CN103189385A - 用于纯化蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于从革兰氏阴性菌宿主细胞样品或其提取物纯化重组蛋白质的方法，其中所述宿主细胞表达重组蛋白质和重组二硫化物异构酶DsbC；所述方法包括：a.将宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH5或更低，以沉淀重组二硫化物异构酶；和b.分离沉淀的重组二硫化物异构酶与Dsbc重组蛋白质，以产生重组蛋白质样品。

Description

用于纯化蛋白质的方法
本发明涉及用于从革兰氏阴性宿主细胞样品或其提取物纯化重组蛋白质的方法。更具体而言，将革兰氏阴性宿主细胞样品或其提取物调节至低pH，以实现蛋白质二硫化物异构酶的沉淀。
重组DNA技术已快速发展且用于抗体特别是治疗用抗体的生产中。用于表达重组基因的系统是所讨论的领域中的技术人员众所周知的。这些包括在哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞以及转基因动物和植物中的表达。表达系统的选择取决于所编码蛋白质的特征，例如翻译后修饰。其他考虑包括在具有所需质量的材料的所需数量生产中涉及的时间且特别是成本。这些较后的考虑在具有监管机构批准所需的质量和治疗大量患者所需的数量的治疗用抗体生产中是特别重要的。
用于生产重组蛋白质的广泛使用的系统是基于在大肠埃希杆菌（Escherichia coli）（大肠杆菌（E.coli））中的表达。使用大肠杆菌遇到的具体问题是以治疗所需的数量生产具有所需质量的材料中的困难。特别地，涉及的时间和成本可以是高得惊人的。一个特别注意的问题是在来自大肠杆菌的抗体纯化过程中的抗体得率中遭受的损失。
尽管，按比例地，纯化成本是治疗用抗体产物的总成本的部分，但纯化成本比例将随着上游生产成本变得更便宜而进一步增加。因此，抗体的回收和纯化中的改善将驱动生产成本进一步向下，与生产方式无关（Humphreys & Glover，Curr.Opin.Drug Discovery & Development，2001，4:172-185）。因此，存在例如通过增加产物回收和/或改善产品流线的质量，将时间和/或成本节省引入治疗用抗体生产且特别是纯化内的方法的需要。
低产物得率通常是在下游纯化步骤中注意到的特别问题。在下游纯化中的具体问题涉及宿主细胞蛋白质（HCP）的分离，所述HCP在从宿主细胞中提取治疗用抗体后释放。已尝试许多方法修饰，以便解决这个问题。此类方法的例子包括下述：
目的蛋白质可以沉淀且随后与其他HCP污染物分离。然而，治疗用抗体的沉淀可以对抗体造成不可逆性损伤。特异性沉淀目的蛋白质的技术通常导致非蛋白质性质的污染物陷入沉淀物中，致使分离无效。
可替代地，HCP可以从治疗用抗体中沉淀出来。US7169908描述了加入乳酸依沙吖啶溶液，以沉淀宿主细胞杂质。然而，诸如乳酸依沙吖啶的试剂的使用不适合于治疗用蛋白质的生产，因为它已用作流产试剂，并且如果它并未完全去除，则可以对于患者是有害的。来自CHO细胞培养物的HCP已使用小分子和pH调节进行沉淀，以便纯化蛋白质（Arunakumari A.等人Advances in Non-Protein A PurificationProcesses for Human Monoclonal Antibodies Supplement to BioPharmInternational2009年3月第22-26页）。
虽然此类方法已对从宿主细胞污染物纯化治疗用抗体作出贡献，但仍需要提供改良方法以减少来自微生物宿主细胞系统的HCP数量，而不负面影响治疗用抗体的性质，以便促进进一步的下游加工。
再者，本发明人已发现特定伴侣蛋白质例如二硫化物异构酶例如DsbC通过宿主的表达可以用于增加抗体或其片段的表达水平。然而，伴侣蛋白质以显著水平表达并且变成所述方法的需要去除的大副产物。
去除大量污染物可以是挑战性的，因为诸如柱色谱的方法发现难以去除大量蛋白质污染物，由于柱捕鸟（column fowling）和需要使用大量试剂或溶剂。
当测试分离的DsbC时，它在低pH例如pH3是可溶的。然而，本发明人已惊讶地发现将pH调节为5或更低可以用于沉淀来自革兰氏阴性菌宿主细胞的重组二硫化物异构酶，从而促进目的重组蛋白质例如治疗用抗体的进一步加工。
发明概述
在一个方面，提供了用于从宿主细胞纯化重组蛋白质的方法，所述宿主细胞例如表达重组蛋白质和重组二硫化物异构酶或其提取物的革兰氏阴性菌宿主细胞样品；其包括：
a.将宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH5或更低，以沉淀重组二硫化物异构酶；和
b.分离沉淀的重组二硫化物异构酶与重组蛋白质，以提供重组蛋白质样品。
本发明还提供了将用编码重组蛋白质或其提取物的表达载体转化的革兰氏阴性菌宿主细胞样品的pH调节至pH5或更低的步骤的用途，以沉淀宿主细胞重组二硫化物异构酶，随后为沉淀的宿主细胞重组二硫化物异构酶与重组蛋白质的分离，且提供纯化的重组蛋白质样品。
在一个实施方案中，提供了用于从革兰氏阴性菌宿主细胞样品或所述宿主细胞的提取物纯化重组抗体或其结合片段的方法，其中所述宿主细胞表达重组抗体或其结合片段和重组二硫化物异构酶DsbC；其中所述方法包括：
a.将宿主细胞样品或其提取物的pH调节至在范围3.5–5中的pH，以沉淀重组DsbC；和
b.分离沉淀的重组DsbC，以提供含有纯化的重组抗体或其片段的样品。
令人惊讶的是，这个pH调节步骤从溶液中沉淀显著数量的宿主细胞重组二硫化物异构酶，从而允许宿主细胞重组二硫化物异构酶与目的重组蛋白质的分离。这通过减少溶液中与重组蛋白质竞争色谱柱上的结合位点的宿主细胞二硫化物异构酶来促进下游加工，特别是任何后续色谱法步骤例如非亲和色谱捕获。因此，HCP在色谱柱上的装载是最小化的，并且当使用相同大小和数目的色谱柱时，目的重组蛋白质的得率得到改善。这减少了进一步下游纯化的时间和成本。
有趣的是，纯DsbC在3.0–5范围的pH不沉淀（参见图4）。然而，当存在于表达抗体或其结合片段的革兰氏阴性细胞的复杂环境中或备选地在所述细胞的部分或全部内容物的存在下时，那么DsbC沉淀。虽然不希望受理论束缚，但假定在即使通常蛋白质在范围3.5–5中的pH是可溶的pH范围中，宿主细胞或来自宿主细胞的提取物的复杂基质环境催化二硫化物异构酶例如DsbC的沉淀。可能一旦沉淀起始，它就继续且扩大。
因此，根据本公开内容的方法适合于在大规模上的使用，且因此在蛋白质例如抗体的商业加工中是非常有用的。
附图简述
图1显示了与对照pH6.9相比较，在pH已调节至pH5.0、pH4.5或pH3.0后，所观察到的宿主细胞溶液的沉淀。
图2显示了与对照pH7相比较，在pH调节至pH5、pH4.5或pH3后，关于宿主细胞溶液在时间（T）=0时的反相HPLC分析的色谱图。
图3显示了与对照pH7相比较，在pH调节至pH5.0、pH4.5或pH3后，关于宿主细胞溶液在T=0时的反相HPLC分析的分开色谱图。
图4显示了与对照pH7相比较，在不同时间间隔后，在pH调节至pH3后，关于包含DsbC的溶液的反相HPLC分析的分开色谱图。
图5显示了与对照pH7相比较，在pH调节至pH5.0、pH4.5或pH3后，来自关于宿主细胞溶液在不同时间点时的反相HPLC分析的关于DsbC的峰总面积。
图6显示了与对照pH7相比较，在pH调节至pH5.0、pH4.5或pH3后，来自关于宿主细胞溶液在不同时间点时的反相HPLC分析的关于DBP的峰总面积。
图7显示了与对照pH6.9相比较，在pH调节至pH5、pH4.5或pH3后，关于宿主细胞溶液的SDS-PAGE分析凝胶。
图8显示了序列SEQ ID NO：1至16。
图9显示了称为CDP870的化合物的结构，其包含经由半胱氨酸残基与赖氨酰-马来酰亚胺接头共价连接的经修饰的抗TNF Fab’片段，其中在赖氨酰残基上的每个氨基具有与之共价附着的甲氧基PEG残基，其中n是约420。
序列简述
SEQ ID NO:1显示了CDP870的CDRH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2显示了CDP870的CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示了CDP870的CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4显示了CDP870的CDRL1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5显示了CDP870的CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6显示了CDP870的CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示了轻链可变区CDP870的核苷酸和预测的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示了重链可变区CDP870的核苷酸和预测的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9显示了移植的抗TNFαFab CDP870轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10显示了移植的抗TNFαFab CDP870重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是加his标签的DsbC的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是加his标签的DsbC的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是包括信号序列的野生型spr基因的序列，所述信号序列是前26个氨基酸残基。
SEQ ID NO:14是不含信号序列的野生型spr基因的序列。
SEQ ID NO:15是包括起始密码子上游的6个核苷酸ATGAAT的突变敲除Tsp基因的DNA序列。
SEQ ID NO:16显示了编码关于大肠杆菌Fab表达的基因间序列2（IGS2）的寡核苷酸盒。
本发明的优选实施方案的详述
本发明现在将更详细地进行描述。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，除非上下文另有说明。“肽”意指10个或更少的氨基酸。
术语“多核苷酸”包括DNA、cDNA、RNA和mRNA。
如本文使用的，在本说明书的背景中的术语“包含”应解释为“包括”。
表达“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和“菌株”可互换使用。
如本文采用的宿主细胞提取物（来自其的提取物）用于指部分或全部宿主细胞内容物，即
·得自部分或总细胞裂解以从细胞中提取一些或所有化学物质的材料，或
·得自对细胞实施加工从而使得由细胞表达的一种或多种蛋白质释放到液相内的材料。
如本文采用的构成宿主细胞的内容物的化学物质和材料指在细胞内的液体、蛋白质、脂质、糖、脂多糖、肽聚糖、质粒和染色体DNA、RNA、小分子例如氨基酸、金属离子、氧化还原活性分子、tRNA和来自上述所有的片段。
用于释放来自细胞的一种或多种蛋白质的方法包括热处理和/或对细胞实施非裂解压力和/或使用化学制品，包括：缓冲剂、螯合剂、去污剂、物理破坏和/或使用声能和/或使用机械剪切。
如本文采用的革兰氏阴性细胞样品指革兰氏阴性细胞群体，例如至少两种革兰氏阴性细胞，但更具体而言在发酵过程特别是商业发酵过程中采用的分批。
如本文采用的纯化的重组抗体或其结合片段意指抗体或片段形式，其中存在比相应未加工形式中更少的杂质和污染物。它不一定预期是绝对术语，因为抗体或片段可以仍需要进一步纯化步骤。
在一个实施方案中，由根据本发明的方法提供的纯化重组抗体或其结合片段是基本上纯的。
如本文采用的基本上纯的指其中抗体或其结合片段是超过90%纯的，例如91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%纯的，特别是95%纯的或更多。
本文描述的本发明基于令人惊讶和出乎意料的观察：在用编码重组蛋白质分子的表达载体转化的宿主细胞样品已培养后，将pH调节至5或更低的步骤可以用于沉淀重组二硫化物异构酶，并且这对蛋白质的纯化具有显著有利的影响。
本发明的步骤a）要求宿主细胞样品或其提取物调节至pH5或更低、小于5的pH、pH4.5或更低、或pH3或更低。在优选实施方案中，宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH4.5或更低、更优选pH约4.5。本发明人已发现pH4.5对于沉淀是特别有利的，并且允许重组DsbC的分离。
在一个实施方案中，宿主细胞样品或其提取物的pH未调节至小于pH3或备选地小于pH3.5的pH。相应地，宿主细胞样品或其提取物的pH优选调节至pH3-4.9、pH3.5-4.9、pH3-4.5或pH3.5-4.5。
在一个实施方案中，宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH3或更低，更优选pH约3。本发明人已发现pH3或更低对于沉淀是有利的，并且允许重组DsbC以及宿主细胞二肽结合蛋白的分离。
然而，虽然pH3或更低适合于沉淀来自宿主细胞或提取物的DsbC蛋白质，但低pH可能改变抗体或其结合片段的折叠构象，并且因此当考虑方法的所有参数时，可能不是最佳的。
因此，用于沉淀宿主细胞蛋白质的最佳pH将取决于由细胞表达的具体抗体或抗体片段，且特别是其在有关pH范围中的稳定性。
至少一种二硫化物异构酶例如至少DsbC采用该方法沉淀。在一个实施方案中，一种或多种其他宿主细胞蛋白质也采用该方法沉淀。
在本发明的方法的步骤a）中，在执行任何进一步纯化步骤例如离心和/或过滤前，和/或在一般是升高溶液pH的进一步pH调节前，宿主细胞溶液或其提取物可以保持在较低pH，例如pH5或更低任何合适的时间段。一般地，宿主细胞溶液或其提取物将保持24小时或更少、12小时或更少、6小时或更少、5小时或更少、2小时或更少、1小时或更少、30分钟或更少、10分钟或更少或7分钟或更少。
在采用本发明的方法后，在执行进一步即后续加工例如进一步纯化例如采用阴离子交换色谱的纯化前，pH可以例如升高至pH6、6.5或7。
本发明的方法的步骤a）可以在任何合适温度执行，例如室温，例如20-23℃或降低的温度例如1-10℃。因此，用于执行该方法的合适温度范围包括至少1–30℃。
宿主细胞样品或其提取物的pH调节可以使用能够改变pH的任何合适的试剂执行。合适试剂的例子是冰乙酸、氢氧化钠、乙酸钠或tris碱、及其组合。试剂可以是任何合适的浓度例如30或60%（v/v）冰乙酸、1M氢氧化钠、1M乙酸钠和2M或3M tris碱。
这些试剂中的一种或多种对于在根据本公开内容的方法中的使用是特别有利的，并且例如致使在治疗用蛋白质的纯化中重组二硫化物异构酶的沉淀和去除成为可能，因为它们是无毒的。
二硫化物异构酶是这样的酶，其催化当蛋白质折叠时，在蛋白质内的半胱氨酸残基之间的二硫键形成和断裂的酶。蛋白质二硫化物异构酶在重组蛋白质提取后从宿主细胞中释放。在本发明的方法中使用的宿主细胞产生重组二硫化物异构酶，并且因此重组二硫化物异构酶构成显著比例的污染性宿主细胞蛋白质。本发明已提供了时间和成本节省方式，以从重组蛋白质中去除重组二硫化物异构酶。重组二硫化物异构酶例如DsbC可以包含在N和/或C末端上的组氨酸标签（his-标签）。
组氨酸标签是有利的，因为它允许有效监控以显示DsbC污染已从抗体或其结合片段中去除。这是重要的，因为当使用针对来自野生型大肠杆菌的细胞内容物产生的多克隆血清时，DsbC的存在可以是难以检测的，因为标准多克隆血清趋于对于DsbC是弱反应或无反应的，并且因此即使当DsbC以高水平过表达时，也不能检测到它。检测标签例如聚-His的存在确保丰富过表达的DsbC的去除可以使用灵敏的免疫检测方法进行监控/证实。
在优选实施方案中，重组二硫化物异构酶是DsbC。DsbC是在大肠杆菌的周质中发现的原核蛋白质，其催化大肠杆菌中的二硫键形成。DsbC具有236的氨基酸序列长度（包括信号肽）和25.6KDa的分子量（UniProt编号P0AEG6）。DsbC首次在1994年鉴定（Missiakas等人The Escherichia coli dsbC（xprA）gene encodes a periplasmic proteininvolved in disulfide bond formation，The EMBO Journal第13卷，no8，第2013-2020页，1994和Shevchik等人Characterization of DsbC，a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli withdisulfide isomerase activity，The EMBO Jounral第13卷，no8，第2007-2012页，1994）。DsbC蛋白质可以包含在N和/或C末端上的组氨酸标签（his-标签）。
DsbC的预期pI是5.7，并且his标签的DsbC的预测pI是6.3。蛋白质的pI可以使用多种商购可得和公众免费的软件以及在线pI预测设施例如ExPASy ProtParam进行预测。
如果溶液的pH超过蛋白质的pI，那么可以预期蛋白质沉淀。然而，由图4可见，当调节至pH3时，不含宿主细胞或宿主细胞提取物的DsbC（his-标记的）溶液不沉淀，因为DsbC的数量在pH调节后未减少。令人惊讶的是，已发现当对包含重组DsbC的宿主细胞样品或其提取物实施小于pH5的pH调节时，DsbC的确沉淀，显著量的DsbC沉淀且可以与目的重组蛋白质分离，如图3中所示。相应地，由蛋白质例如DsbC的预测pI预测需要何种pH以允许来自宿主细胞样品或其提取物的沉淀是不可能的。
如本文使用的，“重组多肽”指使用重组DNA技术构建或产生的蛋白质。编码二硫化物异构酶的多核苷酸序列可以等同于编码在细菌细胞中发现的二硫化物异构酶的内源序列。备选地，编码二硫化物异构酶的重组多核苷酸序列是突变形式的野生型二硫化物异构酶序列，例如已去除限制位点。在其中二硫化物异构酶是DsbC的实施方案中，可以去除限制位点EcoRI和/或加入编码his-标签的序列。用于在本发明中使用的示例经修饰的DsbC核苷酸序列显示于SEQ ID NO:11中，其编码SEQID NO:12中所示的加his-标签的DsbC氨基酸序列。
在一个实施方案中，突变型DsbC由具有通过–CXXC-代表的突变型活性位点的DsbC蛋白质组成，其中XX是TF、GF、HH、NY、SF、MF、VH、SH、RF、FA、GA、MA、GI、AV、PS、QA、SV、PR、PP、AL、PL、FL、TR、LL、VL、QL、LQ。
在本发明的方法的步骤a）之前，该方法可以包括培养用一种或多种表达载体转化的宿主细胞样品，所述表达载体编码重组蛋白质和重组二硫化物异构酶。样品可以处于任何合适的规模，从蛋白质的小规模生产到用于商业目的的蛋白质的大规模制造。
在一个实施方案中，其中蛋白质是抗体，由宿主细胞产生的重组抗体可以是功能和非功能抗体的混合物。
宿主细胞包含编码二硫化物异构酶的重组多核苷酸，其可以存在于转化到细胞内和/或整合到宿主细胞的基因组内的合适表达载体上。优选地，编码二硫化物异构酶的多核苷酸是在细胞中的表达载体中，从而引起对于宿主细胞的基因组的最低限度破坏。重组蛋白质和重组二硫化物异构酶可以存在于同一表达载体或分开的表达载体上。
在本发明中使用的细胞是革兰氏阴性菌。最优选地，细胞是大肠杆菌。细胞是已遗传改造的重组细胞。大肠杆菌宿主细胞是能够产生重组蛋白质的突变株。重组大肠杆菌宿主细胞可以衍生自任何合适的大肠杆菌菌株，包括MC4100、TG1、TG2、DHB4、DH5α、DH1、BL21、K12、XL1Blue和JM109。一个例子是大肠杆菌W3110（ATCC27,325），用于重组蛋白质发酵的常用宿主菌株。例子还包括经修饰的大肠杆菌菌株，例如代谢突变株和蛋白酶缺陷株。
宿主细胞经遗传改造为产生重组二硫化物异构酶。产生重组二硫化物异构酶的宿主细胞是特别有利的，因为重组二硫化物异构酶的存在可以减少细胞裂解且可以帮助重组蛋白质的加工。
在优选实施方案中，宿主细胞包含编码重组DsbC包括加his-标签的DsbC的多核苷酸序列。
根据本发明的宿主细胞可以包含一种或多种进一步的遗传修饰。
在一个实施方案中，宿主细胞可以具有降低的蛋白酶活性，其中所述细胞包含编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质的突变型Tsp基因或是敲除突变的Tsp基因。
例如，与野生型细胞相比较，宿主细胞可以具有降低的Tsp蛋白质活性。Tsp（也称为Prc）是60kDa周质蛋白酶。Tsp的第一种已知底物是青霉素结合蛋白-3（PBP3）（Determination of the cleavage siteinvolved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 ofEscherichia coli；Nagasawa H，Sakagami Y，Suzuki A，Suzuki H，HaraH，Hirota Y.J Bacteriol.1989Nov；171（11）:5890-3和Cloning，mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which isinvolved in C-terminal processing of penicillin-binding protein3；HaraH，Yamamoto Y，Higashitani A，Suzuki H，Nishimura Y.J Bacteriol.1991Aug；173（15）:4799-813），但以后发现Tsp还能够切割噬菌体尾部蛋白质，并且因此将它重命名为尾部特异性蛋白酶（Tsp）（Silber等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：295-299（1992））。
在这个实施方案中，细胞具有与野生型细胞相比较降低的Tsp蛋白质活性。表达“与野生型细胞相比较降低的Tsp蛋白质活性”意指与野生型细胞的Tsp活性相比较，细胞的Tsp活性是降低的。细胞可以通过任何合适的方式进行修饰，以降低Tsp的活性。在一个实施方案中，降低的Tsp活性来自编码Tsp的内源多核苷酸和/或相关调节表达序列的修饰。修饰可以减少或停止Tsp基因转录和翻译，或与野生型Tsp蛋白质相比较，可以提供具有降低的蛋白酶活性的表达的Tsp蛋白质。在一个实施方案中，相关调节表达序列进行修饰，以减少Tsp表达。例如，Tsp基因的启动子可以是突变的，以阻止基因的表达。在优选实施方案中，根据本发明的细胞携带编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质的突变Tsp基因或敲除突变的Tsp基因。优选地，染色体Tsp基因是突变的。
Tsp（prc）活性的降低是希望的，以减少目的蛋白质的蛋白酶解。然而，发现缺乏蛋白酶prc的细胞显示在低摩尔渗透压浓度时的热敏生长。Hara等人分离了含有基因外阻遏因子（spr）突变的抗热逆转株（Hara等人，Microbial Drug Resistance，2：63-72（1996））。Spr是18kDa膜结合的周质蛋白酶，并且spr的底物是在细胞分裂过程中外膜中涉及细胞壁水解的Tsp和肽聚糖。spr基因指定为UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4（SPR_ECOLI）。包含突变型spr基因的改善的蛋白酶缺陷株已得到描述。Chen等人（Chen C，Snedecor B，Nishihara JC，Joly JC，McFarland N，Andersen DC，Battersby JE，Champion KM.Biotechnol Bioeng.2004Mar5；85（5）:463-74）描述了通过扩增基因的上游和下游区且将这些一起连接到包含选择标记和sprW174R突变的载体上，构建携带prc（Tsp）和另一种蛋白酶DegP的不同组合的大肠杆菌菌株（大肠埃希杆菌的周质中重组抗体片段的高水平累积需要三重突变型（ΔDegPΔprc sprW174R）宿主菌株。
spr蛋白质的野生型氨基酸序列显示于在N末端上具有信号序列的SEQ ID NO:13，和不含26个氨基酸的信号序列的SEQ ID NO:14中（根据UniProt登记号P0AFV4）。在本发明中的spr蛋白质序列的氨基酸编号包括信号序列。相应地，spr蛋白质的氨基酸1是SEQ ID NO:13中所示的第一个氨基酸（Met）。
在进一步的实施方案中，细胞包含突变的spr基因。编码spr蛋白质的突变型spr基因可以具有在选自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147、H157和W174的一个或多个氨基酸处的突变。优选地，突变型spr基因编码具有在选自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147和H157的一个或多个氨基酸处的突变spr蛋白质。优选地，突变型spr基因编码具有在选自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的一个或多个氨基酸处的突变spr蛋白质。spr突变能够抑制包含突变Tsp基因的细胞的生长表型。
氨基酸C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147、H157和W174中的一个或多个可以突变为任何合适的氨基酸，其导致能够抑制包含突变Tsp基因的细胞表型的spr蛋白质。例如，S95、V98、Y115、D133和V135中的一个或多个可以突变为小氨基酸例如Gly或Ala。在优选实施方案中，spr蛋白质包含下述突变中的一个或多个：C94A、S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D或G、H145A、G147C和H157A。
在进一步实施方案中，突变的spr基因编码具有突变W174R的spr蛋白质。在备选实施方案中，spr蛋白质不具有突变W174R。
关于本文的置换突变型的指名由字母随后为数字随后为字母组成。第一个字母指定野生型蛋白质中的氨基酸。数字指在其中进行氨基酸置换的氨基酸位置，并且第二个字母指定用于替换野生型氨基酸的氨基酸。
相应地，在优选实施方案中，在本发明中使用的细胞包含编码DsbC的重组多核苷酸和突变的spr基因，如上所述。
在进一步优选实施方案中，与，在本发明中使用的细胞具有野生型细胞相比较降低的Tsp蛋白质活性，并且包含编码DsbC的重组多核苷酸和突变的spr基因，如上所述。
在一个实施方案中，宿主细胞包含编码具有伴侣蛋白活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白质的突变DegP基因和/或突变ptr基因，其中所述突变ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白质，或是敲除突变的ptr基因和/或突变的OmpT基因，其中所述突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质或是敲除突变的OmpT基因。
在一个实施方案中，宿主细胞表达如下一种或多种蛋白质：
·能够促进蛋白质折叠的一种或多种蛋白质，例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD；和/或
·能够促进蛋白质分泌或易位的一种或多种蛋白质，例如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY和Lep；和/或
·能够促进二硫键形成的一种或多种蛋白质，例如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。
上述蛋白质中的一种或多种可以整合到细胞的基因组内和/或插入表达载体中。
在一个实施方案中，宿主细胞不包含编码下述蛋白质中的一种或多种的重组多核苷酸：
·能够促进蛋白质折叠的一种或多种蛋白质，例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD；
·能够促进蛋白质分泌或易位的一种或多种蛋白质，例如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY和Lep；和
·能够促进二硫键形成的一种或多种蛋白质，例如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。
在一个实施方案中，在本发明中使用的细胞与野生型细胞相比较具有降低的Tsp蛋白质活性，并且如上所述包含编码DsbC的重组多核苷酸和突变的spr基因，如上所述包含编码DsbC的重组多核苷酸和突变的spr基因，以及FkpA和/或Skp。
使用本发明的方法产生的重组蛋白质一般在大肠杆菌宿主细胞的周质或宿主细胞培养物上清液中表达，取决于蛋白质的性质和生产规模。用于将蛋白质靶向这些区室的方法是本领域众所周知的，关于综述参见Makrides，Microbiological Reviews，1996，60，512-538。将蛋白质导向大肠杆菌的周质的合适信号序列的例子包括大肠杆菌PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信号序列。蛋白质可以通过依赖天然分泌途径或通过诱导外膜的有限渗漏来靶向上清液，以引起蛋白质分泌，其例子是使用pelB前导区、蛋白A前导区、细菌素释放蛋白质的共表达、丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白质连同甘氨酸加入培养基中、和kil基因的共表达用于膜渗透化。最优选地，在本发明的方法中，重组蛋白质在宿主大肠杆菌的周质中表达。
重组蛋白质在大肠杆菌宿主细胞中的表达也可以处于可诱导系统的控制下，由此重组蛋白质在大肠杆菌中的表达处于诱导型启动子的控制下。适合于在大肠杆菌中使用的许多诱导型启动子是本领域众所周知的，并且取决于启动子，重组蛋白质的表达可以通过不同因素例如生长培养基中的温度和特定物质的浓度进行诱导（Baneyx，Current Opinionin Biotechnology，1999，10:411-421；Goldstein和Doi，1995，Biotechnol.Annu.Rev，105-128）。诱导型启动子的例子包括大肠杆菌lac、tac和trc启动子，其可用乳糖或无法水解的乳糖类似物异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导，以及phoA、trp和araBAD启动子，其分别通过磷酸盐、色氨酸和L-阿拉伯糖诱导。表达可以通过例如诱导物的添加或当诱导是温度依赖性时温度中的改变进行诱导。当重组蛋白质表达的诱导通过将诱导物加入培养物达到时，诱导物可以通过任何合适方法加入，取决于发酵系统和诱导物，例如通过单次或多次发射添加（shot addition）或通过诱导物经过补料的逐步添加。应当理解在诱导物的添加和蛋白质表达的实际诱导之间可以存在延迟，例如当诱导物是乳糖时，在蛋白质表达的诱导发生前可以存在延迟，而任何预先存在的碳源在乳糖前利用。
大肠杆菌宿主细胞培养物（发酵）可以在任何培养基中培养，所述培养基将支持大肠杆菌的生长和重组蛋白质的表达。培养基可以是任何化学成分确定的培养基，例如Pirt S.J.（1975）Principles of Microbe andCell Cultivation，Blackwell Scientific Publications中提供的那些，具有如本文描述的合适时控制生长率的修饰。合适培养基的例子是如由Humphreys等人，2002，Protein Expression and Purification，26:309-320描述的‘SM6E’。
大肠杆菌宿主细胞的培养可以在任何合适的容器例如摇瓶或发酵罐中发生，取决于所需生产规模。多种大规模发酵罐是可获得的，具有超过1,000升直到约100,000升的容量。优选地，使用1,000-50,000升的发酵罐，更优选1,000-10,000或12,000升。还可以使用具有在0.5-1,000升之间的容量的更小规模发酵罐。
大肠杆菌的发酵可以在任何合适的系统中执行，例如连续、分批或补料分批模式（Thiry & Cingolani，2002，Trends in Biotechnology，20:103-105），取决于所需蛋白质和得率。当需要营养物或诱导物的发射添加时，可以使用分批模式。可替代地，可以使用补料分批培养，并且以最大特定生长率（其可以使用最初存在于发酵罐中的营养物维持）以分批模式预诱导生长的培养物和一种或多种营养素补料方案用于控制生长率直至发酵完成时。补料分批模式也可以使用预诱导，以控制大肠杆菌宿主细胞的代谢且允许达到更高的细胞密度（Lee，1996，Tibtech，14:98-105）。
需要时，可以对宿主细胞实施来自发酵培养基的收集，例如宿主细胞可以通过离心、过滤或通过浓缩从样品中收集。特别地，本发明的方法适合于具有治疗质量的抗体的大规模工业制造。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括在培养步骤后的离心步骤，随后为通过加入提取缓冲液的细胞悬浮。
在培养步骤后，该方法可以包括提取步骤，以从宿主细胞中释放重组蛋白质。提取可以通过任何合适的方法执行，例如通过机械或压力处理的细胞裂解、冻融处理、渗透休克、提取剂或热处理。此类提取方法是本领域众所周知的。
在优选实施方案中，将提取缓冲液加入样品中，并且随后对样品实施热处理步骤。热处理步骤优选如US5,665,866（其内容通过引用合并入本文）中详细描述的。通过促进其他抗体有关材料的去除，热处理步骤使得能够获得可溶、正确折叠且装配的抗体的样品。“正确折叠且装配的”抗体通过单个条带的存在显示，所述单个条带对应于关于装配的重链和轻链在非还原SDS PAGE上的预期分子量。其他抗体有关材料一般不含重链和轻链或其部分、正确折叠且装配的抗体的部分降解片段。
热处理步骤通过对样品实施所需升高温度来执行。最优选地，热处理步骤在30℃-70℃的范围内执行。温度可以根据需要选择，并且可以取决于用于纯化的蛋白质的稳定性。在另一个实施方案中，温度在范围40℃-65℃内，或优选在范围40℃-60℃内，更优选在范围45℃-60℃内，甚至更优选在范围50℃-60℃内，且最优选在55℃-60℃、58℃-60℃或59℃。因此，最低温度是30℃、35℃或40℃，并且最高温度是60℃、65℃或70℃。
热处理步骤优选执行延长时间段。热处理的长度优选在1-24小时之间、更优选在4-18小时之间、甚至更优选在6-16小时之间且最优选在10-14小时之间或在10-12小时之间，例如12小时。因此，热处理的最少时间是1、2或3小时，并且最大值是20、22或24小时。
在特定实施方案中，热处理在50℃-60℃执行10-16小时，且更优选在59℃执行10-12小时。本领域技术人员应当理解温度和时间可以选择为适合所讨论的样品和待生产的蛋白质的特征。
在提取步骤后，在调节pH的步骤前，可以对样品实施离心和/或过滤步骤。
实施本发明的步骤a）的样品是宿主细胞样品或其提取物。相应地，步骤a）可以例如对下述执行：
·包含表达重组蛋白质和重组二硫化物异构酶的宿主细胞群体的溶液；
·在离心和/或过滤以去除宿主细胞后，表达重组蛋白质和重组二硫化物异构酶的宿主细胞群体的上清液；
·在提取步骤例如热处理后，表达重组蛋白质和重组二硫化物异构酶的宿主细胞群体的提取物；或
·在提取步骤例如热处理，和一个或多个后续离心和/或过滤步骤后，表达重组蛋白质和重组二硫化物异构酶的宿主细胞群体的提取物。
在步骤a）前，宿主细胞溶液或其提取物处于合适pH，一般地宿主细胞溶液或其提取物的pH是pH5-10，优选pH6-8或约pH7。在步骤a）前，宿主细胞溶液或其提取物的pH可以取决于目的重组蛋白质的pI。如果pH调节至或超过蛋白质的pI，那么蛋白质可以具有沉淀的趋势。因此，在pH调节步骤前，溶液的pH低于重组蛋白质的pI是优选的，以确保pH调节步骤不使溶液的pH达到或超过重组蛋白质的pI。例如，如果重组蛋白质的pI是约8，那么溶液的pH优选小于pH8，以便使重组蛋白质的沉淀最小化。使pH下降至小于pH5的步骤也优选避免重组蛋白质的pI。
蛋白质的pI将取决于它在其中的溶液的离子强度。相应地，蛋白质在水或极低离子强度缓冲液中的计算的pI可能不同于蛋白质在包含缓冲液和HCP的宿主细胞样品或其提取物中的pI。蛋白质的pI可以比蛋白质在水或极低离子强度缓冲液中的测量pI低1、1.5或2个pH单位。因此，宿主细胞溶液或其提取物的pH优选维持在比目的重组蛋白质在水或极低离子强度缓冲液中测量的pI低1、1.5或2个pH单位的pH。
在根据本发明的方法的步骤b）中，沉淀的重组二硫化物异构酶与重组蛋白质分离，以产生重组蛋白质样品。步骤b）一般包括离心和/或过滤，以便分离沉淀的重组二硫化物异构酶。
与步骤a）前重组二硫化物异构酶的数量相比较，所得到的重组蛋白质样品具有减少数量的重组二硫化物异构酶。优选地，在步骤b）后的重组蛋白质样品基本上不含重组二硫化物异构酶。然而，一些重组二硫化物异构酶保留在样品中是可能的，其可以通过以后的纯化步骤去除。技术人员可以使用本领域众所周知的方法确定重组二硫化物异构酶是否仍存在于重组蛋白质样品中。例如，ELISA分析可以用于检测重组二硫化物异构酶，例如DsbC。可以使用对于重组二硫化物异构酶例如DsbC特异性的抗体，或如果重组二硫化物异构酶是加his-标签的，例如DsbC-his-标签，那么抗His-标签抗体可以用于检测重组二硫化物异构酶。
如本文采用的基本上不含意指含有5%w/w或更少，例如4、3、2、1或0.5%w/w或更少。
在一个实施方案中，当宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH3或更低（例如pH3）时，宿主细胞蛋白质二肽结合蛋白（也称为“DBP”）沉淀且在步骤b）中与重组蛋白质分离。在这个实施方案中，所得到的重组蛋白质样品也具有减少数量的宿主细胞二肽结合蛋白（DBP）。优选地，所得到的重组蛋白质样品基本上不含DBP。
优选地，所得到的重组蛋白质样品也具有减少数量的其他宿主细胞蛋白质，其也可以在步骤a）过程中沉淀。优选地，所得到的重组蛋白质样品基本上不含其他宿主细胞蛋白质。
在本发明的步骤a）和b）后，目的重组蛋白质的得率一般是75%或更多、80%或更多、85%或更多或90%或更多。
在步骤b）后，重组蛋白质样品的pH可以调节至合适pH用于贮存重组蛋白质或用于执行下游纯化步骤，例如色谱法。如先前讨论的，通过确保pH不在重组蛋白质的pI，溶液的pH可以调节为使目的重组蛋白质的沉淀降到最小化。优选地，重组蛋白质样品的pH调节至pH5–7、更优选pH5-6。所需确切pH将取决于重组蛋白质的性质，包括蛋白质的pI，以及将执行何种下游纯化步骤。任何合适的试剂都可以用于调节重组蛋白质样品的pH，例如选自NaOH、乙酸钠或Tris碱的碱。
备选地，该方法在不包括步骤b）后的pH调整步骤。在这个实施方案中，重组蛋白质样品的pH可以适合于重组蛋白质的贮存和/或一个或多个后续下游纯化步骤。在一个实施方案中，在步骤a）中，宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH4.5，步骤b）包括离心和过滤，并且随后对步骤b）后所得到的重组蛋白质溶液实施在pH4.5的阳离子交换色谱法步骤。
备选地，色谱法步骤可以在较高pH执行，例如pH或以上，例如5–8，特别是6或7。
在步骤b）后，可以对重组蛋白质样品实施一个或多个进一步纯化步骤，以便去除污染物和/或不需要的蛋白质片段例如抗体片段。一般地，对重组蛋白质样品实施一个或多个色谱法步骤，其中每个色谱法步骤可以随后为过滤步骤，例如微量过滤、渗滤或超滤。一个或多个色谱法步骤可以是亲和或非亲和色谱法步骤。在一个实施方案中，色谱法是非亲和色谱法步骤，例如阳离子或阴离子离子交换色谱法。
在一个实施方案中，在步骤a）中，宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH4.5，步骤b）包括离心和过滤，并且随后对步骤b）后所得到的重组蛋白质溶液实施在pH4.5的阳离子交换色谱法步骤。
当非亲和色谱法步骤用于下游纯化中时，本发明的方法是特别有利的。这是因为大量宿主细胞蛋白质包括重组二硫化物异构酶可以与色谱柱结合，如果它们先前未分离。相应地，色谱柱结合所需重组蛋白质的能力减少。宿主细胞蛋白质包括重组二硫化物异构酶的分离增加后续非亲和色谱柱的能力，其提供用于纯化重组蛋白质的更快速和更便宜的方法。
在本发明的步骤a）过程中，重组蛋白质可以是部分解折叠的，而溶液保持在pH5或更低。然而，蛋白质的部分解折叠是可逆的，并且在沉淀的二硫化物异构酶分离后，蛋白质溶液的pH可以调节至超过5的pH，优选pH5–7或pH5-6，并且蛋白质随后可以采用其原始折叠构象。因此，总体上，低pH保持步骤提供相对温和的条件用于去除杂质，具有最低限度长期后果。通过本发明的方法提供的重组蛋白质样品包含显著比例的功能蛋白质。
由宿主细胞表达的目的重组蛋白质优选具有6或更高的pI，更优选7或更高的pI。如先前讨论的，如果蛋白质具有6或更高的pI，那么通过使样品的pH维持低于蛋白质的pI，优选低于蛋白质在水或极低离子强度缓冲液中的pI1、1.5或2个pH单位，更容易使蛋白质的沉淀最小化，并且将样品的pH调节至pH5或更低的步骤不将溶液的pH调节至蛋白质的pI。
目的重组蛋白质优选是重组抗体。重组抗体优选具有pI6-10、7-10、6-9、7-9、8-9、6、7、8或9。在步骤a）之前、过程中和之后，样品的pH优选维持低于重组抗体的pI，更优选低于重组抗体pI1、1.5或2个pH单位，以便确保抗体的最小限度沉淀。
在优选实施方案中，重组抗体具有pI7-9，并且在步骤a）中，将样品的pH调节至pH3-4.5，更优选pH4.5。
重组抗体的具体例子是如本文和WO01/094585中描述的抗TNFFab’CDP870，其具有pI8。
在一个实施方案中，重组蛋白质或其结合片段是抗TNF Fab’CDP870。
如本文使用的，‘功能抗体’包括保留特异性识别或结合它们所针对产生的抗原（同源抗原）的能力的抗体分子，所述抗原即是针对其是特异性的抗原。功能抗体的生产通过在非还原SDS-PAGE上对应于抗体预期分子量的单个条带的存在，或通过使用BIAcore或本领域技术人员已知的其他方法例如但不限于ELISA的直接结合测定显示。非功能抗体包括不识别其同源抗原的片段，并且包括不正确折叠或不正确装配的抗体、游离重链和轻链及其片段，包括部分降解的抗体片段，其不识别或结合其同源抗原。
抗体的结合片段是能够结合抗体对于其是特异性的抗原的片段。
在优选例子中，重组抗体分子是至少部分抗体轻链和至少部分抗体重链，从而使得所表达的轻链和重链抗体分子中的至少一些能够组合以形成功能抗体。
如本文使用的，‘抗体’包括具有全长重链和轻链的抗体；其功能活性片段、结合片段、衍生物或类似物，并且可以是但不限于VH、VL、VHH、Fab、经修饰的Fab、改变的铰链Fab、Fab’、F（ab’）2或Fv片段；轻链或重链单体或二聚体；单链抗体，例如其中重链和轻链可变结构域通过肽接头连接的单链Fv，Fab-Fv，或双重特异性抗体，例如Fab-dAb，如PCT/GB2008/003331中所述的。
抗体可以是多克隆、单克隆、二、三或四价抗体，人源化或嵌合抗体。这些抗体及其片段可以是天然存在、人源化、嵌合或CDR移植的抗体，并且标准分子生物学技术可以根据需要用于修饰、添加或缺失氨基酸或结构域。人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区（CDR）和来自人免疫球蛋白分子的构架区（参见例如US5,585,089）。使用本发明的方法纯化的抗体分子可以具有免疫球蛋白分子的任何种类（例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA）或亚类。
用于产生这些抗体分子的方法是本领域众所周知的（参见例如，Shrader等人，WO92/02551；Ward等人，1989，Nature，341:544；Orlandi等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86:3833；Riechmann等人，1988，Nature，322:323；Bird等人，1988，Science，242:423；Queen等人，US5,585,089；Adair，WO91/09967；Mountain和Adair，1992，Biotechnol.Genet.Eng.Rev，10:1-142；Verma等人，1998，Journalof Immunological Methods，216:165-181）。
单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法制备，例如杂交瘤技术（Kohler & Milstein，1975，Nature，256:495-497）、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术（Kozbor等人，1983，Immunology Today，4:72）和EBV-杂交瘤技术（Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，第77-96页，Alan R Liss，Inc.，1985）。
嵌合抗体是由免疫球蛋白基因编码的那些抗体，所述免疫球蛋白基因已经遗传改造，从而使得轻链和重链基因由属于不同物种的免疫球蛋白基因区段组成。这些嵌合抗体可能是较少抗原性的。二价抗体可以通过本领域已知的方法制备（Milstein等人，1983，Nature305:537-539；WO93/08829，Traunecker等人，1991，EMBO J.10:3655-3659）。二、三和四价抗体可以包含多重特异性或可以是单特异性的（参见例如WO92/22853）。
抗体序列还可以使用单一淋巴细胞抗体方法生成，基于由单一淋巴细胞生成的免疫球蛋白可变区cDNA的分子克隆和表达，所述单一淋巴细胞选择用于特异性抗体的产生，如由Babcook，J.等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93（15）:7843-7848和WO92/02551中所述的。后面的方法依赖个别抗体生产细胞的分离，其随后克隆扩增然后筛选产生识别其同源抗原的抗体的那些克隆，和需要时，其可变重（VH）和轻（VL）链基因的序列的后续鉴定。备选地，产生识别其同源抗原的抗体的细胞可以一起培养，随后为筛选。
抗体可以是对于任何靶抗原特异性的。抗原可以是细胞相关蛋白质，例如在细胞例如细菌细胞、酵母细胞、T细胞、内皮细胞或肿瘤细胞上的细胞表面蛋白质，或它可以是可溶性蛋白质。目的抗原也可以是任何医学有关蛋白质例如在疾病或感染过程中上调的那些蛋白质，例如受体和/或其对应配体。细胞表面蛋白质的特定例子包括粘附分子，例如整联蛋白例如β1整联蛋白，例如VLA-4、E-选择素、P选择素或L-选择素、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD134（OX40）、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、CSF1或CSF1-受体、DPCR1、DPCR1、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、连接素样2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胚抗原（CEA）、人乳脂球蛋白（HMFG1和2）、MHC I类和MHC II类抗原、KDR和VEGF、PD-1、DC-SIGN、TL1A、IL-7受体A，和合适时其受体。
可溶性抗原包括白细胞介素例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-14、IL-16或IL-17，例如IL17A和/或IL17F，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原，免疫球蛋白例如IgE，干扰素例如干扰素α、干扰素β或干扰素γ，肿瘤坏死因子TNF（以前称为肿瘤坏死因子-α且在本文中称为TNF或TNFα），肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF，以及血小板衍生的生长因子例如PDGF-α和PDGF-β、WISP-1，和合适时其受体。其他抗原包括细菌细胞表面抗原，细菌毒素，病毒例如流感、EBV、HepA、B和C，生物恐怖剂，放射性核素和重金属，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。
在一个实施方案中，抗体可以用于功能上改变目的抗原的活性。例如，抗体可以直接或间接中和、拮抗或激动所述抗原的活性。
在优选实施方案中，抗体是抗TNF抗体，更优选如WO01/094585（其内容通过引用合并入本文）中所述的抗TNF Fab’CDP870。
在一个实施方案中，对于人TNFα具有特异性的抗体包含重链，其中可变结构域包含对于CDRH1具有SEQ ID NO:1所示序列、对于CDRH2具有SEQ ID NO:2所示序列、或对于CDRH3具有SEQ IDNO:3所示序列的CDR。
在一个实施方案中，抗体包含轻链，其中可变结构域包含对于CDRL1具有SEQ ID NO:4所示序列、对于CDRL2具有SEQ ID NO:5所示序列、或对于CDRL3具有SEQ ID NO:6所示序列的CDR。
在一个实施方案中，抗体包含重链，其中可变结构域包含对于CDRH1具有SEQ ID NO:1所示序列、对于CDRH2具有SEQ ID NO:2所示序列、或对于CDRH3具有SEQ ID NO:3所示序列的CDR，和轻链，其中可变结构域包含对于CDRL1具有SEQ ID NO:4所示序列、对于CDRL2具有SEQ ID NO:5所示序列、或对于CDRL3具有SEQ IDNO:6所示序列的CDR。
在一个实施方案中，抗体包含对于CDRH1的SEQ ID NO:1、对于CDRH2的SEQ ID NO:2、对于CDRH3的SEQ ID NO:3、对于CDRL1的SEQ ID NO:4、对于CDRL2的SEQ ID NO:5和对于CDRL3的SEQID NO:6。
抗体优选是CDR移植的抗体分子且一般地可变结构域包含人受体构架区和非人供体CDR。
优选地，抗体包含轻链可变结构域CDP870（SEQ ID NO:7）和重链可变结构域CDP870（SEQ ID NO:8）。
优选抗体是经修饰的Fab片段，其中所述修饰是对其重链的C末端添加一个或多个氨基酸，以允许效应分子或报道分子的附着。优选地，另外的氨基酸形成含有一个或两个半胱氨酸残基的经修饰的铰链区，效应分子或报道分子可以与所述半胱氨酸附着。此类经修饰的Fab片段优选具有包含作为SEQ ID NO:10给出的序列或由作为SEQ ID NO:10给出的序列组成的重链，和包含作为SEQ ID NO:9给出的序列或由作为SEQ ID NO:9给出的序列组成的轻链。
在本发明中使用的宿主细胞包含编码抗体的DNA序列。优选地，DNA序列编码抗体的重链和轻链。
在一个优选实施方案中，DNA序列编码轻链且包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中所示的序列（CDP870）或其简并等价物。
在备选优选实施方案中，DNA序列编码重链且包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中所示的序列（CDP870）或其简并等价物。
DNA序列可以包含例如通过化学加工产生的合成DNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。
如果存在的话，抗体的恒定区结构域可以就抗体分子的所提议功能且特别是可能需要的效应子功能而言进行选择。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，当抗体分子预期用于治疗用途且需要抗体效应子功能时，可以使用人IgG恒定区结构域，尤其是IgG1和IgG3同种型。备选地，当抗体分子预期用于治疗用途且不需要抗体效应子功能时，例如仅用于阻断TNFα活性，可以使用IgG2和IgG4同种型。
用于表达重组蛋白质的方法是本领域众所周知的。用于表达重组抗体分子的宿主细胞的合适例子包括细菌例如革兰氏阳性或革兰氏阴性菌例如大肠杆菌，或酵母细胞例如酿酒酵母（S.cerevisiae），或哺乳动物细胞例如CHO细胞，和骨髓瘤或杂交瘤细胞系例如NSO细胞。最优选地，在本发明的方法中，重组抗体在细菌例如大肠杆菌中产生（参见Verma等人，1988，J.Immunol.Methods216:165-181；Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods263:133-147）。
在表达后，抗体可以例如通过缀合至另一个实体例如效应分子进一步加工。相应地，根据本发明的方法可以包含使效应分子与抗体附着的进一步步骤。
如本文使用的术语效应分子包括例如抗肿瘤药，药物，毒素（例如细菌或植物起源的酶促活性的毒素及其片段，例如蓖麻蛋白及其片段），生物学活性蛋白质例如酶、其他抗体或抗体片段，合成或天然存在的聚合物，核酸及其片段例如DNA、RNA及其片段，放射性核素、特别是放射性碘、放射性同位素，螯合金属，纳米颗粒和报道基团例如荧光化合物或可以通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。效应分子可以通过任何合适方法与抗体或其片段附着，例如抗体片段可以进行修饰，以附着至少一种效应分子，如WO05/003171或WO05/003170（其内容通过引用合并入本文）中所述的。WO05/003171或WO05/003170还描述了合适的效应分子。
抗体可以具有用于螯合重金属原子的大环，或通过共价桥接结构与之附着的毒素例如蓖麻蛋白。备选地，重组DNA技术的程序可以用于产生抗体分子，其中完全免疫球蛋白分子的Fc片段（CH2、CH3和铰链结构域）、CH2和CH3结构域或CH3结构域已替换为功能非免疫球蛋白蛋白质例如酶或毒素分子，或已通过肽连接与之附着。在其中抗体是在其重链的C末端上具有一个或多个氨基酸（以允许效应或报道分子附着）的经修饰的Fab片段的实施方案中，另外的氨基酸优选形成含有一个或两个半胱氨酸残基的经修饰的铰链区，效应分子或报道分子可以与所述半胱氨酸附着。
优选的效应基团是聚合物分子，其可以与经修饰的Fab片段附着，以增加其体内半衰期。
一般而言，聚合物分子可以是合成或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚烷撑、聚亚烯基（polyalkenylene）或聚氧化烯聚合物或分支或未分支的多糖，例如同多糖或杂多糖。
可以存在于上述合成聚合物上的特定任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。合成聚合物的特定例子包括任选取代的直链或支链聚（乙二醇）、聚（丙二醇）、聚（乙烯醇）或其衍生物，尤其是任选取代的聚（乙二醇），例如甲氧基聚（乙二醇）或其衍生物。特别的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、右旋糖酐、糖原或其衍生物。如本文使用的“衍生物”预期包括反应性衍生物，例如硫醇选择的反应基团例如马来酰亚胺等。反应基团可以直接或通过接头区段与聚合物连接。应当理解此类基团的残基在一些情况下构成产物的部分，作为在抗体片段和聚合物之间的连接基团。
聚合物的大小可以根据需要改变，但一般在500Da-50,000Da、优选5000-40,000Da且更优选25,000-40,000Da的平均分子量范围中。聚合物大小可以特别基于产物的预期用途进行选择。因此，例如，当产物预期离开循环且渗透组织例如用于在肿瘤治疗中使用时，使用例如具有约5,000Da的分子量的小分子量聚合物可以是有利的。对于其中产物保留在循环中的应用，使用例如具有在25,000Da-40,000Da的范围中的分子量的更高分子量聚合物可以是有利的。
特别优选的聚合物包括聚烷撑聚合物，例如聚（乙二醇）或尤其是甲氧基聚（乙二醇）或其衍生物，且尤其是具有在约25,000Da-约40,000Da的范围中的分子量。
与经修饰的抗体片段附着的每个聚合物分子可以共价连接至位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价连接将一般是二硫键或特别是硫-碳键。
当需要时，抗体片段可以具有与之附着的一个或多个效应分子或报道分子。效应分子或报道分子可以通过位于片段中的任何可获得的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团与抗体片段附着，例如任何游离氨基、亚氨基、羟基或羧基。一个或多个效应分子或报道分子可以附着至在抗体重链和/或轻链的C末端或朝向C末端的氨基酸。
活化聚合物可以用作如上所述的聚合物修饰的抗体片段制备中的原材料。活化聚合物可以是含有硫醇反应基团例如α-卤代羧酸或酯的任何聚合物，例如碘乙酰胺、酰亚胺例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物。此类原材料可以是商购获得的（例如由Shearwater Polymers Inc.，Huntsville，AL，USA），或可以使用常规化学程序由商购可得的原材料制备。
关于附着聚（乙二醇）（PEG）部分，参考“Poly（ethyleneglycol）Chemistry，Biotechnical and Biomedical Applications”，1992，J.MiltonHarris（编辑），Plenum Press，New York，“Poly（ethyleneglycol）Chemistry and Biological Applications”，1997，J.Milton Harris and S.Zalipsky（编辑），American Chemical Society，Washington DC and“Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the BiomedicalSciences”，1998，M.Aslam and A.Dent，Grove Publishers，New York。
当希望获得连接至效应分子或报道分子的抗体片段时，这可以通过标准化学或重组DNA程序制备，其中适当时在与活化聚合物反应前或后，抗体片段直接或经由偶联剂连接至效应分子或报道分子。特定化学程序包括例如WO93/62331、WO92/22583、WO90,195和WO89/1476中所述的那些。备选地，当效应分子或报道分子是蛋白质或多肽时，连接可以使用重组DNA程序达到，例如如WO86/01533和EP-A-0392745中所述的。
优选地，通过本发明的方法提供的经修饰的Fab片段是根据公开于EP-A-0948544中的方法PEG化的（即具有与之共价附着的PEG（聚（乙二醇））。优选地，抗体是如图9中所示PEG化的经修饰的Fab片段。如图2中所示，经修饰的Fab片段已使赖氨酰-马来酰亚胺-衍生基团与在重链的经修饰的铰链区的C末端上的半胱氨酸残基之一附着，其中赖氨酰残基的两个氨基各自具有与之共价连接的具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚（乙二醇）残基，从而使得甲氧基聚（乙二醇）残基的总平均分子量是约40,000Da，更优选地赖氨酰-马来酰亚胺-衍生基团是[1-[[[2-[[3-（2,5-二氧代-1-吡咯烷基）-1-氧代丙基]氨基]乙基]氨基]-羰基]-1,5-戊烷二基（pentanediyl）]双（亚氨基羰基）。赖氨酸残基共价连接至马来酰亚胺基团。向赖氨酸残基上的氨基各自附着具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚（乙二醇）聚合物。整个效应分子的总分子量因此是约40,000Da。
相应地，根据本发明的方法优选包含使赖氨酰-马来酰亚胺基团与在重链的C末端上的半胱氨酸残基之一附着，其中赖氨酰残基的每个氨基具有与之共价连接的具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚（乙二醇）残基。
优选地，在图9中所示的化合物中，抗体部分的重链具有作为SEQID NO:10给出的序列，并且轻链具有在SEQ ID NO:9所示的序列。这种化合物在本文中称为CDP870。
本发明的每个实施方案的优选特征关于其他实施方案各自已作必要的修正。本说明书中引用的所有出版物包括但不限于专利和专利申请通过引用合并入本文，如同每个个别出版物特别且个别指出通过引用合并入本文，好像完全阐述一样。
本公开内容明确公开包含特定整体组合的实施方案。本公开内容还延伸至由所述整体组合组成或基本上由所述整体组合组成的实施方案。
参数选择和/或实施方案可以如技术上可行的组合。
本发明现在将就下述实施例而言进行描述，所述实施例仅是举例说明性的且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：表达重组DsbC和重组抗体的宿主细胞系的生成
对于所有实验，大肠杆菌细胞系W3110用作亲本野生型细胞系。
产生携带下述突变的细胞系：
a.突变的Tsp基因；
b.突变的Tsp基因且携带重组DsbC；
c.突变的Tsp基因和突变的spr基因；
d.突变的Tsp基因和突变的spr基因且携带重组DsbC。
携带突变的Tsp基因MXE001(ΔTsp）的细胞系的生成
MXE001菌株如下生成：
Tsp盒作为Sal I，Not I限制片段移动到类似限制的pKO3质粒内。pKO3质粒使用pSC101复制起点（RepA）的温度敏感突变株连同氯霉素标记，以强迫且选择染色体整合事件。编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因对于在蔗糖上生长的大肠杆菌是致命的，并且因此（连同氯霉素标记和pSC101起点一起）用于强迫且选择去整合和质粒消除事件。这种方法先前已得到描述（Hamilton等人，1989，Journal of Bacteriology，171，4617-4622和Blomfield等人，1991，Molecular Microbiology，5，1447-1457）。pKO3系统去除除了整合基因外的来自宿主基因组的所有选择标记。
构建下述质粒。
pMXE191包含如SEQ ID NO:15中所示的敲除突变的Tsp基因，包含EcoR I和Ase I限制标记。
随后将质粒转化到电转感受态大肠杆菌W3110细胞内，所述W3110细胞使用Miller，E.M.和Nickoloff，J.A.，“Escherichia colielectrotransformation,”in Methods in Molecular Biology，第47卷，Nickoloff，J.A.（编辑），Humana Press，Totowa，NJ，105（1995）中发现的方法制备。
第1天，在以2500V、25μF和200Ω电穿孔前，在冷冻的BioRad0.2cm电穿孔小杯中，将40μl大肠杆菌细胞与（10pg）1μl pKO3DNA混合。立即加入1000μl2xPY，并且通过以250rpm在温箱中在30℃振荡1小时回收细胞。在将100μl等分试样铺平板到在30℃和43℃预温的含有以20μg/ml氯霉素的2xPY琼脂平板上之前，将细胞1/10连续稀释到2xPY中。将平板在30℃和43℃温育过夜。
第2天，在30℃生长的菌落数目给出电穿孔效率的估计，而在43℃存活生长的菌落代表潜在的整合事件。挑取来自43℃平板的单个菌落且重悬浮于10ml2xPY中。将100μl这个铺平板到预温至30℃含有5%（w/v）蔗糖的2xPY琼脂平板上，以生成单个菌落。将平板在30℃温育过夜。
第3天，菌落在此处代表潜在的同时去整合和质粒消除事件。如果去整合和消除事件在生长早期发生，那么大量菌落团块将是克隆的。挑取单个菌落且重复铺平板到含有以20μg/ml氯霉素或5%（w/v）蔗糖的2xPY琼脂上。将平板在30℃温育过夜。
第4天，在蔗糖上生长且在氯霉素上死亡的菌落代表潜在的染色体替换和质粒消除事件。挑取这些且通过用突变特异性寡核苷酸的PCR筛选。将生成正确大小的阳性PCR条带菌落划线培养，以产生在含有5%（w/v）蔗糖的2xPY琼脂上的单个菌落，并且将平板在30℃温育过夜。
第5天，PCR阳性、氯霉素敏感和蔗糖抗性的大肠杆菌的单个菌落用于制备甘油原种，化学感受态细胞，且充当PCR模板用于用5’和3’侧翼寡核苷酸的PCR反应，以生成PCR产物用于使用Taq聚合酶的直接DNA测序。
通过使用寡核苷酸引物PCR扩增包含非天然存在的Ase I限制位点的Tsp基因区域，测试细胞株MXE001以证实携带突变的Tsp基因的基因组DNA的成功修饰。随后在与Ase I限制性酶温育前和后，通过凝胶电泳分析DNA的扩增区，以证实在突变基因中非天然存在的Ase I限制位点的存在。
通过使单个细胞菌落在95℃在20ul1x PCR缓冲液中加热10分钟制备裂解产物。允许混合物冷却至室温，随后以13,200rpm离心10分钟。取出上清液且标记为‘细胞裂解产物’。
使用Tsp寡核苷酸对扩增每个株。
使用标准PCR程序扩增DNA。
Figure BDA00002774970700301
PCR循环。
Figure BDA00002774970700311
一旦反应完成，就取出25ul至新离心管用于由Ase I消化。向25ulPCR反应中加入19ul H2O、5ul缓冲液3（NEB）、1ul Ase I（NEB），混合且在37℃温育2小时。
向剩余PCR反应中，加入5ul加样缓冲液（x6），且将20ul装载到0.8%TAE琼脂糖凝胶（Invitrogen）加溴化乙啶（5ul10mg/ml原液）上，且以100伏特运行1小时。将10ul大小标记（Perfect DNA标记0.1-12Kb，Novagen）装载到最后一个泳道中。
一旦Ase I消化完成，就加入10ul加样缓冲液（x6），且将20ul装载到0.8%TAE200ml琼脂糖凝胶（Invitrogen）加上溴化乙啶（5ul10mg/ml原液）上，且以100伏特运行1小时。将10ul大小标记（PerfectDNA标记0.1-12Kb，Novagen）装载到最后一个泳道中。两个凝胶都使用UV透照器（transluminator）显现。
扩增的基因组片段显示对于Tsp2.8Kb的正确大小条带。在用Ase I消化后，这证实在Tsp缺陷株MXE001中但不在W3110对照中所引入的Ase I位点的存在。
MXE001：使用Tsp引物组扩增的基因组DNA和所得到的DNA用Ase I消化，以产生2.2和0.6Kbps条带。
W3110PCR扩增的DNA不通过Ase I限制性酶消化。
携带突变spr基因的细胞系和携带突变Tsp基因和突变spr基因的细胞系的生成
生成spr突变且使用互补测定选择。
使用
Figure BDA00002774970700312
随机诱变多样性PCR试剂盒使spr基因突变，所述试剂盒引入1–2个突变/1000bp。将突变的spr PCR DNA克隆到可诱导的表达载体[pTTO CDP870]内，其表达CDP870Fab’连同spr突变体。随后将这个连接电转化到大肠杆菌菌株MXE001（ΔTsp）内，所述菌株使用在Miller，E.M.和Nickoloff，J.A.，“Escherichia colielectrotransformation,”in Methods in Molecular Biology，第47卷，Nickoloff，J.A.（编辑），Humana Press，Totowa，NJ，105（1995）中发现的方法制备。使用下述方案，将40ul电转感受态MXE001、2.5ul连接（100pg DNA）加入0.2cm电穿孔小杯中，使用BioRad GenepulserXcell用下述条件2500V、25μF和200Ω执行电转化。在电转化后，加入1ml SOC（Invitrogen）（预温至37℃），并且将细胞伴随轻轻搅动在37℃静置1小时以回收。
将细胞铺平板到低渗琼脂（5g/L酵母提取物、2.5g/L胰蛋白胨、15g/L琼脂（都是Difco））上，并且在40℃温育。将形成菌落的细胞在43℃再铺平板到HLB上，以证实在低渗透条件下在高温生长至MXE001菌株的能力的恢复。质粒DNA由所选克隆制备且测序以鉴定spr突变。
使用这种方法，分离在spr蛋白质中的五个单一突变和一个双重突变，其补充如下ΔTsp表型：
1.    V98E
2.    D133A
3.    V135D
4.    V135G
5.    G147C
6.    S95F和Y115F
spr（C94A、H145A、H157A）和W174R在上文鉴定的个别突变和三个催化三联突变用于生成新菌株，使用野生型W3110大肠杆菌菌株（基因型：F-LAM-IN（rrnD-rrnE）1rph1（ATCC编号27325）），以产生来自实施例1的spr突变株或MXE001菌株，以制备组合的ΔTsp/突变型spr菌株。
使用基因替换载体系统生成下述突变型大肠杆菌细胞株，使用pKO3同源重组/替换质粒（Link等人，1997，Journal of Bacteriology，179，6228-6237），如实施例1对于MXE001生成所述的。
表1
突变型大肠杆菌细胞株 基因型 Spr载体
MXE001 ΔTsp -
MXE008 ΔTsp，spr D133A pMXE339，pK03spr D133A（-SalI）
MXE009 ΔTsp，spr H157A pMXE345，pK03spr H157A（-SalI）
MXE010 spr G147C pMXE338，pK03spr G147C（-SalI）
MXE011 spr C94A pMXE343，pK03spr C94A（-SalI）
MXE012 spr H145A pMXE344，pK03spr H145A（-SalI）
MXE013 spr W174R pMXE346，pK03spr W174R（-SalI）
MXE014 ΔTsp，spr V135D pMXE340，pK03spr V135D（-SalI）
MXE015 ΔTsp，spr V98E pMXE342，pK03spr V98E（-SalI）
MXE016 ΔTsp，spr C94A pMXE343，pK03spr C94A（-SalI）
MXE017 ΔTsp，spr H145A pMXE344，pK03spr H145A（-SalI）
MXE018 ΔTsp，spr V135G pMXE341，pK03spr V135G（-SalI）
突变型spt整合盒作为Sal I，Not I限制片段移动到类似限制的pKO3质粒内。
质粒使用pSC101复制起点（RepA）的温度敏感突变株连同氯霉素标记，以强迫且选择染色体整合事件。编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因对于在蔗糖上生长的大肠杆菌是致命的，并且因此（连同氯霉素标记和pSC101起点一起）用于强迫且选择去整合和质粒消除事件。这种方法先前已得到描述（Hamilton等人，1989，Journal of Bacteriology，171，4617-4622和Blomfield等人，1991，Molecular Microbiology，5，1447-1457）。pKO3系统去除除了整合基因外的来自宿主基因组的所有选择标记。
构建下文列出的pK03载体，包含包括在spr序列内的沉默突变的突变spr基因，其去除SalI限制位点用于克隆鉴定。
pMXE336，pK03spr S95F（-SalI）
pMXE337，pK03spr Y115F（-SalI）
pMXE338，pK03spr G147C（-SalI）
pMXE339，pK03spr D133A（-SalI）
pMXE340，pK03spr V135D（-SalI）
pMXE341，pK03spr V135G（-SalI）
pMXE342，pK03spr V98E（-SalI）
pMXE343，pK03spr C94A（-SalI）
pMXE344，pK03spr H145A（-SalI）
pMXE345，pK03spr H157A（-SalI）
pMXE346，pK03spr W174R（-SalI）
随后将这些质粒转化到化学感受态大肠杆菌W3110细胞或来自实施例1的MXE001菌株内，以制备如表1中所示的组合的ΔTsp/突变型spr菌株，所述W3110细胞使用Miller，E.M.和Nickoloff，J.A.，“Escherichia coli electrotransformation,”in Methods in MolecularBiology，第47卷，Nickoloff，J.A.（编辑），Humana Press，Totowa，NJ，105（1995）中发现的方法制备。
第1天，在以2500V、25μF和200Ω电穿孔前，在冷冻的BioRad0.2cm电穿孔小杯中，将40μl电转感受态大肠杆菌细胞或MXE001细胞与（10pg）1μl pKO3DNA混合。立即加入1000μl2xPY，并且通过以250rpm在温箱中在30℃振荡1小时回收细胞。在将100μl等分试样铺平板到在30℃和43℃预温的含有以20μg/ml氯霉素的2xPY琼脂平板上之前，将细胞1/10连续稀释到2xPY中。将平板在30℃和43℃温育过夜。
第2天，在30℃生长的菌落数目给出电穿孔效率的估计，而在43℃存活生长的菌落代表潜在的整合事件。挑取来自43℃平板的单个菌落且重悬浮于10ml2xPY中。将100μl这个铺平板到预温至30℃含有5%（w/v）蔗糖的2xPY琼脂平板上，以生成单个菌落。将平板在30℃温育过夜。
第3天，菌落在此处代表潜在的同时去整合和质粒消除事件。如果去整合和消除事件在生长早期发生，那么大量菌落团块将是克隆的。挑取单个菌落且重复铺平板到含有以20μg/ml氯霉素或5%（w/v）蔗糖的2xPY琼脂上。将平板在30℃温育过夜。
第4天，在蔗糖上生长且在氯霉素上死亡的菌落代表潜在的染色体替换和质粒消除事件。挑取这些且通过PCR加上限制性消化筛选SalI位点的丧失。将生成正确大小的阳性PCR条带且针对通过SalI的消化是抗性的菌落划线培养，以产生在含有5%（w/v）蔗糖的2xPY琼脂上的单个菌落，并且将平板在30℃温育过夜。
第5天，PCR阳性、氯霉素敏感和蔗糖抗性的大肠杆菌的单个菌落用于制备甘油原种，化学感受态细胞，且充当PCR模板用于用5’和3’侧翼寡核苷酸的PCR反应，以生成PCR产物用于使用Taq聚合酶的直接DNA测序，以证实正确突变。
用于Fab’和DsbC表达的质粒生成
构建含有抗TNF Fab’的重链和轻链序列以及编码DsbC的序列的质粒。
产生WO01/94585中所述的抗TNFαFab’片段（被称为CDP870）的双顺反子信使。上游顺反子编码抗体的轻链（SEQ ID NO:9），而下游顺反子编码抗体的重链（SEQ ID NO:10）。编码OmpA信号肽的DNA序列融合至编码轻链和重链各自的DNA的5'末端，以允许有效分泌至周质。基因间序列（IGS）2如SEQ ID NO:16中所示使用。
使用常规限制性克隆方法构建质粒pDPH358（pTTO40.4CDP870IGS2），用于CDP870Fab’（抗TNF Fab’）和DsbC（周质多肽）的表达载体，所述方法可以在Sambrook等人1989，Molecular cloning：a laboratory manual.CSHL press，N.Y中发现。质粒pDPH358含有下述特征；强tac启动子和lac操纵子序列。质粒含有在Fab’重链编码区后的独特的EcoRI限制位点，随后为非编码序列且随后为独特的NdeI限制位点。DsbC基因是使用W3110粗制染色体DNA作为模板PCR克隆的，从而使得PCR产物编码5’EcoRI位点，随后为强染色体结合，随后为DsbC的天然起始密码子、信号序列和成熟序列，以C末端His标记终止，且最后为非编码NdeI位点。将EcoRI-NdeI PCR片段限制且连接到表达载体内，从而使得所有三种肽：Fab’轻链、Fab’重链和DsbC都在单个多顺反子mRNA上编码。
Fab轻链、重链基因和DsbC基因作为单个多顺反子信使转录。编码来自大肠杆菌OmpA蛋白质的信号肽的DNA融合至轻链和重链基因序列的5'末端，其指导多肽易位至大肠杆菌周质。使用双重转录终止子rrnB t1t2来终止转录。lacIq基因编码组成性表达的Lac I阻遏蛋白。这阻遏来自tac启动子的转录，直至通过异乳糖或IPTG存在诱导去阻遏。使用的复制起点是p15A，其维持低拷贝数。质粒含有四环素抗性基因用于抗生素选择。
抗TNF Fab’和DsbC的表达
用编码Fab’轻链、Fab’质粒和DsbC的质粒转化MXE008菌株。
菌株的转化使用在Chung C.T等人Transformation and storage ofbacterial cells in the same solution.PNAS86:2172-2175（1989）中发现的方法执行。
抗TNF Fab’的表达
用质粒pMXE117（pTTO CDP870或40.4IGS2）转化菌株MXE008，所述质粒是用于CDP870Fab’的表达载体（抗TNF Fab’具有SEQ ID NO:9中所示的轻链序列和SEQ ID NO:10中所示的重链序列），其使用可以在Sambrook等人1989，Molecular cloning：a laboratory manual.CSHL press，N.Y中发现的常规限制性克隆方法构建。质粒pMXE117（pTTO CDP870或40.4IGS2）含有下述特征：强tac启动子和lac操纵子序列。Fab轻链和重链基因作为单个双顺反子信使转录。编码来自大肠杆菌OmpA蛋白质的信号肽的DNA融合至轻链和重链基因序列的5'末端，其指导多肽易位至大肠杆菌周质。使用双重转录终止子rrnB t1t2来终止转录。lacIq基因编码组成性表达的Lac I阻遏蛋白。这阻遏来自tac启动子的转录，直至通过异乳糖或IPTG存在诱导去阻遏。使用的复制起点是p15A，其维持低拷贝数。质粒含有四环素抗性基因用于抗生素选择。
菌株的转化使用在Chung C.T等人Transformation and storage ofbacterial cells in the same solution.PNAS86:2172-2175（1989）中发现的方法执行。
实施例2–表达重组抗体抗TNF Fab’的宿主细胞的生长
在实施例1中产生的MXE008菌株在发酵实验中用于表达抗TNFαFab’。
表达抗TNF Fab’和DsbC的MXE008使用标准发酵条件和培养基进行发酵。在发酵后，对所得到的宿主细胞样品实施离心，并且将细胞团块冷冻用于贮存。
实施例3–从大肠杆菌菌株中提取抗TNFαFab’和pH调节
随后将来自实施例2的冷冻团块细胞团块解冻且重悬浮于提取缓冲液（0.1M Tris/10mM EDTA pH7.4）中。提取在60℃执行过夜。
在提取步骤后，将提取样品以4200rpm在4℃离心1小时。在离心后，将样品经由0.45um+0.22um过滤澄清。
在过滤后，将所得到的具有pH6.9的宿主细胞样品提取物分成10mL的3个等分试样，并且使用30%（v/v）冰乙酸调节至pH5.0、4.5或3.0。将分离的等分试样作为对照样品保留在pH6.9。
如图1中可见的，随着pH降低观察到增加水平的沉淀。宿主细胞蛋白质的最多沉淀在pH3.0可见，随后为pH4.5且随后为pH5.0。
实施例4–通过反相HPLC分析在pH调节后的宿主细胞样品提取 物
跨越在时间（T）=0、T=1小时、T=2小时、T=4.5小时、T=8小时和T=24小时的时间过程获得在pH调节至pH5.0、4.5或3.0或对照（无pH调节，pH7）后每种宿主细胞样品提取物的样品，并且经由反相HPLC执行实时分析。反相HPLC允许在疏水性的基础上的蛋白质分离，并且使用合适的HPLC柱（来自Agilent Technologies的PoroshellTM300SB-C8，5微米，2.1x75mm）执行。样品在分析前进行过滤（0.22um）。
结果显示于图2、3、5和6中。图2显示了在pH调节后，关于宿主细胞提取物在T=0（T=0意指在pH调节后尽可能快的进行分析，一般为pH调节后约7分钟）时的反相HPLC分析的覆盖色谱图。图3显示了在pH调节后，关于宿主细胞提取物在T=0时的反相HPLC分析的个别色谱图。对于pH7以及pH调节至pH3.0、pH4.5和pH5.0显示了对应于Fab’的轻链（LC）、Fab’的重链（HC）、完整Fab’、DsbC-his（加his-标签的DsbC）和二肽结合蛋白（DBP）的峰。由图2和3可见，与在pH7的对照相比较，DsbC-his的数量在pH调节至pH5后更低，DsbC-his的数量在pH调节至pH4.5或至pH3.0后明显进一步降低。还可见DBP的数量在pH调节至pH3后显著降低。DBP的pI是5.7。因此，在宿主细胞提取物中，pH必须显著降低，以便引起DBP的沉淀。Fab’的数量不受pH调节显著影响。
图5显示了在pH调节至pH3.0、4.5和5.0后，来自反向HPLC色谱图的关于DsbC-his的峰总面积。如图2和3中可见的，DsbC的量在调节至pH5.0后减少并且在调节至pH4.5或3.0后进一步减少。
图6显示了在pH调节至pH3.0、4.5和5.0后，来自反向HPLC色谱图的关于DBP的峰总面积。如图2和3中可见的，DBP的量在调节至pH3.0后减少。
通过混合模式阳离子交换色谱法从菌株MXE008的宿主细胞提取物中获得DsbC-his的纯化溶液。在T=0、1、8和24小时后，在pH7和pH3.0执行包含DsbC-his的这种纯化溶液的分析。结果显示于图4中，其显示了在T=0、1、8和24小时后，在pH7和pH3.0关于包含DsbC-his的纯化溶液的反相HPLC分析的色谱图。由图4可见pH调节对来自溶液的DsbC-his沉淀和去除没有作用。
实施例5–样品的SDS-PAGE分析
在pH7、pH5.0、pH4.5和pH3.0的延长贮存后执行非还原SDS-PAGE分析。图7显示了SDS-PAGE分析凝胶。由图7中可见DBP的数量在pH调节至pH3后减少。DsbC和Fab’的重链（HC）在凝胶上显示相同分子量，但可见关于DsbC和HC的条带在pH调节至pH5、pH4.5和pH3后减少，由于DsbC中的减少证实DsbC-his和DBP的数量在pH调节后减少。
在pH调节至pH4.5后，在上述实施例中测试的抗TNF Fab’CDP870已通过Biacore分析进行测试，且发现已保留针对TNF的亲和力。（数据未显示）。

Claims (25)

1.一种用于从革兰氏阴性菌宿主细胞样品或其提取物纯化重组蛋白质的方法，其中所述宿主细胞表达重组蛋白质和重组二硫化物异构酶DsbC；其中所述方法包括：
a.将宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH5或更低，以沉淀重组二硫化物异构酶；和
b.分离沉淀的重组二硫化物异构酶与重组蛋白质，以产生重组蛋白质样品。
2.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH4.5或更低。
3.根据权利要求2的方法，其中所述宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH4.5-3.0。
4.根据权利要求2的方法，其中所述宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH3或更低。
5.根据权利要求4的方法，其中在步骤a）中，使宿主细胞二肽结合蛋白进一步沉淀，并且在步骤b）中，使宿主细胞二肽结合蛋白进一步与所述重组蛋白质分离。
6.根据任何前述权利要求的方法，其中所述二硫化物异构酶包含组氨酸标签。
7.根据任何前述权利要求的方法，其中所述革兰氏阴性菌宿主细胞是大肠杆菌。
8.根据任何前述权利要求的方法，其中所述宿主细胞包含Fkpa和/或Skp。
9.根据任何前述权利要求的方法，其中在步骤a）中，所述宿主细胞样品或其提取物的pH使用冰乙酸调节至低于5的pH。
10.根据任何前述权利要求的方法，其中所述宿主细胞样品或其提取物保持在pH5或更低一小时或更短。
11.根据任何前述权利要求的方法，其中在步骤b）中的分离包括离心和/或过滤。
12.根据任何前述权利要求的方法，其中在步骤b）后，该方法包括对所述重组蛋白质样品实施色谱法的进一步纯化步骤。
13.根据权利要求11的方法，其中所述色谱法是离子交换色谱法。
14.根据任何前述权利要求的方法，其中在步骤b）后，将所述重组蛋白质样品的pH调节至pH5-7。
15.根据任何前述权利要求的方法，其中在步骤a）前，将提取缓冲液加入所述宿主细胞样品或其提取物，并且对所述宿主细胞样品或其提取物实施热处理步骤。
16.根据任何前述权利要求的方法，其中所述重组蛋白质具有pI6-9。
17.根据权利要求16的方法，其中所述重组蛋白质具有pI8-9。
18.根据任何前述权利要求的方法，其中所述重组蛋白质是重组抗体。
19.根据权利要求18的方法，其中所述重组抗体是单克隆、人源化或嵌合抗体或者其片段，例如其结合片段。
20.根据权利要求18或权利要求19的方法，其中所述重组抗体是Fab或Fab’片段。
21.根据权利要求18–20中任一项的方法，其中所述重组抗体是对于人TNFα特异性的。
22.根据权利要求21的方法，其中所述抗体重链，其中所述可变结构域包含对于CDRH1具有SEQ ID NO:1所示的序列、对于CDRH2具有SEQ ID NO:2所示的序列和对于CDRH3具有SEQ ID NO:3所示的序列的CDR，和轻链，其中所述可变结构域包含具有对于CDRL1具有SEQ ID NO:4所示的序列、对于CDRL2具有SEQ ID NO:5的序列和对于CDRL3的SEQ ID NO:6的序列的CDR。
23.根据权利要求22的方法，其中所述抗体包含在SEQ ID NO:7所示的轻链可变区序列和在SEQ ID NO:8所示的重链可变区。
24.根据权利要求23的方法，其中所述抗体是Fab片段，并且包含具有SEQ ID NO:10所示的序列的重链和具有在SEQ ID NO:9所示的序列的轻链。
25.将用编码重组蛋白质的表达载体转化的革兰氏阴性菌宿主细胞样品或其提取物的pH调节至pH5或更低的步骤的用途，以沉淀宿主细胞重组二硫化物异构酶，使所述沉淀的宿主细胞重组二硫化物异构酶与所述重组蛋白质分离，且产生纯化的重组蛋白质样品。
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