CN103012590B - 一种抗cd20单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于抗CD20单抗及其制备方法和用途。采用中国仓鼠卵巢细胞CHO DG44制备得到与美罗华一致的抗CD20单抗，建立了300L真核细胞大规模高表达生产工艺，蛋白表达量在1.2g/L以上；蛋白纯化得率提高至60%以上。本发明安全有效，实用性较强，价廉，方便快捷，其制备工艺简便、容易操作，使用简便、疗效显著，为治疗B细胞诱导的恶性肿瘤、特别是非霍奇金淋巴瘤，以及自身免疫性疾病、肾衰、乙肝和丙肝、糖尿病等提供了一种新的药物来源，适于医药、生物技术领域等工业和行业的大规模生产和商业应用，应用前景良好，具有显著的社会效益、经济效益。

Description

一种抗CD20单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药、生物技术等领域，具体地说是涉及单克隆抗体、抗体人源化等生物技术及医药技术领域的一种抗体及其制备方法和用途，更具体地说是涉及一种单克隆抗体及其制备方法和用途，再具体地说是涉及一种用于抗CD20单克隆抗体（简称：抗CD20单抗）及其制备方法和用途。

背景技术

（一）抗CD20单克隆抗体的研究概况

1、概述

肿瘤的死亡率在全世界各种疾病的死亡率居榜首，恶性肿瘤已经成为严重影响人类健康和生命的杀手。据不完全统计，在中国，每年有300余万新发恶性肿瘤患者，其中130万人死于恶性肿瘤。在美国，每年诊断为肿瘤的患者为100万，死于肿瘤的患者达54.7万，用于肿瘤的治疗费用1020亿美元。资料显示，今后10年抗肿瘤生物技术药物会急剧增加，2007年美国共有400余种新药在进行抗肿瘤的临床试验，其中生物技术类产品占接近一半，可见，生物技术类抗肿瘤药物在肿瘤的防治中具有十分重要的意义。

非霍奇金淋巴瘤（Non Hodgkin’s Lymphoma，或称：非何杰金氏淋巴瘤，简称：NHL）是常见恶性血液病之一，且是临床最常见的淋巴系统恶性肿瘤，是由B淋巴细胞（简称：B细胞）恶性增长引起的（B细胞来源约占85%），好发于青壮年。近年来，NHL发病率和病死率呈逐年上升趋势，严重危害着人类健康。本发明研究的CD20单抗是治疗非何杰金氏淋巴瘤的一线药物，是世界上销售量最大的抗体之一，2010年全球销售额达到66亿美元。

B淋巴细胞是体液免疫的起点，大部分的造血恶性肿瘤起源于此。因此，由B细胞和其对应恶性肿瘤表达的细胞表面分子是免疫治疗的重要靶标。MS4A基因家族的B细胞特异成员CD20在未成熟和成熟B细胞以及其对应的恶性肿瘤表达（Tedder and Engel(1994)Immunol.Today15:450-454）。近年来针对多种恶性肿瘤表面细胞表面抗原标志物的靶向性治疗取得巨大进步，应用单克隆抗体治疗非霍奇金淋巴瘤的临床结果取得重大进展，使得针对CD20的单克隆抗体治疗非霍奇金淋巴瘤成为发展前景良好的一种新型抗肿瘤方法。

2、CD20

目前抗CD20单克隆抗体是治疗B淋巴瘤的最有效的治疗药物，在治疗NHL中有极其重要的地位。CD20是一种分子量为33～37kD的磷酸化蛋白质分子，是B淋巴细胞非糖基化四重跨膜磷蛋白，位于B淋巴细胞表面，即B淋巴细胞表面分化抗原，而在其他组织以及多能B淋巴干细胞均不表达。它主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化，在免疫系统起重要作用，CD20从前-B淋巴细胞阶段开始表达，直到浆细胞阶段才无CD20表达（Stashenko p.，NsdlerLM，Hardy R，et al.Characterization of a human B lymphocyte-specific antigen.J.Immun.1980；125：1678-1685）。CD20和抗CD20抗体结合后不发生内吞作用，因而细胞表面CD20数量并不因为抗体的结合而减少，在人体血清中无游离的CD20存在。CD20抗原高表达于超过95%的正常或恶化的B淋巴瘤细胞，没有显著内吞和脱落（Press OW，FarrAG，Borroz KI etal.Endocytosis and Degradation of Monoclonal Antibodies Targeting Human B-CellMalignancies.Cancer Res1989；49：4906-4912），因此CD20是治疗B淋巴细胞瘤的理想靶点。

3、CD20基因的表达与调控

CD20是B细胞的重要分化抗原，首先在前-B细胞中表达。成熟的B细胞也表达CD20，B细胞激活将产生CD20的高表达，激活的扁桃体B细胞上的CD20可以被沉降下来，而静态的扁桃体B细胞却不能，生发中心B细胞上的CD20分子也表现为高表达。荧光分析证实，处于生长进化的B细胞均为CD20高表达。B细胞向浆细胞分化时，CD20的表达为下降趋势，CD20在浆细胞中不表达。人CD20基因为单拷贝基因，位于染色体11q12.13.1，长16kb，有8个外显子，其中外显子I含有转录的起始位点，外显子III含有翻译的起始位点，外显子VmRNA在剪接时会被剪切下来，外显子VIII编码CD20分子mRNA的3′端非翻译区。CD20分子的mRNA以三种形式存在：第一种mRNA长2.8kb，含有外显子I到外显子VIII的完整序列，这种mRNA为主要存在形式；第二种mR2NA由于外显子I和外显子III的剪接作用而缺少外显子II，所以在长度上比前者短263bp；第三种mRNA长3.4kb，可能是外显子I上游的某一段序列参与了外显子I内部的剪接而产生的，这种形式的mRNA较少。CD20的表达受到转录因子的调节，PU.1和Pip是最重要的两个转录因子，二者均结合在CD20的启动子区，只有结合了Pip和PU.1的启动子才具有启动转录的功能。CD20的启动子没有TATA框，转录需要一个保守序列——NF2Y结合位点，约占启动子的30%。B细胞分化成为浆细胞时，CD20和PU.1的水平均下降（Steve Alas等，Clin Cancer Res,2002,8(3):836-845）。CD20的表达因淋巴瘤细胞的不同而有所差异，例如CD20在慢性B淋巴白血病细胞中的表达远低于正常的B细胞和其他B淋巴瘤细胞，CD20的表达高低在一定程度上决定了抗体和补体杀伤瘤细胞的程度（Perz J等，Leuk Lymphoma,2002,43(1):149-151）。细胞的生长因子能够调节一些瘤细胞中CD20的表达（Golay J等，Blood,2001,98(12):3383-3389）。IL24、TNF2α、GM2CSF上调慢性B淋巴白血病细胞的CD20的表达，Sivaraman等发现慢性B淋巴白血病细胞与500u/ml的IFN2α作用24小时后，细胞表面的CD20分子明显增加，作用72小时CD20增加的程度低于24小时，这说明这种刺激作用经历一个峰值后将随着时间的延长而下降。Morikawa等发现，抗CD5抗体的加入可以使膜CD20的数量下降，这说明CD5可能也参与了CD20表达的调节（Morikawa K等，Scand J Im munol,2002,55(1):44-52）。亦有研究表明离子射线也可持续上调CD20的表达。

4、CD20分子的功能

CD20的生理作用至今尚未阐明，根据CD20与抗CD20的抗体结合后B细胞产生的一系列的生物学反应，推测CD20可能参与B细胞的增殖、分化、信号转导和钙离子的跨膜传递。抗CD20的抗体对B细胞增殖的影响因抗体种类而异，抗体IF5可刺激B细胞由G0期进入G1期，而抗体B1抑制B细胞由G1期进入S/G2+M期。抗CD20的抗体还抑制B细胞的分化和EB病毒诱导Ig的分泌。CD20的胞内区与酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶为非共价结合，CD20与抗CD20结合将激活这些激酶，诱导PLCγ的磷酸化。同时上调C2myc和B2myb的mRNA水平，增加CD18、CD58和MHCII家族蛋白的表达。越来越多的证据表明，CD20是调节B淋巴细胞生命与分化信号转导的重要分子。抗CD20的抗体可直接抑制B细胞生长并诱导其凋亡的发生，该凋亡的发生与钙离子相关。细胞中钙离子浓度低时，细胞沿循细胞周期生长，CD20与抗体交联形成后，在浆膜上形成钙离子通道，细胞内的钙离子浓度增加，抑制B细胞从G1期进入S/G2+M期，从而引起细胞凋亡的发生（Shan Det al.CancerI mmu no Im munother,2000,48(12):73-76）。二级抗体（如羊抗人抗体）或表达FcRIβ细胞可增强上述B细胞的凋亡的发生，该凋亡与细胞内的钙离子浓度增加和PTK及其底物的磷酸化有着密切关系（Btephan M等，Cancer Res,2000,60:7170-7176）。实验证明，CD20与抗CD20抗体及二级抗体的超级结合能够启动并增强PTK信号通路，底物PLCγ的磷酸化程度与CD20的交联程度有密切依赖关系，内质网储存钙的释放使细胞内的钙离子浓度快速增加，同时胱天蛋白酶（caspase）发生活化。对于耐药的B细胞瘤，CD20与抗CD20抗体的结合增加活性氧的爆发（Steve Alas等，Clin Cancer Res,2002,8(3):836-845）。以上说明CD20分子本身是一个钙泵，CD20的激活是调节内源性钙离子变化的又一个影响因素，并通过钙离子变化直接调节钙离子通道活性。

5、抗CD20单克隆抗体研究进展

多数的人B细胞谱系恶性肿瘤表达CD20（Anderson等，Blood，198463：1424）。基于抗CD20嵌合体或放射标记单克隆抗体的疗法已经用于非霍奇金淋巴瘤（Press等，Hematology，2001,221-240；Kaminski等,N.Engl.J.Med.1993329:459-465）。临床研究表明抗CD20单克隆抗体治疗hia改善类风湿性该关节炎、特发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血以及其他免疫介导的疾病临床表现（Sliverman等,Arthritis Rheum.,2002,48:1484-1492;Enwards等,Rheumatology，2001,40:1-7）。

应用竞争性假设解释抗CD20单克隆抗体的体内（in vivo）治疗效果。在一个模型中，CD20作为膜整合的靶标用于通过天然免疫系统的活化或效应子机制的启动产生单克隆抗体介导的B细胞消除（Reff等,Blood,1994,83:435-445;Maloney等Blood，1998，90：2188-2195;Maloney等,J.Clin.Oncol.1997,15:3266-3274）。

目前，经FDA批准上市用于治疗NHL的抗CD20的单抗有Rituximab、Zevalin、Bexxar等，Rituximab（利妥昔单抗，商品名：美罗华；后简称：美罗华）是第一个是上市的抗CD20的单克隆抗体类药物，是一种嵌合体人IgG1抗人CD20单克隆抗体，能高效诱导补体（C）激活的经典途径和对新鲜分离的淋巴瘤细胞和B细胞系的补体依赖的细胞毒性（Reff等，Blood，1994，83：435-445；Golay等，Blood，98：3383-3389；Cragg等Blood，2003，101：1045-1052；DiGaetano等J.Immunl.2003,171:1581-1587;Bellosillo等，Blood，2001，98：2771-2777）。美罗华还在病人（vander Klok等，Br.J.Hematol.2001,115:807-811）和灵长类（Kennedy等，Blood，2003，101：1071-1079）体内激活补体。此外，包括CD59在内的补体调解蛋白的肿瘤细胞中的表达和抗CD20治疗的抗性相关（Golay等，Blood，98：3383-3389；Treon等J.Immunotheraphy，200124:263-271）。虽然许多人认为补体依赖的细胞毒性是美罗华在体外（in vitro）和体内消除人淋巴瘤细胞中所使用的主要用途（Golay等，Blood，98：3383-3389；Cragg等Blood，2003，101：1045-1052；Di Gaetano等J.Immunl.2003,171:1581-1587;Golay等，Blood，95：3900-3908；Di Gaetano等J.Hematol.2001,114:800-809;Weiner Blood2003，101：788），但是其他人发现，根据肿瘤细胞对补体介导裂解的易感性以及补体抑制剂CD46、CD55和CD59在肿瘤细胞上的表达不能预测美罗华的治疗效果（Weng和Levy，Blood，2001，98：1352-1357）。因为与临床使用的同种型不同的嵌合体抗CD20单克隆抗体不能在非人或灵长类中消除正常的Ｂ细胞（Anderson等，Biochem.Soc.Transac.，1997，25：705-708），并且抗CD20单克隆抗体的抗肿瘤效应部分地依赖通过IgG的Fc受体（FcγR）的免疫激活（Clynes等，Nature Med.，2000，6：443-446），所以其他的抗体依赖作用也是重要的。此外，抗CD20单克隆抗体处理改变了跨膜Ca²⁺转运和B细胞功能，这些扰乱了细胞周期进程（Tedder和Engel，Immunol.Today，1994,15:450-454）并且能够诱导B细胞的程序性细胞死亡（Shan等，Blood，1998，91：1644-1652）。

单独使用美罗华治疗复发以及难治的非霍奇金淋巴瘤有效率达50%左右，若与化疗药物联用，则有效率可达90%~100%。同时，美罗华会带来一系列的不良反应，诸如：脱发、恶心、呕吐、血细胞减少等，且有轻微的发热、寒颤等。但美罗华仍由其在治疗非霍奇金淋巴瘤上表现的良好疗效和低毒副作用，已成为美国销售额最大的抗肿瘤药物之一，2008年销售额近30亿，年增长率14%。

但这些药物治疗费用较高，致使中国很多患者难以接受治疗。因此，研究疗效好、治疗成本低的药物对提高非霍奇金淋巴瘤患者的生活质量具有重大意义。此外，研发对人免疫原性更小，表达量更高，以及具有其他优良特性的抗CD20单克隆抗体或多克隆抗体，更成为目前的研究重点。

（二）真核细胞基因表达系统

自20世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。

在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体（一般为质粒）转化细菌（通常选用的是大肠杆菌），通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：

a)根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制；

b)能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及；

c)能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。

因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

1、酵母表达系统

最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。

甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因-1（简称：A0x1），在该基因的启动子（简称：PAXOI）作用下，外源基因得以表达。PAXOI是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOx1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为E.coli/Pichia Pastoris的穿梭载体，其中含有E.coli复制起点和筛选标志，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量扩增.目前，将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。

利用PAXOI表达外源蛋白时，一般需很长时间才能达到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶（简称：GAP）启动子代替PAXOI，不需要甲醇诱导。培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。

酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。

2、昆虫细胞表达系统

杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒（简称：AcNPV）作为表达载体。在AcNPV感染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码产生多角体蛋白，该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质粒。克隆入外源基因的传递质粒与野生型AcNPV共转染昆虫细胞后可发生同源重组，重组后多角体基因被破坏，因而在感染细胞中不能形成包涵体，利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低，且载体构建时间长，一般需要4～6周。此外，昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。

在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解，胞质内的物质释放出来，与目的蛋白混在一起，从而使蛋白的纯化工作变得很困难，另外水解酶的释放会降解重组蛋白。为了克服以上这些困难，科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒ie-1基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明显。Farrel等（Farrel等，Biotech.and Bioeng.，1998，60（6）：656-663）介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统，该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列：（1）Bombyx mori的肌动蛋白基因启动子；（2）Bombyx mori的核型多角体病毒（BmNPV）的立早基因ie-1（编码俄IE-1蛋白，该蛋白是种转录激活因子，可在体外激活肌动蛋白基因启动子）；（3）BmNPV的同源重复序列3（HR3）可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。三者协同作用，可使转录活性提高1000倍以上，从而大大地提高外源蛋白的表达水平。另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒（HyNPV）被应用于昆虫细胞表达系统的构建，该病毒由AcNPV及Bni'qP发展而来。

一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性。为了解决这个问题将Hsp70（热休克蛋白70）与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平，这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外。如果到达内质网前，前体多肽就伸展开来，暴露出疏水残基，残基间的相互作用可引起多肽的凝聚，这对最终的表达水平有很大影响。而Hsp70是一种分子伴侣，能够与新翻译的多肽结合，抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工，从而提高蛋白的分泌水平。

最近，人们又构建了杆状病毒-S2表达系统，该系统能将重组杆状病毒转染果蝇S2细胞，以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞（如sf9、sf21）中复制，不能在其他昆虫细胞（如果蝇细胞）中复制，然而目前研究表明在一定条件下，杆状病毒也能感染果蝇细胞。在果蝇细胞中，杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用。杆状病毒-S2表达系统的表达载体利用的是果蝇启动子如Hsp70启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启动子等，其中，Hsp70启动子的作用最强。重组杆状病毒感染S2细胞后不会引起宿主细胞的裂解，且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似，因此，杆状病毒-S2系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。

3、哺乳动物细胞表达系统

由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。

将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法：一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞，二是通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。外源基因的体外表达一般采用质粒表达载体，如将重组质粒导入CHO细胞可建立高效稳定的表达系统，而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。目前，病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具，在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相当大（约187kb），利用它作为载体可同时插入几种外源基因，从而构建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因，但要注意的是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险性。

由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高，即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌。另一种方法是通过CrelaxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都插入laxP位点，然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞，通过Cre介导两个laxP位点之间的DNA发生重组，可获得重组腺病毒，这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。最近，人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。由于杆状病毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达，而且载体的构建容易，因而利用杆状病毒进行基因转移为发明人提供了很好的途径。

利用哺乳动物细胞表达外源基因时，大多数情况下不需要诱导，但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导，这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响。哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子。但这些系统存在一些共同的缺陷，如诱导表达特异性差；当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性，常对细胞造成损伤等。

为此，Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系统，该系统由调节质粒和反应质粒组成。调节质粒中具有编码转录激活因子（简称：fIA）的序列，在没有四环素或强力毒素存在的情况下tTA可引起下游目的基因表达。随后Gossen等又对tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了受四环素正调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有四环素的情况下启动子不被激活，而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达（Gossen等，Science，1995，268（5218）：1766-1769；Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89（12）：5547-5551）。四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性强的优点。

外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞产生不利影响，因此利用哺乳动物细胞表达外源基因时，一个主要问题便是外源基因不能持久稳定地表达。Mielke等（Mielke等，Gene，2000，254（1-2）：1-8）构建了一种能够在哺乳动物中稳定表达异二聚体蛋白的载体系统，在这个系统中，编码抗体重链和轻链的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被转录成三顺反子mRNA。内部的顺反子通过内核糖体进入位点（简称：IREs）介导进行翻译，通过持续选择压力，无需繁琐的筛选过程，便可获得持久、稳定表达抗体分子的重组体。

哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。

利用基因工程技术表达外源蛋白。其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。通过转基因动物或转基因植物技术可从动物的乳汁或植物的叶组织中很方便地获得大量较纯的生物活性物质，但目前这项技术还不很成熟，有待进一步研究。

由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统（Mielke等，Gene，2000，254（1-2）：1-8）。Vander Geld等利用不同的表达系统表达了蛋白激酶（简称：PR30），并对它们的抗原性进行了比较，结果发现，在哺乳动物细胞中表达的PR3具有与抗PR3抗体结合的所有表位，在昆虫细胞中表达的PR3具有大部分表位，而在甲醇酵母中表达的PR3只具有少数几个表位（Vander Geld等，J.Immunol.Meth.，2000，244（1-2）：117-132）。

哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。因此，研发一种表达量更高，操作简便的哺乳细胞表达系统，具有巨大的应用空间；并且可以提供成本更低的基因工程类药物，具有巨大的社会意义和经济价值。

（三）哺乳动物细胞无血清培养基

1、细胞培养基概述及优缺点分析

细胞培养基是细胞体外培养的最重要因素。无血清培养基是继天然培养基、合成培养基之后的第三类培养基。与传统的培养基相比，无血清培养基是一种不含有动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。无血清培养技术也是阐明细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的基础研究问题的有力工具。

常规细胞培养基的制备方法是在基础培养基中添加相应量的血清或组织提取物，其中最常用于培养基的血清是一种组分很不明确的混合物。所以常规血清细胞培养基存在以下缺点：

（1）血清来自于动物体，其对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用，但同时也有细胞生长抑制因子和毒性因子，所以存在潜在毒性。、

（2）由于动物血清提取的局限，使其应用于培养基的价格格外昂贵。

（3）动物血清提取的局限，也给细胞培养的标准化带来困难，同时也存在细胞培养表达产品分离纯化难的问题，具有潜在的细胞毒性作用，给规模化培养细胞增加了难度（Even MS,Sandusky C B,Barnard N D.Serum free hydridoma culture:ethical,scientific and safetyconsiderations[J].Trendsin Biotechnology，2006,24(3):105-108.）。

由于上述常规血清细胞培养基存在的诸多问题，促使发明人改进培养方法，用无血清细胞培养基来替代。细胞工程中无血清培养技术的应用，在很大程度上可以避免含血清培养所带来的不利。无血清培养基具有以下明显的优缺点：

无血清培养基的优点：

①可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。

②避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。

③避免血清组分对实验研究的影响。

④有利于体外培养细胞的分化。

⑤可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。

缺点：

①细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。

②成本较高。

③针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。

2、无血清培养基的发展概述

从1975年垂体细胞株Gh3在无血清介质中生长获得成功到现在，无血清培养基的发展大致经历了3代。

第1代无血清培养基不含血清，但含有大量成分不明确的动、植物蛋白。因此，其不利于目标蛋白的分离纯化，成本也较高。

第2代无血清培养基是基于生产重组药物的安全考虑而开发的，其主要特点是完全不用动物来源蛋白，称之为无血清，无动物衍生蛋白培养基。它的优点是既可降低生产成本，又能加快报批的速度。

由于生物工程的要求，第3代无血清培养基近年已出现，即完全没有蛋白或含量极低，组成成分全为化学已知物的培养基，称之为双无培养基。其优点在于细胞培养与生产很容易做到恒定，目标蛋白的分离纯化更为容易，细胞培养基的原材料成本大为下降，生产中品质管理更加容易。但其对培养的细胞具有很高的特异性。

目前预测第4代无血清培养基将会进入研究与开发，这将是一种无血清、无蛋白、又可以高温消毒的适合于许多种不同细胞生长的全能型培养基。小结可见表1（陈峰，无血清培养基的主要补充印子及研究进展[J].海峡药学，2006，18（4）：10-13）。

由上可知，第四代培养基的研制开发并投入市场将成为发展趋势。

表1、无血清培养基的发展过程

3、无血清培养基的组分

无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用，而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。无血清培养基的成分十分复杂，一般认为其由基础培养基和替代血清的补充因子两部分组成。

1)基础培养基

血清培养基是在合成培养基基础上发展而来的，其基础培养基一般是相应的未添加血清的合成培养基，即按细胞生长需要将一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等组合成的基础培养基。在具中可根据需要对基础培养基和某些组分进行适当的凋整，从而使其更好的符合具体细胞株的营养要求或提高目的蛋白的表达量。

用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。

2)补充因子

又称添加组分，是无血清培养基中用于代替血清的各种因子的总称，其主要包括激素、生长因子、结合蛋白、贴壁因子等几大类别。

a)促贴壁物质

许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。贴壁因子常见种类有纤黏连蛋白、软骨黏连蛋白等。

b)促生长因子及激素

针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如常见种类有胰岛素、生长激素、胰高血糖素、孕酮、氢化可的松、雌二醇等；生长因子常见种类有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等。

c)酶抑制剂

培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中酶抑制剂必不可少，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。

d)结合蛋白和转运蛋白

常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。

e)微量元素

硒是最常见的微量元素。

f)其他

还可为亚硒酸钠、维生素、脂类等。

在所有补充因子种类中，胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠是几乎所有的细胞株在无血清培养基中生长时都需要的，一般被认为是必须补充因子。

补充因子的来源直接加入无血清培养基中的某些补充因子，特别是胰岛素和转铁蛋白等通常是以动物为来源的，这样一来就仍然存在与血清同样的安全隐患。利用基因工程技术生产重组生产因子是一种解决上述隐患的有效途径。如张万江等（万江，王秀梅，吴波浪，等．猪表皮生长因子真核表达产物的体外活性试验[J]．动物医学进展，2008，29(4)：31~33．）试验证明用酵母表达的重组猪表皮生长因子能有效促进细胞增殖，具有与国际标准的人表皮生长因子相当的生物学活性；翁少洁等将可以同时表达Igf-1、Vitronectin和Bcl-23个蛋白的三顺反子表达载体pCI-NII-IVB转染于CHO-dhfr一细胞中，构建了适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHDIVB2。这种培养细胞的蛋白类补充因子来源自体化，更是会大大促进第3代和第4代无血清培养基的开发。

4、无血清培养基的研究方法

动物细胞无血清培养基的研究是细胞工程领域的一项重要研究课题。无血清培养基的研究方法主要包括三个部分：培养过程分析方法、分子生物技术方法和统计学方法。

1)培养过程分析方法

细胞代谢方面的基础研究为培养基的设计提供最基本的理论依据，对于配制新的培养基，设计合理的培养方案以及实现高效表达都非常重要。培养过程分析可以实时或者间接提供细胞在体外的生理状态变化，为设计或调整培养基提供信息。目前可用于细胞培养基分析的项目有氨基酸分析，微量元素分析，维生素分析，脂肪酸分析，糖类物质分析，以及用酶学方法分析培养基中葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸的含量等。动物细胞培养过程中各种能量类或辅助类物质的变化对细胞培养的影响较大。细胞培养过程中细胞增殖或者目的产物表达效率不仅在细胞自身的生长特征上表现出来，也可以间接由培养环境中生物分子的消耗或者积累变化来体现。因而对细胞培养环境的观察也显得非常重要。培养基中的物质变化可以通过仪器来计量，如高压液相等色谱技术、质谱技术等。细胞生长和活力变化常通过台盼蓝染色及血球计数板统计细胞的生长曲线变化。微滴定实验是另一种同时分析多个细胞培养样品，运用MTT还原反应来计数细胞活性，这是目前广泛选用的方法（Zhang X Y，Pennec G L，Steffen R，et a1．Application of a MTT assay for screening nutritional factors in growth media ofprimary sponge cell culture．Biotechnol Prog，2004，20(1)：151～155）。另一种方法是应用刃天青的氧化一还原反应来测定细胞活性，刃天青的氧化．还原反应不影响细胞的代谢，而且对细胞的密度测量范围比较广，对于细胞培养条件的研究有一定的推动作用（Gong H X，FangQ Y，Li X S，et a1．A high—throughput end—point assay for viable mammalian cellestimation．Cytotechnology，2005，49(1)：51～58）。

2)分子生物技术方法

基因组技术和蛋白质组技术是近几年来用于细胞培养研究的新工具，在分子水平对细胞培养过程认识的深入，可以更准确地预测和判断体外培养细胞的生长和代谢状态。其中常用的基因组技术包括有基因芯片技术、定量PCR技术；蛋白质组技术有抗体芯片和双向凝胶电泳分离技术。应用这些技术工具，研究人员可以在mRNA和蛋白质水平上观察细胞培养过程的变化，并预测细胞培养过程中可能出现的反应（Scow T K，Korke R，Cynthia R等，．ProteomicInvestigation of metabolic shih in mammalian cell culture．Biotechnol Prog，2001，17(6)：1137～1144；Han M J，Lee S Y．Proteome profiling and its use in metabolic and cellularengineering．Proteomics，2003，3(12)：2317～2324）。针对每一添加组分对细胞生理代谢过程的调控，分析宿主细胞的核中及胞浆中的分子影响机制，筛选适宜细胞培养的添加组分。另外可以通过抗体芯片遴选细胞培养调控过程中细胞表面的受体分布、粘附分子及信号通路相关生物分子。运用收集的细胞生理代谢信息，可以相应确定在培养基中添加配体或其他的生物分子来调控细胞增殖、凋亡、分化、粘附和外源基因表达。分子生物技术方法是一种高通量、可再现的技术工具，目前已有许多商业研究机构已大量运用基因组技术和蛋白质组技术，在细胞培养基的设计与改进方面做了许多工作。

3)统计实验设计方法

该法在化学工业的过程开发中已得到广泛应用，近几年的微生物培养和过程优化广泛运用统计学实验设计方法，动物细胞培养研究也有运用统计学实验方法并取得明显效果的文献报道。Liu等（Liu C H，Chu I M，Hwang S M.Factorial designs combined with the steepest ascentmethod to optimize senull-fl'ee media for CHO cell．Enzyme and Microbial Technology，2001，28(4-5)：314～321）运用统计学设计及优化方法研制CHO NTHU108细胞的无血清培养基，与商业化培养基相比较，首先是明确培养基基本配方信息，另外无血清培养基对细胞的生长及产品表达并不影响，还有培养基的蛋白含量很低，更适于表达蛋白的后期纯化。统计学实验设计方法强调在培养基的设计、优化和数据结果分析方面运用统计学工具，用比较经济的人力、物力和时间，得到可靠的结果，准确地控制和估计误差的大小，使多种因素包括在尽可能少的实验中。

5、CHO细胞无血清培养基的研究进展

由于哺乳动物细胞的转录后修饰的功能，利用哺乳动物细胞生产的外源蛋白比用原核生物生产的外源蛋白比用原核生物生产的蛋白有无可比拟的优越性，该项技术得到了越来越广泛的重视。中国仓鼠卵巢细胞-CHO细胞（Chinese hamster ovary cell）是目前最为广泛使用的细胞，已被广泛用于生产各种基因工程蛋白产品，如CHO细胞在体外经过基因工程改造之后，可以插入表达目地蛋白质药物的基因，产生目的价格昂贵的蛋白质药物例如单克隆抗体，促红细胞生成素、干扰素、胰岛素等等。

外源蛋白在CHO细胞中通常可通过两种不同的方式得到表达，即二氢叶酸还原酶缺陷型（简称：DHFR缺陷型）和谷氨酰胺合成酶系统。通过谷氨酰胺合成酶系统表达的外源蛋白产量高、稳定，而收到重视。

CHO细胞的培养通常是在有血清的培养基中进行，虽然细胞密度和产物浓度较高，但由于血清中蛋白和其他大分子物质太复杂，影响产物的分离和纯化，降低了产物的收率和纯度；同时，由于血清的添加也使成本大大提高。因此，无血清CHO细胞培养基成为当下的研究重点和热点。

李萍等（李萍等，微生物学免疫学进展，200432（4）：46-50）以DMEM：F12（1：1）为基础培养基，通过观察细胞生长状态和检测乙肝表面抗原的表达量作为评价指标，筛选适合于CHO工程细胞生长的生长因子，如：胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、硒酸钠，丁二胺等。并且建立了J5SFM培养基。该培养基与商品化的无血清培养基比较，细胞维持时间3~4周，存活状态差于HBsAg-CHO。J5SFM与商品化的无血清培养基比较有其维持时间长，分泌表达量高的优势，但生长前期略长，细胞密度稍低。

张大棚等（张大鹏等，中国生物制品学杂志，2011，24（10）：1152-1156）研究开发了支持重组CHO-K1细胞生长的无动物源、无蛋白培养基（Protein-free midium，PFM，以柠檬酸铁、硫酸锌和酵母水解物替换SFMC中的转铁蛋白、胰岛素和动物组织水解物）及化学成分确定的培养基（Chemically defined medium，CDM，以PFM培养基为基础，通过调整和优化氨基酸的浓度和其他部分营养物质浓度制备），评价各种无血清培养基的适应性、稳定性以及冻存、复苏性能，并分别在125ml摇瓶和1.4L生物反应器中进行培养。结果CHO-K1细胞在PFM和CDM中生长良好，经125ml摇瓶培养，最高细胞密度分别为9.3×106和7.3×106个/ml，最大细胞密度与SFMC培养基相比，分别提高了107%和62%。经1.4L搅拌式生物反应器流加培养，PFM培养基的最高细胞密度可达9.8×106个/ml，培养216h时，细胞活性仍维持在80%，重组蛋白表达量达110.5mg/L；采用CDM培养基经流加培养，CHO-K1细胞最大密度可达9.5×106个/ml，但细胞培养时间较PFM培养基短。

综上所述，各科学工作者虽然开发了许多无血清培养基，但在细胞工程中只能做到对有限细胞品种的无血清培养基的设计与优化，目前多数无血清培养基都含有白蛋白等大分子蛋白类添加剂，严重影响了产物的分离纯化，同时成本也较高。尤其是缺少适用于CHO细胞培养，且培养效果与有血清培养基相当或者更好的培养基，而政府及药物监管部门对培养基的使用要求也比较严格。

因此，本领域迫切需要开发新的适合CHO细胞培养的，低蛋白或无蛋白的，功能较完善、特性较鲜明的，表达量高、成本低的无血清培养基，寻找新型、成分明确、疗效确切、不良反应小的抗CD20单克隆抗体也势在必行。

但是，经文献检索等，到目前为止，尚未发现有新的抗CD20产品及其制备方法和用途等方面的报道。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是公开了一种特异性抗CD20的单克隆抗体及其制备方法和用途，即该单克隆抗体具有抗CD20的作用，能够用于制备抗CD20产品，以克服现有技术存在的上述缺陷。

也就是说，本发明针对现有技术的不足，通过实验研究和理论探索，目的之一意在提供一种新的单克隆抗体，即提供一种抗CD20单克隆抗体，包括：

a)抗体重链元件，该抗体重链元件含有人抗体重链的恒定区，抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；

b)抗体轻链元件，该抗体轻链元件含有人抗体轻链的恒定区，并且抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；

所述的抗体重链元件和抗体轻链元件通过二硫键连接。

本发明的目的之二是提供一种分离的DNA分子，其编码本发明上述的抗体；

本发明的目的之三是提供了一种载体，其含有本发明上述所述的DNA分子；

本发明的目的之四是提供了一种细胞株，其用于生产上述所述的单克隆抗体；

本发明的目的之五是提供一种本发明所述抗体的制备方法，包括步骤：

在表达所述抗体的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的抗体；并分离所述的抗体；

本发明的目的之六是提供了一种药物组合物，包括安全有效量的本发明所述的特异性单克隆抗体，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂；

本发明的目的之七是提供本发明所述的单克隆抗体的用途，即提供含有上述单克隆抗体及其组合物作为抗CD20产品方面的应用，其用于制备治疗非霍奇金淋巴瘤的药物或用于制备诊断恶性B细胞淋巴溜的试剂；

本发明的目的之八是提供一种新的无蛋白无血清培养基及其制备方法，以改进现有的可用于培以无血清或无蛋白方式有效培养重组细胞的方法；

本发明的目的之九是提供有效提高重组细胞产量的方法；

本发明的目的之十是提供有效降低无蛋白无血清培养基成产成本、实现工业化大生产可能的方法。

本发明所述的抗CD20产品是指医药、生物技术等领域中，一种直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究B细胞相关的恶性疾病及其直接相关疾病的产品；

所述的抗非霍奇金淋巴瘤产品是指医药、生物技术等领域中，一种直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究非霍奇金淋巴瘤及其直接相关疾病的产品；

所述的抗CD20产品是包括药物、试剂等中的一种或多种，优选药物。

所述的抗非霍奇金淋巴瘤产品是包括药物、试剂等中的一种或多种，优选药物。

（一）技术构思

自主开发创新药物是中国目前的一项紧迫任务，发现新药物、已有药物的新组合或新用途，改进现有药物的结构、制备方法、制剂品种等均是有效的快捷途径，也是中国快捷创新药物研制的优势所在。

非霍奇金淋巴瘤的治疗和诊断是近年来的一个研究热点。Rituximab是治疗非何杰金氏淋巴瘤NHL的一线药物，是目前全球开发最为成功的抗体类生物技术药物，也是世界上销售量最大的抗体之一，2010年全球销售额达到66亿美元。Rituximab单抗不但在治疗非何杰金氏淋巴瘤上具有突出的疗效，还可以用于自身免疫性疾病的治疗，因此具有极为广泛的市场前景。但是作为创新药物的Rituximab治疗费用极高，每人每年需花费20多万元，全世界大多数国家的普通患者都无法承受，更是中国普通病患者难以企及的药物。随着该药物专利2015年到期，开发Rituximab的生物仿制药成为全球仿制药研究领域的热点，特别是近年来欧盟已经通过了生物仿制药的相关法规，美国也正在推进生物仿制药法规的颁布，这都为生物仿制药的开发提供了难得的机遇。在中国开发Rituximab生物仿制药不但具有广阔的经济前景，更能造福广大普通患者，使他们仅需花费同类进口药物几分之一的价格即能得到同等的疗效，因此具有广泛的社会效益。

本发明研究的CD20单抗，就是通过开发Rituximab生物仿制药能使发明人建立起生产抗体类生物技术药物所需的动物细胞高效表达技术平台和大规模生产工艺，为开发其它抗体类生物技术药物打下基础并提供有益的经验。

但是，非霍奇金淋巴瘤的机制复杂，是多种因素相互、共同作用的结果，而单一机制的研究往往不能达到满意的效果，因此多种机制的、多药物联合运用的综合性研究有待进一步开展。

目前，由B细胞和其对应恶性肿瘤表达的细胞表面分子是免疫治疗的重要靶标。MS4A基因家族的B细胞特异成员CD20在未成熟和成熟B细胞以及其对应的恶性肿瘤的表达（Tedder and Engel(1994)Immunol.Today15:450-454）。多数的人B细胞谱系恶性肿瘤表达CD20（Anderson等，Blood，198463：1424）。基于抗CD20的生物制剂成为治疗和诊断非霍奇金淋巴瘤等恶性肿瘤或其他自身免疫疾病的关键药物之一。因此，研制抗CD20等方面的产品，特别是药物，意义重大，并具有显著的社会效益和经济效益。

随着对CD20的研究不断趋于完善，也一定会产生更多相关的应用思路和切实可行的方法服务于临床治疗，同时也为研究抗CD20产品提供了一条的新的策略。

发明人参考已有文献并通过计算机进行密码子优化，人工合成CD20单克隆抗体DNA分子并构建高效表达载体，转染、筛选获得高表达CD20抗体的种子细胞株，大规模生产抗CD单克隆抗体，并推断该药物组合物在治疗和诊断恶性B细胞肿瘤等方面的药效，应主要是通过抗CD20来发挥的，研究结果也证明和证实了该药物组合物具有显著的抗CD20的药理作用。

本发明的目标是要研制出与Rituximab作用一致的CD20单抗，并作为生物制品新药申报。通过构建高效表达载体，研制低成本的无血清培养基，开发高效经济的纯化工艺，建立安全可靠的质控体系，达到提高产量、降低生产成本目的。最终在保证质量的前提下，使该抗体的生产成本大大低于国际上同类药物成本。该抗体药物能用于治疗淋巴瘤和类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病等自身性免疫病等疾病。

根据此想法和思路，发明人通过反复的实验研究与分析和理论探索，已成功得到预期的研究结果和应用产品。

（二）抗CD20单克隆抗体及其制备方法

1、定义

如本文所用，术语“抗CD20的特异性单克隆抗体”、“抗CD20单抗”、“抗CD20单克隆抗体”、“CD20单抗”、“CD20抗体”等可互换使用，都是指由抗体重链元件的氨基酸序列和抗体轻链元件的氨基酸序列构成的抗体；该术语还包括与GST等形成的融合蛋白，只要在该融合蛋白中抗体部分仍然保留与CD20的结合活性。

如本文所用，术语“抗体重链元件”指在所述本发明抗体的重链。该抗体重链元件含有抗体重链的可变区和恒定区。对于重链可变区而言，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1的抗体重链。对于重链恒定区而言，其来自人抗体的重链恒定区，较佳的是XX类型的重链恒定区。

如本文所用，术语“抗体轻链元件”是在所述本发明抗体的轻链。该抗体轻链元件含有抗体轻链的可变区和恒定区。对于轻链可变区而言，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2的抗体轻链。对于轻链恒定区而言，其来自人抗体的轻链恒定区，较佳的是XX类型的轻链恒定区。

本发明还提供了抗CD20单克隆抗体的氨基酸序列及其其可变区链，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物，具体地，本发明包括具有含超变区（互补决定区，简称：CDR）的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物（即免疫偶联物及融合表达产物），只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。

抗体的抗原结构特性可由位于重链和轻链可变区的各特定的区域来描述，成为互补决定区（complementarity determining region,简称：CDR），将该段间隔成4各框架区域（简称：FR），4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。本领域技术人员通过常规方法分析将本发明抗体的重链和轻链序列（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2），可确定其CDR区。本发明还包括这些CDR区完全相同的抗体重链和抗体轻链，以及由所述重链和轻链构成的抗体。

此外，最近还发现由轻链可变区构成的相关结构，与相应的重链可变区相比，其结合的动力学较小，分离的重链可变区域自身具有抗原结合活性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或（Fab’）2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体，可用于本发明的形成嵌合抗体的技术是本领域公知的。

本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可用PRC扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短室。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

获得有关序列后，即可用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明中所述的“核酸分子”指聚核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸（简称：DNA）和核糖核苷酸（简称：RNA），还包括由核苷酸类似物形成的DNA或RNA的等效物、类似物，单链（有义链或反义链）和双链聚核苷酸。该术语还包括同源序列。对本领域技术人员来说，很显然，任意一种上述形式的核酸分子都当然地涵盖了该“核酸分子”的所有上述等效形式。

此外，目前已可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生物）的DNA序列，然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

上述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物稀薄。代表例有：大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞、真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收货，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域中公知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可以用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的诉诸细胞，培养中所用的培养基可选用各种常规的培养基。在适合宿主细胞生长的条件下培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转化或化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上述方法中的重组多肽可在细胞内、或细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的其他特性通过各种分离方法分离纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（简称：HPLC）和其他各种液相层析技术及这些方法的结合。

2、抗CD20单克隆抗体的制备方法

参考已有文献并通过计算机进行密码子优化，人工合成CD20单抗包括如下具体步骤：

（1）构建一个独特的pMED高效哺乳动物细胞基因表达系统；

（2）建立一个悬浮细胞、无血清培养驯化体系，通过转染将CD20单抗基因整合到CHO细胞的基因组中，通过逐步增加MTX的浓度可使整合在细胞内的目的蛋白基因拷贝数大量扩增，筛选CHO细胞亚克隆，获得高表达工程细胞株，并建立三级种子细胞库；

（3）建立适合哺乳动物细胞悬浮培养的无血清培养基，使用该无血清CD培养基培养CHO工程细胞株；

（4）建立哺乳动物细胞大规模培养及蛋白纯化体系，利用哺乳动物细胞大规模发酵及纯化平台，获得外源蛋白的大规模表达。

3、完整的嵌合CD20单抗质量标准及结果

主要内容包括：

（1）纯度测定

SDS-PAGE法：非还原条件下的电泳图谱与对照品一致；

HPLC法：用HPLC法测定嵌合CD20单抗的纯度≥95.0%。

（2）分子量测定

SDS-PAGE还原条件下，嵌合CD20单抗为一条重链和一条轻链。

（3）无菌检查

按《中华人民共和国药典》2010版，结果为无菌生长。

（4）细菌内毒素

按《中华人民共和国药典》2010版，每1mg单抗对应的原液含细菌内毒素小于10EU/mg。

（5）抗体的特异结合性

采用流式细胞术方法进行测定，测定结果符合规定。

（6）嵌合CD20单抗生物学活性的测定

CDC法检测，与参比品相似。

此外，还包括DNA残留量、糖基化分析、肽图研究、氨基酸组成、N端和C端序列测定等。临床前动物试验还证明发明人开发的CD20抗体与市售Rituxin具有生物等效性。

4、目的基因表达产物结构的确证

（1）N端氨基酸序列测定

测序结果为Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu-Pro-Gly，该结果与文献报道的Rituximab（利妥昔单抗，商品名：美罗华；后简称：美罗华）一致；

（2）C端搭配序列测定

测序结果为Lys-Gly-Pro-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Thr-Tyr-His-Asn-His，该结果与文献报道的Rituximab（利妥昔单抗，商品名：美罗华；后简称：美罗华）一致；

（3）肽图分析

肽图图谱与对照品Rituximab（利妥昔单抗，商品名：美罗华；后简称：美罗华）一致；

（4）分子量测定

测得的分子量还原型介于63~77KD，非还原型约为150KD，与对照品及文献报道的Rituximab（利妥昔单抗，商品名：美罗华；后简称：美罗华）一致；

（5）等电点测定

测得的等电点分布在4.8±0.5内，与对照品及文献报道的Rituximab（利妥昔单抗，商品名：美罗华；后简称：美罗华）一致。

（三）抗CD20单克隆抗体的用途

1、概述

本发明的目的是提供一种用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究B淋巴瘤细胞及其直接相关疾病的产品，包括药物、试剂、食品、保健品等中的一种或多种，优选药物和保健品，进一步优选药物。

本发明研究涉及到的药物作用机制与抗体依赖的细胞毒作（简称：ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（简称：CDC）和直接诱导细胞凋亡三种可能的机制有关，并进行了进一步的动物实验研究与理论探索。

发明人经过研究的最新发现是：抗CD20单克隆抗体能够在高中低不同浓度均能通过ADCC、CDC和直接诱导细胞三种机制显著杀伤B淋巴瘤细胞，且与阳性对照物物显著性差异。

多数的人B细胞谱系恶性肿瘤表达CD20（Anderson等，Blood，198463：1424）。基于抗CD20嵌合体或放射标记单克隆抗体的疗法已经用于非霍奇金淋巴瘤（Press等，Hematology，2001,221-240；Kaminski等,N.Engl.J.Med.1993329:459-465）。临床研究表明抗CD20单克隆抗体治疗还改善类风湿性该关节炎、特发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血以及其他免疫介导的疾病临床表现（Sliverman等,Arthritis Rheum.,2002,48:1484-1492;Enwards等,Rheumatology，2001,40:1-7）。

本发明已经成功构建了pMED哺乳动物细胞基因表达系统，通过发明人自行研制的无血清培养基和特有的哺乳动物细胞大规模培养技术，发明人获得了CD20抗体的高效表达，蛋白表达量最高达到了2g/L。初步细胞和动物实验表明，该CD20抗体与进口药物Rituximab有相似的疗效、活性和药代动力学特性。

也就是说，经实验研究表明，抗CD20单克隆抗体能够用于制备抗B细胞淋巴瘤产品，可用于非霍奇金淋巴瘤、类风湿性关节炎、特发性血小板减少紫癜和溶血性贫血以及其他免疫介导的疾病临床表现，最优选的是治疗非霍奇金淋巴瘤。

该CD20单抗还可以用于自身免疫性疾病的治疗，现有治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病等自身性免疫病的新药中最成功的品种当属依那昔普（Enbrel，安进）、英利昔单抗（Remicade，强生/Centocor）和阿达木单抗（Humira，雅培）等肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抑制剂。2003年，TNF-α抑制剂总销售额超过40亿美元，近几年该类药物的年销售额以30%的速度快速增长。到2007年，预计约30%的中重度类风湿性关节炎、银屑病患者将接受抗体药物治疗，其市场销售额将达到70亿美元。但该类药物治疗费用较高，每人每年要花费20余万元，如此高额花费，对中国病患者是不能承受的。因此，研究疗效好、治疗成本低的药物就具有非常好的市场前景。

已完成的急性毒性实验证明，小鼠腹腔注射给药对该抗CD20单克隆抗体的最大耐受量超过1mg/kg，相当于临床推荐用药剂量的20倍以上，表明该抗CD20单克隆抗体安全可靠，解决了该类药物剂量使用禁忌上的问题。

综上所述，发明人对抗CD20单克隆抗体进行了理论探索，经过大量的实验研究包括长期的药理学试验，发现所述及的抗CD20单克隆抗体有显著的预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗CD20的活性，为研制抗CD20产品提供了新的来源，为进一步开发利用中国现有药物提供了科学依据。

2、抗CD20单克隆抗体及其组合物的使用方法与要求

本发明抗CD20单克隆抗体可以单独或进一步与其它活性组分联合使用，包括用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗CD20产品，包括药物或试剂等，尤其是药物。

在具体使用方面，本发明所述的抗CD20单克隆抗体能够单独直接使用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解抗CD20单克隆抗体的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可接受的载体或者食品等中的一种或多种；进一步优选医药学上可接受的载体。

本文使用的“医药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了该抗CD20单克隆抗体的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包括赋形剂，如淀粉或水等中的一种或多种；润滑剂，如滑石粉、聚乙二醇、甘油或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠或低取代羟丙纤维素等；填充剂，如淀粉、糊精或乳糖等中的一种或多种；粘接剂，如预胶化淀粉、糊精、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素等中的一种或多种；渗透压调节剂，如氯化钠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；pH调节剂，如盐酸、氢氧化钠等酸或碱中的一种或多种；稀释剂，如水等；溶剂，如水、缓冲液、乙醇或丙二醇等中的一种或多种等；崩解剂，如琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠等中的一种或多种；抗氧剂和络合剂，如亚硫酸钠、EDTA等中的一种或多种；吸收促进剂，如季铵化合物等；表面活性剂，如季铵化合物、十六烷醇等中的一种或多种等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇等中的一种或多种；高分子骨架剂，如环糊精、聚乙二醇、泊洛沙姆等中的一种或多种；稀释剂如淀粉、糖粉、糊精、微晶纤维素、甘露醇、乳糖和大豆油等中的一种或多种；稳定剂如羧甲基纤维素钠或环糊精等中的一种或多种；防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或苯甲酸钠等中的一种或多种。另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂或甜味剂如蔗糖、果糖和天冬甜素等中的一种或多种。

例如，将活性组分抗CD20单克隆抗体溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中（例如，蒸馏水、生理盐水或格林溶液等中的一种或多种）或油性溶剂中（例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种）中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有分散剂（例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、聚维酮、环糊精、苯甲醇、泊洛沙姆、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种）、渗透压调节剂（例如，氯化钠、甘油、D9－甘露糖、D－山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种）。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如稳定剂（例如，人血清白蛋白等）、增溶剂（例如，水杨酸钠或醋酸钠等中的一种或多种）、止痛剂（例如，盐酸普鲁卡因、苯甲醇或利多卡因等中的一种或多种）等。

本发明所述及的抗CD20单克隆抗体还可以进一步以组合物的形式联合使用，特别是与其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种，优选人、小鼠、大鼠、猴、猪、兔或犬等中的一种或多种，进一步优选人、大鼠或猴等中的一种或多种。例如，可以将本发明抗CD20单克隆抗体加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常，该药用组合物包含本发明抗CD20单克隆抗体和药学上可接受的载体。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的该抗CD20单克隆抗体的药物，以及医药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。这类载体包括，但不限于：任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。

抗CD20单克隆抗体的组合物特别是药物组合物可以有各种形式，包括例如液体、半固体和固体等剂量形式中的一种或多种；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的抗CD20单克隆抗体为活性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。

本发明所述的抗CD20单克隆抗体的组合物尤其是药物组合物能够可以采用本领域公知的常规生产方法制成剂型。

抗CD20单克隆抗体的药物组合物可以采用本领域公知的常规生产方法制成任何一种适合于实验、研究或临床上应用的剂型，包括固体制剂如胶囊、片剂、颗粒制剂等，液体制剂如口服液或者注射剂等。例如，使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型；本发明所述的抗CD20单克隆抗体可通过加入适当的辅料进一步制成颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂等剂型，所述的辅料可以选自淀粉、糊精、乳糖、二氧化硅、磷酸氢钙、环糊精、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、滑石粉等中的一种或多种。

所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口服或注射（包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种）、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗CD20单克隆抗体的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。

药物组合物优选含有重量比为0.5%~99%的活性成分抗CD20单克隆抗体，进一步优选含有重量比为1%~95%的活性成分抗CD20单克隆抗体，最优选含有重量比为5%~90%的活性成分抗CD20单克隆抗体。

抗CD20单克隆抗体的组合物尤其是药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该抗CD20单克隆抗体与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该抗CD20单克隆抗体加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。

该组合物中可包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐或明胶，以达到注射组合物的延长吸收；可包括高分子聚合物载体，如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯，以达到口服组合物的延长释放。

用于患者时，本发明所述的抗CD20单克隆抗体剂量为0.005~0.05mg/kg·d，可以分一次或多次使用，该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。

本发明抗CD20单克隆抗体的组合物尤其是药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗CD20单克隆抗体。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。抗CD20单克隆抗体组合物的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及该抗CD20单克隆抗体在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指该抗CD20单克隆抗体组合物的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。本发明抗CD20单克隆抗体的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是0.005~0.05mg/kg，更优选为0.01~0.02mg/kg。应注意，剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化，也就是说用于患者时，本发明所述的抗CD20单克隆抗体剂量或用量，通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。

另外，应理解，对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。

也就是说，需要根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等，变化本发明抗CD20单克隆抗体组合物的每次和/或每日的剂量或用量。例如，该组合物的安全有效量通常至少为10微克/千克体重，而在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是10微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素调整剂量单位，以提供最佳所需反应（例如，治疗或诊断），这些都是熟练医师技能范围之内的。例如，经静脉给予哺乳动物，尤其是成年人（如体重60kg），所述抗CD20单克隆抗体组合物的单剂量约为0.3~3mg，优选约0.5mg，优选每日给药1次。

可以调整剂量单位，以提供最佳所需反应（例如，治疗或预防应答）。例如，可以单次大剂量给药，可以在一段时间内给予几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。

配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式，指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性物抗CD20单克隆抗体。本发明的剂量单位形式的规格，由以下确定并直接取决于以下（a）该抗CD20单克隆抗体的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和（b）在混合这种用于治疗个体敏感性抗CD20单克隆抗体的技术中的内在限制。

本发明提供了一种治疗非霍奇金淋巴瘤的药物组合物，其含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配置于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为5~8，较佳的pH为6~8，尽管pH值可随被配制物的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）腹膜内、静脉内或局部给药。

本发明药物组合物的制备方法可以是将现有的市售可得的上述化合物，或从生物中提取的含上述化合物的提取物，按配比，采用本领域的常规方法获得，即得所述的抗CD20单克隆抗体组合物。本发明中述及的各原料或试剂均市售可得。

综上所述，本发明抗CD20单克隆抗体及其组合物尤其是药物组合物可用于诊断、检测、保护、治疗和研究抗CD20产品，优选以本发明抗CD20单克隆抗体为原料制备而成的抗CD20产品，优选药物和食品，进一步优选药物。

3、抗CD20单克隆抗体及其组合物的药物剂型和给药途径

本发明所述的抗CD20单克隆抗体及其组合物尤其是药物组合物制备的用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗CD20产品，其中按照饮料、食品技术领域的要求制备的产品能够用于诊断、检测、研究抗CD20单克隆抗体；按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗、诊断、预防或研究，既能够单独直接用于制备治疗、预防、研究或保健的药物，也能够与许多化学物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗、预防、研究或保健的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际情况和需要，采用食品级或药用级的物料。

本发明所述的抗CD20单克隆抗体及其组合物尤其是药物组合物，可以用本领域已知的各种方法给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是口服给药。但是，技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如控释制剂，包括移植物传递系统、透皮贴传递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一种或多种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知（例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.,纽约，1978）。

本发明所述的抗CD20单克隆抗体及其组合物尤其是药物组合物，通常通过口服、直肠或肠胃外给药等中的一种或多种方式，施用于需要这种治疗的患者。

用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂或胶囊等中的一种或多种。在实施时，本发明抗CD20单克隆抗体及其组合物可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。该抗CD20单克隆抗体（和其它成分，如果需要）亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述抗CD20单克隆抗体与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等等中的一种或多种形式使用。

为了以非肠道给药之外给予本发明抗CD20单克隆抗体，可能需要用防止其失活的材料对该抗CD20单克隆抗体包衣或与该抗CD20单克隆抗体一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时，将本发明抗CD20单克隆抗体与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。

制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种，如糖浆、酊剂或酏剂等中的一种或多种；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。

本发明所述的抗CD20单克隆抗体及其组合物尤其是药物组合物可以制成任何一种适合于临床上应用的剂型，包括固体制剂，如胶囊、片剂、颗粒制剂等，半固体制剂如软膏等，液体制剂如口服液、混悬剂、乳剂等，或者注射剂。采取口服或注射（包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种）、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗CD20单克隆抗体的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。

以上抗CD20单克隆抗体或其组合物能够使用各种途径，在所述的使用形式中，优选的形式是口服制剂（如片剂、包衣片剂、胶囊、溶液或混悬液等中的一种或多种）、非肠道给予剂型（如注射剂、软膏或贴剂等中的一种或多种）等中的一种或多种，进一步优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种，再优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种，特别优选片剂。

综上所述，本发明抗CD20单克隆抗体及其组合物可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗CD20产品，优选药物和食品，进一步优选药物。

（四）抗CD20单抗的技术特长

本发明为诊断、检测、保护、治疗和研究B细胞诱导的恶性肿瘤提供了一种新的药物来源和应用剂型，从而对现有的抗CD20产品系统特别是药物进行了改进、改善和提高，从而拓展了现有药物的应用。

本发明安全有效，实用性较强，价廉，方便快捷，其制备工艺简便、容易操作，使用简便、疗效显著，可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究各类抗CD20药物组合物及其直接相关疾病的治疗和预防。

本发明有针对性地研究CD20单克隆抗体，发现了一种新的抗CD20单克隆抗体组合物，作出了意想不到的成绩；同时，本发明也有针对性地研究抗CD20单克隆抗体组合物的活性，其药理作用较强，使用安全，最大限度地发挥了作用。本发明对抗CD20单克隆抗体组合物拓展了新的医药用途，也为诊断、检测、保护、治疗和研究抗CD20单克隆抗体提供了一种新的药物来源。

该药物组合物用于治疗B细胞诱导的恶性肿瘤、特别是非霍奇金淋巴瘤，可显著杀伤B淋巴瘤细胞，治疗效果显著，且毒副作用小，克服了现有的常用药物造成的副作用。本发明也为治疗和诊断B细胞诱导的恶性肿瘤提供了一种新的药物手段。

本发明的抗CD20单克隆抗体组合物药理作用较强，效果明显，同时本发明提供了一种新的哺乳动物细胞基因表达系统和细胞培养、蛋白纯化系统，产量高且特异性强，利于大批量产业化生产，更适于医药、试剂等工业和行业的大规模生产和商业应用；使用范围特别广，因此容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

总之，本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，为研究开发新的抗CD20产品提供了新的药物和制剂来源，对开发利用中国现有药物具有重要价值，是用于诊断、检测、保护、治疗和研究B细胞恶性肿瘤等方面的安全来源，对改进和提高现有的医疗水平具有重要价值。

本发明构建了独特的pMED高效哺乳动物细胞基因表达系统，在宿主细胞中引入了表达增强序列，通过渐增MTX的浓度可使在该系统中的目的蛋白基因大量扩增，目的蛋白在中试生产时获得最高达2g/L的表达量，该表达量处于行业领先水平。本发明还获得了一套悬浮细胞无血清培养驯化技术。

此外，本发明还提供了一种适合哺乳动物细胞（简称：CHO）悬浮培养的无蛋白无血清的CHO细胞培养基，该培养基是通过优化培养基中营养成分，筛选适合哺乳动物细胞生长的无血清培养基而，获得哺乳动物细胞进行悬浮培养的无血清培养基。所述培养基具有能使所培养CHO细胞进行高密度（可达9×10⁶/L）、高活力（在整个发酵周期内活细胞率都在95%以上）、目的蛋白大规模高表达（可达到3g/L），且细菌、热源、pH及效价检测均合格等一系列优点。通过向相关生产厂家推广，大量生产该培养基，可大幅降低培养基单价，较市售同类型培养基单价下降3倍左右，且该培养基生产成本低于100元人民币，而市售尽快CD无血清培养基均价在300元人民币左右，价格大大降低。换言之，本发明所述培养基可极大提高CHO细胞产生蛋白质药物例如单克隆抗体，促红细胞生成素、干扰素、胰岛素的能力，提高药物的得率，极大降低生产成本，用于肿瘤、自身免疫性疾病、肾衰、乙肝和丙肝、糖尿病的治疗。

本发明建立300L真核细胞大规模高表达生产工艺，蛋白表达量在1.2g/L以上；蛋白纯化得率提高至60%以上。该真核细胞蛋白表达量和纯化得率均处于行业领先水平。

本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗CD20单克隆抗体提供了一种新的药物来源和应用剂型，从而对现有的抗CD20产品系统特别是药物进行了改进、改善和提高，从而拓展了现有药物的应用。

本发明安全有效，实用性较强，价廉，方便快捷，其制备工艺简便、容易操作，使用简便、疗效显著，可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究各类B细胞诱导的恶性肿瘤及其直接相关疾病的治疗和预防。

本发明有针对性地研究抗CD20单克隆抗体，发现了一种新的抗CD20单克隆抗体，作出了意想不到的成绩；同时，本发明也有针对性地研究抗CD20单克隆抗体的活性，其药理作用较强，使用安全，最大限度地发挥了作用。本发明对抗CD20单克隆抗体拓展了新的医药用途，也为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗CD20单克隆抗体提供了一种新的药物来源。

该药物组合物用于治疗B细胞诱导的恶性肿瘤、特别是非霍奇金淋巴瘤，可明显改善B细胞引起的细胞凋亡，治疗效果显著，且毒副作用小，克服了现有的常用药物造成的副作用。本发明拓展了现有的毒蕈碱受体阻断剂新的医药用途，也为防治B细胞诱导的恶性肿瘤、特别是非霍奇金淋巴瘤提供了一种新的药物干预手段。

本发明的抗CD20单克隆抗体药理作用较强，效果明显，其原料来源丰富、价廉，性质稳定，制备工艺简单，质量控制简便，更适于医药、试剂等工业和行业的大规模生产和商业应用；使用范围特别广，因此容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

总之，本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，为研究开发新的抗CD20产品提供了新的药物和制剂来源，对开发利用中国现有药物具有重要价值，是用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究B细胞诱导的恶性肿瘤、特别是非霍奇金淋巴瘤等方面的安全原料，对改进和提高现有的医疗水平具有重要价值。

附图说明

图1-1表示H02诱导Daudi细胞抗体依赖的细胞毒作用（简称：ADCC）；

注：*与阴性对照组相比p<0.05;**与阴性对照组相比p≤0.01；▲与Rituximab组相比p＞0.05；

图1-2表示H02诱导Raji细胞抗体依赖的细胞毒作用（简称：ADCC）；

注：*与阴性对照组相比p<0.05;**与阴性对照组相比p≤0.01；▲与Rituximab组相比p＞0.05；

图2-1表示H02诱导Daudi细胞补体依赖的细胞毒作用（简称：CDC）；

注：*与阴性对照组相比p<0.05;**与阴性对照组相比p≤0.01；▲与Rituximab组相比p＞0.05；

图2-2表示H02诱导Raji细胞补体依赖的细胞毒作用（简称：CDC）；

注：*与阴性对照组相比p<0.05;**与阴性对照组相比p≤0.01；▲与Rituximab组相比p＞0.05；

图3-1表示H02诱导Daudi细胞凋亡作用；

注：*与阴性对照组相比p<0.05;**与阴性对照组相比p≤0.01；▲与美罗华相比p＞0.05；

图3-2表示H02诱导Raji细胞凋亡作用；

注：*与阴性对照组相比p<0.05;**与阴性对照组相比p≤0.01；▲与Rituximab组相比p＞0.05。

具体实施方式

本发明研究了现有的抗CD20单克隆抗体技术，提供了一种新的抗CD20产品的配方及其制备方法和用途，便于医疗、试剂等行业的安全使用。

本发明研究了现有的单克隆抗体技术，提供了一种新的抗CD20产品的细胞株及其制备方法和用途，同时提供了一种新的细胞基因表达系统及其制备方法和用途，且提供了一种新的细胞培养和蛋白纯化系统及其制备方法和用途，更提供了一种新的培养基及其制备方法和用途，便于医疗、试剂等行业的安全使用。

下面就抗CD20单克隆抗体的制备方法进行详细阐述。

（一）建立一个独特的高效哺乳动物细胞基因表达系统及用途

1、实验研究进展

目前许多科学工作者已经建立了多种诱导表达系统，但它们都有其优点和不足，这就需要发明人根据自己的要求选用适当的表达系统。一般来说，一个理想的可诱导表达系统需要符合下述几个方面的要求：

特异性：该系统不受其他内源因素的影响，仅能被外源的非毒性药物所活化。

非干扰性：该系统成分不能对细胞通路有干扰。

可诱导性：该系统在非活化状态下本底活性最低，而在活化状态下能快速产生高水平的基因表达。

诱导剂的生物利用率：调节分子能快速渗透人各组织，能通过胎盘屏障及血脑屏障。

可逆性：诱导剂能快速被各组织清除使该系统很快恢复非活化状态。

剂量依赖性：该系统的反应与诱导剂的浓度成正比，以便进行定性定量分析。

2、研究结果

发明人根据多年广泛且深入的研究，构建一个独特的高效哺乳动物细胞基因表达系统，并将该表达系统命名为pMED哺乳动物细胞基因表达系统。通过该表达系统进行目的蛋白的表达，在中试生产时最高可获得2g/L的表达量。

通过构建高效表达载体增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的细胞工程株是基因工程药物研究中不可缺少的一步，可以通过增强启动子增强目的基因的转录来增加目的基因的表达。发明人研究的重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白（rhTNFR:Fc），为等二聚体的融合蛋白分子，含有TNF-P75受体与人Ig G1的Fc片段，并且采用了谷氨酰胺台成酶(GS)扩增系统，在低水平的MSX选择压力下，目的融合蛋白的拷贝树大幅度的增加，拷贝树扩增至1000余倍。GS扩增基因是一种显性基因扩增选择标志基因，应用GS基因扩增系统常只需1-2轮蛋氨酸黄酰胺(MSX)加压筛选，即可获得高表达细胞株，扩增效率较高，另外，应用GS基因扩增系统可减少细胞产生的氨。所建立的高效表达载体大大增加了目的基因的拷贝数，处于行业领先水平。

外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种最有效途径就是基因扩增。氨甲喋呤（简称：MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶（简称：DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，DHFR基因均得以扩增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于DHFR基因本身，即与DHFR基因相邻的DNA区域同时被扩增，外源基因可大量扩增至几百个拷贝。

在表达载体上安装病毒或细胞来源的强启动子以及有效的翻译和调控元件，也是使外源基因高效表达的一种手段。

本发明通过上述两种机制构建了一套独特的人CMV强启动子和小鼠DHFR基因的高效哺乳动物细胞基因表达系统，利用DHFR对MTX的结合性作为筛选标记，进行基因工程抗体或抗体与细胞因子融合蛋白的表达。该表达系统最突出的优点是可通过渐增MTX浓度来使DHFR与抗体基因或融合蛋白基因拷贝数大大增加，因而使表达的蛋白大量增加。本发明通过该表达系统构建的抗体药物CD20等均获得了高效表达，在中试生产时蛋白表达量均达到了2g/L以上，本系统除了表达CD20抗体外，还用于其他单克隆抗体的高效表达，均获得了成功。

（二）建立一个悬浮细胞、无血清培养驯化体系

高密度悬浮细胞无血清培养是目前世界范围内各大生物公司产业化生产的发展方向，也是生物制药领域高度产业化的最有效的途径。微载体细胞培养法或玻璃珠床反应器法是目前普遍使用的工程细胞培养方法，但该发酵方法蛋白表达量比较低，也不利于工业化生产发酵体积的连续放大，因此具有更多技术和生产操作优势的悬浮细胞无血清培养是当前和未来所提倡的。与贴壁细胞微载体培养法或玻璃珠床反应器法相比，悬浮细胞无血清培养大大提高了细胞培养的优化空间和蛋白质产率，同时极大地简化了蛋白质纯化的难度和大幅度降低了蛋白质纯化成本。但是，悬浮细胞无血清培养的前期驯化工作非常复杂、技术难度大，更是目前中国生物制药企业非常薄弱的环节。

细胞株筛选的常用方法有：有限稀释法，软琼脂培养法，单细胞显微操作法，单细胞团显微操作法及荧光激活细胞分类仪（流式细胞仪）。目前，大多数实验室用的是有限稀释法，其操作简单，不需要昂贵的仪器，但工作量较大，所需时间长，流式细胞仪价格昂贵。

发明人所采用的筛选方法是软琼脂培养方法，既能大大缩短筛选周期，又能保证所筛选细胞为单个细胞克隆，且不需要高档仪器。在动物细胞培养中稳定细胞株的筛选是一个繁重的工作，发明人在很短时间内就筛选到了稳定表达融合蛋白的细胞株，具有此方面的技术优势。本发明通过几年的艰苦工作，建立了一个悬浮细胞无血清培养的驯化体系，通过该驯化体系，发明人获得了一个中国仓鼠卵巢细胞（简称：CHO）悬浮细胞无血清培养工作细胞株DG-HK，该细胞具有良好的悬浮培养和高密度无血清培养的特性。

本发明通过CHO细胞利用无血清悬浮培养技术获得了CD20的高效表达（蛋白表达量达到3g/L），发明人通过MY20项目悬浮细胞无血清培养的成功经验，将该技术成功推广至其他抗体等生物技术药物，以此带动中国生物制药业的快速发展。

（三）建立适合哺乳动物细胞悬浮培养的无血清培养基及用途

如上述的无血清培养基的研究方向，发明人根据研发和生产经验，设计了适合大生产、成本低、低毒、细胞培养密度大、活力高、蛋白高表达及易纯化的无血清培养基的基本原则，并得到初步的实验结果和制备方法。

1、无血清培养基设计原则

在细胞生物学研究和生产实践中，设计合适的培养基是一项最基本，也是最重要的工作。所涉及到的工作不仅仅是选用适合细胞生长的培养基，而且还能根据细胞特点需要设计针对性的培养基，这对于细胞培养工作者来说，除了对细胞的营养和代谢条件有一定的认识，还要有科学的设计细胞培养基所应遵循的基本原则和设计理念。无血清培养基的设计一般遵循以下四个原则：

（1）设计无血清培养基前，明确配制该培养基的目的及培养对象。如要培养的细胞是贴壁依赖性细胞还是悬浮细胞，是要收集细胞的培养上清还是要收集细胞，是用于科研还是用于规模化培养。

（2）无血清培养基适用范围较窄。在无血清培养环境中，除去一种关键营养物，如一种氨基酸、维生素或矿物质，将会极大地抑制细胞的活性。已有实验定性地证明各种类型的细胞需要相同的营养物，但在数量上有显著的差异。针对细胞及表达产品的特性培养基的设计也是一种必然要求。

（3）无血清培养基的设计应同时注重细胞增殖速率、细胞密度、细胞活力及目的产物的产率，用这些指标来综合评估培养基的优劣。

（4）无血清培养基对于细胞所生长微环境的调控能力，内源性调节与外源性调节应符合细胞在体外生长的最适条件，尽可能在经济节约的范畴内满足细胞生长的需求。

2、无血清培养基设计方法

文献报道的细胞培养基设计大多是在商业化合成培养基的基础上，对某些可能适用的培养基添加组分进行筛选、优化。这种限定了组分类型及数量的模式可定义为“封闭式策略”（closed strategy）。这种模式最大的不足是有许多可能在培养基中有活性作用的组分并没有得到候选优化，所选用的培养基添加组分优化资源相当有限，它是以研究人员所选定的优化组分保证很恰当的前提下的一种设计模式。另一种相对应的设计模式是“开放式策略”（openstrategy）（Kennedy M，Krouse D。Strategies for improving fermentation medium performance：a review.Journal of Industrial Microbiology＆Biotechnology，1999，23(6)：456～475），其设计目的是确定培养基的添加组分。这种模式与“开放式策略”模式相比较，显得更复杂、实施更困难，主要原因是要耗费大量的时间、精力、财力来完成。其优点是并不界定哪一个添加组分是最好的。

由于“开放式策略”模式是一种比较耗时的方法，研究人员大多选择“封闭式策略”模式的方法。数学统计学方法是“封闭式策略”模式中常用的方法，具体的应用是培养基设计方法与组分优化。这种模式主要基于研究人员对细胞的代谢及添加组分认识非常充分，研究人员可以分配更多的精力用于培养基组分的优化组合及用量调整，这一点也适用于开发无血清培养基和基础培养基的混和配比。整个培养基的实验设计中所涉及到的因素多达几十种，如何对其合理考察，如何调整因素之间的交互作用，这些都需要用统计学的设计方法来解决。实验设计是一种同时考察多个输入因素对输出结果的影响，合理设计实验方案，并进行准确的结果统计分析的步骤（李峰青．部分实验设计方法的计算机实现．硕士学位论文．北京：军事医学科学院，2003．8～16）。通常用三个阶段来划分实验设计过程：筛选、优化、验证。

筛选实验常用设计方法有：析因设计、分式析因设计、正交设计、均匀设计、混料设计、中心组合设计、Plaekett—Burman设计等。下面对常用的几种设计方法作一介绍。

析因设计是对全部因素的各个水平进行完全组合，对每种组合至少做两次独立重复实验。析因设计可以分析因素和因素之间的各级交互作用的效应大小。其前提条件是培养基中考察因素较少时，且每个因素的水平分布不多，可认为析因设计是一理想的实验设计方法。Chun（Chun C，Heineken K，Szeto D，et a1.Application of factorial design to accelerate identificationofCHO growth factor requirements.Bioteehnol Prog，2003，19(1)：52-57）等运用析因设计方法对CHO细胞培养基中生长因子进行确定，设计了适于自行配制的无血清培养基，并把细胞的无血清培养驯化也结合到析因设计中。

分式析因设计是对析因设计方法的精简，它能合理地假定某些高阶交互作用被忽略。分式析因设计可用于筛选实验，在众多的因素中识别出对结果有较大响应的因素。Sandadi（Sandadi S，Ensari S，Kearns B.Application of fractional factorial designs to Screen active factorsfor antibody production by Chinese hamster ovary eels.Biotechnol Prog，2006，22(2)：595-600）等运用分式析因设计方法筛选了CHO细胞生产单克隆抗体的培养基组分，并结合响应曲面法优化了培养基的组分用量，研究过程证明分式析因设计是一种重要的筛选活性添加组分的工具，并能与响应曲面法结合起来共同加快培养基的设计与优化。

正交设计是使用一套规范化的正交表来研究与处理多因素、多水平的实验，并用普通的统计分析方法来分析实验结果的科学方法。它是一种多因素、多水平、高效、经济的实验方法。其主要特点是合理安排、实验次数少，得出的数据经统计分析处理，也能够提供较多的信息。

Plackett—Burman设计是一种两水平的实验设计方法，它可以利用最少的实验次数，从众多的考察因素中快速有效地筛选出主要的影响因子，故而被广泛地用于因子主效应的估计中。Castro等（Castro PML，Hayter PM，Isen A P，et a1.Application of a statistical design tothe optimization of culture medium for recombinant interferon—gamma production by Chinesehamster ovary cells．Appl Microbial Biotechnol，1992，38(1)：84-90）在实验中通过本方法考察了20个培养基添加组分，仅运用了24次实验就获得了的提高干扰素产量的效果。

优化实验常用设计方法有：响应曲面法（response sufface methodology）、最速上升法（steepest ascent）、调优设计（evolutionary operation）、典型分析（canonical analysis）、多元线性回归、高斯一塞德尔迭代法（Gauss.Seidel iterative method）、修正Rosenbrock法（modifiedrosenbrock）、Nelder.Mead单纯形法等。优化实验设计是通过系统的统计学方法及数学工具来确定筛选出来的因素添加水平。其中最具有代表性的响应曲面法是统计分析法与数学方法相结合的产物，用来对感兴趣的响应受多个因素影响的问题进行分析，其目的是为了优化响应。上述几种优化实验设计方法通常是根据数据收集的模式来进行相应的选择，相对应的数学方法也是多项函数式，如果没有商业化的计算机软件包来辅助完成分析，非数学专业的实验人员来完成这样的分析比较困难，所以对于优化实验数据的分析多采用计算机软件包辅助的方式来完成分析。

验证实验常用方法主要是：对比实验法。验证实验主要是通过与现有常用或商业供应的无血清培养基进行动物细胞培养效果比较，并且对比不同实验室及不同细胞克隆的培养效果。对比实验一般选择与设计实验条件相近的方法来进行，应尽量遵循合理、适用的原则。

3、CHO细胞无血清无蛋白培养基设计技术构思及实验方法

发明人经过多年广泛而深入的研究，设计筛选所述的培养基中各补充因子的组分和含量，发现了在CHO细胞的无血清无蛋白培养基中，从而使得培养效果相当于或优于有血清培养基，在此基础上完成了本发明。

该培养基上清用于培养基因工程CHO细胞，CHO细胞在体外经过基因工程改造之后，可以插入表达目地蛋白质药物的基因，产生目的价格昂贵的蛋白质药物例如单克隆抗体，促红细胞生成素、干扰素、胰岛素等等。CHO细胞的生长需要我们提供的细胞培养基上清才能维持，该细胞培养基上清为保密配方，可以极大提高CHO细胞产生蛋白质药物例如单克隆抗体，促红细胞生成素、干扰素、胰岛素的能力，提高药物的得率，极大降低生产成本，用于肿瘤、自身免疫性疾病、肾衰、乙肝和丙肝、糖尿病的治疗。

其制造流程为：

称取所有成分→溶解于10升纯水中→搅拌溶解→无菌过滤→即为成品细胞培养基。

其主要检测指标：

（1）无菌：合格；  （2）无热源：合格；

（3）pH：6.5；     （4）效价：合格（提供CHO细胞的生长需要的营养成分）；

在本发明有关培养基部分中，提供了一种用于CHO细胞的培养基，所述的培养基是由基础培养基和补充因子构成；

本发明所述的补充因子，又称添加组分或添加物，是无血清培养基中用于代替血清的各种因子的总称；所述的补充因子还含有选自包含但不限于微量元素。

所述的补充因子由无机盐类、氨基酸、维生素、其他物质组成，其含量分别为0.001~0.9%、0.001~0.035%、0.001~0.06%、0.001~0.4%；

所述的无机盐类是包括无水氯化钙、七水硫酸亚铁、氯化钾、氯化镁、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或七水硫酸锌等中的一种或多种；

所述的氨基酸是包括L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-缬氨酸等中的一种或多种；

所述的维生素是包括硫辛酸、维生素H、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺或维生素B₁₂等中的一种或多种；

所述的其他物质是包括D-葡萄糖、次黄嘌呤、酚红或胸苷等中的一种或多种；

在本发明关于培养基部分的第二方面，提供了本发明所述的培养基的用途，其可用于培养中国仓鼠卵巢细胞（或简称：CHO细胞）。

在本发明关于培养基部分的第三方面，还提供了一种培养CHO细胞的方法，具体步骤包括：在本发明所述的无血清培养基中接种CHO细胞，然后在适合生长的条件下（如37±2℃，5±1%二氧化碳）培养CHO细胞一段时间（如1-3周）。下面通过具体的优选例对此进行详细阐述。

在另一优选例中，所述的补充因子含有以下的无机盐类：

表2、补充因子含无机盐类

成分	含量比例
		无水氯化钙	0.00166%
七水硫酸亚铁	0.000417%
		氯化钾	0.06118%
氯化镁	0.002864%
		无水硫酸镁	0.004884%
氯化钠	0.6999%
		无水磷酸二氢钠	0.005435%
磷酸氢二钠	0.0021%
		七水硫酸锌	0.000432%

在另一优选例中，所述的补充因子含有以下氨基酸：

表3、补充因子含氨基酸

成分	含量比例
		L-精氨酸盐酸盐	0.02475%
L-胱氨酸盐酸盐	0.004129%
		L-谷氨酰胺	0.0565%
甘氨酸	0.003875%
		L-组氨酸盐酸盐	0.004148%
L-异亮氨酸	0.007447%
		L-亮氨酸	0.006905%
L-赖氨酸盐酸盐	0.003125%
		L-蛋氨酸	0.003724
L-苯丙氨酸	0.0055%
		L-丝氨酸	0.0036%
L-苏氨酸	0.0043%
		L-丙氨酸	0.0006%
L-天门冬酰胺	0.0009%
		L-天门冬氨酸	0.0005%
L-半胱氨酸盐酸盐	0.0037%
		L-谷氨酸	0.0001%
L-脯氨酸	0.007%
		L-色氨酸	0.009%
L-酪氨酸	0.0018%
		L-缬氨酸	0.002%

在另一优选例中，所述的添加物含有以下其他物质：

表4、补充因子含其他物质

成分	含量比例
		D-葡萄糖	0.3951%
次黄嘌呤	0.0002%
		酚红	0.000181%
胸苷	0.0000365%

在另一优选例中，所述的补充因子含有以下维生素：

表5、补充因子含维生素

成分	含量比例
		硫辛酸	0.000105%
维生素H	0.000035%
		D-泛酸钙	0.000624%
氯化胆碱	0.000298%
		叶酸	0.000165%
i-肌醇	0.00226%
		烟酰胺	0.00202%
盐酸吡哆醛	0.0008%
		盐酸吡哆醇	0.000021%
核黄素	0.000219%
		盐酸硫胺	0.000817%
维生素B12	0.0068%

该培养基上清用于培养基因工程CHO细胞，CHO细胞在体外经过基因工程改造之后，可以插入表达目地蛋白质药物的基因，产生目的价格昂贵的蛋白质药物例如单克隆抗体，促红细胞生成素、干扰素、胰岛素等等。CHO细胞的生长需要发明人提供的细胞培养基上清才能维持。该培养基具有成本低、细胞培养密度大、活力高、蛋白高表达及易纯化等优势。

无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响，同时可以降低细胞培养液的成本，提高生物制品成品率和利润率。

发明人在细胞的无血清培养上采取了逐步适应的办法，如哺乳动物CHO细胞，在早期培养阶段，细胞对于无血清培养基的适应性往往是克隆特异性的，每个新的克隆常需要重新配制培养基和适应过程。先使野生型宿主CHO细胞适应无血清培养基培养，然后转染这些细胞得到的重组克隆，在基因扩增后保持了在无血清培养基悬浮培养中的生长能力，其产品在生化和结构上类似于未处理的宿主细胞产物。在动物细胞大规模培养中具有丰富的下游技术。

通过优化培养基中营养成分，筛选适合哺乳动物细胞生长的无血清培养基，获得哺乳动物细胞进行悬浮培养的无血清培养基T34配方。T34培养基具有能使所培养CHO细胞进行高密度（可达9x106/L）、大规模高表达（可达到3g/L）等一系列优点。通过向培养基生产厂家订制，大量生产该培养基，可大幅降低培养基单价至80~100元/升，较市售同类型培养基单价下降3倍左右。

（四）建立哺乳动物细胞大规模培养及蛋白纯化体系

发明人在利用动物细胞表达系统表达产品这一生物制药新工艺技术领域具有独特的优势：上游技术和下游技术趋于成熟。尤其是生物药物领域的重磅级炸弹药物——抗体药物人重组肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达水平连续培养已经达到400mg/L，流加培养已经800mg/L，处于行业领先水平。发明人还进行了单克隆抗体等通过哺乳动物细胞表达产品的研究开发，已进入小试阶段。

发明人的合作单位具有完成上述研究的所需的仪器设备，包括全自动PCR扩增仪、细胞培养罐（B.Braun）、蛋白纯化设备、自动化酶联免疫测定仪、高效液相色谱仪、100级生物安全柜、二氧化碳孵箱、倒置显微镜和荧光显微镜、大容量低温高速离心机、超速离心机、超低温冰箱、电泳仪、全自动核酸杂交装置等设备。合作单位与中科院、复旦大学、上海交通大学、同济大学等多家高等院校及科研机构保持密切联系，可以不断获得最新技术支持。

发明人采用B.Braun D500发酵罐，建立300L以上哺乳动物细胞大规模培养体系，通过控制发酵参数、低温诱导、抑制凋亡等手段使细胞得到长时间高效表达，蛋白表达量最高达到2g/L以上。发明人通过法玛西亚（Pharmacia）纯化系统，采用两步纯化法，将目的蛋白纯化得率大幅提高至60%左右，而目前中国蛋白纯化得率一般在40%左右。

完成3批300升规模的试生产，进行了临床前有效性和安全性评价（药效学、药代动力学、毒理学等动物试验）。

发明人前期研制的一类新生物制品碘[¹³¹I]肿瘤细胞核人鼠前和单抗注射液已经经过中国国家SFDA的批准上市用于晚期肺癌的治疗。山东新时代药业有限公司研发的肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白已经完成临床研究申报生产。发明人前期研究的淋巴瘤单抗lym-1已经获得临床研究批文，发明人研制的EPO抗体Fc融合蛋白也获得了临床批文。

下面以人鼠嵌合CD20单抗H02注射液为例，就H02对B淋巴瘤细胞杀伤作用的体外药效学研究进行详细阐述。

CD20嵌合单克隆抗体在体外通过抗体依赖的细胞毒作用（简称：ADCC）、补体依赖的细胞毒作用(简称：CDC)和直接诱导细胞凋亡三种可能的机制（①Reff ME,Carner K,ChambersKSet al.Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20.Blood1994;83:435；②Maloney DG， Smith B,Appelbaum FR.The anti-tumor effect ofmonoclonal anti-CD20antibody(mAb)therapy includes direct antiproliferative activity andinduction of apoptosis in CD20positive non-Hodgkin’slymphoma(NHL)cell lines.Blood1996;88(Suppl1):637）显著杀伤B淋巴瘤细胞。本试验采用Raji人B淋巴瘤细胞和Daudi人B淋巴瘤细胞为靶细胞，Raji细胞和Daudi细胞分别与嵌合单克隆抗体H02作用1小时后，加适量人外周血单个核细胞（简称：PBMC）（效靶比25：1）继续孵育5小时，用细胞毒检测试剂盒检测抗体依赖的细胞毒作用（简称：ADCC）；Raji细胞和Daudi细胞分别与H02作用1小时后，加适量正常人血清（10%V/V）继续孵育5小时，用细胞毒检测试剂盒检测补体依赖的细胞毒作用（简称：CDC）；Raji细胞和Daudi细胞分别与嵌合单克隆抗体H02作用16小时后，用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡（①L.Wu et al.,Characterizationof a humanized anti-CD20antibody with potent antitumor activity against B-cell lymphoma.CancerLett.2010；②D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，L.A.莱因万德著，黄培堂等译《细胞试验指南》，科学出版社，2001年；③魏伟，吴希美，李元建主编，《药理实验方法学》，（第四版），人民卫生出版社，2010年7月）。上述试验均以美罗华(利妥昔单抗,Rituximab)作为阳性对照药。本研究结果表明，与阴性对照组相比，低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度（2μg/ml）的CD20嵌合单克隆抗体H02在体外均能通过ADCC、CDC和诱导细胞凋亡三种机制显著杀伤B淋巴瘤细胞,与同浓度的美罗华相比无显著性差异。

（一）前言

肿瘤的死亡率在全世界各种疾病的死亡率居榜首，恶性肿瘤已经成为严重影响人类健康和生命的杀手。非霍奇金淋巴瘤（ＮＨＬ）是常见恶性血液病之一，由B淋巴细胞恶性增长引起。近年来,NHL发病率逐渐攀升,严重危害着人类健康。目前抗CD20单克隆抗体是治疗B淋巴瘤的最有效的治疗药物,在治疗NHL中有极其重要的地位。CD20是B淋巴细胞非糖基化四重跨膜磷蛋白，对B淋巴细胞的分化增殖具有调节作用。CD20仅表达于B淋巴细胞表面，而在其他组织以及多能B淋巴干细胞均不表达，CD20从前-B淋巴细胞阶段开始表达，直到浆细胞阶段才无CD20表达（Stashenko p.，Nsdler LM，Hardy R，et al.Characterization ofahuman B lymphocyte-specific antigen.J.Immun.1980；125：1678-1685）。CD20和抗CD20抗体结合后不发生内吞作用，因而细胞表面CD20数量并不因为抗体的结合而减少，在人体血清中无游离的CD20存在。CD20抗原高表达于超过95%的正常或恶化的B淋巴瘤细胞，没有显著内吞和脱落（Press OW，Farr AG，Borroz KI et al.Endocytosis and Degradation ofMonoclonal Antibodies Targeting Human B-Cell Malignancies.Cancer Res1989；49：4906-4912），因此CD20是治疗B淋巴细胞瘤的理想靶点。目前，经FDA批准上市用于治疗NHL的CD20单抗有Rituximab、Zevalin、Bexxar等，但这些药物治疗费用较高，致使我国很多患者难以接受治疗。因此，研究疗效好、治疗成本低的药物对提高NHL患者的生活质量具有重大意义。H02是上海瀚康生物医药科技有限公司自行研制的仿制美罗华的人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体，该公司成功构建了pMED哺乳动物细胞基因表达系统，通过自行研制的无血清培养基和特有的哺乳动物细胞大规模培养技术，该公司获得了CD20抗体的高效表达，蛋白表达量最高达到了2g/L，处于国内领先水平。H02作为治疗性抗CD20嵌合单克隆抗体具有治疗效果好、治疗成本达到降低等优点，为中国NHL患者带来了新的曙光。

本试验研究体外H02通过ADCC,CDC和诱导凋亡三种机制对B淋巴瘤细胞杀伤作用的药效学。

（二）抗体依赖的细胞毒性试验

试验目的

观察H02能否诱导Raji细胞和Daudi细胞的抗体依赖的细胞毒作用（简称：ADCC）。

材料与方法

1、材料

1.1细胞及培养液

Raji细胞：购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；

Daudi细胞：购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；

人外周血单个核细胞（PBMC）：购于上海市血液中心；

细胞培养液：含PRMI1640无酚红细胞培养液，10%胎牛血清

1.2受试药品及检测试剂盒

名称：H02

单位：上海瀚康生物医药科技有限公司

浓度：10mg/ml

规格：0.5ml/支

名称：利妥昔单抗注射液

单位：上海罗氏药业有限公司

浓度：10mg/ml

规格：100μl/支

名称：CytoTox

非放射性细胞毒性检测

单位：普洛麦格（北京）生物技术有限公司

2．试验方法

用新配制的PBS将H02配制成浓度分别为0.8、4、20μg/ml的溶液，利妥昔单抗注射液配制成浓度为20μg/ml的溶液待用。细胞计数Raji=5.1×10⁵个/ml，Daudi=4.9×10⁵个/ml,PBMC=1×10⁸个/ml。

将细胞充分悬匀，按每孔800μl将Raji或Daudi细胞悬液种于12孔培养板中，在37℃、含5%二氧化碳的培养箱里孵育。

表6、分组设置2-1

	药物浓度（μg/ml）	试验体系设置
			阴性对照组	0	800μl细胞+100μlPBS+100μlPBMC
H02低剂量组	0.08	800μl细胞+100μlH02+100μlPBMC
			H02中剂量组	0.4	800μl细胞+100μlH02+100μlPBMC
H02高剂量组	2	800μl细胞+100μlH02+100μlPBMC
			阳性药对照组（美罗华）	2	800μl细胞+100μl美罗华+100μl PBMC
细胞自发释放LDH组	0	800μl细胞+200μlPBS
			细胞最大释放LDH组	0	800μl细胞+100μlPBS+100μl裂解液

按上表所示，在每孔含有800μl细胞悬液的12孔板各孔加入相应浓度的H02或美罗华或等体积PBS，每组设三个复孔。将细胞放入培养箱内孵育1小时，再向各相应孔中加入PBMC（效靶比：25:1）或等体积PBS,继续孵育5小时后处理样品。处理样品前45分钟向细胞最大释放LDH组每孔加入100μl试剂盒配备的裂解液。处理样品时每孔取1ml置于1.5mlEP管里1000转离心5分钟，取50μl上清于96孔细胞培养板中，按照CytoTox非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书，每孔加入配好的底物混合物50μl，避光30分钟，再向每孔中加入50μl终止液，随即用酶标仪在470nm处测OD值。

细胞毒性计算公式：

杀伤活性%=100×(试验孔OD值-细胞自发释放LDH组OD值)/(细胞最大释放LDH组OD值-细胞自发释放LDH组OD值）

3、统计分析

统计学检验用t检验，p<0.05为有显著性差异，p≤0.01为有非常显著差异，p>0.05为无显著性差异。

试验结果

1、Daudi细胞ADCC试验结果:

如图1-1所示,与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Daudi细胞的抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）(P<0.01)；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Daudi细胞的ADCC作用无显著性差异(P>0.05)。

2、Raji细胞ADCC实验结果：

如图1-2所示,与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Raji细胞的抗体依赖的细胞毒作用（简称：ADCC）(H02低浓度时,P<0.05,H02中浓度和高浓度时P<0.01)；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Raji细胞的ADCC作用无显著性差异(P>0.05)。

（三）补体依赖的细胞毒性试验

试验目的

观察H02能否介导Raji细胞和Daudi细胞的补体依赖的细胞毒作用（简称：CDC）。

材料与方法

1、材料

1.1细胞及培养液

Raji细胞：购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；

Daudi细胞：购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；

细胞培养液：含

PRMI1640无酚红细胞培养液，10%胎牛血清

1.2受试药品及检测试剂盒

名称：H02

单位：上海瀚康生物医药科技有限公司

浓度：10mg/ml

规格：0.5ml/支

名称：利妥昔单抗注射液

单位：上海罗氏药业有限公司

浓度：10mg/ml

规格：100μl/支

名称：CytoTox

非放射性细胞毒性检测

单位：普洛麦格（北京）生物技术有限公司

2、试验方法

用新配制的PBS将H02配制成浓度分别为0.8、4、20μg/ml的溶液，利妥昔单抗注射液配制成浓度为20μg/ml的溶液待用。细胞计数Raji=4.5×10⁵个/ml，Daudi=5.3×10⁵个/ml。

将细胞充分悬匀，按每孔800μl将Raji或Daudi细胞悬液种于12孔培养板中，在37℃、含5%二氧化碳的培养箱里孵育。

表7、分组设置3-1

	药物浓度（μg/ml）	试验体系设置
			阴性对照组	0	800μl细胞+100μlPBS+100μl补体
H02低剂量组	0.08	800μl细胞+100μlH02+100μl补体
			H02中剂量组	0.4	800μl细胞+100μlH02+100μl补体
H02高剂量组	2	800μl细胞+100μlH02+100μl补体
			阳性药组（美罗华）	2	800μl细胞+100μl美罗华+100μl补体
细胞自发释放LDH组	0	800μl细胞+200μlPBS
			细胞最大释放LDH组	0	800μl细胞+100μlPBS+100μl裂解液

按上表所示，在每孔含有800μl细胞悬液的12孔板各孔加入相应浓度的HO2或美罗华或等体积PBS，每组设三个复孔。将细胞放入培养箱内孵育1小时，再向各相应孔中加入补体或等体积PBS,继续孵育5小时后处理样品。处理样品前45分钟向细胞最大释放LDH组每孔加入100μl试剂盒配备的裂解液，继续孵育。处理样品时，从每孔取1ml置于1.5mlEP管里1000转离心5分钟，取50μl上清于96孔板中，按照CytoTox

非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书，每孔加入配好的底物混合物50μl，避光30分钟，再向每孔加入50μl终止液，随即用酶标仪在470nm处测OD值。

细胞毒性计算公式：

杀伤活性%=100×(试验孔OD值-细胞自发释放LDH组OD值)/（细胞最大释放LDH组OD值-细胞自发释放LDH组OD值）。

3、统计分析

统计学检验用t检验，p<0.05为有显著性差异，p≤0.01为有非常显著差异，p>0.05为无显著性差异。

试验结果

1、Daudi细胞CDC试验结果：

如图2-1所示,与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Daudi细胞的补体依赖的细胞毒作用（CDC）(P<0.01)；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Daudi细胞的CDC作用无显著性差异(P>0.05)。

2、Raji细胞CDC实验结果：

如图2-2所示,与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Raji细胞的补体依赖的细胞毒作用（CDC）(P<0.01)；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Raji细胞的CDC作用无显著性差异(P>0.05)。

（四）细胞凋亡试验

试验目的

观察CD20单抗H02能否显著诱导B淋巴瘤细胞凋亡。

材料与方法

1、材料

1.1细胞及培养液

Raji细胞：购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；

Daudi细胞：购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；

细胞培养液：含PRMI1640细胞培养液，10%胎牛血清

1.2受试药品及检测试剂盒

名称：H02

单位：上海瀚康生物医药科技有限公司

浓度：10mg/ml

规格：0.5ml/支

名称：利妥昔单抗注射液

单位：上海罗氏药业有限公司

浓度：10mg/ml

规格：100μl/支

名称：Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒

单位：碧云天生物技术研究所

产品编号：C1063

2、试验方法

用新配制的PBS将H02配制成浓度分别为0.8、4、20μg/ml的药液，利妥昔单抗注射液配制成浓度为20μg/ml的溶液待用。细胞计数Raji=5.9×10⁵个/ml，Daudi=6.2×10⁵个/ml。

表8、分组设置4-1

	药物浓度（μg/ml）	试验体系设置
			阴性对照组	0	900μl细胞+100μlPBS
H02低剂量组	0.08	900μl细胞+100μl H02
			H02中剂量组	0.4	900μl细胞+100μl H02
H02高剂量组	2	900μl细胞+100μl H02
			阳性药组（美罗华）	2	900μl细胞+100μl美罗华

将细胞充分悬匀，按每孔900μl将Raji或Daudi细胞悬液种于12孔培养板中，在37℃、含5%二氧化碳的培养箱里孵育。

按上表所示，在每孔含有900μl细胞悬液的12孔板各孔加入相应浓度的HO2或美罗华或等体积PBS，每组设三个复孔。在培养箱里孵育16小时后处理样品。处理样品时，每孔取1ml置于1.5mlEP管里1000转离心5分钟，弃上清，加1mlPBS轻轻重悬细胞，1000转离心5分钟，弃上清，按照AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书，加入195μlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5μlAnnexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光10分钟，1000转离心5分钟，弃上清，加入190μlAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，随即进行流式细胞仪检测，早期凋亡率和晚期凋亡率之和计为细胞凋亡率。

3.统计分析

统计学检验用t检验，p<0.05为有显著性差异，p≤0.01为有非常显著差异，p>0.05为无显著性差异。

试验结果

1、Daudi细胞凋亡试验结果：

如图3-1所示,与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Daudi细胞凋亡(H02低浓度和中浓度时，P<0.05；H02高浓度和美罗华，P<0.01)；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Daudi细胞凋亡作用无显著性差异(P>0.05)。

2、Raji细胞凋亡实验结果：

如图3-2所示,与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Raji细胞凋亡(H02低浓度、高浓度和美罗华时，P<0.01；H02中浓度，P<0.05)；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Raji细胞凋亡作用无显著性差异(P>0.05)。

试验结论

通过ADCC、CDC及细胞凋亡试验，得出以下结论：人鼠嵌合单克隆抗体H02在体外低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度（2μg/ml）和美罗华高浓度（2μg/ml）均能显著诱导Raji人B淋巴瘤细胞和Daudi人B淋巴瘤细胞发生抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）以及细胞凋亡，从而显著杀伤B淋巴瘤细胞；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Raji人B淋巴瘤细胞和Daudi人B淋巴瘤细胞ADCC、CDC和凋亡的作用无显著性差异。

抗CD20单克隆抗体及其组合物的常用药物制剂的制备方法。

本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取抗CD20单克隆抗体，加入赋形剂，加水溶解，调节pH，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷、白蛋白、pH调节剂等中的一种或几种。每瓶含抗CD20单克隆抗体0.1~4mg。

本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取抗CD20单克隆抗体，加或不加赋形剂（赋形剂同上），加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。每瓶含抗CD20单克隆抗体0.1~4mg。

本发明制备小针剂时，以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH调节剂、表面活性剂、环糊精、抗氧剂、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。注射剂可以配制成溶液、微乳液、乳液、脂质体、微球、微囊或其它适合于高药物浓度的有序结构，其中可包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐、明胶、乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等，以达到注射组合物的延长吸收。每支含抗CD20单克隆抗体0.1~4mg。

本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液，以注射用水作为溶媒，加入适量葡萄糖或氯化钠配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH调节剂、表面活性剂、抗氧剂、环糊精、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。每瓶含抗CD20单克隆抗体0.1~4mg。

本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂，辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等，按常规技术制备。可包括高分子聚合物载体，如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯等，以达到口服组合物的延长释放。

现就本发明抗CD20单克隆抗体的作用，具体阐述如下：

本发明所涉及的实施例中各药物组合物以腹腔注射形式施加于需要这种治疗的C57BL/6小鼠。施加给需要治疗的C57BL/6小鼠的一般剂量为M胆碱受体阻断剂为0.1~25mg/kg，胆碱脂酶抑制剂为0.2~8mg/kg；优选的剂量M胆碱受体阻断剂为0.2~6.25mg/kg，胆碱脂酶抑制剂为0.4~1mg/kg；进一步优选的剂量为阿托品0.2mg/kg，新斯的明0.4mg/kg。

本发明最终需要制备成抗CD20产品进行应用，下面将列举实施例进行进一步说明。如有问题，可以与发明人直接联系15900897066。上述提供的一些实验数据以及下列实施例中按前述发明内容给出几种一些具体试验研究内容，但应该理解本发明并不仅限于此处所列出的研究内容，还应该理解此处所使用的术语仅用于描述特定的实施例，而并不是对本发明的限定。

在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。

下面通过实施例对本发明作详细描述。

以下实施例的实验中所用到的动物、仪器设备、试剂及其配制等均是来自上述的描述或符合上述的要求。

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如Smabrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例的有关说明

1、主要仪器

微型计算机（联想天麟11106C/1.2G）

石蜡、冰冻两用切片机（德国Lecia公司）

灌注三通管（法国Plastimed公司）

PE10（内径0.30mm，外径0.50mm）（法国Biotrol公司）

PE50（内径0.58mm，外径0.96mm）（法国Biotrol公司）

1ml注射器（BD公司）

JA2003电子天平（上海天平仪器厂）

匀浆机（宁波新芝仪器有限公司）

摇床（上海申能博彩生物公司）

移液器（Eppendorf公司）

烘片机HI1220型（德国Leica公司）

光学显微镜（德国Leica公司）

多道细胞收集器（上海医用仪器厂）

蛋白电泳仪Bio-Rad公司（Bio-Rad公司）

蛋白转膜仪（Bio-Rad公司）

酶标分析仪（芬兰Labsystems Dragon公司）

超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）

倒置相差显微镜（日本Olympus公司）

恒温水浴摇床（上海精宏仪器厂）

低温高速台式离心机5417R（Eppendorf公司）

MP3蛋白电泳槽（Bio-Rad公司）

PowerRasic电泳仪（Bio-Rad公司）

Scotsman制冰机（Fisher公司）

图像分析系统（上海天能科技有限公司）

UV-2802紫外分光光度计（UNICO公司）

荧光显微镜（日本Olympus公司）

Odyssey远红外线影像分析仪（美国LI-COR公司）

MLS-3020高压蒸汽消毒锅（日本三洋电器公司）

6孔板，96孔板（美国Costar公司）

JEM-2000EX透射电镜（JEOL公司）

2、主要试剂及其来源

哺乳动物细胞表达载体pDE上海同济大学生命科学院

中国仓鼠卵巢细胞DG44（Chinese hamster ovary cell DG44，CHO DG44），由上海交通大学生命科学院惠赠；

CD DG44培养基（Cat.NO.12610-010，Invitrogen）

Axygen公司AxiPrep Plasmid Maxiprep Kit

Raji细胞中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；

Daudi细胞中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；

人外周血单个核细胞（PBMC）上海市血液中心；

细胞培养液含

PRMI1640无酚红细胞培养液，10%胎牛血清

H02上海瀚康生物医药科技有限公司（浓度：10mg/ml；规格：0.5ml/支）

利妥昔单抗注射液上海罗氏药业有限公司（浓度：10mg/ml；规格：100μl/支）

非放射性细胞毒性检测普洛麦格（北京）生物技术有限公司

AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒碧云天生物技术研究所（产品编号：C1063）

3、主要试剂的配制

蛋白表达量检测所需试剂

①蛋白提取裂解液

A.体外培养细胞蛋白提取裂解液

2×SDS凝胶加样缓冲液（100mM Tris·Cl(pH6.8），200mM DTT，4.0%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油）。

B.动物组织蛋白提取裂解液

20mM HEPES，420mM NaCl，1.5mM MgCl₂，1mM DTT，1mM PMSF，0.5mM EDTA。

②4×上样缓冲液

1M Tris-HCl（pH6.8）5ml，SDS0.8g，甘油2ml，溴酚兰0.0012g，β-巯基乙醇0.4ml，去离子水定容至10ml。

③1.5M Tris-HCl（pH8.8）

称取Tris18.671g，溶于100ml蒸馏水中，用浓盐酸调pH值至8.8。

④1M Tris-HCl（pH6.8）

称取Tris12.114g，溶于100ml蒸馏水中，用浓盐酸调pH值至6.8。

⑤10%过硫酸铵（简称：AP）

过硫酸铵粉0.1g，蒸馏水定容至1ml，4℃保存。

⑥5×电泳缓冲液

Tris碱15.1g，甘氨酸94g，10%SDS50ml，蒸馏水定容至1000ml。用时取200ml，蒸馏水定容至1000ml。用前取200ml，加蒸馏水定容至1000ml，即为1×电泳缓冲液。

⑦10×转膜缓冲液

Tris碱30.3g，Gly151.1g，蒸馏水定容至1000ml。用时取100ml，加200ml甲醇，蒸馏水定容至1000ml。

⑧10×TBS（pH7.6）

Tris碱24.2g，NaCl80g，用浓盐酸调pH至7.6，蒸馏水定容至1000ml。

⑨1×TBST

10×TBS100ml，Tween-201ml，蒸馏水定容至1000ml。

⑩抗体稀释液

称取BSA1g，溶于100ml1×TBST中，终浓度为1%BSA，4℃存放。

以下实施例的实验中所用到的动物、仪器设备、试剂及其配制等均是来自上述的描述或符合上述的要求。

实施例1、CD20单克隆抗体表达载体的构建

哺乳动物细胞表达载体pDE为上海同济大学生命科学院惠赠，该载体使用了DHFR筛选标记。从序列得到确证的含有Rituximab重链和轻链基因的pUC19/H02用HindIII/EcoRI切出的Rituximab重链和轻链基因片断，连入用HindIII/EcoRI酶切的表达载体pDE，构建成表达载体pDE/H02。

实施例2、生产用细胞株的来源、构建及鉴定

1.宿主细胞的来源及特性

宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞DG44（Chinese hamster ovary cell DG44，CHO DG44），由上海交通大学生命科学院惠赠。采用CD DG44培养基（Cat.NO.12610-010，Invitrogen）常规培养，3-4天换液扩增或传代一次。

2.细胞转染

表达载体pDE/H02转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌大量培养，用Axygen公司AxiPrep Plasmid Maxiprep Kit大量抽提纯化质粒。质粒用PvuI酶切线性化，纯化后的质粒DNA调整浓度至1μg/μl，用于电穿孔转化CHO DG44细胞。

电穿孔当天收集1×10⁷处于对数生长期的细胞，用0.8ml PBS将细胞混悬并加入电穿孔杯中，加入30μg pDE/H02DNA混匀，冰浴10分钟，放入电击槽中，用200V、1050μF电击1次（Gene Pulser II，Bio-Rad），电穿孔杯再次冰浴10分钟。将转染的CHO DG44细胞加入30ml CD DG44非选择性培养基中，置于37℃、8%CO2、130rpm摇瓶振荡培养。

3.细胞筛选

转染细胞培养48小时后，离心收集细胞，用30ml不含HT的CD OptiCHO选择培养基（Cat.No.12681-011，Invitrogen）重悬，37℃、8%CO2、130rpm摇瓶振荡培养，3-4天常规换液一次。在培养过程中，大部分细胞因没有导入DHFR基因而逐渐死亡，细胞活力也明显下降，随着导入了DHFR基因的细胞数量增多，细胞活力会逐渐升高，待细胞活力增至90%以上，可进行基因加压扩增筛选操作，这一阶段约需要2-3周时间。

4.基因扩增（gene amplification）

离心收集3.3步在选择性培养基中培养的细胞，加入30ml含50nM MTX（methotrexatehydrate，SigmaA6770）的CD OptiCHO选择培养，重悬，37℃、8%CO2、130rpm摇瓶振荡培养，3-4天常规换液一次。在培养过程中，部分细胞因DHFR基因拷贝数较少而逐渐死亡，细胞活力也明显下降，随着含较高DHFR基因拷贝数细胞数量的增多及DHFR基因拷贝数的扩增，细胞活力会逐渐升高，待细胞活力增至90%以上，可进行下一轮加压筛选操作，这一阶段约需要3-4周时间。

重复上述操作，再进行3轮加压筛选实验，所使用的MTX浓度分别为100nm、250nm、500nm，每轮加压筛选实验用时约需3-4周。

5.克隆选择（clonal selection）

离心收集500nM MTX加压筛选的细胞，用含2000nM MTX的CD OptiCHO选择培养重悬，调整细胞密度至5×10⁴/ml。取10-20块96孔板，将细胞悬液加入培养板内，200μl/孔，37℃、5%CO2培养，3周左右可见抗MTX阳性细胞克隆出现。

表9、克隆选择：高产细胞株的单细胞表达量

当单细胞克隆在96孔板中长至70%铺满时，取各克隆的培养上清进行ELISA检测，OD读数最高的前20株细胞转移至一块24孔培养板，长至70%铺满时以同样方法检测，选择表达量最高的前6株细胞，进行单细胞表达量测定。将上述细胞密度调整至10⁵/ml，分别接种于96孔板，100μl/孔，培养24小时后检测上清中的H02抗体表达量，结果见上表。

选取表达量最高的3号克隆，作为候选细胞株，进入下一步操作。

6.培养基适应（medium adaptation）

筛选培养基不一定是合适的生产用培养基，选用生产用培养基的目的是为了提高表达量、降低成本并使生产用培养基更符合法规要求（即去除动物来源物质如血清、蛋白胨等）。生产用培养基使用前必须使细胞株与之适应（adaptation）。

发明人选用国产T22无血清培养基对上述高产候选细胞株进行培养适应性实验。离心收集使用OptiCHO培养基培养的候选细胞株，加入T22无血清培养基，37℃、5%CO₂、130rpm摇瓶培养。3-5天传代培养一次，观察细胞形态是否均一，必要时可进一步亚克隆以确保其单克隆性，待细胞生长状态良好、倍增速率稳定后，可初步确定为生产用细胞株，用于建立原始细胞种子库。

7.摇瓶悬浮培养表达

候选细胞株以0.3×10⁶/ml接种入30ml T22培养基，置于125ml摇瓶37℃、5%CO2、120rpm培养。每天取细胞悬液0.5ml，用于计数及细胞活力检查；离心取上清液保存于-20℃，收齐后一同用于ELISA检测目的蛋白表达量。细胞在摇瓶中的生长及表达。H02抗体表达量为279mg/L。

8.生产用细胞株鉴定

初步确定的生产用细胞株能高效表达目的蛋白，并具有良好的遗传稳定性，初步鉴定结果表明其分子量、特异的生物学活性及比活性等理化性质均与目标蛋白一致的，此时可正式确定其为生产用细胞株，命名为H02，并用于建立三级种子细胞库。

建库后须进一步做整合基因序列确证、细胞学特性检定、外源污染因子检定、目的基因表达产物结构确证，全部合格方能用于今后大规模生产。

实施例3、种子细胞库的建立、检定及传代稳定性

1.原始细胞库

初步确定的生产用细胞株在T22无血清培养基中培养至对数生长期，将所有瓶中的细胞混合后计数、离心，细胞沉淀用含10%DMSO+90%T22无血清培养基重悬混匀，以1×10⁷/ml的细胞密度分装10支冻存管冻存，此为原始细胞库。

2.主细胞库

从原始细胞库中取一支冻存细胞复苏，加入10ml T22无血清培养基，1000rpm离心5分钟，细胞沉淀用30ml T22培养基重悬，放入125ml摇瓶中，120rpm，37℃、5%CO₂培养。第5天转入150ml T22培养基/500ml摇瓶中培养，当细胞密度达到1.5×10⁶/ml时，接种入400ml T22培养基/1000ml转瓶中扩增。当细胞密度达到1.2-1.8×10⁶/ml时，离心收集细胞，细胞沉淀用含10%DMSO+90%T22无血清培养基重悬混匀，以1×10⁷/ml的细胞密度按1ml/支分装60支冻存管冻存，此为主细胞库。细胞自原始种子库至主细胞库共分裂6.28次。

3.工作细胞库

从主细胞库中取一支冻存细胞复苏，加入10ml T22无血清培养基，1000rpm离心5分钟，细胞沉淀用30ml T22培养基重悬，放入125ml摇瓶中，120rpm，37℃、5%CO₂培养。第5天转入150ml T22培养基/500ml摇瓶中培养，当细胞密度达到1.5×10⁶/ml时（约为第4天），转为2个150ml/500ml摇瓶扩增。当细胞密度达到1.5-2.0×10⁶/ml时，接种入2个1000ml转瓶，每瓶装有400ml T22培养基。当细胞密度达到1.2-1.8×10⁶/ml时，离心收集细胞，细胞沉淀用含10%DMSO+90%T22无血清培养基重悬混匀，以1×10⁷/ml的细胞密度按1ml/支分装120支冻存管冻存，此为工作细胞库。细胞自主代种子库至工作细胞库共分裂7.15次。

4.传代稳定性试验

细胞代数（generation，或称分裂次数）的计算方法：2^X=C_p/C_i，其中X代表从接种到传代这段时间细胞增殖代数，C_p代表传代时的细胞计数，C_i代表接种时的细胞计数，所以X=log₂(C_p/C_i)=ln(C_p/C_i)/ln2。

自工作细胞库取出1支细胞复苏于30ml T22培养基中，125ml摇瓶、37℃、8%CO₂常规培养，5天后传代一次，细胞密度调整至0.2-0.3×10⁶/ml，继续培养，第5天细胞计数并再次传代，如此循环。每次传代之间细胞增殖代数累加即为增殖的总代数。第1次传代与以后每4次传代，取出10⁶细胞放于1ml培养基，在24孔板内培养24小时，取上清用ELISA方法检测融合蛋白表达量，计算单细胞每天表达量，结果见下表。可见生产用细胞株从工作细胞库复苏后，直到分裂54.63次，历时61天，表达仍十分稳定。由此实验结果确定工作细胞库的限定分裂次数为50次。

表10、生产用细胞株H02抗体表达的稳定性

分裂次数	H02抗体表达量（pg/cell/day）
		1.86	92.1
21.64	78.9
		43.19	75.2
54.63	81.9

5.重组CHO细胞目的基因序列验证

从工作细胞库中复苏1支细胞扩增，离心收集细胞，抽提重组CHO细胞中的总RNA，进行RT-PCR扩增，将扩增产物用EcoRI/HindIII双酶切后克隆至pUC19载体，进行序列测定。RT-PCR序列与目标序列的比对、测序。测序结果表明，从重组CHO细胞中扩增得到的目的基因片段的序列与设计完全一致，证明转染入细胞中的目的基因序列及其转录翻译的重组蛋白均完全正确。

实施例4、目的基因表达产物结构确证资料

1.N端氨基酸序列测定

委托军事医学科学院完成，测序结果为Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu-Pro-Gly，该结果与文献报道一致。

2.C端搭配序列测定

委托军事医学科学院完成，测序结果为Lys-Gly-Pro-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Thr-Tyr-His-Asn-His，该结果与文献报道一致。

3.肽图分析

肽图图谱与对照品（上海中信国健药业有限公司，批号20091006）一致。

4.分子量测定

测得的分子量还原型介于63-77KD，非还原型约为150KD，与对照品及文献报道一致。

5.等电点测定

测得的等电点分布在4.8±0.5内，与对照品及文献报道一致。

实施例5、检测产物对B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用

据文献报道，抗体与CD20结合以后，能过通过抗体依赖的细胞毒作用（简称：ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）和直接诱导细胞凋亡三种可能的机制显著杀伤B淋巴瘤细胞。由此，发明人通过上述三种机制研究本发明所述的抗CD20单克隆抗体对B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用。

1.抗体依赖的细胞毒性试验

1)试验目的：观察H02能否诱导Raji细胞和Daudi细胞的抗体依赖的细胞毒作用（简称：ADCC）。

2)试验方法

用新配制的PBS将H02配制成浓度分别为0.8、4、20μg/ml的溶液，利妥昔单抗注射液配制成浓度为20μg/ml的溶液待用。细胞计数Raji=5.1×10⁵个/ml，Daudi=4.9×10⁵个/ml，PBMC=1×10⁸个/ml。

将细胞充分悬匀，按每孔800μl将Raji或Daudi细胞悬液种于12孔培养板中，在37℃、含5%二氧化碳的培养箱里孵育。

按下表所示，在每孔含有800μl细胞悬液的12孔板各孔加入相应浓度的H02或美罗华或等体积PBS，每组设三个复孔。将细胞放入培养箱内孵育1小时，再向各相应孔中加入PBMC（效靶比：25：1）或等体积PBS，继续孵育5小时后处理样品。处理样品前45分钟向细胞最大释放LDH组每孔加入100μl试剂盒配备的裂解液。处理样品时每孔取1ml置于1.5mlEP管里1000转离心5分钟，取50μl上清于96孔细胞培养板中，按照CytoTox

非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书，每孔加入配好的底物混合物50μl，避光30分钟，再向每孔中加入50μl终止液，随即用酶标仪在470nm处测OD值。

表11、各分组设置

	药物浓度（μg/ml）	试验体系设置
			阴性对照组	0	800μl细胞+100μlPBS+100μlPBMC
H02低剂量组	0.08	800μl细胞+100μlH02+100μlPBMC
			H02中剂量组	0.4	800μl细胞+100μlH02+100μlPBMC
H02高剂量组	2	800μl细胞+100μlH02+100μlPBMC
			阳性药对照组（美罗华）	2	800μl细胞+100μl美罗华+100μl PBMC
细胞自发释放LDH组	0	800μl细胞+200μlPBS
			细胞最大释放LDH组	0	800μl细胞+100μlPBS+100μl裂解液

细胞毒性计算公式：

杀伤活性%=100×（试验孔OD值-细胞自发释放LDH组OD值）/（细胞最大释放LDH组OD值-细胞自发释放LDH组OD值）

3)统计分析

统计学检验用t检验，p<0.05为有显著性差异，p≤0.01为有非常显著差异，p>0.05为无显著性差异。

4)试验结果

a)Daudi细胞ADCC试验结果：

与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Daudi细胞的抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）（P<0.01）；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Daudi细胞的ADCC作用无显著性差异（P>0.05）。

b)Raji细胞ADCC实验结果：

与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Raji细胞的抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）（H02低浓度时，P<0.05，H02中浓度和高浓度时P<0.01）；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Raji细胞的ADCC作用无显著性差异（P>0.05）。

2.补体依赖的细胞毒性试验

1)试验目的：观察H02能否介导Raji细胞和Daudi细胞的补体依赖的细胞毒作用（CDC）。

2)试验方法

用新配制的PBS将H02配制成浓度分别为0.8、4、20μg/ml的溶液，利妥昔单抗注射液配制成浓度为20μg/ml的溶液待用。细胞计数Raji=4.5×10⁵个/ml，Daudi=5.3×10⁵个/ml。

将细胞充分悬匀，按每孔800μl将Raji或Daudi细胞悬液种于12孔培养板中，在37℃、含5%二氧化碳的培养箱里孵育。

按下表所示，在每孔含有800μl细胞悬液的12孔板各孔加入相应浓度的HO2或美罗华或等体积PBS，每组设三个复孔。将细胞放入培养箱内孵育1小时，再向各相应孔中加入补体或等体积PBS，继续孵育5小时后处理样品。处理样品前45分钟向细胞最大释放LDH组每孔加入100μl试剂盒配备的裂解液，继续孵育。处理样品时，从每孔取1ml置于1.5mlEP管里1000转离心5分钟，取50μl上清于96孔板中，按照CytoTox非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书，每孔加入配好的底物混合物50μl，避光30分钟，再向每孔加入50μl终止液，随即用酶标仪在470nm处测OD值。

表12、实验分组设置

	药物浓度（μg/ml）	试验体系设置
			阴性对照组	0	800μl细胞+100μlPBS+100μl补体
H02低剂量组	0.08	800μl细胞+100μlH02+100μl补体
			H02中剂量组	0.4	800μl细胞+100μlH02+100μl补体
H02高剂量组	2	800μl细胞+100μlH02+100μl补体
			阳性药组（美罗华）	2	800μl细胞+100μl美罗华+100μl补体
细胞自发释放LDH组	0	800μl细胞+200μlPBS
			细胞最大释放LDH组	0	800μl细胞+100μlPBS+100μl裂解液

细胞毒性计算公式：

杀伤活性%=100×（试验孔OD值-细胞自发释放LDH组OD值）/（细胞最大释放LDH组OD值-细胞自发释放LDH组OD值）。

3)统计分析

统计学检验用t检验，p<0.05为有显著性差异，p≤0.01为有非常显著差异，p>0.05为无显著性差异。

4)试验结果

a)Daudi细胞CDC试验结果：

与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Daudi细胞的补体依赖的细胞毒作用（CDC）（P<0.01）；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Daudi细胞的CDC作用无显著性差异（P>0.05）。

b)Raji细胞凋亡实验结果

与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Raji细胞的补体依赖的细胞毒作用（CDC）（P<0.01）；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Raji细胞的CDC作用无显著性差异（P>0.05）。

3.细胞凋亡试验

1)试验目的：观察CD20单抗H02能否显著诱导B淋巴瘤细胞凋亡。

2)试验方法

用新配制的PBS将H02配制成浓度分别为0.8、4、20μg/ml的药液，利妥昔单抗注射液配制成浓度为20μg/ml的溶液待用。细胞计数Raji=5.9×10⁵个/ml，Daudi=6.2×10⁵个/ml。

将细胞充分悬匀，按每孔900μl将Raji或Daudi细胞悬液种于12孔培养板中，在37℃、含5%二氧化碳的培养箱里孵育。

按下表所示，在每孔含有900μl细胞悬液的12孔板各孔加入相应浓度的HO2或美罗华或等体积PBS，每组设三个复孔。在培养箱里孵育16小时后处理样品。处理样品时，每孔取1ml置于1.5mlEP管里1000转离心5分钟，弃上清，加1mlPBS轻轻重悬细胞，1000转离心5分钟，弃上清，按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书，加入195μlAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光10分钟，1000转离心5分钟，弃上清，加入190μlAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，随即进行流式细胞仪检测，早期凋亡率和晚期凋亡率之和计为细胞凋亡率。

表13、分组设置

	药物浓度（μg/ml）	试验体系设置
			阴性对照组	0	900μl细胞+100μlPBS
H02低剂量组	0.08	900μl细胞+100μl H02
			H02中剂量组	0.4	900μl细胞+100μl H02
H02高剂量组	2	900μl细胞+100μl H02
			阳性药组（美罗华）	2	900μl细胞+100μl美罗华

3)统计分析

统计学检验用t检验，p<0.05为有显著性差异，p≤0.01为有非常显著差异，p>0.05为无显著性差异。

4)试验结果

a)Daudi细胞凋亡试验结果：

与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Daudi细胞凋亡（H02低浓度和中浓度时，P<0.05；H02高浓度和美罗华，P<0.01）；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Daudi细胞凋亡作用无显著性差异（P>0.05）。

b)Raji细胞凋亡实验结果：

与阴性对照组相比，H02低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及美罗华组（2μg/ml）均能显著诱导Raji细胞凋亡（H02低浓度、高浓度和美罗华时，P<0.01；H02中浓度，P<0.05）；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Raji细胞凋亡作用无显著性差异（P>0.05）。

试验结论

通过ADCC、CDC及细胞凋亡试验，得出以下结论：人鼠嵌合单克隆抗体H02在体外低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度（2μg/ml）和美罗华高浓度（2μg/ml）均能显著诱导Raji人B淋巴瘤细胞和Daudi人B淋巴瘤细胞发生抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）以及细胞凋亡，从而显著杀伤B淋巴瘤细胞；相同浓度的H02和美罗华（2μg/ml）诱导Raji人B淋巴瘤细胞和Daudi人B淋巴瘤细胞ADCC、CDC和凋亡的作用无显著性差异。

菌株保藏

请求保藏的培养物名称：中国仓鼠卵巢细胞CHO DG44

保藏编号：CCTCC NO:C201158

该培养物已于2011年7月18日由中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。由该日起保存三十年，在期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五年。

该培养物的存活性：中国典型培养物保藏中心于2011年8月3日检测完毕，结果为存活。

请求保藏人：上海瀚康生物医药科技有限公司

保藏单位：中国典型培养物保藏中心    地址：中国.武汉.武汉大学（430072）

电话：（027）68752319               传真：（027）68754833

E-mail：cctccwhu.edu.cn

Claims (19)

1.一种抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述的该抗CD20单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：

（1）构建一个独特的pMED高效哺乳动物细胞基因表达系统；

（2）建立一个悬浮细胞、无血清培养驯化体系，通过转染将CD20单抗基因整合到CHO细胞的基因组中，通过逐步增加MTX的浓度使整合在细胞内的目的蛋白基因拷贝数大量扩增，筛选CHO细胞亚克隆，获得高表达工程细胞株，并建立三级种子细胞库；

（3）建立适合哺乳动物细胞悬浮培养的无血清培养基，使用该无血清CD培养基培养CHO工程细胞株；

（4）建立哺乳动物细胞大规模培养及蛋白纯化体系，利用哺乳动物细胞大规模发酵及纯化平台，获得外源蛋白的大规模表达；

所述的CHO工程细胞株是中国仓鼠卵巢细胞CHO DG44，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201158。

2.根据权利要求1所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述的该抗CD20单克隆抗体的有关测定情况如下：

（1）N端氨基酸序列测定

测序结果为Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu-Pro-Gly，该结果与文献报道的美罗华一致；

（2）C端搭配序列测定

测序结果为Lys-Gly-Pro-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Thr-Tyr-His-Asn-His，该结果与文献报道的美罗华一致；

（3）肽图分析

肽图图谱与对照品美罗华一致；

（4）分子量测定

测得的分子量还原型介于63～77KD，非还原型为150KD，与对照品及文献报道的美罗华一致；

（5）等电点测定

测得的等电点分布在4.8±0.5内，与对照品及文献报道的美罗华一致。

3.根据权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述的无血清培养基是由基础培养基和补充因子构成；

所述的补充因子由无机盐类、氨基酸、维生素、其他物质组成，其含量分别为0.001～0.9%、0.001～0.035%、0.001～0.06%、0.001～0.4%。

4.根据权利要求3所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述的无机盐类是包括无水氯化钙、七水硫酸亚铁、氯化钾、氯化镁、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或七水硫酸锌中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述的氨基酸是包括L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-缬氨酸中的至少一种。

6.根据权利要求3所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述的维生素是包括硫辛酸、维生素H、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺或维生素B₁₂中的至少一种。

7.根据权利要求3所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述的其他物质是包括D-葡萄糖、次黄嘌呤、酚红或胸苷中的至少一种。

8.根据权利要求3所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述的无血清培养基用于培养CHO细胞，具体步骤包括：

（1）在本发明所述的无血清培养基中接种CHO细胞；

（2）在适合生长的条件下培养CHO细胞一段时间。

9.根据权利要求8所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述的适合生长的条件是37±2℃，5±1%二氧化碳，所述的一段时间是1-3周。

10.一种权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体在制备抗CD20产品中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的抗CD20产品是一种直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究B细胞相关的恶性疾病及其直接相关疾病的产品。

12.一种权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体的组合物在制备抗CD20产品中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的抗CD20产品是一种直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究B细胞相关的恶性疾病及其直接相关疾病的产品。

14.一种权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体在制备抗非霍奇金淋巴瘤产品中的应用。

15.一种权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体的组合物在制备抗非霍奇金淋巴瘤产品中的应用。

16.一种权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体在制备治疗自身性免疫病的药物中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的自身性免疫病是类风湿性关节炎、特发性血小板减少紫癜和溶血性贫血。

18.一种权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体的组合物在制备治疗自身性免疫病的药物中的应用。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的自身性免疫病是类风湿性关节炎、特发性血小板减少紫癜和溶血性贫血。

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