KR20100099190A - Ｓｍ-단백질 기반의 분비 조작 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 배양 기술 분야에 관한 것이다. 본 발명은 SM 단백질 패밀리의 Munc18c, Sly1 또는 다른 구성원의 이종 발현에 의해 진핵생물 세포에서 단백질의 분비 수송을 증가시키는 신규 방법을 설명한다. 본 방법은 재조합 단백질 산물의 발현 및 제조를 위한 생산능이 증가된 최적화된 숙주 세포계의 생성에 특히 유용하다.

Description

ＳＭ-단백질 기반의 분비 조작{SM-protein based secretion engineering}

본 발명은 세포 배양 기술 분야에 관한 것이다. 본 발명은 단백질을 생산하는 방법뿐 아니라 생물약제(biopharmaceutical)를 제조하기 위한 신규 발현 벡터 및 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제학적 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

사람 치료법에 사용되는 생물약제 시장은 고속으로 성장을 계속하고 있고, 2003년에는 270개의 신규 생물약제가 임상 연구에서 평가되고 있고 추정 매출은 300억이다. 생물약제는 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 사람 유래의 세포주를 비롯한 포유동물 세포 등의 다양한 숙주 세포계로부터 생산될 수 있다. 현재, 증가하는 생물약제의 수는 사람 단백질을 정확하게 프로세싱 및 변형시키는 능력이 있는 이유로 인해 진핵생물 세포로부터 생산되고 있다. 이에 이러한 세포로부터 생물약제의 성공적이고 높은 생산 수율은 중요하고 본 방법에 사용되는 재조합 모노클로날 세포주의 특징에 크게 좌우된다. 따라서, 성질이 개선된 새로운 숙주 세포계를 생산하고 고수율인 방법의 기본으로서 특정 생산성이 높은 생산자(producer) 세포주를 배양하는 방법을 수립하는 것이 절실히 요구된다.

임의의 생물약제 생산 과정의 수율은 공정 조건 하에서 증식했을 때 생산 세포가 시간당 분비하는 단백질 산물의 양에 주로 좌우된다. 진핵생물 세포로부터 치료용 단백질을 합성하고 분비하도록 하는 데에는 많은 복잡한 생화학적 세포내 과정이 필요하다. 전사, RNA 수송, 해독, 해독후 변형 및 단백질 수송과 같은 단계들은 모두 야생형 숙주 세포주에서 엄격하게 조절되는 것으로, 이 숙주 유래의 임의의 생산자 세포주의 특정 생산성에 영향을 미칠 것이다.

과거, 대부분의 유전자조작 시도는 전사 및 해독과 같은 과정이 단백질 생산 시의 상기 단계들의 수율이 증가하도록 하는 분자 네트워크에 초점을 맞추었다. 하지만, 임의의 다단계 생산 과정에 있어서, 이 과정 사슬의 초기 단계 동안 병목(bottleneck)의 확대는 추가로 하류에서, 특히 분비 경로에서 해독후에 병목을 발생시킨다. 생산 세포의 특정 생산성은 특정 역치까지는 산물 유전자 전사 수준과 선형의 상관관계가 있는 것으로 보고되었다.

하지만, mRNA 수준에서 산물 발현의 추가 증강은 단백질 합성, 폴딩 또는 수송 기전의 과부하로 이어질 수 있고, 결과적으로 단백질 산물을 세포내 축적시킨다. 사실상, 이것은 현행 제조 방법들에서 빈번하게 관찰할 수 있다. 따라서, 생산 세포주의 분비 수송 기전은 신규 숙주 세포 조작 전략의 흥미로운 표적이다.

분비형 치료용 단백질의 세포내 수송을 조작하는 데에 대한 최초의 연구들은 결합 단백질 BiP/GRP78 및 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)와 같은 분자 샤페론(chaperone)의 과발현을 중심으로 이루어졌다. 샤페론은 소포체(ER) 내에 거주하는 세포 단백질이고, 새로 합성된 단백질의 폴딩과 어셈블리를 보조한다. 하지만, 예상할 수 있는 것과 반대로, 포유동물 세포에서 BiP 과발현은 이것이 결합한 단백질의 분비를 증가시키기보다는 감소시키는 것으로 밝혀졌고, CHO 세포에서 PDI의 과발현은 다른 단백질 산물마다 상반되는 결과를 산출했다. 이러한 놀라운 발견에 대한 가능한 설명은 세포의 단백질 폴딩능의 증가가 추가로 하류에서 생산 병목 현상을 초래한다는 것으로, 이것은 CHO 세포주에서 IFN-감마 생산 시의 ER에서 시스-골지 수송 문제를 설명하는 보고서(Hooker et al., 1999)에 의해 뒷받침된다.

요약하면, 재조합 단백질 생산을 위해서는 숙주 세포의 분비능을 향상시킬 필요가 있다. 이것은 해독후 병목 현상 및 단백질 산물의 세포내 축적을 방지하기 위하여 신규 전사 증강 기술과 함께 고역가 과정에서 더욱 중요해질 수 있다. 하지만, 현재 분비 수송 기전의 표적 조작으로 향하는 길에 2가지 주요 장애가 있다: 기본적인 조절 기전에 대한 여전히 제한된 지식 및 분비 과정에서 추가 하류 단계들로 병목 이동 현상을 방지해야 하는 문제.

본 발명은 Sec1/Munc18(SM) 단백질 패밀리 구성원들, 특히 두 구성원, 즉 Munc-18c 및 Sly1이 원형질막과 분비형 소포의 융합을 조절하고 세포 표면으로 분비된 단백질의 수송에 있어서 여러 후속 단계들을 연합해서 촉진하여 전체 엑소사이토시스(exocytosis)를 자극하는데 있어서 새롭고 놀라운 역할을 한다는 것을 기술한다. 또한, 본 발명은 진핵생물 세포로부터 분비 경로를 통해 수송되는 단백질의 생산을 효과적으로 향상시키는 방법을 제공한다. 나아가, 본 발명은 질병 및 염증성 상태의 치료를 위한 표적화된 분비 경로의 조작의 용도에 대해 설명한다.

단백질 분비는 복잡한 다단계 기전이다: 세포외 공간 또는 외측 원형질막으로 수송될 운명인 단백질은 먼저 소포체 내로 해독과 동시에 이입된다. 여기서, 지질 소포에 싸여서 골지체로 이송되고, 마지막에 트랜스-골지 네트워크로부터 원형질막으로 수송되어, 여기서 배양 배지로 방출된다.

각 트래피킹(trafficking) 단계에서, 소포 및 표적 막 유래의 SNARE[용해성 NSF(N-에틸말레이미드 민감성 인자) 부착 수용체] 단백질은 융합이 일어나는데 필요한 코어 기구를 구성하는 트랜스-SNARE 복합체를 형성한다. 다양한 상황에서 생리적 요구를 맞추기 위해서, SNARE 매개의 융합 기구는 세포내 및 세포외 근원 유래의 자극이 적당히 통합되도록 하기 위해 공간적 및 시간적으로 조정할 수 있어야 한다.

Sec1/Munc18(SM) 단백질은 SNARE 단백질을 조절하는 열쇠를 보유하고 있는 것으로 보인다. 2개의 SM 단백질, Sly1 및 Munc18(3가지 이소폼(isoform) a, b 및 c를 포함해서)은 분비 경로(ER-골지-원형질막)를 따라 소포 융합에 관여한다. Sly1은 소포체(ER) 유래의 COPII 소포의 골지체에 대한 융합에 필요하고 Munc18은 분비성 소포의 원형질막(PM)에 대한 융합에 필요하다.

본 발명에서, 본 발명자들은 분비 경로에 미치는 Sly1 및 Munc18c의 생리적 영향을 분석한 결과, 두 SM 단백질이 만장일치로 전체 엑소사이토시스를 자극한다는 것을 최초로 발견했다. Munc18c 및 Sly1에 의한 활성화 역할의 분자 기전은 또한 보존되는 것 같다. 이러한 발견을 기초로 하여, 본 발명자들은 포유동물 세포에서 분비를 증대시키는 SM 단백질-기반의 분비 조작을 개척했다. SM 단백질-기반의 분비 조작은 대사 조작의 새로운 전략을 나타내고 산업계에서 단백질 약제의 제조에 새로운 기반을 제공한다.

본 발명에 기술된 방법은 여러 가지 관점에서 유리하다:

첫째, 본 발명자들은 Munc-18c, Sly-1 또는 이 두 단백질의 이종 발현이 숙주 세포의 분비능을 증가시켜 재조합 단백질 생산을 증대시키는 전략이라는 것을 증명해 보인다.

산업상 이용분야와 관련해서, 본 연구는 분비 과정에서 해독후에 작용을 발휘하는 도입유전자의 도입을 통한 유전자 조작에 의해 상기 병목 현상을 우회하는 출구 가능성을 개시한다. 이것은 특히 최근 생성된 고 효율의 발현 벡터의 사용으로 인해 생산자 세포주 내에서 단백질 폴딩, 단백질 변형 및 수송 기구의 과부하가 야기되어 이론적 최대 생산성을 감소시키는 경우에 적절한 것으로 보인다. Munc18 및/또는 Sly1과 같은 SM 패밀리의 분비 증강 단백질의 이종 도입은 이러한 제한을 극복할 수 있다.

둘째, SM 단백질은 효모에서부터 사람에 이르기까지 진화적으로 보존된다: 효모에는 4가지 SM 단백질(Sec1p, Sly1p, Vps33p 및 Vps45p)이 있고, 초파리에는 3가지(ROP, Sly1 및 Vps33/카네이션)가 있으며, 벌레에는 6가지(Unc-18 뿐만 아니라 게놈 서열 데이터베이스에 따른 5가지 다른 유전자)가 있고, 척추동물에는 7가지 단백질(Mnnc18-1, -2 및 -3, VPS45, VPS33-A 및 -B, 및 Sly1)이 있다. 종에 걸쳐 보존도가 높음으로 인해, SM 단백질은 효모에서부터 벌레 및 곤충 세포를 거쳐 포유동물계까지 모든 진핵생물 숙주 세포 종에서 단백질의 분비 및 세포-표면 발현을 조절하는데 사용될 수 있을 가능성이 매우 크다.

셋째, SM 단백질 패밀리의 모든 구성원은 전체 서열 상에서 고도의 서열 유사성을 나타내어, 유사한 전반적 구조를 보일 것이라는 것을 시사한다. 더욱이, 기능상실(loss-of-function) 돌연변이는 4개의 종에 존재하는 9개의 SM 유전자에서 설명된 바 있고, 이들은 모두 소포 트래피킹 및 융합의 심한 장애를 야기하는바, SM 단백질이 소포 수송 및 분비 과정에 유사한 중심 역할을 할 것이라는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에 기술한 목적에 Munc18 및/또는 Sly1의 적용가능성이 SM 단백질 패밀리의 다른 임의의 구성원에도 동일하게 전이될 수 있음을 주장한다.

넷째, SNARE 매개의 소포 융합 기구를 조절함에 의해, SM 단백질 패밀리의 구성원들은 ER에서 골지로, 골지에서 원형질막으로, 그리고 최종 엑소사이토시스 융합에 이르는 소포 트래피킹의 여러 단계에 모두 관여한다. 즉, 분비 수송 사슬의 연속 단계에 관여하는 다수의 SM 단백질의 이종 발현은 막관통 단백질의 세포 표면 발현 또는 전반적인 엑소사이토시스에 부가 효과 또는 심지어 상승작용적 효과를 초래할 가능성이 있다. 더욱이, 단백질 수송의 출발점으로서 ER과 전사 인자 XBP-1의 이종 공동발현에 의한 동시 조작은 그러한 분비 증강 효과를 더욱 증가시킨다.

다섯째 이점으로서, SM 단백질은 또한 분비 경로의 최후 단계, 즉 원형질막으로 소포 수송에도 영향을 미쳐, 이후 하류의 병목을 발생시킬 위험 없이 단백질 분비를 촉진한다.

이를 종합하면, ER부터 골지로, 그리고 골지체에서 원형질막으로 소포-매개의 단백질 수송의 모든 단계에서 SM 단백질의 관여는 Munc18c, Sly1 및 다른 모든 SM 패밀리 단백질을 진핵생물 세포의 분비능을 증강시키기 위한 (다중) 유전자 조작 시도의 매우 매력적이고 유망한 표적으로 만든다.

본 발명에 설명된 소포-매개의 단백질 수송의 표적화된 조작은 매우 다양한 응용분야에 이용할 수 있다. 특히, 2가지 기본 시도로 나뉠 수 있다:

(i) 세포의 분비 수송능을 증가시키는 SM 단백질 활성의 증강 및/또는 과발현, 또는

(ii) 암세포 증식 및/또는 침입을 감소시키기 위한 유전자 요법의 수단으로서 SM 단백질 활성 및/또는 발현의 감소.

SM 단백질 과발현의 적용가능성:

본 발명은 SM 패밀리 단백질의 과발현으로 세포의 전반적인 단백질 분비능을 향상시킴으로써 이종 단백질 생산용의 개량된 진핵생물 숙주 세포를 수득하는 방법을 기술한다.

이로 인해, 진핵생물 세포를 기반으로 한 생산 과정에서 단백질 수율이 증가한다. 이것은 이러한 과정의 상품 비용을 줄이고 동시에 연구 조사, 진단, 임상 연구 또는 치료용 단백질의 시장 공급에 필요한 물질을 수득하기 위해 제작되어야 하는 배취(batch)의 수를 감소시킨다. 또한, 본 발명은 종종 임상전 연구를 위해 충분한 양의 물질의 수득이 시간 일정을 고려한 중요한 작업 패키지인 경우에 약물 개발을 가속화한다.

본 발명은 진단 목적, 연구 목적(표적 확인, 선도(lead) 확인, 선도 최적화)의 하나 또는 여러 특정 단백질의 생산이나, 또는 판매 중이거나 임상 개발 중인 치료용 단백질의 제조에 사용되는 모든 진핵생물 세포의 단백질 생산능을 증가시키는데 사용될 수 있다.

본 출원에 제시된 바와 같이, SM 단백질의 이종 발현은 분비 효소, 성장인자 및 항체를 비롯한 모든 클래스의 단백질의 생산을 증가시킨다. 막관통 단백질은 SM 단백질과 SNARE의 상호작용에 의해 조절되는 동일한 소포-매개의 수송 경로를 공유하는바, 이 조작 시도는 막관통 단백질의 수송을 향상시키고 세포 표면 상에 상기 단백질의 과잉을 증대시키는데 똑같이 적용할 수 있다.

따라서, 본 명세서에 기술된 방법은 세포 표면 수용체의 기능을 특성 분석하기 위한 이론적 및 산업적 연구 목적에도 사용할 수 있다. 예컨대, 표면 단백질의 생산 및 후속 정제, 결정화 및/또는 분석에 사용할 수 있다. 또한, 기술한 방법에 의해 수득되는 막관통 단백질 또는 이 단백질을 발현하는 세포는 선별 분석들, 예컨대 물질의 선별, 고아 수용체(orphan receptor)용 리간드의 확인 또는 선도 최적화 동안 개량된 효과를 조사하는데 사용할 수 있다. 이것은 약물 표적의 주요 클래스가 세포 표면 수용체일 때 신규 사람 약물 치료법을 개발하는데 매우 중요하다.

더욱이, 본 명세서에 기술된 방법은 세포-표면 수용체와 관련 있는 세포내 시그널링 복합체의 연구 또는 용해성 성장인자와 이에 대응하는 동일 세포 또는 다른 세포 상의 수용체와의 상호작용에 의해 부분적으로 매개되는 세포-세포 정보전달의 분석에 유리할 수 있다.

SM 단백질 발현 및/또는 활성의 감소/저해의 이용가능성:

본 발명에서, 본 발명자들은 SM 발현의 감소가, Munc18c 및 Sly1로 나타낸 바와 같이, 용해성 세포외 단백질의 분비 감소를 야기한다는 증거를 제공한다. 이는 SM 단백질을 치료 처치의 유망한 표적으로 만든다.

건강한 정상 세포로부터 암세포로의 변환에 있어서 지표 중 하나는 외인성 성장인자의 존재로 인한 독립성 획득이다. 정상 세포와 달리, 종양 세포는 스스로 생존 및 증식에 필요한 모든 성장인자를 생산할 수 있다. 이러한 자기분비 기전 외에, 암세포는 종종 표면에 성장인자 수용체의 상승조절된 발현을 나타내어, 주위 조직의 세포로부터 분비된 주변분비 작용성 성장 및 생존 인자를 향한 증가된 민감도를 초래한다. shRNA-, siRNA- 또는 안티센스 RNA- 시도 등의 사용으로 종양 세포의 Sly-1 및 Munc18과 같은 SM 단백질을 표적화하면, 자기분비 뿐만 아니라 주변분비 성장-자극 및/또는 생존 기전을 다음과 같은 2가지 방식, 즉 (i) 성장인자 수송 및 분비의 감소시킴, 및 (ii) 종양 세포 상의 수용체와 대응 성장인자의 양을 저하시킴에 의해 파괴하는 것이 가능할 수도 있다. 이러한 방식 모두에 의하면, 성장 자극 시그널의 양 및 암세포가 이러한 시그널을 인식하여 반응하는 능력이 감소할 것이다. 따라서, 암세포에서의 SM 단백질 발현 또는 활성의 저해는 암세포 증식 및 생존을 방해할 강력한 도구이다.

또한, SM 단백질은 종양 침입 및 전이를 억제할 강력한 치료 표적인 것으로 보인다. 대부분의 사람 암 종류는 후기 단계 동안 원발성 종양이 전출하는 개척 세포를 산출하고, 인접 조직에 침입하고, 전이라고 알려진 신규 클로니를 성공적으로 설립할 수 있는 먼 부위로 이동한다.

조직 침입의 전제조건으로, 암세포는 이 세포가 주위 건강 조직을 통해 이주하고, 기저막을 통과하여 혈류로 유입되고, 마지막에 목적 조직에 침입할 수 있도록 하는 프로테아제의 전체 세트를 발현한다. 이러한 프로테아제 중 일부, 예컨대 MT-MMP 및 ADAM은 막결합 단백질로 발현한다. 이들은 바탕질 재구성, 성장인자의 이탈(shedding) 및 종양 침입에 중요한 역할을 하기 때문에, 프로테아제 자체가 암치료의 약물 표적으로 논의된다. 본 발명자들은 종양 세포에서 SM 단백질 발현 및/또는 활성의 저해가 표적화된 세포의 표면에 존재하는 막-결합 프로테아제의 양을 감소시킨다는 것을 주장한다. 이것은 종양 세포의 침입능 뿐만 아니라 성장인자 이탈능을 감소시키거나 심지어 손상시켜, 종양의 침입 및 전이 잠재성을 감소시킨다. 따라서, SM 패밀리 단백질의 표적화는 후기 종양형성, 특히 양성/고형 결절로부터 공격성 전이성 종양으로의 변환을 예방하는 신규 방법을 제공한다.

이에 따라, 치료학적 적용에서는 SM 단백질의 활성 및/또는 발현을 감소시키고/시키거나 저해하는 것이 목표이다. 이것은 SM 단백질의 기능을 저해하여 질환을 치료하는 사람 치료제로서 사용되는 뉴클레오타이드 조성물에 의해 달성될 수 있고, 여기서 약물은 SM 단백질의 RNA의 서열 모티브에 결합을 통해 SM 단백질을 특이적으로 저해하는 shRNA, RNAi, siRNA 또는 안티센스 RNA로 구성된다. 또한, SM 단백질 활성/발현의 감소/저해는 각 SM 단백질 유전자의 프로모터에 결합하여 사일런싱시키는 뉴클레오타이드를 함유하는 약물 성분에 의해 달성될 수도 있다.

또한, 약물 물질 또는 산물은 SM 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 신규 화학적 실체 또는 펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 단백질이 활성 약제 화합물인 경우에, 이것은 (i) SM 단백질의 프로모터에 결합하는 발현을 저해하는 단백질, (ii) SM 단백질 또는 이의 상호작용 파트너(예, SNARE 복합체 내의 단백질 또는 신탁신)에 결합하여 SM 단백질과 이의 결합 파트너와의 기능적 상호작용을 방해하는 단백질, (iii) SM 단백질과 유사하지만 기능을 수행하지 않는, 즉 "우성-음성(dominant-negative)" SM 단백질 변형체를 의미하는 단백질, 또는 (iv) SM 단백질 및 이의 결합 파트너의 스캐폴드(scaffold)로 작용하여, 단백질의 비가역적 결합 및 안정한 비기능성 단백질 복합체의 형성을 초래하는 단백질.

본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물을 이용한 신규 방법이 제공된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 암 또는 다른 이상 증식 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 암은 2가지 방식으로 분류한다: 암이 발생한 조직의 종류(조직학적 종류) 및 암이 최초로 발생한 신체 위치 또는 원발 부위. 암이 발생하는 가장 일반적인 부위로는 피부, 폐, 여성 유방, 전립선, 결장 및 직장, 림프구계, 자궁경부 및 자궁.

따라서, 화합물은 다양한 암 치료에 유용하며, 그 예로는 다음을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다:

AIDS 관련 암, 예컨대 카포시 육종; 골 관련 암, 예컨대 유잉계 종양 및 골육종; 뇌 관련 암, 예컨대 성인 뇌종양, 소아 뇌 줄기 신경아교종, 소아 소뇌 별아교세포종, 소아 뇌 별아교세포종/악성 신경아교종, 소아 뇌실막세포종, 소아 수모세포종, 소아 천막상 원시 신경외배엽 종양, 소아 시각경로 및 시사항부 신경아교종 및 다른 소아 뇌 종양; 유방암; 소화/위장 관련 암, 예컨대 항문암, 간외 담관암, 위장 유암종 종양, 결장암, 식도암, 담낭암, 성인 원시 간암, 소아 간암, 췌장암, 직장암, 소장암 및 위암; 내분비 관련 암, 예컨대 부신피질 암종, 위장 유암종 종양, 섬세포 암종(내분비 췌장), 부갑상선 암, 크롬친화세포종, 하수체 종양 및 갑상선 암; 눈 관련 암, 예컨대 안내 흑색종 및 망막모세포종; 비뇨생식 관련 암, 예컨대 방광암, 신장(신장세포)암, 음경암, 전립선 암, 전이 세포 신우 및 요관암, 정소암, 요도암, 윌름즈 종양 및 다른 소아 신장 종양; 배세포 관련 암, 예컨대 소아 두개외 배세포 종양, 고환외 배세포 종양, 난소 배세포 종양 및 정소암; 부인과 관련 암, 예컨대 자궁경부암, 자궁내막암, 임신 융모성 종양, 난소 상피암, 난소 배세포 종양, 난소 저악성 잠재성 종양, 자궁 육종, 질 암 및 외음부 암; 두경부 관련 암, 예컨대 하인두 암, 후두 암, 입술 및 구강 암, 잠재 원시 비인두 암을 동반한 전이성 편평 경부 암, 구강인두 암, 부비동 및 비강 암, 부갑상선 암 및 침샘 암; 혈액학적/혈액 관련 암, 예컨대 백혈병, 예컨대 성인 급성 림프아구성 백혈병, 소아 급성 림프아구성 백혈병, 성인 급성 골수계 백혈병, 소아 급성 골수계 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수 백혈병 및 털세포 백혈병; 및 림프종, 예컨대 AIDS-관련 림프종, 피부 T-세포 림프종, 성인 호지킨스 림프종, 소아 호지킨스 림프종, 임신 중의 호지킨스 림프종, 균상식육종, 성인 비호지킨스 림프종, 소아 비호지킨스 림프종, 임신 중의 비호지킨스 림프종, 원시 중추신경계 림프종, 세자리 증후군, 피부 T-세포 림프종 및 발덴스트롬 마크로글루볼린혈증 및 다른 혈액학적/혈액 관련 암, 예컨대 만성 골수증식 장애, 다발성골수종/형질세포 신생물, 골수이상 증후군 및 골수이상/골수증식성 질환; 폐 관련 암, 예컨대 비-소세포 폐암 및 소세포 폐암; 근골격 관련 암, 예컨대 유잉계 종양, 골육종, 골의 악성 섬유 조직구증, 소아 횡문근육종, 성인 연조직 육종, 소아 연조직 육종 및 자궁 육종; 신경계 관련 암, 예컨대 성인 뇌종양, 소아 뇌종양, 뇌줄기 신경아교종, 소뇌 별아교세포종, 뇌 별아교세포종/악성 신경아교종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경아교종 및 다른 뇌 종양, 예컨대 신경아세포종, 하수체 종양 및 원시 중추신경계 림프종; 호흡계/흉부 관련 암, 예컨대 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종, 흉선종 및 흉선 암종; 피부 관련 암, 예컨대 피부 T-세포 림프종, 카포시 육종, 흑색종, 메르켈 세포 암종 및 피부암.

이 장애들은 사람에서는 충분히 특성 규명되어 있지만, 다른 포유동물에서도 유사한 병인이 존재하고, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있다.

치료용의 경우, 화합물은 임의의 통상의 방식에 따라 임의의 통상의 투약 형태로 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여 경로로는 정맥내, 근육내, 피하, 윤활막내, 주입, 설하, 경피, 구강, 표면 또는 흡입, 정제, 캡슐, 캐플릿, 액체, 용액, 현탁액, 유탁액, 로젠지, 시럽, 복원성 분말, 과립, 좌약 및 경피 패치가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 투약 형태의 제조방법은 공지되어 있다(예컨대, H.C. Ansel and N.G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., Lea and Febiger (1990)). 치료학적 유효량은 체중, 대사 및 중증도 등에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 활성 화합물의 용량은 1일 기준으로 체중 kg당 약 1mg 내지 약 500mg인 것이 바람직하다. 활성 화합물의 용량은 1일 기준으로 체중 kg당 약 1mg 내지 약 100mg 범위인 것이 더욱 바람직하다.

화합물은 단독 투여할 수 있고, 또는 저해제의 안정성을 증강시키고 특정 양태에서 이 화합물을 함유하는 약제학적 조성물의 투여를 용이하게 하며, 용해 또는 분산을 증가시키고, 저해 활성을 증가시키며, 보조 요법을 제공하는 보강제 등과 함께 투여될 수 있다. 이러한 배합물은 활성 성분의 투여량을 저하시켜, 가능한 독성 및 부작용을 감소시킬 수 있어 유리하다.

본 발명에 따른 화합물과 함께 사용하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체 및 보강제로는, 예컨대 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충제 물질, 물, 염 또는 전해질 및 셀룰로스계 물질이 있다. 이것은 가능한 약제학적으로 허용되는 담체 및 보강제의 전체 목록은 아니며, 당업자라면 당업계에 충분히 알려진 다른 가능성을 알고 있을 것이다.

요약하면, 본 발명은 Munc18c, Sly1 또는 SM 단백질 패밀리의 다른 구성원 및 이의 조합물의 이종 발현에 의해 진핵생물 세포에서 단백질의 분비 수송을 증강시키는 신규 방법을 기술한다. 이 방법은 특히 재조합 단백질 산물을 발현 및 제조하기 위한 생산능이 증대된 최적화된 숙주 세포계의 생성에 특히 유용하다.

Sec1/Munc18(SM) 단백질은 세포내 단백질 수송에서 막 융합에 필요하지만, 이들의 작용 성격은 단일화되기보다는 다양한 것으로 오래전에 제안되었고, 그 이유는 부분적으로 SM 단백질과 SNARE 간의 상호작용의 이종성 때문이다. 본 발명에서, 본 발명자들은 두 SM 단백질이 분비 경로에 미치는 생리적 영향을 평가한다. 중요한 발견은 원형질막 및 골지에 소포 융합 시에 관여하는 Munc18c 및 Sly1이 전반적인 엑소사이토시스를 만장일치로 자극한다는 것이다. 이러한 모델과 일치하는 것으로, 본 발명자들은 Sly1 및 Munc18c가 녹다운(knock down)될 때 전반적인 엑소사이토시스가 감소된다는 것을 보여준다(도 3). 이에 반해, 과발현에 의한 Sly1의 상승된 수준은 분비능을 증가시킨다(도 4). 중요하고 놀라운 것은, Munc18c가 또한 숙주 세포의 분비능을 유의적으로 자극한다는 것이다. 이를 지지하기 위해, 본 발명자들은 Munc18c가 PM(원형질막)에 융합하기 위해 특별한 SNARE 복합체에 직접 결합한다는 것을 증명했다(도 5).

종래 연구에서는 Munc18c가 엑소사이토시스에서 저해 역할을 하는 것으로 지정되었고(Riento et al., 2000; Kanda et al., 2005; Tellam et al., 1997; Thurmond et al., 1998), 이것은 본 발명의 결과와 상반된다. 트래피킹 기구에서, 특히 신탁신 4, SNAP-23 및 VAMP2로 이루어진 엑소사이틱 SNARE 단백질과의 상호작용에서의 Munc18c의 역할을 분자적으로 조사하기 위해, 본 발명자들은 면역침전 실험을 보고한다. 도 5에 도시된 바와 같이, Munc18c-특이적 항체는 Munc18c를 상당한 비율의 신탁신4, SNAP-23 및 VAMP 2와 함께 정량적으로 침전시키며, 이것은 분비 경로에서 소포-소기관 융합을 촉진하는, Munc18c와 상기 SNARE와의 생체내 관련성을 시사한다(Peng and Gallwitz, 2002; Shen et al., 2007; Scott et al., 2004). 이러한 발견은 완전 조립된 SNARE 복합체에 결합하고 골지체의 융합을 촉진하는 Sly1과 마찬가지로, Munc18c가 SNARE 복합체와 직접 상호작용한다는 것을 강조하며, 이는 SNARE-매개의 트래피킹 기구를 촉진함에 의한 보존적인 작용 기전을 시사한다.

따라서, Sly1 및 Munc18c 기능의 기구 및 생리적 역할은 SNARE 매개의 분비 경로에서 보존된다.

SM 단백질 기반의 분비 조작은 Sly1, Munc18c 및 일반 소기관-확장 인자 Xbp-1이 과발현될 때, 효소, 성장 호르몬 및 면역치료성 모노클로날 항체를 비롯한 다양한 단백질의 엑소사이토시스를 증대시킨다.

본 출원의 데이터는 Munc18c 및 Sly1로 나타낸 바와 같이, 동일한 세포 내에서 두 SM 단백질의 동시 과발현 시에 단백질 분비에 미치는 부가 효과 또는 심지어 상승작용성 효과를 입증한다. 따라서, 본 발명의 데이터는 SANRE-매개의 트래피킹 기구를 자극하는데 있어서 SM 단백질의 단일화된 기능의 모델을 지원하고 분비 증대를 위한 해독후 조작의 신규 전략을 나타낸다.

종합하면, 본 출원에서 본 발명자들은 엑소사이틱/분비 경로에서 SM 단백질의 단일화된 활성화 역할에 대한 놀라운 증거를 최초로 제공한다. 이러한 발견을 기초로 하여, 본 발명자들은 증대된 엑소사이토시스가 성공적으로 달성되는 SM 단백질 기반의 해독후 조작을 개척한다.

단백질 치료제의 효과적인 생산은 생물공학 산업에 큰 과제로 남아 있다. 지금까지 다양한 여러 대사 조작 전략이 개발되었다. 예를 들어, 전사 증가(전사 조작); 포유동물 세포의 해독 성능 조절(해독 조작); 특정 당형태의 생산 자극(글리코실화 조작); 대사 에너지의 산물 형성으로 배타적 재유도(증식 조절 기술) 및 생산 세포주의 생육성 개선(항아폽토시스 조작) 전략이 있다. 하지만, 조직화된 분비 기구를 기반으로 하는 대사 조작은 불투명한 상태로 남아 있다. Sly1 및 Munc18c가 전반적인 엑소사이토시스를 만장일치로 자극한다는 발견에 기초하여, 본 발명자들은 여기서 최초로 포유동물 세포의 분비능 증대를 초래하는 SM 단백질 기반의 해독후 조작을 보고한다. 이 시스템은 발현 배치, 사용된 프로모터의 종류 및 프로모터-매개의 전사 수준과 무관함으로 인해, 재조합 단백질 및 약제의 산업적 생산에 매우 적합한 것이다.

본 발명은 또한 SM 단백질 발현을 방해하여 단백질 엑소사이토시스를 저해하거나 감소시키는 수단을 제공한다. 이는 암 또는 염증 상태의 치료에 유용한 수단을 제공할 것이다.

종래 개시된 바에 따르면, 진핵생물 세포에서 막-결합된 수송 소포는 세포하 구획/소기관 사이에서 단백질과 지질을 왕복 수송한다. 각 트래피킹 단계에서, 소포 및 표적 막 유래의 SNARE[용해성 NSF(N-에틸말레이미드 민감성 인자) 부착 수용체] 단백질은, 융합이 일어나는데 필요한 코어 기구를 구성하는 트랜스-SNARE 복합체를 형성한다. 다양한 상황에서 생리적 요구를 맞추기 위해서, SNARE 매개의 융합 기구는 세포내 및 세포외 근원 유래의 자극이 적당히 통합되도록 하기 위해 공간적 및 시간적으로 조정할 수 있어야 한다. 즉, SNARE의 기능은 특이성 또는 막 융합 속도가 전혀 손상되지 않도록 생체내에서 조절되거나 미세조정되는 것이 중요하다. Sec1/Munc18(SM) 단백질은 SNARE 단백질을 조절하는 열쇠를 보유할 수 있다. 효모와 선충류에서 처음 확인된 SM 단백질은 융합에 필수 성분이다. SNARE 외에 다른 상호작용 파트너가 거의 없다는 사실은 SM 단백질이 SNARE 단백질과 기능적으로 커플링되어 있다는 통념을 제공했다(Gallwitz and Jahn, 2003; Jahn et al., 2003; Toonen and Verhage, 2003). 하지만, SM 단백질의 기능적 모델을 일반화하려는 시도는 SNARE와의 상호작용의 이종성 성격으로 인해 상당히 방해되었다. 상이한 트래피킹 단계 및 다른 기관에서, 단량체 신탁신(Dulubova et al., 1999; Yang et al., 2000; Peng and Gallwitz, 2002), 소포-결합된 SNARE(Li et al., 2005; Carpp et al., 2006; Peng and Gallwitz, 2004; Shen et al., 2007), 이종이량체 t-SNARE 복합체(Scott et al., 2004; Zilly et al., 2006) 뿐만 아니라, 삼원성 완전 조립된 SNARE 복합체(Carpp et al., 2006; Peng and Gallwitz, 2004; Shen et al., 2007; Togneri et al., 2006; Carr et al., 1999; Dulubova et al., 2007)는 각 SM 단백질에 쉽게 결합하는 것으로 밝혀져 있다. 결과적으로, 이러한 상호작용의 생리적 유의성은 막 융합에서 SM 단백질 기능에 양성적 및 음성적으로 해석되었다.

결론적으로, 분비 경로에서 SM 단백질의 분자 기구, 특히 생리적 역할은 여전히 수수께끼이다. 예를 들어, Sly1은 단량체 신탁신 5, 단량체 소포-결합된 SNARE, 및 완전 조립된 SNARE 복합체와 상호작용하고(Li et al., 2005; Peng and Gallwizt, 2004), SNARE 복합체의 형성 및 융합 특이성에 양성적 영향을 미치는 것으로 밝혀져 있다(Peng and Gallwitz, 2002; Kosodo et al., 2002).

한편, 종래 연구들은 Munc18 단백질이 막 융합 및 엑소사이토시스에서 저해 역할을 하는 것으로 분류했다: 시냅스 소포의 조절된 엑소사이토시스에 특히 필요한 뉴런 특이적 Munc18a는, 신탁신 1의 폐쇄된 형상에 결합하여 SNARE 복합체 어셈블리를 저해하는 작용(Dulubova et al., 1999; Yang et al., 2000), 및 완전히 조립된 SNARE 복합체에 결합하여 막 융합을 촉진하는 작용(Shen et al., 2008; Dulubova et al., 2007)을 하여 SNARE와 2가지 기능적으로 상반된 상호작용을 나타낸다. 이와 마찬가지로, 엑소사이토시스에 대한 Munc18a의 저해 및 촉진 효과도 보고되었다(Wu et al., 1998; Verhage et al., 2000; Voets et al., 2001). Munc18b 및 Munc18c는 Munc18a와 서열 상동성이나, 편재적으로 발현된다. 시험관내 데이터는 Munc18c가 SNARE 결합에서 Munc18a와 유사하다는 것을 시사했고(Latham et al., 2006; D'Andrea-Merrins et al., 2007), 두 단백질의 구조는 보존적이다(Misura et al., 2000; Hu et al., 2007). 하지만, 유전자 및 생리적 연구들은 지금까지 Munc18b 및 Munc18c에 의한 엑소사이토시스의 저해 역할에 대한 증거만을 제공했다(Riento et al., 2000; Kanda et al., 2005; Tellam et al., 1997; Thurmond et al., 1998). 예를 들어, 1) 파리에서 Munc18a의 과발현은 뉴런 전달을 저해하고(Wu et al., 1998), 2) Caco-2 세포에서 Munc18b의 과발현은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 정점의 전달을 저해하며(Riento et al., 2000), 3) Munc18c는 VAMP2와 신탁신 4에 대한 결합을 경쟁하며(Thurmond et al., 1998); 4) 지방세포에서 인슐린 자극성 GLUT 소포의 전좌는 Munc18c의 과발현에 의해 저해되지만 Munc18c-널(null) 마우스에서는 증대되었다(Tellam et al., 1997; Thurmond et al., 1998).

이러한 보고와 대조적이고 일반적인 예상과 달리, 본 출원에서 본 발명자들은 2개의 SM 단백질 Sly1과 Munc18c가 일반적으로 엑소사이토시스를 동등하게 자극한다는 것을 입증하여 두 단백질의 새롭고 놀라운 역할을 증명한다. Munc18c 및 Sly1에 의한 활성화 역할의 분자 기전도 마찬가지로 보존적이다. 이러한 놀라운 발견에 기초하여, 본 발명자들은 포유동물 세포에서 증대된 분비를 나타내는 SM 단백질 기반의 분비 조작을 개척했다. SM 단백질 기반의 분비 조작은 대사 조작의 신규 전략으로서, 산업적으로 단백질 약제를 제조하는데 있어서 새로운 기반을 제공한다.

구체적으로, 포유동물 세포의 분비능에 미치는 Sly1 및 Munc18c 발현의 양성 효과는 분비를 증가하도록 포유동물 생산 세포주를 조작하는 새로운 해독후 시도를 시사한다.

실시예 5에서 증명된 바와 같이, SEAP 생산은 sly1 또는 munc18c 단독에 의해서는 5배 증가하는데 비해, sly1 및 munc18c의 동시 과발현은 SEAP 생산을 8배 증가시킨다(도 4a). 또한, SAMY 및 VEGF₁₂₁의 분비도 증가한다(도 4b, 4c). sly1, munc18c 및 xbp-1 모두의 과발현은 SEAP, SAMY 및 VEGF의 분비를 각각 10배, 12배 및 8배 증가시켜(도 4a, 4b, 4c), Sly1과 Munc18c 사이, 및 2종의 SM 단백질과 일반적인 소기관-확장 인자 Xbp-1 간에 분비에 대한 상승작용성 효과의 존재를 증명한다.

또한, 실시예 6에서는 sly1을 구성적 발현하도록 조작된 CHO-K1 유래의 세포주(CHO-Sly1₁₆ 및 CHO-Sly1₂₃) 또는 munc18c를 구성적 발현하도록 조작된 CHO-K1 유래의 세포주(CHO-Munc18c₈ 및 CHO-Munc18c₉)의 생성에 의해, CHO-Sly1₁₆ 및 CHO-Sly1₂₃은 SEAP 분비를 4배 및 8배 자극하고(도 6a), SAMY 생산을 4배 및 5배 자극한다(도 6b)을 증명했다. 흥미로운 것은, 더 많은 SEAP를 생산하는 CHO-Sly1₂₃이 또한 더 높은 Sly1 수준을 나타내어 SM 및 산물 단백질의 양성 상관관계를 시사한다는 것을 보여준다(도 6c). 이와 유사하게, 구성적 munc18c 발현에 대해 유전자도입된 세포(CHO-Munc18c₉)는 9배 및 6.5배 많은 SEAP 및 SAMY(도 6e 및 6f)를 생산하고, SEAP를 더 많이 생산하는 CHO-Munc18c₉도 더 높은 Munc18c 수준을 나타낸다(도 6d). 구성적 Sly1 및 Munc18c 발현에 대해 이중 유전자도입된 안정한 세포주 CHO-Sly1-Munc18c₁ 및 구성적 Sly1, Munc18c 및 Xbp-1 발현에 대해 삼중 유전자도입된 CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇은 모 CHO-K1에 비해 13배 및 16배 높은 SEAP 생산을 나타낸다(도 6g).

특히, SM 단백질 기반의 분비 조작은 생산 세포주의 특정 항체 생산성을 증가시킨다. 실시예 7은 이것을 원형 생물약제 제조 시나리오에서 SM 단백질 기반의 분비 조작을 사용하여, 리툭시마브로 알려진 모노클로날 항-사람 CD20 IgG1을 CHO-Sly1₁₆ 및 CHO-Sly1₂₃(최고 10배 증가), CHO-Sly1-Munc18c₁(최고 15배 증가) 및 CHO-Sly1-Xbp-1₄(최고 13배 증가), 및 CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇(최고 19배 증가)에서 발현하도록 하여 입증한다(도 7a). CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇에서 리툭시마브를 생산할 때, 동종유전자 대조군 세포주에 비해 거의 20배 증가량에 대응하는 최고 40pg/세포/일의 특별한 생산 수준에 이를 수 있다(도 7a). SDS-PAGE 분석은 CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇ 및 야생형 CHO-K1 세포에 의해 생산된 항체가 구조적으로 본래 그대로여서 서로 구별할 수 없음을 시사한다(도 7b, 7c). CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇에서 생산된 리툭시마브 유래의 N-결합된 Fc 올리고사카라이드의 maldi-TOF 기반의 글리코프로파일링은 천연 생산 세포주와 비교 시에 차이를 전혀 나타내지 않는바, SM/Xbp-1-기반의 분비 조작이 산물의 질을 떨어뜨리지 않는다는 것을 시사한다(도 7d 및 도 7e).

도 1
HEK-293에서 Sly1 및 Munc18의 발현 및 국재화. (a) 및 (b) 내인성 대조군으로 액틴을 이용한 sly1(a) 및 munc18(b) 전사체의 RT-PCR 기반의 검출. 1-Kb 래더(ladder)는 크기 표준으로 사용된다. (c) Munc18a/b/c의 웨스턴 블롯. (d) YFP-Munc18c(pRP23) 및 CFP-신탁신 4(Stx4, pRP29) 또는 YFP-Sly1(pRP32) 및 CFP-신탁신 5(Stx5, pRP40) 세트로 형질감염된 HEK-293에서 Sly1 및 Munc18c의 세포하 국재화를 나타내는 공초점 현미경사진. 화살표는 Sly1 및 신탁신 5의 공동국재화(상단 패널) 또는 Munc18c와 신탁신 4의 공동국재화(하단 패널)를 나타낸다.
도 2
sly1 및 Munc18c의 shRNA 기반의 녹다운. (a) 여러 sly1-특이적 shRNA에 대한 sly1-특이적 녹다운 리포터 작제물로 사용된 디시스트로닉(dicistronic) sly1-/GFP-암호화 발현 벡터 pRP3의 모식도. (b) pRP3 및 여러 shRNA-암호화 발현 벡터로 공동형질감염되고 48시간 동안 배양된 CHO-K1의 형광 현미경사진. (c) 여러 Munc18c-특이적 shRNA에 대한 Munc18c-특이적 녹다운 리포터 작제물로 사용된 디시스트로닉 Munc18c-/GFP-암호화 발현 벡터 pRP4의 모식도. pRP4 및 여러 shRNA-암호화 발현 벡터로 공동형질감염되고 48시간 동안 배양한 HEK-293의 형광 현미경사진.
도 3
sly1 및 munc18c의 shRNA 기반의 녹다운은 전반적인 엑소사이토시스를 감소시킨다. (a) sly1-표적화된 shRNA 발현 벡터(shRNA_{sly1 _1/2/3}; pRP5-7)로 형질감염된 HEK-293의 Sly1-특이적 웨스턴 블롯. 모 벡터 pmU6, 대조용 shRNA 및 p27^Kip1은 대조군으로 사용된다. (b) pSEAP2-대조군 및 여러 shRNA_sly1 발현 벡터로 공동형질감염된(48시간) HEK-293의 SEAP 발현 프로필. (c) munc18c-표적화된 shRNA 발현 벡터(shRNA_{munc18c _1/2/3}; pRP12, 14, 38, 39)로 형질감염된 HEK-293의 Munc18c-특이적 웨스턴 블롯. (d) pSEAP2-대조군 및 여러 shRNA_munc18 발현 벡터로 공동형질감염된 HEK-293의 SEAP 발현 프로필.
도 4
Sly1 및 Munc18c의 이소성 발현은 CHO-K1의 단백질 생산을 전사후 자극한다. (a-c) SEAP(pSEAP1-대조군) (a), SAMY(pSS158) (b) 또는 VEGF₁₂₁ (pWW276) (c) 생산 벡터 및 (여러 조합의) Sly1- (pRP24), Munc18c- (pRP17) 및 Xbp-1 (pcDNA3.1-Xbp-1)-암호화 발현 벡터로 공동형질감염된 CHO-K1의 생산 프로필. (d) SM 단백질 발현의 존재 또는 부재 하에 산물 mRNA 수준의 정량적 RT-PCR 기반의 프로파일링.
도 5
엑소사이틱 SNARE 복합체와 Munc18c의 상호작용. 친화도 정제된 단백질 A-세파로스-커플링된 항-Munc18c 항체를 이용한 HEK-293 용해물의 면역침전 후, Munc18c, 신탁신4, SNAP-23 및 VAMP2/시냅토브레빈 2(SybII)의 웨스턴 블롯 분석. Sly1뿐만 아니라 미침전된 단백질(상청액)은 대조군으로 사용된다.
도 6
SM 단백질 기반의 분비 조작은 CHO-KI 유래의 세포주에서 이종 단백질의 생산을 증대시킨다. (a) 48시간 동안 배양한, 구성적 Sly1 및 SEAP 발현에 대해 유전자도입된 안정한 혼합 클로날 CHO-K1-유래의 집단(CHO-Sly1₁₆ 및 CHO-Sly1₂₃ 및 CHO-Sly1_mix)의 SEAP 생산. (b) pSS158로 일시적으로 형질감염된 CHO-Sly1₁₆ 및 CHO-Sly1₂₃ 및 CHO-Sly1_mix의 SAMY 생산. (c) 부하 대조군으로 p27^Kip1을 이용한 CHO-K1, CHO-Sly1₁₆ 및 CHO-Sly1₂₃의 Sly1-특이적 웨스턴 블롯. (d) 부하 대조군으로 p27^Kip1을 이용한 CHO-K1, CHO-Munc18c₈ 및 CHO-Munc18c₉ 의 Munc18c-특이적 웨스턴 블롯. (e) 48시간 동안 배양한, 구성적 Munc18c 및 SEAP 발현에 대해 유전자도입된 안정한 혼합 클로날 CHO-K1-유래의 집단(CHO-Munc18c₈, CHO-Munc18c₉ 및 CHO-Munc18c_mix)의 SEAP 생산. (f) pSS158로 일시적으로 형질감염된 CHO-Munc18c₈, CHO-Munc18c₉ 및 CHO-Munc18_mix의 SAMY 생산. (g) 48시간 동안 배양한, Sly1 및 Munc18c (CHO-Sly1-Munc18c₁), Sly1 및 Xbp-1 (CHO-Sly1-Xbp1₄), 및 Sly1, Munc18c 및 Xbp-1 (CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇)을 구성적으로 발현하는 안정한 세포 클론의 SEAP 생산 프로필.
도 7
분비 조작된 CHO-K1 유도체에서 생산된 리툭시마브의 생산 및 글리코프로파일링. (a) 여러 분비 조작된 CHO-K1 유도체의 특이적 리툭시마브 생산성. (SM 단백질 기반의 대사 조작에 의한 사람 IgG1의 분비 증가). (b,c) CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇ 및 CHO-K1 세포로부터 정제된 리툭시마브는 비환원(b) 및 환원(c) SDS-PAGE에 의해 분석된다. 표준 단백질의 분자량(KDa) 및 IgG1의 중쇄 및 경쇄(HC, LC)의 분자량이 표시된다. (d,e) CHO-K1 및 분비 조작된 CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇에서 생산된 리툭시마브의 MALDI-TOF-기반의 글리코프로파일링.
도 8
발현 작제물의 모식도:
다른 발현 단위 (a) 유래 또는 하나의 바이시스트로닉(bicistronic) 단위 (b) 유래의 적어도 하나의 관심있는 단백질(GOI) 및 하나의 SM 단백질을 암호화하는 벡터.
다른 발현 카세트로부터(c) 또는 2개의 유전자가 IRES 요소를 통해 결합되어 있는 바이시스트로닉으로(d) 암호화된 2개의 SM 단백질의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
적어도 2종의 SM 단백질 및 관심있는 유전자(e) 또는 하나의 멀티시스트로닉(multicistronic) 발현 단위로부터 여러 SM 단백질을 암호화하는 발현 벡터.
도 9
SM 단백질은 사람 세포로부터 HRP 분비를 증대시킨다:
분비형 양고추냉이 퍼옥시다제(ssHRP) 및 공 벡터(Mock, 검은색 막대), Munc18c(회색 막대), Sly1(음영 막대) 또는 Munc18c 및 Sly1을 암호화하는 바이시스트로닉 작제물(Munc-IRES-Sly, 줄무늬 막대)로 공동형질감염된 사람 HT1080 세포의 상청액에서의 HRP 활성의 측정. 형질감염후 24시간 및 48시간 째에 상대적 ssHRP 역가를 측정하고, 특정 생산성은 1.0으로 설정한 Mock 대조군에 상대적으로 플로팅했다. 값은 3반복 시료의 평균값에 해당한다, 오차 막대 = SEM.
도 10
IgG 생산자 세포주에서 SM 단백질의 과발현은 특정 생산성 및 최종 IgG 역가를 증가시킨다.
(A) 공 벡터(Mock) 또는 Sly-1(Sly1), Munc-18c(Munc) 또는 두 SM 단백질(Munc/Sly1)의 발현 작제물을 안정하게 발현하는 세포의 상대적 특정 IgG1 생산성. 이 생산성은 유가식 생산 과정 동안 역가 및 생육 세포수로부터 계산했다. 막대는 n=2(Mock) 내지 n=6 모노클로날 유전자도입 IgG 생산 세포주의 평균값을 나타내고, 100%로 설정한 Mock 세포에서의 특정 생산성에 상대적 값으로 나타냈다.
(B) 9일간의 유가식 발효 과정 동안 기술된 작제물을 안정하게 발현하는 안정한 세포 집단의 IgG 역가.

일반 양태들, "포함하는" 또는 "포함된"은 더 구체적인 양태, "이루어진"을 포함한다. 또한, 단일 및 다수의 어형은 제한적 방식으로 사용되지 않았다.

본 발명의 과정에 사용된 용어들은 다음과 같은 의미를 나타낸다.

"유전자"란 용어는 데옥시리보핵산(DNA) 서열(예, cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA)을 의미한다. 본 발명에서, 유전자는 우선해서 사람 DNA 서열을 의미하지만, 다른 포유동물 종, 바람직하게는 마우스, 햄스터 및 래트 유래의 상동성 서열 뿐만 아니라 다른 진핵생물 종, 예컨대 닭, 오리, 이끼, 벌레, 파리 및 효모 등 유래의 상동성 서열도 동일하게 포함한다.

집합적 용어, "Sec1/Munc-18 단백질" 또는 "SM 단백질" 또는 "Sec1/Munc18 그룹의 단백질" 또는 SM-단백질 또는 "SM-단백질을 암호화하는 유전자" 또는 "SM 패밀리"는 진화론적으로 효모부터 사람까지 보존되고 고도의 구조 유사성을 공유하는 60-70kDa의 친수성 단백질 패밀리를 포함한다.

Munc18 및 Sly1은 모두 Sec1/Munc18 단백질 패밀리에 속한다. 이 패밀리는 또한 현재까지 다음과 같은 것을 포함한다:

효모에서: Sec1p, Sly1p, Vps33p 및 Vps45p

초파리에서: ROP, Sly1 및 Vps33/카네이션(carnation)

선충류에서: Unc-18 및 게놈 서열 데이터베이스에 따른 5개의 다른 유전자

척추동물에서: Munc18-1, -2 및 -3, VPS45, VPS33-A 및 -B 및 Sly1.

SM-단백질이란 용어는 또한 이 단백질의 유도체, 돌연변이체 및 단편, 예컨대 flag-태그화 또는 HIS-태그화 또는 다른 방식으로 태그화된 SM-단백질도 포함한다. 이러한 유도체들은 예컨대 단백질의 용이한 정제 또는 분리 또는 가시화를 위해 흔히 사용된다.

SM 단백질은 전체 서열에서 높은 상동성을 나타내어, 전체 구조가 유사할 수 있음을 시사한다. 또한, 기능상실(loss-of-function) 돌연변이는 4종의 9개 SM 유전자에서 설명되어 있고, 모두 소포 트래피킹 및 융합의 심각한 장애를 초래하는바, SM 단백질이 소포 수송 및 분비 과정에서 유사한 중심 역할을 한다는 것을 시사한다.

본 발명의 실시예들은 모델 단백질로 Munc18 및 Sly1을 이용하지만, 본 발명은 SM 단백질 패밀리의 다른 구성원들에도 동일하게 이행될 수 있다.

또한, 종 간의 고도의 보존성에 비추어볼 때, SM 단백질은 효모부터 벌레 및 곤충 세포를 넘어 포유동물계에 이르기까지 모든 진핵생물 숙주 세포 종에서 단백질의 분비 및 세포 표면 발현을 조정하는데 사용될 수 있다.

진핵생물 세포에서, 막-결합된 수송 소포는 세포하 구획/소기관 사이에서 단백질 및 지질을 왕래시킨다. 세포막 또는 표적 구획(예, 리소좀, 골지 복합체 또는 원형질막)과 세포 수송 소포의 융합은 SNARE[용해성 NSF(N-에틸말레이미드 민감성 인자) 부착 수용체] 단백질에 의해 매개된다. 세포의 생리적 요구를 맞추고 구획-특이적 막 조성을 유지하기 위해, SNARE-매개의 융합 기구는 Sec1/Munc18(SM) 패밀리의 소형 단백질에 의해 공간적 및 시간적으로 조절된다. SNARE 및 신탁신(Syntaxin)에 직접 결합함으로써, SM 단백질은 세포내 구획/소기관과 원형질막 사이의 소포-매개 수송의 모든 단계를 조절한다.

"Munc-18" 또는 "Munc-18 단백질(들)" 또는 "Munc-18 단백질 패밀리"란 용어는 진핵생물 유기체에 존재하는 모든 Munc-18 유전자 및 유전자 산물/단백질을 포함한다. 이것은 분명히 3개의 Munc-18 파라로그(paralog), 즉 Munc-18a("Munc-18-1"이라고도 부름), Munc-18b 및 Munc-18c를 포함하고, 이들은 척추동물에서 진화했다.

더 상세하게는, "Munc-18c"는 "신탁신 결합 단백질 3"(STXBP3) 또는 "혈소판 Sec1 단백질(Platelet Sec1 Protein)"(PSP)(서열번호 39)이라고도 알려진 사람 유전자 및 단백질 Munc18c, 및 이의 다른 포유동물 종의 상동체, 예컨대 마우스, 햄스터, 래트, 개 및 토끼의 상동체를 의미한다.

"Sly-1" 또는 "Sly-1 단백질(들)"이란 용어는 모든 Sly1 유전자 및 척추동물, 바람직하게는 포유동물에서 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 의미한다. 더 상세하게는, "Sly-1"은 사람 Sly1 단백질을 의미하며, 이는 또한 "Sec1 패밀리 도메인 함유 단백질 1"(SCFD1) 또는 "신탁신 결합 단백질-1 유사 단백질 2"(STXBP1L2)(서열번호 41)로도 알려져 있다.

"XBP-1"이란 용어도 똑같이 XBP-1 DNA 서열 및 이 유전자로부터 발현된 모든 단백질, 예컨대 XBP-1 스플라이스 변형체를 의미한다. 바람직하게, XBP-1은 사람 XBP-1 서열 및 바람직하게는 "XBP-1"로도 불리는 XBP-1의 스플라이싱된 활성 형태도 의미한다. 전사 인자 XBP-1은 분비 세포 분화뿐 아니라 ER 항상성 및 확장의 유지의 주요 조절인자 중 하나인 것으로 알려져 있다(Lee, 2005; Iwakoshi, 2003). 이러한 기능들은 XBP-1을 분비 조작 시도의 후보가 되게 한다.

더 구체적으로, "XBP-1"은 사람 XBP-1 단백질, 서열번호 43을 의미한다.

"생산성" 또는 "특정 생산성"이란 용어는 일정한 수의 세포에 의해 일정한 시간 내에 생산되는 특정 단백질의 양을 나타낸다. 따라서, 특정 생산성은 관심있는 단백질을 발현/합성/생산하는 세포의 능력에 대한 정량적 척도이다. 산업적 제조의 상황에서, 특정 생산성은 일반적으로 세포 및 1일당 생산되는 단백질의 양(피코그램)('pg/세포*일' 또는 'pcd')로 표현된다.

분비된 단백질의 "특정 생산성"을 측정하는 1가지 방법은 배양 배지로 분비된 관심있는 단백질의 양을 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 정량적으로 측정하는 것이다. 이를 위해, 세포는 일정 밀도로 새 배양 배지에 접종한다. 일정 시간 후에, 예컨대 24, 48 또는 72시간 후에, 세포 배양액 시료를 채취하여 ELISA 측정으로 처리하여 관심있는 단백질의 역가를 측정한다. 특정 생산성은 역가를 평균 세포 수 및 시간으로 나누어 측정할 수 있다.

세포의 "특정 생산성"을 측정하는 다른 방법의 예는 균일 시간 분해 형광(HTRF^®) 분석법이다.

또한, 세포의 세포내 단백질, 막결합 단백질 또는 막관통 단백질의 "생산성"은 웨스턴 블로팅으로 검출 및 정량할 수도 있다. 먼저, 세포를 세척하고, 이어서 트리톤-X, NP-40 또는 SDS와 같은 세제 또는 고농도의 염을 함유하는 완충액에 용해시킨다. 세포 용해물 내의 단백질은 그 다음 SDS-PAGE로 크기별 분리하고, 나일론 막으로 전이시킨 뒤, 이어서 특정 항체를 이용하여 관심있는 단백질을 검출 및 가시화한다.

세포의 "특정 생산성"을 측정하는 또 다른 방법은 관심있는 단백질에 대해 유발된 형광표지된 항체로 관심있는 단백질을 면역학적으로 검출하고 형광 시그널을 유세포분석기로 정량분석하는 것이다. 세포내 단백질인 경우에는 세포를 먼저 파라포름알데하이드 완충액 등에 고정시킨 후, 검출 항체가 세포 내로 침투하도록 투과성이 되게 한다. 세포 표면 단백질은 사전 고정이나 투과화 필요없이 생세포에서 정량분석할 수 있다.

세포의 "생산성"은 또한 관심있는 단백질과 융합 단백질로 발현되거나 관심있는 단백질과 같은 mRNA로부터 이중-, 삼중- 또는 다중 발현 단위의 일부로서 발현되는 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 리포터 단백질의 발현을 측정하여 간접적으로 측정할 수도 있다.

"생산성의 증대/증가"란 용어는 세포의 특정 생산성을 증가/증대시키는 방법을 포함한다. 특정 생산성은 생산성이 연구중인 세포에서 각각의 대조용 세포에 비해 높은 경우, 그리고 그 차이가 통계적으로 상당한 정도이면 증가 또는 증대된 것이다. 연구중인 세포는 처리, 형질감염 또는 유전자 변형된 세포의 이종성 집단 또는 클로날 세포주일 수 있고, 미처리, 미형질감염 또는 미변형된 세포는 대조용 세포로 사용될 수 있다. 당해의 분비 단백질의 상황에서, "증대된/증가된/향상된 생산성" 및 "증대된/증가된/향상된 엑소사이토시스" 및 "증대된/증가된/향상된 분비"란 용어는 동일한 의미인 것으로, 호환해서 사용된다.

"유도체"란 용어는 일반적으로 본 발명의 의도한 용도를 실현하기에 적합한 서열, 즉 세포에서 분비 수송의 증가를 매개하는 서열을 포함한다.

본 발명에 사용된 "유도체"란 용어는 최초 서열 또는 이의 상보성 서열과 적어도 70%의 서열 동일성이 있는 폴리펩타이드 분자 또는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 폴리펩타이드 분자 또는 핵산 분자는 최초 서열 또는 이의 상보성 서열과 적어도 80%의 서열 동일성인 것이 바람직하다. 폴리펩타이드 분자 또는 핵산 분자는 최초 서열 또는 이의 상보성 서열과 적어도 90%의 서열 동일성인 것이 더욱 바람직하다. 폴리펩타이드 분자 또는 핵산 분자는 최초 서열 또는 이의 상보성 서열과 적어도 95%의 서열 동일성이고 최초 서열과 동일하거나 유사한 분비에 미치는 효과를 나타내는 폴리펩타이드 분자 또는 핵산 분자이다.

서열 차이는 여러 유기체 유래의 상동성 서열에서의 차이를 기초로 할 수 있다. 또한, 서열 차이는 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의한 서열의 표적화된 변형을 기초로 할 수도 있다. 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이체는 부위 특이적 돌연변이유발 및/또는 PCR 기반의 돌연변이유발 기술로 발생시킬 수 있다. 참조 서열의 서열 동일성은 표준 "정렬" 알고리듬, 예컨대 "BLAST"를 사용해서 측정할 수 있다. 서열이 함께 일치할 때, 서열은 정렬되고, 표준 "정렬" 알고리듬의 도움을 받아 확인할 수 있다. 또한, 본 발명에서 "유도체"란 용어는 다른 핵산 서열에 하이브리드화하는 핵산 분자(단일 가닥 또는 이중 가닥)를 의미한다. 하이브리드화는 엄중한 하이브리드화 및 세척 조건(예컨대, 5x SSC를 함유하는 완충액에서 65℃ 하에 하이브리드화; 0.2x SSC/0.1% SDS를 이용하여 42℃에서 세척) 하에 수행하는 것이 바람직하다.

"유도체"란 용어는 또한 단백질 결실 및/또는 삽입 돌연변이체, 특히 세린, 트레오닌 또는 타이로신 위치에서의 인산화 돌연변이체 및 단백질 키나제 C(PKC) 또는 카세인 키나제 II(CKII)의 결합 부위의 결실을 보유하는 돌연변이체도 의미한다.

"활성"이란 용어는 세포 내에서 또는 시험관내 분석에서의 단백질의 생물학적 기능을 설명하고 정량화한 것이다.

SM 단백질의 "활성"을 측정하는 1가지 분석은 예컨대 모델 단백질, 당해의 항체 또는 단백질에 대한 분비 분석이다. 세포를 Munc-18c 또는 Sly-1과 같은 연구 중인 유전자 또는 공(empty) 벡터와 함께 ss-HRP-Flag 플라스미드로 공동형질감염시킨다. 24시간 형질감염 후, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 정화된 세포 상청액과 ECL 시약의 항온처리에 의해 0, 1, 3 및 6시간 후에 HRP 분비를 정량분석한다. 측정은 450nm에서 발광측정기(Lucy2, Anthos)로 수행한다.

SM 단백질의 기능적 결합에 의거하여 "활성"을 검출하는 다른 방법은 SM 단백질의 이의 공지된 상호작용 파트너에 대한 결합, 예컨대 Munc-18c의 신탁신-4에 대한 결합 또는 Sly1의 신탁신-5와의 물리적 상호작용을 보여주는 것이다. SM 단백질의 다른 단백질에 대한 결합은 공동면역침전, 예컨대 비드에 커플링된 특정 항체를 이용한 SM 단백질의 풀다운(pull-down), 비드의 변성 및 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯에 의한 공동면역침전 단백질의 후속 분리 및 검출로 증명할 수 있다.

SM 단백질의 다른 단백질, 예컨대 신탁신에 대한 직접 결합은 또한 효모-2중 하이브리드(yeast-two-hybrid) 분석으로 검출할 수 있다. 이 분석에서, 두 단백질은 한 전사 인자의 DNA-결합 및 트랜스활성화 도메인과 각각 융합 단백질로서 효모 세포에서 발현된다. 두 단백질의 직접 상호작용은 선택 조건 하에서 성장하는 효모 세포의 능력에 의해 또는 비색측정에 의해 활성이 검출되는 전사 인자의 재구성으로 이어진다.

또 다른 간접 방법은 SM 단백질과 이의 결합 파트너의 공동면역형광 및 세포 내에서의 이들의 공동국재화의 검출에 의해 제공된다.

XBP-1의 "활성"을 측정하는 1가지 방법은 XBP-1 전사 인자의 이의 DNA 결합 부위에 대한 결합을 검출하는 밴드-이동(band-shift) 실험을 수행하는 것이다. 또 다른 방법은 세포질에서 핵으로 활성 XBP-1 스플라이스 변형체의 전좌(translocation)를 검출하는 것이다. 대안적으로, XBP-1 "활성"은 XBP-1의 이종 발현 후에 결합 단백질(BiP)과 같은 보나 파이드(bona fide) XBP-1 표적 유전자의 유도 발현을 측정하여 간접적으로 확인할 수 있다.

본 발명의 목적에서 "숙주 세포"는 세포, 예컨대 햄스터 세포, 바람직하게는 BHK21, BHK TK^-, CHO, CHO Pro-5, CHO 유래의 돌연변이 세포주 Lec1 내지 Lec35, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 및 CHO-DG44 세포 또는 이러한 임의의 세포주의 유도체/후손이다. 특히, CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21이 바람직하고, CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포가 더욱 바람직하다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 숙주 세포는 또한 쥐 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포 또는 이러한 임의의 세포주의 유도체/후손을 의미한다. 본 발명의 목적에 사용될 수 있는 쥐 및 햄스터 세포의 예는 또한 표 1에 정리했다. 하지만, 이 세포들의 유도체/후손, 다른 포유동물 세포, 예컨대 비제한적으로 사람, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주, 또는 진핵생물 세포, 예컨대 비제한적으로 효모, 곤충, 식물 및 조류 세포 등도 본 발명의 목적에, 특히 생물 약제학적 단백질의 생산에 사용할 수 있다.

진핵생물 생산 세포주

세포주	주문번호
NS0	ECACC No. 85110503
Sp2/0-Ag14	ATCC CRL-1581
BHK21	ATCC CCL-10
BHK TK-	ECACC No. 85011423
HaK	ATCC CCL-15
2254-62.2 (BHK-21 유도체)	ATCC CRL-8544
CHO	ECACC No. 8505302
CHO 야생형	ECACC 00102307
CHO-K1	ATCC CCL-61
CHO-DUKX (= CHO duk-, CHO/dhfr-)	ATCC CRL-9096
CHO-DUKX B11	ATCC CRL-9010
CHO-DG44	(Urlaub et al., 1983)
CHO Pro-5	ATCC CRL-1781
Lec13	(Stanley P. et al, 1984).
V79	ATCC CCC-93
B14AF28-G3	ATCC CCL-14
HEK 293	ATCC CRL-1573
COS-7	ATCC CRL-1651
U266	ATCC TIB-196
HuNS1	ATCC CRL-8644
Per.C6	(Fallaux, F.J. et al, 1998)
CHL	ECACC No. 87111906

숙주 세포는 무혈청 조건 하에, 경우에 따라 동물 기원의 임의의 단백질/펩타이드가 없는 배지에서, 확립되고 조정되며 완전하게 배양될 때 가장 바람직하다. 시판 배지, 예컨대 Ham's F12(Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invtirogen), 무혈청 CHO Medium (Sigma) 및 무단백질(protein-free) CHO Medium (Sigma) 은 예시적인 적당한 영양배지 용액이다. 이러한 임의의 배지는 필요한 경우 다양한 화합물, 예컨대 호르몬 및/또는 다른 성장인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자, 인슐린유사 성장인자), 염(예, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 인산염), 완충액(예, HEPES), 뉴클레오사이드(예컨대, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 다른 등가의 에너지원, 항생제, 미량원소가 보충될 수 있다. 또 다른 임의의 필수 보충물도 당업자에게 공지되어 있을 적당한 농도로 포함될 수 있다. 본 발명에서는 무혈청 배지의 사용이 바람직하지만, 적당한 양의 혈청이 보충된 배지도 숙주 세포의 배양에 사용될 수 있다. 선택가능한 유전자를 발현하는 유전자 변형된 세포의 증식 및 선택을 위하여, 적당한 선택 제제를 배양 배지에 첨가한다.

"단백질"이란 용어는 아미노산 잔기 서열 또는 폴리펩타이드와 호환해서 사용되고, 임의의 길이의 아미노산 중합체를 의미한다. 이 용어는 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화 또는 단백질 프로세싱을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 반응을 통해 해독후 변형되는 단백질을 포함한다. 변형 및 변화, 예컨대 다른 단백질에 대한 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입은 분자의 생물학적 기능 활성을 유지시키면서 폴리펩타이드의 구조에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열 치환은 폴리펩타이드 또는 이의 기본 핵산 암호화 서열에 이루어질 수 있고, 같은 성질을 가진 단백질이 수득될 수 있다.

"폴리펩타이드"란 용어는 아미노산이 10개 초과인 서열을 의미하고, "펩타이드"란 용어는 아미노산 길이가 10개 이하인 서열을 의미한다.

본 발명은 생물약제학적 폴리펩타이드/단백질을 생산하는 숙주 세포를 수득하는데 적합하다. 본 발명은 특히 증대된 세포 생산성을 나타내는 세포에 의해 당해의 다수의 다른 유전자를 고수율로 발현시키는데 적합하다.

"관심있는 유전자"(GOI), "선택 서열", 또는 "산물 유전자"는 의미가 같은 것으로, "목적 산물"이란 용어로도 언급되는 관심있는 산물 또는 "관심있는 단백질"을 암호화하는 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 선택 서열은 전체 길이 또는 절두형 유전자, 융합 또는 태그화된 유전자일 수 있고, cDNA, 게놈 DNA 또는 DNA 단편, 바람직하게는 cDNA일 수 있다. 이것은 천연 서열, 즉 자연 발생 형태(들)이거나, 또는 원한다면 변이되거나 다른 방식으로 변형될 수 있다. 이러한 변형으로는 선택된 숙주 세포에서 코돈 용법을 최적화하는 코돈 최적화, 사람화 또는 태그화를 포함한다. 선택된 서열은 분비형, 세포질형, 핵형, 막 결합형 또는 세포 표면형의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.

"관심있는 단백질"은 선택된 숙주 세포에서 발현될 수 있는, 단백질, 폴리펩타이드, 이의 단편, 펩타이드를 포함한다. 바람직한 단백질은 예컨대 항체, 효소, 사이토킨, 림포킨, 부착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편일 수 있고, 작용제(agonist) 및 길항제(antagonist)로 작용할 수 있고/있거나 치료용 또는 진단용인 임의의 다른 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 바람직한 단백질/폴리펩타이드의 예는 이하에 제시된다.

모노클로날 항체와 같은 더욱 복잡한 분자인 경우에, GOI는 두 항체 사슬의 한쪽 또는 양쪽을 암호화한다.

"관심있는 산물"은 또한 안티센스 RNA, siRNA, RNAi 또는 shRNA일 수 있다.

"관심있는 단백질" 또는 "바람직한 단백질"은 앞에서 언급한 것이다. 특히, 바람직한 단백질/폴리펩타이드 또는 관심있는 단백질은 예컨대, 비제한적으로 인슐린, 인슐린-유사 성장인자, hGH, tPA, 사이토킨, 예컨대 인터루킨(IL), 예, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론(IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양괴사인자(TNF), 예컨대 TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF이다. 또한, 에리트로포이에틴 또는 임의의 다른 호르몬 성장인자의 생산방법도 포함한다. 본 발명에 따른 방법은 또한 항체 또는 이의 단편을 생산하는 데에도 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 단편으로는, 예컨대 Fab 단편(단편 항원 결합 = Fab)을 포함한다. Fab 단편은 인접 불변 영역에 의해 함께 유지되는 두 사슬의 가변 영역으로 이루어진다. 이 단편은 통상의 항체로부터 파파인 등과 같은 프로테아제 분해로 형성될 수 있으나, 다른 한편으로는 유사 Fab 단편이 유전자조작에 의해 생산될 수도 있다. 또 다른 항체 단편으로는 펩신을 이용한 단백분해 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편을 포함한다.

관심있는 단백질은 분비형 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 회수되는 것이 바람직하고, 또는 분비 시그널 없이 발현되면 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수도 있다. 관심있는 단백질의 실질적으로 균일한 제조물을 수득하기 위해서는 관심있는 단백질을 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질로부터 정제하는 것이 필요하다. 제1 단계로, 세포 및/또는 미립자 세포 파편을 배양 배지 또는 용해물로부터 정제한다. 그 다음, 관심있는 산물을 불순물인 용해성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터, 예컨대 면역친화성 또는 이온교환컬럼에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 세파덱스 크로마토그래피, 실리카 크로마토그래피 또는 양이온 교환 수지, 예컨대 DEAE로 정제한다. 일반적으로, 당업자에게 교시된 숙주 세포에 의해 발현된 이종 단백질을 정제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

유전자조작 방법을 이용하면, 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역들로만 이루어진 단축된 항체 단편을 생산하는 것이 가능하다. 이것은 Fv 단편이라고도 불린다(단편 가변 = 가변부의 단편). 이 Fv 단편은 불변 사슬의 시스테인에 의한 두 사슬의 공유결합이 없기 때문에, Fv 단편은 종종 안정적이다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 짧은 펩타이드 단편, 예컨대 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산으로 연결하는 것이 유리하다. 이러한 방식에 의하면, 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH와 VL로 이루어진 단일 펩타이드 가닥이 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일 사실-Fv(scFv)로 알려져 있다. 이러한 종류의 scFv 항체 단백질의 예는 종래 기술에 공지되어 있다.

최근에는 다량체성 유도체로 scFv를 제조하는 다양한 전략이 개발되었다. 이것은 특히 약동학적 및 생체분포 성질이 향상되고 뿐만 아니라 결합 화합력이 증가된 재조합 항체를 산출하려는 것이다. scFv의 다량체화를 달성하기 위해, scFv는 다량체화 도메인을 보유한 융합 단백질로 제조했다. 다량체화 도메인은 예컨대 IgG의 CH3 영역 또는 류신-지퍼(Leucin - zipper) 도메인과 같은 코일형 코일 구조(나선 구조)일 수 있다. 하지만, scFv의 VH/VL 영역 사이의 상호작용이 다량체화에 이용되는 전략도 있다(예컨대, 디아바디, 트리바디 및 펜타바디). 디아바디라 하면, 당업자는 2가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. scFv 분자에 있는 링커를 5 내지 10개의 아미노산으로 단축시키면, 사슬간 VH/VL-중첩(superimposition)이 일어난 동종이량체가 형성된다. 디아바디는 또한 디설파이드 가교의 혼입에 의해 안정화될 수도 있다. 디아바디 항체 단백질의 예는 종래 기술에 알려져 있다.

미니바디라 하면, 당업자는 2가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. 이것은 힌지 영역(예컨대, IgG1 유래) 및 링커 영역을 통해 scFv에 결합하는 이량체화 영역으로서, 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 미니바디-항체 단백질의 예는 종래 기술에 공지되어 있다.

트리아바디라 하면, 당업자는 3가의 동종삼량체성 scFv 유도체를 의미한다. VH-VL이 링커 서열 없이 직접 융합된 scFv 유도체는 삼량체의 형성을 초래한다.

"스캐폴드(scaffold) 단백질"이라 하면, 당업자는 다른 단백질 또는 다른 기능이 있는 단백질의 일부와 유전자 클로닝 또는 공동해독 과정에 의해 커플링된 단백질의 임의의 기능성 도메인을 의미한다.

또한, 당업자는 scFv에서 유래된 2가, 3가 또는 4가 구조인 소위 미니항체를 잘 알고 있을 것이다. 다량체화는 이량체성, 삼량체성 또는 사량체성 코일형 코일 구조에 의해 실행된다.

정의상, 숙주 세포에 도입된 임의의 서열 또는 유전자는, 도입된 서열 또는 유전자가 숙주 세포 내의 내인성 서열 또는 유전자와 동일할지라도 숙주 세포에 대해 "이종 서열", "이종 유전자", "도입유전자" 또는 "재조합 유전자"라 부른다.

서열은 당해의 서열이 내인성 서열이지만, 이 서열이 세포 내로 유입(인위적으로/의도적으로/실험적으로)되었고, 이에 따라 내인성 유전자좌와 상이한 숙주 게놈 내의 유전자에서 발현되는 경우에도 "이종 서열"이라 부른다.

서열은 당해의 서열(예, cDNA)이 (인위적/의도적/실험적으로) 재도입된(=재조합) 내인성 서열이고 이 서열의 발현이 프로모터 변경과 같은 조절 서열의 변경/변형에 의해 또는 임의의 다른 수단에 의해 달성될 때에도 "이종 서열"이라 부른다.

따라서, "이종" 단백질은 이종 서열로부터 발현된 단백질이다.

이종 유전자 서열은 "발현 벡터", 바람직하게는 진핵생물 발현 벡터, 더 더욱 바람직하게는 포유동물 발현 벡터를 이용하여 표적 세포 내로 도입시킬 수 있다. 벡터를 작제하는데 사용되는 방법은 당업자에게 공지되어 있고 다양한 공개문헌에 기술되어 있다. 특히, 적당한 벡터를 작제하는 기술, 예컨대 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그널, 선택 마커, 복제 오리진 및 스플라이싱 시그널과 같은 기능성 요소에 대한 설명은 종래 기술에 공지되어 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 인공/미니-염색체(예, ACE) 또는 바이러스 벡터, 예컨대 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 단순헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 박테리오파지를 포함할 수 있으나, 이에 국한되지는 않는다. 진핵생물 발현 벡터는 일반적으로 세균에서 벡터의 증식을 촉진하는 원핵생물 서열, 예컨대 복제 오리진 및 세균에서 선택을 위한 항생제 내성 유전자를 추가로 함유할 것이다. 폴리뉴클레오타이드가 작동적으로 결합할 수 있는 클로닝 부위를 함유하는 다양한 진핵생물 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 일부는 스트라타진(La Jolla, CA); 인비트로겐(Carlbad, CA); 프로메가(Madison, WI) 또는 비디 바이오사이언시스 클론테크(Palo Alto, CA)와 같은 회사로부터 구입할 수 있다.

바람직한 양태에 따르면, 발현 벡터는 당해의 펩타이드/폴리펩타이드/단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전사 및 해독에 필요한 조절 서열인 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다.

본 명세서에 사용된 "발현"이란 용어는 숙주 세포 내에서의 이종 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 의미한다. 숙주 세포에서 당해의 바람직한 산물/단백질의 발현 수준은 세포에 존재하는 해당 mRNA의 양 또는 본 발명의 실시예에서와 같이 선택된 서열에 의해 암호화된 당해의 바람직한 폴리펩타이드/단백질의 양을 기초로 하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사된 mRNA는 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포 RNA에 대한 동일계내 하이브리드화 또는 PCR에 의해 정량분석할 수 있다. 선택된 서열에 의해 암호화된 단백질은 다양한 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블로팅, 방사능면역분석, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성에 대한 분석, 단백질의 면역염색 후 FACS 분석 또는 균일 시간분해 형광(HTRF) 분석 등으로 정량분석할 수 있다.

본 발명에서, "발현"이란 용어는 DNA 서열을 의미하는 유전자의 상황은 물론 DNA 서열이 해독된 단백질 산물의 상황에서도 동일하게 사용된다. 따라서, "유전자" 및 "단백질"이란 용어는 발현의 상황에서 호환해서 사용될 수 있으며, 예컨대 "관심있는 단백질의 발현" 및 "관심있는 유전자의 발현"은 호환해서 사용되고, 두 표현은 동일한 실체를 의미한다. 본 발명에서, 이 용어들은 바람직하게는 사람 유전자 및 단백질을 의미하지만, 다른 포유동물 종, 바람직하게는 마우스, 햄스터 및 래트 유래의 상동성 서열 및 닭, 오리, 이끼, 벌레, 파리 및 효모를 비롯한 다른 진핵생물 종 유래의 상동성 서열도 동등하게 포함한다.

본 명세서에 사용된 관심있는 단백질의 발현을 "달성하는" 또는 단백질의 분비를 "달성하는"이란 용어는 상기 발현 또는 분비에 양성적으로 영향을 미치거나 상기 발현 또는 분비를 유발하는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 상기 용어들은 "발현을 증가시키는" 또는 "분비를 증가시키는"을 의미하는 것이 바람직하다.

폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 보유하여 유전자 변형 세포 또는 유전자도입 세포를 초래하는 진핵생물 숙주 세포의 "형질감염"은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있다. 형질감염 방법은 리포좀 매개의 형질감염, 인산칼슘 공침전법, 전기천공, 다양이온(예, DEAE-덱스트란)-매개의 형질감염, 원형질 융합, 바이러스 감염 및 마이크로주사를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 형질감염은 안정한 형질감염인 것이 바람직하다. 특정의 숙주 세포주 및 종류에서 이종 유전자의 형질감염 빈도 및 발현을 최적화하는 형질감염 방법이 바람직하다. 적당한 방법은 통상의 절차에 따라 결정할 수 있다. 안정한 형질감염체를 위해, 작제물은 숙주 세포의 게놈 또는 인공 염색체/미니염색체에 통합시키거나 또는 숙주 세포 내에 안정하게 유지되도록 에피솜에 위치시킨다.

본 발명의 실시에는 별다른 언급이 없는 한, 당업자의 기술 범위 내인 세포 생물학, 분자생물학, 세포 배양, 면역학 등의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이 기술에 대해서는 현행 문헌에 완전하게 개시되어 있다.

본 발명은 a) SM-단백질을 암호화하는 적어도 하나의 유전자의 발현 또는 각 단백질이나 이의 적어도 하나의 유도체, 돌연변이체 또는 단편의 활성을 증가시키는 단계, 및 b) 관심있는 이종 단백질의 발현을 달성하는 단계를 포함하여, 세포에서 관심있는 이종 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 구체적으로 a) SEC1/Munc18 그룹의 단백질(SM-단백질) 유래의 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 단계, 및 b) 관심있는 이종 단백질의 발현을 달성하는 단계를 포함하여, 세포에서 관심있는 이종 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 방법 단계 b)에서 관심있는 단백질의 분비는 증가되는 것이 바람직하다. 이에 따라, 본 발명은 바람직하게는 a) SEC1/Munc18 그룹의 단백질(SM-단백질) 유래의 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 단계, b) 관심있는 이종 단백질의 분비를 증가시키는 단계를 포함하여, 세포에서 관심있는 이종 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 Sec1p, Sly1p, Vps33p 및 Vps45p, ROP, Sly1 및 Vps33/카네이션, Unc-18, Munc18-1, -2 및 -3, VPS45, VPS33-A, VPS33-B 및 Sly1로 이루어진 SEC1/Munc18 그룹의 단백질(SM-단백질) 중에서 선택되는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 단계, 및 b) 관심있는 이종 단백질의 발현을 달성하는 단계, 바람직하게는 상기 관심있는 이종 단백질의 발현을 증가시키는 단계, 더욱 바람직하게는 상기 관심있는 이종 단백질의 분비를 증가시키는 단계를 포함하여, 세포에서 관심있는 이종 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

단계 a)의 단백질은 Sec1p, Sly1p, Vps33p, Vps45p, Munc18-1, -2 및 -3, VPS45, VPS33-A, VPS33-B 및 Sly1로 이루어진 SEC1/Munc18 그룹의 단백질(SM-단백질) 중에서 선택되는 것이 바람직하다.

더욱 바람직하게는, 단계 a)의 단백질이 Munc18-1, -2 및 -3, VPS45, VPS33-A, VPS33-B 및 Sly1로 이루어진 SEC1/Munc18 그룹의 단백질(SM-단백질) 중에서 선택되는 것이 좋다.

가장 바람직하게는, 단계 a)의 단백질이 Munc18-3/Munc18c 및 Sly-1로 이루어진 SEC1/Munc18 그룹의 단백질(SM-단백질) 중에서 선택되는 것이 좋다.

본 발명의 특정 양태에서, 상기 방법은 단계 a)에서 하나의 유전자가 Munc-18 단백질 또는 Munc-18 단백질 패밀리 구성원을 암호화하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 단계 a)에서 하나의 유전자가 3가지 Munc18 이소폼, Munc18a, b 또는 c 중 하나, 바람직하게는 Munc18c를 암호화하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 특정 양태에 따르면, 본 방법은 단계 a)에서 하나의 유전자가 Munc18c(서열번호 39)를 암호화하는 것읕 특징으로 한다.

본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 단계 a)에서 하나의 유전자가 Sly-1 단백질 또는 Sly-1 단백질 패밀리 구성원, 바람직하게는 Sly-1을 암호화하는 것을 특징으로 한다. 또 다른 본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 단계 a)에서 하나의 유전자가 Sly-1(서열번호 41)를 암호화하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 본 방법은 단계 a)가 소포 수송의 2가지 상이한 단계에 관여하는 SM 단백질을 암호화하는 적어도 2개의 유전자의 발현 또는 활성을 증가시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 a) 제1 유전자는 원형질막과 소포의 융합을 조절하는 SM 단백질을 암호화하고, b) 제2 유전자는 골지 복합체와 소포의 융합을 조절하는 SM 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 한다.

특히 바람직한 본 발명의 양태에서, 본 방법은 Munc18c(서열번호 39) 및 Sly-1(서열번호 41)의 발현 또는 활성이 증가되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 방법은 단계 a)가 a) SM 단백질 패밀리의 구성원을 암호화하는 제1 유전자의 발현 또는 활성을 증가시키고, b) SM 단백질 패밀리의 다른 구성원을 암호화하는 제2 유전자 및 c) XBP-1을 암호화하는 제3 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 바람직한 양태에서, 본 방법은 Munc18c(서열번호 39), Sly-1(서열번호 41) 및 XBP-1(서열번호 43)의 발현 또는 활성이 증가되는 것을 특징으로 한다.

더욱이, 본 발명은 a) 적어도 2개의 폴리펩타이드를 암호화하되, i) 적어도 하나의 제1 핵산 서열은 SM 단백질 또는 이의 유도체, 돌연변이체 또는 단편을 암호화하고, ii) 제2 핵산 서열은 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터 시스템을 세포 내로 도입시키는 단계, b) 상기 관심있는 단백질 및 상기 적어도 하나의 SM 단백질 또는 이의 유도체, 돌연변이체 또는 단편을 상기 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하여, 세포를 유전자조작하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 상기 핵산 서열이 상기 세포 내로 연속해서 도입되는 것을 특징으로 한다.

또 다른 본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 SM 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열이 상기 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열 전에 도입되는 것을 특징으로 한다.

또 다른 본 발명의 양태에서, 본 방법은 관심있는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열이 상기 SM 단백질을 암호화하는 핵산 서열 전에 도입되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 본 방법은 핵산 서열이 상기 세포 내로 동시에 도입되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 SM 단백질이 Munc-18 이소폼, 바람직하게는 Munc-18c(서열번호 39) 또는 Sly-1(서열번호 41) 중 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 본 방법은 단계 a)i)에서 2개의 SM 단백질이 함께 사용되고, 이 SM 단백질들이 소포 수송의 2가지 상이한 단계에 관여하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 방법은 a) 제1 유전자가 원형질막과 소포의 융합을 조절하는 SM 단백질을 암호화하고, b) 제2 유전자가 골지 복합체와 소포의 융합을 조절하는 SM 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 함께 사용된 2개의 SM-단백질이 Munc-18c(서열번호 39) 및 Sly-1(서열번호 41)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 본 방법은 단계 a)i)에서 2개의 SM 단백질이 XBP-1과 함께 사용되는 것을 특징으로 한다.

특히 바람직한 본 발명의 양태에서, 본 방법은 SM 단백질이 XBP-1(서열번호 43)와 배합된 Munc-18c(서열번호 39) 및 Sly-1(서열번호 41)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 방법은 상기 세포가 효모, 식물, 벌레, 곤충, 조류, 어류, 파충류 또는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 상기 세포가 진핵생물 세포, 바람직하게는 척추동물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 세포인 것을 특징으로 한다.

상기 척추동물 세포는 조류 세포, 예컨대 닭 또는 오리 세포인 것이 바람직하다.

또 다른 본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 상기 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO), 원숭이 신장 CV1, 원숭이 신장 COS, 사람 수정체 상피 PER.C6™, 사람 배아 신장 HEK293, 사람 골수종, 사람 양막세포, 어린 햄스터 신장, 아프리카 녹색원숭이 신장, 사람 자궁경부암종, 개 신장, 버팔로 래트 간, 사람 폐, 사람 간, 마우스 유방 종양 또는 골수종 세포, NS0, 개, 돼지 또는 머카크 세포, 래트, 토끼, 고양이, 염소, 바람직하게는 CHO 세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 본 방법은 상기 CHO 세포가 CHO 야생형, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11, CHO Pro-5 또는 이로부터 유래된 돌연변이체, 예컨대 CHO 돌연변이체 Lec1 내지 Lec35, 바람직하게는 CHO DG44인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 방법은 관심있는 단백질이 치료용 단백질인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 관심있는 단백질이 막 또는 분비형 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 특정 양태에서, 본 방법은 항체가 모노클로날, 폴리클로날, 포유동물, 쥐, 키메라, 사람화된, 영장류화된, 영장류, 사람 항체이거나, 또는 항체 단편 또는 이의 유도체, 예컨대 항체, 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄, Fab, F(ab')2, Fc, Fc-Fc 융합 단백질, Fv, 단일 사슬 Fv, 단일 도메인 Fv, 4가 단일 사슬 Fv, 디설파이드-결합된 Fv, 도메인 결실형, 미니바디, 디아바디 또는 상기 단편들 중 하나와 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드, Fc-펩타이드 융합체, Fc-독소 융합체, 스캐폴드 단백질인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 방법은 상기 이종 SM 단백질이 적어도 하나의 SNARE 단백질을 함유하는 소포 융합 복합체에 존재하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 상기 이종 SM 단백질이 적어도 하나의 SNARE 단백질 및 신탁신 4 또는 신탁신 5를 포함하는 소포 융합 복합체에 존재하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 방법은 상기 세포에서 관심있는 이종 단백질의 특정 생산성이 세포 및 1일당 적어도 5pg, 세포 및 1일당 15pg, 세포 및 1일당 20pg, 세포 및 1일당 25pg인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 방법은 상기 세포에서 관심있는 단백질의 특정 세포 생산성을 관심있는 단백질을 발현하는 대조용 세포에 비해 증가시키지만, 상기 대조용 세포는 임의의 SM 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 본 방법은 생산성의 증가가 약 5% 내지 약 10%, 약 11% 내지 약 20%, 약 21% 내지 약 30%, 약 31% 내지 약 40%, 약 41% 내지 약 50%, 약 51% 내지 약 60%, 약 61% 내지 약 70%, 약 71% 내지 약 80%, 약 81% 내지 약 90%, 약 91% 내지 약 100%, 약 101% 내지 약 149%, 약 150% 내지 약 199%, 약 200% 내지 약 299%, 약 300% 내지 약 499%, 또는 약 500% 내지 약 1000%인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 a) 적어도 하나의 제1 폴리뉴클레오타이드가 SM-단백질 또는 이의 유도체, 돌연변이체 또는 단편을 암호화하고, ii) 제2 폴리뉴클레오타이드가 관심있는 단백질을 암호화하는 적어도 2종의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터 시스템을 세포 내로 도입시키는 단계, 및 b) 상기 세포 내에서 상기 관심있는 단백질 및 상기 SM 단백질 또는 이의 유도체, 돌연변이체 또는 단편을 발현시키는 단계를 포함하여, 세포 내에서 당해의 막 단백질 또는 분비 단백질의 특이적 세포 생산성 또는 역가를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 적어도 2종의 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 단위를 포함하는 발현 벡터로서, a) 적어도 하나의 폴리펩타이드는 SM-단백질 또는 이의 유도체, 돌연변이체 또는 단편이고, b) 제2 폴리펩타이드는 관심있는 단백질인 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태에서, 발현 벡터는 관심있는 단백질이 치료용 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 발현 벡터는 항체가 모노클로날, 폴리클로날, 포유동물, 쥐, 키메릭, 사람화된, 영장류화된, 영장류, 사람 항체이거나 또는 이의 항체 단편 또는 유도체, 예컨대 항체, 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄, Fab, F(ab')2, Fc, Fc-Fc 융합 단백질, Fv, 단일 사슬 Fv, 단일 도메인 Fv, 4가 단일 사슬 Fv, 디설파이드-결합된 Fv, 도메인 결실형, 미니바디, 디아바디 또는 상기 단편들 중 하나와 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드, Fc-펩타이드 융합체, Fc-독소 융합체, 스캐폴드 단백질인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에서, 발현 벡터는 발현 단위가 멀티시스트로닉, 바람직하게는 바이시스트로닉인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 양태에서, 발현 벡터는 이 벡터가 도 8에 도시된 임의의 발현 벡터를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 발현 벡터는 이 벡터가 다음과 같이 배열된 적어도 하나의 바이시스트로닉 발현 단위를 포함하는 것을 특징으로 한다: a) SM 단백질을 암호화하는 유전자, b) IRES 요소 및 c) SM 단백질을 암호화하는 제2 유전자. 도 8 d) 참조.

본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 발현 벡터는 당해의 적어도 하나의 단백질(GOI) 및 다른 발현 단위 유래의 하나의 SM 단백질(도 8a) 또는 하나의 바이시스트로닉 단위 유래의 하나의 SM 단백질(도 8b)을 암호화하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 발현 벡터는 다른 발현 카세트로부터 암호화되거나(도 8c) 또는 바이시스트로닉으로 암호화된 2종의 SM 단백질의 유전자를 포함되나, 이 두 유전자는 IRES 요소를 통해 연결되어 있는(도 8d) 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다른 양태에서, 발현 벡터는 적어도 2종의 SM 단백질 및 관심있는 유전자(도 8e) 또는 하나의 멀티시스트로닉 발현 단위 유래의 여러 SM 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 발현 벡터는 SM-단백질이 Munc-18 이소폼, Munc a, b, c 중 하나, 바람직하게는 Munc-18c(서열번호 39)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 발현 벡터는 SM 단백질이 Sly-1(서열번호 41)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에서, 발현 벡터는 적어도 2종의 SM 단백질이 함께 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 양태에서, 발현벡터는 상기 적어도 2종의 SM 단백질이 소포 수송의 2종의 상이한 단계에 관여하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에서, 발현 벡터는 a) 하나의 SM 단백질이 원형질막과 소포의 융합을 조절하고, b) 제2 SM 단백질이 골지 복합체와 소포의 융합을 조절하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 발현 벡터는 SM 단백질이 Munc-18c(서열번호 39) 및 Sly-1(서열번호 41)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 발현 벡터는 적어도 2종의 SM 단백질이 XBP-1과 함께 사용되고, 바람직하게는 Munc-18c(서열번호 39) 및 Sly-1(서열번호 41)이 XBP-1(서열번호 43)과 함께 사용되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 적어도 2종의 이종 유전자, 즉 a) SM-단백질 또는 이의 유도체, 돌연변이체 또는 단편을 암호화하는 적어도 하나의 유전자 및 b) 관심있는 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하는 세포에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태에서, 세포는 관심있는 단백질이 치료용 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 세포는 항체가 모노클로날, 폴리클로날, 포유동물, 쥐, 키메릭, 사람화된, 영장류화된, 영장류, 사람 항체이거나 또는 이의 항체 단편 또는 유도체, 예컨대 항체, 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄, Fab, F(ab')2, Fc, Fc-Fc 융합 단백질, Fv, 단일 사슬 Fv, 단일 도메인 Fv, 4가 단일 사슬 Fv, 디설파이드-결합된 Fv, 도메인 결실형, 미니바디, 디아바디 또는 상기 단편들 중 하나와 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드, Fc-펩타이드 융합체, Fc-독소 융합체, 스캐폴드 단백질인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 양태에서, 세포는 SM 단백질의 발현 수준이 내인성 수준보다 상당히 높은 수준, 바람직하게는 10% 이상인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다른 양태에서, 세포는 상기 단백질의 발현 수준이 내인성 수준보다 5% 이상, 바람직하게는 내인성 수준보다 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 120%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에서, 세포는 본 발명의 임의의 발현 벡터를 포함한다.

본 발명의 특정 양태에서, 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게는 척추동물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 세포인 것을 특징으로 한다. 특히, 설치류 세포가 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에서, 세포는 상기 진핵생물 세포가 조류 세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 특정 양태에서, 세포는 상기 포유동물 세포가 설치류 세포이고, 바람직하게는 햄스터 또는 쥐 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 세포는 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO), 원숭이 신장 CV1, 원숭이 신장 COS, 사람 수정체 상피 PER.C6™, 사람 골수종, 사람 양막세포, 사람 배아 신장 HEK 293, 어린 햄스터 신장, 아프리카 녹색원숭이 신장, 사람 자궁경부암종, 개 신장, 버팔로 래트 간, 사람 폐, 사람 간, 마우스 유방 종양 또는 골수종 세포, NS0, 개, 돼지 또는 머카크 세포, 래트, 토끼, 고양이, 염소, 바람직하게는 CHO 세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 세포는 상기 CHO 세포가 CHO 야생형, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11, CHO Pro-5 또는 이로부터 유래된 돌연변이체, 예컨대 CHO 돌연변이체 Lec1 내지 Lec35, 바람직하게는 CHO DG44인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 세포는 상기 세포가 CHO 세포, 바람직하게는 CHO DG44 세포인 것을 특징으로 한다.

더욱이, 본 발명은 관심있는 단백질, 바람직하게는 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 하나 또는 여러 SM-단백질의 활성이나 발현, 바람직하게는 발현을 차단 또는 감소시키는데 유용한 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태에서, 약제학적 조성물은 화합물이 폴리뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 한다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 shRNA, RNAi, siRNA 또는 안티센스-RNA인 것이 바람직하고, shRNA가 가장 바람직하다.

본 발명의 또 다른 특정 양태에서, 약제학적 조성물은 SM-단백질이 Munc-18c(서열번호 39) 또는 Sly-1(서열번호 41) 또는 이의 조합물인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 a) 적어도 하나의 SM-단백질 또는 이의 유도체, 돌연변이체 또는 단편, 바람직하게는 Munc-18c를 제공하는 단계, b) 단계 a)의 상기 SM-단백질을 시험 제제와 접촉시키는 단계, c) 세포-표면 단백질의 단백질 분비 또는 발현의 증가 또는 감소와 관련된 효과를 측정하는 단계를 포함하여, SM-단백질 기능의 조절인자(modulator)를 확인하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 암, 자가면역 질환 및 염증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 암, 자가면역 질환 및 염증을 치료하기 위한 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 적용을 포함하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약제학적 조성물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하여, 세포의 증식 또는 이동을 저해 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 가능한 치료학적 응용예로는 세포 또는 조직 유래의 염증성 매개인자, 성장인자, 혈관형성인자와 같은 단백질의 분비를 차단하여 암 치료, 자가면역 질환 및 염증에서 세포-세포 정보전달을 제어하거나, 또는 현탁액에서의 성장을 촉진하고 세포 응집을 예방하기 위해 고착성(anchoring) 막관통-단백질의 세포 표면 존재를 감소시켜 세포 부착을 감소시키는 경우를 포함한다.

또한, 본 발명은 시험관내 세포 또는 조직 배양계에서 관심있는 단백질의 분비 및/또는 생산을 증가시키기 위해 사용하는 SM-단백질 또는 SM-단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. SM 단백질은 Munc 18 단백질, 예컨대 Munc18c(서열번호 39)인 것이 바람직하다. 또한, Sly-1 단백질, 예컨대 Sly-1(서열번호 41)도 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법, 발현 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 진단 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

a) 발현 벡터(예, 포유동물 BI-HEX® 발현 플랫폼)에 사람 Sec1/Munc18 및 Sly1/SCFD1을 클로닝하여, 관심있는 이종 단백질이 하나 또는 여러 바이시스트로닉/멀티시스트로닉 발현 단위에 의해 암호화될 수 있고 상기 단백질이 동일하거나 다른 플라스미드에 함유될 수 있도록 하는 단계,

b) 진핵생물 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, BHK, NS0, HEK293, PerC.6에 상기 작제물을 동시에 또는 연속해서, 단독으로 또는 함께 형질감염시키는 단계,

c) 경우에 따라, 도입유전자 발현을 입증하는 단계,

d) 관심있는 유전자(GOI), 바람직하게는 분비 단백질 또는 막관통 단백질을 암호화하는 작제물을 도입시키는 단계,

e) ELISA, 웨스턴 블롯 또는 유세포분석 등으로 GOI의 발현을 분석하는 단계를 포함하여, 세포의 단백질 분비를 증강시키거나/세포를 유전자조작하거나/세포에서 관심있는 이종 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

대안적으로, 단계 (b+c) 및 (d+e)의 순서를 바꾸어, 먼저 GOI를 도입시킬 수 있고, 또는 단계 (b)와 (d)는 동시에 수행할 수 있다.

이상 일반적으로 설명한 본 발명은, 단지 본 발명의 특정 구체예를 예시하기 위해 포함되는 이하 실시예를 참조로 하면 더 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 이하 실시예는 제한적이지 않다. 이하 실시예는 단지 본 발명의 가능한 양태를 나타낸다. 당업자는 다른 양태에 적용하기 위해 조건을 쉽게 조정할 수 있을 것이다.

실험

재료 및 방법

플라스미드 설계.

사람 sly1은 올리고뉴클레오타이드 ORP70(5'-CGCGGATCCACCATGGCGGCGGCGGCGGCAGCG-3', 서열번호 1) 및 ORP71(5'-CCGCTCGAGTTACTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG-3', 서열번호 2)을 이용하여 HEK-293 총 RNA로부터 RT-PCR 증폭시키고, BamHI/XhoI을 pcDNA3.1 (Invitrogen)에 클로닝하여 pRP24 (P_hCMV-sly1-pA_sv40)를 수득했다. 이와 마찬가지로, munc18c를 클로닝하여 (ORP69, 5'-CGCGGATCCACCATGGCGCCGCCGGTGGCAGAGAGG-3', 서열번호 3; ORP66, 5'-CCCTCGAGCTATTCATCTTTAATTAAGGAGAC-3', 서열번호 4), pRP17 P_hCMV-munc18c-pA_sv40)를 수득했다. pRP32(P_hCMV-EYFP-sly1-pA_sv40)는 ORP29(5'-CTCAGATCTGCGGCGGCGG CGGCAGCG-3', 서열번호 5) 및 ORP30(5'-ACCGTCGACCTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG-3', 서열번호 6)을 이용하여 pRP24로부터 PCR 증폭시키고 BglII/SalI 처리한 sly1을 pEYGFP-C1(Clontech)에 삽입하여 작제했다. pRP23(P_hCMV-EYFP-munc18c-pA_sv40)는 pRP17로부터 munc18c BamHI/XhoI를 절제하고, BglII/SalI을 pEYFP-C1에 클로닝하여 설계했다. pRP3은 ORP9(5'-CGCGCGGCCGCACCATGGCGGCGGCGGCGGCAGCG-3', 서열번호 7) 및 ORP10(5'-CCGGGATCCTTACTTTTGTCC AAGTTGTGACAACTG-3', 서열번호 8)을 이용하여 PCR 증폭시키고 NotI/BamHI 처리한 sly1을, ORP5 (5'-CCCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3', 서열번호 9) 및 ORP6(5'-TTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCC-3', 서열번호 10)을 이용하여 pLEGFP-N1로부터 PCR 증폭시킨 SmaI/XbaI GFP로 네오마이신 내성 부여 유전자를 교체하여 pIRESneo(Clontech)로부터 유래된 pRP1에 삽입하여 수득했다. 이와 마찬가지로, pRP4는 pRP17로부터 PCR 증폭되고(ORP15, 5'-C GCGCGGCCGCACCATGGCGCCGCCGGTGGCAGAGAGG-3', 서열번호 11; ORP16, 5'-CCGGATC CCTATTCATCTTTAATTAAGGAGAC-3', 서열번호 12) NotI/BamHI로 처리한 munc18c를 pRP1에 삽입하여 작제했다. pRP29(P_hCMV-ECFP-신탁신4-pA_sv40)는 신탁신 4(ORP127, 5'-CCCAAGCTTTGCGCGACAGGACCCACGAG-3', 서열번호 13; ORP128, 5'-CGCGTCGACTTATC CAACGGTTATGGTGATGCC-3', 서열번호 14)를 PCR 매개 증폭시킨 뒤, HindIII/SalI를 pECFP-C1(Clontech)에 클로닝하여 작제한다. 이와 마찬가지로, 신탁신 5는 클로닝하여(ORP136, 5'-GGAAGATCTATCCCGCGGA AACGCTAC-3', 서열번호 15; ORP137, 5'-CCCAAGCTTTCAAGCAAGGAAGACCAC-3', 서열번호 16), pRP40(P_hCMV-ECFP-신탁신5-pA_sv40)를 수득한다. sly1- 또는 munc18c-특이적 shRNA를 보유하는 발현 벡터는 이중가닥의 DNA 단편 BbsI/XbaI을 pmU6에 삽입하여 클로닝한다: (i) sly1 (shRNA_{sly1 _1}; pRP5, 5'-TTTGGAAGTAAACTGGAAGAT ATTTTCAAGAGAAATATCTTCCAGTTTACTTCTTTTT-3', 서열번호 23, 및 5'-CTAGAAAAAGAAGTAAACTGGAAGATATTTCTCTTGAAAATATCTTCCAGTTTACTTC-3', 서열번호 24, shRNA_{sly1 _2}; pRP6, 5'-TTTGGCAGTGAAACTAGACAAGAAATTCAAGAGATTTCTTGTCTAGTTTCACTGCTTTTT-3', 서열번호 25 및 5'-CTAGAAAAAGCAGTGAAACTAGACAAGAAATCTCTTGAATTTCTTGTCTAGTTTCACTGC-3', 서열번호 26, shRNA_{sly1 _3}; pRP7, 5'-TTTGGGAGGCAACTAC ATTGAATATTTCAAGAGAATATTCAATGTAGTTGCCTCCTTTTT-3', 서열번호 27 및 5'-CTAGAAAAAGGAGGCAACTACATTGAATATTCTCTTGAAATATTCAATGTAGTTGCCTCC-3', 서열번호 28); (ii) munc18c (shRNA_{munc18c _1}; pRP12, 5'-TTTGCACATGAATCTCAGGTGTATATTCAAGAGATATACACCTGAGATTCATGTGTTTTT-3', 서열번호 29, 및 5'-CTAGAAAAACACATGAATCTCAGGTGTATATCTCTTGAATATACACCTGAGATTCATGTG-3', 서열번호 30; shRNA_{munc18c _2}; pRP14, 5'-TTTGGCTTGAAGACTACTACAAGATTTCAAG AGAATCTTGTAGTAGTCT TCAAGCTTTTT-3', 서열번호 31, 및 5'-CTAGAAAAAGCTTGAAGACTACTACAAGATTCTCTTGAAATCTTGTAGTAGTCTTCAAGC-3', 서열번호 32; shRNA_{munc18c_3}; pRP38, 5'-TTTGCGCCAGAAAC CCAGAGCTAATTTCAAGAGAATTAGCTCTGGGTTTCTGGCGTTTTT-3', 서열번호 33 및 5'-CTAGAAAAACGCCAGAAACCCAGAGCTAATTCTCTTGAAATT AGCTCTGGGTTTCTGG CG-3', 서열번호 34; shRNA_{munc18c _4}; pRP39, 5'-TTTGGCTGAATAAACCCAAGGATAATTCAAGAGATTATCCTTGGGTTTATTCAGCTTTTT-3', 서열번호 35, 및 5'-CTAGAAAAAGCTGAATAAACCCA AGGATAATCTCTTGAATTATCCTTGGGTTTATTCAGC-3', 서열번호 36); (iii) 대조용 shRNA (pRP9, 5'-TTTGCACAAGCTGGAGTACAACTACTTCAAGAG AGTAGTTGTACTCCAGCTT GTGTTTTT-3', 서열번호 37, 및 5'-CTAGAAAAACACAAGCTGGAGTACAACTACTCTCTTGAAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTG-3', 서열번호 38).

사람 태반 알칼리성 포스파타제(SEAP)를 암호화하는 pSEAP2-대조군은 클론테크(Clontech)에서 구입하고, 바실러스 스테아로써모필러스 유래의 분비형 α-아밀라제(SAMY)를 보유하는 pSS158은 전술한 바와 같다(49). 사람 혈관 내피 성장인자 121(VGEF121)을 함유하는 pWW276 및 사람 IgG1 리툭시마브의 중쇄 및 경쇄를 각각 암호화하는 pWW943 및 pWW946은 윌프리드 웨버에게서 공급받았다. xbp-1 발현 벡터 pcDNA3.1-Xbp-1(PhCMV-xbp-1-pASV40)은 전에 기술된 바 있다(Tigges and Fussenegger, 2006).

세포 배양 및 형질감염

a) 부착 세포의 배양:

중국 햄스터 난소 세포(CHO-K1; ATCC CCL-61) 및 사람 배아 신장 세포(HEK-293; ATCC CRL-1573)는 5% FCS (PAN Biotech, Aidenbach, Germany; cat. no. 3302, lot no. P231902)가 보충된 ChoMaster HTS 배지(Cell Culture Technology, Gravesano, Switzerland) 또는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 5% CO₂를 함유하는 가습 대기, 37℃에서 배양했다. 일시적 형질감염을 위해, 1x10⁵ 세포를 12웰 조직 배양판의 한 웰에 접종하고, 24시간 후 변형 인산칼슘 기반의 프로토콜⁴⁷ 또는 FuGENE6 형질감염 시약(Roche, Basel, Switzerland)을 이용하여 형질감염시켰다. 구성적 도입유전자 발현을 위해 유전자조작된 단일유전자도입된 안정성 CHO-K1 유도체는 다음과 같은 조합의 발현 및 선택 벡터뿐만 아니라 항생제를 이용하여 생산한다: (i) CHO-Sly1₁₆ 및 CHO-Sly1₂₃; pRP24; 400㎍/ml G418 (Merck); (ii) CHO-Munc18c₈ 및 CHO-Munc18c₉, pRP17; 400㎍/ml G418. 이중유전자도입된 세포주 CHO-Sly1-Munc18c₁ 및 CHO-Sly1-Xbp1₄는 pRP17 및 pPUR(Clontech), pcDNA3.1-Xbp-1³⁵ 및 pPUR을 각각 CHO-Sly1₂₃에 공동형질감염시킨 후, G418 및 퓨로마이신(4㎍/ml)으로 클론 선택하여 작제했다. sly1, munc18c 및 xbp-1을 구성적 발현할 수 있는 삼중 유전자도입된 세포주, CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇은 pcDNA3.1-Xbp-1 및 pZeoSV2(Invitrogen)를 CHO-Sly1-Munc18c₁에 공동형질감염시킨 뒤, G418(400㎍/ml), 퓨로마이신(4㎍/ml) 및 제오신(150㎍/ml)으로 선택하여 수득했다.

b) 현탁 배양

모노클로날 항체(mAb) 생산성 CHO-DG44 세포의 현탁 배양(Urlaub et al, 1986) 및 이의 안정한 형질감염체는 BI 독점권이 있는 화학적 정의된 무혈청 배지에서 배양한다. 종자 모 배양물은 3x10⁵ 내지 2x10⁵ 세포/ml의 접종 밀도로 2 내지 3일마다 각각 이차배양한다. 세포는 T-플라스크 또는 진탕 플라스크(Nunc)에서 증식시킨다. T-플라스크는 가습 항온배양기(Thermo)에서 배양하고 진탕 플라스크는 5% CO₂, 37℃ 및 120rpm 하에 Multitron HT 항온배양기(Infors)에서 배양한다.

세포 농도 및 생육성은 혈구계를 이용하여 트립판 블루 배제 실험으로 측정한다.

유가식 배양

세포는 항생제 또는 MTX(Sigma-Aldrich, Germany) 없이 BI-독점권이 있는 생산 배지 250ml가 담긴 1000ml 진탕 플라스크에 3x10⁵ 세포/ml로 접종한다. 배양물은 37℃, 5% CO₂ 에서 120rpm으로 진탕 배양하고, CO₂ 농도는 이후에 세포수가 증가하면 2%로 감소시킨다. pH, 글루코스 및 락테이트 농도를 포함하는 배양물 매개변수는 매일 측정하고 pH는 필요한 경우 NaCO₃을 이용해서 pH 7.0으로 조정한다. BI-독점 공급물 용액은 24시간마다 첨가한다. 세포 밀도 및 생육성은 자동 CEDEX 세포 정량 시스템(Innovatis)을 이용해서 트립판 블루 배제 실험으로 측정한다. 세포 배양액 샘플은 수집해서 ELISA로 역가 측정했다. ELISA에는 사람-Fc 단편(Jackson Immuno Research Laboratories) 및 사람 카파 경쇄 HRP 접합형(Sigma)에 대한 항체가 사용된다. 누적된 특정 생산성은 주어진 날에 산물 농도를 그 시점까지의 "생육 세포 적산량"(IVC)으로 나누어 계산한다.

RNA 분리, RT - PCR 및 정량적 실시간 PCR

총 RNA는 NucleoSpin RNA II 키트(Machery-Nagel, Oensingen, Switzerland)를 이용해서 포유동물 세포로부터 제조하고, RT-PCR은 제조자의 프로토콜에 따라 TITANIUM™ 1단계 RT-PCR 키트(Clontech)로 수행한다. seap, samy 및 vegf₁₂₁ mRNA의 상대적 정량분석은 Power SYBR Green PCR 마스터 혼합물(Applied Biosystems, Warrington, UK), 100ng의 cDNA, seap(5'-AGGCCCGGGACAGGAA-3', 서열번호 17; 5'-GCCGTCCTTGAGCACATAGC-3', 서열번호 18), samy(5'-AAA GCTCAATATCTTCAAGCCATTC-3', 서열번호 19; 5'-AACACGACATCGGCGTACACT-3', 서열번호 20) 및 vegf₁₂₁(5'-CTTGCTGCTCTACCTCCACCAT-3', 서열번호 21; 5'-TGATTCTGCCCTCCTCCT TCT-3', 서열번호 22)에 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머 900nM을 함유하는 25㎕ 반응액을 이용하여 Applied Biosystems 7500 실시간 PCR 장치로 수행한다. 모든 시료는 리보솜 18s-RNA-특이적 전사체 분석(Applied Biosystems)을 이용하여 표준화하고 용융 곡선 분석은 비특이적 증폭의 부재를 확인하기 위해 모든 앰플리콘에 대해 수행한다.

공초점 검경법

폴리리신-코팅된 유리 슬라이드에 접종해서 형질감염시킨 HEK-293은 48시간 후 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 파라포름알데하이드(3% w/v)로 고정하고, PBS로 다시 세척한 뒤, 공초점 검경법으로 분석한다. 영상은 Leica TCS SP1(Leica, Heerbrugg, Switzerland)로 기록하고 Adobe Photoshop 10으로 분석한다.

항체, 면역침전 및 웨스턴 블롯

포유동물 세포는 용균 완충액(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA, 1% Triton X-100)에서 얼음 상에서 용해시킨다. 총 단백질 용해물은 4℃, 14,000xg에서 10분 동안 원심분리한 뒤, 단백질 A-세파로스 비드(Amersham Biociences, Uppsla, Sweden)와 4℃에서 30분 동안 항온처리한다. 면역침전은 최종 용량이 500㎕인 용균 완충액에서 단백질 A-세파로스에 커플링된 친화도 정제된 Munc18c 항체와 총 단백질 2mg을 4℃에서 밤새 회전시켜 혼합하여 수행한다. 그 다음, 비드는 500㎕ 용균 완충액으로 4회 세척하고, 단백질은 SDS-PAGE와 이어서 웨스턴 블로팅 분석으로 용출 및 분리한다. Sly1에 특이적인 항체는 제시 헤이(Jesse Hay)(University of Montana, Missoula, MO, USA)로부터 공급받은 것이다. Munc18a, 신탁신 4 및 Vamp2에 특이적인 항체는 시냅틱 시스템즈(Goettingen, Germany)에서 구입하고 Munc18b, Munc18c 및 p27^Kip1은 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입했다. 블로팅된 단백질은 ECL-Plus 검출 시약 및 HRP-접합된 2차 항체로 가시화한다(Amersham, Piscataway, NJ, USA).

단백질 생산

단백질 생산은 표준화된 분석법으로 배양 48시간 후에 평가한다: SEAP, p-니트로페닐포스페이트 기반의 흡광도 시간 과정; SAMY, 청색 전분 Phadebas^®분석(Pharmacia Upjohn, Peapack, NJ, cat. no. 10-5380-32); 사람 VEGF₁₂₁-특이적 ELISA에 의한 VEGF₁₂₁(R&D Systems, Minneapolis, MN, cat. no. DY293) 및 ELISA에 의한 리툭시마브(Sigma, cat. no. 12136 및 AO170).

현탁 배양물에서 성장하는 세포의 항체 역가 및 특정 생산성은 다음과 같이 측정한다:

CHO-DG44를 생산하는 항체는 바이시스트로닉 벡터로 형질감염시켜 mAb 생산성에 미치는 이종 단백질 발현의 효과를 분석한다. 종자 모 배양액에서의 생산성을 평가하기 위해, 세포 배양 상청액 유래의 시료를 3회 연속 계대배양으로부터 수집한다. 산물 농도는 그 다음 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 분석한다. ELISA를 위해 사람-Fc 단편(Jackson Immuno Research Laboratories) 및 사람 카파 경쇄 HRP 접합형(Sigma)에 대한 항체를 사용한다. 세포 밀도 및 생육성과 함께 특정 생산성은 다음과 같이 계산할 수 있다:

qp = 특정 생산성(pg/세포/일)

mAb = 항체 농도(mg/L)

t = 시점(일)

cc = 세포수(x10⁶ 세포/ml)

P = 계대수

리툭시마브의 N- 결합된 글리코실화 프로필

리툭시마브는 단백질 A-세파로스로 정제하고, 10mM 글리신 완충액(pH 2.8)로 용출시킨 다음, 2M 트리스, pH9.0으로 중화시킨다. 순도/완전성은 SDS-PAGE로 확인한다. 올리고사카라이드는 2mM Tris, pH 7에서 37℃에서 3시간 동안 0.05mU/mg 단백질을 이용하여 N-글리코시다제 분해(PNGaseF, EC 3.5.1.52, QA-Bio, San Mateo, CA)로 항체로부터 효소적으로 방출시킨다. 방출된 올리고사카라이드는 150mM 아세트산에서 항온처리한 뒤, 양성 이온 방식으로 작동하는 Autoflex MALDI/TOF(Bruker Daltonics, Faellanden, Switzerland)를 이용하여 기질로서 DHB를 사용한 MALDI 분석을 수행한다(Papac et al., 1998).

HRP 수송 분석

사람 HT1080 섬유육종 세포는 분비형 양고추냉이 퍼옥시다제(ssHRP)를 암호화하는 작제물 및 공 벡터, Munc18c, Sly1 또는 Munc18c 및 Sly1을 모두 암호화하는 바이시스트로닉 발현 유닛으로 공동형질감염시킨다. 형질감염 후 24시간 및 48시간 후, 세포 배양액 유래의 시료를 취해, 정화된 세포 상청액과 TMB 시약(BD Biosciences, Pharmingen)을 항온처리하여 리포터-단백질 ssHRP의 분비를 검출한다. 3분 후 반응을 정지시키고 450nm에서 ELISA 판독기(Spectra Rainbow Thermo)로 흡광도를 측정하여 ssHRP 역가를 측정한다. 추가로 특정 생산성을 분석하기 위해, 세포를 최종 측정 후에 트립신처리하고, CASY® 세포 계수기(Schaerfe System)를 사용하여 계수하고, 특정 생산성은 ssHRP 역가를 총 세포수로 나누어 계산한다.

실시예

실시예 1: Sly1 및 Munc18c는 HEK -293 세포의 분비 경로를 따라 국재화되어 있다.

본 발명자들은 HEK-293에서 SM 단백질 Sly1 및 Munc18의 이소폼(a, b, c)의 발현을 프로필하기 위해 RT-PCR 기반의 분석을 사용한다. 도 1a 및 1b에 제시한 바와 같이, sly1(NM_016160) 및 munc18c(NM_007269)는 고농도로 발현되고 munc18b(NM_006949)는 미량으로 발현되는 반면, 뉴런-특이적 munc18a의 전사체(NM_003165)는 검출할 수 없었다. SM 단백질 프로필은 웨스턴 블롯으로 확인한다(도 1c). Sly1 및 주요 Munc18 이소폼 Munc18c의 세포내 국재화는 HEK-293에서 YFP-Sly1(pRP32) 및 CFP-신탁신5(pRP40), 또는 YFP-Munc18c(pRP23) 및 CFP-신탁신4(pRP29)를 공동발현시켜 분석한다. 신탁신5는 골지체에 국제화된 Sly1-결합성 SNARE이고, 신탁신4는 원형질막에 결합된 Munc18c-상호작용성 SNARE이다. 공초점 검경법은 Sly1이 골지체에서 신탁신5와 매우 치밀한 핵주위 공동국재화를 나타내고, 원형질막은 Munc18c 및 신탁신4에 대해 공동염색된다는 것을 보여준다(도 1d). 이러한 결과는 Sly1 및 Munc18c가 HEK-293에서 발현되고 골지체와 원형질막에 국재화되고, 이것은 각 소기관에서 2가지 상이한 융합 단계에서의 각자의 역할과 일치한다(Jahn et al., 2003).

실시예 2: Sly1 및 Munc18은 단백질 분비를 조절한다.

SM 단백질은 세포내 단백질 트래픽에 필수적인 소포 융합을 조절하는 것으로 알려져 있으나, 단백질 분비 시의 역할에 대해서는 아직 해명되지 않은 채 남아 있다. 전반적인 엑소사이토시스에 미치는 Sly1 및 Munc18의 영향을 특성 규명하기 위해, 본 발명자들은 상기 SM 단백질에 특이적인 shRNA를 설계한다. Sly1 및 Munc18c의 녹다운(knockdown)은 디시스트로닉 Sly1- (pRP3; P_hCMV-sly1-IRES-eGFP-pA) 및 Munc18c-(pRP4; P_hCMV-munc18c-IRES-eGFP-pA) 암호화 리포터 작제물 및 특이적 뿐만 아니라 비특이적 대조용 shRNA로 공동형질감염된 세포의 형광 검경법으로 증명한다(도 2). 내인성 Sly1 및 Munc18c를 녹다운시키는 각 shRNA의 능력은 HEK-293에서 최고 70%에 이르는 것으로 확인된다(도 3a 및 3c). 포유동물 세포의 전반적인 단백질 분비 능력에 미치는 Sly1 및 Munc18c 녹다운의 영향을 분석하기 위해, 본 발명자들은 pSEAP2-대조군 및 pRP5(shRNA_{sly1 _1}), pRP6(shRNA_{sly1 _2}), pRP7(shRNA_{sly1 _3}), 또는 pRP12(shRNA_{munc18c _1}), pRP14(shRNA_{munc18c _2}), pRP38(shRNA_{munc18c _3}), pRP39(shRNA_{munc18c_4})를 HEK-293 세포에 공동형질감염시키고, 배양 상청액 중의 SEAP 수준을 프로필했다. sly1 및 Munc18c 녹다운과 SEAP 생산 감소와의 직접적인 상관성은 포유동물 분비 경로에서 이들 SM 단백질의 중심 역할을 제안한다(도 3b 및 3d).

실시예 3: Sly1 및 Munc18c의 이소성 발현은 포유동물 세포의 분비 능력을 증가시킨다.

CHO-K1에서 Sly1 또는 Munc18c의 이소성 발현 후(도 4a, 4b, 4c), SEAP, SAMY 또는 VEGF₁₂₁의 이종 생산은 산물의 유전자 전사를 유도하는데 사용된 프로모터(P_SV40, P_hCMV, P_{EF1 α})에 관계없이 최고 5배까지 증가한다. 또한, HEK-293 세포가 사용된 경우에도 유사한 결과가 관찰된다(데이터는 미제시). 이종 단백질 생산의 증대는, Sly1, Munc18c 또는 둘 모두의 존재 또는 부재 하에 SEAP, SAMY 및 VEGF의 mRNA 수준이 대략 일정하기 때문에(도 4d), 해독후 기전에 의해 매개되는 것이다. 이러한 결과는 지방세포 및 근육세포를 비롯한 일련의 세포 종류에서 엑소사이토시스에 대한 Munc18 단백질의 저해 효과를 주장하는 종래의 연구(Riento et al., 2000; Kanda et al., 2005; Tellam et al., 1997; Thurmond et al., 1998)와 뚜렷하게 상반되는 것으로, Munc18c와 Sly1이 모두 전반적인 엑소사이토시스를 촉진한다는 최초 증거를 제공한다.

실시예 4: 분비 경로에 미치는 SM 단백질과 Xbp -1의 상승작용성 효과

분비성 소기관의 크기를 증가시켜 단백질 분비를 증대시키는 것으로 최근에 확인된(Tigges and Fussenegger, 2006) Xbp-1뿐만 아니라 Sly1 및 Munc18은 분비 경로에서 표적이 다르기 때문에, 이들은 단백질 생산을 상승작용적으로 증강킬 수 있을지도 모른다. 따라서, 본 발명자들은 Sly1-, Munc18c 및 Xbp-1 암호화 발현 벡터 및 SEAP-, SAMY 및 VEGF₁₂₁-함유 발현 벡터의 여러 조합으로 CHO-K1을 공동형질감염시키고 배양 상청액 중의 리포터 단백질 수준을 프로필한다. 도 4a에 도시된 바와 같이, sly1 또는 munc18c 단독에 의해서는 5배 증가시키는데 비해, sly1 및 munc18c의 동시 과발현은 SEAP 생산을 8배 증가시킨다. 또한, SAMY 및 VEGF₁₂₁의 분비도 증가한다(도 4b, 4c). sly1, munc18c 및 xbp-1 모두의 과발현은 SEAP, SAMY 및 VEGF의 분비를 각각 10배, 12배 및 8배 증가시켜(도 4a, 4b, 4c), Sly1과 Munc18c 사이, 및 2종의 SM 단백질과 일반적인 소기관-확장 인자 Xbp-1 간에 분비에 대한 상승작용성 효과의 존재를 증명한다.

실시예 5: SM 단백질은 SNARE -매개의 트래피킹 기구를 자극하여 분비능을 증강시킨다 .

종래 연구는 엑소사이토시스에서 Munc18c의 저해 역할을 보고했고, 이는 본 발명에서 보고되는 결과와 상반된 것이다(Riento et al., 2000; Kanda et al., 2005; Tellam et al., 1997; Thurmond et al., 1998). 트래피킹 기구에서 Munc18c의 역할, 특히 신탁신 4, SNAP-23 및 VAMP2로 이루어진 엑소사이틱 SNARE 단백질과의 상호작용을 분자적으로 통찰하기 위해, 본 발명자들은 면역침전 실험을 수행한다. 도 5에 도시된 바와 같이, Munc18c-특이적 항체는 신탁신4, SNAP-23 및 VAMP 2의 유의적인 비율과 함께 Munc18c를 정량적으로 침전시켜, 분비 경로에서 소포-소기관 융합을 촉진하는, 상기 SNARE와 Munc18c의 생체내 연관성을 시사한다(Peng and Gallwitz, 2002; Shen et al., 2007; Scott et al., 2004). 이러한 발견은 완전 어셈블리된 SNARE 복합체에 결합하여 골지체의 융합을 촉진하는 Sly1과 마찬가지로, Munc18c도 역시 SNARE 복합체와 직접 상호작용함을 강조하는 것으로, SNARE-매개의 트래피킹 기구를 촉진함에 의한 보존적 작용 기전을 시사한다.

실시예 6: 포유동물 세포에서 분비능의 증가를 위한 포유동물 세포의 SM 단백질 기반의 조작

포유동물 세포의 분비능에 대한 Sly1 및 Munc18c 발현의 양성 효과는 분비 증가를 위해 포유동물 생산 세포주를 조작하는 새로운 해독후 시도를 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 sly1을 구성적 발현하도록 조작된 CHO-K1 유래의 세포주(CHO-Sly1₁₆ 및 CHO-Sly1₂₃) 또는 munc18c를 구성적 발현하도록 조작된 CHO-K1 유래의 세포주(CHO-Munc18c₈ 및 CHO-Munc18c₉)를 작제했다. CHO-Sly1₁₆ 및 CHO-Sly1₂₃은 SEAP 분비를 4배 및 8배 자극하고(도 6a), SAMY 생산을 4배 및 5배 자극한다(도 6b). 흥미로운 것은, 더 많은 SEAP를 생산하는 CHO-Sly1₂₃이 또한 더 높은 Sly1 수준을 나타내어 SM 및 산물 단백질의 양성 상관관계를 시사한다는 것을 보여준다(도 6c). 이와 유사하게, 구성적 munc18c 발현에 대해 유전자도입된 세포(CHO-Munc18c₉)는 9배 및 6.5배 많은 SEAP 및 SAMY(도 6e 및 6f)를 생산하고, SEAP를 더 많이 생산하는 CHO-Munc18c₉도 더 높은 Munc18c 수준을 나타낸다(도 6d). Sly1 및 Munc18c 발현에 대해 이중 유전자도입된 안정한 세포주 CHO-Sly1-Munc18c₁ 및 Sly1, Munc18c 및 Xbp-1 발현에 대해 삼중 유전자도입된 CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇은 모 CHO-K1에 비해 13배 및 16배 높은 SEAP 생산을 나타낸다(도 6g).

실시예 7: SM 단백질 기반의 분비 조작은 생산 세포주의 특정 항체 생산성을 증가시킨다.

원형 생물약제 제조 시나리오에서 SM 단백질 기반의 분비 조작을 입증하기 위해, 리툭시마브로 알려진 모노클로날 항-사람 CD20 IgG1을 CHO-Sly1₁₆ 및 CHO-Sly1₂₃(최고 10배 증가), CHO-Sly1-Munc18c₁(최고 15배 증가) 및 CHO-Sly1-Xbp-1₄(최고 13배 증가), 및 CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇(최고 19배 증가)에서 발현시킨다(도 7a). CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇에서 리툭시마브를 생산할 때, 동종유전자 대조군 세포주에 비해 거의 20배 증가량에 대응하는 최고 40pg/세포/일의 특별한 생산 수준에 이를 수 있다(도 7a). SDS-PAGE 분석은 CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇ 및 야생형 CHO-K1 세포에 의해 생산된 항체가 구조적으로 본래 그대로여서 서로 구별할 수 없음을 시사한다(도 7b, 7c). CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇에서 생산된 리툭시마브 유래의 N-결합된 Fc 올리고사카라이드의 Maldi-TOF 기반의 글리코프로파일링은 천연 생산 세포주와 비교 시에 차이를 전혀 나타내지 않는바, SM/Xbp-1-기반의 분비 조작이 산물의 질을 떨어뜨리지 않는다는 것을 시사한다(도 7d 및 도 7e).

실시예 8: SM 단백질 기반의 분비 조작은 생산 과정에서 총 항체 수율을 증가시킨다.

a) SM 단백질의 이종 발현이 산업적 제조와 관련된 조건 하에서 치료용 단백질 분비를 증강시키는 데에도 사용될 수 있는지를 시험하기 위해, 사람화된 항-CD44v6 IgG 항체 BIWA 4를 분비하는 항체 생산성 CHO 세포주(CHO DG44)를 공 벡터(MOCK 대조군) 또는 Sly1(서열번호 41) 또는 Munc-18(서열번호 39), 또는 두 단백질을 바이시스트로닉 발현 단위로 암호화하는 발현 작제물로 안정하게 형질감염시킨다. 그 다음, 세포는 안정한 세포 수집물을 수득하기 위해 선택 단계로 처리한다. 6회의 연속 계대 동안, 상청액은 모든 안정한 세포 수집물의 종자-모 배양물로부터 취하고, MCP-1 역가는 ELISA로 측정하여 세포의 평균수로 나누어 특정 생산성을 계산했다. SM 단백질 중 어느 하나를 발현하는 모든 세포에서, IgG 발현은 MOCK 또는 미형질감염 세포에 비해 유의적으로 증가했고, 최고의 값은 두 SM 단백질을 동시에 발현하는 세포 수집물에서 관찰되었다.

이와 유사한 결과는 안정한 형질감염체가 회분석 또는 유가식 발효로 처리된 경우에도 수득될 수 있다. 총 세포수 및 세포 생육성은 매일 측정하고, 3일, 5일, 7일, 9일 및 11일에는 세포 배양액으로부터 시료를 취해 IgG 역가 및 특정 생산성을 측정했다(도 10A, B). 이러한 조건 하에서, SM 단백질 유전자도입 세포는 MOCK 대조군 및 미형질감염된 모 세포주와 비교했을 때 유사한 증식성을 나타낸다. 하지만, MOCK 대조군에 비해, 특정 IgG 생산성은 Sly1 또는 Munc-18 발현 세포 또는 두 SM 단백질을 동시에 발현하는 세포에서 유의적으로 증가했고(50% 이상)(도 10A), 이것은 생산 과정에서 모노클로날 항체 역가의 분명한 증가를 야기했다(도 10B).

이를 종합해보면, 상기 데이터는 SM 단백질 기반의 세포 조작 시도의 적용가능성이 연속 배양, 생물반응기 회분식 배양 및 유가식 배양을 비롯한 다양한 배양 형식에서 치료용 단백질 생산을 증가시킨다는 것을 입증한다.

b) CHO 숙주 세포(CHO DG44)는 먼저 Sly1(서열번호 41) 또는 Munc-18(서열번호 39)을 암호화하는 벡터 또는 이 두 단백질을 함께 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 세포는 선택 조건으로 처리하여, SM 단백질의 이종 발현을 증명하는 세포주를 채취했다. 이어서, 이 세포주 및 이와 병행하여 CHO DG 44 야생형 세포를, 관심있는 유전자로서 사람 모노클로날 IgG형 항체를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시킨다. 2차 선택 라운드 이후에, 상청액은 후속 6회 계대 기간 동안 모두 안정한 세포 수집물의 종자-모 배양물로부터 채취하고, IgG 역가는 ELISA로 측정한 뒤, 평균 세포수로 나누어 특정 생산성을 계산했다.

최고 값은 두 SM 단백질을 수용하는 세포 수집물에서 관찰되었고, 그 다음 Sly1 또는 Munc-18 단독물을 발현하는 세포 수집에서 관찰되지만, 이 값은 여전히 SM 단백질을 전혀 발현하지 않는 CHO DG-44 세포에 비해서는 유의적으로 높은 항체 역가이다. 유사한 결과는 안정한 형질감염체가 회분식 또는 유가식 발효로 처리된 경우에도 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, 두 SM 단백질의 과발현은 항체 역가 및 특성 생산성 모두의 유의적인 증가로 이어진다. 이것은 Sly1 또는 Munc-18 단독의 이종 발현이 치료용 항체 분비를 증가시키기에 충분하다는 것을 시사한다. 또한, 두 단백질의 이종 발현은 함께, 일시적 형질감염된 세포주 뿐만 아니라 안정하게 형질감염된 세포주에서도 전반적인 엑소사이토시스를 상승작용적 방식으로 연합해서 증가시킨다.

실시예 9: SM 단백질의 과발현은 섬유아세포 활성화 단백질 알파( FAP )의 생물약제 단백질 생산을 증가시킨다.

(a) 막관통 젤라티나제 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP)를 발현하는 사람 섬유육종 세포주(HT1080, ATCC CCL-121)는 공 벡터(MOCK 대조군) 또는 Sly1(서열번호 41) 또는 Munc-18(서열번호 39) 또는 두 단백질을 바이시스트로닉 발현 단위로 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시킨다. 그 다음, 세포를 선택 조건으로 처리하여 안정한 세포 수집물을 수득한다. 이 수집물의 종자-모 배양물로부터 세포를 수거하여 FACS에 의한 FAP 표면 발현의 측정을 위해 고정시키거나, 또는 항-FAP 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 위해 세포 용해물을 제조한다. MOCK 세포에 비해, 세포 표면 상의 FAP의 양은 SM 단백질을 발현하는 모든 세포에서 유의적으로 증가하고, 발현은 Sly1 및 Munc-18을 모두 발현하는 세포에서 가장 높았다. 이러한 결과는 두 SM 단백질이 세포 표면 막관통 단백질에 대한 세포의 생산 및 수송능을 상승작용적으로 증가시킨다는 것을 시사한다.

b) 사람 HT1080 또는 HEK293 세포는 먼저 Sly1(서열번호 41) 또는 Munc-18(서열번호 39)을 암호화하는 벡터 또는 두 단백질을 함께 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 세포를 선택 조건으로 처리하고, SM 단백질의 이종 발현을 증명하는 세포주를 채취한다. 이어서, 이 세포주 및 이와 함께 HT1080 또는 HEK293 야생형 세포를 관심있는 유전자로서 FAP 알파를 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 2차 선택 과정 후, 모두 안정한 세포 수집물의 배양물로부터 세포를 채취하고 FAP의 발현 수준을 FACS 또는 웨스턴 블로팅으로 측정한다. 최고 값은 두 SM 단백질을 모두 수용하는 세포 수집물에서 관찰되고, 그 다음은 SM 단백질을 전혀 발현하지 않는 모세포에 비해 유의적으로 높은 FAP 수준을 발현하는 Sly1 또는 Munc-18 중 어느 하나만을 발현하는 세포 수집물에서 관찰된다. 이와 유사한 결과는 안정한 형질감염체를 현탁액에서 증식하도록 조정하여 회분식 또는 유가식 발효로 처리한 경우에 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, 두 SM 단백질 모두의 과발현은 FAP 발현을 유의적으로 증가시킨다. 이것은 Sly1 및 Munc-18의 이종 발현이 막관통 단백질의 생산 및 세포 표면 국재화를 개선하며, 이 효과는 두 단백질이 함께 이종 도입 후에 가장 높다는 것을 시사한다.

실시예 10: SM 단백질의 과발현은 막관통 단백질 상피 성장인자 수용체( EGFR )의 생물약제 단백질 생산을 증가시킨다.

(a) 막관통 단백질 상피 성장인자(EGFR)를 발현하는 CHO 세포주(예, CHO-DG44)를 공벡터(MOCK 대조군) 또는 Sly1(서열번호 41) 또는 Munc-18(서열번호 39), 또는 두 단백질을 바이시스트로닉 발현 단위로 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시킨다. 세포는 그 다음 안정한 세포 수집물을 수득하기 위해 선택 조건으로 처리한다. 이러한 수집물의 종자-모 배양물로부터, 후속 4회 계대동안 세포를 취하고, EGFR의 발현 수준을 FACS 또는 웨스턴 블로팅으로 측정한다. MOCK 세포에 비해, 세포 표면에 존재하는 EGFR의 양은 SM 단백질을 발현하는 모든 세포에서 유의적으로 증가하고 발현은 두 단백질, Sly1 및 Munc-18을 발현하는 세포에서 가장 높다. 안정한 형질감염체를 회분식 발효 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서 Sly1 또는 Munc-18의 과발현은 대조군에 비해 EGFR 발현을 약간 증가시키는 반면, EGFR 수준은 Sly1 및 Munc-18의 동시 과발현 후에는 상당히 증가하는바, 두 SM 단백질은 연속 배양, 생물반응기 회분식 배양 및 유가식 배양을 비롯한 다양한 배양 형식에서 세포-표면 막관통 단백질의 세포 생산 및 수송 능력을 상승작용적으로 증강시키는 작용을 한다는 것을 시사한다.

b) CHO 숙주 세포(CHO DG44)는 먼저 Sly1(서열번호 41) 또는 Munc-18(서열번호 39)을 함께 암호화하는 벡터 또는 두 단백질을 함께 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 세포를 선택 조건으로 처리하고, SM 단백질의 이종 발현을 증명하는 세포주를 채취한다. 이어서, 이 세포주 및 이와 함께 CHO DG44 야생형 세포를 관심있는 유전자로서 EGFR을 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 2차 선택 과정 후, 연속 6회 계대 동안 모두 안정한 세포 수집물의 종자-모 배양물로부터 세포를 채취하고 EGFR의 발현 수준을 FACS 또는 웨스턴 블로팅으로 측정한다. 최고 값은 두 SM 단백질을 모두 수용하는 세포 수집물에서 관찰되고, 그 다음은 SM 단백질을 전혀 발현하지 않는 CHO-DG44 세포에 비해 유의적으로 높은 EGFR 수준을 발현하는 Sly1 또는 Munc-18 중 어느 하나만을 발현하는 세포 수집물에서 관찰된다. 이와 유사한 결과는 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리한 경우에도 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, 두 SM 단백질 모두의 과발현은 EGFR 발현을 유의적으로 증가시킨다. 이것은, Sly1 및 Munc-18의 이종 발현이 막관통 단백질의 생산 및 세포 표면 국재화를 개선하며, 이 효과는 두 단백질이 함께 이종 도입된 후에 가장 높다는 것을 시사한다.

실시예 11: SM 단백질의 과발현은 단핵구 화학유인 단백질 1( MCP -1)의 생물약제 단백질 생산을 증가시킨다.

(a) 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1)을 분비하는 CHO 세포주(예, CHO DG44)를 공벡터(MOCK 대조군) 또는 Sly1(서열번호 41) 또는 Munc-18(서열번호 39), 또는 두 단백질을 바이시스트로닉 발현 단위로 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시킨다. 세포는 그 다음 안정한 세포 수집물을 수득하기 위해 선택 조건으로 처리한다. 후속 6회 계대 동안, 모두 안정한 세포 수집물의 종자-모 배양물로부터 상청액을 취하고, MCP-1 역가를 ELISA로 측정한 뒤, 평균 세포수로 나누어 특정 생산성을 계산한다. SM 단백질 중 어느 하나를 발현하는 모든 세포에서, IgG 발현은 MOCK 또는 미형질감염된 세포에 비해 현저하게 상승하여, 최고값은 SM 단백질 모두를 동시에 발현하는 세포 수집물에서 관찰된다. 안정한 형질감염체를 회분식 발효 또는 유가식 발효로 처리하면 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서 두 SM 단백질의 과발현은 MCP-1 발현을 증가시키고, 이것은 두 SM 단백질이 연속 배양, 생물반응기 회분식 배양 및 유가식 배양을 비롯한 다양한 배양 형식에서 세포의 단백질 생산 능력을 상승작용적으로 향상시키는 작용을 한다는 것을 시사한다.

b) CHO 숙주 세포(CHO DG44)는 먼저 Sly1(서열번호 41) 또는 Munc-18(서열번호 39)을 함께 암호화하는 벡터 또는 두 단백질을 함께 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 세포를 선택 조건으로 처리하고, SM 단백질의 이종 발현을 증명하는 세포주를 채취한다. 이어서, 이 세포주 및 이와 함께 CHO DG44 야생형 세포를 관심있는 유전자로서 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1)을 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 2차 선택 과정 후, 연속 6회 계대 동안 모두 안정한 세포 수집물의 종자-모 배양물로부터 상청액을 취하여 MCP-1 역가를 ELISA로 측정하고, 평균 세포수로 나누어 특정 생산성을 계산한다.

최고 값은 두 SM 단백질을 모두 수용하는 세포 수집물에서 관찰되고, 그 다음은 SM 단백질을 전혀 발현하지 않는 CHO DG-44 세포에 비해 유의적으로 높은 MCP-1 역가를 생산하는 Sly1 또는 Munc-18 중 어느 하나만을 발현하는 세포 수집물에서 관찰된다. 이와 유사한 결과는 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리한 경우에도 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, 두 SM 단백질 모두의 과발현은 MCP-1 역가 및 특정 생산성 모두를 유의적으로 증가시킨다. 이것은, Sly1 또는 Munc-18의 이종 발현이 MCP-1 분비를 증가시키기에 충분하다는 것을 시사한다. 하지만, 두 단백질이 함께 이종 발현되면 일시적 형질감염된 세포주는 물론 안정하게 형질감염된 세포주에서도 전반적인 엑소사이토시스를 상승작용적 방식으로 연합해서 증가시킨다는 것을 시사한다.

실시예 12: SM 단백질은 사람 세포로부터 HRP 분비를 증가시킨다.

SM 단백질의 과발현이 또한 설치류외 세포, 특히 사람 세포에서 분비 수송을 증강시키는데 사용될 수 있는지를 해결하기 위해, 구성적 단백질 분비의 리포터로서 사용할 수 있는 분비형 양고추냉이 퍼옥시다제(ssHRP)를 암호화하는 플라스미드를 이용한다.

사람 섬유육종 세포주(HT1080, ATCC CCL-121)를 ssHRP를 암호화하는 발현 플라스미드 및 공 벡터(Mock 대조군) 또는 Sly1(서열번호 41), Munc18(서열번호 39) 또는 두 단백질을 바이시스트로닉 발현 단위로 암호화하는 발현 작제물 중 어느 하나로 공동형질감염시킨다. 형질감염 24시간 및 48시간 후, 세포 배양물 상청액 유래의 시료를 취하여 퍼옥시다제 활성에 대해 분석한다. 측정 후, 세포를 트립신처리하고 계수하여 세포의 특정 생산성을 측정한다.

24시간 후에 이미 대조군 세포에 비해 ssHRP 분비의 약한 증가는 Munc18 또는 Munc18과 Sly1을 모두 발현하는 세포에서 검출할 수 있다(도 9). 형질감염 후 48시간째, SM 단백질을 발현하는 모든 세포는 mock 대조군에 비해 증가된 ssHRP 역가를 나타낸다(도 9). 최고값은 Munc18로 형질감염된 세포 유래의 시료에서 측정되며, 대조군 시료에 비해 약 1.4배 증가된 HRP 활성을 나타낸다. 또한, Munc18, Sly1 또는 두 SM 단백질로 형질감염된 세포의 특정 생산성은 대조용 세포에 비해 유의적으로 증가된다(도 9).

이것은 두 SM 단백질이 기능적으로 발현되어 사람 세포로부터 단백질 분비를 향상시킨다는 것을 확인시켜준다.

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<110> Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG <120> SM-protein based secretion engineering <130> P01-2308 <150> EP 07150254.6 <151> 2007-12-20 <150> EP 08152829.1 <151> 2008-03-17 <160> 60 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 cgcggatcca ccatggcggc ggcggcggca gcg 33 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ccgctcgagt tacttttgtc caagttgtga caactg 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 cgcggatcca ccatggcgcc gccggtggca gagagg 36 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 ccctcgagct attcatcttt aattaaggag ac 32 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 cgcgcggccg caccatggcg ccgccggtgg cagagagg 38 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 ccggatccct attcatcttt aattaaggag ac 32 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 cccaagcttt gcgcgacagg acccacgag 29 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 cgcgtcgact tatccaacgg ttatggtgat gcc 33 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 ggaagatcta tcccgcggaa acgctac 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 cccaagcttt caagcaagga agaccac 27 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 tttgcgccag aaacccagag ctaatttcaa gagaattagc tctgggtttc tggcgttttt 60 <210> 34 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 ctagaaaaac gccagaaacc cagagctaat tctcttgaaa ttagctctgg gtttctggcg 60 <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 tttggctgaa taaacccaag gataattcaa gagattatcc ttgggtttat tcagcttttt 60 <210> 36 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 ctagaaaaag ctgaataaac ccaaggataa tctcttgaat tatccttggg tttattcagc 60 <210> 37 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 tttgcacaag ctggagtaca actacttcaa gagagtagtt gtactccagc ttgtgttttt 60 <210> 38 <211> 60 <212> DNA <213> 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accaaaaauc 2460 augaacauuc uaagagaaaa uaaauauaga auuuaaaaaa uuaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aa 2522 <210> 41 <211> 642 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ile Arg 1 5 10 15 Glu Arg Gln Thr Val Ala Leu Lys Arg Met Leu Asn Phe Asn Val Pro 20 25 30 His Ile Lys Asn Ser Thr Gly Glu Pro Val Trp Lys Val Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Arg Phe Gly Gln Asp Ile Ile Ser Pro Leu Leu Ser Val Lys Glu 50 55 60 Leu Arg Asp Met Gly Ile Thr Leu His Leu Leu Leu His Ser Asp Arg 65 70 75 80 Asp Pro Ile Pro Asp Val Pro Ala Val Tyr Phe Val Met Pro Thr Glu 85 90 95 Glu Asn Ile Asp Arg Met Cys Gln Asp Leu Arg Asn Gln Leu Tyr Glu 100 105 110 Ser Tyr Tyr Leu Asn Phe Ile Ser Ala Ile Ser Arg Ser Lys Leu Glu 115 120 125 Asp Ile Ala Asn Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala Val Thr Gln Val Ala 130 135 140 Lys Val Phe Asp Gln Tyr Leu Asn Phe Ile Thr Leu Glu Asp Asp Met 145 150 155 160 Phe Val Leu Cys Asn Gln Asn Lys Glu Leu Val Ser Tyr Arg Ala Ile 165 170 175 Asn Arg Pro Asp Ile 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cuuuuuuguu acucugggug cuguuccuau aaucagaugu 660 ucaagaggaa cagcagcaga aaugguagca gugaaacuag acaagaaacu ucgagaaaau 720 cuaagagaug caagaaacag ucuuuuuaca ggugauacac uuggagcugg ccaauucagc 780 uuccagaggc ccuuauuagu ccuuguugac agaaacauag auuuggcaac uccuuuacau 840 cauacuugga cauaucaagc auuggugcac gauguacugg auuuccauuu aaacaggguu 900 aauuuggaag aaucuucagg aguggaaaac ucuccagcug gugcuagacc aaagagaaaa 960 aacaagaagu cuuaugauuu aacuccgguu gauaaauuuu ggcaaaaaca uaaaggaagu 1020 ccauucccag aaguugcaga aucaguucag caagaacuag aaucuuacag agcacaggaa 1080 gaugagguca aacgacuuaa aagcauuaug ggacuagaag gggaagauga aggagccaua 1140 aguaugcuuu cugacaauac cgcuaagcua acaucagcug uuaguucuuu gccagaacuc 1200 cuugagaaaa aaagacuuau ugaucuccau acaaauguug ccacugcugu uuuagaacau 1260 auaaaggcaa gaaaauugga uguauauuuu gaauaugaag aaaaaauaau gagcaaaacu 1320 acucuggaua aaucucuucu agauauaaua ucagacccug augcaggaac uccagaagau 1380 aaaaugaggu uguuucuuau cuauuauaua agcacacagc aagcaccuuc ugaggcugau 1440 uuggagcaau auaaaaaagc uuuaacugau gcaggaugca accuuaaucc uuuacaauau 1500 aucaaacagu ggaaggcuuu uaccaagaug gccucagcuc cggccagcua uggcagcacu 1560 accacuaaac caaugggucu uuuaucacga gucaugaaua caggaucaca guuugugaug 1620 gaaggaguga agaaccuggu uuugaaacag caaaaucuac cuguuacucg uauuuuggac 1680 aaucuuaugg agaugaaguc aaaccccgaa acugaugacu auagauauuu ugaucccaaa 1740 augcugcggg gcaaugacag cucaguuccc agaaauaaaa auccauucca agaggccauu 1800 guuuuugugg ugggaggagg caacuacauu gaauaucaga aucuuguuga cuacauaaag 1860 gggaaacaag gcaaacacau uuuauauggc ugcagugagc uuuuuaaugc uacacaguuc 1920 auaaaacagu ugucacaacu uggacaaaag uaacacagaa gaaccuuacu augauaaucu 1980 acuuggaaug uggauaaaug uaaaaagaag aaaaguuaga agagcaauau guuuccuucu 2040 cuguaacagu guccuaacag ugaaaaucag aguuauuugu uaauuuuuaa ggaaauuaua 2100 uacuuaauau guauugauua aaagaaacau uucagaaaua aaauuucaac auuguuaaaa 2160 aaaaaaaaaa aa 2172 <210> 43 <211> 376 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Val Val Val Ala Ala Ala Pro Asn Pro Ala Asp Gly Thr Pro Lys 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Ser Gly Gln Pro Ala Ser Ala Ala Gly Ala Pro Ala 20 25 30 Gly Gln Ala Leu Pro Leu Met Val Pro Ala Gln Arg Gly Ala Ser Pro 35 40 45 Glu Ala Ala Ser Gly Gly Leu Pro Gln Ala Arg Lys Arg Gln Arg Leu 50 55 60 Thr His Leu Ser Pro Glu Glu Lys Ala Leu Arg Arg Lys Leu Lys Asn 65 70 75 80 Arg Val Ala Ala Gln Thr Ala Arg Asp Arg Lys Lys Ala Arg Met Ser 85 90 95 Glu Leu Glu Gln Gln Val Val Asp Leu Glu Glu Glu Asn Gln Lys Leu 100 105 110 Leu Leu Glu Asn Gln Leu Leu Arg Glu Lys Thr His Gly Leu Val Val 115 120 125 Glu Asn Gln Glu Leu Arg Gln Arg Leu Gly Met Asp Ala Leu Val Ala 130 135 140 Glu Glu Glu Ala Glu Ala Lys Gly Asn Glu Val Arg Pro Val Ala Gly 145 150 155 160 Ser Ala Glu Ser Ala Ala Gly Ala Gly Pro Val Val Thr Pro Pro Glu 165 170 175 His Leu Pro Met Asp Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ser Asp Ser Glu Ser 180 185 190 Asp Ile Leu Leu Gly Ile Leu Asp Asn Leu Asp Pro Val Met Phe Phe 195 200 205 Lys Cys Pro Ser Pro Glu Pro Ala Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Val 210 215 220 Tyr Pro Glu Gly Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Val 225 230 235 240 Gly Thr Ser Ser Ala Lys Leu Glu Ala Ile Asn Glu Leu Ile Arg Phe 245 250 255 Asp His Ile Tyr Thr Lys Pro Leu Val Leu Glu Ile Pro Ser Glu Thr 260 265 270 Glu Ser Gln Ala Asn Val Val Val Lys Ile Glu Glu Ala Pro Leu Ser 275 280 285 Pro Ser Glu Asn Asp His Pro Glu Phe Ile Val Ser Val Lys Glu Glu 290 295 300 Pro Val Glu Asp Asp Leu Val Pro Glu Leu Gly Ile Ser Asn Leu Leu 305 310 315 320 Ser Ser Ser His Cys Pro Lys Pro Ser Ser Cys Leu Leu Asp Ala Tyr 325 330 335 Ser Asp Cys Gly Tyr Gly Gly Ser Leu Ser Pro Phe Ser Asp Met Ser 340 345 350 Ser Leu Leu Gly Val Asn His Ser Trp Glu Asp Thr Phe Ala Asn Glu 355 360 365 Leu Phe Pro Gln Leu Ile Ser Val 370 375 <210> 44 <211> 1131 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 augguggugg uggcagccgc gccgaacccg gccgacggga ccccuaaagu ucugcuucug 60 ucggggcagc ccgccuccgc cgccggagcc ccggccggcc aggcccugcc gcucauggug 120 ccagcccaga gaggggccag cccggaggca gcgagcgggg ggcugcccca ggcgcgcaag 180 cgacagcgcc ucacgcaccu gagccccgag gagaaggcgc ugaggaggaa acugaaaaac 240 agaguagcag cucagacugc cagagaucga aagaaggcuc gaaugaguga gcuggaacag 300 caagugguag auuuagaaga agagaaccaa aaacuuuugc uagaaaauca gcuuuuacga 360 gagaaaacuc auggccuugu aguugagaac caggaguuaa gacagcgcuu ggggauggau 420 gcccugguug cugaagagga ggcggaagcc aaggggaaug aagugaggcc aguggccggg 480 ucugcugagu ccgcagcagg ugcaggccca guugucaccc cuccagaaca ucuccccaug 540 gauucuggcg guauugacuc uucagauuca gagucugaua uccuguuggg cauucuggac 600 aacuuggacc cagucauguu cuucaaaugc ccuuccccag agccugccag ccuggaggag 660 cucccagagg ucuacccaga aggacccagu uccuuaccag ccucccuuuc ucugucagug 720 gggacgucau cagccaagcu ggaagccauu aaugaacuaa uucguuuuga ccacauauau 780 accaagcccc uagucuuaga gauacccucu gagacagaga gccaagcuaa ugugguagug 840 aaaaucgagg aagcaccucu cagccccuca gagaaugauc acccugaauu cauugucuca 900 gugaaggaag aaccuguaga agaugaccuc guuccggagc uggguaucuc aaaucugcuu 960 ucauccagcc acugcccaaa gccaucuucc ugccuacugg augcuuacag ugacugugga 1020 uacggggguu cccuuucccc auucagugac auguccucuc ugcuuggugu aaaccauucu 1080 ugggaggaca cuuuugccaa ugaacucuuu ccccagcuga uuagugucua a 1131 <210> 45 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 uuuggaagua aacuggaaga uauuuucaag agaaauaucu uccauuuacu ucuuuuu 57 <210> 46 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 cuagaaaaag aaguaaacug gaagauauuu cucuugaaaa uaucuuccag uuuacuuc 58 <210> 47 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 uuuggcagug aaacuagaca agaaauucaa gagauuucuu gucuaguuuc acugcuuuuu 60 <210> 48 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 cuagaaaaag cagugaaacu agacaagaaa ucucuugaau uucuugucua guuucacugc 60 <210> 49 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 uuugggaggc aacuacauug aauauuucaa gagaauauuc aauguaguug ccuccuuuuu 60 <210> 50 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 cuagaaaaag gaggcaacua cauugaauau ucucuugaaa uauucaaugu aguugccucc 60 <210> 51 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 uuugcacaug aaucucaggu guauauucaa gagauauaca ccugagauuc auguguuuuu 60 <210> 52 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 cuagaaaaac acaugaaucu cagguguaua ucucuugaau auacaccuga gauucaugug 60 <210> 53 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 uuuggcuuga agacuacuac aagauuucaa gagaaucuug uaguagucuu caagcuuuuu 60 <210> 54 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 59 uuugcacaag cuggaguaca acuacuucaa gagaguaguu guacuccagc uuguguuuuu 60 <210> 60 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 cuagaaaaac acaagcugga guacaacuac ucucuugaag uaguuguacu ccagcuugug 60

Claims (43)

1. 세포에서 관심있는 이종 단백질을 생산하는 방법으로서,
   a) SEC1/Munc18 그룹의 단백질(SM 단백질) 유래의 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 단계, 및
   b) 상기 관심있는 이종 단백질의 발현을 달성하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 b)에서 상기 관심있는 이종 단백질의 발현이 증가하고, 바람직하게는 단계 b)에서 상기 관심있는 이종 단백질의 분비가 증가하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)의 하나의 유전자가 3종의 Munc18 이소폼, Munc18a, b 또는 c 중 하나, 바람직하게는 Munc18c(서열번호 39)를 암호화하는 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)의 하나의 유전자가 Sly-1(서열번호 41)을 암호화하는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)가, 소포 수송의 2가지 상이한 단계에 관여하는 상기 SM 단백질을 암호화하는 적어도 2종의 유전자의 발현을 증가시킴을 포함하는 방법.
6. 제5항에 있어서,
   a) 하나의 유전자는 원형질막과 소포의 융합을 조절하는 SM 단백질을 암호화하고,
   b) 제2 유전자는 골지 복합체와 소포의 융합을 조절하는 SM 단백질을 암호화하는 방법.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, Munc18c(서열번호 39) 및 Sly-1(서열번호 41)의 발현이 증가하는 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)가
   i) SM 단백질 패밀리의 구성원을 암호화하는 제1 유전자의 발현을 증가시키고,
   ii) SM 단백질 패밀리의 다른 구성원을 암호화하는 제2 유전자의 발현을 증가시키며,
   iii) XBP-1을 암호화하는 제3 유전자의 발현을 증가시킴을 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, Munc18c(서열번호 39), Sly-1(서열번호 41) 및 XBP-1(서열번호 43)의 발현이 증가하는 방법.
10. a) 적어도 2종의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터 시스템을 세포 내로 도입시키는 단계로서, 여기서
    i) 적어도 하나의 제1 핵산 서열이 SM-단백질을 암호화하고,
    ii) 제2 핵산 서열이 관심있는 단백질을 암호화하는 단계, 및
    b) 상기 관심있는 단백질 및 상기 적어도 하나의 SM 단백질을 발현시키는 단계를 포함하여,
    세포를 조작하는 방법.
11. 제10항에 있어서, SM-단백질이 Munc-18 이소폼 중 어느 하나, 바람직하게는 Munc-18c(서열번호 39), 또는 Sly-1(서열번호 41)인 방법.
12. 제10항에 있어서, 단계 a)i)에서 2종의 SM-단백질이 함께 사용되고, 상기 SM 단백질이 소포 수송의 2가지 상이한 단계에 관여하는 방법.
13. 제12항에 있어서,
    a) 하나의 유전자는 원형질막과 소포의 융합을 조절하는 SM 단백질을 암호화하고,
    b) 제2 유전자는 골지 복합체와 소포의 융합을 조절하는 SM 단백질을 암호화하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 함께 사용되는 2종의 SM-단백질이 Munc-18c(서열번호 39) 및 Sly-1(서열번호 41)인 방법.
15. 제10항 또는 제12항에 있어서, 단계 a)i)에서 2종의 SM-단백질이 XBP-1과 함께 사용되는 방법.
16. 제15항에 있어서, SM 단백질이 XBP-1(서열번호 43)과 함께 사용되는 Munc-18c(서열번호 39) 및 Sly-1(서열번호 41)인 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 진핵생물 세포, 바람직하게는 척추동물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 세포인 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 단백질이 치료용 단백질인 방법.
19. 제18항에 있어서, 관심있는 단백질이 항체 또는 항체 단편인 방법.
20. a) 적어도 하나의 폴리펩타이드가 SM-단백질이고,
    b) 제2 폴리펩타이드가 관심있는 단백질인,
    적어도 2종의 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 단위를 포함하는 발현 벡터.
21. 제20항에 있어서, 관심있는 단백질이 치료용 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편인 발현 벡터.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 발현 단위가 멀티시스트로닉(multicistronic), 바람직하게는 바이시스트로닉(bicistronic)인 발현 벡터.
23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, SM-단백질이 Munc-18 이소폼 Munc-18 a, b, c 중 하나, 바람직하게는 Munc-18c(서열번호 39)인 발현 벡터.
24. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, SM-단백질이 Sly-1(서열번호 41)인 발현 벡터.
25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2종의 SM-단백질이 함께 사용되는 발현 벡터.
26. 제25항에 있어서, 다음과 같이 배열된 적어도 하나의 바이시스트로닉 발현 단위를 포함하는 발현 벡터:
    a) SM 단백질을 암호화하는 유전자,
    b) IRES 요소 및
    c) SM 단백질을 암호화하는 제2 유전자.
27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2종의 SM-단백질이 XBP-1과 함께 사용되고, 바람직하게는 Munc-18c(서열번호 39) 및 Sly-1(서열번호 41)가 XBP-1(서열번호 43)과 함께 사용되는 발현 벡터.
28. 적어도 2종의 이종 유전자, 즉
    a) SM-단백질을 암호화하는 적어도 하나의 유전자 및
    b) 관심있는 단백질을 암호화하는 다른 유전자
    를 발현하는 세포.
29. 제28항에 있어서, 관심있는 단백질이 치료용 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편인 세포.
30. 제28항 또는 제29항에 있어서, SM 단백질의 발현 수준이 내인성 수준보다 유의적으로 높은, 바람직하게는 10% 이상인 세포.
31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 세포.
32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 진핵생물 세포, 바람직하게는 척추동물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 세포인 세포.
33. 제32항에 있어서, 세포가 CHO 세포, 바람직하게는 CHO DG44 세포인 세포.
34. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 관심있는 단백질, 바람직하게는 항체.
35. 하나 또는 다수의 SM-단백질의 활성 또는 발현을 차단하거나 감소시키는데 유용한 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
36. 제35항에 있어서, 화합물이 폴리뉴클레오타이드 서열인 약제학적 조성물.
37. 제36항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열이 shRNA, RNAi, siRNA 또는 안티센스-RNA, 바람직하게는 shRNA인 약제학적 조성물.
38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, SM-단백질이 Munc-18c(서열번호 39) 또는 Sly-1(서열번호 41) 또는 이 둘의 조합물인 약제학적 조성물.
39. a) 적어도 하나의 SM-단백질, 바람직하게는 Munc-18c를 제공하는 단계,
    b) 상기 단계 a)의 SM-단백질을 시험 제제와 접촉시키는 단계,
    c) 세포 표면 단백질의 단백질 분비 또는 발현의 증가 또는 감소와 관련된 효과를 측정하는 단계를 포함하여,
    SM-단백질 기능의 조절인자를 확인하는 방법.
40. 암, 자가면역 질환 및 염증의 치료 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는, 방법.
41. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물과 세포를 접촉시킴을 포함하여, 세포의 증식 또는 이동을 억제하거나 감소시키는 방법.
42. 관심있는 단백질의 분비 및/또는 생산을 증가시키기 위한, 시험관내 세포 또는 조직 배양 시스템에서의 SM-단백질 또는 SM-단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 용도.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 방법, 발현 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 진단학적 용도.

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