KR101944121B1

KR101944121B1 - 단백질의 정제 방법

Info

Publication number: KR101944121B1
Application number: KR1020137004911A
Authority: KR
Inventors: 개빈 배리 와일드
Original assignee: 유씨비 바이오파마 에스피알엘
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2011-07-27
Publication date: 2019-01-30
Also published as: RS54085B1; CA2804099C; CA2804099A1; EP2598516B8; BR112013000177A2; IL224044A; EP2598516A2; PL2598516T3; ES2537877T3; CN103189385B; KR20130103713A; SG196862A1; US9751930B2; CN103189385A; MX337184B; EP2598516B1; JP2013535463A; SG186974A1; DK2598516T3; HRP20150639T1

Abstract

본 발명은 그람 음성 박테리아 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물로부터 재조합 단백질을 정제하는 방법을 제공하며, 상기 숙주 세포는 재조합 단백질 및 재조합 이황화물 이성질화효소 DsbC를 발현하며, 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH를 pH 5 이하로 조정하여 재조합 이황화물 이성질화효소를 침전시키는 단계; 및 b. 침전된 재조합 이황화물 이성질화효소 DsbC를 재조합 단백질로부터 분리하여 재조합 단백질 샘플을 생성시키는 단계를 포함한다.

Description

단백질의 정제 방법{PROCESS FOR PURIFYING PROTEINS}

본 발명은 그람 음성 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물로부터 재조합 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 그람 음성 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물은 단백질 이황화물 이성질화효소(disulphide isomerase)의 침전을 실시하기 위해 낮은 pH로 조정된다.

재조합 DNA 기술은 빠르게 성장하고 있으며 항체, 특히 치료용 항체의 생성에 유용하다. 재조합 유전자 발현용 시스템은 당 분야의 숙련가에게는 잘 알려져 있다. 이들 시스템에는 포유동물 세포, 곤충 세포, 진균 세포, 박테리아 세포 및 형질전환 동물 및 식물에서의 발현이 포함된다. 발현 시스템의 선택은 코딩되는 단백질의 특징, 예를 들면 번역후 변형 등에 의해 좌우된다. 다른 고려사항으로는 시간과, 특히, 필요한 품질의 재료를 원하는 양으로 생산하는데 들어가는 비용이 포함된다. 이러한 후자의 고려사항들은 많은 수의 환자들을 치료하는데 필요한 양으로 규제 승인에 요구되는 품질의 치료 항체를 생산하려는 경우 특히 중요하다.

재조합 단백질 생산에 광범위하게 사용되는 시스템은 에스케리치아 콜라이(이.콜라이)(Escherichia coli(E. coli))에서의 발현을 기반으로 한다. 이.콜라이 사용시 겪게되는 특정 문제로는 치료에 필요한 양으로 요구되는 품질의 재료를 생산하는데 있어서의 어려움이다. 구체적으로, 관련 비용 및 시간이 과도할 수 있다. 주목할만한 특정 문제점 한가지는 이.콜라이로부터 항체를 정제하는 동안 항체 수율 손실 발생이다.

비례적으로, 정제 비용은 전체 치료 항체 생산 비용의 일부분이지만, 정제 비용 비율은 상위 생산 비용이 저렴해지면 더 상승된다. 따라서, 항체의 회수 및 정제의 개선은 생산 수단과 무관하게 생산 비용을 더욱 낮추게 된다(Humphreys & Glover, Curr. Opin. Drug Discovery & Development, 2001, 4: 172-185). 따라서, 치료 항체 생산시, 구체적으로, 정제시 예를 들면 생산 수율 증가 및/또는 생산 흐름의 질을 개선시켜 시간 및/또는 비용을 절감하는 방법이 요구된다.

대개 후속 정제 단계 동안 저 생산 수율이 특히 주목받는 문제이다. 후속 정제 동안의 특정 문제는 숙주 세포로부터 치료 항체의 추출 시 방출되는 숙주 세포 단백질(HCP)의 분리에 대한 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 다수의 공정 변경이 시도되었다. 그러한 공정의 예로는 다음의 것들이 포함된다:

목적 단백질을 침전시킨 후 다른 HCP 오염물로부터 분리할 수 있다. 그러나, 치료 항체의 침전은 항체에 되돌릴 수 없는 손상을 야기시킬 수 있다. 목적 단백질을 특이적으로 침전시키는 기술은 침전물에 비단백질성 오염물을 포집시켜, 분리가 비효율적일 수 있다.

대안적으로, HCP는 치료 항체와 떨어져 침전시킬 수 있다. US7169908은 숙주 세포 불순물을 침전시키기 위해 에타크리딘 락테이트 용액을 첨가하는 것을 기술하고 있다. 그러나, 이러한 에타크리딘 락테이트 등의 시약 사용은 이것이 낙태제로서 사용되었고 완전하게 제거되지 않으면 환자에 해로울 수 있기 때문에 치료 단백질 생산에는 적합하지 않다. CHO 세포 배양물 유래의 HCP는 단백질 정제를 위해 소형 분자 및 pH 조정을 이용해 침전된바 있다(Arunakumari A. et al. Advances in Non-Protein A Purification Processes for Human Monoclonal Antibodies Supplement to BioPharm International March 2009 p 22-26).

이러한 방법들이 숙주 세포 오염물로부터 치료 항체를 정제하는데 도움을 주기도 하였지만, 후속 하위 공정들을 용이하게 하기 위해 치료 항체의 특성에 부정적인 영향을 주지 않으면서 미생물 숙주 세포계로부터 HCP의 양을 줄이는 개선 방법을 제공해야한다는 요구가 여전히 존재한다.

본 발명자들이 더욱 발견한 것은 숙주에 의한 일부 샤페론 단백질, 예를 들면 이황화물 이성질화효소, 예컨대 DsbC의 발현이 항체 또는 이의 단편의 발현도를 증가시키는데 유용할 수 있다는 것이다. 그러나, 이러한 샤페론 단백질은 상당한 수준으로 발현되고 제거가 필요한 공정상의 대량 부산물이 될 수 있다.

대량의 오염물 제거는 컬럼 크로마토그래피 등과 같은 방법들이 컬럼 파울링 등에 기인해 대량의 단백질 오염물을 제거하는데 어려움이 있고 대량의 시약이나 용매를 사용할 필요가 있기 때문에 고될 수 있다.

단리된 DsbC를 테스트할 경우 이는 낮은 pH 예컨대 pH 3에서 가용성이다. 하지만, 본 발명자들은 놀랍게도 pH 5 이하로 pH를 조정하는 것을 사용해 그람 음성 박테리아 숙주 세포로부터 재조합 이황화물 이성질화효소를 침전시킬 수 있고 따라서 목적 재조합 단백질, 예컨대 치료 항체의 후속 공정을 용이하게 할 수 있음을 발견했다.

일 측면에서 숙주 세포, 예를 들면 재조합 단백질 및 재조합 이황화물 이성질화효소를 발현하는 그람 음성 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물로부터 재조합 단백질을 정제하는 방법을 제공하고, 이 방법은

a. 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH를 pH 5 이하로 조정하여 재조합 이황화물 이성질화효소를 침전시키는 단계; 및

b. 침전된 재조합 이황화물 이성질화효소를 재조합 단백질로부터 분리하여 재조합 단백질 샘플을 제공하는 단계

를 포함한다.

본 발명은 또한 숙주 세포 재조합 이황화물 이성질화효소를 침전시킨 후, 침전된 숙주 세포 재조합 이황화물 이성질화효소를 재조합 단백질로부터 분리하고 정제된 재조합 단백질 샘플을 제공하기 위한, 재조합 단백질을 코딩하는 발현 벡터로 형질전환된 그람 음성 박테리아 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH를 pH 5 이하로 조정하는 단계의 용도를 제공한다.

일 구체예에서 그람 음성 박테리아 숙주 세포 샘플 또는 상기 숙주 세포의 추출물로부터 재조합 항체 또는 이의 결합 단편을 정제하는 방법을 제공하고, 상기 숙주 세포는 재조합 항체 또는 이의 결합 단편 및 재조합 이황화물 이성질화효소 DsbC를 발현하며, 이 방법은

a. 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH를 pH 3.5∼5의 범위로 조정하여 재조합 DsbC를 침전시키는 단계; 및

b. 침전된 재조합 DsbC를 분리하여 정제된 재조합 항체 또는 이의 단편을 포함하는 샘플을 제공하는 단계

를 포함한다.

놀랍게도 이러한 pH 조정 단계는 용액으로 부터 상당량의 숙주 세포 재조합 이황화물 이성질화효소를 침전시켜서 목적 재조합 단백질로부터 숙주 세포 재조합 이황화물 이성질화효소를 분리할 수 있게 한다. 이는 후속 공정, 특히 크로마토그래피 컬럼 상의 결합 부위에 대해 재조합 단백질과 경쟁하는 용액 내 숙주 세포 이황화물 이성질화효소를 감소시킴으로써, 임의의 후속 크로마토그래피 단계 예컨대 비친화성 크로마토그래피 포획을 용이하게 한다. 따라서, 크로마토그래피 컬럼 상에 HCP의 충전이 최소화되고 동일 크기 및 갯수의 크로마토그래피 컬럼을 사용시 목적 재조합 단백질의 수율은 향상된다. 이는 후속 하류 정제의 시간과 비용을 절감시킨다.

흥미롭게도, 순수한 DsbC는 pH 3.0∼5 범위에서는 침전되지 않는다(도 4 참조). 그러나, 항체 또는 이의 결합 단편을 발현하는 그람 음성 세포의 복합 환경에 존재 시 또는 대안적으로 상기 세포 내용물의 일부분 또는 전부가 존재하면 DsbC는 침전된다. 임의 이론에 한정되지 않으나, 정상적으로는 그 단백질이 pH 3.5 내지 5 범위에서 가용성일지라도 숙주 세포 또는 이의 추출물의 복합 매트릭스 환경이 이러한 pH 범위에서, 이황화물 이성질화효소, 예컨대 DsbC의 침전을 촉매하는 것으로 가정할 수 있다. 아마도 침전이 시작되면 계속되고 확대되는 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 방법은 대규모일 때 사용하기 적합하며 따라서 항체 등의 단백질의 상업적 공정에 매우 유용하다.

도면의 간단한 설명
도 1은 pH 6.9의 대조군과 비교하여 pH를 pH 5.0, pH 4.5 또는 pH 3.0으로 조정한 후 숙주 세포 용액의 관찰된 침전을 도시한 도면이다.
도 2는 pH 7의 대조군과 비교하여 pH를 pH 5, pH 4.5 또는 pH 3으로 조정 후 숙주 세포 용액에 대한 시간(T) = 0에서 역상 HPLC 분석의 크로마토그램을 도시한 도면이다.
도 3은 pH 7의 대조군과 비교하여 pH를 pH 5, pH 4.5 또는 pH 3으로 조정한 후 숙주 세포 용액에 대한 T = 0에서 역상 HPLC 분석의 개별 크로마토그램을 도시한 도면이다.
도 4는 pH 7의 대조군과 비교하여 상이한 시간 간격 후 pH 3으로 pH 조정 후 DsbC 포함 용액에 대한 역상 HPLC 분석의 개별 크로마토그램을 도시한 도면이다.
도 5는 pH 7의 대조군과 비교하여 pH를 pH 5, pH 4.5 또는 pH 3으로 조정 후 숙주 세포 용액을 다양한 시점에서 역상 HPLC 분석한 DsbC에 대한 전체 피크 영역을 도시한 도면이다.
도 6은 pH 7의 대조군과 비교하여 pH를 pH 5, pH 4.5 또는 pH 3으로 조정한 후 숙주 세포 용액을 다앙한 시점에서 역상 HPLC 분석한 DBP에 대한 전체 피크 영역을 도시한 도면이다.
도 7은 pH 6.9의 대조군과 비교하여 pH를 pH 5, pH 4.5 또는 pH 3으로 조정한 후 숙주 세포 용액에 대한 SDS-PAGE 분석 겔을 도시한 도면이다.
도 8은 서열번호 1 내지 16의 서열을 도시한 도면이다.
도 9는 라이실-말레이미드에 시스테인 잔기를 통해 공유 결합된 변형 항-TNF Fab' 단편을 포함하는 CDP870이라 불리는 화합물을 구조를 도시한 도면이며, 여기서 라이실 잔기 상의 각 아미노 기는 메톡시 PEG 잔기에 공유 결합되어 있으며, n은 약 420이다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 CDP870의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 CDP870의 CDRH2의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 CDP870의 CDRH3의 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 CDP870의 CDRL1의 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 CDP870의 CDRL2의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 CDP870의 CDRL3의 아미노산 서열이다.
서열번호 7은 CDP870 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 예상 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 CDP870 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 예상 아미노산 서열이다.
서열번호 9는 그라프트된 항-TNFα Fab CDP870 경쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 그라프트된 항-TNFα Fab CDP870 중쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 his-태깅된 DsbC의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 12는 his-태깅된 DsbC의 아미노산 서열이다.
서열번호 13은 처음 26개 아미노산 잔기인 신호 서열을 포함하는 야생형 spr 유전자의 서열이다.
서열번호 14는 신호 서열이 없는 야생형 spr 유전자의 서열이다.
서열번호 15는 출발 코돈의 6개 뉴클레오티드 ATGAAT 상향부를 포함하는 돌연변이 넉아웃 Tsp 유전자의 DNA 서열이다.
서열번호 16은 이.콜라이 Fab 발현을 위한 유전자간 서열 2(IGS2)를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 카세트의 서열이다.

본 발명을 이하 보다 상세하게 설명한다.

달리 언급하지 않으면, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "펩티드"는 10개 이하의 아미노산을 지칭하고자 한다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 NA, cDNA, RNA 및 mRNA를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)"은 "포괄하는(including)"으로 해석되어야 한다.

"세포", "세포주", "세포 배양물" 및 "균주" 등의 표현은 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 숙주 세포 추출물(이의 추출물)은 숙주 세포 내용물, 즉

. 세포로부터 일부 또는 전체 화학물을 추출하고자 부분 또는 전체 세포 용해로 얻은 물질, 또는

. 세포로부터 발현되는 1 이상의 단백질이 액상으로 방출되게하는 공정을 세포에 실시하여 얻은 물질

의 일부분 또는 전부를 의미한다.

본원에서 사용되는 숙주 세포 내용물을 형성하는 화학물 및 물질은 세포 내에서 유래하는 액체, 단백질, 지질, 당, 지질다당류, 펩티도글리칸, 플라스미드 및 염색체 DNA, RNA, 소형 분자 예컨대 아미노산, 금속 이온, 리독스 활성 분자, tRNA 및 상기 이들 전체의 단편들을 의미한다.

세포로부터 1 이상의 단백질을 방출하는 방법은 열처리 및/또는 세포에 대한 비용해 가압 실시 및/또는 완충액, 킬레이팅화제, 세제를 포함한 화학제의 사용, 물리적 파괴 및/또는 초음파 에너지 사용 및/또는 기계적 전단력 사용을 포함한다.

본원에서 사용되는 그람 음성 세포 샘플은 그람 음성 세포, 예를 들면 2 이상의 그람 음성 세포의 개체군, 보다 구체적으로는 발효 공정에 사용되는 뱃치, 특히 상업적 발효 공정에 사용되는 뱃치를 의미한다.

본원에서 사용되는 정제된 재조합 항체 또는 이의 결합 단편은 항체 또는 단편 형태를 의미하고자 하는 것이며, 여기서는 상응하는 미처리 형태에서 보다 불순물 및 오염물이 적게 존재한다. 항체 또는 단편은 여전히 후속 정제 단계를 필요로할 수 있으므로 반드시 절대적인 용어인 것은 아니다.

일 구체예에서 본 발명에 따른 방법으로 제공되는 정제된 재조합 항체 또는 이의 결합 단편은 실질적으로 순수하다.

본원에서 사용되는 실질적으로 순수한은 항체 또는 이의 결합 단편이 90% 이상 순수한 것, 예를 들면 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 순수한 것, 특히 95% 이상 순수한 것을 의미한다.

본원에 기술된 발명은 재조합 단백질 분자를 코딩하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 샘플을 배양한 후 pH를 5 또는 그 이하로 조정하는 단계를 사용하여 재조합 이황화물 이성질화효소를 침전시킬 수 있고 이것이 단백질 정제에 상당히 유익한 영향을 미친다는 예상치못한 놀라운 관찰을 기반으로 한다.

본 발명의 단계 a)는 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH를 pH 5 또는 그 이하, pH 5 미만, pH 4.5 또는 그 이하 또는 pH 3 또는 그 이하로 조정하는 것을 필요로 한다. 바람직한 구체예에서, 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH는 pH 4.5 또는 그 이하, 보다 바람직하게는 대략 pH 4.5로 조정된다. 본 발명자들은 pH 4.5가 재조합 DsbC를 침전시키고 분리시키는데 특히 유리함을 발견하였다.

일 구체예에서 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH는 pH 3 미만 또는 다르게는 pH 3.5 미만으로 pH를 조정되지 않는다. 따라서, 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH는 바람직하게는 pH 3∼4.9, pH 3.5∼4.9, pH 3~4.5 또는 pH 3.5∼4.5로 조정된다.

일 구체예에서 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH는 pH 3 또는 그 이하, 보다 바람직하게는 대략 pH 3으로 조정된다. 본 발명자들은 pH 3 이하가 재조합 Dsbc 및 또한 숙주 세포 디펩티드 결합 단백질을 침전시키고 분리시키는데 유리함을 발견하였다.

그러나, pH 3 또는 그 이하가 숙주 세포 또는 추출물로부터 DsbC 단백질을 침전시키는데 적합하지만 낮은 pH는 항체 또는 이의 결합 단편의 폴딩된 구조(conformation)를 변형시킬 수 있어서 공정의 모든 매개변수를 고려할 경우에는 최적이지 않을 수 있다.

따라서 숙주 세포 단백질을 침전시키는데 최적인 pH는 세포에 의해 발현되는 특정 항체 또는 항체 단편 및 구체적으로는 관련 pH 범위 내에서 그 특정 항체 또는 항체 단편의 안정성에 의존적이다.

1 이상의 이황화물 이성질화효소, 예를 들면 적어도 DsbC는 공정을 적용하면서 침전된다. 일 구체예에서 1 이상의 다른 숙주 세포 단백질은 또한 공정을 적용하면서 침전된다.

본 발명의 방법의 단계 a)에서, 숙주 세포 용액 또는 이의 추출물은 임의의 후속 정제 단계, 예컨대 원심분리 및/또는 여과를 수행하기 전에 및/또는 대체로 용액의 pH를 상승시키기 위한 추가의 pH 조정 전에 임의의 적절한 기간 동안 보다 낮은 pH, 예를 들면 pH 5 또는 그 이하로 유지될 수 있다. 대체로, 숙주 세포 용액 또는 이의 추출물은 24시간 또는 그 이하, 12시간 또는 그 이하, 6시간 또는 그 이하, 5시간 또는 그 이하, 2시간 또는 그 이하, 1시간 또는 그 이하, 30분 또는 그 이하, 10분 또는 그 이하 또는 7분 또는 그 이하 동안 유지될 수 있다.

본 발명의 방법을 적용한 후 pH는 예를 들면 추가, 즉 후속 공정 예컨대 추가 정제, 예를 들면 음이온 교환 크로마토그래피를 적용하는 정제를 수행하기 전에 pH 6, 6.5 또는 7로 상승될 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 a)는 임의의 적절한 온도, 예를 들면 실온, 예컨대 20-23℃ 또는 저온 예컨대 1-10℃에서 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명을 수행하기 위한 적절한 온도 범위는 적어도 1∼30℃를 포함한다.

숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH 조정은 pH를 변화시킬 수 있는 임의의 적절한 제제를 사용해 수행될 수 있다. 적절한 제제의 예로는 빙초산, 수산화나트륨, 아세트산나트륨 또는 트리스 베이스, 및 이의 조합이다. 제제는 임의의 적절한 농도 예컨대 30 또는 60%(v/v) 빙초산, 1 M 수산화나트륨, 1 M 아세트산나트륨, 및 2 M 또는 3 M 트리스 베이스일 수 있다.

이들 제제 중 1 이상은 예를 들면 이들이 무독성이므로 치료 단백질의 정제시 재조합 이황화물 이성질화효소를 침전 및 제거할 수 있어서, 본 발명에 따른 방법에 사용하는데 특히 유리하다.

이황화물 이성질화효소는 단백질들이 폴딩시 단백질 내 시스테인 간 이황화 결합의 형성 및 파괴를 촉매하는 효소이다. 단백질 이황화물 이성질화효소는 재조합 단백질의 추출 시 숙주 세포로부터 방출된다. 본 발명의 방법에 사용된 숙주 세포는 재조합 이황화물 이성질화효소를 생성하며, 따라서 재조합 이황화물 이성질화효소는 상당한 비율의 오염된 숙주 세포 단백질을 구성한다. 본 발명은 재조합 단백질로부터 재조합 이황화물 이성질화효소를 제거하기 위한 시간 및 비용 절감 수단을 제공한다. 재조합 이황화물 이성질화효소, 예컨대 DsbC는 N 말단 및/또는 C 말단에 히스티딘 태그(his-태그)를 포함할 수 있다.

히스티딘 태그가 유용한데 그 이유는 DsbC 오염물이 항체 또는 이의 결합 단편으로부터 제거됨을 보여주어 효과적으로 모니터링 가능케 하기 때문이다. 이는 중요한데 왜냐면 DsbC의 존재는 야생형 이.콜라이 유래의 세포물에 대해 생성된 다클론 혈청을 사용시 검출이 어려울 수 있기 때문인데 표준 다클론 혈청은 DsbC에 대해 불충분하게 반응성이거나 또는 비반응성일 수 있어서, 높은 수준으로 과발현되는 경우에도 DsbC를 검출할 수 없기 때문이다. 예컨대 폴리-His 등과 같은 검출 태그의 존재는 과량으로 과발현된 DsbC의 제거를 감응성 면역검출법을 사용해 모니터링하고 확인할 수 있게 한다.

바람직한 구체예에서, 재조합 이황화물 이성질화효소는 DsbC이다. DsbC는 이.콜라이에서 이황화 결합 형성을 촉매하는 이.콜라이의 주변세포질에 존재하는 원핵생물 단백질이다. DsbC는 아미노산 서열 길이가 236개(신호 펩티드 포함)이고 분자량이 25.6 KDa(UniProt No. P0AEG6)이다. DsbC는 1994년에 처음 동정되었다([Missiakas et al. The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation, The EMBO Journal vol 1, no 8, p2013-2020, 1994] 및 [Shevchik et al. Characterization of DsbC, a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli with disulfide isomerase activity, The EMBO Jounral vol 13, no 8, p2007-2012, 1994]). DsbC 단백질은 N 말단 및/또는 C 말단에 히스티딘 태그(his-태그)를 포함할 수 있다.

DsBc의 예상 pI는 5.7이고 his-태깅된 DsbC의 예상 pI는 6.3이다. 단백질의 pI는 다양한 시판 및 무료의 공공 소프트웨어 및 온라인 pI 예상 도구 예컨대 ExPASy ProtParam을 사용해 예상할 수 있다.

단백질은 용액의 pH가 단백질의 pI를 지나면 침전하는 것을 예상할 수 있다. 그러나, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 pH 3으로 조정시 숙주 세포 또는 숙주 세포 추출물이 없는 DsbC(his-태깅) 용액은 침전되지 않는데 DsbC의 양이 pH 조정 이후 감소되지 않기 때문이다. 놀랍게도, DsbC는 재조합 DsbC를 포함하는 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물을 pH 5 보다 낮게 pH 조정을 실시하면 DsbC가 침전되며 도 3에 도시한 바와 같이 상당량의 DsbC가 침전되어 목적 재조합 단백질로부터 분리시킬 수 있다. 따라서, 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물로부터 침전을 가능케하는데 어떠한 pH가 요구되는지에 대해, 단백질의 예상 pI로부터 예측하기란 가능치 않다.

본원에서 사용되는 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 기술을 사용해 제작 또는 생산되는 단백질을 의미한다. 이황화물 이성질화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리아 세포에 존재하는 이황화물 이성질화효소를 코딩하는 내생성 서열과 동일할 수 있다. 다르게, 이황화물 이성질화효소를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 제한효소 부위가 제거된, 야생형 이황화물 이성질화효소 서열의 돌연변이형이다. 이황화물 이성질화효소가 DsbC인 구체예에서, 제한효소 부위 EcoRI은 제거되고/되거나 his-태깅을 코딩하는 서열이 부가될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 예시적인 변형 DsbC 뉴클레오티드 서열은 서열번호 11에 도시하였고, 이는 서열번호 12에는 his-태깅된 DsbC 아미노산 서열을 코딩한다.

일 구체예에서 돌연변이된 DsbC는 -CXXC-로 표시되는 돌연변이된 활성 부위를 갖는 DsbC로 구성되며, 여기서 XX는 TF, GF, HH, NY, SF, MF, VH, SH, RF, FA, GA, MA, GI, AV, PS, QA, SV, PR, PP, AL, PL, FL, TR, LL, VL, QL, LQ이다.

본 발명의 방법의 단계 a) 전에, 이 방법은 재조합 단백질 및 재조합 이황화물 이성질화효소를 코딩하는 1 이상의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 샘플을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플은 단백질의 소규모 생산부터 상업적 목적의 대규모 단백질 제조까지 임의의 적절한 규모일 수 있다.

일 구체예에서, 단백질이 항체인 경우, 숙주 세포로부터 생산되는 재조합 항체는 기능성 및 비기능성 항체의 혼합물일 수 있다.

숙주 세포는 세포에 형질전환된 적절한 발현 벡터 상에 존재하고/하거나 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있는 이황화물 이성질화효소를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게 이황화물 이성질화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 내 발현 벡터에 존재하여서 숙주 세포의 게놈에 최소의 파괴만을 일으킨다. 재조합 단백질 및 재조합 이황화물 이성질화효소는 동일한 발현 벡터에 존재하거나 또는 개별 발현 벡터에 존재할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 세포는 그람 음성 박테리아이다. 가장 바람직하게, 세포는 이.콜라이이다. 세포는 유전적으로 조작시킨 재조합 세포이다. 이.콜라이 숙주 세포는 재조합 단백질을 생산할 수 있는 돌연변이 균주이다. 재조합 이.콜라이 숙주 세포는 MC4100, TGI, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XLlBlue 및 JM109를 포함하는 임의의 적절한 이.콜라이 균주로부터 유도될 수 있다. 일례로는 재조합 단백질 발효를 위해 통용되는 숙주 균주인 이.콜라이 W3110(ATCC 27,325)가 있다. 또 다른 예들로는 변형된 이.콜라이 균주, 예를 들면 물질대사 돌연변이체 및 프로테아제 결핍 균주가 포함된다.

숙주 세포는 재조합 이황화물 이성질화효소를 생산하도록 유전적으로 조작된다. 재조합 이황화물 이성질화효소를 생산하는 숙주 세포는 재조합 이황화물 이성질화효소의 존재가 세포 용해를 줄일 수 있고 재조합 단백질의 처리를 보조할 수 있기 때문에 특히 유용하다.

바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 his-태깅된 DsbC를 포함하여, 재조합 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 1 이상의 추가 유전적 변형을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 숙주 세포는 프로테아제 활성이 감소된 것일 수 있는데, 여기서 세포는 프로테아제 활성이 감소된 Tsp 단백질을 코딩하는 돌연변이 Tsp 유전자를 포함하거나 또는 넉아웃 돌연변이 Tsp 유전자이다.

예를 들면, 숙주 세포는 아생형 세포와 비교하여 Tsp 단백질 활성이 감소된 것일 수 있다. Tsp(Prc라고도 알려짐)는 60 kDa의 주변세포질 프로테아제이다. Tsp의 처음 알려진 기질은 페니실린-결합 단백질-3(PBP3)([Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli; Nagasawa H, Sakagami Y, Suzuki A, Suzuki H, Hara H, Hirota Y. J Bacterid. 1989 Nov;171(11):5890-3] 및 [Cloning, mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3; Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y. J Bacteriol. 1991 Aug;173 (15):4799-813])이지만 Tsp는 또한 파지 꼬리 단백질을 절단할 수 있다는 것이 이후에 밝혀졌고, 따라서 꼬리 특이적 프로테아제(Tail Specificr Protease)(Tsp)로 재명명되었다(Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)).

이러한 구체예에서 세포는 야생형 세포와 비교하여 Tsp 단백질 활성이 감소되었다. "야생형 세포와 비교하여 감소된 Tsp 단백질 활성"이란 표현은 세포의 Tsp 활성이 야생형 세포의 Tsp 활성과 비교하여 감소되었음을 의미한다. 세포는 Tsp 활성이 감소되도록 임의의 적절한 수단을 통해 변형될 수 있다. 일 구체예에서 감소된 Tsp 활성은 Tsp를 코딩하는 내생성 폴리뉴클레오티드 및/또는 관련된 조절 발현 서열의 변형에 의한다. 변형은 Tsp 유전자 전사 및 번역을 감소 또는 중지시키거나 또는 야생형 Tsp 단백질과 비교해 프로테아제 활성이 감소된 발현 Tsp 단백질을 제공할 수 있다. 일 구체예에서 관련 조절 발현 서열은 Tsp 발현이 감소되도록 변형된다. 예를 들면, Tsp 유전자에 대한 프로모터는 유전자의 발현을 방해하도록 돌연변이될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 세포는 프로테아제 활성이 감소된 Tsp 단백질을 코딩하는 돌연변이 Tsp 유전자 또는 넉아웃 돌연변이 Tsp 유전자를 보유한다. 바람직하게, 염색체 Tsp 유전자가 돌연변이된다.

Tsp(prc) 활성 감소는 목적 단백질의 단백질가수분해를 줄이는데 바람직하다. 하지만, 프로테아제 prc가 결여된 세포는 낮은 삼투도에서 감열성 성장을 보이는 것으로 확인되었다. [Hara et al]은 유전자외적(extragenic) 서프레서(spr) 돌연변이를 포함하는 내열성 복귀돌연변이체를 단리하였다(Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)). Spr은 18 kDa의 막 결합 주변세포질 프로테아제이며 spr의 기질은 세포 분열 동안 세포벽 가수분해에 관여하는 외막의 펩티도글리칸 및 Tsp이다. spr 유전자는 UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_ECOLI)로서 지정되었다. 돌연변이체 spr 유전자를 포함하는 개선된 프로테아제 결핍 균주가 보고되었다. [Chen et al](Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechnol Bioeng. 2004 Mar 5;85(5):463-74)에는 유전자의 상류 및 하류 영역을 증폭시키고 이들을 선별 마커 및 sprW 174R 돌연변이를 포함하는 벡터에 함께 결찰시켜서, prc(Tsp) 및 다른 프로테아제, DegP에 상이한 돌연변이 조합을 보유하는 이.콜라이 균주를 제작하였음이 기술되어 있다(에스케리치아 콜라이의 주변세포질에 재조합 항체 단편을 높은 수준으로 축적시키는 것은 삼중-돌연변이체(△DegP △prc sprW174R) 숙주 균주가 필요함).

spr 단백질의 야생형 아미노산 서열은 N 말단에 신호 서열을 갖는 서열번호 13 및 26개 아미노산의 신호 서열이 없는 서열번호 14에 도시하였다(UniProt 기탁 번호 P0AFV4에 따름). 본 발명에서 spr 단백질 서열의 아미노선 넘버링은 신호 서열을 포함한다. 따라서, spr 단백질의 아미노산 1은 서열번호 13에 도시된 제1 아미노산(Met)이다.

추가 구체예에서, 세포는 돌연변이된 spr 유전자를 포함한다. spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자는 C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, H157 및 W174에서 선택된 1 이상의 아미노산에 돌연변이를 가질 수 있다. 바람직하게 돌연변이체 spr 유전자는 C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 및 H157에서 선택된 1 이상의 아미노산에 돌연변이를 갖는 spr 단백질을 코딩한다. 바람직하게, 돌연변이체 spr 유전자는 S95, V98, Y115, D133, V135 및 G147에서 선택된 1 이상의 아미노산에 돌연변이를 갖는 spr 단백질을 코딩한다. spr 돌연변이는 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 성장 표현형을 억제할 수 있다.

아미노산 C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, H157 및 W174 중 1 이상은 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 spr 단백질을 생성하는 임의의 적절한 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, S95, V98, Y115, D133 및 V135 중 1 이상은 소형 아미노산 예컨대 Gly 또는 Ala로 돌연변이될 수 있다. 바람직한 구체예예서, spr 단백질은 이하의 돌연변이 중 1 이상을 포함한다: C94A, S95F, V98E, Y1 15F, D133A, V135D 또는 G, H145A, G147C 및 H157A.

추가 구체예에서, 돌연변이된 spr 유전자는 돌연변이 W174R을 갖는 spr 단백질을 코딩한다. 다른 구체예에서, spr 단백질은 돌연변이 W174R을 갖지 않는다.

본원에서 치환된 돌연변이체의 지정은 문자 이후에 번호가 후속되고 문자가 후속되는 것으로 이루어진다. 처음 문자는 야생형 단백질에서의 아미노산을 지정한다. 번호는 아미노산 치환이 이루어진 아미노산 위치를 의미하고 두번째 문자는 야생형 아미노산을 치환하는데 사용된 아미노산을 표시한다.

따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 사용된 세포는 상기 정의된 바와 같이, 돌연변이된 spr 유전자 및 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

추가의 바람직한 구체에예서, 본 발명에서 사용되는 세포는 야생형 세포와 비교하여 Tsp 단백질 활성이 감소되었고 상기 정의된 바와 같이, 돌연변이된 spr 유전자 및 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일 구체예에서 숙주 세포는 샤페론 활성을 갖고 프로테아제 활성이 감소된 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자 및/도는 돌연변이된 ptr 유전자를 포함하며, 여기서 돌연변이된 ptr 유전자는 프로테아제 활성이 감소된 프로테아제 III 단백질을 코딩하거나 또는 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자 및/또는 돌연변이된 OmpT 유전자이고, 여기서 돌연변이된 OmpT 유전자는 프로테아제 활성이 감소된 OmpT 단백질을 코딩하거나 또는 넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자이다.

일 구체예에서 숙주 세포는 다음과 같은 1 이상의 단백질을 발현한다:

. 단백질 폴딩을 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 FkpA, Skp, SurA, PPiA 및 PPiD; 및/또는

. 단백질 분비 또는 전좌를 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY and Lep; 및/또는

. 이황화 결합 형성을 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

상기 단백질 중 1 이상은 세포의 게놈에 통합되고/되거나 발현 벡터에 삽입될 수 있다.

일 구체예에서 숙주 세포는 1 이상의 하기 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다:

. 단백질 폴딩을 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, FkpA, Skp, SurA, PPiA 및 PPiD;

. 단백질 분비 또는 전좌를 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY 및 Lep; 및

일 구체예에서 본 발명에서 사용되는 세포는 야생형 세포와 비교하여 Tsp 단백질 활성이 감소되고 상기 정의된 바와 같이, 돌연변이된 spr 유전자 및 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 정의된 바와 같이, 돌연변이된 spr 유전자 및 DsbC, 및 FkpA 및/또는 Skp를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 방법을 사용해 생산된 재조합 단백질은 생산 규모 및 단백질 성질에 따라서, 숙주 세포 배양 상등에 또는 이.콜라이 숙주 세포의 주변세포질에서 대체로 발현된다. 이들 구획에 단백질을 표적화하는 방법은 당분야에 공지이며, 이하 문헌을 참조한다: [Makrides, Microbiological Reviews, 1996, 60, 512-538]. 이.콜라이의 주변세포질로 단백질을 지정하는 적절한 신호 서열의 예에는 이.콜라이 PhoA, OmpA, OmpT, LamB 및 OmpF 신호 서열이 포함된다. 단백질은 천연 분비 경로에 의존하거나 또는 단백질 분비가 일어나도록 외막의 제한 누수를 유도하여 상등액으로 표적화할 수 있고 이의 예로는 pelB 리더, 단백질 A 리더의 사용, 박테리오신 방출 단백질의 공동발현, 배양 배지에 글리신 부가와 함께 미토마이신-유도 박테리오신 방출 단백질의 사용 및 막 투과성을 위한 kil 유전자의 공동발현 등이 있다. 가장 바람직하게, 본 발명의 방법에서는, 재조합 단백질은 숙주 이.콜라이의 주변세포질에서 발현된다.

이.콜라이 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현은 또한 유도성 시스템의 제어 하에 존재하여서, 이.콜라이에서 재조합 단백질의 발현이 유도성 프로모터의 제어하에 존재하게 된다. 이.콜라이에서 사용하기 적합한 많은 유도성 프로모터가 당분야에 공지이며, 프로모터에 따라서, 재조합 단백질의 발현은 인자들, 예컨대 온도 또는 성장 배지 내 특정 물질의 농도 등을 가변화시켜 유도시킬 수 있다(Baneyx, Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10:411-421; Goldstein and Doi, 1995, Biotechnol.Annu.Rev, 105-128). 유도성 프로모터의 예로는 락토스 또는 비가수분해성 락토스 유사체, 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)에 의해 유도될 수 있는 이. 콜라이 lac, tac, 및 trc 프로모터, 및 인산염, 트립토판 및 L-아라비노스에 각각 의해 유도되는 phoA, trp 및 araBAD 프로모터가 포함된다. 발현은 예를 들면 유도가 온도 의존적인 경우 온도를 변화시키거나 또는 유도물질을 부가하여 유도시킬 수 있다. 재조합 단백질 발현의 유도가 배양물에 유도물질을 부가하여 이루어지는 경우 그 유도물질은 발효 시스템 및 유도물질에 따라 임의의 적절한 방법으로 부가될 수 있는데, 유도물질은 예를 들면 단회 또는 다수회 부가에 의해 또는 공급물을 통한 유도물질의 점진적 부가에 의해 부가될 수 있다. 유도물질의 부가와 실제 단백질 발현 유도 간에 지연이 있을 수 있는데 예를 들면 유도물질이 락토스인 경우 이전에 존재하는 탄소원이 락토스에 앞서 이용되면서 단백질 발현 유도 전에 지연이 존재할 수 있다.

이.콜라이 숙주 세포 배양물(발효물)은 이.콜라이의 성장 및 재조합 단백질의 발현을 지원하는 임의의 배지에서 배양될 수 있다. 배지는 [Pirt S.J. (1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publications]에서 제공하는 바와 같은, 임의의 화학 한정 배지일 수 있고, 적절하다면 본원에 기술된 대로 성장률을 제거하기 위해 변형이 가해질 수 있다. 적절한 배지의 예로는 [Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26:309-320]에 기술된 'SM6E'가 있다.

이.콜라이 숙주 세포의 배양은 필요한 생산 규모에 따라서 진탕 플라스크 또는 발효배양기 등의 임의의 적절한 용기에서 수행할 수 있다. 1,000 리터 이상에서 최대 약 100,000 리터 용량의 다양한 대규모 발효배양기를 이용할 수 있다. 바람직하게, 1,000 내지 50,000 리터, 보다 바람직하게는 1,000 내지 10,000 또는 12,000 리터의 발효배양기를 사용한다. 0.5 내지 1,000 리터 용량의 보다 작은 규모의 발효배양기를 사용할 수도 있다.

이.콜라이의 발효는 원하는 단백질 및 수율에 따라 예를 들면 연속, 뱃치 또는 유가배양 방식 등의 임의의 적절한 시스템에서 수행될 수 있다(Thiry & Cingolani, 2002, Trends in Biotechnology, 20: 103-105). 뱃치 방식은 필요한 경우 영양분 또는 유도물질을 쇼트 부가하여 사용할 수 있다. 다르게, 유가 배양을 사용할 수 있는데 발효배양기에 초기에 존재하는 영양분을 사용해 유지될 수 있는 최대 비성장률로 배양물을 뱃치 방식 사전유도로 성장시키고 1 이상의 영양 공급 계획을 사용해 발효가 완료될 때까지 성장률을 제어할 수 있다. 유가배양 방식은 또한 사전유도를 사용해 이.콜라이 숙주 세포의 물질대사를 제어하고 보다 높은 세포 밀도에 도달하게 할 수 있다(Lee, 1996, Tibtech, 14:98-105).

바람직하다면, 숙주 세포는 발효 배지로부터 모을 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포는 원심분리, 여과 또는 농축에 의해 샘플로부터 수집될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 치료 품질의 항체의 대규모 산업 제조에 적합하다.

일 구체예에서 본 발명에 따른 방법은 배양 이후 원심분리 단계와 이후, 추출 완충액의 부가를 통한 세포의 현탁 단계를 포함한다.

배양 단계 이후, 이 방법은 숙주 세포로부터 재조합 단백질을 방출하기 위한 추출 단계를 포함할 수 있다. 추출은 기계적 또는 압력 처리, 동결해동 처리, 삼투압 쇼크, 추출제 또는 열처리를 통한 세포 용해법 등과 같은 임의의 적절한 방법으로 수행할 수 있다.

바람직한 구체예에서 추출 완충액을 샘플에 부가하고 이어서 샘플에 대해 열처리 단계를 수행한다. 열처리 단계는 바람직하게는 US 5,665,866(그 내용을 참조하여 본원에 포함시킴)에 상세히 설명되어 있다. 열처리 단계는 다른 항체 관련 물질의 제거를 촉진시켜 가용성의, 올바르게 폴딩 및 어셈블링된 항체 샘플을 얻을 수 있게 한다. "올바르게 폴딩 및 어셈블리된" 항체는 비환원 SDS-PAGE 상에서 어셈블리된 중쇄 및 경쇄에 대한 예상 분자량에 상응하는 단일 밴드 존재로 확인된다. 다른 항체 관련 물질은 대체로 올바르게 폴딩되고 어셈블리된 항체의 부분 분해 단편인, 자유 중쇄 및 경쇄 또는 이의 일부분이다.

열처리 단계는 원하는 고온을 샘플에 가하여 수행한다. 가장 바람직하게, 열처리 단계는 30℃ 내지 70℃의 범위 내에서 수행된다. 온도는 필요에 따라 선택할 수 있고 정제용 단백질의 안정성에 따라 좌우될 수 있다. 다른 구체예에서, 온도는 40℃ 내지 65℃, 또는 바람직하게는 40℃ 내지 60℃ 범위 내, 보다 바람직하게는 45℃ 내지 60℃ 범위 내, 보다 더 바람직하게는 50℃ 내지 60℃ 범위내, 가장 바람직하게는 55℃ 내지 60℃, 58℃ 내지 60℃ 또는 59℃이다. 따라서, 최소 온도는 30℃, 35℃ 또는 40℃이고, 최대 온도는 60℃, 65℃ 또는 70℃이다.

열처리 단계는 바람직하게 장기간 동안 수행된다. 열처리 기간은 바람직하게 1 내지 24시간, 보다 바람직하게는 4 내지 18시간, 보다 더 바람직하게는 6 내지 16시간, 가장 바람직하게는 10 내지 14시간 또는 10 내지 12시간, 예를 들면 12시간이다.

따라서, 열처리를 위한 최소 시간은 1, 2 또는 3시간이고 최대 시간은 20, 22 또는 24시간이다.

특정 구체예에서, 열처리는 50℃ 내지 60℃에서 10 내지 16시간 동안, 보다 바람직하게는 59℃에서 10 내지 12시간 동안 수행된다. 당분야의 숙련가는 온도 및 시간이 대상 샘플 및 생산되는 단백질의 특정에 적합하도록 선택할 수 있다.

추출 단계 이후 샘플에 대해 pH 조정 단계 이전에 원심분리 및/또는 여과 단계를 수행할 수 있다.

본 발명의 단계 a)를 수행한 샘플은 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물이다. 따라서, 단계 a)는 예를 들면 다음에 대해 수행된다:

. 재조합 단백질 및 재조합 이황화물 이성질화효소를 발현하는 숙주 세포의 개체군을 포함하는 용액;

. 숙주 세포를 제거하기 위한 원심분리 및/또는 여과 후의 재조합 단백질 및 재조합 이황화물 이성질화효소를 발현하는 숙주 세포 개체군의 상등액;

. 추출, 예컨대 열처리 단계 이후의 재조합 단백질 및 재조합 이황화물 이성질화효소를 발현하는 숙주 세포 개체군의 추출물; 또는

. 추출, 예컨대 열처리, 및 1 이상의 후속 원심분리 및/또는 여과 단계 이후의 재조합 단백질 및 재조합 이황화물 이성질화효소를 발현하는 숙주 세포 개체군의 추출물.

단계 a) 전에, 숙주 세포 용액 또는 이의 추출물은 적절한 pH이고, 대체로 숙주 세포 용액 또는 이의 추출물의 pH는 pH 5 내지 10, 바람직하게는 pH 6 내지 8 또는 약 pH 7이다. 단계 a) 이전에 숙주 세포 용액 또는 이의 추출물의 pH는 목적 재조합 단백질의 pI에 의존적일 수 있다. 단백질은 pH가 단백질의 pI로 또는 pI를 통해 조정되면 침전되는 경향을 나타낼 수 있다. 따라서, pH 조정 단계 전 용액의 pH는 재조합 단백질의 pH 보다 낮아서 pH 조정 단계가 용액의 pH를 재조합 단백질의 pI로 또는 그를 통하지 않는 것을 보장하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 재조합 단백질의 pI가 대략 8이면, 용액의 pH는 재조합 단백질의 침전을 최소화하도록 바람직하게는 pH 8 보다 낮다. pH를 pH 5 보다 낮게 낮추는 단계는 또한 바람직하게는 재조합 단백질의 pI를 피하게 된다.

단백질의 pI는 그 단백질이 있는 용액의 이온 강도에 의존적이다. 따라서, 물 또는 매우 낮은 이온 강도 완충액 중 단백질의 산출 pI는 완충액 및 HCP를 포함하는 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물 중 단백질의 pI와 다를 수 있다. 단백질의 pI는 물 또는 매우 낮은 이온 강도 완충액 중 단백질의 측정 pI 보다 1, 1.5 또는 2 pH 유닛이 낮을 수 있다. 따라서, 숙주 세포 용액 또는 이의 추출물의 pH는 물 또는 매우 낮은 이온 강도 완충액에서 측정한 목적 재조합 단백질의 pI 보다 1, 1.5 또는 2 pH 유닛이 낮은 pH로 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법의 단계 b)에서, 침전된 재조합 이황화물 이성질화효소는 재조합 단백질 샘플을 생산하도록 재조합 단백질로부터 분리된다. 단계 b)는 대체로 침전된 재조합 이황화물 이성질화효소를 분리하기 위해 원심분리 및/또는 여과를 포함한다.

얻어진 재조합 단백질 샘플은 단계 a) 전 재조합 이황화물 이성질화효소의 양과 비교하여 재조합 이황화물 이성질화효소의 양이 감소된다. 바람직하게 단계 b) 이후 재조합 단백질은 재조합 이황화물 이성질화효소가 실질적으로 없다. 그러나, 일부 재조합 이황화물 이성질화효소는 샘플 중에 잔존할 가능성이 있고, 이는 이후 정제 단계를 통해 제거할 수 있다. 당업자는 당분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법을 사용해 재조합 이황화물 이성질화효소가 여전히 재조합 단백질 샘플에 존재하는지를 확인할 수 있다. 예를 들면, ELISA 분석을 사용해, 재조합 이황화물 이성질화효소, 예컨대 DsbC를 검출할 수 있다. 재조합 이황화물 이성질화효소, 예컨대 DsbC에 특이적인 항체를 사용하거나, 또는 재조합 이황화물 이성질화효소가 his-태깅된 경우, 예컨대 DsbC-his-태그인 경우, 항-His-태그 항체는 재조합 이황화물 이성질화효소의 검출에 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는, 실질적으로 없는은 5% w/w 또는 그 이하, 예컨대 4, 3, 2, 1 또는 0.5 % w/w 또는 그 이하를 함유하는 것을 의미하고자 한다.

일 구체예에서, 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH가 pH 3 또는 그 이하(예컨대 pH 3)인 경우, 숙주 세포 단백질 디펩티드 결합 단백질("DBP")은 침전되고 단계 b)에서 재조합 단백질로부터 분리된다. 이러한 구체예에서 얻어진 재조합 단백질 샘플은 또한 숙주 세포 디펩티드 결합 단백질(DBP)의 양이 감소되었다. 바람직하게, 얻어진 재조합 단백질 샘플은 실질적으로 DBP가 없다.

바람직하게 얻어진 재조합 단백질 샘플은 또한 단계 a) 동안 침전될 수 있는 다른 숙주 세포 단백질의 양이 감소된다. 바람직하게 얻어진 재조합 단백질 샘플은 실질적으로 다른 숙주 세포 단백질이 없다.

본 발명의 단계 a) 및 b) 이후 목적 단백질의 수율은 대체로 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상 또는 90% 또는 그 이상이다.

단계 b) 이후, 재조합 단백질 샘플의 pH는 하위 정제 단계, 예컨대 크로마토그래피를 위해 또는 재조합 단백질을 조정하기 위해 적절한 pH로 조정될 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이, 용액의 pH는 pH가 재조합 단백질의 pI가 아님을 보장하여 목적 재조합 단백질의 침전을 최소화하도록 조정될 수 있다. 바람직하게, 재조합 단백질 샘플의 pH는 pH 5 내지 7, 보다 바람직하게는 pH 5 내지 6으로 조정된다. 필요한 정확한 pH는 단백질의 pI를 포함한, 재조합 단백질의 특성, 및 수행되는 하위 정제 단계의 특성에 의존적이다. 임의의 적절한 제제, 예컨대 NaOH, 아세트산나트륨 또는 트리스 베이스에서 선택된 베이스 등을 사용해 재조합 단백질의 pH를 조정할 수 있다.

다르게, 이 방법은 단계 b) 이후에 pH 조정 단계를 포함하지 않는다. 이 구체예에서, 재조합 단백질 샘플의 pH는 재조합 단백질의 저장 및/또는 1 이상의 후속 하위 정제 단계에 적합할 수 있다. 일 구체예에서, 단계 a)에서, 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH는 pH 4.5로 조정되고, 단계 b)는 원심분리 및 여과를 포함하며 단계 b) 이후 얻어진 재조합 단백질 용액에 대해 이후 pH 4.5에서 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 수행한다.

다르게 크로마토그래피 단계는 높은 pH, 예를 들면 pH 또는 그 이상, 예컨대 5 내지 8, 특히 6 또는 7에서 수행될 수 있다.

단계 b) 이후, 재조합 단백질 샘플에 대해 오염물 및/또는 바람직하지 않은 단백질 단편 예컨대 항체 단편을 제거하기 위해 1 이상의 후속 정제 단계를 수행할 수 있다. 대체로, 재조합 단백질 샘플에 대해 1 이상의 크로마토그래피 단계가 수행되며, 여기서 각 크로마토그래피 단계는 여과 단계, 예컨대 미세여과, 정용여과 또는 한외여과 단계가 후속될 수 있다. 1 이상의 크로마토그래피 단계는 친화성 또는 비친화성 크로마토그래피 단계일 수 있다. 일 구체예에서 크로마토그래피는 비친화성 크로마토그래피 단계 예컨대 양이온 또는 음이온 이온-교환 크로마토그래피이다.

일 구체예에서, 단계 a)에서, 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH는 pH 4.5로 조정되고, 단계 b)는 원심분리 및 여과를 포함하며 단계 b) 후에 얻어진 재조합 단백질 용액에 대해서 pH 4.5에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한다.

본 발명의 방법은 비친화성 크로마토그래피 단계가 하위 정제에서 사용되는 경우 특히 바람직하다. 이는 재조합 이황화물 이성질화효소를 포함하는 대량의 숙주 세포 단백질이 이전에 분리되지 않았으면 크로마토그래피 컬럼에 결합하기 때문이다. 따라서, 원하는 재조합 단백질이 결합되는 크로마토그래피 컬럼의 용량을 감소시킨다. 재조합 이황화물 이성질화효소를 포함하는, 숙주 세포 단백질의 분리는 재조합 단백질의 정제를 위해 보다 빠르고 저렴한 수단을 제공하는 후속 비친화성 크로마토그래피 컬럼의 용량을 증가시킨다.

본 발명의 단계 a) 동안, 용액을 pH 5 또는 그 이하로 유지시키면서 재조합 단백질은 부분 언폴딩할 수 있다. 그러나, 단백질의 부분 언폴딩은 가역적이고, 침전된 이황화물 이성질화효소의 분리 후, 단백질 용액의 pH는 pH 5 이상, 바람직하게는 pH 5 내지 7, 또는 pH 5 내지 6으로 조정되고, 이어서 단백질은 그의 원래 폴딩된 입체구조를 채택할 수 있게 된다. 따라서 전체적으로 낮은 pH 유지 단계는 최소한의 장기간 결과로, 불순물을 제거하는데 비교적 온화한 조건을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 제공되는 재조합 단백질은 상당한 비율의 기능성 단백질을 포함한다.

숙주 세포에 의해 발현되는 목적 재조합 단백질은 바람직하게는 pI가 6 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 pI가 7 또는 그 이상이다. 앞서 기술한 바와 같이, 단백질 pI가 6 또는 그 이상이면 샘플의 pH를 단백질의 pI 이하, 바람직하게는 물 또는 매우 낮은 이온 강도 완충액 중 단백질의 pI 보다 1, 1.5 또는 2 pH 유닛 이하로 유지시켜 단백질의 침전을 최소화하는 것이 보다 용이하고, 샘플의 pH를 pH 5 또는 그 이하로 조정하는 단계는 단백질의 pI로 용액의 pH를 조정하지 않는다.

목적 재조합 단백질은 바람직하게는 재조합 항체이다. 재조합 항체는 바람직하게는 pI가 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9, 8 내지 9, 6, 7, 8 또는 9이다. 샘플의 pH는 항체의 최소 침전을 보장하기 위해, 단계 a) 전, 그 동안 및 그 이후에, 바람직하게는 재조합 항체의 pI 이하, 보다 바람직하게는 재조합 항체의 pI 보다 1, 1.5 또는 2 pH 유닛 이하로 유지시킨다.

바람직한 구체예에서, 재조합 항체는 pH가 7-9이고 샘플의 pH는 단계 a)에서, pH 3 내지 4.5, 보다 바람직하게는 pH 4.5로 조정된다.

재조합 항체의 특정 예로는 pI가 8인, WO01/094585A 및 본원에 기술된 바와 같은 항-TNF Fab' CDP870이 있다.

일 구체예에서 재조합 항체 또는 이의 결합 단편은 항 -TNF Fab' CDP870이다.

본원에서 사용되는 '기능성 항체'는 그들을 생성시킨 항원(동족 항원), 즉 특이적인 항원을 특이적으로 인식 또는 결합하는 능력을 보유하는 항체 분자를 포함한다. 기능성 항체의 생산은 항체의 예상 분자량에 상응하는 비환원성 SDS-PAGE 상의 단일 밴드 존재를 통해서, 또는 BIAcore 또는 당분야의 숙련가에게 공지된 다른 방법, 예를 들면 제한없이, ELISA를 사용한 직접 결합 분석을 통해 확인된다. 비기능성 항체는 그들의 동족 항원을 인식하지 않는 단편을 포함하고, 그들의 동족 항원을 인식하지 않거나 또는 결합하지 않는 항체의 부분 분해 단편을 포함하여, 부정확하게 폴딩 또는 부정확하게 어셈블링된 항체, 자유 중쇄 및 경쇄, 및 이의 단편을 포함한다.

항체의 결합 단편은 항체가 특이적으로 결합하는 항원에 결합할 수 있는 단편이다.

바람직한 예에서, 재조합 항체 분자는 적어도 항체 경쇄의 일부분 및 적어도 항체 중쇄의 일부분이어서, 발현되는 경쇄 및 중쇄 항체의 적어도 일부분은 조합되어 기능성 항체를 형성할 수 있다.

본원에서 사용되는 '항체'는 전체 길이 중쇄 및 경쇄; 이의 기능성 활성 단편, 결합 단편, 유사체 또는 유도체를 포함하고, 제한없이 VH, VL, VHH, Fab, 변형된 Fab, 변경된 힌지 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv 단편; 경쇄 또는 중쇄 단량체 또는 이량체; 단쇄 항체, 예를 들면 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 펩티드 링커, Fab-Fv, 또는 이중 특이성 항체, 예컨대 PCT/GB2008/003331에 기술된 바와 같이, Fab-dAb에 의해 연결된 단쇄 Fv를 포함한다.

항체는 다클론, 단일클론, 2가, 3가 또는 4가 항체, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다. 이들 항체 및 이들 단편은 천연 발생, 인간화, 키메라 또는 CDR 그라프트된 항체일 수 있고 표준 분자 생물학법을 사용해 필요에 따라 아미노산 또는 도메인을 변형, 부가 또는 결실시킬 수 있다. 인간화 항체는 인간 면역글로불린 분자 유래의 프레임워크 영역 및 비인간종 유래의 1 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 비인간종 유래 항체 분자이다(예를 들면, US 5,585,089 참조). 본 발명의 방법을 사용해 정제된 항체 분자는 임의 부류(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA)이거나 또는 면역글로불린 분자의 하위부류일 수 있다.

이들 항체를 생성시키는 방법은 당분야에 공지이다(예를 들면, 하기 문헌들을 참조한다: Shrader et al., WO92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341:544; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86:3833; Riecnmann et al, 1988, Nature, 322:323; Bird et al, 1988, Science, 242:423; Queen et al., US5,585,089; Adair, WO91/09967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet.Eng.Rev, 10:1-142; Verma et al, 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181).

단일클론 항체는 당분야에 공지된 임의 방법 예컨대 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al, 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)을 통해 제조할 수 있다.

키메라 항체는 중쇄 및 경쇄 유전자가 다른 종에 속하는 면역글로불린 유전자 절편으로 구성되도록 유전자 조작된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 항체이다. 이들 키메라 항체는 항원성이 덜 할 수 있다. 2가 항체는 당분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다(Milstein et al, 1983, Nature 305:537-539; WO 93/08829, Traunecker et al, 1991, EMBO J. 10:3655-3659). 2가, 3가 및 4가 항체는 다중 특이성을 포함하거나 또는 단일특이성일 수 있다(예를 들면, WO 92/22853을 참조함).

항체 서열은 또한 [Babcook, J. et al, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848] 및 WO 92/02551 등에 기술된 바와 같은 특이적 항체의 생산을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA의 발현 및 분자 클로닝을 기반으로 하는 단일 림프구 항체 방법을 사용해 생성시킬 수 있다. 후자의 방법은 개별 항체 생성 세포의 단리에 이어서 클론을 확장한 후 그 동족 항원을 인식하는 항체를 생성하는 클론을 스크리닝하고, 필요하면 그들의 가변 중쇄(V_H) 및 중쇄(V_L) 유전자 서열의 후속 동정에 기초한다. 다르게, 그 동족 항원을 인식하는 항체 생성 세포는 함께 배양된 후 스크리닝된다.

항체는 임의의 표적 항원에 특이적일 수 있다. 항원은 세포 연합 단백질, 예를 들면 세포 예컨대 박테리아 세포, 효모 세포, T-세포, 내피 세포 또는 종양 세포 상의 세포 표면 단백질이거나, 또는 가용성 단백질일 수 있다. 목적 항원은 또한 임의의 의학적 관련 단백질 예컨대 질환이나 감염 동안 상향조절되는 단백질, 예를 들면 수용체 및/또는 그들의 상응 리간드일 수 있다. 세포 표현 단백질의 특정 예에는 부착 분자, 예를 들면 인테그린 예컨대 β1 인테그린, 예를 들어 VLA-4, E-셀렉틴, P 셀렉틴 또는 L-셀렉틴, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134(OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP l, CSF1 또는 CSF1-수용체, DPCR1, DPCR1, 두둘린2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA 1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, 넥틴-유사 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCA1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, 발암배아성 항원(CEA), 인간 유지방 글로불린(HMFG1 및 2), MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 항원, DR 및 VEGF, PD-1 , DC-SIGN, TL1A, IL-7 수용체 A 및 적절하다면, 이의 수용체가 포함된다.

가용성 항원은 인터루킨 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 또는 IL-17, 예컨대 IL17A 및/또는 IL17F, 바이러스 항원 예를 들면 호흡기 세포융합 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 항원, 면역글로불린, 예컨대 IgE, 인터페론 예컨대 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 종양 괴사 인자 TNF(이전에 종양 괴사 인자-α로 알려져 있었으며, 본원에서는 TNF 또는 TNFα라고 함), 종양 괴사 인자-β, 콜로니 자극 인자 예컨대 G-CSF 또는 GM-CSF, 및 혈소판 유도 성장 인자 예컨대 PDGF-α, 및 PDGF-β, WISP-1 및 적절하면 이의 수용체를 포함한다. 다른 항원은 박테리아 세포 표면 항원, 박테리아 독소, 바이러스 예컨대 인플루엔자, EBV, HepA, B 및 C, 생화학 무기, 방사성핵종 및 중금속, 및 뱀 및 거미 독 및 독소를 포함한다.

일 구체예에서, 항체는 목적 항원의 활성을 기능적으로 변경시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체는 상기 항원을 직접적으로 또는 간접적으로 중화, 길항 또는 작용화시킬 수 있다.

바람직한 구체예에서, 항체는 항-TNF 항체, 보다 바람직하게는 WO01/094585(이의 내용을 참조하여 본원에 포함시킴)에 기술된 바와 같은, 항-TNF Fab' CDP870이다.

일 구체예에서, 인간 TNFα에 특이성을 갖는 항체는 중쇄를 포함하고, 여기서 가변 도메인은 CDRH1에 대해 서열번호 1에 제시된 서열, CDRH2에 대해 서열번호 2에 제시된 서열 또는 CDRH3에 대해 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 CDR을 포함한다.

일 구체예에서 항체는 경쇄를 포함하고 여기서 가변 도메인은 CDRL1에 대해 서열번호 4에 제시된 서열, CDRL2에 대해 서열번호 5에 제시된 서열 또는 CDRL3에 대해 서열번호 6에 제시된 서열을 갖는 CDR을 포함한다.

일 구체예에서 항체는 가변 도메인이 CDRH1에 대해 서열번호 1에 제시된 서열, CDRH2에 대해 서열번호 2에 제시된 서열, 또는 CDRH3에 대해 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄, 및 가변 도메인이 CDRL1에 대해 서열번호 4에 제시된 서열, CDRL2에 대해 서열번호 5에 제시된 서열 또는 CDRL3에 대해 서열번호 6에 제시된 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일 구체예에서 항체는 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 4, CDRL2에 대해 서열번호 5 및 CDRL3에 대해 서열번호 6을 포함한다.

항체는 바람직하게는 CDR-그라프트된 항체 분자이고 대체로 가변 도메인은 인간 억셉터 프레임워크 영역 및 비인간 도너 CDR을 포함한다.

바람직하게, 항체는 경쇄 가변 도메인 CDP870(서열번호 7) 및 중쇄 가변 도메인 CDP870(서열번호 8)을 포함한다.

바람직하게 항체는 변경된 Fab 단편이고 여기서 변경은 이펙터 또는 리포터 분자에 부착되도록 1 이상의 아미노산을 그 중쇄의 C 말단에 부가하는 것이다. 바람직하게, 부가된 아미노산은 이펙터 또는 리포터 분자가 부착될 수 있는 1 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변경된 힌지 영역을 형성한다. 이러한 변경된 Fab 단편은 바람직하게는 서열번호 10에 제기된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄 및 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄를 갖는다.

본 발명에서 사용되는 숙주 세포는 항체를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 바람직하게, DNA 서열은 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩한다.

바람직한 일 구체예에서, DNA 서열은 경쇄를 코딩하고 서열번호 7 또는 서열번호 9(CDP870)에 제시된 서열 또는 이의 축퇴성(degenerate) 균등물을 포함한다.

다른 바람직한 구체예에서, DNA 서열은 중쇄를 코딩하고 서열번호 8 또는 서열번호 10(CDP870)에 제시된 서열 또는 이의 축퇴성 균등물을 포함한다.

DNA 서열은 예를 들면, 화학 처리, cDNA, 게놈 DNA 또는 이의 임의 조합으로 생성된, 합성 DNA를 포함할 수 있다.

존재하면, 항체의 불변 영역 도메인은 항체 분자의 제안 기능, 특히 필요할 수 있는 이펙터 기능을 갖게 선택할 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 구체적으로, 인간 IgG 불변 영역 도메인을 사용할 수 있는데, 항체 분자를 치료 용도로 사용하고자 하고 항체 이펙터 기능이 필요한 경우에 IgG1 및 IgG3 이소타입의 불변 영역 도메인을 사용할 수 있다. 다르게, IgG2 및 IgG4 이소타입은 항체 분자를 치료 목적으로 하용하고 항체 이펙터 기능은 필요하지 않을 경우, 예를 들면 단순히 TNFα 활성을 차단하려는 경우에 사용할 수 있다.

재조합 단백질의 발현 방법은 당분야에 공지되어 있다. 재조합 항체 분자의 발현에 적합한 숙주 세포의 예로는 박테리아 예컨대 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아, 예를 들면, 이.콜라이, 또는 효모 세포, 예를 들면 에스.세레비지아(S. cerevisiae), 또는 포유동물 세포, 예를 들면 CHO 세포 및 골수종 또는 하이브리도마 세포주, 예를 들면 NSO 세포를 포함한다. 가장 바람직하게, 본 발명의 방법에서, 재조합 항체는 박테리아, 예를 들면 이.콜라이에서 생산된다(예를 들면, 다음의 문헌을 참조한다: Verma et al, 1988, J. Immunol. Methods 216: 165-181; Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods 263: 133-147).

발현 후, 항체는 예를 들면 다른 부분 예컨대 이펙터 분자에 접합시켜 추가로 처리될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 항체에 이펙터 분자를 부착시키는 추가 단계를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 이펙터 분자는 예를 들면, 항신생물제, 약물, 독소(예컨대 박테리아 또는 식물 기원의 효소 활성 독소 및 이의 단편, 예를 들어 리신 및 이의 단편), 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들면 DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성요오드, 방사성동위원소, 킬레이팅된 금속, 나노입자 및 수용체기 예컨대 형광발광 화합물 또는 NMR이나 ESR 분광법으로 검출할 수 있는 화합물을 포함한다. 이펙터 분자는 임의의 적절한 방법에 의해 항체 또는 이의 단편에 부착될 수 있으며, 예를 들면 항체 단편은 WO05/003171 또는 WO05/003170(이의 내용을 참조하여 본원에 포함시킴)에 기술된 바와 같이 1 이상의 이펙터 분자에 부착되도록 변형될 수 있다. WO05/003171 또는 WO05/003170은 또한 적절한 이펙터 분자를 기술하고 있다.

항체는 공유 결합 구조에 의해 부착된, 중금속 원자, 또는 독소, 예컨대 리신을 킬레이팅하기 위한, 거대고리를 가질 수 있다. 다르게, 재조합 DNA 기술 방법을 사용해 Fc 단편(CH2, CH3 및 힌지 도메인), CH2 및 CH3 도메인 또는 완전한 면역글로불린 분자의 CH3 도메인이 치환되거나, 또는 펩티드 결합, 기능성 비면역글로불린 단백질, 예컨대 효소 또는 독소 분자에 의해 결합된 항체 분자를 생산할 수 있다. 항체가 이펙터 또는 리포터 분자가 부착될 수 있도록 그의 중쇄의 C 말단에 1 이상의 아미노산을 갖는 변형된 Fab 단편인 구체예에서, 부가의 아미노산은 바람직하게 이펙터 또는 리포터 분자가 부착될 수 있는 1 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 힌지 영역을 형성한다.

바람직한 이펙터 기는 중합체 분자이고, 이는 변형된 Fab 단편에 부착되어 그 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다.

대체로 중합체 분자는 합성 또는 천연 발생 중합체, 예를 들면 임의 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지 또는 미분지 다당류, 예를 들면 동종 또는 이형 다당류일 수 있다.

상기 언급된 합성 중합체에 존재할 수 있는 특정한 임의 치환체는 1 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다. 합성 중합체의 특정 예에는 임의 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알콜) 또는 이의 유도체, 특히 임의 치환된 폴리(에틸렌글리콜) 예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체가 포함된다. 특히 천연 발생 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이의 유도체를 포함한다. 본원에서 사용되는 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들면 티올-선택적 반응성 기 예컨대 말레이미드 등을 포함하고자 한다. 반응성 기는 중합체에 링커 절편을 통해서 또는 직접적으로 연결될 수 있다. 이러한 기의 잔기는 일부 예에서 항체 단편과 중합체 간에 연결기로서 산물의 일부분을 형성할 수 있다.

중합체의 크기는 필요에 따라 다양할 수 있지만, 대체로 평균 분자량이 500 Da 내지 50,O00 Da 범위, 바람직하게는 5000 내지 40,000 Da 범위, 보다 바람직하게는 25,000 내지 40,OOO Da 범위이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 목적 용도에 따라 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 생성물이 종양 치료 용도로, 순환계를 떠나 조직을 침투해야되는 경우, 소 분자량 중합체, 예를 들면 분자량이 대략 5,000 Da인 것을 사용하는 것이 유리하다. 생성물을 순환계에 잔류시키려는 용도의 경우, 고분자량 중합체, 예를 들면 분자량이 25,000 Da 내지 40,000 Da 범위인 것을 사용하는 것이 유리하다.

특히 바람직한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜), 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체, 및 특히 분자량이 약 25,000 Da 내지 약 40,000 Da 범위인 것을 포함한다.

변형된 항체 단편에 부착된 각 중합체 분자는 단편에 위치하는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유 결합될 수 있다. 공유 결합은 대체로 이황화 결합이거나, 또는 특히 황-탄소 결합일 수 있다.

바람직한 경우, 항체 단편은 이에 결합된 1 이상의 이펙터 또는 리포터 분자를 가질 수 있다. 이펙터 또는 리포터 분자는 단편에 위치하는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들면 임의의 자유 아미노, 이미노, 히드록실 또는 카르복실 기를 통해 항체 단편에 결합될 수 있다. 1 이상의 이펙터 또는 리포터 분자는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 C 말단에서 또는 그를 향해서 아미노산에 부착될 수 있다.

활성화된 중합체는 상기 기술된 바와 같이 중합체-변형 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응성 기를 포함하는 임의의 중합체 예컨대 α-할로카르복실산 또는 에스테르, 예를 들면 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들면 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드를 포함하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로 입수하거나(예를 들면 Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) 또는 통상의 화학적 방법을 사용해 상업적으로 시판되는 출발 물질로부터 제조될 수 있다.

부착된 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 대해서는, 이하의 문헌들을 참조한다: ["Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris(ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky(eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York.]

이펙터 또는 리포터 분자에 결합된 항체 단편을 얻는 것이 바람직한 경우, 이는 적절하면 활성화된 중합체와의 반응 전 또는 이후에 항체 단편을 이펙터 또는 리포터 분자에 커플링제를 통해 또는 직접적으로 연결시키는 표준 화학 또는 재조합 DNA 방법으로 제조될 수 있다. 특히 화학 방법은 예를 들면, WO 93/62331, WO 92/22583, WO 90,195 및 WO 89/1476에 기술된 것을 포함한다. 다르게, 이펙터 또는 리포터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우 연결부는 예를 들면 WO 86/01533 및 EP-A-0392745에 기술된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 사용해 얻을 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 방법으로 제공된 변형된 Fab 단편은 EP-A-0948544에 기술된 방법에 따라 PEG화(즉, 공유 결합된 PEG(폴리(에틸렌글리콜))된다. 바람직하게 항체는 도 9에 도시된 바와 같이 PEG화된 변형된 Fab 단편이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 변형된 Fab 단편은 중쇄의 변형된 힌지 영역의 C 말단에 시스테인 잔기 중 하나 라이실-말레이미드-유도기에 부착되며 여기서 라이실 잔기 중 2개 아미노 기 각각은 분자량이 약 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기에 공유 결합되어, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기의 총 평균 분자량이 약 40,000 Da이고, 보다 바람직하게는 라이실-말레이미드-유도기는 [1-[[[2-[[3-(2,5-디옥소-1-피롤리디닐)-1-옥소프로필]아미노]에틸]아미노]-카르보닐]-1,5-펜탄디일]비스(이미노카르보닐)이다. 리신 잔기는 말레이미드 기에 공유 결합된다. 리신 잔기 상의 아민기 각각에 분자량이 대략 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜)중합체가 부착된다. 전체 이펙터 분자의 총 분자량은 따라서 대략 40,000 Da이다.

따라서, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게 중쇄의 C 말단에 시스테인 잔기 중 하나에 라이실-말레이미드 기를 부착시키는 단계를 포함하고, 여기서 라이실 잔기의 각 아미노 기는 분자량이 약 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기에 공유 결합된다.

바람직하게, 도 9에 도시된 화합물에서, 항체부의 중쇄는 서열번호 10에 제시된 서열을 가지며 경쇄는 서열번호 9에 제시된 서열을 갖는다. 이 화합물을 본원에서는 CDP870이라고 한다.

본 발명의 각 구체예의 바람직한 특징은 필요한 부분을 수정하여 다른 구체예 각각에 대해 설명한다. 제한없이 본원에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함해 모든 출판물을 각각의 개별 출판물이 완전하게 기술된 것처럼 구체적으로 그리고 개별적으로 참조하여 본원에 포함시킨다고 표시된 대로 참조하여 본원에 포함시킨다.

본 발명은 명백하게 일정 정수의 조합을 포함하는 구체예를 개시한다. 본원은 또한 상기 정수의 조합으로 이루어지거나 또는 실질적으로 이루어진 구체예로 확대된다.

바람직한 부분 및/또는 구체예는 기술적으로 실현가능하게 조합될 수 있다.

본 발명을 이하 실시예를 참조하여 설명하지만, 단지 예시적이며 본 발명의 범주를 임의 방식으로 한정하려는 것이 아니다.

실시예

실시예 1: 재조합 DsbC 및 재조합 항체를 발현하는 숙주 세포주의 생성

모든 실험에서 모 야생형 세포주로서 이.콜라이 세포주 W3110을 사용하였다. 다음의 돌연변이를 보유하는 세포를 생성시켰다:

a. 돌연변이된 Tsp 유전자;

b. 돌연변이된 Tsp 유전자 및 재조합 DsbC 보유;

c. 돌연변이된 Tsp 유전자 및 돌연변이된 spr 유전자;

d. 돌연변이된 Tsp 유전자 및 돌연변이된 spr 유전자 및 재조합 DsbC 보유.

돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 세포주 MXE001(△Tsp)의 생성

MXE001 균주는 다음과 같이 생성시켰다:

Tsp 카세트는 SalI, NotI 제한효소 단편을 유사하게 제한효소처리된 pKO3 플라스미드로 연결시켰다. pKO3 플라스미드는 염색체 통합 이벤트를 일으키고 선별하기 위한 클로람페니콜 마커와 함께 pSC101 복제 기원(RepA)의 감열성 돌연변이체를 사용한다. 레바스쿠라제를 코딩하는 sacB 유전자는 수크로스 상에서 성장하는 이.콜라이에 치명적이고 따라서 (클로람페니콜 마커 및 pSC101 기원과 함께) 탈통합 및 플라스미드 큐어링(curing) 이벤트를 일으키고 선별하는데 사용된다. 이러한 방법론은 이미 기술되어 있다(Hamilton et al, 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 and Blomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457). pK03 시스템은 삽입된 유전자를 제외하고 숙주 게놈으로부터 모든 선별 마커를 제거한다.

이하 플라스미드를 제작하였다.

pMXE191는 EcoRI 및 AseI 제한효소 마커를 포함하는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함한다.

이어서 플라스미드는 [Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)]에 존재하는 방법을 사용해 제조된 전기-컴피턴트 컴피턴트 이.콜라이 W3110 세포로 형질전환시켰다.

1일 40 ㎕의 이.콜라이 세포를 차가운 BioRad 0.2 cm 전기천공 큐벳에서 (10 pg) 1 ㎕의 pKO3 DNA와 혼합한 후 2500V, 25 μΡ 및 200 Ω에서 전기천공하였다. 1000 ㎕의 2xPY를 즉시 부가하고, 세포를 30℃에 항온배양기에서 1시간 동안 250 rpm에서 진탕하여 회수하였다. 세포를 2xPY에 연속으로 1/10로 희석한 후 100 ㎕ 분취액을 30℃ 및 43℃에서 사전승온시킨 20 ㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 2xPY 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 밤새 30℃ 및 43℃에서 항온배양시켰다.

2일 30℃에서 자란 콜로니 수로 전기천공 효율을 추정하는 한편 43℃에서 생존한 콜로니는 통합 가능성을 나타낸다. 43℃ 플레이트로부터의 단일 콜로니를 픽킹하고 10 ㎖ 2xPY에 재현탁시켰다. 이의 100 ㎕를 단일 콜로니를 생성하도록 30℃로 사전승온시킨 5%(w/v) 수크로스 함유 2xPY 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 밤새 30℃에서 항온배양시켰다.

3일 콜로니는 가능성있는 동시 탈통합 및 플라스미드 큐어링 이벤트를 의미한다. 탈통합 및 큐어링 이벤트가 성장 초기에 일어나면, 다수의 콜로니가 복제된다. 단일 콜로니를 픽킹하고 20 ㎍/㎖의 클로람페니콜 또는 5%(w/v) 수크로스를 포함하는 2xPY 아가 상에 레플리카 플레이팅하였다. 플레이트를 밤새 30℃에서 항온배양하였다.

4일 수크로스 상에서 성장하고 클로람페니콜에서 죽은 콜로니는 염색체 치환 및 플라스미드 큐어링 이벤트가 일어났음을 의미한다. 이들을 픽킹하고 돌연변이 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용해 PCR을 통해 스크리닝하였다. 정확한 크기의 양성 PCR 밴드를 생성한 콜로니는 단일 콜로니를 생성하도록 5% (w/v) 수크로스를 포함하는 2xPY 아가 상에 스트리킹하고 그 플레이트를 밤새 30℃에서 항온배양하였다.

5일 PCR 양성, 클로람페니콜 감응성 및 수크로스 내성 이.콜라이의 단일 콜로니를 사용해 글리세롤 스탁, 화학적 컴피턴트 세포를 만들었고 Taq 중합효소를 사용한 직접 DNA 서열분석을 위한 PCR 생성물을 얻도록 5' 및 3' 측접 올리고를 사용한 PCR 반응용 PCR 주형으로 사용하였다.

세포 균주 MXE001을 검사하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용해 비천연 발생 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 Tsp 유전자 영역의 PCR 증폭을 통해 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 게놈 DNA의 성공적인 변형을 검증하였다. DNA의 증폭 영역은 돌연변이된 유전자 내 비천연 발생 Ase I 제한효소 부위의 존재를 확증하기 위해 Ase I 제한효소와 항온반응 전 및 후에 겔 전기여동을 통해 분석하였다.

용해물은 1x PCR 완충액 20 ㎕ 중에서 10분간 95℃에서 세포의 단일 콜로니를 가열하여 준비하였다. 이 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 이어서 13,200 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 '세포 용해물'로 표지하였다.

각 균주는 Tsp 올리고 쌍을 사용해 증폭하였다.

DNA는 표준 PCR 방법을 사용해 증폭하였다.

5 ㎕ 완충액xlO (Roche)

l ㎕ dNTP 믹스 (Roche, lOmM mix)

1.5 ㎕ 5' 올리고 (5 pmol)

1.5 ㎕ 3' 올리고 (5 pmol)

2 ㎕ 세포 용해물

0.5 ㎕ Taq DNA 중합효소 (Roche 5 U/㎕)

38.5 ㎕ H₂0

PCR 사이클.

94℃ 1분

94℃ 1분)

55℃ 1분) 30사이클 반복

72℃ 1분)

72℃ 10분

반응을 완료하면 25 ㎕를 Ase I 분해를 위해 새로운 마이크로튜브로 옮겼다. 25 ㎕의 PCR 반응물에 19 ㎕의 H₂0, 5 ㎕의 완충액 3(NEB), l ㎕의 Ase I(NEB)을 부가하고, 혼합한 후 2시간 동안 37℃에서 항온반응시켰다.

나머지 PCR 반응물에 5 ㎕의 로딩 완충액(x6)을 부가하고 20 ㎕를 에티디움 브로마이드(10 ㎎/㎖ 스탁 중 5 ㎕)가 부가된 0.8% TAE 200 ㎖ 아가로스 겔 상에 로딩하고 1시간 동안 100 volts에서 러닝하였다. lO ㎕의 크기 마커(Perfect DNA marker 0.1-12Kb, Novagen)를 마지막 레인에 로딩하였다.

Ase I 효소분해가 완료되면 10 ㎕의 로딩 완충액(x6)을 부가하고 20 ㎕는 에티디움 브로마이드(10 ㎎/㎖ 스탁 중 5 ㎕)가 부가된 0.8% TAE 아가로스 겔(Invitrogen) 상에 로딩하고 1시간 동안 100 volts에서 러닝하였다. lO ㎕의 크기 마커(Perfect DNA marker 0.1-12Kb, Novagen)를 마지막 레인에 로딩하였다. 두 겔을 UV 트랜스루미네이터를 사용해 가시화하였다.

증폭된 게놈 단편은 Tsp에 맞는 2.8 kb의 정확한 크기를 나타냈다. Ase I으로 효소분해 후, W3110 대조군이 아닌 Tsp 결핍 균주 MXE001에 도입된 Ase I 부위의 존재가 확인되었다.

MXEOOl: Tsp 프라이머 세트를 사용해 증폭된 게놈 DNA 및 얻어진 DNA를 Ase I로 효소분해하여 2.2 및 0.6 kbps 밴드가 생성되었다.

W3110 PCR 증폭된 DNA는 Ase I 제한효소로 분해되지 않았다.

돌연변이된 spr 유전자를 보유한 세포주 및 돌연변이된 Tsp 유전자 및 돌연변이된 spr 유전자를 보유한 세포주의 생성

spr 돌연변이를 생성시키고 상보성 분석을 사용해 선별하였다.

spr 유전자는 1000 bp 당 1 내지 2 돌연변이를 유입시키는 Clontech® random mutagenisis diversity PCR 키트를 사용해 돌연변이시켰다. 돌연변이된 spr PCR DNA는 spr 돌연변이와 함께 CDP870 Fab'을 발현하는 유도성 발현 벡터 [pTTO CDP870]에 클로닝하였다. 이어서 이 결찰물을 [Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molec㎕ar Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)]에 기술된 방법을 사용해 제조된 이.콜라이 균주 MXE001(ΔTsp)에 전기-형질전환시켰다. 이하 프로토콜을 사용하였고, 40 ㎕의 전기 컴피턴트 MXEOOl, 2.5 ㎕의 결찰물(lOO pg의 DNA)를 0.2 cm 전기천공 큐벳에 부가하고, 이하의 조건으로 BioRad Genepulser Xcell을 사용해 수행하였다:2500V, 25 μΡ 및 200Ω. 전기-형질전환 후 1 ㎖의 SOC(Invitrogen)(37℃로 사전승온)를 부가하고 세포를 천천히 교반하면서 1시간 동안 37℃에 두어 회수하였다.

세포를 저장성 아가(5 g/L 효모 추출물, 2.5 g/L 트립톤, 15 g/L 아가(모두 Difco)) 상에 플레이팅하고 40℃에서 항온배양하였다. 콜로니를 형성한 세포를 43℃의 HLB 상에 재플레이팅하여 MXE001 균주에 대해 고온에 낮은 삼투압 조건 하에서 성장하는 능력의 회복능을 확인하였다. 플라스미드 DNA를 선별된 클론으로부터 준비하고 spr 돌연변이를 확인하기 위해 서열분석하였다.

이 방법을 사용해 다음과 같이 ΔTsp 표현형을 보완하는 spr 단백질에 5개의 단일 돌연변이 및 하나의 이중 돌연변이를 단리하였다:

1. V98E

2. D133A

3. V135D

4. V135G

5. G147C

6. S95F 및 Y115F

조합된 ΔTsp/돌연변이체 spr 균주를 제조하기 위한 실시예 1 유래의 MXE001 균주 또는 spr 돌연변이된 균주를 생성하기 위한 야생형 W3110 이.콜라이 균주(표현형: F- LAM- IN (rrnD-rrnE)1 rph1 (ATCC no. 27325))를 사용해 새로운 균주를 생성하는데 상기 동정된 개별 돌연변이 및 spr의 3가지 촉매 트리아드 돌연변이(C94A, H145A, H157A) 및 W174R을 사용하였다.

이하 돌연변이체 이.콜라이 균주는 MXE001을 생성하기 위해 실시예 1에 기술한 바와 같이, pKO3 상동성 재조합/치환 플라스미드(Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237)를 사용하는 유전자 치환 벡터 시스템을 사용해 생성시켰다.

돌연변이체 spr 통합 카세트는 SalI, NotI 제한효소 단편으로 유사한 제한효소 절단된 pKO3 플라스미드로 ?겼다.

pKO3 플라스미드는 염색체 통합 이벤트를 일으키고 선별하기 위한 클로람페니콜 마커와 함께 pSC101 복제 기원(RepA)의 감열성 돌연변이체를 사용한다. 레바스쿠라제를 코딩하는 sacB 유전자는 수크로스 상에서 성장하는 이.콜라이에 치명적이고 따라서 (클로람페니콜 마커 및 pSC101 기원과 함께) 탈통합 및 플라스미드 큐어링(curing) 이벤트를 일으키고 선별하는데 사용된다. 이러한 방법론은 이미 기술되어 있다(Hamilton et al, 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 and Blomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457). pK03 시스템은 삽입된 유전자를 제외하고 숙주 게놈으로부터 모든 선별 마커를 제거한다. 클론 동정을 위해 SalI 제한효소 부위가 제거된 spr 서열 내 침묵 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 spr 유전자를 포함하는, 이하 열거된 pKO3 벡터를 제작하였다.

pMXE336, pK03 spr S95F (-SalI)

pMXE337, pK03 spr Yl 15F (-SalI)

pMXE338, pK03 spr G147C (-SalI)

pMXE339, pK03 spr D133A (-SalI)

pMXE340, pK03 spr V135D (-SalI)

pMXE341 , pK03 spr V135G (-SalI)

pMXE342, p 03 spr V98E (-SalI)

pMXE343, pK03 spr C94A (-SalI)

pMXE344, pK03 spr H145 A (-SalI)

pMXE345, pK03 spr H157A (-SalI)

pMXE346, pK03 spr W174R (-SalI)

이어 이 플라스미드를 [Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)]에 기술된 방법을 사용해 화학적 컴피턴트 이.콜라이 W3110 세포에 또는 실시예 1의 MXE001 균주에 형질전환시켜 표 1에 도시한 바와 같이, 조합된 ΔTsp/돌연변이체 spr 균주를 만들었다.

1일 40 ㎕의 전기-컴피턴트 이.콜라이 세포 또는 MXE001 세포를 차가운 BioRad 0.2 cm 전기천공 큐벳에서 (10 pg) 1 ㎕의 pKO3 DNA와 혼합한 후 2500V, 25 μΡ 및 200 Ω에서 전기천공하였다. 1000 ㎕의 2xPY를 즉시 부가하고, 세포를 30℃에 항온배양기에서 1시간 동안 250 rpm에서 진탕하여 회수하였다. 세포를 2xPY에 연속으로 1/10로 희석한 후 100 ㎕ 분취액을 30℃ 및 43℃에서 사전승온시킨 20 ㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 2xPY 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 밤새 30℃ 및 43℃에서 항온배양시켰다.

4일 수크로스 상에서 성장하고 클로람페니콜에서 죽은 콜로니는 염색체 치환 및 플라스미드 큐어링 이벤트가 일어났음을 의미한다. 이들을 픽킹하고 SalI 부위 손실에 대한 제한효소 분해와 PCR을 통해 스크리닝하였다. 정확한 크기의 양성 PCR 밴드를 생성하고 SalI 분해에 내성인 콜로니는 단일 콜로니를 생성하도록 5% (w/v) 수크로스를 포함하는 2xPY 아가 상에 스트리킹하고 그 플레이트를 밤새 30℃에서 항온배양하였다.

5일 PCR 양성, 클로람페니콜 감응성 및 수크로스 내성 이.콜라이의 단일 콜로니를 사용해 글리세롤 스탁, 화학적 컴피턴트 세포를 만들었고 Taq 중합효소를 사용한 직접 DNA 서열분석을 위한 PCR 생성물을 얻도록 5' 및 3' 측접 올리고를 사용한 PCR 반응용 PCR 주형으로 사용하여 올바른 돌연변이를 검증하였다.

Fab' 및 DsbC 발현용 플라스미드의 생성

DsbC를 코딩하는 서열 및 항-TNF Fab'의 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 플라스미드를 제작하였다.

WOO1/94585에 기술된 항-TNFα Fab' 단편(CDP870이라함)의 디시스트론 메세지를 생성시켰다. 상류 시스트론은 항체의 경쇄(서열번호 9)를 코딩하는 한편 하류 시스트론은 항체의 중쇄(서열번호 10)를 코딩한다. OmpA 신호 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 경쇄 및 중쇄 각각에 대한 DNA 코딩부의 5' 말단에 융합시켜 주변세포질로의 효율적인 분비를 가능케하였다. 유전자간(intergenic) 서열 2(IGS)는 서열번호 16에 제시된 대로 사용하였다.

플라스미드 pDPH358(pTTO 40.4 CDP870 IGS2), 즉 CDP870 Fab'(항-TNF Fab') 및 DsbC(주변세포질 폴리펩티드)에 대한 발현 벡터는 [Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y.]에 기술된 통상의 제한효소 클로닝 방법을 사용헤 제작하였다. 플라스미드 pDPH358은 다음의 특징을 포함한다; 강력한 tac 프로모터 및 lac 오퍼레이터 서열. 이 플라스미드는 Fab' 중쇄 코딩 영역 후에 고유한 EcoRI 제한효소 부위, 이허에 비코딩 서열 및 이어 고유한 NdeI 제한효소 부위를 포함한다. DsbC 유전자는 주형으로서 W3110 미정제 염색체 DNA를 사용해 PCR 클로닝하여서 PCR 산물은 5' EcoRI 부위 이후에 강력한 리보솜 결합부, 이어서 천연 출발 코돈, 신호 서열 및 성숙한 DsbC 서열, C-말단 His 태그로 종결되어 최종적으로 비코딩 NdeI 부위를 코딩한다. EcoRI-Ndel PCR 단편을 제한효소 처리하고 발현 벡터에 결찰시켜서 모든 3개 폴리펩티드: Fab' 경쇄, Fab' 중쇄 및 DsbC는 하나의 폴리시스트론 mRNA 상에서 코딩되었다.

Fab 경쇄, 중쇄 유전자 및 DcbC 유전자는 단일 폴리시스트론 메세지로서 전사되었다. 이.콜라이 OmpA 단백질 유래의 신호 펩티드를 코딩하는 DNA를 경쇄 및 중쇄 유전자 서열의 5' 말단에 융합시켜서, 이.콜라이 주변세포질로 폴리펩티드를 이동시킨다. 전사는 전사 종결인자 rrnB tlt2를 사용해 종결시켰다. laclq 유전자는 항상 발현되는 Lac I 리프레서 단백질을 코딩한다. 이는 탈억제가 알로락토스 또는 IPTG 존재에 의해 유도될 때까지 tac 프로모터로부터의 전사를 억제한다. 사용된 복제 기원은 p15A이며, 이는 카피 수를 낮게 유지시킨다. 이 플라스미드는 항생제 선별용 테트라사이클린 내성 유전자를 포함한다.

항-TNF Fab' 및 DsbC의 발현

MXE008 균주는 Fab' 경쇄, Fab' 중쇄 및 DsbC를 코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰다.

균주의 형질전환은 [Chung C.T et al Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86:2172-2175 (1989)]에 기술된 방법을 사용해 수행하였다.

항-TNF Fab'의 발현

균주 MXE008은 플라스미드 pMXE117(pTTO CDP870 또는 40.4 IGS2), CDP870 Fab'(서열번호 9에 제시된 경쇄 서열 및 서열번호 10에 제시된 중쇄 서열을 갖는 항-TNF Fab')에 대한 발현 벡터로 형질전환시켰으며, 이 벡터는 [Sambrook et al 1 89, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y.]에 기술된 통상의 제한효소 클로닝 방법을 사용해 제작하였다. 플라스미드 pMXE117(pTTO CDP870 또는 40.4 IGS2)은 다음의 특징을 포함한다; 강력한 tac 프로모터 및 lac 오퍼레이터 서열. Fab 경쇄 및 중쇄 유전자는 단일 디시스트론 메세지로 전사되었다. 이. 콜라이 OmpA 단백질 유래의 신호 펩티드를 코딩하는 DNA를 경쇄 및 중쇄 유전자 서열의 5' 말단에 융합시켜서 이.콜라이 주변세포질로 폴리펩티드를 이동시킬 수 있었다. 전사는 이중 전사 종결인자 rrnB tlt2를 사용해 종결시켰다. laclq 유전자는 Lac I 리프레서 단백질을 항상 발현한다. 이는 탈억제가 알로락토스 또는 IPTG 존재에 의해 유도될 때까지 tac 프로모터로부터의 전사를 억제하였다. 사용된 복제 기원은 pl5A이며, 카피 수를 낮게 유지시켰다. 플라스미드는 항생제 선별용 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하였다.

실시예 2 - 재조합 항체 항-TNF Fab'을 발현하는 숙주 세포의 성장

실시예 1에서 생산된 MXE008 균주를 발효 실험에 사용하여 항-TNFα Fab'를 발현시켰다.

항-TNF Fab' 및 DsbC를 발현하는 MXE008은 표준 발효 조건 및 배지를 사용해 발효배양하였다. 발효배양 후 얻어진 숙주 세포 샘플에 대해 원심분리하고 세포 펠렛을 저장을 위해 냉동시켰다.

실시예 3 - 이.콜라이 균주로부터 항-TNFα Fab'의 추출 및 pH 조정

실시예 2에서 냉동시킨 세포 펠렛을 해동시키고 추출 완충액(0.1 M Tris/10 mM EDTA pH 7.4)에 재현탁시켰다. 밤새 60℃에서 추출을 수행하였다.

추출 단계 후 추출 샘플을 1시간 동안 4200 rpm으로 4℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후 샘플을 0.45 ㎛+0.22 ㎛ 여과를 통해 정화하였다.

여과 후, pH가 6.9인 얻어진 숙주 세포 샘플 출출물을 10 ㎖씩 3 분취액으로 나누고 30%(v/v) 빙초산을 사용해 pH 5.0, 4.5 또는 3.0으로 조정하였다. 별개 분취액을 대조군 샘플로서 pH 6.9로 유지시켰다.

도 1에 도시한 바와 같이, pH가 감소함에 따라 침전도가 높음을 관찰하였다. 최고의 숙주 세포 단백질 침전은 pH 3.0에서 관찰되었고, 이어서 pH 4.5이고 다음으로는 pH 5.0이었다.

실시예 4 - 역상 HPLC를 통한 pH 조정 후 숙주 세포 샘플 추출물의 분석

pH 5.0, 4.5 또는 3.0로 pH 조정 후 또는 대조군(pH 무조정, pH 7)의 각 숙주 세포 샘플을 시간 (T)=0, T=1시간, T=2시간, T=4.5시간, T=8시간 및 T=24시간의 시간 경과에 따라 취하고, 역상 HPLC를 통해 실시간 분석을 수행하였다. 역상 HPLC는 소수성을 기반으로 단백질 분리를 가능하게 하며 적절한 HPLC 컬럼(Poroshell™ 300SB-C8, 5micron, 2.1x75mm from Agilent Technologies)을 사용해 수행하였다. 분석 전에 샘플을 여과하였다(0.22 ㎛).

결과는 도 2, 3, 5 및 6에 도시하였다. 도 2는 pH 조정 후 숙주 세포 샘플 추출물에 대한 T=0(T=0은 pH 조정 후 분석을 가능한 빨리, 대체로 pH 조정 후 대략 7분에 수행함을 의미함)에서의 역상 HPLC 분석에 대한 오버레이된 크로마토그램을 도시한 도면이다. 도 3은 pH 조정 후 숙주 세포 샘플 추출물에 대한 T=0에서 역상 HPLC 분석의 개별 크로마토그램을 도시한 도면이다. pH 3.0, pH 4.5 및 pH 5.0으로 pH 조정한 경우 및 pH 7의 경우에서 Fab'의 경쇄(LC), Fab'의 중쇄(HC), 전체 Fab', DsbC-his(his-태깅된 DsbC) 및 디펩티드 결합 단백질(DBP)에 상응하는 피크를 도시하였다. 도 2 및 도 3에서는 DsbC-his의 양이 pH 7의 대조군과 비교하여 pH 5로 pH 조정 후 보다 낮았고, DsbC-his의 양은 pH 4.5 또는 pH 3.0으로 pH 조정 후 더욱 유의하게 낮아짐을 보여준다. DBP의 양은 pH 3으로 pH 조정 후 유의하게 낮음을 볼 수 있다. DBP의 pI는 5.7이다. 따라서, 숙주 세포 추출물에서, pH는 DBP의 침전을 일으키기 위해 유의하게 낮아야했다. Fab'의 양은 pH 조정에 의해 유의하게 영향받지 않았다.

도 5는 pH 3.0, 4.5 및 5.0으로 pH 조정 후 역상 HPLC 크로마토그램으로부터의 DsbC-his에 대한 전체 피크 영역을 도시한 도면이다. 도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, DsbC의 양은 pH 5.0으로 pH 조정 후 낮아지고 pH 4.5 또는 3.0으로 조정 후 더욱 낮아졌다.

도 6은 pH 3.0, 4.5 및 5.0으로 pH 조정 후 역상 HPLC 크로마토그램으로부터의 DBP에 대한 전체 피크 영역을 도시한 도면이다. 도 2 및 3에 도시한 바와 같이, DBP의 양은 pH 3.0으로 조정 후 감소되었다.

정제된 DsbC-his 용액은 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 균주 MXE008의 숙주 세포 추출물로부터 얻었다. DsbC-his를 포함하는 이러한 정제 용액의 분석을 T=0, 1, 8 및 24시간 후 pH 7 및 pH 3.0에서 수행하였다. 결과는 도 4에 도시하였는데 이는 T=0, 1, 8 및 24시간 이후 pH 7.0 및 pH 3.0에서 DsbC를 포함하는 정제된 용액의 역상 HPLC 분석에 대한 크로마토그램을 보여준다. 도 4에서는 pH 조정이 용액으로부터 DsbC-his의 침전 및 제거에 어떠한 영향도 주지 않음을 볼 수 있다.

실시예 5 - 샘플의 SDS-PAGE 분석

비환원 SDS-PAGE 분석은 pH 7, pH 5.0, pH 4.5 및 pH 3.0에서 장기간 저장 후 수행하였다. 도 7은 SDS-PAGE 분석 겔을 보여준다. 도 7에서 볼 수 있듯이 DBP이 양은 pH 3으로 pH 조정 후 감소하였다. DsbC 및 Fab'의 중쇄(HC)는 겔 상에서 동일 분자량을 보이지만 DsbC 및 HC에 대한 밴드가 pH 5, pH 4.5 및 pH 3으로 조정 후 감소됨을 볼 수 있는데 DsbC의 감소는 DsbC-his 및 DBP의 양이 pH 조정 후 감소됨을 확인시켜준다.

pH 4.5로 pH 조정 후 상기 실시예에서 검사한 항-TNF Fab' CDP870은 Biacore 분석을 통해 검사하였고 TNF에 대한 친화성을 유지함을 확인하였다(결과는 도시하지 않음).

SEQUENCE LISTING <110> UCB CELLTECH <120> PROCESS FOR PURIFYING PROTEINS <130> G0126-WO01 <140> PCT/GB2011/001129 <141> 2011-07-27 <150> GB1012599.5 <151> 2010-07-27 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of CDRH1 of CDP870 <400> 1 Asp Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of CDP870 <400> 2 Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of CDRH3 of CDP870 <400> 3 Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of CDP870 <400> 4 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of CDRL2 of CDP870 <400> 5 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of CDRL3 of CDP870 <400> 6 Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of the light chain variable region CDP870 <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain variable region CDP870 <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of a grafted anti-TNF? Fab CDP870 light chain <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 10 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of a grafted anti-TNF? Fab CDP870 heavy chain <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Ala Ala 225 <210> 11 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of his-tagged DsbC <400> 11 atgaagaaag gttttatgtt gtttactttg ttagcggcgt tttcaggctt tgctcaggct 60 gatgacgcgg caattcaaca aacgttagcc aaaatgggca tcaaaagcag cgatattcag 120 cccgcgcctg tagctggcat gaagacagtt ctgactaaca gcggcgtgtt gtacatcacc 180 gatgatggta aacatatcat tcaggggcca atgtatgacg ttagtggcac ggctccggtc 240 aatgtcacca ataagatgct gttaaagcag ttgaatgcgc ttgaaaaaga gatgatcgtt 300 tataaagcgc cgcaggaaaa acacgtcatc accgtgttta ctgatattac ctgtggttac 360 tgccacaaac tgcatgagca aatggcagac tacaacgcgc tggggatcac cgtgcgttat 420 cttgctttcc cgcgccaggg gctggacagc gatgcagaga aagaaatgaa agctatctgg 480 tgtgcgaaag ataaaaacaa agcgtttgat gatgtgatgg caggtaaaag cgtcgcacca 540 gccagttgcg acgtggatat tgccgaccat tacgcacttg gcgtccagct tggcgttagc 600 ggtactccgg cagttgtgct gagcaatggc acacttgttc cgggttacca gccgccgaaa 660 gagatgaaag aatttctcga cgaacaccaa aaaatgacca gcggtaaaca ccatcaccat 720 <210> 12 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of his-tagged DsbC <400> 12 Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15 Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala Lys Met 20 25 30 Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala Gly Met Lys 35 40 45 Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Lys 50 55 60 His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser Gly Thr Ala Pro Val 65 70 75 80 Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu Glu Lys 85 90 95 Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val Ile Thr Val 100 105 110 Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu His Glu Gln Met 115 120 125 Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro 130 135 140 Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp 145 150 155 160 Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys 165 170 175 Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala 180 185 190 Leu Gly Val Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser 195 200 205 Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu 210 215 220 Phe Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys His His His His 225 230 235 240 His His <210> 13 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of wild-type spr gene including the signal sequence which is the first 26 amino acid residues <400> 13 Met Val Lys Ser Gln Pro Ile Leu Arg Tyr Ile Leu Arg Gly Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ile Ala Val Ala Val Leu Leu Ser Ala Cys Ser Ala Asn Asn Thr 20 25 30 Ala Lys Asn Met His Pro Glu Thr Arg Ala Val Gly Ser Glu Thr Ser 35 40 45 Ser Leu Gln Ala Ser Gln Asp Glu Phe Glu Asn Leu Val Arg Asn Val 50 55 60 Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Asp Gln Tyr Ala Asp Trp Lys Gly Val 65 70 75 80 Arg Tyr Arg Leu Gly Gly Ser Thr Lys Lys Gly Ile Asp Cys Ser Gly 85 90 95 Phe Val Gln Arg Thr Phe Arg Glu Gln Phe Gly Leu Glu Leu Pro Arg 100 105 110 Ser Thr Tyr Glu Gln Gln Glu Met Gly Lys Ser Val Ser Arg Ser Asn 115 120 125 Leu Arg Thr Gly Asp Leu Val Leu Phe Arg Ala Gly Ser Thr Gly Arg 130 135 140 His Val Gly Ile Tyr Ile Gly Asn Asn Gln Phe Val His Ala Ser Thr 145 150 155 160 Ser Ser Gly Val Ile Ile Ser Ser Met Asn Glu Pro Tyr Trp Lys Lys 165 170 175 Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Arg Val Leu Ser Arg Ser 180 185 <210> 14 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of the wild-type spr gene without the signal sequence <400> 14 Cys Ser Ala Asn Asn Thr Ala Lys Asn Met His Pro Glu Thr Arg Ala 1 5 10 15 Val Gly Ser Glu Thr Ser Ser Leu Gln Ala Ser Gln Asp Glu Phe Glu 20 25 30 Asn Leu Val Arg Asn Val Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Asp Gln Tyr 35 40 45 Ala Asp Trp Lys Gly Val Arg Tyr Arg Leu Gly Gly Ser Thr Lys Lys 50 55 60 Gly Ile Asp Cys Ser Gly Phe Val Gln Arg Thr Phe Arg Glu Gln Phe 65 70 75 80 Gly Leu Glu Leu Pro Arg Ser Thr Tyr Glu Gln Gln Glu Met Gly Lys 85 90 95 Ser Val Ser Arg Ser Asn Leu Arg Thr Gly Asp Leu Val Leu Phe Arg 100 105 110 Ala Gly Ser Thr Gly Arg His Val Gly Ile Tyr Ile Gly Asn Asn Gln 115 120 125 Phe Val His Ala Ser Thr Ser Ser Gly Val Ile Ile Ser Ser Met Asn 130 135 140 Glu Pro Tyr Trp Lys Lys Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Arg Val Leu Ser 145 150 155 160 Arg Ser <210> 15 <211> 2048 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of a mutated knockout Tsp gene including the 6 nucleotides ATGAAT upstream of the start codon <400> 15 atgaattcgt ttttaggctt accgcgttag ctggcctgct tgcaatagca ggccagacat 60 taattgtaga agatatcacg cgtgctgatc aaattccggt attaaaggaa gagacgcagc 120 atgcgacggt aagtgagcgc gtaacgtcgc gcttcacccg ttctcattat cgccagttcg 180 acctcgatca ggcattttcg gccaaaatct ttgaccgcta cctgaatctg ctcgattaca 240 gccacaacgt gctgctggca agcgatgttg aacagttcgc gaaaaagaaa accgagttag 300 gcgatgaact gcgttcaggc aaactcgacg ttttctacga tctctacaat ctggcgcaaa 360 agcgccgttt tgagcgttac cagtacgctt tgtcggtact ggaaaagccg atggatttca 420 ccggcaacga cacttataac cttgaccgca gcaaagcgcc ctggccgaaa aacgaggctg 480 agttgaacgc gctgtgggac agtaaagtca aattcgacga gttaagcctg aagctgacag 540 gaaaaacgga taaagaaatt cgtgaaaccc tgactcgccg ctacaaattt gccattcgtc 600 gtctggcgca aaccaacagc gaagatgttt tctcgctggc aatgacggcg tttgcgcgtg 660 aaatcgaccc gcataccaac tatctttccc cgcgtaatac cgaacagttc aacactgaaa 720 tgagtttgtc gctggaaggt attggcgcag tgctgcaaat ggatgatgac tacaccgtta 780 tcaattcgat ggtggcaggt ggtccggcag cgaagagtaa agctatcagc gttggtgaca 840 aaattgtcgg tgttggtcaa acaggcaagc cgatggttga cgtgattggc tggcgtcttg 900 atgatgtggt tgccttaatt aaagggccga agggcagtaa agttcgtctg gaaattttac 960 ctgctggtaa agggaccaag acccgtactg taacgttgac ccgtgaacgt attcgtctcg 1020 aagaccgcgc ggttaaaatg tcggtgaaga ccgtcggtaa agagaaagtc ggcgtgctgg 1080 atattccggg cttctatgtg ggtttgacag acgatgtcaa agtgcaactg cagaaactgg 1140 aaaaacagaa tgtcagcagc gtcatcatcg acctgcgtag caatggcggt ggggcgttaa 1200 ctgaagccgt atcgctctcc ggtctgttta ttcctgcggg tcccattgtt caggtccgcg 1260 ataacaacgg caaggttcgt gaagatagcg ataccgacgg acaggttttc tataaaggcc 1320 cgctggtggt gctggttgac cgcttcagtg cttcggcttc agaaatcttt gccgcggcaa 1380 tgcaggatta cggtcgtgcg ctggttgtgg gtgaaccgac gtttggtaaa ggcaccgttc 1440 agcaataccg ttcattgaac cgtatttacg atcagatgtt acgtcctgaa tggccagcgc 1500 tgggttctgt gcagtacacg atccagaaat tctatcgcgt taacggcggc agtacgcaac 1560 gtaaaggcgt aacgccagac atcatcatgc cgacgggtaa tgaagaaacg gaaacgggtg 1620 agaaattcga agataacgcg ctgccgtggg atagcattga tgccgcgact tatgtgaaat 1680 caggagattt aacggccttt gaaccggagc tgctgaagga acataatgcg cgtatcgcga 1740 aagatcctga gttccagaac atcatgaagg atatcgcgcg cttcaacgct atgaaggaca 1800 agcgcaatat cgtttctctg aattacgctg tgcgtgagaa agagaataat gaagatgatg 1860 cgacgcgtct ggcgcgtttg aacgaacgct ttaaacgcga aggtaaaccg gagttgaaga 1920 aactggatga tctaccgaaa gattaccagg agccggatcc ttatctggat gagacggtga 1980 atatcgcact cgatctggcg aagcttgaaa aagccagacc cgcggaacaa cccgctcccg 2040 tcaagtaa 2048 <210> 16 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide cassette encoding intergenic sequence 2 (IGS2) for E. coli Fab expression <400> 16 gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggggagtgt taaaatgaag aagactgcta 60 tagcaattg 69

Claims

그람 음성 박테리아 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물로부터 6 이상의 pI를 갖는 재조합 단백질을 정제하는 방법으로서, 상기 숙주 세포는 재조합 단백질 및 재조합 이황화물 이성질화효소 DsbC를 발현하고,
a) 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH를 pH 5 내지 3으로 조정하여 재조합 이황화물 이성질화효소를 침전시키는 단계; 및
b) 침전된 재조합 이황화물 이성질화효소를 재조합 단백질로부터 분리하여 재조합 단백질 샘플을 수득하는 단계
를 포함하는 것인 정제 방법.
제1항에 있어서, 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH를 pH 4.5 내지 3으로 조정하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 이황화물 이성질화효소는 히스티딘 태그를 포함하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 그람 음성 박테리아 숙주 세포는 이.콜라이(E. coli)인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 숙주 세포는 Fkpa 및 Skp에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 추가로 포함하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)에서 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH를 빙초산을 사용해 조정하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)에서 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH를 1 시간 이하 동안 유지하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b)에서의 분리는 원심분리 또는 여과를 포함하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b)에서의 분리는 원심분리 및 여과를 포함하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b) 이후에 재조합 단백질 샘플을 크로마토그래피하는 추가 정제 단계를 포함하는 정제 방법.
제10항에 있어서, 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b) 이후에 재조합 단백질 샘플의 pH를 pH 5 내지 7로 조정하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a) 이전에 추출 완충제를 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물에 부가하고 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물에 대해 열처리 단계를 수행하는 것인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 단백질은 pI가 6 내지 9인 정제 방법.
제14항에 있어서, 재조합 단백질은 pI가 8 내지 9인 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 단백질은 재조합 항체인 정제 방법.
제16항에 있어서, 재조합 항체는 단일클론, 인간화 또는 키메라 항체, 또는 이의 단편인 정제 방법.
제16항에 있어서, 재조합 항체는 Fab 또는 Fab' 단편인 정제 방법.
제16항에 있어서, 재조합 항체는 인간 TNFα에 특이적인 정제 방법.
제19항에 있어서, 항체는 가변 도메인이 CDRH1에 대해 서열번호 1에 제시된 서열, CDRH2에 대해 서열번호 2에 제시된 서열 및 CDRH3에 대해 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄, 및 가변 도메인이 CDRL1에 대해 서열번호 4에 제시된 서열, CDRL2에 대해 서열번호 5에 제시된 서열 및 CDRL3에 대해 서열번호 6에 제시된 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 정제 방법.
제20항에 있어서, 항체는 서열번호 7에 제시된 경쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8에 제시된 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 정제 방법.
제21항에 있어서, 항체는 Fab 단편이고 서열번호 10에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 9에 제시된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 것인 정제 방법.
숙주 세포 재조합 이황화물 이성질화효소를 침전시키고, 침전된 숙주 세포 재조합 이황화물 이성질화효소를 6 이상의 pI를 갖는 재조합 단백질로부터 분리하고, 정제된 재조합 단백질 샘플을 생성하기 위해, 재조합 단백질을 코딩하는 발현 벡터로 형질전환된 그람 음성 박테리아 숙주 세포 샘플 또는 이의 추출물의 pH를 pH 5 내지 3으로 조정하는 단계를 사용하는 방법.
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