CN101679521B - 特异性结合cd154的包括抗体、抗体衍生物和抗体片段在内的结合蛋白及其用途 - Google Patents

特异性结合cd154的包括抗体、抗体衍生物和抗体片段在内的结合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供特异性结合CD154(CD40L)蛋白的结合蛋白，包括抗体、抗体衍生物和抗体片段。本发明还提供与表位特异性结合的嵌合、人源化或全人抗体、抗体衍生物或抗体片段，含SEQ ID NO：1所示的可变重链序列且含SEQ ID NO：2所示的可变轻链序列的人源化Fab片段与所述表位特异性结合。本发明的CD154结合蛋白可引发相对于第二种抗CD154抗体减少的效应子功能。本发明的CD154结合蛋白在诊断和治疗方法中有用，例如在疾病包括涉及由CD154-CD40相互作用介导的不希望有的免疫应答的那些的治疗和预防中。

Description

特异性结合CD154的包括抗体、抗体衍生物和抗体片段在内的结合蛋白及其用途
本申请要求提交于2007年3月27日的美国临时专利申请No.60/920,495、提交于2007年3月22日的美国临时专利申请No.60/919,938、及提交于2007年3月22日的美国临时专利申请No.60/919,816的优先权。US 60/920,495、US 60/919,938和US 60/919,816的内容通过引用整体并入本文。 
技术领域
本发明提供特异性结合CD154(CD40L)蛋白的结合蛋白，包括抗体、抗体衍生物和抗体片段。本发明还提供与表位特异性结合的嵌合、人源化或全人抗体、抗体衍生物或抗体片段，含SEQ IDNO：1的可变重链序列且含SEQ ID NO：2的可变轻链序列的人源化Fab片段与所述表位特异性结合。本发明的CD154结合蛋白可引发相对于第二种抗CD154抗体减少的效应子功能。本发明的CD154结合蛋白在诊断和治疗方法中有用，例如在治疗和预防疾病中，包括涉及由CD154-CD40相互作用介导的不希望有的免疫应答的疾病中。 
背景技术
体液和细胞介导的免疫的产生由活化的辅助T细胞与抗原呈递细胞(“APC”)和效应T细胞的相互作用配合。辅助T细胞的活化不仅依赖抗原特异性T细胞受体(“TCR”)与其同源肽-MHC配体的相互作用，还需要由许多细胞粘附和共刺激分子的协调结合和活化。参见例如，Salazar-Fontana，L.I.and B.E.Bierer(2001)Curr.Opin.Hemat.8：5。 
一种关键的共刺激分子是CD154，以活化依赖性、暂时限 制方式在CD4+T细胞的表面上表达的II型跨膜蛋白。在活化后，CD154也在CD8+T细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和血小板的子集上表达。CD154反受体CD40是在包括APC在内的许多细胞类型表面上组成型且广泛表达的I型膜蛋白。参见例如，Foy，T.M.et al.，(1996)Ann.Rev.Immunol.14：591。 
通过CD40经由CD154信号起始事件级联，这导致具有CD40受体的细胞的活化和最佳的CD4+T细胞引发。更具体而言，CD154与CD40的结合促进B细胞分化成抗体分泌细胞和记忆B细胞。参见例如，Burkly，L.C.(2001)In Adv.Exp.Med.Bio.，第489卷.D.M.Monroe et al.，编辑Kluwer Academic/Plenum Publishers，第135页(以下简称“上述Burkly的文章”)。此外，CD154-CD40相互作用通过巨噬细胞与树突状细胞的活化以及天然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞的产生来促进细胞介导的免疫。参见例如，上述Burkly的文章。 
CD154在调节体液和细胞介导的免疫应答的功能中的中枢作用已引起将此通路的抑制剂用于治疗性免疫调节的用途中的极大兴趣。像这样，抗CD154抗体已显示在针对其他治疗性蛋白或基因疗法、变应原、自身免疫和移植的广泛多样的免疫应答模型中是有利的。参见例如，US 5,474,771；上述Burkly的文章。 
CD40-CD154相互作用已显示在几种实验诱导的自身免疫疾病中是重要的，在其中已显示疾病诱导可在抗原施用时用CD154拮抗剂阻断(上述Burkly的文章)。使用抗CD154拮抗剂的疾病阻断已见于自发性自身免疫疾病的动物模型中。参见例如，上述Burkly的文章。 
目前存在对具有更高结合亲和力和更少不需要的副作用的改良的抗CD154抗体的需求。增加的“效应子功能”例如直接的细胞毒性、补体依赖性细胞毒性(“CDC”)、抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)和异常抗体产生，是可能与治疗抗体有关的不需要的副作用。 
几种抗体效应子功能至少部分由Fc受体(FcR)介导， 所述Fc受体结合一般免疫球蛋白的恒定结构域中的抗体Fc区。存在对不同免疫球蛋白类别特异的许多Fc受体。免疫球蛋白类别包括IgG、IgE、IgA、IgM和IgD。免疫球蛋白类别进一步分成亚类：IgG分成4个亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，而IgA分成2个亚类(IgA1和IgA2)。有IgG的3种已知受体：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))。每个FcγR亚类由2种或3种基因编码，并且可变RNA剪接导致多种转录物和FcγR同种型的广泛多样性。 
一般地，免疫球蛋白是含2条相同的重链和2条相同的轻链的Y型分子。二硫键使重链和轻链对以及2条重链连接在一起。每条链由在序列方面不同且负责抗原结合的1个可变结构域构成；这些结构域对于重链和轻链分别称为VH和VL结构域。在轻链中存在单个恒定结构域(CL)，并且在重链中存在3个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。含所有可变和恒定结构域的分子可称为完整抗体。 
抗体可变结构域中的残基通常根据由Kabat等人设计的系统进行编号。这个系统在Kabat et al.，1987，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Department of Health and HumanServices，NIH，USA(以下简称“上述Kabat等人的文章”)中阐述。除非另有说明，在本说明书中使用这个编号系统。应当指出Kabat残基命名不一定直接对应氨基酸残基的线性编号。实际线性氨基酸序列可能含与严格Kabat编号中不同的更少或附加的氨基酸，对应于无论是基本可变结构域结构的构架区还是互补决定区(CDR)的结构组分的缩短或插入。给定抗体的残基的正确Kabat编号可通过使抗体序列中的同源性残基与“标准”Kabat编号序列比对予以测定。 
可变结构域有3个序列组高度可变的区域位于4个更高度保守的构架区之间。这些高度可变的CDR主要负责抗原识别。根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)处。然而，根据Chothia(Chothia，C.and Lesk，A.M.J.Mol.Biol.，1987，196： 901-917)，等价于CDR-H1的环从残基26延长至残基32。因此，根据Kabat编号系统和Chothia的拓扑环定义的组合描述，本文所述’CDR-H1’还包括位于残基26-35处的CDR。根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)处。 
尽管天然存在的抗体(如完整抗体或如保留特异性结合性质的片段)最初源自单个物种，但经改造抗体(例如嵌合抗体)可源自超过一个动物物种。迄今为止，已主要产生小鼠(鼠类)/人嵌合抗体和鼠类/非人灵长类抗体，尽管其他嫁接物种组合(hybrid speciescombinations)也是可能的。目前已知天然存在的和经改造抗体多肽、及其衍生物和片段的许多不同构型。所有共同的特征是一种以上的所述多肽保留通过一个以上的表位结合结构域的抗原结合特异性。除表位结合外，抗体多肽的功能性质可依赖于存在何种其他序列而不同，例如Fc结构域或活化效应子功能和/或与其他细胞通路相互作用的其他序列。 
含掺入非免疫球蛋白支架或构架内的表位结合结构域(例如CDR或可变结构域)的CD154结合蛋白(参见例如，Binz et al.，2005Nat Biotech 23：1257-1268；Hosse et al.，2006Protein Science 15：14-27)可显示出减少的效应子功能。希望具有特异性拮抗CD154与CD40结合且减少或消除CD154-CD40复合物的下游功能的新结合蛋白。还希望具有与已知抗CD154抗体相比具有减少的效应子功能的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)。 
发明概述
本发明通过提供特异性结合CD154蛋白(其可为人CD154蛋白)的结合蛋白(例如分离的、重组的或合成的抗体、或其片段或衍生物)来提供对于这些和其他问题的解决方案。本发明的抗CD154抗体，包括其片段和衍生物，可为单克隆的、多克隆的、鼠类的、嵌合的、灵长类化的、人源化的或全人抗体。本发明的抗CD154 抗体可为多聚、异二聚、半二聚(hemidimeric)、单价、二价、四价、双特异性的，并且可包括单链抗体；及这些的衍生物。 
在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)具有对于CD154的高选择性，并且在一些实施方案中，还相比例如抗CD154抗体5c8(如在US 5,474,771中所述由保藏号为ATCC No.HB 10916的杂交瘤产生；或人源化5c8)具有一种以上的减少的效应子功能。本发明的某些CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)对于CD154结合是单价的。 
本发明的CD154结合蛋白和抗CD154抗体(包括抗体片段和衍生物)对于抑制CD154与CD40的结合有用且特异性高，例如具有20pM-1.5μM(包括端点)的IC50。在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)可具有20pm-500pm、50pm-500pm或100pm-500pm的IC50。在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白和抗CD154抗体(包括抗体片段和衍生物)基本上不拮抗CD40活性。 
本发明的某些实施方案涉及对于人CD154显示出高亲和力的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)。例如，在某些实施方案中，如由表面等离子体共振(例如， 
Figure 286083DEST_PATH_G2008800093615D00051
)测得CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)以50nM-1pM(包括端点)的KD与人CD154(人CD40L)解离。例如，人CD154的KD可为50pm-1pm、20pm-1pm或甚至10pm-1pm。在一些实施方案中，人CD154的KD小于20pM。在其他实施方案中，人CD154的KD小于10pM。 
在某些实施方案中，本发明提供如下CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)：其当基于其结合亲和力以用于CD154结合的饱和浓度存在或超过用于CD154结合的饱和浓度存在时，当首先加入CD154中时，能够阻断抗体5c8与CD154的结合，并且当在将抗体5c8加入CD154之后加入时，也能够取代与CD154结合的抗体5c8。 
在某些实施方案中，本发明提供如下结合蛋白(例如抗体)：其特异性结合CD154蛋白，并且含一个以上的如下CDR重链 (H)序列或由一个以上的如下CDR重链(H)序列构成，所述序列选自CDR-H1(SEQ ID NO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ ID NO：5)。在进一步实施方案中，CD154结合蛋白或抗体含选自CDR-H1(SEQ ID NO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ ID NO：5)中的至少2个CDR，或由选自CDR-H1(SEQ ID NO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ IDNO：5)中的至少2个CDR构成。在更进一步实施方案中，结合蛋白或抗体含所有3个如下CDR H序列或由所有3个如下CDR H序列构成，所述序列是CDR-H1(SEQ ID NO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ ID NO：5)。 
在某些实施方案中，本发明提供如下结合蛋白(例如抗体)：其特异性结合CD154蛋白，并且含一个以上的如下CDR轻链(L)序列或由一个以上的如下CDR轻链(L)序列构成，所述序列选自CDR-L1(SEQ ID NO：6)、CDR-L2(SEQ ID NO：7)和CDR-L3(SEQ ID NO：8)。在进一步实施方案中，CD154结合蛋白或抗体含选自CDR-L1(SEQ ID NO：6)、CDR-L2(SEQ ID NO：7)和CDR-L3(SEQ ID NO：8)中的至少2个CDR，或由选自CDR-L1(SEQ ID NO：6)、CDR-L2(SEQ ID NO：7)和CDR-L3(SEQ IDNO：8)中的至少2个CDR构成。在更进一步实施方案中，CD154结合蛋白或抗体含所有3个如下CDR L序列或由所有3个如下CDR L序列构成，所述序列是CDR-L1(SEQ ID NO：6)、CDR-L2(SEQ IDNO：7)和CDR-L3(SEQ ID NO：8)。 
在某些实施方案中，本发明提供如下结合蛋白(例如抗体)：其特异性结合CD154蛋白，并且含CDR-L1(SEQ ID NO：6)、CDR-L2(SEQ ID NO：7)和CDR-L3(SEQ ID NO：8)，或由CDR-L1(SEQ ID NO：6)、CDR-L2(SEQ ID NO：7)和CDR-L3(SEQ IDNO：8)构成，并且其中所述结合蛋白或抗体进一步含CDR-H1(SEQID NO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ ID NO：5)，或由CDR-H1(SEQ ID NO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4) 和CDR-H3(SEQ ID NO：5)构成。 
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的结合蛋白(例如抗体)，其中所述CD154结合蛋白或抗体含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的VH序列，或由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的VH序列构成。在某些其他实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的结合蛋白(例如抗体)，其中所述CD154结合蛋白或抗体含选自SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的重链序列，或由选自SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的重链序列构成。 
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的结合蛋白(例如抗体)，其中所述CD154结合蛋白或抗体含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14的VL序列，或由选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14的VL序列构成。在某些实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的结合蛋白(例如抗体)，其中所述CD154结合蛋白或抗体含SEQ ID NO：15的轻链序列，或由SEQ ID NO：15的轻链序列构成。 
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的结合蛋白(例如抗体)，其中所述CD154结合蛋白或抗体含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14的VL序列以及选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的VH序列，或由选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14的VL序列以及选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的VH序列构成。在某些实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的结合蛋白(例如抗体)，其中所述CD154结合蛋白或抗体含SEQID NO：15的轻链序列以及选自SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的重链序列，或由SEQ ID NO：15的轻链序列以及选自SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的重链序列构成。在其他实施方案中，CD154结合蛋白或抗体含SEQ ID NO：15的轻链序列和SEQ ID NO：13的 重链序列，或由SEQ ID NO：15的轻链序列和SEQ ID NO：13的重链序列构成。 
在其他实施方案中，本发明涉及如下结合蛋白(例如抗体)：其特异性结合CD154，并且含一个以上的如下重链(H)CDR序列或由一个以上的如下重链(H)CDR序列构成，所述序列选自CDR-H1(SEQ ID NO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQ ID NO：44)。在进一步实施方案中，结合蛋白或抗体含选自CDR-H1(SEQ ID NO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQ ID NO：44)中的至少2个CDR，或由选自CDR-H1(SEQ IDNO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQ ID NO：44)中的至少2个CDR构成。在更进一步实施方案中，结合蛋白或抗体含所有3个如下CDR H序列或由所有3个如下CDR H序列构成，所述序列是CDR-H1(SEQ ID NO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQ ID NO：44)。 
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的结合蛋白(例如抗体)，其中所述结合蛋白或抗体含一个以上的如下CDR轻链(L)序列或由一个以上的如下CDR轻链(L)序列构成，所述序列选自CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46)和CDR-L3(SEQ ID NO：47)。在进一步实施方案中，结合蛋白或抗体含选自CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46)和CDR-L3(SEQ ID NO：47)中的至少2个CDR，或由选自CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46)和CDR-L3(SEQ ID NO：47)中的至少2个CDR构成。在更进一步实施方案中，结合蛋白或抗体含所有3个如下CDR L序列或由所有3个如下CDR L序列构成，所述序列是CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46)和CDR-L3(SEQ ID NO：47)。 
在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白或抗CD154抗体分别含如下互补序列，所述互补序列含上述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中一个以上的轻链CDR，或由上述CDR-L1、 CDR-L2和CDR-L3中一个以上的轻链CDR构成；或如下互补序列，所述互补序列含上述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中一个以上的重链CDR，或由上述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中一个以上的重链CDR构成。因此，在某些实施方案中，本发明的结合蛋白或抗体含CDR-H1(SEQ ID NO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)或CDR-H3(SEQ ID NO：44)和CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQID NO：46)或CDR-L3(SEQ ID NO：47)，或由CDR-H1(SEQ IDNO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)或CDR-H3(SEQ ID NO：44)和CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46)或CDR-L3(SEQ ID NO：47)构成。 
在某些实施方案中，本发明提供CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，其中结合蛋白或抗体含如下3个CDR L序列或由如下3个CDR L序列构成：CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46)和CDR-L3(SEQ ID NO：47)，并且其中结合蛋白或抗体进一步含如下3个CDR H序列或由如下3个CDR H序列构成：CDR-H1(SEQ ID NO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQ ID NO：44)。 
在进一步实施方案中，本发明提供结合蛋白(例如抗体)：其特异性结合CD154，并且含SEQ ID NO：54的可变轻链(VL)序列或由SEQ ID NO：54的可变轻链(VL)序列构成。本发明还涉及CD154结合蛋白或抗CD154抗体，其含SEQ ID NO：56的可变重链(VH)序列或由SEQ ID NO：56的可变重链(VH)序列构成。在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白或抗CD154抗体可含SEQID NO：54的VL序列和SEQ ID NO：56的VH序列，或由SEQ ID NO：54的VL序列和SEQ ID NO：56的VH序列构成。 
在其他实施方案中，本发明涉及特异性结合CD154的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，其中所述CD154结合蛋白或抗CD154抗体含一个以上的如下重链(H)CDR序列或由一个以上的如下重链(H)CDR序列构成，所述序列选自CDR-H1(SEQ ID NO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQ ID NO：50)。在进一步实施方案中，CD154结合蛋白或抗CD154抗体含选自CDR-H1(SEQ ID NO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQ ID NO：50)中的至少2个CDR，或由选自CDR-H1(SEQ IDNO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQ ID NO：50)中的至少2个CDR构成。在更进一步实施方案中，CD154结合蛋白或抗CD154抗体含所有3个如下CDR H序列或由所有3个如下CDR H序列构成，所述序列是CDR-H1(SEQ ID NO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQ ID NO：50)。 
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，其中所述CD154结合蛋白或抗CD154抗体含一个以上的如下CDR轻链(L)序列或由一个以上的如下CDR轻链(L)序列构成，所述序列选自CDR-L1(SEQID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQ ID NO：53)。在进一步实施方案中，CD154结合蛋白或抗CD154抗体含选自CDR-L1(SEQ ID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQ ID NO：53)中的至少2个CDR，或由选自CDR-L1(SEQ ID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQID NO：53)中的至少2个CDR构成。在更进一步实施方案中，CD154结合蛋白或抗CD154抗体含所有3个如下CDR L序列或由所有3个如下CDR L序列构成，所述序列是CDR-L1(SEQ ID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQ ID NO：53)。 
在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)含如下互补序列，所述互补序列分别含上述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中一个以上的轻链CDR，或由上述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中一个以上的轻链CDR构成；或如下互补序列，所述互补序列分别含上述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中一个以上的重链CDR，或由上述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中一个以上的重链CDR构成。因此，在某些实施方案中，本发明的抗体含选自 CDR-H1(SEQ ID NO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQ ID NO：50)的CDR H，或选自CDR-L1(SEQ ID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQ ID NO：53)的CDR L，或者由选自CDR-H1(SEQ ID NO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQ ID NO：50)的CDR H，或选自CDR-L1(SEQID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQ ID NO：53)的CDR L构成。 
在某些实施方案中，本发明提供CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，其中所述CD154结合蛋白或抗CD154抗体含所有3个如下CDR L序列或由所有3个如下CDR L序列构成，所述序列是CDR-L1(SEQ ID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQ ID NO：53)，并且其中结合蛋白(例如抗体)进一步含所有3个如下CDR H序列或由所有3个如下CDR H序列构成，所述序列是CDR-H1(SEQ ID NO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQ ID NO：50)。 
在进一步实施方案中，本发明提供特异性结合CD154的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，其中所述CD154结合蛋白或抗CD154抗体含SEQ ID NO：58的VL序列或由SEQ ID NO：58的VL序列构成。在另外的实施方案中，抗体含SEQ ID NO：60的VH序列或由SEQ ID NO：60的VH序列构成。在进一步实施方案中，抗体含SEQ ID NO：60的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列，或由SEQ ID NO：60的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列构成。 
在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白含SEQ IDNO：62的轻链序列和SEQ ID NO：65的重链序列。在其他实施方案中，本发明的CD154结合蛋白含SEQ ID NO：63的轻链序列和SEQID NO：66的重链序列。 
在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白含SEQ IDNO：68的轻链序列和SEQ ID NO：71的重链序列。在其他实施方案中，本发明的CD154结合蛋白含SEQ ID NO：69的轻链序列和SEQ ID NO：72的重链序列。在其他实施方案中，CD154结合蛋白含SEQID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72中的至少一个序列。 
SEQ ID NO：3-8的CDR序列源自大鼠单克隆抗体342。在本发明的一个备选实施方案中，抗CD154抗体是含SEQ ID NO：29的VH结构域序列和SEQ ID NO：30的VL结构域序列的大鼠342抗体。本发明还提供分离的、重组的或合成的DNA分子，其含选自SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32中的至少一个序列，或由选自SEQID NO：31和SEQ ID NO：32中的至少一个序列构成。另外提供含选自SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34中的至少一个序列的载体。 
本发明还提供CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，其与本文公开的任一个抗CD154抗体(例如，342、381和338抗体及其表位结合序列)选择性结合相同表位。尤其是如本文所述当在与抗CD154抗体5c8的竞争测定法中用作第一抗体或第二抗体时，本发明的抗体342和338显示出相似的CD154结合性质。 
因此，在某些实施方案中，本发明提供如下CD154结合蛋白和抗CD154抗体，其与如下人源化抗体结合相同表位，所述人源化抗体含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的重链序列，并且含SEQID NO：15的轻链序列(342Fab和Fab’片段)，并且如本文所述当在与抗CD154抗体5c8的竞争测定法中用作第一抗体或第二抗体时，其显示出相似的CD154结合性质。在其他实施方案中，本发明提供如下CD154结合蛋白和抗CD154抗体，其与如下人源化抗体结合相同表位，所述人源化抗体含SEQ ID NO：58的VL结构域序列和SEQ IDNO：60的VH结构域序列(338抗体可变序列)，并且如本文所述在与抗CD154抗体5c8的竞争测定法中显示出相似的CD154结合性质。 
在涉及本发明的CD154结合蛋白的任何上述实施方案中，结合蛋白可经PEG化。在CD154结合蛋白是抗CD154抗体、抗体多肽或其片段或衍生物的实施方案中，其中抗体可在重链、轻链或两条链上经PEG化。 
本发明还提供分离的、重组的和/或合成的DNA分子，其含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ IDNO：25中的至少一个序列，或由选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：25中的至少一个序列构成。 
在某些实施方案中，本发明还提供分离的、重组的和/或合成的DNA分子，其含选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：73中的至少一个序列，或由选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：73中的至少一个序列构成。 
在其他实施方案中，本发明提供分离的、重组的和/或合成的DNA分子，其含选自SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：41中的至少一个序列，或由选自SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：41中的至少一个序列构成。 
本发明还提供含本发明的分离的、重组的和/或合成的DNA分子中的任一种的载体。在一个实施方案中，载体含选自SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQID NO：41中的至少一个序列。 
在另外的实施方案中，本发明提供分离的、重组的和/或合成的DNA分子，其含选自SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：57中的至少一个序列，或由选自SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：57中的至少一个序列构成。在一些实施方案中，本发明提供分离的、重组的和/或合成的DNA分子，其含SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：57，或由SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：57构成。 
在另外的实施方案中，本发明提供分离的、重组的和/或合成的DNA分子，其含选自SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61中的至少一个序列，或由选自SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61中的 至少一个序列构成。在一些实施方案中，本发明提供分离的、重组的和/或合成的DNA分子，其含SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61，或由SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61构成。 
如本文其他处所述，在本发明涉及含参与效应子功能的序列的CD154结合蛋白和抗CD154抗体的任何实施方案中，所述结合蛋白或抗CD154抗体可另外经选择或改造，以引发与具有Fc区的抗CD154抗体相比减少的效应子功能。例如，可在本发明中选用如下CD154结合蛋白和抗CD154抗体：其无Fc区或恒定区序列，或缺乏功能Fc区或恒定区序列。 
在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白和抗CD154抗体对于与CD154结合是单价的，并且优选当施用于受试者时，相对于可比较的CD154结合蛋白(例如二价抗CD154抗体)，引发减少的效应子功能。 
在某些其他实施方案中，如果Fc或恒定区序列存在于CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)多肽中时，则可对所述Fc或恒定区序列进行选择或改造，以含一种以上的修饰(例如，氨基酸置换、插入、加合或缺失)，相对于含天然、亲本或未经修饰的Fc或恒定区序列的对照抗CD154抗体，所述修饰减少或消除一种以上的效应子功能。 
在本发明的一些实施方案中，Fc区(当存在时)是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的Fc区，或者源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，可使用嫁接(hybrid)Fc区，即IgG1/IgG4嫁接Fc序列。在具体实施方案中，Fc区含IgG4Fc序列或源自IgG4抗体。应知可根据本发明在减少一种以上的效应子功能的不同Fc区之间使用任意嫁接组合。 
如本文进一步描述，在某些其他实施方案中，抗体的Fc部分的糖基化经减少或消除，或抗体的糖基化特征被改变。在某些实施方案中，CD154结合蛋白或抗CD154抗体多肽含具有Fc区的CH2结构域，所述Fc区具有在保守的N联糖基化位点处或附近修饰。在 保守的N联糖基化位点处的修饰可含在重链糖基化位点中或附近的突变，其中突变减少、改变或阻止在该位点处的糖基化，在进一步实施方案中，修饰含突变N298Q(使用EU Kabat编号的N297)。在某些实施方案中，修饰含CH2结构域聚糖或其部分的去除。在某些备选实施方案中，修饰阻止在糖基化位点处的成熟N-聚糖的形成。 
在一些实施方案中，本发明涉及CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，其含选自SEQ ID NO：5、44和50的重链CDR3序列，和变体Fc区，所述变体Fc区含第一个氨基酸残基和N糖基化位点，所述第一个氨基酸残基经侧链化学作用或氨基酸置换修饰，以达到与未经修饰的第一个氨基酸残基相比增加的空间位阻或增加的静电电荷，从而减少在N糖基化位点处的糖基化水平或以其他方式改变在N糖基化位点处的糖基化。在某些这些实施方案中，与对照、非变体Fc区相比，变体Fc区赋予减少的效应子功能。 
在某些实施方案中，本发明涉及CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，其含选自SEQ ID NO：5、44和50的重链CDR3序列，和变体Fc区，所述变体Fc区含第一个氨基酸残基和N糖基化位点，所述第一个氨基酸残基含半胱氨酸硫醇，从而减少在N糖基化位点处的糖基化水平或改变在N糖基化位点处的糖基化，其中变体Fc区赋予减少的效应子功能。 
在某些实施方案中，上述含变体Fc区的抗CD154抗体的第一个氨基酸残基和N糖基化位点在N联糖基化基序附近或其内。在进一步实施方案中，N联糖基化基序含氨基酸序列NXT或NXS。在某些实施方案中，N联糖基化基序含氨基酸序列NXT。在某些实施方案中，N糖基化位点位于根据Kabat编号系统的氨基酸297处。在另外的实施方案中，经修饰的第一个氨基酸残基是根据Kabat编号系统的氨基酸299。 
在某些上述实施方案中，由任一种含本文所述结合蛋白的抗体或抗体片段显示出的减少的效应子功能是与Fc受体(FcR)减少的结合。在某些实施方案中，Fc受体(FcR)选自FcγRI、FcγRII和 FcγRIII，及其一种以上的亚型，例如FcγRIIa。在一些实施方案中，FcR结合减少至少约1.5倍以上、约2倍以上、约3倍以上、约4倍以上、约5倍以上、约6倍以上、约7倍以上、约8倍以上、约9倍以上、约10倍以上、约15倍以上、约50倍以上、或约100倍以上。 
在某些实施方案中，如本文所述具有一种以上的减少的效应子功能的本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)不与特定效应子受体或效应子受体亚型结合。在某些这些实施方案中，CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)不与FcγRIIa结合。 
在某些实施方案中，由本文所述任一种抗体显示出的减少的效应子功能是与补体蛋白减少的结合。在一些实施方案中，补体蛋白是C1q。在某些实施方案中，与补体蛋白的结合减少约1.5倍以上、约2倍以上、约3倍以上、约4倍以上、约5倍以上、约6倍以上、约7倍以上、约8倍以上、约9倍以上、约10倍以上、约15倍以上。 
在本发明的进一步实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)含在Fc区中的一种以上的修饰或变化，是未糖基化的，并且当施用于受试者时，引发一种以上的减少的效应子功能。 
在某些实施方案中，当施用于受试者时，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)引起相比抗CD154抗体5c8的施用更少的血栓栓塞效应。 
在本发明的某些实施方案中，上述含变体Fc区的CD154结合蛋白或抗CD154抗体的经修饰的第一个氨基酸残基与功能部分连接。在进一步实施方案中，功能部分是阻断部分、可检测部分、诊断部分或治疗部分、或其组合。在某些实施方案中，阻断部分可为例如半胱氨酸加合物、混合的二硫化物、聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方案中，可检测部分可为例如荧光部分、发光部分或同位素部分。使用了诊断部分的实施方案中，诊断部分可能能够揭示病状、疾病或病症的存在。在其他实施方案中，可使用治疗部分，例如抗炎剂、抗癌剂、抗神经变性剂、对于除CD154外的分子选择的抗 体、或抗感染剂。 
在本发明的某些实施方案中，CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)含经修饰的氨基酸残基，该修饰允许蛋白或抗体与功能部分的定点缀合，例如用于定点聚乙二醇化。在某些实施方案中，经修饰的氨基酸残基是经半胱氨酸或混合的二硫化物加合物修饰的半胱氨酸残基。因此，在某些实施方案中，CD154结合蛋白是在经修饰的氨基酸残基(例如在半胱氨酸或赖氨酸残基)处聚乙二醇化的抗CD154抗体多肽。在某些实施方案中，抗CD154抗体是用PEG-马来酰亚胺聚乙二醇化的Fab或Fab’片段。 
本发明还提供编码本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)的核酸，例如DNA序列。本发明的DNA序列可含例如通过化学处理产生的合成DNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。本发明进一步提供含本发明的一种以上的核酸(例如DNA序列)的克隆或表达载体。在一些实施方案中，本发明还涉及含上述任何合成的、分离的和/或重组的核酸的载体。 
本发明还提供含本发明的DNA序列或载体的宿主细胞。在某些方面，本发明涉及用于产生CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)的方法，其包括在适合于由宿主细胞产生CD154结合蛋白或抗CD154抗体的条件下，培养含上述任何载体的宿主细胞。在一些实施方案中，该方法包括从宿主细胞培养物中回收CD154结合蛋白或抗CD154抗体。 
在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白、抗CD154抗体或核酸经可检测标记进行标记，所述可检测标记可为放射性同位素、酶、染料或生物素。在某些其他实施方案中，本发明的抗体与至少一种其他治疗剂缀合，所述治疗剂可为放射性同位素、放射性核酸、毒素、类毒素、非CD154特异性抗体多肽或片段(即，产生双特异性或多特异性抗体的)、或例如化学治疗剂。在另外其他的实施方案中，本发明的抗体与可为标记部分的显像剂缀合。标记剂可为生物素、荧光或发光部分、放射性部分、组氨酸标签或肽标签。 
本发明还涉及本文所述CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)、以及编码其的核酸序列的序列变体。本发明的序列变体优选与本发明的多肽或编码其的核酸序列享有至少90％、91％、92％、93％或94％同一性。序列变体在氨基酸或核酸水平上更优选享有至少95％、96％、97％或98％同一性。序列变体与本发明的多肽或编码其的核酸序列最优选享有至少99％、99.5％、99.9％或更多同一性。 
因此，本发明提供含如下序列的分离蛋白，所述序列与下述序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的同一性：SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72。 
在某些实施方案中，本发明的嵌合、人源化或人抗CD154抗体多肽是例如dAb、Fab、Fab’、scFv、Fv、二硫键合的Fv，或含单免疫球蛋白可变结构域，例如VH或VL结构域，其对于CD154结合特异且是单价的。本发明的某些CD154结合蛋白(例如嵌合、人源化或人抗CD154抗体)多肽含本发明的1个、2个或更多本发明的CDR和备选的支架或通用构架序列。在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白和抗CD154抗体含选自可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单可变结构域。 
本发明还提供CD154结合蛋白(例如嵌合、人源化或人抗CD154抗体)多肽，其对于与CD154结合是单价的，所述CD154 与功能部分缀合，相对于缺乏功能部分的相同多肽，所述功能部分增加其体内半衰期。在某些实施方案中，功能部分含聚乙二醇或由聚乙二醇构成。在某些实施方案中，功能部分含白蛋白分子或由白蛋白分子构成，所述白蛋白分子例如人血清白蛋白。因此，本发明提供PEG连接的CD154结合蛋白(例如PEG连接的嵌合、人源化或人抗CD154抗体)多肽，其与CD154特异性且单价结合，并且相对于缺乏连接的聚乙二醇的相同多肽具有增加的体内半衰期。 
本发明还提供含本发明的至少一种CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)的药物组合物，在一些实施方案中，其可进一步含药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可任选地进一步含另外的生物活性剂或治疗剂(例如免疫抑制或免疫调节化合物或制剂)；或诊断剂。在某些实施方案中，组合物含治疗有效量的本文所述的聚乙二醇化的、抗CD154Fab’抗体，其具有抗CD154抗体342或338的表位特异性。 
本发明进一步提供用于治疗或预防完全或部分由CD40信号转导的人病状、病症、疾病或任何前述的症状的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物含本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，从而使得达到病状、疾病或病症的治疗或预防。 
本发明还提供用于抑制或预防完全或部分由CD40信号转导的一种以上的免疫、自身免疫或炎症应答，或任何前述的症状的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物含本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，从而使得达到治疗或预防应答。在某些实施方案中，该方法用于治疗呈现全身性红斑狼疮(SLE)的体征或诊断出具有全身性红斑狼疮(SLE)的受试者。在其他实施方案中，该方法用于治疗呈现类风湿性病状的体征或诊断出具有类风湿性病状的受试者，所述类风湿性病状例如类风湿性关节炎(RA)。 
本发明提供对于与CD154结合单价的人抗体多肽。在某 些实施方案中，对于与CD154结合单价的人抗体多肽，当基于其结合亲和力以用于CD154结合的饱和浓度存在或超过用于CD154结合的饱和浓度存在时，当首先加入CD154中时，能够阻断抗体5c8与CD154的结合，并且当在加入抗体5c8后加入时，取代与CD154结合的抗体5c8。在某些实施方案中，人抗体多肽是PEG连接的。在某些实施方案中，人抗体多肽无Fc结构域。在某些上述实施方案中，CD154结合蛋白或人抗体多肽不取代与CD40结合的CD154。 
在某些实施方案中，本发明提供对于CD154结合单价的聚乙二醇化的抗CD154Fab’抗体，并且进一步提供用于治疗或预防关节炎(例如类风湿性关节炎)或全身性红斑狼疮(SLE)中一种以上的症状的方法，其包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物含聚乙二醇化的、抗CD154Fab’抗体，从而使得达到治疗或预防应答。 
附图简述
图1是显示抗CD154抗体342、381和338的互补决定区(CDR)的氨基酸序列的表。 
图2是显示大鼠抗CD154抗体342的VH和VL结构域的氨基酸和相应核苷酸序列的表。加有下划线的序列相应于编码前导(即信号)肽的核苷酸序列。 
图3是显示用于产生实施例中的人源化抗CD154抗体的人受体构架的氨基酸和相应核苷酸序列的表。 
图4是显示已将342CDR移植到图3中所示的构架内的VH和VL结构域的氨基酸和相应核苷酸序列的表。 
图5是显示抗体342的VH结构域(VH3gH1和VH4gH1)的氨基酸和相应核苷酸序列的表，其中342CDR已被移植到人受体构架内，并且其中某些关键供体残基被保留。 
图6是显示抗体342的VL结构域(VK1gL4)的氨基酸和相应核苷酸序列的表，其中342CDR已被移植到人受体构架内，并且其中某些关键供体残基被保留。
图7是显示抗体342的完整轻链(可变和恒定轻链区)和重链区的序列。相应于信号/前导肽的序列加有下划线。 
图8显示用于制备Fab(SEQ ID NO：28)和Fab’(SEQID NO：41)形式的移植物342gL4gH1的表达插入物的核苷酸序列。信号/前导序列加有下划线，并且限制位点(用于如实施例2中所述克隆到大肠杆菌(E.coli)表达载体内)用大写字母书写、且以粗体显示。 
图9显示大鼠342抗CD154抗体(供体)氨基酸序列的轻链和重链与在342抗体的人源化中使用的人种系(受体)构架的比对。“轻342”是大鼠VL结构域序列。“重342”是大鼠VH结构域序列。CDR残基以粗体显示且加有下划线。显示了受体构架轻((211O12；SEQ ID NO：35)和重(1-13-66；SEQ ID NO：37和1-14-59；SEQID NO：39)链。也显示了仅移植到人种系受体构架的CDR(VK1gL3、VH3gH7和VH4gH6)。在某些人源化重链和轻链中，342抗体的供体残基保留在构架区内，并且这些关键供体构架残基以粗斜体显示且突出显示。VK1gL4供体内容物是R38、Y71和S85。VH3gH1供体内容物是V24、M48、G49、T73和V78。VH4gH1供体内容物是M48、R71和V78。显示了轻链的SEQ ID NO，从上至下依次是SEQ ID NO：30(″342″)、SEQ ID NO：35(″211O12″)、SEQ ID NO：14(″342gL3″)和SEQ ID NO：2(″342gL4″)。显示了关于重链的SEQ ID NO(VH3移植物)，从上至下依次是SEQ ID NO：29(″342″)、SEQ ID NO：37(″1-13-66″)、SEQID NO：10(″342gH7″)和SEQ ID NO：1(″342gH1″)。显示了重链的SEQ ID NO(VH4移植物)，从上至下依次是SEQID NO：29(″342″)、SEQ ID NO：39(″1-14-59″)、SEQ ID NO：9的变体(″VH4gH6″(SEQ ID NO：74))和SEQ ID NO：11的变体(″VH4gH1″(SEQ ID NO：75))。显示于图9中的SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11变体始于氨基酸″E″(代替分别如在图4和5中的″Q″)，用于在大肠杆菌中表达。因此，相应于这些变体SEQ ID NO：9和11的核苷酸序列不同于SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21中所示的核苷酸序列，因为它们始于核苷酸″g″而不是″c″。 
图10显示抗CD154抗体381的VL和VH氨基酸以及相应核苷酸序列。CDR氨基酸序列加有下划线。 
图11显示抗CD154抗体338的VL和VH氨基酸以及相应核苷酸序列。CDR氨基酸序列加有下划线。 
图12是列出通过选择淋巴细胞抗体方法(SLAM)分离的大鼠抗人CD154抗体的表。该表显示用这些抗体在 
Figure 203224DEST_PATH_G2008800093615D00221
CD40结合测定法和ICAM-1上调测定法中获得的Kd和IC50值。用抗体342获得的数据是突出显示的。 
图13显示无糖基化抗CD154抗体hu5c8(hu5c8aglyP-huIgG4)的κ轻链氨基酸和相应核苷酸序列。 
图14显示无糖基化抗CD154抗体hu5c8(hu5c8aglyP-huIgG4)的重链氨基酸和相应核苷酸序列。为赋予变体无糖基化(在Kabat EU命名法中的S228P/T299A；残基226和297)进行的突变在成熟蛋白序列中显示为有下划线和粗体的。 
图15显示无糖基化抗CD154抗体hu342(hu342aglyP-huIgG4)的κ轻链氨基酸和相应核苷酸序列。 
图16显示无糖基化抗CD154抗体hu342(hu342aglyP-huIgG4)的重链氨基酸和相应核苷酸序列。为赋予变体无糖基化(在Kabat EU命名法中的S228P/T299A；残基226和297)进行的突变在成熟蛋白序列中显示为有下划线和粗体的。 
图17显示了示例性Fab’片段和显示抗CD154抗体的Fab’片段的位点特异性PEG化的凝胶。通过使PEG-马来酰亚胺与在铰链处的单个半胱氨酸残基反应而将Fab’聚乙二醇化。 
图18是显示人源化342gL4gH1抗体(包括Fab’片段和抗体-PEG缀合物)的不同实施方案，在 
Figure 982961DEST_PATH_G2008800093615D00222
CD40结合测定法、 ICAM-1上调测定法和CD40L竞争结合测定法中获得的Kd和IC50值的表。 
图19显示在接受盐水对照或各种剂量的抗CD154抗体的食蟹猴中作为时间函数的抗TT(破伤风类毒素)IgG滴度值的2个坐标图。上坐标图显示在抗体处理和TT攻击(初次免疫应答)后第0-20天的IgG滴度值，而下坐标图显示在抗体处理后和在第30天时的第二次TT攻击后第30-50天的值。 
图20是在接受单剂量(hu5c8、无糖基化5c8和无糖基化34220为mg/kg，而342Fab’-PEG和342DFM-PEG为40mg/kg)的各种形式的抗CD154抗体的食蟹猴中作为时间函数的抗TT(破伤风类毒素)IgG滴度值的坐标图。DFM-PEG是其中2个Fab’片段由PEG化的二马来酰亚胺桥交联的抗体片段。 
图21是在接受盐水对照或各种剂量的抗CD154抗体的食蟹猴中作为时间函数的抗TT(破伤风类毒素)IgG滴度值的坐标图。该坐标图显示在用TT攻击(初次免疫应答)后第0-20天的IgM滴度值。 
图22是比较342Fab’-PEG抗体和hu5c8抗体在食蟹猴中的药代动力学的坐标图。 
图23显示经标记的342Fab’与表达CD154的D 1.1Jurkat细胞结合的交叉阻断的流式细胞术分析结果，所述D 1.1Jurkat细胞与未标记的第一种抗CD154Fab’预结合，如每个小图(23A-A33；23B-338；23C-402；23D-381；23E-300；23F-294；23G-335；23H-303)中显示(参见实施例9)。A33是同种型匹配的对照抗体且确认不存在非特异性交叉阻断。 
图24显示经标记的Hu5c8Fab’与表达CD154的D 1.1Jurkat细胞的交叉阻断的流式细胞术分析结构，所述D 1.1Jurkat细胞与未标记的第一种抗CD154Fab’预先结合，如每个小图(24A-338；24B-402；24C-381；24D-303；24E-335；24F-300；24G-294；24H-A33)中显示(参见实施例9)。A33是同种型匹配的对照抗体且确认不存在非特异性交叉阻断。
图25A-F显示各种形式的342和Hu5c8抗体与可溶性CD154蛋白(ECD)或CD4O：CD154复合物的竞争结合的 
Figure 191220DEST_PATH_G60628222150131000D000021
分析结果。FL-全长。CD40hFc-人CD40融合蛋白。 
图26是显示实施例11中所述用Hu5c8抗CD154抗体、342Fab’-PEG抗CD154抗体和对照抗体进行的血小板凝集测定法(测定法1)结果的坐标图。第一个小图显示用由完整IgG形成的CD40L复合物获得的结果，而第二个小图显示用Fab’-PEG或二Fab’-PEG形成的复合物。第三个小图显示用三Fab’-PEG和无糖基化抗CD154抗体hu342获得的结果。 
图27是显示实施例11中所述用阳性和阴性对照抗体进行的血小板凝集测定法(测定法2)结果的坐标图。结果证实血小板凝集通过阳性对照抗CD154抗体和重组人可溶性CD40L(sCD154)的复合物特异性增强。 
图28显示人(SEQ ID NO：76)和小鼠(SEQ ID NO：77)可溶性CD40L氨基酸序列的序列比对。人和小鼠序列之间的差异以红色指出。Hu5c8表位序列以蓝色指出。内部残基用″|″标记。选择将人残基引入可溶性小鼠CD40L内的序列的6个区域(1-6)。 
图29显示竞争ELISA测定法结果，以证实342Fab’和hu5c8Fab’的交叉阻断(参见实施例14)。图29A显示生物素342Fab’在CD154上的滴定结果。1nM浓度在曲线的线性部分上。图29B显示生物素hu5c8Fab’在CD154上的滴定结果。0.3nM浓度在曲线的线性部分上。图29C显示生物素342和生物素5c8由未标记的342Fab’的交叉阻断。ch342Fab是嵌合342Fab’。图29D显示生物素342由未标记的5c8Fab’的交叉阻断。 
发明详述
为了可更充分理解本文所述本发明，提供以下详述。除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。以下描述示例性方法和材料，尽管与本文所述方法和材料相似或等价的方法和材料也可在本发明的实践中使用，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。 
本申请自始至终，提及各种专利、出版物和参考文献。这些专利、出版物和参考文献的公开内容通过引用整体并入本文。 
本领域技术人员已知的阐述重组DNA技术的一般原则的标准参考文献著作包括Ausubel et al.，Current Protocols In MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York(1998and Supplements to2001)；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2dEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York(1989)；Kaufman et al.，Eds.，Handbook Of Molecular And CellularMethods In Biology And Medicine，CRC Press，Boca Raton(1995)；McPherson，Ed.，Directed Mutagenesis：A Practical Approach，IRLPress，Oxford(1991)。 
本领域技术人员已知的阐述免疫学的一般原则的标准参考文献著作包括：Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1999)；和Roitt et al.，Immunology，3d Ed.，Mosby-Year BookEurope Limited，London(1993)。本领域技术人员已知的阐述医学生理学和药理学的一般原则的标准参考文献著作包括：Fauci et al.，Eds.，Harrison’s Principles Of Internal Medicine，14th Ed.，McGraw-HillCompanies，Inc.(1998)。 
定义
本文所述术语“CD154结合蛋白”包括与CD154特异性结合或拮抗CD154的任何分子(包括抗体)。因此，本文所述抗CD154抗体是一类CD154特异性结合蛋白。本发明的CD154结合蛋白可含如本文公开的至少1个、优选2个、3个或更多CDR。CD154结合蛋白或其他此CD154拮抗剂可含并非常规抗体片段或衍生物，但含赋予CD154表位结合特异性的氨基酸序列和/或化学结构的种类。此CD154 拮抗剂可例如由备选支架制成(参见例如，Binz et al.，2005Nat Biotech23：1257-1268和Hosse et al.，2006Protein Science 15：14-27)。此CD154结合蛋白或拮抗剂可与功能上缺陷的抗体Fc区或与如本文所述异源功能部分融合，以改善CD154结合蛋白的半衰期和/或其他体内性质。 
CD154结合蛋白可含掺入生物相容性构架结构内的本文所述至少一个CDR。在一个例子中，生物相容性构架结构含足以形成构象上稳定的结构支持物、或构架、或支架的多肽或其部分，其能够显示与局限性表面区域中的抗原(例如，CDR、可变结构域等)结合的氨基酸的一种以上的序列。此结构可为天然存在的多肽或多肽“折叠”(结构基序)，或可相对于天然存在的多肽或折叠具有一种以上的修饰，(例如氨基酸添加、删除或置换)。这些支架可源自任何物种(或超过一个物种)(例如人、其他哺乳动物、其他脊椎动物、无脊椎动物、植物、细菌或病毒)的多肽。 
一般情况下，生物相容性构架结构基于除免疫球蛋白结构域外的蛋白支架或骨架。例如，可使用基于纤连蛋白、锚蛋白、脂质运载蛋白、新制癌菌素(neocarzinostain)、细胞色素b、CPl锌指、PSTl、卷曲螺旋、LACI-Dl、Z结构域和tendramisat结构域的生物相容性构架结构(参见例如，Nygren和Uhlen，1997，Current Opinionin Structural Biology，7，463-469)。 
如本文就本发明而言所使用的术语“抗体”包括分离的、重组的或合成的抗体、抗体缀合物或抗体衍生物。术语“抗体”通常意欲包括抗体片段(包括抗原结合片段)，除非上下文另有说明或理解。抗原结合片段与完整抗体竞争特异性结合。一般参见，FundamentalImmunology，第7章(Paul，W.，编辑，第2版.Raven Press，N.Y.(1989))。抗原结合片段可通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。在一些实施方案中，抗原结合片段包括Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、Fd、Fv、结构域抗体(dAb)、其他单价和二价片段、互补决定区(CDR)片段、单链抗 体(例如scFv、scFab和scFabΔC)、嵌合抗体、双抗体、三抗体、小型抗体、纳米抗体、和含足以赋予与多肽特异性抗原结合的至少部分抗体的多肽；以及前述的融合物和衍生物。参见例如，Holliger和Hudson，Nature Biotechnology 23：1126-1136(2005)和Hust et al.，BMC Biotech 7：14(2007)。 
“Fd片段”是由VH和CH1结构域构成的抗体片段；“Fv片段”由抗体单臂的VL和VH结构域构成；“scFv片段”是含通过肽接头连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的单链抗体；“scFab片段”是含难以通过肽接头与轻链连接的片段(Fd)的单链抗体；“scFabΔC”片段是无半胱氨酸的scFab变体(参见例如上述Hust等人的文章)；和“dAb片段”(单结构域抗体)含单个可变结构域(例如VH或VL结构域)(Ward et al.，Nature 341：544-546(1989))。此外，还包括了双抗体和三抗体。本发明的双抗体和三抗体包括例如同二聚和异二聚的双抗体以及三抗体。例如，在某些实施方案中，构成三抗体的可变结构域可与3个不同表位或相同表位结合。 
除非上下文另有说明或另有提示，本发明的“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段、抗体衍生物或可含一种以上的修饰(例如，氨基酸插入、删除、置换、翻译后修饰或其缺失等)的变体，包括抗体缀合物(即，与功能部分缀合或结合的抗体或其抗原结合片段)。抗体衍生物(包括抗体缀合物)可基于本发明的抗原结合片段或可含本发明的抗原结合片段，所述本发明的抗原结合片段特异性结合CD154。此外，上述抗体实施方案可为鼠类、仓鼠、山羊、兔、嵌合、人源化、或全人抗体、片段、衍生物或缀合物。应当理解在本发明的某些方面，术语“抗体”可排除上述一个以上的抗体实施方案；此条件对于技术人员将是显而易见的。 
术语“聚乙二醇化”、“聚乙二醇”或“PEG”包括聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，连同或不连同偶联剂或者用偶联或活化部分(例如用硫醇、三氟甲磺酸盐(triflate)、三氟乙磺酸盐(tresylate)、氮丙啶、环氧乙烷，或优选用马来酰亚胺部分(例如PEG-马来酰亚 胺))的衍生化。其他合适的聚亚烷基二醇化合物包括但不限于，马来酰亚胺单甲氧基PEG、活化PEG聚丙二醇、以及下述类型的带电或中性聚合物：右旋糖、多聚乙酰神经氨酸、或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物、以及生物素和其他亲和剂衍生物。 
术语“效应子功能”指抗体的Fc或恒定区与蛋白和/或免疫系统的细胞结合的功能性能力。具有减少的效应子功能的抗体和用于改造此抗体的方法是本领域众所周知的(参见例如，WO 05/18572、WO 05/03175和US 6,242,195)，并且在本文中进一步详细描述。一般的效应子功能包括结合补体蛋白(例如，补体蛋白C1q)和/或Fc受体(FcR)(例如，FcγRI、FcγRII、FcγRIIa、FcγRIII和/或FcγRIIIb)的能力。能够与一种以上上述分子结合的功能结果包括但不限于，调理作用、噬菌作用、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或效应子细胞调节。效应子功能减少指至少部分通过Fc与其同源受体结合或与补体蛋白或效应细胞结合诱导的一种以上的生物化学或细胞活性减少，同时维持抗体(或其片段)可变区的抗原结合活性，即使伴随减少的、相似的、相同的还是增加的结合亲和力。本发明的具体抗体显示出减少的效应子功能。效应子功能(例如Fc与Fc受体或补体蛋白结合的减少，可以减少倍数(例如，减少1.5倍、2倍等)表示，并且可基于例如使用本领域已知的结合测定法测定的结合活性的减少百分比进行计算(参见例如，WO 05/18572)。 
除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。 
本说明书和权利要求自始至终，单词“含”应当理解为默认包括所言整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。 
CD154
CD154在本领域中通过几种其他名称已知，例如CD40配体(CD40L)、CD40反受体(CD40CR)、gp39、T-BAM、T细胞活化分子、TRAF、TNF相关活化蛋白(TRAP)、和肿瘤坏死因子配体超家族成员(TNFSF5)(Gauchat et al.，1993FEBS Lett.315： 259-266；Graf et al.，1992，Europ.J.Immun.22：3191-3194；Hollenbaugh et al.，1992EMBO J.11：4313-4321)。这些术语在本申请自始至终可互换使用。本发明的CD154结合蛋白(包括抗体)与人CD154特异性结合，并且可与其他物种的CD154交叉反应且因此特异性结合。在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(包括抗体)与人CD154、小鼠CD154或非人灵长类CD154特异性结合。 
抗CD154抗体和CD154结合蛋白
本文所述术语“抗CD154抗体”指能够与CD154抗原上的表位特异性结合的免疫球蛋白分子。抗CD154抗体可为源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可为完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体一般是免疫球蛋白分子的四聚体。 
因此，本发明的所有实施方案和方法中所述“抗CD154抗体”含(除非上下文另有说明或另有提示)单克隆抗体、多克隆抗体、鼠类抗体、仓鼠抗体、山羊抗体、兔抗体、嵌合抗体、灵长类源化抗体、人源化抗体、(全)人抗体、多聚抗体、异二聚抗体、半二聚抗体、二价、三价或四价抗体、双特异性抗体、单链抗体(例如，scFv、scFab和scFabΔC))、二-scFv、双抗体、三抗体或四抗体、单结构域抗体、和经修饰的Fab片段。在某些实施方案中，抗CD154抗体是仅含单个可变免疫球蛋白结构域的抗体。因此，单价抗体包括仅含一个免疫球蛋白可变结构域(即，单个轻或重可变链)且与CD154特异性结合的抗体。此外，本发明的抗CD154抗体对于CD154可为单价、二价或多价的。 
在某些实施方案中，具有减少的效应子功能的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)含抗CD154抗体的任何部分，其足以维持与CD154抗原的特异性结合。例如，抗体可仅含单个可变免疫球蛋白结构域-VH或VL结构域。 
因此，在某些实施方案中，CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)是抗体片段。抗体片段包括例如Fab片段、F(ab)2片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、F(ab’)3片段、单链F(v)片段或F(v) 片段及任何上述的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson，2005，Nature Biotech.23(9)：1126-1136)。本发明的抗体片段在下文有更详细描述。 
在一个例子中，CD154结合蛋白或抗CD154抗体是具有天然或经修饰的铰链区的抗体(例如，IgG4亚型的抗体)或片段(例如，Fab’片段)。许多经修饰的铰链区已得到描述，例如在US5,677,425、WO 99/15549和WO 98/25971中。在另一个例子中，本发明的抗体的恒定区被修饰，如WO 05/003169、WO 05/003170和WO05/003171中所述那些抗体。任何上述抗CD154抗体、抗体衍生物或抗体片段可用于形成本发明的抗体缀合物。任何上述抗体、片段和衍生物可引发与第二种抗CD154抗体相比减少的效应子功能。 
本发明的抗体分子可为免疫球蛋白分子的任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚类。可根据所推荐的抗体分子功能选择抗体的恒定区结构域(如果存在)。例如，恒定区结构域可为人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。尤其可使用人IgG恒定区结构域，特别是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG2和IgG4同种型可在某些实施方案中使用，其中抗体分子预期用于需要减少或消除抗体效应子功能的治疗用途。而当抗体分子预期用于需要抗体效应子功能的治疗用途时，还可使用IgG1和IgG3同种型。 
在一些实施方案中，可将本发明的CD154结合蛋白(例如抗体)的一个以上的CDR掺入一个以上的免疫球蛋白结构域、通用构架、蛋白支架或者基于除免疫球蛋白结构域外的蛋白支架或骨架的其他生物相容性构架结构内(Nygren & Uhlén，1997，Curr.Opin.Strural Biol.7：463-469；Saragovi et al，1992，Bio/Technology10：773-779；Skerra，2000，J.Mol.Recognition 13：167-187)。在某些实施方案中，将抗CD154抗体的CDR掺入通用构架(即，可用于产生最初由不同构架的大集合维持的功能、特异性或性质的完全变异性的构架，参见U.S.6,300,064)。在其他实施方案中，备选支架(参见例如，Binz et al.，2005Nat Biotech 23：1257-1268和Hosse et al.，2006 Protein Science 15：14-27)可用于产生本发明的CD154结合蛋白。 
术语“抗CD154抗体”还含合成抗体或使用重组DNA技术产生的重组抗体，例如由噬菌体表达的抗体。术语“抗CD154抗体”还应解释为包括已通过合成编码抗体的DNA分子或确定抗体的氨基酸序列产生的抗体，所述DNA分子表达抗体蛋白、其中DNA或氨基酸序列已使用本领域可用且众所周知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。 
在一个实施方案中，本发明提供是单克隆抗体的“抗CD154抗体”。单克隆抗体指得自基本上均质抗体群的抗体，即构成所述抗体群的单个抗体除可能的可少量存在的天然发生的突变外是相同的。修饰词“单克隆”指得自基本上均质的抗体群的抗体的特征，并且不解释为需要通过任何具体方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤(鼠类或人的)方法制备，或可通过重组DNA方法(参见例如，US 4,816,567)制备。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson etal.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，JMol.Biol.，222：581-597(1991)中所述技术从噬菌体抗体文库中分离。还应当理解本发明的某些实施方案涉及含一种以上的不同单克隆抗体的组合物，所述单克隆抗体特异性结合CD154，即含具有不同表位特异性的多种单克隆抗体的多克隆抗体组合物。 
在本发明的另一实施方案中，“抗CD154抗体”指是嵌合抗体的抗体、或其抗体衍生物或缀合物或抗原结合片段。嵌合抗体一般包括与另一个物种(一般是人)的恒定区融合的一个物种(一般是小鼠)的重链和/或轻链可变区(包括CDR和构架残基)。这些嵌合小鼠/人抗体含约75％人和25％小鼠氨基酸序列。人序列表示抗体的恒定区，而小鼠序列表示抗体的可变区(且因此含抗原结合位点)。 
在另一实施方案中，本发明的CD154结合蛋白、抗CD154抗体包括含可变结构域的抗体、抗体衍生物和抗原结合片段，所述可变结构域含来自一种抗体的构架区和来自另一种抗体的CDR区。 
在一个更具体的实施方案中，本发明的CD154结合蛋白和抗CD154抗体包括含来自不同人抗体的构架区和CDR区嵌合抗体。 
制备上述所有嵌合抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。参见例如，US 5,807,715；Morrison et al.，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci USA 81(21)：6851-5；Sharon et al.，(1984)Nature 309(5966)：364-7；Takeda et al.，(1985)Nature 314(6010)：452-4。 
在本发明的某些实施方案中，结合CD154的抗CD154抗体通过选择淋巴细胞抗体方法(SLAM)(Babcook et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci，93，7843-7848；WO 92/02551；de Wildt et al.，1997，J.Immunol.Methods，207：61-67和Lagerkvist et al.，1995，BioTechniques 18：862-869)产生，所述方法使得能够从任何种类中分离在体内免疫应答过程中产生高亲和力抗体的细胞。其他技术包括由de Wildt et al.，1997，J.Immunol.Methods，207：61-67和Lagerkvistet al.，1995，BioTechniques 18(5)：862-869所述的技术。上述方法依赖单个抗体产生细胞的分离，所述细胞随后进行克隆扩增，随后筛选产生抗CD154抗体的克隆，随后鉴定其可变重(VH)和轻(VL)链基因的序列。具体筛选方法在WO 04/051268中详述。因此，分离对于针对CD154的抗体是阳性的B细胞。B细胞可来自人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊或其他哺乳动物物种。可例如通过常规重组DNA技术将这些B细胞中的抗体基因进行克隆且在宿主细胞中表达。在某些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。其他宿主细胞将在下文详述。在这些细胞中表达的抗体(其包括抗体片段(例如Fab’片段))可通过常规方法进行纯化。如果抗体来自非人来源，则它们可通过常规方法(例如通过诱变其基因)进行人源化。随后可在宿主细胞中表达所述人源化抗体，且对其进行纯化。 
单克隆抗体可通过本领域已知的任何方法进行制备，例如杂交瘤技术(Kohler & Milstein，Nature，1975，256：495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，ImmunologyToday，1983，4，72)和EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，″Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy″，第77-96页，Alan R.Liss，Inc.，1985)。用于产生和制备重组抗体的方法是本领域众所周知的(参见例如，US 4,816,397；US 6,331,415；Simmons et al.，2002，Journal ofImmunological Methods，263，133-147；WO 92/02551；Orlandi et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3833；Riechmann et al.，1988，Nature，322，323；US 5,585,089；WO91/09967；Mou ntain和Adair，1992，Biotechnol Genet.Eng.Rev，10，1-142；Verma et al.，1998，J.Immunol.Methods，216：165-181；Holliger和Hudson，2005，NatureBiotech.23(9)：1126-1136)。 
本发明的抗体也可使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生，包括由下述文献公开的方法：Brinkman et al.，1995，J.Immunol.Methods，182：41-50；Ames et al.，1995，J.Immunol.Methods，184，177-186；Kettleborough et al.，1994，Eur.J.Immunol，24，952-958；Persic et al.，1997，Gene，187，9-18；和Burton et al.，1994，Advances in Immunol，57，191-280；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；和WO95/20401；和US 5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；和5,969,108。 
此外，转基因(例如经遗传改造的)小鼠或其他生物体(包括其他哺乳动物)可用于产生本发明的结合蛋白和抗体(参见例如US6,300,129)。例如，已知可将把仅小鼠免疫基因座(重链V、D和J区段，以及轻链V和J区段)用相应人可变序列替换的经可变区改造的小鼠用于产生大量具有人可变序列的高亲和力抗体(参见例如，US6,586,251；US 6,596,541和US.7,105,348)。 
在本发明的另一实施方案中，“抗CD154抗体”指灵长类源化或人源化的抗体、抗体衍生物或缀合物、或抗原结合片段。灵长类源化和人源化抗体一般包括来自移植到非人灵长类或人的抗体V区构架上的鼠类抗体的重链和/或轻链CDR，通常进一步含人恒定区。 参见例如，Riechmann et al.，(1988)Nature 332：323-327；US6,054,297；5,821,337；5,770,196；5,766,886；5,821,123；5,869,619；6,180,377；6,013,256；5,693,761；和6,180,370。 
关于使用此灵长类源化或人源化抗体的原理是保留由小鼠CDR赋予的小鼠抗体的(人)抗原特异性，但通过使用尽可能多的人构架序列减少小鼠抗体的免疫原性(小鼠抗体会在除小鼠外的物种中引起针对其的免疫应答)。此抗体可在人治疗中用于使不希望有的副作用(例如免疫应答)降到最低或消除。已描述了含从抗原特异性非人抗体移植到在人中具有减少的免疫原性的同源非人灵长类受体构架上的供体CDR的抗体(US 2005/0208625；US 2002/0062009；US7,338,658)。 
因此，人源化形式的非人(例如鼠类)抗体是特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合亚序列)，其含源自非人免疫球蛋白和人免疫球蛋白的序列。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠或兔)CDR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应非人FR残基替换。 
此外，人源化抗体可含不见于受体抗体、也不见于输入的CDR或FR序列的残基。进行这些修饰以进一步改善和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体可含基本上所有至少1个、和一般2个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区相应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且所有或基本上所有FR残基是人免疫球蛋白共有序列的FR残基。人源化抗体任选还可含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白恒定区。 
人源化抗体(其包括例如抗体片段和抗体衍生物或缀合物)可通过重组DNA技术产生，其中将对于抗原结合不需要的人免疫球蛋白轻链或重链的一些或全部氨基酸(例如，可变结构域的恒定 区和构架区)用于代替来自同源抗体、非人抗体的轻链或重链的相应氨基酸。用于制备人源化抗体的方法是抗体领域技术人员众所周知的。参见例如，EP 239400；Jones et al.，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann et al.，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen et al.，(1988)Science 239：1534-1536；Queen et al.，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci USA 86：10029；Orlandi et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA86：3833；US 6,180,370和EP 519596，其描述了表面残基的抗体饰面(veneering)。 
因此，在本发明的一个实施方案中，抗CD154抗体指人源化抗体(其包括但不限于人源化抗原结合片段和人源化抗体衍生物或缀合物)，其通过将鼠类或大鼠(或其他非人)CDR移植到人抗体上来产生。更具体而言，这种人源化如下达到：(1)从分泌抗体的杂交瘤或B细胞中分离编码重链和轻链可变结构域的cDNA；(2)通过测序测定可变结构域(包括CDR)的DNA序列；(3)通过定点诱变将编码CDR的DNA转移到人抗体重链或轻链可变结构域编码序列的相应区域；和(4)加入所需同种型(例如，对于CH为l，对于CL为k)的人恒定区基因区段。最后，在哺乳动物宿主细胞(例如，CHO或NSO细胞)中共表达人源化重链和轻链基因，以产生可溶性人源化抗体。 
有时，CDR直接转移至人构架导致所产生的结合蛋白或抗体的抗原结合亲和力的丧失。可发生抗原结合亲和力的丧失，因为在一些同源抗体中，构架区内的某些氨基酸与CDR相互作用，并且因此影响抗体的总体抗原结合亲和力。在此情况下，技术人员应当理解在受体抗体的构架区中引入“回复突变”将是关键的，以便保留同源抗体的抗原结合活性。制备回复突变的一般方法是本领域技术人员众所周知的。参见例如，Queen et al.，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci USA86：10029；Co et al.，1991.Proc.Nat.Acad.Sci USA 88：2869-2873；WO 90/07861；Tempest 1991.Biotechnology 9：266-271。本发明抗体的示例性回复突变包括在图9中供体内容下所示残基。 
在某些实施方案中，本发明的结合蛋白或抗体可含非骆驼科或鼠类免疫球蛋白可变结构域的VH结构域。在某些实施方案中，抗体多肽可含如下VH结构域，与人VH结构域相比，其不含对骆驼科免疫球蛋白可变结构域特异的一种以上的氨基酸。 
在本发明的一个实施方案中，“抗CD154抗体”指全人的抗体(其包括抗原结合片段和抗体衍生物或缀合物)。全“人”抗体含具有源自人免疫球蛋白的序列(例如，得自人免疫球蛋白编码序列)的抗体多肽或免疫球蛋白可变结构域。术语“人抗体”包括例如具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在)的抗体。本文中将术语“人”应用于抗体或片段(例如可变结构域)时，不含已通过将人恒定区序列移植到抗体多肽(即，用人恒定区替换非人恒定区)或通过将人V区构架序列移植到来自非人哺乳动物的免疫球蛋白可变结构域(即用人构架区替换V结构域的非人构架区)而“人源化”的来自另一个物种(例如小鼠)的抗体。已描述了通过互补决定残基的合理修饰使免疫球蛋白可变区人源化的方法(US 2006/0258852)。 
在某些实施方案中，人抗体包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或者通过体内体突变引入的突变)。因此，在某些实施方案中，本发明涉及含具有一个以上的构架区(例如FW1、FW2、FW3和/或FW4)的可变结构域的抗CD154抗体，其含与由人种系抗体基因区段编码的相应构架区的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或相对于由人种系抗体基因区段编码的所述相应构架区的氨基酸序列，总共含多达5个氨基酸差异的一个以上的所述构架区的氨基酸序列。在进一步实施方案中，可变结构域的构架区(FW1、FW2、FW3和FW4)的氨基酸序列与由人种系抗体基因区段编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或相对于由人种系抗体基因区段编码的相应构架区的序列，FW1、FW2、FW3和FW4的序列总共含多达10个氨基酸差异。示例性种系抗体基因区段包括例如DP47、DP45、DP48和DPK9(US 2006/0062784)、以及编码实施例和附图中所示受体构架序列的区段。 
在一些实施方案中，人抗体(其包括抗体片段或可变结构域序列)与天然存在的人抗体具有至少85％氨基酸序列同一性(包括例如，87％、90％、93％、95％、97％、99％或更高序列同一性)。 
全人抗体或人抗体可源自携带来自人细胞的人抗体基因(携带可变(V)、多样性(D)、连接(J)、和恒定(C)外显子)或人V、D和J区的转基因(例如经遗传改造的(例如敲入(knock-in)的))小鼠。例如，目前可产生经遗传改造的动物(例如小鼠)，其在无内源免疫球蛋白产生的情况下，在免疫接种后能够产生人抗体全库(参见例如，Jakobovits et al.，PNAS，90：2551(1993)；Jakobovitset al.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year inImmuno.，7：33(1993)；和Duchosal et al.，Nature 355：258(1992))。可改造转基因(例如经遗传改造(包括敲除、敲入、基因替换等)的)小鼠品系，使其含来自未重排的人免疫球蛋白基因的基因序列。人序列可编码人抗体的重链和轻链并且将在小鼠中正确发挥作用，经历重排以提供类似于在人抗体库的广泛抗体库。经遗传改造的小鼠可用靶蛋白(例如，CD154、其片段、或表达CD154的细胞)进行免疫接种，以产生特定抗体及其编码RNA的不同阵列。编码此抗体的抗体链组分的核酸随后可从动物中克隆到展示载体内。一般地，克隆编码重链和轻链序列的核酸的分离群，并且随后将通过将分离的群插入载体内而进行重组，从而使得载体的任何给定拷贝接受重链和轻链的随机组合。载体设计为表达抗体链，从而使得它们可在含载体的展示包的外表面上装配和展示。例如，抗体链可作为与来自噬菌体的外表面的噬菌体外壳蛋白的融合蛋白进行表达。其后，展示包可就与靶结合的抗体的展示进行筛选。 
此外，人抗体可源自噬菌体展示文库(Hoogenboom et al.，J.Mol.Biol，227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)；Vaughan et al.，Nature Biotech 14：309(1996)，US6,300,064)。可产生使用合成人抗体V区的随机组合的合成噬菌体文库。通过在抗原上选择，可制备V区在性质方面非常象人的全人抗体。 参见US 6,794,132，6,680,209，4,634,666和Ostberg et al.，(1983)，Hybridoma 2：361-367。 
关于人抗体的产生，还参见Mendez et al.，Nature Genetics15：146-156(1997)，Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)。人抗体在U.S.5,939,598和6,673,986中进一步讨论和描述。还参见U.S.6,114,598、6,075,181和6,162,963。还参见US 6,150,584、US 6,713,610、US 6,657,103、US 2003/0229905A1、US 2004/0010810A1、US 2004/0093622A1、US 2006/0040363A1、US 2005/0054055A1、US 2005/0076395A1和US 2005/0287630A1。还参见EP 0463151B1、WO 94/02602、WO 96/34096和WO 98/24893。 
在备选方法中，其他人已利用“小型基因座”方法。在小型基因座方法中，通过包括来自Ig基因座的片段(单个基因)模拟外源Ig基因座。因此，将一种以上的VH基因、一种以上的DH基因、一种以上的JH基因、μ恒定区和第二个恒定区(优选γ恒定区)形成到构建体内用于插入动物内。这种方法在例如US 5,545,807、5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215和5,643,763中描述。还参见US 5,569,825、5,877,397、6,300,129、5,874,299、6,255,458和7,041,871，所述专利的公开内容通过引用整体并入本文。还参见EP 0546073、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884。进一步参见Taylor et al.，(1992Nuc.Acids.Res.，20：6287)，Chen et al.，(1993Int.Immunol.5：647)，Tuaillon et al.，(1993PNAS USA.90：3720-4)，Choi etal.，(1993Nature Genetics4：117)，Lonberg et al.，(1994Nature 368：856-859)，Taylor et al.，(1994International Immunology 6：579-591)，和Tuaillon et al.，(1995J Immunol.154：6453-65)，Fishwild et al.，(1996Nature Biotechnology 14：845)，and Tuaillon et al.，(2000EurJ Immunol.10：2998-3005)。 
在本发明的一个更具体的实施方案中，全人抗体使用体外预处理的人脾细胞进行制备(Boerner et al.，1991.J.Immunol.147：86-95)。 
在本发明的一个更具体的实施方案中，全人抗体通过库克隆进行制备(Persson et al.，1991.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88：2432-2436；Huang和Stollar 1991.J.Immunol.Methods 141：227-236)。此外，US 5,798,230描述了来自人B细胞的人单克隆抗体的制备，其中产生人抗体的B细胞通过用EB病毒或其衍生物感染而永生化，所述衍生物表达EB病毒核抗原2(“EBNA2”)(永生化所需的蛋白)。随后关闭EBNA2功能，导致抗体产生增加。 
用于产生全人抗体的其他方法涉及使用非人动物，所述动物具有灭活的内源Ig基因座，并且是未重排的人抗体重链和轻链基因的转基因动物。可用活化T细胞或D 1.1蛋白免疫接种此转基因动物(US 5,474,771、6,331,433和6,455,044)，并且可由源自其的B细胞产生杂交瘤。这些方法的细节在本领域得到描述。参见例如，有关含人Ig小型基因座的转基因小鼠的各种出版物/专利，包括US5,789,650；有关 
Figure 5592DEST_PATH_G2008800093615D00391
小鼠的各种出版物/专利，包括US6,075,181；6,150,584；和6,162,963；Green，1997，Nature Genetics7：13-21；Mendez，1997，Nature Genetics 15：146-56；以及有关“transomic”小鼠的各种出版物/专利，包括EP 843961和Tomizuka，1997，Nature Genetics 16：1433-43。 
本发明的CD154结合蛋白和抗CD154抗体还涉及交叉阻断结合蛋白或抗体，或涉及与和本文所述任何抗体结合相同表位、或与和本文所述任何抗体紧密相关或重叠的表位结合的结合蛋白或抗体。交叉阻断结合蛋白或抗体可竞争性抑制或阻断本文所述任何抗体的结合。在本文所述某些实施方案中，本发明提供如下CD154结合蛋白和抗CD154抗体，其与含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的重链序列且含SEQ ID NO：15的轻链序列的人源化抗体(342Fab和Fab’片段)结合相同表位，并且在用抗CD154抗体5c8的竞争测定法 中，显示出相似的CD154结合性质。在本文所述其他实施方案中，本发明提供如下CD154结合蛋白和抗CD154抗体，其与含SEQ ID NO：58的VL结构域序列和SEQ ID NO：60的VH结构域序列的人源化抗体(338抗体可变序列)结合相同表位，并且在用抗CD154抗体5c8的竞争测定法中，显示出相似的CD154结合性质。 
在本发明的某些实施方案中，CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)显示出对于人CD154的高亲和力。例如，在某些实施方案中，如通过表面等离子体共振(例如 )所测定，CD154结合蛋白以50nM-1pM(包括端点)的KD与人CD154(人CD40L)解离。例如，与人CD154的KD可为25nM-1pM、10nM-1pM、5nm-1pM、1nM-1pM、0.5nM-1pM、0.1nM-1pM、75pM-1pM、50pM-1pM、20pm-1pm、或甚至10pm-1pm。在其他实施方案中，如通过表面等离子体共振(例如 
Figure 95088DEST_PATH_G2008800093615D00402
)所测定，本发明的CD154结合蛋白以500pM-1pM(包括端点)的KD与人CD154解离。在一些实施方案中，与人CD154的KD小于50pM。例如，在本发明的一些实施方案中，CD154结合蛋白以小于20pM的KD与人CD154解离。在本发明的一些实施方案中，CD154结合蛋白以小于10pM的KD与人CD154解离。在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白以高亲和力与CD154结合，但不从CD40取代结合的CD154。抗体亲和力可通过本领域已知的方法得到增强(参见例如，Clark et al.，2006Protein Sci.15(5)：949-60，其描述了使用基于结构的计算设计的抗体亲和力增强，和Chao et al.，2006Nat Protoc 1：755-768，其描述了使用酵母表面展示分离且改造具有所需性质的scFv的方法)。 
当希望改善含一种以上的上述CDR的本发明抗体的亲和力时，具有改善亲和力的此抗体可通过许多亲和力成熟方案获得，包括但不限于维持CDR(Yang et al.，J.Mol.Biol，254，392-403，1995)、链改组(Marks et al.，Bio/Technology，10，779-783，1992)、大肠杆菌突变菌株的使用(Low et al.，J.Mol.Biol.，250，350-368，1996)、 DNA改组(Patten et al.，Curr.Opin.Biotechnol，8，724-733，1997)、噬菌体展示(Thompson et al.，J.Mol.Biol，256，7-88，1996)和有性PCR(Crameri，et al.，Nature，391，288-291，1998)。所有这些亲和力成熟方法由Vaughan et al.，(Nature Biotechnology，16，535-539，1998)讨论。因此，本发明还提供与CD154特异性结合的本发明抗体的序列变体。此序列变体在其序列内含一种以上的半保守或保守置换，并且此置换优选不显著影响多肽的所需活性。置换可为天然存在的或可例如使用诱变引入(例如Hutchinson et al.，1978，J.Biol.Chem.253：6551)。氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通常可彼此置换(具有脂肪族侧链的氨基酸)。在这些可能的置换中，优选甘氨酸和丙氨酸用于彼此置换(因为它们具有相对短的侧链)，并且缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸用于彼此置换(因为它们具有疏水性的较大的脂肪族侧链)。通常可彼此置换的其他氨基酸包括但不限于：-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。 
本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)的结合亲和力也可以相对术语或与第二种抗体的结合亲和力比较进行描述，所述第二种抗体也与CD154特异性结合(例如，CD154特异性的第二种抗CD154抗体，其在本文中可称为“第二种CD154特异性抗体”。在一些实施方案中，第二种CD154特异性抗体可为抗体5c8(由US5,474,771中所述保藏于ATCC的保藏号为HB 10916的杂交瘤产生)或人源化5c8。在其他实施方案中，第二种CD154特异性抗体可为本发明的任何抗体，例如342、381、338、294、295、300、335、303或402(图12)。因此，本发明的某些实施方案涉及如下抗CD154抗体，其以相比抗体5c8更大的亲和力、或以相比抗体5c8KD更低的 KD与人CD154结合。在某些实施方案中，在等摩尔浓度下，本发明的抗CD154抗体也抑制CD154活性或阻断CD154:CD40相互作用至相比第二种CD154特异性抗体(例如5c8)更大的程度。抗CD154抗体阻断CD154:CD40相互作用的相对能力可通过任何可用的测定法进行测量，例如本文所述ICAM-1上调测定法和竞争结合测定法。 
因此，在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白和抗CD154抗体(包括抗体片段和衍生物)对于抑制CD154与CD40的结合有用且特异性高(例如10pM-1.5μM(包括端点)的IC50)。在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗体)可具有10pm-500pm、50pm-500pm、100pm-500pm、250pm-750pm、500pm-1μM或750pm-1.5μM的IC50。在进一步实施方案中，抗CD154抗体基本上不激活CD40活性或活化CD40信号。在一些实施方案中，本发明的抗CD154抗体拮抗CD154或CD40或两者的活性。 
因此，本发明的某些实施方案涉及如下CD154结合蛋白和抗CD154抗体，相对于第二种CD154特异性抗体(例如抗体5c8或人源化5c8)，其以更大或相等的亲和力、或以低于或等于第二种CD154特异性抗体的KD与人CD154结合，其中相对于第二种CD154特异性抗体，抗CD154抗体基本上不抑制CD154:CD40相互作用。此抗体可例如用作结合测定法和诊断剂。与第二种CD154特异性抗体相比，显示出对于人CD154的高亲和力但更低程度的CD154:CD40抑制的示例性抗体是本文所述抗体381和338。例如，本发明提供如下抗CD154抗体，其以更高或相等的亲和力(相对于第二种CD154特异性抗体(例如人源化5c8))与人CD154特异性结合，但阻断CD154:CD40相互作用至相比第二种CD154特异性抗体更少的程度。在进一步实施方案中，抑制CD154(CD40L)与CD40的结合至相比第二种CD154特异性抗体更少的程度的这些抗CD154抗体也基本上不激活CD40活性或活化CD40信号。例如，如果在如实施例7中所述体外效力测定法中施用此抗体，则可不显示出超过对照处理的任何 基本上显著的拮抗作用，或可显示出与阳性对照(例如CD154配体)相比1％、2％、3％、5％或10％的拮抗作用。Vidalain等人(The EMBOJournal(2000)19：3304-3313)和Pearson等人(InternationalImmunology(2001)13：273-283)描述了CD40信号通路，并且还提供可用于测定CD154:CD40相互作用是否被阻断或抑制，以及至何种程度被阻断或抑制的测定法。 
在一些实施方案中，本发明涉及含选自CDR-H1(SEQ IDNO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ ID NO：5)中的至少一个CDR的抗CD154抗体。抗体优选含选自CDR-H1(SEQID NO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ ID NO：5)中的至少2个CDR，并且更优选含这些CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的所有3个CDR。 
在另一实施方案中，本发明的抗CD154抗体含选自CDR-L1(SEQ ID NO：6)、CDR-L2(SEQ ID NO：7)和CDR-L3(SEQ ID NO：8)中的至少一个CDR。抗体优选含选自CDR-L1(SEQID NO：6)、CDR-L2(SEQ ID NO：7)和CDR-L3(SEQ ID NO：8)中的至少2个CDR，并且更优选含这些CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的所有3个CDR。 
在进一步实施方案中，抗体含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(SEQ ID NO：3-5)中的所有3个以及CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(SEQ ID NO：6-8)中的所有3个。 
在进一步实施方案中，抗CD154抗体含SEQ ID NO：1、9、10或11中任一个的可变重链序列，并且含SEQ ID NO：2或14的可变轻链序列。 
在一些实施方案中，本发明涉及含选自CDR-H1(SEQ IDNO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQ ID NO：44)中的至少一个CDR的抗CD154抗体。抗体优选含选自CDR-H1(SEQ ID NO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQID NO：44)中的至少2个CDR，并且更优选含这些CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3中的所有3个CDR。 
在另一实施方案中，本发明的抗CD154抗体含选自CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46)和CDR-L3(SEQ ID NO：47)中的至少一个CDR。抗体优选含选自CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46)和CDR-L3(SEQID NO：47)中的至少2个CDR，并且更优选含这些CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的所有3个CDR。 
在进一步实施方案中，抗体含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(SEQ ID NO：42-44)中的所有3个，以及CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(SEQ ID NO：45-47)中的所有3个。 
在进一步实施方案中，抗CD154抗体含SEQ ID NO：56的可变重链序列和/或含SEQ ID NO：54的可变轻链序列。 
在一些实施方案中，本发明涉及含选自CDR-H1(SEQ IDNO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQ ID NO：50)中的至少一个CDR的抗CD154抗体。抗体优选含选自CDR-H1(SEQ ID NO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQID NO：50)中的至少2个CDR，并且更优选含这些CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的所有3个CDR。 
在另一实施方案中，本发明的抗CD154抗体含选自CDR-L1(SEQ ID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQ ID NO：53)中的至少一个CDR。抗体优选含选自CDR-L1(SEQ ID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQID NO：53)中的至少2个CDR，并且更优选含这些CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的所有3个CDR。 
在某些实施方案中，抗体具有分别含上述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中一个以上的轻链CDR的互补序列，或者含上述一个以上的重链CDR或CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的互补序列。因此，在某些实施方案中，本发明的抗体含CDR-H1(SEQ ID NO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)或CDR-H3(SEQ ID NO：50)， 以及CDR-L1(SEQ ID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)或CDR-L3(SEQ ID NO：53)。 
在进一步实施方案中，抗体含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(SEQ ID NO：48-50)中的所有3个以及CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(SEQ ID NO：51-53)中的所有3个。 
在进一步实施方案中，抗CD154抗体含SEQ ID NO：60的可变重链序列和/或含SEQ ID NO：58的可变轻链序列。 
在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白含SEQ IDNO：62的轻链序列和SEQ ID NO：65的重链序列。在其他实施方案中，本发明的CD154结合蛋白含SEQ ID NO：63的轻链序列和SEQID NO：66的重链序列。 
在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白含SEQ IDNO：68的轻链序列和SEQ ID NO：71的重链序列。在其他实施方案中，本发明的CD154结合蛋白含SEQ ID NO：69的轻链序列和SEQID NO：72的重链序列。在其他实施方案中，CD154结合蛋白含SEQID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72的序列之一。 
本发明还提供如下CD154结合蛋白，其与本发明的CD154结合蛋白优选共享至少90％、91％、92％、93％或94％同一性。CD154结合蛋白更有选共享至少95％、96％、97％或98％同一性。CD154结合蛋白最优选与本发明的CD154结合蛋白共享至少99％、99.5％、99.9％或更多同一性。本发明的CD154结合蛋白可含与SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60的可变结构域，或其一个以上的CDR至少85％等同的可变结构域序列。 
本发明的其他实施方案涉及双特异性抗体。双特异性抗体是单克隆的，优选人或人源化抗体，其具有对于至少2种不同抗原的 结合特异性。它们可单独使用或混合到含多克隆群的组合物内。在本发明中，结合特异性之一是对于CD154抗原，而另一种结合特异性是对于任何其他抗原，并且优选对于细胞表面蛋白或受体或受体亚单位。例如，其他结合特异性可为选自人血清白蛋白(HSA)、TNFα、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、IFN-γ、CD2、CD4、CD8、CTLA4、LFA1、LFA3和VLA4的配体。 
在本发明的其他实施方案中，抗CD154抗体含通用配体结合位点。通用配体(例如多肽)能够无关靶配体特异性地结合库的功能成员。通用配体因此可用于鉴定或选择(例如，如在纯化和筛选过程中)库的功能成员(例如，无关抗体的抗原结合特异性的抗体的集合或组)。通用配体包括例如蛋白A、蛋白G和蛋白L。WO 99/20749中教导了用通用配体预筛选噬菌体文库成员。 
抗体片段
本发明还涉及抗原结合或表位结合抗CD154抗体片段。有关抗CD154抗体的所有上述方法和制剂可类似地用于产生且使用本发明的抗CD154抗体片段。 
在本发明的一些实施方案中，抗CD154抗体片段包括异聚抗体复合物和抗体融合物，例如双特异性抗体、半二聚抗体、多价抗体(即四价抗体)和单链抗体。半二聚抗体由Fc部分和一个Fab部分构成。单链抗体由在单条蛋白链中将可变区通过蛋白间隔物连接而构成。 
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗CD154抗体片段还可包括含一个以上的免疫球蛋白轻链和/或重链的蛋白，例如这些链的单体和同多聚体或异多聚体(例如二聚体或三聚体)，其中这些链任选是二硫化物键合的或以其他方式交联的。这些抗体能够与一种以上的抗原结合。 
在某些实施方案中，本发明包括完整抗体的抗原结合片段，例如Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、F(v)、Fd、dAb、双抗体、小型抗体和纳米抗体片段。本发明还涉及仅含单 个可变结构域(例如VH或VL结构域)的片段，或仅含重链或轻链结构域的片段。片段可为人源化的或全人的。本发明还包括由备选支架制备(参见例如上述Binz和上述Hosse的文章)，或含通用构架的抗原结合片段。本发明还涉及含任何抗原结合片段的缀合物、或例如与功能部分(例如载体蛋白或PEG)共价或非共价或者直接或间接缀合的特异性结合CD154的CD154结合蛋白。 
本发明的抗CD154抗体包括二价抗体。因此，在某些实施方案中，本发明涉及二价抗CD154抗体片段，其含以共价连接的2条抗体重链和至少一个聚合物分子，每条重链通过至少一个非二硫化物链间桥与其他链共价连接，所述非二硫化物链间桥使一条链中的半胱氨酸残基的硫原子与另一条链中的半胱氨酸残基的硫原子连接，半胱氨酸残基位于每条链的可变区结构域外，其特征在于至少一个非二硫化物链间桥含共价连接的聚合物分子。本文所述术语“非二硫化物”意在排除例如通常见于抗体中的类型的S-S桥。然而，如下文所述，本发明的片段中存在的链间桥类型仍可经由-S-S-键与重链连接。一般而言，本发明的二价抗体片段中的每个聚合物分子形成链间桥的部分。每个桥用于使2条重链连接，并且在每条链中将与半胱氨酸残基的硫原子共价连接。共价键一般将是二硫键，或在具体实施方案中，将是硫-碳键。关于示例性二价抗体结构，参见WO 99/64460和WO05/061005。 
本发明还提供是单价抗体或单价抗原结合片段的抗CD154抗体。本文所述术语“单价”意指给定抗体或抗原结合片段(例如，Fv、单链scFv、dAb、Fab、Fab’、Fd、scFab、scFabΔC等)可结合其靶的仅单个分子。天然存在的抗体一般是二价的，因为它们具有2个功能抗原结合臂，各自含VH和VL结构域。当空间位阻不是问题时，二价抗体可结合同一抗原的2个独立的分子。相比之下，“单价”抗体具有靶的一个抗原结合位点。单价抗体的抗原结合结构域可含VH和VL结构域，或可仅含单个免疫球蛋白可变结构域(即VH或VL结构域)，其无需分别相应VL或VH结构域的情况下具有结合CD154 的能力。此示例性单价抗体是Fd片段，其含单个免疫球蛋白可变结构域并且可仅与一个CD154抗原分子结合。单价抗体缺乏使单个抗原分子交联的能力。 
本发明提供抗CD154抗体，其中抗体与如下表位特异性结合，分别具有SEQ ID NO：12或13的重链序列且具有SEQ ID NO：15的轻链序列的人源化Fab或Fab’片段与所述表位特异性结合。在某些实施方案中，本发明的抗体是具有SEQ ID NO：1、9、10或11的可变重链序列且具有SEQ ID NO：2或14的可变轻链序列的抗体片段。在其他实施方案中，本发明的抗体是具有SEQ ID NO：12或13的重链序列和SEQ ID NO：15的轻链序列的抗体片段。 
在某些实施方案中，CD154结合蛋白或抗体含SEQ IDNO：15的轻链序列和SEQ ID NO：13的重链序列，或由SEQ ID NO：15的轻链序列和SEQ ID NO：13的重链序列构成。在某些实施方案中，CD154结合蛋白或抗体含SEQ ID NO：15的轻链序列和SEQ IDNO：12的重链序列，或由SEQ ID NO：15的轻链序列和SEQ ID NO：12的重链序列构成。 
在备选实施方案中，本发明提供含SEQ ID NO：56的可变重链序列且含SEQ ID NO：54的可变轻链序列的抗体片段。在其他实施方案中，本发明的抗体是含SEQ ID NO：60的可变重链序列且含SEQ ID NO：58的可变轻链序列的抗体片段。 
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合CD154的Fab’或F(ab’)2或F(ab’)3片段。这种Fab’或F(ab’)2或F(ab’) 3片段可为人源化的，并且可具有含SEQ ID NO：13序列或由SEQ IDNO：13序列构成的重链序列，并且可具有含SEQ ID NO：15序列或由SEQ ID NO：15序列构成的轻链序列。 
在一些实施方案中，本发明涉及无Fc结构域的抗CD154抗体。此Fc缺陷抗体或片段可为单价、二价、或还可为多价的。 
本发明还提供与如下表位特异性结合的抗体或抗体片段，上述Fab’或F(ab’)2或F(ab’)3片段与所述表位特异性结合。这 些抗体或抗体片段可通过如本文所述交叉阻断测定法进行鉴定(实施例9)。这些抗体或抗体片段可进行分离、重组或合成，并且可与第二种分子附着以形成抗体-缀合物。 
具有减少的效应子功能的抗体
抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统细胞的相互作用触发各种应答，在本文中称为效应子功能。IgG抗体通过与细胞表面Fcγ受体家族成员和补体系统的C1q结合而活化免疫系统的效应子通路。效应蛋白通过成簇抗体的连接触发各种应答，包括炎症细胞因子的释放、抗原产生的调节、胞吞作用和细胞杀伤。在一些临床应用中，这些应答对于单克隆抗体的功效是关键的。在其他中，它们引起不希望有的副作用(例如炎症)和带抗原细胞的消除。因此，本发明进一步涉及具有改变(例如减少)的效应子功能的CD154结合蛋白(包括抗体)。重要的是，减少的效应子功能不一定减少抗CD154抗体经由阻断CD154-CD40相互作用来抑制一种以上的疾病的能力(参见通过引用整体并入本文的WO 05/03175)。 
具有减小的效应子功能(例如Fc介导的效应子功能；参见下文)的抗CD154抗体特别希望用于在其中存在不希望有的血栓栓塞活性潜力的受试者中使用。此外，抗CD154抗体减小的效应子功能可减小或消除抗CD154抗体治疗的其他潜在不需要的副作用，例如活化T细胞和诱导表达CD154或Fc依赖性单核细胞/巨噬细胞活化的其他细胞群的消失。 
本发明的抗CD154抗体的效应子功能可使用许多已知测定法之一进行测定。抗CD154抗体的效应子功能相对于第二种抗CD154抗体可为减少的。在一些实施方案中，第二种抗CD154抗体可为特异性结合CD154的任何抗体。在一些实施方案中，第二种抗CD154抗体可为抗体5c8(如US 5,474,771中所述由保藏于ATCC的保藏号为HB 10916的杂交瘤产生)或人源化5c8。在其他实施方案中，第二种CD154特异性抗体可为本发明的任何抗体，例如，342、381、338、294、295、300、335、303或402(图12)。在其他实施方案中， 当目的抗CD154抗体已经修饰以减少效应子功能时，第二种抗CD154抗体可为抗体的未修饰或亲本形式。 
本发明的抗CD154抗体的效应子功能也可例如通过测量相对于对照抗体由用抗CD154抗体处理引起的血小板凝集或活化水平来进行测定。因此，在一些实施方案中，本发明的抗CD154抗体在标准血小板凝集或活化测定法中不介导或不增强血小板凝集或活化。在其他实施方案中，相对于第二种抗CD154抗体(例如5c8或人源化5c8)，抗CD154抗体介导较低水平的血小板凝集或活化。 
示例性效应子功能包括Fc受体结合、噬菌作用、凋亡、促炎应答、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。其他效应子功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，其中抗体结合在细胞毒性T细胞、天然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞上的Fc受体导致细胞死亡，和补体依赖性细胞毒性(CDC)，这是经由补体级联活化诱导的细胞死亡(在Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)；Ward和Ghetie，Therapeutic Immunol.2：77-94(1995)；以及Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)中综述)。此效应子功能一般需要Fc区以与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可使用本领域已知的标准测定法进行评估(参见例如，WO 05/018572、WO 05/003175和U.S.6,242,195)。 
效应子功能可通过使用缺乏Fc结构域的抗体片段(例如Fab、Fab’2或单链Fv)来避免。备选方案已使用IgG4亚型抗体，其与FcγRI结合但很少与C1q以及FcγRII和RIII结合。IgG2亚型也具有与Fc受体减少的结合，但保留与FcγRIIa的H131同种异型和C1q的显著结合。因此，需要Fc序列中的另外改变，以消除与所有Fc受体和C1q的结合。 
几种抗体效应子功能(包括ADCC)由结合抗体的Fc区的Fc受体(FcR)介导。抗体对于特定FcR的亲和力且因此由抗体介导的效应子活性可通过改变抗体的Fc和/或恒定区的氨基酸序列和/或翻译后修饰来进行调节。 
FcR通过其对于免疫球蛋白同种型的特异性来限定；IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，IgE抗体的Fc受体被称为FcεR，IgA抗体的Fc受体被称为FcαR等等。已鉴定了3个FcγR亚类：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。FcγRII和FcγRIII都具有2个类型：FcγRIIA(CD32)和FcγRIIB(CD32)；以及FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。因为每个FcγR亚类由2种或3种基因编码，并且可变RNA剪接导致多种转录物，所以存在FcγR同种型中的广泛多样性。例如FcγRII(CD32)包括同种型lla、llb1、llb2、llb3和llc。 
已于之间将人和鼠类抗体上FcγR的结合位点定位于由残基233-239构成的所谓的“较低铰链区”(如在下述中的EU指数编号：Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)，Woof et al.，Molec.Immunol.23：319-330(1986)；Duncanet al.，Nature 332：563(1988)；Canfield和Morrison，J Exp.Med.173：1483-1491(1991)；Chappel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 88：9036-9040(1991))。这些文献中指出残基233-239中的P238和S239可能参与结合。其它先前指出可能参与与FcγR的结合的区域是：人FcγRI的G316-K338(人IgG)(仅通过序列比对；未评估置换突变体)(Woof et al.，Molec Immunol.23：319-330(1986))；人FcγRIII的K274-R301(人IgG1)(基于肽)(Sarmay et al.，Molec.Immunol.21：43-51(1984))；和人FcγRIII的Y407-R416(人IgG)(基于肽)(Gergely et al.，Biochem.Soc.Trans.12：739-743(1984)和Shieldset al.，J Biol Chem 276：6591-6604(2001)，Lazar GA et al.，Proc NatlAcad Sci 103：4005-4010(2006)。根据Ig-FcR复合物的晶体结构的检查，涉及FcR结合的氨基酸残基的这些和其他段或区域对于本领域技术人员可为显而易见的(参见例如，Sondermann et al.，2000Nature406(6793)：267-73和Sondermann et al.，2002Biochem Soc Trans.30(4)：481-6)。因此，本发明的抗CD154抗体包括一种以上的上述 残基的修饰。 
用于减少mAb效应子功能的其他已知方法包括使mAb表面上参与效应子结合相互作用的氨基酸突变(Lund，J.，et al.，(1991)J.Immunol.147(8)：2657-62；Shields，R.L.et al.，(2001)J.Biol.Chem.276(9)：6591-604；以及使用不同亚型序列区段的组合(例如IgG2和IgG4组合)，以产生比单独的任一亚型与Fcγ受体的结合的更大减少(Armour et al.，Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-1624；Mol.Immunol.40(2003)585-593)。 
本领域已知对于一些或全部Fc受体亚型(并且因此对于效应子功能)具有改变和/或减少的亲和力的大量Fc变体。参见例如，US 2007/0224188；US 2007/0148171；US 2007/0048300；US2007/0041966；US 2007/0009523；US 2007/0036799；US 2006/0275283；US 2006/0235208；US 2006/0193856；US 2006/0160996；US2006/0134105；US 2006/0024298；US 2005/0244403；US 2005/0233382；US 2005/0215768；US 2005/01 18174；US 2005/0054832；US2004/0228856；US 2004/132101；US 2003/158389；还参见US7,183,387；6,737,056；6,538,124；6,528,624；6,194,551；5,624,821；5,648,260。 
在CDC中，抗体-抗原复合物结合补体，导致补体级联的活化和膜攻击复合物的产生。经典补体通路的活化通过补体系统的第一种组分(C1q)与抗体(合适的亚类的)的结合起始，所述抗体与其同源抗原结合；因此补体级联的活化部分地通过免疫球蛋白与C1q蛋白的结合亲和力调节。为了活化补体级联，C1q必须与IgG1、IgG2或IgG3中的至少2种分子结合，但与IgM的仅一个分子结合，所述抗体与抗原靶附着(Ward和Ghetie，Therapeutic Immunology 2：77-94(1995)第80页)。为了评估补体活化，可进行例如如Gazzano-Santoroet al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述CDC测定法。 
已提出IgG分子的各个残基涉及与C1q的结合，包括在CH2结构域上的Glu318、Lys320和Lys322，位于与相同β链紧密相 邻的转折上的氨基酸残基331，位于较低铰链区中的Lys235和Gly237残基，以及位于CH2结构域的N末端区域中的残基231-238(参见例如，Xu et al.，J.Immunol.150：152A(Abstract)(1993)，WO94/29351；Tao et al.，J.Exp.Med.，178：661-667(1993)；Brekkeet al.，Eur.J.Immunol，24：2542-47(1994)；Burton et al.，；Nature，288：338-344(1980)；Duncan和Winter，Nature 332：738-40(1988)；Idusogie et al.，J Immunol 164：4178-4184(2000；U.S.5,648,260和U.S.5,624,821)。作为IgG1的例子，人IgG1的CH2结构域的COOH末端区域中的2个突变(K322A和P329A)不活化CDC通路，并且显示导致C1q结合中超过100倍的减少(US 6,242,195)。 
因此，在本发明的某些实施方案中，可修饰、置换或去除一个以上的这些残基，或者可插入一个以上的氨基酸残基，以减少本文提供的CD154抗体的CDC活性。例如，在一些实施方案中，可能希望减少或消除受试者抗体的一种以上的效应子功能，以便减少或消除进一步活化免疫应答的潜力。具有减少的效应子功能的抗体也可减少接受抗体的受试者中的血栓栓塞事件的危险。 
在某些其他实施方案中，本发明提供如下抗CD154抗体，其显示出与一种以上的FcR受体减少的结合，但维持其结合补体的能力(例如，至相似程度，或在一些实施方案中，至比天然、非变体或亲本抗CD154抗体更低的程度)。因此，本发明的抗CD154抗体可结合且活化补体，同时显示出与FcR(例如FcγRIIa(例如在血小板上表达的FcγRIIa))减少的结合。此与FcγRIIa(例如在血小板上表达的FcγRIIa)具有减少的结合或无结合但可结合C1q且使补体级联活化至至少一定程度的抗体将减少血栓栓塞事件的危险，同时维持可能需要的效应子功能。在备选实施方案中，本发明的抗CD154抗体显示出与一种以上的FcR减少的结合，但维持其与一种以上的其他FcR结合的能力。参见例如，US 2007-0009523、2006-0194290、2005-0233382、2004-0228856和2004-0191244，所述专利描述了产生与FcRI、FcRII和/或FcRIII具有减少的结合的抗体的各种氨基酸修 饰，以及导致与一种FcR增加的结合但与另一种FcR减少的结合的氨基酸置换。 
因此，涉及抗CD154抗体的恒定区的效应子功能可通过改变恒定区且尤其是Fc区的性质来进行调节。在某些实施方案中，比较具有减少的效应子功能的抗CD154抗体与具有效应子功能的第二种抗体，所述第二种抗体可为含介导效应子功能的天然恒定区或Fc区的非变体、天然或亲本抗体(例如，抗体342或在US 5,474,771中所述抗体5c8)。在具体实施方案中，效应子功能调节包括活性消除或完全缺失的情况。 
天然序列Fc或恒定区含与见于天然的Fc或恒定链区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。用于评估相对效应子功能的对照分子优选含与测试抗体或变体抗体相同类型/亚型的Fc区。变体或改变的Fc或恒定区含如下氨基酸序列，其借助于至少一个氨基酸修饰(例如，翻译后修饰、氨基酸置换、插入或删除)而不同于天然序列重链区域的序列。因此，变体恒定区可含导致改变的翻译后修饰(包括例如改变的糖基化模式)的一个以上的氨基酸置换、删除或插入。亲本抗体或Fc区是例如用于构建具有改变的(例如减少的)效应子功能的恒定区(即Fc)的具有正常效应子功能的变体。 
可通过改造或产生具有变体恒定、Fc或重链区域的抗体来产生具有改变的(例如减少或消除的)效应子功能的抗体。重组DNA技术和/或细胞培养和表达条件可用于产生具有改变的功能和/或活性的抗体。例如，重组DNA技术可用于改造影响抗体功能(包括效应子功能)的区域(例如Fc或恒定区)中的一种以上的氨基酸置换、删除或插入。备选地，可通过操作产生抗体的宿主细胞以及细胞培养和表达条件来达到翻译后修饰(例如糖基化模式)的改变(参见下文)。 
氨基酸改变(例如氨基酸置换)可在不影响抗原结合亲和力的情况下改变本发明的抗CD154抗体的效应子功能。上述氨基酸置换(例如Glu318、Kys320、Lys332、Lys235、Gly237、K332和P329)例如可用于产生具有减少的效应子功能的抗体。 
在其他实施方案中，可对一个以上的下述氨基酸残基进行氨基酸置换：重链恒定区的234、235、236、237、297、318、320和322(参见US 5,624,821和US 5,648,260)。此置换可在改变效应子功能的同时保留抗原结合活性。与未经修饰的或非变体抗体相比，在氨基酸234、235、236和237中的一处或多处改变可减少Fc区对于FcγRI受体的结合亲和力。氨基酸残基234、236和/或237可例如用丙氨酸置换，并且氨基酸残基235可例如用谷氨酰胺置换。在另一实施方案中，抗CD154IgG1抗体可含在位置234处的Leu用Ala的置换，在位置235处的Leu用Glu的置换，在位置237处的Gly用Ala的置换。 
另外或备选地，可改变在318、320和322处的Fc氨基酸残基。在小鼠和人IgG中高度保守的这些氨基酸残基介导补体结合。已显示这些氨基酸残基的改变减少C1q结合，但不改变抗原结合、蛋白A结合、或Fc与小鼠巨噬细胞结合的能力。 
在另一实施方案中，本发明的抗CD154抗体是含减少或消除效应子功能的置换的IgG4免疫球蛋白。本发明的抗CD154抗体的IgG4Fc部分可含一种以上的下述置换：用脯氨酸置换在残基233处的谷氨酸，用丙氨酸或缬氨酸置换在残基234处的苯丙氨酸，以及用丙氨酸或谷氨酸置换在残基235(EU编号，参照上述Kabat，E.A.等人(1991)的文章)处的亮氨酸。此外，通过用Ala置换在残基297(EU编号)处的Asn来去除IgG4Fc区中的N联糖基化位点可进一步减少效应子功能，并且消除可能存在的任何残留效应子活性。具有减少的效应子功能的另一种示例性IgG4突变体是在重链恒定区中含突变S228P和L235E(PE突变)的IgG4亚型变体。这个突变导致减少的效应子功能。参见US 5,624,821和US 5,648,260。在IgG4中减少效应子功能的另一种示例性突变是本文所述的S228P/T229A。 
在恒定区中的其他示例性氨基酸序列改变包括但不限于由B1uestone等人所述Ala-Ala突变(参见WO 94/28027和WO98/47531；还参见Xu et al.，2000Cell Immunol 200；16-26)。因此在某些实施方案中，具有在恒定区内的突变(包括Ala-Ala突变)的 抗CD154抗体可用于减少或取消效应子功能。根据这些实施方案，抗CD154抗体的恒定区含对位置234处的丙氨酸的突变或对位置235处的丙氨酸的突变。因此，恒定区可含双重突变：对位置234处的丙氨酸的突变和对位置235处的丙氨酸的第二种突变。 
在一个实施方案中，抗CD154抗体含IgG4构架，其中Ala-Ala突变将描述在位置234处从苯丙氨酸到丙氨酸的突变和/或在位置235处从亮氨酸到丙氨酸的突变。在另一实施方案中，抗CD154抗体含IgG1构架，其中Ala-Ala突变将描述在位置234处从亮氨酸到丙氨酸的突变和/或在位置235处从亮氨酸到丙氨酸的突变。抗CD154抗体可备选或另外携带其他突变，包括在CH2结构域中的点突变K322A(Hezareh et al.，2001J Virol.75：12161-8)。 
在WO 94/29351(其通过引用整体合并入本文)中提供了其他示例性氨基酸置换，所述专利描述了在CH2结构域的N末端区域中具有突变的抗体，所述突变改变抗体与FcRI结合的能力，从而减少抗体与C1q结合的能力，这又减少抗体固定补体的能力。还参见Cole等人(J Immunol.(1997)159：3613-3621)，其描述了在IgG2的上游CH2区中导致较低FcR结合的突变。 
产生含氨基酸置换的任何上述抗体变体的方法是本领域众所周知的。这些方法包括但不限于，通过对制成的编码抗体或抗体的至少恒定区的DNA分子的定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。 
定点诱变是本领域众所周知的(参见例如，Carter et al.，Nucleic Acids Res.13：4431-4443(1985)和Kunkel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488(1987)))。 
PCR诱变也适合于制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见Higuchi，PCR Protocols，第177-183页(Academic Press，1990)；和Vallette et al.，Nuc.Acids Res.17：723-733(1989)。 
用于制备序列变体的另一方法——盒式诱变基于由Wellset al.，Gene 34：315-323(1985)所述技术。 
本发明的另一个实施方案涉及具有减少的效应子功能的抗CD154抗体，其中抗体的Fc区或其部分与具有天然减少的效应子诱导活性的Fc区(或其部分)交换。例如，人IgG4恒定区显示出减少的补体活化或无补体活化。此外，不同IgG分子在其对于FcR的结合亲和力方面不同，这可至少部分是由IgG铰链区的各种长度和弹性所致(这按顺序IgG3＞IgG1＞IgG4＞IgG2减少)。例如，IgG4显示出与FcγRIIa减少的结合或无结合。关于嵌合分子和嵌合恒定区的例子，参见例如，Gillies et al.，(Cancer Res.1999，59：2159-2166)和Muelleret al.，(Mol.Immunol.1997，34：441-452)。 
本发明还涉及具有减少的效应子功能的抗CD154抗体，其中Fc区完全缺失。此抗体也可称为本发明的抗体衍生物和抗原结合片段。此衍生物和片段可与非抗体蛋白序列或非蛋白结构融合，当施用于动物(例如人受试者)时，所述结构尤其是设计为促进递送和/或生物利用度的结构(参见下文)。 
如上所述，在铰链区内的改变也影响效应子功能。例如，铰链区的缺失可影响对于Fc受体的亲和力，并且可减少补体活化(Klein et al.，1981PNAS USA 78：524-528)。本公开内容因此也涉及具有在铰链区中的改变的抗体。 
在具体实施方案中，本发明的抗体可经修饰以抑制补体依赖性细胞毒性(CDC)。通过在抗体的Fc区中引入一个以上的氨基酸置换、插入或删除可实现调节的CDC活性(参见例如，US 6,194,551和US 6,242,195)。备选或另外地，可将半胱氨酸残基引入Fc区中，从而允许这个区域中的链间二硫键形成。因此产生的同二聚抗体可具有改善或减少的内在化能力和/或增加或减少的补体介导的细胞杀伤。参见Caron et al.，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)，WO 99/51642，Duncan & WinterNature 322：738-40(1988)；US 5,648,260；US 5,624,821；和WO94/29351。 
应进一步理解效应子功能可根据抗体的结合亲和力而改 变。例如，与具有相对更低的亲和力的抗体相比，具有高亲和力的抗体在活化补体系统方面可能更有效(Marzocchi-Machado et al.，1999Immunol Invest 28：89-101)。因此，抗体可改变为对于其抗原的结合亲和力减少(例如，通过诸如一个以上的氨基酸残基的置换、添加或删除的方法通过改变抗体的可变区)。具有减少的结合亲和力的抗体可显示出减少的效应子功能，包括例如减少的ADCC和/或CDC。 
具有减少的效应子功能的本发明的抗CD154抗体包括相对于亲本或非变体抗CD154抗体，对于一种以上的Fc受体(FcR)具有减少的结合亲和力的抗体。因此，具有减少的FcR结合亲和力的抗CD154抗体包括如下抗CD154抗体，与亲本或非变体抗CD154抗体(例如抗体342或5c8)相比，其在与一种以上的Fc受体的结合亲和力方面显示出1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更多倍的减少。在一些实施方案中，相对于亲本或非变体抗体，具有减少的效应子功能的抗CD154抗体以小约10倍的亲和力与FcR结合。在其他实施方案中，相对于亲本或非变体抗体，具有减少的效应子功能的抗CD154抗体以小约15倍的亲和力或小约20倍的亲和力与FcR结合。FcR受体可为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII、及其同种型，以及FcεR、FcμR、FcδR和/或FcαR中的一种以上。在具体实施方案中，具有减少的效应子功能的抗CD154抗体在与FcγRIIa的结合亲和力方面显示出1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更多倍的减少。 
因此，在某些实施方案中，相对于第二种抗CD154抗体，本发明的抗CD154抗体显示出与补体蛋白减少的结合。在某些实施方案中，相对于第二种抗CD154抗体，本发明的抗CD154抗体显示出约1.5倍以上、约2倍以上、约3倍以上、约4倍以上、约5倍以上、约6倍以上、约7倍以上、约8倍以上、约9倍以上、约10倍以上、或约15倍以上减少的结合。 
因此，在某些实施方案中，本发明涉及当施用于受试者时，引发减少的效应子功能的抗体。在某些实施方案中，本发明的抗CD154 抗体不在施用了抗体的受试者中引起血栓形成。血栓形成包括例如血栓栓塞事件。此事件包括例如血管病变(例如血管变化，例如内膜增厚和血管壁变化)。在一些实施方案中，相对于第二种CD154特异性抗体(例如抗体342、抗体5c8或人源化5c8)，本发明的抗CD154抗体引起更少的血栓栓塞事件。当施用于受试者且与非变体或亲本抗CD154抗体相比时，具有减少的效应子功能的抗CD154抗体可显示出5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％的血栓栓塞事件次数减少。 
在某些实施方案中，当与第二种CD154特异性抗体(例如抗体5c8或人源化5c8；参见实施例1)相比时，本发明的抗CD154抗体在体外不引起血小板凝集或活化，和/或使血小板凝集或活化增强至更少的程度。因此，在某些实施方案中，在标准血小板凝集或活化测定法中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)的存在不导致超过阴性对照测定法中观察到的凝集或活化20％、25％、30％或50％以上的凝集或活化。示例性标准血小板凝集测定法是本文描述(实施例1，测定法1)且在图26中显示的测定法。可在本发明中使用的标准测定法和备选血小板凝集测定法(测定法2，图27)描述于实施例11。CD154结合蛋白可为可溶性的。 
在某些实施方案中，本发明还提供CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，所述蛋白含特异性且单价结合CD40L的单个免疫球蛋白可变结构域，其中所述可溶性蛋白与CD154的结合基本上不诱导Jurkat T细胞中的JNK磷酸化。本发明还提供CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，所述蛋白含特异性且单价结合CD154的单个免疫球蛋白可变结构域，其中所述可溶性蛋白与CD154的结合基本上不诱导通过用抗CD3抗体共刺激的Jurkat T细胞的IFN-γ分泌。 
本发明的某些实施方案涉及如下抗CD154抗体，其含选自CDR-H1(SEQ ID NO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ ID NO：5)中一个以上的重链CDR序列，其中抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。在进 一步实施方案中，抗CD154抗体含至少2个所述CDR，并且在其他实施方案中，抗体含所有3个如下重链CDR序列，所述序列是CDR-H1(SEQ ID NO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ IDNO：5)。 
本发明的其他实施方案涉及如下抗CD154抗体，其含选自CDR-Ll(SEQ ID NO：6)、CDR-L2(SEQ ID NO：7)和CDR-L3(SEQ ID NO：8)中一个以上的轻链CDR序列，其中抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。在进一步实施方案中，抗CD154抗体含至少2个所述轻链CDR，并且在其他实施方案中，抗体含所有3个如下轻链CDR序列，所述序列是CDR-L1(SEQ ID NO：6)、CDR-L2(SEQ ID NO：7)和CDR-L3(SEQ ID NO：8)。 
在本发明的进一步实施方案中，具有减少的效应子功能的抗CD154抗体含所有3个如下轻链CDR序列，所述序列是CDR-L1(SEQ ID NO：6)、CDR-L2(SEQ ID NO：7)和CDR-L3(SEQ IDNO：8)，并且含所有3个如下重链CDR序列，所述序列是CDR-H1(SEQ ID NO：3)、CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ IDNO：5)。 
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的抗CD154抗体，其中抗体含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的VH序列。在某些其他实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的抗CD154抗体，其中抗体含选自SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的重链序列。在进一步实施方案中，含上述任一个以上的CDR或者重链或轻链序列的抗体是Fab或Fab’片段或其衍生物。在更进一步实施方案中，抗体是F(ab’) 2片段或其衍生物。还包括了特异性结合CD154蛋白的含CDR或者重链或轻链序列的其他抗体片段或其衍生物。可将这些抗体修饰为引发减少的效应子功能或无效应子功能。因此，在某些实施方案中，本发明涉及含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和 SEQ ID NO：11的VH序列的抗CD154抗体，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。 
在其他实施方案中，本发明涉及含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14的VL序列的抗CD154抗体，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。 
在一些实施方案中，抗体含SEQ ID NO：2的可变轻链序列。在进一步实施方案中，含SEQ ID NO：2的抗体是Fab或Fab’片段或其衍生物。在更进一步实施方案中，抗体是F(ab’)2片段或其衍生物。还包括了特异性结合CD154蛋白的含CDR或者重链或轻链序列的其他抗体片段或其衍生物。 
在另外的实施方案中，本发明涉及含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14的VL序列，且进一步含选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的VH序列的抗CD154抗体，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。 
在其他实施方案中，本发明涉及含SEQ ID NO：29的VH序列和SEQ ID NO：30的VL序列的抗CD154抗体，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。 
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合CD154蛋白的抗CD154抗体，其中抗体含SEQ ID NO：15的轻链序列。在进一步实施方案中，含SEQ ID NO：15的轻链序列的抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区(例如具有改变的糖基化和/或其他修饰的Fc区)。 
在某些实施方案中，本发明涉及含SEQ ID NO：15的轻链序列以及选自SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的重链序列的抗CD154抗体，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区(例如具有改变的糖基化和/或其他修饰的Fc区)。 
在某些实施方案中，本发明提供含如SEQ ID NO：2或 14中所示的轻链序列和如SEQ ID NO：1、9、10或11中所示的重链序列的抗CD154抗体。在一些实施方案中，抗CD154抗体可为抗体片段。在进一步实施方案中，抗体是Fab或Fab’片段或其衍生物。在更进一步实施方案中，抗体是F(ab’)2片段或其衍生物。还包括了特异性结合CD154蛋白的含CDR或者重链或轻链序列的其他抗体片段或其衍生物。此外，抗体可显示出减少的效应子功能。例如，含Fc区的抗体可含具有一种以上的修饰(例如改变的糖基化、缀合等)的Fc区，从而使得抗体引发减少的效应子功能或无效应子功能。 
在其他实施方案中，本发明涉及含SEQ ID NO：15的轻链序列和SEQ ID NO：13的重链序列的抗CD154抗体，其中抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。在其他实施方案中，本发明涉及含SEQ ID NO：15的轻链序列和SEQID NO：12的重链序列的抗CD154抗体，其中抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。 
在一些实施方案中，本发明涉及如下抗CD154抗体，其含选自CDR-H1(SEQ ID NO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQ ID NO：44)中一个以上的重链CDR序列，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。在某些实施方案中，抗CD154抗体含至少2个所述重链CDR，并且在其他实施方案中，抗体含所有3个如下重链CDR序列，所述序列是CDR-H1(SEQ ID NO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQ ID NO：44)。 
在某些实施方案中，本发明涉及如下抗CD154抗体，其含选自CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46)和CDR-L3(SEQ ID NO：47)中一个以上的轻链CDR序列，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。在某些实施方案中，抗CD154抗体含至少2个所述轻链CDR，并且在其他实施方案中，抗体含所有3个如下轻链CDR序列，所述序列是CDR-L1(SEQ ID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46) 和CDR-L3(SEQ ID NO：47)。 
本发明的进一步实施方案涉及如下抗CD154抗体，所述抗体含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区，其中抗体含所有3个如下轻链CDR序列，所述序列是CDR-L1(SEQID NO：45)、CDR-L2(SEQ ID NO：46)和CDR-L3(SEQ ID NO：47)，并且其中抗体含所有3个如下重链CDR序列，所述序列是CDR-H1(SEQ ID NO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQ ID NO：44)。 
在其他实施方案中，本发明涉及如下抗CD154抗体，其含选自CDR-H1(SEQ ID NO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQ ID NO：50)中一个以上的重链CDR序列，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。在进一步实施方案中，抗CD154抗体含至少2个所述重链CDR，并且在其他实施方案中，抗体含所有3个如下重链CDR序列，所述序列是CDR-H1(SEQ ID NO：42)、CDR-H2(SEQ ID NO：43)和CDR-H3(SEQ ID NO：44)。 
在某些实施方案中，本发明涉及如下抗CD154抗体，其含选自CDR-Ll(SEQ ID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQ ID NO：53)中一个以上的轻链CDR序列，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。在进一步实施方案中，抗体含至少2个所述轻链CDR，并且在其他实施方案中，抗体含所有3个如下轻链CDR序列，所述序列是CDR-Ll(SEQ ID NO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQ ID NO：53)。 
在某些实施方案中，具有减少的效应子功能的抗CD154抗体含所有3个如下轻链CDR序列，所述序列是CDR-Ll(SEQ IDNO：51)、CDR-L2(SEQ ID NO：52)和CDR-L3(SEQ ID NO：53)，并且进一步含所有3个如下重链CDR序列，所述序列是CDR-H1(SEQ ID NO：48)、CDR-H2(SEQ ID NO：49)和CDR-H3(SEQ ID NO：50)。 
在进一步实施方案中，本发明提供特异性结合CD154的抗CD154抗体，其中抗体含SEQ ID NO：54的VL序列。本发明还涉及含SEQ ID NO：56的VH序列的抗CD154抗体。本发明的抗CD154抗体可含SEQ ID NO：54的VL序列和SEQ ID NO：56的VH序列。在进一步实施方案中，抗体是Fab或Fab’片段或其衍生物。在更进一步实施方案中，抗体或抗体片段是F(ab’)2片段或其衍生物。抗体或片段还可为人源化或全人抗体或其片段。本发明的某些实施方案涉及含SEQ ID NO：56的VH序列和SEQ ID NO：54的VL序列的抗CD154抗体，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。 
在进一步实施方案中，本发明提供特异性结合CD154的抗CD154抗体，其中抗体含SEQ ID NO：58的VL序列。在另外的实施方案中，抗体含SEQ ID NO：60的VH序列。在进一步实施方案中，抗体或片段含SEQ ID NO：60的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列。抗体可为Fab或Fab’片段或其衍生物。在更进一步实施方案中，抗体是F(ab’)2片段或其衍生物。抗体还可为人源化或全人抗体或其片段。在其他实施方案中，本发明涉及含SEQ ID NO：58的VH序列和SEQ ID NO：60的VL序列的抗CD154抗体，所述抗体进一步含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。 
具有改变的糖基化的抗CD154抗体
聚糖去除产生应大大减少与跨物种的Fc受体家族的所有成员的结合的结构变化。在糖基化抗体(包括抗CD154抗体)中，与Fc二聚体的CH2结构域中的保守N联位点附着的聚糖(寡糖)在CH2结构域之间包围，使糖残基与相对CH2结构域上的特定氨基酸残基接触。不同糖基化模式与抗体的不同生物性质相关(Jefferis和Lund，1997，Chem.Immunol，65：111-128；Wright和Morrison，1997，Trends Biotechnol，15：26-32)。某些特定糖型赋予潜在有利的生物性质。聚糖的丧失改变结构域之间的间隔，并且增加其相对于彼此的 流动性，并且预期对Fc受体家族的所有成员的结合具有抑制作用。例如，在用各种糖基化抗体的体外研究中已证实CH2聚糖的去除改变Fc结构，从而使得与Fc受体和补体蛋白C1Q结合的抗体大大减少。减少效应子功能的另一种已知方法是抑制Fc的CH2结构域中的位置297(EU编号)处的N联聚糖的产生，或去除Fc的CH2结构域中的位置297(EU编号)处的N联聚糖(Nose et al.，1983PNAS 80：6632；Leatherbarrow et al.，1985Mol.Immunol.22：407；Tao et al.，1989Immunol.143：2595；Lund et al.，1990Mol.Immunol.27：1145；Doraiet al.，1991Hybridoma 10：211；Hand et al.，1992Cancer Immunol.Immunother.35：165；Leader et al.，1991Immunology 72：481；Poundet al.，1993Mol.Immunol.30：233；Boyd et al.，1995Mol.Immunol.32：1311)。还已知不同糖型可显著影响治疗性质，包括药代动力学、药效学、受体相互作用和组织特异性靶向(Graddis et al.，2002，CurrPharm Biotechnol.3：285-297)。尤其是，对于抗体，寡糖结构可影响与蛋白酶抗性相关的性质、由FcRn受体介导的抗体的血清半衰期、噬菌作用和抗体反馈、加上抗体效应子功能(例如与补体复合物C1结合，这诱导CDC，和与FcγR受体结合，这负责调节ADCC通路)(Nose和Wigzell，1983；Leatherbarrow和Dwek，1983；Leatherbarrow et al.，，1985；Walker et al.，1989；Carter et al.，1992，PNAS，89：4285-4289)。 
因此，调节抗体的效应子功能的另一种方法包括改变抗体恒定区的糖基化。改变的糖基化包括例如许多糖基化残基的减少或增多，糖基化残基模式或位置的改变，以及糖结构的改变。在人IgG上发现的寡糖影响其效应子功能程度(Raju，T.S.BioProcessInternational April 2003.44-53)；人IgG寡糖的微观不均匀性可影响生物学功能例如CDC和ADCC、与各种Fc受体的结合和与C1q蛋白的结合(Wright A.& Morrison SL.TIBTECH 1997，1526-32；Shieldset al.，J Biol Chem.2001276(9)：6591-604；Shields et al.，J Biol Chem.2002；277(30)：26733-40；Shinkawa et al.，J Biol Chem.2003 278 (5)：3466-73；Umana et al.，Nat Biotechnol.1999Feb；17(2)：176-80)。例如，IgG结合C1q且活化补体级联的能力可依赖定位在2个CH2结构域之间的碳水化合物部分(这通常锚定在Asn297处)的存在、不存在或修饰(Ward和Ghetie，Therapeutic Immunology 2：77-94(1995)。 
含Fc的多肽(例如抗体(例如IgG抗体))中的糖基化位点可通过标准技术进行鉴定。糖基化位点的鉴定可为实验的或基于序列分析或建模数据。共有基序即由各种糖基转移酶识别的氨基酸序列已得到描述。例如，N联糖基化基序的共有基序通常是NXT或NXS，其中X可为除脯氨酸外的任何氨基酸。用于定位潜在的糖基化基序的几种算法已得到描述。因此，为了鉴定抗体或含Fc片段内的潜在糖基化位点，抗体的序列例如通过使用可公开获得的数据库进行检查，例如由Center for Biological Sequence Analysis提供的网站(关于预测N联糖基化位点参见NetNGlyc服务器，和关于预测O联糖基化位点参见NetOGlyc服务器)。 
体内研究已证实无糖基抗体的效应子功能中的减少。例如，无糖基抗CD8抗体无法耗尽小鼠中具有CD8的细胞(Isaacs，1992J.Immunol.148：3062)，并且无糖基抗CD3抗体在小鼠或人中不诱导细胞因子释放综合征(上述Boyd(1995)的文章；Friend，1999Transplantation 68：1632)。 
重要的是，尽管CH2结构域中聚糖的去除看起来对效应子功能具有明显影响，但抗体的其他功能和物理性质仍未改变。尤其是，已显示聚糖的去除对血清半衰期和与抗原的结合具有很少的影响或无影响(上述Nose(1983)的文章；上述Tao(1989)的文章；上述Dorai(1991)的文章；上述Hand(1992)的文章；Hobbs，1992Mol.Immunol.29：949)。 
尽管存在无糖基化方法的体内验证，但存在用无糖基mAbs的残留效应子功能的报告(参见例如，Pound，J.D.et al.，(1993)Mol.Immunol 30(3)：233-41；Dorai，H.et al.，(1991)Hybridoma 10(2)：211-7)。Armour等人显示与FcγRIIa和FcγRIIb蛋白残留的结合(Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-1624；Mol.Immunol.40(2003)585-593)。因此，效应子功能特别是补体活化中的进一步减少，在一些情况下对于保证活性的完全取消可能是重要的。为此，设想了IgG2和IgG4和G1/G4嫁接物的无糖基形式，因为在具有减少的效应子功能的本发明的方法和抗体组合物中有用。 
去糖基化的和无糖基抗CD154抗体的产生
本发明的抗CD154抗体可进行修饰或改变，以引发减少的效应子功能(与第二种CD154特异性抗体相比)，同时任选保留Fc部分的其他有价值的属性。 
因此，在某些实施方案中，本发明涉及具有减少的效应子功能的无糖基抗CD154抗体，其特征在于在抗体的Fc部分的CH2结构域中的保守N联位点处的修饰。Fc二聚体的CH2结构域中的保守N联位点的修饰可导致无糖基抗CD154抗体。此修饰的例子包括Fc二聚体的CH2结构域中的保守N联位点的突变，与CH2结构域中的N联位点附着的聚糖的去除，和糖基化的阻止。例如，可通过使重链CH2结构域中的常规N联Asn位点变成Gln残基来产生无糖基抗CD154抗体(参见例如，WO 05/03175和US 2006-0193856)。 
在本发明的一个实施方案中，修饰含在重链糖基化位点处的突变，以阻止在该位点处的糖基化。因此，在本发明的一个实施方案中，无糖基抗CD154抗体通过重链糖基化位点的突变(即N298Q(使用Kabat EU编号的N297)的突变)进行制备，并且在合适的宿主细胞中表达。例如，这个突变可通过关于来自Amersham-Pharmacia (Piscataway，NJ，USA)的独特位点诱变剂盒根据制造商推荐的方案来实现。 
突变抗体可在宿主细胞(例如NSO或CHO细胞)中稳定表达，随后进行纯化。例如，纯化可使用蛋白A和凝胶过滤层析来进行。对于本领域技术人员显而易见的是，还可使用另外的表达和纯化方法。 
在本发明的另一实施方案中，无糖基抗CD154抗体具有减少的效应子功能，其中在所述抗体或抗体衍生物的Fc部分的CH2结构域中的保守N联位点处的修饰含CH2结构域聚糖的去除，即去糖基化。这些无糖基抗CD154抗体可通过常规方法来产生，然后酶促去糖基化。用于抗体的酶促去糖基化的方法是本领域技术人员众所周知的(Williams，1973；Winkelhake & Nicolson，1976J.Biol Chem.251：1074-80.)。 
在本发明的另一实施方案中，去糖基化可通过使产生抗体的宿主细胞在培养基中生长来达到，所述培养基含糖基化抑制剂例如衣霉素(Nose & Wigzell，1983)。即，修饰是在所述抗体的Fc部分的CH2结构域中的保守N联位点处的糖基化的减少或阻止。 
在本发明的其他实施方案中，重组CD154多肽(或含此多肽的细胞或细胞膜)可用作抗原，以产生抗CD154抗体或抗体衍生物，其随后可进行去糖基化。 
在备选实施方案中，本发明的无糖基抗CD154抗体或具有减少的糖基化的抗CD154抗体，可通过Taylor等人(WO 05/18572和US 2007-0048300)中所述方法来产生。例如，在一个实施方案中，抗CD154无糖基抗体可通过改变第一个氨基酸残基(例如通过置换、插入、删除、或通过化学修饰)来产生，其中改变的第一个氨基酸残基通过空间位阻或电荷或两者抑制第二个残基的糖基化。在某些实施方案中，第一个氨基酸残基通过氨基酸置换进行修饰。在进一步实施方案中，氨基酸置换选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Asn、Gln、Trp、Pro、Ser、Thr、Tyr、Cys、Met、Asp、Glu、Lys、Arg和His。在其他实施方案中，氨基酸置换是非常规氨基酸残基。第二个氨基酸残基可接近或在糖基化基序内，例如含氨基酸序列NXT或NXS的N联糖基化基序。在一个示例性实施方案中，第一个氨基酸残基是氨基酸299，和第二个氨基酸残基是氨基酸297(根据Kabat编号)。例如，第一个氨基酸置换可为T299A、T299N、T299G、T299Y、T299C、T299H、T299E、T299D、T299K、T299R、T299G、T299I、T299L、 T299M、T299F、T299P、T299W和T299V(根据Kabat编号)。在具体实施方案中，氨基酸置换是T299C。 
效应子功能也可这样减少：通过修饰本发明的抗体，从而使得抗体含阻断部分。示例性阻断部分包括足够空间位阻和/或电荷的部分，从而使得减少的糖基化发生，例如通过阻断糖苷酶使多肽糖基化的能力。阻断部分可另外或备选地减少效应子功能，例如通过抑制Fc区结合受体或补体蛋白的能力。在一些实施方案中，本发明涉及CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)，其含选自SEQ ID NO：5、44和50的重链CDR3序列，以及变体Fc区，所述变体Fc区含第一个氨基酸残基和N糖基化位点，第一个氨基酸残基经侧链化学进行修饰，以达到与未经修饰的第一个氨基酸残基相比，增加的空间位阻或增加的静电电荷，从而减少在N糖基化位点处的糖基化水平或以其他方式改变在N糖基化位点处的糖基化。在某些这些实施方案中，与对照、非变体Fc区相比，变体Fc区赋予减少的效应子功能。在进一步实施方案中，具有增加的空间位阻的侧链是选自下述的氨基酸残基的侧链：Phe、Trp、His、Glu、Gln、Arg、Lys、Met和Tyr。在更进一步实施方案中，具有增加的静电电荷的侧链化学是选自下述的氨基酸残基的侧链：Asp、Glu、Lys、Arg和His。 
因此，在一个实施方案中，糖基化和Fc结合可通过用带电侧链化学(例如D、E、K或R)置换T299来调节。由于不利的静电相互作用，所产生的抗体将具有减少的糖基化和与Fc受体减少的Fc结合亲和力。 
在另一实施方案中，与其无糖基化抗体对应物(参见例如WO 05/18572)相比，无糖基化且能够形成半胱氨酸加合物的T299C变体抗体可显示出更少的效应子功能(例如FcγRI结合)。因此，接近糖基化基序的第一个氨基酸的改变可抑制在第二个氨基酸残基处抗体的糖基化；当第一个氨基酸残基是半胱氨酸残基时，抗体可显示出更进一步减少的效应子功能。此外，与其他亚型中的无糖基化的影响相比，IgG4亚型抗体的糖基化的抑制可能对FcγRI结合具有更显著的 影响。 
在另外的实施方案中，本发明涉及具有改变的糖基化的抗CD154抗体，其显示出与一种以上的FcR受体减少的结合，并且任选还显示出与一种以上的Fc受体和/或补体增加的或正常的结合(例如至少维持与天然、对照抗CD154抗体相同或相似的对于一种以上的Fc受体和/或补体的结合亲和力的具有改变的糖基化的抗体)。例如，与其中Man5GlcNAc2N-聚糖结构不占优势的抗CD154抗体群相比，具有占优势地Man5GlcNAc2N-聚糖作为存在的聚糖结构的抗CD154抗体(例如，其中Man5GlcNAc2N-聚糖结构以比Ig组合物的下一个占优势聚糖结构多至少约5摩尔百分比的水平存在)可显示出改变的效应子功能。具有占优势地这种聚糖结构的抗体显示出与FcγRIIa和FcγRIIb减少的结合，与FcγRIIIa和FcγRIIIb增加的结合，以及与C1复合物的C1q亚单位增加的结合(参见US 2006-0257399)。这种聚糖结构当它是占优势的聚糖结构时，赋予增加的ADCC、增加的CDC、增加的血清半衰期、B细胞增加的抗体产生、和减少的经由巨噬细胞的噬菌作用。 
一般而言，在糖蛋白上的糖基化结构将依表达宿主和培养条件而变(Raju，TS.Bio Process International April 2003.44-53)。此差异可导致效应子功能和药代动力学中的变化(Israel et al.，Immunology.1996；89(4)：573-578；Newkirk et al.，P.Clin.Exp.1996；106(2)：259-64)。例如，糖基化可随着细胞培养条件改变，这可赋予一些免疫球蛋白组合物免疫原性，依赖其具体半乳糖模式(Patelet al.，1992.Biochem J.285：839-845)。由非人哺乳动物细胞产生的糖蛋白的寡糖结构趋于与人糖蛋白的寡糖结构更紧密相关。此外，蛋白表达宿主系统可进行改造或选择，以表达占优势的Ig糖型，或备选地可天然产生具有占优势的聚糖结构的糖蛋白。产生具有占优势糖型的糖蛋白的经改造蛋白表达宿主系统的例子包括基因敲除/突变(Shields et al.，2002，JBC，277：26733-26740)；遗传改造(Umanaet al.，1999，Nature Biotech.，17：176-180)或两者的组合。备选地， 某些细胞天然表达占优势的糖型——例如，鸡、人和牛(Raju et al.，2000，Glycobiology，10：477-486)。因此，本领域技术人员可通过选择许多表达宿主系统中的至少一种来获得具有改变的糖基化(例如占优势地一种特定聚糖结构)的抗CD154抗体或抗体组合物的表达。可用于产生本发明的抗CD154抗体的蛋白表达宿主系统包括动物、植物、昆虫、细菌细胞等。例如，US 2007-0065909、2007-0020725和2005-0170464描述了在细菌细胞中产生无糖基化的免疫球蛋白分子。作为进一步的例子，Wright和Morrison在糖基化方面缺陷的CHO细胞系中产生了抗体(1994J Exp Med 180：1087-1096)，并且显示在这种细胞系中产生的抗体无法补体介导的细胞溶解。在本领域中发现的用于产生糖蛋白的其他表达宿主系统的例子包括：CHO细胞：Raju WO 99/22764和Presta WO 03/35835；杂交瘤细胞：Trebak et al.，1999，J.Immunol.Methods，230：59-70；昆虫细胞：Hsu et al.，1997，JBC，272：9062-970，和植物细胞：Gerngross et al.，WO 04/74499。就给定细胞或提取物已导致给定基序的糖基化的程度，用于测定基序是否被糖基化的领域公认技术是可用的，例如使用凝胶电泳和/或质谱法。 
用于改变抗体的糖基化位点的另外方法例如在US6,350,861和US 5,714,350、WO 05/18572和WO 05/03175中描述；这些方法可用于产生具有改变、减少的糖基化或无糖基化的本发明的抗CD154抗体。 
具有减少的效应子功能的无糖基抗CD154抗体可为如下抗体，其含修饰或可缀合以含功能部分。此部分包括阻断部分(例如，PEG部分、半胱氨酸加合物等)、可检测部分(例如，荧光部分、放射性同位素部分、不透射线的部分等，包括诊断部分)，和/或治疗部分(例如，细胞毒性剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗感染剂、抗癌剂、抗神经变性剂、放射性核素等)。 
抗体缀合物
当施用时，抗体通常从循环中快速清除，并且因此可引发 相对短寿命的药理学活性。因此，可能需要相对大剂量的抗体的频繁注射，以维持抗体治疗的治疗效力。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗CD154抗体可为经修饰(与其他部分例如异源功能部分缀合)的抗体，以增加抗体在体内的完整性和寿命。例如，本发明的抗CD154抗体可为经修饰以包括部分(功能部分)的抗体，所述部分可增加稳定性，从而延长抗体的血清半衰期。本发明的CD154结合蛋白(例如抗体)的血清半衰期可为至少3天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天、至少1个月或更久。增加抗体的半衰期的此功能部分例如在其中抗体是抗体片段的实施方案中可为特别有用的。 
抗体修饰也可增加蛋白在水溶液中的溶解性，消除凝集，增强蛋白的物理和化学稳定性，并且大大地减少蛋白的免疫原性和抗原性。因此，通过比用未修饰的蛋白更少的频率或更低的剂量施用此聚合物-蛋白加合物可达到所需体内生物活性。 
因此，在某些实施方案中，本发明的抗体是与异源功能部分附着的抗体，以形成抗体缀合物。“功能部分”指与本发明的抗体结合的任何功能部分(例如，多肽、蛋白结构域、载体、聚合物等)。与抗CD154抗体的结合可为共价或非共价附着，并且可为可逆或可调节的。可用于形成本发明的CD154抗体缀合物的示例性分子包括但不限于功能部分，例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、其他抗体、抗体衍生物或抗体片段，合成的(例如PEG)或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、适体、放射性核素(特别是放射性碘、放射性同位素)、螯合金属、纳米颗粒和报告基团(例如荧光或发光化合物或者可通过成像技术(例如NMR或ESR光谱法)检测的化合物)。 
在一个进一步的例子中，缀合有本发明的抗体的功能部分可增加抗体在体内的半衰期，和/或减少抗体的免疫原性和/或增强抗体经过上皮屏障递送给免疫系统。这种类型的合适功能部分的例子包括聚合物、右旋糖、羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、转铁蛋白、白 蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如在PCT/GB2005/002084中所述那些。 
当功能部分是聚合物时，一般而言，它可为合成或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物，或者支链或未分支多糖(例如同或异多糖)。参见例如Veronese和Pasut，2005，Drug Discovery Today，10(21)：1451-1458；Pasut et al.，2004，Expert Opinion in Therapeutic Patents，14(6)：859-894。 
可存在于上述合成聚合物上的具体任选取代基包括一个以上的羟基、甲基或甲氧基。 
合成的聚合物的具体例子包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚乙烯醇或其衍生物，尤其是任选取代的聚(乙二醇)，例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。 
具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、右旋糖、糖原或其衍生物。在这个背景下的“衍生物”意欲包括反应衍生物，例如硫醇选择性反应基团(例如马来酰亚胺等)。反应基团可直接或通过接头区段与聚合物连接。应当理解，此基团的残基在一些情况下将形成产物的部分，作为抗体片段和聚合物之间的连接基团。 
需要时，可改变聚合物的大小，但平均分子量一般将为500Da-50000Da，优选5000Da-40000Da且更优选20000Da-40000Da。聚合物大小可特别基于产物的预期用途进行选择，所述用途例如定位至某些组织(例如肿瘤)或延长循环半衰期的能力(关于综述，参见Chapman，2002，Advanced Drug Delivery Reviews，54，531-545)。因此，例如，当产物预期离开循环且渗透组织，例如用于在肿瘤治疗中使用时，使用小分子量聚合物(例如具有约5000Da的分子量)可能是有利的。对于其中产物保留在循环中的应用，使用较高分子量聚合物(例如具有在20000Da-40000Da的分子量)可为有利的。 
特别优选的聚合物包括聚亚烷基聚合物，例如聚(乙二醇) (或尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物)，且尤其具有约15000Da-约40000Da的分子量。 
优选地，本发明的抗体、抗体衍生物或抗体片段，包括具有减少的效应子功能的抗体或片段，与聚亚烷基聚合物，特别是聚(乙二醇)(在本文中缩写为PEG)或其衍生物附着。在某些实施方案中，本发明的抗体、抗体衍生物或抗体片段是如下抗体片段，其是Fab’或F(ab’)2片段或其衍生物，在重链或轻链或两者上与PEG附着。这种Fab’或其F(ab’)2片段可为人或人源化的。 
因此，在本发明的某些实施方案中，本发明的抗CD154抗体是通过功能部分(例如水溶性聚合物的共价附着进行修饰的抗体，所述聚合物例如聚(乙二醇)、聚(乙二醇)和聚(丙二醇)的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)或聚(脯氨酸)，所有这些已知在静脉内注射后显示出在血液中比相应未经修饰的蛋白基本上更长的半衰期。参见例如，Abuchowski et al.，1981.In：″Enzymes as Drugs″，Holcenberg et al.，(编辑)1981.Wiley-Inter science，New York，NY，367-383(1981)；Anderson，W.F.1992.Human Gene Therapy.Science 256：808-813；Newmark etal.，1982.J.Appl.Biochem.4：185-189；Katre et al.，1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：1487-1491。 
在一些实施方案中，本发明的抗体是与功能部分(例如聚(乙二醇)(PEG)部分)附着的抗体。在一个具体实施方案中，抗体是抗体片段，并且PEG分子可通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸功能基团进行附着，所述基团例如任何游离氨基、亚氨基、硫醇、羟基或羧基。此氨基酸可在抗体片段中天然存在，或可使用重组DNA方法改造到片段内(参见例如US 5,219,996；US5,667,425；WO 98/25971)。在另一实施方案中，本发明的Fab片段通过使其重链的C末端与一个以上的氨基酸附着来进行修饰，以允许功能部分的附着。优选地，另外的氨基酸形成含可附着有功能部分的一个以上的半胱氨酸残基的经修饰的铰链区。多个位点可用于附着2 个以上PEG分子。 
在本发明的某些方面，PEG分子可通过位于本发明的抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基进行共价连接。与经修饰的抗体片段附着的每个PEG分子可与位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子共价附着。共价连接将一般是二硫键，或尤其是硫-碳键。当巯基用作适当活化的功能部分的附着点时，可使用例如硫醇选择性衍生物(例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物)。活化PEG可用作如上所述经PEG修饰的抗体片段的制备中的起始材料。活化PEG可为含硫醇反应基团的任何PEG，所述反应基团例如α-卤羧酸或酯(例如碘乙酰胺、酰亚胺(例如马来酰亚胺)、乙烯基砜或二硫化物)。在某些实施方案中，抗CD154抗体缀合物可含2个PEG分子与2个马来酰亚胺分子。起始材料可商购获得(例如来自Nektar，之间是ShearwaterPolymers Inc.，Huntsville，AL，USA)，或可使用常规化学操作由商购可得的起始材料进行制备。具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可从Nektar，之前是Shearwater；Rapp Polymere；和SunBio获得)和M-PEG-SPA(可从Nektar，之前是Shearwater获得)。 
在一个优选实施方案中，本发明的抗体是经修饰的Fab片段，其是PEG化的，即具有与之共价附着的PEG(聚(乙二醇))，例如根据EP 0948544中公开的方法(还参见″Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnical and Biomedical Applications″，1992，J.Milton Harris(编辑)，Plenum Press，New York，″Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications″，1997，J.Milton Harris和S.Zalipsky(编辑)，American Chemical Society，Washington DC和″Bioconjugation Protein Coupling Techniques forthe Biomedical Sciences″，1998，M.Aslam和A.Dent，GrovePublishers，New York；Chapman，A.2002，Advanced Drug DeliveryReviews 2002，54：531-545)。在一个例子中，PEG与铰链区中的半胱氨酸附着。在另一个例子中，经PEG修饰的Fab片段具有与经修饰的铰链区中的单个巯基共价连接的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可 与马来酰亚胺基团共价连接，并且赖氨酸残基上的每个胺基可与具有约20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物附着。与Fab片段附着的PEG的总分子量因此可为约40,000Da。 
在另一实施方案中，功能部分是PEG，并且使用WO98/25971和WO 04/72116中所述方法附着，其中赖氨酰-马来酰亚胺基团与重链的C末端处的半胱氨酸残基附着，并且赖氨酰残基的每个氨基已与具有约20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)残基共价连接。与抗体附着的PEG的总分子量因此是约40,000Da。 
在另一实施方案中，功能部分是PEG，并且使用WO98/25971和WO 04/072116中所述方法与F(ab)2片段附着，其中赖氨酰-二马来酰亚胺基团与每条Fab重链的C末端处的半胱氨酸残基附着，并且赖氨酰残基的每个氨基已与具有约20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)残基共价连接。与F(ab)2抗体附着的PEG的总分子量因此是约40,000Da。 
在本发明的某些实施方案中，本发明的抗体是Fab’抗体片段，其可为全人或人源化的，并且在重链、轻链或两者中是PEG化的。在其他实施方案中，全人或人源化的抗体片段在一条或两条重链、或者一条或两条轻链、或者重链和轻链上是PEG化的。 
因此，在某些实施方案中，抗CD154抗体是PEG连接的抗体(例如PEG连接的人抗体)，其中PEG与抗体在半胱氨酸或赖氨酸残基处连接。在某些实施方案中，PEG化的抗CD154抗体具有至少24kD的流体动力学尺寸。在其他实施方案中，PEG的尺寸可任意变化于20kD-60kD(包括端点)。在进一步实施方案中，PEG连接的抗CD154抗体具有至少200kD的流体动力学尺寸。在其中抗CD154抗体与PEG部分连接的本发明的实施方案中，相对于缺乏PEG部分的抗CD154抗体，PEG化的抗CD154抗体可具有增加的体内半衰期。 
在某些实施方案中，本发明提供含SEQ ID NO：15的轻链序列和SEQ ID NO：13的重链序列的CD154结合蛋白，其中蛋白 是PEG化的。 
在改善本发明抗体的体内完整性和寿命方面可有用的其他功能部分包括多肽。例如，本发明的抗CD154抗体或抗体片段可进行修饰，以包括人血清白蛋白(HSA)多肽。与未缀合的抗体或抗原结合片段相比，此抗体缀合物可显示出增加的稳定性和增加的血清半衰期。例如，在某些实施方案中，相对于未缀合的抗CD154抗体，与HSA缀合的抗CD154抗体可显示出增加的体内半衰期。HSA缀合抗体的半衰期(tα-或tβ-半衰期)可增加10％、20％、30％、40％、50％或更多。例如，tα-半衰期可在0.25分钟-12小时范围内，而tβ-半衰期可例如在12-48小时内。tα-或tβ-半衰期可优选是至少3天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天、至少1个月或更久。 
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗CD154抗体是经功能部分修饰(通过用可检测标记物标记)的抗体，所述可检测标记例如放射性同位素、酶、染料或生物素、或其他亲和剂。 
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗CD154抗体是经功能部分修饰(与治疗剂缀合)的抗体，所述治疗剂例如放射性同位素或放射性核素(例如111In或90Y)、毒素部分(例如，破伤风类毒素或蓖麻蛋白)、类毒素或化学治疗剂(U.S.6,307,026)。 
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗CD154抗体是通过与显像剂缀合修饰的抗体。显像剂可包括例如用于容易分离或检测的标记部分(例如，生物素、荧光部分、放射性部分、组氨酸或myc标签或其他肽标签)。 
用于本发明的抗CD154抗体的修饰或与本发明的抗CD154抗体缀合的功能部分的进一步例子，可包括血清毒素或细胞毒性剂，包括对于细胞有害(例如杀死)的任何制剂。例子包括combrestatins、dolastatins、埃博霉素、星形孢菌素、类美坦素、spongistatins、根霉素、软海绵素、杆孢菌素、哈米特林、泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二 羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。 
在缀合中有用的功能部分包括但不限于，抗叶酸剂(例如氨基蝶呤和氨甲蝶呤)、抗代谢药(例如氨甲蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、和顺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环(例如柔红霉素(之前是道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(之前是放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、氨茴霉素(AMC)、卡奇霉素或多卡米星、CC-1065、enedieyenes、新制癌菌素)、和抗有丝分裂药(例如长春新碱和长春碱)。关于进一步的细节，参见Garnett，2001，Advanced drug Delivery Reviews 53：171-216。 
其他功能部分可包括螯合放射性核素，例如131I、111In和 90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188、211砹；或药物例如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷和舒拉明。 
进一步的功能部分包括蛋白、肽和酶。感兴趣的酶包括但不限于，蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白、多肽和肽包括但不限于，免疫球蛋白、毒素(例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素)、类美坦素(例如，但不限于DMl)、蛋白(例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子或组织型纤溶酶原激活物)、血栓形成剂或抗血管生成剂(例如血管他丁或内皮他丁)、血管生成素、白树毒素、dolstatins、小沟结合剂、bis-ido-phenolmustard、或生物应答修饰剂(例如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子)。 
其他功能部分可包括例如在诊断中有用的可检测物质。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于在正电子发射断层摄影术中使用)、和非放射性顺磁金属离子。关于可与抗体缀合用于用作诊断剂的金属离子，一般参见US 4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉亲和素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和水母素；并且合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。 
核酸
在某些方面，本发明涉及编码本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)的核酸。 
因此，在某些实施方案中，本发明涉及分离的、重组的和/或合成的DNA分子，其含选自下述一个以上的序列：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：73。 
在另一个方面，本公开内容的特征在于含编码多肽的一种以上的序列的分离核酸，所述多肽包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60的可变结构域序列的序列至少80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或100％等同的序列， 或与编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：SEQ ID NO：56或SEQ IDNO：60的可变结构域的序列的核酸杂交(例如在严格条件下)的序列。 
本发明的核酸可进一步包括调节序列(例如，启动子序列、非翻译的5’区和非翻译的3’区)和/或载体序列。例如，核酸构成载体。在更进一步实施方案中，本发明涉及含载体的宿主细胞。宿主细胞可产生抗体，从而使得抗体显示出减少的糖基化或无糖基化(例如，如果Fc区存在)。 
本发明还涉及上述核酸的序列变体。例如，本发明包括与本文提供的任何序列约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、99.5％、99.9％或100％等同的核酸序列，包括其片段和针对其的互补体。本发明还包括由于遗传密码的简并性与本文具体提供的序列不同的核酸。 
此外，本发明包括与本文提供的任何核酸特异性杂交的序列。术语“特异性杂交”指核酸序列与本文提供的序列或针对其的序列互补体的至少12、15、20、25、30、35、40、45、50或100个连接核苷酸杂交的能力，从而使得它具有与对照核酸(例如，非特异性DNA或除本文提供的具体抗体序列外的DNA)小于15％、优选小于10％、和更优选小于5％的背景杂交。各种杂交条件可用于检测特异性杂交，并且严格性主要由杂交测定法的洗涤步骤决定。一般而言，高温和低盐浓度产生高严格性，而低温和高盐浓度产生低严格性。通过在例如约2.0×SSC中在50℃下洗涤达到低严格性杂交，并且用约0.2×SSC在50℃下达到高严格性。 
编码本发明的CD154结合蛋白的核酸可含前导或信号序列。前导和信号序列可改变，并且可用备选前导序列取代，并且应当理解，在某些实施方案中，本发明的CD154结合蛋白含无前导序列的序列。可使用任何合适的备选前导或信号序列。 
宿主细胞
本发明涉及经改造以表达图2-8、10、11和13-16中提供的任何DNA分子，包括其序列变体的宿主细胞。 
还提供表达本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)的宿主细胞。无论结合蛋白还是抗体，它可仅含一条链，在该情况下，仅需要将编码那条多肽链的DNA序列用于转染细胞。对于含2条链的抗体的产生，细胞系可用2种载体进行转染。备选地，合适时，单个载体可编码2条链序列，例如抗CD154抗体的轻链和重链，以及变化，依赖待表达的具体抗体结构。宿主细胞可为例如原核细胞例如大肠杆菌，或其他微生物细胞，或真核细胞包括但不限于哺乳动物细胞，例如人、小鼠、猴、兔、山羊、仓鼠或大鼠细胞，昆虫细胞，禽类细胞，植物细胞和低等真核细胞例如真菌细胞(参见下文)。应当理解宿主细胞机制负责使重组表达的蛋白糖基化，并且因此可选择具体糖基化模式，以进一步改变本发明的抗体的效应子功能。 
在本发明的一些实施方案中，用于实践本发明的宿主细胞可为例如(1)细菌细胞例如大肠杆菌、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)、链球菌属(Streptococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链霉菌属(Streptomyces)物种和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞、和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；(2)真菌细胞和曲霉菌属(Aspergillus)细胞、酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosacch aromycespombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、其他毕赤酵母属物种、乳酸克鲁维氏酵母(K.lactis)，(3)昆虫细胞系，例如来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞(如Sf9和Sf21细胞系，以及expresSFTM细胞(Protein SciencesCorp.，Meriden，CT，USA))、果蝇属S2细胞，和粉纹叶蛾(Trichoplusiani)High Cells(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)；(4)哺乳动物细胞，或(5)植物细胞。 
因此，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体) 可在任何可用的原核或真核宿主细胞中产生，所述细胞能够被改造以表达外源核酸序列。可用于产生本发明的抗CD154抗体的低等真核宿主细胞包括本领域中所述那些细胞(参见例如，WO 02/00879、WO03/056914、WO 04/074498、WO 04/074499，Choi et al.，2003，PNAS，100：5022-5027；Hamilton et al.，2003，Nature，301：1244-1246和Bobrowicz et al.，2004，Glycobiology，14：757-766)。 
一般的哺乳动物细胞包括COS1和COS7细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO骨髓瘤细胞、NIH 3T3细胞、293细胞、HEPG2细胞、HeLa细胞、C127、3T3、BHK、Bowes黑素瘤细胞、L细胞、MDCK、HEK293、WI38、鼠类ES细胞系(例如，来自品系129/SV、C57/BL6、DBA-1、129/SVJ)、K562、Jurkat细胞和BW5147。本发明因此提供表达本发明的抗体的细胞，包括但不限于杂交瘤细胞、B细胞、浆细胞，以及经重组修饰以表达本发明的抗体的哺乳动物和人宿主细胞(例如成人胚胎干细胞)。其他有用的哺乳动物细胞系是众所周知的，并且可从美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)(Manassas，VA，USA)和在Coriell Cell Repositories(Camden，NJ，USA)的National Institute of General Medical Sciences(NIGMS)HumanGenetic Cell Repository容易地获得。这些细胞类型仅是代表性的，并且这个列表不意味着是详尽列表。 
在其他考虑中，其中一些是上述，宿主细胞可就其以所需方式处理所表达的抗CD154抗体的能力进行选择。除经修饰的糖基化和无糖基化外，多肽的此翻译后修饰包括但不限于乙酰化、羧化、羧甲基化、磷酸化、脂化和酰化。 
在本发明的另一实施方案中，本发明的抗CD154抗体通过无细胞翻译或在体外合成进行制备。编码这些蛋白的基因可在体外合成。 
在另一实施方案中，本发明的抗CD154抗体在含抗体表达细胞的生物反应器中进行生产，以便促进大规模生产。 
在另一实施方案中，本发明的CD154结合蛋白或抗 CD154抗体在乳中表达抗体的经遗传改造或转基因哺乳动物(例如，山羊、牛、绵羊)中进行生产，以便促进抗CD154抗体的大规模生产(US 5,827,690；Pollock et al.，1999.J.Immunol.Meth.231(1-2)：147-57)。 
治疗方法
在本发明的一个实施方案中，CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制受试者中的免疫应答。以有效抑制量给受试者施用本发明的抗体或本发明的药物组合物。 
在某些实施方案中，抗CD154抗体或含所述抗体的药物组合物的“有效抑制量”是有效抑制施用了所述抗体或药物组合物的受试者中的CD154-CD40相互作用的任何量。确定“抑制量”的方法是本领域技术人员众所周知的，并且依赖包括但不限于下述的因素：涉及的受试者类型、受试者的大小和年龄以及递送的具体治疗剂的药代动力学性质。 
在本发明的另一个具体实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够通过抑制CD154-CD40相互作用而抑制免疫应答。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制炎症。为了本发明的目的，炎症应答的特征在于发红、肿大、发热和疼痛，作为毛细血管膨胀与水肿和吞噬性白细胞的迁移的结果。炎症应答的一些例子包括：关节炎、接触性皮炎、高IgE综合征、炎性肠病、变应性哮喘和特发性炎性疾病。特发性炎性疾病包括例如牛皮癣和狼疮(例如，全身性红斑狼疮(SLE)、药物诱发性红斑狼疮、和狼疮mephritis)。参见例如，Gallin 1989.Fundamental Immunology，第26章，Raven Press，第2版，第721-733页，New York。本发明提供治疗或预防个体中的全身性红斑狼疮(SLE)症状的方法，所述方法包括以有效治疗或预防SLE症状的量给个体施用单价CD154结合 蛋白，例如单价抗CD154抗体。 
关节炎的一些例子包括：类风湿性关节炎、非类风湿性炎性关节炎、与莱姆病相关的关节炎和炎性骨关节炎。特发性炎性疾病的一些例子包括：牛皮癣和全身性狼疮。 
在本发明的一个实施方案中，抗CD154抗体或含所述抗体的药物组合物，能够抑制受试者对移植器官的排斥。 
在本发明的一个更具体的实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制受试者对移植心脏、肾、肝、皮肤、胰岛细胞或骨髓的排斥。 
在本发明的一个实施方案中，CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制受试者中的移植物抗宿主病。 
在本发明的一个实施方案中，CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制受试者中的变应性应答，例如花粉热或者对青霉素或其他药物的过敏症。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制患有自身免疫疾病的受试者中的自身免疫应答。在一些实施方案中，自身免疫应答与选自下述的病状相关或源自选自下述的病状：类风湿性关节炎、重症肌无力、全身性红斑狼疮、格雷夫斯氏病、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、糖尿病、炎性肠病、克罗恩氏病、多发性硬化症、牛皮癣、药物诱发性自身免疫疾病、或药物诱发性狼疮。在某些实施方案中，自身免疫应答与全身性红斑狼疮相关或源自全身性红斑狼疮。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制患有自身免疫应答的受试者中的自身免疫应答，所述自身免疫应答源自传染病。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白 (例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制患有自身免疫应答的受试者中的自身免疫应答，所述自身免疫应答源自莱特氏综合征、椎关节炎、莱姆病、HIV感染、梅毒或肺结核。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制受试者中的纤维化。 
纤维化的一些例子包括：肺纤维化或纤维变性疾病。肺纤维化的一些例子包括：成人呼吸窘迫综合征继发的肺纤维化、药物诱发性肺纤维化、特发性肺纤维化、或过敏性肺炎。纤维变性疾病的一些例子包括：丙型肝炎；乙型肝炎；肝硬化；毒素损伤继发的肝的硬化；药物继发的肝的硬化；病毒感染继发的肝的硬化；和自身免疫疾病继发的肝的硬化。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制胃肠道疾病。胃肠道疾病的一些例子包括：食管活动不良、炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、胃炎、胶原性结肠炎(包括淋巴细胞性结肠炎和微观结肠炎)、腹部疾病(也称为麸质肠病、腹腔口炎性腹泻或麸质耐受不良)和硬皮病。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制血管疾病。血管疾病的一些例子包括：动脉粥样硬化、肾动脉疾病、淋巴水肿、局部缺血性病症和再灌注损伤。还包括了胶原血管/免疫复合物疾病，例如全身性红斑狼疮或冷球蛋白血症。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制患有T细胞癌症的受试者中的T细胞肿瘤细胞增殖，所述T细胞癌症例如T细胞白血病或淋巴瘤。此抗CD154抗体或含所述抗体的药物组合物，可以有效抑制受试者中的T细胞肿瘤细胞增殖的量施用于受试者。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白 (例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够抑制受试者的T细胞通过人嗜T淋巴细胞病毒1型(HTLV I)的病毒感染。此抗CD154抗体或含所述抗体的药物组合物可以有效抑制病毒感染的量施用于受试者。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够使受试者中的肿瘤细胞或赘生细胞成像，所述细胞表达本发明的抗体与之特异性结合的CD154蛋白。用于使受试者中的肿瘤细胞或赘生细胞成像的方法包括下述步骤：在允许抗体和肿瘤细胞或赘生细胞表面上的蛋白之间形成复合物的条件下，给受试者施用有效量的本发明的抗CD154抗体或含其的组合物；并且使所形成的任何抗体/蛋白复合物成像，从而使受试者中的肿瘤细胞或赘生细胞成像。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够检测受试者中的肿瘤细胞或赘生细胞的存在，所述细胞表达本发明的抗体与之特异性结合的CD154蛋白。用于检测受试者中的肿瘤细胞或赘生细胞的存在的一个此方法包括下述步骤：在允许抗体和蛋白之间形成复合物的条件下，给受试者施用有效量的本发明的抗CD154抗体或含其的药物组合物；从受试者中去除任何未结合的显像剂；并且检测所形成的任何抗体/蛋白复合物的存在，此复合物的存在指示受试者中的肿瘤细胞或赘生细胞的存在。 
药物组合物
本发明提供含如本发明中所述的CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)的药物组合物。 
在本发明的一个实施方案中，药物组合物含本发明的至少一种CD154结合蛋白(例如抗CD154抗体)。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的无糖基抗CD154抗体(或具有减少的效应子功能的其他抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，能够与CD154抗原(例如，由保藏号为ATCC No. PTA-4931的细胞系产生的无糖基hu5c8特异性结合的CD154抗原)结合，并且其中无糖基抗CD154抗体的特征在于具有N298Q(使用EU Kabat编号的N297)的突变，并且进一步显示出减少的效应子功能，如本文其他处所述。 
在本发明的某些实施方案中，无糖基抗CD154抗体(或具有减少的效应子功能的其他抗CD154抗体)或含所述抗体的药物组合物，不与效应子受体结合。在一个更具体的实施方案中，无糖基抗CD154抗体或含所述抗体的药物组合物，能够与由保藏号为ATCC No.PTA-4931的细胞系产生的无糖基hu5c8特异性结合的CD154蛋白结合，并且其中无糖基抗CD154抗体或药物组合物不与效应子受体结合。 
在本发明的一个具体实施方案中，无糖基抗CD154抗体(或具有减少的效应子功能的其他抗CD154抗体或CD154结合蛋白)或含所述抗体的药物组合物，不引起血栓形成，包括血栓栓塞事件。在本发明的一个更具体的实施方案中，无糖基抗CD154抗体或含所述抗体的药物组合物，能够与由保藏号为ATCC No.PTA-4931的细胞系产生的无糖基hu5c8特异性结合的CD154蛋白结合，并且其中无糖基抗CD154抗体或药物组合物不引起血栓形成。 
在本发明的另一实施方案中，药物组合物可进一步含任一种以上的药学上可接受的载体、佐剂、递送媒介物、缓冲剂和/或稳定剂。用于配制和施用本发明的抗体的示例性技术可例如见于″Remington’s Pharmaceutical Sciences，″Mack Publishing Co.，Easton，PA，最近版本。 
在本发明的一个更具体的实施方案中，药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水、柠檬酸盐/蔗糖/Tween制剂和乳状液(例如油/水乳状液)。 
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可在微囊化装置中递送，以便减少或阻止针对组合物的宿主免疫应答。结合剂例如本发明的抗体或抗体片段也可微囊化于膜中而递送，例如脂质体或其他 胶囊化或免疫保护的递送媒介物。 
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可以无菌注射剂的形式，例如无菌可注射水或油悬浮液。这种悬浮液可使用合适的分配、湿润和悬浮剂，根据本领域已知的技术进行配制。 
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可经口、局部或静脉内递送。当全身性施用时，治疗组合物应是无菌、基本上无热原的且在肠胃外可接受的溶液中，所述溶液已考虑pH、等渗性和稳定性。例如，药物组合物基本上不含致热材料，以便适合于作为人治疗施用。这些条件是本领域技术人员已知的。 
在本发明的一个更具体的实施方案中，对于口部施用，药物组合物在合适的胶囊、片剂、水悬浮液或溶液中配制。用于口部施用的组合物的固体制剂可含合适的载体或赋形剂，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、阿拉伯胶、蔗糖、微晶纤维素、白陶土、甘露醇、磷酸二钙、磷酸钙、氯化钠或海藻酸。可使用的崩解剂包括但不限于微晶纤维素、玉米淀粉、淀粉羟乙酸钠和海藻酸。可使用的片剂结合剂包括阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮(PovidoneTM)、羧丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。可使用的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、硅酮流体、滑石、蜡、油和胶体硅。 
在本发明的一个更具体的实施方案中，对于局部应用，药物组合物可在合适的软膏中配制。用于局部使用的组合物制剂的一些例子包括：含活性成分和各种支持物和媒介物的滴剂、酊剂、洗剂、乳膏剂、溶液和软膏。 
在本发明的一个实施方案中，局部半固体软膏制剂一般含在载体(例如药学膏基)中约1-20％(例如5-10％)浓度的活性成分。 
在本发明的一个实施方案中，还可容易地制备用于吸入和经皮组合物的药物组合物。治疗组合物可通过鼻或肺施用，例如作为液体或粉末气溶胶(冻干的)。 
在本发明的一个实施方案中，在水或其他水媒介物中制备用于口部施用的药物组合物的液体制剂可含各种悬浮剂，例如甲基纤维素、海藻酸盐、黄蓍胶、果胶、kelgin、角叉菜胶、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。本发明的药物组合物的液体制剂还可包括溶液、乳状液、糖浆剂和酏剂，其连同活性化合物含湿润剂、甜味剂以及着色和调味剂。药物组合物的各种液体和粉末制剂可通过常规方法进行制备，以用于吸入待治疗的哺乳动物的肺内。 
在本发明的一个实施方案中，用于注射的药物组合物的液体制剂可含各种载体，例如蔬菜油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)等。在一些实施方案中，组合物包括柠檬酸盐/蔗糖/Tween载体。对于静脉内注射，组合物的水溶性形式可通过滴注法进行施用，其中输注含抗真菌剂和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5％右旋糖、0.9％盐水、林格氏溶液或其他合适的赋形剂。组合物的合适的不溶性形式可作为在水基或药学上可接受的油基(例如长链脂肪酸酯(例如油酸乙酯))中的悬浮液进行制备且施用。 
在本发明的一个实施方案中，药物组合物含在药学上可接受的载体中的0.1-90重量％(例如，1-20％或1-10％)的本发明的抗CD154抗体。 
在本发明的一个实施方案中，在每种药物组合物中的本发明的抗CD154抗体的最佳百分比根据制剂其自身以及具体病理状态和相关治疗方案中所需的疗效而变化。药物制剂是本领域良好确定的。医学领域普通技术人员已知的常规方法可用于给受试者施用药物组合物。 
因此，本发明的药物组合物涉及延长释放制剂。延长释放或控制释放或缓慢释放指如下药物制剂，其在施用于受试者后经过时间段释放活性药物，例如多肽或抗体药物。可在所需时间范围(例如，分钟、小时、天、周或更久，依赖药物制剂)内发生延长释放的多肽 药物不同于基本上整个剂量单位可经由血流立即被吸收或立即被分配的标准制剂。在某些实施方案中，延长释放制剂可导致来自单次施用的循环药物水平持续例如8小时以上、12小时以上、24小时以上、36小时以上、48小时以上、60小时以上、72小时以上84小时以上、96小时以上、或甚至例如1周或2周或更久、例如1个月以上。延长释放组合物可含本发明的单价抗CD154抗体。在进一步实施方案中，单价抗体是人源化或全人抗体。在进一步实施方案中，抗CD154抗体，抗CD154抗体是如本文所述具有减少的效应子功能的抗体。 
在本发明的一些实施方案中，药物组合物进一步含免疫抑制或免疫调节化合物。例如，此免疫抑制或免疫调节化合物可为下述之一：中断经由CD28的T细胞共刺激信号的制剂；中断钙神经素信号转导的制剂、皮质类固醇、抗增殖剂、与免疫细胞表面上表达的蛋白特异性结合的抗体，所述免疫细胞表面上表达的蛋白包括但不限于CD45、CD2、IL2R、CD4、CD8和RANK FcR、B7、CTLA4、TNF、LTβ和VLA-4。 
在本发明的一些实施方案中，免疫抑制或免疫调节化合物是他克莫司、西罗莫司、霉酚酸吗啉乙酯或其活性形式霉酚酸、mizorubine、脱氧精胍菌素、布喹那钠、来氟米特、雷帕霉素或氮杂螺烷。 
在本发明的其他实施方案中，本发明的抗体或含其的药物组合物可单独或作为试剂盒的部分与标签和施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。 
施用和递送途径
本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可以医学上可接受的任何方式施用于受试者。为了本发明的目的，“施用”意指本领域技术人员已知的施用抗体、抗体片段和药物组合物的任何标准方法，并且不应限制于本文提供的例子。 
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可通过静脉内、皮下、腹膜内、肌内、髓内、心 室内、硬膜内、动脉内、血管内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、脊柱内、瘤内、颅内注射；通过肠内、肺内、经粘膜、子宫内或舌下施用途径、或局部(例如在炎症或肿瘤生长位点处)施用于受试者。 
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可经口或经鼻，或通过吸入、眼、直肠或局部途径施用于受试者。 
在一个更具体的实施方案中，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可以胶囊、片剂、水悬浮液或溶液的形式经口施用于受试者。 
在一个更具体的实施方案中，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可通过乳膏、软骨等的应用局部施用于受试者。 
在本发明的其他实施方案中，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物也可通过使用喷雾器、干粉吸入器或计量吸入器通过吸入进行施用。 
在本发明的进一步实施方案中，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可通过持续释放施用、通过诸如在手术过程中直接应用的易蚀植入剂的积存注射的方式、或通过输注泵的植入或生物相容性持续释放植入受试者内而施用于受试者。 
在一个更具体的实施方案中，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可通过可注射积存施用途径，例如通过使用1、3或6个月积存可注射或生物可降解材料和方法施用于受试者。 
在一个更具体的实施方案中，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可这样施用于受试者：通过给受试者的皮肤应用含抗体、抗体衍生物或药物组合物的经皮贴剂，并且使贴剂与受试者的皮肤接触，一般1-5小时/贴剂。 
在本发明的其他实施方案中，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可以任何剂量/体重和医学上可接受的任何剂量频率施用于受试者。可接受剂量包括约0.01-200mg/kg受试者体重 的范围。 
在使用本发明的抗体或药物组合物的任何方法中，抗体或药物组合物可每天、每2、3、4、5或6天、每周、每月或任何期段或其倍数期段以单次或多次剂量施用于受试者，并且可进一步根据技术人员的决定以每天到隔月的间隔重复施用于受试者。 
在使用本发明的抗体或药物组合物的任何方法中，结合蛋白、抗体或含其的药物组合物可以如医学上指示的长时间间隔(数天或数周到受试者的寿命)施用于有此需要的受试者。在进一步实施方案中，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可以每天到隔月的间隔重复施用于受试者。 
在本发明的一个实施方案中，可根据需要将本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物以多次剂量/天进行施用，以达到总所需日剂量。治疗方法的有效性可通过监控受试者的病症的已知体征或症状来评估。 
对于本发明的所有实施方案，有效产生所需效应的本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物的给药和剂量率将依赖各种因素，例如待治疗疾病的性质、受试者的大小和年龄、治疗目的、所使用的具体药物组合物、活性剂的药代动力学和治疗医生的判断。 
因此，本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物将以有效达到其预期用途的量进行施用。治疗有效量可指有效预防、减轻或改善疾病症状或延长待治疗受试者的存活的抗体量。治疗有效量可通过改变受试者抗体的施用剂量和给药方案来达到。 
本发明的抗CD154抗体和本发明的药物组合物可作为单次剂量施用于某些适应症，例如预防针对暴露于受试者短暂时间的抗原的免疫应答，例如在治疗一天时施用的外源性抗原。此治疗的例子将包括本发明的抗体片段连同治疗剂的同时施用，所述治疗剂例如抗原药物、变应原或血液产品、或基因治疗载体。在抗原长期存在的适应症中，例如在控制针对移植组织或长期施用的抗原药物的免疫应答中，本发明的抗体片段或药物组合物以如医学上指示的长时间间隔(数 天或数周到受试者的寿命)进行施用。 
在本文所述任何方法中，抗体或药物组合物可与第二种制剂一起施用于受试者。在某些实施方案中，制剂是治疗剂，例如免疫调节或免疫抑制剂。免疫调节或免疫抑制剂可为下述任何：(a)中断经由CD28的T细胞共刺激信号转导的制剂；(b)中断钙神经素信号转导的制剂，(c)皮质类固醇，(d)抗增殖剂；和(e)与免疫细胞表面上表达的蛋白特异性结合的抗体，所述免疫细胞表面上表达的蛋白包括但不限于CD45、CD2、IL2R、CD4、CD8和RANK FcR、B7、CTLA4、TNF、LTβ和VLA-4。免疫抑制或免疫调节化合物可为例如他克莫司、西罗莫司、霉酚酸吗啉乙酯、mizorubine、脱氧精胍菌素、布喹那钠、来氟米特、雷帕霉素或氮杂螺烷。抗体和第二种制剂可同时或顺序施用。 
在一些情况下，给有此需要的受试者施用本发明的一种以上的核酸可为有利的。本发明的范围内包括本发明的治疗和诊断方法，其包括根据众所周知的方法施用本发明的至少一种核酸的步骤。 
在本发明的一个实施方案中，可通过上述方法治疗的受试者是动物。优选地，动物是哺乳动物。可治疗的哺乳动物的例子包括但不限于，人、非人灵长类、啮齿类动物(包括大鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠)、牛、马、绵羊、山羊、猪、犬和猫。优选地，哺乳动物是人。 
基于下述实施例可更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将容易地理解所讨论的具体方法和结果仅是如本文所述的本发明的举例说明。 
实施例
下述实施例举例说明本发明的方法和产品。对于本领域技术人员显而易见的分子生物学领域中通常遇到的所述条件和参数的合适修改和调整在本发明的精神和范围内。 
实施例1：通过SLAM产生抗人CD154抗体
选择淋巴细胞抗体方法(SLAM)(Babcook et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci，93，7843-7848；WO 92/02551；de Wildt et al.，1997，J.Immunol.Methods，207：61-67和Lagerkvist et al.，1995，BioTechniques 18：862-869)被用于鉴定且分离抗人CD154抗体。SLAM使得在体内免疫应答过程中产生的产生高亲和力抗体的细胞能够与任何种类分离。分离的单个抗体产生细胞随后进行克隆扩增，随后筛选产生抗CD154抗体的那些克隆，随后鉴定其可变重(VH)和轻(VL)链基因的序列。具体筛选方法在WO 04/051268中详述。因此，分离对于针对人CD154的抗体阳性的B细胞。 
使用SLAM技术鉴定且分离几种大鼠抗人CD154抗体(图12)。这些抗体之一CA081 00342(所述“342抗体”)是人源化的，如下述实施例中所述。它的DNA和推定氨基酸序列显示于图2中。克隆编码这种抗体的基因。 
实施例2：CA081 00342的人源化——342.G2的产生
SLAM抗体342通过将CDR移植到人种系构架上进行人源化。大鼠抗体(供体)序列与人种系(受体)构架的比对显示于图9中，连同设计的人源化序列。所选择的轻链种系受体序列是人VK12-1-(1)012V-区加JK1J-区(V BASE，MRC Centre for ProteinEngineering，UK；SEQ ID NO：35和36)(图3)。所选择的重链种系受体序列是人VH31-13-66V-区加JH4J-区(V BASE，MRCCentre for Protein Engineering，UK；SEQ ID NO：37和38)(图3)。此外，选择不同的VH受体构架，人VH41-14-59序列(SEQ ID NO：39和40)(图3)。除其中使用组合的Chothia/Kabat定义的CDR-H1外(参见WO91/09967)，从供体移植到受体序列的CDR通过Kabat(Kabat.Et al.，Sequence of proteins of immunological interest(1987).Bethesda MD，National Institutes of Health，US)定义。对于其中仅CDR从供体抗体转移到受体构架上的移植，构建其中还包括关键供体构架残基的形式。这些残基使用基于WO 91/09967中所述那种的方法 进行鉴定。例如，轻链移植物VK1gL4含在位置38、71和85处的供体残基；重链移植物VH3gH1含在位置24、48、49、73和78处的供体构架；重链移植物VH4gH1含在位置48、71和78处的供体构架。所有这些移植物的序列显示于图9中。 
通过合同基因合成公司(Entelechon GmBH；DNA 2.0；B1ue Heron)使用标准分子生物学技术设计且构建编码这些V区序列的基因。使用标准寡核苷酸指导的诱变使用PCR进行修饰以产生移植的变体。来自原始大鼠抗体的信号肽序列包括在原始基因设计中，以允许使用哺乳动物细胞表达载体的表达。 
将移植的轻链基因亚克隆到轻链表达载体内，所述表达载体含编码人C-κ恒定区(Km3同种异型)的DNA。将移植的重链基因亚克隆到人γ-4表达载体内，所述表达载体含编码人γ-4恒定区的DNA，所述恒定区含铰链稳定突变S241P(Angal et al.，Mol Immunol.1993，30(l)：105-8)。可使用任何合适的表达载体。还将原始大鼠抗体基因亚克隆到这些载体内，产生表达嵌合大鼠V区/人C区抗体的质粒作为测定法中的基准。 
轻链基因和重链基因质粒共转染到CHO细胞内使得能够表达IgG和通过 
Figure 18547DEST_PATH_G2008800093615D00951
分析人CD154结合。 
为了分析在大肠杆菌中的表达和作为单价Fab’的活性，将关键构建体的基因亚克隆到表达载体pTTOD(Fab)内(WO03/48208，WO 03/031475)。亚克隆在2步过程中完成：首先克隆入VK基因片段作为EcoRV-BsiWI片段；随后克隆入VH基因片段作为PvuII-XhoI片段。这个过程使编码来自OmpA蛋白的信号肽的DNA与编码轻链和重链的基因融合，赋予将翻译的蛋白分泌到细菌周质。将所产生的表达质粒转化到大肠杆菌K-12菌株W3110内，并且用于在小规模摇瓶中的诱导实验和用于高细胞密度发酵。 表1通过
Figure 772877DEST_PATH_G2008800093615D00952
测定的342Fab构建体的亲和力(从1L发酵物中纯化的Fab)
  移植物   ka(1/Ms)   kd(l/s)   KD(M)   KD(pM)
  gL4gH1   1.53E+07   6.97E-05   4.55E-12   4.55
最佳移植物的选择考虑在测定法中的活性和Fab在大肠杆菌发酵物中的表达水平。通过 
Figure 509888DEST_PATH_G2008800093615D00961
的亲和力测定的例子显示于表1中。在这个基础上选择移植物gL4gH1。 
制备编码移植物gL4gH1的Fab’形式的质粒。这个移植物的插入片段的DNA序列显示于图8中(SEQ ID NO：41)。图8还显示用于表达Fab片段的插入子的序列(SEQ ID NO：28)，这可用于制备F(ab)2片段。 
实施例3：通过定点诱变产生无糖基化hu5c8和hu342抗体
在后续实验中使用的无糖基化hu5c8和hu342抗体使用标准重组DNA技术进行制备。无糖基化hu5c8基本上如US2006/0193856中所述进行制备，除huIgG4Fc结构域取代先前使用的IgG1Fc结构域，以便进一步减少效应子功能。无糖基化hu5c8的κ轻链序列显示于图13(SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64)中。无糖基化hu5c8的重链含在CH2(T299A，Kabat EU)和铰链(S228PKabat EU)结构域中通过定点诱变制造的2个突变(图14；SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67)。T299A突变修饰在CH2结构域中的N糖基化位点，从而使得不再有N糖基化酶的底物，使得分子无糖基化。 
无糖基化hu342抗体源自342Fab片段载体。这个序列通过添加人信号序列和合适的人恒定结构域序列进行修饰。无糖基化hu342抗体还含huIgG4Fc结构域。无糖基化hu342的κ轻链序列显示于图15中(SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70)。无糖基化hu342的重链含在CH2(T299A，Kabat EU)和铰链(S228PKabat EU)结构域中通过定点诱变制造的2个突变(图16；SEQ IDNO：71、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73)。T299A突变修饰在CH2结构域中的N糖基化位点，从而使得不再有N糖基化酶的底物，使得分子无糖基化。无糖基化hu5c8和hu342在CHO细胞中都是稳 定表达的。 
实施例4：与CD154的结合：结合亲和力测量
Figure 33274DEST_PATH_G2008800093615D00971
技术实时且无需标记地监控生物分子之间的结合。称为配体的相互作用物之一直接固定在固定表面上或在固定表面上捕获，而称为分析物的另一种在捕获表面上的溶液中流动。当分析物与配体结合以在表面上形成复合物时，传感器检测传感器表面上的质量变化。这相应于结合过程。当分析物由缓冲液替换时，监控解离过程。在亲和力 
Figure 463118DEST_PATH_G2008800093615D00972
测定法中，配体是抗CD154抗体(例如342抗体)，并且分析物是人CD154的细胞外结构域。 
方法的细节如下： 仪器： 
Figure 517793DEST_PATH_G2008800093615D00973
3000，Biacore AB，Uppsala，Sweden。 传感器芯片：CM5(研究级)目录号：BR-1001-14，Biacore AB，Uppsala，Sweden。芯片贮存于4℃。 BIAnormalising溶液：70％(w/w)甘油。Part of BIAmaintenanceKit目录号BR-1002-51，Biacore AB，Uppsala，Sweden。BIAmaintenance试剂盒贮存于4℃。 胺偶联试剂盒：目录号：BR-1000-50，Biacore AB，Uppsala，Sweden。乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸化物(EDC)。加蒸馏水至75mg/mL，并且以200μL等分试样贮存于-70℃。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。加蒸馏水至11.5mg/mL，并且以200μL等分试样贮存于-70℃。1M乙醇胺盐酸化物-NaOH pH 8.5。以200μL等分试样贮存于-70℃。 缓冲液：运行缓冲液是HBS-EP(0.01M HEPES pH 7.4、0.15MNaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)。目录号：BR-1001-88，Biacore AB，Uppsala，Sweden。缓冲液贮存于4℃。固定缓冲液是乙酸盐5.0(10mM乙酸钠pH 5.0)。目录号：BR-1003-51，Biacore AB，Uppsala，Sweden。缓冲液贮存于4℃。 配体捕获：Affinipure F(ab’)2片段山羊抗人IgG，Fab’片段特异(目录号：109-006-097)或Fc片段特异(目录号：109-006-098)， Jackson ImmunoResearch Inc(Pennsylvania，USA)。试剂贮存于4℃。 配体：抗CD154抗体。 分析物：人CD154的重组细胞外结构域。材料在磷酸盐缓冲盐水中以2mg/mL(40μM)制备，贮存于4℃，并且在HBE-EP运行缓冲液中稀释用于测定法。一般地CD154通过用二倍稀释从～1nM稀释到～100pM用于亲和力测定法。 再生溶液：通过用蒸馏水稀释由11.6M母液(BDH，Poole，England.目录号：101254H)制备40mM HCl。通过用蒸馏水稀释由50mM母液制备5mM NaOH。目录号：BR-1003-58，Biacore AB，Uppsala，Sweden。 测定方法：使用 
Figure 792916DEST_PATH_G2008800093615D00981
3000(Biacore AB)进行BIA(生物分子相互作用分析)。Affinipure F(ab’)2片段山羊抗人IgG，Fc或Fab’片段特异性(Jackson ImmunoResearch)经由胺偶联化学固定在CM5Sensor Chip上，至≈6000应答单位(RU)的捕获水平。HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20、Biacore AB)以10μl/分钟的流速用作运行缓冲液。抗CD154抗体或Fab片段以如下浓度使用，使得一旦被固定的抗人IgG-Fc(或抗人IgG Fab’)表面捕获，就产生≈200RU的信号。人CD154以各种浓度滴定在捕获抗体上。将90μL CD154注射在表面上(结合相)，随后为240秒解离相，全部以30μL/分钟的流速。表面通过40mM HCl的2次10μL注射，随后为5mM NaOH以10μL/分钟的流速的5μL注射得到再生。本底扣除结合曲线通过使用BIAevaluation软件(版本3.2)根据标准操作进行分析。动力学参数由拟合算法进行测定。 
这种方法可用于评估本发明的任何抗体、抗体衍生物或抗体片段对于CD154蛋白或其片段的亲和力。通过 
Figure 436387DEST_PATH_G2008800093615D00982
获得的通过SLAM分离的抗CD154抗体的Kd值显示于图12和18中。 
实施例5：CD40结合的抑制
基于流式细胞术的测定法用于评估经标记的CD40与表达 CD154的D 1.1细胞的结合。D 1.1Jurkat细胞(美国典型培养物保藏中心)维持在RPMI 1640培养基(Gibco，31870-025))中，所述培养基含10％(v/v)胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺(Invitrogen，23030024)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen，11360-039)，1％(v/v)D-(+)-葡萄糖(Sigma，G8769)和10mM HEPES(Sigma，H0887)。在测定时，在连续稀释的抗CD154抗体的存在或不存在下，100,000D1.1细胞在100μL RPMI 1640培养基+10％FCS中在室温下温育15分钟。随后加入5μL 1∶75稀释的hCD40-mFc-PE(Alexis Corp，ANC-504-050)，并且在室温下再温育30分钟。在含1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA级分V，Serologicals Proteins Inc，81-068-5)和0.02％(w/v)叠氮化钠(BDH，103692K)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤2次后，将细胞重悬浮于200μL PBS/1％BSA/0.02％叠氮化钠中，并且在Becton Dickinson FACScan上进行流式细胞术。在所有情况下评估关于几何平均荧光(FL2)的值。相对于在不存在抗体的情况下的信号(0％抑制)和不存在hCD40-mFc-PE的情况下的信号(100％抑制)，使用下式计算hCD40-mFc-PE结合的抑制：[(0％抑制-％测试)/(0％抑制-100％抑制)]×100 
使用XLfit作为Activity Base包的部分获得来自数据的IC50值。 
通过SLAM分离的抗CD154抗体的CD40结合IC50值显示于图12和18中。 
实施例6：竞争结合测定法
基于流式细胞术的测定法用于评估抗CD154抗体与表达CD154的D 1.1细胞的结合。D 1.1Jurkat细胞(美国典型培养物保藏中心)维持在RPMI 1640培养基(Gibco，31870-025)中，所述培养基含10％(v/v)胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺(BioWhittaker，17-605E)和1青霉素-链霉素(Mediatech，30002107)。在测定时，在连续稀释的抗CD154抗体和生物素化的抗CD154Fab(克隆342)的存在或不存在下，将100,000D 1.1细胞在10mL PBS、0.1％BSA、 0.02％叠氮化钠(FACS缓冲液)中在4℃下温育2小时。细胞在FACS缓冲液中洗涤3次，在洗涤之间伴随在290×g下离心3分钟。加入链霉亲和素-R-藻红蛋白缀合物(Jackson Immunoresearch，016-110-084)在150μM FACS缓冲液中的1∶500稀释物，并且使细胞在4℃下温育1小时。细胞洗涤1次，并且在具有3％甲醛的PBS中在室温下固定10分钟。将细胞重悬浮于FACS缓冲液中，并且在FacsCalibur(BD)上运行。在所有情况下评估几何平均荧光(FL2)的值。相对竞争抗体的浓度对生物素342Fab结合进行作图，以获得对于使用GraphPadPrism拟合的4参数曲线拟合的S形抑制曲线。在这个测定法中产生的IC50值显示于图18中。 
实施例7：ICAM01上调测定法
在体外共培养效力测定法中测量抗CD154抗体抑制CD40L:CD40细胞表面相互作用的能力。CD40与CD154(CD40L)的连接(例如结合)活化B淋巴细胞，导致细胞表面上CD54(ICAM-1)的上调，并且这种接触依赖性CD40L:CD40B细胞活化可通过抗CD154阻断。简言之，表达CD154的D 1.1Jurkat T淋巴细胞(CRL-10915，美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA，USA)和表达CD40的Ramos 2G6.4C10B淋巴细胞(CRL-1923，ATCC)在37℃培养箱中伴随5％CO2以1∶4比共培养过夜，伴随抗CD154Fabs或对照完整Ab(hu5c8)的滴定。在96孔圆底平板中以1×106细胞/ml的浓度在RPMI完全培养基(具有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠和10mM HEPES pH 6.8的RPMI，Gibco BRL，Rockville，MD，USA)中进行测定。次日用分别在含1％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS中以1∶100和1∶200浓度的来自BD Pharmingen(SanDiego，CA，USA)的CD20FITC(#555622)和CD54APC(#559771)使细胞在4℃下染色1小时。细胞进行洗涤，并且用1％低聚甲醛固定，并且在FACScan Calibur Cytometer(BD Biosciences)上进行分析。使用DeltaGraph软件(Red Rock Software，Salt Lake City，UT，USA)将Ramos细胞(双重阳性细胞)对抗CD154(CD40L)浓度 的几何平均荧光拟合至4参数曲线(图12和18)。IC50值用于测定抗CD154抗体的相对效力。 
实施例8：在免疫应答的食蟹猴模型中的活性
用于证实体内活性的模型在Gobburu et al.，(1998)JPharmacol Exp Therapeutics 286：925中描述。在用0.5mL破伤风类毒素(TT)的单次肌内剂量攻击4小时前，食蟹猴接受盐水、Hu5c8抗体的单次静脉内剂量或342Fab’-PEG的剂量响应。每个处理组含3只雄性和3只雌性。在第30天时，给定抑制剂的第二次剂量，并且用TT再次攻击动物(继发应答)。在所选择的时间段时获取血样，总共50天，用于分析IgG和IgM抗TT滴度(图19和21)。数据显示342Fab’-PEG以剂量依赖性方式抑制针对TT的IgG和IgM免疫应答。 
还在用各种形式的抗CD154抗体的单次剂量(对于hu5c8、无糖基5c8和无糖基34220mg/kg，并且对于342Fab’-PEG和342DFM-PEG 40mg/kg)处理后测量食蟹猴中的IgG抗TT滴度(图20)。对于评估的所有抗体，观察到TT免疫应答的抑制。 
实施例9：荧光活化细胞分选交叉阻断测定
本发明的抗CD154Fab’片段的结合性质通过交叉阻断抗体测定法进行研究。简言之，表达CD154的D1.1Jurkat细胞与培养基或10μg/ml未标记的第一种抗CD154Fab’在室温下温育60分钟。未洗涤后，加入经A1exa Fluor 488标记的第二种抗CD154Fab’(300ng/ml)的最佳稀释物60分钟。随后洗涤细胞并且通过流式细胞术进行分析。如果第一种和第二种Fab’与相同表位结合，则第一种Fab’将竞争性阻断第二种Fab’的结合。如果2种抗体与不同表位结合，则第一种Fab’将不阻断第二种Fab’的结合。如果所测试的经标记的第二种Fab’是342，则可证实342Fab’被338(图23B)、381(图23D)和335(图23G)Fab’交叉阻断，但不被295(未显示)、402(图23C)、300(图23E)、303(图23H)或294(图23F)Fab’交叉阻断。当经标记的Fab’是hu5c8时，可证实被338(图24A)、402(图24B)、 381(图24C)、303(图24D)、335(图24E)、300(图24F)和294(图24G)Fab’的交叉阻断。用A33(同种型匹配的对照抗体)的测试证实不存在非特异性交叉阻断(图23A和24H)。抗体342和hu5c8彼此竞争CD154结合，不管它是未标记的(第一种)还是经标记的(第二种)Fab’。 
实施例10：抗体结合的 分析
与可溶性CD154蛋白(sCD154)(细胞外结构域；ECD)结合的342和hu5c8抗体的 分析指出，当第二个加入sCD154时，342取代hu5c8与sCD154结合(图25A和B)。当第二个加入sCD154时，5c8无法从sCD154取代342(图25C)。就hu5c8竞争测定法中的非相互结果而言，抗体338表现类似于342。 
Hu5c8Fab可与342全长(FL)/sCD 154复合物结合(图25D)。这个结果提示当首先加入342FL时，hu5c8Fab不竞争342FL结合位点。不受理论束缚，这些结果提示342与sCD154三聚体的一条或两条臂的结合不阻止hu5c8与“游离”臂结合。 
当hu5c8Fab在342Fab’后时，存在结合中的轻微(～20RU)增加(图25E)。这个结果增加了hu5c8Fab’已阻断342Fab’的结合或342Fab’已替换在捕获的sCD154上的hu5c8Fab’的可能性。 
342Fab’和hu5c8Fab’都不与CD40:sCD154复合物结合，在蛋白测定法中也不影响复合物的解离。无一Fab’可结合CD40:sCD154复合物的事实提示复合物使用所有3条sCD154臂，或复合物空间位阻任一Fab’接近“游离”臂。 
实施例11：人血小板活化
测定法1
血小板凝集可使用公开的测定法(例如，Florian et al.，(2005)Thrombosis Hemostasis 93：1137)进行测量。在一种测定法中，在包被BSA的管中在HEPES缓冲盐水中从正常供体富含血小板血浆中洗涤血小板，并且调整至250,000/微升(μl)。随后将洗涤的血小板吸取到凝集计比色杯(Chrono-Log 490D)内，并且使示踪信 号校准至零百分比凝集，使用HEPES(测定法)缓冲液作为空白对照。在这个仪器中，比色杯维持在37.0℃下，并且硅化处理的磁棒以1000rpm搅拌血小板。将完全形成的免疫复合物(即以1∶1化学计量学的抗体加重组人可溶性CD40L(rhsCD40L)，其中rhsCD40L作为三聚体处理)加入血小板中，并且凝集作为溶液的光密度示踪进行评估。具体地，将15μl免疫复合物加入285μl洗涤的血小板悬浮液中，从而使得加入比色杯后，sCD40L的终浓度是10μg/ml，并且IgG抗体的终浓度是27.8μg/ml或对于Fab’-PEG是16.7μg/ml。数据显示凝集在完整IgG抗CD154抗体Hu5c8的存在下，而非342Fab’-PEG的存在下发生(图26)。 
测定法2
在WO 07/59332中所述另一种测定法中，血小板凝集这样进行测量：使血小板与血小板活化剂(例如二磷酸腺苷(ADP)、胶原、凝血酶、血栓烷、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、p-选择素或convulxin)接触，使活化血小板与抗CD154抗体接触，然后使活化血小板与交联剂(例如，可溶性CD154(sCD154)、抗人IgG抗体、抗hFc抗体、RF、Fc受体阳性辅助细胞、可溶性蛋白A、或可溶性人Fc受体)接触。凝集随后通过血小板的沉降进行定量，其中血小板的沉降指示血小板的凝集。对富含血小板血浆(PRP)进行凝集测定法。约50mL全血以等分试样收集到含0.5mL 3.8％柠檬酸钠的4.5mL真空采血管中。通过使抗凝血在200g下离心10分钟且收获上清液制备PRP。为了进行测定法，Biodata 4通道血小板凝集剖析器(PAP-4；Biodata Corp.，Hatboro，PA)用仅含贫血小板血浆(PPP)的比色杯调零。将含约2-5×108/mL血小板的350μL PRP等分试样加入含搅拌棒的比色杯中。以总体积100μL加入抗CD154抗体、人IgG、正常人血清、CD40-Fc或抗hFc。将装载的比色杯放入机器中，并且在加入ADP前使反应组分混合。 
通过添加在50μL中的亚最适浓度的ADP(终浓度对于每个单个样品都不同)起始凝集。凝集剖析器具有可同时运行的4个 孔。在加入ADP后4分钟时对于每种样品产生凝集进行追踪。在追踪结束时，仪器通过比较通过样品的光透射与通过PPP空白对照的光透射来计算凝集百分比。在每次实验开始时进行滴定，并且在亚最适ADP浓度时进行后续运行。 
来自这个测定法的结果显示于图27中。PRP得自1个健康个体。用0.75μM(被确定为对于这个供体是亚最适的)ADP诱导凝集。阳性对照抗CD154抗体和阴性对照hIgG以200μg/mL进行评估，并且sCD154以30μg/mL进行评估。在加入含PRP比色杯前，抗CD154抗体或hIgG与重组sCD154混合不少于20分钟。柱表示2个数据点的平均值和标准差。结果显示尽管阴性对照人IgG(hIgG)和sCD154均对血小板凝集无影响，但阳性对照抗CD154抗体增强血小板凝集。在使用阳性和阴性对照的这个测定法的结果证实这个测定法可用于比较本发明的抗体对血小板凝集的相对作用。 
为了测定血小板是否在其表面上表达CD154，血小板可与生物素缀合的抗CD154抗体一起温育，并且表面CD154的存在通过定量结合的生物素化的抗CDL抗体进行测定。因此，CD154的表面表达在连同或不连同10μM ADP温育1、10、20、40和60分钟后进行评估。CD40L的表面表达早在活化后1分钟时在ADP活化的血小板上可检测，并且经时增加。生物素缀合的抗CD154抗体的结合对于CD154特异，因为生物素缀合的抗CD154抗体与sCD154的预温育抑制与活化血小板的结合。在灭活的(“休止”)血小板上检测到的表面CD154的量也经时增加。这个现象可能规因于在实验条件下血小板活化的基础水平。 
实施例12：用于测定无糖基化和其他变体抗体改变的效应子功能的方法
下述实施例描述了用于测定且表征本发明的无糖基化和其他经修饰的变体抗体的效应子功能的测定法。 
本发明的无糖基化和其他经修饰的变体抗体的效应子功能可通过抗体结合抗原以及结合Fc受体或补体分子(例如C1q)的 能力来进行表征。尤其是，FcγR结合亲和力可用基于抗体形成CD154抗原和带有Fc受体的细胞之间的“桥”的能力的测定法进行测量。C1q的结合亲和力可基于抗体形成CD154抗原和C1q之间的“桥”的能力进行测量。本发明的抗体与FcR或补体的相互作用也可通过基于珠的 
Figure 500475DEST_PATH_G2008800093615D01051
技术 
Figure 641607DEST_PATH_G2008800093615D01052
进行测量。 
Fc受体结合测定法
FcγR桥连测定法可通过用重组可溶性人CD154配体(例如，以1μg/ml的浓度在4℃下在PBS中过夜；Karpusas et al.，1995Structure 3(10)：1031-1039和3(12)：1426和Karpusas et al.，2001Structure 9(4)：321-329)包被96孔Maxisorb ELISA平板(Nalge-NuncRochester，NY，USA)来进行。糖基化或无糖基化形式的抗CD154抗体的滴定与CD154在37℃下结合30分钟，随后洗涤平板，并且测量经荧光标记的U937(CD64+)细胞的结合。U937细胞可在具有10％FBS、10mM HEPES、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI培养基中生长，以1∶2分开，并且在用1000单位/ml IFNγ测定前活化1天，以增加Fc受体(FcγRI)表达。 
在测定法的另一种形式中，本发明的抗体与另外一种Fc受体(例如FcγRIII(CD16))结合，或者无法与另外一种Fc受体(例如FcγRIII(CD16))结合的能力，可使用上述桥连测定法针对经荧光标记的人T细胞(Jurkat细胞)来进行，所述细胞经CD16表达构建体进行转染。配体可通过在96孔组织培养平板(Corning LifeScienees Acton，MA，USA)中生长的单层表达CD154的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来产生。例如，CHO-CD154+细胞以1×105细胞/ml种植到96孔平板内，并且在具有10％透析FBS、100nM氨甲蝶呤、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(Gibco-BRL Rockville，MD，USA)的oc-MEM中生长至汇合。CD16+Jurkat细胞在具有10％FBS、400pg/ml遗传霉素、10mM HEPES、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(Gibco-BRL)的RPMI中生长，并且在进行测定法前1天以1∶2分开。 
在对于2种受体的测定法中，具有Fc受体的细胞可用2’，7’-二-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧甲酯(BCECF-AM)(Molecular Probes Eugene，OR，USA)在37℃下标记20分钟。洗涤以去除过量标记后，使1×105经标记的细胞在测定法中在37℃下温育30分钟。未结合的FcγR阳性细胞通过洗涤几次去除，并且平板在微板阅读器(Cytofluor 2350Fluorescent Microplate Reader，MilliporeCorporation Bedford，MA，USA)上以485nm的激发波长和530nm的发射波长进行读数。 
除上述测定法外，本发明的抗体与Fc受体的结合可以竞争形式进行测量，使用AlphaScreenTM(Amplified LuminescentProximity Homogeneous Assay；Perkin Elmer)或直接使用表面等离子体共振( 
Figure 139584DEST_PATH_G2008800093615D01061
)。Biacore测定法可使用 
Figure 911231DEST_PATH_G2008800093615D01062
3000仪器监控分析物受体与蛋白A/G芯片上捕获的抗体的结合。 
Figure 861869DEST_PATH_G2008800093615D01063
是用于表征蛋白-蛋白相互作用的优良方法(Myszka 1997Curr OpinBiotechnol.8：50-57.；Malmborg & Borrebaeck 1995J ImmunolMethods 183：7-13)，并且已成功地用于测量IgG抗体与FcγRIII的结合(Galon et al.，1997Eur J Immunol.27：1928-1932)。例如，蛋白A/G与传感器芯片(例如，使用NHS化学的CM5传感器芯片)共价偶联。在测定法中使用运行缓冲液(例如HBS-EP(0.01M HEPESpH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％v/v表面活性剂P20， 
Figure 744375DEST_PATH_G2008800093615D01064
))和芯片再生缓冲液(例如甘氨酸1.5(10mM甘氨酸-HCl，pH 1.5， 
Figure 906978DEST_PATH_G2008800093615D01065
))。具有减少的效应子功能的变体抗CD154抗体和野生型或天然抗CD154抗体在运行缓冲液(例如HBSEP缓冲液)中稀释至100nM，并且与蛋白A/G芯片结合5分钟。受体在结合相中以浓度系列结合，随后为用缓冲液的解离相。无抗体的循环提供基线应答。传感图可对1∶1朗氏(Langmuir)结合模型总体拟合，以使用例如BIAevaluation软件v4.1( 
Figure 849527DEST_PATH_G2008800093615D01066
)获得平衡解离常数(KDS)。 
AlphaScreen测定法使用未标记的抗体，以竞争与链霉亲和素供体珠结合的生物素化的IgG和与抗GST受体珠结合的 FcγR-His-GST之间的相互作用。野生型或天然抗CD154抗体(例如IgG1抗体)使用标准方法进行生物素化，并且在PBS中进行透析。抗GST受体珠和链霉亲和素供体珠可从商业厂家获得，并且可以20μg/ml终浓度使用。在1×测定缓冲液(例如25mM HEPES、100mMNaCl、0.1％BSA、0.01％Tween-20，pH 7.4)中的FcγRI-His-GST、FcγRIIIa-His-GST、FcγRIIa-His-GST、或其他经标记的FcR分配到96孔平板的每个孔内至0.5nM终浓度。野生型或天然抗CD154抗体、变体抗CD154抗体、或缓冲液在1×测定缓冲液中制备为1/2对数稀释物，并且直接等分到每个孔内。短暂离心后，将在1×测定缓冲液中的生物素化的野生型抗CD154抗体(例如，IgG1抗体)加入每个孔中至5nM终浓度。将100μg/ml抗GST受体珠加入每个孔，并且使平板在黑暗中在室温下温育1小时。将100μg/ml链霉亲和素供体珠加入每个平板中，并且在短暂离心后，使平板在室温下温育1.5小时。将反应样品转移至白色不透光平板，并且在FusionTM A1pha-FP HT微板阅读器(Perkin Elmer)中读出荧光。可将数据相对最高信号(无竞争)标准化，并且使用非线性回归与例如软件GraphPad Prism(GraphPad Software)以单位点竞争模型进行拟合。 
技术人员可进行上述或类似测定法，以测量抗体变体与任何FcR(包括例如FcγRIIa)的结合。 
C1q结合测定法
C1q结合测定法可通过用50μl10μg/ml的重组可溶性人CD154配体(Karpusas et al.，Structure，15；3(12)：1426(1995)在4℃下在PBS中包被96孔Maxisorb ELISA平板(Nalge-NuncRochester，NY，USA)过夜来进行。孔用洗涤缓冲液(PBS、0.05％Tween20)抽吸且洗涤3次，并且用200μl/孔阻断/稀释缓冲液(0.1MNa2HPO4，pH 7.0、1M NaCl、0.05％Tween 20、0.1％明胶)阻断至少1小时。待测试的抗体在阻断/稀释缓冲液中进行稀释，以3倍稀释从15μg/ml开始。每孔加入50μl，并且使平板在室温下温育2小时。 
如上抽吸且洗涤后，加入在阻断/稀释缓冲液中稀释的50 μl/孔2μg/ml Sigma人C1q(C0660)，并且在室温下温育1.5小时。如上抽吸且洗涤后，加入在阻断/稀释缓冲液中稀释3,560倍的50μl/孔绵羊抗C1q(Serotec AHP033)。在室温下温育1小时后，如上抽吸且洗涤孔。随后加入在阻断/稀释剂中稀释至1∶10,000的50μl/孔驴抗绵羊IgG HRP缀合物(Jackson ImmunoResearch 713-035-147)，并且使孔在室温下温育1小时。 
如上抽吸且洗涤后，加入100μl TMB底物(在0.1M乙酸钠/柠檬酸缓冲液，pH 4.9中的420μM TMB、0.004％H2O2)，并且在用100μl 2N硫酸终止反应前温育2分钟。用Softmax PRO仪器读出在450nm处的吸光度，并且Softrnax软件用于以4参数拟合测定相对结合亲和力(C值)。 
备选C1q结合测定法使用ELISA以测定与C1q结合的抗CD154，但不使用CD154作为桥。简言之，测定法平板可用在包被缓冲液中的变体抗体或亲本抗体(对照)在4℃下包被过夜。平板随后可进行洗涤且阻断。洗涤后，人C1q的等分试样可加入每个孔中，并且在室温下温育2小时。进一步洗涤后，可将100μl绵羊抗补体C1q过氧化物酶缀合的抗体加入每个孔中，并且在室温下温育1小时。平板可用洗涤缓冲液再次洗涤，并且含OPD(邻苯二胺二盐酸盐(Sigma))的100μl底物缓冲液可加入每个孔中。可允许通过黄色的出现观察到的氧化反应进行30分钟，并且通过添加100μl 4.5NH2SO4进行终止。随后可读出在(492-405)nm处的吸光度。 
示例性抗体变体是在这个测定法中显示“C1q结合的显著减少”的抗体。在一些实施方案中，显著减少可为与具有非突变的IgG1Fc区的100μg/ml对照抗体相比，约100μg/ml抗体变体显示C1q结合的约50倍以上的减少。在最优选的实施方案中，多肽(即抗体)变体不结合C1q，即与100μg/ml对照抗体相比，100μg/ml抗体变体显示C1q结合的约100倍以上的减少。 
补体活化和CDC
为了评估补体活化，可进行补体依赖性细胞毒性(CDC) 测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。简言之，各种浓度的多肽(即抗体)变体和人补体可用缓冲液进行稀释。表达多肽变体与之结合的抗原的细胞可稀释至约1×106细胞/ml的密度。多肽变体、稀释的人补体和表达抗原的细胞的混合物可加入平底组织培养96孔平板中，并且允许在37℃和5％CO2下温育2小时，以促进补体介导的细胞裂解。50μl alamar蓝(Accumed International)随后可加入每个孔中，并且在37℃下温育过夜。使用96孔荧光计用在530nm处的激发和在590nm处的发射测量吸光度。结果可以相对荧光单位(RFU)表达。样品浓度可由标准曲线计算，并且报告目的多肽变体的与非变体多肽相比的活性百分比。 
实施例13：将342抗体结合位点定位在CD154蛋白上
使用人-小鼠嵌合CD154蛋白进行实验以鉴定在人CD154中对于342的结合重要的氨基酸残基。342以高亲和力与人CD154结合，但不与小鼠CD154结合。因此，通过使CD154小鼠残基突变成相应人残基，并且测量突变蛋白对于342的亲和力的变化，可鉴定重要的结合残基。选择在所选区域处将人残基引入可溶性小鼠CD154内的6组突变(图28中标记的1-6)。也评估了非突变的人和小鼠可溶性CD154(sCD154)蛋白。不同的sCD154蛋白在 
Figure 287461DEST_PATH_G2008800093615D01091
实验中使用，使用固定在芯片上的342(以IgG形式)与在溶液相中的sCD154上清液。结果证实342结合仅伴随人组5残基引入小鼠CD154内而发生。 
实施例14：竞争ELISA交叉阻断测定法
为了证实342和5c8Fab’的交叉阻断，使用竞争ELISA。在这个测定法中，将抗Myc抗体9E10包被在ELISA平板上。经Myc标记的CD154由这种抗体捕获。未标记的342或5c8Fab’的稀释系列与1nM生物素342Fab’或0.3nM生物素5c8在平板上在室温下在PBS、0.05％Tween-20、1％BSA中温育2小时。平板进行洗涤，并且使用链霉亲和素HRP作为次级测定生物素化5c8Fab的量。使用 Prism软件(Graph Pad)中的单位点结合双曲线或双位点结合双曲线拟合曲线对信号作图且拟合。 
进行在CD154上的生物素342Fab’的滴定，以测定用于交叉阻断分析的合适浓度(图29A)。发现1nM浓度在曲线的线性部分上。还进行在CD154上的生物素5c8Fab’的滴定，以测定用于交叉阻断分析的合适浓度(图29B)。发现0.3nM浓度在曲线的线性部分上。在分析生物素342和生物素5c8Fab’经由未标记的342Fab’的交叉阻断的实验中，342Fab’以0.09nM的亲和力抑制生物素342Fab’结合(图29C)。342Fab’以2个亲和力0.134nM和76nM抑制生物素5c8结合(图29C)。生物素342经由未标记的5c8Fab’的交叉阻断显示于图29D中。在这个曲线上的5c8Fab’的最大浓度50nM大大超过5c8的饱和点，并且也大大超过生物素342的1nM浓度。在这些浓度下完全抑制的缺乏提示5c8无法完全阻断在CD40L上的所有342结合位点。 
序列表
<110>BIOGEN IDEC MA INC.
     UCB PHARMA S.A.
<120>特异性结合CD154的包括抗体、抗体衍生物和抗体片段在内的结合蛋白及其用途
<130>000455-0381-WO1
<140>PCT/US08/003735
<141>2008-03-21
<150>60/920,495
<151>2007-03-27
<150>60/919,938
<151>2007-03-22
<150>60/919,816
<151>2007-03-22
<160>77
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
His Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser
        115
<210>2
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser A1a Ser Val Gly
1               5                   10                   15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>3
Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr His Val His
1               5                   10
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>4
Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser
1               5                   10                   15
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>5
Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala
1               5                   10
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>6
Arg Ala Ser Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>7
Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp
1               5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>8
Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe Thr
1               5
<210>9
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                   15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
His Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser
        115
<210>10
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
His Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser
        115
<210>11
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>11
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                   15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
His Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser
        115
<210>12
<211>221
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
His Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
<210>13
<211>229
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
His Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
    210                 215                 220
His Thr Cys Ala Ala
225
<210>14
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                   15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>15
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                   15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>16
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>16
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact   60
attacctgtc gtgccagtga ggacctctat tacaacctgg cctggtatca gcaaaaaccg  120
ggcaaagccc cgaagctgct catctatgat acgtaccgcc tggctgacgg tgtgccaagc  180
cgtttcagtg gcagtggcag cggtactgac tttaccctca caatttcgtc tctccagccg  240
gaagatttcg ccacttacta ttgtcagcaa tattacaagt tccctttcac cttcggtcag  300
ggcactaaag tagaaatcaa a                                            321
<210>17
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>17
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact   60
attacctgtc gtgccagtga ggacctctat tacaacctgg cctggtatca gcgtaaaccg  120
ggcaaagccc cgaagctgct catctatgat acgtaccgcc tggctgacgg tgtgccaagc  180
cgtttcagtg gcagtggcag cggtactgac tataccctca caatttcgtc tctccagccg  240
gaagatttcg cctcttacta ttgtcagcaa tattacaagt tccctttcac cttcggtcag  300
ggcactaaag tagaaatcaa a                                            321
<210>18
<211>705
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>18
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa   60
gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg  120
actattacct gtcgtgccag tgaggacctc tattacaacc tggcctggta tcagcgtaaa  180
ccgggcaaag ccccgaagct gctcatctat gatacgtacc gcctggctga cggtgtgcca  240
agccgtttca gtggcagtgg cagcggtact gactataccc tcacaatttc gtctctccag  300
ccggaagatt tcgcctctta ctattgtcag caatattaca agttcccttt caccttcggt  360
cagggcacta aagtagaaat caaacgtacg gtagcggccc catctgtctt catcttcccg  420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc  480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc  540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg  600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag  660
ggcctgagct caccagtaac aaaaagtttt aatagagggg agtgt                  705
<210>19
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>19
caggtgcagc tgcaggagtc tggaccgggg cttgtcaagc ctagtgagac cctgagcctc   60
acttgtaccg tgagcggctt cagctctacc aattaccatg tgcactggat tcgtcagcca  120
cctgggaagg gcctggagtg gattggtgtt atttggggcg acggcgatac atcctacaac  180
tccgtcctga agagccgtgt caccatttcc gttgacacct caaagaatca attttccctc  240
aagttgagct ctgtcaccgc agcggacaca gcagtctatt actgtgcacg tcaactgacc  300
cactattacg ttttggcagc ctggggtcaa gggactctgg tcacagtctc g           351
<210>20
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>20
gaggtgcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggtgggag cctgcgtctc   60
tcttgtgcag cgagcggctt cagctctacc aattaccatg tgcactgggt gcgtcaggca  120
cctgggaagg gcctggagtg ggtgagtgtt atttggggcg acggcgatac atcctacaac  180
tccgtcctga agagccgttt caccatttcc cgtgacaact caaagaatac cctttacctc  240
cagatgaact ctctccgcgc agaggacaca gcagtctatt actgtgcacg tcaactgacc  300
cactattacg ttttggcagc ctggggtcaa gggactctgg tcacagtctc g           351
<210>21
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>21
caggtgcagc tgcaggagtc tggaccgggg cttgtcaagc ctagtgagac cctgagcctc   60
acttgtaccg tgagcggctt cagctctacc aattaccatg tgcactggat tcgtcagcca  120
cctgggaagg gcctggagtg gatgggtgtt atttggggcg acggcgatac atcctacaac  180
tccgtcctga agagccgtgt caccatttcc cgtgacacct caaagaatca agtttccctc  240
aagttgagct ctgtcaccgc agcggacaca gcagtctatt actgtgcacg tcaactgacc  300
cactattacg ttttggcagc ctggggtcaa gggactctgg tcacagtctc g           351
<210>22
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>22
gaggtgcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggtgggag cctgcgtctc   60
tcttgtgcag tgagcggctt cagctctacc aattaccatg tgcactgggt gcgtcaggca  120
cctgggaagg gcctggagtg gatgggtgtt atttggggcg acggcgatac atcctacaac  180
tccgtcctga agagccgttt caccatttcc cgtgacacct caaagaatac cgtttacctc  240
cagatgaact ctctccgcgc agaggacaca gcagtctatt actgtgcacg tcaactgacc  300
cactattacg ttttggcagc ctggggtcaa gggactctgg tcacagtctc g           351
<210>23
<211>663
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>23
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggtgggag cctgcgtctc   60
tcttgtgcag tgagcggctt cagctctacc aattaccatg tgcactgggt gcgtcaggca  120
cctgggaagg gcctggagtg gatgggtgtt atttggggcg acggcgatac atcctacaac  180
tccgtcctga agagccgttt caccatttcc cgtgacacct caaagaatac cgtttacctc  240
cagatgaact ctctccgcgc agaggacaca gcagtctatt actgtgcacg tcaactgacc  300
cactattacg ttttggcagc ctggggtcaa gggactctgg tcacagtctc gagcgcttct  360
acaaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca  420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac  480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc  540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc  600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct  660
tgt                                                                663
<210>24
<211>687
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>24
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggtgggag cctgcgtctc   60
tcttgtgcag tgagcggctt cagctctacc aattaccatg tgcactgggt gcgtcaggca  120
cctgggaagg gcctggagtg gatgggtgtt atttggggcg acggcgatac atcctacaac  180
tccgtcctga agagccgttt caccatttcc cgtgacacct caaagaatac cgtttacctc  240
cagatgaact ctctccgcgc agaggacaca gcagtctatt actgtgcacg tcaactgacc  300
cactattacg ttttggcagc ctggggtcaa gggactctgg tcacagtctc gagcgcttct  360
acaaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca  420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac  480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc  540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc  600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct  660
tgtgacaaaa ctcacacatg cgccgcg                                      687
<210>25
<211>384
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>25
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa   60
gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg  120
actattacct gtcgtgccag tgaggacctc tattacaacc tggcctggta tcagcgtaaa  180
ccgggcaaag ccccgaagct gctcatctat gatacgtacc gcctggctga cggtgtgcca  240
agccgtttca gtggcagtgg cagcggtact gactataccc tcacaatttc gtctctccag  300
ccggaagatt tcgcctctta ctattgtcag caatattaca agttcccttt caccttcggt  360
cagggcacta aagtagaaat caaa                                         384
<210>26
<211>726
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>26
atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa   60
gctgaggttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggtgg gagcctgcgt  120
ctctcttgtg cagtgagcgg cttcagctct accaattacc atgtgcactg ggtgcgtcag  180
gcacctggga agggcctgga gtggatgggt gttatttggg gcgacggcga tacatcctac  240
aactccgtcc tgaagagccg tttcaccatt tcccgtgaca cctcaaagaa taccgtttac  300
ctccagatga actctctccg cgcagaggac acagcagtct attactgtgc acgtcaactg  360
acccactatt acgttttggc agcctggggt caagggactc tggtcacagt ctcgagcgct  420
tctacaaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc  480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg  540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga  600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac  660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtcg acaagaaagt tgagcccaaa  720
tcttgt                                                             726
<210>27
<211>750
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>27
atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa   60
gctgaggttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggtgg gagcctgcgt  120
ctctcttgtg cagtgagcgg cttcagctct accaattacc atgtgcactg ggtgcgtcag  180
gcacctggga agggcctgga gtggatgggt gttatttggg gcgacggcga tacatcctac  240
aactccgtcc tgaagagccg tttcaccatt tcccgtgaca cctcaaagaa taccgtttac  300
ctccagatga actctctccg cgcagaggac acagcagtct attactgtgc acgtcaactg  360
acccactatt acgttttggc agcctggggt caagggactc tggtcacagt ctcgagcgct  420
tctacaaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc  480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg  540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga  600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac  660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtcg acaagaaagt tgagcccaaa  720
tcttgtgaca aaactcacac atgcgccgcg                                   750
<210>28
<211>1438
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>28
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa    60
gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg   120
actattacct gtcgtgccag tgaggacctc tattacaacc tggcctggta tcagcgtaaa   180
ccgggcaaag ccccgaagct gctcatctat gatacgtacc gcctggctga cggtgtgcca   240
agccgtttca gtggcagtgg cagcggtact gactataccc tcacaatttc gtctctccag   300
ccggaagatt tcgcctctta ctattgtcag caatattaca agttcccttt caccttcggt   360
cagggcacta aagtagaaat caaacgtacg gtagcggccc catctgtctt catcttcccg   420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc   480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc   540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg   600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag   660
ggcctgagct caccagtaac aaaaagtttt aatagagggg agtgttaaaa tgaagaagac   720
tgctatagca attgcagtgg cgctagctgg tttcgccacc gtggcgcaag ctgaggttca   780
gctggtcgag tctggaggcg ggcttgtcca gcctggtggg agcctgcgtc tctcttgtgc   840
agtgagcggc ttcagctcta ccaattacca tgtgcactgg gtgcgtcagg cacctgggaa   900
gggcctggag tggatgggtg ttatttgggg cgacggcgat acatcctaca actccgtcct   960
gaagagccgt ttcaccattt cccgtgacac ctcaaagaat accgtttacc tccagatgaa  1020
ctctctccgc gcagaggaca cagcagtcta ttactgtgca cgtcaactga cccactatta  1080
cgttttggca gcctggggtc aagggactct ggtcacagtc tcgagcgctt ctacaaaggg  1140
cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct  1200
gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc  1260
cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct  1320
cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt  1380
gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat cttgttaa    1438
<210>29
<211>117
<212>PRT
<213>鼠属物种(Rattus sp.)
<400>29
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Glu
1               5                   10                   15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
His Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Arg Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Ala
            100                 105                 110
Ser Val Thr Val Ser
        115
<210>30
<211>107
<212>PRT
<213>鼠属物种
<400>30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                   15
Glu Thr Val Thr Val Glu Cys Arg Ala Ser Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Asn Ser Pro Gln Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Thr Leu Pro Ser
65                  70                  75                  80
Gly Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105
<210>31
<211>321
<212>DNA
<213>鼠属物种
<400>31
gacatccaga tgacacagtc tccagcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtcacc   60
gtcgaatgtc gagcaagtga ggacctttac tataatttag cgtggtatca gcggaaacca  120
gggaactctc ctcaactcct gatctatgat acatataggt tggcagatgg ggtcccatca  180
cggttcagtg gcagtgggtc tggcacacag tattctctaa agataaacac cctgccatct  240
ggagatgtcg caagttattt ctgtcaacag tattacaaat ttccattcac gttcggctca  300
gggaccaagc tggaactgaa a                                            321
<210>32
<211>351
<212>DNA
<213>鼠属物种
<400>32
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtgcagc cctcagagac cctgtctctc   60
acctgcactg tctctgggtt ctcatcaacc aattatcatg tgcactgggt tcgacagcct  120
ccaggaaaaa gtcttgagtg gatgggagta atatggggtg atggagacac atcatataat  180
tcagttctca aatcccgact gagcatcacc agggacacct ccaggagcca agttttctta  240
aaaatgagca gtctgcaaac ggaggacact gccacctact attgtgccag gcaattgact  300
cattactatg ttctggctgc ctggggtcaa ggagcttcag tcactgtctc g           351
<210>33
<211>381
<212>DNA
<213>鼠属物种
<400>33
atgggtgtgc ccactcatct cctggggttg ttgctactgt ggattacaga tgccatatgt   60
gacatccaga tgacacagtc tccagcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtcacc  120
gtcgaatgtc gagcaagtga ggacctttac tataatttag cgtggtatca gcggaaacca  180
gggaactctc ctcaactcct gatctatgat acatataggt tggcagatgg ggtcccatca  240
cggttcagtg gcagtgggtc tggcacacag tattctctaa agataaacac cctgccatct  300
ggagatgtcg caagttattt ctgtcaacag tattacaaat ttccattcac gttcggctca  360
gggaccaagc tggaactgaa a                                            381
<210>34
<211>408
<212>DNA
<213>鼠属物种
<400>34
atggctgtcc tggtgctgtt gctctgcctg atgacatttc caagctgtgt cctgtcccag   60
gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtgcagccct cagagaccct gtctctcacc  120
tgcactgtct ctgggttctc atcaaccaat tatcatgtgc actgggttcg acagcctcca  180
ggaaaaagtc ttgagtggat gggagtaata tggggtgatg gagacacatc atataattca  240
gttctcaaat cccgactgag catcaccagg gacacctcca ggagccaagt tttcttaaaa  300
atgagcagtc tgcaaacgga ggacactgcc acctactatt gtgccaggca attgactcat  360
tactatgttc tggctgcctg gggtcaagga gcttcagtca ctgtctcg               408
<210>35
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                   15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>36
<211>321
<212>DNA
<213>智人
<400>36
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc   60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca  120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca  180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct  240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccttggac gttcggccaa  300
gggaccaagg tggaaatcaa a                                            321
<210>37
<211>111
<212>PRT
<213>智人
<400>37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
<210>38
<211>333
<212>DNA
<213>智人
<400>38
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc   60
tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct  120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg gtggtagcac atactacgca  180
gactccgtga agggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt  240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag atactttgac  300
tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcc                               333
<210>39
<211>111
<212>PRT
<213>智人
<400>39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                   15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
<210>40
<211>333
<212>DNA
<213>智人
<400>40
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc   60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc  120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac  180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg  240
aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag atactttgac  300
tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcc                               333
<210>41
<211>1459
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核甘酸
<400>41
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa   60
gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg  120
actattacct gtcgtgccag tgaggacctc tattacaacc tggcctggta tcagcgtaaa  180
ccgggcaaag ccccgaagct gctcatctat gatacgtacc gcctggctga cggtgtgcca  240
agccgtttca gtggcagtgg cagcggtact gactataccc tcacaatttc gtctctccag  300
ccggaagatt tcgcctctta ctattgtcag caatattaca agttcccttt caccttcggt  360
cagggcacta aagtagaaat caaacgtacg gtagcggccc catctgtctt catcttcccg  420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc  480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc  540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg  600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag  660
ggcctgagct caccagtaac aaaaagtttt aatagagggg agtgttaaaa tgaagaagac  720
tgctatagca attgcagtgg cgctagctgg tttcgccacc gtggcgcaag ctgaggttca  780
gctggtcgag tctggaggcg ggcttgtcca gcctggtggg agcctgcgtc tctcttgtgc  840
agtgagcggc ttcagctcta ccaattacca tgtgcactgg gtgcgtcagg cacctgggaa   900
gggcctggag tggatgggtg ttatttgggg cgacggcgat acatcctaca actccgtcct   960
gaagagccgt ttcaccattt cccgtgacac ctcaaagaat accgtttacc tccagatgaa  1020
ctctctccgc gcagaggaca cagcagtcta ttactgtgca cgtcaactga cccactatta  1080
cgttttggca gcctggggtc aagggactct ggtcacagtc tcgagcgctt ctacaaaggg  1140
cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct  1200
gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc  1260
cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct  1320
cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt  1380
gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa  1440
aactcacaca tgcgccgcg                                               1459
<210>42
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>42
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ala
1               5                   10
<210>43
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>43
Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>44
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>44
His Asp Asp Ser Pro Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>45
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>45
Leu Ala Gly Glu Asp Ile Ser Asn Val Leu Ala
1               5                   10
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>46
Ala Ala Asn Arg Leu Gln Asp
1               5
<210>47
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>47
Gln Gln Thr Phe Arg Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>48
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>48
Gly Phe Ser Leu Thr Ser His His Ile Ser
1               5                   10
<210>49
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>49
Val Met Trp Asn Asp Gly Gly Thr Leu Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>50
<211>l0
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>50
Gly Lys Met His Tyr Tyr Val Leu Asp Ala
1               5                   10
<210>5l
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>51
Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>52
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>52
Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp
1               5
<210>53
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>53
Gln His Tyr Ser Asn Phe Pro Trp Thr
1               5
<210>54
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                   15
Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Gly Glu Asp Ile Ser Asn Val
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gly Ser Pro Gln Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Asn Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Met Arg Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Phe Arg Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105
<210>55
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>55
gacatccaga tgacacagtc tccaacttcc ctgtctgcat ctctcggaga aactgtctcc    60
atcgaatgtc tagcaggtga agacatttcc aatgttttag cgtggtatca gcagaagtca  120
ggggggtctc ctcagctcct gatctatgct gcaaataggt tacaagacgg ggtcccctca  180
cggttcagtg gcagtggatc tggcacacgg tattctctca agatcagtgg catgcgacct  240
gaagatgaag cagattattt ctgtcaacag actttcaggt atccgctcac gttcggttct  300
gggaccaagc tggaattgaa a                                            321
<210>56
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>56
Glu Val Pro Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                   15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ile Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met His Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Asp Ser Pro Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
           100                 105                 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser
        115
<210>57
<211>357
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>57
gaggtgccgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaaggtc catgaaactt   60
tcctgtgtag cctcaggatt cactttcagt gactattaca tggcctgggt ccgccaggct  120
ccaaagaagg gtctggagtg ggtcgcatcc attagttatg agggtagtag tacttactat  180
ggagactccg tgaagggccg attcactgtc tccagagata ttgcaaaaag caccctatac  240
cttcaaatgc acagtctgaa gtctgaggat acggccattt attattgtgc acgacatgac  300
gatagtccag gatactactt tgattattgg ggccaaggag tcatggtcac agtctcg     357
<210>58
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                   15
Glu Thr Val Thr Ile Glu Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln His Tyr Ser Asn Phe Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Asp Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105
<210>59
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>59
gacatccaga tgacacagtc tccggcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtcacc   60
atcgaatgtc gaacaagtga ggacatttac agtaatttag cgtggtatcg gcagagacca  120
gggaagtctc ctcagctcct gatctatgat acaaatagat tggctgatgg ggtcccgtca  180
cggttcagtg gcagtggatc tggcacacaa tattctctaa agataaacag cctgcaatct  240
gaagatgtcg ccagctattt ctgtcaacac tatagcaatt ttccgtggac cttcggtgga  300
gacaccaagc tggaattgaa a                                            321
<210>60
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>60
Gln Val Gln Leu Thr Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                   15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser His
            20                  25                  30
His Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Val Met Trp Asn Asp Gly Gly Thr Leu Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Pro Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Lys Met His Tyr Tyr Val Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala
            100                 105                 110
Ser Val Thr Val Ser
        115
<210>61
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>61
caggtgcagc tgacggagtc agggcctggc ctggtgcagc cctcacagac cctgtctctc   60
acctgcactg tctctgggtt ctcattaacc agccatcata tatcctgggt tcgacagcct  120
ccaggaaaag gtctggagtg ggtgggagtc atgtggaatg atggaggcac attatataat  180
tcagctctca agtctcgacc gagcatcagt agggacacct ccaagagtca ggtcttctta  240
aaaatgagca gtctgcaaac tgaagacaca gccacttact actgtgccag gggcaaaatg  300
cattactatg ttctggatgc ctggggtcaa ggagcttcag tcactgtctc g           351
<210>62
<211>238
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>62
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                   15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
            20                  25                  30
Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg
        35                  40                  45
Val Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                  55                  60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
                165                 170                 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
            180                 185                 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
        195                 200                 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
    210                 215                 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>63
<211>218
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>63
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                   15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
                85                  90                  95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
        115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ash Phe Tyr
    130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
                165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
            180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
        195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210>64
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>64
atggagacag acacactcct gttatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt   60
gacattgtac tgacacagtc tcctgctacc ttatctgtat ctccgggaga gagggccacc  120
atctcatgca gggccagcca acgtgtcagt tcatctacct atagttatat gcactggtac  180
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct  240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggactg acttcaccct caccatctct  300
tctgtggagc cggaggattt tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattcctccg  360
acgttcggtg gagggaccaa gctggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc  420
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg  480
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg  540
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc  600
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc  660
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag     717
<210>65
<211>463
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>65
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
1               5                   10                   15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe
        35                  40                  45
Thr Ser Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn
65                  70                  75                  80
Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
    130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
                165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
            180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
    210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
                245                 250                 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
            260                 265                 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
        275                 280                 285
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
    290                 295                 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Ala Tyr Arg Val Val
305                 310                 315                 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
                325                 330                 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
            340                 345                 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
        355                 360                 365
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
    370                 375                 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385                 390                 395                 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
                405                 410                 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
            420                 425                 430
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
        435                 440                 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
    450                 455                 460
<210>66
<211>444
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75              80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Ala Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
        435                 440
<210>67
<211>1392
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>67
atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag caccaggtgc ccactcccag   60
gtccaactgg tgcagtcagg ggctgaagtg gtgaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc  120
tgcaaggctt ctggctacat cttcaccagt tattatatgt actgggtgaa gcaggcgccc  180
ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca atggtgatac taacttcaat  240
gagaagttca agagtaaggc cacactgact gtagacaaat ccgccagcac agcatacatg  300
gagctcagca gcctgaggtc tgaggacact gcggtctatt actgtacaag atcggacggt  360
agaaatgata tggactcctg gggccaaggg accctggtca ccgtctcctc agcttccacc  420
aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagat ctacctccga gagcacagcc  480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca  540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac  600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc   660
aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt   720
cccccatgcc caccgtgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc   780
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg   840
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag   900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcgcgta ccgtgtggtc   960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc  1020
tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc  1080
cgagagccac aagtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc  1140
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc  1200
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tcctcgattc cgacggctcc  1260
ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc  1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg  1380
tctctgggtt ga                                                      1392
<210>68
<211>236
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>68
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
        35                  40                  45
Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln
            100                 105                 110
Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
        115                 120                 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
    130                 135                 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
            180                 185                 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
        195                 200                 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
    210                 215                 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>69
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Ash Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>70
<211>711
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>70
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc    60
agatgtgata tccagatgac ccagagtcca agcagtctct ccgccagcgt aggcgatcgt  120
gtgactatta cctgtcgtgc cagtgaggac ctctattaca acctggcctg gtatcagcgt  180
aaaccgggca aagccccgaa gctgctcatc tatgatacgt accgcctggc tgacggtgtg  240
ccaagccgtt tcagtggcag tggcagcggt actgactata ccctcacaat ttcgtctctc  300
cagccggaag atttcgcctc ttactattgt cagcaatatt acaagttccc tttcaccttc  360
ggtcagggca ctaaagtaga aatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc  420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac  480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac  540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc  600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat  660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta g           711
<210>71
<211>463
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>71
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
1               5                   10                  15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ser
        35                  40                  45
Thr Asn Tyr His Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
   50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser
65                  70                  75                  80
Val Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
                85                  90                  95
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
    130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
                165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
            180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
    210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
                245                 250                 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
            260                 265                 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
        275                 280                 285
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
    290                 295                 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Ala Tyr Arg Val Val
305                 310                 315                 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
                325                 330                 335
Lys Cys Lys Val Ser Ash Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
            340                 345                 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
        355                 360                 365
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
    370                 375                 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385                 390                 395                 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
                405                 410                 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
            420                 425                 430
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
        435                 440                 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
    450                 455                 460
<210>72
<211>444
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
His Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Ala Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
        435                 440
<210>73
<211>1392
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多核苷酸
<400>73
atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag caccaggtgc ccactccgaa   60
gtacaattgg tcgagtctgg aggcgggctt gtccagcctg gtgggagcct gcgtctctct  120
tgtgcagtga gcggcttcag ctctaccaat taccatgtgc actgggtgcg tcaggcacct  180
gggaagggcc tggagtggat gggtgttatt tggggcgacg gcgatacatc ctacaactcc  240
gtcctgaaga gccgtttcac catttcccgt gacacctcaa agaataccgt ttacctccag  300
atgaactctc tccgcgcaga ggacacagca gtctattact gtgcacgtca actgacccac  360
tattacgttt tggcagcctg gggtcaaggg actctggtca cagtctcgag cgcttcaacc   420
aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagat ctacctccga gagcacagcc   480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca   540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac   600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc   660
aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt   720
cccccatgcc caccgtgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc   780
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg   840
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag   900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcgcgta ccgtgtggtc   960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc  1020
tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc  1080
cgagagccac aagtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc  1140
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc  1200
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tcctcgattc cgacggctcc  1260
ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc  1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg  1380
tctctgggtt ga                                                      1392
<210>74
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>74
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
His Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ara Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser
        115
<210>75
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>75
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
His Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser
115
<210>76
<211>146
<212>PRT
<213>智人
<400>76
Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser
1               5                   10                  15
Ser Lys Thr Thr Ser yal Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr
            20                  25                  30
Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val
        35                  40                  45
Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser
    50                  55                  60
Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu
65                  70                  75                  80
Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr
                85                  90                  95
His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly
            100                 105                 110
Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp
        115                 120                 125
Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu
    130                 135                 140
Lys Leu
145
<210>77
<211>146
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>77
Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu Ala Asn
1               5                   10                  15
Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr
            20                  25                  30
Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val
        35                  40                  45
Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln Val Thr Phe Cys Ser
    50                  55                  60
Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu Trp Leu
65                  70                  75                  80
Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn Thr
                85                  90                  95
His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val His Leu Gly Gly
            100                 105                 110
Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Glu
        115                 120                 125
Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly Leu Leu
    130                 135                 140
Lys Leu
145

Claims (33)

1.CD154结合蛋白，
包含的重链CDR1、CDR2和CDR3序列分别为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，
包含的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列分别为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
2.CD154结合蛋白，包含：
(a)选自下列的VH结构域序列：
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：29，和
(b)选自下列的VL结构域序列：
SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：30。
3.权利要求2的CD154结合蛋白，包含选自下列的VH和VL结构域序列：
(a)分别为：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
(b)分别为：
SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；
(c)分别为：
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：14；
(d)分别为：
SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14；和
(e)分别为：
SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30。
4.CD154结合蛋白，包含：
(a)选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：72的重链序列；和
(b)选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：69的轻链序列。
5.权利要求4的CD154结合蛋白，包含选自下列的重链和轻链序列：
(a)分别为：
SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15；
(b)分别为：
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15；及
(c)分别为：
SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：69。
6.包含分别为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15的重链和轻链序列的CD154结合蛋白。
7.权利要求1～6中任一项的CD154结合蛋白，其中所述结合蛋白是抗-CD154抗体或其抗原结合片段。
8.权利要求7的CD154结合蛋白，其中所述抗体选自：单克隆抗体、嵌合抗体、灵长类源化抗体和人源化抗体。
9.权利要求7的CD154结合蛋白，其中所述抗体选自：多聚抗体、异二聚抗体、半二聚抗体、四价抗体、双特异性抗体和单链抗体，和它们的衍生物。
10.权利要求7的CD154结合蛋白，其中所述片段选自：Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、Fd、Fv和结构域抗体。
11.权利要求7的CD154结合蛋白，其共价连接功能部分。
12.权利要求9的CD154结合蛋白，其中所述功能部分是聚乙二醇或其衍生物。
13.权利要求12的CD154结合蛋白，
其中所述抗原结合片段是Fab，
其中经修饰铰链区中的单个巯基与共价连接于赖氨酸残基的马来酰亚胺基共价连接，
其中将分子量约20,000Da的甲氧基聚乙二醇聚合物与赖氨酸的各胺基连接。
14.权利要求1的CD154结合蛋白，其中所述CD154结合蛋白的CDR掺入到非免疫球蛋白结构域支架中。
15.权利要求1的CD154结合蛋白，其中所述结合蛋白缺乏免疫球蛋白Fc区。
16.权利要求1的CD154结合蛋白，其中所述结合蛋白包含免疫球蛋白Fc区，
所述免疫球蛋白Fc区选自：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区，或
所述免疫球蛋白Fc区源自：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。
17.权利要求1的CD154结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含与天然或亲本Fc区相比，赋予减少的效应子功能的变体Fc区。
18.权利要求17的CD154结合蛋白，其中所述变体Fc区是包含来自超过一种Ig Fc结构域类型的序列的嫁接Fc区。
19.权利要求1～6中任一项的CD154结合蛋白，其中所述结合蛋白未糖基化。
20.权利要求17或18的CD154结合蛋白，其中所述减少的效应子功能是与Fc受体(FcR)减少的结合。
21.权利要求17或18的CD154结合蛋白，其中所述减少的效应子功能是与补体蛋白减少的结合。
22.权利要求1～6中任一项的CD154结合蛋白，其中所述结合蛋白、抗体或片段与功能部分共价相连接。
23.核酸分子，其编码权利要求1～22中任一项的CD154结合蛋白。
24.DNA分子
包含选自下列的序列：
SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：73。
25.载体，其包含：权利要求23的核酸分子或权利要求24的DNA分子。
26.宿主细胞，其包含权利要求25的载体。
27.产生CD154结合蛋白的方法，包括下列步骤：
(a)在适合于由所述宿主细胞表达所述CD154结合蛋白的条件下，培养权利要求26的宿主细胞；及
(b)回收所述CD154结合蛋白。
28.权利要求27的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
29.组合物，其包含：
●权利要求1～22中任一项的CD154结合蛋白，及
●合适的药学载体。
30.权利要求29的组合物，其还包含其他免疫抑制或免疫调节化合物或制剂。
31.下列物质用于制备治疗或预防完全或部分由CD40信号转导的人病状、病症、疾病，或任何前述的症状的药物的用途：
●权利要求1～22中任一项的CD154结合蛋白，或
●权利要求30的组合物。
32.权利要求31的用途，其中所述病状、病症、或疾病是炎性或自身免疫应答，或者纤维化。
33.权利要求32的用途，其中所述炎性或自身免疫应答，或者纤维化选自：类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、脊椎关节炎、炎性肠病、克罗恩氏病、牛皮癣硬皮病、狼疮、特发性血小板减少性紫癜、血管疾病和多发性硬化症。
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