CN114230669B

CN114230669B - 一种双特异性抗体的生产方法

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Publication number: CN114230669B
Application number: CN202111602161.4A
Authority: CN
Inventors: 王鹏银; 张玮; 穆怀斌; 徐骁; 荆玮; 李文蕾; 曹小丹; 徐立华; 田方; 李静; 黄瑞晶
Original assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: WO2023116728A1; CN114230669A

Abstract

本发明公开了一种双特异性抗体的生产方法。所述方法包括(1)构建生产双特异性抗体的细胞，并进行筛选；(2)培养步骤(1)筛选获得的细胞，获得培养液并进行分离纯化，获得双特异性抗体；所述细胞包括CHO细胞，所述培养的方式包括分批补料培养或灌流培养。本发明综合分析发酵培养和分离纯化中各种影响因素，通过有效控制，使得各因素间能够有效协同，从而实现高效生产高纯度的双特异性抗体，日产量可达3g/L以上，经纯化后双特异性抗体的纯度可达在90％以上，并对生产工艺进行了放大验证，工艺稳定、可靠且成本低，与现有生产方法相比实现了巨大突破，对于双特异性抗体的广泛临床应用具有重要意义。

Description

一种双特异性抗体的生产方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种双特异性抗体的生产方法。

背景技术

肿瘤(tumour)根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类；其中恶性肿瘤疾病是当今社会上危害人类健康的重大疾病，致死程度高居第二，常见肿瘤有肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌等。

恶性肿瘤由于其个体差异，一般会对大部分患者进行综合治疗，即综合采用手术、化疗、放疗、免疫治疗、中医中药治疗、介入治疗、微波治疗等手段，以期较大幅度地提高治愈率，并改善患者的生活质量。其中免疫治疗(immunotherapy)是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法。免疫治疗的方法有很多，适用于多种疾病的治疗，旨在激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。与以往的手术、化疗、放疗和靶向治疗不同的是，免疫治疗针对的靶标不是肿瘤细胞和组织，而是人体自身的免疫系统，包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。

目前上市在售的抗体药物多为单克隆抗体，治疗性单克隆抗体已被用于治疗癌症、自身免疫病、炎症和其他疾病，多数是针对一个靶标的特异性。然而，病人接受单克隆抗体治疗可能产生耐药性或无应答，并且有些疾病在体内的影响因素是多方面的，包括不同的信号通路、不同的细胞因子和受体的调节机制等，单一靶点的免疫疗法似乎并不足以摧毁癌细胞。因此，需要通过组合不同的药物，或是使用多特异性抗体的多重靶向策略来实现，如CN109942712A提供了一种抗PD-L1/VEGF双特异性抗体，包括：抗PD-L1的抗体或元件；和与所述抗PD-L1的抗体或元件相连接的抗VEGF的抗体或元件，可同时与VEGF及PD-L1结合，从而发挥对VEGF和PD-L1阳性的肿瘤细胞-的治疗作用，双功能抗体虽然是抗体药物研发的方向，但面临诸多挑战，比如临床前评价模型、表达量低、稳定性差、工艺复杂、质控差异性大等问题，因此一直以来双功能抗体的研发困难重重。

综上所述，针对由于双特异性抗体产业化生产复杂、生产成本高制约了其临床应用的问题，亟需一种既能提高双特异性抗体表达量又不影响其安全性、特异性和纯度且能降低生产成本的方法。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种双特异性抗体的生产方法，所述生产方法能够高效生产高纯度双特异性抗体，工艺稳定、可靠且成本低，能够显著促进双特异性抗体的临床应用。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种双特异性抗体的生产方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建生产双特异性抗体的细胞，并进行筛选；

(2)培养步骤(1)筛选获得的细胞，获得培养液并进行分离纯化，获得双特异性抗体；

所述细胞包括哺乳动物细胞；

所述培养的方式包括分批补料培养或灌流培养，所述分批补料培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括Dynamis^TMAGT^TM培养基，所述补料培养基包括Cell Boost^TM7a和Cell Boost^TM7b，所述分批补料培养的温度为31℃～37℃，包括但不限于32℃、33℃、34℃、35℃或36℃，所述分批补料培养的pH为6.8～7.3，包括但不限于6.9、7.0、7.1或7.2，所述分批补料培养的溶氧为10％以上，所述灌流培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括Eden-300S培养基和High-Intensity PerfusionCHO培养基，所述灌流培养的温度为31℃～37℃，包括但不限于32℃、33℃、34℃、35℃或36℃，所述分批补料培养的pH为6.8～7.3，包括但不限于6.9、7.0、7.1或7.2，所述灌流培养的溶氧为10％以上。

本发明中，筛选能够高产双特异性抗体的菌株，对高产菌株进行培养，综合分析影响发酵培养多种因素，通过控制发酵方式、培养基组合、培养温度、培养pH和溶氧，利用各因素协同，实现了高效生产双特异性抗体。

优选地，所述双特异性抗体包括PD-L1/VEGF双特异性抗体。

优选地，所述PD-L1/VEGF双特异性抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的序列。

SEQ ID NO.1(双特异性抗体重链)：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRRYSISWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGAAKYAQKFQGRVTITADEFTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCALSGDSDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGDTGSPFVEMYSEIPEIIHMTEGSELVIPCRVTSPDITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISDATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLDCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKDSTFVRVHEK。

SEQ ID NO.2(双特异性抗体轻链)：

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDLSLNAWVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。

优选地，所述哺乳动物细胞包括HEK 293细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，优选为中国仓鼠卵巢细胞。

本发明中，通过配制培养基为Dynamis^TMAGT^TMMedium，能够进一步提高双特异性抗体产量。

优选地，所述分批补料培养的基础培养基中含有F-68 Biochemica。

本发明中，在培养基中加入F-68 Biochemica能够有效解决培养过程中细胞结团问题，从而利于细胞快速生长。

优选地，所述Cell Boost^TM7a补料流加比例为2％～3％，包括但不限于2.2％、2.4％、2.6％、2.7％、2.8％或2.9％，所述Cell Boost^TM7b补料流加比例为0.2～2.5％，包括但不限于0.3％、0.4％、0.6％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.3％或2.4％。

优选地，所述分批补料培养的接种密度为不低于0.15×10⁶cells/mL，包括但不限于0.36×10⁶cells/mL、0.38×10⁶cells/mL、0.4×10⁶cells/mL、0.45×10⁶cells/mL、0.5×10⁶cells/mL或0.6×10⁶cells/mL。

优选地，所述分批补料还包括补加葡萄糖。

优选地，所述葡萄糖的流加量为1.0～10g/L，包括但不限于1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L。

优选地，所述灌流培养的补料培养基包括Eden-F400a和Eden-F200。

优选地，步骤(2)所述分离纯化包括以下步骤：

(1’)对所述培养液进行深层过滤，获得澄清液；

(2’)对所述澄清液进行亲和层析；

(3’)调节亲和层析产物pH并进行孵育；

(4’)调节孵育产物pH并进行深层过滤；

(5’)对深层过滤产物进行阴离子交换层析；

(6’)对阴离子交换层析产物进行阳离子交换层析；

(7’)对阳离子交换层析产物进行纳滤。

本发明中，双特异性抗体存在一定比例的多聚体，严重影响纯化过程中的收率和蛋白纯度，通过控制纯化工艺提升多聚体与双特异性抗体的分离度，能够进一步提高双提异性抗体的收率和纯度。

优选地，步骤(1’)所述深层过滤的过滤器的滤芯包括Zeta Plus EZP滤芯E16E07A60SP02A(3M公司)。

优选地，步骤(2’)所述亲和层析的洗脱缓冲液包括醋酸和醋酸钠。

优选地，步骤(2’)所述亲和层析的层析柱的填料包括MabSelect Prism A。

优选地，步骤(3’)所述pH为3～4。

优选地，步骤(3’)所述孵育的温度为18℃～26℃，包括但不限于19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃，所述孵育的时间为50～70min，包括但不限于51min、52min、53min、54min、55min、56min、60min、61min、62min、65min、66min、67min、68min或69min。

优选地，步骤(5’)所述阴离子交换层析的层析柱的填料包括Capto adhere。

优选地，所述Capto adhere的载量定为≤30g/L。

优选地，步骤(5’)所述阴离子交换层析在pH为5.8～6.0下进行，优选为5.9。

优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析的层析柱的填料包括Ceramic CM和/或Nuvia HR S。

优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析的平衡缓冲液包括醋酸和醋酸钠。

优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析在pH为5.4～5.6下进行，优选为5.5。

优选地，步骤(6’)所述阳离子交换层析的洗脱液包括精氨酸。

优选地，所述洗脱液中精氨酸的浓度为0.18～0.20mol/L。

优选地，所述分离纯化还包括制备抗体原液的步骤。

优选地，所述抗体原液的制备方法包括：

对所述阳离子交换层析的产物进行超滤，使用无菌过滤膜对超滤产物进行过滤，得到所述抗体原液。

作为优选的技术方案，所述双特异性抗体的生产方法包括以下步骤：

(1)构建生产双特异性抗体的细胞，并进行筛选；

(2)培养步骤(1)筛选获得的细胞，获得培养液；

(3)使用Zeta Plus EZP滤芯E16E07A60SP02A过滤器对所述培养液进行深层过滤，获得澄清液；

(4)使用MabSelect Prism A填充层析柱，对所述澄清液进行亲和层析，使用含有醋酸和醋酸钠的洗脱缓冲液进行洗脱；

(5)调节亲和层析产物pH为5.8～6.0，并于18℃～26℃进行孵育50～70min；

(6)调节孵育产物pH为5.4～5.6并进行深层过滤；

(7)使用Capto adhere填充层析柱，使用含有醋酸和醋酸钠的平衡缓冲液进行柱平衡，对深层过滤产物进行阴离子交换层析；

(8)使用Ceramic CM和/或Nuvia HR S填充层析柱，使用含有醋酸和醋酸钠的平衡缓冲液进行柱平衡，对阴离子交换层析产物进行阳离子交换层析；

(9)对阳离子交换层析产物进行纳滤；

(10)对所述纳滤产物进行超滤，使用无菌过滤膜对超滤产物进行过滤，得到所述抗体原液。

所述培养的方式包括分批补料培养或灌流培养。

所述分批补料培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括Dynamis^TMAGT^TM培养基，所述补料培养基包括Cell Boost^TM7a和Cell Boost^TM7b，所述分批补料培养的温度为31℃～37℃，所述分批补料培养的pH为6.8～7.3，所述分批补料培养的溶氧为10％以上。

所述灌流培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括Eden-300S培养基和High-Intensity Perfusion CHO培养基，所述灌流培养的温度为31℃～37℃，所述灌流培养的pH为6.8～7.3，所述灌流培养的溶氧为10％以上。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明中，综合分析发酵培养和分离纯化中各种影响因素，通过有效控制，使得各因素间能够有效协同，从而实现高效生产高纯度的双特异性抗体，日产量可达3g/L以上，经纯化后双特异性抗体的SEC-HPLC纯度可达在90％以上，并对生产工艺进行了放大验证，工艺稳定、可靠且成本低，与现有生产方法相比实现了巨大突破，对于双特异性抗体的广泛临床应用具有重要意义。

附图说明

图1为B1962-vector-3-pCHUGUN-Kan质粒结构示意图；

图2为5L反应器中细胞生长曲线图；

图3为5L反应器中葡萄糖代谢曲线图；

图4为5L反应器中乳酸代谢曲线图；

图5为5L反应器中铵代谢曲线图；

图6为5L反应器中蛋白表达产量图；

图7为200L反应器中细胞生长曲线图；

图8为200L反应器中葡萄糖代谢曲线图；

图9为200L反应器中乳酸代谢曲线图；

图10为200L反应器中蛋白表达产量图；

图11为灌流培养细胞密度图；

图12为灌流培养细活率图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例构建表达双特异性抗体PD-L1/VEGF的细胞株。

本实施例的生物源性物料为中国仓鼠卵巢细胞(CHO，Chinese hamster ovary)，表达载体B1962载体命名为B1962-vector-3-pCHOGUN-Kan，该质粒含有SV40启动子：介导重组蛋白的高表达；GS：谷氨酰胺合成酶基因；SV40 polyA：polyA尾信号，有效终止mRNA转录并使其多腺苷酸化；Kan：卡那抗性基因，用于转化E.coil时筛选；pNic CHOGUN element：pNic CHOGUN元件；BGH polyA：BGH多腺苷酸化信号，所用的宿主细胞为CHO cells，为CHO-GS敲除表达系统，购买于Horizon Discovery Ltd，天士力生物建立了GS-CHO-K1工作细胞库(MCB)，代次为P10，建立了GS-CHO-K1 WCB，代次为P13。

目的氨基酸序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)由圆祥生物科技股份有限公司研发，以圆祥生物开发的氨基酸序列为基础，在不改变PD-L1/VEGF双特异性抗体氨基酸序列的前提下，按照宿主细胞GS-CHO-K1密码子偏好，在DNA水平对PD-L1/VEGF双特异性抗体序列进行优化，抗体目的基因序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.3(双特异性抗体重链DNA序列)：

caggtgcagctggtgcagtccggcgccgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtgagctgtaaggcttccggcggcaccttcaggaggtacagcatcagctgggtgaggcaggcccctggccagggactggagtggatgggcggcatcatccctgtgttcggcgctgctaagtacgcccagaagttccagggccgggtgaccatcaccgccgatgagttcaccagcaccgcctacatggagctgtcctccctgacctccgaggataccgctgtgtattattgtgccctgtccggcgacagcgatgccttcgacatctggggccagggcacaatggttaccgtgtcctccgcttccaccaagggcccctccgtgttccccctggccccttcttccaagtccaccagcggcggcaccgccgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagcctgtgaccgtgagctggaatagcggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagagcagcggcctgtactccctgtcctccgtggtgaccgtgcccagctcctccctgggcacccagacctacatctgtaatgtgaatcacaagcccagcaataccaaggtggacaagaaggtggagcccaagagctgcgataagacccacacctgtcctccttgtcccgcccccgagctgctgggaggaccatctgtgttcctgttccctcccaagcctaaggataccctgatgatctccaggacccctgaggtgacctgtgtggtggtggatgtgagccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaatgccaagaccaagcccagggaggagcagtacgcttccacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtataagtgcgctgtgagcaataaggctctgcccgcccccatcgagaaaactattagtaaggccaagggccagcccagggagccccaggtgtataccctgcccccttcccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaaaggcttctacccttccgacatcgctgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaattataagaccacccctcccgtgctggacagcgatggctccttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaatgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtcccccggcggcggaggaggatctggaggaggaggcagcggcggcggaggttctggagacaccggctcccccttcgtggagatgtactccgagatccctgagatcatccacatgaccgagggctccgagctggtgatcccctgtcgggtgaccagccccgatatcaccgtgaccctgaagaagttccctctggataccctgatccccgacggcaagaggatcatctgggatagcaggaagggcttcatcatctccgatgctacctataaggagatcggcctgctgacctgtgaggctaccgtgaatggccacctgtacaagaccaactacctgacccaccggcagaccaataccatcatcgacgtggtgctgagccctagccacggcatcgagctgtccgtgggcgagaagctggtgctggactgcaccgccaggaccgagctgaatgtgggcatcgacttcaactgggagtaccctagcagcaagcaccagcacaagaagctggtgaatagggacctgaaaactcaatctggcagcgagatgaagaagttcctgagcaccctgaccatcgatggcgtgaccaggtccgatcagggcctgtacacctgtgctgcttcttccggcctgatgaccaagaaggactccaccttcgtgagggtgcacgagaag。

SEQ ID NO.4(双特异性抗体轻链DNA序列)：

cagagcgtgctgacccagcccccttccgctagcggcacccctggacagagggtgaccatcagctgttccggcagcagcagcaacatcggctccaacaccgtgaactggtaccagcagctgcctggcaccgcccccaagctgctgatctatagcaacaaccagcggccctccggcgtgcctgatcggttctccggctccaagtccggcacctccgcctccctggccatctccggtctgcagagcgaggatgaggccgactactactgcgctacctgggacctgagcctgaacgcttgggtggtgttcggcggcggcaccaagctgaccgtgctgggacagcctaaggctgctccctccgtgaccctgttccctcctagctccgaggagctgcaggctaataaggctaccctggtgtgcctgatctccgacttctatcccggcgccgtgaccgtggcttggaaggctgactccagccccgtgaaggccggagtggagaccaccaccccttccaagcagagcaacaataagtacgctgccagcagctatctgagcctgacccccgagcagtggaagagccaccggagctatagctgccaggtgacccacgagggctccaccgtggagaaaactgttgctcccaccgagtgtagc。

通过电转染的方法将表达载体导入到宿主细胞GS-CHO-K1中，在传代培养过程中经过不含有谷氨酰胺(Glutamine，Gln)而含有蛋氨酸亚氨基代砜(methioninesulfoximine，MSX)的培养基筛选后得到稳定的细胞群，再通过有限稀释法(0.45个细胞/孔，96孔板)、单克隆成像(分板后将96孔板离心进行首次拍照，后续于24h、48h、72h、168h拍照)、表达量检测等一系列的筛选得到单克隆细胞株，将高产单克隆进行补料发酵(Fed-batch)培养，根据生长状态、质量分析(纯度、活性等关键质量属性)、分子表征(质谱法高分辨相对分子量分析、肽段覆盖率、质谱法N/C末端序列分析、Edman降解法N端序列分析)、基因组水平测序确证、初步稳定性研究获得最优克隆，命名为131-35。

实施例2

本实施例进行摇瓶Fed-batch培养。

根据确定的摇瓶Fed-batch培养工艺，开展了摇瓶阶段Fed-batch培养工艺确认试验，基础培养基为Dynamis^TMAGT^TMMedium(含有1.0g/LF-68 Biochemica)，补料培养基为Cell Boost^TM7a和Cell Boost^TM7b，按照接种密度0.60×10⁶cells/mL接种，培养体积50mL，共接种3个平行(编号为35-12、35-13、为35-14)，工艺确认方案见表1，细胞生长数据和目的蛋白表达量见表2，样品(35-12、35-13、35-14)经过Capto Adhere纯化后，对关键质量属性进行检测，结果如表3所示，3个摇瓶样品的SEC-HPLC、CE-SDS、iCIEF数据具有可比性。

表1

表2

表3

实施例3

本实施进行5L生物反应器细胞培养。

复苏3支WCB细胞至250mL摇瓶，培养体积80mL，培养3天以0.45×10⁶cells/mL密度放大至1L摇瓶中，培养体积250mL；1L摇瓶培养3天以0.55×10⁶cells/mL密度放大至2L摇瓶中，培养体积600mL，2L摇瓶培养3天活细胞密度＞5.00×10⁶cells/mL，活率＞90.00％，接种于3个5L反应器A3、A4和B2，培养基为Dynamis^TMAGT^TMMedium(含有1.0g/LF-68BioChemica)，A3、A4、B2三个反应器的接种密度均为0.65×10⁶cells/mL，第3天(D3)开始流加，D4开始降温培养，Fed-batch培养流加工艺和补糖量见表4；三个反应器培养至第四天(D4)(细胞密度≥12.00×10⁶cells/mL)降温至33℃，细胞培养活率低于70.00％以下时终止培养，反应器关键参数见表5。

表4

表5

3个5L反应器接种至培养结束时细胞密度、活率、培养天数和目的蛋白表达量等见表6，细胞生长曲线见图2，A3、A4和B2反应器的细胞均在第7天(D7)达到密度峰值，密度峰值约为20.00×10⁶cells/mL；整个Fed-batch培养过程中，细胞密度和活率正常，3批平行反应器的密度和活率基本一致，结束培养时细胞活率均大于80.00％，中控跟踪细胞代谢情况见图3-图5，葡萄糖检测值较为平稳，Fed-batch后期葡萄糖维持在0.6～1.6g/L之间；Fed-batch培养至D6时乳酸开始下降，后期到结束培养，乳酸含量为极低；整个流加过程中NH4⁺有累积增加的趋势，累积过程相对平缓。

3个反应器的蛋白表达量见图6，细胞培养液中聚体比例见表6，细胞结束培养时3个平行反应器聚体比例(HMW)均低于8.0％。发酵液经过Mab Select Prism A亲和捕获和Capto Adhere纯化后，检测SEC-HPLC、CE-SDS、iCIEF，结果如表7所示：3个反应器平行批次的SEC-HPLC、CE-SDS、iCIEF结果差别不大，批次间一致性较好。

表6

表7

实施例4

本实施例进行200L生物反应器细胞培养。

在GMP条件下进行了2批次200L规模的细胞培养(批号200716、200830)，细胞培养过程对每个操作步骤的工艺参数进行控制，摇瓶阶段对温度、CO₂、转速、细胞密度进行控制，Wave培养过程中对温度、DO、pH、转速、细胞密度进行控制，200L培养过程中对温度、DO、pH、转速、培养时间、细胞活率进行控制，培养结果见表8，200L细胞培养阶段的细胞生长见图7，200L细胞培养阶段葡萄糖代谢参数见图8和图9，目的蛋白表达产量见图10，结果表明培养工艺稳定可靠，重现性好，在该培养工艺条件下的细胞生长、代谢和蛋白表达量较一致，培养液中目的蛋白表达量分别为3.560g/L和3.845g/L。

表8

实施例5

本实施例进行灌流培养。

培养规模为50mL TPP培养管，所用灌流培养基为Eden-300S(倍谙基，本实施例命名为52#)和High-Intensity Perfusion CHO Medium(gibco，本实施例命名为75#)。

52#灌流培养基搭配补料Eden-F400a(倍谙基)和Eden-F200(倍谙基)，即根据细胞生长补充Eden-F400a为培养体积2.5％～12％；Eden-F200为Eden-F400a补加体积的10％。

使用52#灌流培养基的细胞灌流前期葡萄糖控制约10g/L；灌流中后期葡萄糖控制在10～20g/L，使用75#灌流培养基的细胞灌流过程葡萄糖控制在10～12g/L。

52#培养基细胞密度达3×10⁷cells/mL降温至33℃，75#培养基细胞密度达3.5×10⁷cells/mL降温至33℃。

1培养管52#培养基细胞密度6.5×10⁷cells/mL～9.0×10⁷cells/mL每天排培养体积10％的细胞液；1培养管75#培养基细胞密度4.5×10⁷cells/mL～6.0×10⁷cells/mL每天排培养体积10％的细胞液，细胞培养周期为20天，灌流培养细胞密度和活率见图11和图12，52#培养基细胞密度峰值较高，约8.0×10⁷cells/mL～10.0×10⁷cells/mL；75#培养基细胞密度峰值约5.0×10⁷cells/mL～6.0×10⁷cells/mL，灌流培养表达量如表9所示，75#在灌流中后期每天表达量＞2g/L；52#在灌流中后期每天表达量更高，表达量＞3g/L。

表9

实施例6

本实施例进行PD-L1/VEGF双特异性抗体纯化。

在5L小试纯化工艺开发和确认基础上，进行了200L发酵规模纯化工艺放大研究，建立了原液纯化工艺，确定了以Mabselect PrisemA填料(CYTIVA医疗集团)亲和层析为基础，低pH孵育(pH 3.5±0.1)第一次除病毒，以CaptoAdhere复合填料(CYTIVA医疗集团)阴离子层析和Nuvia HRS填料(BIORAD)阳离子交换层析为精细纯化，1.0m²Bio EX纳滤膜(旭化成)过滤进行第三次除病毒，以截留分子量50kDa的切向流超滤膜P2B050A25(默克密理博)进行浓缩原液制备的纯化工艺，纯化过程对微生物限度、HCP残留、DNA残留、内毒素、中间体含量和纯度进行控制检测。在符合GMP条件下进行了两批次原液生产，经放行检验均符合质量标准，工艺稳定、可靠，批次之间具有较好的一致性，用于IND申报。

1、纯化放大工艺各步骤溶液配制见表10。

表10

2、以下按工艺步骤列出各纯化工艺的操作参数。

(1)深层过滤澄清

深层过滤器是针对预处理料液的粒径分布而特别设计的，具有梯度密度结构的澄清滤器。发酵完毕的样品经深层过滤澄清，除大颗粒物质，为捕获做准备，深层过滤放大工艺操作参数见表11，进行两批试验(编号为200716和200830)，深层过滤工艺产品纯度和收率如表12所示；

表11

表12

项目/批号	200716	200830
			纯度(％)	50.8％	50.7％
收率(％)	95.9％	89.6％

(2)亲和层析捕获与低pH孵育灭活病毒工艺

亲和捕获层析利用目标蛋白抗体与Protein A特异性吸附作用，达到捕获目标蛋白的目的，Mabselect PrismA捕获放大工艺操作参数见表13，产品纯度和收率见表14；

表13

表14

项目/批号	200716	200830
			纯度(％)	94.0％，94.0％	92.9％，93.3％
收率(％)	92.3％，91.0％	94.2％，93.3％

(3)Capto adhere层析

利用Capto Adhere携带的阴离子和疏水配基对DNA、宿主蛋白等杂质的特异性吸附进行纯化，去除目标蛋白中残留的DNA及HCP，将捕获后的样品进行中和、过滤，进行Adhere流穿工艺，收集流穿液，Capto adhere层析工艺放大操作参数见表15，层析产品纯度和收率见表16；

表15

表16

项目/批号	200716	200830
			纯度(％)	95.6％，95.3％	97.6％，96.9％
收率(％)	85.8％，86.1％	85.3％，89.2％

(4)阳离子交换层析

利用阳离子交换层析的特性，对目标蛋白组分进行吸附—洗脱模式分离纯化，主要去除聚集体或者片段类与目标蛋白性质接近的杂质，同时去除部分宿主蛋白残留及DNA类残留，达到纯化效果，Nuvia HR S阳离子交换层析工艺操作参数见表17，层析产品纯度和收率见表18；

表17

表18

项目/批号	200716	200830
			纯度(％)	99.0％	99.0％
收率(％)	91.7％	93.9％

(5)除病毒纳滤

纳滤放大工艺操作参数见表19，纳滤膜水通量监测表如表20所示；

表19

表20

(6)原液制备

对纳滤产品进行抗体原液制备，抗体原液制备放大工艺操作参数见表21，产品纯度和收率见表22。

表21

表22

项目/批号	200716	200830
			纯度(％)	99.0％	99.1％
收率(％)	100.0％	100％

可见，通过控制纯化过程包括亲和层析的洗脱液、阳离子层析的pH和填料等，能够有效去除多聚体，大幅提高双特异性抗体的收率和产品纯度。

实施例7

与实施例3相比，区别仅在于培养温度为31℃，其它与实施例3相同。

实施例8

与实施例3相比，区别仅在于培养温度为37℃，其它与实施例3相同。

实施例9

与实施例3相比，区别仅在于培养pH为6.8，其它与实施例3相同。

实施例10

与实施例3相比，区别仅在于培养pH为7.3，其它与实施例3相同。

对比例1

与实施例3相比，区别仅在于将培养基Dynamis^TMAGT^TM培养基替换为等量ActiPro^TM培养基，其它与实施例3相同，细胞生长速度变慢。最终影响细胞密度峰值，造成产量降低。

对比例2

与实施例3相比，区别仅在于将培养基Dynamis^TMAGT^TM培养基替换为等量ExpiCHOStable Production培养基，其它与实施例3相同。细胞生长速度变慢，最终影响细胞密度峰值，造成产量降低。

对比例3

与实施例3相比，区别仅在于将培养基Dynamis^TMAGT^TM培养基替换为等量CDFortiCHO培养基，其它与实施例3相同。细胞生长速度变慢，最终影响细胞密度峰值，造成产量降低。

对比例4

与实施例3相比，区别仅在于培养温度为25℃，其它与实施例3相同。培养温度较低会导致细胞生产缓慢，最终影响细胞的密度峰值，造成产量的降低。

对比例5

与实施例3相比，区别仅在于培养温度为40℃，其它与实施例3相同。高温对细胞培养不利，细胞会受到一定损伤，同时造成产物的不稳定降解。

对比例6

与实施例3相比，区别仅在于培养pH为5.5，其它与实施例3相同。产物蛋白对于pH较为敏感，较低的pH会导致产物降解，造成产量损失。

对比例7

与实施例3相比，区别仅在于培养pH为8.1，其它与实施例3相同。过高的pH对细胞生长有一定的抑制作用，影响细胞的密度峰值，最终影响产量，同时高pH会导致抗体的碱性峰增加，对产品的质量造成一定的影响。

对比例8

与实施例3相比，区别仅在于培养溶氧(OD)为5％，其它与实施例3相同。DO过低会改变细胞的代谢，葡萄糖生产乳酸的比例上升，培养基的有效利用率明显降低，降低细胞蛋白表达水平，甚至因缺氧而导致细胞逐渐凋亡。

比较实施例3和实施例7-9及对比例1-8可知，实施例7-9中双特异性抗体产量亦可达5g/L以上，而对比例1-7中双特异性抗体产量均显著降低，说明双特异性抗体产量受多种因素影响，且对各因素变化非常敏感，而本发明综合分析各影响因素，系统地控制各影响因素，协同发挥作用，显著提高双特异性抗体产量。

综上所述，本发明综合分析发酵培养和分离纯化中各种影响因素，通过有效控制，使得各因素间能够有效协同，从而实现高效生产高纯度的双特异性抗体，灌流生产日产量可达3g/L以上，经纯化后双特异性抗体的SEC-HPLC纯度可达在90％以上，并对生产工艺进行了放大验证，工艺稳定、可靠且成本低，与现有生产方法相比实现了巨大突破，对于双特异性抗体的广泛临床应用具有重要意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 天士力生物医药股份有限公司

<120> 一种双特异性抗体的生产方法

<130> 2021-12-23

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 667

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Arg Tyr

20 25 30

Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Ala Ala Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Phe Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Leu Ser Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp

450 455 460

Thr Gly Ser Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile

465 470 475 480

His Met Thr Glu Gly Ser Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser

485 490 495

Pro Asp Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile

500 505 510

Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile

515 520 525

Ser Asp Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr

530 535 540

Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr

545 550 555 560

Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu

565 570 575

Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asp Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu

580 585 590

Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln

595 600 605

His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu

610 615 620

Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser

625 630 635 640

Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys

645 650 655

Lys Asp Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys

660 665

<210> 2

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Leu Ser Leu

85 90 95

Asn Ala Trp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 3

<211> 2001

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ctggctcctc cgtgaaggtg 60

agctgtaagg cttccggcgg caccttcagg aggtacagca tcagctgggt gaggcaggcc 120

cctggccagg gactggagtg gatgggcggc atcatccctg tgttcggcgc tgctaagtac 180

gcccagaagt tccagggccg ggtgaccatc accgccgatg agttcaccag caccgcctac 240

atggagctgt cctccctgac ctccgaggat accgctgtgt attattgtgc cctgtccggc 300

gacagcgatg ccttcgacat ctggggccag ggcacaatgg ttaccgtgtc ctccgcttcc 360

accaagggcc cctccgtgtt ccccctggcc ccttcttcca agtccaccag cggcggcacc 420

gccgctctgg gatgtctggt gaaggattac ttccctgagc ctgtgaccgt gagctggaat 480

agcggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagag cagcggcctg 540

tactccctgt cctccgtggt gaccgtgccc agctcctccc tgggcaccca gacctacatc 600

tgtaatgtga atcacaagcc cagcaatacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 660

tgcgataaga cccacacctg tcctccttgt cccgcccccg agctgctggg aggaccatct 720

gtgttcctgt tccctcccaa gcctaaggat accctgatga tctccaggac ccctgaggtg 780

acctgtgtgg tggtggatgt gagccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagcccaggg aggagcagta cgcttccacc 900

tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtat 960

aagtgcgctg tgagcaataa ggctctgccc gcccccatcg agaaaactat tagtaaggcc 1020

aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtat accctgcccc cttcccggga ggagatgacc 1080

aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aaaggcttct acccttccga catcgctgtg 1140

gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aattataaga ccacccctcc cgtgctggac 1200

agcgatggct ccttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag 1260

ggcaatgtgt tcagctgctc cgtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacccagaag 1320

agcctgagcc tgtcccccgg cggcggagga ggatctggag gaggaggcag cggcggcgga 1380

ggttctggag acaccggctc ccccttcgtg gagatgtact ccgagatccc tgagatcatc 1440

cacatgaccg agggctccga gctggtgatc ccctgtcggg tgaccagccc cgatatcacc 1500

gtgaccctga agaagttccc tctggatacc ctgatccccg acggcaagag gatcatctgg 1560

gatagcagga agggcttcat catctccgat gctacctata aggagatcgg cctgctgacc 1620

tgtgaggcta ccgtgaatgg ccacctgtac aagaccaact acctgaccca ccggcagacc 1680

aataccatca tcgacgtggt gctgagccct agccacggca tcgagctgtc cgtgggcgag 1740

aagctggtgc tggactgcac cgccaggacc gagctgaatg tgggcatcga cttcaactgg 1800

gagtacccta gcagcaagca ccagcacaag aagctggtga atagggacct gaaaactcaa 1860

tctggcagcg agatgaagaa gttcctgagc accctgacca tcgatggcgt gaccaggtcc 1920

gatcagggcc tgtacacctg tgctgcttct tccggcctga tgaccaagaa ggactccacc 1980

ttcgtgaggg tgcacgagaa g 2001

<210> 4

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagagcgtgc tgacccagcc cccttccgct agcggcaccc ctggacagag ggtgaccatc 60

agctgttccg gcagcagcag caacatcggc tccaacaccg tgaactggta ccagcagctg 120

cctggcaccg cccccaagct gctgatctat agcaacaacc agcggccctc cggcgtgcct 180

gatcggttct ccggctccaa gtccggcacc tccgcctccc tggccatctc cggtctgcag 240

agcgaggatg aggccgacta ctactgcgct acctgggacc tgagcctgaa cgcttgggtg 300

gtgttcggcg gcggcaccaa gctgaccgtg ctgggacagc ctaaggctgc tccctccgtg 360

accctgttcc ctcctagctc cgaggagctg caggctaata aggctaccct ggtgtgcctg 420

atctccgact tctatcccgg cgccgtgacc gtggcttgga aggctgactc cagccccgtg 480

aaggccggag tggagaccac caccccttcc aagcagagca acaataagta cgctgccagc 540

agctatctga gcctgacccc cgagcagtgg aagagccacc ggagctatag ctgccaggtg 600

acccacgagg gctccaccgt ggagaaaact gttgctccca ccgagtgtag c 651

Claims

1.一种双特异性抗体的生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）构建生产双特异性抗体的细胞，并进行筛选；

（2）培养步骤（1）筛选获得的细胞，获得培养液并进行分离纯化，获得双特异性抗体；

所述细胞包括哺乳动物细胞；

所述培养的方式包括分批补料培养或灌流培养；

所述分批补料培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括Dynamis™ AGT™培养基，所述补料培养基包括Cell Boost™ 7a和Cell Boost™ 7b，所述分批补料培养的温度为31℃~37℃，所述分批补料培养的pH为6.8~7.3，所述分批补料培养的溶氧为10%以上；所述Cell Boost™ 7a补料流加比例为2%~3%，所述Cell Boost™ 7b补料流加比例为0.2~0.25%；培养时间为10~14天；

所述灌流培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括Eden-300S培养基和High-Intensity Perfusion CHO培养基，所述灌流培养的温度为31℃~37℃，所述灌流培养的pH为6.8~7.3，所述灌流培养的溶氧为10%以上；所述补料培养基包括Eden-F400a和Eden-F200，所述Eden-F400a的添加量为培养体积的2.5%~12%，Eden-F200的添加量为Eden-F400a补加体积的10%培养时间为13~20天；

所述双特异性抗体包括PD-L1/VEGF双特异性抗体；

所述PD-L1/VEGF双特异性抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；

所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞；

所述分批补料培养的基础培养基中含有Pluronic® F-68 BioChemica。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体的生产方法，其特征在于，所述分批补料培养的接种密度为不低于0.15×10⁶ cells/mL。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体的生产方法，其特征在于，所述分批补料培养还包括补加葡萄糖；

所述葡萄糖的流加量为1.0~10.0 g/L。

4.根据权利要求1所述的双特异性抗体的生产方法，其特征在于，步骤（2）所述分离纯化包括以下步骤：

（1’）对所述培养液进行深层过滤，获得澄清液；

（2’）对所述澄清液进行亲和层析；

（3’）调节亲和层析产物pH并进行孵育；

（4’）调节孵育产物pH并进行深层过滤；

（5’）对深层过滤产物进行阴离子交换层析；

（6’）对阴离子交换层析产物进行阳离子交换层析；

（7’）对阳离子交换层析产物进行纳滤。

5.根据权利要求4所述的双特异性抗体的生产方法，其特征在于，步骤（1’）所述深层过滤的过滤器的滤芯包括Zeta Plus EZP滤芯E16E07A60SP02A。

6.根据权利要求4所述的双特异性抗体的生产方法，其特征在于，步骤（2’）所述亲和层析的洗脱缓冲液包括醋酸和醋酸钠；

步骤（2’）所述亲和层析的层析柱的填料包括MabSelect Prism A。

7.根据权利要求4所述的双特异性抗体的生产方法，其特征在于，步骤（3’）所述pH为3~4；

步骤（3’）所述孵育的温度为18℃~26℃，所述孵育的时间为50~70 min。

8.根据权利要求4所述的双特异性抗体的生产方法，其特征在于，步骤（5’）所述阴离子交换层析的层析柱的填料包括Capto adhere；

所述Capto adhere的载量定为≤30g/L；

步骤（5’）所述阴离子交换层析在pH为5.8~6.0下进行。

9.根据权利要求4所述的双特异性抗体的生产方法，其特征在于，步骤（6’）所述阳离子交换层析的层析柱的填料包括Ceramic CM和/或Nuvia HR S；

步骤（6’）所述阳离子交换层析的平衡缓冲液包括醋酸和醋酸钠；

步骤（6’）所述阳离子交换层析在pH为5.4~5.6下进行；

步骤（6’）所述阳离子交换层析的洗脱液包括精氨酸；

所述洗脱液中精氨酸的浓度为0.18~0.20 mol/L。

10.根据权利要求4所述的双特异性抗体的生产方法，其特征在于，所述分离纯化还包括制备抗体原液的步骤；

所述抗体原液的制备方法包括：

11.根据权利要求1-10任一项所述的双特异性抗体的生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）构建生产双特异性抗体的中国仓鼠卵巢细胞，并进行筛选；

（2）培养步骤（1）筛选获得的细胞，获得培养液；

（3）使用Zeta Plus EZP滤芯E16E07A60SP02A对所述培养液进行深层过滤，获得澄清液；

（4）使用MabSelect Prism A填充层析柱，对所述澄清液进行亲和层析，使用含有醋酸和醋酸钠的洗脱缓冲液进行洗脱；

（5）调节亲和层析产物pH为3~4，并于18℃~26℃进行孵育50~70 min；

（6）调节孵育产物pH为5.4~5.6并进行深层过滤；

（7）使用Capto adhere填充层析柱，使用含有醋酸和醋酸钠的平衡缓冲液进行柱平衡，对深层过滤产物进行阴离子交换层析；

（8）使用Ceramic CM和/或Nuvia HR S填充层析柱，使用含有醋酸和醋酸钠的平衡缓冲液进行柱平衡，对阴离子交换层析产物进行阳离子交换层析；

（9）对阳离子交换层析产物进行纳滤；

（10）对所述纳滤产物进行超滤，使用无菌过滤膜对超滤产物进行过滤，得到所述抗体原液；

所述培养的方式包括分批补料培养或灌流培养；

所述分批补料培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括Dynamis™ AGT™培养基，所述补料培养基包括Cell Boost™ 7a和Cell Boost™ 7b，所述分批补料培养的温度为31℃~37℃，所述分批补料培养的pH为6.8~7.3，所述分批补料培养的溶氧为10%以上；

所述灌流培养的培养基包括基础培养基和补料培养基，所述基础培养基包括Eden-300S培养基和High-Intensity Perfusion CHO培养基，所述灌流培养的温度为31℃~37℃，所述灌流培养的pH为6.8~7.3，所述灌流培养的溶氧为10%以上。