ES2713859T3 - Proteínas de unión, incluyendo anticuerpos, derivados de anticuerpo y fragmentos de anticuerpo, que se unen específicamente a CD154 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-CD 154 o un fragmento de unión a CD 154 del mismo, que comprende: (a) una secuencia del dominio VH de acuerdo con SEQ ID NO: 1 de la Figura 5; y (b) una secuencia de dominio VL de acuerdo con SEQ ID NO: 2 de la Figura 6.

Description

DESCRIPCION

Protemas de union, incluyendo anticuerpos, derivados de anticuerpo y fragmentos de anticuerpo, que se unen espedficamente a CD154 y usos de los mismos

Campo tecnico de la invencion

Esta divulgacion proporciona generalmente protemas de union, incluyendo anticuerpos, derivados de anticuerpo y fragmentos de anticuerpo, que espedficamente se unen a una protema CD154 (CD40L). En particular, la invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD 154 o un fragmento de union a CD 154 del mismo, que comprende: (a) una secuencia del dominio VH de acuerdo con SEQ ID NO: 1 de la Figura 5; y (b) una secuencia de dominio VL de acuerdo con SEQ ID NO: 2 de la Figura 6. Tambien se desvela un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo quimerico, humanizado o completamente humano que se une espedficamente a un epttopo al cual se une espedficamente un fragmento Fab humanizado que comprende una secuencia de cadena pesada variable de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y comprende una secuencia de cadena ligera variable de acuerdo con SEQ ID NO: 2. Las protemas de union a CD154 de esta divulgacion pueden producir una funcion efectora reducida con relacion a un segundo anticuerpo anti-CD154. Las protemas de union a CD154 de esta divulgacion son utiles en metodos de diagnostico y terapeuticos, tales como en el tratamiento y la prevencion de enfermedades que incluyen aquellas que implican respuestas inmunes indeseables que estan mediadas por interacciones CD154-CD40.

Antecedentes de la invencion

La generacion de inmunidad humoral y mediada por celulas esta orquestada por la interaccion de celulas T auxiliares activadas con celulas presentadoras de antígeno (“APC”) y celulas T efectoras. La activacion de las celulas T auxiliares no solamente depende de la interaccion del receptor de la celula T espedfico del antígeno (“TCR”) con su ligando peptido-MHC afm, sino que tambien requiere la union coordinada y la activacion a traves de un numero de moleculas de adhesion celular y coestimuladoras. Vease, por ejemplo, Salazar-Fontana, L. I., y B. E. Bierer (2001) Curr. Opin. Hemat. 8:5.

Una molecula coestimuladora cntica es CD154, una protema de transmembrana de Tipo II que se expresa en la superficie de las celulas T CD4+ en una forma temporalmente restringida, dependiente de la activacion. CD154 tambien se expresa, despues de la activacion, en un subconjunto de celulas T CD8+, basofilos, mastocitos, eosinofilos, linfocitos citoltticos naturales (celulas NK), celulas B, macrofagos, celulas dendnticas y plaquetas. El contra receptor de CD154, CD40, es una protema de membrana de Tipo I que esta constitutiva y ampliamente expresada en la superficie de muchos tipos celulares, incluyendo APC. Vease, por ejemplo, Foy, T. M. et al., (1996) Ann. Rev. Immunol. 14:591.

La senalizacion a traves de CD40 mediante CD154 inicia una cascada de eventos que da como resultado la activacion de las celulas que llevan el receptor CD40 y el cebado de la celula T CD4+. Mas espedficamente, la union de CD154 a CD40 promueve la diferenciacion de las celulas B en celulas secretoras de anticuerpo y celulas B de memoria. Vease, por ejemplo, Burkly, L. C. (2001) In Adv. Exp. Med. Bio., Vol. 489. D.M. Monroe et al, eds. Kluwer Academic/Plenum Publishers, p. 135 (en lo sucesivo “Burkly, supra"). Adicionalmente, la interaccion CD154-CD40 promueve la inmunidad mediada por celulas a traves de la activacion de macrofagos y celulas dendnticas y la generacion de celulas aniquiladoras naturales y linfocitos C citotoxicos. Vease, por ejemplo Burkly, ibid.

El papel pivotal de CD154 en la regulacion de la funcion tanto de la respuesta inmune humoral como de la mediada por celulas ha provocado un gran interes en el uso de inhibidores de esta trayectoria para la inmunomodulacion terapeutica. Es decir, los anticuerpos anti-CD154 han demostrado ser beneficiosos en una amplia diversidad de modelos de respuesta inmune a otras protemas terapeuticas o terapia genica, alergenos, autoinmunidad y trasplante. Vease, por ejemplo, el documento US 5.474.771; Burkly, supra.

La interaccion CD40-CD154 ha demostrado ser importante en varias enfermedades autoinmunes experimentalmente inducidas en donde se ha demostrado que la induccion de la enfermedad puede bloquearse con antagonistas de CD154 en el momento de la administracion del antígeno (Burkly, supra). El bloqueo de la enfermedad utilizando antagonistas anti-CD154 tambien se ha visto en modelos de animales de enfermedad autoinmune espontanea. Vease, Burkly, supra.

Actualmente existe una necesidad de anticuerpos anti-CD154 mejorados con afinidades de union mayores y menos efectos secundarios indeseados. Las “funciones efectoras” aumentadas tales como la citotoxicidad directa, la citotoxicidad dependiente del complemento (“CDC”), la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (“ADCC”) y la produccion anormal del anticuerpo, son efectos secundarios indeseados que pueden estar asociados a los anticuerpos terapeuticos.

Varias funciones efectoras del anticuerpo estan mediadas al menos en parte por los receptores Fc (FcR), que unen la region Fc de un anticuerpo en el dominio constante de una inmunoglobulina tfpica. Existe un numero de receptores Fc que son espedficos para diferentes clases de inmunoglobulinas. Las clases de inmunoglobulinas incluyen IgG, IgE, IgA, IgM, e IgD. Las clases de inmunoglobulinas ademas se dividen en subclases: IgG se divide en cuatro subclases (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4) e IgA se divide en dos subclases (IgA1 e IgA2). Existen tres receptores conocidos para IgG: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), y FcyRIII (CD 16). Cada subclase FcyR se codifica por dos o tres genes, una division de ARN alternativa que conduce a multiples transcripciones y a una amplia diversidad en isoformas FcyR.

Tfpicamente, las inmunoglobulinas son moleculas en forma de Y que comprenden dos cadenas pesadas identicas y dos cadenas ligeras identicas. Los enlaces de bisulfuro enlazan juntos los pares de cadena pesada y ligera asf como las dos cadenas pesadas. Cada cadena consiste en un dominio variable que vana en la secuencia y es responsable de la union del antigeno; los dominios son conocidos como los dominios Vh y Vl para las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente. En la cadena ligera existe un solo dominio constante (Cl) y en la cadena pesada existen tres dominios constantes (Chi, Ch2 y Ch3). Las moleculas que contienen todos los dominios variable y constante pueden denominarse anticuerpos completos.

Los restos en los dominios de variable de anticuerpo convencionalmente se enumeran de acuerdo con el sistema disenado por Kabat et al. Este sistema se determina en Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (en lo sucesivo “Kabat et al., supra"). Este sistema de enumeracion se utiliza en el presente documento memoria descriptiva excepto en donde se indica lo contrario. Se debera observar que las designaciones de resto de Kabat no siempre corresponden directamente a la enumeracion lineal de los restos de aminoacido. La secuencia de aminoacido lineal actual puede contener menos o aminoacidos adicionales que en la numeracion de Kabat estricta que corresponde a la abreviacion de, o insercion en, un componente estructural, ya sea el marco, o la region de determinacion de complementariedad (CDR), de la estructura del dominio variable basica. La enumeracion de Kabat correcta de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante la alineacion de los restos de homologfa en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada Kabat “convencional”.

Existen tres regiones dentro de los dominios variables que son hipervariables en la secuencia establecida dentro de cuatro regiones marco mas altamente conservadas. Estas CDR hipervariables son principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. Las CDR del dominio variable de cadena pesada se localizan en los restos 31-35 (CDR-H1), restos 50-65 (CDR-H2) y los restos 95-102 (CDR-H3), de acuerdo con el sistema de enumeracion de Kabat. Sin embargo, de acuerdo con Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M. J. Mol. Biol, 1987, 196:901-917), el equivalente del bucle para CDR-H1 se extiende desde el resto 26 al resto 32. De esta forma 'CDR-H1', como se utiliza en el presente documento, tambien incluye una CDR localizada en los restos 26 a 35, como se describe a traves de una combinacion del sistema de enumeracion de Kabat y la definicion del bucle topologico de Chothia. Las CDR del dominio variable de cadena ligera se localiza en los restos 24-34 (CDR-L1), los restos 50-56 (CDR-L2), y los restos 89-97 (CDR-L3) de acuerdo con el sistema de enumeracion de Kabat.

Aunque los anticuerpos de origen natural, como anticuerpos completos o como fragmentos que retienen las propiedades de union espedfica, originalmente derivaron de especies individuales, los anticuerpos geneticamente modificados pueden derivar de mas de una especie de animal, por ejemplo, anticuerpos quimericos. Hasta la fecha, se han generado principalmente los anticuerpos quimericos de raton (murino)/humano y de murino/primate no humano, aunque tambien son posibles otras combinaciones de especies hfbridas. Se conocen muchas configuraciones diferentes de polipeptidos de anticuerpos de origen natural y modificados geneticamente, y derivados y fragmentos de los mismos. La caractenstica comun para todos es que el polipeptido o polipeptidos retienen la especificidad de union a antígeno a traves de uno o mas dominios de union a epítopo. Aparte de la union al epítopo, las propiedades funcionales de un polipeptido de anticuerpo pueden diferir dependiendo de que otras secuencias estan presentes, por ejemplo, dominios FC u otras secuencias que activan las funciones efectoras y/o interactuan con otras rutas celulares.

Las protemas de union a CD154 que comprenden los dominios de union del epítopo (tales como CDR o dominios variables) incorporadas en un andamio o marco distinto de inmunoglobulina (vease, por ejemplo, et al, 2005 Nat Biotech 23: 1257-1268; Hosse et al., 2006 Protein Science 15: 14-27) pueden exhibir funciones efectoras reductivas. Los anticuerpos anti-CD154 se desvelan en los documentos WO 01/68860 y WO205/011376. Sena deseable tener nuevas protemas de union que espedficamente antagonizan la union de CD154 a CD40 y reducen o eliminan las funciones aguas abajo del complejo CD154-CD40. Tambien sena deseable tener protemas de union a CD154 tales como los anticuerpos anti-CD154, con funciones efectoras reducidas en comparacions con los anticuerpos anti-CD154 conocidos.

Sumario de la invencion

La presente divulgacion proporciona una solucion a estos y otros problemas proporcionando una protema de union, tales como un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, aislado, recombinante o sintetico, que se une espedficamente a una protema CD154, que puede ser una protema CD154 humana. Los anticuerpos anti-CD154 de la divulgacion, que incluyen fragmentos y derivados de los mismos, pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales murinos, quimericos, primatizados, humanizados o completamente humanos. Los anticuerpos anti-CD154 de la divulgacion pueden ser multimericos, heterodimeticos, hemidimericos, monovalentes, bivalentes, tetravalentes, biespedficos y pueden incluir anticuerpos de cadena individual; y derivados de los mismos.

La presente invencion se dirige a los siguientes artfculos:

[1] Un anticuerpo anti-CD 154 o un fragmento de union a CD 154 del mismo, que comprende:

(a) una secuencia del dominio Vh de acuerdo con SEQ ID NO: 1 de la Figura 5; y

(b) una secuencia de dominio Vl de acuerdo con SEQ ID NO: 2 de la Figura 6.

[2] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con el artfculo [1], que comprende:

(a) una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 12 de la Figura 7, SEQ ID NO: 13 de la Figura 7 y SEQ ID NO: 72 de la Figura 16; y

(b) una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 15 de la Figura 7 y SEQ ID NO: 69 de la Figura 15.

[3] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con el artfculo [2], que comprende secuencias de cadena pesada y ligera seleccionadas de:

(a) SEQ ID NO: 12 de la Figura 7 y SEQ ID NO: 15 de la Figura 7, respectivamente;

(b) SEQ ID NO: 13 de la Figura 7 y SEQ ID NO: 15 de la Figura 7, respectivamente; y

(c) SEQ ID NO: 72 de la Figura 16 y SEQ ID NO: 69 de la Figura 15, respectivamente.

[4] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con el artfculo [3], que comprende secuencias de cadena pesada y ligera de SEQ ID NO: 13 de la Figura 7 y SEQ ID NO: 15 de la Figura 7, respectivamente.

[5] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con los artfculos [1]-[4], en donde:

(a) el anticuerpo anti-CD 154 es un anticuerpo anti-CD154 seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo multimerico, un anticuerpo heterodimerico, un anticuerpo hemidimerico, un anticuerpo tetravalente, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo de cadena unica y derivados de los mismos; o

(b) el anticuerpo anti-CD 154 es un fragmento de union a antígeno de un anticuerpo anti-CD 154 y dicho fragmento de union a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, F(ab)², Fab', F(ab')², F(ab')³, Fd y Fv;

[6] El anticuerpo de union anti-CD 154 de acuerdo con el artfculo [5], en donde dicho anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo se modifican por una union covalente de poli(etilenglicol) o un derivado del mismo.

[7] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con el artfculo [6], en donde el anticuerpo CD 154 es un fragmento Fab' en donde un grupo tiol en una region bisagra modificada se une covalentemente a un grupo maleimida que esta unido covalentemente a un resto lisina, en donde un polfmero de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 000 Da se fija a cada uno de los grupos amina de la lisina.

[8] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con el artfculo [1], en donde:

(a) el anticuerpo o el fragmento del mismo carece de una region Fc de inmunoglobulina; o

(b) el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende una region Fc de inmunoglobulina seleccionada de una region Fc de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, o deriva de una region Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

[9] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con el artfculo [1], en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende ademas una region Fc variante que es una region Fc hforida que comprende secuencias de mas de un tipo de dominio Fc de Ig.

[10] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de los artfculos [1]-[9], en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo no estan glicosilados.

[11] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de los artfculos [1]-[10], en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza a un resto funcional seleccionado de un resto de bloqueo, un resto detectable, un resto terapeutico o una combinacion de los mismos.12

[12] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de los artfculos [1]-[11], en donde el fragmento es una fusion de Fab, Fab', Fd, Fv, un scFv, un scFab o un scFab sin cistema.

[13] Una molecula de acido nucleico que codifica el anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de los artmulos [1]-[l2].

[14] La molecula de acido nucleico del artmulo [13], en donde la molecula de acido nucleico es una molecula de ADN que codifica un anticuerpo anti-CD 154 o un fragmento de union a CD 154 del mismo, comprendiendo la molecula de ADN una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17 de la Figura 6, SEQ ID NO: 18 de la Figura 6, SEQ ID NO: 22 de la Figura 5, SEQ ID NO: 23 de la Figura 7, SEQ ID NO: 24 de la Figura 7, SEQ ID NO: 25 de la Figura 6, SEQ ID NO: 26 de la Figura 7, SEQ ID NO: 27 de la Figura 7, SEQ ID NO: 28 de la Figura 8, SEQ ID NO: 41 de la Figura 8, SEQ ID NO: 70 de la Figura 15 y SEQ ID NO: 73 de la Figura 16.

[15] Un vector que comprende una molecula de acido nucleico de acuerdo con el artmulo 13 o una molecula de ADN de acuerdo con el artmulo [14].

[16] Una celula hospedadora que comprende el vector del artmulo [15].

[17] Un metodo para producir un anticuerpo anti-CD 154 o un fragmento de union a CD 154 del mismo, en donde dicho metodo comprende las etapas de:

(a) cultivar una celula hospedadora de acuerdo con el artmulo [16] en condiciones adecuadas para la expresion del anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo, por dicha celula hospedadora; y (b) recuperar el anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo.

[18] El metodo de acuerdo con el artmulo [17], en donde la celula hospedadora es una celula procariota o una eucariota.

[19] Una composicion que comprende el anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de los artmulos [1]-[12] y un vehmulo farmaceutico adecuado.

[20] La composicion de acuerdo con el artmulo [19], en donde dicha composicion comprende ademas un compuesto o agente inmunosupresor o inmunomodulador adicional.

[21] Uso del anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de los artmulos [1]-[12] o de la composicion de acuerdo con el artmulo [19] o [20] en la preparacion de un medicamento para tratar o prevenir una afeccion, un trastorno o una enfermedad humanos mediados en total o en parte por la senalizacion de CD40 o un smtoma de cualquiera de los anteriores, en donde dicha afeccion, trastorno o enfermedad es preferentemente una respuesta inflamatoria o autoinmune o fibrosis.

[22] El uso de acuerdo con el artmulo [21], en donde la respuesta inflamatoria o autoinmune o fibrosis se selecciona de artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, espondilartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, psoriasis, escleroderma, nefritis por lupus, purpura trombocitopenico idiopatico, enfermedad vascular y esclerosis multiple.

[23] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de los artmulos [1]-[12] o la composicion de acuerdo con el artmulo [19] o [20] para su uso en el tratamiento o la prevencion de una afeccion, un trastorno o una enfermedad humanos mediados en total o en parte por la senalizacion de CD40 o un smtoma de cualquiera de los anteriores, en donde dicha afeccion, trastorno o enfermedad es preferentemente una respuesta inflamatoria o autoinmune o fibrosis.

[24] El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de los artmulos [1]-[12] o la composicion de acuerdo con el artmulo [19] o [20] para su uso en el tratamiento o la prevencion de una respuesta inflamatoria o autoinmune o fibrosis de acuerdo con el artmulo [23], en donde la respuesta inflamatoria o autoinmune o fibrosis se selecciona de artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, espondilartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, psoriasis, escleroderma, nefritis por lupus, purpura trombocitopenico idiopatico, enfermedad vascular y esclerosis multiple.

En ciertas realizaciones, las protemas de union a CD154, por ejemplo, los anticuerpos anti-CD154, de la presente divulgacion tienen alta selectividad por CD154, y en algunas realizaciones, tambien tienen una o mas funciones efectoras reducidas en comparacion, por ejemplo, con el anticuerpo 5c8 anti-CD154 (producido por el hibridoma depositado bajo el N.° de Acceso HB 10916 ATCC, como se describe en el documento US 5.474.771, o 5c8 humanizado). Algunas de las protemas de union a CD154, por ejemplo, anticuerpos anti-CD154, de la divulgacion son monovalentes para la union de CD154.

Las protemas de union a CD154 y los anticuerpos anti-CD154 (incluyendo fragmentos y derivados de anticuerpos) de la divulgacion son utiles para inhibir la union de CD154 a CD40 y hacer esto con una alta especificidad, por ejemplo, con un IC50 en el intervalo de 20 pM a 1,5 pM, inclusive. En ciertas realizaciones, las protemas de union a CD154, por ejemplo, anticuerpos anti-CD154 de la divulgacion pueden tener un IC50 en el intervalo de 20 ppm a 500 ppm, de 50 pm a 500 pm o de 100 pm a 500 pm. En ciertas realizaciones, las protemas de union a CD154 y los anticuerpos anti-CD154 (incluyendo fragmentos y derivados de anticuerpos) de la divulgacion no agonizan sustancialmente la actividad de CD40.

Ciertas realizaciones de la presente divulgacion se refieren a protemas de union a CD154, por ejemplo, anticuerpos anti-CD154, que exhiben una alta afinidad por CD154 humano. Por ejemplo en ciertas realizaciones, una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, se disocia del CD154 humano (CD40L humano) con una Kd en el intervalo de 50 nM a 1 pM, inclusive, segun se determina por resonancia de plasmon de superficie (por ejemplo, Biacore®). Por ejemplo, la Kd para CD154 humano puede ser 50 pm a 1 pm, 20 pm a 1 pm o aun 10 pm a 1 pm. En algunas realizaciones, la Kd para CD154 humano es menor de 20 pM. En otras realizaciones, la Kd para CD154 humano es menor de 10 pM.

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union a CD154, por ejemplo un anticuerpo anti-CD154, que cuando esta presente en o por encima de las concentraciones de saturacion para la union de CD154 con base en su afinidad de union, es capaz de bloquear la union del anticuerpo 5c8 para CD154 cuando se anade primero a CD154, y tambien es capaz de desplazar el anticuerpo 5c8 unido a CD154 cuando se anade despues de que se anada el anticuerpo 5c8 a CD154.

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, un anticuerpo, que se une espedficamente a una protema CD154 y que comprende o consiste en una o mas secuencia o secuencias de cadena pesada de CDR (H) seleccionadas de CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 5). En realizaciones adicionales, la protema de union a CD154 o anticuerpo comprende o consiste en al menos dos CDR seleccionados de CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 5). En aun realizaciones adicionales, la protema de union o anticuerpo comprende o consiste en las tres secuencias H CDR, que estan en CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), el CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) y el CDR-H3 (SEQ ID NO: 5).

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, anticuerpo, que espedficamente une una protema CD154 y que comprende o consiste en una o mas secuencia o secuencias de cadena ligera CDR (L) seleccionada de CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 8). En realizaciones adicionales, la protema o anticuerpo de union a CD154 comprende o consiste en al menos dos CDR seleccionadas de CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 8). En aun otra realizacion, la protema o anticuerpo CD154 comprende o consiste en las tres secuencias L CDR, que son CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 8).

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, anticuerpo, que espedficamente une a una protema CD154 y que comprende o consiste en CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 8), y en donde la protema o anticuerpo ademas comprende o consiste en CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 5).

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, anticuerpo que espedficamente une a una protema CD154, en donde la protema de union a CD154 o anticuerpo comprende o consiste en una secuencia Vh seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEC ID n O; 11. En ciertas otras realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, anticuerpo, que espedficamente une a una protema CD154, en donde la protema de union a CD154 o anticuerpo comprende o consiste en una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, anticuerpo, que espedficamente une una protema CD154, en donde la protema o anticuerpo de union a CD154 comprende o consiste en la secuencia Vl seleccionada de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 14. En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, anticuerpo, que espedficamente une a una protema CD154, en donde la protema de union a CD154 o anticuerpo comprende o consiste en una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 15.

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, anticuerpo, que espedficamente une una protema, CD154, en donde la protema de union a CD154 o anticuerpo comprende o consiste en una secuencia Vl seleccionada de SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 14 y una secuencia Vh seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11. En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, un anticuerpo, que espedficamente une una protema CD154, en donde la protema de union a CD154 o anticuerpo comprende o consiste en una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 15, y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13. En otras realizaciones, la protema de union a CD154 o anticuerpo comprende o consiste en una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 13.

En otras realizaciones, la presente divulgacion se refiere a un protema de union, por ejemplo, un anticuerpo, que espedficamente une CD154, y comprende o consiste en una o mas secuencia o secuencias, CDR de cadena pesada (H) seleccionada de CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 44). En realizaciones adicionales, la protema de union o el anticuerpo comprenden o consiste en al menos dos CDR seleccionados de CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 44). En aun otras realizaciones, la protema de union o anticuerpo comprende o consiste en las tres secuencias H CDR, que son CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) y la CDR-H3 (SEQ ID NO: 44).

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, un anticuerpo, que espedficamente une una protema CD154, en donde la protema de union o anticuerpo comprende o consiste en una o mas secuencias de cadena ligera (L) CDR seleccionadas de CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 47). En realizaciones adicionales, la protema de union o anticuerpo comprende o consiste en al menos dos CDR seleccionados de CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 47). En aun otras realizaciones, la protema de union o anticuerpo comprende o consiste en las tres secuencias L CDR, que son CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 47).

En ciertas realizaciones, una protema de union a CD154, o anticuerpo anti-CD154 de la presente divulgacion comprende una secuencia complementaria que comprende o consiste en una o mas CDR de cadena ligera de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, por arriba, o una secuencia complementaria que comprende o consiste en uno o mas CDR de cadena pesada de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, anterior, respectivamente. De esta forma, en ciertas realizaciones, una protema de union o anticuerpo de esta invencion comprende o consiste en CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) o CDR-H3 (SEQ ID NO: 44), y CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) o CDR-L3 (SEQ ID NO: 47).

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, en donde la protema de union de anticuerpo comprende o consiste en las tres siguientes secuencias L CDR: CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 47), y en donde la protema de union o anticuerpo ademas comprende o consiste en las tres siguientes secuencias H CDR: CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 44).

En realizaciones adicionales, esta divulgacion proporciona una protema de union, por ejemplo, anticuerpo, que espedficamente une CD154, y que comprende o consiste en una secuencia de cadena ligera variable (Vl) de SEQ ID NO: 54. Esta divulgacion tambien se refiere a una protema de union CD 154 o anticuerpo anti-CD154 que comprende o consiste en una secuencia de cadena pesada variable (Vh) de SEQ ID NO: 56. En ciertas realizaciones, una protema de union a CD154 o anticuerpo anti-CD154 de la divulgacion puede comprender o consistir de ambas una secuencia Vl SEQ ID NO: 54 y una secuencia Vh de SEQ ID NO: 56.

En otras realizaciones, la presente divulgacion se refiere a una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, que espedficamente une CD154, en donde la protema de union a CD154 o el anticuerpo anti-CD154 comprende o consiste en una o mas secuencia o secuencias CDR de cadena pesada (H) seleccionada de CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 50). En realizaciones adicionales, la protema de union a CD154 o anticuerpo anti-CD154 comprende o consiste en al menos dos CDR seleccionadas de CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 50). En realizaciones adicionales, la protema de union a CD154 o el anticuerpo anti-CD154 comprende o consiste en las tres secuencias H CDR, que son CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 50).

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CE154, que espedficamente une a una protema CD154, en donde la protema CD154 o el anticuerpo anti-CD154 comprende o consiste en una o mas secuencias de cadena ligera (L) CDR seleccionadas de CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 53). En realizaciones adicionales, la protema de union a CD154 o el anticuerpo anti-CD154 comprende o consiste en al menos dos CDR seleccionadas de CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) y Cd R-L3 (SEQ ID NO: 53). En realizaciones, la protema de union a CDl54 o el anticuerpo anti-CD154 comprende o consiste en las tres secuencias L CDR, que son CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (s Eq ID NO: 52) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 53).

En ciertas realizaciones, una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, de la presente divulgacion comprende una secuencia complementaria que comprende o consiste en una o mas CDR de cadena ligera de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, anterior, o una secuencia complementaria que comprende o consiste en una o mas CDR de cadena pesada, de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, anterior, respectivamente. De esta forma, en ciertas realizaciones, un anticuerpo de la divulgacion comprende o consiste en una CDR H seleccionada de (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 50), o una CDR L seleccionada de CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 53).

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, en donde la protema de union a CD154 o el anticuerpo anti-CD154 comprende o consiste en las tres secuencias L CDR que son CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 53), y en donde la protema union, por ejemplo, anticuerpo, ademas comprende o consiste en las tres secuencias H CDR que son (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 50).

En realizaciones adicionales, la divulgacion proporciona una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154 que espedficamente une CD154, en donde la protema de union a CD154 o el anticuerpo anti-CD154 comprende o consiste en una secuencia Vl de SEQ ID NO: 58. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende o consiste en una secuencia Vh de SEQ ID NO: 60. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende o consiste en una secuencia Vh de SEQ ID NO: 60 y una secuencia de Vl de SEQ ID NO: 58.

En ciertas realizaciones, la protema de union a CD154 de esta divulgacion comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 62 y una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones, la protema de union a CD154 de esta divulgacion comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 63 y una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 66.

En ciertas realizaciones, la protema de union a CD154 de esta divulgacion comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 68, y una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 71. En otras realizaciones, la protema de union a CD154 de esta divulgacion comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 69 y una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 72. En otras realizaciones, la protema de union a CD154 comprende al menos una de las secuencias de acuerdo con SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72.

Las secuencias CDR de SEQ ID NO: 3-8 derivan del anticuerpo monoclonal de rata 342. En una realizacion alternativa de la divulgacion, el anticuerpo anti-CD154 es el anticuerpo 342 de rata que comprende la secuencia del dominio Vh de SEQ ID NO: 29 y la secuencia del dominio Vl de SEQ ID NO: 30. Esta invencion tambien proporciona una molecula de ADN aislado, recombinante o sintetico que comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32. Adicionalmente se proporciona un vector que comprende al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34.

La divulgacion tambien proporciona protemas de union a CD154, por ejemplo, anticuerpos anti-CD154, que se unen selectivamente al mismo epítopo como lo hace cualquiera de los anticuerpos anti-CD154 descritos en el presente documento (por ejemplo, los anticuerpos 342, 381 y 338 y la secuencia de epítopo de estos). En particular, los anticuerpos 342 y 338 de la presente invencion exhiben similares propiedades de union a CD154 cuando se utilizan como primero o segundo anticuerpos en ensayos de competencia con el anticuerpo 5c8 anti-CD154, como se describe en el presente documento.

De esta forma, en ciertas realizaciones, la divulgacion proporciona protemas de union a CD154 y anticuerpos anti-CD154 que se unen al mismo epítopo como lo hace un anticuerpo humanizado que comprende una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13 y comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 15 (342 Fab y fragmentos Fab'), y que exhiben propiedades de union a CD154 similares cuando se utilizan como primero o segundo anticuerpos en ensayos de competencia con el anticuerpo anti-CD154 5c8, como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, la divulgacion proporciona protemas de union a CD154 y anticuerpos anti-CD154 que se unen al mismo epítopo como lo hace un anticuerpo humanizado que comprende la secuencia del dominio Vl de acuerdo con SEQ ID NO: 58 y la secuencia del dominio Vh de acuerdo con SEQ ID NO: 60 (secuencias variables de anticuerpo 338), y que exhiben propiedades de union a CD154 similares en ensayos de competencia con el anticuerpo anti-CD1545c8, como se describe en el presente documento.

En cualquiera de las realizaciones anteriores relacionadas con una protema de union a CD154 de la divulgacion, la protema de union puede estar PEGilada. En realizaciones en donde la protema de union a CD154 es un anticuerpo anti-CD154, polipeptido del anticuerpo o fragmento o derivado de este, el anticuerpo puede estar PEGilado en la cadena pesada, la cadena ligera, o ambas cadenas.

La presente divulgacion tambien proporciona una molecula de ADN aislada, recombinante y/o sintetica que comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SeQ ID NO: 25.

En ciertas realizaciones, esta divulgacion tambien proporciona una molecula de ADN aislada, recombinante y/o sintetica que comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 73.

En otras realizaciones, la divulgacion proporciona una molecula de ADN aislada, recombinante y/o sintetica que comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 41.

Esta divulgacion tambien proporciona un vector que comprende una cualquiera de las moleculas de ADN aislada, recombinante y/o sintetica de esta divulgacion. En una realizacion, el vector comprende al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 41.

En realizaciones adicionales, esta divulgacion proporciona una molecula de ADN aislada, recombinante y/o sintetica que comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 57. En algunas realizaciones, la divulgacion proporciona una molecula de ADN aislada, recombinante y/o sintetica que comprende o consiste en ambas SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 57.

En realizaciones adicionales, la divulgacion proporciona una molecula de ADN aislada, recombinante y/o sintetica que comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61. En algunas realizaciones, la divulgacion proporciona una molecula de ADN aislada, recombinante y/o sintetica que comprende o consiste en ambas SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61.

En cualquiera de las realizaciones de la divulgacion relacionadas con las protemas de union a CD154 y anticuerpos anti-CD154 que comprenden secuencias que contribuyen a las funciones efectoras, las protemas de union o anticuerpos anti-CD154, pueden adicionalmente seleccionarse o modificarse geneticamente para provocar la funcion efectora reducida comparada con un anticuerpo anti-CD154 que tiene una region Fc, como se describe en cualquier lugar en el presente documento. Por ejemplo, las protemas de union a CD154 y los anticuerpos anti-CD154 que no tienen una region Fc o secuencias de region constante, o que carecen de una region Fc funcional o secuencias de region constante, pueden seleccionarse para su uso en la divulgacion.

En ciertas realizaciones, las protemas de union a CD154 y los anticuerpos anti-CD154 de la divulgacion son monovalentes para la union a CD154 y preferentemente producen funciones efectoras reducidas cuando se administran a un sujeto con relacion a una protema de union a CD154 comparable tal como un anticuerpo anti-CD154 bivalente.

En ciertas realizaciones, las secuencias de la region Fc o constante, si estan presentes en una protema de union a CD154, por ejemplo un polipeptido de anticuerpo anti-CD154, pueden seleccionarse o modificarse geneticamente para comprender una o mas modificaciones (por ejemplo, sustituciones, inserciones, aductos o eliminaciones de aminoacidos) que reducen o eliminan una o mas funciones efectoras con relacion a un anticuerpo anti-CD154 control, que comprende secuencias de region Fc o constantes nativas, parentales o no modificadas.

El algunas realizaciones de la divulgacion, una region FC, cuando esta presente, es una region Fc de o derivada de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas realizaciones, las regiones Fc tnbridas pueden utilizarse, es decir secuencias Fc IgG1/IgG4 tnbridas. En realizaciones particulares, la region Fc comprende secuencias Fc IgG4 o se derivan del anticuerpo IgG4. Se entiende que cualquier combinacion tnbrida entre las diferentes regiones Fc que reduce una o mas de las funciones efectoras puede utilizarse de acuerdo con la divulgacion.

En ciertas otras realizaciones, la glicosilacion de la porcion Fc de un anticuerpo se reduce o elimina, o el perfil de glicosilacion del anticuerpo se altera, como se describe adicionalmente en el presente documento. En ciertas realizaciones, la protema de union a CD154 o polipeptido de anticuerpo anti-CD154 comprende un dominio Ch2 con una region Fc que tiene una modificacion en o cerca del sitio de glicosilacion enlazado a N conservado. La modificacion en el sitio de glicosilacion enlazado a N conservado puede comprender una mutacion en o cerca del sitio de glicosilacion de cadena pesada, en donde la mutacion reduce, altera o evita la glicosilacion en el sitio. En realizaciones, adicionales, la modificacion comprende la mutacion N298Q (N297 utilizando la enumeracion de Kabat de EU). En ciertas realizaciones, la modificacion comprende la retirada de glicanos del dominio Ch2 o sus porciones. En ciertas realizaciones alternativas, la modificacion evita la formacion de un N-glicano maduro en el sitio de glicosilacion.

En algunas realizaciones, la presente divulgacion se refiere a una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada selecciona de SEQ ID NO: 5, 44 y 50, y una region Fc variante, la region Fc variante comprende un primer resto de aminoacido y un sitio de N-glicosilacion, el primer resto de aminoacido modificado con qmmica de cadena lateral o a traves de una sustitucion de aminoacido para lograr el volumen esferico aumentado o carga electroestatica aumentado en comparacion con el resto de aminoacido no modificado, por lo tanto reduciendo el nivel de o por el contrario alterando la glicosilacion en el sitio de N-glicosilacion. En ciertas de estas realizaciones, la region Fc variante confiere una funcion efectora reducida comparada con un control, una region Fc no variante.

En ciertas realizaciones, la divulgacion se refiere a una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, que comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 5, 44 y 50, y una region Fc variante, la region Fc variante comprende un primer resto de aminoacido y un sitio de N-glicosilacion, el primer resto de aminoacido comprende una tiol cistema, por lo tanto reduciendo el nivel de o alterando la glicosilacion en el sitio de N-glicosilacion, en donde la region Fc variante confiere funcion efectora reducida.

En ciertas realizaciones, el primer resto de aminoacido y el sitio de N-glicosilacion de los anticuerpos anti-CD154 comprende regiones Fc variantes descritas anteriormente que estan cerca o dentro de un motivo de glicosilacion enlazado a N. En realizaciones adicionales, el motivo de glicosilacion enlazado a N comprende las secuencias de aminoacido NXT o NXS. En ciertas realizaciones, el motivo de la glicosilacion enlazada a N comprende la secuencia de aminoacido NXT. En ciertas realizaciones, el sitio de N-glicosilacion esta localizado en el aminoacido 297 de acuerdo con el sistema de enumeracion de Kabat. En realizaciones adicionales, el primer resto de aminoacido modificado es el aminoacido 299 de acuerdo con el sistema de enumeracion de Kabat.

En ciertas de las realizaciones anteriores, la funcion efectora reducida exhibida por cualquiera de los anticuerpos o fragmented de anticuerpo que contienen protemas de union descritas en el presente documento es una union reducida a un receptor Fc (FcR). En ciertas realizaciones, el receptor (FcR) se selecciona de FcyRI, FcyRII y FcyRIII, y uno o mas subtipos de estos, tales como por ejemplo, FcYRIIa. En algunas realizaciones, la union de FcR se reduce por un factor de al menos 1,5 veces o mas, aproximadamente 2 veces o mas, aproximadamente 3 veces o mas, aproximadamente 4 veces o mas, aproximadamente 5 veces o mas, aproximadamente 6 veces o mas, aproximadamente 7 veces o mas, aproximadamente 8 veces o mas, aproximadamente 9 veces o mas, aproximadamente 10 veces o mas, aproximadamente 15 veces o mas, aproximadamente 50 veces o mas, o aproximadamente 100 veces o mas.

En ciertas realizaciones, una protema de union a CD154, por ejemplo un anticuerpo anti-CD154, de la divulgacion con una o mas funciones efectoras reducidas como se describe en el presente documento no se une a un receptor efector espedfico o subtipo receptor efector. En ciertas de estas realizaciones, la protema de union a CD154, por ejemplo un anticuerpo anti-CD154, no se une a FcYRIIa.

En ciertas realizaciones, la funcion efectora reducida exhibida por cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento es una union reducida a una protema complementaria. En algunas realizaciones, la protema complementaria es C1q. En ciertas realizaciones, la union reducida a una protema complementaria es por un factor de aproximadamente 1,5 veces o mas, aproximadamente 2 veces o mas, aproximadamente 3 veces o mas, aproximadamente 4 veces o mas, aproximadamente 5 veces o mas, aproximadamente 6 veces o mas, aproximadamente 7 veces o mas, aproximadamente 8 veces o mas, aproximadamente 9 veces o mas, aproximadamente 10 ves o mas, o aproximadamente 15 veces o mas.

En realizaciones adicionales de la presente divulgacion, una protema de union a CD154, por ejemplo un anticuerpo anti-CD154, de la divulgacion comprende una o mas modificaciones o variaciones en la region Fc, no esta glicosilada y provoca una o mas funciones efectoras reducidas cuando se administra a un sujeto.

En ciertas realizaciones, una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154 de la divulgacion causa menos efectos tromboembolicos que la administracion del anticuerpo 5c8 anti-CD154 cuando se administra a un sujeto.

En ciertas realizaciones de la presente divulgacion, el primer resto modificado de las protemas de union a CD154 o anticuerpos anti-CD154 que comprenden las regiones Fc variantes descritas anteriormente se enlaza a una fraccion funcional. En realizaciones adicionales, la fraccion funcional es una fraccion de bloqueo, una fraccion detectable, una fraccion de diagnostico o una fraccion terapeutica, o una combinacion de estas. Una fraccion de bloqueo, en ciertas realizaciones, puede ser, por ejemplo, un aducto de cistema, un disulfuro mixto, un polietilenglicol o una maleimida de polietilenglicol. Una fraccion detectable, en ciertas realizaciones, puede ser, por ejemplo, una fraccion fluorescente, una fraccion luminiscente o una fraccion isotopica. En realizaciones en donde se utiliza una fraccion de diagnostico, la fraccion de diagnostico puede ser capaz de revelar la presencia de una afeccion, enfermedad o trastorno. En otras realizaciones puede utilizarse la fraccion terapeutica tal como por ejemplo, un agente anti-inflamatorio, un agente anticancengeno, un agente anti-neurodegenerativo, un anticuerpo que es selectivo para una molecula diferente de CD154, o un agente anti-infeccioso.

En ciertas realizaciones de la presente divulgacion, una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154 comprende un resto de aminoacido modificado, la modificacion permite la conjugacion dirigida al sitio de la protema o anticuerpo para una fraccion funcional, tal como para una pegilacion dirigida al sitio. En ciertas realizaciones, el resto de aminoacido modificado es un resto de cistema modificado por una cistema o un aducto de disulfuro mixto. De esta forma, en ciertas realizaciones, la protema de union a CD154 es un polipeptido de anticuerpo anti-CD154 que esta pegilado en un resto de aminoacido modificado, por ejemplo, en un resto de cistema o lisina. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD154 es un fragmento Fab o Fab' pegilado con una PEG-maleimida.

Esta divulgacion tambien proporciona acido nucleico, por ejemplo, secuencias de ADN que codifican las protemas de union a CD154, por ejemplo, anticuerpos anti-CD154, de la divulgacion. Las secuencias de ADN de la presente divulgacion pueden comprender ADN sintetico, por ejemplo, producido a traves del procesamiento qmmico, ADNc, ADN genomico o cualquier combinacion de estos. Esta divulgacion ademas proporciona vectores de clonacion o expresion que comprende uno o mas acidos nucleicos, por ejemplo secuencias de ADN de la presente divulgacion. La divulgacion tambien se refiere, en algunas realizaciones, a un vector que comprende cualquiera de los acidos nucleicos sintetico, aislado y/o recombinante descritos anteriormente.

Esta divulgacion tambien proporciona una celula hospedadora que comprende una secuencia de ADN o un vector de la divulgacion. En ciertos aspectos, la presente divulgacion se refiere a un metodo para producir una protema de union a CD154, por ejemplo anticuerpo anti-CD154 que comprende cultivar una celula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores descritos anteriormente bajo condiciones adecuadas para producir la protema de union a CD154 o anticuerpo anti-CD154 a traves de la celula hospedadora. En algunas realizaciones, el metodo comprende recuperar la protema de union a CD154 o anticuerpo anti-CD154 del cultivo de la celula hospedadora.

En ciertas realizaciones, la protema de union a CD154, el anticuerpo anti-CD154 o el acido nucleico de esta divulgacion

se marcan con un marcador detectable, que puede ser un isotopo radioactivo, un enzima, un colorante o biotina. En

otras ciertas realizaciones, el anticuerpo de esta divulgacion se conjuga con al menos otro agente terapeutico, que

puede ser un radioisotopo, radionuclido, toxina, toxoide, un polipeptido o fragmento de anticuerpo espedfico no CD154

(es decir, creando un anticuerpo diespedfico o multiespedfico), o agente quimioterapeutico, por ejemplo. En aun otras

realizaciones, el anticuerpo de esta invencion se conjuga con un agente formador de imagenes, que podna ser una

fraccion marcadora. El agente marcador tambien puede ser una biotina, una fraccion fluorescente o luminiscente, una

fraccion radioactiva, una etiqueta de histidina, o una etiqueta de peptido.

La presente divulgacion tambien se refiere a variantes de secuencia de las protemas de union a CD154, por ejemplo,

anticuerpos anti-CD154, descritos en el presente documento, y secuencias de acido nucleico que las codifican. Las

variantes de secuencia de la invencion preferentemente comparten al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % de

identidad con un polipeptido de la divulgacion o con una secuencia de acido nucleico que la codifica. Mas

preferentemente, una variante de secuencia comparte al menos 95 %, 96 %, 97 % o 98 % de identidad con el

aminoacido o nivel de acido nucleico. Mas preferentemente, las variantes de secuencias comparten al menos 99 %,

99,5 %, 99,9 % o mas de identidad con un polipeptido de la invencion o una secuencia de acido nucleico que la

codifica.

Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona una protema aislada que comprende una secuencia que es al

menos 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 o 1o0 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID

NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9,

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 72.

En ciertas realizaciones, un polipeptido del anticuerpo anti-CD154, quimerico, humanizado o humano, de la divulgacion

es, por ejemplo, un dAb, Fab, Fab’, scFv, Fv, un Fv enlazado a disulfuro o comprende un solo dominio variable de

inmunoglobulina, tal como un dominio Vh o a Vl, que es espedfico y monovalente para la union de CD154. Ciertas

protemas de union a CD154, por ejemplo, polipeptidos del anticuerpo anti-CD154 quimerico, humanizado o humano

de la divulgacion comprenden 1,2 o mas c Dr de la invencion y el andamio alternativo o secuencias marco universales.

En ciertas realizaciones, las protemas de union a CD154 y los anticuerpos anti-CD154 de la divulgacion comprenden

un solo dominio variable seleccionado de una cadena pesada variable (Vh) y una cadena ligera variable (Vl).

La divulgacion tambien proporciona una protema de union a CD154, por ejemplo, un polipeptido del anticuerpo anti-CD154 quimerico, humanizado o humano, que es monovalente para la union a CD154 que se conjuga con una fraccion

funcional que aumenta su vida media in vivo con relacion al mismo polipeptido que carece de la fraccion funcional. En

ciertas realizaciones, la fraccion funcional comprende o consiste en polietilenglicol. En ciertas realizaciones, la fraccion

funcional comprende o consiste en una molecula de albumina tal como albumina de suero humano. Por consiguiente,

la divulgacion proporciona una protema de union a CD154 enlazada a PEG, por ejemplo, un polipeptido del anticuerpo

anti-CD154 quimerico humanizado o humano enlazada a PEG que especifica y monovalentemente une CD154, y que

tiene una vida media in vivo aumentada con relacion al mismo polipeptido que carece de polietilenglicol enlazado.

Esta divulgacion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende al menos una protema de union

a CD154, por ejemplo un anticuerpo anti-CD154, de la presente invencion, que puede, en algunas realizaciones,

ademas comprender un portador farmaceuticamente aceptable. Una composicion farmaceutica de la divulgacion

puede opcionalmente ademas comprender un agente bioactivo o terapeutico adicional, tal como, por ejemplo, un

compuesto o agente inmunosupresor o inmunomodulador; o un agente de diagnostico. En ciertas realizaciones, la

composicion comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de un anticuerpo Fab’ anti-CD154 pegilado que tiene

la especificidad delepítopo del anticuerpo anti-CD154 y 342 o 338, como se describe en el presente documento.

La presente divulgacion ademas proporciona un metodo para tratar o prevenir una afeccion, trastorno o enfermedad

humana mediada en total o en parte por la senalizacion de CD40, o un smtoma de cualquiera de los anteriores, el

metodo comprende la etapa de administrar al sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de una

composicion farmaceutica que comprende una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, de

la presente invencion, de tal forma que se logra la terapia o prevencion de la afeccion, enfermedad o trastorno.

Esta divulgacion tambien proporciona un metodo para inhibir o prevenir una o mas de una respuesta inmune, autoinmune o inflamatoria mediada en total o en parte por la senalizacion de CD40, o un smtoma de cualquiera de los

anteriores, el metodo comprende la etapa de administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad

terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende la protema de union a CD154, por

ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, de la presente divulgacion, de tal forma que se logra la respuesta terapeutica o

preventiva. En ciertas realizaciones, el metodo se utiliza para tratar a un sujeto que presenta los signos de o

diagnosticado con lupus eritematoso sistemico (SLE). En otras realizaciones, el metodo se utiliza para tratar a un

sujeto que presenta signos de o esta diagnosticado con una afeccion reumatoide, como por ejemplo, artritis reumatoide.

Esta divulgacion proporciona un polipeptido de anticuerpo humano que es monovalente para la union a CD154. En ciertas realizaciones, el polipeptido de anticuerpo humano que es monovalente para la union a CD154, cuando esta presente en o por encima de las concentraciones de saturacion para la union a CD154 con base en su afinidad de union, tanto bloquean la union del anticuerpo 5c8 a CD154 cuando se anade al primer CD154, como desplaza la union del anticuerpo 5c8 a CD154 cuando se anade despues de que se anade el anticuerpo 5c8. En ciertas realizaciones, el polipeptido de anticuerpo humano esta enlazado a PEG. En ciertas realizaciones, el polipeptido del anticuerpo humano esta libre de un dominio Fc. En ciertas de las realizaciones anteriores, la protema de union a CD154 o el polipeptido del anticuerpo humano no desplaza la union de CD154 a CD40.

En ciertas realizaciones, la divulgacion proporciona un anticuerpo Fab' anti-CD154 pegilado que es monovalente para la union de CD154 y ademas proporciona metodos para tratar o prevenir uno o mas de los smtomas de artritis, tal como artritis reumatoide, o lupus eritematoso sistemico (SLE) que comprende la etapa de administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo Fab' anti-CD154 pegilado, de tal forma que se logra una respuesta terapeutica o preventiva.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es una tabla que proporciona las secuencias de aminoacido para las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos anti-CD154342, 381 y 338.

La Figura 2 es una tabla que proporciona las secuencias de aminoacido y de nucleotidos correspondientes para los dominios Vh y Vl del anticuerpo anti-CD154 342 de rata. Las secuencias subrayadas corresponden a las secuencias de nucleotido que codifican un peptido lfder (es decir, senal).

La Figura 3 es una tabla que proporciona las secuencias de aminoacido y de nucleotidos correspondientes de los marcos del aceptor humano utilizadas para producir los anticuerpos anti-CD154 humanizados en los Ejemplos. La Figura 4 es una tabla que proporciona las secuencias de aminoacido y de nucleotidos correspondientes de los dominios Vh y Vl en donde las CDR 342 se han injertado en los marcos en la Figura 3.

La Figura 5 es una tabla que proporciona las secuencias de aminoacido y las secuencias de nucleotido correspondientes de los dominios Vh del anticuerpo 342(VH3 gH1 y VH4 gH1) en donde las CDR 342 se injertan en los marcos del aceptor humano y en donde se mantienen ciertos restos de donador clave.

La Figura 6 es una tabla que proporciona las secuencias de aminoacido y nucleotidos correspondientes a un dominio Vl del anticuerpo 342 (VK1 gL4) en donde las CDR 342 se injertan en los marcos aceptores humanos y en donde se mantienen ciertos restos de donador clave.

La Figura 7 es una tabla que proporciona secuencias para la cadena ligera completa (regiones de cadena ligera variable y constante) y regiones de cadena pesada del anticuerpo 342. Las secuencias que corresponden a peptidos senal/lfder estan subrayados.

La Figura 8 muestra la secuencia de nucleotido de los insertos de expresion que se utilizaron para formar las versiones Fab (SEQ ID NO: 28) y Fab' (SEQ ID NO: 41) del injerto 342 gL4gHl. Las secuencias senal/lfder estan subrayadas y los sitios de restriccion (utilizados para la clonacion en vector de expresion E. coli como se describe en el Ejemplo 2) estan en letra mayuscula y negrita.

La Figura 9 muestra un alineacion de las cadenas ligera y pesada de la secuencia de aminoacido del anticuerpo anti-CD154 342 de rata (donador) con los marcos de la lmea germinal humana (aceptor) utilizada en la humanizacion del anticuerpo 342. “Ligera 342” es la secuencia del dominio Vl de rata. “Pesada 342” es la secuencia del dominio Vh de rata. Los restos CDR estan en negrita y subrayados. Se muestran las cadenas ligera (211 O12; SEQ ID NO: 35) y pesada (1-1 3-66; SEQ ID NO: 37 y 1-1 4-59; SEQ ID NO: 39) marco aceptoras. Tambien se muestran los injertos solamente de CDR en los marcos aceptores de la lmea germinal humana (VK1 gL3, VH3 gH7 y VH4 gH6). En ciertas cadenas ligeras y pesadas humanizadas, los restos donadores del anticuerpo 342 se retienen dentro de la region marco, y estos restos marco donadores clave se muestran en cursiva negrita y resaltados. El contenido donador VK1 gL4 es R38, Y71 y S85. El contenido donador VH3 gHl es V24, M48, G49, T73 y V78. El contenido donador VH4 gH1 es M48, R71 y V78. Las SEQ ID NO para las cadenas ligeras mostradas, en el orden de arriba hacia abajo son SEQ ID NO: 30 (“342”), SEQ ID NO: 35 (“211 O12”), SEQ ID NO: 14 (“342 gL3”) y SEQ ID NO: 2 (“342 gL4”). Las SEQ ID NO para cadenas pesadas mostradas (injertos VH3) en el orden de arriba hacia abajo, son SEQ ID NO: 29 (“342”), SEQ ID NO: 37 (“1-13-66”), SEQ ID NO: 10 (“342 gH7”), y SEQ ID NO: 1 (“342 gHl”). Las SEQ ID NO para cadenas pesadas mostradas (injertos VH4), en orden de arriba hacia abajo son SEQ ID NO: 29 (“342”), SEQ ID NO: 39 (“1-1 4-59”), una variante de SEQ ID NO: 9 (“VH4 gH6”) y variante de SEQ ID NO: 11 (“VH4 gHl”). La SEQ ID No : 9 y SEQ ID NO: 11 variantes mostradas en la Figura 9 comienzan con el aminoacido “E” (en lugar de “Q” como en las Figura 4 y 5, respectivamente) para la expresion en E. coli. Por consiguiente, las secuencias de nucleotido que corresponden a estas variantes SEQ ID NO: 9 y 11 difieren en las secuencias de nucleotido establecidas en SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21 en que estas inician con el nucleotido “g” en lugar de “c”.

La Figura 10 proporciona las secuencias de aminoacido Vl y Vh y de nucleotido correspondientes para el anticuerpo anti-CD154381. Las secuencias de aminoacido CDR se subrayan.

La Figura 11 proporciona las secuencias de aminoacido Vl y Vh y de nucleotidos correspondientes para el anticuerpo anti-CD154338. Las secuencias de aminoacido CDR se subrayan.

La Figura 12 es una tabla que enumera los anticuerpos CD154 anti-humanos de rata aislados a traves del Metodo del Anticuerpo del Linfocito Seleccionado (SLAM). La Tabla proporciona los valores K^d e IC⁵⁰ obtenidos con estos anticuerpos en el ensayo de union CD40 Biacore®, y ensayos de regulacion ascendente ICAM-1. Los datos obtenidos con el anticuerpo 342 se resaltan.

La Figura 13 proporciona las secuencias de aminoacido de cadena ligera Kappa y nucleotidos correspondientes del anticuerpo anti-CD154 aglicosilado hu5c8 (hu5c8 aglyP- huIgG4).

La Figura 14 proporciona las secuencias de aminoacido de cadena pesada y nucleotido correspondiente del anticuerpo anti-CDl54 aglicosilado hu5c8 (hu5c8 aglyP- huIgG4). Las mutaciones hechas para crear la variante glicosilada (S228P/T299A en la nomenclature de EU Kabat; los restos 226 y 297) se muestran subrayados y en negrita en la secuencia de protema madura.

La Figura 15 proporciona las secuencias de aminoacido de cadena ligera kappa y nucleotidos correspondientes del anticuerpo anti-CD154 aglicosilado hu342 (hu342 aglyP- huIgG4).

La Figura 16 proporciona la secuencia de aminoacido de cadena pesada y nucleotido correspondientes del anticuerpo anti-CD154 aglicosilado hu342 (hu342 aglyP-huIgG4). Las mutaciones hechas para hacer la variante aglicosilada (S228P/T299A en la nomenclature de EU de Kabat; los restos 226 y 297) se muestran subrayados y en negrita en la secuencia de protema madura.

Las Figura 17 muestra los fragmentos Fab' ilustrativos y un gel que muestra la PEGilacion espedfica del sitio en un fragmento Fab' de un anticuerpo anti-CD154. El Fab' se pegilo mediante la reaccion de PEG-maleimida con un solo resto de cistema en la bisagra.

La Figura 18 es una tabla que proporciona los valores K^d e IC⁵⁰ obtenidos en los ensayos de union CD40 Biacore®, ensayos de regulacion ascendente ICAM-1, y ensayos de union de competencia CD40L para diferentes realizaciones del anticuerpo gL4gHl 342 humanizado incluyendo los fragmentos Fab' y los conjugados del anticuerpo-PEG.

La Figura 19 muestra dos graficas de los valores de la concentracion IgG anti-TT (toxoide tetanico) como una funcion del tiempo en monos cynomolgus que reciben bien un control salino o varias dosis de anticuerpos anti-CD154. La grafica superior muestra los valores de concentracion IgG para los dfas 0-20 despues del tratamiento con anticuerpo y el ataque con TT (la respuesta inmune primaria), y la grafica inferior muestra los valores para los dfas 30-50 despues del tratamiento con el anticuerpo y un segundo ataque con TT en el dfa 30.

La Figura 20 es una grafica de los valores de concentracion IgG del anti-TT (toxoide tetanico) como una funcion del tiempo en monos cynomolgus que reciben varios formatos de anticuerpos anti-CD154 en una sola dosis (20 mg/kg para hu5x8, aglicosilo 5c8 y aglicosilo 342 y 40 mg/kg para Fab'-PEG 342 y DFM-PEG 342). DFM-PEG es un fragmento de anticuerpo en donde los dos fragmentos Fab' estan entrelazados con un puente de dimaleimida PEGilado.

La Figura 21 es una grafica de los valores de la concentracion de IgM de anti-TT (toxoide tetanico) como una funcion de tiempo en monos cynomolgus que reciben ya sea un control salino o varias dosis de anticuerpos anti-CE154. La grafica muestra los valores de concentracion de IgM para los dfas 0-20 despues del ataque con TT (respuesta primaria).

La Figura 22 es una grafica que compara los farmacocineticos en los monos cynomolgus del anticuerpo Fab'-PEG 342 y el anticuerpo hu5c8.

La Figura 23 muestra los resultados del analisis de citometna de flujo del bloqueo cruzado de la union de Fab' 342 marcado a celulas Jurkat D1.1 que expresa CD154 pre-unidas con un primer Fab' anti-CD154 sin marcar, como se indica en cada Figura (23A - A33; 23B - 338; 23C - 402; 23D - 381; 23E - 300; 23F - 294; 23G - 335; 23H - 303) (vease el Ejemplo 9). A33 es un anticuerpo de control en comparacion con isotipo y confirma que no existe un bloqueo cruzado no espedfico.

La Figura 24 muestra los resultados del analisis de citometna de flujo del bloqueo cruzado de Hu5c8 marcado de union a celulas Jurkat Fab' D1.1 que expresan CD154 pre-unidas con un primer Fab' de anti-CD154 sin marcar, como se indica en cada Figura (24A - 338; 24B - 402; 24C - 381; 24D - 303; 24E - 335; 24F - 300; 24G - 294; 24H - A33) (vease el Ejemplo 9). A33 es un anticuerpo de control en comparacion con isotipo y confirma que no existe un bloqueo cruzado no espedfico.

Las Figuras 25 A-F muestran los resultados del analisis Biacore® de union competitiva de diversas formas de los anticuerpos 342 y Hu5c8 con protema CD154 soluble (ECD) o un complejo CD40:CD154. FL - Longitud completa. CD40hFc - protema de fusion CD40 humana.

La Figura 26 es una grafica que muestra los resultados del ensayo de agregacion de plaquetas descrito en el Ejemplo 11 (Ensayo 1) realizado con el anticuerpo anti-CD154 Hu5c8, el anticuerpo anti-CD154 Fab'-PEG 342 y anticuerpos de control. El primer panel muestra los resultados obtenidos con los complejos CD40L formados con IgG completa y el segundo panel muestra los complejos formados con Fab'-PEG o diFab'-PEG. El tercer panel muestra los resultados obtenidos con triFab'-PEG y el anticuerpo hu342 anti-CD154 aglicosilado.

La Figura 27 es una grafica que muestra los resultados de un ensayo de agregacion de plaquetas descrito en el Ejemplo 1 (Ensayo 2) llevado a cabo con anticuerpos de control positivo y negativo. Los resultados demuestran que la agregacion de plaquetas se mejora espedficamente por los complejos del anticuerpo anti-CD154 de control positivo y CD40 L soluble humano recombinante (sCD154).

La Figura 28 muestra un alineamiento de secuencia de secuencias de aminoacido CD40L solubles de humano y raton. Las diferencias entre las secuencias de humano y de raton se indican en rojo. Las secuencias del epítopo Hu5c8 se indican en azul. Los restos internos se marcan con “ | ”. Se seleccionaron seis regiones (1-6) de la secuencia en donde se introdujeron restos humanos en el CD40L de raton soluble.

La Figura 29 muestra los resultados de un ensayo ELISA de competicion para demostrar el bloqueo cruzado de 342 Fab' y hu5c8 Fab' (vease el Ejemplo 14). La Figura 29A muestra los resultados de una titulacion de biotina 432 Fab' en CD154. Una concentracion de 1 nM esta en la parte lineal de la curva. La Figura 29B muestra los resultados de una titulacion de biotina hu58 Fab' en CD154. Una concentracion de 0.3 nM esta en la parte lineal de la curva. La Figura 29C muestra el bloqueo cruzado de biotina 342 y biotina 5c8 a traves de Fab' 342 sin marcar. ch342 Fab es el Fab' 342 quimerico. La Figura 29D muestra el bloqueo cruzado de biotina 342 a traves de Fab' 5c8 sin marcar.

Descripcion detallada de la invencion

Con el fin de que la invencion aqu descrita pueda entenderse mas completamente, se establece la siguiente descripcion detallada. A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comunmente entendido por un experto en la materia a la cual pertenece esta invencion. Los metodos y materiales a modo de ejemplo se describen a continuacion, aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento tambien pueden utilizarse en la practica de la presente invencion y seran evidentes para el experto en la materia.

Los trabajos de referencia convencionales que establecen los principios generales de tecnologfa de ADN recombinante conocidos por los expertos en la materia incluyen Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 y Suplementos hasta 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufman et al., Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991).

Los trabajos de referencia convencionales que establecen los principios generales de inmunologfa conocidos por los expertos en la materia incluyen: A Laboratory Manual, 2a. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1999); y Roitt et al., Immunology, 3a. Ed., Mosby- Year Book Europe Limited, Londres (1993). Los trabajos de referencia convencionales que establecen los principios generales de fisiologfa medica y farmacologfa conocidos por los expertos en la materia incluyen: Fauci et al., Eds., Harrison's Principles Of Internal Medicine, 14a. Ed., McGraw-Hill Companies, Inc. (1998).

Definiciones

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “protema de union a CD154” incluye cualquier molecula, incluyendo un anticuerpo, que espedficamente se une o antagoniza con CD154. De esta forma, como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo anti-CD154 es una clase de protemas de union espedficas de CD154. Una protema de union a CD154 de la invencion puede comprender al menos una, preferentemente dos, tres o mas CDR, como se describe en el presente documento. Una protema de union a CD154 u otra tal como un antagonista de CD154 puede abarcar especies que no son fragmentos de anticuerpo clasicos o derivados pero que sin embargo comprenden secuencias de aminoacido y/o estructuras qmmicas que confieren especificidad de union al epítopo CD154. Los antagonistas CD154 pueden hacerse, por ejemplo, de andamios alternativos (vease, por ejemplo, Binz et al., 2005 Nat Biotech 23: 1257-1268 and Hosse et al., 2006 Protein Science 15: 14-27). La protema de union a CD154 o el antagonista pueden fusionarse en una region Fc de anticuerpo que es funcionalmente deficiente o a una fraccion funcional heterologa como se describe en el presente documento para mejorar la vida media y/o otras propiedades in vivo de la protema de union a CD154.

Las protemas de union a CD154 pueden comprender al menos una de las CDR descritas en el presente documento incorporadas en una estructura de marco biocompatible. En un ejemplo, la estructura de marco biocompatible comprende un polipeptido o una porcion suya que es suficiente para formar un soporte estructural conformacionalmente estable, un marco, un andamio, que es capaz de desplegar una o mas secuencias de aminoacido que se unen a un antígeno (por ejemplo, CDR, un dominio variable, etc.) en una region de superficie localizada. Dichas estructuras pueden ser un polipeptido de origen natural o un “pliegue” polipeptfdico (un motivo estructural) o puede tener una o mas modificaciones, tales como adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos, con relacion a un polipeptido de origen natural o pliegue. Estos andamios pueden derivarse de un polipeptido de cualquier especie (o de mas de una especie) tal como humano, otro mairnfero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o virus.

Tfpicamente, las estructuras marco biocompatibles se basan en andamios o esqueletos de protema diferentes de los dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden utilizarse los basados en fibronectina, anquirina, lipocalina, neorcarzonostaina, citocromo b, dedo de zinc CP1, PST1, bobina bobinada, LACI-D1, dominio Z y dominios de tendramisat (vease, por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).

El termino “anticuerpo” como se utiliza en el presente documento con respecto a la invencion, incluye un anticuerpo, conjugado de anticuerpo o derivado de anticuerpo aislado, recombinante o sintetico. El termino “anticuerpo” por lo general pretende incluir un fragmento de anticuerpo, incluyendo un fragmento de union a antígeno, a menos que se indique lo contrario o se entienda por el contexto. Un fragmento de union a antígeno compite con el anticuerpo intacto para la union espedfica. Vease, generalmente, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a. ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Los fragmentos de union a antígeno pueden producirse a traves de tecnicas de ADN recombinante o a traves de division enzimatica o qmmica de anticuerpos intactos. En algunas realizaciones, los fragmented de union antigeno incluyen Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv, anticuerpos de dominio (dAb), otros fragmentos monovalentes y divalentes, fragmentos de la region determinadora de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena individual (por ejemplo, scFv, scFab, y scFabAC), anticuerpos quimericos, diacuerpos, triacuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, y polipetidos que contienen al menos una porcion de un anticuerpo que es suficiente para conferir la union de antigeno espedfica al polipeptido; y funciones y derivados de los anteriores. Vease, por ejemplo, Holliger y Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1 136 (2005) y Hust et al., BMC Biotech 7: 14 (2007).

Un “fragmento Fd” es un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios Vh y Cm); un “fragmento Fv” consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo; un “fragmento scFv” es un anticuerpo de cadena individual que comprende una region variable de cadena pesada (Vh) y una region variable de cadena ligera (Vl) unida por un enlazador de peptido; un “fragmento scFab” es un anticuerpo de cadena simple que comprende un fragmento difteil (Fd) unido a una cadena ligera a traves de un enlazador de peptido; un fragmento “scFabAC” es una variante scFab sin cistema (vease, por ejemplo, Hust et al., supra); y un “fragmento dAb” (anticuerpo de dominio simple) comprende un solo dominio variable (por ejemplo, un dominio Vh o Vl) (Ward et al., Nature 341 :544-546 (1989)). Ademas, tambien incluyen los diacuerpos y triacuerpos. Los diacuerpos y triacuerpos de la presente invencion incluyen, por ejemplo, diacuerpos y triacuerpos homodimericos y heterodimericos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los dominios variables que forman un triacuerpo pueden unirse a tres epítopos diferentes o epttopos identicos.

A menos que se declare lo contrario o en donde se implique lo contrario por contexto, un “anticuerpo” de la presente invencion incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de union antígeno de los mismos, derivados de anticuerpo o variantes que pueden contener una o mas modificaciones (por ejemplo, una insercion, delecion, sustitucion, una modificacion post-traduccional o falta de la misma, de aminoacido, etc.), incluyendo conjugados de anticuerpo (es decir, anticuerpo o fragmentos de union de antígeno de los mismos conjugados con o asociados a una fraccion funcional). Los derivados de anticuerpo, incluyendo conjugados de anticuerpo, pueden basarse en o pueden comprender un fragmento de union a antígeno de la invencion que une espedficamente CD154. Adicionalmente, las realizaciones de anticuerpo de la presente invencion pueden ser anticuerpos de raton (murinos), de hamster, de cabra, de conejo, quimericos, humanizados, o completamente humanos, fragmentos, derivados o conjugados. Se entiende que en ciertos aspectos de la invencion, el termino “anticuerpo” puede excluir una o mas de las realizaciones de anticuerpo descritas anteriormente; tales condiciones seran evidentes para el experto en la materia.

Los terminos “pegilacion”, “polietilenglicol” o “PEG” incluyen un compuesto de polialquilen glicol o derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento o derivatizacion con fracciones de acoplamiento o activacion (por ejemplo, con tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirano, o preferentemente con una fraccion de maleimida, por ejemplo, PEG-maleimida). Otros compuestos de polialquilen glicol apropiados incluyen, pero no se limitan a, maleimida monometoxi PEG, propilenglicol PEG activado, pero tambien polfmeros cargados o neutrales de los siguientes tipos: dextrina, acidos colommicos, u otros polfmeros con base en carbohidrato, polfmeros de aminoacidos y biotina y otros derivados del reactivo de afinidad.

El termino “funcion efectora” se refiere a la capacidad funcional de la region Fc o constante de un anticuerpo para unir protemas y/o celulas del sistema inmune. Anticuerpos que tienen funcion efectora reducida y los metodos para modificarlos son bien conocidos en la tecnica (Vease, por ejemplo, los documentos WO 05/18572, WO 05/03175, y US 6.242.195) y se describen con mayor detalle en el presente documento. Las funciones efectoras tfpicas incluyen la capacidad de unir una protema de complemento (por ejemplo, la protema complemento C11), y/o un receptor Fc (FcR) (por ejemplo, FcyRI, FcyRII, FcYRIla, FcyRIII, y/o FcYRIIIb). Las consecuencias funcionales de ser capaz de unir una o mas de las moleculas anteriores incluyen, sin limitacion, opsonizacion, fagocitosis, citotoxicidad celular dependiente de antígeno (ADCC), citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o modulacion celular efectora. Una disminucion en la funcion efectora se refiere a una disminucion en una o mas de las actividades bioqmmicas o celulares inducidas al menos en parte por la union de Fc a su receptor afm o a una protema complementaria o celula efectora, mientras se mantiene la actividad de union a antígeno de la region variable del anticuerpo (o su fragmento), a pesar de su afinidad de union reducida, similar, identica o aumentada. Los anticuerpos particulares de la invencion exhiben funcion efectora reducida. La disminucion en la funcion efectora, por ejemplo, union de Fc a un receptor Fc o protema complementaria, puede expresarse en terminos de reduccion de veces (por ejemplo, reducida en 1,5 veces, 2 veces, y similares) y puede calcularse basandose en, por ejemplo, la reduccion en porcentaje en la actividad de union determinada utilizando ensayos de union conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, el documento WO 05/18572).

A menos que se requiera lo contrario por el contexto, los terminos singulares deberan incluir pluralidades y los terminos plurales deberan incluir el singular.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra “comprender” o variaciones tales como “comprende” o “comprendiendo” se entendera que implica la inclusion de un numero entero o grupo de numeros enteros manifestados pero no la exclusion de cualquier otro numero entero o grupo de numeros enteros.

CD154

CD154 se conoce por muchos otros nombres en la tecnica, tales como el ligando CD40 (CD30L), contra receptor CD40 (CD40CR), gp39, T-BAM, Molecula de Activacion de Celula T, TRAF, Protema de Activacion Relacionada con TNF (TRAP), y Miembro 5 de la Superfamilia de Ligando del Factor de Necrosis Tumoral (TNFSF5) (Gauchat et al., 1993 FEBS Lett. 315: 259-266; Graf et al., 1992, Europ. J. Immun. 22: 3191-3194; Hollenbaugh et al., 1992 EMBO J.

11:4313-4321). Estos terminos se utilizan de manera intercambiable a lo largo de esta solicitud. Las protemas de union a CD154, incluyendo los anticuerpos, de esta divulgacion se unen espedficamente al CD154 humano y pueden reaccionar de manera cruzada y por consiguiente unirse espedficamente a CD154 de otras especies. En ciertas realizaciones, las protemas de union a CD154, incluyendo los anticuerpos, de esta invencion se unen espedficamente a CD154 de humano, CD154 de raton o CD154 de primate no humano.

Anticuerpos Anti-CD154 y Protemas de union a CD154

La expresion “anticuerpo anti-CD154” como se utiliza en el presente documento se refiere a una molecula de inmunoglobulina que es capaz de unir espedficamente a un epttopo en un antigeno CD154. Los anticuerpos anti-CD154 pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunoreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son tfpicamente tetrameros de moleculas de inmunoglobulina.

Por consiguiente, como se hace referencia en todas las realizaciones y metodos de esta divulgacion, un “anticuerpo anti-CD154” abarca (a menos que se indique lo contrario o se sugiera lo contrario por el contexto) un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo murino, un anticuerpo de hamster, un anticuerpo de cabra, un anticuerpo de conejo, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo primatizado, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano (completo), un anticuerpo multimerico, un anticuerpo heterodimerico, un anticuerpo hemidimerico, un anticuerpo bi-, tri-, o tetravalente, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo de cadena simple (por ejemplo, scFv, scFab, and scFabAC), Bis-scFv, un diacuerpo, un triacuerpo o tetracuerpo, anticuerpos de dominio simple, y fragmentos Fab modificados. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD154 es un anticuerpo que comprende solamente un dominio simple de inmunoglobulina variable. Por consiguiente, los anticuerpos monovalentes incluyen anticuerpos que comprenden solamente un dominio variable de inmunoglobulina (es decir, una sola cadena variable ligera o pesada) y que se une espedficamente a CD154. Ademas, los anticuerpos anti-CD154 de la invencion pueden ser monovalentes, divalentes o multivalentes para CD154.

En ciertas realizaciones, una protema de union a CD154, por ejemplo un anticuerpo anti-CD154, con una funcion efectora reducida comprende cualquier porcion de un anticuerpo anti-CD154 que es suficiente para mantener la union espedfica al antígeno CD154. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender solamente un dominio de inmunoglobulina variable simple, un dominio Vh o Vl.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, una protema de union a CD154, por ejemplo un anticuerpo anti-CD154, es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, por ejemplo un fragmento de Fab, un fragmento de F(ab)2, un fragmento de Fab1, un fragmento de F(ab')2, un fragmento de F(ab')3, un fragmento de cadena simple de F(v) o un fragmento de F(v) y fragmentos de union a epítopo de cualquiera de los anteriores (vease, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136). Los fragmentos de anticuerpo de la invencion se describen con mayor detalle mas adelante.

En un ejemplo, las protemas de union a CD154 o anticuerpos anti-CD154 son anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos del subtipo IgG4) o fragmentos (por ejemplo, fragmentos Fab') que poseen una region bisagra nativa o modificada. Han sido descritas numerosas regiones bisagra modificadas, por ejemplo, en los documentos US 5.677.425, WO 99/15549, y WO 98/25971. En otro ejemplo, los anticuerpos de la invencion se modifican en sus regiones constantes como los anticuerpos descritos en W o 05/003169, WO 05/003170 y WO 05/003171. Cualquiera de los anticuerpos anti-CD154 antes mencionados, derivados de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden utilizarse para formar conjugados de anticuerpo de la presente invencion. Cualquiera de los anticuerpos anteriores, fragmentos y conjugados pueden producir una funcion efectora reducida en comparacion con un segundo anticuerpo anti-CD154.

Las moleculas del anticuerpo de la invencion pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD o IgA) o subclases de moleculas de inmunoglobulina. Los dominios de region constante del anticuerpo, si estan presente, pueden seleccionarse estando relacionados con la funcion propuesta de la molecula del anticuerpo. Por ejemplo, los dominios de la region constante pueden ser dominios IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humano. En particular, los dominios de la region constante de IgG humana pueden utilizarse, especialmente IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Los isotipos IgG2 e IgG4 pueden utilizarse en ciertas realizaciones en donde la molecula del anticuerpo esta pensada para usos terapeuticos para los cuales las funciones efectoras del anticuerpo reducidas o eliminadas son deseadas. Alternativamente, los isotipos IgG1 e IgG3 pueden utilizarse cuando la molecula del anticuerpo esta pensada para propositos terapeuticos para los cuales se requieren las funciones efectoras del anticuerpo.

En algunas realizaciones, una o mas de las CDR de una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo, de la invencion puede incorporarse en uno o mas dominios de inmunoglobulina, marcos universales, andamios de protema u otras estructuras biocompatibles con base en andamios o esqueletos de protema diferentes de los dominios de inmunoglobulina (Nygren & Uhlen, 1997, Curr. Opin. Strural Biol. 7:463-469; Saragovi et al., 1992, Bio/Technology 10:773-779; Skerra, 2000, J. Mol Recognition 13:167- 187). En ciertas realizaciones, las CDR de un anticuerpo anti-CD154 se incorporan en un marco universal (es decir, un marco que puede utilizarse para crear la variabilidad completa de las funciones, especificidades, o propiedades que estan originalmente sostenidas por una gran coleccion de diferentes armazones, vease el documento U.S. 6.300.064). En otras realizaciones, los andamios alternativos (Vease, por ejemplo, Binz et al., 2005 Nat Biotech 23: 1257-1268 y Hosse et al., 2006 Protein Science 15: 14-27) pueden utilizarse para crear protemas de union a CD154 de la invencion.

El termino “anticuerpo anti-CD154” tambien abarca un anticuerpo sintetico o un anticuerpo recombinante que se genera utilizando tecnologfa de ADN recombinante, tal como por ejemplo, una protema expresada por un bacteriofago. El termino “anticuerpo anti-CD154” debera construirse para incluir un anticuerpo que ha sido generado mediante smtesis de una molecula de ADN que codifica para el anticuerpo y cuya molecula de ADN expresa una protema de anticuerpo, o una secuencia de aminoacido que especifique el anticuerpo, en donde el a Dn o la secuencia de aminoacido han sido obtenidas utilizando ADN sintetico o tecnologfa de secuencia de aminoacido que esta disponible y es bien conocida en la tecnica.

En una realizacion, la invencion proporciona un “anticuerpo anti-CD154” que es un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo monoclonal se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpo individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por mutaciones de origen natural posibles que pueden estar presentes en cantidades menores. El modificador “monoclonal” indica el caracter del anticuerpo como obteniendose de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no se construira requiriendo la produccion del anticuerpo a traves de un metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de acuerdo con la presente invencion pueden producirse a traves del metodo de hibridoma (murino o humano) descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden producirse a traves de metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, US 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” tambien pueden aislarse de colecciones de anticuerpo de fago utilizando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624­ 628 (1991) y Marks et al., J Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo. Tambien se entiende que ciertas realizaciones de la presente invencion se refieren a composicion que comprenden uno o mas anticuerpos monoclonales diferentes que se unen espedficamente a CD154, es decir, una composicion de anticuerpo policlonal que comprende una pluralidad de anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de epítopo.

En otra realizacion de la invencion, un “anticuerpo anti-CD154” se refiere a un anticuerpo que es un anticuerpo quimerico, o un derivado de anticuerpo o conjugado o fragmento de union a antígeno del mismo. Tfpicamente, los anticuerpos quimericos incluyen las regiones variables de cadena pesada y/o ligera, incluyendo tanto CDR como restos de marco, de una especie (tfpicamente raton) fusionadas a regiones constantes de otras especies (tfpicamente humana). Estos anticuerpos de raton/humano quimericos contienen aproximadamente un 75 % de secuencias de aminoacido humanas y un 25 % de raton. Las secuencias humanas representan las regiones constantes del anticuerpo, mientras que las secuencias de raton representan las regiones variables (y por lo tanto contienen los sitios de union a antígeno) del anticuerpo.

En otra realizacion, las protemas de union a CD154, los anticuerpos anti-CD154 de la invencion incluyen anticuerpos, derivados de anticuerpo y fragmentos de union a antígeno que comprenden un dominio variable que comprende regiones de marco de un anticuerpo, y regiones CDR de otro anticuerpo.

En una realizacion mas espedfica, las protemas de union a CD154 y los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion incluyen anticuerpos quimericos que comprenden regiones marco y regiones CDR de diferentes anticuerpos humanos.

Los metodos para formar los anticuerpos quimericos descritos anteriormente son bien conocidos por un experto en la materia. Vease, por ejemplo, el documento US 5.807.715; Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81(21):6851-5; Sharon et al., (1984) Nature 309(5966):364-7; Takeda et al., (1985) Nature 314(6010):452-4.

En ciertas realizaciones de la presente invencion, un anticuerpo anti-CD154 que une CD154 se genera a traves del Metodo de Anticuerpo de Linfocito Seleccionado (SLAM) (Babcook et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci, 93, 7843-7848; WO 92/02551; de Wildt et al., 1997, J. Immunol. Methods, 207:61-67 y en Lagerkvist, et al., 1995, BioTechniques 18:862-869) que permite el aislamiento de cualquier especie de celulas que produce anticuerpos de alta afinidad durante respuestas inmunes in vivo. Otras tecnicas incluyen aquellas descritas por Wildt et al., 1997, J. Immunol. Methods, 207:61-67 y Lagerkvist et al., 1995, BioTechniques 18(5):862-869. Los metodos anteriores se basan en el aislamiento de celulas productoras de anticuerpo individuales que despues se expanden clonalmente seguido por clasificacion de esos clones que producen anticuerpos anti-CD154 seguido por la posterior identificacion de la secuencia de genes de cadena pesada (Vh) y ligera (Vl) variable. Un metodo de cribado particular se detalla en WO 04/051268. De esta forma, las celulas B que son positivas para anticuerpos para CD154 se afslan. Las celulas B pueden ser de humano, raton, rata, hamster, conejo, cabra u otras especies mairnferas. Los genes del anticuerpo en estas celulas B pueden clonarse y expresarse en una sola celula hospedadora, por ejemplo, a traves de tecnologfa de ADN recombinante convencional. En ciertas realizaciones, la celula hospedadora es E. coli. Otras celulas hospedadoras se detallan a continuacion. Los anticuerpos (que incluyen fragmentos de anticuerpo tal como los fragmentos Fab') expresadas en estas celulas pueden purificarse a travé dse medios convencionales. Si los anticuerpos son de una fuente no humana, se pueden humanizar a traves de metodos convencionales, tal como a traves de mutagenesis de sus genes. Los anticuerpos humanizados pueden posteriormente expresarse en una celula hospedadora y pueden purificarse.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse a traves de cualquier metodo conocido en la tecnica tal como la tecnica de hibridoma (Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256:495-497), la tecnica de trioma, la tecnica de hibridoma de celula B humana (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) y las tecnica de hibridoma EBV (Cole et al., “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985). Los metodos para crear y fabricar anticuerpos recombinantes son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, US 4.816.397; US 6.331.415; Simmons et al., 2002, Journal of Immunological Methods, 263, 133-147; WO 92/02551; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; US 5.585.089; WO91/09967; Mountain y Adair, 1992, Biotechnol Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, J. Immunol. Methods, 216:165-181; Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136).

Los anticuerpos de la presente invencion tambien se pueden generar utilizando varios metodos de visualizacion de fago conocidos en la tecnica e incluyen aquellos descritos por Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184, 177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol, 24, 952-958; Persic et al., 1997, Gene, 187, 9-18; y Burton et al., 1994, Advances in Immunol, 57, 191-280; documentos WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; and WO 95/20401; y US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; y 5.969.108.

Tambien, los ratones transgenicos (por ejemplo, geneticamente modificados), u otros organismos, incluyendo otros mairnferos, pueden utilizarse para producir protemas de union y anticuerpos de esta invencion (vease, por ejemplo, el documento US 6.300.129). Por ejemplo, se sabe que los ratones modificados para reemplazar solamente las regiones variables de loci inmunes de raton (cadena pesada V, D y los segmentos J, y la cadena ligera V y los segmentos J) con secuencias variables humanas correspondientes pueden emplearse para producir grandes cantidades de anticuerpos de alta afinidad con secuencias variables humanas (vease, por ejemplo, los documentos US 6.586.251; US 6.596.541 y US. 7.105.348).

En otra realizacion de esta invencion un “anticuerpo anti-CD154” se refiere a un anticuerpo, derivado o conjugado de anticuerpo, o fragmento de union a antígeno que se primatiza o humaniza. Los anticuerpos primatizados y humanizados tfpicamente incluyen CDR de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo murino injertado en un marco de la region V del anticuerpo de primate no humano o humano, usualmente ademas comprendiendo una region constante humana. Vease, por ejemplo, Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-327; US 6.054.297; 5.821.337; 5.770.196; 5.766.886; 5.821.123; 5.869.619; 6.180.377; 6.013.256; 5.693.761; y 6.180.370.

La base logica para utilizar los anticuerpos primatizados humanizados es retener la especificidad del antígeno (humano) del anticuerpo de raton conferido por las CDR de raton pero reducir la inmunogenicidad del anticuerpo de raton (un anticuerpo de raton causana una respuesta inmune contraria en las especies diferentes del raton) mediante el uso de tantas secuencias marco humanas como sea posible. Dichos anticuerpos pueden utilizarse en terapias humanas para minimizar o eliminar los efectos secundarios indeseados, tales como respuestas inmunes. Los anticuerpos que comprenden CDR donadoras injertadas de anticuerpos no humanos espedficos de antígeno sobre marcos aceptores de primate no humano homologas que tienen inmunogenicidad reducida en humanos han sido descritos (documentos US 2005/0208625; US 2002/0062009; US 7.338.658).

Por consiguiente, las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quimericas espedficas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de estas (tales como Fv, Fab, Fab¹, F(ab')² u otras subsecuencias de union a antígeno de anticuerpo) que contienen secuencias derivadas de inmunoglobulina no humana y secuencias de inmunoglobulina humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en donde los restos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo receptor se reemplazan por restos de las CDR de especies no humanas (anticuerpo donador) tal raton, rata o conejo que tienen la especificidad deseada, afinidad y capacidad. En algunas instancias, los restos de la region de estructura Fv(FR) de la inmunoglobulina humana estan reemplazados por restos FR no humanos correspondientes.

Ademas, el anticuerpo humanizado puede comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las CDR importadas o las secuencias FR. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente todos de al menos un, y tfpicamente 2, dominios variables, en donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de la inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los restos FR son los de las secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien puede comprender al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente de una inmunoglobulina humana.

Un anticuerpo humanizado (que incluye, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo, y derivados o conjugados de un anticuerpo) puede producirse a traves de tecnologfa de ADN recombinante, en donde algunos o todos los aminoacidos en la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humana que no son requeridos para la union del antigeno (por ejemplo, la region constantes y las regiones marco de los dominios variables) se utilizan para sustituir los aminoacidos correspondientes de la cadena ligera o pesada del anticuerpo no humano afm. Los metodos para hacer anticuerpos humanizados son bien conocidos por el experto en la materia de los anticuerpos. Vease, por ejemplo, EP 239400; Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-1536; Queen et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029; Orlandi et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833; US 6.180.370, y EP 519596, que describe el anticuerpo que cubre los restos de la superficie.

Por consiguiente, en una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 se refiere a un anticuerpo humanizado (que incluye sin limitacion un fragmento de union a antigeno humanizado y un derivado de anticuerpo humanizado o un conjugado), que se genera a traves del trasplante de CDR murino o de rata (u otro no humano) sobre un anticuerpo humano. Mas espedficamente, esta humanizacion se logra como sigue: (1) los ADNc que codifican dominios variables de cadena ligera y pesada se afslan de un hibridoma o una celula B que secreta el anticuerpo; (2) las secuencias de ADN de los dominios variables, incluyendo las CDR, se determinan mediante secuenciacion; (3) los ADN que codifican las CDR se transfieren a las regiones correspondiente de un dominio variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo humano que codifica la secuencia a traves de mutagenesis dirigida al sitio; y (4) los segmentos del gen de la region constante humana de un isotipo deseado (por ejemplo, 1 para CH y k para CL) se anaden. Finalmente, los genes de cadena pesada y ligera humanizados se co-expresan en celulas hospedadoras de mairnfero (por ejemplo, celulas CHO o NS0) para producir el anticuerpo humanizado soluble.

En ocasiones, la transferencia directa de CDR a un marco humano conduce a una perdida de la afinidad de union a antígeno de la protema o anticuerpo de union resultante. La perdida de la afinidad de union a antígeno puede ocurrir porque en algunos anticuerpos afines, ciertos aminoacidos dentro de las regiones marco interaction con las CDR y de esta forman influyen en la afinidad de union a antígeno general del anticuerpo. En tales casos, el experto en la materia apreciara que sena cntico introducir “mutaciones de respaldo” en las regiones de marco del anticuerpo aceptor con el fin de retener la actividad de union a antígeno del anticuerpo afm. Los metodos generales para producir mutaciones de respaldo son bien conocidos por el experto en la materia. Vease, por ejemplo, Queen et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029; Co et al., 1991. Proc. Nat. Acad. Sci USA 88:2869-2873; WO 90/07861; Tempest 1991. Biotechnology 9: 266-271. Las mutaciones de respaldo ejemplares para anticuerpos de la presente invencion incluyen aquellos restos representados en la Figura 9 bajo el contenido de donador.

En ciertas realizaciones la protema o anticuerpo de union de la presente divulgacion puede comprender un dominio Vh que no es un dominio variable de inmunoglobulina murina o de camelido. En ciertas realizaciones el polipeptido del anticuerpo puede comprender un dominio Vh que no contiene uno o mas aminoacidos que son espedficos para dominios variables de inmunoglobulina de camelido en comparacion con los dominios Vh humanos.

En una realizacion de esta divulgacion, un “anticuerpo anti-CD154” se refiere a un anticuerpo (que incluye un fragmento de union a antígeno y un derivado o conjugado de anticuerpo) que es completamente humano. Un anticuerpo complementamente “humano” comprende un polipeptido de anticuerpo o un dominio variable de inmunoglobulina que tiene una secuencia derivada de una inmunoglobulina humana (por ejemplo, obtenida de una secuencia de codificacion de inmunoglobulina). El termino “anticuerpos humanos” incluye, por ejemplo, anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si estan presentes) derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de la lmea germinal humana. El termino “humano” como se aplica en el presente documento para un anticuerpo o para un fragmento tal como un dominio variable no abarca un anticuerpo de otras especies, por ejemplo, raton, que ha sido “humanizado” a traves del injerto de las secuencias de region constante humanas en el polipeptido del anticuerpo (es decir, reemplazando regiones constantes no humanas con regiones constantes humanas) o a traves del injerto de secuencias marco de la region V humana en un dominio variable de inmunoglobulina de un mamnfero no humano (es decir, reemplazando las regiones marco no humanas del dominio V con regiones marco humanas). Han sido descritos metodos para humanizar regiones variables de inmunoglobulina a traves de la modificacion racional de los restos de determinacion de complementariedad (documento US 2006/0258852).

Los anticuerpos humanos pueden, en ciertas realizaciones, incluir restos de aminoacidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la lmea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por una mutagenesis aleatoria o espedfica del sitio in vitro o mediante mutacion somatica in vivo). En ciertas realizaciones, por consiguiente, la presente invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende un dominio variable que tiene una o mas regiones marco (por ejemplo, FW1, FW2, FW3, y/o FW4) que comprenden una secuencia de aminoacido que es igual a la secuencia de aminoacido de la region marco correspondiente codificada por un segmento de gen de anticuerpo de lmea germinal humana, o las secuencias de aminoacido de una o mas dichas regiones marco colectivamente comprendiendo hasta 5 diferencias de aminoacido con relacion a la secuencia de aminoacido de dicha region marco correspondiente codificada por un segmento del gen de anticuerpo de lmea terminal humana. En realizaciones adicionales, las secuencias de aminoacido de las regiones marco (FW1, FW2, FW3, y FW4) de un dominio variable son iguales que las secuencias de aminoacido de las regiones marco correspondientes codificadas por un segmento del gen de anticuerpo de lmea germinal humana, o las secuencias de FW1, FW2, FW3, y FW4 colectivamente conteniendo hasta 10 diferencias de aminoacido en relacion a las secuencias de las regiones marco correspondientes codificadas por el segmento del gen de anticuerpo de lmea germinal humana. Los segmentos del gen de anticuerpo de lmea germinal ilustrativos incluyen, por ejemplo, DP47, DP45, DP48, y DPK9 (documento US 2006/0062784), y segmentos que codifican las secuencias marco aceptoras descritas en los ejemplos y figuras.

En algunas realizaciones, el anticuerpo humano (que incluye un fragmento de anticuerpo o secuencia de dominio variable) tiene al menos 85 % de identidad de secuencia de aminoacido (incluyendo, por ejemplo, 87 %, 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o mas de identidad de secuencia) con un anticuerpo humano de origen natural.

Los anticuerpos completamente humanos o humanos pueden derivarse de ratones transgenicos (por ejemplo, geneticamente modificados tales como knock-in) portadores de genes de anticuerpo humano (llevan los exones de variable (V), diversidad (D), union (J) y constante (C)) o unas regiones V, D y J humanas de las celulas humanas. Por ejemplo, ahora es posible producir animales geneticamente modificados (por ejemplo, ratones) que son capaces, despues de la inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de la produccion de inmunoglobulina endogena (vease, por ejemplo, Jakobovits et al., PNAS, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355:258 (1992). Una cepa de raton transgenica (por ejemplo geneticamente modificada incluyendo un reemplazo de gen activado, desactivado, y similar) puede modificarse para contener secuencias de gen de genes de inmunoglobulina humanos sin configurar. Las secuencias humanas pueden codificar tanto la cadena pesada como ligera de anticuerpos humanos y funcionaran correctamente en los ratones, que experimentan reconfiguraciones para proporcionar un amplio repertorio de anticuerpos similar al de los humanos. Los ratones geneticamente modificados pueden inmunizarse con la protema diana (por ejemplo, CD154, sus fragmentos, o celulas que expresan CD154) para crear una coleccion diversa de anticuerpos espedficos y su ARN de codificacion. Los acidos nucleicos que codifican los componentes de la cadena de dichos anticuerpos despues pueden clonarse del animal en un vector de despliegue. Tfpicamente las poblaciones separadas de acidos nucleicos que codifican secuencias de cadena pesada y ligera se clonan, y las poblaciones separadas despues se recombinan en la insercion en el vector, de tal forma que cualquier copia dada de un vector recibe una combinacion aleatoria de una cadena pesada y ligera. El vector se disena para expresar cadenas de anticuerpos de tal forma que pueden ensamblarse y desplegarse en la superficie exterior del paquete de despliegue que contiene el vector. Por ejemplo, las cadenas de anticuerpo pueden expresarse como protemas de fusion con una protema de capa de fago de la superficie exterior del fago. A continuacion, los paquetes de despliegue pueden cribarse para desplegar la union de los anticuerpos a la diana.

Ademas, los anticuerpos humanos pueden derivarse de colecciones de visualizacion de fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Moa. Biol, 222:581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech 14:309 (1996), US 6.300.064). Pueden crearse colecciones de fagos sinteticos mediante el uso de combinaciones aleatorias de regiones V de anticuerpo humano sintetico. Mediante la seleccion del antígeno, se pueden crear anticuerpos completamente humanos en donde las regiones V son muy de tipo humano en naturaleza. Vease, US 6.794.132, 6.680.209, 4.634.666, y Ostberg et al., (1983), Hybridoma 2:361-367.

Para la generacion de anticuerpos humanos, tambien ver Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Los anticuerpos humanos se explican y delinean adicionalmente en U.S.

5.939.598 y 6.673.986. Tambien ver U.S. 6.114.598, 6.075.181 y 6.162.963. Vease tambien US 6.150.584, US 6.713.610, US 6.657.103, US 2003/0229905 Al, US 2004/0010810 Al, US 2004/0093622 Al, US 2006/0040363 Al, US 2005/0054055 Al, US 2005/0076395 Al y US 2005/0287630 Al. Vease tambien EP 0463151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, y WO 98/24893.

En un metodo alternativo, otros han utilizado un metodo “minilocus”. En el metodo de “minilocus”, un locus Ig exogeno se emula a traves de la inclusion de piezas (genes individuales) del locus Ig. De esta forma, uno o mas genes VH, uno o mas genes DH, uno mas genes JH, una region mu constante, y una segunda region constante (preferentemente una region constante gamma) se forman en el constructo para la insercion en un animal. Este metodo se describe en, por ejemplo, US 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215, y 5.643.763. Tambien ver US 5.569.825, 5.877.397, 6.300.129, 5.874.299, 6.255.458, y 7.041.871, las descripciones de las cuales se incorporan aqrn por referencia en su totalidad. Vease tambien EP 0546073, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884. Ademas, vease Taylor et al., (1992 Nuc. Acids. Res., 20: 6287), Chen et al., (1993 Int. Immunol. 5: 647), Tuaillon et al., (1993 PNAS USA. 90: 3720-4), Choi et al., (1993 Nature Genetics 4:117), Lonberg et al., (1994 Nature 368: 856-859), Taylor et al., (1994 International Immunology 6: 579-591), y Tuaillon et al., (1995 J Immunol. 154: 6453-65), Fishwild et al., (1996 Nature Biotechnology 14:845), y Tuaillon et al., (2000 Eur J Immunol. 10: 2998-3005).

En una realizacion particular de esta invencion, los anticuerpos completamente humanos se preparan utilizando esplenocitos humanos primados in vitro (Boerner et al, 1991. J. Immunol. 147:86-95).

En una realizacion mas particular de esta invencion, los anticuerpos completamente humanos se preparan a traves de la clonacion del repertorio (Persson et al., 1991. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:2432-2436; Huang y Stollar 1991. J. Immunol. Methods 141:227- 236). Ademas, US 5.798.230 describe la preparacion de anticuerpos monoclonales humanos de celulas B humanas, en donde las celulas B productoras del anticuerpo humano se inmortalizan a traves de la infeccion con un virus Epstein-Barr, o uno de sus derivados, que expresa el antígeno 2 nuclear del virus Epstein-Barr (“EBNA2”), una protema requerida para la inmortalizacion. Lafuncion EBNA2 posteriormente se desactiva, dando como resultado un aumento en la produccion del anticuerpo.

Otros metodos para producir anticuerpos completamente humanos implican el uso de animales no humanos que tienen un locus Ig endogeno inactivado y son transgenicos para los genes de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo humano sin configurar. Los animales transgenicos pueden inmunizarse con celulas o la protema D1.1 (US 5.474.771; 6.331.433; y 6.455.044) e hibridomas que pueden generarse de las celulas B derivadas de estos. Los detalles de estos metodos se describen en la tecnica. Vease, por ejemplo, varias publicaciones/patentes referentes a los ratones transgenicos que contienen un locus Ig humano, incluyendo US 5.789.650; varias publicaciones/patentes con respecto a los ratones Xe NOMOUSE®, incluyendo US 6.075.181; 6.150.584; y 6.162.963; Green, 1997, Nature Genetics 7: 13­ 21; Mendez, 1997, Nature Genetics 15: 146-56; y las publicaciones/patentes que se refieren a ratones “transomicos” incluyendo EP 843961 y Tomizuka, 1997, Nature Genetics 16: 1433-43.

Las protemas de union a CD154 y los anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion tambien se refieren a las protemas o anticuerpos de union de bloqueo cruzado, o a protemas de union o anticuerpos que se unen al mismo epítopo o que se unen a un epítopo estrechamente relacionado o solapado como cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. Una protema o anticuerpo de union de bloqueo cruzado puede inhibir o bloquear competitivamente la union de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, la invencion proporciona protemas de union a CD154 y anticuerpos anti-CD154 que se unen al mismo epítopo como lo hace un anticuerpo humanizado que comprende una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13 y que comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 15 (342 Fab y fragmentos Fab'), y que exhiben propiedades de union a CD154 similares en ensayos de competencia con un anticuerpo anti-CD154 5c8, como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, la invencion proporciona protemas de union a CD154 y anticuerpos anti-CD154 que se unen al mismo epítopo como lo hace el anticuerpo humanizado que comprende la secuencia del dominio Vl de acuerdo con SEQ ID NO: 58 y una secuencia del dominio Vh de acuerdo con SEQ ID NO: 60 (secuencias variables del anticuerpo 338), y que exhiben protemas de union a CD154 similares en ensayos de competencia con el anticuerpo anti-CD154 5c8, como se describe en el presente documento.

En ciertas realizaciones de la presente invencion, una protema de union a CD154, por ejemplo el anticuerpo anti-CD154, exhibe alta afinidad para el CD154 humano. Por ejemplo en ciertas realizaciones, la protema de union a CD154 se disocia del CD154 humano (CD40L humano) con un Kd en el intervalo de 50 nM a 1 pM, inclusive, como se determina por las resonancia de plasmon de superficie (por ejemplo Biacore®). Por ejemplo, el Kd para el CD154 humano puede ser de 25 nM a 1 pM, 10 nM a 1 pM, 5 nm a 1 pM, 1 nM a 1 pM, 0,5 nM a 1 pM, 0,1 nM a 1 pM, 75 pM a 1 mP, 50 pM a 1 pM, 20 pm a 1 pm, o aun de 10 pm a 1 pm. En otras realizaciones, una protema de union a CD154 de la presente invencion se disocia del CD154 humano con un Kd en el intervalo de 500 pM a 1 pM, inclusive, como se determina por la resonancia de plasmon de superficie (por ejemplo, Biacore®). En algunas realizaciones, el Kd para el CD154 humano es menor de 50 pM. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente invencion, una protema de union a CD154 se disociada del CD154 humano con un Kd que es menor de 20 pM, en algunas realizaciones de la presente invencion, una protema de union a CD154 se disocia del CD 154 humano con un Kd que es menor de 10 pM. En ciertas realizaciones, una protema de union a CD154 de la invencion se une a CD154 con alta afinidad pero no desplaza la union de CD154 de CD40. La afinidad del anticuerpo puede mejorarse mediante metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Clark et al., 2006 Protein Sci. 15(5):949-60, que describen la mejora de la afinidad de un anticuerpo utilizando un diseno computacional con base en el marco, y Chao et al., 2006 Nat Protoc 1:755-768, que describe metodos para aislar y modificar scFvs con propiedades deseadas utilizando despliegue de superficie de levadura).

Cuando se desea mejorar la afinidad de los anticuerpos de la invencion que contienen unas o mas de las CDR antes mencionadas, los anticuerpos con una afinidad mejorada pueden obtenerse a travé dsistintos protocolos de maduracion y afinidad, incluyendo pero no limitandose a mantener las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), organizacion de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), el uso de cepas de mutacion de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), organizacion de ADN (Patten et al, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724­ 733, 1997), visualizacion de fago (Thompson et al., J. Mol. Biol, 256, 7-88, 1996) y PCR sexual (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Todos estos metodos de modulacion de afinidad son explicados por Vaughan et al., (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). De esta forma, la invencion tambien proporciona variantes de secuencia de los anticuerpos de la invencion que se unen espedficamente a CD154. Las variantes de secuencia comprenden una o mas sustituciones semi-conservadas o conservadas dentro de las secuencias y las sustituciones preferentemente no afectan de manera significativa la actividad deseada del polipeptido. Las sustituciones pueden ser de origen natural o pueden introducirse por ejemplo utilizando mutagenesis (por ejemplo, Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem.

253:6551). Los aminoacidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, por ejemplo, por lo general pueden intercambiarse (aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas). De estas posibles sustituciones, se prefiere que glicina y alanina se sustituyan entre sf (ya que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y la valina, leucina e isoleucina se utilizan para sustituirse entre sf (ya que tienen grandes cadenas laterales que son hidrofobas). Otros aminoacidos que por lo general pueden sustituirse entre sf incluyen pero no se limitan a:

-fenilalanina, tirosina, y triptofano (aminoacidos que tienen cadenas laterales aromaticas);

-lisina, arginina e histidina (aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas);

-aspartato y glutamato (aminoacidos que tienen cadenas laterales acidas);

-asparagina y glutamina (aminoacidos que tienen cadenas laterales de amina):

-cistema y metionina (aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre).

La afinidad de union de las protemas de union a CD154, por ejemplo de los anticuerpos anti-CD154, de la presente divulgacion tambien se pueden describir con relacion a los terminos o en comparacion con la afinidad de union a un segundo anticuerpo que tambien se une espedficamente a CD154 (por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-CD154 que es espedfico de CD154, que puede referirse en el presente documento como un “segundo anticuerpo espedfico de CD154”. En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo espedfico de CD154 puede ser el anticuerpo 5c8 (producido por hibridoma depositado con el N.° de Acceso HB 10916 ATCC, como se describe en US 5.474.771) o humanizado 5c8). En otras realizaciones, el segundo anticuerpo espedfico de CD154 puede ser cualquiera de los anticuerpos de la divulgacion, tal como 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 o 402 (Figura 12). Por consiguiente, ciertas realizaciones de la presente invencion se refieren a un anticuerpo anti-CD154 que se une a CD154 humano con mayor afinidad que el anticuerpo 5c8, o con un Kd menor que el Kd del anticuerpo 5c8. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 de la presente divulgacion tambien inhibe la actividad de CD154 o bloquea la interaccion CD154:CD40 en un grado mayor al que lo hace un segundo anticuerpo espedfico de CD154, tal como 5c8, a concentracion equimolares. La capacidad relativa de un anticuerpo anti-CD154 para bloquear la interaccion CD154:CD40 puede medirse a traves de cualquier ensayo disponible, tal como, por ejemplo, el ensayo de regulacion positiva ICAM-1 descrito en el presente documento y los ensayos de competicion de union.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las protemas de union a CD154 y los anticuerpos anti-CD154 (incluyendo fragmentos y derivados de anticuerpos) de la invencion son utiles para inhibir la union de CD154 a CD40 y lo hacen con una alta especificidad, por ejemplo, con un IC50 en la escala de 10 pM a 1,5 |^jM, inclusive. En ciertas realizaciones, las protemas de union a CD154, por ejemplo, los anticuerpos, de la invencion pueden tener un IC50 en el intervalo de 10 pm a 500 pm, 50 pm a 500 pm, 100 pm a 500 pm, 250 pm a 750 pm, 500 pm a 1 |^jM o 750 pm a 1,5 |^jM. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-CD154 no acaba sustancialmente con la actividad de CD40 ni activa la senalizacion de CD40. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 de la presente invencion antagoniza una actividad de CD154 o CD40 o ambos.

Ciertas realizaciones de la presente divulgacion, por consiguiente, se refieren a protemas de union a CD154 y anticuerpo anti-CD154 que unen el CD154 humano con mayor o igual afinidad en relacion a un segundo anticuerpo espedfico de CD154 (por ejemplo, el anticuerpo 5c8 o 5c8 humanizado) o con un Kd que es menor que o igual al Kd de un segundo anticuerpo espedfico de CD154, en donde el anticuerpo anti-CD154 no inhibe sustancialmente la interaccion CD154:CD40 con relacion al segundo anticuerpo espedfico de CD154. Los anticuerpos pueden ser utiles como reactivos en ensayos de union y de diagnostico, por ejemplo. Los anticuerpos ilustrativos que exhiben una alta afinidad a CD154 humano pero un grado inferior de inhibicion CD154:CD40 en comparacion con un segundo anticuerpo espedfico de CD154 son los anticuerpos 381 y 338 descritos en el presente documento. Por ejemplo, la presente invencion proporciona anticuerpos anti-CD154 que se unen espedficamente a CD154 humano con una afinidad mayor o igual (con relacion a un segundo anticuerpo espedfico de CD154, tal como 5c8 humanizado, por ejemplo) pero que bloquean la interaccion CD154:CD40 en menor grado que el segundo anticuerpo espedficamente de CD154. En realizaciones adicionales, estos anticuerpos anti-CD154 que inhiben la union de CD154 (CD40L) a CD40 en menor grado que un segundo anticuerpo espedfico de CD-154 tampoco acaban sustancialmente con la actividad de CD40 o la activacion de la senalizacion de CD40. Por ejemplo, los anticuerpos, si se administran en un ensayo de potencia in vitro como se describe en el Ejemplo 7, pueden no exhibir ninguna agonizacion estadfsticamente significativa sobre un tratamiento de control o pueden exhibir 1 %, 2 %, 3 %, 5 % o 10 % de agonizacion en comparacion con un control positivo (por ejemplo, el ligando CD154). Vidalain et al., (The EMBO Journal (2000) 19:3304-3313) y Pearson et al., (International Immunology (2001) 13:273-283) describen la trayectoria de senalizacion de CD40 y tambien proporcionan ensayos que pueden utilizarse para determinar si la interaccion CD154-CD40 se bloquea o inhibe, y en que grado.

En algunas realizaciones, la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende al menos una CDR seleccionada de CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 5). Preferentemente, el anticuerpo comprende al menos dos CDR seleccionadas de CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) y CDR-H3 (Se Q ID NO: 5) y mas preferentemente, las tres CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3.

En otra realizacion, el anticuerpo anti-CD 154 de la divulgacion comprende al menos una CDR seleccionada de CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (Se Q ID NO: 7) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 8). Preferentemente, el anticuerpo comprende al menos dos CDR seleccionada de CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 8) y mas preferentemente, las tres CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3.

En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende las tres CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 (SEQ ID NO: 3-5) y las tres CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 (SEQ ID NO: 6-8).

En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-CD154 comprende una secuencia de cadena pesada variable de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 1, 9, 10 o 11 y comprende la secuencia de cadena ligera variable de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o 14.

En algunas realizaciones, la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD 154 que comprende al menos una CDR seleccionada de CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 44). Preferentemente, el anticuerpo comprende al menos dos CDR seleccionada de CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 44) y mas preferentemente las tres CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3.

En otra realizacion, el anticuerpo anti-CD154 de la divulgacion comprende al menos una CDR seleccionada de CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 47). Preferentemente, el anticuerpo comprende al menos dos CDR seleccionada de CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 47) y mas preferentemente las tres CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3.

En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende las tres CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 (SEQ ID NO: 42-44) y las tres CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 (SEQ ID NO: 45-47).

En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-CD154 comprende una secuencia de cadena pesada o variable de acuerdo con SEQ ID NO: 56 y/o comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 54.

En algunas realizaciones, la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD 154 que comprende al menos una CDR seleccionada de CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 50). Preferentemente, el anticuerpo comprende al menos dos CDR seleccionada de CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 50) y mas preferentemente las tres CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3.

En otra realizacion, el anticuerpo anti-CD154 de la divulgacion comprende al menos una CDR seleccionada de CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 53). Preferentemente, el anticuerpo comprende al menos dos CDR seleccionada de CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 53) y mas preferentemente las tres CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos tienen una secuencia complementaria que comprende una o mas CDR de cadena ligera de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, mencionadas anteriormente, o una secuencia complementaria que comprende una o mas CDR de cadena pesada de CDR o CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, mencionadas anteriormente, respectivamente. De esta forma, en ciertas realizaciones, un anticuerpo de esta divulgacion comprende CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) o CDR-H3 (SEQ ID NO: 50), y CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) o CDR-L3 (SEQ ID NO: 53).

En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende las tres CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 (SEQ ID NO: 48-50) y las tres CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 (SEQ ID NO: 51-53).

En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-CD154 comprende una secuencia de cadena pesada variable de acuerdo con SEQ ID NO: 60 y/o comprende una secuencia de cadena ligera variable de acuerdo con SEQ ID NO: 58.

En ciertas realizaciones, la protema de union a CD154 de esta divulgacion comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 62 y una secuenciad de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 65. En otras realizaciones, la protema de union a CD154 de esta invencion comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 63 y una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 66.

En ciertas realizaciones, la protema de union a CD154 de esta divulgacion comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 68 y una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 71. En otras realizaciones, la protema de union a CD154 de esta divulgacion comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 69 y una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 72. En otras realizaciones, la protema de union a CD154 comprende una de las secuencias de acuerdo con SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 o SEQ ID NO: 72.

Esta divulgacion tambien proporciona protemas de union a CD154 que preferentemente comparten al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % de identidad con una protema de union a CD154 de la divulgacion. Mas preferentemente, una protema de union a CD154 comparte al menos un 95 %, 96 %, 97 % o 98 % de identidad. Mas preferentemente, una protema de union a CD154 comparte al menos un 99 %, 99,5 %, 99,9 % o mas de identidad con una protema de union a CD154 de union. Las protemas de union a CD154 de la divulgacion pueden comprender una secuencia de dominio variable que al menos es identica en un 85 % a un dominio variable de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 60, o una o mas CDR de la misma.

Otras realizaciones de la invencion se refieren a anticuerpos biespedficos. Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados que tienen especificidad de union a al menos dos antígenos diferentes. Estos pueden utilizarse solos o mezclados en composiciones que comprenden poblaciones policlonales. En la presente invencion, una de las especificidades de union es para el antígeno CD154, mientras la otra especificidad de union es para cualquier otro antígeno, y preferentemente para una protema de superficie celular o receptor, o subunidad receptora. Por ejemplo, la otra especificidad de union puede ser un ligando seleccionado de entre albumina de suero humano (HSA), TNFa, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL -12, IL -18, IFN-y, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFA1, LFA3 y VLA4.

En otras realizaciones de la presente invencion, un anticuerpo anti-CD154 comprende un sitio de union de ligando generico. Un ligando generico (por ejemplo, un polipeptido) es capaz de unir miembros funcionales de un repertorio independientemente de la especificidad del ligando diana. Un ligando generico puede por consiguiente utilizarse para identificar o seleccionar (por ejemplo, como en un procedimiento de purificacion y filtracion) miembros funcionales de un repertorio (tal como una coleccion o grupo de anticuerpos, independientemente de las especificidades de union del antígeno de los anticuerpos). Los ligandos genericos incluyen, por ejemplo, protema A con protema V y protema L. La pre-seleccion de los miembros de una coleccion de fago o ligandos genericos se describe en el documento WO 99/20749.

Fragmentos de Anticuerpo

La presente invencion tambien se refiere a fragmentos de anticuerpo anti-CD154 de union a antígeno o de union a epítopo. Todos los metodos y reactivos descritos anteriormente con respecto a los anticuerpos anti-CD154 pueden utilizarse de manera similar para producir y utilizar los fragmentos de anticuerpo anti-CD154 de esta invencion.

En algunas realizaciones de esta invencion, los fragmentos de anticuerpo anti-CD154 incluyen complejos de anticuerpo heteromericos y fusiones de anticuerpo, tales como anticuerpos biespedficos, anticuerpos hemidimericos, anticuerpos multivalentes (es decir, anticuerpos tetravalentes) y anticuerpos de cadena individual. Un anticuerpo hemidimerico se forma por una porcion Fc y una porcion Fab. Un anticuerpo de cadena individual se forma por regiones variables enlazadas por separadores de protema en una cadena de protema individual.

En algunas realizaciones de esta invencion, los fragmentos de anticuerpo anti-CD154 tambien incluyen protemas que contienen una o mas cadenas ligeras y/o cadenas pesadas de inmunoglobulina, tales como monomeros y homo- o hetero-multfmeros (por ejemplo dfmeros o tnmeros) de estas cadenas, en donde estas cadenas estan opcionalmente unidas al disulfuro o por el contrario reticuladas. Estos anticuerpos pueden ser capaces de unirse a uno o mas antígenos.

En ciertas realizaciones, la presente invencion incluye fragmentos de union a antígeno de anticuerpos completos, tales como los fragmentos de anticuerpos Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, F(v), Fd, dAb, diacuerpo, minicuerpo, y nanocuerpo. La presente invencion tambien se refiere a fragmentos que comprenden solamente un dominio variable individual, tal como un dominio Vh o Vl, o a un fragmento que comprende solamente el dominio de cadena ligera o de cadena pesada. Los fragmentos pueden ser humanizados o completamente humanos. La presente invencion tambien incluye fragmentos de union a antígeno que se forman de andamios alternativos (vease, por ejemplo, Binz y Hosse anteriormente) o que comprenden un armazon universal. La presente invencion tambien se refiere a conjugados que comprenden cualquier fragmento de union a antígeno o protema de union a CD154 que se une espedficamente a CD154 conjugado covalente o no covalentemente, o directa o indirectamente, a una fraccion funcional tal como una protema vehnculo o PEG, por ejemplo.

Los anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion incluyen anticuerpos divalentes. De esta forma, en ciertas realizaciones, la invencion se refiere a un fragmento de anticuerpo anti-CD154 divalente que comprende dos cadenas pesadas de anticuerpo y al menos una molecula de polfmero en un enlace covalente, cada cadena pesada estando covalentemente enlazada a la otra por al menos un puente intercatenario distinto de disulfuro que une el atomo de azufre de un resto de cistema en una cadena al atomo de azufre de un resto de cistema en otra cadena, estando localizados los restos de cistema en la parte exterior del dominio de la region variable de cada cadena, caracterizado por que al menos un puente intercatenario distinto de disulfuro contiene una molecula de polfmero covalentemente enlazada. La frase “distinto de disulfuro” como se utiliza en el presente documento pretende indicar que los puentes S-S, por ejemplo, el tipo normalmente encontrado en los anticuerpos, se excluyen. Un puente intercatenario del tipo presente en un fragmento de acuerdo con la invencion puede sin embargo estar igualmente enlazado a una cadena pesada a traves de un enlace S-S como se describe a continuacion. En general, cada molecula de polfmero en el fragmento de anticuerpos divalente de acuerdo con la invencion forma parte de un puente intercatenario. Cada puente sirve para enlazar dos cadenas pesadas y cada cadena estara covalentemente enlazada a un atomo de azufre de un resto de cistema. El enlace covalente generalmente sera un enlace de disulfuro o, en realizaciones particulares, un enlace de azufre-carbono. Para estructuras de anticuerpos divalentes ejemplares, veanse los documentos WO 99/64460 y WO 05/061005.

La invencion tambien proporciona un anticuerpo anti-CD154 que es un anticuerpo monovalente o fragmento de union a antígeno monovalente. Como se utiliza en el presente documento, el termino “monovalente” significa que un anticuerpo dado o fragmento de union a antígeno (por ejemplo, Fv, una cadena individual scFv, dAb, Fab, Fab', Fd, scFab, scFabAC, etc.) puede unirse solamente a una sola molecula de su diana. Los anticuerpos de origen natural son generalmente divalentes, ya que tienen dos brazos de union a antígeno funcionales, cada uno comprendiendo un domino Vh y Vl. Un anticuerpo divalente puede unir dos moleculas separadas del mismo antígeno en donde la barrera esterica no es un problema. En contraste, un anticuerpo “monovalente” tiene un sitio de union a antígeno para una diana. El dominio de union a antigeno de un anticuerpo monovalente puede comprender un dominio Vh y uno Vl o puede comprender solamente un solo dominio variable de inmunoglobulina, es dedr, un dominio Vh o un dominio Vl, que tiene la capacidad de unir CD154 sin la necesidad de dominios Vh y Vl, respectivamente. Un anticuerpo monovalente ilustrativo es un fragmento Fd que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina y que solamente puede unir una molecula de antigeno CD154. Un anticuerpo monovalente carece de la capacidad para entrelazar moleculas de un solo antigeno.

Esta invencion proporciona un anticuerpo anti-CD154, en donde el anticuerpo se une espedficamente a un epítopo al cual se unen espedficamente fragmentos Fab o Fab' humanizados con una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 12 o 13, respectivamente y con una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 15. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de esta divulgacion es un fragmento de anticuerpo con una secuencia de cadena pesada o variable de acuerdo con SEQ ID NO: 1, 9, 10 u 11 y con una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o 4. En otras realizaciones, el anticuerpo de esta invencion es un fragmento de anticuerpo con una secuencia de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 12 o 13 y una secuencia de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 15.

En ciertas realizaciones, la protema de union a CD154 o anticuerpo comprende o consiste en una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 13. En ciertas realizaciones, la protema de union a CD154 o anticuerpo comprende o consiste en una secuencia de cadena ligera SEQ ID NO: 15 y una secuencia de cadena pesada SEQ ID NO: 12.

En realizaciones alternativas, la divulgacion proporciona un fragmento de anticuerpo que comprende una secuencia de cadena pesada variable de acuerdo con SEQ ID NO: 56 y que comprende una secuencia de cadena ligera variable de acuerdo con SEQ ID NO: 54. En otras realizaciones, el anticuerpo de esta divulgacion es un fragmento de anticuerpo que comprende una secuencia de cadena pesada variable de acuerdo con SEQ ID NO: 60 y que comprende una secuencia de cadena ligera variable de acuerdo con SEQ ID NO: 58.

En una realizacion, esta invencion proporciona un fragmento Fab' o F(ab')² o F(ab')³ que se une espedficamente CD154. Este fragmento Fab' o F(ab')² o F(ab')³ puede ser humanizado y tener una secuencia de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 13 y puede tener una secuencia de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 15.

En algunas realizaciones, la presente invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que esta libre de un dominio Fc. El anticuerpo o fragmento deficiente de Fc puede ser monovalente, divalente o incluso multivalente.

Esta invencion tambien proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen espedficamente al epítopo al cual se unen los fragmentos Fab' o F(ab')² o F(ab')³ descritos anteriormente espedficamente. Estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden identificarse a traves de un ensayo de bloqueo cruzado como se describe en el presente documento (Ejemplo 9). Estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden ser aislados, recombinantes o sinteticos y pueden unirse a una segunda molecula para formar un conjugado de anticuerpo.

Anticuerpos con funcion efectora reducida

La interaccion de los anticuerpos y los complejos de anticuerpos-antígeno con celulas del sistema inmune desencadenan una diversidad de respuestas, denominadas en el presente documento funciones efectoras. Los anticuerpos IgG activan las rutas efectoras del sistema inmune mediante la union a membranas de la familia de los receptores Fcy de la superficie celular y a C1q del sistema complementario. La ligacion de las protemas efectoras a traves de anticuerpos agrupados desencadena una diversidad de respuestas, incluyendo la liberacion de las citocinas inflamatorias, la regulacion de la produccion de antígenos, la endocitosis, y la muerte celular. En algunas aplicaciones cftnicas estas respuestas son cruciales para la efectividad de un anticuerpo monoclonal. En otras provocan efectos secundarios indeseados tales como inflamacion y la eliminacion de las celulas que llevan el antígeno. Por consiguiente, la presente invencion ademas se refiere a anticuerpos anti- CD154, con funciones alteradas, por ejemplo, funciones efectoras, reducidas. De manera importante, la funcion efectora reducida no necesariamente reduce la capacidad de un anticuerpo anti-CD154 para inhibir una o varias enfermedades a traves del bloqueo de la interaccion CD154-CD40 (vease el documento WO 05/03175, que se incorpora aqrn por referencia en su totalidad).

Los anticuerpos anti-CD154 con una funcion efectora disminuida (por ejemplo, funciones efectoras mediadas por Fc; vease a continuacion) son particularmente deseables para utilizarse en sujetos en donde existe el potencial de actividad tromboembolica indeseable. Adicionalmente, la funcion efectora disminuida de los anticuerpos anti-CD154 puede disminuir o eliminar otros efectos secundarios indeseados potenciales de las terapias de anticuerpo anti-CD154 tales como eliminacion de celulas T activadas u otras poblaciones de celulas inducidas para expresar CD154 o activacion dependiente de Fc de monocitos/macrofagos.

La funcion efectora de un anticuerpo anti-CD154 de la presente invencion puede determinarse utilizando uno de muchos ensayos conocidos. La funcion efectora del anticuerpo anti-CD154 puede reducirse con relacion a un segundo anticuerpo anti-CD154. En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo anti-CD154 puede ser cualquier anticuerpo que une CD154 espedficamente. En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo anti-CD154 puede ser un anticuerpo 5c8 (producido por el hibridoma depositado con ATCC bajo el N.° de Acceso HB 10916, como se describe en el documento US 5.474.771) o 5c8 humanizado. En otras realizaciones, el segundo anticuerpo espedfico de CD154 puede ser cualquiera de los anticuerpos de la invencion tales como 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 o 402 (Figura 12). En otras realizaciones, en donde el anticuerpo anti-CD154 de interes ha sido modificado para reducir la funcion efectora, el segundo anticuerpo anti-CD154 puede ser la version no modificada parental del anticuerpo.

La funcion efectora de un anticuerpo anti-CD154 de la presente invencion puede tambien determinarse, por ejemplo, midiendo el nivel de agregacion de plaquetas o la activacion causada por el tratamiento con el anticuerpo anti-CD154 con relacion a un anticuerpo de control. En algunas realizaciones, por consiguiente, los anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion no median o no mejoran la agregacion de las plaquetas o la activacion en un ensayo de agregacion o activacion de plaquetas estandar. En otras realizaciones, los anticuerpos anti-CD154 median un nivel inferior de agregacion de plaquetas o activacion con relacion a un segundo anticuerpo anti-CD154 (Vease, por ejemplo, 5c8 o 5c8 humanizado).

Las funciones efectoras ejemplares incluyen la union del receptor Fc, fagocitosis, apoptosis, respuestas proinflamatorias, regulacion descendente de los receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de la celula B; BCR), etc. Otras funciones efectoras incluyen citotoxicidad mediada por celula dependiente del anticuerpo (ADCC), en donde los anticuerpos unen los receptores Fc en celulas T citotoxicas, linfocitos citoltticos naturales (NK), o los macrofagos conducen a la muerte celular, y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), que es una muerte celular inducida a traves de la activacion de la cascada de complemento (revisado en Daeron, Annu. Rev. Immunol.

15:203-234 (1997); Ward y Ghetie, Therapeutic Immunol. 2:77-94 (1995); y Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol.

9:457-492 (1991)). Las funciones efectoras generalmente requieren que la region Fc se combine con un dominio de union (por ejemplo, un dominio variable del anticuerpo) y puede evaluarse utilizando ensayos convencionales que se conocen en la tecnica (veanse, por ejemplo, los documentos WO 05/018572, WO 05/003175, y U.S. 6.242.195).

Las funciones efectoras pueden evitarse mediante el uso de fragmentos de anticuerpo que carecen del dominio Fc tal como Fab, Fab'2, o de cadena individual Fv. Una alternativa ha sido el uso del anticuerpo del subtipo IgG4, que une a FcyRI pero que une pobremente a C1q y FcyRII y RIII. El subtipo IgG2 tambien tiene una union reducida a los receptores Fc, pero retiene una union significativa al alotipo H131 de FcYRIla y a C1q. De esta forma, los cambios adicionales en la secuela Fc se requieren para eliminar la union de todos los receptores Fc y C1q.

Varias funciones efectoras del anticuerpo, incluyendo ADCC, estan mediadas por los receptores FC (FcR), que unen la region Fc de un anticuerpo. La afinidad de un anticuerpo para un FcR particular, y por lo tanto la actividad efectora mediada por el anticuerpo, pueden modularse alterando la secuencia de aminoacido y/o modificaciones posttraduccion de la region Fc y/o constante del anticuerpo.

Los FcR se definen por su especificidad para isotipos de inmunoglobulina; los receptores Fc para anticuerpos IgG se denominan FcyR, para IgE FceR, para IgA FcaR, etcetera. Se han identificado tres clases de FcyR: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). Tanto FcyRII como FcyRIII tienen dos tipos: FcyRIIA (CD32) y FcyRIIB (CD32); y FcyRIIIA (CD16a) y FcyRIIIB (CD16b). Debido a que cada subclase FcyR se codifica por dos o tres genes, y la division de ARN alternativa conduce a multiples transcripciones, existe una amplia diversidad en isoformas FcyR. Por ejemplo, FcyRII (CD32) incluye las isoformas IIa, IIb1, IIb2 IIb3, y IIc.

El sitio de union en los anticuerpos humano y murino para FcyR se ha mapeado previamente a la denominada “region bisagra inferior” que consiste en los restos 233-239 (enumeracion de mdice de EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), Woof et al., Molec. Immunol. 23:319-330 (1986); Duncan et al., Nature 332:563 (1988); Canfield y Morrison, J. Exp. Med. 173:1483-1491 (1991); Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:9036-9040 (1991)). De los restos 233-239, P238 y S239 estan entre los citados como posiblemente estando implicados en la union. Otras areas previamente citadas posiblemente implicadas en la union FcyR son: G316-K338 (IgG humano) para FcyRI humano (a traves de la comparacion de secuencia solamente; no se evaluaron mutantes en sustitucion) (Woof et al., Molec Immunol. 23:319­ 330 (1986)); K274-R301 (IgG humano) para FcyRIII humano (con base en el peptido) (Sarmay et al., Molec. Immunol.

21:43-51 (1984)); y Y407-R416 (IgG humano) para FcyRIII humano (con base en el peptido) (Gergely et al., Biochem. Soc. Trans. 12:739-743 (1984) y Shields et al., J Biol Chem 276: 6591-6604 (2001), Lazar GA et al., Proc Natl Acad Sci 103: 4005-4010 (2006). Estos y otros alargamientos o regiones de los restos de aminoacidos implicados en la union FcR pueden ser evidentes para el experto en la materia a partir de un examen de las estructuras cristalinas de los complejos Ig-FcR (Vease, por ejemplo, Sondermann et al., 2000 Nature 406(6793):267-73 y Sondermann et al., 2002 Biochem Soc Trans. 30(4):481-6). Por consiguiente, los anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion incluyen modificaciones de uno o mas de los restos antes mencionados.

Otros enfoques conocidos para reducir la funcion efectora mAb incluyen mutacion de aminoacidos en la superficie de mAb que estan implicados en las interaccion de union efectoras Lund, J., et al., (1991) J. Immunol. 147(8): 2657-62; Shields, R. L. et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(9): 6591-604; y el uso de combinaciones de diferentes subtipos de segmentos de secuencia (por ejemplo, IgG2 y combinaciones de IgG4) para dar una mayor reduccion en la union a los receptores Fcy que cualquiera de los subtipos por sf solos (Armour et al., Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-1624; Mol. Immunol. 40 (2003) 585-593).

Un gran numero de variantes Fc que tienen afinidades alteradas y/o reducidas para algunos o todos los subtipos Fc (y de esta forma para las funciones efectoras) se conocen en la tecnica, veanse, por ejemplo, los documentos US 2007/0224188 US 2007/0148171 US 2007/0048300 US 2007/0041966 US 2007/0009523 US 2007/0036799 US 2006/0275283 US 2006/0235208 US 2006/0193856 US 2006/0160996 US 2006/0134105 US 2006/0024298 US 2005/0244403 US 2005/0233382 US 2005/0215768 US 2005/0118174 US 2005/0054832 US 2004/0228856 US 2004/132101; US 2003/158389; veanse tambien los documentos US 7.183.387; 6.737.056; 6.538.124; 6.528.624; 6.194.551; 5.624.821; 5.648.260.

En CDC, el complejo anticuerpo-antigeno une el complemento, dando como resultado la activacion de la cascada complemento y la generacion del complejo de ataque de membrana. La activacion de la trayectoria de complemento clasica se inicia por la union del primer componente del sistema complemento (C1q) a los anticuerpos (de la subclase apropiada) que se unen a su antigeno afm. De esta forma la activacion de la cascada del complemento se regula en parte por la afinidad de union de la inmunoglobulina a la protema C1q. Para activar la cascada de complemento, es necesario que C1q se una a al menos dos moleculas de IgG1, IgG2, o IgG3, pero solamente una molecula de IgM, unida a la diana antigenica (Ward y Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995) p. 80). Para evaluar la activacion del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo CDC, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

Se ha propuesto que diversos restos de la molecula IgG esten implicados en la union a C1q incluyendo los restos en el dominio CH2, el resto de aminoacido 331 localizado en una vuelta en proximidad contigua a la misma cepa beta, el resto Lys235 y Gly237 localizado en la region de conexion inferior, y los restos 231 a 238 localizados en la region N-terminal del dominio CH2 (vease, por ejemplo, Xu et al., J. Immunol. 150:152A (Abstract) (1993), WO94/29351; Tao et al., J. Exp. Med., 178:661-667 (1993); Brekke et al., Eur. J. Immunol, 24:2542-47 (1994); Burton et al.; Nature, 288:338-344 (1980); Duncan y Winter, Nature 332:738-40 (1988); Idusogie et al., Immunol 164:4178-4184 (2000; U.S.

5.648.260, y U.S. 5.624.821). Como un ejemplo en IgG1, dos mutaciones en la region terminal COOH del dominio CH2 de IgG1 humano, K322A y P329A no activa la trayectoria CDC y mostraron que dan como resultado una disminucion de mas de 100 veces en la union C1q (US 6.242.195).

De esta forma, en ciertas realizaciones de la invencion, uno o mas de estos restos pueden modificarse, sustituirse o retirarse o uno mas restos de aminoacido pueden insertarse para asf disminuir la actividad de CDC de los anticuerpos CD154 provistos en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, puede ser deseable reducir o eliminar la funcion o funciones efectoras de los anticuerpos objeto con el fin de reducir o eliminar el potencial de respuestas inmunes activadas adicionalmente. Los anticuerpos con una funcion efectora disminuida tambien pueden reducir el riesgo de eventos tromboembolicos en sujetos que reciben los anticuerpos.

En ciertas otras realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo anti-CD154 que exhibe una union reducida a uno o mas receptores FcR pero que mantiene su capacidad de unir el complemento (por ejemplo, a un anticuerpo anti-CD154 similar o en algunas realizaciones, en un grado menor a un anticuerpo anti-CD154 nativo, no variante, o parental). Por consiguiente un anticuerpo anti-CD154 de la presente invencion puede unir y activar el complemento mientras se exhibe una union reducida a un FcR, tal como, por ejemplo, FcYRIIa (por ejemplo, FcYRIIa expresaron plaquetas). El anticuerpo con una union reducida o sin union a FcYRIIa (tal como FcYRIIa expresaron plaquetas, por ejemplo) pero que puede unir C1q y activar la cascada de complemento hasta al menos cierto grado reducira el riesgo el eventos tromboembolicos mientras mantiene quizas las funciones efectoras deseables. En realizaciones alternativas, un anticuerpo anti-CD154 de la presente invencion exhibe una union reducida a uno o mas FcR pero mantiene su capacidad de unir uno o mas de otros FcR diferentes. Vease, por ejemplo, US 2007-0009523, 2006-0194290, 2005-0233382, 2004-0228856, y 2004-0191244, que describen diversas modificaciones de aminoacidos que generan anticuerpos con union reducida a FcRI, FcRII, y/o FcRIII, asf como sustituciones de aminoacidos que dan como resultado una union aumentada a un FcR pero union disminuida a otro FcR.

Por consiguiente, las funciones efectoras que implican a la region constante de un anticuerpo anti-CD154 pueden modularse alterando las propiedades de la region constante, y la region Fc en particular. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD154 que tiene una funcion efectora reducida se compara con un segundo anticuerpo con una funcion efectora y que puede ser un anticuerpo no variante, nativo o parental (por ejemplo, el anticuerpo 342 o el anticuerpo 5c8, que se describe en el documento US 5.474. 771) que comprende una region constante nativa o Fc que media la funcion efectora. En realizaciones particulares, la modulacion de la funcion efectora incluye situaciones en donde se abole una actividad o esta completamente ausente.

Una secuencia nativa Fc o region constante comprende una secuencia de aminoacido identica a la secuencia de aminoacido de una region Fc o de cadena constante encontrada en la naturaleza. Preferentemente, una molecula de control utilizada para evaluar la funcion efectora relativa comprende el mismo tipo/subtipo de la region Fc como lo hace un anticuerpo de prueba o variante. Una variante o Fc alterada o region constante comprende una secuencia de aminoacido que difiere de una region de cadena pesada de secuencia nativa en virtud de al menos una modificacion de aminoacido (por ejemplo, una modificacion post-traduccional, sustitucion, insercion o eliminacion de aminoacido). Por consiguiente, la region constante y variante puede contener una o mas sustituciones, eliminacion o inserciones de aminoacido que dan como resultado modificaciones post-traduccionales alteradas incluyendo, por ejemplo, un patron de glucosilacion alterado. Un anticuerpo parental o region Fc es, por ejemplo, una variante que tiene una funcion efectora normal utilizada para construir una region constante (es decir, Fc) que tiene una funcion efectora alterada, por ejemplo, reducida.

Los anticuerpos con funcion o funciones efectoras alteradas (por ejemplo, reducidas o eliminadas) pueden generarse modificando o produciendo anticuerpos con una constante variante, una region Fc, o de cadena pesada. La tecnologfa de ADN recombinante y/o el cultivo celular y las condiciones de expresion pueden utilizarse para producir anticuerpos con una funcion y/o actividad alterada. Por ejemplo, la tecnologfa de ADN recombinante puede utilizarse para modificar una o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones del aminoacido en regiones (tales como por ejemplo, las regiones Fc o constantes) que afectan la funcion del anticuerpo incluyendo las funciones efectoras. Alternativamente, los cambios en las modificaciones post-traduccionales, tales como los patrones de glucosilacion (vease a continuacion) puede lograrse mediante la manipulacion de la celula hospedadora y del cultivo celular y las condiciones de expresion a traves de las cuales se produce el anticuerpo.

Las alteraciones de aminoacido tales como las sustituciones de aminoacidos, pueden alterar la funcion efectora de los anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion sin afectar a la afinidad de union del antígeno. Las sustituciones de aminoacido descritas anteriormente (por ejemplo, Glu318, Kys320, Lys332, Lys235, Gly237, K332, y P329) pueden utilizarse para generar anticuerpos con una funcion efectora reducida.

En otras realizaciones, las sustituciones de aminoacido pueden hacerse para uno o mas de los siguientes restos de aminoacido: 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, y 322 de la region constante de cadena pesada (veanse los documentos US 5.624.821 y US 5.648.260). Dichas sustituciones pueden alterar la funcion efectora mientras retienen la actividad de union a antígeno. Una alteracion en uno o mas de los aminoacidos 234, 235, 236, y 237 puede disminuir la afinidad de union a la region Fc del receptor FcyRI en comparacion con un anticuerpo no modificado o no variante. Los restos de aminoacido 234, 236, y/o 237 pueden sustituirse con alanina, por ejemplo, y el resto de aminoacido 235 puede sustituirse con glutamina, por ejemplo. En otra realizacion, un anticuerpo IgG1 anti-CD154 puede comprender una sustitucion de Leu en la posicion 234 con Ala, una sustitucion de Leu en la posicion 235 con Glu, y una sustitucion de Gly en la posicion 237 con Ala.

Adicional o alternativamente, los restos de aminoacido Fc en 318, 320 y 322 pueden alterarse. Estos restos de aminoacidos, mientras estan altamente conservados en IgG de raton y humano, median la union del complemento. Se ha demostrado que la alteracion de estos restos de aminoacido reduce la union C1q pero no altera la union del antígeno, la union de la protema A, o la capacidad de Fc para unir los macrofagos de raton.

En otra realizacion, un anticuerpo anti-CD154 de la presente invencion es una inmunoglobulina IgG4 que comprende sustituciones que reducen o eliminan la funcion efectora. La porcion Fc de IgG4 de un anticuerpo anti-CD154 de la invencion puede comprender una o mas de las siguientes sustituciones: sustitucion de prolina por glutamato en el resto 233, alanina o valina por fenilalanina en el resto 234 y alanina o glutamato por leucina en el resto 235 (enumeracion EU Kabat, E. A. et al., (1991), supra). Ademas, la retirada del sitio de glucosilacion enlazado a N en la region Fc IgG4 al sustituir Ala por Asn en el resto 297 (enumeracion EU) ademas puede reducir la funcion efectora y eliminar cualquier actividad efectora residual que pueda existir. Otra IgG4 mutante ejemplar con una funcion efectora reducida es la variante del subtipo IgG4 que contiene las mutaciones S228P y L235E (mutacion PE) en la region constante de la cadena pesada. Esta mutacion da como resultado una funcion efectora reducida. Veanse los documentos US 5.624.821 y US 5.648.260. Otra mutacion ejemplar en el contexto IgG4 que reduce la funcion efectora es S228P/T229A, como se describe en el presente documento.

Otros cambios en la secuencia de aminoacido ejemplares en la region constante incluyen pero no se limitan a la mutacion Ala-Ala descrita por Bluestone et al., (veanse los documentos WO 94/28027 y WO 98/47531; tambien vease Xu et al, 2000 Cell Immunol 200; 16-26). De esta forma en ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD154 con mutaciones dentro de la region constante incluyendo la mutacion Ala-Ala pueden utilizarse para reducir o abolir la funcion efectora. De acuerdo con estas realizaciones, la region constante de un anticuerpos anti-CD154 comprende una mutacion en una alanina en la porcion 234 o una mutacion en la alanina en la posicion 235. Adicionalmente, la region constante puede contener una mutacion doble: una mutacion a una alanina en la posicion 234 y una segunda mutacion a una alanina en la posicion 235.

En una realizacion, un anticuerpo anti-CD154 comprende un marco IgG4, en donde la mutacion Ala-Ala describina una mutacion o mutaciones de fenilalanina a alanina en la posicion 234 y/o una mutacion de leucina a alanina en la posicion 235. En otra realizacion, el anticuerpo anti-CD154 comprende un marco IgG1, en donde la mutacion Ala-Ala describina una mutacion o mutaciones de leucina a alanina en la posicion 234 y/o una mutacion de leucina a alanina en la posicion 235. Un anticuerpo anti-CD154 puede llevar otras mutaciones alternativa o adicionalmente, incluyendo la mutacion puntual K322A en el dominio CH2 (Hezareh et al., 2001 J Virol. 75: 12161-8).

Otras sustituciones de aminoacido ejemplares se proveen en el documento WO 94/29351 (que se incorpora aqrn por referencia en su totalidad), que recita anticuerpos que tienen mutaciones en la region N-terminal del dominio CH2 para alterar la capacidad de los anticuerpos para unirse a FcRI, por lo tanto disminuyendo la capacidad de los anticuerpos para unirse a C1q, que a su vez disminuye la capacidad de los anticuerpos para fijar el complemented Tambien vease Cole et al. (J. Immunol. (1997) 159: 3613-3621), que describe mutaciones en la region CH2 superior en IgG2 que da como resultado una union FcR.

Los metodos para generar cualquiera de las variantes de anticuerpos anteriormente mencionadas que comprenden sustituciones de aminoacido son bien conocidas en la tecnica. Estos metodos incluyen, pero no se limitan a, preparacion a travé dse mutagenesis dirigida al sitio (o mediada por oligonucleotido), mutagenesis por PCR, y mutagenesis de casete de una molecula de ADN preparada que codifica el anticuerpo o al menos una region constante del anticuerpo.

La mutagenesis dirigida al sitio es bien conocida en la tecnica (vease, por ejemplo, Carter et al., Nucleic Acids Res.

13 :4431-4443 (1985) y Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1987)).

La mutagenesis por PCR tambien es adecuada para crear variantes de las secuencias de aminoacido del polipeptido de partida. Vease, Higuchi, en PCR Protocols, pp.177- 183 (Academic Press, 1990); y Vallette et al., Nuc. Acids Res.

17:723-733 (1989).

Otro metodo para preparar variantes de secuencia, mutagenesis de casete, se basa en la tecnica descrita por Wells et al., Gene 34:315-323 (1985).

Otra realizacion de la presente invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 con una funcion efectora reducida en donde la region Fc del anticuerpo, o las porciones de la misma, se alternan con una region Fc (o con porciones de la misma) que tienen una funcion efectora naturalmente reducida que induce la actividad. Por ejemplo, la region constante IgG4 humana exhibe activacion reducida o nada del complemento. Ademas, las diferentes moleculas IgG difieren en su afinidad de union a FcR, que puede deberse al menos en parte a la longitud variable y flexibilidad a las regiones de conexion de IgG (que disminuyen el orden de IgG3>IgG1>IgG4>IgG2). Por ejemplo, IgG4 exhibe una union reducida o una union a FcYRIIa. Para ejemplos de moleculas quimericas y regiones constantes quimericas, Vease, por ejemplo Gillies et al., (Cancer Res. 1999, 59: 2159-2166) y Mueller et al., (Mol. Immunol. 1997, 34: 441­ 452).

La invencion tambien se refiere a anticuerpos anti-CD154 con funcion efectora reducida en donde la region Fc esta completamente ausente. Dichos anticuerpos tambien pueden referirse a derivados de anticuerpo y fragmentos de union a antígeno de la presente invencion. Los derivados y fragmentos pueden fusionarse a secuencias de protema no de anticuerpos o estructuras no de protema, especialmente estructuras disenadas para facilitar la distribucion y/o biodisponibilidad cuando se administran a un animal, por ejemplo, un sujeto humano (vease a continuacion).

Como se explico anteriormente, los cambios dentro de la region de conexion tambien afectan las funciones efectoras. Por ejemplo, la eliminacion de la region de conexion puede reducir la afinidad para receptores Fc y puede reducir la activacion del complemento (Klein et al., 1981 PNAS USA 78: 524-528). La presente descripcion por consiguiente tambien se refiere a anticuerpos con alteraciones en la region bisagra.

En realizaciones particulares, los anticuerpos de la presente invencion pueden modificarse para inhibir la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). La actividad CDC modulada puede lograrse introduciendo una o mas sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoacido en la region Fc del anticuerpo (vease, por ejemplo, US 6.194.551 y US 6.242.195). Alternativa o adicionalmente, el resto o restos de cistema pueden introducirse en la region Fc, permitiendo por lo tanto la formacion del enlace de disulfuro intercatenario en esta region. El anticuerpo homodimerico generado de esta forma puede tener una capacidad de internalizacion mejorada o reducida y/o muerte celular mediada por el complemento aumentada o disminuida. Vease Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992), el documento WO 99/51642, Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); US 5.648.260; US 5.624.821; y WO 94/29351.

Ademas se entiende que la funcion efectora puede variar de acuerdo con la afinidad de union del anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos con alta afinidad pueden ser mas eficientes en la activacion del sistema del complemento en comparacion con anticuerpos con una afinidad relativamente baja (Marzocchi-Machado et al., 1999 Immunol Invest 28: 89- 101). Por consiguiente, un anticuerpo debe alterarse de tal forma que la afinidad de union a su antígeno se reduce (por ejemplo, cambiando las regiones variables del anticuerpo a traves de metodos tales como sustitucion, adicion o eliminacion de uno o mas restos de aminoacido). Un anticuerpo con afinidad de union reducida puede exhibir funciones efectoras reducidas, incluye, por ejemplo, ADCC y/o CDC reducido.

Los anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion con funcion efectora reducida incluyen anticuerpos con la afinidad de union reducida para uno o mas receptores Fc (FcR) con relacion a un anticuerpo anti-CD154 parental o no variante. Por consiguiente, los anticuerpos anti-CD154 con afinidad de union FcR reducida incluyen anticuerpos anti-CD154 que exhiben una disminucion de 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces o mayor en la afinidad de union a uno o mas receptores Fc en comparacion con un anticuerpo anti-CD154 parental o no variante (por ejemplo, anticuerpo 342 o 5c8). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 con una funcion efectora reducida se une a un FcR con aproximadamente 10 veces menos afinidad con relacion a un anticuerpo parental o no variante. En otras realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 con una funcion efectora reducida se une a un FcR con aproximadamente 15 veces menos de afinidad o con aproximadamente 20 veces menos de afinidad con relacion a un anticuerpo parental o no variante. El receptor FcR puede ser uno o mas de FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), y FcyRIII, y sus isoformas, y FceR, FcpR, Fc8R, y/o un FcaR. En realizaciones particulares un anticuerpo anti-CD154 con funcion efectora reducida exhibe una disminucion de 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces, o 5 veces o mayor en la afinidad de union a FcYRIIa.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 de la presente invencion exhibe una union reducida a una protema complemento con relacion a un segundo anticuerpo anti-CD154. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD154 de la invencion exhibe una union reducida por un factor de aproximadamente 1,5 veces o mas, aproximadamente 2 veces o mas, aproximadamente 3 veces o mas, aproximadamente 4 veces o mas, aproximadamente 5 veces o mas, aproximadamente 6 veces o mas, aproximadamente 7 veces o mas, aproximadamente 8 veces o mas, aproximadamente 9 veces o mas, aproximadamente 10 veces o mas, o aproximadamente 15 veces o mas, con relacion a un segundo anticuerpo anti-CD154.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones la presente invencion se refiere a anticuerpos que provocan una funcion efectora reducida cuando se administra a un sujeto. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion no causa la trombosis en un sujeto al cual se administra el anticuerpo. La trombosis incluye, por ejemplo, eventos tromboembolicos. Los eventos incluyen, por ejemplo, vasculopatfa (por ejemplo, cambios vasculares tales como engrosamiento de la mtima y cambios en la pared del vaso). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion causa menos efectos tromboembolicos con relacion a un segundo anticuerpo espedfico CD154 (por ejemplo, anticuerpo 342, el anticuerpo 5c8 o 5c8 humanizado). Un anticuerpo anti-CD154 con una funcion efectora reducida puede demostrar una reduccion de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, o 50 % en el numero de eventos tromboembolicos cuando se administra a un sujeto y en comparacion con un anticuerpo anti-CD154 no variante o parental.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion no causa agregacion de plaquetas o activacion in vitro y/o mejora la agregacion o activacion de plaquetas a un grado menor cuando se compara con un segundo anticuerpo espedfico de CD154 (por ejemplo, anticuerpo 5c8 o 5c8 humanizado; vease el Ejemplo 1). Por consiguiente, en ciertas realizaciones la presencia de la protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, de la presente invencion en un ensayo de agregacion o activacion de plaquetas convencional no da como resultado la agregacion o activacion de mas de 20 %, 25 %, 30 % o 50 % sobre la agregacion o activacion observada en un ensayo de control negativo. Un ensayo de agregacion de plaquetas convencional ejemplar es el ensayo descrito en el presente documento (Ejemplo 11, Ensayo 1) y mostrado en la Figura 26. Ambos ensayos convencionales y un ensayo de agregacion de plaquetas alternativo (Ensayo 2, Figura 27) que pueden utilizarse en la invencion se describen en el Ejemplo 11. La protema de union a CD154 puede ser soluble.

En ciertas realizaciones, esta invencion tambien proporciona un anticuerpo anti-CD154 que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se une espedfica y monovalentemente a CD40L, en donde la union de dicha protema soluble a CD154 sustancialmente no induce a la fosforilacion JNK en celulas T de Jurkat. Esta invencion tambien proporciona protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, y la protema comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se une espedfica y monovalentemente a CD154, en donde la union de la protema soluble a CD154 no induce sustancialmente la secrecion de IFN-gama a traves de las celulas T Jurkat coestimuladas con el anticuerpo Anti-CD3.

Ciertas realizaciones de la presente divulgacion tambien se refieren a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una o mas secuencias CDR de cadena pesada seleccionadas de DR- Hl (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 5), en donde el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida comparada con una region Fc nativa o parental. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-CD154 comprende al menos dos de las CDR, y en otras realizaciones el anticuerpo comprende las tres secuencias CDR de cadena pesada, que son CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 5).

Otras realizaciones de la presente divulgacion se refieren a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una o mas secuencias CDR de cadena ligera seleccionadas de CDR- Ll (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 8), comprendiendo el anticuerpo ademas una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida comparada con una region Fc nativa o parental. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-CD154 comprende al menos dos de las CDR de cadena ligera, en otras realizaciones el anticuerpo comprende las tres secuencias CDR de cadena ligera, que son CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 8).

En realizaciones adicionales de la presente divulgacion, el anticuerpo anti-CD154 con funcion efectora reducida comprende las tres secuencias CDR de cadena ligera, que son CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 8), y comprende las tres secuencias CDR de cadena pesada, que son CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 5).

En ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona un anticuerpo anti-CD154 que se une espedficamente a una protema CD154, en donde el anticuerpo comprende una secuencia Vh seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11. En otras ciertas realizaciones, esta divulgacion proporciona el anticuerpo que se une espedficamente a una protema CD154, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-CD154 que comprende una cualquiera de una o mas de las CDR o secuencias de cadena ligera o pesada descritas anteriormente es un fragmento Fab o Fab' o uno de sus derivados. En aun otras realizaciones, el anticuerpo es un fragmento F(ab')² o uno de sus derivados. Tambien se incluyen otros fragmentos de anticuerpo derivados de los mismos que comprenden la CDR o las secuencias de cadena pesada o ligera que unen espedficamente una protema CD154. Estos anticuerpos pueden modificarse para asf provocar funciones reducidas o no efectoras. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia Vh seleccionada de SEQ iD NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, el anticuerpo ademas comprende la region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida comparada con una region Fc nativa parental.

En otras realizaciones, la divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia Vl seleccionada de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 14, el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida comparada con una region Fc nativa o parental.

En algunas realizaciones, un anticuerpo comprende una secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 2. En realizaciones adicionales, un anticuerpo comprende SEQ ID NO: 2 que es un fragmento Fab o Fab' o un derivado de los mismos. En aun otras realizaciones, el anticuerpo es un fragmento F(ab')² o uno de sus derivados. Tambien se incluyen otros fragmentos de anticuerpo o sus derivados comprenden las CDR o las secuencias de cadena pesada o ligera que se unen espedficamente a una protema CD154.

En realizaciones adicionales, la divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia Vl seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 14 y ademas comprende una secuencia Vh seleccionada de Se Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID No : 10 y SEQ ID NO: 11, el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida comparada con una region Fc nativa o parental.

En otras realizaciones, la divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia Vh de SEQ ID NO: 29 y una secuencia Vl de SEQ ID NO: 30, el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida comparada con una region Fc nativa o parental.

En ciertas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un anticuerpo anti-CD154 que se une espedficamente a una protema CD154, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 15. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 que ademas comprende una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida comparada con una region Fc nativa o parental (por ejemplo, una region Fc con glucosilacion alterada y/u otra modificacion).

En ciertas realizaciones, la presente invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de cadena pesada selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida compara con una region Fc nativa o parental (por ejemplo, una region Fc con glucosilacion alterada y/u otra modificacion).

En ciertas realizaciones, la divulgacion proporciona un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia de cadena ligera como se estable en SEQ ID NO: 2 o 14 y una secuencia de cadena pesada como se establece en SEQ ID NO: 1, 9, 10 u 11. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD154 puede ser un fragmento de anticuerpo. En realizaciones adicionales, el anticuerpo es un fragmento Fab o Fab' o uno de sus derivados. En aun otras realizaciones, el anticuerpo es un fragmento F(ab')² o uno de sus derivados. Otros fragmentos de anticuerpo o sus derivados comprenden las CDR o las secuencias de cadena pesada y ligera que se une espedficamente a una protema CD154 tambien se incluyen. Adicionalmente los anticuerpos pueden exhibir una funcion efectora reducida. Por ejemplos, los anticuerpos que comprenden una region Fc pueden comprender una region Fc con una o mas modificaciones (por ejemplo, glucosilacion alterada, conjugacion, etc.) de tal forma que el anticuerpo produce una funcion o funciones efectoras reducidas o ninguna funcion.

En otras realizaciones, la presente invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 13, en donde el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una region efectora reducida en comparacion con una region Fc nativa o parental. En otras realizaciones, la presente invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 12, en donde el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una region efectora reducida en comparacion con una region Fc nativa o parental.

En algunas realizaciones, la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una o mas secuencias CDR de cadena pesada seleccionadas de CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 44), el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida en comparacion con una region Fc nativa o parental. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD154 comprende al menos dos de las CDR de cadena pesada, en otras realizaciones el anticuerpo comprende las tres secuencias CDR de cadena pesada, que son CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID n O: 43) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 44).

En ciertas realizaciones, la divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una o mas secuencias CDR de cadena ligera seleccionadas de CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 47), el anticuerpo ademas comprende una region Fc que confiere una funcion efectora reducida en comparacion con una region Fc nativa o parental. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD154 comprende al menos dos de las CDR de cadena ligera, y en otras realizaciones, el anticuerpo comprende las tres secuencias CDR de cadena ligera, que son CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 47).

Realizaciones adicionales de la presente divulgacion se refieren al anticuerpo anti-CD154 que comprende una region Fc que confiere una funcion efectora reducida en comparacion con una region Fc nativa o parental, en donde el anticuerpo comprende las tres secuencias CDR de cadena ligera, que son CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 47), y en donde el anticuerpo comprende las tres secuencias CDR de cadena pesada que son CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 44).

En otras realizaciones, la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una o mas secuencias CDR de cadena pesada seleccionadas de CDR- Hl (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 50), el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida en comparacion con una region Fc nativa o parental. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-CD154 comprende al menos dos CDR de cadena pesada, y en otras realizaciones el anticuerpo comprende las tres secuencias CDR de cadena pesada, que son CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 50).

En ciertas realizaciones, la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una o mas secuencias CDR de cadena ligera seleccionadas de CDR- Ll (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 53), el anticuerpo ademas comprende una Fc variante que confiere una funcion efectora reducida en comparacion con una region Fc nativa o parental. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende al menos dos de las CDR de cadena ligera, y en otras realizaciones el anticuerpo comprende las tres secuencias CDR de cadena ligera, que son CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 53).

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 con una funcion efectora reducida comprende las tres secuencias CDR de cadena ligera, que son CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 53), y ademas comprende las tres secuencias CDR de cadena pesada, que son CDR-H1 (s Eq ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 50).

En realizaciones adicionales, esta divulgacion proporciona un anticuerpo anti-CD154 que se une espedficamente a CD154, en donde el anticuerpo comprende una secuencia Vl de SEQ ID NO: 54. La divulgacion tambien se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia Vh de SEQ ID NO: 56. Un anticuerpo anti-CD154 puede comprender tanto una secuencia Vl de SEQ ID NO: 54 como una secuencia Vh de SEQ ID NO: 56. En realizaciones adicionales, el anticuerpo es un fragmento Fab o Fab' o uno de sus derivados. En aun otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un fragmento F(ab')² o uno de sus derivados. El anticuerpo tambien puede ser un anticuerpo humanizado o completamente humano o uno de sus fragmentos. Ciertas realizaciones de la presente invencion se refieren al anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia Vh de SEQ ID NO: 56 y la secuencia Vl de SEQ ID NO: 54, el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida en comparacion con una region Fc nativa o parental.

En realizaciones adicionales, esta divulgacion proporciona un anticuerpo anti-CD154 que se une espedficamente a CD154, en donde el anticuerpo comprende una secuencia Vl de SEQ ID NO: 58. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende una secuencia Vh de SEQ ID NO: 60. En realizaciones adicionales, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia Vh de SEQ ID NO: 60 y una secuencia de Vl de SEQ ID NO: 58. El anticuerpo puede ser un fragmento Fab o Fab' o uno de sus derivados. En otras realizaciones, el anticuerpo es un fragmento F(ab')² o uno de sus derivados. El anticuerpo tambien puede ser un anticuerpo humanizado o completamente humano o uno de sus fragmentos. En otras realizaciones, la presente invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD154 que comprende una secuencia Vh de SEQ ID NO: 58 y una secuencia Vl de SEQ ID NO: 60, el anticuerpo ademas comprende una region Fc variante que confiere una funcion efectora reducida en comparacion con una region Fc nativa o parental.

Anticuerpos anti-CD154 con glucosilacion alterada

La retirada del glucano produce un cambio estructural que debena reducir enormemente la union a todos los miembros de las especies a traves de la familia del receptor Fc. En los anticuerpos glucosilados, incluyendo los anticuerpos anti-CD154, los glucanos (oligosacaridos) unidos al sitio N-enlazado conservado en los dominios CH2 del dfmero Fc estan encasillados entre los dominios CG2, con los restos de azucar haciendo contacto con los restos de aminoacido espedficos en el dominio CH2 opuesto. Los diferentes patrones de glucosilacion estan asociados con diferentes propiedades biologicas de los anticuerpos (Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol, 65:111-128; Wright y Morrison, 1997, Trends Biotechnol, 15:26-32). Ciertas glucoformas espedficas confieren propiedades biologicas potencialmente ventajosas. La perdida de los glucanos cambia la separacion entre los dominios y aumentan su movilidad con relacion entre sf y se espera que tengan un efecto inhibidor en la union de todos los miembros de la familia del receptor Fc. Por ejemplo, los estudios in Vitro con varios anticuerpos glucosilados han demostrado que la retirada de los glucanos de CH2 alteran la estructura Fc de tal forma que la union del anticuerpo y los receptores Fc y la protema complemento C1Q se reduce en gran forma. Otro metodo conocido para reducir las funciones efectoras es inhibir la produccion de o retirar los glucanos N-enlazados en las posiciones 297 (enumeracion EU) en el dominio CH2 Fc (Nose et al., 1983 PNAS 80: 6632; Leatherbarrow et al., 1985 Mol. Immunol. 22: 407; Tao et al., 1989 J. Immunol. 143: 2595; Lund et al., 1990 Mol. Immunol. 27: 1145; Dorai et al., 1991 Hybridoma 10:211; Hand et al., 1992 Cancer Immunol. Immunother.

35:165; Leader et al., 1991 Immunology 72:481; Pound et al., 1993 Mol. Immunol. 30:233; Boyd et al., 1995 Mol. Immunol. 32:1311). Tambien se sabe que las diferentes glucoformas pueden afectar profundamente a las propiedades de un terapeutico, incluyendo farmacocineticoas, farmacodinamicas, interaccion del receptor y activacion espedfica del tejido (Graddis et al., 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3: 285-297). En particular, para anticuerpos, la estructura del oligosacarido puede afectar a las propiedades relevantes para la resistencia a proteasa, la vida media en suero del anticuerpo mediado por el receptor, la fagocitosis y la retroalimentacion del anticuerpo, ademas de a las funciones efectoras del anticuerpo (por ejemplo, la union al complejo C1 de complemento, que incluye CDC, y la union a los receptores FcyR, que son responsables de la modulacion de la trayectoria ADCC) (Nose y Wigzell, 1983; Leatherbarrow y Dwek, 1983; Leatherbarrow et al., 1985; Walker et al., 1989; Carter et al., 1992, PNAS, 89: 4285­ 4289).

Por consiguiente, otros medios para modular la funcion efectora de los anticuerpos incluyen alterar la glucosilacion de la region constante del anticuerpo. La glucosilacion alterada incluye, por ejemplo, una distribucion o aumento en el numero de restos glucosilados, y un cambio en el patron o ubicacion de los restos glucosilados, asf como un cambio en la estructura o estructuras de azucar. Los oligosacaridos encontrados en IgG humano afectan su grado de la funcion efectora (Raju, T. S. BioProcess International Abril 2003. 44-53); la microheterogeneidad de los oligosacaridos IgG humanos puede afectar las funciones biologicas tales como CDC y ADCC, la union a varios receptores Fc y la union a la protema C1q (Wright A. & Morrison SL. TIBTECH 1997, 1526-32; Shields et al., J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604; Shields et al., J Biol Chem. 2002; 277(30):26733-40; Tonkawa et al., J Biol Chem. 2003278(5):3466-73; Amana et al., Nat Biotechnology. 1999 Feb.; 17(2): 176-80). Por ejemplo, la capacidad de IgG de unirse a C1q y activar la cascada de complemento puede depender de la presencia, ausencia o modificacion de la fraccion de carbohidrato colocada entre los dos dominios CH2 (que esta normalmente anclada en Asn297) (Ward y Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995).

Los sitios de glucosilacion en un polipeptido que contiene Fc, por ejemplo un anticuerpo tal como un anticuerpo IgG, pueden identificarse a travé dse tecnicas convencionales. La identificacion del sitio de glucosilacion puede ser experimental o con base en analisis de secuencia o datos de modelacion. Se han descrito los motivos consenso, es decir, la secuencia de aminoacido reconocida por varias glucosiltransferasas. Por ejemplo, el motivo consenso para un motivo de glucosilacion enlazada a N es frecuentemente NXT o NXS, en donde X puede ser cualquier aminoacido excepto prolina. Tambien han sido descritos varios algoritmos para localizar un motivo de glucosilacion potencial. Por consiguiente, para identificar los sitios de glucosilacion potencial dentro de un anticuerpo o un fragmento que contiene Fc, la secuencia del anticuerpo se examina, por ejemplo, mediante el uso de bases de datos publicamente disponibles tales como el sitio web provisto por el centro para el analisis de secuencia biologica (ver servicios NetGlyc para pronosticas los sitios de glucosilacion enlazados N y servicios NetOGlyc para pronosticar sitios de glucosilacion enlazados a O).

Los estudios in vivo han confirmado la reduccion en la funcion efectora de los anticuerpos de aglucosilo. Por ejemplo, un anticuerpoanti-CD8 de aglucosilo es incapaz de consumir las celulas que llevan CD8 en ratones (Isaacs, 1992 J. Immunol. 148:3062) y un anticuerpo anti-CD3 de aglucosilo no induce el smdrome de liberacion de citocinas en ratones ni humanos (Boyd, 1995 supra; Friend, 1999 Transplantation 68:1632).

De manera importante, ya que la retirada de los glucanos en el dominio CH2 parece que tiene un efecto significativo en la funcion efectora, otras propiedades funcionales y ffsicas del anticuerpo permanecen inalteradas. Espedficamente, se ha demostrado que la retirada de los glucanos tiene poco o ningun efecto sobre la vida media en suero y la union al antígeno (Nose, 1983 supra; Tao, 1989 supra; Dorai, 1991 supra; Hand, 1992 supra; Hobbs, 1992 Mol. Immunol. 29:949).

Aunque existe una validacion in vivo del metodo de aglucosilo, existen informes de la funcion efectora residual con mAb de aglucosilo (vease, por ejemplo, Pound, J. D. et al., (1993) Mol. Immunol 30(3):233-41; Dorai, H. et al., (1991) Hybridoma 10(2): 211-7). Armour et al. muestran la union residual a protemas FcYRIIa y FcYRIIb (Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-1624; Mol. Immunol. 40 (2003) 585-593). De esta forma una disminucion adicional en funcion efectora, particularmente la activacion complementaria, puede ser importante para garantizar la anulacion completa de la actividad en algunos casos. Por esta razon, las formas de aglucosilo de IgG2 y IgG4 y un hnbrido G1/G4 son visualizadas como utiles en metodos y composiciones de anticuerpo de la invencion que tienen funciones efectoras reducidas.

Generacion de anticuerpos anti-CD154 desglucosilados y de aglucosilo

Los anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion pueden modificarse o alterarse para producir una funcion o funciones efectoras reducidas (en comparacion con un segundo anticuerpo espedfico de CD154) mientras opcionalmente retienen los otros atributos valiosos de la porcion Fc.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la presente invencion se refiere a anticuerpos anti-CD154 de aglucosilo con una funcion efectora disminuida, que se caracteriza por una modificacion del sitio enlazado a N conservado en los dominios CH2 de la porcion Fc del anticuerpo. Una modificacion del sitio enlazado a N conservado en los dominios CH2 del dfmero Fc puede dar lugar a anticuerpos anti-CD154 de aglucosilo. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen la mutacion del sitio enlazado a N conservado en los dominios CH2 del dfmero Fc, la retirada de los glucanos unidos al sitio enlazado a N en los dominios CH2, y la prevencion de la glucosilacion. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154 de aglucosilo puede crearse cambiando el sitio de Asn canonico enlazado a N en el dominio CH2 de cadena pesada a un resto Gln (veanse, por ejemplo, los documentos WO 05/03175 y US 2006-0193856).

En una realizacion de la presente invencion, la modificacion comprende una mutacion en el sitio de glucosilacion de cadena pesada para prevenir la glucosilacion en el sitio. De esta forma, en una realizacion de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de aglucosilo se preparan mediante la mutacion del sitio de glucosilacion de cadena pesada, es decir, la mutacion de N298Q (N297 utilizando la enumeracion EU de Kabat) y expresados en una celula hospedadora apropiada. Por ejemplo, esta mutacion puede lograrse siguiendo el protocolo recombinado por el fabricante para un kit de mutagenesis de sitio unico de Amersham-Pharmacia Biotech® (Piscataway, NJ, USA).

El anticuerpo mutado puede expresarse establemente en una sola celula hospedadora (por ejemplo, una celula NSO o CHO) y despues purificarse. Como un ejemplo, la purificacion puede llevarse a cabo utilizando la protema A y cromatograffa de filtracion con gel. Sera evidente para los expertos en la materia que tambien pueden utilizarse metodos adicionales de expresion y purificacion.

En otra realizacion de la presente invencion, los anticuerpos anti-CD154 y de aglucosilo tienen una funcion efectora disminuida, en donde la modificacion en el sitio enlazado a N conservado en los dominios CH2 de la porcion Fc del anticuerpo o derivado de anticuerpo comprende la retirada de los glucanos del dominio CH2, es decir, su desglucosilacion. Estos anticuerpos anti-CD154 de aglucosilo pueden generarse a traves de metodos convencionales y despues desglicosarse enzimaticamente. Los metodos para la desglucosilacion enzimatica de los anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la materia (Williams, 1973; Winkelhake & Nicolson, 1976 J. Biol Chem. 251:1074­ 80.).

En otra realizacion de esta invencion, la desglucosilacion puede lograrse cultivando celulas hospedadoras que producen los anticuerpos en un medio de cultivo que comprende un inhibidor de glucosilacion como la tunicamicina (Nose & Wigzell, 1983). Es decir, la modificacion es la reduccion o prevencion de la glucosilacion en el sitio enlazado a N conservado en los dominios CH2 de la porcion Fc del anticuerpo.

En otras realizaciones de esta invencion, los polipeptidos CD154 recombinantes (o celulas o membranas de celulas que contienen los polipeptidos) pueden utilizarse como un anrtgeno para generar un anticuerpo anti-CD154 o derivados de anticuerpo, que pueden despues desglicosilarse.

En realizaciones alternativas, los anticuerpos anti-CD154 de aglucosilo o los anticuerpos anti-CD154 con glucosilacion reducida de la presente invencion, pueden producirse a traves de los metodos descritos en Taylor y col., (documentos WO 05/18572 y US 2007-0048300). Por ejemplo, en una realizacion, un anticuerpo de aglucosilo anti-CD154 puede producirse alterando un primer resto de aminoacido (por ejemplo, mediante la sustitucion, insercion, eliminacion o a traves de modificacion qmmica), en donde el primer resto de aminoacido alterado inhibe la glucosilacion del segundo resto ya sea a traves de una inhibicion esterica o carga o ambos. En ciertas realizaciones el primer resto de aminoacido se modifica a traves de la sustitucion del aminoacido. En realizaciones adicionales, la sustitucion del aminoacido se selecciona del grupo que consiste en Gly, Ala, Val, Leu, He, Phe, Asn, Gln, Trp, Pro, Ser, Thr, Tyr, Cys, Met, Asp, Glu, Lys, Arg, e His. En otras realizaciones, la sustitucion del aminoacido es un resto de aminoacido no tradicional. El segundo resto de aminoacido puede estar cerca o dentro de un motivo de glucosilacion, por ejemplo, un motivo de glucosilacion enlazado a N que contiene la secuencia de aminoacido NXT o NXS. En una realizacion ejemplar, el primer resto de aminoacido es el aminoacido 299 y el segundo resto de aminoacido es el aminoacido 297, de acuerdo con la enumeracion de Kabat. Por ejemplo, la primera sustitucion del aminoacido puede ser T299A, T299N, T299G, T299Y, T299C, T299H, T299E, T299D, T299K, T299R, T299G, T299I, T299L, T299M, T299F, T299P, T299W, y T299V, de acuerdo la enumeracion de Kabat. En realizaciones particulares, la sustitucion del aminoacido es T299C.

La funcion efectora tambien puede reducirse modificando un anticuerpo de la presente invencion de tal forma que el anticuerpo contenga una fraccion de bloqueo. Las fracciones de bloqueo ejemplares incluyen fracciones de volumen y/o carga suficiente de tal forma que ocurre la glucosilacion reducida, por ejemplo, mediante el bloqueo de la capacidad de una glucosidasa para glucosilar el polipeptido. La fraccion de bloqueo adicional o alternativamente reduce la funcion efectora, por ejemplo, inhibiendo la capacidad de la region Fc para unir un receptor en una protema de complemento. En algunas realizaciones, la presente divulgacion se refiere a una protema de union a CD154, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154, que comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 5, 44 y 50, y una region FC variante, la region Fc variante comprende un primer resto de aminoacido y un sitio de N-glucosilacion, el primer resto de aminoacido modificado con qmmica de cadena lateral para lograr un volumen esterico aumentado o carga electroestatica aumentada comparada con el primer resto de aminoacido no modificado, por lo tanto reduciendo el nivel o por el contrario alterando la glucosilacion en el sitio de N-glucosilacion. En ciertas de estas de estas realizaciones, la region Fc variante confiere una funcion efectora reducida comparada con un control, la region Fc no variante. En realizaciones adicionales, la cadena lateral con un volumen esterico aumentado es una cadena lateral de un resto de aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Phe, Trp, His, Glu, Gln, Arg, Lys, Met y Tyr. En aun otras realizaciones adicionales, la qmmica de cadena lateral con una carga electrostatica aumentada es una cadena lateral de un resto de aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Glu, Lys, Arg, y His.

Por consiguiente, en una realizacion, la glucosilacion y la union de Fc pueden modularse sustituyendo T299 con qmmica de cadena lateral cargada tal como D, E, K, o R. El anticuerpo resultante tendra glucosilacion reducida asf como una afinidad de union Fc reducida a un receptor Fc debido a las interacciones electrostaticas desfavorables.

En otra realizacion, un anticuerpo variante T299C, que esta tanto aglucosilado como capaz de formar un aducto de cistema, puede exhibir una funcion efectora menor (por ejemplo, union de FcyRI) en comparacion con su contraparte de anticuerpo aglucosilado (vease, por ejemplo, el documento WO 05/18572). Por consiguiente, la alteracion de un primer aminoacido proximo o un motivo de glucosilacion puede inhibir la glucosilacion del anticuerpo en un segundo resto de aminoacido; cuando el primer aminoacido es un resto de cistema, el anticuerpo puede exhibir aun una funcion efectora reducida adicional. Ademas, la inhibicion de la glucosilacion de un anticuerpo del subtipo IgG4 puede tener un efecto aun mas profundo sobre la union de FcyRI en comparacion con los efectos de la aglucosilacion en otros subtipos.

En realizaciones adicionales, la presente invencion se refiere a anticuerpos anti-CD154 con glucosilacion alterada que exhiben una union reducida a uno o mas receptores FcR y que opcionalmente tambien exhiben una union aumentada o normal a uno o mas receptores Fc y/o complemento - por ejemplo, anticuerpos con glucosilacion alterada que al menos mantienen una afinidad de union igual o similar a uno o mas receptores Fc y/o complemento como un nativo, anticuerpo anti-CD154 de control. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD154 con Man^sGlcNAc²N-glucano predominante como la estructura de glucano presente (por ejemplo, en donde la estructura de Man^sGlcNAc²N-glucano esta presente a un nivel que es al menos aproximadamente 5% en moles mas que en la siguiente estructura de glucano predominante de la composicion Ig) puede exhibir una funcion efectora alterada comparada con una poblacion de anticuerpo anti-CD154 en donde la estructura Man^sGlcNAc²N-glucano no es predominante. Los anticuerpos que cuentan predominantemente con esta estructura de glucano exhiben una union disminuida a FcYRIla y FcYRIIb, una union aumentada a FcYRIIIa y FcYRIIIb, y una union disminuida a la subunidad C1q del complejo C1 (vease el documento US 2006-0257399). Esta estructura de glucano, cuando es la estructura de glucano predominante, confiere un ADCC aumentado, CDC aumentado, vida media en suero aumentada, una produccion de anticuerpo de las celulas B aumentada, y una fagocitosis a traves de macrofagos disminuida.

En general, las estructuras de glucosilacion en una glicoprotema variaran dependiendo de la expresion del hospedador y las condiciones de cultivo (Raju, TS. BioProcess International Abril 2003. 44-53). Dichas diferencias pueden conducir a cambios tanto en la funcion efectora como en la farmacocinetica (Israel et al., Immunology. 1996; 89(4):573-578; Newkirk et al., P. Clin. Exp. 1996; 106(2):259-64). Por ejemplo, la galactosilacion puede variar con las condiciones del cultivo celular, que pueden convertir algunas composiciones de inmunoglobulina en inmunogenicas dependiendo de su patron de galactosa espedfico (Patel et al., 1992. Biochem J. 285:839-845). Las estructuras de oligosacarido de glicoprotemas producidas por celulas de mairnfero no humano tienden a estar estrechamente relacionadas con las de las glicoprotemas humanas. Ademas, los sistemas hospedadores de expresion de protema pueden modificarse o seleccionarse para expresar una glucoforma Ig predominante o alternativamente pueden producir glicoprotemas naturales que tienen estructuras de glucano predominantes. Los ejemplos de sistemas hospedadores de expresion de protema modificados que producen una glicoprotema que tienen una glucoforma predominante incluyen desactivaciones/mutaciones de gen (Shields et al., 2002, JBC, 277:26733-26740); modificacion genetica (Umana et al., 1999, Nature Biotech., 17:176-180) o una combinacion de ambos. Alternativamente, ciertas celulas expresan de manera natural una glucoforma predominante, por ejemplo, pollos, humanos y vacas (Raju et al., 2000, Glycobiology, 10:477-486). De esta forma, la expresion de un anticuerpo o composicion de anticuerpo que tienen una glucosilacion alterada (por ejemplo, predominantemente una estructura de glucano espedfica) puede obtenerse por un experto en la materia seleccionando al menos uno de varios sistemas hospedadores de expresion. Los sistemas hospedadores de expresion de protema que pueden usarse para producir anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion incluyen celulas animales, vegetales, de insecto, bacterianas y similares. Por ejemplo, los documentos US 2007-0065909, 2007-0020725, y 2005-0170464 describen la produccion de moleculas de inmunoglobulina aglucosiladas en celulas bacterianas. Como un ejemplo mas, Wright y Morrison produjeron anticuerpos en una lmea celular deficiente en CHO en la glucosilacion (1994 J Exp Med 180: 1087-1096) y mostraron que los anticuerpos producidos en esta lmea celular fueron incapaces de realizar citolisis mediada por el complemento. Otros ejemplos de sistemas hospedadores de expresion encontrados en la tecnica para la produccion de glicoprotemas incluyen: celulas CHO: Raju WO 99/22764 y Presta WO 03/35835; celulas de hibridoma: Trebak et al., 1999, J. Immunol. Methods, 230: 59-70; celulas de insecto Hsu et al., 1997, JBC, 272:9062-970, y celulas vegetales: Gerngross et al., WO 04/74499. Debido a que una celula o extracto dados han resultado en la glucosilacion de un motivo dado, estan disponibles tecnicas reconocidas en la tecnica para determinar si el motivo ha sido glucosilado, por ejemplo, utilizando electroforesis de gel y/o espectroscopfa de masas.

Se describen metodos adicionales para alterar los sitios de glucosilacion de los anticuerpos, por ejemplo, en los documentos US 6.350.861 y US 5.714.350, WO 05/18572 y WO 05/03175; estos metodos pueden utilizarse para producir anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion con glucosilacion alterada, reducida, o sin glucosilacion.

Los anticuerpos anti-CD154 de aglucosilo con una funcion efectora reducida pueden ser anticuerpos que comprenden modificaciones o que pueden conjugarse para comprender una fraccion funcional. Las fracciones incluyen una fraccion de bloqueo (por ejemplo, una fraccion PEG, aductos de cistema, etc.), una fraccion detectable (por ejemplo, fracciones fluorescentes, fracciones radioisotopicas, fracciones radioopacas, etc., incluyendo fracciones de diagnostico), y/o una fraccion terapeutica (por ejemplo, agentes citotoxicos, agentes anti-inflamatorios, agentes inmunomoduladores, agentes anti-infecciosos, agentes anti-cancengenos, agentes anti-neurodegenerativos, radionuclidos, etc.).

Conjugados de Anticuerpo

Cuando se administran, los anticuerpos por lo general son retirados rapidamente de la circulacion y por consiguiente pueden provocar una actividad farmacologica relativamente corta. En consecuencia, pueden requerirse inyecciones frecuentes de dosis relativamente grandes de anticuerpos para sostener la eficacia terapeutica del tratamiento de anticuerpo.

En una realizacion de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion pueden ser anticuerpos modificados (por ejemplo, unidos a otras fracciones tales como la fraccion funcional heterologa) para aumentar la integridad y longevidad del anticuerpo in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion pueden ser anticuerpos que estan modificados para incluir una fraccion (fraccion funcional) que puede aumentar la estabilizacion, por lo tanto prolongando la vida media en suero del anticuerpo. La vida media en suero de una protema de union CD2154, por ejemplo, un anticuerpo, de la invencion puede ser de al menos 3 dfas, al menos 7 dfas, al menos 14 dfas, al menos 21 dfas, al menos 28 dfas, al menos 1 mes o mas. Las fracciones funcionales que aumentan la vida media de los anticuerpos pueden ser particularmente utiles en realizaciones en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo.

Las modificaciones del anticuerpo tambien pueden aumentar la solubilidad de la protema en una solucion acuosa, eliminar la agregacion, mejorar la estabilidad ffsica y qmmica de la protema, y reducir enormemente la inmunogenicidad y la antigenicidad de la protema. Como resultado, la actividad biologica in vivo deseada puede lograrse a traves de la administracion de aductos de polfmero-protema menos frecuentemente o en dosis inferiores que con la protema no modificada.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invencion son anticuerpos unidos a fracciones funcionales heterologas para formar conjugados de anticuerpos. Una “fraccion funcional” se refiere a cualquier fraccion funcional (por ejemplo, polipeptido, dominio de protema, vehuculo, polfmero, etc.) que esta asociado con un anticuerpo de la invencion. La asociacion con un anticuerpo puede ser a traves de una union covalente o no covalente y tambien puede ser reversible o regulable. Las moleculas ejemplares que pueden utilizarse para formar conjugados de anticuerpo CD154 de la presente invencion incluyen pero no se limitan a fracciones funcionales tales como, por ejemplo, agentes antineoplasicos, farmacos, toxinas, protemas biologicamente activas, por ejemplo, enzimas, otro anticuerpo, derivados de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo, polfmeros sinteticos (por ejemplo, PEG) o de origen natural, acidos nucleicos y fragmentos de estos, por ejemplo a Dn , ARN y fragmentos de los mismos, aptameros, radionuclidos, particularmente, radioyoduro, radioisotopos, metales quilatados, nanopartmulas y grupos reporteros tales como los compuestos fluorescentes o luminiscentes o compuestos que pueden detectarse a traves de tecnicas formadoras de imagenes tales como RMN o espectroscopia ESR.

En un ejemplo adicional, una fraccion funcional a la cual los anticuerpos de la invencion se conjugan puede aumentar la vida media del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o mejorar la distribucion de un anticuerpo a traves de la barrera epitelial al sistema inmune. Los ejemplos de fracciones funcionales adecuadas de este tipo incluyen polfmero, dextrina, hidroxipropilmetacrilamida (HPMA), transferrina, albumina, protemas de union a albumina o compuestos de union a albumina tales como los descritos en PCT/GB2005/002084.

Cuando la fraccion funcional es un polfmero puede, en general, ser un polfmero sintetico de origen natural, por ejemplo, un polfmero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido o polisacarido ramificado o no ramificado, por ejemplo un homo- o hetero-polisacarido. Vease, por ejemplo, Veronese y Pasut, 2005, Drug Discovery Today, 10(21):1451-1458; Pasut et al., 2004, Expert Opinion in Therapeutic Patents, 14(6):859-894.

Los sustituyentes opcionales particulares que pueden estar presentes en los polfmeros sinteticos antes mencionados incluyen uno o mas grupos hidroxi, metilo o metoxi.

Los ejemplos particulares de polfmeros sinteticos incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol), poli(vinilalcohol) de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituidos o sus derivados, especialmente poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli(etilenglicol) o sus derivados.

Los polfmeros de origen natural particulares incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucogeno o sus derivados. “Derivados” en este contexto pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo, grupos reactivos selectivos de tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar enlazado directamente o a traves de un segmento enlazador al polfmero. Se apreciara que el resto de cada grupo en algunas instancias formara parte del producto como el grupo enlazador entre el fragmento del anticuerpo y el polfmero.

El tamano del polfmero puede variar segun se desee, pero generalmente estara en un intervalo de peso molecular promedio de 500 Da a 50000 Da, preferentemente de 5000 Da a 40000 Da y mas preferentemente de 20000 Da a 40000 Da. El tamano del polfmero en particular puede seleccionarse sobre las bases del uso previsto del producto, por ejemplo, la capacidad de localizar ciertos tejidos tales como tumores o la vida media circulante extendida (para una revision vease Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). De esta forma, por ejemplo, cuando se preve que el producto deje la circulacion y penetre en el tejido, por ejemplo, para el uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso utilizar un polfmero de peso molecular pequeno, por ejemplo, con un peso molecular de aproximadamente 5000 Da. Para aplicaciones en donde el producto permanece en la circulacion, puede ser ventajoso utilizar un polfmero de peso molecular mas alto, por ejemplo, teniendo un peso molecular en el intervalo de 20000 Da a 40000 Da.

Los polfmeros particularmente preferidos incluyen un polfmero de polialquileno, tales como poli(etilenglicol) o, especialmente, un metoxipoli(etilenglicol) o uno de sus derivados, y especialmente, con un peso molecular en la escala de aproximadamente 15000 Da a aproximadamente 40000 Da.

Preferentemente, el anticuerpo, el derivado del anticuerpo o fragmento del anticuerpo de esta invencion incluye un anticuerpo o fragmento con una funcion efectora reducida, que se une a un polfmero de polialquileno, particularmente un poli(etilenglicol) (abreviado en el presente documento como PEG) o uno de sus derivados. En ciertas realizaciones, el anticuerpo, el derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de esta invencion es un fragmento de anticuerpo que es un fragmento Fab' o F(ab')2 o uno de sus derivados que se une a PEG, ya sea en la cadena pesada, en la cadena ligera o ambas. Este fragmento Fab' o F(ab')2 del mismo puede ser humano o humanizado.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion son anticuerpos que se modifican a traves de la union covalente de fracciones funcionales tales como polfmeros solubles en agua, tales como poli(etilenglicol), copolfmeros de poli(etilenglicol) y poli(propilenglicol, carboximetil celulosa, dextrano, poli(vinilalcohol), poli(vinilpirrolidona) o poli(prolina), todos los cuales se sabe que exhiben vidas medias sustancialmente mas largas en sangre tras inyeccion intravenosa que sus correspondientes protemas no modificadas. Vease, por ejemplo, Abuchowski et al., 1981. En: “Enzymes as Drugs”, Holcenberg et al., (ed.) 1981. Wiley-Inter science, New York, NY, 367-383 (1981); Anderson, W.F. 1992. Human Gene Therapy. Science 256:808-813; Newmark et al., 1982. J. Appl. Biochem. 4:185-189; Katre et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1487-1491.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invencion son anticuerpos unidos a fracciones funcionales tales como fracciones de poli(etilenglicol) (PEG). En una realizacion particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moleculas PEG pueden unirse a traves de cualquier grupo funcional de cadena lateral del aminoacido o aminoacido terminal localizado en el fragmento del anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Los aminoacidos pueden existir de manera natural en el fragmento de anticuerpo o pueden modificarse en el fragmento utilizando metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, el documento US 5.219.996; US 5.667.425; WO 98/25971). En otras realizaciones, el fragmento Fab de esta invencion se modifica a traves de la adicion en el extremo terminal C de su cadena pesada uno o mas aminoacidos para permitir la union de una fraccion funcional. Preferentemente, los aminoacidos adicionales forman una region bisagra modificada que contiene uno mas restos de cistema a los cuales puede unirse la fraccion funcional. Se pueden utilizar multiples sitios para unir dos o mas moleculas PEG.

En ciertos aspectos de esta invencion, las moleculas de PEG estan covalentemente enlazadas a traves de un grupo tiol de al menos un resto de cistema localizado en un fragmento de anticuerpo de esta invencion. Cada molecula de PEG unida al fragmento de anticuerpo modificado puede enlazarse covalentemente al atomo de azufre de un resto de cistema localizado en el fragmento. El enlace covalente generalmente sera un enlace de disulfuro, o, en particular, un enlace de azufre-carbono. Cuando se utiliza un grupo tiol como el punto de union pueden utilizarse fracciones funcionales apropiadamente activas como, por ejemplo, derivados selectivos de tiol como derivados de maleimidas y cistema. El PEG activado puede utilizarse como el material de partida en la preparacion de fragmentos de anticuerpo modificados con PEG como se describe anteriormente. El PEG activado puede ser cualquier PEG que contiene un grupo reactivo tiol tal como acido o ester a -halocarboxflico, por ejemplo, yodoacetamida, una imida, por ejemplo, maleimida, una vinilsulfona o un disulfuro. En ciertas realizaciones, un conjugado de anticuerpo anti-CD154 puede comprender dos moleculas de PEG con dos moleculas de maleimida. Los materiales de partida pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo de Nektar, formerly Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) o pueden prepararse de materiales de partida comercialmente disponibles utilizando procedimientos qmmicos convencionales. Las moleculas de PEG particulares incluyen 20K metoxi-PEG-amina (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater).

En una realizacion preferida, un anticuerpo de la invencion es un fragmento Fab modificado que esta PEGilado, es decir, tiene PEG (Poli(etilenglicol)) covalentemente unido al mismo, por ejemplo, de acuerdo con el metodo descrito en el documento EP 0948544 (vease tambien “Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, “Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC y “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545). En un ejemplo PEG se une a una cistema en la region de conexion. En otro ejemplo, un fragmento Fab modificado con PEG tiene un grupo de maleimida covalentemente enlazado a un solo grupo tiol en una region bisagra modificada. Los restos de lisina pueden enlazarse covalentemente al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina en el resto de lisina puede unirse un polfmero metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab puede por consiguiente ser de aproximadamente 40.000 Da.

En otra realizacion, la fraccion funcional es PEG y se une utilizando el metodo descrito en WO 98/25971 y WO 04/72116, a traves del cual un grupo lisil-maleimida se une al resto de cistema en el extremo terminal C de la cadena pesada, y cada grupo amino del resto de lisilo tiene covalentemente enlazado al mismo un resto metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al anticuerpo por consiguiente es de aproximadamente 40.000 Da.

En otra realizacion, la fraccion funcional es PEG y se une a un fragmento F(ab)2 utilizando los metodos descritos en WO 98/25971 y WO 04/72116, a traves del cual un grupo lisil-dimaleimida se une al resto de cistema en el extremo terminal C de cada cadena pesada Fab, y cada grupo amino del resto de lisilo tiene covalentemente enlazado al mismo un resto metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al anticuerpo F(ab)2 por consiguiente es de aproximadamente 40.000 Da.

En ciertas realizaciones de esta invencion, el anticuerpo de esta invencion es un fragmento de anticuerpo, que puede ser completamente humano o humanizado, y esta PEGilado, ya sea en la cadena pesada, la cadena ligera o ambas. En otras realizaciones, el fragmento de anticuerpo, puede ser completamente humano o humanizado, esta PEGilado en una o ambas cadenas pesadas, o en una o en ambas cadenas ligeras, o en ambas cadenas pesadas y ligeras.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 es un anticuerpo PEG enlazado (por ejemplo, un anticuerpo humano enlazado a PEG) en donde el PEG esta enlazado al anticuerpo en un resto de cistema o de lisina. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD154 PEGilado tiene un tamano hidrodinamico de al menos 24 kD. En otras realizaciones, el PEG puede variar en un tamano cualquiera de entre 20 a 60 kD (inclusive). En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-CD154 enlazado a PEG tiene un tamano hidrodinamico de al menos 200 kD. En las realizaciones de la presente invencion en donde el anticuerpo anti-CD154 esta enlazado a la fraccion PEG, el anticuerpo anti-CD154 PEGilado puede tener una vida in vivo aumentada con relacion a un anticuerpo anti-CD154 que carece de la fraccion PEG.

En ciertas realizaciones, la invencion proporciona una protema de union a CD154 que comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 13, en donde la protema esta PEGilada.

Otras fracciones funcionales que pueden ser utiles en mejoramiento de la integridad y la longevidad de los anticuerpos de la presente invencion in vivo incluye los polipeptidos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD154 o fragmentos de anticuerpo de la invencion pueden modificarse para incluir un polipeptido de albumina de suero humano (HSA). Un conjugado de anticuerpo puede exhibir una estabilizacion aumentada y una vida media en el suero aumentada comparada con un anticuerpo no conjugado o fragmento de union a antígeno. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD154 conjugado con HSA pueden exhibir una vida aumentada in vivo con relacion a un anticuerpo anti-CD154 no conjugado. La vida (vida media ta- o tp-) del anticuerpo conjugado con HSA puede aumentarse en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o mas. La vida media ta puede estar dentro del intervalo de 0,25 minutos a 12 horas, por ejemplo, mientras la vida media tp puede estar dentro de 12-48 horas, por ejemplo. La vida media ta o tp puede ser preferentemente de al menos 3 dfas, al menos 7 dfas, al menos 14 dfas, al menos 21 dfas, al menos 28 dfas, al menos 1 mes o mas.

En algunas realizaciones de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion son anticuerpos modificados con una fraccion funcional mediante el marcaje con un marcador detectable, por ejemplo, un isotopo radioactivo, enzima, colorante o biotina, u otro agente reactivo de afinidad.

En algunas realizaciones de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion son anticuerpos modificados con una fraccion funcional a traves de la cual se conjuga a un agente terapeutico, por ejemplo, un radio isotopo o radio nuclido (por ejemplo, 111In o 90Y), una fraccion de toxina (por ejemplo, toxoide de tetanos o ricina), un toxoide o un agente quimioterapeutico (documento U.S. 6.307.026).

En algunas realizaciones de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion son anticuerpos modificados al estar conjugados con un agente formador de imagenes. Los agentes formadores de imagenes pueden incluir, por ejemplo, una fraccion de marcaje (por ejemplo, biotina, fracciones fluorescentes, fracciones radioactivas, una histidina, o una etiqueta myc u otras etiquetas de peptido) para facilitar aislamiento o deteccion.

Los ejemplos adicionales de fracciones funcionales para la modificacion o conjugacion de anticuerpos anti-CD514, pueden incluir serotoxinas o agentes citotoxicos que incluyen cualquier agente que es perjudicial para las celulas (por ejemplo, las mata). Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinoides, espongiestatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorobucina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestorona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propanolol, y puromicina y analogos u homologos de estos.

Las fracciones funcionales utiles en la conjugacion incluyen, pero no se limitan a, anti-folatos (por ejemplo, aminopterina y metotrexato), antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas o diocarmicinas, CC-1065, enedieyenos, neocarzinostatina), y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Vease Garnett, 2001, Advanced drug Delivery Reviews 53:171-216 para detalles adicionales.

Otras fracciones funcionales pueden incluir radionuclidos quelados tales como 131I, 111In y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252, Iridio192 y Tungsteno188/Renio188, 211astatina; o farmacos tales como pero no limitandose a, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, toxoides y suramina.

Las fracciones funcionales adicionales incluyen protemas, peptidos y enzimas. Las enzimas de interes incluyen, pero no se limitan a, enzimas proteolfticas, hidrolasa, liasas, isomerasas, transferasas. Las protemas, los polipeptidos y los peptidos de interes incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulina, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, o una toxina difterica, un maitanisinoide (por ejemplo, pero no limitandose a, DMI), una protema tal como insulina, factor de necrosis tumoral, a -interferon, p-interferon, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaqueta o activador de plasminogeno de tejido, un agente trombotico o un agente antiangiogenico, por ejemplo angioestatina o endoestatina, angiogenina, gelonina, dolestaninas, aglutinantes de ranura menores, mostaza de bis-ido-fenol, o, un modificador de la respuesta biologica tal como linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de macrofagos granulodticos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otros factores de crecimiento.

Otras fracciones funcionales pueden incluir sustancias detectables utiles, por ejemplo, en el diagnostico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nuclidos radioactivos, metales emisores de positron (para utilizarse en la tomograffa de emision de positron), e iones metalicos paramagneticos no radioactivos. Vease generalmente el documento US 4.741.900 para iones metalicos que pueden conjugarse con los anticuerpos para utilizase como diagnostico. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los grupos prosteticos adecuados incluyen estreptavidina, avidita y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, diclorotriazinilamina de fluorescema, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina, y aecuorina; y los nuclidos radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In y 99Tc.

Acidos Nucleicos

En ciertos aspectos, la presente invencion se refiere a acidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion.

En consecuencia, en ciertas realizaciones la presente divulgacion se refiere a una molecula de ADN aislada, recombinante y/o sintetica que comprende una o mas secuencia o secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 73.

En otro aspecto, la divulgacion representa un acido nucleico aislado que comprende una o mas secuencia o secuencias que codifican un polipeptido que incluye una secuencia de al menos un 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 % identica a la secuencia de una secuencia del domino variable de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 60 o una secuencia que hibrida (por ejemplo, en condiciones rigurosas) a un acido nucleico que codifica la secuencia de un dominio variable de Se Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 60.

Los acidos nucleicos de la invencion pueden ademas incluir secuencias reguladoras (por ejemplo, una secuencia promotora, una region 5' sin traducir, y una region 3' sin traducir) y/o secuencias de vector. Por ejemplo, el acido nucleico constituye un vector. En realizaciones aun mas adicionales, la invencion se refiere a una celula hospedadora que comprende el vector. La celula hospedadora puede producir anticuerpo de tal forma que el anticuerpo exhibe una glucosilacion reducida o nada de glucosilacion (por ejemplo, si esta presente una region Fc).

La presente divulgacion tambien se refiere a variantes de secuencia de acido nucleico descritas anteriormente. Por ejemplo, la presente invencion incluye secuencias de acido nucleico que son de aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 %, 99,5 %, 99,9 % o 100 % identicas a cualquiera de las secuencias provistas en el presente documento, incluyendo sus fragmentos y complementos. La presente invencion tambien incluye acidos nucleicos que vanan de las secuencias espedficamente provistas en el presente documento debido a la degeneracion del codigo genetico.

Ademas, la presente invencion incluye secuencias que hibridan espedficamente con cualquiera de los acidos nucleicos provistos en el presente documento. La frase “hibrida espedficamente” se refiere a la capacidad de la secuencia de acido nucleico para hibridar con al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 100 nucleotidos consecutivos de una secuencia provista en el presente documento, o una secuencia complementaria de la misma, de tal forma que tiene menos del 15 %, preferentemente menos del 10 %, y mas preferentemente menos del 5 % de hibridacion de fondo para el acido nucleico de control (por ejemplo, ADN no espedfico o ADN diferente de la secuencia de anticuerpo espedfica provista en el presente documento). Puede usarse una diversidad de condiciones de hibridacion para detectar una hibridacion espedfica, y la severidad se determina principalmente por la etapa de lavado del ensayo de hibridacion. Generalmente las altas temperaturas y las bajas concentraciones de sal dan una alta severidad, mientras las bajas temperaturas y las altas concentraciones de sal dan una severidad baja. La hibridacion de severidad baja se logra lavando en, por ejemplo aproximadamente 2,0 x SSC a 50 °C, y la alta severidad se logra con aproximadamente 0,2 x SSC a 50 °C.

Los acidos nucleicos que codifican las protemas de union a CD154 de la presente invencion pueden comprender una secuencia lfder o de senal. La secuencia lfder y de senal pueden variar y pueden sustituirse con una secuencia lfder alternativa, y se entiende que, en ciertas realizaciones, las protemas CD154 de la presente invencion comprenden secuencias sin la secuencia lfder. Puede utilizarse cualquier secuencia lfder o de senal alternativa adecuada.

Celulas hospedadoras

La presente divulgacion se refiere a celulas hospedadoras modificadas geneticamente para expresar cualquiera de las moleculas de ADN provistas en la Figuras 2-8, 10, 11 y 13-16, incluyendo las variantes de secuencia de las mismas.

Tambien se proporcionan las celulas hospedadoras que expresan los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion. Ya sea una protema de union o un anticuerpo, puede comprender solamente una cadena, en cuyo caso, solamente la secuencia de ADN que codifica la cadena de polipeptido necesita utilizarse para transfectar la celula. Para la produccion de anticuerpos que comprenden dos cadenas, la lmea celular puede transfectarse con dos vectores. Alternativamente, cuando es apropiado, un solo vector puede codificar ambas secuencias de cadena, por ejemplo, cadena ligera y pesada de un anticuerpo anti-CD154, y las variaciones dependen de la estructura del anticuerpo en particular a ser expresado. La celula hospedadora puede ser, por ejemplo, celulas procariotas tales como E. coli, u otras celulas microbianas, o celulas eucariotas que incluyen pero no se limitan a celulas de mairnfero tales como de humano, raton, mono, conejo, cabra, hamster o celulas de rata, celulas de insecto, celulas aviares, celulas vegetales y celulas eucariotas inferiores tales como las celulas fungicas (vease a continuacion). Se entiende que la maquinaria de la celula hospedadora es responsable de la glucosilacion de las protemas recombinantemente expresadas y de esta formas los patrones de glucosilacion particulares pueden seleccionarse para ademas alterar la funcion efectora de los anticuerpos de la invencion.

En algunas realizaciones de esta invencion, las celulas hospedadoras utiles para poner en practica la invencion pueden ser, por ejemplo, (1) celulas bacterianas tales como celulas de E. coli, Caulobacter crescentus, especies de Streptococci, Staphylococci, Streptomyces y Bacillus subtilis, y Salmonella typhimurium; (2) celulas fungicas y celulas de Aspergillus, celulas de levadura, tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica, otras especies de Pichia, K. lactis; (3) lmeas celulares de insecto, tales como Spodoptera frugiperda - por ejemplo, las lmeas celulares Sf9 y Sf21, y las celulas expresSF™ (Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA) - celulas S2 de Drosophila, y celulas de Trichoplusia ni High Five® (Invitrogen, Carlsbad, c A, USA); (4) celulas de marnffero o (5) celulas vegetales.

Por consiguiente, las protemas de union a CD154, por ejemplo anticuerpos anti-CD154 de esta invencion pueden producirse en cualquier celula hospedadora procariota o eucariota disponible capaz de ser modificada geneticamente para expresar secuencias de acido nucleico exogenas. Las celulas hospedadoras eucariotas inferiores que se pueden utilizar para producir los anticuerpos anti-CD154 de la presente invencion incluyen las celulas descritas en la tecnica (Vease, por ejemplo, los documentos WO 02/00879, WO 03/056914, WO 04/074498, WO 04/074499, Choi et al., 2003, PNAS, 100: 5022-5027; Hamilton et al., 2003, Nature, 301:1244-1246 y Bobrowicz et al., 2004, Glycobiology, 14: 757­ 766).

Las celulas de mairnfero tfpicas incluyen las celulas COS1 y COS7, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas de mieloma NS0, celulas NlH 3T3, celulas 293, celulas HEPG2, celulas HeLa, C127, 3T3, BHK, celulas de melanoma de Bowes, celulas L, MDCK, HEK293, W138, lmeas celulares ES murinas (por ejemplo, de las cepas 129/SV, C57/BL6, DBA-1, 129/SVJ), K562, celulas Jurkat, y BW5147. La invencion proporciona de esta forma celulas que expresan los anticuerpos de la presente invencion, incluyendo pero no limitandose a celulas de hibridoma, celulas B, celulas de plasma, asf como celulas huesped de marnffero y humanas modificadas por recombinacion para expresar los anticuerpos de la presente invencion (por ejemplo, celulas madre embrionicas adultas). Otras lmeas celulares de mamnfero utiles son bien conocidas y facilmente disponibles de la Coleccion de Cultivo de Tipo Americano (“ATCC”) (Manassas, VA, USA) y el National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Human Genetic Cell Repository at the Coriell Cell Repositories (Camden, NJ, USA). Estos tipos de celula solamente son representativos, y esta lista no pretende ser una lista exhaustiva.

Entre otras consideraciones, alguna de las cuales se describen anteriormente, una celula hospedadora puede seleccionarse por su capacidad para procesar el anticuerpo anti-CD154 expresado en una forma deseada. Ademas de la glucosilacion modificada y la aglucosilacion, las modificaciones post-desplazamiento del polipeptido incluyen, pero no se limitan a, acetilacion, carboxilacion, carboximetilacion, fosforilacion, lipidacion, y acilacion.

En otra realizacion de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion se preparan a traves de la traduccion sin celulas o se sintetizan in Vitro. Los genes que codifican estas protemas pueden sintetizarse in vitro.

En otra realizacion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion se producen en bioreactores que contienen las celulas que expresan el anticuerpo, con el fin de facilitar la produccion a gran escala.

En otra realizacion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion se producen en marnfferos geneticamente modificados o transgenicos (por ejemplo, cabras, vacas, ovejas) que expresan el anticuerpo en la leche, con el fin de facilitar la produccion a gran escala de los anticuerpos anti-CD154 (US 5.827.690; Pollock et al, 1999. J. Immunol. Meth. 231 (1-2):147-57).

Metodos Terapeuticos

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir una respuesta inmune en un sujeto. El anticuerpo de esta invencion, o la composicion farmaceutica de la invencion, se administra al sujeto en una cantidad inhibidora eficaz.

En ciertas realizaciones, una “cantidad inhibidora eficaz” de un anticuerpo anti-CD154, o composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es cualquier cantidad que es eficaz para inhibir la interaccion CD154-CD40 en el sujeto al cual se administra. Los metodos para determinar una “cantidad inhibidora” son bien conocidos por los expertos en la materia y dependen de factores que incluyen, pero no se limitan a: el tipo de sujeto involucrado, el tamano y la edad del sujeto y las propiedades farmacocineticas del agente terapeutico particular distribuido.

En otra realizacion espedfica de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir la respuesta inmune mediante la inhibicion de la interaccion CD154-CD40.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154, de esta invencion o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir la inflamacion. Para los propositos de esta invencion, las respuestas inflamatorias se caracterizan por enrojecimiento, hinchazon, calor y dolor, como consecuencias de la dilatacion capilar con edema y migracion de leucocitos fagodticos. Algunos ejemplos de respuesta inflamatorias incluyen: artritis, dermatitis de contacto, smdrome tnper-IgE, enfermedad inflamatoria del intestino, asma alergica, y enfermedad inflamatoria idiopatica. La enfermedad inflamatoria idiopatica incluye, por ejemplo, psoriasis y lupus (por ejemplo, lupus sistemico eritematoso (SLE), lupus eritematoso inducido por farmaco, y lupus nefritis). Vease, por ejemplo, Gallin 1989. Fundamental Immunology, Capttulo 26, Raven Press, 2o. Ed., pp. 721-733, New York. Esta divulgacion proporciona un metodo para tratar o prevenir un smtoma de lupus sistemico eritematoso (SLE) en un individuo, el metodo comprende administrar una protema de union a CD154 monovalente, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD154 monovalente a un individuo en una cantidad efectiva para tratar o prevenir un smtoma de SLE.

Algunos ejemplos de artritis incluyen: artritis reumatoide, artritis inflamatoria no reumatoide, artritis asociada a la enfermedad de Lyme y osteoartritis inflamatoria. Algunos ejemplos de enfermedad inflamatoria e idiopatica incluyen: psoriasis y lupus sistemico.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir el rechazo por el sujeto de un organo trasplantado.

En una realizacion mas espedfica de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir el rechazo por el sujeto de un corazon, rinon, hngado, piel, celulas de islote pancreaticas o medula osea trasplantados.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir la enfermedad de injerto contra hospedador en un sujeto.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir respuestas alergicas, en un sujeto, por ejemplo, fiebre del heno o una alergia a penicilina u otros farmacos.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir la respuesta autoinmune en sujetos que sufren de la enfermedad autoinmune. En algunas realizaciones, la respuesta autoinmune esta asociada a o deriva de una afeccion seleccionada del grupo que consiste en: artritis reumatoide, miastemia grave, lupus sistemico eritematoso, enfermedad de Graves, purpura idiopatica, trombocitopenia, anemia hemolftica, diabetes mellitus, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, esclerosis multiple, psoriasis, enfermedades autoinmunes inducidas por farmaco, o lupus inducido por farmaco. En ciertas realizaciones, la respuesta autoinmune se asocia con o deriva de lupus sistemico eritematoso.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir una respuesta autoinmune en un sujeto que sufre de una respuesta autoinmune que deriva de una enfermedad infecciosa.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir una respuesta autoinmune en un sujeto que sufre de una respuesta autoinmune que se deriva del smdrome de Reiter, espondiloartritis, enfermedad de Lyme, infeccion VIH, sffilis, o tuberculosis.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir fibrosis en un sujeto.

Algunos ejemplos de fibrosis incluyen: fibrosis pulmonar o enfermedad fibrotica. Algunos ejemplos de fibrosis pulmonar incluyen: fibrosis pulmonar secundaria al smdrome de tension respiratoria en adultos, fibrosis pulmonar inducida por farmacos, fibrosis pulmonar idiopatica, o neumonitis de hipersensibilidad. Algunos ejemplos de enfermedad fibrotica incluyen: hepatitis C; hepatitis B; cirrosis; cirrosis del Imgado secundaria a un insulto toxico; cirrosis del Imgado secundario a farmacos; cirrosis del Imgado secundaria una infeccion viral; y cirrosis del Imgado secundaria a una enfermedad autoinmune.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir la enfermedad gastrointestinal. Algunos ejemplos de enfermedad gastrointestinal incluyen: desmotilidad esofagica, enfermedad inflamatoria del intestino (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), gastritis, colitis colagenosa (incluyendo colitis linfocftica y colitis microscopica), enfermedad celiaca (tambien denominada enteropatfa de gluten, enfermedad celiaca de bebedero, o intolerancia al gluten) y escleroderma.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir una enfermedad vascular. Algunos ejemplos de enfermedades vasculares incluyen: ateroesclerosis, enfermedad de arteria renal, linfoma, trastornos isquemicos, y dano por reperfusion. Tambien se incluyen enfermedades del complejo vascular/inmunitario de colageno tales como lupus sistemico eritematoso o crioglobulinemia.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir la proliferacion de celulas de tumor de celula T en un sujeto que sufre de un cancer de celulas T, por ejemplo, leucemia o linfoma de celulas T. Dicho anticuerpo anti-CD154, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, puede administrarse a un sujeto en una cantidad eficaz para inhibir la proliferacion de las celulas T tumorales en ese sujeto.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de inhibir la infeccion vmca de las celulas T de un sujeto a traves del virus linfotropico de la celula T humana de tipo 1 (HTLV I). Dicho anticuerpo anti-CD154 o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo puede administrate al sujeto en una cantidad efectiva para inhibir la infeccion vmca.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de tomar imagenes de las celulas tumorales o de las celulas neoplasicas en un sujeto que expresa una protema CD154 a la cual el anticuerpo de esta invencion se une espedficamente. Un metodo para formar imagenes de celulas tumorales o celulas neoplasicas en sujeto que comprende las etapas de: administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-CDl54 de esta invencion, o una composicion que lo comprende, bajo condiciones que permiten la formacion de un complejo entre el anticuerpo y una protema en la superficie de las celulas tumorales o celulas neoplasicas; y la formacion de imagenes de cualquier complejo de anticuerpo/protema formado, por lo tanto formando imagenes de cualquier celula tumoral o celula neoplasica en el sujeto.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de detectar la presencia de celulas tumorales o celulas neoplasicas en un sujeto que expresa la protema CD154 a la cual un anticuerpo de la invencion espedficamente se une. Un metodo para detectar la presencia de celulas tumorales o celulas neoplasicas en un sujeto comprende las etapas de: administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, o una composicion farmaceutica que lo comprende, bajo condiciones que permite que la formacion de un complejo entre el anticuerpo y una protema; aclarar cualquier agente formador de imagenes no unido del sujeto; y detectar la presencia de cualquier complejo de anticuerpo/protema formado, la presencia del complejo indica la presencia de celulas tumorales o celulas neoplasicas en el sujeto.

Composiciones Farmaceuticas

Esta invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo anti-CD154, como se describe en esta invencion.

En una realizacion de la invencion, la composicion farmaceutica comprende al menos un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion.

En una realizacion de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de aglucosilo (u otro anticuerpo anti-CD154 con una funcion efectora reducida) de la invencion, o composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de unirse a un antigeno CD154 (por ejemplo, el antigeno CD154 que se une espedficamente a traves del aglucosilo hu5c8 producido por la lmea celular que tiene el N.° de Acceso ATCC PTA-4931), y en donde el anticuerpo anti-CD154 de aglucosilo se caracteriza por tener una mutacion de N298Q (N298 utilizando la enumeracion de Kabat EU) y que ademas exhibe una funcion efectora reducida como se describe en cualquier lugar en el presente documento.

En ciertas realizaciones de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de aglucosilo (u otro anticuerpo anti-CD154 con una funcion efectora reducida), o composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, no se une a un receptor efector. En una realizacion mas espedfica, un anticuerpo anti-CD154 de aglucosilo, o composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, es capaz de unirse a la protema CD154 que espedficamente se une a traves del aglucosilo hu5c8 producido por la lmea celular que tiene el N.° de Acceso ATCC PTA-4931, y en donde el anticuerpo anti-CD154 de aglucosilo o composicion farmaceutica no se une a un receptor efector.

En una realizacion espedfica de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de aglucosilo (u otro anticuerpo anti-CD154 o protema de union a CD154 con una funcion efectora reducida), o composicion farmaceutica que comprende al anticuerpo, no causa trombosis, incluyendo eventos tromboembolicos. En una realizacion mas espedfica de esta invencion, un anticuerpo anti-CD154 de aglucosilo o composicion farmaceutica que comprende al anticuerpo es capaz de unirse a la protema CD154 que espedficamente se une a traves del aglucosilo hu5c8 producido por la lmea celular que tiene el N.° de Acceso ATCC PTA-4931, en donde el anticuerpo anti-CD154 de aglucosilo o la composicion farmaceutica no causa trombosis.

En otra realizacion de esta invencion, las composiciones farmaceuticas ademas pueden comprender cualquiera o mas de un veldculo, un adyuvante, un vehmulo de distribucion, un tampon, y/o un estabilizante farmaceuticamente aceptable. Las tecnicas ejemplares para la formulacion de administracion de los anticuerpos de la presente invencion pueden encontrarse, por ejemplo, en “Remington's Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, ultima edicion.

En una realizacion mas particular de esta invencion, el vehmulo farmaceuticamente aceptable es solucion salina tamponada con fosfato, solucion salina fisiologica, agua, formulaciones de citrato/sacarosa/Tween y emulsiones, por ejemplo, emulsiones de aceite/agua.

En una realizacion de esta invencion, la composicion farmaceutica puede distribuirse en un dispositivo de microencapsulacion para asf reducir o evitar una respuesta inmune del hospedador contra la composicion. Los agentes de aglutinamiento, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de esta invencion, tambien pueden distribuirse microencapsulados en una membrana, tales como por ejemplo, un liposoma u otro vehmulo de distribucion encapsulado, o inmunoprotegido.

En una realizacion de esta invencion, la composicion farmaceutica puede estar en forma de una preparacion inyectable esteril, por ejemplo, una suspension acuosa u oleaginosa inyectable esteril. Esta suspension puede formularse de acuerdo con las tecnicas conocidas en la tecnica utilizando agentes de dispersion, humectacion, y suspension adecuados.

En una realizacion de esta invencion, la composicion farmaceutica puede distribuirse oral, topica o intravenosamente. Cuando se administra sistemicamente, la composicion terapeutica debera ser esteril, sustancialmente sin pirogeno y en una solucion parenteralmente aceptable con respecto al pH, isotonicidad y estabilidad. Por ejemplo, una preparacion farmaceutica esta sustancialmente libre de materiales pirogenicos para asf ser un adecuado para la administracion como un terapeutico humano. Estas condiciones son conocidas por los expertos en la materia.

En una realizacion mas espedfica de esta invencion, para administracion oral, la composicion farmaceutica se formula en una capsula, comprimido, suspension o solucion acuosa adecuada. Las formulaciones solidas de las composiciones para administracion oral pueden contener vehmulos o excipientes adecuados, tales como almidon de mafz, gelatina, lactosa, goma arabiga, sacarosa, celulosa microcristalina, caolm, manitol, fosfato dicalcico, carbonato de calcio, cloruro de sodio, o acido algmico. Los disgregantes que pueden utilizarse incluyen, sin limitacion, celulosa microcristalina, almidon de mafz, glicolato de almidon de sodio, y acido algmico. Los aglutinantes de comprimidos que pueden utilizarse incluyen goma arabiga, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica, polivinilpirrolidona (Povidone™), hidroxipropil metilcelulosa, sacarosa, almidon, y etilcelulosa. Los lubricantes que pueden utilizarse incluyen estearatos de magnesio, acido estearico, fluido de silicio, talco, ceras, aceites y sflice coloidal.

En una realizacion mas espedfica de esta invencion, para aplicaciones topicas, las composiciones farmaceuticas pueden formularse en un unguento adecuado. Algunos ejemplos de formulaciones de una composicion para aplicacion topica incluyen: gotas, tintes, lociones, cremas, soluciones y unguentos que contienen el principio activo y soportes y vehmulos variados.

En una realizacion de esta invencion, una formulacion de unguento semisolida topica tfpicamente comprende una concentracion del principio activo de aproximadamente 1 a 20 %, por ejemplo, de 5 a 10 %, en un vehmulo, tal como una base de crema farmaceutica.

En una realizacion de esta invencion, las composiciones farmaceuticas para inhalacion y composiciones transdermicas tambien pueden prepararse facilmente. La composicion terapeutica puede administrarse a traves de la nariz o los pulmones, por ejemplo, como un lfquido o aerosol en polvo (liofilizado).

En una realizacion de esta invencion las formulaciones lfquidas de una composicion farmaceutica para administracion oral preparadas en agua u otros vehmulos acuosos pueden contener varios agentes de suspension tales como metilcelulosa, alginatos, tragacanto, pectina, quelgina, carragenina, goma arabiga, polivinilpirrolidona, y alcohol polivimlico. Las formulaciones lfquidas de las composiciones farmaceuticas de esta invencion tambien incluyen soluciones, emulsiones, jarabes y elixires que contienen, junto con el compuesto o compuestos activos, agentes de humectacion, edulcorantes, y agentes de coloracion y saborizantes. Varias formulaciones lfquidas y en polvo de las composiciones farmaceuticas pueden prepararse a traves de metodos convencionales para la inhalacion en los pulmones del mairnfero a ser tratado.

En una realizacion de esta invencion, las formulaciones lfquidas de una composicion farmaceutica para inyeccion pueden comprender varios vehmulos tales como aceites vegetales, dimetilacetamida, dimetilformamida, etil lactato, etil carbonato, isopropil miristato, etano, polioles, es decir, glicerol, propilenglicol, polietileno glicol lfquido y similares. En algunas realizaciones, la composicion incluye un vehmulo de citrato/sacarosa/Tween. Para inyecciones intravenosas, las versiones solubles en agua de las composiciones pueden administrarse a traves de un metodo por goteo, a traves del cual se infunde una formulacion farmaceutica que contiene el antígeno de antifungico y un excipiente fisiologicamente aceptable. Los excipientes fisiologicamente aceptables pueden incluir por ejemplo, 5 % de dextrosa, 0,9 % de solucion salina, solucion de Ringer u otros excipientes adecuados. Una forma insoluble adecuada de las composiciones puede prepararse y administrarse como una suspension en una base acuosa o una base oleosa farmaceuticamente aceptable, tal como ester de un acido graso de cadena larga, por ejemplo, etil oleato.

En una realizacion de esta invencion, la composicion farmaceutica comprende de aproximadamente 0,1 a 90 % en peso (tal como de 1 a 20 %, o de 1 a 10 %) de un anticuerpo anti-CD154 de esta invencion, en un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion de esta invencion, el porcentaje optimo del anticuerpo anti-CD154 de esta invencion en cada composicion farmaceutica vana de acuerdo con la formulacion misma y el efecto terapeutico deseado en las patologfas espedficas y regfmenes terapeuticos correlacionados. La formulacion farmaceutica esta bien establecida en la tecnica. Los metodos convencionales, conocidos por los expertos en la tecnica de la medicina, pueden utilizarse para administrar la composicion farmaceutica al sujeto.

Por consiguiente, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se refieren a formulaciones de liberacion extendida. Por liberacion extendida, liberacion controlada o liberacion lenta se refiere a las formulaciones de farmacos que liberan el farmaco activo, tal como un farmaco de polipeptido o anticuerpo, durante un periodo de tiempo despues de la administracion a un sujeto. La liberacion extendida de los farmacos de polipeptido, que pueden ocurrir a traves de un intervalo de tiempos deseados (por ejemplo, minutos, horas, d^as, semanas o mas, dependiendo de la formulacion de farmaco) difiere de formulaciones estandar en donde sustancialmente la unidad de dosificacion completa esta disponible para absorcion o distribucion inmediata a traves de la corriente sangumea. Las formulaciones de liberacion extendida pueden, en ciertas realizaciones, resultar en un nivel del farmaco circulante de una administracion individual que es sostenida, por ejemplo, por 8 horas o mas, 12 horas o mas, 24 horas o mas, 36 horas 0 mas, 48 horas o mas, 60 horas o mas, 72 horas o mas, 84 horas o mas, 96 horas o mas, o aun por ejemplo, durante 1 semana o 2 semanas o mas, por ejemplo 1 mes o mas. Las composiciones de liberacion extendida pueden comprender un anticuerpo anti-CD154 monovalente de la presente invencion. En realizaciones adicionales, el anticuerpo monovalente es un anticuerpo humanizado o completamente humano. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-CD154, el anticuerpo anti-CD154 es un anticuerpo con una funcion efectora reducida como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones de esta invencion, la composicion farmaceutica ademas comprende un compuesto inmunosupresor o inmunomodulador. Por ejemplo, un compuesto inmunosupresor o inmunomodulador puede ser uno de los siguientes: un agente que interrumpe la senalizacion coestimuladora de la celula T a traves de CD28; un agente que interrumpe la senalizacion de la calcineurina, un corticoesteroide, un agente antiproliferativo, y un anticuerpo que espedficamente se une a una protema expresada en la superficie de las celulas inmunes, incluyendo pero no limitandose a CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 y RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTp, y VLA-4.

En algunas realizaciones de esta invencion, el compuesto inmunosupresor o inmunomodulador es tacrolimus, sirolimus, microfenolato mofetilo o su forma activa acido micofenolico, mizorubina, desoxiespergualina, brequinar sodio, leflunomida, rapamicina o azaspirano.

En otras realizaciones de esta invencion, los anticuerpos de esta invencion o composiciones farmaceuticas que los comprenden pueden incluirse en un contenedor, paquete o dispensador solo o como parte de un kit con etiquetas e instrucciones para administracion.

Rutas de Administracion y Distribucion

Los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse a un sujeto en cualquier forma que sea medicamente aceptable. Para los propositos de esta invencion “administracion” significa cualquiera de los metodos estandar de administrar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o composicion farmaceutica conocida por los expertos en la materia, y no debera limitarse a los ejemplos provistos en el presente documento.

En algunas realizaciones de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse a un sujeto a traves de inyeccion intravenosa, subcutanea, intraperitoneal, intramuscular, intramedular, intraventricular, intraepidural, intraarterial, intravascular, intra-articular, intra-sinobial, intrasternal, intratecal, intrahepatica, intraespinal, intratumoral, intracraneal; a travé dse rutas de administracion enteral, intrapulmonar, transmucosal, intrauterina o sublingual, o localmente, por ejemplo, en sitios de inflamacion o crecimiento de tumor.

En algunas realizaciones de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse a un sujeto oral o nasalmente, o a traves de inhalacion, ruta oftalmica, rectal o topica.

En una realizacion mas espedfica, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse a un sujeto oralmente en la forma de capsulas, comprimidos, suspensiones acuosas o soluciones.

En una realizacion mas espedfica, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse a un sujeto topicamente a traves de la aplicacion de una crema, unguento o similar.

En otras realizaciones de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion tambien pueden administrarse a travé dse inhalacion a travé dsel uso de un nebulizador, un inhalador de polvo seco o un inhalador con dosis medida.

En realizaciones adicionales de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse a un sujeto a traves de administracion de liberacion sostenida, a traves de medios como inyecciones de deposito de implantes erosionables directamente aplicados durante cirugfa o traves de implante de una bomba de infusion o un implante de liberacion sostenida biocompatible en el sujeto.

En una realizacion mas espedfica, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse a un sujeto a traves de rutas de deposito inyectables de administracion, tales como a traves de uso de materiales y metodos de deposito de 1, 3, o 6 meses inyectables o biodegradables.

En una realizacion mas espedfica, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse a un sujeto mediante la aplicacion en la piel del sujeto de un parche transdermico que contiene el anticuerpo, derivado de anticuerpo y composicion farmaceutica, y dejar el parche en contacto con la piel del sujeto, generalmente de 1 a 5 horas por parche.

En otras realizaciones de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse a un sujeto en cualquier dosis por peso corporal y cualquier frecuencia de dosificacion que sea medicamente aceptable. Las dosis aceptables incluyen un intervalo de entre aproximadamente 0,01 y 200 mg/kg del peso corporal del sujeto.

En cualquiera de los metodos para utilizar los anticuerpos o composiciones farmaceuticas de esta invencion, los anticuerpos o composiciones farmaceuticas pueden administrarse a un sujeto en una sola dosis o multiples dosis diariamente, cada 2, 3, 4, 5 o 6 dfas, semanal, mensualmente, o cualquier fraccion o multiplo de estos, y ademas puede administrarse a un sujeto repetidamente a intervalos en la escala de cada dfa a cada mes alterno, como determine el medico experimentado.

En cualquiera de los metodos para utilizar los anticuerpos o composiciones farmaceuticas de esta invencion, las protemas de union, anticuerpos, o composiciones farmaceuticas que los comprenden pueden administrarse a un sujeto que necesite los mismos a intervalos mientras sea un penodo tiempo medicamente indicado, en la escala de dfas o semanas a la vida del sujeto. En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse a un sujeto repetidamente a intervalos en la escala de cada dfa a cada mes alterno.

En una realizacion de esta invencion, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse en dosis multiples por dfa, si se desea, para lograr la dosis diaria deseada total. La eficacia del metodo de tratamiento puede evaluarse monitorizando al sujeto para signos conocidos o smtomas de un trastorno.

Para todas las realizaciones de esta invencion, la dosificacion y la velocidad de la dosis de los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion efectivas para producir los efectos deseados dependeran de una diversidad de factores, tales como la naturaleza de la enfermedad a ser tratada, el tamano y la edad del sujeto, la diana del tratamiento, la composicion farmaceutica espedfica utilizada, los farmacocineticos del agente activo, y el juicio del medico que trata al sujeto.

Por consiguiente, los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion, y las composiciones farmaceuticas de esta invencion, se administraran en una cantidad eficaz para lograr su proposito previsto. Una cantidad terapeuticamente eficaz puede referirse a una cantidad del anticuerpo efectiva para prevenir, aliviar o mitigar los smtomas de la enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se esta tratando. Una cantidad terapeuticamente efectiva puede lograrse alterando la dosis y el programa de dosificacion de la administracion de los anticuerpos del sujeto.

Los anticuerpos anti-CD154 de esta invencion y las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden administrarse como una sola dosificacion para ciertas indicaciones, tales como prevenir la respuesta inmune a un antígeno al cual el sujeto esta expuesto durante un tiempo breve, tal como un antígeno exogeno administrado en un solo dfa de tratamiento. Los ejemplos de dicha terapia incluinan la co-administracion del fragmento de anticuerpo de la invencion junto con un agente terapeutico, por ejemplo, un farmaceutico antigenico, un alergeno o un producto sangumeo, o un vector de terapia genica. En las indicaciones en donde el antígeno esta cronicamente presente, tal como el control de la reaccion inmune al tejido transplantado o farmaceuticos antigenicos cronicamente administrados, los fragmentos de anticuerpo y las composiciones farmaceuticas de la invencion se administran a intervalos durante el tiempo que el medico indique, en la escala de dfas a semanas a la vida del sujeto.

En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los anticuerpos o composiciones farmaceuticas pueden administrarse a un sujeto con un segundo agente. En ciertas realizaciones, el agente es un agente terapeutico, tal como, por ejemplo, un agente inmunoregulador o inmunosupresor. Los agentes inmunomoduladores o inmunosupresores puede cualquiera de los siguientes:

(a) un agente que interrumpe la senalizacion coestimuladora de la celula T a traves de CD28;

(b) un agente que interrumpe la senalizacion de calcineurina,

(c) un corticosteroide,

(d) un agente anti-proliferativo; y

(e) un anticuerpo que se une espedficamente una protema expresada en la superficie de las celulas inmunes, incluyendo pero no limitandose a CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 y RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTp, y VLA-4. El compuesto inmunosupresor e inmunomodulador puede ser, por ejemplo, tacrolimo, sirolimo, micofenolato de mofetilo, mizorubina, desoxiespergualina, brequinar sodio, leflunomida, rapamicina o azaspirano. El anticuerpo y el segundo agente pueden administrarse simultanea o secuencialmente.

En algunos casos, puede ser ventajoso administrar uno o mas acidos nucleicos de la invencion a un sujeto que los necesite. Los metodos terapeutico y de diagnostico de la invencion que comprenden la etapa de administrar al menos un acido nucleico de la invencion de acuerdo con los metodos bien conocidos se incluyen en el alcance de la presente invencion.

En una realizacion de esta invencion, el sujeto o sujetos que pueden tratarse a traves de los metodos antes descritos es un animal. Preferentemente el animal es un mairnfero. Los ejemplos de mairnferos que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a humanos, primates no humanos, roedores (incluyendo ratas, ratones, hamster y conejillos de indias) vacas, caballos, ovejas, cabras, cerdos, perros y gatos. Preferentemente, el mairnfero es un humano.

Esta invencion puede entenderse mejor con base en los ejemplos siguientes. Sin embargo, un experto en la materia apreciara facilmente que los metodos espedficos y los resultados explicados son meramente ilustrativos de la invencion como se describe en el presente documento.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos ilustran los metodos y productos de la presente invencion.

EJEMPLO 1: GENERACION DE ANTICUERPOS ANTI-HUMANOS-CD154 POR SLAM

El Metodo de Anticuerpo de Linfocito Seleccionado (SLAM, por sus siglas en ingles) (Babcook et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci, 93, 7843-7848; WO 92/02551; de Wildt et al., 1997, J. Immunol. Methods, 207:61-67 y Lagerkvist, et al., 1995, BioTechniques 18:862- 869) se utilizo para identificar y aislar celulas que producen anticuerpos de alta afinidad generados durante respuestas inmunes in vivo a ser aislados de cualquier especie. El anticuerpo individual aislado que produce celulas despues se expande clonicamente seguido por filtracion para esos clones que producen anticuerpos anti-CD154 seguido por la posterior identificacion de la secuencia de sus genes de cadena pesada (Vh) y ligera (Vl) variables. Un metodo de filtracion particular se detalla en el documento WO 04/051268. De esta forma se aislaron las celulas B que son positivas para anticuerpos para CD154 humano.

Varios anticuerpos CD154 anti-humanos de rata se identificaron y se aislaron utilizando la tecnologfa SLAM (Figura 12). Uno de estos anticuerpos, CA081 00342 (el "anticuerpo 342"), se humanizo como se describe en el siguiente ejemplo. Su ADN y secuencias de aminoacido deducidas se muestran en la Figura 2. Se clono el gen que codifica este anticuerpo.

EJEMPLO 2: HUMANIZACION DE CA081 00342 - CREACION DE 342.G2

El anticuerpo SLAM 342 se humanizo injertando las CDR en los marcos de la lmea germinal humana. Las alineaciones de la secuencia del anticuerpo (donador) de rata con los marcos de la lmea germinal (aceptora) humana se muestran en la Figura 9, junto con la secuencia humanizada disenada. La secuencia aceptora de la lmea germinal de cadena ligera seleccionada fue la region VK1 2-1-(1) O12 V humana mas la region JK1 J (V BASE, MRC Centre for Protein Engineering, UK; SEQ ID NO: 35 y 36) (Figura 3). La secuencia aceptora de la lmea germinal de cadena pesada seleccionada fue la region VH3 1-1 3-66 V humana mas la JH4 J (V BASE, MRC Centre for Protein Engineering, UK; SEQ ID NO: 37 y 38) (Figura 3). Ademas, se selecciono un marco aceptor VH diferente, la secuencia VH4 1-1 4-59 humana (SEQ iD NO: 39 y 40) (Figura 3). Las CDR injertadas de la secuencia donadora a la aceptora son como se definen en Kabat (Kabat et al. Sequence of proteins of immunological interest (1987). Bethesda MD, National Institutes of Health, US), con la excepcion de CDR-H1, en donde se utilizo la definicion de Chothia/Kabat combinada (ver WO91/09967). Para injertos en donde se transfirieron solamente las CDR al anticuerpo donador sobre los marcos del aceptor, se construyeron versiones en las que los restos de marco de donador clave tambien se incluyeron. Estos restos se identificaron utilizando un metodo con base en el descrito en el documento WO 91/09967. Por ejemplo, el injerto de cadena ligera VKl gL4 que contiene restos donadores en las posiciones 38, 71 y 85; el injerto de cadena pesada VH3 gH1 que contiene restos de marcos donadores en las posiciones 24, 48, 49, 73 y 78; el injerto de cadena pesada VH4 gH1 que contiene marcos donadores en las posiciones 48, 71 y 78. Las secuencias de todos estos injertos se muestran en Figura 9.

Los genes que codifican estas secuencias de la region V se disenaron y construyeron utilizando tecnicas de biologfa molecular estandar contratando compares para la smtesis de genes (Entelechon GmBH; ADN 2.0; Blue Heron). Las modificaciones para crear versiones injertadas se hicieron mediante mutagenesis dirigida a oligonucleotido estandar utilizando PCR. Las secuencias de peptido senal de anticuerpos de rata originales se incluyeron en los disenos de genes originales, para permitir la expresion utilizando vectores de expresion celular de mairnfero.

Los genes de cadena ligera injertados se sub-clonaron en un vector de expresion de cadena ligera, que contiene ADN que codifica la region constante C-Kappa humana (Alotipo Km3). Los genes de cadena pesada injertados se subclonaron en el vector de expresion gamma-4 humano, que contiene ADN que codifica la region constante gamma-4 humana que contiene la mutacion S241P de estabilizacion de conexion (Angal et al., Mol Immunol. 1993, 30(l):105-8). Cualquier vector de expresion adecuado puede utilizarse. Los genes de anticuerpo de rata originales tambien se subclonaron en estos vectores, creando plasmidos que expresan el anticuerpo de la region V de rata quimerica/region C humana como un estandar de comparacion en los ensayos.

La co-transfeccion de los plasmidos del gen de cadena ligera y el gen de cadena pesada en Celulas CHO1 permitio la expresion de IgG y el analisis de la union de CD154 humana por Biacore®.

Con el fin de analizar la expresion en E. coli y la actividad como un Fab' monovalente, los genes para constructos clave se sub-clonaron en el vector de expresion pTTOD (Fab) (documentos WO 03/48208, WO 03/031475). La subclonacion se logro en un proceso de dos fases: primero el fragmento del gen VK se clono como un fragmento EcoRV - BsiWI; despues el fragmento de gen VH se clono como un fragmento PvuII - Xhol. Este proceso fusiona ADN de acuerdo con el peptido de senal de la protema OmpA con los genes que codifican tanto la cadena ligera como pesada, confirieron la secrecion de la protema traducida al periplasma bacteriano. Los plasmidos de expresion resultantes se transformaron en la cepa W3110 K-12 de E.coli y se utilizo en la induccion de experimentos en frascos de agitacion de pequena escala y para fermentacion de alta densidad celular.

Tabla 1

Afinidad de los constructos de 342 Fab por Biacore® (^"Fab Purificado de fermentacion IL)

Injerto ka(l/Ms) kd(l/s) KD(M) KD(pM)

gL4gHl 1,53E+07 6,97E-05 4,55E-12 4,55

La seleccion del injerto optimo se hizo teniendo en cuenta tanto la actividad del ensayo como los niveles de expresion de Fab en fermentacion de E. coli. Un ejemplo de determinacion de afinidad por Biacore® se muestra en la Tabla 1. Sobre estas bases se eligio el injerto gL4gHl.

Se produjo un plasmido que codificaba una version Fab' del injerto gL4gH1. La secuencia de ADN del inserto de insercion de este injerto se muestra en la Figura 8 (SEQ ID NO: 41). La Figura 8 tambien proporciona la secuencia de un inserto (SEQ ID NO: 28) para la expresion de un fragmento Fab, que se puede utilizar para fabricar un fragmento F(ab)².

EJEMPLO 3: CREACION DE HU5C8 AGLUCOSILADO Y ANTICUERPOS HU342 POR MUTAGENESIS DIRIGIDA AL SITIO

Los anticuerpos hu5c8 y hu342 aglucosilados utilizados en los posteriores experimentos se crearon utilizando tecnicas de ADN recombinante convencionales. El hu5c8 aglucosilado se hizo sustancialmente como se describe en el documento US2006/0193856, excepto por la sustitucion del dominio Fc huIgG4 para el dominio Fc IgG1 previamente utilizado, con el fin de ademas reducir la funcion efectora. La secuencia de cadena ligera kappa del hu5c8 aglucosilado se muestran en la Figura 13 (SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64). La cadena pesada del hu5c8 aglucosilado contiene dos mutaciones hechas por mutagenesis dirigida al sitio en los dominios CH2 (T299A, Kabat EU) y de conexion (S228P Kabat EU) (Figura 14; SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 67). La mutacion T299A modifica el sitio de N-glucosilacion en el dominio CH2 de tal forma que ya no es un sustrato para las enzimas N-glucosiladas, convirtiendo a la molecula aglucosilada.

El anticuerpo hu342 aglucosilado derivo del vector del fragmento 342 Fab. Esta secuencia se modifico por la adicion de secuencias de senal humanas y las secuencias del dominio constante humano apropiadas. El anticuerpo hu342 aglucosilado tambien comprende un dominio Fc huIgG4. La secuencia de cadena ligera kappa del hu342 aglucosilado se muestra en la Figura 15 (SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70). La cadena pesada del hu342 aglucosilado contiene dos mutaciones hechas por mutagenesis dirigida al sitio en el dominio de CH2 (T299A, Kabat EU) y de conexion (S228P Kabat EU) (Figura 16; SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 73). La mutacion T299A modifica el sitio de N-glucosilacion en el dominio CH2 por lo que ya no es un sustrato para las enzimas de N-glucosilacion, convirtiendo a la molecula en aglucosilada. Ambos hu5c8 y hu342 aglucosilados se expresaron establemente en celulas CHO.

EJEMPLO 4: UNION A CD154: MEDICIONES DE LA AFINIDAD DE UNION

La tecnologfa Biacore® monitoriza la union entre las biomoleculas en tiempo real y sin el requerimiento de marcaje. Uno de los interactuantes, denominado ligando, esta ya sea directamente inmovilizado o capturado en la superficie inmovilizada mientras el otro, denominado analito, fluye en solucion sobre la superficie capturada. El sensor detecta el cambio en masa en la superficie del sensor como el analito se une al ligando para formar un complejo en la superficie. Esto corresponde al procedimiento de asociacion. El proceso de disociacion se monitoriza cuando el analito se reemplaza por el tampon. En el ensayo Biacore® de afinidad, el ligando es un anticuerpo anti-CD154 tal como el anticuerpo 342 y el analito es el dominio extracelular del CD154 humano.

Los detalles del metodo son como siguen:

Instrumento: Biacore® 3000, Biacore AB, Uppsala, Suecia.

Chip Sensor: CM5 (grado de investigacion) Numero de Catalogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Los chips se almacenaron a 4 °C.

Solucion de BIAnormalizacion: 70 % (p/p) de Glicerol. Parte del Kit de BIAmantenimiento Numero de Catalogo: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. El kit de BIAmantenimiento se almaceno a 4 °C.

Kit de acoplamiento de amina: Numero de catalogo: BR- 1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Clorhidrato de Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Se formo de 75 mg/ml en agua destilada y se almaceno en 200 pl de alfcuotas a -70 °C. N-Hidroxisuccinimida (NHS). Formado por 11,5 mg/ml en agua destilada y se almaceno en 200 pl de alfcuotas a -70 °C. 1M de clorhidrato de etanolamina -NaOH, pH 8,5. Se almaceno en 200 pl de alfcuotas a -70 °C. Tampones: el tampon corriente es HBS-EP (siendo 0,01 M de h Ep ES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % de Agente tensioactivo P20). Numero de catalogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Tampon almacenado a 4 °C. El tampon de inmovilizacion es acetato 5,0 (siendo 10 mM de acetato de sodio pH 5,0). Numero de catalogo: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Tampon almacenado a 4 °C.

Captura de ligando: IgG anti-humano de cabra del fragmento Affinipure F(ab')², fragmento Fab' espedfico (Numero de catalogo: 109-006-097) o fragmento Fc espedfico (Numero de catalogo: 109-006-098), Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, USA). Reactivos almacenados a 4 °C.

Ligando: anticuerpos anti-CD154.

Analito: Dominio extracelular recombinante de CD154 humano. El material se preparo a 2 mg/ml (40 pM) en solucion salina tamponada con fosfato, almaceno a 4 °C, y diluyo en tampon corriente HBE-EP para los ensayos. Tfpicamente CD154 se diluyo de ~1 nM a ~ 100 pM duplicando las diluciones para en ensayo de afinidad.

Solucion de Regeneracion: 40 mM de HCl preparado por dilucion con agua destilada de una solucion concentrada de 11,6 M (BDH, Poole, Inglaterra. Numero de catalogo: 101254H). Se prepararon 5 mM de NaOH por dilucion con agua destilada de una solucion concentrada de 50 mM. Numero de catalogo: BR-1003-58, Biacore a B, Uppsala, Suecia. Metodo de Ensayo: BIA (Analisis de Interaccion Biomolecular) se llevo a cabo utilizando un Biacore® 3000 (Biacore AB). El IgG anti-humano de cabra del fragmento Affinipure F(ab')², o el fragmento Fc- o Fab'- espe^d fico (Jackson ImmunoResearch) se inmovilizaron en un Chip Sensor CM5 a traves de qrnmica de acoplamiento de amina a un nivel de captura de “ 6000 unidades de respuesta (RU). Se utilizo tampon HBS-EP (10 mM de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % de agente tensioactivo P20, Biacore AB) como el tampon corriente con una velocidad de flujo de 10 pl/min. Se utilizaron los anticuerpos anti-CD154 o fragmentos Fab a concentraciones tales, que una vez capturados mediante la superficie de IgG-Fc anti-humano inmovilizado (o Fab^’ IgG anti-humano), dieron una sena de “ 200 RU. El CD154 humano se titulo sobre el anticuerpo capturado, a varias concentraciones. Se inyectaron 90 pl de CD154 sobre la superficie (fase de asociacion), seguido por una fase de disociacion de 240 segundos, a una velocidad de flujo de 30 pl/min. La superficie se regenero mediante dos inyecciones de 10 pl de 40 mM de HCl, seguido por una inyeccion de 5 pl de 5 mM de NaOH a una velocidad de flujo de 10 pl/min. Las curvas de union de sustraccion de fondo se analizaron utilizando el software de BIAevaluacion (version 3.2) siguiendo los procedimientos convencionales. Los parametros cineticos se determinaron del algoritmo de ajuste.

Este metodo puede utilizarse para evaluar la afinidad para la protema CD154, o un fragmento de la misma, o cualquiera de un anticuerpo, derivado de anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de esta invencion. Los valores Kd obtenidos por Biacore® para los anticuerpos anti-CD154 se aislaron por SLAM como se muestra en las Figuras 12 y 18.

EJEMPLO 5: INHIBICION DE LA UNION DE CD40

Se utilizo un ensayo basado en citometna de flujo para evaluar la union de CD40 marcado a CD154 que expresa celulas D1.1. Las celulas D1.1 Jurkat (Coleccion de Cultivo Tipo Americano) se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco, 31870-025)) conteniendo 10 % (v/v) de suero bovino fetal (FCS), 2 mM de glutamina (Invitrogen, 23030024), 1 mM de piruvato de sodio (Invitrogen, 11360-039), 1 % (v/v) de D-(+)- glucosa (Sigma, G8769) y 10 mM de HEPES (Sigma, H0887). En el momento del ensayo, se incubaron 100.000 celulas D1.1 en 100 pl de medio RPMI 1640 10 % de FCS, en la presencia o ausencia del anticuerpo anti-CD154 diluido en serie durante 15 minutos a temperatura ambiente. Despues se anadieron 5 pl de una dilucion de 1:75 de hCD40-mFc-PE (Alexis Corp, ANC- 504-050) y se incubo durante 30 minutos mas a temperatura ambiente. Despues de lavar dos veces en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 1 % (p/v) de albumina de suero bovino (BSA fraccion V, Serologicals Proteins Inc, 81­ 068-5) y 0,02 % (p/v) de azida de sodio (BDH, 103692K), las celulas se volvieron a suspender en 200 pl de PBS/1 %BSA/0,02 % de azida de sodio y se realizo la citometna de flujo en un Becton Dickinson FACScan. Los valores para la fluorescencia media promedio (FL2) se evaluaron en todos los casos. La inhibicion de la union de hCD40-mFc-PE se calculo con relacion a la senal en ausencia del anticuerpo (0 % de inhibicion) y a la senal en ausencia de hCD40-mFc-PE (100 % de inhibicion), utilizando la formula:

Los valores IC50 de los datos se obtuvieron utilizando XLfit como parte del Paquete Base de Actividad.

Los valores IC50 de la union de CD40 para los anticuerpos anti-CD154 aislados por SLAM se muestran en las Figuras 12 y 18.

EJEMPLO 6: ENSAYO DE UNION DE COMPETICION

Se utilizo un ensayo basado en citometna de flujo para evaluar la union del anticuerpo anti-CD154 a celulas D1.1 que expresan CD154. Las celulas D1.1 Jurkat (Coleccion de Cultivo de Tipo Americano) se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Gibco, 31870-025) conteniendo 10 % (v/v) suero de becerro fetal (FCS), 2 mM de glutamina (BioWhittaker, 17-605E) y 1 Penicilina-estreptomicina (Mediatech, 30002107). En el momento del ensayo, se incubaron 100.000 celulas D1.1 en 10 ml de PBS, 0,1 % de BSA, 0,02 % de azida de sodio (tampon FACS), en la presencia o ausencia del anticuerpo anti-CD154 serialmente diluido y fab anti-CD154 biotenido (clon 342) durante 2 horas a 4 °C. Las celulas se lavaron tres veces en tampon FACS con centrifugacion a 290xg por 3 minutos entre lavados. Se agrego una dilucion de 1:500 de conjugado de estreptavadina-R-ficoeritrina (Jackson Immunoresearch, 016-110-084) en 150 pM de tampon FACS y las celulas se incubaron por una hora a 4 °C. Las celulas se lavaron una vez y se fijaron en p Bs con 3 % de formaldehido a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las celulas se volvieron a suspender en tampon FACS y se corrieron en un FacsCalibur (BD). Los valores para la fluorescencia media geometrica (FL2) se evaluaron en todos los casos. La union de Fab 342 a biotina se represento graficamente enfrentada a la concentracion del anticuerpo de competicion para obtener las curvas de inhibicion sigmoideas que se ajustaron para adaptar una cuarta curva de parametro utilizando GraphPad Prism. Los valores IC50 generados se muestran en la Figura 18.

EJEMPLO 7: ENSAYO DE REGULACION POSITIVA ICAM-1

La capacidad de los anticuerpos anti-CD154 para inhibir las interacciones en superficie celular CD40L:CD40 se midio en un ensayo de potencia de co-cultivo in vitro. La ligacion (por ejemplo, union) de CD40 con CD154 (CD40L) activa los linfocitos B dando como resultado una regulacion positiva de CD54 (ICAM-1) en la superficie celular y esta activacion de celula B CD40L:CD40 B dependiente del contacto puede bloquearse mediante anti-CD154. Brevemente, las celulas de linfoma T Jurkat D1.1 (CRL- 10915, Coleccion de Cultivo de Tipo Americano (ATCC), Manassas, VA, USA) que expresan CD154 y celulas de linfoma B Ramos 2G6.4C10 (CRL- 1923, ATCC) que expresan CD40 se cocultivaron en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2 durante la noche a una proporcion de 1:4 con titulaciones de Fab anti-CD154 o Ab intacta de control (hu5C8). El ensayo se llevo a cabo en placas de fondo redondo de 96 pocillos a una concentracion de 1 X 106 celulas/ml en medio RPMl completo (RPMI con 10 % de FBS, 1 % de L-glutamina, 1 % de piruvato de sodio y 10 mM de HEPES pH 6,8, Gibco BRL, Rockville, MD, USA). Al dfa siguiente las celulas se tineron durante una hora a 4°C con CD20 FITC (n.° 555622) y CD54 APC (n.° 559771) de BD Pharmingen (San Diego, CA, USA) a una concentracion de 1:100 y 1:200 respectivamente en PBS que contiene 1 % de BSA y 0,1 % de azida de sodio. Las celulas se lavaron y fijaron con 1 % de paraformaldefndo y se analizaron en un Citometro FACScan Calibur (BD Biosciences). La fluorescencia media geometrica de las celulas Ramos (celulas positivas dobles) contra la concentracion del anti-CD154 (CD40L) se ajusto a una curva de parametros utilizando el software DeltaGraph (Red Rock Software, Salt Lake City, UT, USA) (Figuras 12 y 18). Los valores IC50 se utilizaron para determinar la potencia relativa de los anticuerpos anti-CD154.

EJEMPLO 8: ACTIVIDAD EN EL MODELO DE MONO CYNOMOLGUS DE RESPUESTA INMUNE

El modelo utilizado para demostrar la actividad in vivo se describe en Gobburu et al., (1998) J Pharmacol Exp Therapeutics 286: 925. Los monos cynomolgus recibieron dosis i.v. individuales bien de solucion salina, anticuerpo Hu5c8 o una respuesta de dosis de 342 Fab'-PEG, 4 horas antes del ataque con una sola dosis i.m. de 0,5 ml del toxoide tetanico (TT). Cada grupo de tratamiento contuvo 3 machos y 3 hembras. En el dfa 30, se les dio una segunda dosis del inhibidor, y los animales se volvieron a atacar con TT (la respuesta secundaria). Se tomaron muestras sangumeas en los penodos de tiempo seleccionados durante hasta 50 dfas para analisis de ambas concentraciones anti-TT de IgG e IgM (Figuras 19 y 21). Los datos muestran que 342 Fab'-PEG inhibe la respuesta inmune de IgG y IgM a TT en forma dependiente de la dosis.

Los tftulos anti-TT de IgG en monos cynomolgus tambien se midieron despues del tratamiento con una sola dosis (20 mg/kg para hu5c8, aglucosilo 5c8 y aglucosilo 342 y 40 mg/kg para 342 Fab'-PEG y 342 DFM-PEG) de diversas formas de los anticuerpos anti-CD154 (Figura 20). La inhibicion de la respuesta inmune TT se observo con todos los anticuerpos evaluados.

EJEMPLO 9: ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO CLASIFICANDO LA CELULA ACTIVADA POR FLUORESCENCIA

Las propiedades de union de los fragmentos Fab' anti-CD154 de la invencion se estudiaron por ensayos de anticuerpo de bloqueo cruzado. Brevemente, las celulas Jurkat D1.1 que expresan CD154 se incubaron bien con medio o 10 pg/ml del primer Fab' anti-CD154 no marcado durante 60 minutos a temperatura ambiente. Despues de no lavar, se agrego una dilucion optima de un segundo Fab' anti-CD154 marcado Alexa Fluor 488 (300 ng/ml) durante 60 minutos. Las celulas despues se lavaron y analizaron mediante citometna de flujo. Si el primer y el segundo Fab' se unen al mismo epítopo, el primer Fab' bloquea competitivamente la union del segundo Fab'. Si los dos anticuerpos se unen a diferentes epítopos, el primer Fab' no bloqueara la union del segundo Fab'. Si el segundo Fab' marcado ensayado es 342, se puede demostrar que el Fab' 342 esta bloqueado de forma cruzada por el Fab' 338 (Figura 23B), 381 (Figura 23D) y 335 (Figura 23G) pero no esta bloqueado por cruce por el Fab' 295 (no mostrado), 402 (Figura 23C), 300 (Figura 23E), 303 (Figura 23H) o 294 (Figura 23F). Cuando el Fab' marcado es hu5c8, el bloqueo por cruce por Fab' 338 (Figura 24A), 402 (Figura 24B), 381 (Figura 24C), 303 (Figura 24D), 335 (Figura 24E), 300 (Figura 24F) y 294 (Figura 24G) se puede demostrar. La prueba con A33 (un anticuerpo de control en comparacion con el isotipo) confirma que no existe un bloqueo por cruce espedfico (Figuras 23A y 24h ). Los anticuerpos 342 y hu5c8 compiten entre sf para unirse a CD154 independientemente de cual fue el Fab' no marcado (primero) y marcado (segundo).

EJEMPLO 10: ANALISIS BIACORE® DE LA UNION DEL ANTICUERPO

El analisis Biacore® de la union de anticuerpo 342 y hu5c8 a la protema CD154 soluble (sCD154) (dominio extracelular; ECD) indico que 342 desplazo la union de hu5c8 a sCD154 cuando se anadio al segundo sCD154 (Figuras 25 A y B).

5c8 no fue capaz de desplazar 342 de sCD154 cuando se anade al segundo sCD154 (Figura 25C). El anticuerpo 338 se comporta de manera similar a 342 con respecto a resultados no redprocos en el ensayo de competicion hu5c8.

El Fab Hu5c8 Fab se puede unir a un complejo 342 de longitud completa (FL)/sCD154 (Figura 25D). Este resultado sugiere que Fab hu5c8 no compite con el sitio de union FL 342 cuando se anade primero FL 342. Sin desear quedar ligado a teona alguna, estos resultados sugieren que la union de uno o dos brazos del tnmero sCD154 por 342 no evita la union de hu5c8 al brazo o brazos "libres".

Existe un ligero aumento (~20 RU) en la union cuando el Fab hu5c8 es seguido por Fab' 342 (Figura 25E). Este resultado da origen a la posibilidad de que Fab' hu5c8 tenga una union bloqueada de Fab' 342 o bien que Fab' 342 haya reemplazado a Fab' hu5c8 en el sCD154 capturado.

Ni Fab' 342 ni Fab' hu5c8 se unen al complejo CD40:sCD154 o afectan a la disociacion del complejo en un ensayo de protema. El hecho de que ni Fab' pueda unir el complejo CD40:sCD154 sugiere que tampoco ese complejo utiliza los tres brazos sCD154 o que el complejo obstaculiza estericamente el acceso ya sea de cualquier Fab' a un brazo “libre”.

EJEMPLO 11: ACTIVACION DE PLAQUETAS HUMANA

Ensayo 1

La agregacion de plaquetas puede medirse utilizando ensayos publicados (por ejemplo, Florian et al. (2005) Thrombosis Hemostasis 93: 1137). En un ensayo, las plaquetas se lavaron de plasma rico en plaquetas donadoras HEPES tampon salino en tubos recubiertos con BSA y se ajusto a 250.000 por microlitro ( jl). Las plaquetas lavadas despues se midieron con pipetas en un tubo agregometro (Chrono-Log 490D) y la senal de rastreo se calibro a una agregacion de porcentaje cero, utilizando tampon HEPES (ensayo) para el blanco. En este instrumento el tubo se mantuvo a 37,0 °C y una barra magnetica siliconada agito las plaquetas a 1000 rpm. Los complejos inmunitarios completamente formados (es decir, anticuerpo mas el CD40L soluble humano recombinante), en 1:1 de estequiometria fue rhsCD40L que se trato como trimerico) se anadieron a las plaquetas y la agregacion se evaluo como un rastro derivado de la densidad optica de la solucion. Espedficamente, se anadieron 15 pl del complejo inmunitario a 285 pl de suspension de plaqueta lavados de tal forma que despues de la adicion al tubo, la concentracion final de sCD40L fue de 10 jg/m l y la del anticuerpo IgG fue de 27,8 jg/m l o 16,7 jg/m l para Fab'-PEG. Los datos muestran que la agregacion ocurre en la presencia del anticuerpo Hu5c8 anti-CD40L de IgG intacto, pero con Fab'-PEG 342 (Figura 26).

Ensayo 2

En otro ensayo descrito en el documento WO 07/59332, la agregacion de plaquetas se midio poniendo en contacto las plaquetas con un agente activador de plaqueta (por ejemplo, adenosina difosfato (ADP), colageno, trombina, tromboxano, neurofilo elastasa, p-selectina, o convulxina), poniendo en contacto las plaquetas activadas con un anticuerpo anti-CD154, y despues poniendo en contacto las plaquetas activadas con un agente de entrelazamiento (por ejemplo, CD154 soluble (sCD154), anticuerpo IgG anti-humano, anticuerpo anti-hFc, RF, celula accesoria positiva del receptor Fc, protema A soluble, o receptor Fc humano soluble). La agregacion despues se cuantifico mediante sedimentacion de plaquetas, en donde la sedimentacion de las plaquetas indica la agregacion de las plaquetas. El ensayo de agregacion se realizo en plasma rico en plaquetas (PRP). Aproximadamente se recolectaron 50 ml de sangre completa en almuotas en tubos vacutainer de 4,5 ml que contiene 0,5 ml de 3,8 % de citrato de sodio. El PRP se preparo centrifugando la sangre anticoagulada a 200 g durante 10 minutos y cosechando el sobrenadante. Para llevar a cabo el ensayo, el perfilador de agregacion de plaquetas de 4 canales Biodata (PAP-4; Biodata Corp., Hatboro, PA) se blanqueo utilizando un tubo conteniendo solamente el plasma pobre en plaquetas (PPP). Se anadio una almuota de 350 j l de PRP, que contiene aproximadamente 2 a 5 x 108/ml de plaquetas, a un tubo conteniendo una barra de agitacion. El anticuerpo anti-CD40L, IgG humano, suero humano normal, CD40-Fc, o anti-hFc se agregaron en un volumen total de 100 jl. El tubo cargado se coloco en la maquina y los componentes de reaccion se mezclaron antes de la adicion de ADP.

La agregacion se inicio con la adicion de la concentracion sub-optima de ADP en 50 j l (la concentracion final vana para cada muestra individual). El perfilador de agregacion tiene cuatro puertos, que pueden correr simultaneamente. Se genero un rastreo de agregacion para cada muestra durante cuatro minutos siguiendo la adicion de ADP. Al final del rastreo, el instrumento calcula el porcentaje de agregacion comparando la transmision de luz a traves de la muestra con la transmision de luz a traves del PPP en blanco. Se llevo a cabo una titulacion al inicio de cada experimento, y las posteriores ejecuciones se llevaron a cabo a una concentracion ADP sub-optima.

Los resultados de este ensayo se muestran en la Figura 27. El PRP se obtuvo de un individuo sano. La agregacion se indujo con 0,75 pM de ADP, que se determino como siendo sub-optima para este donador. Se evaluo un anticuerpo anti-CD154 de control positivo y un hIgG de control negativo a 200 pg/ml y sCD154 a 30 pg/ml. El anticuerpo anti-CD154 o hIgG se mezclaron con sCD154 recombinante no menos de 20 minutos antes de la adicion al tubo que contiene PRP. Las barras representan las medias y las desviaciones estandar de dos puntos de datos. Los resultados muestran que mientras el IgG humano de control negativo (hIgG) y sCD154 juntos no tienen efecto sobre la agregacion de plaquetas, el anticuerpo anti-CD154 de control positivo y de control negativo demuestran que este ensayo puede utilizarse para comparar el efecto relativo de los anticuerpos de la presente invencion en la agregacion de plaquetas.

Para determinar si las plaquetas expresan CD154 en su superficie, las plaquetas pueden incubarse con un anticuerpo anti-CD154 conjugado con biotina y la presencia del CD154 en superficie se determino mediante la cuantificacion del anticuerpo anti-CD40L biotenido unido. Por consiguiente, la expresion en superficie de CD154 se evaluo despues de 1, 10, 20, 40, y 60 minutos de incubacion con o sin 10 pM de ADP. La expresion en superficie de CD40Lfue detectable en plaquetas activadas con ADP tan pronto como un minuto despues de la activacion y aumento con el tiempo. La union del anticuerpo anti-CD154 conjugado con biotina es espedfica para CD154, como la preincubacion del anticuerpo anti-CD154 conjugado con biotina inhibio la union de las plaquetas activadas. La cantidad de CD154 en superficie detectada en plaquetas inactivadas (“en reposo”) tambien aumento con el tiempo. Este fenomeno es igualmente atribuible al nivel basal de la activacion de plaquetas bajo las condiciones experimentales.

EJEMPLO 12: METODOS PARA DETERMINAR LA FUNCION EFECTORA ALTERADA DE ANTICUERPOS AGLUCOSILADOS Y OTRAS VARIANTES

El siguiente ejemplo describe ensayos utiles para la determinacion y caracterizacion de la funcion o funciones efectoras de los anticuerpos aglucosilados y otras variantes modificadas de la invencion.

La funcion efectora de los anticuerpos aglucosilados y otras variantes modificadas de la invencion puede caracterizarse por la capacidad de los anticuerpos para unir un antígeno y tambien unir un receptor Fc o una molecula de complemento tal como C1q. En particular, las afinidades de union de FcyR pueden medirse con ensayos con base en la capacidad del anticuerpo para formar un “puente” entre el antígeno CD154 y la celula que lleva el receptor Fc. La interaccion de los anticuerpos de la presente invencion con un FcR o con complemento tambien se puede medir por tecnologfa AlphaScreen® con base en perlas (Perkin Elmer®).

Ensayos de union del receptor Fc

El ensayo de union a FcyR puede llevarse a cabo cubriendo placas ELISA Maxisorb de 96 pocillos (Nalge-Nunc Rochester, NY, USA) con ligando humano CD154 soluble recombinante (por ejemplo, a una concentracion de 1 pg/ml durante la noche a 4°C en PBS; Karpusas et al. 1995 Structure 3(10): 1031-1039 y 3(12): 1426 y Karpusas et al. 2001 Structure 9(4): 321-329). Las titulaciones de formas glucosiladas y aglucosiladas del anticuerpo anti-CD154 estan unidas a CD154 durante 30 minutos a 37 °C, las placas despues se lavan, y se mide la union de celulas U937 (CD64+) marcadas con fluorescencia. Las celulas U937 pueden cultivarse en medio RPMI con 10 % de FBS, 10 mM de HEPES, L-glutamina, y penicilina/estreptomicina, divididas a 1:2, y activadas por un dfa antes del ensayo con 1000 unidades/ml de IFNy para aumentar la expresion del receptor Fc (FcyRI).

En otra variacion del ensayo, la capacidad de los anticuerpos de la invencion para unirse a, o mas bien, fallar al unirse a, aun otro receptor Fc, tal como, FcyRIII (CD16) puede llevarse a cabo utilizando el ensayo de puenteo anterior contra celulas T humanas marcadas con fluorescencia (celulas Jurkat) transfectadas con un constructo de expresion CD16. El ligando puede producirse mediante una monocapa de celulas de Ovario de Hamster Chino (CHO) que expresan CD154 cultivadas en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (Corning Life Sciences Acton, MA, USA). Por ejemplo, las celulas CHO-CD154+ se sembraron en placas de 96 pocillos a 1X105 celulas/ml y se cultivaron con confluencia en oc-MEM con 10 % de FBS dializado, 100 nM de metotrexato, L-glutamina, y penicilina/estreptomicina (Gibco-BRL Rockville, MD, USA). Las celulas CD16+ Jurkat se cultivaron en RPMI con 10 % de FBS, 400 pg/ml de Geneticina, 10 mM de HEPES, piruvato de sodio, L-glutamina, y penicilina/estreptomicina (Gibco-BRL) y se dividieron 1:2 un dfa antes de realizar el ensayo.

En los ensayos para ambos receptores, la celulas que llevan el receptor Fc pueden marcarse con acetoximetil ester de 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5- (y-6)-carboxifluorescema (BCECF- AM) (Molecular Probes Eugene, OR, USA) durante 20 minutos a 37 °C. Despues de lavar para retirar el marcador en exceso, se incubaron 1x105 de las celulas marcadas en el ensayo durante 30 minutos a 37 °C. Las celulas positivas FcyR se retiraron por lavado varias veces y las placas se leyeron en un lector de microplacas (Cytofluor 2350 Fluorescent Microplate Reader, Millipore Corporation Bedford, MA, USA) a una longitud de onda de excitacion de 485 nm y una longitud de onda de emision de 530 nm.

Ademas de los ensayos descritos anteriormente, la union de los anticuerpos de la presente invencion a receptores Fc puede medirse en un formato de competicion utilizando un AlphaScreen™ (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay; Perkin Elmer) o directamente utilizando Resonancia de Plasmon (Biacore®). Los ensayos Biacore pueden monitorizar la union del receptor de analito para el anticuerpo capturado en un chip A/G de protema utilizando un instrumento Biacore® 3000. Biacore® es un metodo bien establecido para caracterizar las interacciones de protema-protema (Myszka 1997 Curr Opin Biotechnol. 8:50-57; Malmborg & Borrebaeck 1995 J Immunol Methods 183:7-13), y ha sido utilizado exitosamente para medir la union de los anticuerpos IgG a FcyRIII (Galon et al., 1997 Eur J Immunol. 27:1928-1932). Por ejemplo, la protema A/G se acopla covalentemente a un chip sensor (por ejemplo, un chip sensor CM5 utilizando qmmica NHS). Un tampon (por ejemplo, HBS-EP (0,01 M de He Pe S pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % v/v de Agente tensioactivo P20, Biacore®)), y un tampon de regeneracion de chip (por ejemplo, Glicina 1,5 (10 mM de glicina-HCl, pH 1,5, Biacore®)) se utilizaron en el ensayo. Los anticuerpos anti-CD154 variantes con funcion efectora reducida y anticuerpos anti-CD154 de tipo silvestre o nativos se diluyeron a 100 nM en tampon corriente (por ejemplo, tampon HBS-EP) y se unen al chip de la protema A/G por 5 min. Los receptores estan unidos a la fase de asociacion en series de concentraciones, seguido por una fase de disociacion con tampon. Un ciclo sin anticuerpo proporciona una respuesta de la lmea base. Los sensogramas pueden ajustarse globalmente a 1:1 del modelo de union de Langmuir para obtener las constantes de disociacion en equilibrio (KdS) utilizando el software BIAevaluation v4.1 (Biacore®), por ejemplo.

Los ensayos AlphaScreen utilizan anticuerpo no marcado para competir en la interaccion entre la union de IgG biotenido con perlas de donador de estreptavidina y FcYR-His-GST unido a perlas del aceptor anti-GST. Un anticuerpo anti-CD154 nativo o de tipo silvestre (tal como un anticuerpo IgG1) se biotine utilizando metodos convencionales y se dializa en PBS. Las perlas del aceptor anti-GST y perlas donadoras de estreptavidina estan disponibles de vendedores comerciales y puede utilizarse a una concentracion final de 20 pg/ml. FcYRI-His-GST, FcYRIIIa-His-GST, FcYRIIa-His-GST, o cualquier FcR marcado, en el tampon de ensayo IX (por ejemplo, 25 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 0,1 % de BSA, 0,01 % de Tween-20, pH 7,4) se distribuye en cada cavidad de una placa de 96 pocillos a una concentracion final de 0,5 nM. El anticuerpo anti-CD154 de nativo o de tipo silvestre, el anticuerpo anti-CD154 variante, o el tampon se prepara como diluciones log A en tampon de ensayo 1X, y se alicuotaron directamente en cada cavidad. Despues de una breve centrifugacion, el anticuerpo anti-CD154 biotenido de tipo silvestre (por ejemplo, un anticuerpo IgG1) en tampon de ensayo 1X se anadio a cada cavidad a una concentracion final de 5 nM. Se anadieron 100 pg/ml de perlas del aceptor anti-GST en cada cavidad, y la placa se incubo en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Se anadieron 100 pg/ml de perlas del donador de estreptavidina a cada placa y despues de una breve centrifugacion la placa se incubo a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Las muestras de la reaccion se transfirieron a placas opacas blancas, y la fluorescencia se leyo en un lector de microplacas Fusion™ Alpha-FP HT (Perkin Elmer). Los datos pueden normalizarse a la senal mas alta (sin competicion) y adaptarse a un modelo de competicion de un sitio utilizando regresion no lineal con el software GraphPad Prism (GraphPad Software), por ejemplo.

Los expertos en la materia pueden llevar a cabo el ensayo anterior o ensayos similares para medir la union de las variantes del anticuerpo a cualquier FcR, incluyendo por ejemplo, FcYRIIa.

Ensayos de union a C1q

El ensayo de union a C1q se realizo cubriendo placas ELISA Maxisorb de 96 pocillos (Nalge-Nunc Rochester, NY, USA) con 50 pl del ligando humano CD154 soluble recombinante (Karpusas et al. Structure, 15; 3 (12): 1426 (1995) a 10 pg/ml durante la noche a 4 °C en PBS. Los pocillos se aspiraron y se lavaron tres veces con tampon de lavado (PBS, 0,05 % de Tween 20) y bloquearon durante al menos una hora con 200 pl/pocillo de tampon de bloqueo/diluyente (0,1 M de Na2HPO4, pH 7,0, 1 M de NaCl, 0,05 % de Tween 20, 0,1 % de gelatina). El anticuerpo a probar se diluyo en tampon de bloqueo/diluyente iniciando a 15 pg/ml con diluciones de 3 veces. Se anadieron 50 pl por pocillo, y las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente.

Despues de la aspiracion y el lavado anterior, se agregaron 50 pl/pocillo de 2 pg/ml de C1q humano Sigma (C0660) diluido en tampon de bloqueo/diluyente y se incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Despues de la aspiracion y lavado como anteriormente, se anadieron 50 pl/pocillo de anti C1q de oveja (Serotec AHP033), diluido 3.560 veces en tampon de bloqueo/diluyente. Despues de la incubacion durante 1 hora a temperatura ambiente, los pocillos se aspiraron y lavaron como anteriormente. Despues se anadieron 50 pl/pocillo de conjugado HRP de IgG de anti-oveja de burro (Jackson ImmunoResearch 713-035-147) diluidos a 1:10.000 en bloque/diluyente y los pocillos se incubaron durante 1 hora temperatura ambiente.

Despues de aspirar y lavar como anteriormente, se anadieron 100 pl de sustrato TMB (420 pM de TMB, 0,004 % de H2O2 en 0,1 M de tampon de acetato de sodio/acido cftrico, pH 4,9) y se incubaron por 2 minutos antes de detener la reaccion con 100 pl de 2 N de acido sulfurico. La absorbancia se leyo a 450 nm con un instrumento Softmax PRO, y se utilizo el software Softmax para determinar la afinidad de la union relativa (valor C) con un ajuste de 4 parametros.

Un ensayo de union C1q alternativo utiliza ELISA para determinar la union de anti-CD154 a C1q pero no utiliza CD154 como un puente. Brevemente, las placas de ensayo pueden cubrirse durante la noche a 4°C con un anticuerpo variante o un anticuerpo parental (control) en el tampon de recubrimiento. Las placas despues pueden lavarse y bloquearse.

Despues del lavado, puede anadirse una almuota de C1q humano a cada cavidad e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Despues de un lavado mas, se pueden anadir 100 |jl de un anticuerpo conjugado de peroxidasas C1q anti-complemento de oveja e incubarse durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa puede volverse a lavar con tampon de lavado y agregarse 100 j l de tampon que contiene OPD (diclorhidrato de O-fenilenodiamina (Sigma)) a cada cavidad. La reaccion de oxidacion, observada por la aparicion de un color amarillo, puede dejarse avanzar durante 30 minutos y detenerse mediante la adicion de l00 j l de 4,5 NH2SO4. La absorbancia despues puede leerse a (492-405) nm.

Una variante de anticuerpo ejemplar es una que despliega una “reduccion significativa en la union de C1q” en este ensayo. Una reduccion significativa puede ser, en algunas realizaciones, aproximadamente 100 jg /m l de la variante del anticuerpo que despliega aproximadamente 50 veces o mas de reduccion en la union de C1q en comparacion con 100 jg/m l de un anticuerpo de control que tiene una region Fc de IgG1 no mutada. En la realizacion mas preferida, la variante del polipeptido (es decir, anticuerpo) no une C1q, es decir, 100 jg/m l de la variante del anticuerpo despliega aproximadamente 100 veces o mas de reduccion en la union de C1q en comparacion con 100 jg/m l del anticuerpo de control.

Activacion del complemento y CDC

Para evaluar la activacion del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Brevemente, varias concentraciones de la variante del polipeptido (es decir, anticuerpo) y el complemento humano pueden diluirse con tampon. Las celulas que expresan el antígeno al cual la variante del polipeptido se une pueden diluirse a una densidad de aproximadamente 1 X 106 celulas/ml. Las mezclas de la variante de polipeptido, complemento humano diluido y celulas que expresan el antígeno pueden agregarse a una placa de 96 pocillos de cultivo celular de fondo plano y dejar incubar durante dos horas a 37 °C y 5 % de CO2 para facilitar la lisis celular mediada por el complemento. Despues pueden agregarse 50 j l de azul alamar (Accumed International) en cada pocillo e incubar durante la noche a 37 °C. La absorbancia se mide utilizando un fluorometro de 96 pocillos con excitacion a 530 nm y emision a 590 nm. Los resultados pueden expresarse en unidades de fluorescencia relativa (RFU). Las concentraciones de la muestra pueden calcularse de una curva estandar y la actividad porcentual segun en comparacion con el polipeptido no variante se reporta para la variante del polipeptido de interes.

EJEMPLO 13: MAPEO DEL SITIO DE UNION DEL ANTICUERPO 342 EN PROTEINA CD154

Los experimentos se llevaron a cabo para identificar los restos de aminoacido en CD154 humano que son importantes en la union de 342 utilizando protemas CD154 quimericas de humano-raton. 342 se une con una alta afinidad a CD154 humano pero no se une a CD154 de raton. Por consiguiente, al mutar los restos de raton CD154 a los restos humanos correspondientes y medir el cambio en la afinidad de la protema mutada para 342, pueden identificarse restos de union importantes. Se seleccionaron seis grupos de mutantes en donde los restos humanos en las regiones seleccionadas se introdujeron en CD154 soluble de raton (marcado 1-6 en Figura 28). Las protemas CD154 solubles de humano y raton no mutadas (sCD154) tambien se evaluaron. Las diferentes protemas sCD154 se utilizaron en experimentos Biacore® utilizando 342 (en un formato IgG) inmovilizado en el chip y con los sobrenadantes de sCD154 en la fase de solucion. Los resultados demuestran que la union de 342 solamente ocurre con la introduccion de restos del Grupo 5 humanos en el CD154 de raton.

EJEMPLO 14: ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO ELISA DE COMPETICION

Para demostrar el bloqueo cruzado de los Fab' 342 y 5c8, se utilizo ELISA de competicion. En este ensayo, el anticuerpo anti-Myc 9E10 se recubrio en una placa ELlSA. El CD154 marcado con Myc se capturo mediante este anticuerpo. Una serie de diluciones de Fab' 342 o 5c8 sin marcar se incubo con ya sea 1 nM de Fab' biotina o 0,3 nM de 5c8 de biotina en una placa durante 2 horas a temperatura ambiente en PBS, 0,05 % de Tween-20, 1 % de BSA. La placa se lavo y la cantidad del Fab 5c8 biotenido unido se determino utilizando HRP de estreptavidina como un secundario. La senal se represento graficamente y adapto utilizando ya sea una hiperbola de union de sitio o dos curvas de hiperbole de union de sitio adaptadas con el software Prism (Graph Pad).

Se llevo a cabo una titulacion del Fab' 342 de biotina en CD154 para determinar la concentracion apropiada para el analisis de bloqueo cruzado (Figura 29A). Se encontro que una concentracion de 1 nM como estado en la parte lineal de la curva. Tambien se realizo una titulacion del Fab' 5c8 de biotina en CD154 para determinar la concentracion apropiada para el analisis de bloqueo cruzado (Figura 29B). Una concentracion de 0,3 nM se encontro estando en la parte lineal de la curva. En un experimento para analizar el bloqueo cruzado del Fab' de 342 biotina y 5c8 biotina mediante el Fab' 342 sin marcar, el Fab' 342 inhibio la union del Fab' 342 con una afinidad de 0,09 nM (Figura 29C). Fab' 342 inhibe la union de 5c8 de biotina con dos afinidades, 0,134 nM y 76 nM (Figura 29C). El bloqueo cruzado de biotina 342 mediante Fab' 5c8 sin marcar se muestra en la Figura 29D. La concentracion maxima del Fab' 5c8 en esta curva, 50 nM, es la cavidad por encima del punto de saturacion para 5c8 y tambien es el pocillo por encima de la concentracion de 1 nM de la biotina 342. La falta de la inhibicion completa en estas concentraciones sugiere que 5c8 es incapaz de bloquear completamente todos los sitios de union de 342 en CD40L.

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CD 154 o un fragmento de union a CD 154 del mismo, que comprende:

(a) una secuencia del dominio Vh de acuerdo con SEQ ID NO: 1 de la Figura 5; y

(b) una secuencia de dominio Vl de acuerdo con SEQ ID NO: 2 de la Figura 6.

2. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende:

(a) una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 12 de la Figura 7, SEQ ID NO: 13 de la Figura 7 y SEQ ID NO: 72 de la Figura 16; y

(b) una secuencia de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 15 de la Figura 7 y SEQ ID NO: 69 de la Figura 15.

3. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con la reivindicacion 2, que comprende secuencias de cadena pesada y ligera seleccionadas de:

(a) SEQ ID NO: 12 de la Figura 7 y SEQ ID NO: 15 de la Figura 7, respectivamente;

(b) SEQ ID NO: 13 de la Figura 7 y SEQ ID NO: 15 de la Figura 7, respectivamente; y

(c) SEQ ID NO: 72 de la Figura 16 y SEQ ID NO: 69 de la Figura 15, respectivamente.

4. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con la reivindicacion 3, que comprende secuencias de cadena pesada y ligera de SEQ ID NO: 13 de la Figura 7 y SEQ ID NO: 15 de la Figura 7, respectivamente.

5. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en donde:

(a) el anticuerpo anti-CD 154 es un anticuerpo anti-CD154 seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo multimerico, un anticuerpo heterodimerico, un anticuerpo hemidimerico, un anticuerpo tetravalente, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo de cadena unica y derivados de los mismos; o

(b) el anticuerpo anti-CD 154 es un fragmento de union a antígeno de un anticuerpo anti-CD 154 y dicho fragmento de union a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, F(ab)², Fab', F(ab')² , F(ab')³, Fd y Fv;

6. El anticuerpo anti-CD 154 de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde dicho anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo se modifican por una union covalente de poli(etilenglicol) o un derivado del mismo.

7. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde el anticuerpo CD 154 es un fragmento Fab' en donde un grupo tiol en una region bisagra modificada se une covalentemente a un grupo maleimida que esta unido covalentemente a un resto lisina, en donde un polfmero de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 000 Da se fija a cada uno de los grupos amina de la lisina.

8. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde: (a) el anticuerpo o el fragmento del mismo carece de una region Fc de inmunoglobulina; o

(b) el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende una region Fc de inmunoglobulina seleccionada de una region Fc de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, o deriva de una region Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

9. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende ademas una region Fc variante que es una region Fc hforida que comprende secuencias de mas de un tipo de dominio Fc de Ig.

10. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo no estan glucosilados.

11. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza a un resto funcional seleccionado de un resto de bloqueo, un resto detectable, un resto terapeutico o una combinacion de los mismos.

12. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el fragmento es una fusion de Fab, Fab', Fd, Fv, un scFv, un scFab o un scFab sin cistema.

13. Una molecula de acido nucleico que codifica el anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. El acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde el acido nucleico es una molecula de ADN que codifica un anticuerpo anti-CD 154 o un fragmento de union a CD 154 del mismo, comprendiendo la molecula de ADN una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17 de la Figura 6, SEQ ID NO: 18 de la Figura 6, SEQ ID NO: 22 de la Figura 5, SEQ ID NO: 23 de la Figura 7, SEQ ID NO: 24 de la Figura 7, SEQ ID NO: 25 de la Figura 6, SEQ ID NO: 26 de la Figura 7, SEQ ID NO: 27 de la Figura 7, SEQ ID NO: 28 de la Figura 8, SEQ ID NO: 41 de la Figura 8, SEQ ID NO: 70 de la Figura 15 y SEQ ID NO: 73 de la Figura 16.

15. Un vector que comprende una molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 13 o una molecula de ADN de acuerdo con la reivindicacion 14.

16. Una celula hospedadora que comprende el vector de la reivindicacion 15.

17. Un metodo para producir un anticuerpo anti-CD 154 o un fragmento de union a CD 154 del mismo, en donde dicho metodo comprende las etapas de:

(a) cultivar una celula hospedadora de acuerdo con la reivindicacion 16 en condiciones adecuadas para la expresion del anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo, por dicha celula hospedadora; y

(b) recuperar el anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo.

18. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 17, en donde la celula hospedadora es una celula procariota o una eucariota.

19. Una composicion que comprende el anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un vehmulo farmaceutico adecuado.

20. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 19, en donde dicha composicion comprende ademas un compuesto o agente inmunosupresor o inmunomodulador adicional.

21. Uso del anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o de la composicion de acuerdo con la reivindicacion 19 o 20 en la preparacion de un medicamento para tratar o prevenir una afeccion, un trastorno o una enfermedad humanos mediados en total o en parte por la senalizacion de CD40 o un smtoma de cualquiera de los anteriores, en donde dicha afeccion, trastorno o enfermedad es una respuesta inflamatoria o autoinmune o fibrosis.

22. El uso de acuerdo con la reivindicacion 21, en donde la respuesta inflamatoria o autoinmune o fibrosis se selecciona de artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, espondilartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, psoriasis, escleroderma, nefritis por lupus, purpura trombocitopenico idiopatico, enfermedad vascular y esclerosis multiple.

23. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o la composicion de acuerdo con la reivindicacion 19 o 20 para su uso en el tratamiento o la prevencion de una afeccion, un trastorno o una enfermedad humanos mediados en total o en parte por la senalizacion de CD40 o un smtoma de cualquiera de los anteriores, en donde dicha afeccion, trastorno o enfermedad es una respuesta inflamatoria o autoinmune o fibrosis.

24. El anticuerpo anti-CD 154 o el fragmento de union a CD 154 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o la composicion de acuerdo con la reivindicacion 19 o 20 para su uso en el tratamiento o la prevencion de una respuesta inflamatoria o autoinmune o fibrosis de acuerdo con la reivindicacion 23, en donde la respuesta inflamatoria o autoinmune o fibrosis se selecciona de artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, espondilartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, psoriasis, escleroderma, nefritis por lupus, purpura trombocitopenico idiopatico, enfermedad vascular y esclerosis multiple.