CN108707196B - 一种人肿瘤坏死因子ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法，该制备方法包括如下几个大步骤：1)构建人TNFR1‑ECD的原核表达载体，并将其转化入大肠杆菌DH5α菌株内；2)诱导人TNFR1‑ECD蛋白在大肠杆菌中表达；3)人TNFR1‑ECD蛋白包涵体洗涤和变性；4)人TNFR1‑ECD蛋白的复性；5)人TNFR1‑ECD蛋白纯化，使得本发明的人源TNFR1‑ECD蛋白能够在大肠杆菌细胞中表达，通过菌体破碎后沉淀蛋白的变性、复性，镍柱亲和层析以及阳离子交换层析纯化得到，具有纯度高、生物活性显著、生产成本低且制备步骤简便的特点，适合于生物医药产业大规模生产。

Description

一种人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及一种人源肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白(TNFR1-ECD)的表达和纯化方法。
背景技术
人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(tumor necrosis factor receptor typeⅠ，TNFR1)是TNF受体超家族的重要成员之一，它和TNFR2都是TNF-α(或TNF-β)的受体。TNF-α通过与TNFR1/TNFR2的特异性结合参与免疫调节、炎症、凋亡和自身免疫等生理和病理过程，而TNF-α在机体内的过量表达及TNF-α-TNFR信号通路的异常激活是破坏机体免疫稳态，导致类风湿关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病等自身免疫性疾病发生发展的重要因素。
TNFR为Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜段和胞内域构成，其胞外区(extracellulardomain，ECD)是与TNF-α结合的区域，也被称为TNF结合蛋白(TNF binding-protein，TBP)。研究发现，TNFR-ECD在体内可被酶解剪切而游离分泌出去，形成可溶性的TNFR(sTNFR)，sTNFR能够中和体液中的过量TNF-α，抑制和局限TNF-α的活性，在细胞因子网络中有重要的调节作用。一定浓度的sTNFR可以减轻关节炎等疾病的局部炎症(参考文献：GattoB.Biologics targeted at TNF:design,production and challenges.Reumatismo.2006,58(2):94-103)，如TNFR2胞外区与IgG-Fc的融合蛋白(依那西普)已在临床上治疗类风湿关节炎取得了良好的效果。
人成熟TNFR1-ECD蛋白含有190个氨基酸残基，其中第9至第190位和第20至180位氨基酸的截短体蛋白曾被报道在真核细胞中进行了融合表达(参考文献：Loetscher H,Gentz R,Zulauf M,Lustig A,Tabuchi H,Schlaeger EJ,et al.Recombinant 55-kDatumor necrosis factor(TNF)receptor.Stoichiometry of binding to TNF alpha andTNF beta and inhibition of TNF activity.J Biol Chem.1991,266(27):18324-9)，而TNFR1-ECD全长蛋白的重组表达目前没有文献报道，也尚未有人采用原核生物对全长蛋白进行融合表达。
发明内容
本发明的目的在于采用原核表达方式对人TNFR1-ECD全长蛋白进行重组表达，即提供了一种人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法。
该制备方法包括如下几个大步骤：1)构建人TNFR1-ECD的原核表达载体，并将其转化入大肠杆菌DH5α菌株内；2)诱导人TNFR1-ECD蛋白在大肠杆菌中表达；3)人TNFR1-ECD蛋白包涵体洗涤和变性；4)人TNFR1-ECD蛋白的复性；5)人TNFR1-ECD蛋白纯化。该方法在流程上简易快捷，符合工业化生产中成本低、周期短、得率高的要求。
本发明的技术方案是：采用不依赖连接酶的克隆(LIC)构建人TNFR1-ECD的原核表达载体，使用优化的条件诱导大肠杆菌表达人TNFR1-ECD蛋白，在包涵体蛋白变性过程中添加特定浓度和作用时间的还原剂和氧化剂，优化蛋白复性缓冲液的配方和蛋白复性浓度、复性时间，在复性后利用镍柱亲和层析和阳离子交换层析得到高纯度的人TNFR1-ECD蛋白，并通过等温滴定量热法(ITC)验证目的蛋白具有结合TNF-α的生物学活性。
本发明的第一方面，提供了一种构建人TNFR1-ECD的原核表达载体的方法。
人TNFR1-ECD原核表达载体的构建方法具体为：PCR扩增两端带有LIC序列的人TNFR1-ECD基因片段，以SspⅠ核酸内切酶处理包含6×组氨酸标签序列的原核表达载体(优选pMCSG7)使其线性化，使用T4DNA聚合酶处理目的基因片段和载体使二者两端产生粘性末端，室温下将二者混合后孵育20分钟，转化大肠杆菌DH5α菌株，通过菌落PCR和抽提质粒测序筛选阳性克隆。
优选的，PCR使用的引物序列为：
上游引物5’-TACTTCCAATCCAATGGCATATACCCCTCAGGGGTTATT-3’(SEQ ID NO:1)；下游引物5’-TTATCCACTTCCAATGTCATGTGGTGCCTGAGTCCTCAGT-3’(SEQ ID NO:2)。
优选的，PCR反应程序设置为：a)94℃预变性5min；b)94℃变性30s；c)58℃退火30s；d)68℃延伸45s；e)68℃终末延伸10min；f)4℃保温，第2至4步循环35次。
优选的，使用SspⅠ核酸内切酶酶切空载体pMCSG7使其线性化，酶切温度为37℃，酶切时间为2-4h。
优选的，T4DNA聚合酶对目的基因片段和载体的处理条件为22℃、45min，75℃、15min。
本发明的第二方面，提供了人TNFR1-ECD蛋白在大肠杆菌中的诱导表达方法。
人TNFR1-ECD蛋白在大肠杆菌中的诱导表达方法具体为：使用37℃的诱导温度，220rpm的转速，在LB培养基中振荡培养大肠杆菌的表达菌株BL21(DE3)，所用诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)终浓度为0.25mmol/L，诱导时间为4h。
具体操作为：挑取BL21(DE3)单克隆菌落在LB液体培养基中振摇过夜，次日以1:50的体积比将过夜培养物接种于1L含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养3h-3.5h，加入IPTG(购自AMRESCO公司)至终浓度为0.25mmol/L。调节转速为200rpm继续振摇8h，每隔2小时取适量菌液制备SDS-PAGE电泳样品。通过实验以及图2的结果可知，诱导4小时后蛋白表达量达到最大并稳定。
本发明的第三方面，提供了一种提供人TNFR1-ECD蛋白包涵体洗涤和变性的方法。
首先确定人TNFR1-ECD蛋白存在于包涵体中，具体方法为：使用30～40mL PBS缓冲液重悬菌体沉淀，置于冰浴中超声破碎菌体，设置超声功率200W，工作4s，间隔8s，时间30min。而后17000rpm 4℃离心40min，取样行SDS-PAGE电泳，如附图3显示，目的蛋白存在于破菌后的包涵体沉淀中。
人TNFR1-ECD蛋白包涵体洗涤方法具体为：使用缓冲液A重悬包涵体沉淀，冰浴超声10min(功率200W，工作4s，间隔8s)至沉淀全部溶解，高速离心20min后弃上清。重复2次后，再使用缓冲液B重悬包涵体沉淀，冰浴超声10min(功率200W，工作4s，间隔8s)至沉淀全部溶解，高速离心20min后弃上清，即得洗涤后的包涵体。
人TNFR1-ECD包涵体蛋白变性的具体方法为：使用缓冲液C重悬包涵体沉淀，室温下搅拌2h使包涵体蛋白变性；然后加入还原剂DTT至终浓度30mM，于室温下搅拌30分钟使包涵体充分溶解，再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度40mM，于室温下继续搅拌1小时，高速离心30分钟，收集上清液即得变性的人TNFR1-ECD蛋白。
本发明研究发现，在人TNFR1-ECD包涵体蛋白的变性过程中需要使用浓度为
25mmol/L以上(优选30mmol/L)的还原剂DTT，否则包涵体不会充分溶解；并且需要使用浓度为30-50mmol/L(优选40mmol/L)的氧化型谷胱甘肽处理变性蛋白，否则蛋白在后续的复性和纯化过程中会发生较大程度的降解或沉淀。
本发明的第四方面，提供人TNFR1-ECD蛋白的复性方法。
使用稀释的方法在4℃条件下将变性的人TNFR1-ECD蛋白溶液逐滴滴入包含碱性缓冲成分、还原剂及蛋白酶抑制剂的低盐复性缓冲液中，稀释比例为1:50-1:100，搅拌速度50-100rpm，复性时间8-12小时。
优选的方法为：在4℃条件下，将变性后的人TNFR1-ECD蛋白溶液以1:100的稀释比例逐滴滴入预冷的缓冲液D中，设置搅拌速度50rpm，复性10小时。
优选的，低盐复性缓冲液的盐浓度小于100mmol/L，碱性缓冲成分的pH为9.5～10.5，还原剂浓度低于5mmol/L。
本发明的第五方面，提供了人TNFR1-ECD蛋白的纯化方法。
该纯化方法包括人TNFR1-ECD蛋白的镍柱亲和层析方法以及阳离子交换层析方法。
人TNFR1-ECD蛋白的镍柱亲和层析方法具体为：将复性后的TNFR1-ECD蛋白上样于以缓冲液E平衡的Ni-NTA重力层析柱，分别使用包含20mM、50mM咪唑的缓冲液E依次流过镍柱冲洗杂蛋白，使用包含500mM咪唑的缓冲液E洗脱目的蛋白TNFR1-ECD。
人TNFR1-ECD蛋白的阳离子交换层析方法具体为：将镍柱上洗脱下的TNFR1-ECD蛋白在分子截留量为5kD的超滤离心管中将缓冲液E置换为缓冲液F，浓缩后上样于阳离子交换层析柱(优选Hitrap SP HP)，使用缓冲液F洗脱杂蛋白至流穿峰出完，再用线性梯度浓度的缓冲液G洗脱目的蛋白TNFR1-ECD，所述线性梯度为5％-100％，收集洗脱峰，浓缩后即得纯化好的人TNFR1-ECD蛋白。
本发明的第六方面，提供了一种鉴定重组人TNFR1-ECD蛋白体外生物学活性的方法。
具体为，将纯化的重组人TNFR1-ECD蛋白和TNF-α蛋白更换至缓冲液H中；在MicroCal iTC200的样品池中注入浓度为20μmol/L的TNF-α蛋白，上样针中吸入浓度为200μmol/L的重组TNFR1-ECD蛋白；在25℃恒温条件下，将TNFR1-ECD样品分为若干滴(每滴2μL，第一滴0.5μL)，逐滴加入到800rpm高速旋转的样品池内，每滴加样时间4s，两滴之间间隔120s，而后使用Origin7软件进行分析处理，拟合滴定曲线，求出两者结合的亲和力。
根据附图7所示，根据本发明的方法纯化得到的重组人TNFR1-ECD与TNF-α的结合能力为182.15nM，显示出较强的生物学活性。
本发明所使用的各个缓冲液的配方分别为：
缓冲液A：20mmol/L Tris-HCl pH8.0，200mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1mmol/LDTT，0.5％Triton X-100；
缓冲液B：20mmol/L Tris-HCl pH8.0，200mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1mmol/LDTT；
缓冲液C：50mmol/L Tris-HCl pH8.5，6mol/L Gua-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/LPMSF；
缓冲液D：50mmol/L CAPS pH10.0，50mmol/L NaCl，2mmol/L L-cysteine，2mmol/LPMSF，1mmol/L EDTA；
缓冲液E：20mmol/L Tris-HCl pH8.0，150mmol/L NaCl；
缓冲液F：50mmol/L NaH2PO4pH6.0，25mmol/LNaCl；
缓冲液G：50mmol/L NaH2PO4pH6.0，500mmol/LNaCl；
缓冲液H：50mmol/L Tris-HCl pH7.4，150mmol/L NaCl。
本发明的有益保障及效果：
使用本发明方法制备的人TNFR1-ECD蛋白经SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色鉴定蛋白的纯度大于98％，产率约为7.3mg每升菌液。ITC法测定纯化的TNFR1-ECD与TNF-α的结合能力为182.15nmol/L，显示出较强的生物学活性。
本发明采用原核表达方式对人TNFR1-ECD全长蛋白进行重组表达，大大简化了人TNFR1胞外区蛋白的包涵体变、复性和纯化技术路线，生产成本低、纯化周期短，得到的蛋白产物具有较高的纯度和活性，适宜于在生物医药工业化生产中大规模应用。
附图说明
图1为菌落PCR鉴定pMCSG7-TNFR1-ECD阳性克隆的电泳结果图；
图2为TNFR1-ECD在大肠杆菌中诱导表达的SDS-PAGE分析结果图；
图3为超声破菌后TNFR1-ECD蛋白表达分布的SDS-PAGE分析结果图；
图4为SDS-PAGE电泳分析结果图，其中(A)为TNFR1-ECD变性后的SDS-PAGE电泳分析结果图；(B)为TNFR1-ECD复性后镍柱亲和层析纯化的SDS-PAGE分析结果图；
图5为阳离子交换层析纯化人TNFR1-ECD蛋白的结果分析图，其中(A)为紫外吸收峰图谱；(B)SDS-PAGE分析结果图；
图6为纯化后浓缩的TNFR1-ECD电泳分析结果图；
图7为ITC检测TNFR1-ECD与TNF-α亲和力的结果图。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：人TNFR1-ECD的原核表达
一、TNFR1-ECD重组表达载体的构建
PCR扩增两端带有LIC序列的人TNFR1-ECD基因片段，使用引物序列为：上游引物5’-TACTTCCAATCCAATGGCATATACCCCTCAGGGGTTATT-3’(SEQ ID NO:1)，下游引物5’-TTATCCACTTCCAATGTCATGTGGTGCCTGAGTCCTCAGT-3’(SEQ ID NO:2)。使用DNA聚合酶为高保真KOD-Plus-Neo DNAPolymerase(购自TOYOBO公司)。
PCR反应程序设置为：a)94℃预变性5min；b)94℃变性30s；c)58℃退火30s；d)68℃延伸45s；e)68℃终末延伸10min；f)4℃保温，第2至4步循环35次。
使用SspⅠ核酸内切酶(购自New England Biolabs公司)酶切空载体pMCSG7(购自武汉淼灵生物科技有限公司)使其线性化，酶切温度为37℃，酶切时间为2-4h。
通过1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的基因片段TNFR1-ECD和线性化载体pMCSG7。
使用T4DNA聚合酶(购自Novagen)分别处理TNFR1-ECD片段和线性化pMCSG7使二者两端产生粘性末端，处理条件为22℃、45min，75℃、15min。室温下将二者混合后孵育20min进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素的LB固体平板培养基上培养单克隆菌落。通过菌落PCR筛选阳性克隆，所用引物同前文(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)。结果如图1所示，M为DNA分子量标准，泳道1、3和4为阳性克隆子(607bp)。
将阳性重组子接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养过夜，用质粒抽提试剂盒(购自OMEGA公司)提取质粒，测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，LB平板培养单菌落。
二、TNFR1-ECD重组蛋白在大肠杆菌中的表达
挑取BL21(DE3)单克隆菌落在LB液体培养基中振摇过夜，次日以1:50的体积比将过夜培养物接种于1L含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养3h-3.5h，加入IPTG(购自AMRESCO公司)至终浓度为0.25mM。调节转速为200rpm继续振摇8h，每隔2小时取适量菌液制备SDS-PAGE电泳样品。
结果如附图2所示，M为蛋白分子量标准，泳道0为诱导前对照，泳道1-5分别为诱导后1、2、4、6和8小时样品，结果可见诱导1小时后在24kD分子量位置处有特异的蛋白条带出现，诱导4小时后蛋白表达量达到最大并稳定。
诱导完成后4000rpm离心收集菌体，用PBS缓冲液(购于生工公司)洗涤菌体沉淀，储存于-20℃。
实施例2：TNFR1-ECD重组蛋白的纯化
一、菌体裂解
使用30-40mLPBS缓冲液重悬菌体沉淀，置于冰浴中超声破碎菌体。设置超声功率200W，工作4s，间隔8s，时间30min。17000rpm 4℃离心40min，取样行SDS-PAGE电泳，结果如附图3显示，目的蛋白存在于破菌后的包涵体沉淀中。
二、包涵体洗涤与变性
使用30-40mL缓冲液A重悬包涵体沉淀，超声10min至沉淀全部溶解，17000rpm4℃离心20min，弃上清。用缓冲液A重复洗涤2次后，再用缓冲液B洗涤一次，高速离心后弃上清液。向每1g包涵体沉淀加入20ml缓冲液C，室温搅拌2h使包涵体蛋白变性。然后加入DTT(购自AMRESCO公司)至终浓度30mM，于室温下搅拌30min使包涵体充分溶解，再加入氧化型谷胱甘肽(购自AMRESCO公司)至终浓度40mM，继续搅拌40min，于4℃17000rpm离心30min，收集上清液，取样电泳结果如附图4A所示。
缓冲液A：20mmol/L Tris-HCl pH8.0，200mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1mmol/LDTT，0.5％Triton X-100；
缓冲液B：20mmol/L Tris-HCl pH8.0，200mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1mmol/LDTT；
缓冲液C：50mmol/L Tris-HCl pH8.5，6mol/L Gua-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/LPMSF。
三、包涵体变性蛋白的复性
配制1L缓冲液D加入烧杯，置于磁力搅拌器上，调节转速50～100rpm。取10ml一次性注射器针筒接上1ml规格的针头，固定在烧杯口上。将5ml包涵体变性上清液加入注射器内，用活塞施以适当的压力使溶液缓慢滴入到下方的复性液里，缓慢搅拌2h。按照此法分2-3次滴加包涵体变性液，每次5mL，间隔1h，1L复性液内滴加的蛋白总量不超过50mg。
所述的整个复性过程在4℃进行，总时间8-12h(优选10h)。
所述的缓冲液D为：50mmol/LCAPS pH10.0，50mmol/L NaCl，2mmol/L L-cysteine，2mmol/L PMSF，1mmol/L EDTA。
四、复性后蛋白的亲和层析纯化
在4℃环境下使用0.45μm微孔滤膜(购自上海兴亚进化材料厂)过滤复性蛋白溶液去除沉淀，上样于以缓冲液E平衡过的Ni-NTA重力层析柱(购自GE公司)，用缓冲液E配制20mmol/L咪唑溶液50ml和50mmol/L咪唑溶液30ml依次流过镍柱冲洗杂蛋白，再用缓冲液E配制500mmol/L咪唑溶液20ml洗脱目的蛋白。取流穿液和各洗脱液样品行SDS-PAGE分析，结果见附图4B，500mmol/L咪唑可将目的蛋白TNFR1-ECD蛋白洗脱下来。
所述的缓冲液E为：20mmol/L Tris-HCl pH8.0，150mmol/L NaCl。
五、阳离子交换层析纯化人TNFR1-ECD蛋白
配制缓冲液F和G，0.45μm滤膜过滤后超声脱气。将镍柱上洗脱下的TNFR1-ECD蛋白在分子截留量为5kD的超滤离心管中将缓冲液E置换为缓冲液F，并浓缩至2ml以下体积。以去离子水、缓冲液G和F依次冲洗平衡阳离子交换层析柱HiTrap SP HP(购自GE公司)，设置流速1ml/min，将蛋白上样后监测280nm紫外吸收峰，在杂蛋白流穿峰走至水平后，泵入缓冲液G进行连续线性梯度洗脱，梯度5％-100％，时间30min。收集洗脱峰样品，进行SDS-PAGE电泳检测蛋白的位置和纯度，结果见附图5。
所述的缓冲液F：50mmol/L NaH2PO4pH6.0，25mmol/L NaCl。
所述的缓冲液G：50mmol/L NaH2PO4pH6.0，500mmol/L NaCl。
将纯度高的组分合并用超滤管浓缩，SDS-PAGE分析最终的纯度，如附图6所示，纯化后的TNFR1-ECD蛋白显示为单一条带，纯度大于98％。
实施例3：ITC鉴定重组人TNFR1-ECD的体外生物学活性
使用超滤管将纯化的重组蛋白和TNF-α蛋白(购自PeproTech公司)更换至缓冲液H中。在MicroCal iTC200(马尔文公司)的样品池中注入浓度为20μM的TNF-α蛋白350μl，上样针中吸入200μmol/L重组TNFR1-ECD蛋白60μl。在25℃恒温条件下，将TNFR1-ECD样品分为20滴，每滴2μl(第一滴0.5μl)，逐滴加入到800rpm高速旋转的样品池，设置每滴加样时间4s，两滴之间间隔120s。使用Origin7软件进行分析处理，拟合滴定曲线，求出两者结合的亲和力。结果见附图7，纯化的重组人TNFR1-ECD与TNF-α的结合能力为182.15nM，显示出较强的生物学活性。
所述的缓冲液H：50mmol/L Tris-HCl pH7.4，150mmol/L NaCl。
以上已对本发明的实例进行了具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 一种人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法
<130> 说明书；权利要求书
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacttccaat ccaatggcat atacccctca ggggttatt 39
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttatccactt ccaatgtcat gtggtgcctg agtcctcagt 40

Claims (6)

1.一种人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建人TNFR1-ECD的原核表达载体，并将其转化入大肠杆菌DH5α菌株内
PCR扩增两端带有LIC序列的人TNFR1-ECD基因片段，以SspⅠ核酸内切酶处理包含6×组氨酸标签序列的原核表达载体使其线性化，使用T4 DNA聚合酶处理目的基因片段和载体使二者两端产生粘性末端，室温下将二者混合后孵育20分钟，转化大肠杆菌DH5α菌株，通过菌落PCR和抽提质粒测序筛选阳性克隆，PCR使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
2)诱导人TNFR1-ECD蛋白在大肠杆菌中表达
采用37℃的诱导温度，220rpm的转速，在LB培养基中振荡培养大肠杆菌的表达菌株BL21，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0.25mM，诱导时间为4h；
3)人TNFR1-ECD蛋白包涵体洗涤和变性
采用缓冲液A重悬包涵体沉淀，冰浴超声至沉淀全部溶解，高速离心后弃上清，重复操作两次后，使用缓冲液B重悬包涵体沉淀，冰浴超声至沉淀全部溶解，高速离心后弃上清，得洗涤后的包涵体，
采用缓冲液C重悬包涵体沉淀，室温下搅拌一定时间使包涵体蛋白变性，然后加入还原剂DTT至终浓度大于25mmol/L，于室温下搅拌使包涵体充分溶解，再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度30～50mmol/L，于室温下继续搅拌，高速离心后收集上清液，即得变性的人TNFR1-ECD蛋白；
4)人TNFR1-ECD蛋白的复性
使用稀释的方法在4℃条件下将变性的人TNFR1-ECD蛋白溶液逐滴滴入包含pH为9.5～10.5的碱性缓冲成分、还原剂及蛋白酶抑制剂的低盐复性缓冲液D中，稀释比例为1:50-1:100，搅拌速度50-100rpm，复性时间8-12小时；
5)人TNFR1-ECD蛋白纯化
将复性后的TNFR1-ECD蛋白上样于以缓冲液E平衡的Ni-NTA重力层析柱，分别采用包含20mmol/L、50mmol/L咪唑的缓冲液E依次流过镍柱冲洗杂蛋白，采用包含500mmol/L咪唑的缓冲液E洗脱目的蛋白TNFR1-ECD，
将镍柱上洗脱下的TNFR1-ECD蛋白在分子截留量为5kD的超滤离心管中过滤，将缓冲液E置换为缓冲液F，浓缩后上样于阳离子交换层析柱，使用缓冲液F洗脱杂蛋白至流穿峰出完，再用5％-100％线性梯度浓度的缓冲液G洗脱目的蛋白TNFR1-ECD，收集洗脱峰，浓缩后即得纯化好的人TNFR1-ECD蛋白，
其中，缓冲液A～G的配方分别为：
缓冲液A：20mmol/L Tris-HCl pH8.0，200mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，0.5％Triton X-100；
缓冲液B：20mmol/L Tris-HCl pH8.0，200mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1mmol/L DTT；
缓冲液C：50mmol/L Tris-HCl pH8.5，6mol/L Gua-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/LPMSF；
缓冲液D：50mmol/L CAPS pH10.0，50mmol/L NaCl，2mmol/L L-cysteine，2mmol/LPMSF，1mmol/L EDTA；
缓冲液E：20mmol/L Tris-HCl pH8.0，150mmol/L NaCl；
缓冲液F：50mmol/L NaH2PO4 pH6.0，25mmol/L NaCl；
缓冲液G：50mmol/L NaH2PO4 pH6.0，500mmol/L NaCl。
2.根据权利要求1所述的人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法，其特征在于：
还包括鉴定重组人TNFR1-ECD蛋白体外生物学活性的步骤，具体为，将纯化的重组人TNFR1-ECD蛋白和TNF-α蛋白更换至缓冲液H中；在MicroCal iTC200的样品池中注入浓度为20μmol/L的TNF-α蛋白，上样针中吸入浓度为200μmol/L的重组TNFR1-ECD蛋白；在25℃恒温条件下，将TNFR1-ECD样品分为若干滴，逐滴加入到800rpm高速旋转的样品池内，每滴加样时间4s，两滴之间间隔120s，而后使用Origin7软件进行分析处理，拟合滴定曲线，求出两者结合的亲和力，
缓冲液H的配方为：50mmol/L Tris-HCl pH7.4，150mmol/L NaCl。
3.根据权利要求1所述的人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法，其特征在于：
其中，步骤1)中，PCR反应程序设置为：a)94℃预变性5min；b)94℃变性30s；c)58℃退火30s；d)68℃延伸45s；e)68℃终末延伸10min；f)4℃保温，第2至4步循环35次。
4.根据权利要求1所述的人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法，其特征在于：
其中，步骤1)中，所述原核表达载体为空载体pMCSG7，使用SspⅠ核酸内切酶酶切空载体pMCSG7使其线性化，酶切温度为37℃，酶切时间为2-4h。
5.根据权利要求1所述的人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法，其特征在于：
其中，步骤1)中，T4 DNA聚合酶对目的基因片段和载体使的处理条件为22℃45min，75℃15min。
6.根据权利要求1所述的人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法，其特征在于：
其中，步骤3)中，冰浴超声的条件为超声功率为200W，工作4s，间隔8s；高速离心的时间为20min，
所述还原剂DTT至终浓度为30mmol/L，氧化型谷胱甘肽的终浓度为40mmol/L。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A family of LIC vectors for high-throughput cloning and purification of proteins;Eschenfeldt W.H.et al;《Methods Mol Biol》;20091231;第498卷;105-115 *
Expression, in Escherichia coli, of a soluble human tumor necrosis factor receptor;Saccardo M.B.et al;《Journal of Biotechnology》;19930930;第30卷(第3期);367-378 *
sTNFR1在昆虫细胞中的表达及鉴定;高波 等;《军事医学科学院院刊》;20021231;第26卷(第4期);250-253 *
TNF受体（P55）胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达;安乃莉 等;《病毒学报》;20010630;第17卷(第2期);127-131 *
可溶性TNF受体在大肠杆菌中表达;梁小兵 等;《中华微生物学和免疫学杂志》;19990130;第19卷(第1期);76 *
可溶性肿瘤坏死因子受体（P55）和IgGFc融合蛋白原核表达载体的构建及其表达、鉴定;祖东;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑 E059-36》;20030215(第2期);摘要，第10页第1段-第21页第1段，第29页第2段-第34页第1段 *

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