuencia de codificación de proteínas puede ser una secuencia genómica, una secuencia de ADNc, una combinación de las mismas, u otras secuencias expresables. En una modalidad, un cásete de expresión recombinante incluye todos los elementos reguladores necesarios para dirigir la expresión de la proteína codificada. Ejemplos de elementos reguladores no traducidos 5' adecuados incluyen promotores, potenciadores o las secuencias de Kozak. Ejemplos de elementos reguladores no traducidos 3' adecuados incluyen secuencias de poliadenilación u otras secuencias de terminación de transcripción/traducción. La selección de promotores, potenciadores adecuados u otros elementos reguladores para un cásete de expresión es un asunto de diseño de rutina con el nivel de capacidad ordinaria en la técnica. Muchos elementos de este tipo se describen en la literatura y están disponibles a través de proveedores comerciales. Los promotores adecuados para la presente invención incluyen promotores constitutivos o inducibles. Estos promotores pueden ser endógenos o heterólogos para las células huésped. En una modalidad, se usa un promotor específico de tejidos. Los promotores específicos de tejidos adecuados incluyen, pero no están limitados a, promotores específicos de hígado, promotores específicos linfoides, promotores específicos de células T, promotores específicos de neuronas, promotores específicos de páncreas o promotores específicos de glándulas mamarias. También se puede usar un promotor regulado en desarrollo. Un cásete de expresión recombinante que tenga un promotor específico de ejidos o regular el desarrollo puede usarse para preparar animales o plantas transgénicos. Las proteínas codificadas por este cásete de expresión recombinante pueden producirse en tejidos específicos o en etapas de desarrollo específicas de los animales o plantas transgénicos. En otra modalidad, se usa un sistema de expresión inducible para producir una proteína de interés o un componente/modulador del UPR. Los sistemas adecuados para este propósito incluyen, pero no están limitados a, el sistema Tet-encendido/apagado, el sistema de Ecdisona y el sistema de Rapamicina. El sistema Tet-encendido/apagado se basa en dos elementos reguladores derivados del operón de resistencia a tetraciclina del transposón TnlO de E . coli . El sistema incluye dos componentes, un cásete regulador y un cásete reportero. En un formato del sistema Tet-apagado, el cásete regulador codifica para una proteína híbrida que comprende un represor Tet (tetR) fusionado al dominio de activación VP16 del virus del herpes simple (HSV) . El cásete reportero incluye un elemento de respuesta a tet (TRE) enlazado operablemente a un gen reportero. El gen reportero puede codificar, por ejemplo, para una proteína de interés o un componente/modulador del UPR. En ausencia de inductor (por ejemplo, tetraciclina o doxiciclina) , la proteína de fusión tetR-VP16 se une a TRE, activando de esta manera la transcripción del gen reportero. En un formato del sistema tet-encendido, el cásete regulador codifica para una proteína híbrida que comprende un represor Tet mutado (rtetR) fusionado al dominio de activación VP16 de HSV. El rtetR es un represor Tet inverso que se une a y activa al TRE en presencia de inductor (por ejemplo, tetraciclina o doxiciclina) . El sistema de Ecdisona se basa en el sistema de inducción de fusión en Drosophila . En un formato, el sistema incluye un cásete regulador que codifica para un receptor de ecdisona funcional, y un cásete reportero que incluye un promotor de respuesta a ecdisona enlazado operablemente a un gen reportero. En presencia de un inductor (tal como ponasterona A o muristerona A) , el receptor de ecdisona se une al promotor de respuesta a ecdisona, activando la transcripción del gen reportero. El sistema de Rapamicina, también conocido como el sistema CID ("inductores químicos de dimerización"), emplea dos proteínas quiméricas. La primera proteína quimérica incluye FKBP12 fusionada a un dominio de unión a ADN que se une a un elemento de respuesta a ADN. La segunda proteína quimérica incluye FRAP fusionada a un dominio de activación de transcripción. La adición de rapamicina causa la dimerización de las dos proteínas quiméricas, activando así la expresión de genes controlados por el elemento de respuesta a ADN.

En un ejemplo, un cásete de expresión recombinante empleado en la presente invención comprende SEQ ID NO: 5. La transcripción de SEQ ID NO: 5 produce un ARNm de XBPl humano no empalmado. El estrés del ER activa IREl, lo cual corta un intrón del ARNm no empalmado. La traducción del ARNm empalmado produce una proteína XBPl madura y funcional, la secuencia de aminoácidos de la cual se ilustra en SEQ ID NO: 6. En otro ejemplo, un cásete de expresión recombinante empleado en la presente invención comprende SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 7 no incluye ninguna secuencia de intrón escindible. La expresión de SEQ ID NO: 7 produce una proteína XBPl humana madura y funcional (SEQ ID NO: 6). Otras secuencias de ácido nucleico que codifican para SEQ ID NO: 6 o un equivalente funcional de la misma también se pueden usar para preparar un cásete de expresión recombinante de la invención. Estas secuencias de ácido nucleico pueden o no incluir intrones u otras secuencias removibles. En otro ejemplo más, un cásete de expresión recombinante empleado en la presente invención comprende SEQ ID NO: 8. La transcripción y traducción de SEQ ID NO: 8 producen una proteína ATF6 humana, cuya secuencia de aminoácidos se ilustra en SEQ ID NO: 9. En un ejemplo más, un cásete de expresión recombinante empleado en la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para los residuos de aminoácido 1-366 de SEQ ID NO: 9. Un ejemplo de esta secuencia de ácido nucleico es los nucleótidos 1-1098 de SEQ ID NO: 8. Los residuos de aminoácido 1-366 de SEQ ID NO: 9 incluyen la región básica completa y la mayoría de la región de la cremallera de leucina de la proteína ATFß humana. Este fragmento ATF6 ha demostrado ser capaz de activar genes GRP78 endógenos. Véase Haze, et al . , MOL. Biol.. CELL., 10:3787-3799 (1999) . Los casetes recombinantes que codifican para proteínas XBPl o ATF6 derivadas de especies no humanas también se pueden usar en la presente invención. Por ejemplo, proteínas XBPl o ATF6 de roedores u otras especies animales pueden usarse. Estas proteínas XBPl o ATF6 pueden seleccionarse de tal forma que la co-expresión de estas proteínas con una proteína de interés mejore el rendimiento de la última proteína en las células huésped. Un cásete de expresión recombinante puede incorporarse en células huésped mediante una variedad de medios. En una modalidad, un cásete de expresión recombinante se introduce en una célula huésped eucariótica usando un vector de transfección o transducción. Los vectores adecuados para este propósito incluyen, pero no están limitados a, vectores de expresión de células de insecto (por ejemplo, vectores de expresión de baculovirus) o vectores de expresión de mamífero. Estos vectores pueden derivare de una variedad de fuentes, tales como episomas, cósmidos, virus o combinaciones de los mismos. En muchos casos, estos vectores incluyen marcadores seleccionables para facilitar su incorporación en las células huésped. En otra modalidad, un cásete de expresión recombinante empleado en la presente invención es construido al modificar un gen endógeno en las células huésped. El gen endógeno puede codificar para una proteína de interés o un componente/modulador del UPR. Muchas porciones de gen endógeno pueden modificarse para lograr un efecto de expresión o regulación deseado. Por ejemplo, el promotor original de un gen endógeno puede ser reemplazado por un promotor viral para incrementar el nivel de expresión del gen. Un cásete de expresión recombinante puede ser incorporado en una célula huésped en varias formas. Por ejemplo, un cásete de expresión recombinante puede ser integrado en un cromosoma o el genoma de una célula huésped. Un cásete de expresión recombinante también puede ser portado por un vector de expresión no integrado en una célula huésped. Los métodos para introducir estable o transitoriamente un vector o cásete de expresión en una célula huésped se conocen en la técnica. En un ejemplo, el vector o cásete de expresión se incorpora en un cromosoma de la célula huésped mediante integración dirigida. Los métodos adecuados para este propósito incluyen, pero no están limitados a, el sistema de recombinación Cre-lox y aquellos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 6,656,727, 6,537,542 y 6,541,231. En muchas modalidades, una célula genéticamente manipulada de la presente invención incluye (1) un primer cásete de expresión recombinante que codifica para una proteína de interés y (2) un segundo cásete de expresión recombinante que codifica para un componente/modulador del UPR (por ejemplo, XBPl o ATF6) . La relación del número total del primer cásete de expresión recombinante sobre el número total del segundo cásete de expresión recombinante en la célula puede variar, por ejemplo, de no más de 0.1:1 a por lo menos 10:1. Ejemplos no limitativos de relaciones adecuadas incluyen de 0.2:1 a 5:1, de 0.5:1 a 5:1, de 1:1 a 2:1, de 1:1 a 3:1, de 1:1 a 4:1, de 1:1 a 5:1, de 2:1 a 3:1, de 2:1 a 4:1, y de 2:1 a 5:1. El primero y segundo casetes de expresión recombinantes pueden ser portados por el mismo o diferentes vectores y conducidos por el mismo o diferentes promotores que tengan las mismas o diferentes potencias. En un ejemplo, el promotor en el primer cásete de expresión recombinante tiene la misma o similar potencia que aquél en el segundo cásete de expresión recombinante, y la relación del número total del primer cásete de expresión recombinante al número total del segundo cásete recombinante en la célula es de al menos 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 o más. Las células huésped adecuadas para la presente invención incluyen células animales o vegetales. Las células huésped pueden ser células cultivadas, tales como líneas de células o cultivos primarios. También pueden ser células en animales o plantas transgénicos. La selección de células huésped adecuadas y métodos para el cultivo, transfección/traducción, amplificación, tamizado, producción de productos y purificación se conocen en la técnica. En una modalidad, las células huésped empleadas en la presente invención son células de mamífero. Ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, células de ovario de hámster chino, células (CHO), células HeLa, células COS, células 293, células CV-1 y otras líneas de células de mamífero colectadas por la Colección Americana de Tipos de Cultivos (Manassas, Virginia) . En ciertos casos, es deseable producir proteínas terapéuticas o profilácticas en células humanas, las cuales comúnmente proporcionan modificaciones post-traduccionales deseadas en las proteínas expresadas. Las células huésped empleadas en la presente invención también pueden ser células híbridas creadas a través de la fusión de dos o más células. En muchos casos, una célula híbrida empleada en la presente invención se genera al fusionar una célula animal (por ejemplo, una célula de mamífero) y una célula de cáncer/inmortal (por ejemplo, una célula de mieloma o blastoma) . La célula animal y la célula de cáncer/inmortal pueden derivarse de la misma especie. También se pueden derivar de diferentes especies. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para producir células híbridas. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, electrofusión o fusión química (por ejemplo, fusión a polietilenglicol) . Un cásete de expresión recombinante puede introducirse o incorporarse en una célula híbrida antes o después del evento de fusión. Por ejemplo, un cásete de expresión recombinante que codifique para una proteína de interés puede ser incorporado en una célula de mamífero antes de que la célula sea fusionada con una célula de cáncer que expresa un componente modulador de UPR exógeno. Para otro caso, una célula de mamífero puede ser primero transfectada o transducida con vectores de expresión recombinantes que codifiquen para una proteína de interés y un componente o modulador de UPR, y luego fusionada con una célula de cáncer. También se pueden usar otros procedimientos para preparar células híbridas de la presente invención. En muchas modalidades, las células de cáncer/inmortales usadas para preparar células híbridas son sensibles a uno o más agentes selectivos. Por ejemplo, las células de cáncer/inmortales pueden ser sensibles a un medio de cultivo que contenga hipoxantina, aminopterina y timidina, el cual se conoce como "medio HAT". Estas células sensibles a HAT son fusionadas a células insensibles a medio HAT. Las células híbridas producidas de esta manera se seleccionan contra HAT, el cual mata a las células no fusionadas. Las células fusionadas son después tamizadas para características deseadas . La presente invención incorpora también animales o plantas que comprenden una célula huésped eucariótica de la presente invención. Los métodos para incorporar una célula recombinante en un animal o una planta se conocen bien en la técnica. En muchas modalidades, los animales o plantas son animales o plantas transgénicos que incluyen uno o más transgenes que codifican para una proteína de interés y un componente/modulador del UPR. Los animales o plantas transgénicos pueden prepararse al usar técnicas estándares. En una modalidad, los animales transgénicos son animales no humanos . La presente invención incorpora además cultivos de células animales vegetales o vegetales que son transfectados o transducidos con uno o más vectores de expresión que codifican para (1) una proteína de interés y (2) un componente/modulador del UPR. Los cultivos de células pueden ser cultivos de células de mamífero, cultivos de células de insecto, cultivos de células vegetales u otros cultivos adecuados para la producción de proteínas de interés. Los vectores de expresión pueden ser transfectados o transducidos transitoriamente o establemente. En una modalidad, los vectores de expresión empleados comprenden un primer cásete de expresión recombinante que codifica para una proteína de interés y un segundo cásete de expresión recombinante que codifica para un componente/modulador del UPR (por ejemplo, XBPl o ATF6) . El primero y el segundo casetes de expresión pueden ser portados por el mismo o diferentes vectores. Pueden ser conducidos por el mismo o diferentes promotores. La relación molar del primer cásete de expresión recombinante sobre el segundo cásete de expresión recombinante puede variar, por ejemplo, de no más de 0.1:1 a por lo menos 10:1. En un ejemplo, el promotor empleado por el primer cásete de expresión recombinante tiene la misma o similar potencia que el promotor empleado por el segundo cásete recombinante, y la relación molar del primer cásete recombinante sobre el segundo cásete recombinante en el cultivo de células varía de 0.5:1 a 10:1, tal como al menos 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, o más.

D. Composiciones Farmacéuticas Una proteína terapéutica o profiláctica producida por la presente invención puede usarse para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente o animal que lo requiera. Una composición farmacéutica de la presente invención incluye típicamente una cantidad efectiva de una proteína terapéutica o profiláctica y un portador farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen solventes, solubilizadores, rellenos, estabilizadores, aglutinantes, absorbentes, bases, agentes reguladores de pH, lubricantes, vehículos de liberación controlada, diluyentes, agentes emulsionantes, humectantes, lubricantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos o antifúngicos, agentes de retraso isotónicos y de absorción, y similares que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conocen bien en la técnica. Agentes complementarios también pueden incorporarse en la composición. Una composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para ser compatible con su ruta de administración deseada. Ejemplos de rutas de administración incluyen administración parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, inhalante, transdérmica, rectal, transmucosal, tópica y sistémica. En un ejemplo, la administración se lleva a cabo por un implante. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: Un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina; propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfato de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; reguladores de pH tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación de origen puede ser encerrada en ampolletas, jeringas desechables o frascos de varias dosis hechos de vidrio o plástico. Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a un paciente o animal en una dosis deseada. Una dosis adecuada puede variar, por ejemplo, de 5 mg a 100 mg, de 15 mg a 85 mg, de 30 mg a 70 mg o de 40 mg a 60 mg. Pueden usarse también dosis de menos de 5 mg o más de 100 mg. La composición farmacéutica puede administrarse en una dosis o en varias dosis. Las dosis pueden administrarse a intervalos tales como una vez al día, dos veces por semana o una vez al mes. La toxicidad y eficacia terapéutica de una proteína terapéutica pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivo de células o modelos de animales experimentales. Por ejemplo, la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) pueden ser determinadas. La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede ser expresado como la relación LD50/ED5o. En muchos casos, proteínas terapéuticas que exhiban grandes índices terapéuticos son seleccionadas . Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos de células y estudios con animales pueden usarse para formular una gama de dosis para usarse en humanos. En una modalidad, la dosis está dentro de una escala que exhibe efectividad terapéutica en al menos 50% de la población con muy poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de esta escala dependiendo de la forma de dosis empleada y de la ruta de administración utilizada. El régimen de dosificación para la administración de una proteína terapéutica producida por la presente invención puede determinarse por el médico que atienda con base en varios factores tales como la acción de la proteína, el sitio de la patología, la severidad de la enfermedad, la edad, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier inflamación, tiempo de administración y otros factores clínicos. En un ejemplo, la administración sistémica o inyectable es iniciada a una dosis que es mínimamente efectiva, y la dosis se incrementa sobre un curso de tiempo preseleccionado hasta que se observe un efecto positivo. Subsecuentemente, incrementos cada vez más en la dosis se hacen limitando a niveles que produzcan un incremento correspondiente mientras se toma en cuenta también cualquier evento adverso que pudiera aparecer. El progreso de un tratamiento puede monitorearse mediante la evaluación periódica de la progresión de la enfermedad. El progreso puede ser monitoreado, por ejemplo, mediante rayos X, MRI u otras modalidades de formación de imágenes, análisis de fluido sinovial o examen clínico. Una proteína terapéutica o profiláctica de interés también se puede introducir en un humano o animal usando un vector de suministro génico. Los vectores adecuados para este propósito incluyen, pero no están limitados a, vectores virales tales como vectores retrovirales, lentivirales, adenovirales, virales adeno-asociados (AAV), virales de herpes, alfavirus, astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus, o togavirus. Los vectores de expresión encapsulados liposómicamente también se pueden usar para el suministro génico. En muchas modalidades, el vector de suministro génico codifica tanto para la proteína de interés como para un modulador UPR. La co-expresión del modulador de UPR incrementa la producción de proteína de interés en las células objetivo (por ejemplo células tumorales u otras células disfuncionales) . La proteína de interés y el modulador de UPR también se pueden suministrar a las células objetivo usando vectores diferentes. El suministro génico puede llevarse a cabo in vivo o ex vivo . En una modalidad, métodos de suministro génico específicos de células se emplean para introducir una proteína terapéutica/profiláctica de interés o un modulador de UPR en las células objetivo. Muchos métodos de suministro de genes específicos de células conocidos en la técnica se pueden usar para la presente invención. Por ejemplo, un ligando específico de células (por ejemplo, un anticuerpo específico para un antígeno de superficie de la célula objetivo) puede ser incorporado conjugado a la envoltura de un vector viral que codifique para una proteína terapéutica/profiláctica o un modulador de UPR. Este ligando puede mediar la entrada del vector viral en un tipo específico de célula. Liposomas conjugados de anticuerpos también se pueden usar para suministrar vectores de terapia génica a células objetivo específicas. Se debe entender que las modalidades descritas arriba y los siguientes ejemplos se dan a manera de ilustración y no de limitación. Varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la presente invención se harán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la presente descripción.

E. Ejemplos Ejemplo 1 Líneas de células COS-1 y DUKX Células COS-1 fueron obtenidas de la Colección Americana de Tipos de Cultivos (ATCC) , Manassas, VA, con el número de ATCC CRL-1650. Células CHO DUKX y células PA DUKX ambas derivadas de CHO-Kl (número de ATCC CCL-61) , el cual es un derivado de las células de ovario de hámster chino (CHO) . Las células CHO DUXK, las cuales también son referidas como células DUXK Bll o DXBH, son deficientes en la producción de dihidrofolato reductasa (dhfr) , una enzima crítica en el proceso de replicación de ADN. Para seleccionar células en las cuales ambos alelos dhfr fueron mutados, Urlaub y Chasin, PROC. NATL. ACAD. SCI. E.U.A., 77:4216-4220 (1980), llevaron a cabo la mutagénesis y selección en dos etapas. El agente selectivo usado contra células dhfr+ fue desoxiuridina tritiada. La desoxiuridina tritiada es tóxica para células debido a su incorporación e ADN y subsecuente decaimiento radioactivo. La incorporación de desoxiuridina en ADN requiere de su conversión e ácido timidílico, un proceso para el cual DHFR es esencial.

Células mutantes de dhfr son incapaces de incorporar desoxiuridina en su ADN y entonces son capaces de sobrevivir en presencia de desoxiuridina tritiada. Algunas células dhfr+ así como mutantes deficientes en algunas otras enzimas necesarias para la incorporación de desoxiuridina en ADN, también pueden sobrevivir. Los mutantes de dhfr pueden distinguirse porque son incapaces de conducir biosíntesis de nuevo de glicina, hipoxantina y timidina; por lo tanto requieren de nucleósidos endógenos para el crecimiento. En la primera etapa de selección usada por Urlaub y Chasin, citado arriba, células tipo silvestre fueron sometidas a mutagénesis con sulfonato de etilmetano (EMS) y seleccionadas con desoxiuridina tritiada en presencia de metotrexato de inhibición de dhfr (MTX) para aislar un presunto heterocigoto (d+/d-) . Usando una concentración de MTX que era suficiente para inactivar todo el DHFR en heterocigoto (d+/d-) , pero no en el ho ocigoto (d+/d+) , el homocigoto tuvo actividad DHFR residual e incorporó desoxiuridina tritiada. En virtud de esta incorporación, las células (the d+/d+) se seleccionaron contra y sólo los heterocigotos fueron capaces de sobrevivir. Después de tres rondas de selección, agrupamiento y expansión de las células sobrevivientes, la línea de células heterocigóticas presuntas, UKB25 fue aislada. Las células UKB25 fueron mutagenizadas más con irradiación gama y seleccionadas en desoxiuridina tritiada en ausencia de MTX. Las colonias supervivientes exhibieron triple auxotrofia para glicina, hipoxantina y timidina, lo cual indicó un fenotipo dhfr. Las colonias que exhibían esta triple auxotrofia fueron clonadas y mostraron ser deficientes en actividad dhfr. El análisis de uno de estos clones mediante hibridación Southern Blot reveló que los genes dhfr no sufren ninguna redisposición general. Este clon fue designado DXB11. Las células DXBll generadas entonces fueron examinadas para confirmar las características predichas de la línea de células. Se encontró que las células DUKX Bll eran genotípicamente similares a la línea de células CHO-Kl de las cuales serán derivadas. Son células CHO tipo diploides, con 20 cromosomas que han sido extensamente estudiados citogenéticamente . El bandeo Geimsa de los cromosomas de la metafase DUKX Bll demostró que las células DUKX Bll son derivados de CHO-Kl. Las células DUKX Bll son deficientes en DHFR y por lo tanto auxotróficas para glicina, nucleósidos de purina y timidina. Este fenotipo deficiente en DHFR de las células DUKX Bll es la base de la selección genética usada para la transferencia de plásmidos de expresión de proteínas heterólogas recombinantes en las células. En algunos experimentos, el medio usado para cultivar células DUKX Bll no contenía hipoxantina o timidina. Sin actividad dihidrofolato reductasa, el único medio para que las células revivan o se dupliquen fue mediante la complementación de nucleósidos en el medio de crecimiento para compensar la incapacidad de las células para hacerlas. Por lo tanto, adenosina, desoxiadenosina y timidina fueron añadidas al medio de crecimiento para células DUKX Bll. Estas se agregaron cada una a una concentración de 10 µg/ml. Esta concentración fue un exceso de lo que las células requerían bajo condiciones de crecimiento a pequeña escala de rutina . Las células DUKX Bll son útiles para introducir plásmidos de expresión que contienen moléculas de ADNcs para proteínas deseadas. Debido a que carecen de la actividad DHFR endógena pueden ser usadas como un marcador seleccionable y amplificable cuando se generen líneas de células para producir proteínas heterólogas. Ya sea al co-transfectar otro vector de expresión que contenga un ADNc para dhfr, o al poner el ADNc de dhfr en cercana proximidad con el ADNc de interés en el mismo vector de expresión, se puede usar la actividad de dhfr como un marcador para el cual las células hayan adoptado el plásmido de expresión que contenga el gen deseado, y sean propensas a producir la proteína deseada. Al retener nucleósidos exógenos después de la transfección, sólo las células que incorporen un vector que contenga el gen dhfr serán capaces de producir dhfr y de esta manera sobrevivir. Las células sobrevivientes pueden producir ahora la proteína deseada. Esto puede lograrse en virtud de un mensaje bicistrónico cuando el ADNc deseado y el dhfr estén en el mismo plásmido, o mediante mensajes individuales cuando los genes estén sobre diferentes plásmidos, los cuales normalmente se co-localizan sobre el cromosoma durante un evento de transfección. Cuando se usan dos plásmidos separados, alterar la relación del plásmido que contiene dhfr al plásmido que contiene ADNc puede incrementar la capacidad de uno para seleccionar células que contengan ambos. Las células DUKX Bll son deficientes en dhfr en virtud de una mutación por puntos en el gen de dhfr y por lo tanto la reversión a un fenotipo dhfr+ es posible. Esta reversión en capacidad de crecer sin nucleósidos exógenos se observó durante un esfuerzo de adaptación en suspensión libre de suero. La población de células DUKX en cultivo permaneció dhfr- durante alrededor de 154 duplicaciones de población acumulativa (CPD) a partir del inicio de un cultivo en suspensión. Sin embargo, cuando la población se revisó nuevamente para la dependencia en nucleósidos exógenos en 190 CPD, fue evidente una reversión fenotípica. Coincidente con el fenotipo dhfr+ es un incremento significativo en la velocidad de crecimiento promedio de estas células. Debido a que el fenotipo dhfr- es deseable para la transfección y estrategias de amplificación génica, una suspensión libre de suero de células DUKX adaptadas se hizo después de 153.8 CPD. Debido a que estas células fueron adaptadas para crecer en suspensión libre de suero y en cultivo de suspensión libre de suero hasta un vector de expresión que era introducido, fueron llamadas "pre-adaptadas", y son referidas como "PA DUKX" . Las monocapas de DUKX dependientes de FBS y no adaptadas pueden usarse para transfectar vectores de expresión. Una vez que se logra la expresión de un gen heterólogo y dhfr, cada nueva línea de células puede ser adaptada a un crecimiento en suspensión libre de FBS. El periodo de adaptación después de la transfección usando células de monocapa es comúnmente largo. Las células DUXK "pre-adaptadas" también se pueden usar como células huésped para transfección. Estas células PA DUKX comúnmente ofrecen ventajas desde una perspectiva de tiempo y esfuerzo ya que el periodo de readaptación a la post-transfección en crecimiento de suspensión libre de suero normalmente es más corta. Véase Sinacore, et al . , BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 52:518-528 (1996) .

Ejemplo 2 Inducción de estrés del ER mediante sobre-expresión de BMP6 en células PA DUKX pSMED2/XBPl y pSMED2/BMP6 (+) o vector pSMED2 completo (-) fue co-transfectado en células PA DUKX. Los vectores de expresión pSMED2/XBPl y pSMED2/BMP6 codifican para XBPl y BMP6, respectivamente. Ambos vectores son conducidos por un promotor de CMV. Las transíecciones se llevaron a cabo en placas de 6 pocilios usando Fugened (Roche, Indianápolis, IN) . El medio de crecimiento para células medio Alfa (Gibco) complementado con nucleósidos y 10% de PBS (inactivado con calor y dializado) y penicilina/estreptomicina/glutamina (Gibco) . Las células fueron usadas en Regulador de Lisis de Células (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) con la adición de 400 mM de NaCl y 1 Complete Mini (una tableta de coctel inhibidor de proteasa de Roche, Indianápolis, IN) . Los usados se tomaron 7, 24, 31 y 48 horas después de la transfección y corridos en un gel de tricina al 10%, seguido por análisis Western blot (figura 1) . El análisis Western blot se llevó a cabo usando regulador de pH de bloqueo de 4% de leche deshidratada sin grasa, 1% de BSA y 0.1% de Tween20 en TBS, y un regulador de pH de lavado de 0.1% de Tween 20 en TBS. Los anticuerpos fueron diluidos en el regulador de pH de bloqueo. La titulación para Western fue 1:1000 anti-XBPl (Santa Cruz Biotechnology) seguida por 1:5000 de anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (The Jackson Laboratory) . La figura 1 indica que la sobre-expresión de BMP6 en células DUKX causó estrés ER, medido por el incremento de la proteína XBPlp (aproximadamente 54 kD) .

Ejemplo 3 Líneas de células establemente transfectadas con XBPl El vector pSMED2/XBPl fue transfectado en células CHO DUKX para crear líneas de células estables. El gen DFHR en el vector pSMED2 permite resistencia a metotrexato (MTX) . Las células transfectadas fueron plaqueadas a concentraciones de MTX de 5, 10 ó 20 nM. Tres colonias de 5 nM de MTX (5-2, 5-4, 5-5), una colonia de 10 nM (10-3) y una colonia de 20 nM (20-10) fueron aisladas. Las células de cada colonia fueron tratadas con (+ ) o sin (-) tunacimicina (Tu) , un químico que se sabe causa estrés del ER. Los Usados fueron corridos en un gen de tricina al 10%, seguidos por análisis Western blot (figura 2) usando anticuerpo anti-XBPl policlonal de conejo (Santacruz Biotechnology) . La figura 2 demuestra que XBPl más maduro se produjo en líneas de células estables para XBPl cuando las células fueron estresadas por tratamiento con Tu. pSMED2/BMP6 fue transfectado transitoriamente en líneas de células XBPl estables (5-2, 5-4 y 20-10) y progenitoras (CHO DUKX) . Los medios condicionados recogidos 48 horas después de la transfección fueron corridos en un gel de tricina al 10%, seguidos por análisis Western blot. La membrana Western blot (figura 3) fue sondeada con un anticuerpo anti-BMP5 monoclonal de ratón (1:2000) el cual reacciona en forma cruzada fuertemente con BMP6. El anticuerpo secundario fue anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (1:5000) (The Jackson Laboratory) . Cada carril en la figura 3 representa un experimento separado para una línea de células respectiva. Como se demuestra en la figura 3, más BMP6 fue secretado en líneas de células estables a XBPl seleccionadas con 5 nM y 10 nM de MTX que en células progenitoras. pSMED2/ILHRFc, que codifica para una proteína ILllRFc, también fue transfectada transitoriamente en líneas de células XBPl estables y progenitoras. Medios acondicionados recogidos 48 horas después de la transfección fueron corridos en un gel de tricina al 10%, seguidos por análisis Western blot. Las membranas de Western blot (figura 4) fueron sondeadas con anticuerpo Fc anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (TheJackson Laboratory) . Más ILllRFc fue secretado en la mayoría de las células XBPl seleccionadas con 5 nM de MTX que en células CHO DUKX.

Ejemplo 4 Comparación de eficiencias de transfección, transcripción y traducción entre líneas de células estables XBPl y sus células CHO progenitoras Células 5-2, 20-10 y CHO DUKX fueron contadas y cantidades iguales se transfectaron transitoriamente con una construcción que codificaba para proteína fluorescente verde (GFP) . Las células fueron visualizadas a una ampliación de 10 x 10 y la eficiencia de transfección (% de células que expresaban GFP) se determinó al comparar células fluorescentes GFP con células totales en tres campos visuales por línea de células. El resultado de la comparación indica que la eficiencia de transcripción de GFP es similar en todas las líneas de células XBPl y CHO DUKX probadas (figura 5) . En un experimento más, construcciones que codificaban para (+) o no codificaban (-) GFP fueron transfectadas transitoriamente en líneas de células estables XBPl y progenitoras. El lisado de células colectado 48 horas después de la transfección se corrió en un gel de tricina al 10%, seguido por análisis Western blot (figura 6) . Cada carril de la figura 6 representa un experimento separado. La membrana de Western blot fue sombreada con anticuerpo anti-GFP policlonal de conejo y anticuerpo anti-actina monoclonal de ratón para control de carga. Como se muestra por la figura 6, la suma de eficiencias de transcripción y traducción para GFP es similar en todas las líneas de células investigadas .

Ejemplo 5 Célula transfectada transitoriamente con ATF6 ADNc marcado con Flag del dominio soluble activo de ATF6 fue clonado en un vector de expresión inducible por Tet/off ptTATOPd y transfectado transitoriamente en células COS-1. El vector ptTATOPd incluye un promotor inducible que controla la expresión de la proteína de fusión que comprende ATF6 y el marcador Flag. El lisado de células colectado 18, 48 y 60 horas después de la transfección fue corrido en un gel de tricina al 10%, seguido por análisis Western blot. La membrana de Western blot (figura 7) fue sondeada con anticuerpo anti-flag. "V" indica un vector ptTATOPd vacío y "P representa un control positivo de flag. Como se ilustra por la figura 7, la proteína ATF6 fue expresada exitosamente en células COS-1 en ausencia de doxiciclina.

Ejemplo 6 La co-expresión de genes objetivo con XBPl o ATF6 en relaciones adecuadas incrementa la secreción de los genes objetivo en células HEK293 HEK293-FT y HEK293-EBNA fueron cultivadas y mantenidas en una incubadora humidificada con 5% de C02 a 37°C en medio 293 de estilo libre (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con 5% de suero de bovino fetal. La expresión transitoria se llevó a cabo en giradores de 50 ml y placas de 24 pocilios, o giratorios de 1L. Para el volumen de cultivo de 50 ml (o IL) , 25 µg (o 0.5 mg para 1L) de ADN plasmídico se mezcló con 400 µg ( 8 mg para 1L) de polietilenimina (PEÍ, 25 kDa, lineal, neutralizado a pH 7.0, mediante HCl, 1 mg/ml, polysciences, Warrington, PA) en 2.5 ml (50 ml para 1L) de medio 293 libre de suero. Los centrifugadores fueron incubados a 37°C con una velocidad de rotación de 170 rpm en un P2005 Stirrer (Bélico) durante 72-144 horas antes de la cosecha. Para un formato de placa de 24 pocilios, 1 µg de ADN se mezclaron con 8 µ de PEÍ en 0.5 ml de un medio 293 libre de suero. Después las mezclas se mezclaron con 0.5 ml de células HEK293 en medio 293 con 10% de FBS a la densidad celular de 0.5xl06 células/ml. Las placas fueron incubadas a 37°C en un agitador Orbital (BellCo) con una velocidad de giro de 300 rpm durante 72 horas antes de la cosecha. Se usaron pSMED2 y pSMEDA para la construcción de ADN. Proteína 1 relacionada con congelación secretada y marcada con Hisd-terminal (sFRP-1) , y agrecanasa-2 marcada con Flag C-terminal (Agg-2) fueron subclonadas en pSMEDA. Tirosina cinasa neutrotrófica marcada con His C-terminal, receptor, tipo 2 (TrkB) fue subclonada en pSMED2. Estos genes subclonados no tienen ningún dominio de transmembrana o citoplásmico, permitiendo así la secreción de los productos expresados . Propl y Prop34-LBD marcados con His-6 C-terminales fueron subclonados en pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Propl y Prop34-LBD fueron derivados de proteína 5 relacionada con receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP5) con la supresión de los dominios de transmembrana y citoplásmico. Las secuencias de aminoácidos de Propl y Prop34-LBD se ilustran en SEQ ID Nos: 10 y 11, respectivamente. SEQ ID NO: 10 incluye un marcador Hisd en los aminoácidos 342-347 y un marcador Flag en los aminoácidos 348-356. SEQ ID NO: 11 incluye un marcador His6 en los aminoácidos 795-800 y un marcador V5 en los aminoácidos 778-794. Un microgramo de Propl-hisd-Flag en pcDNA3.1 fue co-transfectado con 0.3 µg (1:3) o 1 µg (1:1) de XBPlp en vector pSMED2. Tanto pcDNA3.1 como pSMED2 son conducidos por un promotor de CMV. Los medios acondicionados son cosechados 72 horas después de la transfección de ADN. Las muestras fueron separadas mediante SDS-PAGE e inmunoabsorbidas con anticuerpos anti-His4. Experimentos por duplicado (Set#l y Set#2) se llevaron a cabo. Como se muestra en la figura 8A, la co-transfección de XBPl con Propl en las relaciones de 1:1 o 1:3 mejoró drásticamente la expresión de Propl. En otro experimento, 1 µg de Prop34-LBD-V5-his6 en pcDNA3.1 fue co-transfectado con 0.3 µg (1:3) o 1 µg (1:1) de ATF6 en vector ptTATOPd en células HEK293T. Al igual que pSMED2, ptTATOPd también es conducido por un promotor de CMV. Medios acondicionados cosechados 72 horas después de la transfección de ADN se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunoabsorción con anticuerpo anti-His4. La figura 8B muestra que la co-transfección de ATF6 con Prop34-LBD-V5-hisd en la relación de 1:1 ó 1:3 incrementó significativamente la expresión de Prop34-LBD. La figura 9 ilustra los efectos de XBPlp o ATF6 en la expresión de diferentes proteínas objetivo. Propl-hisd-Flag o Prop34-LBD-V5-Hisd en pcDNA3.1 fue co-transfectado con XBPlp en vector pSMED2 o ATF-6 en vector ptTATOPd en células HEK293T. Medios acondicionados cosechados 72 horas después de la transfección de ADN fueron analizados mediante SDS-PAGE e inmunoabsorción con anticuerpo anti-His4. Las señales fueron cuantificadas mediante densitometría como se muestra en la figura 9. Los resultados indican que XBPlp y ATF-6 tienen diferentes efectos en la expresión de Propl y Prop34-LBD. Diferentes efectos de incremento se observaron también para TrkB, sFRP-1, y Agg-2 cuando estas proteínas fueron coexpresadas con XBPlp contra ATF-6. Por ejemplo, la coexpresión con XBPlp incrementó el rendimiento de TrkB en aproximadamente 5 veces, mientras que sólo alrededor de 2 veces de incremento se observó cuando TrkB fue co-expresado con ATF6. La anterior descripción de la presente invención proporciona ilustración y descripción, pero no está destinada a ser exhaustiva o a limitar la invención a la precisa descrita. Modificaciones y variaciones consistentes con las enseñanzas anteriores son posibles o pueden ser adquiridas de la práctica de la invención. Así, se hace notar que el alcance de la invención es definido por las reivindicaciones y sus equivalentes. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una célula animal o vegetal caracterizada porque comprende uno o más casetes de expresión recombinantes que codifican para: una proteína de interés y un componente o no modulador de IREl de una vía de respuesta de proteína desdoblada (UPR) .

2. La célula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es una célula animal, y el componente o no modulador de IREl es una proteína XBPl o ATF6.

3. La célula de conformidad con una de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque el uno o más casetes de expresión recombinantes incluye: al menos un cásete de expresión recombinante que codifica para la proteína de interés y al menos otro cásete de expresión recombinante que codifica para la proteína XBPl o ATF6, y en donde la relación del número total del por lo menos un cásete de expresión recombinante al número total del por lo menos otro cásete de expresión recombinante en la célula es de 0.5:1 a 10:1.

4. La célula de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la relación del número total del por lo menos un c sete de expresión recombinante al número total del por lo menos otro cásete de expresión recombinante en la célula es de por lo menos 3:1.

5. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la célula es una célula de mamífero.

6. Un animal transgénico y no humano, caracterizado porque comprende la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque es una célula híbrida producida al fusionar una célula animal y una célula cancerosa.

8. Una célula animal o vegetal caracterizada porque comprende uno o más casetes de expresión recombinantes que codifican para: una proteína de interés y un polipéptido capaz de unirse a un elemento de UPR (UPRE) o elemento de respuesta a estrés del ER (ERSE) de la célula.

9. La célula de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es una célula animal, y el polipéptido incluye un dominio de activación de transcripción .

10. La célula de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el dominio de activación de transcripción comprende un dominio de activación de transcripción de una proteína XBPl y ATF6.

11. Un cultivo de células animales o vegetales caracterizado porque comprende uno o más vectores de expresión que codifican para: una proteína de interés y un componente o no modulador de IREl de una vía de UPR.

12. El cultivo de células de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el componente o no modulador de IREl es una proteína XBPl o ATF6, y el uno o más casetes de expresión recombinantes incluye: al menos un cásete de expresión recombinante que codifica para la proteína de interés y al menos otro cásete de expresión recombinante que codifica para la proteína XBPl o ATF6, y en donde la relación molar del por lo menos un cásete de expresión recombinante sobre el por lo menos otro cásete de expresión recombinante en la célula es de 0.5:1 a 10:1.

13. El cultivo de células de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el cultivo de células es un cultivo de células de mamífero, y la relación molar del por lo menos un cásete de expresión recombinante sobre el por lo menos otro cásete de expresión recombinante en la célula es de por lo menos 3:1.

14. Un método caracterizado porque comprende expresar una proteína de interés en una célula animal o vegetal, la célula incluye uno o más casetes de expresión recombinantes que codifican para: la proteína de interés y un componente o no modulador de IREl de una vía de UPR.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la célula es una célula animal, y el componente o no modulador de IREl es una proteína XBPl o ATF6.

16. Un método caracterizado porque comprende expresar una proteína de interés en una célula animal o vegetal, la célula incluye uno o más casetes de expresión recombinantes que codifican para: la proteína de interés y un polipéptido capaz de unirse a un UPRE o ERSE de la célula.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la célula es una célula animal, y el polipéptido comprende un dominio de activación de transcripción de una proteína XBPl o ATF6.

18. Un método caracterizado porque comprende expresar una proteína de interés en un cultivo de células animales o vegetales, el cultivo de células siendo transfectado o transducido con uno o más vectores de expresión que incluyen: al menos un cásete de expresión recombinante que codifica para la proteína de interés y al menos otro cásete de expresión recombinante que codifica para un componente o no modulador de una vía de UPR.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el cultivo de células es un cultivo de células de mamífero, y el componente o no modulador de IREl es una proteína XBPl o ATF6 , y en donde la relación molar del por lo menos un cásete de expresión recombinante sobre el por lo menos otro cásete de expresión recombinante en el cultivo de células es de 0.5:1 a 10:1.

20. Un vector de expresión caracterizado porque codifica: un proteína de interés terapéutica o profiláctica y un componente o no modulador de IREl de una vía UPR.