BR112013000177A2 - processo para purificar proteínas - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA PURIFICAR PROTEÍNAS. A presente invenção fornece método para purificar uma proteína recombinante a partir de uma amostra de célula hospedeira bacteriana gram negativa ou extrato desta em que a dita célula hospedeira expressa uma proteína recombinante e uma dissulfeto isomerase recombinante DsbC; que compreende: a. ajustar o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta a um pH de 5 ou menos para precipitar a dissulfeto isomerase recombinante; e b. separar a dissulfeto isomerase recombinante DsbC precipitada da proteína recombinante para produzir uma amostra de proteína recombinante.

Description

1/38 08/01/2013 1648 Neo

VV “PROCESSO PARA PURIFICAR PROTEÍNAS” BR 11 2013 000177 1 . Esta invenção diz respeito a um processo para purificar uma proteina recombinante a partir de uma amostra de célula hospedeira gram negativa ou extrato desta. Mais ” particularmente, a amostra de célula hospedeira gram negativa ou extrato desta são ajustadosaum pH baixo para efetuar a precipitação da dissulfeto isomerase da proteína.

As técnicas de DNA recombinante têm se desenvolvido rapidamente e são úteis na produção de anticorpos, em particular anticorpos terapêuticos. Sistemas para a expressão de genes recombinantes são bem conhecidos pela pessoa habilitada no campo em questão, Estes incluem expressão em células de mamífero, células de inseto, células fúngicas, células bacterianas e animais e plantas transgênicas. A escolha do sistema de expressão é dependente das características da proteina codificada, por exemplo modificações pós- traducionais. Outras considerações incluem o tempo e, em particular, o custo envolvidos na produção da quantidade desejada de material da qualidade requerida. Estas últimas considerações são particularmente importantes na produção de anticorpos terapêuticos da qualidade requerida para a aprovação regulatória e nas quantidades necessárias para o tratamento de números grandes de pacientes.

. Um sistema amplamente usado para a produção das proteínas recombinantes está fundamentado na expressão em Escherichia coli (E. coli. Um problema específico ' encontrado com o uso da E. coli é a dificuldade em produzir material da qualidade requerida em quantidades necessárias para terapia. Em particular, o tempo e custos envolvidos podem ser proibitivos. Um problema específico digno de nota é a perda incorrida no rendimento de anticorpos durante a purificação dos anticorpos a partir da E. coli, Embora, proporcionalmente, os custos de purificação sejam uma fração do custo total de um produto de anticorpo terapêutico, a proporção do custo de purificação aumentará ainda mais conforme os custos de produção a montante se tomam mais baratos. Assim, melhorias na recuperação e purificação de anticorpos conduzirão os custos de produção mais para baixo independente dos meios de produção (Humphreys & Glover, Curr. Opin. : Drug Discovery & Development, 2001, 4: 172-185), Consequentemente, existe uma necessidade quanto a métodos que introduzam economia de tempo e/ou custo na produção de anticorpo terapêutico e, em particular, na purificação, por exemplo pelo aumento da recuperação do produto e/ou melhora da qualidade da corrente de produto.

Rendimento de produto baixo é frequentemente um problema particular mencionado durante as etapas de purificação a jusante. Um problema específico na purificação a jusante relaciona-se com a separação das proteínas da célula hospedeira — (HCP) que são liberadas na extração do anticorpo terapêutico da célula hospedeira. Várias modificações de processo foram tentadas de modo a tratar este problema. Os exemplos de tais processos incluem o que segue:

2/38 | A proteina de interesse pode ser precipitada e depois separada de outros . contaminantes da HCP. Entretanto, a precipitação de um anticorpo terapêutico pode causar dano irreversível ao anticorpo. As técnicas que especificamente precipitam a proteína de - interesse frequentemente resultam no aprisionamento dos contaminantes não proteináceos noprecipitado, tornando a separação ineficaz.

Alternativamente, a HCP pode ser precipitada do anticorpo terapêutico. A US7169908 descreve a adição de uma solução de lactato de etacridina para precipitar as impurezas da célula hospedeira, Entretanto, o uso de um agente tal como o lactato de etacridina não é adequado para a produção de proteinas terapêuticas porque o mesmo foi usado como um agente de absorção e pode ser nocivo para o paciente se não for completamente removido. As HCPs de uma cultura de célula CHO foi precipitada usando uma molécula pequena e ajuste de pH de modo a purificar uma proteina (Arunakumari A. et al. Advances in Non-Protein A Purification Processes for Human Monoclonal Antibodies Supplement to BioPharm International Março de 2009 p 2226).

Embora tais métodos tenham contribuído para ajudar a purificar anticorpos terapêuticos dos contaminantes da célula hospedeira existe ainda uma necessidade para - fornecer métodos melhorados para reduzir a quantidade de HCPs dos sistemas de célula hospedeira microbiana sem afetar negativamente as propriedades do anticorpo terapêutico * de modo a facilitar ainda mais o processamento a jusante.

Além disto, os inventores descobriram que a expressão de certas proteínas acompanhantes, por exemplo uma dissulfeto isomerase, tal como DsbC, pelo hospedeiro podem ser úteis em aumentar os níveis de expressão de anticorpos ou seus fragmentos. Entretanto, a proteina acompanhante é expressada em níveis significantes e torna-se um subproduto grande do processo que requer remoção.

A remoção de quantidades grandes de contaminante pode ser desafiadora porque métodos tais como a cromatografia de coluna encontram dificuldade para remover quantidades grandes de um contaminante de proteína devido ao entupimento da coluna e a necessidade de usar quantidades grandes de reagentes ou solventes.

Quando a DsbC isolada é testada a mesma é solúvel nos pHs baixos tais como pH

3. Entretanto, os presentes inventores surpreendentemente descobriram que o ajuste de pH de 5 ou menos pode ser usado para precipitar a dissulfeto isomerase recombinante de uma célula hospedeira bacteriana gram negativa e deste modo facilitar ainda mais o processamento de uma proteina recombinante de interesse, tal como um anticorpo terapêutico.

Sumário da Invenção Em um aspecto é fornecido um método para purificar uma proteina recombinante a partir de uma célula hospedeira, por exemplo uma amostra de célula hospedeira bacteriana

3/38 | gram negativa que expressa uma proteina recombinante e uma dissulfeto isomerase - recombinante ou extrato desta; que compreende: a. ajustar o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta a um pH de 5 ou . menos para precipitar a dissulfeto isomerase recombinante; e b. separar a dissulfeto isomerase recombinante precipitada da proteina recombinante para fornecer uma amostra de proteina recombinante.

A presente invenção também fornece o uso de uma etapa de ajustar o pH de uma amostra de célula hospedeira bacteriana gram negativa transformada com um vetor de expressão que codifica uma proteína recombinante ou extrato desta a um pH de 5 ou menos para precipitar a dissulífeto isomerase recombinante da célula hospedeira, seguido pela separação da dissulfeto isomerase recombinante da célula hospedeira precipitada da proteina recombinante e fornecer uma amostra de proteína recombinante purificada.

Em uma forma de realização é fornecido um método para purificar um anticorpo recombinante ou um fragmento de ligação deste a partir de uma amostra de célula hospedeira bacteriana gram negativa ou um extrato da dita célula hospedeira em que a dita célula hospedeira expressa o anticorpo recombinante ou fragmento de ligação deste e uma - dissulfeto isomerase recombinante DsbC; em que o método compreende: a. ajustar o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta a um pH na faixa * de 3,5 a 5 para precipitar a DsbC recombinante; e b. separar a DsbC recombinante precipitada para fornecer uma amostra contendo um anticorpo recombinante purificado ou fragmento deste.

Surpreendentemente, esta etapa de ajuste de pH precipita uma quantidade significante da dissulfeto isomerase recombinante da célula hospedeira da solução e deste modo possibilita a separação da dissulfeto isomerase recombinante da célula hospedeira da proteína recombinante de interesse. Isto facílita o processamento a jusante, particularmente qualquer uma das etapas de cromatografia subsequentes tais como a captura pela cromatografia que não de afinidade, pela redução da dissulfeto isomerase da célula hospedeira na solução que compete com a proteína recombinante quanto aos sítios de ligação na cromatografia de coluna. Portanto, a carga de HCPs na cromatografia de coluna é minimizada e o rendimento da proteina recombinante de interesse é melhorado quando o mesmo tamanho e número de colunas de cromatografia são usados. Isto reduz o tempo e custo de purificação adicional a jusante.

De maneira interessante a DsbC pura não precipita em um pH na faixa de 3,0a 5 (ver a Figura 4). Entretanto, quando presente no ambiente complexo de uma célula gram —negativaque expressa um anticorpo ou um fragmento de ligação deste ou alternativamente na presença de parte ou todo do conteúdo das ditas células então a DsbC precipita. Embora não se deseje estar ligado pela teoria é levantada a hipótese de que o ambiente de matriz

4138 o complexo da célula hospedeira ou extrato desta catalise a precipitação da dissulfeto . isomerase, tal como DsbC, na faixa de pH embora normalmente a proteína seja solúvel em um pH na faixa de 3,5 a 5. Talvez uma vez que a precipitação é iniciada a mesma continua - e aumenta gradativamente.

Assim, o método de acordo com a presente divulgação é adequado para o uso em escalas grandes e portanto é muito útil no processamento comercial das proteínas tais como anticorpos.

Descrição Resumida dos Desenhos A Figura 1 mostra a precipitação observada da solução de célula hospedeira depois queopHfoiajustado para o pH 5,0, pH 4,5 ou pH 3,0 comparada com o pH de controle de 6,9.

A Figura 2 mostra o cromatograma de uma análise de HPLC de fase reversa no Tempo (T) = O para as soluções de célula hospedeira depois do ajuste de pH ao pH 5, pH 4,5 ou pH 3 comparado com o controle de pH de 7.

A Figura 3 mostra os cromatogramas separados de uma análise de HPLC de fase reversa em T = O para as soluções da célula hospedeira depois do ajuste de pH para o pH 5, - PH 4,5 ou pH 3 comparado com o controle de pH de 7. A Figura 4 mostra os cromatogramas separados de uma análise de HPLC de fase bl reversa para uma solução que compreende DsbC depois do ajuste do pH para o pH 3 depoisde intervalos de tempo diferentes comparados com o controle de pH de 7.

A Figura 5 mostra a área de pico total para DsbC de uma análise de HPLC de fase reversa em vários pontos de tempo para as soluções de célula hospedeira depois do ajuste de pH para pH 5, pH 4,5 ou pH 3 comparado com o controle de pH de 7.

A Figura 6 mostra a área de pico total para DBP de uma análise de HPLC de fase reversa em vários pontos de tempo para as soluções de célula hospedeira depois do ajuste de pH para pH 5, pH 4,5 ou pH 3 comparado com o controle de pH de 7.

A Figura 7 mostra o Gel de Análise de SDS-PAGE para soluções de célula hospedeira depois do ajuste de pH para pH 5, pH 4,5 ou pH 3 comparado com o controle de pH de 6,9.

A Figura 8 mostra as sequências SEQ ID NOs: 1 a 16.

A Figura 9 mostra a estrutura de um composto chamado de CDP870 que compreende um fragmento Fab' anti-TNF modificado covalentemente ligado por intermédio de um resíduo de cisteína a um ligador de lisil-maleimida em que cada grupo amida no resíduo de lisila tem covalentemente ligado ao mesmo um resíduo de metóxi PEG em que n édecercaded420.

Descrição Resumida das Sequências A SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de aminoácido de CDRH1 de CDP870.

5/38 NA A SEQ ID NO: 2 mostra à sequência de aminoácido de CDRH2 de CDP870. . A SEQ ID NO: 3 mostra a sequência de aminoácido de CDRH3 de CDP870. A SEQ ID NO: 4 mostra a sequência de aminoácido de CDRL1 de CDP870. . A SEQ ID NO: 5 mostra a sequência de aminoácido de CDRL2 de CDP870. A SEQ ID NO: 6 mostra a sequência de aminoácido de CDRL3 de CDP870.

A SEQ ID NO: 7 mostra o nucleotídeo e a sequência de aminoácido prognosticada da região variável de cadeia leve de CDP870.

A SEQ ID NO: 8 mostra o nucleotídeo e a sequência de aminoácido prognosticada da região variável de cadeia pesada de CDP870.

A SEQ ID NO: 9 mostra a sequência de aminoácido de uma cadeia leve de Fab anti-TNFa enxertada de CDP870.

A SEQ ID NO: 10 mostra a sequência de aminoácido de uma cadeia pesada de Fab anti-TNFa enxertada de CDP870.

A SEQ ID NO: 11 é a sequência de nucleotídeo de DsbC alvejada em his.

A SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácido de DsbC alvejada em his. A SEQ ID NO: 13 é a sequência do gene spr do tipo selvagem incluindo a . sequência de sinal que é os primeiros 26 residuos de aminoácido. A SEQ ID NO: 14 é a sequência do gene spr do tipo selvagem sem a sequência de * sinal. A SEQ ID NO: 15 é a sequência de DNA de um gene Tsp silenciado mutado que inclui os 6 nucleotídeos ATGAAT a montante do códon de partida.

A SEQ ID NO: 16 mostra o cassete de oligonucleotídeo que codifica a sequência intergênica 2 (IGS2) para a expressão de Fab da E. coli.

Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas da Invenção A presente invenção será agora descrita em mais detalhes.

Os termos “proteína” e “polipeptídeo” são usados aqui intercambiavelmente, a menos que o contexto indique de outro modo. “Peptídeo” é intencionado a se referir a 10 ou menos aminoácidos.

O termo “polinucleotídeo” inclui DNA, cDNA, RNA e mRNA.

Como aqui usado, o termo “que compreende" no contexto do presente relatório descritivo deve ser interpretado como “que incluí”.

As expressões “célula”, “linhagem de célula”, “cultura de célula” e “cepa” são usados intercambiavelmente.

Extrato de célula hospedeira (extrato da mesma) como aqui utilizado é usado para sereferira parte ou todo dos conteúdos da célula hospedeira isto é, * material obtido de uma lise de célula parcial ou total para extrair alguma ou toda matéria química das células, ou

6/38 | * material obtido da submissão das células ao processamento tal que uma ou mais . das proteinas expressadas a partir das células são liberadas na fase líquida. A matéria química e o material que forma os conteúdos da célula hospedeira como - aqui utilizados referem-se aos líquidos, proteínas, lipídeos, açúcares, lipopolissacarídeos, peptidoglicanos, plasmídeo e DNA's cromossômicos, RNA's, moléculas pequenas tais como aminoácidos, íons metálicos, moléculas ativas em redox, tRNA's e fragmentos de todos os acima de dentro da célula.

Os métodos para a liberação de uma ou mais proteínas das células incluem tratamento térmico e/ou submeter as células à pressão que não as lise e/ou uso de produtos químicos que incluem: tampões, agentes queladores, detergentes, rompimento físico e/ou uso de energia sônica e/ou uso de cisalhamento mecânico.

A amostra de célula gram negativa como aqui utilizada refere-se a uma população ' de células gram negativas, por exemplo pelo menos duas células gram negativas mas mais especificamente um lote utilizado em um processo de fermentação, em particular um processo de fermentação comercial. O anticorpo recombinante ou fragmento de ligação deste purificados como aqui .« utilizados são intencionados a se referir a uma forma do anticorpo ou fragmento em que existem menos impurezas e contaminantes do que na forma não processada . correspondente. O mesmo não é necessariamente intencionado a ser um termo absoluto porque o anticorpo ou fragmento podem requerer ainda etapas de purificação adicionais.

Em uma forma de realização um anticorpo recombinante ou fragmento de ligação deste purificados fornecidos pelo método de acordo com a presente invenção são substancialmente puros.

Substancialmente puro como aqui utilizado refere-se a quando o anticorpo ou fragmento de ligação deste são mais do que 90 % puros, por exemplo 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % puros, em particular 95 % puros ou maior.

Esta invenção aqui descrita está fundamentada na observação surpreendente e inesperada de que depois que uma amostra de célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que codifica uma molécula de proteina recombinante foi cultivada, uma etapade ajustaro pH a 5 ou menos pode ser usada para precipitar a dissulfeto isomerase recombinante e que isto tem um impacto significantemente benéfico sobre a purificação da proteína.

A Etapa a) da presente invenção requer o ajuste da amostra de célula hospedeira ou extrato desta a um pH de 5 ou menos, um pH de menos do que 5, um pH de 4,5 ou —menosouum pH de3oumenos. Em uma forma de realização preferida, o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta é ajustado a um pH de 4,5 ou menos, mais preferivelmente um pH de aproximadamente 4,5. Os inventores descobriram que um pH de

7138 oO 4,5 é particularmente vantajoso para precipitar e possibilitar a separação de DsbC . recombinante.

Em uma forma de realização o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta não é ajustado a um pH que seja menor do que pH 3 ou alternativamente menor do quepH3,5 Consequentemente, o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta é preferivelmente ajustado a um pH de 3 a 4,9, um pH de 3,5 a 4,9, um pH de 3 a 4,5 ou um PH de 3,5 a 4,5.

Em uma forma de realização o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta é ajustado a um pH de 3 ou menos, mais preferivelmente um pH de aproximadamente

3. Os inventores descobriram que um pH de 3 ou menos é vantajoso para precipitar e possibilitar a separação de DsbC recombinante e também proteína de ligação de dipeptídeo da célula hospedeira.

Entretanto, embora os pHs de 3 ou menos sejam adequados para precipitar a proteína de DsbC da célula hospedeira ou extrato, os pHs baixos podem alterar a conformação dobrada do anticorpo ou fragmento de ligação deste e assim podem não ser ideais quando todos os parâmetros do processo são considerados.

- Assim o pH ideal para precipitar as proteínas da célula hospedeira dependerá do anticorpo ou fragmento de anticorpo específicos expressados pela célula e em particular a + estabilidade da mesma na faixa de pH relevante.

Pelo menos uma dissulfeto isomerase, por exemplo pelo menos DsbC é precipitada utilizando o processo. Em uma forma de realização uma ou mais outras proteínas da célula hospedeira são também precipitadas utilizando o processo, Na etapa a) do método da presente invenção a solução de célula hospedeira ou extrato desta podem ser mantidos no pH mais baixo, por exemplo um pH de 5 ou menos por qualquer período adequado de tempo antes de realizar qualquer uma das etapas de purificação adicionais, tais como centrifugação e/ou filtração, e/ou antes de um ajuste de pH adicional tipicamente para elevar o pH da solução. No geral a solução de célula hospedeira ou extrato desta serão mantidos por 24 horas ou menos, 12 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 2 horas ou menos, 1 hora ou menos, 30 minutos ou menos, 10 —minutosoumenos ou?7 minutos ou menos.

Depois de utilizar o método da invenção o pH pode, por exemplo ser elevado para o pH 6, 6,5 ou 7 antes que processamento adicional isto é, subsequente tal como purificação adicional, por exemplo purificação utilizando a cromatografia de troca de ânion seja realizado.

A Etapa a) do método da presente invenção pode ser realizada em qualquer temperatura adequada, por exemplo temperatura ambiente, tal como de 20 a 23º C ou temperatura reduzida tal como de 1 a 10º C. Assim as faixas de temperatura adequadas

8/38 O para realizar o método incluem pelo menos de 1 a 30º C, . O ajuste do pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta pode ser realizado usando qualquer agente adequado capaz de mudar o pH. Os exemplos de - agentes adequados são ácido acético glacial, hidróxido de sódio, acetato de sódio ou base tris e combinação destes. O agente pode estar em qualquer concentração adequada tal como de 30 ou 60 % (v/v) de ácido acético glacial, hidróxido de sódio1 M, acetato de sódio 1 M, e 2 M ou 3 M da sua base.

Um ou mais destes agentes são particularmente vantajosos para o uso no método de acordo com a presente divulgação e, por exemplo possibilitar a precipitação e remoção da dissulfeto isomerase recombinante na purificação de uma proteína terapêutica porque eles não são tóxicos.

A dissulfeto isomerase é uma enzima que catalisa a formação e quebra das ligações de dissulfeto entre resíduos de cisteina dentro das proteínas conforme elas dobram. A dissulfeto isomerase da proteina é liberada da célula hospedeira na extração da proteina recombinante. A célula hospedeira usada no método da presente invenção produz a dissulfeto isomerase recombinante e, portanto, a dissulfeto isomerase recombinante - constitui uma proporção significante da proteina contaminante da célula hospedeira. À presente invenção tem fornecido um meio que economiza tempo e custo para remover a . dissulfeto isomerase recombinante da proteína recombinante. A dissulfeto isomerase recombinante, tal como DsbC, pode compreender um rótulo de histidina (rótulo his) no terminal N e/ou C.

O rótulo de histidina é vantajoso porque possibilita o monitoramento eficaz para mostrar que a contaminação pela DsbC foi removida do anticorpo ou fragmento de ligação deste. Isto é importante porque a presença de DsbC pode ser difícil de detectar quando do —usode soros policionais incitados contra os conteúdos celulares da E. coli do tipo selvagem porque os soros policlonais padrão tendem a ser insuficientemente reativos ou não reativos para DsbC, e assim são incapazes de detectar DsbC mesmo quando a mesma é superexpressada em níveis altos. A presença de um rótulo de detecção tal como poli-His garante que a remoção de DsbC abundantemente superexpressadas possa ser —monitorada/confirmada usando métodos de imunodetecção sensíveis.

Em uma forma de realização preferida, a dissulfeto isomerase recombinante é a DsbC. A DsbC é uma proteína procariótica encontrada no periplasma da E. coli que catalisa a formação de ligações de dissulfeto na E. coli. A DsbC tem um comprimento de sequência de aminoácido de 236 (que inclui peptídeo de sinal) e um peso molecular de 25,6 KDa —(UniProt No POAEG6). A DsbC foi primeiro identificada em 1994 (Missiakas et al. The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation, The EMBO Journal vol 13, no 8, p2013-2020, 1994 e Shevchik et al.

PL 9/38 Characterization of DsbC, a periplasmic protein of Enwinia chrysanthemi and Escherichia coli . with disuífide isomerase activity, The EMBO Journal vol 13, no 8, p2007-2012, 1994). À proteína DsbC pode compreender um rótulo de histidina (rótulo his) no terminal N e/ou C. - O pl prognosticado de DsbC é 5,7 e o pl prognosticado de DsbC rotulado em rótulo hiséde63 O pl de uma proteina pode ser prognosticado usando uma variedade de softwares comercialmente disponíveis e liberados ao público e meios de prognóstico de pl on-line tais como EXPASy ProtParam. Espera-se que as proteínas precipitem se o pH da solução passe através do pl da proteína. Entretanto, pode ser observado a partir da Figura 4 que uma solução de DsbC (rotulado com his) isento de célula hospedeira ou extrato de célula hospedeira quando ajustado ao pH 3 não precipita porque a quantidade de DsbC não é reduzida depois do ajuste de pH, Surpreendentemente, foi descoberto que DsbC precipita quando uma amostra de célula hospedeira ou extrato desta que compreende DsbC recombinante é submetida a um ajuste de pH a menos do que o pH 5 uma quantidade significante da DsbC é precipitada epode ser separada de uma proteina recombinante de interesse, como mostrado na Figura

3. Consequentemente, não é possível prognosticar a partir da p1 prognosticada de uma - proteína, tal como DsbC, qual pH é requerido para possibilitar a precipitação de uma amostra de célula hospedeira ou extrato desta. - Como aqui usado, um “polipeptídeo recombinante" refere-se a uma proteina que é construída ou produzida usando a tecnologia de DNA recombinante. A sequência de polinucleotídeo que codifica a dissulfeto isomerase pode ser idêntica a uma sequência endógena que codifica a dissulfeto isomerase encontrada nas células bacterianas. Alternativamente, a sequência de polinucleotídeo recombinante que codifica a dissulfeto isomerase é uma versão mutada da sequência de dissulfeto isomerase do tipo selvagem, por exemplo tendo um sítio de restrição removido. Na forma de realização em que a dissulfeto isomerase é DsbC, o sítio de restrição EcoRI pode ser removido e/ou uma sequência que codifica um rótulo his adicionada. Um exemplo de sequência de nucleotídeo de DsbC modificada para o uso na presente invenção é mostrado na SEQ ID NO: 11, que codifica a sequência de aminoácido de DsbC rotulada com his mostrada na SEQ ID NO: 12. Em uma forma de realização a DsbC mutante consiste de uma proteína DsbC com um sítio ativo mutado representado pela -CXXC- em que XX é TF, GF, HH, NY, SF, MF, VH, SH, RF, FA, GA, MA, Gl, AV, PS, QA, SV, PR, PP, AL, PL, FL, TR, LL, VL, QL, LO. Antes da etapa a) do método da presente invenção, o método pode compreender cultivar uma amostra de célula hospedeira transformada com um ou mais vetores de expressão que codificam uma proteina recombinante e uma dissulfeto isomerase recombinante. A amostra pode estar em qualquer escala adequada da produção em escala pequena da proteina até a fabricação em escala grande da proteina com propósitos comerciais. . Em uma forma de realização, em que a proteina é um anticorpo, os anticorpos recombinantes produzidos a partir da célula hospedeira podem ser uma mistura de - anticorpos funcionais e não funcionais.

A célula hospedeira compreende um polinucleotíideo recombinante que codifica uma dissulfeto isomerase que pode estar presente em um vetor de expressão adequado transformado na célula e/ou integrado no genoma da célula hospedeira. Preferivelmente o polinucleotídeo que codifica a dissulfeto isomerase está em um vetor de expressão na célula causando deste modo rompimento mínimo ao genoma da célula hospedeira. A proteina recombinante e a dissulfeto isomerase recombinante podem estar presentes no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão separados.

As células usadas na presente invenção são de bactérias gram-negativas. Mais preferivelmente, as células são da E. coli, As células são células recombinantes que foram geneticamente engendradas. As células hospedeiras da E. coli são cepas mutadas capazes de produzir proteinas recombinantes. As células hospedeiras da E. coli recombinantes podem ser derivadas de qualquer uma das cepas da E. coli adequadas que incluem . MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5a, DH1, BL21, K12, XL1Blue e JM109. Um exemplo é a E.

coli W3110 (ATCC 27.325) uma cepa hospedeira habitualmente usada para as - fermentações de proteína recombinante. Os exemplos também incluem cepas da E. coli modificadas, por exemplo mutantes metabólicos e cepas deficientes em protease.

A célula hospedeira é geneticamente engendrada para produzir a dissulfeto isomerase recombinante, As células hospedeiras que produzem a dissulfeto isomerase recombinante são particularmente vantajosas porque a presença da dissulfeto isomerase recombinante pode reduzir a lise de célula e pode ajudar no processamento da proteína recombinante.

Em uma forma de realização preferida a célula hospedeira compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica a DsbC recombinante, que inclui DsbC rotulada com his.

A célula hospedeira de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou maisde outrasmodificações genéticas.

Em uma forma de realização, a célula hospedeira pode ter atividade de protease reduzida, em que a célula compreende um gene Tsp mutado que codifica uma proteina Tsp tendo atividade de protease reduzida ou é um gene Tsp mutado silenciado, Por exemplo, a célula hospedeira pode ter atividade de proteina Tsp reduzida comparada com uma célula do tipo selvagem, A Tsp (também conhecida como Prc) é uma protease periplásmica de 60 kDa. O primeiro substrato conhecido de Tsp foi a Proteína 3 de ligação de penicilina (PBP3) (Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli; Nagasawa H, Sakagami Y, . Suzuki A, Suzuki H, Hara H, Hirota Y. J Bacteriol. Nov de 1989; 171(11): 5890-3 e Cloning, mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene that is involved in C-terminal - processing of penicillin-binding protein 3; Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y. J Bacteriol, Agosto de 1991; 173 (15): 4799-813) mas foi mais tarde descoberto que a Tsp também foi capaz de clivar as proteínas da cauda de fago e, portanto, foi renomeada como Protease Específica de Cauda (Tsp) (Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)).

Nesta forma de realização a célula tem atividade de proteina Tsp reduzida comparada com uma célula do tipo selvagem. A expressão “atividade de proteina Tsp reduzida comparada com uma célula do tipo selvagem” significa que a atividade de Tsp da célula é reduzida comparada com a atividade de Tsp de uma célula do tipo selvagem. À célula pode ser modificada por qualquer meio adequado para reduzir a atividade de Tsp. Em uma forma de realização a atividade de Tsp reduzida é de modificação do polinucleotídeo —endógeno que codifica Tsp e/ou as sequências de expressão regulatórias associadas. A modificação pode reduzir ou parar a transcrição e tradução do gene Tsp ou pode fornecer - uma proteina Tsp expressada tendo atividade de protease reduzida comparada com a proteina do Tsp do tipo selvagem, Em uma forma de realização uma sequência de - expressão regulatória associada é modificada para reduzir a expressão de Tsp. Por exemplo, o promotor para o gene Tsp pode ser mutado para prevenir a expressão do gene. Em uma forma de realização preferida a célula de acordo com a presente invenção carrega um gene Tsp mutado que codifica uma proteína Tsp tendo atividade de protease reduzida ou um gene Tsp mutado silenciado. Preferivelmente o gene Tsp cromossômico é mutado. A redução da atividade de Tsp (prc) é desejável para reduzir a proteólise das proteínas de interesse. Entretanto, foi descoberto que as células que carecem da protease prc apresentam crescimento termossensível em osmolaridade baixa, Hara et al isolated thermoresistant revertants containing extragenic suppressor (spr) mutations (Hara et al. Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)). Spr é uma protease periplásmica ligada à membrana de 18 kDa e os substratos de spr são Tsp e peptidoglicanos na membrana externa envolvidos na hidrólise da parede celular durante a divisão celular. O gene spr é designado como UniProtKB/Swiss-Prot POAFV4 (SPR ECOLI). As cepas deficientes em protease melhoradas que compreendem o gene spr mutante foram descritas. Chen et al (Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechnol Bicveng. 5 de março de 2004; 85(5): 463-74) descrevem a construção de cepas de E. coli que carregam combinações diferentes de mutações em prc (Tsp) e uma outra protease, DegP, criada pela amplificação das regiões a montante e a jusante do gene e ligando estes juntos em um vetor que compreende marcadores de seleção e uma mutação sprW174R (Acúmulo de alto nível de um fragmento de anticorpo - recombinante no periplasma de Escherichia coli requer uma cepa hospedeira mutante tripla (ADegP Aprc sprW174R). - A sequência de aminoácido do tipo selvagem da proteína spr é mostrada na SEQ IDNO:13coma sequência de sinal no terminal N e na SEQ ID NO: 14 sem a sequência de sinal de 26 aminoácidos (de acordo com o Número de Acesso UniProt POAFV4). A numeração de aminoácido da sequência de proteína spr na presente invenção inclui a sequência de sinal. Consequentemente, o aminoácido 1 da proteina spr é o primeiro aminoácido (Met) mostrado na SEQ ID NO: 13.

Em uma outra forma de realização a célula compreende um gene spr mutado. O gene spr mutante que codifica uma proteína spr pode ter uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados de C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, 11157 e W174. Preferivelmente o gene spr mutante codifica uma proteína spr tendo uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados de C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 e HI1I57. Preferiveimente, o gene spr mutante codifica uma proteína spr tendo uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados de S95, Ve98, Y115, D133, V135 e - G147, As mutações spr são capazes de suprimir o fenótipo de crescimento de uma célula que compreende um gene Tsp mutado. 1 Um ou mais dos aminoácidos C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, H157eWI174 podem ser mutados em qualquer aminoácido adequado que resulta em uma proteína spr capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado, Por exemplo, um ou mais de S95, V98, Y 115, D133 e V135 pode ser mutado a um aminoácido pequeno tal como Gly ou Ala. Em uma forma de realização preferida a proteína spr compreende uma ou mais das mutações que seguem: C94A, S95F, VSBE, Y115F, D133A,V135D ou G, H145A, G147C e H157A.

Em uma outra forma de realização o gene spr mutado codifica uma proteina spr tendo a mutação W174R. Em uma forma de realização alternativa a proteína spr não tem a mutação W174R.

A designação para um mutante de substituição aqui consiste de uma letra seguida —porum número seguido por uma letra. A primeira letra designa o aminoácido na proteina do tipo selvagem. O número refere-se à posição de aminoácido onde a substituição de aminoácido está sendo feita, e a segunda letra designa o aminoácido que é usado para substituir o aminoácido do tipo selvagem.

Consequentemente, em uma forma de realização preferida a célula usada na presente invenção compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC e um gene spr mutado, como definido acima.

Em uma outra forma de realização preferida a célula usada na presente invenção tem atividade de proteina Tsp reduzida comparada com uma célula do tipo selvagem e - compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC e um gene spr mutado, como definido acima. . Em uma forma de realização a célula hospedeira compreende um gene DegP mutado que codifica uma proteína DegP tendo atividade de acompanhante e atividade de protease reduzida e/ou um gene ptr mutado, em que o gene ptr mutado codifica uma proteína de Protease Ill tendo atividade de protease reduzida ou é um gene ptr mutado silenciado e/ou um gene OmpT mutado, em que o gene OmpT mutado codifica uma proteina OmpT tendo atividade de protease reduzida ou é um gene OmpT mutado silenciado.

Em uma forma de realização a célula hospedeira expressa uma ou mais proteínas como segue: * uma ou mais proteínas capazes de facilitar a dobra da proteina, tais como FKpA, Skp, SurA, PPiA e PPiD; e/ou * uma ou mais proteinas capazes de facilitar a secreção ou translocação da proteína, tais como SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY e Lep; e/ou - * uma ou mais proteinas capazes de facilitar a formação da ligação de dissulfeto, tais como DsbA, DsbB, DsbD, DsbG. - Uma ou mais das proteínas acima podem ser integradas no genoma da célula e/ou inseridas em um vetor de expressão.

Em uma forma de realização a célula hospedeira não compreende polinucleotídeo recombinante que codifica uma ou mais das proteinas que seguem: * uma ou mais proteínas capazes de facilitar a dobra da proteina, tais como FKpA, Skp, SurA, PPiA e PPiD; * uma ou mais proteínas capazes de facilitar a secreção ou translocação da proteina, tais como SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY e Lep; e * uma ou mais proteínas capazes de facilitar a formação da ligação de dissulfeto, tais como DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

Em uma forma de realização a célula usada na presente invenção tem atividade de proteina Tsp reduzida comparada com uma célula do tipo selvagem e compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC e um gene spr mutado, como definido acima compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC e um gene spr mutado, como definido acima, e FKpA e/ou Skp.

A proteina recombinante produzida usando os métodos da presente invenção é tipicamente expressada no periplasma da célula hospedeira de E. coli ou no sobrenadante da cultura da célula hospedeira, dependendo da natureza da proteína e da escala de produção.

Os métodos para alvejar proteinas a estes compartimentos são bem conhecidos na técnica, para uma revisão ver Makrides, Microbiological Reviews, 1996, 60, 512-538. Os . exemplos de sequências de sinal adequadas para direcionar proteínas ao periptasmo da E. coli incluem as sequências de sinal da E. coli PhoA, OmMpA, OmpT, LamB e OmpF. As É proteinas podem ser alvejadas ao sobrenadante dependendo dos caminhos secretores naturais ou pela indução do vazamento limitado da membrana externa para causar a secreção da proteina exemplos dos quais são o uso do líder pelB, da proteína líder A, a coexpressão da proteina libera bacteriocina, a proteína libera bacteriocina induzida por mitomicina junto com a adição de glicina ao meio de cultura e a coexpressão do gene kil para a permeabilização da membrana. Mais preferivelmente, nos métodos da invenção, a proteina recombinante é expressada no periplasma da E. Coli hospedeira.

A expressão da proteina recombinante nas células hospedeiras de E. coli também pode estar sob o controle de um sistema indutível, por meio do qual a expressão da proteína recombinante na E. coli está sob o controle de um promotor indutível. Muitos promotores indutíveis adequados para o uso na E. coli são bem conhecidos na técnica e dependendo do promotor, a expressão da proteina recombinante pode ser induzida pela variação de fatores tais como temperatura ou a concentração de uma substância particular no meio de - crescimento (Baneyx, Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10: 411-421; Goldstein e Doi, 1995, Biotechnol. Annu. Rev, 105-128). Os exemplos de promotores indutíveis incluem os . promotores da E.coli lac, tac, e tre que são indutíveis com a lactose ou os análogos da lactose não hidrolisáveis, isopropil-B-D-1-tiogalactopiranosídio (IPTG) e os promotores phoA, trp e araBAD que são induzidos pelo fosfato, triptofano e L-arabinose respectivamente. À expressão pode ser induzida, por exemplo, pela adição de um indutor ou uma mudança na temperatura onde a indução é dependente da temperatura. Onde a indução da expressão da proteina recombinante é obtida pela adição de um indutor à cultura, o indutor pode ser adicionado por qualquer método adequado dependendo do sistema de fermentação e do indutor, por exemplo, pelas adições de lance único ou múltiplo ou por uma adição gradual de indutor através de uma alimentação. Será avaliado que pode haver uma demora entre a adição do indutor e a indução real da expressão da proteína por exemplo onde o indutor é lactose pode haver uma demora antes que a indução da expressão da proteína ocorra — enquanto que qualquer fonte de carbono pré-existente é utilizada antes da lactose.

Culturas (fermentações) de célula hospedeira da E. coli podem ser cultivadas em qualquer meio que sustentará o crescimento da E. coli e a expressão da proteína recombinante. O meio pode ser qualquer meio quimicamente definido, tal como aquele fornecido em Pirt S. J. (1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publications, com modificações onde apropriadas para controlar a taxa de crescimento como aqui descrita. Um exemplo de um meio adequado é 'SM6E' como descrito por Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26: 309-320.

O cultivo das células hospedeiras de E. coli pode ocorrer em qualquer recipiente - adequado tal como um frasco agitado ou um fermentador dependendo da escala de produção requerida. Vários fermentadores em escala grande são disponíveis com uma , capacidade de mais do que 1.000 litros até cerca de 100.000 litros. Preferivelmente, fermentadores de 1.000 a 50.000 litros são usados, mais preferivelmente de 1.000 a 10.000 ou 12.000 litros. Fermentadores em escala pequena também podem ser usados com uma capacidade entre 0,5 e 1.000 litros.

A fermentação da E. coli pode ser realizada em qualquer sistema adequado, por exemplo modo contínuo, de lote ou lote alimentado (Thiry & Cingolani, 2002, Trends in Biotechnology, 20: 103-105) dependendo da proteina e dos rendimentos requeridos. O modo de lote pode ser usado com adições de lances de nutrientes ou indutores onde requerido, Alternativamente, uma cultura de lote alimentado pode ser usada e as culturas cultivadas na pré-indução pelo modo de lote na taxa de crescimento específico máximo que pode ser sustentado usando os nutrientes inicialmente presentes no fermentador e um ou maisregimes de alimentação de nutriente usados para controlar a taxa de crescimento até que a fermentação esteja completa. O modo de lote alimentado também pode ser usado na . pré-indução para controlar o metabolismo das células hospedeiras de E. coli e possibilitar que densidades de célula mais altas sejam atingidas (Lee, 1996, Tibtech, 14: 98-105). . Se desejado, as células hospedeiras podem ser submetidas à coleta a partir do meiode fermentação, por exemplo, as células hospedeiras podem ser coletadas da amostra pela centrifugação, filtração ou pela concentração. Em particular, os métodos da invenção são adequados para a fabricação industrial em larga escala de anticorpos de qualidade terapêutica.

Em uma forma de realização o método de acordo com a presente invenção compreende uma etapa de centrifugação depois da etapa de cultivo, seguido pela suspensão das células pela adição do tampão de extração.

A seguir da etapa de cultivo, o método pode compreender uma etapa de extração para liberar a proteina recombinante da célula hospedeira. A extração pode ser realizada por qualquer método adequado tal como lise de célula pelo tratamento mecânico ou com pressão, tratamento de congelamento-descongelamento, choque osmótico, agentes de extração ou tratamento térmico. Tais métodos de extração são bem conhecidos na técnica.

Em uma forma de realização preferida um tampão de extração é adicionado à amostra e a amostra é depois submetida a uma etapa de tratamento térmico. A etapa de tratamento térmico é preferivelmente como descrita em detalhes na US 5.665.866 (os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência). A etapa de tratamento térmico torna possível obter uma amostra de anticorpo solúvel, corretamente dobrado e montado pela facilitação da remoção de outro material relacionado com anticorpo. O anticorpo que é

"corretamente dobrado e montado" é mostrado pela presença de uma única faixa que . corresponde ao peso molecular esperado para as cadeias pesada e leve montadas no SDS PAGE não redutor. O outro material relacionado com o anticorpo tipicamente será livre das - cadeias pesadas e leves ou parte destas, fragmentos parcialmente degradados de anticorpo corretamente dobrado e montado.

A etapa de tratamento térmico é realizada submetendo-se a amostra a uma temperatura elevada desejada. Mais preferivelmente, a etapa de tratamento térmico é realizada dentro da faixa de 30º C a 70º C. A temperatura pode ser selecionada como desejado e pode depender da estabilidade da proteína para purificação. Em uma outra forma de realização, a temperatura está dentro da faixa de 40º C a 65º C, ou preferivelmente dentro da faixa de 40º C a 60º C, mais preferivelmente dentro da faixa de 45º C a 60º C, ainda mais preferiveimente dentro da faixa de 50º C a 60º C e mais preferivelmente de 55º C a 60º C, de 58º C a 60º C ou 59º C. Assim, as temperaturas mínimas são de 30º C, 35º C ou 40º C e as temperaturas máximas de 60º C, 65º C ou 70º

C A etapa de tratamento térmico é preferivelmente realizada por um período s prolongado de tempo. A duração do tratamento térmico é preferivelmente entre 1 e 24 horas, mais preferivelmente entre 4 e 18 horas, ainda mais preferivelmente entre 6 e 16 - horas e o mais preferivelmente entre 10 e 14 horas ou entre 10 e 12 horas, por exemplo 12 horas.

Assim, o tempo mínimo para o tratamento térmico é de 1, 2 ou 3 horas e o máximo é de 20, 22 ou 24 horas.

Em uma forma de realização particular, o tratamento térmico é realizado de 50º C a 60º C por 10 a 16 horas, e mais preferivelmente a 59º C por 10 a 12 horas. Uma pessoa —habilitadana técnica entenderá que as temperaturas e tempo podem ser selecionados como for conveniente para a amostra em questão e as características da proteína que é produzida.

A seguir da etapa de extração, a amostra pode ser submetida a uma etapa de centrifugação e/ou filtração antes da etapa de ajustar o pH.

A amostra que é submetida à etapa a) da presente invenção é uma amostra de célula hospedeira ou extrato desta. Consequentemente, a etapa a), por exemplo pode ser realizada em: * uma solução que compreende a população de células hospedeiras que expressam a proteina recombinante e a dissulfeto isomerase recombinante; * o sobrenadante da população de células hospedeiras que expressam a proteina recombinante e a dissulfeto isomerase recombinante a seguir da centrifugação e/ou filtração para remover as células hospedeiras;

* o extrato da população de células hospedeiras que expressam a proteína . recombinante e a dissulfeto isomerase recombinante a seguir de uma etapa de extração, tal como tratamento térmico; ou . * o extrato da população de células hospedeiras que expressam a proteína recombinante e a dissulfeto isomerase recombinante a seguir de uma etapa de extração, tal como tratamento térmico, e uma ou mais etapas subsequentes de centrifugação e/ou filtração.

Antes da etapa a), a solução da célula hospedeira ou extrato desta está em um pH adequado, tipicamente o pH da solução da célula hospedeira ou extrato desta é pH 5a 10, preferiveimente pH 6 a 8 ou aproximadamente pH 7. O pH da solução de célula hospedeira ou extrato desta antes da etapa a) pode depender do pl da proteina recombinante de interesse.

As proteínas podem ter uma tendência para precipitar se o pH é ajustado a ou através do pl da proteína.

Portanto, é preferível que o pH da solução antes da etapa de ajuste do pH seja mais baixa do que o pl da proteina recombinante para garantir que a etapa de ajuste do pH não leve o pH da solução para ou através do pl da proteína recombinante.

Por exemplo, se o pl da proteína recombinante está em torno de 8, o pH da - solução é preferivelmente menor do que o pH 8 de modo a minimizar a precipitação da proteina recombinante.

A etapa de diminuir o pH a menos do que o pH 5 também . preferivelmente evitará o pl da proteina recombinante.

O pl de uma proteina dependerá da concentração iônica da solução dentro da qual a mesma está inserida.

Consequentemente, o pl calculado de uma proteina em água ou tampão de concentração iônica muito baixa pode ser diferente do pl de uma proteina em uma amostra da célula hospedeira ou extrato desta que compreende tampão e HCPs.

O pl de uma proteína pode ser 1, 1,5 ou 2 unidades de pH mais baixa do que o pl medido da —proteinaem água ou tampão de concentração iônica muito baixa.

Portanto, o pH da solução de célula hospedeira ou extrato desta é preferivelmente mantido em um pH de 1, 1,5 ou 2 unidades de pH abaixo do pl da proteina recombinante de interesse medido em água ou tampão de concentração iônica muito baixa.

Na etapa b) do método de acordo com a presente invenção, a dissulfeto isomerase recombinante precipitada é separada da proteina recombinante para produzir uma amostra de proteína recombinante.

A Etapa b) tipicamente compreende a centrifugação e/ou filtração de modo a separar a dissulfeto isomerase recombinante precipitada.

A amostra de proteina recombinante resultante tem uma quantidade reduzida de dissulfeto isomerase recombinante comparada com a quantidade de dissulfeto isomerase recombinante antes da etapa a). Preferivelimente a amostra de proteina recombinante depois da etapa b) é substancialmente isenta da dissulfeto isomerase recombinante.

Entretanto, é possível que alguma dissulfeto isomerase recombinante permaneça na amostra, que pode ser removida pelas etapas de purificação subsequentes. A pessoa . habilitada pode determinar se a dissulfeto isomerase recombinante está ainda presente na amostra de proteina recombinante usando métodos bem conhecidos na técnica. Por . exemplo, uma análise de ELISA pode ser usada para detectar a dissulfeto isomerase recombinante, tal como DsbC. Um anticorpo específico para a dissulfeto isomerase recombinante, tal como DsbC, pode ser usado ou se a dissulfeto isomerase recombinante é rotulada com his, tal como DsbC-rótulo his, um anticorpo anti-rótulo his pode ser usado para a detecção da dissulfeto isomerase recombinante. Substancialmente isento de como aqui utilizado é intencionado a se referir a conter 5% p/poumenos, tal como 4,3, 2,1 ou0,5% p/p ou menos.

Em uma forma de realização, onde o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta é ajustado a um pH de 3 ou menos (tal como pH 3), a proteína que liga dipeptídeo da proteina da célula hospedeira (também aludida como “DBP”) é precipitada e separada da proteina recombinante na etapa b). Nesta forma de realização a amostra de proteína recombinante resultante também tem quantidade reduzida de proteína de ligação de dipeptídeo da célula hospedeira (DBP). ” Preferivelmente a amostra de proteina recombinante resultante é substancialmente isenta de DBP. ' Preferivelimente a amostra de proteina recombinante resultante também tem quantidade reduzida de outras proteínas da célula hospedeira que também podem precipitar durante a etapa a). Preferiveimente a amostra de proteina recombinante resultante é substancialmente isenta de outras proteínas da célula hospedeira.

Para produzir a proteina recombinante de interesse as etapas a) e b) que seguem da presente invenção são tipicamente de 75 % ou mais, 80 % ou mais, 85 % ou mais ou 90 %oumais.

Depois da etapa b), o pH da amostra de proteina recombinante pode ser ajustado a um pH adequado para armazenar a proteína recombinante ou para realizar uma etapa de purificação a jusante, tal como cromatografia, Como debatido anteriormente, o pH da solução pode ser ajustado para minimizar a precipitação da proteína recombinante de interesse garantido que o pH não está no pl da proteína recombinante, Preferivelmente o pH da amostra de proteína recombinante é ajustado a um pH de 5 a 7, mais preferivelmente um pH de 5 a 6. O pH exato requerido dependerá das propriedades da proteína recombinante, que incluem o pl da proteína, e que as etapas de purificação a jusante devem ser realizadas. Qualquer agente adequado pode ser usado para ajustar o pH da amostra de proteina recombinante, tal como uma base selecionada de NaOH, Acetato de Na ou Base tris.

Alternativamente, o método não compreende uma etapa de ajuste de pH depois da etapa b). Nesta forma de realização, o pH da amostra de proteina recombinante pode ser . adequado para a armazenagem da proteina recombinante e/ou para uma ou mais etapas de purificação a jusante subsequentes. Em uma forma de realização, na etapa a) o pH da - amostra de célula hospedeira ou extrato desta é ajustado a um pH de 4,5, a etapa b) compreende a centrifugação e filtração e a solução de proteina recombinante resultante depois da etapa b) é então submetida a uma etapa de cromatografia de troca de cátion no pH 4,5.

Alternativamente uma etapa de cromatografia pode ser realizada em pH mais alto, por exemplo pH ou acima, tal como de 5 a 8, em particular 6 ou 7.

, A seguirdaetapab), a amostra de proteína recombinante pode ser submetida a uma ou mais etapas de purificação adicionais de modo a remover contaminantes e/ou fragmentos de proteína indesejados tais como fragmentos de anticorpo. Tipicamente a amostra de proteina recombinante é submetida a uma ou mais etapas de cromatografia, em que cada etapa de cromatografia pode ser seguida por uma etapa de filtração, tal como microfiltração, diafiltração ou ultrafiltração. A uma ou mais etapas de cromatografia podem ser etapas de cromatografia de afinidade ou não afinidade. Em uma forma de realização a - cromatografia é uma etapa de cromatografia de não afinidade tal como cromatografia de troca de (on cátion ou ânion. - Em uma forma de realização, na etapa a) o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta é ajustado a um pH de 4,5, a etapa b) compreende centrifugação e filtração e a solução de proteína recombinante resultante depois da etapa b) é então submetida a uma etapa de cromatografia de troca de cátion no pH 4,5.

O método da presente invenção é particularmente vantajoso quando etapas de cromatografia de não afinidade são usadas na purificação a jusante. Isto é porque uma grande quantidade de proteínas da célula hospedeira, que incluem a dissulfeto isomerase recombinante, pode ligar-se às colunas de cromatografia se as mesmas não forem previamente separadas. Consequentemente, a capacidade da coluna de cromatografia para ligar a proteina recombinante desejada é reduzida. A separação de proteínas da célula hospedeira, que incluem a dissulfeto isomerase recombinante aumenta a capacidade das colunas de cromatografia de não afinidade subsequentes que fornecem um meio mais rápido e mais barato para a purificação da proteína recombinante.

Durante a etapa a) da presente invenção, a proteina recombinante pode ser parcialmente desdobrada embora a solução seja mantida no pH de 5 ou menos. Entretanto, a desdobra parcial da proteina é reversível e a seguir da separação da dissuifeto isomerase precipitada, o pH da solução de proteína pode ser ajustado a um pH acima de 5, preferivelmente um pH de 5 a 7, ou pH de 5 a 6, e a proteina pode depois adota a sua conformação dobrada original. Assim no todo a etapa de manter o pH baixo fornece condições relativamente suaves para a remoção das impurezas, com consequências de . longa duração mínimas.

A amostra de proteína recombinante fornecida pelo método da presente invenção compreende uma proporção significante de proteina funcional. . A proteína recombinante de interesse expressada pelas células hospedeiras, preferivelmente tem um pl de 6 ou mais alto, mais preferivelmente pl de 7 ou mais alto, Como debatido previamente, se a proteina tem um pl de 6 ou mais alto é mais fácil minimizar a precipitação da proteina mantendo o pH da amostra abaixo do pl da proteína, preferivelmente 1, 1,5 ou 2 unidades de pH abaixo do pl da proteina em água ou tampão de concentração iônica muito baixa, e a etapa de ajustar o pH da amostra para o pH 5 ou menos não ajusta o pH da solução até o pl da proteína.

A proteina recombinante de interesse é preferivelmente um anticorpo recombinante.

O anticorpo recombinante preferivelmente tem um pl de 8 a 10,7 a 10,6a9,7a9,8a9,6, 7,8 ou 9. O pH da amostra é preferivelmente mantido abaixo do pl do anticorpo recombinante, mais preferivelmente 1, 1,5 ou 2 unidades de pH abaixo do pl do anticorpo recombinante, antes, durante e depois da etapa a) de modo a garantir precipitação mínima do anticorpo. ” Em uma forma de realização preferida, o anticorpo recombinante tem um pl de 7 a 9 e o pH da amostra é ajustado ao pH 3 a 4,5, mais preferivelmente pH 4,5, na etapa a). . Um exemplo específico de um anticorpo recombinante é um Fab' anti-TNF CDP870, como aqui descrito e na WO01/094585, que tem um pl de 8. Em uma forma de realização o anticorpo recombinante ou fragmento de ligação deste é Fab' anti-TNF CDP870. Como aqui usado, 'anticorpo funcional inclui moléculas de anticorpo que retêm a capacidade para reconhecer especificamente ou ligar ao antígeno contra o qual elas foram incitadas (antígeno cognato) isto é, o antígeno para o qual as mesmas são específicas.

À produção de um anticorpo funcional é mostrado pela presença de uma única faixa no SDS- PAGE não redutor que corresponde ao peso molecular esperado do anticorpo, ou pelo ensaio de ligação direta usando BlAcore ou outros métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica, por exemplo mas não limitado ao ELISA.

Os anticorpos não funcionais incluem fragmentos que não reconhecem seu antígeno cognato, e incluem anticorpos incorretamente dobrados ou incorretamente montados, isentos de cadeias pesadas e leves, e seus fragmentos, que incluem fragmentos parcialmente degradados de anticorpos que não reconhecem ou se ligam ao seu antígeno cognato.

Um fragmento de ligação de um anticorpo é um fragmento que é capaz de ligar o antígeno para oqualo anticorpo é específico.

Em um exemplo preferido, a molécula de anticorpo recombinante é pelo menos parte de uma cadeia leve de anticorpo e pelo menos parte de uma cadeia pesada de anticorpo, tal que pelo menos algumas das moléculas de anticorpo de cadeia leve e pesada - expressadas são capazes de combinar para formar anticorpo funcional. Como aqui usado, “anticorpos' incluem anticorpos tendo cadeias pesadas e leves - de tamanho natural; fragmentos funcionalmente ativos, fragmentos de ligação, derivados ou análogos destese podem ser, mas não são limitados a VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, um Fab de dobradiça alterado, Fab', F(ab')2 ou fragmento Fv; um monômero ou dímero de cadeia leve ou cadeia pesada; um anticorpo de cadeia única, por exemplo, um Fv de cadeia única em que os domínios variáveis das cadeias pesada e leve são unidos por um ligador peptídico, Fab-Fv, ou um anticorpo de especificidade dual, tal como um Fab-dAb, como descritonaPCT/GB2008/003331.

Os anticorpos podem ser anticorpos policionais, monoclonais, bi-, tri- ou tetra- valentes, anticorpos humanizados ou quiméricos. Estes anticorpos e seus fragmentos podem ser anticorpos de ocorrência natural, humanizados, quiméricos ou enxertados na CDR e técnicas da biologia molecular padrão podem ser usadas para modificar, adicionar ou deletar aminoácidos ou domínios como desejado. Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas tendo uma ou mais regiões . determinadoras de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e uma região de matriz de uma molécula de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, a US 5.585.089). As . moléculas de anticorpo purificadas que usam os métodos da invenção podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

Os métodos para criar estas moléculas de anticorpo são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo, Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341: 544; Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322: 323; Bird et al, 1988, Science, 242: 423; Quen et al, US 5.585.089; Adair, WO91/09967; Mountain e Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10: 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216: 165-181).

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica tal como a técnica do hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), a técnica do trioma, a técnica do hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72) e a técnica do EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

Os anticorpos quiméricos são aqueles anticorpos codificados pelos genes da imunoglobulina que foram geneticamente engendrados de modo que os genes das cadeias —levee pesada sejam compostos de segmentos de gene da imunoglobulina que pertencem a espécies diferentes. Estes anticorpos quiméricos são prováveis de serem menos antigênicos. Os anticorpos bivalentes podem ser fabricados pelos métodos conhecidos na técnica (Milstein et al., 1983, Nature 305: 537-539; WO 93/08829, Traunecker et al., 1991, . EMBO J. 10: 3655-3659). Os anticorpos bi-, tri- e tetra-valentes podem compreender especificidades múltiplas ou podem ser monoespecíficos (ver por exemplo a WO 92/22853). - As sequências de anticorpo também podem ser geradas usando métodos de anticorpos linfocíticos únicos com base na clonagem molecular e expressão de cDNAs da região variável da imunoglobulina gerados a partir de linfócitos únicos que foram selecionados para a produção de anticorpos específicos tais como descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843-7848 e em WO 92/02551. Os últimos métodos dependem da isolação de células que produzem anticorpo individuais que são depois clonalmente expandidas seguido pela triagem quanto aqueles clones que são produzidos em um anticorpo que reconhece seu antígeno cognato, e, se desejado, a identificação subsequente da sequência dos seus genes de cadeia pesada (VH) e leve (V1) variáveis. Alternativamente, as células que produzem anticorpo que reconhece o seu antígeno cognato podem ser cultivadas juntas seguido pela triagem. O anticorpo pode ser específico para qualquer antígeno alvo. O antígeno pode ser uma proteina associada com célula, por exemplo uma proteína de supefície celular nas - células tais como células bacterianas, células de levedura, células T, células endoteliais ou células de tumor, ou pode ser uma proteína solúvel. Antígenos de interesse também podem . ser qualquer proteína medicamente relevante tal como aquelas proteínas supra reguladas durante doença ou infecção, por exemplo receptores e/ou seus ligandos correspondentes. Os exemplos particulares de proteinas de superfície celular incluem moléculas de adesão, por exemplo integrinas tais como integrinas B1 por exemplo, VLA-4, E-selectina, P selectina ou L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD 11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDWS52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, —BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 ou CSF1-Receptor, DPCR1, DPCR1, dudulina2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAAO63A4, KIAANGS9, KIAAIZA6, KIAA1I455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, equivalente à nectina 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antígeno carcinoembrionário (CEA), globulina da gordura do leite humano (HMFG1 e 2), antigenos MHC Classe | e MHC Classe Il, KDR e VEGF, PD-1, DC- SIGN,TLI1A,|IL-7 receptor A e onde apropriado, receptores destes.

Os antígenos solúveis incluem interleucinas tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL, IL-5, IL- 6, IL-B, 11-12, I1L-13, IL-14, IL-16 ou 11-17, tal como ILI7A e/ou IL1I7F, antígenos virais por exemplo antígenos do vírus sincicial respiratório ou citomegalovírus, imunoglobulinas, tais como IgE, interferons tais como interferon a, interferon B ou interferon y, fator de necrose de tumor TNF (antigamente conhecido como fator a de necrose de tumor e aqui aludido como TNF ou TNFa), fator À de necrose de tumor, fatores estimuladores de colônia tais como G- CSF ou GM-CSF, e fatores de crescimento derivados de plaqueta tais como PDGF-g, e

PDGF-B, WISP-1 e onde apropriado seus receptores. Outros antígenos incluem antígenos ' de superfície de célula bacteriana, toxinas bacterianas, vírus tais como influenza, EBV, HepA, B e C, agentes de bioterrorismo, radionuclídeos e metais pesados, e venenos e . toxinas de cobra e aranha.

Em uma forma de realização, o anticorpo pode ser usado para funcionalmente alterar a atividade do antígeno de interesse. Por exemplo, o anticorpo pode neutralizar, antagonizar ou agonizar a atividade do dito antígeno, direta ou indiretamente.

Em uma forma de realização preferida o anticorpo é um anticorpo anti-TNF, mais preferivelmente um Fab' anti-TNF CDP870, como descrito na WO01/094585 (os conteúdos dosquaissão aqui incorporados por referência).

Em uma forma de realização o anticorpo tendo especificidade para o TNFa humano, compreende uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende uma CDR tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 para a CDRH1, a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2 para a CDRH2 ou a sequência mostrada na SEQ ID NO: 3 para a CDRH3.

Em uma forma de realização o anticorpo compreende uma cadeia leve em que o domínio variável compreende uma CDR tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 para - a CDRL1, a sequência mostrada na SEQ ID NO: 5 para a CDRL2 ou a sequência mostrada na SEQ ID NO: 6 para a CDRL3. . Em uma forma de realização o anticorpo compreende uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende uma CDR tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 para a CDRH1, a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2 para a CDRH2 ou a sequência mostrada na SEQ ID NO: 3 para a CDRH3 e uma cadeia leve em que o domínio variável compreende uma CDR tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 para a CDRL1, a sequência mostrada na SEQ ID NO: 5 para a CDRL2 ou a sequência mostrada na SEQ ID NO: 6 para aCDRL3.

Em uma forma de realização o anticorpo compreende à SEQ ID NO: 1 para a CDRH1, SEQ ID NO: 2 para a CDRH2, SEQ ID NO: 3 para a CDRH3, SEQ ID NO: 4 para a CDRL1, SEQ ID NO: 5 para a CDRL2 e SEQ ID NO: 6 para a CDRL3.

O anticorpo é preferivelmente uma molécula de anticorpo enxertada na CDR e tipicamente o domínio variável compreende regiões de matriz aceitadora humana e CDRs doadoras não humanas.

Preferivelmente, o anticorpo compreende o domínio variável de cadeia leve CDP870 (SEQ ID NO: 7) e o domínio variável de cadeia pesada CDP870 (SEQ ID NO: 8).

É preferido que o anticorpo seja um fragmento de Fab modificado em que a — modificaçãoéa adição à extremidade do terminal C da sua cadeia pesada de um ou mais aminoácidos para possibiltar a ligação de uma molécula efetora ou repórter. Preferivelmente, os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça modificada contendo um ou dois resíduos de cisteína aos quais as moléculas efetora ou repórter podem - ser ligadas. Um tal fragmento de Fab modificado preferivelmente tem uma cadeia pesada que compreende ou que consiste da sequência dada como SEQ ID NO: 10 e a cadeia leve - que compreende ou que consiste da sequência dada como SEQ ID NO: 9. A célula hospedeira usada na presente invenção compreende a sequência de DNA que codifica o anticorpo. Preferivelmente, a sequência de DNA codifica a cadeia pesada e a leve do anticorpo.

Em uma forma de realização preferida, a sequência de DNA codifica uma cadeia leve e compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9 (CDP870) ou umequivalente degenerado destas.

Em uma forma de realização alternativamente preferida, a sequência de DNA codifica uma cadeia pesada e compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 8 ou SEQ 1D NO: 10 (CDP870) ou um equivalente degenerado destas.

A sequência de DNA da pode compreender DNA sintético, por exemplo produzido —peloprocessamento químico, CDNA, DNA genômico ou qualquer combinação destes. Os domínios de região constante do anticorpo, se presentes, podem ser - selecionados considerando-se a função proposta da molécula de anticorpo, e em particular as funções efetoras que podem ser requeridas. Por exemplo, os domínios da região 7 constante podem ser domínios de IgA, I1gD, IgE, IgG ou IgM humanos. Em particular, os domínios da região constante de IgG humanos podem ser usados, especialmente dos isótipos IgG1 e IgG3 quando a molécula de anticorpo é intencionada para os usos terapêuticos e as funções efetoras de anticorpo são requeridas. Alternativamente, os isótipos IgG2 e IgG4 podem ser usados quando a molécula de anticorpo é intencionada para propósitos terapêuticos e as funções efetoras de anticorpo não são requeridas, por exemplo, —parasimplesmente bloquear a atividade de TNFa.

Os métodos para a expressão das proteinas recombinantes são bem conhecidas na técnica. Os exemplos adequados de células hospedeiras para a expressão de moléculas de anticorpo recombinante incluem bactérias tais como bactérias gram positivas ou gram negativas, por exemplo, E. coli, ou células de levedura, por exemplo, S. cerevisiae, ou células de mamífero, por exemplo, células CHO e linhagens de células de mieloma ou hibridoma, por exemplo, células NSO. Mais preferiveimente, nos métodos da invenção, um anticorpo recombinante é produzido em bactérias, por exemplo, E. coli (ver Verma et al., 1988, J. Immunol. Methods 216: 1651 81; Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods 263: 133-147).

Depois da expressão, o anticorpo pode ser processado ainda, por exemplo pela conjugação a uma outra entidade tal como uma molécula efetora. Consequentemente, o método de acordo com a presente invenção pode compreender uma etapa adiciona! de ligar uma molécula efetora ao anticorpo.

O termo molécula efetora como aqui usado inclui, por exemplo, agentes ' antineoplásticos, medicamentos, toxinas (tais como toxinas enzimaticamente ativas de . origem bacteriana ou vegetal e seus fragmentos por exemplo, ricina e seus fragmentos), proteínas biologicamente ativas, por exemplo enzimas, outro anticorpo ou fragmentos de anticorpo, polímeros de sintéticos ou de ocorrência natural, ácidos nucléicos e seus fragmentos por exemplo, DNA, RNA e seus fragmentos, radionuclideos, particularmente radioiodetos, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórteres tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados pela espectroscopia de RMN ou ESR.

A molécula efetora pode ser ligada ao anticorpo ou fragmento deste por qualquer método adequado, por exemplo um fragmento de anticorpo pode ser modificado para ligar a pelo menos uma molécula efetora como descrito na WOO5/003171 ou WOO05/003170 (os conteúdos das quais são aqui incorporados por referência). À WOO5/003171 ou WO05/003170 também descrevem moléculas efetoras adequadas.

O anticorpo pode ter um macrociclo, para quelar um átomo de metal pesado, ou uma toxina, tal como ricina, ligado ao mesmo por uma estrutura de ligação em ponte . covalente.

Alternativamente, procedimentos da tecnologia de DNA recombinante podem ser usados para produzir uma molécula de anticorpo em que o fragmento Fc (CH2, CH3 e . domínios de dobradiça), os domínios CH2 e CH3 ou o domínio CH3 de uma molécula de —imunoglobulina completa foram (foi) substituídos por, ou ligados aí pela ligação de peptídeo, uma proteina que não imunoglobulina funcional, tal como uma enzima ou molécula de toxina.

Na forma de realização em que o anticorpo é um fragmento de Fab modificado tendo na extremidade de terminal C da sua cadeia pesada um ou mais aminoácidos para possibilitar a ligação de uma molécula efetora ou repórter, os aminoácidos adicionais preferivelmente formam uma região de dobradiça modificada contendo um ou dois resíduos de cisteína aos quais a molécula efetora ou repórter pode ser ligada.

Um grupo efetor preferido é uma molécula polimérica, que pode ser ligada ao fragmento de Fab modificado para aumentar a sua meia-vida in vivo.

A molécula polimérica, no geral, pode ser um polímero sintético ou um de ocorrência natural, por exemplo um polímero de polialquileno de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído, polialquenileno ou polioxialquileno ou um polissacarídeo ramiíficado ou não ramíificado, por exemplo, um homo- ou hetero- polissacarídeo.

Os substituintes opcionais particulares que podem estar presentes nos polímeros sintéticos mencionados acima incluem um ou mais grupos hidróxi, metila ou metóxi.

Os exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem poli(etileno glicol) de cadeia reta ou ramiíficada, poli(propileno glicol), politálcoo! vinílico) opcionalmente substituídos ou derivados destes, especialmente polietileno glicol) opcionalmente substituido tal como metoxipoli(etileno glicol) ou derivados destes. Os polimeros de ocorrência natural . particulares incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados destes, "Derivados" como aqui usado é intencionado a incluir derivados reativos, por exemplo grupos reativos - seletivo em tiol tais como maleimidas e os semelhantes. O grupo reativo pode ser ligado diretamente ou através de um segmento ligador ao polímero. será avaliado que o resíduo de um tal grupo em alguns casos formará parte do produto como o grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero.

O tamanho do polímero pode ser variado como desejado, mas no geral estará em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50.000 Da, preferivelmente de 5000 a

40.000 Da e mais preferivelmente de 25.000 a 40.000 Da. O tamanho do polímero em particular pode ser selecionado com base no uso pretendido do produto. Assim, por exemplo, onde o produto é intencionado a deixar a circulação e penetrar no tecido, por — exemplo para o uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular pequeno, por exemplo com um peso molecular em torno de 5,000 Da. Para aplicações onde o produto permanece na circulação, pode ser vantajoso usar um polimero de peso molecular mais alto, por exemplo tendo um peso molecular na faixa de 25.000 Da a - 40.000 Da, Os polímeros particularmente preferidos incluem um polímero de polialquileno, tal ' como um poli(etileno glicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etileno glicol) ou um derivado destes, e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 25.000 Da a cerca de

40.000 Da.

Cada molécula polimérica ligada ao fragmento de anticorpo modificado pode ser covalentemente ligado ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente será no geral uma ligação de dissuífeto ou, em particular, uma ligaçãode enxofre-carbono.

Onde desejado, o fragmento de anticorpo pode ter uma ou mais moléculas efetoras ou repórter ligadas a ele. As moléculas efetoras ou repórter podem ser ligadas ao fragmento de anticorpo através de qualquer cadeia lateral de aminoácido ou grupo funcional de aminoácido terminal disponíveis localizados no fragmento, por exemplo qualquer grupo amino, imino, hidroxila ou carboxila livre. Uma ou mais moléculas efetoras ou repórter podem ser ligadas a um aminoácido no ou na direção da extremidade do terminal C da cadeia pesada e/ou da cadeia leve do anticorpo.

Um polimero ativado pode ser usado como o material de partida na preparação de fragmentos de anticorpo modificados com polímero como descrito acima. O polímero ativado pode ser qualquer polímero contendo um grupo reativo de tiol tal como um ácido ou éster a- halocarboxílico, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, uma vinil sulfona ou um dissulfeto. Tais materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo da Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ou podem ser preparados a . partir de materiais de partida comercialmente disponíveis usando procedimentos químicos convencionais. é Com respeito à ligação de porções de poli(etileno glico!) (PEG), referência é feita à “Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nova lorque, “Poly(ethyleneglicol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris e S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, Nova lorque.

Onde é desejado obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora ou repórter, este pode ser preparado pelos procedimentos de DNA químicos ou recombinantes em que o fragmento de anticorpo é ligado diretamente ou por intermédio de = um agente de ligação à molécula efetora ou repórter antes ou depois da reação com o polímero ativado como apropriado. Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, aqueles descritos na WO 93/62331, WO 92/22583, WO 90.195 e WO 89/1476. Alternativamente, onde a molécula efetora ou repórter é uma proteína ou polipeptídeo a - ligação pode ser obtida usando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo como descrito na WO 86/01533 e EP-A0392745. . Preferivelmente, o fragmento de Fab modificado fornecido pelo método da presente invençãoé PEGuilado (isto é, tem PEG (poli(etileno glicol)) covalentemente ligado a ele) de acordo com o método divulgado na EP-A-0948544. Preferivelmente o anticorpo é um fragmento de Fab PEGuilado modificado como mostrado na Figura 9. Como mostrado na Figura 2, o fragmento de Fab modificado tem ligado a um dos resíduos de cisteina na extremidade de terminal C da região de dobradiça modificada da cadeia pesada um grupo derivado de lisikmaleimida em que cada um dos dois grupos amidas do resíduo de lisina tem covalentemente ligado a ele um resíduo de metoxipoli(etileno glicol) tendo um peso molecular de cerca de 20.000 Da, tal que o peso molecular médio total dos resíduos de metoxipoli(etileno glicol) é de cerca de 40.000 Da, mais preferivelmente o grupo derivado de lisitmaleimida é [1-[1[2-[13-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)-1-oxopropiljamino]-etiljamino]-carbonil]- 1,5-pentanodiil|bis(iminocarbonila). Um resíduo de lisina é covalentemente ligado ao grupo maleimida. A cada um dos grupos amina no resíduo de lisina é ligado um polímero de metoxipoli(etileno glicol) tendo um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. O peso molecular total da molécula efetora inteira é portanto de aproximadamente 40.000 Da.

Consequentemente, o método de acordo com a presente invenção preferivelmente compreende ligar a um dos resíduos de cisteina na extremidade do terminal O da cadeia pesada um grupo lisi-maleimida em que cada grupo amida do resíduo de lisila tem covalentemente ligado a ele um resíduo de metoxipolifetileno glicol) tendo um peso molecular de cerca de 20.000 Da. - Preferivelmente, no composto mostrado na Figura 9, a parte da cadeia pesada do anticorpo tem a sequência dada como a SEQ ID NO: 10 e a cadeia leve tem a sequência - dada na SEQ ID NO: 9. Este composto é aqui aludido como CDP870.

As características preferidas de cada forma de realização da invenção são como para cada uma das outras formas de realização mutatis mutandis. Todas as publicações, que incluem mas não são limitadas às patentes e pedidos de patente citados neste relatório descritivo são aqui incorporadas por referência como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada ser aqui incorporada por referência como se apresentada na íntegra, A presente divulgação explicitamente divulga forma de realização que compreende certas combinações de números inteiros. A presente divulgação também se estende às formas de realização que consistem ou que consistem essencialmente das ditas combinações de números inteiros.

Preferências e/ou formas de realização podem ser combinadas como tecnicamente praticável. - A invenção será agora descrita com referência aos exemplos que seguem, que são meramente ilustrativos e de nenhuma maneira não devem ser interpretados como limitando 7 o escopo da presente invenção. Exemplos Exemplo |: Geração de Linhagem de Célula Hospedeira Que Expressa DsbC Recombinante e Anticorpo Recombinante Para todos os experimentos a linhagem de célula W3110 da E. coli foi usada como a linhagem de célula do tipo selvagem precursora. As linhagens de célula foram criadas —carregandoas mutações que seguem: a. um gene Tsp mutado; b. um gene Tsp mutado e que carrega DsbC recombinante; c. um gene Tsp mutado e um gene spr mutado; d. um gene Tsp mutado e um gene spr mutado e que carregam DsbC recombinante.

Geração de Linhagem de célula que carrega gene Tsp mutado MXEOO01 (ATsp) A cepa MXE001 foi gerada como segue: O cassete Tsp foi movido como fragmentos de restrição Sal |, Not | em plasmídeos pKO3 similarmente restritos. O plasmídeo pKO3 usa o mutante sensível à temperatura da origem pSC101 de replicação (RepA) junto com um marcador de cloranfenicol para forçar e selecionar quanto aos eventos de integração cromossômica. O gene sacB que codifica a levansucrase é letal para o cultivo de E. coli em sacarose e consequentemente (junto com o marcador de cloranfenicol e a origem pSC101) é usado para forçar e selecionar a . desintegração e eventos de cura de plasmídeo. Esta metodologia foi descrita anteriormente (Hamilton et al., 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 e Blomfield et al., 1991, - Molecular Microbiology, 5, 1447-1457). O sistema pKO3 remove todos os marcadores —seletivosdogenoma hospedeiro exceto para o gene inserido. Os plasmídeos que seguem foram construídos. PMXE191 que compreende o gene Tsp mutado silenciado como mostrado na SEQ ID NO: 15 que compreende os marcadores de restrição EcoR | e Ase |. O plasmídeo foi depois transformado dentro de células W3110 eletro-competentes daE.colicompetente preparadas usando o método encontrado em Miller, E. M. e Nickoloff, J. A., “Escherichia coli electrotransformation,” em Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J. A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995). Dia 1 401,41 de células da E. coli foram misturadas com (10 pg) 1 Jul de DNA de pKO3 em uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm BioRad gelada antes da eletroporação a 2500V,25 pFe200 QN. 1000 ul de 2xPY foram adicionados imediatamente, as células recuperadas pela agitação a 250 rpm em um incubador a 30º C por 1 hora. As células foram - diluídas 1/10 em série em 2xPY antes que alíquotas de 100 ul foram plaqueadas em placas de 2xPY ágar contendo cloranfenico! a 20 pg/ml pré-aquecida a 30º C e 43º C. As placas ' foram incubadas durante a noite a 30º C e 43º C. Dia 2 O número de colônias cultivadas a 30º C deu uma estimativa da eficiência da eletroporação embora as colônias que sobrevivem ao cultivo a 43º C representam eventos de integração potenciais. As colônias únicas da placa de 43º C foram escolhidas e recolocadas em suspensão em 10 ml! de 2xPY. 1000 destas foram plaqueadas em placas de 2xPY ágar contendo 5 % (p/v) de sacarose pré-aquecida a 30º C para gerar colônias únicas. As placas foram incubadas durante a noite a 30º C. Dia 3 As colônias aqui representam eventos de desintegração e cura de plasmídeo potenciais simultâneos, Se os eventos de desintegração e cura aconteceram no princípio do cultivo, então o grosso da massa da colônia será clonal, As colônias únicas foram escolhidas e plaqueadas em réplica em 2xPY ágar que conteve cloranfenicol a 204 ml ou 5 % (p/v) de sacarose. As placas foram —incubadas durante a noite a 30º C.

Dia 4 As colônias que tanto cresceram em sacarose quanto morreram em cloranfenicol representam eventos de substituição cromossômica e de cura de plasmídeo potenciais. Estas foram escolhidas e triadas pela PCR com um oligonucleotídeo específico de mutação. As colônias que geraram uma faixa de PCR positiva do tamanho correto foram —riscadas para produzir colônias únicas sobre 2xPY ágar contendo 5 % (p/v) de sacarose e as placas foram incubadas durante a noite a 30º C. Dia 5 Colônias únicas de E. coli positivas na PCR, sensíveis ao cloranfenicol e resistentes à sacarose foram usadas para fabricar estoques de glicerol, células . quimicamente competentes e atuam como padrões de PCR para uma reação de PCR com oligos que flanqueia 5' e 3' para gerar produto de PCR para o sequenciamento de DNA . direto usando a Taq polimerase.

A cepa MXE001 da célula foi testada para confirmar a modificação bem sucedida do gene Tsp mutado que carrega o DNA genômico pela amplificação pela PCR da região do gene Tsp que compreende um sítio de restrição Ase | de ocorrência não natural usando iniciadores de oligonucleotídeos. As regiões amplificadas do DNA foram depois analisadas pela eletroforese em gel antes e depois da incubação com enzima de restrição Ase | para confirmar a presença do sítio de restrição de Ase | de ocorrência não natural nos genes mutados. Os lisados foram preparados pelo aquecimento de uma única colônia de células por 10 minutos a 95º C em 20 yl de tampão 1x PCR. A mistura foi deixada esfriar até a temperatura ambiente depois da centrifugação a 13.200 rpm por 10 minutos. O —sobrenadante foi removido e rotulado como "lisado de célula”. Cada cepa foi amplificada usando par de oligos Tsp. - O DNA foi amplificado usando um procedimento de PCR padrão. sul Tampão x10 (Roche) : 1u mistura de dNTP (Roche, mistura de 10 mM) 15u 8' oligo (5 pmol) 15u 3' oligo (5 pmol) 2u Lisado de célula 0,5 pl Tag DNA polimerase (Roche 5 U/ul) 38,5 ul HO Ciclo de PCR. ac 1 minuto 94º C 1 minuto) 55º C 1 minuto) repetido por 30 ciclos 72CO 1 minuto) 72C 10 minutos Uma vez que as reações foram completadas 25 ul foram removidos para um novo tubo de microcentrífuga para a digestão com Ase |. Aos 25 ul de reação de PCR 19 ul de HÃO, 5 ul de tampão 3 (NEB), 1 ul de Ase | (NEB) foram adicionados, misturados e incubados a 37º C por 2 horas.

À reação de PCR remanescente 5 ul de tampão de carga (x6) foram adicionados e 20 ul foram carregados em 200 ml! de um gel de agarose a 0,8 % de TAE (Invitrogen) mais Brometo de etídio (5 ul de estoque de 10 mg/ml) e conduzido a 100 volts por 1 hora. 10 ul de marcador de tamanho (marcador de DNA Perfect 0,1 a 12 Kb, Novagen) foi carregado na . linha final.

Uma vez que as digestões com Ase | foram completadas 10 ul de tampão de carga - (x6) foram adicionados e 20 ul foram carregados em um gel de agarose a 0,8 % de TAE (Invitrogen) mais Brometo de etídio (5 ul do estoque de 10 mg/ml de estoque) e conduzida a 100 volts por 1 hora. 10 ul de marcador de tamanho (marcador de DNA Perfect 0,1 a 12 Kb, Novagen) foram carregados na linha final.

Ambos os géis foram visualizados usando transluminador de UV.

O fragmento genômico amplificado mostrou a faixa de tamanho correto de 2,8 Kb para Tsp.

A seguir da digestão com Ase | isto confirmou a presença dos sítios de Ase | introduzidos na cepa MXE001 deficiente em Tsp mas não no controle W3110. MXEO0O01: DNA genômico amplificado usando o conjunto de iniciador de Tsp e o DNA resultante foi digerido com Ase | para produzir faixas de 2,2 e 0,6 Kbps.

O DNA amplificado pela PCR de W3110 não foi digerido pela enzima de restrição Asel.

Geração de Linhagem de células que carregam gene spr mutado e Linhagem de é células que carregam gene Tsp mutado e gene spr mutado As mutações spr foram geradas e selecionadas usando um ensaio de ' complementação.

O gene spr foi mutado usando o kit de PCR de diversidade de mutagênese aleatória da Clontech& que introduziu de 1 a 2 mutações por 1000 pares de base.

O DNA da PCR spr mutado foi clonado em um vetor de expressão indutível [6TTO CDP870] que expressa CDP870 Fab' junto com o mutante spr.

Esta ligação foi depois eletro-transformada em uma cepa MXE001 da E. coli (ATsp) preparada usando o método encontrado em Miller, EM e Nickoloff, J.

A., “Escherichia coli electrotransformation," em Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.

A, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995). O protocolo que segue foi usado, 40 ul de MXE001 eletro competente, 2,5 ul da ligação (100 pg de DNA) foram adicionados a uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm, a eletro-transformação foi realizada usando um BioRad Genepulser Xcell com as condições que seguem, 2500 V, 25 pFez200o0N Depois da eletro-transformação 1 ml de SOC (Invitrogen) (pré-aquecido a 37º C) foi adicionado e a células deixadas recuperar a 37º C por 1 hora com agitação suave.

As células foram plaqueadas sobre Ágar hipotônico (5 g/L de Extrato de levedura, 2,5 g/L de Triptona, 15 g/L de Ágar (todos da Difco)) e incubadas a 40º C.

As células que formaram colônias foram re-plaqueadas sobre HLB a 43º C para confirmar a restauração da capacidade para crescer sob condições osmóticas baixas em temperatura alta à cepa MXEDO01. O DNA plamídico foi preparado a partir dos clones e sequenciados para identificar mutações spr.

Usando este método cinco mutações únicas e uma dupla na proteina spr foram . isoladas que complementaram o fenótipo ATsp como segue:

1. VOBE - 2. DI33A

3. VI35SD 4, V135G

5. G147C

6. S95F e Y115F As mutações individuais identificadas acima e três mutações da tríade catalítica de —spr(C94A, H145A, H157A) e W174R foram usadas para gerar novas cepas usando a cepa W3110 do tipo selvagem da E. coli (genótipo: F- LAM-IN (rmD-rmE)1 rphl (ATCC no. 27325)) para criar cepas spr mutadas ou a cepa MXEO01 do Exemplo 1 para fabricar cepas spr ATsp/mutantes combinadas. As cepas de célula da E. coli mutantes que seguem foram geradas usando um sistema vetorial de substituição de gene usando o plasmídeo de recombinação/substituição homólogo pKO3 (Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237), como descrito - no Exemplo 1 para a geração de MXE001. Tabela 1

E O EE Rir [GENS pROSSprWWTaR (Sal) EE te sr VIS0D ESTO pROS pr VISSD (Sal PE Tap aoreSiR pIIXESAS, ROS Sor COMA (SAI | Os cassetes de integração de spr mutantes foram movidos como fragmentos de restrição Sal |, Not | em plasmídeos pKO3 similarmente restritos. O plasmídeo usa o mutante sensível à temperatura da origem pSC101 de replicação (RepA) junto com um marcador de cloranfenicol para forçar e selecionar quanto aos eventos de integração cromossômica. O gene sacB que codifica a levansucrase é letal para o cultivo de E. coli em sacarose e consequentemente (junto com o marcador de . cloranfenicol e origem pSC101) é usado para forçar e selecionar quanto aos eventos de desintegração e cura plásmica.

Esta metodologia foi descrita anteriormente (Hamilton et al., í 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 e Blomfield et al, 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457). O sistema pKO3 remove todos os marcadores seletivos do genoma hospedeiro exceto quanto ao gene inserido.

Os vetores pK03 listados abaixo foram construídos, que compreendem os genes spr mutados que incluem uma mutação silenciosa dentro da sequência spr que remove um sitio de restrição de Sall para a identificação de clone.

PMXE336, pKo03 spr S95F (-Sall) PMXE337, pKo03 spr Y115F (-Sall) PMXE338, p1(03 spr G147C (-Sall) PMXE339, pKO03 spr D133A (-Sall) PMXE340, pKo03 spr V135D (-Sall) PMXE341, pKo03 spr V135G (-Sall) PMXE342, pK03 spr V9BE (-Sall) . PMXE343, pK03 spr C94A (-Sall) PMXE344, pKO3 spr H145A (-Sall) - PMXE345, pK03 spr H157A (-Sall) PMXE346, pKO03 spr W174R (-Sall) Estes plasmídeos foram depois transformados nas células W3110 da E. coli quimicamente competentes preparadas usando o método encontrado em Miller, E.

M. e Nickoloff, J.

A., “Escherichia coli electrotransformation," em Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.

A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995) ou na cepa MXE001 do Exemplo 1 para fabricar as cepas ATsp/spr mutante combinadas, como mostradas na Tabela 1. Dia 1 40 ul de células E. coli eletro-compententes ou células MXEOO01 foram misturadas com (10 pg) 0,1 ul de DNA de pKO3 em uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm BioRad gelada antes da eletroporação a 2500 V, 25 pF e 200 O, 1000 ul de 2xPY foram adicionados imediatamente, as células recuperadas por agitação a 250 rom em uma incubadora a 30º C por 1 hora.

As células foram diluídas 1/10 em série em 2xPY antes que alíquotas de 100 ul fossem plaqueadas sobre placas de 2xPY ágar contendo cloranfenicol a 20 pg/ml pré-aquecido a 30º C e 43º C.

As placas foram incubadas durante a noite a 30º C e 43º C, Dia 2 O número de colônias cultivadas a 30º C deu uma estimativa da eficiência de eletroporação enquanto que as colônias que sobrevivem cultivadas a 43º C representam eventos de integração potenciais.

As colônias únicas da placa a 43º C foram escolhidas e recolocadas em suspensão em 10 ml de 2xPY. 100 ul disto foram plaqueados em placas de 2xPY ágar contendo 5 % (p/v) de sacarose pré-aquecida a 30º C para gerar colônias únicas. ' As placas foram incubadas durante a noite a 30º C, . Dia 3 As colônias aqui representam os eventos de desintegração e cura de plasmídeo simultâneos potenciais.

Se os eventos de desintegração e cura aconteceram no princípio do cultivo, então o grosso da massa de colônia será clonal.

As colônias únicas foram escolhidas e a réplica plaqueada em 2xPY ágar que conteve cloranfenicol a 20 pa/ml ou 5 % (p/v) de sacarose.

As placas foram incubadas durante a noite a 30º C.

Dia 4 As colônias que tanto cresceram em sacarose quanto morreram no —cloranfenicol representam os eventos de substituição cromossômica e de cura de plasmídeo potencial.

Estes foram escolhidos e triados pela PCR mais digestão de restrição para a perda de um sítio Sall.

As colônias que geraram uma faixa de PCR posítiva do tamanho correto e resistência à digestão pelo Sall foram riscadas para produzir colônias únicas sobre 2xPY ágar contendo 5 % (p/v) de sacarose e as placas foram incubadas durante a noite a 3c.

Dia 5 As colônias únicas de E. coli positivas na PCR, sensíveis ao cloranfenicol e . resistentes à sacarose foram usadas para fabricar estoques de glicerol, células quimicamente competentes e atuar como padrões de PCR para uma reação de PCR com F oligos que flanqueiam 5' e 3' para gerar produto de PCR para o sequenciamento de DNA diretousando Taq polimerase para confirmar a mutação correta.

Geração de plasmídeo para expressão de Fab' e DsbC Um plasmídeo foi construído contendo ambas as sequências de cadeia pesada e leve de um anti-TNF Fab' e a sequência que codifica DsbC.

Uma mensagem dicistrônica foi criada do anti-TNFa Fab' fragmento (aludido como CDP870) descrita na WOO01/94585. O cistron a montante codificou a cadeia leve do anticorpo (SEQ ID NO: 9) embora o cistron a jusante codificou a cadeia pesada do anticorpo (SEQ ID NO: 10). Uma sequência de DNA que codifica o peptídeo de sinal OmpA foi fundido à extremidade 5' do DNA que codifica cada uma da cadeia leve e da cadeia pesada para possibilitar a secreção eficiente para o periplasma.

A sequência intergênica (IGS) 2 foi usadacomo mostrado na SEQ ID NO: 16. O plasmídeo pDPH358 (pTTO 40.4 CDP870 IGS2), um vetor de expressão para o Fab' CDP870 (um Fab' anti-TNF) e DsbC (um polipeptídeo periplásmico), foi construído usando metodologias de clonagem de restrição convencionais que podem ser encontradas em Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual.

CSHL press, NY.

O plasmídeo pDPH358 conteve as características que seguem; um promotor tac forte e sequência de operador lac.

O plasmídeo conteve um sítio de restrição EcoRI único depois da região codificadora da cadeia pesada de Fab', seguido por uma sequência não codificadora e depois um sítio de restrição Ndel único. O gene DsbC foi clonado pela PCR . usando DNA cromossômico bruto W3110 como um padrão tal que o produto de PCR codificado para um sítio EcoRI 5' seguido por uma ligação de ribossoma forte, seguido pelo - códon de partida nativo, sequência de sinal e sequência madura de DsbC, terminando em umrótuloHisde terminal C e finalmente um sítio Ndel não codificador. O fragmento de PCR EcoRI-Ndel foi restringido e ligado no vetor de expressão tal que todos os três polipeptídeos: cadeia leve de Fab', cadeia pesada de Fab' e DsbC foram codificados em um mRNA policistrônico único. Os genes da cadeia leve, cadeia pesada de Fab e gene de DcbC foram transcritos como uma mensagem policistrônica única, O DNA que codifica o peptídeo de sinal da proteina OmpA da E. coli foi fundido à extremidade 5' das sequências de gene tanto da cadeia leve quanto da pesada, que direcionaram a translocação dos polipeptídeos para o — periplasma da E. coli. A transcrição foi terminada usando um terminador de transcrição dual rmB tl 12. O gene lack codificou a proteina repressora Lac | constitutivamente expressada. Isto reprimiu a transcrição do promotor tac até que a desrepressão fosse induzida pela presença de alolactose ou IPTG. A origem de replicação usada foi p15A, que manteve um - número de cópia baixo. O plasmídeo conteve um gene de resistência à tetraciclina para a seleção de antibiótico. jd Expressão de anti-TNF Fab' e DsbC A cepa MXEO008 foi transformada com o plasmídeo que codifica a cadeia leve de Fab', cadeia pesada de Fab' e DsbC. A transformação da cepa foi realizada usando o método encontrado em Chung C. T et al Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86: 2172-2175 (1989). Expressão de Fab' anti-TNF A cepa MXE008 foi transformada com o plasmídeo pMXE117 (pTTO CDP870 ou

40.4 I1GS2), um vetor de expressão para o CDP870 Fab' (um Fab' anti-TNF tendo uma sequência de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 10), que foi construída usando metodologias de clonagem de restrição convencionais que podem ser encontradas em Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y. O plasmídeo pMXE | 17 (pTTO CDP870 ou

40.4 1GS2) contiveram as características que seguem; um promotor tac forte e sequência operadora lac. Os genes da cadeia leve e pesada de Fab foram transcritas como uma mensagem dicistrônica única. O DNA que codifica o peptídeo de sinal da proteina OMpA da E, colifoifundidaà extremidade 5' das sequências de gene tanto de cadeia leve quanto da pesada, que direcionou a translocação dos polipeptídeos para o periplasma da E. coli. À transcrição foi terminada usando um terminador de transcrição dual rmB t112. O gene laclq codificou a proteína repressora Lac | constitutivamente expressada.

Isto reprimiu a . transcrição do promotor tac até que a desrepressão fosse induzida pela presença de alolactose ou IPTG.

A origem de replicação usada foi p15A, que manteve um número de - cópia baixo.

O plasmídeo conteve um gene de resistência à tetraciclina para a seleção em antibiótico.

A transformação das cepas foi realizada usando o método encontrado em Chung C.

T et al Transformation and storage of bacterial cells in the same solution.

PNAS 86: 2172- 2175 (1989). Exemplo 2 — Cultivo de Célula Hospedeira Que Expressa Anticorpo Recombinante Fab'ant-TNF A cepa MXEODO8 produzida no Exemplo 1 foi usada em um experimento de fermentação para expressar o Fab' anti-TNFa —=— MXEOO8 que expressa Fab' anti-TNF e DsbC foi fermentada usando condições e meio de fermentação padrão.

A seguir da fermentação a amostra de célula hospedeira resultante foi submetida à centrifugação e a pelota de célula foi congelada para armazenagem. - Exemplo 3 — Extração de Fab' anti-TNFa a partir da cepa da E. coli & ajuste de pH A pelota de célula congelada do Exemplo 2 foi depois descongelada e recolocada 1 em suspensão em tampão de extração (Tris 0,1 M/10 mM de EDTA pH 7,4). A extração foi realizada durante a noite a 60º C.

A seguir da etapa de extração da amostra de extração foi centrifugada por 1 hora a 4200 rpm a 4º C.

Após a centrifugação a amostra foi clarificada por intermédio de uma filtração em 0,45 um + 0,22 um, Depois da filtração, a amostra de extrato de célula hospedeira resultante tendo um pHde6,9foidivididoem 3 alíquotas de 10 ml e foi ajustado ao pH 5,0, 4,5 ou 3,0 usando 30 % (v/v) de ácido acético glacial.

Uma alíquota separada foi retida no pH 6,9 como uma amostra de controle.

Como pode ser observado na Figura 1, os níveis aumentados de precipitação foram observados conforme o pH diminuiu.

A maior parte da precipitação da proteína da célula — hospedeirafoiobservada a pH 13,0, seguido pelo pH 4,5 e depois pH 5,0. Exemplo 4 — Análise de extratos de amostra de célula hospedeira a seguir do ajuste de pH pela HPLC de fase reversa As amostras de cada amostra de extrato de célula hospedeira a seguir do ajuste de pH para pH 5,0, 4,5 ou 3,0 ou o controle (nenhum ajuste de pH, pH 7) foram tiradas através —docursodetempo no tempo (T)=0,T=1 hora, T=2 horas, T=4,5 horas, T=8horaseT = 24 horas, e a análise em tempo real foi realizada por intermédio da HPLC de fase reversa, A HPLC de fase reversa possibilita a separação das proteínas com base na hidrofobicidade e foi realizada usando uma coluna de HPLC adequada (Poroshellº 300SB-C8, 5 mícrons, : 21 x 75 mm da Agilent Technologies). As amostras foram filtradas (0,22 um) antes da análise. . Os resultados são mostrados nas Figuras 2, 3, 5 e 6. A Figura 2 mostra os cromatogramas sobrepostos para à análise de HPLC de fase reversa em T= 0 (T= O significa tão logo fosse possível para conduzir a análise depois do ajuste de pH, tipicamente em torno de 7 minutos depois do ajuste de pH) para a amostra de extrato de célula hospedeira depois do ajuste de pH.

A Figura 3 mostra os cromatogramas individuais para a análise de HPLC de fase reversa em T = O para a amostra de extrato de célula hospedeira depoisdo ajuste de pH.

Os picos que correspondem à cadeia leve (LC) do Fab', a cadeia pesada (HC) do Fab', o Fab' inteiro, o DsbC-his (rotulado com his DsbC) e proteina de ligação de dipeptídeo (DBP) são mostrados para o pH 7 e para o ajuste de pH para pH 3,0, pH 4,5 e pH 5,0. Pode ser observado a partir das figuras 2 e 3 que a quantidade de DsbChis é mais baixa depois do ajuste de pH para o pH 5 comparada com o controle no pH 7, a quantidade de DsbC-his é significantemente diminuída ainda depois do ajuste de pH para o pH 4,5 ou para o pH 3,0. Também pode ser observado que a quantidade de DBP é . significantemente diminuída depois do ajuste de pH para o pH 3. O pl de DBP é 5,7. Portanto, no extrato de célula hospedeira o pH teve que ser significantemente diminuído de . modo a causar a precipitação de DBP.

A quantidade de Fab' não é significantemente afetada pelo ajuste de pH.

A Figura 5 mostra a área de pico total para DsbC-his a partir dos cromatogramas de HPLC de fase reversa depois do ajuste de pH para o pH 3,0, 4,5 e 5,0. Como observado nas Figuras 2 e 3, a quantidade de DsbC é reduzida depois do ajuste para o pH 5,0 e reduzida ainda mais depois do ajuste para o pH 4,5 ou 3,0. A Figura 6 mostra a área de pico total para DBP a partir do cromatograma da HPLC de fase reversa depois do ajuste de pH para o pH 3,0, 4,5 e 5,0. Como observado nas Figuras 2 e 3, a quantidade de DBP é reduzida depois do ajuste para o pH 3,0. Uma solução purificada de DsbC-his foi obtida do extrato de célula hospedeira da cepa MXEOO8 pela cromatografia de troca de cátion no modo misturado.

A análise desta solução purificada que compreende DsbC-his foi realizada no pH 7 e no pH 3,0 depois de T = O, 1, 8 e 24 horas.

Os resultados são mostrados na Figura 4 que mostra os cromatogramas para a análise de HPLC de fase reversa da solução purificada que compreende DsbC-his no pH 7 e no pH 3,0 depois de T = O, 1, 8 e 24 horas.

Pode ser observado a partir da Figura 4 que o ajuste de pH não teve nenhum efeito sobre a precipitaçãoeremoção de DsbC-his da solução.

Exemplo 5 —Análise de SDS-PAGE das Amostras A análise de SDS-PAGE não redutora foi realizada depois de uma armazenagem prolongada no pH 7, pH 5,0, pH 4,5 e pH 3,0. A Figura 7 mostra o gel de análise de SDS- . PAGE. Pode ser observado a partir da Figura 7 que a quantidade de DBP é reduzida depois do ajuste de pH para o pH 3. A DsbC e a cadeia pesada (HC) do Fab' mostradas no mesmo - peso molecular no gel mas pode ser observado que a faixa para DsbC e HC é reduzida a seguirdo ajuste do pH para o pH 5, pH 4,5 e pH 3 devido à redução em DsbC confirma que a quantidade de DsbC-his e DBP é reduzida depois do ajuste de pH. O Fab' anti-TNF CDP870 testado nos exemplos acima depois do ajuste de pH para o pH 4,5 foi testado pela análise de Biacore e descoberto ter retida afinidade para TNF.

(dados não mostrados).

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para purificar uma proteina recombinante a partir de uma amostra de ] célula hospedeira bacteriana gram negativa ou extrato desta em que a dita célula . hospedeira expressa uma proteína recombinante e uma dissulfeto isomerase recombinante DsbC;ométodo caracterizado pelo fato de que compreende: a. ajustar o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta a um pH de 5 ou menos para precipitar a dissulfeto isomerase recombinante; e b. separar a dissulífeto isomerase recombinante precipitada da proteina recombinante para produzir uma amostra de proteina recombinante.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta é ajustado a um pH de 4,5 ou menos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta é ajustado a um pH de 4,5a3,0.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pH da —amostrade célula hospedeira ou extrato desta é ajustado a um pH de 3 ou menos.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que na . etapa a) a proteina de ligação de dipeptídeo da célula hospedeira é precipitada ainda e na etapa b) a proteína de ligação de dipeptídeo da célula hospedeira é separada ainda da - proteína recombinante.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a dissulfeto isomerase compreende um rótulo de histidina.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira bacteriana gram negativa é a E. coli.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende Fkpa e/r Skp.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que na etapa a) o pH da amostra de célula hospedeira ou extrato desta é ajustado a um pH de menos do que 5 usando ácido acético glacial.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a amostra de célula hospedeira ou extrato desta é mantida em um pH de 5 ou menos por uma hora ou menos.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a separação na etapa b) compreende centrifugação e/ou filtração.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que depois da etapa b) o método compreende um etapa de purificação adicional de submeter a amostra de proteina recombinante à cromatografia.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a . cromatografia é a cromatografia de troca iônica.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, - caracterizado pelo fato de que depois da etapa b) o pH da amostra de proteína recombinante é ajustado a um pH de 5a7.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que antes da etapa a) um tampão de extração é adicionado à amostra de célula hospedeira ou extrato desta e a amostra de célula hospedeira ou extrato desta é submetida a uma etapa de tratamento térmico.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante tem um pl de 6 a 9.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante tem um pl de 8 a 9.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante é um anticorpo recombinante.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o - anticorpo recombinante é um anticorpo monocional, humanizado ou quimérico, ou um fragmento deste, tal como um fragmento de ligação deste. *

20. Método, de acordo com as reivindicações 18 ou 19, caracterizado pelo fato de queo anticorpo recombinante é um fragmento de Fab ou Fab'.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo recombinante é específico para o TNFa humano.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDRHI, SEQ ID NO: 2, para a CDRH2 e SEQ ID NO: 3 para a CDRH3 e uma cadeia leve em que o domínio variável compreende uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para a CDRL1, SEQ ID NO: 5 para a CDRL2 e SEQ ID NO: 6 para a CDRL3.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência da região variável de cadeia leve dada na SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada dada na SEQ ID NO: 8.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento Fab e compreende uma cadeia pesada tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 9.

25. Uso de uma etapa, caracterizado pelo fato de ajustar o pH de uma amostra de célula hospedeira bacteriana gram negativa ou extrato desta transformada com um vetor de expressão que codifica uma proteina recombinante a um pH de 5 ou menos para precipitar a dissulfeto isomerase recombinante da célula hospedeira, separar a dissulfeto isomerase . precipitada recombinante da proteina recombinante da célula hospedeira e produzir uma amostra de proteína recombinante purificada.

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Figura 8 SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de aminoácido de CDRH1 de CDP870. Asp Tyr Gly Met Asn SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácido de CDORH2 de CDP870 Trp Tle Asa Thr Tyr Te Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly SEQ ID NO: 3 mostra a sequência de aminoácido de CDRH3 de CDP870. Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr SEQ ID NO: 4 mostra a sequência de aminoácido de CDRL1 de CDP870. Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn Val Ala SEQ ID NO: 5 mostra a sequência de aminoácido de CDRL2 de CDP870.

' Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Í SEQ ID NO: 6 mostra à sequência de aminoácido de CDRL3 de CDP870. 7 Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr SEQ ID NO: 7 mostra a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de CDP870 Asp Ile Gin Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Tbr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gla Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu Tle Lys

7 Figura 8 (Continuação) SEQ ID NO: 8 mostra a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada CDP870 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Giy Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr Gly Met Asn Tip Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Met ' Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ale Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Va! Thr Val Ser Ser SEQ ID NO: 9 mostra a sequência de aminoácido de uma cadeia leve de CDP870 de Fab anti-TNFa enxertada Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Hle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy . Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe ç Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe . Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gln Tyr Asn lle Tyr Pro Leu Thr Phe Gty Gin Gly Thr Lys Val Glu Tle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Ghn Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

Figura 8 (Continuação) SEQ ID NO: 10 mostra a sequência de aminoácido de uma cadeia pesada de CDP870 de Fab anti-TNFa enxertada Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr 1le Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vel Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Giy Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser : Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala . Ala SEQ ID NO: 11 é a sequência de nucleotídeo de DsbC rotulada com his. atgaagaaag gttttatatt grttactttg tragoggogt tttcaggott tgcteagget Getsacdema caattcaaca ascgttagce aaaatgggea tcaaaageag cgatatteag ceegegecta tagctggcat gaagacágtt ctgactaaca goggegtgtt gtacatcaco CT aegatagta aacatatcat tcaggggeca atgtatgacg ttagtogeac ggetecggte aacgueeca atuagatgot gttaaageag ttgaatgogo ttgaaaaaga gatgatogtt Catasagege cgcaggasas acacgteate acogtattta ctgatateao crgtggttao Laccacanac tgcatgagea aatggcagao tacamcgege tagggatcao cgtgaogtrar Stegatteno egegecagçg gotagacage gatgcagaga aagaaatçaa agotatotog tâeacgaaag ataaaaacaa agegttrgat gargtgatag caggtaaaag cgtogeacea Queagttasa acgtagatat tgccgaccat tacgcactta gegtecaget tggegttage ggtastecgs cagttgtgot gagcaatage acacttgtre cagattacca gocgocgaas

? Figura 8 (Continuação) gagatansag astttotega ogascacesa sasatgacoa gogutanaca ccatoscçat SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácido da DsbC rotulada com his.

MKKGFMLFTL LAAFSGFAQA DDAAIQQTLA KMGIKSSDIO PAPVAGMKTV LTNSGVLYIT

DDGKHIIQGP MYDVSGTAPV NVTNKMLLKO LNALEKEMIV YKAPQEKAVI TVPTDITCGY

CHKLHEQMAD YNALGITVRY LAFPROGLDS DAEKENKAIW CAKDKNKAPD DVMAGKSVAP

ASCOVOTADA YALGVGLGYS GTPAVVLSNG TLVPGYQPPK EMKEFLDEHO KMTSGRHHHH SEQ ID NO: 13 é a sequência do gene spr do tipo selvagem que inclui a sequência de sinal que é dos primeiros 26 resíduos de aminoácido Met Val Lys Ser Gin Pro 1le Leu Arg Tyr Ile Leu Arg Gly Ile Pro Ala Tle Ala Val Ala Val Leu Leu Ser Ala Cys Ser Ala Asn Asn Thr Ala Lys Asn Met His Pro Glu Thr Arg Ala Val Gly Ser Glu Thr Ser Ser Leu Gln Ala Ser Gin Asp Glu Phe Glu Asn Leu Val Arg Asn Val Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Asp Gln Tyr Ala Asp Trp Lys Gly Val Arg Tyr Arg Leu Gly Gly Ser Thr Lys Lys Gly Ile Asp Cys Ser Gly Phe Val Gin Arg Thr Phe Arg ' Glu Gn Phe Gly Leu Glu Leu Pro Arg Ser Thr Tyr Glu Gin Gin Glu Met Gly Lys Ser ' Val Ser Arg Ser Asn Leu Arg Thr Gly Asp Leu Val Leu Phe Arg Ala Gly Ser Thr Gly 7 Arg His Val Gly Ile Tyr Ile Gly Asn Asn Gin Phe Val His Ala Ser Thr Ser Ser Gly Val Te Ile Ser Ser Met Asn Glu Pro Tyr Trp Lys Lys Arg Tyr Asu Glu Ala Arg Arg Val Leu Ser Arg Ser SEQ ID NO: 14 é a sequência do gene spr do tipo selvagem sem à sequência de sinal. Cys Ser Ala Asn Asn Thr Ala Lys Asn Met His Pro Glu Thr Arg Ala Val Gly Ser Glu Thr Ser Ser Leu Gin Ala Ser Gin Asp Glu Phe Glu Asn Leu Val Arg Asn Val Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Asp Gin Tyr Ala Asp Trp Lys Gly Val Arg Tyr Arg Leu Gly Gly Ser Thr Lys Lys Gly Ile Asp Cys Ser Gly Phe Val Gin Arg Thr Phe Arg Glu Gln Phe Gly Leu Glu Leu Pro Arg Ser Thr Tyr Glu Gln Gin Glu Met Gly Lys Ser Val Ser Arg Ser Asn Leu Arg Thr Gly Asp Leu Val Leu Phe Arg Ala Giy Ser Thr Gly Arg His Val Gly 1le Tyr Tle Gly Asn Asn Gin Phe Val His Ala Ser Thr Ser Ser Gly Val Ile Ile Ser Ser Met Asn Glu Pro Tyr Trp Lys Lys Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Arg Val Leu Ser Arg Ser

: Figura 8 (Continuação) SEQ ID NO: 15 é a sequência de DNA de um gene Tsp mutado silenciado incluindo os 6 nucleotídeos ATGAAT a montante do códon de partida. atgaattogt tttaggott acegogttag ctggectgot tgcantagea geccagacat — 60 taattgtaga agatatcacg ogtgctgato anattocggt attaaaggas gagacgeange — 120 atgcgacget aagtgagoge gtencgtoge geticacecg ttoteattat cgocagttog — 180 acctegatca ggcatittog gocanantot ttgacogeta cotgantote ctogattaca — 240 gecacanogt gotgotggea agogatgttg sacagitoge gaanaagana accgagitag — 300 Begatganct gogticagge aaactegacg tittotacga tototacaat ctggegeaan — 360 Aagogocgttt tgagegttac cagtacgott tetoggtact geanangccg atggatitoa — 420 CCggcaacga cacttatase cttgaccgoa geaaageges ctggocgana aacgagecte” =— 480 Agttgaacge getgtgggac agtanagtca aatregacga gitaagcotg angclgacag — 540

" gasanacgga tasaguantt cgtgaaaccc tgactegeog ctacasatit gocattegte — 600

1 Btctggogen aaccascago gaagatgttt totegotgge aatgacgeng tiigogegte — 660

. aRstogacce goataccane tatetttoco cgcgraatac cgaacagitoe aacactgasa — 720 tgagttgto geteganget attggegeag tectecanat ggatgatgac tacacegtta — 780 tcasttogat ggtggcaget ggtccggcas craagagtaa agotatoago gttggtgaça — 840 aanttgtcgg tgttggtcas acaggcaage cgatgetiga cgtesttggo tegegtotig — 900 atgatgtggt tgccttaatt anagggocga agggcagtas agitogtote gasatittac — 960 Ctgctggtas agggaccaag accegtactg taacgtigac cegtgaacgtattegteteg 1020 aagacegogo gettasaatg teggtgnaga cogtogetaa agagaaagto gecgtgetge — 1080 atattecggg cttctatetg getitgacas acgatgtoaa agtecancte cagaaactag — 1140 aanancagas tetoageage gtoatcateg acetgegtag cantegoggt pgegegttaa — 1200 etgaagecgt atogetetos gatetaetita ttectgoggg tecoatigtt caggtecgeg — 1260 ataacancgg caaggttogt gaagatageg ataccgacgg acaggtttto tataaagece — 1320 cgctggtggt getggtigas ceottcagte cttogecito agaaatetit googeggeaa — 1380 tgcaggatta cegtcgtgo ctegttgtgg gigaaccgas gtttggtasa gecacegtto — 1440 agrantaçog ttcattgaas cgtatitacg atoagatett acgtcctgas tggecagege — 1500 tgggttotgt goagracacg atccaganat tetatogegt tancggeggce agtacgeaae — 1560

MM MM Ns . 13/14 [ : Figura 8 (Continuação)

V Btaaaggcgt aacgccagac atcatcatge cgacgggtaa tgaagaaacg gaaacgggte — 1620 agaaattcga agataacgcg ctgccgtggg atageattga tgcegegact tatgigaaat — 1680 caggagattt aacggocttt gaaccggago tgctgaagga acataatgeg cgtategega — 1740 aagatcctga gltecagaac atcatgaagp atategegeg ctteaacget atgaaggaca — 1800 agegeaatat cgtttetotg aattacgetg tgcgigagaa agagaataat gaagatgatg — 1860 Cgacgegtet ggegegtttg ascgaacget ttanacgega aggtaaacog gagtigaaga — 1920 aactggatga tetaccgaaa gattaccagg agccggatoc tatctggat gagacggtga — 1980 | atatcgeact cgatetggeg aagetigaaa aagocagace cgeggaacaa cccgetecog — 2040 | tcaagtaa 2048 SEQ ID NO: 16 mostra a sequência intergênica 2 que codifica o cassette de oligonucleotídeo (IGS2) para a expressão de Fab da E. coli. Bageteacca gtaacaaaaa gitttaatag ageggagtet tamaatgaag aagactgcta — 60 tagcaattg 69 |

Figura 9 Ss CHEO(CHOCH2D) CONHAAS a AH '