PL207133B1

PL207133B1 - Cząsteczka wiążąca ludzkie monocytowe białko chemotaktyczne (MCP-1), konstrukt DNA, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, sposób produkcji cząsteczki wiążącej MCP-1 oraz jej zastosowanie

Info

Publication number: PL207133B1
Application number: PL359854A
Authority: PL
Inventors: Peter Hiestand; Hans Hofstetter; Trevor Glyn Payne; Roman Urfer; Padova Franco E. Di
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2010-11-30
Also published as: ZA200300199B; ECSP024402A; CN1443199A; HUP0301477A2; HUP0301477A3; DE60138102D1; ATE426616T1; AU2001283903B2; EP1299421B1; GB0016138D0; NO20026063L; CA2412775A1; KR20030014272A; RU2314316C2; WO2002002640A2; NO20026063D0; JP2007054079A; ES2322643T3; KR100603899B1; US20040047860A1

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy cząsteczek wiążących ludzkie monocytowe białko chemotaktyczne (MCP)-1, konstruktu DNA, wektora ekspresyjnego, kompozycji farmaceutycznej zawierającej cząsteczki wiążące, sposobu produkcji tych cząsteczek i ich zastosowania do leczenia chorób i zaburzeń, w których bierze udział migracja i aktywacja monocytów i limfocytów T, np. chorób zapalnych.

W opublikowanym japoń skim zgł oszeniu patentowym JP 05276986, (Sumitomo Electric Co.) opisano otrzymywanie monoklonalnych przeciwciał gryzoni, specyficznych względem ludzkiego MCP-1, użytecznych do określania MCP-1, do leczenia i diagnozowania chorób, w których bierze udział przenikanie makrofagów. W innym opublikowanym japońskim zgłoszeniu patentowym JP 09067399 (Mitsui Toatsu) opisano otrzymywanie ludzkich monoklonalnych przeciwciał przeciwko ludzkiemu MCP-1 z transformowanych EBV ludzkich obwodowych krwinek do zastosowania w leczeniu zapaleń. W kolejnym opublikowanym japońskim zgłoszeniu patentowym JP 11060502 (Teijin) opisano zastosowanie inhibitora MCP-1, w szczególności ludzkiego przeciwciała anty-MCP-1 do leczenia martwicy mózgu.

Zostały opracowane ulepszone cząsteczki wiążące ludzkie MCP-1 do zastosowania w leczeniu chorób i zaburzeń, w których bierze udział migracja i aktywacja monocytów i limfocytów T.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka wiążąca ludzkie monocytowe białko chemotaktyczne (MCP-1) zawierająca zmienne domeny zarówno ciężkiego (VH), jak i lekkiego łańcucha (VL), gdzie cząsteczka wiążąca MCP-1 obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiązania antygenu zawierające:

a) zmienną domenę (VH) ciężkiego łańcucha immunoglobulinowego, która obejmuje w sekwencji hiperzmienne regiony CDR1, CDR2 i CDR3, gdzie CDR1 ma sekwencję aminokwasową His-Tyr-Trp-Met-Ser, CDR2 ma sekwencję aminokwasową Asn-lle-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly i CDR3 ma sekwencję aminokwasową Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu, i

b) zmienną domenę (VL) lekkiego łańcucha immunoglobulinowego, która obejmuje w sekwencji hiperzmienne regiony CDR1', CDR2' i CDR3', gdzie CDR1' ma sekwencję aminokwasową Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala, gdzie CDR2' ma sekwencję aminokwasową Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser i CDR3' ma sekwencję aminokwasową Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro.

Korzystnie cząsteczka wiążąca MCP-1 jest ludzkim przeciwciałem.

Korzystnie cząsteczka stanowi przeciwciało względem MCP-1, które reaguje krzyżowo z eotaksyną.

Korzystnie również cząsteczka ma wartość KD wiązania z MCP-1 wynoszącą około 50 pM lub poniżej tej wartości.

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka wiążąca MCP-1, która obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiązania antygenu, zawierające pierwszą domenę mającą sekwencję aminokwasową identyczną z przedstawioną jako SEQ. ID. No. 1 rozpoczynającą się od reszty aminokwasowej w pozycji 1 i zakończoną resztą aminokwasową w pozycji 122 i drugą domenę mającą sekwencję aminokwasową identyczną z przedstawioną jako SEQ. ID. No. 2, rozpoczynającą się od reszty aminokwasowej w pozycji 1 i zakończoną resztą aminokwasową w pozycji 109.

Korzystnie powyżej opisana cząsteczka stanowi przeciwciało wiążące MCP-1, które reaguje krzyżowo z eotaksyną.

Korzystnie powyżej opisana cząsteczka ma wartość KD wiązania z MCP-1 wynoszącej około 50 pM lub poniżej tej wartości.

Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt DNA kodujący ciężki łańcuch i lekki łańcuch lub jego fragment cząsteczki wiążącej MCP-1 określonej powyżej, który obejmuje:

a) pierwszą część, która koduje zmienną domenę zawierającą naprzemiennie regiony zrębowe i regiony hiperzmienne, gdzie regiony hiperzmienne stanowią kolejno CDR1, CDR2 i CDR3, których sekwencje aminokwasowe przedstawiono jako SEQ. ID. No. 1, ta pierwsza część rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas zmiennej domeny i zakończona jest kodonem kodującym ostatni aminokwas zmiennej domeny,

b) drugą część, która koduje zmienną domenę zawierającą naprzemiennie regiony zrębowe i regiony hiperzmienne; gdzie regiony hiperzmienne stanowią CDR1', CDR2' i CDR3', których sekwencje aminokwasowe przedstawiono jako SEQ. ID. No. 2; przy czym ta druga część rozpoczyna się

PL 207 133 B1 kodonem kodującym pierwszy aminokwas zmiennej domeny i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas zmiennej domeny.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor ekspresyjny zdolny do replikacji w prokariotycznej lub eukariotycznej linii komórkowej, który obejmuje przynajmniej jeden konstrukt DNA określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca cząsteczkę wiążącą ludzkie monocytowe białko chemotaktyczne (MCP-1), zawierająca zmienne domeny zarówno ciężkiego (VH), jak i lekkiego łańcucha (VL), która reaguje krzyżowo z eotaksyną i która jest zdolna do hamowania wiązania MCP-1 i eotaksyny z ich receptorami, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca cząsteczkę wiążącą MCP-1, która obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiązania antygenu, zawierające pierwszą domenę mającą sekwencję aminokwasową identyczną z przedstawioną jako SEQ. ID. No. 1 i drugą domenę mającą sekwencję aminokwasową identyczną z przedstawioną jako SEQ. ID. No. 2, która reaguje krzyżowo z eotaksyną i która jest zdolna do hamowania wiązania MCP-1 i eotaksyny z ich receptorami, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką , rozcień czalnikiem lub nośnikiem.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób produkcji cząsteczek wiążących MCP-1, określonych powyżej, który obejmuje (i) hodowlę organizmu, który jest transformowany powyżej określonym wektorem ekspresyjnym i (ii) uzyskiwanie z hodowli cząsteczki wiążącej MCP-1.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie cząsteczek wiążących MCP-1, określonych powyżej, które reagują krzyżowo z eotaksyną i które są zdolne do hamowania wiązania MCP-1 i eotaksyny z ich receptorami, do leczenia choroby autoimmunologicznej oraz choroby zapalnej.

Jeśli nie określono inaczej, dowolny łańcuch polipeptydowy został tutaj opisany jako mający sekwencję aminokwasową rozpoczynającą się od końca N i zakończoną końcem C.

Gdy miejsce wiązania antygenu zawiera zarówno domenę VH jak i VL, mogą one być zlokalizowane na tej samej cząsteczce polipeptydowej lub, korzystnie, każda domena może być na innym łańcuchu, domena VH będąca częścią immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu, a VL bę d ą ca częścią immunoglobulinowego lekkiego ł a ń cucha lub jego fragmentu.

Określenie „cząsteczka wiążąca MCP-1 oznacza dowolną cząsteczkę zdolną do wiązania się z antygenem MCP-1, zarówno osobno jak i w połączeniu z innymi cząsteczkami. Reakcja wiązania może być przedstawiona standardowymi sposobami (testy jakościowe) obejmującymi, na przykład, test biologiczny do określania hamowania wiązania MCP-1 z jego receptorem, to jest receptorem chemokin (CCR)-2, np. CCR2B, lub dowolnego typu testy wiązania, w odniesieniu do badań negatywnej kontroli, w których stosowane jest przeciwciało o specyficzności nie związanej, lecz korzystnie o takim samym izotypie. Korzystnie, wiązanie cząsteczek wiążących MCP-1 według wynalazku z MCP-1 może być przedstawione, na przykład, w testach BlAcore.

Przykłady cząsteczek wiążących antygen obejmują przeciwciała jakie są produkowane przez limfocyty B lub hybrydomy i chimeryczne, szczepione CDR lub ludzkie przeciwciała lub dowolny ich fragment, np. fragmenty F(ab')2 i Fab, jak i pojedynczy łańcuch lub pojedyncza domena przeciwciała.

Jednołańcuchowe przeciwciało zawiera zmienne domeny ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała, kowalencyjnie związane linkerem peptydowym, zwykle zawierającym od 10 do 30 aminokwasów, korzystnie od 15 do 25 aminokwasów. Dlatego, taka struktura nie obejmuje części stałej ciężkich i lekkich łańcuchów, i uważa się, że mała peptydowa część rozdzielająca powinna być mniej antygeniczna, niż cała część stała. Określenie chimeryczne przeciwciało oznacza przeciwciało, w którym stałe rejony ciężkich i lekkich łańcuchów lub obu są pochodzenia ludzkiego, podczas gdy zmienne domeny zarówno ciężkiego jak i lekkiego łańcucha nie są pochodzenia ludzkiego (np. pochodzenia mysiego) lub pochodzenia ludzkiego lecz pochodzą z różnych ludzkich przeciwciał. Określenie przeciwciało szczepione CDR oznacza przeciwciało, w których hiperzmienne rejony (CDR-y) pochodzą z donorowego przeciwciała, takiego jak przeciwciała nie pochodzącego od ludzi (np. pochodzenia mysiego) lub różnego ludzkiego przeciwciała, podczas gdy wszystkie, lub zasadniczo wszystkie, pozostałe części immunoglobuliny np. stałe rejony i wysoce konserwatywne części zmiennych domen, to jest regiony zrę bowe, pochodzą z akceptorowego przeciwciała, np. przeciwciało pochodzenia ludzkiego. Przeciwciało szczepione CDR mo4

PL 207 133 B1 że jednakże zawierać kilka aminokwasów z sekwencji donora w regionach zrębowych, na przykład w częściach regionów zrębowych przylegających do hiperzmiennych regionów. Określenie ludzkie przeciwciało oznacza przeciwciało, w którym stałe i zmienne rejony zarówno ciężkich jak i lekkich ł a ń cuchów są wszystkie pochodzenia ludzkiego, lub zasadniczo identyczne z sekwencjami pochodzenia ludzkiego, niekoniecznie z tego samego przeciwciała i obejmuje przeciwciała produkowane przez myszy, w których mysia zmienna immunoglobulina i części stałe genów zostały zastąpione ich ludzkimi odpowiednikami, np. jak opisano w opisach patentowych EP 0546073 B1, USP 5545806, USP 5569825, USP 5625126, USP 5633425, USP 5661016, USP 5770429, EP 0 438474 B1 i EP 0 463151B1.

Szczególnie korzystne cząsteczki wiążące MCP-1 według wynalazku stanowią ludzkie przeciwciała, szczególnie przeciwciała AAV293, AAV294 i ABN912 jak poniżej opisano w przykładach, (przeciwciało AAV293 jest ludzkim przeciwciałem IgG3/K a ABN912 jest ludzkim przeciwciałem IgG4/K, lecz są zasadniczo identyczne względem innych cech. Przeciwciało AAV294 stanowi ludzkie przeciwciało IgG1/K, które ma zmienne domeny będące identyczne z AAV293 z wyjątkiem zmian pojedynczego aminokwasu w FR1, CDR2 i FR3 VH i CDR1' i FR3' VL jak poniżej opisano w przykładach).

Zatem w korzystnych chimerycznych przeciwciałach zmienne domeny zarówno ciężkich jak i lekkich łańcuchów są pochodzenia ludzkiego, na przykład te przeciwciała ABN912, które przedstawiono jako Seq. Id. No. 1 i Seq. Id. No. 2. Domeny stałego regionu korzystnie również obejmują odpowiednie ludzkie domeny stałego regionu, na przykład jak opisano w Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat E. A. i inni, US Department of Health i Human Services, Public Health Service, National Institute of Heath.

Hiperzmienne rejony mogą być połączone z dowolnymi regionami zrębowymi, korzystnie pochodzenia ludzkiego. Odpowiednie regiony zrębowe opisano w Kabat E. A. i inni., korzystne zręby ciężkiego łańcucha stanowią zręby struktury ciężkiego łańcucha, na przykład przeciwciała ABN912, które przedstawiono jako Seq. Id. No. 1. Zawiera ono kolejno regiony FR1, FR2, FR3 i FR4. W podobny sposób, Seq. Id. No. 2 wykazuje korzystną strukturę lekkiego łańcucha ABN912, która zawiera, kolejno, regiony FR1', FR2', FR3' i FR4'. Alternatywne regiony zrębowe, korzystnie ludzkie regiony zrębowe, mogą być stosowane do tych przedstawionych jako Seq. Id. No. 1 i Seq. Id. No. 2, na przykład jak opisano w cytowanej powyżej publikacji Kabat i inni. Kilka reszt aminokwasowych regionów zrębowych, w szczególności w częściach zrębowych przylegających do hiperzmiennych regionów, mogą być różne od tego odpowiednio zdefiniowanego regionu zrębowego, np. aby wpływać na właściwości wiązania.

Monoklonalne przeciwciała przeciwko białku naturalnie występującemu u wszystkich ludzi typowo opracowuje się w układach innych niż pochodzenia ludzkiego np. u myszy. Tako bezpośrednia tego konsekwencja, przeciwciało pochodzenia obcego jakie produkowane jest przez hybrydomę, gdy jest podawane ludziom, wywołuje niepożądaną odpowiedź odpornościową, w której przeważająco pośredniczy część stała immunoglobuliny pochodzenia obcego. To wyraźnie ogranicza zastosowanie takich przeciwciał, gdyż nie mogą one być podawane przez dłuższy czas. Dlatego szczególnie korzystne jest zastosowanie pojedynczego łańcucha, pojedynczej domeny, chimery, szczepionego CDR, lub szczególnie ludzkiego przeciwciała, które nie będzie wywoływać zasadniczej reakcji allogenicznej gdy jest podawany ludziom.

Biorąc pod uwagę powyższe, korzystniejsza cząsteczka wiążąca MCP-1 według wynalazku jest wybrana z grupy obejmującej ludzkie przeciwciało anty MCP-1 które obejmuje przynajmniej

a) immunoglobulinowy ciężki łańcuch lub jego fragment, który obejmuje (i) zmienną domenę zawierającą w sekwencji hiperzmienne rejony CDR1, CDR2 i CDR3 i (ii) stałą część lub fragment tych rejonów ludzkiego ciężkiego łańcucha; z których CDR1 ma sekwencję aminokwasową His-Tyr-Trp-Met-Ser, CDR2 ma sekwencję aminokwasową Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly i CDR3 ma sekwencję aminokwasową Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu oraz

b) immunoglobulinowy lekki łańcuch lub jego fragment których obejmuje (i) zmienną domenę zawierającą hiperzmienny region CDR3' i ewentualnie również hiperzmienne rejony CDR1', CDR2' i (ii) stałą część lub fragment tych rejonów ludzkiego lekkiego łańcucha, z których CDR1' ma sekwencję aminokwasową Arg-Ala-Ser-Głn-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala, CDR2' ma sekwencję aminokwasową Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser i CDR3' ma sekwencję aminokwasową Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro.

PL 207 133 B1

Alternatywnie, cząsteczka wiążąca MCP-1 według wynalazku może być wybrana z grupy obejmującej cząsteczkę wiążącą o pojedynczym łańcuchu, która obejmuje miejsce wiążące antygen zawierające

a) pierwszą domenę zawierającą w sekwencji hiperzmienne rejony CDR1, CDR2 i CDR3, te hiperzmienne rejony mają sekwencje aminokwasowe przedstawione jako Seq. Id. No. 1,

b) drugą domenę zawierającą hiperzmienne rejony CDR1', CDR2' i CDR3', te hiperzmienne rejony mają sekwencje aminokwasowe przedstawione jako Seq. Id. No. 2 oraz

c) łącznik (linker) peptydowy, który jest związany zarówno z zakończeniem końca N pierwszej domeny i z zakończeniem końca C drugiej domeny lub z zakończeniem końca C pierwszej domeny i z zakończeniem końca N drugiej domeny.

Zgodnie z ogólną wiedzą, mniejsze zmiany w sekwencji aminokwasowej takie jak delecja, addycja lub podstawienie jednym, kilkoma lub więcej aminokwasami może prowadzić do formy allelicznej wyjściowego białka która ma zasadniczo identyczne właściwości.

W obecnym opisie sekwencje aminokwasowe są przynajmniej 80% homologiczne do siebie jeś li mają przynajmniej 80% identycznych reszt aminokwasowych w podobnej pozycji, gdy sekwencje są ustawione optymalnie, przerwy lub insercje w sekwencjach aminokwasowych są liczone jako reszty nie identyczne.

Hamowanie wiązania MCP-1 z jej receptorem może być dogodnie badane w różnych testach obejmujących te testy, które są opisane poniżej w tekście. Określenie w tym samym stopniu oznacza, że cząsteczki odniesienia i ekwiwalent wykazują, na podstawie obliczeń statystycznych, zasadniczo podobne krzywe hamowania wiązania MCP-1 w jednym z testów wspomnianych powyżej. Na przykład, cząsteczki wiążące MCP-1 według wynalazku typowo mają wartości IC50 hamowania wiązania MCP-1 z jej receptorem (CCR2B), które są w zakresie +/- x 5 tych, korzystnie zasadniczo takich samych jak wartość IC50 odpowiadającej cząsteczki - odnośnika, gdy jest testowana jak opisano powyżej.

Na przykład, zastosowany test może być testem kompetycyjnego hamowania wiązania MCP-1 przez związany z błoną receptor MCP-1 (CCR2B) i cząsteczki wiążące MCP-1 według wynalazku, np. stosując technologię SPA jak poniżej opisano w przykładach.

Najkorzystniej, ludzkie przeciwciało MCP-1 obejmuje przynajmniej

a) jeden ciężki łańcuch, który obejmuje zmienną domenę mającą sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z przedstawioną jako Seq. Id. No. 1 rozpoczynającą się od aminokwasu w pozycji 1 i zakończoną aminokwasem w pozycji 122 i stałą część ludzkiego ciężkiego łańcucha oraz

b) jeden lekki łańcuch, który obejmuje zmienną domenę mającą sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z przedstawioną jako Seq. Id. No. 2 rozpoczynającą się od aminokwasu w pozycji 1 i zakończoną aminokwasem w pozycji 109 i stałą część ludzkiego lekkiego łańcucha.

Stała część ludzkiego ciężkiego łańcucha może być typu γ1, γ2, γ3, γ4, μ, α1, α2, δ lub ε, korzystnie typu γ, korzystniej typu γ4, podczas gdy stała część ludzkiego lekkiego łańcucha może być typu κ lub λ, (która obejmuje podtypy λ1, λ2 i λ3), ale korzystnie jest typu κ. Sekwencje aminokwasowe wszystkich tych stałych części są podane w powyżej cytowanej publikacji Kabat i inni.

Cząsteczka wiążąca MCP-1 według wynalazku może być produkowana technikami rekombinacji DNA. Biorąc pod uwagę powyższe, jedna lub więcej cząsteczek DNA kodujących cząsteczkę wiążącą musi być utworzona, umieszczona pod kontrolą odpowiednich sekwencji i przeniesiona do odpowiedniego organizmu gospodarza w celu ekspresji.

Przeciętny znawca przedmiotowej dziedzinie techniki jest w stanie, korzystając ze znanego stanu techniki, zsyntetyzować cząsteczki DNA według wynalazku na podstawie informacji przekazanej w obecnym opisie, to jest sekwencji aminokwasowych hiperzmiennych rejonów i sekwencji DNA kodujących te cząsteczki. Sposób konstruowania genu kodującego zmienną domenę został na przykład opisany w opisie patentowym EPA 239 400 i może być krótko podsumowany następująco: gen kodujący zmienną domenę MAb o dowolnej specyficzności został sklonowany. Segmenty DNA kodujące regiony zrębowe i hiperzmienne rejony zostały wyznaczone i segmenty DNA kodujące hiperzmienne rejony zostały usunięte, tak że segmenty DNA kodujące regiony zrębowe są sprzężone razem z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi w połączeniach. Miejsca restrykcyjne mogą być wytworzone w odpowiednich pozycjach przy zastosowaniu mutagenezy cząsteczki DNA zgodnie ze standardowymi procedurami. Dwuniciowe syntetyczne kasety CDR przygotowano metodą syntezy DNA zgodnie z sekwencjami przedstawionymi jako Seq. Id. No. 1 lub 2. Te kasety wyposażono w lepkie końce, tak że mogą być ligowane w połączeniach struktury. Ponadto,

PL 207 133 B1 nie jest konieczne aby mieć dostęp do mRNA z linii komórkowej produkującej hybrydomę w celu otrzymania konstruktu DNA kodującego cząsteczki wiążące MCP-1 według wynalazku. Zatem opis w zgłoszeniu patentowym PCT WO 90/07861 przedstawia pełną instrukcję do produkcji przeciwciała technikami rekombinacji DNA mając daną jedynie zapisaną informację dotyczącą kolejności nukleotydowej genu. Sposób obejmuje syntezę wielu oligonukleotydów, ich amplifikacji metodą PCR i ich splicing aby otrzymać żądaną kolejność DNA.

Wektory ekspresyjne zawierające odpowiedni promotor lub geny kodujące stałe części ciężkiego jak i lekkiego łańcucha są ogólnie dostępne. Zatem, gdy cząsteczka DNA według wynalazku jest przygotowana może ona być dogodnie przeniesiona w odpowiednim wektorze ekspresyjnym. Cząsteczki DNA kodujące pojedynczy łańcuch przeciwciała mogą również być przygotowane standardowymi sposobami, na przykład, jak opisano w opisie patentowym WO 88/1649.

Biorąc pod uwagę powyższe nie są konieczne żadne depozyty hybrydomy lub linii komórkowej aby spełniać kryteria całkowitego opisu środków technicznych.

W szczególności rozwiązanie według wynalazku obejmuje konstrukt DNA do produkcji cz ąsteczki wiążącej MCP-1, opisany w części dotyczącej istoty wynalazku.

W opisie zostały ujawnione konstrukty DNA do produkcji cząsteczki wiążącej MCP-1 jak opisano poniżej: pierwszy konstrukt DNA koduje ciężki łańcuch lub jego fragment i obejmuje

a) jedną część, która koduje zmienną domenę zawierającą alternatywnie zrąb i hiperzmienne regiony, te hiperzmienne rejony stanowią kolejno CDR1, CDR2 i CDR3, których sekwencje aminokwasowe przedstawiono jako Seq. Id. No. 1; jedna część rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas zmiennej domeny i zakończona jest kodonem kodującym ostatni aminokwas zmiennej domeny oraz

b) drugą część kodującą ciężki łańcuch stałej części lub jego fragment, który rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas stałej części ciężkiego łańcucha i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas stałej części lub fragmentu tych rejonów, po którym występuje kodon stop.

Korzystnie, jedna część kodująca zmienną domenę ma sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową jak przedstawiono na Seq. Id. No. 1 rozpoczynającą się od aminokwasu w pozycji 1 i zakończoną aminokwasem w pozycji 122. Korzystniej jedna część ma kolejność nukleotydową jak przedstawiono na Seq. Id. No. 1 rozpoczynającą się od nukleotydu w pozycji 1 i zakończoną nukleotydem w pozycji 366. Również korzystnie, druga część koduje stałą część ludzkiego ciężkiego łańcucha, korzystniej stałą część ludzkiego łańcucha γ4. Ta druga część może być fragmentem DNA pochodzenia genomowego (zawierającym introny) lub fragmentem cDNA (bez intronów).

Drugi konstrukt DNA koduje lekki łańcuch lub jego fragment i obejmuje

a) jedną część która koduje zmienną domenę zawierającą alternatywnie zrąb i hiperzmienne regiony; te hiperzmienne rejony są CDR1', CDR2' i CDR3', których sekwencje aminokwasowe przedstawiono jako Seq. Id. No. 2; ta jedna część rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas zmiennej domeny i zakończona jest kodonem kodującym ostatni aminokwas zmiennej domeny

b) drugą część kodującą lekki łańcuch stałej części lub jego fragment, która rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas stałej części lekkiego łańcucha i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas stałej części lub fragmentu tych rejonów, po którym występuje kodon stop.

Korzystnie, ta jedna część kodująca zmienną domenę mającą sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową jak przedstawiono na Seq. Id. No. 2 rozpoczyna się od aminokwasu w pozycji 1 i zakończona jest aminokwasem w pozycji 109. Korzystniej, jedna część ma kolejność nukleotydową jak przedstawiono na Seq. Id. No. 2 i rozpoczyna się od nukleotydu w pozycji 1 i zakoń czona jest nukleotydem w pozycji 327. Również korzystnie druga część koduje stałą część ludzkiego lekkiego łańcucha, korzystniej stałą część ludzkiego łańcucha κ.

Wynalazek również obejmuje cząsteczki wiążące MCP-1, w których jeden lub więcej, typowo tylko kilka reszt CDR1, CDR2, CDR3, CDR1, CDR2' lub CDR3' jest zmienionych względem reszt przedstawionych jako Seq Id No. 1 i Seq. Id. No. 2; na przykład poprzez mutację np. mutagenezę ukierukowaną punktowo, odpowiednich sekwencji DNA. Wynalazek obejmuje sekwencje DNA kodujące tak zmienione cząsteczki wiążące MCP-1. Wynalazek również obejmuje cząsteczki wiążące, w których jedna lub wię cej, typowo tylko kilka reszt regionów strukturalnych został o zmienionych względem reszt przedstawionych jako Seq Id No. 1 i Seq. Id. No. 2.

W pierwszym i drugim konstrukcie DNA, pierwsza i druga część może być oddzielona przez intron, oraz enhancer może być dogodnie zlokalizowany w intronie pomiędzy pierwszą a drugą częścią.

PL 207 133 B1

Obecność takiego enhancera, który ulega transkrypcji, ale nie ulega translacji, może towarzyszyć wydajnej transkrypcji. W szczegółowych rozwiązaniach pierwszy i drugi konstrukt DNA obejmują enhancer genu kodującego ciężki łańcuch korzystnie pochodzenia ludzkiego.

Każdy z konstruktów DNA jest umieszczony pod kontrolą odpowiedniej sekwencji kontrolującej ekspresję, w szczególności pod kontrolą odpowiedniego promotora. Może być stosowany dowolny rodzaj promotora, pod warunkiem, że jest on dostosowany do organizmu gospodarza, w których konstrukty DNA będą przenoszone w celu ekspresji. Jednakże, jeśli ekspresja ma mieć miejsce w komórce ssaka, szczególnie korzystne jest zastosowanie promotora genu kodującego immunoglobulinę.

Przeciwciało według wynalazku może być produkowane w hodowli komórkowej lub przez zwierzę transgeniczne. Odpowiednie zwierzę transgeniczne może być otrzymane zgodnie ze standardowymi sposobami, które obejmują mikroiniekcję do jaj pierwszego i drugiego konstruktu DNA umieszczonego pod odpowiednią kontrolną sekwencją przeniesienie tak przygotowanych jaj do odpowiednich pseudo-ciężarnych samic i wybranie potomka, u którego zachodzi ekspresja żądanego przeciwciała.

Gdy łańcuchy przeciwciała są produkowane w hodowli komórkowej, konstrukty DNA muszą najpierw być wprowadzone do pojedynczego wektora ekspresyjnego lub do dwóch oddzielnych lecz kompatybilnych wektorów ekspresyjnych, ta druga możliwość jest korzystna.

Odpowiednio, wynalazek również dotyczy wektora ekspresyjnego zdolnego do replikacji w prokariotycznej lub eukariotycznej linii komórkowej, który obejmuje przynajmniej jeden konstrukt DNA według wynalazku.

Każdy wektor ekspresyjny zawierający konstrukt DNA jest następnie przeniesiony do odpowiedniego organizmu gospodarza. Gdy konstrukty DNA są oddzielnie wprowadzone do dwóch wektorów ekspresyjnych, mogą być one przeniesione oddzielnie, to jest jeden rodzaj wektora na komórkę, lub współprzeniesione, ta ostatnia możliwość jest korzystna. Odpowiedni organizm gospodarza może być bakteryjną, drożdżową lub ssaczą linią komórkową, ta druga możliwość jest korzystna. Korzystniej, ssacza linia komórkowa jest pochodzenia limfoidalnego, np. taka jak szpiczak, hybrydoma lub normalny unieśmiertelniony Iimfocyt-β, który dogodnie nie wyraża żadnego endogennego przeciwciała o ciężkim lub lekkim łańcuchu, np. linia komórkowa SP 2/0.

W celu ekspresji w komórkach ssaka korzystne jest aby sekwencja kodująca cząsteczkę wiążącą MCP-1 była zintegrowana z DNA komórki gospodarza w miejscu genu w chromosomie, co umożliwia lub ułatwia wysoki poziom ekspresji cząsteczki wiążącej MCP-1. Komórki, w których sekwencja kodująca cząsteczkę wiążącą MCP-1 jest zintegrowana z takim dogodnym miejscem genu w chromosomie mogą być zidentyfikowane i wybrane na podstawie poziomów przy jakich zachodzi ekspresja cząsteczki wiążącej MCP-1 w tych komórkach. Każdy odpowiedni selekcyjny marker może być stosowany do otrzymania komórek gospodarza zawierających sekwencję kodującą cząsteczkę wiążącą MCP-1; na przykład, może być stosowany układ selekcyjny gen dhfr/metotreksan lub układ ekwiwalentny. Układy do ekspresji cząsteczek wiążących MCP-1 według wynalazku obejmują układy do amplifikacji/selekcji oparte na GS, takie jak te opisane w opisach patentowych EP 0256055 B, EP 0323997 B i EP 0338841 B.

Najkorzystniej cząsteczka wiążąca MCP-1 według wynalazku jest ludzkim przeciwciałem, np. przeciwciałem AAV293, AAV294 lub ABN912 i może być produkowana przez hodowlę odpowiedniej linii komórkowej hybrydomy, lub korzystnie w zrekombinowanej linii komórkowej zawierającej DNA kodujące ludzkie przeciwciało, obejmujące zmienione DNA, tak aby zmienić izotyp przeciwciała lub inne funkcje lub właściwości przeciwciała.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem stwierdzono, że przeciwciało AAV294 i korzystniej przeciwciała AAV293 i ABN912 oddziałują krzyżowo ze zrekombinowaną ludzką eotaksyną-1. W takim przypadku przeciwciała te korzystnie oddziałują z eotaksyną-1 jak i z MCP-1 i, oprócz hamowania wiązania MCP-1 z jej receptorem, mogą być stosowane do hamowania wiązania eotaksyny-1 z jej receptorem. Wydzielanie eotaksyny jest związane z chorobami alergicznymi i zaburzeniami obejmującymi alergiczne i zapalne choroby dróg oddechowych, takie jak astma. Opisano przeciwciała, w szczególności przeciwciała chimeryczne i szczepione CDR, a szczególnie ludzkie przeciwciała, które wykazują specyficzność wiązania zarówno względem MCP-1 jak i względem eotaksyny, np. ludzkiego MCP-1 i ludzkiej eotaksyny oraz zastosowanie takich przeciwciał do leczenia chorób w których pośredniczy MCP-1 lub eotaksyna.

Zatem w kolejnym aspekcie wynalazek obejmuje przeciwciało przeciwko MCP-1, które reaguje krzyżowo z eotaksyną.

PL 207 133 B1

Korzystnie przeciwciała w tym aspekcie wynalazku stanowią przeciwciała, które są zdolne do hamowania wiązania MCP-1 z jej receptorem i zdolne do hamowania wiązania eotaksyny z jej receptorem.

Przeciwciało jest „zdolne do hamowania wiązania MCP-1 i eotaksyny z ich receptorami jeśli przeciwciało jest zdolne do hamowania wiązania MCP-1 i eotaksyny z ich receptorami zasadniczo w tym samym stopniu co przeciwciał o AAV294, AAV293 lub ABN912, gdzie w tym samym stopniu oznacza jak zdefiniowano powyżej.

W obecnym opisie wyraż enie choroby w których poś redniczy MCP-1 i choroba, w której pośredniczy eotaksyna obejmuje wszystkie choroby i stany medyczne, w których MCP-1 lub eotaksyna, w szczególnoś ci eotaksyna-1, odgrywa rolę , zarówno bezpoś rednio lub poś rednio, w chorobie lub stanie medycznym, obejmującymi przyczynę, rozwój, postępowanie, odporność lub patologię choroby lub stanu.

W obecnym opisie okreś lenia leczenie lub traktowanie dotyczą zarówno profilaktyki lub leczenia zapobiegawczego jak i leczniczego lub leczenia modyfikującego chorobę pacjenta, obejmujące leczenie pacjenta, u którego występuje ryzyko nabycia choroby lub u którego podejrzewa się nabycie choroby jak i pacjentów, którzy są chorzy lub u których zdiagnozowano chorobę lub stan medyczny, i obejmuje supresję klinicznych nawrotów choroby.

Przeciwciała AAV293 i ABN912 mają powinowactwo wiązania z MCP-1, które jest wyższe niż powinowactwa wcześniej opisywane dla przeciwciał anty-MCP-1, np. przeciwciała anty ludzkie MCP-1. Zatem ABN912 ma stałą równowagi dysocjacji KD wiązania z MCP-1 poniżej około 50 pM, np. około 43 pM. Tak wysokie powinowactwo wiązania powoduje, że ABN912 jest szczególnie odpowiednie do zastosowań terapeutycznych.

Zatem w jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy przeciwciała przeciwko MCP-1 które ma KD wiązania z MCP-1 około 50 pM lub poniżej. Ten aspekt wynalazku również obejmuje sposoby zastosowania i kompozycje takich przeciwciał o dużym powinowactwie, jak opisano powyżej, względem przeciwciał specyficznych względem MCP-1, które oddziałują krzyżowo z eotaksyną.

Ponadto zgodnie z niniejszym wynalazkiem stwierdzono, że przeciwciało ABN912 wiąże się z antygenowym epitopem MCP-1, który obejmuje resztę argininową w pozycji 24 w MCP-1. Zatem korzystnie przeciwciało ABN912 jest zdolne od współzawodniczenia bezpośrednio o wiązanie MCP-1 z jego receptorem (CCR2B); Arg24 jest waż ną resztą MCP-1 przy wiązaniu MCP1 z CCR2B. Ponadto miejsce wiążące ABN912 obejmuje reszty Arg18 i Lys49 MCP-1.

Odpowiednio w jeszcze innym aspekcie wynalazek obejmuje przeciwciało przeciwko MCP-1, które wiąże się z antygenowym epitopem MCP-1, który obejmuje resztę argininową w pozycji 24 MCP-1. Korzystnie antygenowy epitop również obejmuje resztę argininową w pozycji 18 i resztę lizynową w pozycji 49 MCP-1. Podobnie ten aspekt wynalazku obejmuje zastosowania, sposoby i kompozycje jak opisano powyżej dla przeciwciał specyficznych względem MCP-1, które oddziałują krzyżowo z eotaksyną .

Cząsteczki wiążące MCP-1 jak zdefiniowano powyżej, to jest przeciwciała specyficzne względem MCP-1, które oddziałują krzyżowo z eotaksyną, w szczególności przeciwciała, które są zdolne do hamowania wiązania MCP-1 i eotaksyny z ich receptorami; przeciwciała specyficzne względem MCP-1, które wykazują KD wiązania z MCP-1 około 50 pM lub poniżej; i przeciwciała specyficzne względem MCP-1 które wiążą się z antygenowym epitopem MCP-1, który obejmuje resztę argininową w pozycji 24 MCP-1 poniżej są określane jako przeciwciała według wynalazku.

Korzystnie przeciwciała według wynalazku stanowią ludzkie przeciwciała, najkorzystniej przeciwciało ABN912.

Przeciwciała według wynalazku hamują wpływ MCP-1 na jego komórki docelowe a zatem są wskazane do zastosowania w leczeniu chorób lub zaburzeń, w których pośredniczy MCP-1. Te i inne farmakologiczne działania przeciwciała według wynalazku mogą być wykazane standardowymi metodami oznaczeń, na przykład jak opisano poniżej:

1. Hamowanie wiązania MCP-1 z komórkami, w których zachodzi ekspresja CCR2B

Warunkiem wstępnym przy funkcjach sygnałowych i efektorowych MCP-1 jest jego oddziaływanie z receptorem CCR2B. Technika oznaczania zbliżeniowym testem scyntylacyjnym (Scintillation proximity assay - SPA) jest stosowana do wykazania, że przeciwciała według wynalazku hamują wiązanie MCP-1 z błonami komórek, w których zachodzi ekspresja tego receptora.

Błony komórek CHO, w których zachodzi ekspresja CCR2B są inkubowane z zakresem stężeń docelowego przeciwciała (np. 10^-14M do 10^-8M) i pozostałe wiązanie (125-1)-MCP-1 jest mierzone

PL 207 133 B1 techniką SPA stosując perełki aglutyninowe z kiełków pszenicy. Przeciwciała według wynalazku typowo mają wartość IC50 w zakresie od około 0,1 do około 10 nM, szczególnie od około 0,5 nM (np. 46±206 pM) według określenia tą techniką.

2. Hamowanie sygnalizowania, w którym pośredniczy MCP-1

Potencjał przeciwciała według wynalazku do hamowania efektów fizjologicznych wywołanych przez MCP-1 jest wyznaczany przez pomiar gromadzenia się wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ indukowanego MCP-1 w obecności i braku przeciwciała.

Pomiar odpowiedzi wapniowej przeprowadzano z zastosowaniem stabilnie transfekowanej linii komórkowej CHO, w której zachodzi ekspresja CCR2B i komórek THP-1 stosując barwniki fluorescencyjne i analizę FACS jak poniżej opisano w przykładach. Przeciwciała według wynalazku typowo mają wartość IC50 w zakresie od około 0,05 do około 10 nM, szczególnie od około 0,5nM (np. 390 ± 20pM) według określenia tą techniką.

Przeciwciała według wynalazku korzystnie oddziałują krzyżowo z eotaksyną, w szczególności eotaksyną-1, a zatem korzystnie mogą hamować wpływ eotaksyny na jej komórki docelowe, a zatem są dodatkowo wskazane do zastosowania w leczeniu chorób i zaburzeń w których pośredniczy eotaksyna. Reaktywność krzyżowa przeciwciała według wynalazku z eotaksyną może być określona stosując technikę biosensorów optycznych, taką jak BlAcore (Karlsson i wsp.. J. Immunol. Met. 1991; 145: 229-240).

Jak wykazano w powyższych testach przeciwciała według wynalazku silnie blokują działanie MCP-1 i korzystnie oddziałują krzyżowo z eotaksyną. Odpowiednio, przeciwciała według wynalazku są użyteczne farmaceutycznie w następujący sposób:

Przeciwciała według wynalazku są użyteczne w profilaktyce i leczeniu chorób i stanów medycznych, w których pośredniczy MCP-1 lub eotaksyna. MCP-1 odgrywa ważną rolę w przemieszczaniu leukocytów, w szczególności w migracji monocytów do miejsc zapalnych, a zatem przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane do hamowania migracji monocytów np. w leczeniu stanów zapalnych, alergii i stanów alergicznych, chorób autoimmunizacyjnych, odrzuceniach przeszczepu, nowotworach, w których bierze udział przenikanie leukocytów, zwężeniu lub nawrocie zwężenia, miażdżycy tę tnic, reumatoidalnym zapaleniu stawów i zapaleniach kości i stawów.

Choroby lub stany, które mogą być leczone przeciwciałami według wynalazku obejmują: stany zapalne lub alergiczne, obejmujące choroby alergiczne układu oddechowego takie jak astma, alergiczne zapalenie śluzówki nosa, COPD, nadwrażliwościowe choroby płuc, nadwrażliwościowe zapalenie płuc, śródmiąższowa choroba płuc (ILD), (np. idiopatyczne zwłóknienie płucne, lub ILD w połączeniu z chorobami autoimmunizacyjnymi takimi jak RA, SLE, itp.); anafilaksja lub odpowiedzi nadwrażliwościowe, alergie na leki (np. na penicyliny lub cefalosporyny) i alergie na użądlenia owadów; zapalne choroby jelita, takie jak choroby Crohna i wrzodziejące zapalenie okrężnicy; choroby stawów kręgosłupa, sklerodoma; łuszczyca i zapalne dermatozy takie jak zapalenie skóry, egzema, zewnątrzpochodne zapalenie skóry, alergiczne kontaktowe zapalenie skóry, pokrzywka; zapalenie naczyń;

Choroby autoimmunizacyjne, w szczególności choroby autoimmunizacyjne o etiologii obejmującej składnik zapalny, takie jak zapalenie stawów (na przykład reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie stawów przewlekłe progrediente, łuszczycowe zapalenie stawów i zniekształcające zapalenie stawów) i choroby gośćcowe, obejmujące zapalne stany i choroby gośćcowe włącznie z utratą kości, bólem zapalnym, nadwrażliwością (obejmujące zarówno nadwrażliwość dróg oddechowych jak i nadwrażliwość skórną) i alergie.

Specyficzne choroby autoimmunologiczne w których przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane obejmują autoimmunologiczne hematologiczne zaburzenia (obejmujące np. niedokrwistość hemolityczną, niedokrwistość aplastyczną, niedokrwistość czystych czerwonych krwinek i idiopatyczną małopłytkowość), ukł adowy liszaj rumieniowaty, wielozapalenie chrzą stki, sklerodomę, ziarniakowatość Wegenera, zapalenie skórno-mięśniowe, przewlekłe czynne zapalenie wątroby, osłabienie mięśni górnej części ciała, łuszczycę, zespół Stevena-Johnsona, idiopatyczną celiaklię, autoimmunologiczną zapalną chorobę jelita (obejmującą np. wrzodziejące zapalenie okrężnicy, choroby Crohna i zespół nadpobudliwego jelita), autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, chorobę Behceta, oftalmopatię wewnątrzwydzielniczą, chorobę Gravesa, sarkoidozę, stwardnienie rozsiane, marskość wątroby żółciową pierwotną, młodzieńczą cukrzycę (cukrzyca typu I), zapalenie błony naczyniowej oka (przedniej i tylnej), zapalenie rogówki suche i wiosenne

PL 207 133 B1 zapalenie rogówki, śródmiąższowe zwłóknienie płuc i zapalenie kłębuszków nerkowych (z i bez zespołu nerczycowego, np. obejmujące idiopatyczny zespół nerczycowy lub nefropatię z minimalnymi zmianami);

odrzucenia przeszczepu (np. przy przeszczepach obejmujących serce, płuca, łączone płuco-serca, wątroby, nerek, trzustki, skóry, lub przeszczep rogówki) obejmujące odrzucenia aloprzeszczepu lub odrzucenia ksenoprzeszczepu lub reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi i przeszczep organów związany ze stwardnieniem tętnic;

miażdżycę tętnic;

nowotwór z nacieczeniem leukocytowym skóry lub organów;

zwężenie lub nawrót zwężenia układu naczyniowego, szczególnie tętnic, np. tętnicy wieńcowej, obejmujące zwężenie lub nawrót zwężenia, który wynika z naczyniowej interwencji, jak i rozrost nowej błony wewnętrznej naczynia;

i inne choroby lub stany w których biorą udział odpowiedzi zapalne obejmujące uszkodzenie spowodowane przywróceniem przepływu krwi, hematologiczną złośliwość, indukowaną cytokinami toksyczność (np. wstrząs septyczny lub wstrząs endotoksyczny), zapalenie wielu mięśni, zapalenie skórno-mięśniowe i ziarniakowe choroby obejmujące sarkoidozę.

Przeciwciała według wynalazku są szczególnie użyteczne do leczenia choroby metabolizmu kości i chrząstki obejmujące zapalenia kości i stawów, osteoporozę i inne zapalne wykwity skórne, np. reumatoidalne zapalenie stawów i ogólną utratę kości, obejmujące związaną z wiekiem utratę kości w szczególności chorobę przyzębia.

Przy powyższych wskazaniach, odpowiednia dawka będzie, oczywiście, różna w zależności od, na przykład, szczególnego przeciwciała według wynalazku, które ma być zastosowane, gospodarza, sposobu podawania i charakteru i ciężkości stanu, który jest leczony. Jednakże, w zastosowaniu profilaktycznym, wskazano, że satysfakcjonujące wyniki ogólnie, otrzymywane są przy dawkach od około 0,05 mg do około 10 mg na kilogram masy ciała, zwykle od około 0,1 mg do około 5 mg na kilogram masy ciała. Częstość dawkowania przy profilaktycznym zastosowaniu będzie normalnie w zakresie od około raz na tydzień do około raz na 3 miesiące, zwykle w zakresie od około raz na 2 tygodnie do około raz na 10 tygodni, np. raz na 4 lub 8 tygodni.

Przeciwciało według wynalazku jest dogodnie podawane pozajelitowo, dożylnie, np. do żyły zgięcia łokciowego lub innej żyły obwodowej, domięśniowo, lub podskórnie. Na przykład, stosowanie profilaktyczne typowo obejmuje podawanie przeciwciała według wynalazku raz na miesiąc do raz na do 3 miesięcy, lub rzadziej.

Farmaceutyczne kompozycje według wynalazku mogą być wytwarzane w tradycyjny sposób. Kompozycja zgodnie z wynalazkiem jest korzystnie dostarczona w postaci liofilizowanej. Przy podawaniu natychmiastowym, jest ona rozpuszczona w odpowiednim nośniku wodnym, na przykład sterylnej wodzie do iniekcji lub sterylnym buforowanym roztworze soli fizjologicznej. Jeśli uważa się, że jest pożądane przygotowanie roztworu o większej objętości do podawania przez wlew niż jako jedna iniekcja uderzeniowa, korzystnie jest wprowadzić ludzką albuminę z surowicy lub własną heparynizowaną krew pacjenta do roztworu soli w momencie wytwarzania roztworu. Obecność nadmiaru takiego fizjologicznie obojętnego białka zapobiega utracie przeciwciała przez absorpcję na ściankach zbiornika lub przewodu stosowanego przy roztworze do wlewu. Jeśli stosowana jest albumina, odpowiednie stężenie wynosi od 0,5 do 4,5% wagowych roztworu soli.

Wynalazek jest ponadto opisany na zasadzie zobrazowania na następujących przykładach, które obejmują następujący rysunek:

fig. 1

A-a wykres przedstawiający aktywność eozynofiloperoksydazy (EPO) dla różnych biopsji trepanem od leczonych i nieleczonych rezusów;

B-a podobny wykres przedstawiający aktywność mieloperoksydazy (MPO) dla biopsji;

fig. 2-fotografie przedstawiające barwienie granulocytów kwasochłonnych do histologii próbki pobranej od czterech rezusów zarówno przed jak i po leczeniu ABN912 i CGP44290 (przeciwciało kontrolne);

Fig. 3-wykresy przedstawiające migrację komórek Th (%) w przeszczepach ludzkiej skóry dla różnych trybów leczenia oraz fig. 4-a wykres przedstawiający względne powinowactwa wiązania mutantów ABN912Z MCP-1.

PL 207 133 B1

P r z y k ł a d y

Transgeniczne myszy zaprojektowano, tak aby eskprymowały ludzki IgG/κ zestaw zamiast mysiego zestawu immunoglobulin (Fishwild i wsp., 1996, Nat Biotechnol, 14,845-851) stosowano do wytworzenia przeciwciał przeciwko ludzkiemu MCP-1. Limfocyty B z tych myszy unieśmiertelniano standardową technologią hybrydomy i otrzymano mysie komórki hybrydoma, które wydzielają ludzkie przeciwciało IgG3/K AAV293.

P r z y k ł a d 1:

Immunizacja myszy i wytworzenie linii komórkowej hybrydomy

Immunizacja

Cztery myszy Medarex (myszy Nr 16194-16197, Medarex Inc. Annadale, NJ, USA) immunizowano rekombinowaną ludzką MCP-1 (R & D Układy, Minneapolis, MN, USA), 100 μg białka na mysz w kompletnym adiuwancie Frenunda w dniu 0 i 14 (dootrzewnowo) i dniu 26 (dożylnie). W dniu 41 żadna z myszy nie wykazywała wykrywalnego przeciwciała w surowicy. Myszy ponadto immunizowano rhMCP-1, 100 μg białka na mysz podskórnie w niepełnym adiuwancie Frenunda w dniu 49 i 65. Gdy testowano w dniu 106, zasadnicze miano przeciwciał anty-MCP-1 jest wykrywane w surowicy krwi jednej z myszy (mysz Nr 16194). Mysz tę poddano działaniu dawki wspomagającej 7 dodatkowych razy przed fuzją: 100 μg białka na mysz w roztworze soli w dniu 106 (dootrzewnowo), 119 (podskórnie) i 135 (dootrzewnowo) i 25 μg białka na mysz w roztworze soli w dniach 4 (x2 dożylnie i dootrzewnowo) i -3 i -2 (również dootrzewnowo) przed fuzją.

Fuzja i selekcja hybrydom

W dniu fuzji mysz 16194 została zabita przez wdychanie CO2 i wszystkie komórki śledziony (4,8 x 10⁷) poddano fuzji tradycyjną metodą stosując PEG 4000 z komórkami PAl-O (5 x 10⁷), mysia linia komórkowa szpiczaka. Komórki po fuzji wysiano w 720 studzienkach (1 ml/studzienkę) zawierających warstwę odżywiającą mysie komórki otrzewnowe (Balb/c myszy), uzupełnioną HAT RPMI 1640, 10% inaktywowany temperaturą cielęcą surowicą płodową, 5 x 10^-5 M (3-merkaptoetanol, 50 μg/ml gentamycyny. Pożywkę hodowlaną wymieniano co 4 dni i po 14 dniach pożywkę HAT wymieniano na pożywkę HT, to jest nie stosowano aminopteryny. Z początkowych zasianych 720 studzienek, 461 studzienek (64%)) było dodatnie pod względem wzrostu hybrydomy. Supernatanty zebrano i badano przesiewowe pod kątem reaktywnych monoklonalnych przeciwciał z MCP-1 oznaczeniem ELISA. Zidentyfikowano siedem monoklonalnych przeciwciał podklasy IgG. Klonowanie przeprowadzono stosując 4 x 96 studzienkowe mikrotitracyjne szalki, na których wysiano 0,5 komórek/100 μl na studzienkę. Klony sprawdzono mikroskopowo po 8 dniach, dodano 100 μl pożywki wzrostowej i supernatant badano następnego dnia w oznaczeniu ELISA. Najbardziej reaktywna hybrydoma, klon 149, jest wybrany do dalszego klonowania i charakteryzacji. Subklon hybrydomy 149-12 jest wybrany w oparciu o aktywność inhibitorową w teście gromadzenia wapnia zależnego od rhMCP-1 jego produktu monoklonalnego przeciwciała IgG3/K, AAV293.

Czystość i częściowe sekwencje aminokwasowe ciężkiego jak i lekkiego łańcucha

Sekwencjonowanie aminokwasów

Lekkie i ciężkie łańcuchy oczyszczonego przeciwciała AAV293 oddzielono metodą SDS-PAGE i aminokwasy końca aminowego określono metodą degradacji Edmana. Sekwencje cDNA kodujące zmienne domeny ciężkiego jak i lekkiego łańcucha otrzymano metodą amplifikacji PCR cDNA otrzymanego z mRNA ze sklonowanych komórek hybrydomy i całkowicie zsekwencjonowano. Sekwencje aminokwasowe końca aminowego zmiennej domeny ciężkiego jak i lekkiego łańcucha i odpowiadające im sekwencje DNA są podane w Seq. Id no. 1 i Seq Id No. 2 poniżej, w których CDRy przedstawiono wytłuszczoną czcionką.

PL 207 133 B1

Seq. Id no. 1

60

GAG G IG CAG CFG G IG CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

20

CDR1 120

TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGT CAC TAC TGG ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Trp Met Ser Tip Val Arg Gin Ala

40

150 CDR2 180

CCA GGG AAA GGG CTG GAG TGG CTG GCC AAC ATA GAG CAA GAI' GGA AGT GAG AAA TAC TAT

Pio Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Glu Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr

60

210 240

GTG GAC TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC GCC AAG AAT TCA CTG TAT

Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

80

270 300

CTG CAA ATG AAC AGT CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCT GTG TAT TTC TGT GCG AGG GAT C’TT

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu

100

CDR3 330 360

G AA GGT CTA CAT GGG GAT GGG TAC TTC GAT CTC TGG GGC CGT GGC ACC CTG GTC ACC GTC’

Glu Gly Leu His Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Leu Tip Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val

110 120 : ( i tca

PL 207 133 B1

Ser Ser

Seq. Id no. 2

60

GCC ATC CAG TTG AGA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ATC

Ala Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile

20

CDR1 90 120

CTC ATC TGC CGG GCA AGT CAG GGC GTT AGC AGT GCT TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA

Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala Tip Tyr Gin Gin Lys Pro

40

150 CDR2 180

GGG AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC TAT GAT GCC TCC AGT TTG GAA AGT GGG GTC CCA TCA

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

60

210 240

AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG CCA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro

80

270 CDR3 300

GAA GAT TTT GCA ACT TAT TTC TGT CAA CAG TTT AAT AGT TAC CCT CTC ACT TTC GGC GGA

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly

100

GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGA ACT

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

PL 207 133 B1

Kolejne monoklonalne przeciwciało anty-MCP-1 również otrzymano jak opisano powyżej, produkt monoklonalnego przeciwciała IgG1/K, AAV294. Przeciwciało to wiąże się z MCP-1 w przybliżeniu z 3-krotnie mniejszym powinowactwem niż przeciwciało AAV293 i stwierdzono, że ma sekwencje aminokwasowe VH i VL, które są identyczne z tymi sekwencjami przeciwciała AAV293 z wyjątkiem że w VH AAV294 ma Val zamiast Ala w pozycji 24, Phe zamiast Tyr w pozycji 60 i Ser zamiast Asn w pozycji 74 i w VL AAV294 ma Tyr zamiast Ser w pozycji 30 i Thr zamiast Pro w pozycji 69.

Konstrukcja wektorów ekspresyjnych dla ciężkiego jak i lekkiego łańcucha

Sklonowane sekwencje kodujące VL i VH amplifikowano metodą PCR i wstawiono stosując odpowiednie miejsca restrykcyjne do wektorów kasetowych dostarczających immunoglobulinowy promotor, sekwencje liderowe przeciwciała RFT2 (Heinrich i wsp., (1989) J. Immunol. 143,358997), część segmentów J i miejsce donorowe splicingu. Kasetę lekkiego łańcucha zawierającą sekwencję całego regionu VL, promotora i lidera do wydzielania przeniesiono do wektora ekspresyjnego zawierającego ludzki gen Ck, enhancer immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha i zmodyfikowany mysi cDNA dhfr w celu selekcji z metotreksanem (MTX).

Kasetę ciężkiego łańcucha przeniesiono odpowiednio do wektora ekspresyjnego kodującego ludzki gen lgG4, enhancer immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha i gen oporności na neomycycynę do przeprowadzenia selekcji.

Zarówno ciężki jak i lekki łańcuch mają taką konfigurację w wektorach ekspresyjnych, że przypominają konfigurację genomową o zmienionym rozmieszeniu genów immunoglobulinowych, co uważa się za krytyczne do wysokiego poziomu ekspresji.

W celu produkcji przeciwciała, powyższymi wektorami współ-transfekowano odpowiednie linie komórkowe gospodarza, np. linia komórkowa SP2/0. Komórki zawierające sekwencje wektora wybrano poprzez selekcję metotreksanem i wybrane linie komórkowe hodowano tak, aby prowadziły ekspresję przeciwciała ABN912 (ludzkie IgG4/K anty-ludzkie przeciwciało MCP-1).

Wektory ekspresyjne niosące geny kodujące odpowiednio ciężki jak i lekki łańcuch NVP-ABN912, przeprowadzono w postać liniową i komórki SP2/0 transfekowano przez elektroporację. Transfekowane komórki hodowano przez 20 godzin na nieselektywnej pożywce RPM1 z cielęcą surowicą płodową (FCS) i selekcję G418 stosowano przez 48-72 godzin przy 1,4 mg/ml. Transfekowane zbiory dostosowywano do pożywki RPMI bez FCS zawierającej ogólnie stosowane dodatki (pirogronian, glutamina, ludzka albumina z surowicy, transferyna, insulina). Klony o wysokim poziomie produkcji wyodrębniono po dwóch etapach amplifikacji z metotreksanem przy 200nM i 1 μM. Stabilność produkcji przez klony i pod-klony określano w hodowlach T175 przez okres czterech-pięciu miesięcy niezmiennej hodowli, z dodatkowymi doświadczeniami satelitarnymi. W przypadku klonów o wysokim poziomie produkcji powiększono skalę ze skali laboratoryjnej do hodowli w bioreaktorach. Otrzymano kilka linii komórkowych o wysokim poziomie produkcji, użytecznych do produkcji ABN912. Maksymalna ilość zgromadzonego produktu otrzymana w przerosłych hodowlach wynosiła 504 mg/l.

P r z y k ł a d 2: Biochemiczne i biologiczne dane

Ludzkie monoklonalne przeciwciało ABN912 wiąże się z ludzkim MCP-1 i neutralizuje jego funkcję in vitro. Monoklonalne przeciwciało jest ponadto charakteryzowane poprzez jego wiązanie z rekombinowanym ludzkim MCP-1 dwoma niezależnymi biochemicznymi sposobami, analizą BIAcore i zbliżeniowym testem scyntylacyjnym (SPA). Specyficzność przeciwciała ABN912 względem innych chemokin-CC lub nie będących pochodzenia ludzkiego MCP-1 oznaczono techniką BlAcore i techniką SPA wykazano hamowanie przez ABN912 wiązania MCP-1 z komórkami, w których zachodzi ekspresja CCR2B. Biologiczną aktywność ABN912 względem rekombinowanego i naturalnie produkowanego MCP-1 wykazano w oznaczeniu gromadzenia Ca²⁺ w komórkach, w których zachodzi ekspresja CCR2B. Aktywność ABN912 względem jego naturalnych komórek docelowych, ludzkich obwodowych monocytów krwi (hPBMC), wykazano testem indukowanej MCP-1 chemotaksji.

2.1 Analiza BlAcore

Stałe szybkości asocjacji i dysocjacji wiązania rekombinowanego ludzkiego MCP-1 z unieruchomioną ABN912 zostały oznaczone analizą BlAcore i uzyskano wartość KD

ABN912 unieruchomiono na powierzchni sensorowochipowej i wiązanie rekombinowanego MCP-1 zmierzono powierzchniowym rezonansem plazmonowym (BIACORE 2000 Instrument

PL 207 133 B1

Handbook, March 1999 (Version AC); http: www. biacore. com). Otrzymane wyniki podano w tabeli poniżej.

Stałe szybkości asocjacji [M^-1s^-1']	(n=30)	(1,3 ± 0,1) x 10⁷
Stałe szybkości dysocjacji [s^-1]	(n=30)	(5,0 ± 0,1) x 10^-4
Stała równowagi dysocjacji Kd [M]	(n=30)	(43,0 ± 2,9) x 10^-12

ABN912 wiąże się z rekombinowanym ludzkim MCP-1 z bardzo dużym powinowactwem.

2.2. Selektywność chemokin i wykres specyficzności gatunków

W celu okreś lenia specyficznoś ci oddziaływania MCP-1 z ABN912, wiele MCP-1 pochodzenia nieludzkiego i chemokin-CC badano testem BlAcore pod kątem siły ich oddziaływania z ABN912.

2.2.1 Oddziaływania z nie pochodzącym od naczelnych MCP-1

Serie MCP-1 od gatunków ogólnie stosowanych w laboratoriach badano pod kątem wiązania z przeciwciałem ABN912. Pomiary prowadzono poprzez iniekcję 5 nM roztworu chemokin do komórki przepływowej BlAcore, do której wcześniej wprowadzono ABN912. Po 8 minutach ilości związanej chemokiny mierzono dla każdej badanej chemokiny. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli poniż ej jako procent wią zania każ dej chemokiny w porównaniu do rekombinowanego ludzkiego MCP-1 (100%).

Chemokina	Procent wiązania ABN912 Średnia SEM, n = 3
Rek lu MCP-1 (ludzkie)	100
Rek mysi JE/MCP-1 (mysie)	-0,4 ± 0,2
Rek szczurze MCP-1 (szczurze)	-0,2 ± 2,3
Rek królicze MCP-1 (królicze)	0,9 ± 0,4
Rek psie MCP-1 (psie)	1,3 ± 0,3
Rek świni MCP-1 (od świni)	0,5 ± 0,4
Rek świnki morskiej MCP-1 (od świnki morskiej)	2,3 ± 0,2

ABN912 jest specyficzne względem ludzkiego MCP-1 i nie oddziałuje krzyżowo z MCP-1 żadnego innego badanego gatunku.

2.2.2 Oddziaływania z rekombinowanymi chemokinami

W celu określenia profilu reaktywności krzyż owej ABN912 z innymi chemokinami-CC, ich siłę wiązania z przeciwciałem określono zgodnie z procedurą opisaną powyżej. Procent wiązania każdej chemokiny w porównaniu do rekombinowanego ludzkiego MCP-1 przedstawiono w tabeli poniżej.

Chemokina	Wiązanie z ABN912 średnia SEM, n = 3
rhMCP-1	100
rh MCP-2	6,2 ± 0,9
rh MCP-3	4,3 ± 4,3
rh MCP-4	-2,4 ± 0,6
rh LEC	-2,8 ± 0,3
rh RANTES	-2,7 ± 0,4
rhMlP-1a	-2,8 ± 0,9
rhMlP-1e	-2,9 ± 0,1
rh eotaksyna	52,6 ± 1,9

PL 207 133 B1

ABN912 jest specyficzne względem ludzkiego MCP-1 i nie oddziałuje krzyżowo z MCP-2, MCP-3, MCP-4, LEC, RANTES, MlP-Ια i MlP-Ιβ, lecz znacząco oddziałuje krzyżowo z ludzką eotaksyną, to jest ludzką eotaksyną-1. Stwierdzono, że AAV294 również znacząco oddziałuje krzyżowo z eotaksyną.

2.3 Hamowanie wiązania MCP-1 z komórkami, w których zachodzi ekspresja CCR2B

Technika SPA jest stosowana do wykazania, że przeciwciało ABN912 zapobiega wiązaniu MCP-1 z błonami komórek w których zachodzi ekspresja receptora CCR2B. Błony komórek CHO, w których zachodzi ekspresja CCR2B (CHO#84-patrz poniżej) są inkubowane w zakresie stężeń ABN912 (10^-14 M do 10^-8 M) i resztkowe wiązanie radioaktywnego (125-I) MCP-1 jest mierzone techniką SPA stosując perełki aglutyninowe z kiełków pszenicy. Średnia IC50 [M] otrzymana z trzech niezależnych doświadczeń wynosi (461 ± 206) x 10^-12. ABN912 zapobiega wiązaniu MCP-1 z błonami komórek, w których zachodzi ekspresja receptora CCR2B.

2.4 Hamowanie przekaźnictwa sygnałowego w którym pośredniczy MCP-1

Wczesny sygnał przekaźnictwa sygnałowego w którym pośredniczy MCP-1 stanowi gromadzenie wewnątrzkomórkowego Ca²⁺, co może być zmierzone techniką barwników fluorescencyjnych.

Pomiar odpowiedzi wapniowych przeprowadzano stosując linię komórkową CHO#84, linię komórkową CHO stabilnie transfekowano w celu prowadzenia ekspresji receptora chemokinowego CCR2B. Komórki CHO#84 hodowano w pożywce MEM alfa bez rybonukleaz i dezoksyrybonukleaz, z glutamaksem-1 uzupełnionej 10% dializowaną FCS, 200 U/ml Penicyliny/Streptomycyny i 80 nM metotreksanu jako czynnika umożliwiającego selekcję. Gdy hodowla komórkowa jest zagęszczona, ale przed stanem konfluencji, komórki przemyto PBS i oddzielono od podłoża poprzez krótką inkubację z trypsyną -EDTA (1 min maksimum).

Komórki CHO#84 przemyto raz RPMI, wirowano przez 7 min przy 250g i ponownie zawieszono otrzymując 3,5x10⁶komórek/ml w Buforze Hepes 0,5% BSA zawierającym 0,04% kwasu pluronowego, 1,0 M czerwiem fura i 0,3, μM fluo-3. Do komórek wprowadzano wapniowe sondy fluorescencyjne przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności przy delikatnym mieszaniu, od czasu do czasu (6-8 razy). Następnie, komórki zebrano dwukrotnie z buforu Hepes 0,5% BSA przez wirowanie i osad ponownie zawieszono do stężenia 1,5 do 2x10⁶ komórek/ml w buforze Hepes 0,5% BSA. W tym momencie komórki są gotowe do stymulacji i pomiaru wapnia, i przechowywane w temperaturze pokojowej w ciemności do momentu użycia.

Zarówno przeciwciała jak i chemokinę (MCP-1, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) przygotowano jako roztwory dwudziestokrotnie stężone i mieszano razem, w temperaturze pokojowej przez 5-8 min, przed dodaniem do komórek. Zarówno zielony i czerwony sygnał fluorescencji zmierzono względem czasu stosując cytometr przepływowy (FACS, Becton Dickinson). Dla każdej próbki komórek, fluorescencja komórki do której wcześniej wprowadzono sondy fluorescencyjne Ca jest po raz pierwszy mierzona przez 15 sekund, w celu otrzymania wartości podstawowej. Zbieranie danych przerywano na krótko przed stymulacją komórek poprzez dodanie małej objętości bodźca (dziesięciokrotnie zatężonej chemokiny z lub bez przeciwciała) i pomiary fluorescencji wznowiono. Całkowity pomiar fluorescencji trwał 51 sekund.

Stosowane wskaźniki Ca²⁺ wykazują wzajemne przesunięcie w intensywności fluorescencji przy wiązaniu z wapniem; fluorescencja czerwieni fura obniża się podczas gdy fluorescencja fluo3 wzrasta. Dla każdego doświadczenia, zielony i czerwony sygnał fluorescencji zapisano i stosunek pomiędzy zielonym i czerwonym sygnałem fluorescencji obliczano i wykreślano względem czasu. Stosunek linii podstawowej i stosunek pobudzenia są odpowiednio zdefiniowane jako średnia wartość stosunków otrzymanych tuż przed podaniem bodźca i średnia wartość stosunków maksymalnych otrzymana po podaniu bodźca. Natężenie odpowiedzi określono ilościowo poprzez wskaźnik stymulacji (S. I.) podany jako stosunek pobudzenia podzielony przez stosunek linii podstawowej. Wskaźniki stymulacji otrzymane w obecności przeciwciała są wyrażone jako procent S. I. otrzymanego w obecności jedynie rozpuszczalnika.

Hamowanie (%) przeciwciała A1 rozpuszczonego w rozpuszczalniku S1 jest podana wzorem:

100-[S.I.A1 x 100)/S.I.S1]

Hamowanie przez ABN912 jest porównane z hamowaniem przez prekursorowe przeciwciało, AAV293 i niepokrewnym dostępnym na rynku mysim przeciwciałem anty-MCP-1 (R & D SysPL 207 133 B1 tems). Również ze względu na to, że stosowany immunogen do uzyskiwania AAV293 nie był glikozylowanym rekombinowanym ludzkim MCP-1 z E. coli, supernatant MCP-1 z kolonii HUVEC stymulowanych TNFa (Ludzkie komórki ze śródbłonka naczyń pępowinowych - Human Umbilical Vein Endothelial Cells) jest również stosowany do stymulacji komórek CHO#84 i działanie antagonistyczne ABN912 na gromadzenie Ca²⁺ mierzono jak opisano powyżej. Otrzymane wyniki są podane w tabeli poniżej

Ludzkie MCP-1	Anty-ludzkie MCP-1 mAb
Źródło	Stęż. molowe (nM)	Ludzkie ABN912 (IC50 w nM)	Ludzkie AAV293 (IC₅₀ w nM)	Mysie R&D Systems (IC50 w nM)
E. coli	0,3	0,1 ± 0,02	0,20 ± 0,00
(nieglikozylowane)	1 3	0,39 ± 0,02 1,53 ± 0,47	0,66 ± 0,16 2,12 ± 0,06	0,73 ± 0,09
HUVEC (glikozylowane)	1	0,33 ± 0,01	0,73 ± 0,04	0,95 ± 0,49

ABN912 specyficznie hamuje indukowane MCP-1 gromadzenie Ca²⁺ w komórkach CHO#84, z podobną siłą zarówno u pochodnych E. coli jak i pochodzącego z HUVEC MCP-1.

2.5 Hamowanie chemotaksji indukowanej MCP-1

Zdolność ABN912 do hamowania działania chemotaktycznego MCP-1 względem hPBMC (ludzkie komórki monocytowe krwi obwodowej - Peripheral Blood Monocytic Cells) jest mierzona w komorze Boydena do oznaczeń chemotaksji.

HPBMC przygotowano z użyciem Lymphoprep^TM i jako wprowadzenie stosowano 2 x 10⁶monocytów na ml. ABN912 lub niepokrewne przeciwciało (kontrola negatywna) dodano przy wskazanych molowych ilościach w dolnym i górnym przedziałach komory. Chemotaksja jest indukowana 5,7 nM rekombinowanego ludzkiego MCP-1 lub 1 nM fMIFL (kontrola negatywna) w dolnej komorze. Komórkom umożliwiono migrowanie z górnej komory do dolnej komory przez okres 90 minut w temperaturze pokojowej. Liczba komórek, które przemieściły się jest wyznaczana przez barwienie i zliczanie. Stwierdzono, że dawka ABN912 zależnie hamuje indukowaną MCP-1 chemotaksję komórek hPBMC. Działanie ABN912 na indukowaną MCP chemotaksję jest specyficzne; niepokrewne przeciwciało nie ma wpływu i ABN912 nie ma wpływu na indukowaną fMIFL chemotaksję.

2.6 Hamowanie emigracji leukocytów u rezusów

Ten mechanistyczny model był stosowany do testowania, czy indukowana MCP-1 emigracja leukocytów do skóry rezusów może być hamowana przez NVP-ABN912, gdy jest podany jako dożylna iniekcja uderzeniowa (tzw. bolus).

Dorosłym samcom rezusów wstrzykiwano 30 μg/kg IL-3 przez 13 dni (dwa razy na dzień, dożylnie) w celu zwiększenia liczby leukocytów i sprawdzenia endotelialnych komórek, pod względem optymalnej rekrutacji leukocytów. W dniu 13 małpy usypiano i MCP-1 (10 μg) wstrzyknięto w trzech powtórzeniach śródskórnie po prawej stronie piersi i brzucha. Cztery godziny później, małpy ponownie usypiano i pobierano biopsję trepanem z miejsc iniekcji MCP-1. Następnie podawano jako dożylną uderzeniową iniekcję aby osiągnąć dawkę 5 mg/kg, NVP-ABN912 lub odpowiadające izotypowi humanizowane, będące kontrolą negatywną przeciwciało (CGP44290) skierowano przeciwko ludzkiemu antygenowi rakowo-płodowemu. Na koniec, MCP-1 (10 μg) wstrzyknięto ponownie w trzech powtórzeniach śródskórnie po lewej stronie piersi i brzucha. Te miejsca iniekcji były zlokalizowane symetrycznie względem pierwszej serii iniekcji. Cztery godzin później, małpy usypiano i biopsję pobierano trepanem z miejsc iniekcji MCP-1. Wszystkie biopsje trepanem następnie krojono na pół i jedną połowę zamrażano w płynnym azocie w celu przeprowadzenia analizy enzymów. Drugą połowę przechowywano w formalinie w celu przeprowadzenia później histologii. Testy enzymów dla granulocytów kwasochłonnych i krwinek białych obojętnochłonnych oznaczały odpowiednio aktywność eozynofilo-peroksydazy (EPO) i aktywność mieloperoksydazy (MPO). Kontrole obejmujące iniekcję PBS i brak iniekcji, w celu stymulowania naciekania komórek, prowadzono równolegle przy każdej małpie. Nie obserwowano żadnych znaczących działań, w których pośredniczy przeciwciało przy którejkolwiek z kontroli.

PL 207 133 B1

Aktywności enzymatyczne w miejscach iniekcji MCP-1 odpowiednio przed i po leczeniu NVP ABN912 i CGP44290 (lgG4, odpowiadająca izotypowi kontrola negatywna), przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Wielokrotne miejsca iniekcji (3) zastosowano przy każdej małpie dla każdego stanu. Połączone dane z dwóch niezależnych przebiegów doświadczenia przedstawiono na fig. 1A emigracja granulocytów kwasochłonnych i fig. 1B emigracja krwinek białych obojętnochłonnych.

Normalizowane aktywności EPO (A) lub MPO (B) w biopsji trepanem przed (nieleczone MCP-1, 100%) i po leczeniu przeciwciałem przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD).

Gdy emigracja leukocytów była indukowana w skórze rezusów przez 10 μg MCP-1, hamowanie w 85,5% emigracji granulocytów kwasochłonnych i w 81,4% emigracji krwinek białych obojętnochłonnych obserwowano w obecności NVP-ABN912 w porównaniu do emigracji leukocytów przed leczeniem przeciwciałem. Jedynie około 20% hamowania dla obu typów komórek zmierzono gdy stosowano CGP44290. Biorąc pod uwagę, że iniekcja PBS sama prowadziła do rekrutacji 13,0% (granulocytów kwasochłonnych)

22,7% (krwinek białych obojętnochłonnych) odpowiedzi obserwowanej przy 10 μg MCP-1, podawanie NVP-ABN912 obniżało ilość emigrujących leukocytów względem poziomu podstawowego obserwowanego przy stymulacji PBS. Różnice obserwowane pomiędzy NVP-ABN912 i kontrolnym przeciwciałem były statystycznie bardzo znaczące (p < 0,01) i biorąc pod uwagę wielkość działania, wydaje się również, że ma znaczenie biologiczne. Reprezentatywną histologię emigracji granulocytów kwasochłonnych przedstawiono na fig. 2.

Histologia biopsji trepanem z doświadczenia indukowania MCP-1 emigracji granulocytów kwasochłonnych jest przedstawiona dla czterech małp (2279, 2280, 2281 i 2282).

(A), (B), (E), (F) barwienie granulocytów kwasochłonnych przed leczeniem przeciwciałem małpy odpowiednio 2279,2280, 2281 i 2282.

(C), (D), (G), (H), barwienie granulocytów kwasochłonnych po leczeniu przeciwciałem małpy odpowiednio 2279,2280, 2281 i 2282.

Małpom 2279 i 2280 podawano przeciwciało CGP44290 (5 mg/kg), będące kontrolą negatywną, odpowiadającą izotypowi, a małpom 2281 i 2282 podawano NVP-ABN912 (5 mg/kg). Granulocyty kwasochłonne były barwione czerwienią (widoczne jako ciemne plamy). Strzałki na panelach (G) i (H) przedstawiają kilka granulocytów kwasochłonnych obecnych u dwóch małp, którym podawano NVP-ABN912.

Nie obserwowano żadnych różnic przed leczeniem i po leczeniu CGP 44290, podczas gdy prawie całkowite hamowanie emigracji granulocytów kwasochłonnych obserwowano u małp, którym podawano NVP ABN912.

2.7 Hamowanie naciekania limfocytów T u myszy SCID-hu

Ten mechanistyczny model był stosowany do testowania czy indukowane MCP-1 naciekanie komórek Th na skórze myszy o skórze SCID-hu może być hamowane przez dootrzewnową iniekcję NVPABN912.

Myszom SCID przeszczepiano dwa małe kawałki ludzkiej dorosłej skóry (Skóra SCID-hu). Jakość przeszczepów monitorowano podczas 5-6 tygodni po przeszczepach a następnie, z powodzeniem przeszczepione myszy (ogólnie > 85%) wybrano do doświadczenia migracji in vivo. Przy migracji indukowanej chemokina, PBMC wyodrębniono standardową techniką rozdziału w gradiencie gęstości z próbki „kożuszków (warstwy włókniaka i krwinek białych w górnej części skrzepu) i adoptywnie przeniesiono (dootrzewnowo 1x10⁸ komórek/mysz, 500 μl objętości) do myszy o skórze SCID-hu, którym wcześniej przeszczepiano (5-8 tygodni) dwa kawałki ludzkiej skóry (po prawej i lewej górnej stronie grzbietu). Przeniesienie komórek przeprowadzano w dniu 0. MCP-1 (R&D Układy, Minneapolis, MN) i PBS podawano śródskórnie do ludzkich przeszczepów w doświadczalnych dniach 1, 2, 4 i 6. Kontrolne myszy (leczone CGP44290) otrzymywały 500 ng MCP-1 w prawym przeszczepie skóry i równą objętość (30- 1) PBS w lewym przeszczepie. Myszom leczonym NVP-ABN912 wstrzyknięto 500 ng MCP-1 zarówno, prawy jak i lewy przeszczep skóry. NVP-ABN912 i izotyp kontrolny CGP44290 podawano dootrzewnowo (100 μg/mysz, 4 mg/kg, 500 μl objętości) w dniu 0 (5 godzin przed przeniesieniem komórek) i w doświadczalnych dniach i 5. W dniu 8, wszystkie myszy uśmiercano i ludzkie przeszczepy skóry zebrano w celu dalszych analiz. Pojedyncze zawiesiny komórek każdego ludzkiego przeszczepu skóry przygotowywano stosując DAKO Medimachine® zgodnie z zaleceniami producenta. Te zawiesiny komórek barwiono ludzkim anty-CD3 i anty-CD4 mAb sprzężonym z HTC i PE i analizowano cytometrem przepływowym FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Wyniki przedstawiono na fig. 3. 0,73 ± 0,15% wprowadzonych ludzkich komórek Th przeniknęło do przeszczepu skóry w grupie leczonej ABN912 (5 myszy, n = 10) w porównaniu do 3,73±1,03% stwierdzonych w odpowiadającej im grupie leczonej CPG44290 (3 myszy,

PL 207 133 B1 n = 3). U myszy, u których migracja komórek była indukowana PBS, 0,34 0,17% komórek Th przeniknęło do ludzkiego przeszczepu skóry (3 myszy, n = 3).

Analizę statystyczną przeprowadzono analizą jednokierunkową wariancji, a następnie testem wielokrotnego porównania post hoc Dunett'a. Zmniejszenie wnikania komórek Th u zwierząt leczonych odpowiednio ABN912 względem CGP44290, było bardzo znaczące (p < 0,01, **).

2.8 Charakterystyka wiązania epitopu ABN912 na ludzkim MCP-1 i sposób działania

Trójwymiarowa struktura kompleksu MCP-1 z fragmentem Fab NVP ABN912 była określona krystalograficznie metodą rentgenografii strukturalnej.

Fragment Fab NVP-ABN912 produkowano przez cięcie proteolityczne całego przeciwciała i oczyszczanie metodą chromatografii białka A, a następnie chromatografii wykluczenia (SEC).

Kompleks pomiędzy Fab i rekombinowanym ludzkim MCP-1 oczyszczono metodą chromatografii z białkiem G i chromatografii wykluczenia i zatężono przez ultrafiltrację do 26 mg/ml w 50 mM TrisHCl pH8,0; 0,1 M NaCl. Kryształy hodowano w temperaturze pokojowej techniką dyfuzji par w wiszącej kropli w, 20% (steż. masowe) PEG 4 000, 10% (obj./obj.) izopropanol, 0,1M Na Hepes pH 7,5, w grupie przestrzennej P2, 212, z wymiarami komórki jednostkowej a=63,90 A, b=86,08 A, c=321,64 A i trzy kompleksy na jednostkę asymetryczną. Przed zebraniem danych, jeden kryształ był moczony w 17% (stęż. masowe) PEG 4,000, 8,5% (obj./obj.) izopropanol, 15% glicerol, 85 mM Na Hepes pH 7,5 przez około 3 minuty. Kryształ następnie był osadzany w nylonowym oczku CryoLoop i bezpośrednio zamrażany w strumieniu azotu w 120K. Dane dyfrakcyjne zmierzono przy pomocy obrazowego układu płytowego MAR 345 w linii promienia SNBL w instalacji European Synchrotron Radiation Facility (X =0,90 A). W sumie 242,617 obserwacji, odpowiadających 68,948 charakterystycznych odbić (Rsym=0,050), zebrano pomiędzy 20,0 a 2,33 A rozdzielczości (zupełność 89,3%). Strukturę określono przez zastąpienie molekularne, stosując struktury rentgenograficzne fragmentu Fab monoklonalnego przeciwciała 3D6 (RCSB entry 1DFB; He i wsp., 1992) i ludzkiego MCP-1 (RCSB entry 1DOL; Lubkowski i wsp., 1997) jak w modelach wyjściowych. Struktura została oczyszczona dynamiką kąta torsyjnego i minimalizacją energii stosując program CNX, do końcowego czynnika R 0,224 (Rfree=0,261) dla wszystkich odbić pomiędzy 20 i 2,33 A. Końcowy model obejmuje L1 do L214 i H1 do H222 ABN912 i reszty 10 do 71 ludzkiego MCP-1. Ma ono dobrą geometrię, przy odchyleniu rms 0,006 A na długości wiązań i 1,36° na kątach wiązań.

Kompleks NVP-ABN912 Fab/ludzkie MCP-1 wykazuje dużą powierzchnię rozdziału faz wiązania (1,590 A² połączonej powierzchni ukrytej) obejmującej wiele hydrofobowych i polarnych oddziaływań jak i dla kluczowych elektrostatycznych oddziaływań. Główne miejsca kontaktu z antygenem stanowią te, w których pośredniczy długa pętla H CDR3 NVP-ABN912, która owija się wokół centrum miejsca związania antygenu i staje się w znaczniej mierze ukryta w kompleksie. Epitop wiążący w ludzkim MCP-1 obejmuje reszty aminokwasowe Asn 14, Thr 16, Asn 17, Arg 18, Lys 19, Ile 20, Ser 21, Gln 23, Arg 24, Lys 49, Glu 50, Ile 51 i Cys 52. Arg 18, Arg 24 i Lys 49, które biorą udział w elektrostatycznych oddziaływaniach z resztami przeciwciała Glu L55, Asp H99 i Glu H101 i w związanych H oddziaływaniach z Tyr L94, Trp H33, Asn H50, Gln H53, Asp H99 i Tyr H108. Ponadto, część guanidynowa Arg 18 i Arg 24 MCP-1 jest π-sprzężona względem pierścieni aromatycznych odpowiednio Trp H33 i Tyr H32. W dodatkowych oddziaływaniach pomiędzy NVP-ABN912 a Tyr 13, Gln 17, Ser 21, Lys 19, Arg 24 i Glu 50 antygenu pośredniczy osiem cząsteczek wody ukrytych w powierzchni rozdziału faz białka. Ze względu na fakt, że Tyr 13 i Arg 24 MCP-1 były włączone w wiązanie z receptorem chemokiny CCR2B (Hemmerich i wsp., 1999, Biochemistry, 38; 13013-13025), wydaje się, że NVP-ABN912 bezpośrednio współzawodniczy z receptorem względem wiązania związku antagonistycznego.

2.9 Mapowanie epitopu ABN912 na MCP-1 przez skierowaną punktowo mutagenezę

W celu określenia funkcjonalnie ważnych reszt MCP-1 do rozpoznawania przez NVP ABN912, przeprowadzono badania mutagenezy przeszukującej pod kątem alaniny (Cunningham, B. C. i Wells, J. A. (1989) Science 244,1081-1085). Po pierwsze, trójwymiarowa struktura MCP-1 (Handel, T. M. i Domaille, P. J. (1996) Biochemistry 35, 6569-6584; Lubkowski, J., Bujacz, G., Boque, L., Domaille, P. J., Handel, T. M. i Wlodawer, A. (1997) Nature Struct. Biol. 4,64-69) została wzrokowo zbadana w celu określenia reszt eksponowanych na powierzchni stosując oprogramowanie WebLab Viewer. Całkowitą ilość 39 reszt, które mogłyby skutecznie oddziaływać z ABN912 indywidualnie mutowano na alaniną lub lizyną (D3K, A48K) zestawem QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Papworth, C, Bauer, J. C, Braman, J. i Wright, D. A. (1996) Strategies

PL 207 133 B1 (3), 3-4). Ekspresja otrzymanych zmutowanych genów prowadzono w komórkach HEK.EBNA poprzez najpierw transfekowanie komórek dwoma mikrogramami plazmidów ekspresyjnych niosących zmutowane sekwencje MCP-1 z odczynnikiem do transfekcji Geneporter (Gene Therapy Systems). Po transfekcji, komórki inkubowano przez trzy dni w temp. 37°C i supernatanty następnie zebrano, żwirowano przez 5' i poddano oczyszczaniu chromatografią powinowactwa. Stężenia zmutowanych MCP-1 określono stosując oznaczenie białka (Biorad) z oczyszczonymi MCP-1 jako standard. Typowo z 3 ml hodowli otrzymano 40 μg oczyszczonego ludzkiego MCP-1 lub mutantów MCP-1.

Powinowactwo MCP-1 i mutantów MCP-1 z NVP-ABN912 zmierzono powierzchniowym rezonansem plazmonowym przy użyciu przyrządu BlAcore. Na początku, powierzchnię przyrządu sensorchipa aktywowano i roztwór 30 μg/ml anty-Fcy wstrzyknięto, aby kowalencyjnie się związało z chipem. Przeciwciało NVP-ABN912 zgromadzono na zmodyfikowanej anty-Fcy powierzchni przez iniekcję roztworu 5 μg/ml. Rozcieńczenia MCP-1 lub mutantów MCP-1 przygotowano, tak aby otrzymać końcowe stężenia 0,75 do 4 nM i wstrzyknięto, aby związać z unieruchomionym NVP-ABN912 na powierzchni sensorchipa. Asocjację i dysocjację obserwowano przez 5 min podczas których sygnał powierzchniowego rezonansu plazmonowego był rejestrowany. Serie miareczkowe następnie analizowano stosując oprogramowanie BIAevaluation 3.0 (część oprogramowania instalacji aparatury; Handbook Cat. No. BR 1002-29; wydanie 7-97). Wyniki przedstawiono na fig. 4, którego wykazują one wiązanie się mutantów MCP-1 i MCP-1 z NVP-ABN912.

Główne determinanty cząsteczki MCP-1 do rozpoznawania NVP-ABN912, zidentyfikowane jak opisano powyżej, stanowią reszty T16, R18, R24 i K49. Mutacja T16, R18 i R24 na alaninę całkowicie znosiła wiązanie z NVP-ABN912, podczas gdy mutacja K49 na alaninę prowadziła do 133-krotnego zmniejszenia powinowactwa.

PL 207 133 B1

SEKWENCJE <110> Novartis AG

Novartis-Erfindungen Verwaltunggesellschaft m-b-H

Hiestand Peter

Hofstetter Hans

Payne Trevor Glyn

Urfer Roman <120> PRZECIWCIAŁA PRZECIWKO LUDZKIEMU MCP-1 <130> 31491 <140> PCT/EP 01/07468 <141> 2001-06-29 <150> GB0016138.0 <151> 2000-06-30 <160> 10 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <2U> 366 <212> DNA <213> MUS MUSCARIS <220>

<221> CDS <222> (1)..(366)

<223> CDR1	od 295 ,	91 do 105; CDR2 _od do 333	, 148 do 198; CDR3
	od
<400> 1
gag	gtg cag	ctg	gtg cag tct ggg gga	ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48
Glu	Val Gin	Leu	Val Gin Ser Gly Gly	Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1			5	10 15
tcc	ctg aga	ctc	tcc tgt gca gcc tct	gga ttc acc ttt agt cac tac 96
Ser	Leu Arg	Leu	Ser Cys Ala Ala Ser	Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
		20	25	30
tgg	atg agc	tgg	gtc cgc cag gct cca	ggg aaa ggg ctg gag tgg ctg 144
Trp	Met Ser	Trp	Val Arg Gin Ala Pro	Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
	35		40	45
gcc	aac ata	gag	caa gat gga agt gag	aaa tac tat gtg gac tct gtg 192

PL 207 133 B1

Ala Asn 50

Ile Glu

Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

55

60

aag

ggc

ega

ttc

acc

atc

tcc

aga

gac

aac

gee

aag

aat

tea

ctg

tat

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr

65

70

75

80

ctg

caa

atg

aac

agt

ctg

aga

gee

gag

gac

acg

get

gtg

tat

ttc

tgt

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

gcg

agg

gat

ctt

gaa

ggt

eta

cat

ggg

gat

ggg

tac

ttc

gat

etc

tgg

Ala

Arg

Asp

Leu

Glu

Gly

Leu

His

Gly

Asp

Gly

Tyr

Phe

Asp

Leu

Trp

100

105

110

ggc

cgt

ggc

acc

ctg

gtc

acc

gtc

tet

tea

Gly

Arg

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115 120 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <400> 2

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser

Gly

Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

His

Tyr

20

25

30

Trp

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

35

40

45

Ala

Asn

Ile

Glu

Gin

Asp

Gly

Ser

Glu

Lys

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Leu

Glu

Gly

Leu

His

Gly

Asp

Gly

Tyr

Phe

Asp

Leu

Trp

100

105

110

Gly

Arg

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

PL 207 133 B1

115 120

<210> 3 <211> 327 <212> DNA <213> MUS MUSCARIS
<220> <221> <222>	CDS (1) -	.(327)
<223>	CDR1	• _Od 70 do 102; CDR2 * od	148 do 168; CDR3’
	od	265 do 285

<400> 3

gcc atc cag ttg aca cag tct

cca tcc

tcc ctg tct gca tct gta gga

48

Ala Ile 1

Gin

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala Ser

Val 15

Gly

gac

aga

gtc

atc

ctc

atc

tgc

cgg

gca

agt

cag

ggc

gtt

agc

agt

gct

96

Asp

Arg

Val

Ile

Leu

Ile

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Gly

Val

Ser

Ala

20

25

30

tta

gcc

tgg

tat

cag

aaa

cca

ggg

aaa

gct

cct

aag

ctc

ctg

atc

144

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

tat

gat

gcc

tcc

agt

ttg

gaa

agt

ggg

gtc

cca

tca

agg

ttc

agc

ggc

192

Tyr

Asp

Ala

Ser

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

agt

gga

tct

ggg

cca

gat

ttc

act

ctc

acc

atc

agc

ctg

cag

cct

240

Ser

Gly

Ser

Gly

Pro

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

gaa

gat

ttt

gca

act

tat

ttc

tgt

caa

cag

ttt

aat

agt

tac

cct

ctc

288

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Gin

Phe

Asn

Ser

Tyr

Pro

Leu

85

90

95

act

ttc

ggc

gga

ggg

acc

aag

gtg

gaa

atc

aaa

ega

act

327

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100 105 <210> 4 <211> 109 <212> PRT

PL 207 133 B1 <213> MUS MUSCARIS

<400> 4

Ser Val Gly 15

Ala 1

Ile Gin Leu

Thr Gin 5

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu Ser

Ala

Asp

Arg

Val

Ile

Leu

Ile

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Gly

Val

Ser

Ala

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Pro

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe.

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Gin

Phe

Asn

Ser

Tyr

Pro

Leu

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100 105 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(5) <223> Vh CDR1 <400> 5

His Tyr Trp Met Ser 1 5

<210>	6
<211>	17
<212>	PRT
<213>	MUS MUSCARIS
<220>
<221>	PEPTYD

PL 207 133 B1 <222> (1)..(17) <223> Vh CDR2 «400> 6

Asn Ile Glu Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(13) <223> Vh CDR3 <400> 7

Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Leu 15 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(11) <223> VI CDR1* <400> 8

Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala 15 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220>

<221> PEPTYD

PL 207 133 B1 <222> (1)..(7) <223> VI CDR2· <400> 9

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(7) <223> VI CDR3· <400> 10

Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Cząsteczka wiążąca ludzkie monocytowe białko chemotaktyczne (MCP-1) zawierająca zmienne domeny zarówno ciężkiego (VH), jak i lekkiego łańcucha (VL), w których cząsteczka wiążąca MCP-1 obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiązania antygenu zawierające:

a) zmienną domenę (VH) ciężkiego łańcucha immunoglobulinowego, która obejmuje w sekwencji hiperzmienne regiony CDR1, CDR2 i CDR3, gdzie CDR1 ma sekwencję aminokwasową His-Tyr-Trp-Met-Ser, CDR2 ma sekwencję aminokwasową Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly i CDR3 ma sekwencję aminokwasową Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu, i

b) zmienną domenę (Vl) lekkiego łańcucha immunoglobulinowego, która obejmuje w sekwencji hiperzmienne regiony CDR1', CDR2' i CDR3', gdzie CDR1' ma sekwencję aminokwasową Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala, gdzie CDR2' ma sekwencję aminokwasową Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser i CDR3' ma sekwencję aminokwasową Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro.
2. Cząsteczka wiążąca MCP-1 według zastrz. 1, znamienna tym, że jest ludzkim przeciwciałem.
3. Cząsteczka wiążąca MCP-1 według zastrz. 1 albo 2, która stanowi przeciwciało względem MCP-1, które reaguje krzyżowo z eotaksyną.
4. Cząsteczka wiążąca MCP-1 według zastrz. 1 albo 2, o wartości KD wiązania z MCP-1 wynoszącej około 50 pM lub poniżej tej wartości.
5. Cząsteczka wiążąca MCP-1, która obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiązania antygenu, zawierające pierwszą domenę mającą sekwencję aminokwasową identyczną z przedstawioną jako SEQ. ID. No. 1 rozpoczynającą się od reszty aminokwasowej w pozycji 1 i zakończoną resztą aminokwasową w pozycji 122 i drugą domenę mającą sekwencję aminokwasową identyczną z przedstawioną jako SEQ. ID. No. 2, rozpoczynającą się od reszty aminokwasowej w pozycji 1 i zakończoną resztą aminokwasową w pozycji 109.
6. Cząsteczka wiążąca MCP-1 według zastrz. 5, która stanowi przeciwciało względem MCP-1, które reaguje krzyżowo z eotaksyną.

PL 207 133 B1
7. Czą steczka wiążąca MCP-1 wedł ug zastrz. 5 o wartoś ci KD wią zania z MCP-1 wynoszą cej około 50 pM lub poniżej tej wartości.
8. Konstrukt DNA kodują cy ciężki ł a ń cuch i lekki ł a ń cuch czą steczki wiążącej MCP-1, okreś lonej w zastrz. 1, lub fragment tych łańcuchów, który obejmuje:

a) pierwszą część, która koduje zmienną domenę zawierają c ą naprzemiennie regiony zr ę bowe i regiony hiperzmienne, gdzie regiony hiperzmienne stanowią kolejno CDR1, CDR2 i CDR3, których sekwencje aminokwasowe przedstawiono jako SEQ. ID. No. 1, przy czym ta pierwsza część rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas zmiennej domeny i zakończona jest kodonem kodującym ostatni aminokwas zmiennej domeny

b) drugą część, która koduje zmienną domenę zawierają c ą naprzemiennie regiony zrę bowe i regiony hiperzmienne; gdzie regiony hiperzmienne stanowią CDR1', CDR2' i CDR3', których sekwencje aminokwasowe przedstawiono jako SEQ. ID. No. 2; przy czym ta druga część rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas zmiennej domeny i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas zmiennej domeny.
9. Wektor ekspresyjny zdolny do replikacji w prokariotycznej lub eukariotycznej linii komórkowej, który obejmuje przynajmniej jeden konstrukt DNA określony w zastrz. 8.
10. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca cząsteczkę wiążącą MCP-1 określoną w zastrz. 1 albo 2, która reaguje krzyżowo z eotaksyną i która jest zdolna do hamowania wiązania MCP-1 i eotaksyny z ich receptorami, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.
11. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca cząsteczkę wiążącą MCP-1 określoną w zastrz. 5, która reaguje krzyżowo z eotaksyną i która jest zdolna do hamowania wiązania MCP-1 i eotaksyny z ich receptorami, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.
12. Sposób produkcji cząsteczki wiążącej MCP-1, który obejmuje (i) hodowlę organizmu, który jest transformowany wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 9 i (ii) uzyskiwanie z hodowli cząsteczki wiążącej MCP-1.
13. Zastosowanie cząsteczki wiążącej MCP-1 określonej w zastrz. 1 albo 2, która reaguje krzyżowo z eotaksyną i która jest zdolna do hamowania wiązania MCP-1 i eotaksyny z ich receptorami, do leczenia choroby autoimmunologicznej oraz choroby zapalnej.
14. Zastosowanie cząsteczki wiążącej MCP-1 określonej w zastrz. 5, która reaguje krzyżowo z eotaksyną i która jest zdolna do hamowania wiązania MCP-1 i eotaksyny z ich receptorami, do leczenia choroby autoimmunologicznej oraz choroby zapalnej.