CN101903529A - 基于sm-蛋白的分泌工程化 - Google Patents

Abstract

本发明系关于细胞培养技术之领域。其描述一种藉由异源表达Munc18c、Sly1或其它SM蛋白家族成员来增强蛋白在真核细胞中分泌性转运的新颖方法。此方法尤其适用于产生具有增强之制造能力之最优化宿主细胞系统以表达及制造重组蛋白产物。

Description

基于SM-蛋白的分泌工程化

技术领域

本发明系关于细胞培养技术之领域。其系关于一种产生蛋白之方法以及一种产生新表达载体及宿主细胞以供生物药生产之方法。本发明另外系关于药物组合物及治疗方法。

背景技术

用于人类疗法之生物药品的市场继续高速增长，有270种新颖生物药品在临床研究中正得到评估且估计在2003年出售了300亿。生物药品可自各种宿主细胞系统制造，所述宿主细胞系统包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞及哺乳动物细胞，包括衍生自人类之细胞株。目前，由于真核细胞之正确加工及修饰人类蛋白之能力，因此自真核细胞制造愈来愈多数目之生物药品。因此，自此等细胞成功且高产率地制造生物药品系关键的且高度视用于方法中之重组单克隆细胞株之特征而定。因此，急需产生具有改良特性之新颖宿主细胞系统且建立以高的比生产率培养生产细胞株之的方法作为高产率方法之基础。

任何生物药品制造方法之产率均很大程度上视当在方法条件下生长时生产细胞(producing cell)每次分泌之蛋白产物之量而定。许多复杂之生物化学细胞内过程对于自真核细胞合成及分泌治疗用蛋白为必要的。所有此等步骤，诸如转录、RNA转运、转译、转译后修饰及蛋白转运在野生型宿主细胞株中均经严格调控且将影响衍生自此宿主之任何生产细胞株的比生产率。

在以往，大多数工程化方法系集中于推动诸如转录及转译之过程的分子网络以提高蛋白制造中此等步骤之产率。然而，就任何多步骤制造过程而言，在过程链之早期步骤期间拓宽瓶颈均可能在远处下游(尤其分泌途径中之转译后)产生瓶颈。上至某一临限，已报道生产细胞之比生产率系与产物基因转录量线性相关。

然而，进一步增强产物在mRNA水平之表达可引起蛋白合成、折叠或转运机制之超负荷，导致蛋白产物在细胞内累积。实务上，此现象可在目前制造过程中频繁地观察到。因此，制造细胞株之分泌性转运机制为用于新颖宿主细胞工程化策略之引人关注之目标。

对工程化所分泌之治疗用蛋白之细胞内转运的首次研究系围绕如结合蛋白BiP/GRP78及蛋白二硫化异构酶(PDI)之分子伴随蛋白的过度表达。伴随蛋白为宿于内质网(ER)中且有助于新合成蛋白之折叠及组装的细胞蛋白。然而，与可预期之情况相反，已展示哺乳动物细胞中之BiP过度表达降低而非增大其所缔合之蛋白的分泌，而CHO细胞中之PDI过度表达产生与不同蛋白产物抵触之结果。描述在CHO细胞株中对于IFN-γ制造之ER至顺式高尔基体转运问题之报告(Hooker等人，1999)支持此等惊人发现(增大细胞之蛋白折叠能力产生远处下游制造瓶颈)之可能解释。

总之，需要改良宿主细胞之分泌能力以便重组蛋白纸制造。此与新颖转录增强技术及高滴度方法组合可甚至变得更重要以防止转译后瓶颈及蛋白产物之细胞内累积。然而，目前在通向分泌性转运机制之目标操作的道路上存在两个主要障碍：关于基本调控机制之仍受限之了解及防止在分泌过程中瓶颈移至远处下游之挑战。

发明内容

本发明描述Sec1/Munc 18(SM)蛋白家族之成员，尤其两个成员，亦即Munc-18c及Sly1，藉由联合促进将所分泌蛋白转运至细胞表面及调节分泌小泡与细胞膜之融合中的若干后续步骤而在刺激总体胞吐作用中的新颖及惊人作用。本发明亦提供有效改良自真核细胞经由分泌途径转运之蛋白之产量的方法。另外，其描述分泌途径之目标操作用于治疗疾病及发炎病况之用途。

蛋白分泌为复杂之多步骤机制：蛋白预定转运至细胞外空间或将外部细胞膜首先以共转译方式转运至内质网中。自此，将其封装于脂质小泡中且转运至高尔基体(Golgi apparatus)且最终从穿越高尔基体的网络至细胞膜中，其中将其释放至培养基中。

在各转运步骤中，自小泡及目标膜之SNARE[可溶性NSF(N-乙基马来酰亚胺敏感因子)附接受体]蛋白均形成反式SNARE复合物，其构成发生融合所需之核心机构。为满足在各种情况下之生理需求，SNARE介导的融合机构必须空间地且暂时地可调，以便能将来自细胞内及细胞外两方面的刺激正确地整合。

Sec1/Munc18(SM)蛋白似乎为调节SNARE蛋白之关键。两种SM蛋白，Sly1及Munc18(包括a、b及c三种同工型)系与沿分泌途径(ER-高尔基体-细胞膜)之小泡融合有关。Sly1为融合至内质网(ER)衍生COPII小泡之高尔基体所需，Munc18为融合至分泌小泡之细胞膜(PM)所需。

在本发明中，我们分析Sly1及Munc18c对分泌途径之生理影响，且首次发现两种SM蛋白一致地刺激总体胞吐作用。Munc18c及Sly1之活化作用的分子机制可能亦保守。基于本文之发现，我们领创了基于SM蛋白之分泌工程化，其导致增强哺乳动物细胞中的分泌。基于SM蛋白之分泌工程化代表了代谢工程化的新颖策略，为工业化生产蛋白药提供了新的平台。

本发明所述方法在若干方面有利：

首先，我们证实，Munc-18c或Sly-1单独，或两种蛋白一起异源表达，是一种通过提高宿主细胞分泌能力来增加重组蛋白产量的策略。

在产业化应用方面，该研究通过在分泌途径中引入转译后发挥作用的转基因进行基因工程化，开拓了避过此瓶颈的激励人心的前景。这看上去特别具有实用性，因为最近的一代高效表达载体的使用可能引起生产细胞株内蛋白折叠、修饰及转运机构的超负荷，因此降低其理论最大生产率。异源引入SM家族的促分泌蛋白(诸如Munc18及/或Sly1)可克服此限制。

第二，SM蛋白系自酵母至人类保守进化：在酵母中，存在四种SM蛋白(Sec1p、Sly1p、Vps33p及Vps45p)，在果蝇中有三种(ROP、Sly1及Vps33/康乃馨(carnation))，在蠕虫中有六种(Unc-18以及5种根据基因组序列数据库之其它基因)以及在脊椎动物中有七种蛋白(Munc18-1、Munc18-2及Munc18-3、VPS45、VPS33-A及VPS33-B及Sly1)。鉴于跨物种之高保守程度，似乎极有可能将SM蛋白用以调节所有真核宿主细胞物种(自酵母历经蠕虫及昆虫细胞至哺乳动物系统)中的蛋白分泌及细胞表面表达。

第三，SM蛋白家族所有成员均展示在整个序列中之高序列相似性程度，表明其应显示类似整体结构。另外，已为四个物种中九种SM基因描述了功能损失突变，其所有均引起小泡转运及融合之严重损伤，表明SM蛋白在小泡转运及分泌过程中应起到类似及重要之作用。因此，我们主张Munc18及/或Sly1对在本发明中所述之目的之适用性可同等地转移至SM蛋白家族之任何其它成员。

第四，藉由调节SNARE介导之小泡融合机构，SM蛋白家族之成员与自ER至高尔基体、自高尔基体至细胞膜之小泡转运及最终胞吐融合(exocytoticfusion)之所有不同步骤均有关。因此，参与分泌性转运链之后续步骤的多种SM蛋白之异源表达具有对跨膜蛋白之总体胞吐作用或细胞表面表达产生附加或甚至协同效应的潜力。另外，作为藉由转录因子XBP-1异源性共表达之蛋白转运的起点之ER之同时工程化进一步提高此分泌增强作用。

作为第五优势，SM蛋白亦影响分泌途径之最后一个步骤，亦即小泡转运至细胞膜，且藉此在不产生远处下游瓶颈之风险的情况下促进蛋白分泌。

总之，SM蛋白在小泡介导蛋白转运(自ER至高尔基体及自高尔基体至细胞膜)之所有步骤中的参与使得Munc18c、Sly1及所有其它SM家族蛋白均为用于目的在于增强真核细胞分泌能力之(多)基因工程化方法的极诱人及有希望之目标。

在本发明中所述之小泡介导蛋白转运之目标工程化可具有广泛应用。详言之，可突出两种基本方法：

(i)过度表达SM蛋白及/或增强SM蛋白之活性以提高细胞之分泌性转运能力，或

(ii)降低SM蛋白活性及/或表达以作为降低癌细胞增殖及/或侵入之基因疗法的手段。

SM蛋白过度表达之适用性：

所述之本发明描述一种藉由SM家族蛋白之过度表达改良细胞之总体蛋白分泌能力来产生用于制造异源蛋白之改良真核宿主细胞之方法。

此使得在基于真核细胞之制造过程中提高蛋白产率。其藉此降低此等过程之物品的成本且同时降低需经制造以产生物质之批料之数目，该物质为治疗用蛋白之调查研究、诊断学、临床研究或市场供应所需。本发明另外加速药物开发，因为产生足量的用于临床前研究之物质常为关于时间表之关键工作包。

本发明可用以提高用于产生一或若干种用于诊断目的、研究目的(目标识别、先导识别(lead identification)、先导最佳化(lead optimization))或在市场或在临床开发中制造治疗用蛋白的特异性蛋白之所有真核细胞的蛋白制造能力。

如在本申请案中所示，SM蛋白之异源表达引起所有类别蛋白(包括经分泌之酶、生长因子及抗体)之产量增加。因为跨膜蛋白共享同一小泡介导转运途径(其系由SM蛋白与SNARE之相互作用来调节)，所以此工程化方法同等地适用于改良跨膜蛋白之转运及增强其在细胞表面上之丰度。

因此，本文所述之方法亦可用于学术及工业研究目的，其旨在表征细胞表面受体之功能。举例而言，其可用于表面蛋白之制造及后续纯化、结晶及/或分析。另外，藉由所述方法产生之跨膜蛋白或表达此等蛋白之细胞可用于筛选试验，例如物质之筛选、孤儿受体之配位体的识别或在先导最佳化期间对改良效用之搜寻。因为细胞表面受体为药物目标之主要类别，所以此对于新颖人类药物疗法之开发至关重要。

另外，本文所述之方法对于研究与细胞表面受体缔合之细胞内信号复合物或分析细胞-细胞通讯(部分系由可溶性生长因子与在同一或另一细胞上之其相应受体的相互作用所介导)而言可为有利的。

降低/抑制SM蛋白表达及/或活性之适用性：

在本发明中，我们提供SM表达降低引起可溶性细胞外蛋白分泌降低之证据，如为Munc18c及Sly1所示。此使得SM蛋白为治疗性操作之诱人目标。

自正常健康细胞转化为癌细胞的特点之一为自外源生长因子之存在获得独立。与正常细胞相反，肿瘤细胞能够产生所有为其存活及自身增殖所必需之生长因子。除此自分泌机制之外，癌细胞常展示在其表面上生长因子受体之上调表达，其导致对自周围组织中之细胞所分泌之旁分泌作用生长及存活因子的反应性增强。例如藉由使用shRNA-方法、siRNA-方法或反义RNA-方法，藉由靶向SM-蛋白，如肿瘤细胞中之Sly-1及Munc18，可能以两种方式破坏自分泌以及旁分泌生长-刺激及/或存活机制：(i)藉由降低生长因子转运及分泌及(ii)藉由减少肿瘤细胞上相应生长因子-受体之量。藉此，生长刺激信号之量及癌细胞感知及响应此等信号之能力均将降低。抑制在癌细胞中之SM蛋白表达或活性因此应代表防止癌细胞增殖及存活之强大手段。

SM蛋白另外似乎为抑制肿瘤侵入及转移之有效治疗目标。在大多数类型之人类癌症的晚期，原发肿瘤产生先驱细胞(pioneer cell)，所述先驱细胞移出、侵入相邻组织且行进至远程位点，其中其可成功建立新群落(称为转移)。

作为组织侵入之先决条件，癌细胞表达整套蛋白酶，所述蛋白酶使其能够经由周围健康组织而迁移，穿过基膜，进入血流且最终侵入目标组织。将此等蛋白酶中之一些表示为膜结合蛋白，例如MT-MMP及ADAM。由于其在基质重塑、生长因子排出(shedding)及肿瘤侵入中之关键作用，因此将蛋白酶本身讨论作为癌症疗法之药物目标。我们主张抑制肿瘤细胞中SM蛋白表达及/或活性减少在目标细胞表面上之膜结合蛋白酶之量。此应降低或甚至损伤肿瘤细胞之侵入能力以及其对生长因子排出之能力，从而使得肿瘤侵入性及转移潜力降低。因此，靶向SM家族之蛋白提供防止晚期肿瘤发生，尤其自良性/实体节结转化为侵袭性转移肿瘤之新颖方式。

因此，对于治疗应用而言，目标在于降低及/或抑制SM蛋白之活性及/或表达。此可藉由核苷酸组合物来达成，将该核苷酸组合物用作藉由抑制SM蛋白功能来治疗疾病之人类治疗剂，藉以该药物包含经由结合其RNA之序列移动子(sequence motive)来特异性抑制SM蛋白的shRNA、RNAi、siRNA或反义RNA。降低/抑制SM蛋白活性/表达亦可藉由含有结合及沉默各别SM蛋白基因之启动子的核苷酸之药物物质来达成。

另外，药物物质或产物可包含抑制SM蛋白之表达或活性的新颖化学实体或肽或蛋白。在蛋白为活性医药化合物之情况下，其可为(i)与SM蛋白之启动子结合藉此抑制其表达之蛋白，(ii)与SM蛋白或其相互作用搭配物(例如，SNARE复合物内之突触融合蛋白(syntaxin)或蛋白)结合藉此阻碍SM蛋白与其结合搭配物之功能相互作用的蛋白，(iii)类似于SM蛋白但并不履行其功能之蛋白，意谓″显性负″SM蛋白变异体，或(iv)充当SM蛋白及其结合搭配物两者之骨架从而使得蛋白不可逆结合且形成稳定及非功能性蛋白复合物的蛋白。

根据本发明，提供使用本发明之化合物的新颖方法。因此，本发明之化合物可用以治疗癌症或其它异常增殖性疾病。癌症系以两种方式分类：癌症起源之组织的类型(组织类型)及原发部位，或在体内癌症首先发生之位置。癌症发生之最常见部位包括皮肤、肺、女性乳房、前列腺、结肠及直肠、淋巴系统、子宫颈及子宫。

化合物因此适用于治疗多种癌症，包括(但不限于)以下：

AIDS相关之癌症，诸如卡波氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)；骨相关癌症，诸如尤因(Ewing)家族肿瘤及骨肉瘤；脑相关癌症诸如成人脑瘤、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、儿童室管膜瘤、儿童神经管胚细胞瘤、儿童小脑幕上原始神经外胚层瘤、儿童视觉途径及下丘脑神经胶质瘤及其它儿童脑瘤；乳癌；消化/胃肠相关癌症，诸如肛门癌、肝外胆管癌、胃肠类癌、结肠癌、食道癌、胆囊癌、成人原发性肝癌、儿童肝癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌及胃癌；内分泌相关癌症，诸如肾上腺皮质癌、胃肠类癌、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、副甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤及甲状腺癌；眼相关癌症，诸如眼内黑色素瘤及视网膜胚细胞瘤；泌尿生殖器相关癌症，诸如膀胱癌、肾脏(肾细胞)癌、阴茎癌、前列腺癌、移行细胞(transitional cell)肾盂及输尿管癌、睾丸癌、尿道癌、韦尔姆斯氏瘤(Wilms′tumor)及其它儿童肾脏肿瘤；生殖细胞相关癌症，诸如儿童颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤及睾丸癌；妇科相关癌症，诸如子宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠期滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic tumor)、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜力肿瘤、子宫肉瘤、阴道癌及外阴癌；头及颈部相关癌症，诸如下咽癌(hypopharyngeal cancer)、喉癌、唇及口腔癌、原发灶隐匿之转移性鳞状颈癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦及鼻腔癌、副甲状腺癌及唾液腺癌；血液学/血液相关癌症，诸如白血病，诸如成人急性淋巴母细胞白血病、儿童急性淋巴母细胞白血病、成人急性骨髓白血病、儿童急性骨髓白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓白血病及毛细胞白血病；及淋巴瘤，诸如AIDS相关之淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、成人霍奇金氏淋巴瘤(adultHodgkin′s lymphoma)、儿童霍奇金氏淋巴瘤、怀孕期间霍奇金氏淋巴瘤、蕈样真菌病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、怀孕期间非霍奇金氏淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、赛谢症候群(Sezarysyndrome)、皮肤T-细胞淋巴瘤及华氏巨球蛋白血症(

macroglobulinemia)及其它血液学/血液相关癌，诸如慢性脊髓增生病症、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓发育不良症候群及骨髓发育不良/骨髓增生病；肺相关癌症，诸如非小细胞肺癌及小细胞肺癌；肌肉骨骼相关癌症，诸如尤因氏家族肿瘤、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、儿童横纹肌肉瘤、成人软组织肉瘤、儿童软组织肉瘤及子宫肉瘤；神经相关癌症，诸如成人脑瘤、儿童脑瘤、脑干神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、小脑幕上原始神经外胚层瘤、视觉途径及下丘脑神经胶质瘤及其它脑瘤，诸如神经母细胞瘤、垂体瘤及原发性中枢神经系统淋巴瘤；呼吸道/胸相关癌症，诸如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤及胸腺癌；皮肤相关癌症，诸如皮肤T-细胞淋巴瘤、卡波氏肉瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)及皮肤癌。

此等病症已在人类中充分表征，但于其它哺乳动物中亦以类似之病源学存在，且可藉由本发明之药物组合物来治疗。

对于治疗用途而言，可以治疗有效量、以任何习知剂型、以任何习知方式来投与化合物。投与途径包括(但不限于)静脉内、肌肉内、皮下、滑液内、藉由输注、舌下、经皮、经口、局部或藉由吸入、锭剂、胶囊、囊片、液体、溶液、悬浮液、乳液、口含剂、糖浆、可复水散剂、颗粒、栓剂及经皮贴片剂。制备此等剂型之方法为已知的(例如，参见，H.C.Ansel及N.G.Popovish，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第5版，Lea及Febiger(1990))。治疗有效量可由熟习此项技术者基于诸如体重、代谢及疾患严重性等因素来确定。活性化合物优选以每公斤体重每日约1mg至约500mg来给药。活性化合物更优选以每公斤体重每日约1mg至约100mg来给药。

化合物可单独或与佐剂组合投与，所述佐剂增强抑制剂之稳定性，促进在某些实施例中含有其之药物组合物的投与，提供增强之溶解或分散，提高抑制活性，提供辅助疗法，及其类似情况。有利地，此等组合可利用较低剂量之活性成份，由此降低可能之毒性及不利副作用。

与根据本发明之化合物一起使用的可药用载剂及佐剂包括(例如)离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白、缓冲物质、水、盐或电解质及基于纤维素之物质。此并非可能之可药用载剂及佐剂的完整清单，且一般技术者知道其它可能性，其在此项技术中为充分的。

总之，本发明描述藉由异源表达Munc18c、Sly1或SM蛋白家族之其它成员及其组合来增强在真核细胞中蛋白之分泌性转运的新颖方法。此方法尤其适用于以增强之制造能力产生最优化宿主细胞系统以便表达及制造重组蛋白产物。

Sec1/Munc18(SM)蛋白为在细胞内蛋白转运中膜融合所需的，但已长期提出其作用之性质为不同而非统一的，其部分系因为在SM蛋白与SNARE之间相互作用之非均质性。在本发明中，我们评估两种SM蛋白对分泌途径之生理影响。基本发现在于在小泡融合至细胞膜及高尔基体中涉及之Munc18c及Sly1一致地刺激总体胞吐作用。

与此模型一致，我们展示当敲低Sly1及Munc18c时，总体胞吐作用降低(图3)。相反地，藉由过度表达造成的增加水平之Sly1提高分泌能力(图4)。重要及令人惊讶地，Munc18c亦显著刺激宿主细胞之分泌能力。为支持此，我们论证Munc18c系与为融合至PM(细胞膜)而特异性化之SNARE复合物直接结合(图5)。

先前研究指定Munc18c在胞吐作用中之抑制作用(Riento等人，2000；Kanda等人，2005；Tellam等人，1997；Thurmond等人，1998)，其与本发明之结果相抵触。为提供Munc18c在转运机制中之作用，详言之其与由突触融合蛋白4、SNAP-23及VAMP2组成之胞吐SNARE蛋白之相互作用的分子理解，我们报道免疫沉淀实验。如图5中所示，Munc18c-特异性抗体定量地使Munc18c连同显著量之突触融合蛋白4、SNAP-23及VAMP 2一起沉淀，表明Munc18c与此等SNARE之活体内缔合，其促进在分泌途径中的小泡-细胞器融合(Peng及Gallwitz，2002；Shen等人，2007；Scott等人，2004)。此发现强调类似于与完全组装之SNARE复合物结合且促进融合高尔基体之Sly1，Munc18c亦与SNARE复合物直接相互作用，提示藉由促进SNARE介导之转运机制之保守作用机制。

因此，Sly1及Munc18c功能之生理学作用及机制在SNARE介导分泌途径中均为保守的。

当Sly1、Munc18c及通用细胞器扩增因子Xbp-1过度表达时，基于SM蛋白之分泌工程增强多种蛋白之胞吐作用，所述蛋白包括酶、生长激素及免疫治疗单克隆抗体。

本申请案之数据论证一旦在相同细胞内两种SM蛋白同时过度表达即对蛋白分泌有附加或甚至协同之效应，如为Munc18c及Sly1所示。我们的数据因此支持SM蛋白在刺激SNARE介导转运机制中之统一功能的模型且表示用于增强分泌之转译后工程化的新颖策略。

总之，在本申请案中，我们提供SM蛋白在胞吐/分泌途径中之统一活化作用的第一个惊人证据。基于此发现，我们开创了基于SM蛋白之转译后工程化，藉由其成功达成增强之胞吐作用。

有效产生蛋白治疗剂对生物技术工业仍为大挑战。迄今为止，已开发多种不同代谢工程化策略。举例而言，藉由增大转录(转录工程化)；藉由调节哺乳动物细胞之转译效能(转译工程化)；藉由提高特异性糖型(glycoform)之产量(糖基化工程化)；藉由仅将代谢能复位向至产物形成(受控增殖技术)及藉由改良生产细胞株之活力(抗细胞凋亡工程化)。然而，基于和谐配合之(orchestrated)分泌机构的代谢工程仍为难懂的。基于Sly1及Munc18c一致地刺激总体胞吐作用之发现，在本文中我们首次报道引起哺乳动物细胞之分泌能力增强的基于SM蛋白之转译后工程化。该系统系与所用启动子之表达组态、类型及启动子介导转录量无关，使得其尤其适于工业制造重组蛋白及医药。

本发明另外提供藉由干扰SM蛋白表达来抑制或降低蛋白胞吐作用之手段。此将为治疗癌症或发炎病况提供适用手段。

先前已描述，在真核细胞中，膜结合转运小泡使蛋白及脂质在亚细胞区室/细胞器之间穿梭。在各转运步骤，自小泡及目标膜之SNARE[可溶性NSF(N-乙基马来酰亚胺敏感因子)附接受体]蛋白均形成反式SNARE复合物，其构成发生融合所需之核心机构。为满足在各种情况下之生理需求，SNARE介导融合机构必须在空间上暂时地可调以自待适当整合之细胞内及细胞外来源均获得刺激。因此，关键在于活体内调节或微调SNARE功能以使膜融合之特异性及速度均不受损。Sec1/Munc18(SM)蛋白可为调节SNARE蛋白之关键。首先在酵母及线虫中识别之SM蛋白为融合所必需。除SNARE外几乎不存在相互作用搭配物之事实已得出SM蛋白系与SNARE蛋白功能偶联之普遍观点(Gallwitz及Jahn，2003；Jahn等人，2003；Toonen及Verhage，2003)。然而，推广SM蛋白之功能模型的尝试已显著地受阻于其与SNARE相互作用之异质性质。在独特转运步骤且在不同生物体中，单体突触融合蛋白(Dulubova等人，1999；Yang等人，2000；Peng及Gallwitz，2002)、小泡相关SNARE(Li等人，2005；Carpp等人，2006；Peng及Gallwitz；2004；Shen等人，2007)、异二聚体t-SNARE复合物(Scott等人，2004；Zilly等人，2006)以及三元完全组装之SNARE复合物(Carpp等人，2006；Peng及Gallwitz；2004；Shen等人，2007；Togneri等人，2006；Carr等人，1999；Dulubova等人，2007)已展示易于与个别SM蛋白结合。因此，已为膜融合中之SM蛋白功能以正面及负面观点解释了此等相互作用之生理学意义。

因此，分子机制，尤其SM蛋白在分泌途径中之生理作用仍为未知的。举例而言，Sly1系与单体突触融合蛋白5、单体小泡结合SNARE及完全组装之SNARE复合物相互作用(Li等人，2005；Peng及Gallwitz；2004)，且已展示正面影响形成SNARE复合物及融合特异性(Peng及Gallwitz，2002；Kosodo等人，2002)。

另一方面，先前研究指定Munc18蛋白在膜融合及胞吐作用中之抑制作用：突触小泡之经调节胞吐作用尤其需要之神经元特异性Munc18a呈现两种与SNARE相互作用之功能对立：藉由与突触融合蛋白1之封闭构形结合，由此抑制SNARE复合物组装(Dulubova等人，1999；Yang等人，2000)，且与完全组装之SNARE复合物结合，因此促进膜融合(Shen等人，2007；Dulubova等人，2007)。一致地，报道了Munc18a对胞吐作用之抑制及促进作用(Wu等人，1998；Verhage等人，2000；Voets等人，2001)。Munc18b及Munc18c在序列上与Munc18a同源但无所不在地表达。活体外数据表明Munc18c在SNARE结合方面类似于Munc18a(Latham等人，2006；D′Andrea-Merrins等人，2007)，且两种蛋白之结构为保守的(Misura等人，2000；Hu等人，2007)。然而，遗传学及生理学研究迄今为止已提供Munc18b及Munc18c在胞吐作用中之抑制作用的专有证据(Riento等人，2000；Kanda等人，2005；Tellam等人，1997；Thurmond等人，1998)。举例而言，1)蝇类中Munc18a之过度表达抑制神经元传输(Wu等人，1998)，2)在Caco-2细胞中Munc18b之过度表达抑制流感病毒血球凝集素之顶端传递(apical delivery)(Riento等人，2000)，3)Munc18c对突触融合蛋白4与对VAMP2竞争结合(Thurmond等人，1998)；4)在脂肪细胞中经胰岛素刺激GLUT小泡之易位系受Munc18c过度表达抑制但在无Munc18c小鼠中增强(Tellam等人，1997；Thurmond等人，1998)。

与此等报道相反且与主导预想不同，在本申请案中，我们藉由证明两种蛋白通常同等刺激胞吐作用来论证两种SM蛋白sly1及Munc18c之新颖及惊人之作用。藉由Munc18c及Sly1之活化作用的分子机制可能亦为保守的。基于此等惊人发现，我们开创了在哺乳动物细胞中产生增强之分泌的基于SM蛋白之分泌工程化。基于SM蛋白之分泌工程化表示代谢工程之新颖策略且为在工业中生产蛋白医药提供新颖平台。

详言之，Sly1及Munc18c表达对哺乳动物细胞分泌能力之正面作用指出一种将增大分泌之哺乳动物生产细胞株工程化之新颖转译后方法。

在实施例5中说明sly1与munc18c同时过度表达引起SEAP产量增大8倍，相比之下，藉由单独之sly1或munc18c增大5倍。SAMY及VEGF₁₂₁之分泌亦增大(图4b、4c)。sly1、munc18c及xbp-1全部之过度表达将SEAP、SAMY及VEGF之分泌分别增大10倍、12倍及8倍(图4a、4b、4c)，明显地说明在Sly1与Munc18c之间及在两种SM蛋白与通用细胞器扩增因子Xbp-1之间对分泌存在协同效应。

在实施例6中进一步说明，藉由产生为sly1(CHO-Sly1₁₆及CHO-Sly1₂₃)或munc18c(CHO-Munc18c₈及CHO-Munc18c₉)之组成型表达而工程化的稳定CHO-K1衍生细胞株，CHO-Sly1₁₆及CHO-Sly1₂₃刺激SEAP分泌增加4倍及8倍(图6a)及SAMY产量提高4倍及5倍(图6b)。有趣地，产生较多SEAP之CHO-Sly1₂₃亦展示较高Sly1水平，表明SM与产物蛋白之正相关性(图6c)。类似地，为组成型munc18c表达转基因之细胞(CHO-Munc18c₉)产生多9倍及6.5倍之SEAP及SAMY(图6e及6f)且产生更多SEAP之CHO-Munc18₉亦展示较高Munc18c水平(图6d)。与亲本CHO-K1相比，稳定细胞株CHO-Sly1-Munc18c₁(为组成型Sly1及Munc18c表达之双转基因)及CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇(为组成型Sly1、Munc18c及Xbp-1表达之三转基因)展示高13倍及16倍之SEAP产量(图6g)。

具体地，基于SM蛋白之分泌工程化提高生产细胞株之抗体的比生产率。实施例7藉由在原型生物药生产方案中使用基于SM蛋白之分泌工程化以在CHO-Sly1₁₆及CHO-Sly1₂₃中(增大至多10倍)、在CHO-Sly1-Munc18c₁中(增大至多15倍)及在CHO-Sly1-Xbp-1₄中(增大至多13倍)及在CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇中(增大至多19倍)表达称为利妥昔单抗(Rituximab)之单克隆抗人类CD20 IgG1来说明此(图7a)。当在CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇中产生利妥昔单抗时，可达到至多40pg/细胞/天之特别制造水平，与同基因对照细胞株相比，其对应于增大接近20倍(图7a)。SDS-PAGE分析表明藉由CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇及野生型CHO-K1细胞产生之抗体为结构完整的且彼此不可区分(图7b、7c)。自在CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇中产生之利妥昔单抗的N-连接Fc寡糖之基于Maldi-TOF之糖基化概况分析(Glycoprofiling)揭示与原生生产细胞株相比无差异，表明基于SM/Xbp-1之分泌工程化并不损害产物质量(图7d及7e)。

附图说明

图1

Sly1及Munc18在HEK-293中之表达及定位。(a)及(b)将肌动蛋白用作内源对照物对sly1(a)及munc18(b)转录物进行基于RT-PCR之侦测。将1-Kb序列梯用作分子量标准。(c)Munc18a/b/c之Western印迹。(d)共焦显微照片显示Sly1及Munc18c在经YFP-Munc18c(pRP23)加CFP-突触融合蛋白4(Stx4，pRP29)组合或YFP-Sly1(pRP32)加CFP-突触融合蛋白5(Stx5，pRP40)组合转柒的HEK-293中的亚细胞定位。箭头表示Sly1与突触融合蛋白5(上图)或Munc18c与突触融合蛋白4(下图)之共定位(colocalization)。

图2

基于shRNA而敲低sly1及Munc18c。(a)图示编码双顺反子sly1/GFP的表达载体pRP3，其用作不同的sly1特异性shRNA的sly1特异性敲低报道构建体。(b)荧光显微照片显示经pRP3及编码shRNA的不同表达载体共转染、且培养48h的CHO-K1。(c)图示编码双顺反子Munc18c/GFP的表达载体pRP4，其用作不同的Munc18c特异性shRNA的Munc18c特异性敲低报道构建体。(d)荧光显微照片显示经pRP4及编码shRNA的不同表达载体共转染、且培养48h的HEK-293。

图3

基于shRNA而敲低sly1及munc18c导致降低总体胞吐作用。(a)HEK-293的Sly1特异性Western印迹，所述细胞被靶向sly1的shRNA表达载体(shRNA_{sly1_1/2/3}；pRP5-7)转染。将亲本载体pmU6、对照物shRNA及p27^Kip1用作对照物。(b)HEK-293的SEAP表达概况，所述细胞被pSEAP2-对照物及不同的shRNA_sly1表达载体共转染(48h)。(c)HEK-293的Munc18c特异性Western印迹，所述细胞被靶向munc18c的shRNA表达载体(shRNA_{munc18_c1/2/3}；pRP12，14，38，39)转染。(d)HEK-293的SEAP表达概况，所述细胞被pSEAP2-对照物及不同的shRNA_munc18表达载体共转染。

图4

Sly1及Munc18c的异位表达在转录后阶段提高CHO-K1的蛋白产量。(a-c)CHO-K1之生产概况，所述细胞被SEAP(pSEAP1-对照物)(a)、SAMY(pSS158)(b)或VEGF₁₂₁(pWW276)(c)生产型载体及(不同组合的)编码Sly1(pRP24)、Munc18c(pRP17)及Xbp-1(pcDNA3.1-Xbp-1)的表达载体共转染。(d)在有或无SM蛋白表达时，产物mRNA水平基于定量RT-PCR的概况分析(profiling)。

图5

Munc18c与胞吐的SNARE复合物的相互作用。用亲和纯化的、蛋白A-Sepharose-偶联的抗Munc18c抗体使HEK-293溶胞物免疫沉淀之后，对Munc18c、突触融合蛋白4、SNAP-23及VAMP2/突触泡蛋白(synaptobrevin)2(SybII)进行Western印迹分析。用未沉淀的蛋白(上清)及Sly1作对照物。

图6

基于SM蛋白的分泌工程化提高了异源蛋白在CHO-KI衍生之细胞株中的产量。(a)稳定混合并克隆化的CHO-K1衍生群体的SEAP产量，所述细胞是Sly1及SEAP组成型表达(CHO-Sly1₁₆及CHO-Sly1₂₃及CHO-Sly1_混合)的转基因体，且已培养48h。(b)经pSS158瞬时转染的CHO-Sly1₁₆及CHO-Sly1₂₃及CHO-Sly1_混合的SAMY产量。(c)CHO-K1、CHO-Sly1₁₆及CHO-Sly1₂₃的Sly1特异性Western印迹，以p27^Kip1作为负载对照物(loading control)。(d)CHO-K1、CHO-Munc18c₈及CHO-Munc 18c₉的Munc18c特异性Western印迹，p27^Kip1作为负载对照物。(e)稳定混合并克隆化的CHO-K1衍生群体的SEAP产量，所述细胞为Munc18c及SEAP组成型表达的转基因体(CHO-Munc18c₈、CHO-Munc18c₉及CHO-Munc18c_混合)，并已培养48h。(f)经pSS158瞬时转染的CHO-Munc18c₈、CHO-Munc18c₉及CHO-Munc18_混合的SAMY产量。(g)稳定细胞克隆培养48h之后的SEAP生产概况，所述细胞组成型表达Sly1及Munc18c(CHO-Sly1-Munc18c₁)、Sly1及Xbp-1(CHO-Sly1-Xbp1₄)及Sly1、Munc18c以及Xbp-1(CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇)。

图7

在分泌工程化CHO-K1衍生物中产生的利妥昔单抗的产量及糖基化概况分析。(a)不同的分泌工程化CHO-K1衍生物的利妥昔单抗比生产率。基于SM蛋白的代谢工程化使人IgG1的分泌增加。(b、c)从CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇及CHO-K1细胞纯化的利妥昔单抗经非还原型(b)和还原型(c)SDS-PAGE来分析。图中示出了标准蛋白和IgG1重链及轻链(HC、LC)的分子量(KDa)。(d、e)基于MALDI-TOF分析在CHO-K1及分泌工程化CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇中产生的利妥昔单抗的糖基化概况。

图8

表达构建体的示意图：

编码至少一种目标蛋白(GOI)及一种SM蛋白的载体，所述蛋白由不同的表达单元(a)或由单个双顺反子单元(b)编码。

包含两种SM蛋白的基因的表达载体，所述蛋白由不同的表达盒(c)编码，或者两个基因通过IRES组件相连以双顺反子方式来编码蛋白(d)。

由单个多顺反子表达单元编码至少两种SM蛋白及一个目标基因(e)或多种SM蛋白的表达载体。

图9

SM蛋白增强人类细胞的HRP分泌：

测量人HT1080细胞上清中的HRP活性，所述细胞用分泌型辣根过氧化物酶(ssHRP)及空载体(Mock，黑条)、Munc18c(灰条)、Sly1(阴影条)或编码Munc 18c和Sly1的双顺反子构建体(Munc-IRES-Sly，横纹条)共转染。相对于设定为1.0之Mock对照物，绘制转染后24h及48h测量的相对ssHRP滴度以及比生产率的图形。这些值对应于三份试样的平均值，误差条＝SEM。

图10

SM蛋白在IgG生产细胞株中的过表达提高比生产率及最终IgG滴度

(A)稳定表达空载体(Mock)或Sly-1(Sly1)、Munc-18c(Munc)或两种SM蛋白(Munc/Sly1)的表达构建体的细胞的IgG1相对比生产率。所述生产率根据补料分批(fed-batch)生产过程期间的滴度及活细胞计数来计算。这些柱图代表n＝2(Mock)至n＝6个单克隆转基因IgG生产细胞株的平均值，且相对于设定为100％之Mock细胞中的比生产率来描绘。

(B)历经9天补料分批发酵过程稳定地表达所述构建体的稳定细胞群的IgG滴度。

实施方式

一般实施例″包含″涵盖更特定之实施例″由…组成″。另外，单数及复数形式并非以限制方式使用。

在本发明期间所用之术语具有以下含义。

术语″基因″意谓脱氧核酸(DNA)序列(例如，cDNA、基因组DNA或mRNA)。在本发明中，基因优选系指人类DNA序列，但包括自其它哺乳动物物种(优选为小鼠、仓鼠及大鼠)之同等同源序列，以及自额外真核物种(包括鸡、鸭、苔藓、蠕虫、蝇及酵母)之同源序列。

集合术语″Sec1/Munc-18蛋白″或″SM蛋白″或″Sec1/Munc18蛋白群″或″SM-蛋白″或″编码SM-蛋白之基因″或″SM家族″包含60-70kDa之亲水性蛋白之家族，其具有高的结构相似性程度且自酵母至人类保守进化。

Munc18及Sly1两者均属于Sec1/Munc18蛋白家族。此家族迄今进一步包括：

在酵母中：Sec1p、Sly1p、Vps33p及Vps45p

在果蝇中：ROP、Sly1及Vps33/康乃馨

在线虫中：Unc-18以及5种其它根据基因组序列数据库之基因

在脊椎动物中：Munc18-1、Munc18-2及Munc18-3、VPS45、VPS33-A及VPS33-B及Sly1。

术语SM-蛋白亦涵盖此等蛋白之衍生物、突变体及片段，例如带flag-卷标、带HIS-卷标或带另外卷标之SM-蛋白。频繁地将此等衍生物例如用于蛋白之简易纯化或分离或观测。

SM蛋白展示在整个序列上之高同源性，表明其可能具有类似整体结构。另外，已为四个物种中九种SM基因描述了功能丧失突变，其均引起小泡转运及融合之严重损伤，表明SM蛋白在小泡转运及分泌之过程中起到类似及重要之作用。

本发明之实施例使用Munc18及Sly1作为模型蛋白，然而，本发明可同样转移至SM蛋白家族之其它成员。

另外，鉴于跨物种之高保守程度，SM蛋白可用以调节在所有真核宿主细胞物种(自酵母历经蠕虫及昆虫细胞至哺乳动物系统)中蛋白之分泌及细胞表面表达。

在真核细胞中，膜结合转运小泡使蛋白及脂质在亚细胞区室/细胞器之间穿梭。细胞转运小泡与细胞膜或与目标区室(诸如溶酶体、高尔基复合体或细胞膜)之融合系由SNARE[可溶性NSF(N-乙基马来酰亚胺敏感因子)附接受体]蛋白介导。为满足细胞之生理需求且保持区室特异性膜组成，藉由Sec1/Munc18(SM)家族之小蛋白来在空间上暂时地控制SNARE介导之融合机构。藉由与SNARE及突触融合蛋白直接结合，SM蛋白调节在细胞内区室/细胞器与细胞膜之间小泡介导转运之所有步骤。

术语″Munc-18″或″Munc-18蛋白″或″Munc-18蛋白家族″包括存在于真核生物体中之所有Munc-18基因及基因产物/蛋白。此清楚地包括三种Munc-18旁系同源物(paralog)，亦即Munc-18a(其亦称为″Munc-18-1″)、Munc-18b及Munc-18c，其已在脊椎动物中进化。更具体地，术语″Munc-18c″系指人类基因及亦称为″突触融合蛋白结合蛋白3″(STXBP3)或″血小板Sec1蛋白″(PSP)(SEQ-ID NO 39)之蛋白Munc18c，包括在其它哺乳动物物种(包括小鼠、仓鼠、大鼠、狗及兔)中之其同源物。

术语″Sly-1″或″Sly-1蛋白″系指所有自脊椎动物(优选为哺乳动物)中此等基因表达之Sly1基因及蛋白。更具体地，″Sly-1″系指人类Sly1蛋白，亦称为″含有Sec1家族结构域之蛋白1″(SCFD1)或″突触融合蛋白结合蛋白-1状蛋白2″(STXBP1L2)，SEQ-ID NO.41。

术语″XBP-1″同样系指XBP-1DNA序列及所有自此基因表达之蛋白，包括XBP-1拼接变异体。优选地，XBP-1系指人类XBP-1序列且优选系指XBP-1之拼接及活性形式，亦称为″XBP-1″。已知转录因子XBP-1为分泌细胞分化以及维持ER稳态及扩增之关键调节子之一(Lee，2005；Iwakoshi，2003)。此等功能使得XBP-1为用于分泌工程方法之候选物。

更具体地，″XBP-1″系指人类XBP-1蛋白，SEQ-ID NO.43。

术语″生产率″或″比生产率″描述藉由限定数目之细胞在限定时间内产生之特异性蛋白之量。比生产率因此为细胞表达/合成/产生目标蛋白的能力之定量量度。在工业制造中，通常将比生产率表示为每细胞及每天所产生之以皮克(′pg/细胞*天′或′pcd′)计的蛋白之量。

测定所分泌蛋白之″比生产率″的一种方法为藉由酶联免疫吸附试验(ELISA)来定量测量分泌至培养基中的目标蛋白之量。出于此目的，将细胞以限定密度接种至新鲜培养基中。在限定时间之后，例如在24小时、48小时或72小时之后，对细胞培养液取样且使其经受ELISA测量以测定目标蛋白的滴度。可藉由将滴度除以平均细胞数目及时间来测定比生产率。

藉由均匀时间解析荧光(HTRF

)试验来提供如何测量细胞″比生产率″之另一实例。

对于细胞内、膜相关或跨膜蛋白而言之细胞的″生产率″亦可藉由Western印迹法来侦测且定量。将细胞首先洗涤且随后溶解于含有诸如Triton-X、NP-40或SDS之清洁剂或高盐浓度之缓冲液中。接着将细胞溶胞物中之蛋白藉由在SDS-PAGE上以尺寸分离，转移至耐纶膜，其中目标蛋白随后藉由使用特异性抗体来侦测及观测。

测定细胞之″比生产率″之另一方法为藉由针对目标蛋白而提出之荧光标记抗体来免疫侦测目标蛋白且在流式细胞仪中定量荧光信号。在细胞内蛋白之情况下，首先将细胞固定于中例如三聚甲醛(paraformaldehyde)缓冲液中，且接着渗透以允许侦测抗体穿透至细胞中。可在无需事先固定或渗透的情况下对活细胞定量细胞表面蛋白。

细胞之″生产率″可另外藉由测量诸如绿荧光蛋白(GFP)之报道蛋白的表达来间接测定，该绿荧光蛋白系表达为具有目标蛋白之融合蛋白或来自与目标蛋白相同之mRNA作为二表达单元、三表达单元或多表达单元之部分。

术语″提高/增加生产率″包含增加/提高细胞之比生产率的方法。若生产率在所研究之细胞中较之各别对照细胞更高且若此差异为统计上显著的，则比生产率增加或提高。所研究之细胞可为经处理、转染或基因修饰之细胞的非均质群体或克隆化细胞株；未经处理、未经转染或未经修饰之细胞可充当对照细胞。在所分泌之目标蛋白的情形中，术语″提高/增加/改良之生产率″及″增强/提高/改良之胞吐作用″及″提高/增加/改良之分泌″具有相同含义且可互换使用。

术语″衍生物″通常包括适于实现本发明之预定用途的序列，其意谓所述序列介导细胞中分泌性转运之提高。

术语″衍生物″当用于本发明中时意谓在序列中与原始序列或其互补序列至少70％一致之多肽分子或核酸分子。多肽分子或核酸分子优选在序列中与原始序列或其互补序列至少80％一致。多肽分子或核酸分子更优选在序列中与原始序列或其互补序列至少90％一致。最优选为在序列中与原始序列或其互补序列至少95％一致且显示与原始序列相同或类似之对分泌之影响的多肽分子或核酸分子。

序列差异可基于自不同生物体之同源序列的差异。其亦可能基于藉由取代、插入或缺失一或多个核苷酸或氨基酸(优选1、2、3、4、5、7、8、9或10个)之序列的目标修饰。可使用位点特异性突变及/或基于PCR之突变技术来制造缺失、插入或取代突变体。可藉由使用(例如)标准″对准″算法，例如″BLAST″来测定参考序列之序列一致性。当其在其序列中配合在一起时，序列对准，且可借助于标准″对准″算法来识别。

另外，在本发明中，术语″衍生物″意谓与其它核酸序列杂交之核酸分子(单股或双链)。杂交优选在严格杂交及洗涤条件下进行(例如在65℃下在含有5xSSC之缓冲液中杂交；在42℃下使用0,2×SSC/0,1％SDS洗涤)。

术语″衍生物″另外意谓尤其在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸位置处蛋白缺失及/或插入突变体、磷酸化突变体，及带有蛋白激酶C(PKC)或酪蛋白激酶II(CKII)之结合位点缺失的突变体。

术语″活性″描述且定量在细胞内或在活体外试验中蛋白之生物学功能。

测量SM蛋白″活性″之一种试验为例如用于模型蛋白、抗体或目标蛋白的分泌试验。将细胞以ss-HRP-Flag质粒连同空载体或所研究之基因(诸如Munc-18c或Sly-1)一起共转染。转染后24h以无血清培养基洗涤细胞且在0、1、3及6h之后藉由一起培育澄清细胞上清与ECL试剂对HRP分泌定量。以光度计(Lucy2，Anthos)在450nm下进行测量。

侦测就SM蛋白之功能结合而言之″活性″的另一方法将展示SM蛋白与其已知相互作用搭配物之结合，例如Munc-18c与突触融合蛋白-4之结合或Sly1与突触融合蛋白-5之物理相互作用。SM蛋白与其它蛋白之结合可藉由免疫共沉淀来证明，例如使用与珠粒偶联之特异性抗体使SM蛋白下沈(pull-down)，珠粒变性及之后藉由SDS-PAGE及Western印迹之免疫共沉淀蛋白之分离及侦测。

SM蛋白与另一蛋白(例如，突触融合蛋白)之直接结合可进一步在酵母-二-杂交(yeast-two-hybrid)试验中侦测。在此试验中，两种蛋白在酵母细胞中以分别与转录因子之DNA结合域及转录活化域之融合蛋白的形式表达。两种蛋白之直接相互作用均引起转录因子重构，该转录因子之活性系以比色方式或藉由酵母细胞在选择性条件下生长之能力来侦测。

藉由SM蛋白与其结合搭配物之共免疫荧光法(co-immunofluorescence)及侦测其在细胞内之共定位来提供另一间接方法。

测量XBP-1之″活性″的一种方法为进行带移实验以侦测XBP-1转录因子与其DNA结合位点之结合。另一方法为侦测活性XBP-1拼接变异体自细胞溶质至核之易位。或者，XBP-1″活性″可藉由测量真正(bona fide)XBP-1目标基因(诸如结合蛋白(BiP))之一旦XBP-1异源表达后的诱导表达来间接证实。

在本发明之含义中″宿主细胞″为诸如仓鼠细胞之细胞，优选为BHK21、BHK TK^-、CHO、CHO Pro-5、CHO衍生之突变细胞株Lec1至Lec35、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1及CHO-DG44细胞或此等细胞株中任一者之衍生物/后代。尤其优选为CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1及BHK21，且甚至更优选为CHO-DG44及CHO-DUKX细胞。在本发明之另一实施例中，宿主细胞亦意谓鼠类骨髓瘤细胞，优选为NS0及Sp2/0细胞或此等细胞株中任一者之衍生物/后代。亦将可用于本发明含义中之鼠类及仓鼠细胞之实例概括于表1中。然而，所述细胞、其它哺乳动物细胞(包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、猴及啮齿动物细胞株，或真核细胞，包括(但不限于)酵母、昆虫、植物及禽类细胞)之衍生物/后代亦可以本发明之含义使用，尤其对于制造生物药蛋白而言。

表1：真核生物生产细胞株

细胞株	顺序编号
		NS0	ECACC No.85110503
Sp2/0-Ag14	ATCC CRL-1581
		BHK21	ATCC CCL-10
BHK TK-	ECACC No.85011423
		HaK	ATCC CCL-15
2254-62.2(BHK-21衍生物)	ATCC CRL-8544
		CHO	ECACC No.8505302
野生型CHO	ECACC 00102307
		CHO-K1	ATCC CCL-61
CHO-DUKX(＝CHO duk-，CHO/dhfr-)	ATCC CRL-9096
		CHO-DUKX B11	ATCC CRL-9010
CHO-DG44	(Urlaub等人，1983)

CHO Pro-5	ATCC CRL-1781
		Lec13	(Stanley P.等人，1984)
V79	ATCC CCC-93
		B14AF28-G3	ATCC CCL-14
HEK 293	ATCC CRL-1573
		COS-7	ATCC CRL-1651
U266	ATCC TIB-196
		HuNS1	ATCC CRL-8644
Per.C6	(Fallaux，F.J.等人，1998)
		CHL	ECACC No.87111906

宿主细胞当在无血清条件下建立、适应且完全培养，且任选地在不含动物来源之任何蛋白/肽之培养基中时为最佳。市售培养基，诸如Ham′sF12(Sigma，Deisenhofen，Germany)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco改质之Eagle培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM；Sigma)、最低必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM；Sigma)、Iscove改质之Dulbecco培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium，IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)、CHO-S-Invtirogen、无血清CHO培养基(Sigma)及无蛋白CHO培养基(Sigma)为例示性适当营养溶液。必要时任何培养基均可补充有多种化合物，其实例为激素及/或其它生长因子(诸如，胰岛素、运铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐(诸如，氯化钠、磷酸钙、磷酸镁)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷(诸如，腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其它等效能源、抗生素、微量元素。亦可包括熟习此项技术者已知之适当浓度的任何其它必要补充剂。在本发明中，优选使用无血清培养基，但补充有合适量血清之培养基亦可用于培养宿主细胞。对于表达可选基因之经基因修饰之细胞的生长及选择而言，将合适选择剂添加至培养基中。

术语″蛋白″可与氨基酸残基序列或多肽互换使用且系指任何长度之氨基酸的聚合物。此等术语亦包括经由包括(但不限于)糖基化、乙酰化、磷酸化之反应或蛋白处理而经转译后修饰之蛋白。在分子保持其生物学功能活性之同时，可在多肽结构中产生修饰及改变(例如与其它蛋白融合)、氨基酸序列取代、缺失或插入。举例而言，可在多肽或其基本核酸编码序列中产生某些氨基酸序列取代且可获得具有类似特性之蛋白。

术语″多肽″意谓具有10个以上氨基酸之序列且术语″肽″意谓至多10个氨基酸长度之序列。

本发明适于产生用于制造生物药多肽/蛋白之宿主细胞。本发明尤其适于藉由展示增强之细胞生产率的细胞使大量不同之目标基因高产率表达。

″目标基因″(GOI)、″所选序列″或″产物基因″在本文中具有相同含义且系指编码目标产物或″目标蛋白″(亦称为″所需产物″)的任何长度之多核苷酸序列。所选序列可为全长或截短基因、融合或带标签基因，且可为cDNA、基因组DNA或DNA片段，优选为cDNA。其可为原生序列，亦即天然存在之形式，或必要时可经突变或另外经修饰。此等修饰包括密码子优化以便优化密码子在所选宿主细胞中、在人源化过程中或在标记过程中的利用情况。所选序列可编码分泌型、胞质型、核型、膜结合型或细胞表面型多肽。

″目标蛋白″包括蛋白、多肽、其片段、肽，其所有均可在所选宿主细胞中表达。所需蛋白可为(例如)抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段，及可充当激动剂或拮抗剂及/或具有治疗或诊断用途之任何其它多肽。下文亦给出所需蛋白/多肽之实例。

在诸如单克隆抗体等较复杂分子之情况下，GOI编码两个抗体链中之一或两者。

″目标产物″亦可为反义RNA、siRNA、RNAi或shRNA。

″目标蛋白″或″所需蛋白″为上述者。具体地，所需蛋白/多肽或目标蛋白例如为(但不限于)胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、细胞因子(诸如介白素(IL)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω或IFNτ、肿瘤坏死因子(TNF)，诸如TNFα及TNFβ、TNFγ、TRAIL；G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1及VEGF。亦包括制造红细胞生成素或任何其它激素生长因子。根据本发明之方法亦可有利地用于制造抗体或其片段。此等片段包括(例如)Fab片段(片段抗原-结合＝Fab)。Fab片段系由藉由相邻恒定区保持在一起之两个链的可变区组成。此等者可藉由自习知抗体例如以木瓜酶进行蛋白酶消化来形成，但在同时藉由基因工程亦可产生类似Fab片段。其它抗体片段包括F(ab′)2片段，其可藉由用胃蛋白酶之蛋白水解来制备。

目标蛋白优选系自培养基中以分泌之多肽的形式回收，或若在无分泌信号情况下表达则其可自宿主细胞溶胞物中回收。有必要以获得目标蛋白的大体上均匀制剂之方式自其它重组蛋白及宿主细胞蛋白纯化目标蛋白。作为第一步，自培养基或溶解物移除细胞及/或微粒细胞碎片。此后例如藉由免疫亲和或离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、Sephadex层析、硅层析或诸如DEAE之阳离子交换树脂层析将目标产物从污染的可溶性蛋白、多肽及核酸中纯化。一般而言，在此项技术中熟知教示熟习此项技术者如何纯化由宿主细胞异源表达之蛋白的方法。

使用基因工程方法，可能产生仅由重链之可变区(VH)及轻链之可变区(VL)组成的缩短抗体片段。将此等者称为Fv片段(可变片段(Fragmentvariable)＝可变部分之片段)。因为此等Fv片段缺乏两个链藉由恒定链之半胱氨酸的共价键结，所以Fv片段经常为稳定的。有利的在于藉由短肽片段(例如，具有10至30个氨基酸，优选15个氨基酸)连接重链之可变区与轻链之可变区。以此方式，获得由藉由肽连接子连接之VH及VL组成的单一肽链。将此类抗体蛋白称为单链-Fv(scFv)。自先前技术已知此类scFv-抗体蛋白之实例。

近年来，已开发各种策略用以制备呈多聚体衍生物之scFv。此尤其意欲产生具有改良之药物动力学及生物分布特性以及具有提高之结合亲和力的重组抗体。为达成scFv之多聚化，将scFv制备为具有多聚化结构域之融合蛋白。多聚化结构域可为(例如)IgG或卷曲螺旋结构(螺线结构)(诸如亮氨酸-拉链域(Leucin-zippeer domain))之CH3区域。然而，亦存在将scFv之VH/VL区域之间的相互作用用于多聚化(例如，双功能抗体(diabodies)、三功能抗体(tribodies)及五功能抗体(pentabodies))之策略。对于熟习此项技术者而言双功能抗体意谓二价均二聚scFv衍生物。将scFv分子中之连接子缩短至5-10个氨基酸使得形成内部产生链间VH/VL迭加之均二聚体。双功能抗体可另外藉由并入二硫桥(disulphide bridge)而稳定。自先前技术已知双功能抗体-抗体蛋白之实例。

对于熟习此项技术者而言微型抗体意谓二价均二聚scFv衍生物。其系由融合蛋白组成，该融合蛋白含有免疫球蛋白，优选IgG，最优选呈二聚化区域形式(其经由铰链区(例如，亦自IgG1)及连接区域来连接至scFv)之IgG1的CH3区域。自先前技术已知微型抗体-抗体蛋白之实例。

对于熟习此项技术者而言三功能抗体意谓：三价均三聚scFv衍生物。VH-VL在无连接子序列之情况下直接融合之scFv衍生物使得形成三聚物。

对于熟习此项技术者而言，″骨架蛋白″意谓藉由基因克隆或藉由共转译过程与另一蛋白或具有另一功能之蛋白之部分偶联的蛋白之任何功能域。

熟习此项技术者亦应熟悉具有二价、三价或四价结构且衍生自scFv之所谓微型抗体。藉由二聚、三聚或四聚卷曲螺旋结构进行多聚化。

据定义，即使所引入序列或基因与宿主细胞中之内源序列或基因一致，仍将任何引入宿主细胞中之序列或基因相对于宿主细胞称作″异源序列″或″异源基因″或″转基因″或″重组基因″。

甚至当目标序列为内源序列，但序列已(人工地/有意地/实验地)被带进细胞中且因此自不同于内源基因座之宿主基因组中之基因座表达时，将序列称作″异源序列″。

甚至当目标序列(例如cDNA)为(人工地/有意地/实验地)再引入(＝重组)之内源序列且此序列之表达系受调节序列之改变/修饰(例如，启动子改变或藉由任何其它手段)之影响时，将序列称作″异源序列″。

″异源″蛋白因此为自异源序列表达之蛋白。

可藉由使用″表达载体″，优选真核生物，且甚至更优选哺乳动物表达载体将异源基因序列引入目标细胞中。用以构建载体之方法为熟习此项技术者所熟知且描述于各种出版物中。详言之，在先前技术中已知用于构建合适载体之技术，包括描述功能组件，诸如启动子、强化子、终止子(termination)及聚腺苷酸化信号、选择标记、复制起点及拼接信号。载体可包括(但不限于)质粒载体、噬菌粒(phagemid)、粘粒、人工/微型染色体(例如ACE)或病毒载体，诸如杆状病毒(baculovirus)、反转录病毒、腺病毒、腺联病毒(adeno-associated virus)、单纯疱疹病毒、反转录病毒、噬菌体。真核生物表达载体通常亦将含有促进载体在细菌中繁殖(诸如复制起始)之原核序列及用于在细菌中选择之抗生素抗性基因。在此项技术中熟知多种含有克隆位点(多核苷酸可有效连接至其中)之真核生物表达载体，且一些可购自诸如Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen，Carlsbad，CA；Promega，Madison，WI或BDBiosciences Clontech，Palo Alto，CA之公司。

在一优选实施例中，表达载体包含至少一种核酸序列，该核酸序列为编码目标肽/多肽/蛋白之核苷酸序列的转录及转译所必需之调节序列。

如本文中所用之术语″表达″系指异源核酸序列在宿主细胞中之转录及/或转译。所需产物/目标蛋白在宿主细胞中之表达程度可取决于存在于细胞中之相应mRNA之量，或藉由如在本发明实例中之所选序列编码的所需多肽/目标蛋白之量。举例而言，自所选序列所转录之mRNA可藉由Northen印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA之原位杂交或藉由PCR来定量。由所选序列编码之蛋白可藉由以下各种方法来定量：例如藉由ELISA、藉由Western印迹法、藉由放射免疫分析、藉由免疫沉淀、藉由检测蛋白之生物活性、藉由将蛋白免疫染色，接着FACS分析或藉由均匀时间解析荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)试验。

在本发明中，术语″表达″同样系用于基因(意谓DNA序列)之情形中，以及DNA序列所转译之蛋白产物之情形中。术语″基因″及″蛋白″因此在表达之情形中可互换使用，例如″目标蛋白之表达″及″目标基因之表达″可互换使用且两个用语系指同一事实问题。在本发明中，此等术语优选系指人类基因及蛋白，但包括来自其它哺乳动物物种(优选为小鼠、仓鼠及大鼠)之同等同源序列，以及来自额外真核物种(包括鸡、鸭、苔藓、蠕虫、蝇及酵母)之同源序列。

如本文中所用之术语″实现″目标蛋白的表达或″实现″目标蛋白的分泌系指正面影响该事件或引起该事件。如本文中所用之此等术语优选系指″增加表达″或″提高分泌″。

可藉由在此项技术中熟知之任何方法对真核宿主细胞进行以多核苷酸或表达载体″转染″，从而产生经基因修饰之细胞或转基因细胞。转染方法包括(但不限于)脂质粒介导转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、聚阳离子(诸如DEAE-葡聚糖)介导转染、原生质体融合、病毒感染及显微注射。转染优选为稳定转染。在特定宿主细胞株及细胞类型中提供异源基因之最佳转染频率及表达的转染方法为有利的。可藉由常规程序确定合适方法。为了稳定转染，将构建体整合至宿主细胞之基因组或人工染色体/微型染色体中或以游离方式(episomally)定位以便稳定地保持在宿主细胞内。

除非另作说明，否则本发明之实践将采用细胞生物学、分子生物学、细胞培养、免疫学及在熟习此项技术者之技术中的类似学科之习知技术。在目前文献中充分揭示此等技术。

本发明系关于在细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包含a)增加至少一种编码SM-蛋白之基因的表达或各别蛋白或其至少一种衍生物、突变体或片段之活性，及b)实现该目标异源蛋白的表达。

本发明具体地系关于在细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包含a)增加至少一种编码来自SEC1/Munc18蛋白群(SM-蛋白)之蛋白的基因之表达，及b)实现该目标异源蛋白的表达。在方法步骤b)中目标蛋白的分泌优选得以提高。本发明因此优选系关于在细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包含a)增加至少一种编码来自SEC1/Munc18蛋白群(SM-蛋白)之蛋白的基因之表达，及b)提高该目标异源蛋白的分泌。

本发明优选系关于在细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包含a)增加至少一种编码选自SEC1/Munc18蛋白群(SM-蛋白)之蛋白的基因之表达，该SEC1/Munc18蛋白群系由以下各物组成：

Sec1p、Sly1p、Vps33p及Vps45p、ROP、Sly1及Vps33/康乃馨、Unc-18、Munc18-1、Munc18-2及Munc18-3、VPS45、VPS33-A、VPS33-B及Sly1，

及b)实现该目标异源蛋白的表达，优选增加该目标异源蛋白的表达或尤其优选其之分泌。

步骤a)中之蛋白优选系选自SEC1/Munc18蛋白群(SM-蛋白)，该群系由以下各物组成：Sec1p、Sly1p、Vps33p、Vps45p、Munc18-1、Munc18-2及Munc18-3、VPS45、VPS33-A及VPS33-B及Sly1。

步骤a)中之蛋白更优选系选自SEC1/Munc18蛋白群(SM-蛋白)，该群系由Munc18-1、Munc18-2、Munc18-3、VPS45、VPS33-A及VPS33-B及Sly1组成。步骤a)中之蛋白最优选系选自SEC1/Munc18蛋白群(SM-蛋白)，该群系由Munc18-3/Munc18c及Sly-1组成。

在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于步骤a)中之一基因编码Munc-18蛋白或Munc-18蛋白家族成员。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于步骤a)中之一基因编码三种Munc18同工型，Munc18a、b或c中之一者，优选Munc18c。

在本发明之另一特定实施例中，方法之特征在于步骤a)中之一基因编码Munc18c(SEQ ID NO：39)。

在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于步骤a)中之一基因编码Sly-1蛋白或Sly-1蛋白家族成员，优选Sly-1。

在本发明之另一特定实施例中，方法之特征在于步骤a)中之一基因编码Sly-1(SEQ ID NO：41)。

在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于步骤a)包含增加至少两种编码SM-蛋白之基因的表达或活性，藉此所述SM蛋白系与小泡转运之两个不同步骤有关。

在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于a)一基因编码调节小泡与细胞膜之融合的SM蛋白，b)第二基因编码调节小泡与高尔基复合体之融合的SM蛋白。

在本发明之一尤其优选实施例中，方法之特征在于Munc18c(SEQ IDNO：39)及Sly-1(SEQ ID NO：41)之表达或活性增加。

在本发明之另一实施例中，方法之特征在于步骤a)包含a)增加编码SM蛋白家族之一成员的第一基因之表达或活性，b)第二基因编码SM蛋白家族之另一成员，及c)第三基因编码XBP-1。

在本发明之一尤其优选实施例中，方法之特征在于Munc18c(SEQ IDNO：39)、Sly-1(SEQ ID NO：41)及XBP-1(SEQ ID NO：43)之表达或活性增加。

本发明另外系关于将细胞工程化之方法，其包含a)将一或多种包含为至少两种多肽编码之核酸序列的载体系统引入细胞中，藉以i)至少一种第一核酸序列编码SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段，及ii)第二核酸序列编码目标蛋白，b)在该细胞中表达该目标蛋白及该至少一种SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段。

在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于将核酸序列依次引入该细胞中。

在本发明之另一特定实施例中，方法之特征在于引入至少一种编码SM蛋白之核酸序列，随后引入编码该目标蛋白的核酸序列。

在本发明之另一实施例中，方法之特征在于引入至少一种编码目标蛋白的核酸序列，随后引入编码该SM蛋白的核酸序列。

在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于将核酸序列同时引入该细胞中。

在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于SM-蛋白为Munc-18同工型中之任一者，优选为Munc-18c(SEQ ID NO：39)或Sly-1(SEQ ID NO：41)。

在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于在步骤a)i)中组合使用两种SM-蛋白，藉以所述SM蛋白系与小泡转运之两个不同步骤有关。

在本发明之另一实施例中，方法之特征在于a)一基因编码调节小泡与细胞膜之融合的SM蛋白，b)第二基因编码调节小泡与高尔基复合体之融合的SM蛋白。

在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于组合使用之两种SM-蛋白为Munc-18c(SEQ ID NO：39)及Sly-1(SEQ ID NO：41)。

在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于在步骤a)i)中，将两种SM-蛋白与XBP-1组合使用。

在本发明之一尤其优选实施例中，方法之特征在于SM蛋白为与XBP-1(SEQ ID NO：43)组合之Munc-18c(SEQ ID NO：39)及Sly-1(SEQ IDNO：41)。

在本发明之另一实施例中，方法之特征在于该细胞为真核细胞，诸如酵母、植物、蠕虫、昆虫、禽类、鱼、爬行动物或哺乳动物细胞。

在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于该细胞为真核细胞，优选为脊椎动物细胞，最优选为哺乳动物细胞。

该脊椎动物细胞优选为禽类细胞，诸如鸡或鸭细胞。

在本发明之另一特定实施例中，方法之特征在于该哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)、猴肾CV1、猴肾COS、人类晶状体上皮PER.C6^TM、人类胚肾HEK293、人类骨髓瘤、人类羊水细胞(humanamniocyte)、婴儿仓鼠肾脏、非洲绿猴肾脏、人类宫颈癌、犬肾、水牛大鼠肝脏、人类肺脏、人类肝脏、小鼠乳腺肿瘤或骨髓瘤细胞、NS0、狗、猪或恒河猴细胞、大鼠、兔、猫、山羊细胞，优选为CHO细胞。

在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于该CHO细胞为野生型CHO、CHO K1、CHO DG44、CHO DUKX-B11、CHO Pro-5或由其衍生之突变体，包括CHO突变体Lec1至Lec35，优选为CHO DG44。

在本发明之另一实施例中，方法之特征在于目标蛋白为治疗用蛋白。

在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于目标蛋白为膜或分泌蛋白，优选为抗体或抗体片段。

在本发明之另一特定实施例中，方法之特征在于抗体为单克隆、多克隆、哺乳动物、鼠类、嵌合、人源化、灵长化、灵长类、人类或其抗体片段或衍生物，诸如抗体、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链及重链、Fab、F(ab′)2、Fc、Fc-Fc融合蛋白、Fv、单链Fv、单结构域Fv、四价单链Fv、二硫键联Fv、结构域缺失、微型抗体、双功能抗体，或以上片段中一者与另一肽或多肽之融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋白。

在本发明之另一实施例中，方法之特征在于该异源SM蛋白存在于包含至少一种SNARE蛋白之小泡融合复合物中。

在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于该异源SM蛋白存在于包含至少一种SNARE蛋白及突触融合蛋白4或突触融合蛋白5之小泡融合复合物中。

在本发明之另一实施例中，方法之特征在于在该细胞中该目标异源蛋白的比生产率为每细胞每天至少5pg，每细胞每天15pg，每细胞每天20pg，每细胞每天25pg。

在本发明之另一实施例中，方法之特征在于该方法引起该目标蛋白在该细胞中与表达该目标蛋白之对照细胞相比提高之比细胞生产率，但藉以该对照细胞并不具有任何SM-蛋白之增加之表达或活性。

在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于生产率之提高为约5％至约10％、约11％至约20％、约21％至约30％、约31％至约40％、约41％至约50％、约51％至约60％、约61％至约70％、约71％至约80％、约81％至约90％、约91％至约100％、约101％至约149％、约150％至约199％、约200％至约299％、约300％至约499％，或约500％至约1000％。

本发明另外系关于一种提高目标膜或分泌蛋白在细胞中之比细胞生产率或滴度的方法，其包含a)将一或多种包含为至少两种多肽编码之核酸序列的载体系统引入细胞中，藉以i)至少一种第一多核苷酸编码SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段，及ii)第二多核苷酸编码目标蛋白，及b)在该细胞中表达该目标蛋白及该SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段。

本发明另外系关于包含编码至少两种多肽之表达单元的表达载体，藉以a)至少一种多肽为SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段，及b)第二多肽为目标蛋白。

在本发明之一特定实施例中，表达载体之特征在于目标蛋白为治疗用蛋白，优选为抗体或抗体片段。

在本发明之一优选实施例中，表达载体之特征在于抗体为单克隆、多克隆、哺乳动物、鼠类、嵌合、人源化、灵长化、灵长类、人类或其抗体片段或衍生物，诸如抗体、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链及重链、Fab、F(ab′)2、Fc、Fc-Fc融合蛋白、Fv、单链Fv、单结构域Fv、四价单链Fv、二硫键联Fv、结构域缺失、微型抗体、双功能抗体，或以上片段中之一者与另一肽或多肽之融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋白。

在本发明之另一实施例中，表达载体之特征在于表达单元为多顺反子，优选为双顺反子。

在本发明之一特定实施例中，表达载体之特征在于载体包含在图8中所述之表达构建体的任一者。

在本发明之一优选实施例中，表达载体之特征在于载体包含至少一个配置如下之双顺反子表达单元：a)编码SM蛋白之基因，b)IRES组件及c)编码SM蛋白之第二基因。参见图8d)。

在本发明之另一优选实施例中，表达载体之特征在于自分离之表达单元(图8a)或自一种双顺反子单元(图8b)编码至少一种目标蛋白(GOI)及一种SM蛋白。在本发明之另一优选实施例中，表达载体之特征在于其包含自分离之表达盒(图8c)编码或以双顺反子而其中两个基因经由一个IRES组件连接(图8d)编码两种SM蛋白的基因。在本发明之另一实施例中，表达载体之特征在于其编码至少两种SM蛋白及一个目标基因(图8e)或自一种多顺反子表达单元编码几种SM蛋白。

在本发明之一个优选实施例中，表达载体之特征在于SM-蛋白为Munc-18同工型Munc a、b、c之一，优选为Munc-18c(SEQ ID NO：39)。

在本发明之另一优选实施例中，表达载体之特征在于SM-蛋白为Sly-1(SEQ ID NO：41)。

在本发明之另一实施例中，表达载体之特征在于组合使用至少两种SM-蛋白。

在本发明之一个特定实施例中，表达载体之特征在于该至少两种SM蛋白涉及小泡转运之两个不同步骤。

在本发明之另一实施例中，表达载体之特征在于a)一种SM蛋白调节小泡与细胞膜之融合，b)第二SM蛋白调节小泡与高尔基复合体之融合。

在本发明之一个优选实施例中，表达载体之特征在于SM蛋白为Munc-18c(SEQ ID NO：39)及Sly-1(SEQ ID NO：41)。

在本发明之另一优选实施例中，表达载体之特征在于至少两种SM-蛋白与XBP-1组合使用，优选Munc-18c(SEQ ID NO：39)及Sly-1(SEQ ID NO：41)与XBP-1(SEQ ID NO：43)组合。

本发明另外系关于表达至少两种异源基因之细胞：a)至少一种编码SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段之基因，及b)编码目标蛋白的基因。

在本发明之一特定实施例中，细胞之特征在于目标蛋白为治疗用蛋白，优选为抗体或抗体片段。

在本发明之一优选实施例中，细胞之特征在于抗体为单克隆、多克隆、哺乳动物、鼠类、嵌合、人源化、灵长化、灵长类、人类或其抗体片段或衍生物，诸如抗体、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链及重链、Fab、F(ab′)2、Fc、Fc-Fc融合蛋白、Fv、单链Fv、单结构域Fv、四价单链Fv、二硫键联Fv、结构域缺失、微型抗体、双功能抗体，或以上片段中之一者与另一肽或多肽之融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋白。

在本发明之一特定实施例中，细胞之特征在于SM蛋白之表达量显著在内源量以上，优选10％。在本发明之另一实施例中，细胞之特征在于该蛋白之表达量系在内源量以上5％，优选在内源量以上10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％、150％、175％、200％、300％、400％、500％、1000％。

在本发明之另一实施例中，细胞包含本发明之表达载体之任一者。

在本发明之一特定实施例中，细胞之特征在于该细胞为真核细胞，优选为脊椎动物细胞，最优选为哺乳动物细胞。尤其优选为啮齿动物细胞。

在本发明之一优选实施例中，细胞之特征在于该真核细胞为禽类细胞。

在本发明之另一特定实施例中，细胞之特征在于该哺乳动物细胞为啮齿动物细胞，优选为仓鼠或鼠类细胞。在本发明之一优选实施例中，细胞之特征在于该哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)、猴肾CV1、猴肾COS、人类晶状体上皮PER.C6^TM、人类骨髓瘤、人类羊水细胞、人类胚肾HEK293、婴儿仓鼠肾脏、非洲绿猴肾脏、人类宫颈癌、犬肾、水牛大鼠肝脏、人类肺脏、人类肝脏、小鼠乳腺肿瘤或骨髓瘤细胞、NS0、狗、猪或恒河猴细胞、大鼠、兔、猫、山羊细胞，优选为CHO细胞。

在本发明之另一优选实施例中，细胞之特征在于该CHO细胞为野生型CHO、CHO K1、CHO DG44、CHO DUKX-B11、CHO Pro-5或由其衍生之突变体，包括CHO突变体Lec1至Lec35，优选为CHO DG44。

在本发明之一尤其优选实施例中，细胞之特征在于该细胞为CHO细胞，优选为CHO DG44细胞。

本发明另外系关于目标蛋白，优选藉由任何本发明之方法产生的抗体。

本发明另外系关于一种药物组合物，其包含适用于阻断或降低一或若干种SM-蛋白之活性或表达(优选为表达)之化合物及可药用载剂。

在本发明之一特定实施例中，药物组合物之特征在于化合物为多核苷酸序列。多核苷酸序列优选为shRNA、RNAi、siRNA或反义-RNA，最优选为shRNA。

在本发明之另一特定实施例中，药物组合物之特征在于SM-蛋白为Munc-18c(SEQ ID NO：39)或Sly-1(SEQ ID NO：41)或两者之组合。

本发明另外系关于一种识别SM-蛋白功能之调节剂的方法，其包含a)提供至少一种SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段，优选为Munc-18c，b)使步骤a)之该SM-蛋白与测试剂接触，c)测定与细胞表面蛋白之增加或减少之蛋白分泌或表达相关的效应。

本发明另外系关于一种治疗癌症、自身免疫病及炎症之方法，其包含向有此需要之患者投与治疗有效量之根据本发明之药物组合物。

本发明亦系关于一种包含应用根据本发明之药物组合物以治疗癌症、自身免疫病及炎症之方法。

本发明亦系关于一种抑制或降低细胞增殖或迁移之方法，其包含使该细胞与根据本发明之药物组合物接触。

本发明之可能治疗应用包括防止诸如自细胞或组织之发炎性介体、生长因子、血管生成因子之蛋白的分泌以在癌症疗法、自身免疫病及炎症中控制细胞-细胞通讯，或为了促进在悬浮液中生长及防止细胞聚集之目的藉由减少锚定跨膜蛋白之细胞表面存在来减少细胞附接。

本发明另外系关于SM-蛋白或编码SM-蛋白之多核苷酸在活体外细胞或组织培养系统中增加目标蛋白的分泌及/或产量之用途。SM蛋白优选为Munc18蛋白，诸如Munc18c(SEQ ID NO：39)。亦优选的为Sly-1蛋白，诸如Sly-1(SEQ ID NO：41)。

本发明另外系关于本发明之任何方法、表达载体、细胞或药物组合物的诊断用途。

本发明另外系关于一种提高细胞之蛋白分泌/将细胞工程化/在细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包含：

a)将人类Sec1/Munc18及Sly1/SCFD1克隆至表达载体(例如，哺乳动物BI-HEX

表达平台)中，藉以所述蛋白可藉由一种或不同双顺反子/多顺反子表达单元来编码且藉以可在同一或不同质粒上含有所述蛋白，

b)以单独或组合方式，同时或依次将所述构建体转染至真核生物宿主细胞中，所述真核生物宿主细胞优选为哺乳动物细胞，诸如CHO、BHK、NS0、HEK293、PerC.6，

c)任选地：核对转基因表达，

d)引入编码目标基因(GOI)之构建体，优选为分泌蛋白或跨膜蛋白，

e)例例如藉由ELISA、Western印迹法或流式细胞仪进行GOI之表达分析。

或者，步骤(b+c)及(d+e)之顺序可变化，藉此首先引入GOI，或步骤(b)及(d)可同时进行。

参考仅出于说明本发明之某些实施例之目的而包括于本文中之以下实施例，将较易于理解上文一般描述之本发明。以下实施例并非限制性的。其仅展示本发明之可能实施例。熟习此项技术者可易于调节条件以将其应用于其它实施例。

实验

材料及方法

质粒设计。

人sly1从HEK-293总RNA经RT-PCR扩增，使用寡核苷酸ORP70(5′-CGCGGATCCACCATGGCGGCGG CGGCGGCAGCG-3′，SEQ ID NO 1)及ORP71(5′-CCGCTCG AGTTACTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG-3′，SEQID NO 2)，将克隆的BamHI/XhoI引入pcDNA3.1(Invitrogen)中，得到pRP24(P_hCMV-sly1-pA_SV40)。同样地，将munc18c克隆(ORP69，5′-CGCGGATCCACCATGGCGCCGCCGGTGGCAG AGAGG-3′，SEQ ID NO 3；ORP66，5′-CCCTCGAGCTATTCA TCTTTAATTAAGGAGAC-3′，SEQ ID NO 4)，得到pRP17(P_hCMV-munc18c-pA_SV40)。pRP32(P_hCMV-EYFP-sly1-pA_SV40)通过插入sly1来构建，所述sly1，使用ORP29(5′-CTCAGATCTGCGGCGGCGGCGGCAGCG-3′，SEQ ID NO 5)及ORP30(5′-ACCGTCGACCTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG-3′，SEQ ID NO 6)从pRP24经PCR扩增获得，再经BglII/SalI引入pEYFP-C1(Clontech)。pRP23(P_hCMV-EYFP-munc18c-pA_SV40)的设计是：从pRP17切取munc18c BamHI/XhoI，将其经BglII/SalI处理克隆至pEYFP-C1中。pRP3通过插入syl1来产生，所述syl1用ORP9(5′-CGCGCGGCCGCACCATGGCGGCGGCGGCGGCAGC G-3′，SEQ ID NO7)及ORP10(5′-CCGGGATCCTTACTTTTGTCCAAGTTGT GACAACTG-3′，SEQ ID NO 8)经PCR扩增获得，经NotI/BamHI引入pRP1中，该pRP1来自pIRESneo(Clontech)，是将新霉素抗性基因替换为SmaI/XbaI GFP而衍生的，所述GFP用ORP5(5′-CCCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCG AGG-3′，SEQ IDNO 9)及ORP6(5′-TTTCTAGATTACTTGTACAGCTCG TCC-3′，SEQ ID NO10)自pLEGFP-N1(Clontech)经PCR扩增制得。同样地，pRP4通过插入munc18c来构建，所述munc18c用ORP15，5′-CGCGCGGCCGCACCATGGCGCCGCCGGTGGCAGAGAGG-3′，SEQ ID NO 11；ORP16，5′-CCGGATCCCTATTCATCTTTAATTAAGGAGAC-3′，SEQ ID NO 12)从pRP 17经PCR扩增获得，并经NotI/BamHI引入pRP1中。pRP29(P_hCMV-ECFP-突触融合蛋白4-pA_SV40)的构建是，用PCR扩增突触融合蛋白4(ORP127，5′-CCCAAGCTTTGCGCGACAGGACCCACGAG-3′，SEQ ID NO 13；ORP128，5′-CGCGTCGACTTATCCAACGGTTATGG TGATGCC-3′，SEQ ID NO 14)，接着将HindIII/SalI克隆至pECFP-C1(Clontech)中。同样地，将突触融合蛋白5克隆(ORP136，5′-GGAAGATCTATCCCGCGGAAACGCTAC-3′，SEQ ID NO 15；ORP137，5′-CCCAAGCTTTCAAGCAAGGAAGACCAC-3′，SEQ ID NO 16)，得到pRP40(P_hCMV-ECFP-突触融合蛋白5-pA_SV40)。带sly1-或munc18c-特异性shRNA的表达载体通过将双链DNA片段经BbsI/XbaI插入pmU6中来克隆：(i)sly1(shRNA_{sly1_1}；pRP5，5′-TTTGGAAGTAAACT GGAAGATATTTTCAAGAGAAATATCTTCCAGTTTACTTCTTTTT-3′，SEQ ID NO 23，及5′-CTAGAAAAAGAAGTAAACTGGAAGATATTTCTCTTGAAAATATCTTCCAGTTTACTTC-3′；SEQ ID NO 24，shRNA_{sly1_2}；pRP6，5′-TTTGGCAGTGAAACTAGACAAGAAATTCAAGAGATTTCTTGTCTAGTTTCACTGCTTTTT-3′，SEQ ID NO 25及5′-CTAGAAAAAGCA GTGAAACTAGACAAGAAATCTCTTGAATTTCTTGTCTAGTTTCACTGC-3′；SEQ ID NO 26 shRNA_{sly1_3}；pRP7，5′-TTTGGGAGGCAACTACATTGAATATTTCAAGAGAATATTCAATGTAGTTGCCTCCTTTTT-3′，SEQ ID NO 27，及5′-CTAGAAAAAGGAGGCAACTACATTGAATATTCTCTTGAAATATTCAATGTAGTTGCCTCC-3′，SEQ ID NO 28)；(ii)munc18c(shRNA_{munc18c_1}；pRP12，5′-TTTGCACATGAATCTC AGGTGTATATTCAAGAGATATACACCTGAGATTCATGTGTTTTT-3′，SEQ ID NO 29，及5′-CTAGAAAAACACATGA ATCTCAGGTGTATATCTCTTGAATATACACCTGAGATTCATGTG-3′，SEQ ID NO 30；shRNA_{munc18c_2}；pRP14，5′-TTTGGCTTGAAGACTACTACAAGATTTCAAGAGAATCTTGTAGTAGTCTTCAAGCTTTTT-3′，SEQ ID NO 31，及5′-CTAGAAAAAGCTTGAAGACTACTACAAGATTCTCTTGAAATCTTGTAGTAGTCTTCAAGC-3′，SEQ ID NO 32；shRNA_{munc18c_3}；pRP38，5′-TTTGCGCCAGAAAC CCAGAGCTAATTTCAAGAGAATTAGCTCTGGGTTTCTGGCGTTTTT-3′，SEQ ID NO33，及5′-CTAGAAAAACGCCAGAAA CCCAGAGCTAATTCTCTTGAAATTAGCTCTGGGTTTCTGG CG-3′，SEQ ID NO 34；shRNA_{munc18c_4}；pRP39，5′-TTTGGCTGAATAAACCCAAGGATAATTCAAGAGATTATCCTTGGGTTTATTCAGCTTTTT-3′，SEQ ID NO 35，及5′-CTAGAA AAAGCTGAATAAACCCAAGGATAATCTCTTGAATTATCCTTGGGTTTATTCAGC-3′，SEQ IDNO 360；(iii)对照shRNA(pRP9，5′-TTTGCACAAGCTGGAGTACAACTACTTCAAGA GAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGTTTTT-3′，SEQ ID NO37，及5′-CTAGAAAAACACAAGCTGGAGTACAACTACTCTCTTGAAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTG-3′，SEQ ID NO 38)。

编码人类胎盘碱性磷酸酶(SEAP)的pSEAP2对照购自Clontech，携嗜热脂肪芽孢杆菌衍生的分泌型α-淀粉酶(SAMY)的pSS158已被在先文献⁴⁹描述。含有人类血管内皮生长因子121(VGEF121)的pWW276以及分别编码人类IgG1利妥昔单抗之重链及轻链的pWW943及pWW946由Wilfried Weber友情提供。xbp-1表达载体pcDNA3.1-Xbp-1(PhCMV-xbp-1-pASV40)之前已描述(Tigges及Fussenegger，2006)。

细胞培养及转染

a)贴壁细胞之培养：

在37℃下在含有5％CO₂之湿润气氛中，在补充有5％FCS(PAN Biotech，Aidenbach，Germany；目录号3302，批号P231902)之ChoMaster HTS培养基(Cell Culture Technology，Gravesano，Switzerland)或Dulbecco改质之Eagle培养基(DMEM；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中培养中国仓鼠卵巢(CHO-K1；ATCC CCL-61)及人类胚肾细胞(HEK-293；ATCC CRL-1573)。为了瞬间转染，将1×10⁵个细胞接种于12孔组织培养板之一个孔中，24h后，用改良的基于磷酸钙的方案⁴⁷或FuGENE6转染试剂(Roche，Basel，Switzerland)进行转染。使用表达及选择载体以及抗生素之以下组合来产生为组成型转基因表达而工程化之单转基因稳定CHO-K1衍生物：(i)CHO-Sly1₁₆及CHO-Sly1₂₃；pRP24；400μg/ml G418(Merck)；(ii)CHO-Munc18c₈及CHO-Munc18c₉、pRP17；400μg/ml G418。双转基因细胞株CHO-Sly1-Munc18c₁及CHO-Sly1-Xbp1₄系藉由将pRP17与pPUR(Clontech)、pcDNA3.1-Xbp-1³⁵与pPUR分别共转染至CHO-Sly1₂₃中，接着以G418及嘌呤霉素(4μg/ml)进行克隆选择来构建。藉由将pcDNA3.1-Xbp-1与pZeoSV2(Invitrogen)共转染至CHO-Sly1-Munc18c₁中，接着以G418(400μg/ml)、嘌呤霉素(4μg/ml)及零霉素(zeocin)(150μg/ml)进行选择来产生使能够组成型表达sly1、munc18c及xbp-1之三转基因细胞株CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇。

b)悬浮液培养物

将产生单克隆抗体(mAB)的CHO-DG44细胞的悬浮液培养物(Urlaub等人，1986)及其稳定转染物培育于BI专属(BI-proprietary)化学确定的(chemically defined)无血清培养基中。每2-3天转种(sub-cultivated)晶种储备培养物，接种密度分别为3×10⁵-2×10⁵个细胞/毫升。使细胞生长于T-烧瓶或摇瓶(Nunc)中。在5％CO₂、37℃及120rpm下，在湿润培育箱(Thermo)中培育T-烧瓶且在Multitron HT培育箱(Infors)中培育摇瓶。

使用血球计通过台盼蓝排除法(trypan blue exclusion)，来测定细胞浓度及活力。

补料分批培养

将细胞以3×10⁵个细胞/毫升接种于1000ml摇瓶中，于250ml无抗生素或MTX(Sigma-Aldrich，Germany)之BI-专属生产型培养基中。将培养物在120rpm、37℃、5％CO₂中搅拌，稍后，当细胞数目增加时将CO₂降至2％。每日测定培养参数，包括pH值、葡萄糖及乳酸盐浓度，根据需要用NaCO₃将pH值调节至pH 7.0。每24hr添加BI-专属补料溶液。用自动化CEDEX细胞定量系统(Innovatis)通过台盼蓝排除法来测定细胞密度及活力。收集来自细胞培养液之试样，通过ELISA测量滴度。

为进行ELISA，使用抗人类-Fc片段之抗体(Jackson Immuno ResearchLaboratories)及偶联HRP的人类κ轻链(Sigma)。

将累积的比生产率(cumulative specific productivity)计算为指定日的产物浓度除以直至该时间点的″活细胞总数″(integral of viable cells，IVC)。

RNA分离、RT-PCR及定量实时PCR

用NucleoSpin RNA II试剂盒(Macherey-Nagel，Oensingen，Switzerland)，从哺乳动物细胞制备总RNA，用TITANIUM^TM One-Step RT-PCR试剂盒(Clontech)根据制造商方案进行RT-PCR。seap、samy及vegf₁₂₁ mRNA之相对定量系以Applied Biosystems 7500实时PCR装置，使用25μl含有Power SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems，Warrington，UK)、100ng cDNA、900nM正向及反向引物(特异于seap(5′-AGGCCCGGGACAGGAA-3′，SEQID NO 17；5′-GCCGTCCTTGAGCACATAGC-3′，SEQ ID NO 18)、特异于samy(5′-AAAGCTCAATATCTTCAAGCCATTC-3′，SEQ ID NO 19；5′-AACACGACATCGGCGTACACT-3′，SEQ ID NO 20)及特异于vegf₁₂₁(5′-CTTGCTGCTCTACCTCCACCAT-3′，SEQ ID NO 21；5′-TGATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3′，SEQ ID NO 22))之反应液来进行。使用核糖体18s-RNA特异性转录物试验(Applied Biosystems)将所有试样均标准化且对所有扩增子(amplicons)均进行解链曲线分析，以证实不存在非特异性扩增。

共焦显微法

在48h之后将接种且转染于涂布聚赖氨酸之玻璃载片上的HEK-293以磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，以低聚甲醛(paraformaldehyde，3％w/v)固定，以PBS再次洗涤，且藉由共焦显微法分析。以Leica TCS SP1(Leica，Heerbrugg，Switzerland)记录影像且藉由Adobe Photoshop 10加以分析。

抗体、免疫沉淀及Western印迹法

将哺乳动物细胞在冰上溶胞缓冲液(50mM Tris-HCL，pH 7.5、150mMNaCl、1mM DTT、1mM EDTA、1％Triton X-100)中裂解。4℃、14,000×g离心10min，接着4℃与蛋白A-Sepharose珠粒(Amersham Biosicences，Uppsla，Sweden)一起培育30min，一次获得总蛋白溶胞物。4℃旋转过夜，使2mg总蛋白与亲和纯化的Munc18c抗体(与蛋白A-Sepharose偶联)混合于最终体积为500μl的溶胞缓冲液中，进行免疫沉淀。接着将珠粒用500μl溶胞缓冲液洗涤四次，洗脱蛋白，用SDS-PAGE分离，接着进行Western印迹分析。特异于Sly1的抗体由Jesse Hay(University of Montana，Missoula，MO，USA)友情提供。特异于Munc18a、突触融合蛋白4及Vamp2的抗体购自SynapticSystems(Goettingen，Germany)，抗Munc18b、Munc18c及p27^Kip1的抗体来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)。使用ECL-Plus侦测试剂及偶联HRP的第二抗体(Amersham，Piscataway，NJ，USA)来观测经印迹之蛋白。

蛋白生产

蛋白生产在培养48h之后用标准试验来评估：SEAP，基于对硝基苯磷酸盐之光吸收时间过程；SAMY，蓝淀粉Phadebas

试验(Pharmacia Upjohn，Peapack，NJ，目录号10-5380-32)；VEGF₁₂₁，人VEGF₁₂₁特异性ELISA(R&DSystem，Minneapolis，MN，目录号DY293)；利妥昔单抗，ELISA(Sigma，目录号I2136及A0170)。

如下测定生长于悬浮液培养物中之细胞的抗体滴度及比生产率：

以双顺反子载体转染产抗体的CHO-DG44，分析异源蛋白表达对mAb生产率之影响。为评定种子储用培养物之生产率，自三个连续继代收集来自细胞培养物上清之试样。接着藉由酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析产物浓度。为进行ELISA，使用抗人类-Fc片段抗体(Jackson Immuno ResearchLaboratories)及偶联HRP的人类κ轻链(Sigma)。连同细胞密度及活力一起，如下计算比生产率，：

$\mathrm{qp}=\frac{\frac{({\mathrm{mAb}}_{P+1}+{\mathrm{mAb}}_P)}{2}}{(t_{P+1}-t_P)*\left(\frac{{\mathrm{cc}}_{P+1}+{\mathrm{cc}}_p}{2}\right)}$

qp＝比生产率(pg/细胞/天)

mAb＝抗体浓度(mg/L)

t＝时点(天)

cc＝细胞计数(×10⁶细胞/毫升)

P＝代

利妥昔单抗之N-连接糖基化概况

利妥昔单抗用蛋白A-Sepharose纯化，以10mM甘氨酸缓冲液(pH 2.8)洗脱，接着以2M Tris(pH 9.0)中和。藉由SDS-PAGE证实纯度/完整性。接着在37℃以2mM Tris(pH7)中之0.05mU/mg蛋白进行N-糖苷酶消化(PNGaseF，EC 3.5.1.52，QA-Bio，San Mateo，CA)历时3h，从而使寡糖自抗体中酶促释放。在150mM乙酸中培育所释放之寡糖，随后以DHB作为基质(Papac等人，1998)，使用Autoflex MALDI/TOF(Bruker Daltonics，Faellanden，Switzerland)，以阳离子模式操作来进行MALDI分析。

HRP转运试验

以编码分泌型辣根过氧化物酶(ssHRP)的构建体与空载体、表达Munc18c、Sly1的构建体或编码Munc18c及Sly1两者的双顺反子表达单元中之任一者来共转染人类HT1080纤维肉瘤细胞。在转染后24h及48h后，自细胞培养液取样，将澄清细胞的上清与TMB试剂(BD Biosciences，Pharmingen)一起培育，侦测报道蛋白ssHRP之分泌。3min后，停止反应，以ELISA读取器(Spectra Rainbow Thermo)在450nm测量光吸收度，以确定ssHRP滴度。为进一步分析比生产率，在最后一次测量之后将细胞用胰蛋白酶消化，用CASY

细胞计数器(Schaerfe System)计数，将ssHRP滴度除以细胞总数来计算比生产率。

实施例

实施例1：将Sly1及Munc18c沿分泌途径在HEK-293中定位。

我们使用基于RT-PCR之分析以描绘SM蛋白Sly1及Munc18之同工型(a、b、c)在HEK-293中之表达。如在图1a及1b中所示，sly1(NM_016160)及munc18c(NM_007269)表达水平较高，muc18b(NM_006949)痕量表达，未能侦测到神经元特异性munc18a(NM_003165)之转录物。藉由Western印迹法(图1c)来证实SM蛋白概况。藉由在HEK-293中共表达YFP-Sly1(pRP32)与CFP-突触融合蛋白5(pRP40)或YFP-Munc18c(pRP23)与CFP-突触融合蛋白4(pRP29)来分析Sly1及Munc18主要同工型Munc18c之细胞内定位。突触融合蛋白5为定位于高尔基体之结合Sly1的SNARE，突触融合蛋白4为与细胞膜结合之与Munc18c相互作用的SNARE。共焦显微法展示，Sly1显示与突触融合蛋白5在高尔基体处极致密之核周共定位，Munc18c与突触融合蛋白4之细胞膜共染色(co-stain)(图1d)。此等结果证明Sly1及Munc18c在HEK-293中表达且定位于高尔基体与细胞膜，此系与其在各个细胞器处之两个独特融合步骤中之作用一致(Jahn等人，2003)。

实施例2：Sly1及Munc18对蛋白分泌进行调节。

已知SM蛋白控制对细胞内蛋白转运必需之小泡融合，但其对于蛋白分泌之作用仍未知。为表征Sly1及Munc18对总体胞吐作用之影响，我们设计了这些SM蛋白的特异性shRNA。Sly1及Munc18c的敲低用以下方法证明：细胞用双顺反子性质的编码Sly1(pRP3；P_hCMV-sly1-IRES-eGFP-pA)及编码Munc18c(pRP4；P_hCMV-munc 18c-IRES-eGFP-pA)的报道构建体与特异性以及非特异性对照物shRNA共转染，进行荧光显微镜检(图2)。在HEK-293中证实，各个shRNA将内源Sly1及Munc18c表达最多敲低70％之能力(图3a及3c)。为分析Sly1及Munc18c敲低对哺乳动物细胞之总体蛋白分泌能力的影响，我们将pSEAP2对照物及pRP5(shRNA_{sly1_1})、pRP6(shRNA_{sly1_2})、pRP7(shRNA_{sly1_3})或pRP12(shRNA_{munc18c_1})、pRP14(shRNA_{munc18c_2})、pRP38(shRNA_{munc18c_3})、pRP39(shRNA_{munc18c_4})共转染至HEK-293中，确定培养上清中的SEAP水平。Sly1及Munc18c的敲低与SEAP产量减少直接相关，表明此等SM蛋白在哺乳动物分泌途径中起重要作用(图3b及3d)。

实施例3：Sly1及Munc18c之异位表达提高哺乳动物细胞之分泌能力。

在Sly1或Munc18c于CHO-K1中异位表达(图4a 4b、4c)之后，SEAP、SAMY或VEGF₁₂₁之异源生产提高至多5倍，这与用以启动产物基因转录的启动子(P_SV40、P_hCMV、P_EF1α)无关。当使用HEK-293细胞时，亦观察到类似结果(数据未展示)。因为SEAP、SAMY及VEGF之mRNA水平在有或无升高之Sly1、Munc18c或两者之情况下都基本恒定(图4d)，所以异源蛋白产量之提高系由转译后机制介导。我们的结果与主张Munc18蛋白在一系列细胞类型(包括脂肪细胞及肌细胞)中对胞吐有抑制作用的先前研究(Riento等人，2000；Kanda等人，2005；Tellam等人，1997；Thurmond等人，1998)形成鲜明对比，，这是首次提供Munc18c及Sly1均促进总体胞吐作用的证据。

实施例4：SM蛋白及Xbp-1对分泌途径之协同效应。

因为Sly1及Munc18以及Xbp-1(最近被鉴定为通过增大分泌细胞器之尺寸来增强蛋白分泌(Tigges及Fussenegger，2006))在分泌途径中具有不同目标，所以其可能能够协同地提高蛋白产量。因此我们将编码Sly1、Munc18c及Xbp-1的表达载体以及含SEAP、SAMY及VEGF₁₂₁的表达载体的不同组合共转染至CHO-K1中，确定培养上清中的报道蛋白水平。如图4a中所示，sly1与munc18c同时过度表达引起SEAP产量提高8倍，相比之下，单独之sly1或munc18c仅导致提高5倍。SAMY及VEGF₁₂₁之分泌亦增多(图4b、4c)。sly1、munc18c及xbp-1全都过度表达将SEAP、SAMY及VEGF之分泌分别增多10倍、12倍及8倍(图4a、4b、4c)，明显地说明在Sly1与Munc18c之间及在两种SM蛋白与通用细胞器扩张因子Xbp-1之间存在对分泌的协同效应。

实施例5：SM蛋白藉由刺激SNARE介导之转运机制来提高分泌能力。

先前研究指定Munc18c在胞吐中起抑制作用，其与在本文中报道之结果形成对比(Riento等人，2000；Kanda等人，2005；Tellam等人，1997；Thurmond等人，1998)。为从分子水平研究Munc18c在转运机制中之作用，尤其是其与由突触融合蛋白4、SNAP-23及VAMP2组成之胞吐SNARE蛋白之相互作用，我们进行免疫沉淀实验。如图5中所示，Munc18c-特异性抗体定量沉淀Munc18c以及显著量的突触融合蛋白4、SNAP-23及VAMP 2，表明Munc18c与这些SNARE在体内相关(association)，其在分泌途径中促进小泡-细胞器融合(Peng and Gallwitz，2002；Shen等人，2007；Scott等人，2004)。此发现强调，类似于与完全组装之SNARE复合物结合且促进融合高尔基体之Sly1，Munc18c亦与SNARE复合物直接相互作用，提示抑制通过促进SNARE介导之转运机制而起作用的保守机制。

实施例6：对哺乳动物细胞进行基于SM蛋白的工程化以提高哺乳动物细胞中的分泌能力。

Sly1及Munc18c表达对哺乳动物细胞分泌能力之正面效应提出一种对哺乳动物生产细胞株进行工程化以提高分泌的新颖转译后方法。因此我们制得稳定的CHO-K1衍生细胞株，它们经工程化后能组成型表达sly1(CHO-Sly1₁₆及CHO-Sly1₂₃)或munc18c(CHO-Munc18c₈及CHO-Munc18c₉)。CHO-Sly1₁₆及CHO-Sly1₂₃刺激4倍和8倍的SEAP分泌(图6a)及4倍和5倍的SAMY生产(图6b)。有趣的是，产生较多SEAP之CHO-Sly1₂₃亦展示较高的Sly1水平，表明SM与产物蛋白正相关(图6c)。类似地，因转基因而为组成型表达munc18c的细胞(CHO-Munc18c₉)的SEAP产量多9倍，SAMY产量多6.5倍(图6e及6f)，产生更多SEAP的CHO-Munc18₉亦展示较高的Munc18c水平(图6d)。与亲本CHO-K1相比，组成型表达Sly1及Munc18c的双转基因稳定细胞株CHO-Sly1-Munc18c₁的SEAP产量高出13倍，组成型表达Sly1、Munc18c及Xbp-1的三转基因稳定细胞株CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇的SEAP产量高出16倍(图6g)。

实施例7：基于SM蛋白的分泌工程化提高生产细胞株对抗体的比生产率。

为在原型生物药生产方案中验证基于SM蛋白之分泌工程化，我们使称为利妥昔单抗之单克隆抗人类CD20 IgG1在CHO-Sly1₁₆及CHO-Sly1₂₃中表达(增加至多10倍)、在CHO-Sly1-Munc18c₁中表达(增加至多15倍)及在CHO-Sly1-Xbp-1₄中表达(增加至多13倍)及在CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇中表达(增加至多19倍)(图7a)。当在CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇中产生利妥昔单抗时，可达到至多40pg/细胞/天之特别制造水平，其比同基因对照细胞株增加近20倍(图7a)。SDS-PAGE分析表明，由CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇及野生型CHO-K1细胞产生的抗体结构完整且彼此无法区别(图7b、7c)。对CHO-Sly1-Munc18c-Xbp-1₇中产生的利妥昔单抗的N-连接Fc寡糖进行基于Maldi-TOF的糖基化概况分析，结果发现与天然生产细胞株相比无差异，表明基于SM/Xbp-1之分泌工程化并不损害产物质量(图7d及7e)。

实施例8：基于SM蛋白的分泌工程化提高生产过程中的抗体总产量。

a)为测试SM蛋白之异源表达是否亦可用以在工业制造之相关条件下提高治疗用蛋白的分泌，以空载体(MOCK对照物)或编码Sly1(SEQ ID NO.41)或Munc-18(SEQ ID NO.39)或两者之表达构建体作为双顺反子表达单元来稳定转染分泌人源化抗CD44v6 IgG抗体BIWA 4的产抗体CHO细胞株(CHODG44)。接着使细胞经受选择以获得稳定细胞池(cell pool)。在六次后续传代期间，自所有稳定细胞池之种子储用培养物取上清，藉由ELISA测定MCP-1滴度，将其除以细胞平均数来计算比生产率。在所有表达任一SM蛋白之细胞中，与MOCK或未经转染之细胞相比，IgG表达均显著提高，最高值见于同时表达两种SM蛋白之细胞池中。

对稳定转染物进行分批发酵或补料分批发酵可获得类似结果。每日测量细胞总数及细胞活力，且在第3天、第5天、第7天、第9天及第11天，自细胞培养液取样以测定IgG滴度及比生产率(图10A、10B)。在此等条件下，与MOCK对照物及未经转染之亲本细胞株相比，SM蛋白转基因细胞展示类似生长特性。然而与MOCK对照物相比，在表达Sly1或Munc-18或同时表达两种SM蛋白之细胞中IgG比生产率显著提高(高至多50％)(图10A)，造成在制造过程中单克隆抗体滴度明显增加(图10B)。

这些数据一起证明，基于SM蛋白之细胞工程化方法可用于以多种培养形式(包括系列培养、生物反应器分批培养及补料分批培养)提高治疗用蛋白的产量。

b)首先以编码Sly1(SEQ ID NO.41)或Munc-18(SEQ ID NO.39)或两种蛋白一起之载体转染CHO宿主细胞(CHO DG44)。使细胞经受选择压力，挑选异源表达SM蛋白的细胞株。随后，此等细胞株及CHO DG 44野生型细胞平行地以编码人类单克隆IgG型抗体作为目标基因的表达构建体转染。在第二轮选择之后，自所有历经六次后续传代的稳定细胞池之种子储用培养物取上清，藉由ELISA测定IgG滴度，将其除以细胞平均数来计算比生产率。

最高值见于同时携两种SM蛋白之细胞池，其次是表达单独之Sly1或Munc-18者，其仍产生与不表达任一SM蛋白之CHO DG-44细胞相比显著更高之抗体滴度。对稳定转染物进行分批发酵或补料分批发酵可获得类似结果。在上述每一种情况中，两种SM蛋白都过度表达引起抗体滴度及比生产率均显著提高。此表明，单独之Sly1或Munc-18之异源表达足以增强治疗用抗体的分泌。另外，两种蛋白之异源表达以组合形式联合地以协同方式在瞬间以及在稳定转染的细胞株中增强总体胞吐作用。

实施例9：SM蛋白之过度表达提高成纤维细胞活化蛋白α(FibroblastActivation Protein alpha，FAP)之生物药蛋白产量。

(a)表达跨膜明胶酶成纤维细胞活化蛋白α(FAP)之人类纤维肉瘤细胞株(HT1080，ATCC CCL-121)以空载体(MOCK对照物)、或以编码Sly1(SEQ IDNO.41)或Munc-18(SEQ ID NO.39)或编码两种蛋白作为双顺反子表达单元的表达构建体来转染。接着使细胞经受选择以获得稳定细胞池。自此等池之种子储用培养物收集细胞，将其固定以便藉由FACS测定FAP表面表达，或制备细胞溶胞物以便使用抗FAP抗体进行Western印迹法。与MOCK细胞相比，细胞表面FAP量在所有表达SM蛋白之细胞中均显著增大，且在表达Sly1及Munc-18两者之细胞中表达为最高。此等结果表明，两种SM蛋白协同地增强细胞产生及转运细胞表面跨膜蛋白的能力。

b)首先以编码Sly1(SEQ ID NO.41)或Munc-18(SEQ ID NO.39)或两种蛋白一起之载体转染人类HT1080或HEK293细胞。使细胞经受选择压力，挑选异源表达SM蛋白的细胞株。随后，此等细胞株及HT1080或HEK293野生型细胞平行地以编码FAPα作为目标基因的载体转染。在第二轮选择之后，自所有稳定细胞池之培养物取细胞，藉由FACS或Western印迹法来测定FAP表达量。最高值见于携两种SM蛋白之细胞池，其次是表达单独之Sly1或Munc-18者，其仍表达与不表达任一SM蛋白之亲本细胞相比显著更高之FAP水平。使稳定转染物适应于在悬浮液中生长且经受分批发酵或补料分批发酵，则可获得类似结果。在所述每一种情况中，两种SM蛋白一起过度表达引起FAP表达显著增多。此表明Sly1及Munc-18之异源表达引起跨膜蛋白之产量及细胞表面定位的改进，在异源引入组合之两种蛋白后，效果为最佳。

实施例10：SM蛋白之过度表达增佳跨膜蛋白表皮生长因子受体(EGFR)之生物药蛋白产量。

(a)表达跨膜蛋白表皮生长因子受体(EGFR)之CHO细胞株(例如CHO-DG44)以空载体(MOCK对照物)或编码Sly1(SEQ ID NO.41)或Munc-18(SEQ ID NO.39)或两种蛋白作为双顺反子表达单元之表达构建体来转染。接着使细胞经受选择以获得稳定细胞池。在四次后续传代期间，自此等池之种子储用培养物取细胞，藉由FACS或Western印迹法测定EGFR表达量。与MOCK细胞相比，细胞表面EGFR量在所有表达SM蛋白之细胞中均显著增大，在表达Sly1及Munc-18两者之细胞中为最高。使稳定转染物经受分批发酵或补料分批发酵，可获得极类似结果。在所述每一种情况中，Sly1或Munc-18之过度表达引起EGFR表达与对照物相比中等增加，而一旦Sly1与Munc-18同时过度表达后EGFR水平即显著提高，表明两种SM蛋白协同地增强细胞在多种培养形式(包括系列培养、生物反应器分批培养及补料分批培养)中产生及转运细胞表面跨膜蛋白的能力。

b)首先以编码Sly1(SEQ ID NO.41)或Munc-18(SEQ ID NO.39)或两种蛋白一起之载体转染CHO宿主细胞(CHO DG44)。使细胞经受选择压力，挑选异源表达SM蛋白的细胞株。随后，此等细胞株及CHO DG 44野生型细胞平行地以编码EGFR作为目标基因的载体转染。在第二轮选择之后，从六次连续传代的所有稳定细胞池之种子储用培养物取细胞，藉由FACS或Western印迹法来测定EGFR表达量。最高值见于携两种SM蛋白之细胞池，其次是表达单独之Sly1或Munc-18者，其仍表达与不表达任一SM蛋白之CHO DG-44细胞相比显著更高之EGFR水平。对稳定转染物进行分批发酵或补料分批发酵可获得类似结果。在所述每一种情况中，两种SM蛋白一起之过度表达引起EGFR表达显著增加。此表明Sly1及Munc-18之异源表达使跨膜蛋白之产量及细胞表面定位都改进，一旦异源引入组合之两种蛋白后，效果最好。

实施例11：SM蛋白之过度表达增加单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)之生物药蛋白产量。

(a)分泌单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)之CHO细胞株(CHO DG44)以空载体(MOCK对照物)或编码Sly1(SEQ ID NO.41)或Munc-18(SEQ ID NO.39)或两种蛋白作为双顺反子表达单元之表达构建体来转染。接着使细胞经受选择以获得稳定细胞池。在六次后续传代期间，自所有稳定细胞池之种子储用培养物取上清，藉由ELISA测定MCP-1滴度，将其除以细胞平均数来计算比生产率。在所有表达任一SM蛋白之细胞中，与MOCK或未经转染之细胞相比，IgG表达均显著增加，最高值见于同时表达两种SM蛋白之细胞池中。对稳定转染物进行分批发酵或补料分批发酵可获得类似结果。在所述每一种情况中，两种SM蛋白之过度表达引起MCP-1分泌增强，表明两种SM蛋白协同改进细胞在多种培养形式(包括系列培养、生物反应器分批培养及补料分批培养)中产生蛋白的能力。

b)首先以编码Sly1(SEQ ID NO.41)或Munc-18(SEQ ID NO.39)或两种蛋白一起之载体转染CHO宿主细胞(CHO DG44)。使细胞经受选择压力，挑选异源表达SM蛋白的细胞株。随后，此等细胞株及CHO DG 44野生型细胞平行地以编码单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)作为目标基因的载体转染。在第二轮选择之后，自所有历经六次后续传代的稳定细胞池之种子储用培养物取上清，藉由ELISA测定MCP-1滴度，将其除以细胞平均数来计算比生产率。

最高值见于携两种SM蛋白之细胞池，其次是表达单独之Sly1或Munc-18者，其仍产生与不表达任一SM蛋白之CHO DG-44细胞相比显著更高之MCP-1滴度。对稳定转染物进行分批发酵或补料分批发酵可获得类似结果。在所述每一种情况中，两种SM蛋白一起之过度表达引起MCP-1滴度及比生产率均显著提高。此表明单独之Sly1或Munc-18之异源表达足以增强MCP-1分泌。然而，两种蛋白之异源表达以组合形式联合地以协同方式在瞬间以及稳定转染之细胞株中增强总体胞吐作用。

实施例12：SM蛋白增强人类细胞的HRP分泌。

为解决SM蛋白过度表达是否亦可用以在非啮齿动物细胞、尤其人类细胞中增强分泌性转运之问题，我们使用了编码分泌型辣根过氧化物酶(ssHRP)之质粒，其可用作组成型蛋白分泌之报道物。

人类纤维肉瘤细胞株(HT1080，ATCC CCL-121)以编码ssHRP的表达质粒，与空载体(MOCK对照物)或编码Sly1(SEQ ID NO.41)、Munc18(SEQ IDNO.39)或两种蛋白作为双顺反子表达单元之表达构建体来共转染。转染后24小时及48小时，自细胞培养物上清取样，分析过氧化物酶活性。在测量之后，将细胞用胰蛋白酶消化，计数以测定细胞之比生产率。

在24小时之后，可在表达Munc18或Munc18与Sly1两者之细胞中侦测到与对照细胞相比ssHRP分泌之略微增强(图9)。在转染后48小时，与mock对照物相比，所有表达SM蛋白之细胞均展示提高之ssHRP滴度(图9)。在Munc18转染的细胞的试样中测量到最高值，其HRP活性比对照试样提高约1.4倍。经Munc18或Sly1或两种SM蛋白转染的细胞与对照细胞相比，比生产率亦显著提高(图9)。

此证实，两种SM蛋白均功能性表达，且增强人类细胞的蛋白分泌。

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序列表

<110>贝林格尔英格海姆法玛两合公司(Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG)

 

<120>基于SM-蛋白的分泌工程化

 

<130>P01-2308

 

<140>PCT/EP2008010882

<141>2008-12-19

 

<150>EP 08152829.1

<151>2008-03-17

 

<150>EP 07150254.6

<151>2007-12-20

 

<160>60

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

 

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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>1

cgcggatcca ccatggcggc ggcggcggca gcg                                33

 

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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>2

ccgctcgagt tacttttgtc caagttgtga caaactg                            36

 

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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

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cgcggatcca ccatggcgcc gccggtggca gagagg                             36

 

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ccctcgagct attcatcttt aattaaggag ac                                 32

 

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ctcagatctg cggcggcggc ggcagcg                                       27

 

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accgtcgacc ttttgtccaa gttgtgacaa ctg                                33

 

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cgcgcggccg cacca tggcg gcggcggcgg cagcg                             35

 

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ccgggatcct tacttttgtc caagttgtga caactg                             36

 

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cccccgggat ggtgagcaag ggcgagg                                       27

 

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tttctagatt acttgtacag ctcgtcc                                       27

 

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cgcgcggccg caccatggcg ccgccggtgg cagagagg                           38

 

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ccggatccct attcatcttt aattaaggag ac                                 32

 

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cccaagcttt gcgcgacagg acccacgag                                     29

 

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cgcgtcgact tatccaacgg ttatggtgat gcc                                33

 

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ggaagatcta tcccgcggaa acgctac                                       27

 

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cccaagcttt caagcaagga agaccac                                       27

 

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<223>人工序列的描述：合成的引物

 

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aggcccggga caggaa                                                   16

 

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<223>人工序列的描述：合成的引物

 

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gccgtccttg agcacatagc                                               20

 

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aaagctcaat atcttcaagc cattc                                         25

 

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<223>人工序列的描述：合成的引物

 

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aacacgacat cggcgtacac t                                             21

 

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cttgctgctc tacctccacc at                                            22

 

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<223>人工序列的描述：合成的引物

 

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tgattctgcc ctcctccttc t                                             21

 

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tttggaagta aactggaaga tattttcaag agaaatatct tccagtttac ttcttttt     58

 

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ctagaaaaag cagtgaaact agacaagaaa tctcttgaat ttcttgtcta gtttcactgc    60

 

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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

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tttgggaggc aactacattg aatatttcaa gagaatattc aatgtagttg cctccttttt    60

 

<210>28

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>28

ctagaaaaag gaggcaacta cattgaatat tctcttgaaa tattcaatgt agttgcctcc    60

 

<210>29

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>29

tttgcacatg aatctcaggt gtatattcaa gagatataca cctgagattc atgtgttttt    60

 

<210>30

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>30

ctagaaaaac acatgaatct caggtgtata tctcttgaat atacacctga gattcatgtg    60

 

<210>31

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>31

tttggcttga agactactac aagatttcaa gagaatcttg tagtagtctt caagcttttt    60

 

<210>32

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>32

ctagaaaaag cttgaagact actacaagat tctcttgaaa tcttgtagta gtcttcaagc    60

 

<210>33

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>33

tttgcgccag aaacccagag ctaatttcaa gagaattagc tctgggtttc tggcgttttt    60

 

<210>34

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>34

ctagaaaaac gccagaaacc cagagctaat tctcttgaaa ttagctctgg gtttctggcg    60

 

<210>35

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>35

tttggctgaa taaacccaag gataattcaa gagattatcc ttgggtttat tcagcttttt    60

 

<210>36

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>36

ctagaaaaag ctgaataaac ccaaggataa tctcttgaat tatccttggg tttattcagc    60

 

<210>37

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>37

tttgcacaag ctggagtaca actacttcaa gagagtagtt gtactccagc ttgtgttttt    60

 

<210>38

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>38

ctagaaaaac acaagctgga gtacaactac tctcttgaag tagttgtact ccagcttgtg    60

 

<210>39

<211>592

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>39

Met Ala Pro Pro Val Ala Glu Arg Gly Leu Lys Ser Val Val Trp Gln

1               5                   10                  15

Lys Ile Lys Ala Thr Val Phe Asp Asp Cys Lys Lys Glu Gly Glu Trp

            20                  25                  30

Lys Ile Met Leu Leu Asp Glu Phe Thr Thr Lys Leu Leu Ala Ser Cys

        35                  40                  45

Cys Lys Met Thr Asp Leu Leu Glu Glu Gly Ile Thr Val Val Glu Asn

    50                  55                  60

Ile Tyr Lys Asn Arg Glu Pro Val Arg Gln Met Lys Ala Leu Tyr Phe

65                  70                  75                  80

Ile Thr Pro Thr Ser Lys Ser Val Asp Cys Phe Leu His Asp Phe Ala

                85                  90                  95

Ser Lys Ser Glu Asn Lys Tyr Lys Ala Ala Tyr Ile Tyr Phe Thr Asp

            100                 105                 110

Phe Cys Pro Asp Asn Leu Phe Asn Lys Ile Lys Ala Ser Cys Ser Lys

        115                 120                 125

Ser Ile Arg Arg Cys Lys Glu Ile Asn Ile Ser Phe Ile Pro His Glu

    130                 135                 140

Ser Gln Val Tyr Thr Leu Asp Val Pro Asp Ala Phe Tyr Tyr Cys Tyr

145                 150                 155                 160

Ser Pro Asp Pro Gly Asn Ala Lys Gly Lys Asp Ala Ile Met Glu Thr

                165                 170                 175

Met Ala Asp Gln Ile Val Thr Val Cys Ala Thr Leu Asp Glu Asn Pro

            180                 185                 190

Gly Val Arg Tyr Lys Ser Lys Pro Leu Asp Asn Ala Ser Lys Leu Ala

        195                 200                 205

Gln Leu Val Glu Lys Lys Leu Glu Asp Tyr Tyr Lys Ile Asp Glu Lys

    210                 215                 220

Ser Leu Ile Lys Gly Lys Thr His Ser Gln Leu Leu Ile Ile Asp Arg

225                 230                 235                 240

Gly Phe Asp Pro Val Ser Thr Val Leu His Glu Leu Thr Phe Gln Ala

                245                 250                 255

Met Ala Tyr Asp Leu Leu Pro Ile Glu Asn Asp Thr Tyr Lys Tyr Lys

            260                 265                 270

Thr Asp Gly Lys Glu Lys Glu Ala Ile Leu Glu Glu Glu Asp Asp Leu

        275                 280                 285

Trp Val Arg Ile Arg His Arg His Ile Ala Val Val Leu Glu Glu Ile

    290                 295                 300

Pro Lys Leu Met Lys Glu Ile Ser Ser Thr Lys Lys Ala Thr Glu Gly

305                 310                 315                 320

Lys Thr Ser Leu Ser Ala Leu Thr Gln Leu Met Lys Lys Met Pro His

                325                 330                 335

Phe Arg Lys Gln Ile Thr Lys Gln Val Val His Leu Asn Leu Ala Glu

            340                 345                 350

Asp Cys Met Asn Lys Phe Lys Leu Asn Ile Glu Lys Leu Cys Lys Thr

        355                 360                 365

Glu Gln Asp Leu Ala Leu Gly Thr Asp Ala Glu Gly Gln Lys Val Lys

    370                 375                 380

Asp Ser Met Arg Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Asn Lys Asn His Asp

385                 390                 395                 400

Asn Cys Asp Lys Ile Arg Ala Ile Leu Leu Tyr Ile Phe Ser Ile Asn

                405                 410                 415

Gly Thr Thr Glu Glu Asn Leu Asp Arg Leu Ile Gln Asn Val Lys Ile

            420                 425                 430

Glu Asn Glu Ser Asp Met Ile Arg Asn Trp Ser Tyr Leu Gly Val Pro

        435                 440                 445

Ile Val Pro Gln Ser Gln Gln Gly Lys Pro Leu Arg Lys Asp Arg Ser

    450                 455                 460

Ala Glu Glu Thr Phe Gln Leu Ser Arg Trp Thr Pro Phe Ile Lys Asp

465                 470                 475                 480

Ile Met Glu Asp Ala Ile Asp Asn Arg Leu Asp Ser Lys Glu Trp Pro

                485                 490                 495

Tyr Cys Ser Gln Cys Pro Ala Val Trp Asn Gly Ser Gly Ala Val Ser

            500                 505                 510

Ala Arg Gln Lys Pro Arg Ala Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Lys Asn Gly

        515                 520                 525

Ser Lys Leu Ile Val Phe Val Ile Gly Gly Ile Thr Tyr Ser Glu Val

    530                 535                 540

Arg Cys Ala Tyr Glu Val Ser Gln Ala His Lys Ser Cys Glu Val Ile

545                 550                 555                 560

Ile Gly Ser Thr His Val Leu Thr Pro Lys Lys Leu Leu Asp Asp Ile

                565                 570                 575

Lys Met Leu Asn Lys Pro Lys Asp Lys Val Ser Leu Ile Lys Asp Glu

            580                 585                 590

 

<210>40

<211>2522

<212>RNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>40

accccaacgc cgcuucugcg gccaaaguag guugggagug gaagguggug gcugcugcuc       60

cgcagugucg ggaagauggc gccgccggug gcagagaggg ggcuaaagag cgucgugugg      120

cagaagauaa aagcaacagu guuugaugac ugcaagaaag aaggcgaaug gaagauaaug      180

cuuuuagaug aauuuaccac uaagcuuuug gcaucguguu gcaaaaugac agaucuucua      240

gaagaaggua uuacuguugu agagaauauu uauaagaacc gugaaccugu cagacaaaug      300

aaagcucuuu auuucaucac uccgacauca aagucuguag auuguuucuu acaugauuuu      360

gcaaguaaau cggagaacaa guauaaagca gcauauauuu acuucacuga cuuuugcccu      420

gauaaucucu uuaacaaaau uaaggcuucu ugcuccaagu caauaagaag auguaaagaa      480

auaaauauuu ccuucauucc acaugaaucu cagguguaua cucuugaugu accagaugca      540

uucuauuacu guuauagucc agacccuggu aaugcaaagg gaaaagaugc cauuauggaa      600

acaauggcug accagauagu uacagugugu gccaccuugg augaaaaucc cggaguaaga      660

uauaaaagua aaccucuaga uaaugccagu aagcuugcac agcuuguuga aaaaaagcuu      720

gaagacuacu acaagauuga ugaaaagagc cuaauaaagg guaaaacuca uucacagcuc      780

uuaauaauug aucguggcuu ugauccugug uccacugucc ugcaugaacu gaccuuucag      840

gcaauggcau augaucuacu accaauugag aaugauacau acaaauauaa aacagaugga      900

aaagaaaagg aggccauccu ugaagaagaa gaugaccucu ggguuagaau ucgacaucga      960

cauauugcgg uuguguuaga ggaaauuccc aagcuuauga aagaaauuuc aucaacaaag     1020

aaagcaacag aaggaaagac aucacuuagu gcucuuaccc agcugaugaa aaagaugccc     1080

cauuuccgaa aacagauuac uaagcaaguu guccaucuua acuuagcaga agauugcaug     1140

aauaaguuca agcuuaauau agaaaagcuc ugcaaaacug aacaggaccu ggcacuugga     1200

acugaugcag aaggacagaa ggugaaagau uccaugcgag uacuccuucc aguucuacuc     1260

aacaaaaauc augauaauug ugauaaaaua agagcaauuc uacuuuauau cuucaguauu     1320

aauggaacua cggaagaaaa uuuggacagg uugauccaga auguaaagau agaaaaugag     1380

agugacauga uucguaacug gaguuaccuu gguguuccca uuguucccca aucucaacaa     1440

ggcaaaccgu uaagaaagga ucggucugca gaagaaacuu uucagcucuc ucgguggaca     1500

ccuuuuauca aagauauuau ggaggaugcu auugauaaua gauuagauuc aaaagaaugg     1560

ccauauuguu cccagugucc agcaguaugg aaugguucag gagcuguaag ugcucgccag     1620

aaacccagag cuaauuauuu agaagaccga aaaaaugggu caaagcugau uguuuuugua     1680

auuggaggga ucacauacuc ugaagugcgu ugugcuuaug aaguuucuca ggcacauaaa     1740

uccugugaag uuauuauugg uucuacacau guuuuaacac ccaaaaagcu guuggaugau     1800

auaaagaugc ugaauaaacc caaggauaaa gucuccuuaa uuaaagauga auagcauuuc     1860

uuuuuggagg guuuagagau ucuuacuaau auguugaacu aaaauagaaa gaaaauguug     1920

cugucaugua auuuaaacaa uguaaauauu uuauggaaua auggcuuuuc aaauacauuu     1980

cuuaaggaac uguuuaugau uauuacugga uuugucauuu uugauaauuu aaauauugcu     2040

gcugcuuugu agaugaugag aagaaauguu aaagugcuuu cuaaaaggaa auuuuuucac     2100

cuuuggagga gaauauauua gaguuguggg uaauuuuuca cagccaccua uguacauacu     2160

aauuacccau uggauacuua uaucuaaaag ucucaugcug aaguauaguu uuugggaaag     2220

aaugauuuua aauaaagaga uuguaaaagu aaaaaacugu aaauguauau guaugauaga     2280

auuguuuccu cuaaguguag uuuuucuuuc aacuaaaauu caguuuaugu guaaaauaau     2340

ucagucauua auagaaaugg agugauuuca caguguguac uguuuugcca cauacuucua     2400

aagaacacaa uuuuauauaa uuuugaaauc auguauguuu aaauuagaaa accaaaaauc     2460

augaacauuc uaagagaaaa uaaauauaga auuuaaaaaa uuaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2520

aa                                                                    2522

 

<210>41

<211>642

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>41

Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ile Arg

1               5                   10                  15

Glu Arg Gln Thr Val Ala Leu Lys Arg Met Leu Asn Phe Asn Val Pro

            20                  25                  30

His Ile Lys Asn Ser Thr Gly Glu Pro Val Trp Lys Val Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Arg Phe Gly Gln Asp Ile Ile Ser Pro Leu Leu Ser Val Lys Glu

    50                  55                  60

Leu Arg Asp Met Gly Ile Thr Leu His Leu Leu Leu His Ser Asp Arg

65                  70                  75                  80

Asp Pro Ile Pro Asp Val Pro Ala Val Tyr Phe Val Met Pro Thr Glu

                85                  90                  95

Glu Asn Ile Asp Arg Met Cys Gln Asp Leu Arg Asn Gln Leu Tyr Glu

            100                 105                 110

Ser Tyr Tyr Leu Asn Phe Ile Ser Ala Ile Ser Arg Ser Lys Leu Glu

        115                 120                 125

Asp Ile Ala Asn Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala Val Thr Gln Val Ala

    130                 135                 140

Lys Val Phe Asp Gln Tyr Leu Asn Phe Ile Thr Leu Glu Asp Asp Met

145                 150                 155                 160

Phe Val Leu Cys Asn Gln Asn Lys Glu Leu Val Ser Tyr Arg Ala Ile

                165                 170                 175

Asn Arg Pro Asp Ile Thr Asp Thr Glu Met Glu Thr Val Met Asp Thr

            180                 185                 190

Ile Val Asp Ser Leu Phe Cys Phe Phe Val Thr Leu Gly Ala Val Pro

        195                 200                 205

Ile Ile Arg Cys Ser Arg Gly Thr Ala Ala Glu Met Val Ala Val Lys

    210                 215                 220

Leu Asp Lys Lys Leu Arg Glu Asn Leu Arg Asp Ala Arg Asn Ser Leu

225                 230                 235                 240

Phe Thr Gly Asp Thr Leu Gly Ala Gly Gln Phe Ser Phe Gln Arg Pro

                245                 250                 255

Leu Leu Val Leu Val Asp Arg Asn Ile Asp Leu Ala Thr Pro Leu His

            260                 265                 270

His Thr Trp Thr Tyr Gln Ala Leu Val His Asp Val Leu Asp Phe His

        275                 280                 285

Leu Asn Arg Val Asn Leu Glu Glu Ser Ser Gly Val Glu Asn Ser Pro

    290                 295                 300

Ala Gly Ala Arg Pro Lys Arg Lys Asn Lys Lys Ser Tyr Asp Leu Thr

305                 310                 315                 320

Pro Val Asp Lys Phe Trp Gln Lys His Lys Gly Ser Pro Phe Pro Glu

                325                 330                 335

Val Ala Glu Ser Val Gln Gln Glu Leu Glu Ser Tyr Arg Ala Gln Glu

            340                 345                 350

Asp Glu Val Lys Arg Leu Lys Ser Ile Met Gly Leu Glu Gly Glu Asp

        355                 360                 365

Glu Gly Ala Ile Ser Met Leu Ser Asp Asn Thr Ala Lys Leu Thr Ser

    370                 375                 380

Ala Val Ser Ser Leu Pro Glu Leu Leu Glu Lys Lys Arg Leu Ile Asp

385                 390                 395                 400

Leu His Thr Asn Val Ala Thr Ala Val Leu Glu His Ile Lys Ala Arg

                405                 410                 415

Lys Leu Asp Val Tyr Phe Glu Tyr Glu Glu Lys Ile Met Ser Lys Thr

            420                 425                 430

Thr Leu Asp Lys Ser Leu Leu Asp Ile Ile Ser Asp Pro Asp Ala Gly

        435                 440                 445

Thr Pro Glu Asp Lys Met Arg Leu Phe Leu Ile Tyr Tyr Ile Ser Thr

    450                 455                 460

Gln Gln Ala Pro Ser Glu Ala Asp Leu Glu Gln Tyr Lys Lys Ala Leu

465                 470                 475                 480

Thr Asp Ala Gly Cys Asn Leu Asn Pro Leu Gln Tyr Ile Lys Gln Trp

                485                 490                 495

Lys Ala Phe Thr Lys Met Ala Ser Ala Pro Ala Ser Tyr Gly Ser Thr

            500                 505                 510

Thr Thr Lys Pro Met Gly Leu Leu Ser Arg Val Met Asn Thr Gly Ser

        515                 520                 525

Gln Phe Val Met Glu Gly Val Lys Asn Leu Val Leu Lys Gln Gln Asn

    530                 535                 540

Leu Pro Val Thr Arg Ile Leu Asp Asn Leu Met Glu Met Lys Ser Asn

545                 550                 555                 560

Pro Glu Thr Asp Asp Tyr Arg Tyr Phe Asp Pro Lys Met Leu Arg Gly

                565                 570                 575

Asn Asp Ser Ser Val Pro Arg Asn Lys Asn Pro Phe Gln Glu Ala Ile

            580                 585                 590

Val Phe Val Val Gly Gly Gly Asn Tyr Ile Glu Tyr Gln Asn Leu Val

        595                 600                 605

Asp Tyr Ile Lys Gly Lys Gln Gly Lys His Ile Leu Tyr Gly Cys Ser

    610                 615                 620

Glu Leu Phe Asn Ala Thr Gln Phe Ile Lys Gln Leu Ser Gln Leu Gly

625                 630                 635                 640

Gln Lys

 

<210>42

<211>2172

<212>RNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>42

gggcaguggc ucgugggagc caagauggcg gcggcggcgg cagcgacagc agcagcagca        60

gccaguauuc gggaaaggca gacaguggcu uugaagcgua uguugaauuu caaugugccu       120

cauauuaaaa acagcacagg agaaccagua uggaagguac ucauuuauga cagauuuggc       180

caagauauaa ucucuccucu gcuaucugug aaggagcuaa gagacauggg aaucacucug       240

caucugcuuu uacacucuga ucgagauccu auuccagaug uuccugcagu auacuuugua       300

augccaacug aagaaaauau ugacagaaug ugccaggauc uucgaaauca acuauaugaa       360

ucauauuauu uaaauuuuau uucugcuauu ucaagaagua aacuggaaga uauugcaaau       420

gcagcguuag cagcuagugc aguaacacaa guagccaagg uuuuugacca auaucucaau       480

uuuauuacuu uggaagauga uauguuugua uuauguaauc aaaauaagga gcuuguuuca       540

uaucgugcca uuaacaggcc agauaucaca gacacggaaa uggaaacugu uauggacacu       600

auaguugaca gccucuucug cuuuuuuguu acucugggug cuguuccuau aaucagaugu       660

ucaagaggaa cagcagcaga aaugguagca gugaaacuag acaagaaacu ucgagaaaau       720

cuaagagaug caagaaacag ucuuuuuaca ggugauacac uuggagcugg ccaauucagc       780

uuccagaggc ccuuauuagu ccuuguugac agaaacauag auuuggcaac uccuuuacau       840

cauacuugga cauaucaagc auuggugcac gauguacugg auuuccauuu aaacaggguu       900

aauuuggaag aaucuucagg aguggaaaac ucuccagcug gugcuagacc aaagagaaaa       960

aacaagaagu cuuaugauuu aacuccgguu gauaaauuuu ggcaaaaaca uaaaggaagu      1020

ccauucccag aaguugcaga aucaguucag caagaacuag aaucuuacag agcacaggaa      1080

gaugagguca aacgacuuaa aagcauuaug ggacuagaag gggaagauga aggagccaua     1140

aguaugcuuu cugacaauac cgcuaagcua acaucagcug uuaguucuuu gccagaacuc     1200

cuugagaaaa aaagacuuau ugaucuccau acaaauguug ccacugcugu uuuagaacau     1260

auaaaggcaa gaaaauugga uguauauuuu gaauaugaag aaaaaauaau gagcaaaacu     1320

acucuggaua aaucucuucu agauauaaua ucagacccug augcaggaac uccagaagau     1380

aaaaugaggu uguuucuuau cuauuauaua agcacacagc aagcaccuuc ugaggcugau     1440

uuggagcaau auaaaaaagc uuuaacugau gcaggaugca accuuaaucc uuuacaauau     1500

aucaaacagu ggaaggcuuu uaccaagaug gccucagcuc cggccagcua uggcagcacu     1560

accacuaaac caaugggucu uuuaucacga gucaugaaua caggaucaca guuugugaug     1620

gaaggaguga agaaccuggu uuugaaacag caaaaucuac cuguuacucg uauuuuggac     1680

aaucuuaugg agaugaaguc aaaccccgaa acugaugacu auagauauuu ugaucccaaa     1740

augcugcggg gcaaugacag cucaguuccc agaaauaaaa auccauucca agaggccauu     1800

guuuuugugg ugggaggagg caacuacauu gaauaucaga aucuuguuga cuacauaaag     1860

gggaaacaag gcaaacacau uuuauauggc ugcagugagc uuuuuaaugc uacacaguuc     1920

auaaaacagu ugucacaacu uggacaaaag uaacacagaa gaaccuuacu augauaaucu     1980

acuuggaaug uggauaaaug uaaaaagaag aaaaguuaga agagcaauau guuuccuucu     2040

cuguaacagu guccuaacag ugaaaaucag aguuauuugu uaauuuuuaa ggaaauuaua     2100

uacuuaauau guauugauua aaagaaacau uucagaaaua aaauuucaac auuguuaaaa     2160

aaaaaaaaaa aa                                                         2172

 

<210>43

<211>376

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>43

Met Val Val Val Ala Ala Ala Pro Asn Pro Ala Asp Gly Thr Pro Lys

1               5                   10                  15

Val Leu Leu Leu Ser Gly Gln Pro Ala Ser Ala Ala Gly Ala Pro Ala

            20                  25                  30

Gly Gln Ala Leu Pro Leu Met Val Pro Ala Gln Arg Gly Ala Ser Pro

        35                  40                  45

Glu Ala Ala Ser Gly Gly Leu Pro Gln Ala Arg Lys Arg Gln Arg Leu

    50                  55                  60

Thr His Leu Ser Pro Glu Glu Lys Ala Leu Arg Arg Lys Leu Lys Asn

65                  70                  75                  80

Arg Val Ala Ala Gln Thr Ala Arg Asp Arg Lys Lys Ala Arg Met Ser

                85                  90                  95

Glu Leu Glu Gln Gln Val Val Asp Leu Glu Glu Glu Asn Gln Lys Leu

            100                 105                 110

Leu Leu Glu Asn Gln Leu Leu Arg Glu Lys Thr His Gly Leu Val Val

        115                 120                 125

Glu Asn Gln Glu Leu Arg Gln Arg Leu Gly Met Asp Ala Leu Val Ala

    130                 135                 140

Glu Glu Glu Ala Glu Ala Lys Gly Asn Glu Val Arg Pro Val Ala Gly

145                 150                 155                 160

Ser Ala Glu Ser Ala Ala Gly Ala Gly Pro Val Val Thr Pro Pro Glu

                165                 170                 175

His Leu Pro Met Asp Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ser Asp Ser Glu Ser

            180                 185                 190

Asp Ile Leu Leu Gly Ile Leu Asp Asn Leu Asp Pro Val Met Phe Phe

        195                 200                 205

Lys Cys Pro Ser Pro Glu Pro Ala Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Val

    210                 215                 220

Tyr Pro Glu Gly Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Val

225                 230                 235                 240

Gly Thr Ser Ser Ala Lys Leu Glu Ala Ile Asn Glu Leu Ile Arg Phe

                245                 250                 255

Asp His Ile Tyr Thr Lys Pro Leu Val Leu Glu lle Pro Ser Glu Thr

            260                 265                 270

Glu Ser Gln Ala Asn Val Val Val Lys Ile Glu Glu Ala Pro Leu Ser

        275                 280                 285

Pro Ser Glu Asn Asp His Pro Glu Phe Ile Val Ser Val Lys Glu Glu

    290                 295                 300

Pro Val Glu Asp Asp Leu Val Pro Glu Leu Gly Ile Ser Asn Leu Leu

305                 310                 315                 320

Ser Ser Ser His Cys Pro Lys Pro Ser Ser Cys Leu Leu Asp Ala Tyr

                325                 330                 335

Ser Asp Cys Gly Tyr Gly Gly Ser Leu Ser Pro Phe Ser Asp Met Ser

            340                 345                 350

Ser Leu Leu Gly Val Asn His Ser Trp Glu Asp Thr Phe Ala Asn Glu

        355                 360                 365

Leu Phe Pro Gln Leu Ile Ser Val

    370                 375

 

<210>44

<211>1131

<212>RNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>44

augguggugg uggcagccgc gccgaacccg gccgacggga ccccuaaagu ucugcuucug       60

ucggggcagc ccgccuccgc cgccggagcc ccggccggcc aggcccugcc gcucauggug      120

ccagcccaga gaggggccag cccggaggca gcgagcgggg ggcugcccca ggcgcgcaag      180

cgacagcgcc ucacgcaccu gagccccgag gagaaggcgc ugaggaggaa acugaaaaac      240

agaguagcag cucagacugc cagagaucga aagaaggcuc gaaugaguga gcuggaacag      300

caagugguag auuuagaaga agagaaccaa aaacuuuugc uagaaaauca gcuuuuacga      360

gagaaaacuc auggccuugu aguugagaac caggaguuaa gacagcgcuu ggggauggau      420

gcccugguug cugaagagga ggcggaagcc aaggggaaug aagugaggcc aguggccggg      480

ucugcugagu ccgcagcagg ugcaggccca guugucaccc cuccagaaca ucuccccaug      540

gauucuggcg guauugacuc uucagauuca gagucugaua uccuguuggg cauucuggac      600

aacuuggacc cagucauguu cuucaaaugc ccuuccccag agccugccag ccuggaggag      660

cucccagagg ucuacccaga aggacccagu uccuuaccag ccucccuuuc ucugucagug      720

gggacgucau cagccaagcu ggaagccauu aaugaacuaa uucguuuuga ccacauauau      780

accaagcccc uagucuuaga gauacccucu gagacagaga gccaagcuaa ugugguagug      840

aaaaucgagg aagcaccucu cagccccuca gagaaugauc acccugaauu cauugucuca      900

gugaaggaag aaccuguaga agaugaccuc guuccggagc uggguaucuc aaaucugcuu      960

ucauccagcc acugcccaaa gccaucuucc ugccuacugg augcuuacag ugacugugga     1020

uacggggguu cccuuucccc auucagugac auguccucuc ugcuuggugu aaaccauucu     1080

ugggaggaca cuuuugccaa ugaacucuuu ccccagcuga uuagugucua a              1131

 

<210>45

<211>57

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>45

uuuggaagua aacuggaaga uauuuucaag agaaauaucu uccauuuacu ucuuuuu       57

 

<210>46

<211>58

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>46

cuagaaaaag aaguaaacug gaagauauuu cucuugaaaa uaucuuccag uuuacuuc      58

 

<210>47

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>47

uuuggcagug aaacuagaca agaaauucaa gagauuucuu gucuaguuuc acugcuuuuu    60

 

<210>48

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>48

cuagaaaaag cagugaaacu agacaagaaa ucucuugaau uucuugucua guuucacugc    60

 

<210>49

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>49

uuugggaggc aacuacauug aauauuucaa gagaauauuc aauguaguug ccuccuuuuu    60

 

<210>50

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>50

cuagaaaaag gaggcaacua cauugaauau ucucuugaaa uauucaaugu aguugccucc    60

 

<210>51

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>51

uuugcacaug aaucucaggu guauauucaa gagauauaca ccugagauuc auguguuuuu    60

 

<210>52

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>52

cuagaaaaac acaugaaucu cagguguaua ucucuugaau auacaccuga gauucaugug    60

 

<210>53

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>53

uuuggcuuga agacuacuac aagauuucaa gagaaucuug uaguagucuu caagcuuuuu    60

 

<210>54

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>54

cuagaaaaag cuugaagacu acuacaagau ucucuugaaa ucuuguagua gucuucaagc    60

 

<210>55

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>55

uuugcgccag aaacccagag cuaauuucaa gagaauuagc ucuggguuuc uggcguuuuu    60

 

<210>56

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>56

cuagaaaaac gccagaaacc cagagcuaau ucucuugaaa uuagcucugg guuucuggcg    60

 

<210>57

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>57

uuuggcugaa uaaacccaag gauaauucaa gagauuaucc uuggguuuau ucagcuuuuu    60

 

<210>58

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>58

cuagaaaaag cugaauaaac ccaaggauaa ucucuugaau uauccuuggg uuuauucagc    60

 

<210>59

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>59

uuugcacaag cuggaguaca acuacuucaa gagaguaguu guacuccagc uuguguuuuu    60

 

<210>60

<211>60

<212>RNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

 

<400>60

cuagaaaaac acaagcugga guacaacuac ucucuugaag uaguuguacu ccagcuugug    60

Claims (43)

1.一种在细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包括：

a)增加至少一种基因的表达，所述基因编码来自SEC1/Munc18群(SM蛋白)的蛋白，及

b)实现该目标异源蛋白的表达。

2.权利要求1之方法，其中在步骤b)中该目标异源蛋白的表达增加，优选在步骤b)中该目标异源蛋白的分泌增加。

3.权利要求1或2之方法，其中步骤a)中的一个基因编码三种Munc18同工型(isoforms)：Munc18a、b或c中的一种，优选为Munc18c(SEQ ID NO：39)。

4.权利要求1或2之方法，其中步骤a)中的一个基因编码Sly-1(SEQ IDNO：41)。

5.权利要求1或2之方法，其中步骤a)包含增加至少两个编码SM-蛋白的基因的表达，其中所述SM蛋白参与小泡转运的两个不同步骤。

6.权利要求5之方法，其中：

a)一个基因编码能调节小泡与细胞膜融合的SM蛋白，

b)第二基因编码能调节小泡与高尔基复合体融合的SM蛋白。

7.权利要求5或6之方法，其中Munc18c(SEQ ID NO：39)及Sly-1(SEQ IDNO：41)的表达增加。

8.权利要求1或2之方法，其中步骤a)包含：

i)增加编码该SM蛋白家族之一个成员的第一基因之表达，

ii)增加编码该SM蛋白家族之另一成员的第二基因之表达，及

iii)增加编码XBP-1之第三基因的表达。

9.权利要求8之方法，其中Munc18c(SEQ ID NO：39)、Sly-1(SEQ ID NO：41)及XBP-1(SEQ ID NO：43)之表达增加。

10.一种细胞工程化之方法，其包含：

a)将一或多种载体系统引入细胞中，所述载体系统包含编码至少两种多肽之核酸序列，其中

i)至少一种第一核酸序列编码SM-蛋白，及

ii)第二核酸序列编码目标蛋白，

b)表达该目标蛋白及该至少一种SM-蛋白。

11.权利要求10之方法，其中该SM-蛋白为Munc-18同工型之一，优选为Munc-18c(SEQ ID NO：39)，或Sly-1(SEQ ID NO：41)。

12.权利要求10之方法，其中在步骤a)i)中组合使用两种SM-蛋白，其中所述SM蛋白参与小泡转运的两个不同步骤。

13.权利要求12之方法，其中：

a)一个基因编码能调节小泡与细胞膜融合的SM蛋白，

b)第二基因编码能调节小泡与高尔基复合体融合的SM蛋白。

14.权利要求13之方法，其中组合使用的两种SM-蛋白为Munc-18c(SEQ ID NO：39)及Sly-1(SEQ ID NO：41)。

15.权利要求10或12之方法，其中在步骤a)i)中两种SM-蛋白与XBP-1组合使用。

16.权利要求15之方法，其中所述SM蛋白为Munc-18c(SEQ ID NO：39)及Sly-1(SEQ ID NO：41)与XBP-1(SEQ ID NO：43)组合。

17.权利要求1-16中任一项之方法，其中该细胞为真核细胞，优选为脊椎动物细胞，最优选为哺乳动物细胞。

18.权利要求1-17中任一项之方法，其中该目标蛋白为治疗用蛋白。

19.权利要求18之方法，其中该目标蛋白为抗体或抗体片段。

20.一种表达载体，其包含编码至少两种多肽的表达单元，其中

a)至少一种多肽为SM-蛋白，及

b)第二多肽为目标蛋白。

21.权利要求20之表达载体，其中该目标蛋白为治疗用蛋白，优选为抗体或抗体片段。

22.权利要求20或21之表达载体，其中所述表达单元为多顺反子，优选为双顺反子。

23.权利要求20-22之一的表达载体，其中该SM-蛋白为Munc-18同工型：Munc-18a、b、c之一，优选为Munc-18c(SEQ ID NO：39)。

24.权利要求20-22之一的表达载体，其中该SM-蛋白为Sly-1(SEQ IDNO：41)。

25.权利要求20-24之一的表达载体，其中组合使用至少两种SM-蛋白。

26.权利要求25之表达载体，其中该载体包含至少一个配置如下之双顺反子表达单元：

a)编码SM蛋白之基因，

b)IRES组件，及

c)编码SM蛋白之第二基因。

27.权利要求20-26之一的表达载体，其中至少两种SM-蛋白与XBP-1组合使用，优选为Munc-18c(SEQ ID NO：39)及Sly-1(SEQ ID NO：41)与XBP-1(SEQ ID NO：43)组合。

28.一种细胞，其表达至少两种异源基因：

a)至少一种基因编码SM-蛋白，及

b)另一基因编码目标蛋白。

29.权利要求28之细胞，其中该目标蛋白为治疗用蛋白，优选为抗体或抗体片段。

30.权利要求28或29之细胞，其中该SM蛋白之表达量显著高于内源表达量，优选高10％。

31.权利要求28-30之一的细胞，其包含权利要求20至27的任一表达载体。

32.权利要求28-31之一的细胞，其中该细胞为真核细胞，优选为脊椎动物细胞，最优选为哺乳动物细胞。

33.权利要求32之细胞，其中该细胞为CHO细胞，优选为CHO DG44细胞。

34.一种目标蛋白，优选为抗体，其藉由权利要求1至19中任一项之方法所产生。

35.一种药物组合物，其包含化合物及可药用载剂，所述化合物适用于阻断或降低一或多种SM-蛋白之活性或表达。

36.权利要求35之药物组合物，其中该化合物为多核苷酸序列。

37.权利要求36之药物组合物，其中该多核苷酸序列为shRNA、RNAi、siRNA或反义-RNA，优选为shRNA。

38.权利要求35-37之一的药物组合物，其中该SM-蛋白为Munc-18c(SEQ ID NO：39)或Sly-1(SEQ ID NO：41)或该两者之组合。

39.鉴别SM-蛋白功能的调节剂的方法，其包含：

a)提供至少一种SM-蛋白，优选为Munc-18c，

b)使步骤a)之该SM-蛋白与测试剂接触，

c)测定与增加或减少蛋白分泌或细胞表面蛋白表达相关的效应。

40.治疗癌症、自身免疫病及炎症的方法，包括对有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求35-38之一的药物组合物。

41.抑制或减少细胞增殖或迁移的方法，包括将所述细胞与权利要求35-38之一的药物组合物接触。

42.SM-蛋白或编码SM-蛋白之多核苷酸在活体外细胞或组织培养系统中增加目标蛋白的分泌及/或生成的用途。

43.权利要求1-42之一的方法，表达载体，细胞或药物组合物的诊断用途。

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