PL180125B1 - Bialko fuzyjne o swoistosci wiazania przeciwko ludzkiej IL-4, PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 Bialko fuzyjne o swoistosci wiazania przeciwko ludzkiej intcrleukinie-4 (IL4), które obejmuje regiony zapewniajace k omplementamosc (CDR) lancucha ciezkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. N r Id.: 22, Sek. Nr Id.: 24 lub Sek. N r Id.: 26 oraz C D R - z lancucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek N r Id 16 Sek Nr Id.: 18, Sek. Nr Id.: 20, lub Sek. Nr Id.: 28. 7. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, która jest wybrana z grupy obejmujacej: (a) sekwencje kwasu nukleinowego kodujaca bialko fuzyjne o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako Sek N r Id.: 14 lub Sek. N r Id.: 12; (b) sekwencje kwasu nukleinowego komplementarna do (a); (c) sekwencje kwasu nukleinowego o 18 lub wiecej nukleotydach zdolna do hybrydyzowania do (a) lub (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji i (d) fragment lub analog (a), (b) lub (c), który koduje bialko swoiste wobec ludzkiej intcrleukiny-4; przy czym ta sekwencja ewentualnie zawiera miejsce restrykcji. 9. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, która jest wybrana z grupy obejmujacej: (a) sekwencje kwasu nukleinowego kodujaca region zapewniajacy komplementamosc (CDR) o sekwencji am inokw a- sowej przedstawionej w Sek. N r Id 22, Sek. N r Id.: 24, Sek. N r Id.: 26; Sek. N r Id.: 16, Sek. Nr Id.: 18, Sek. Nr Id.: 20 lub Sek. Nr Id.: 28; (b) sekwencje kwasu nukleinowego komplementarna do (a); (c) sekwencje kwasu nukleinowego o 18 lub wiecej nukleotydach zdolna do hybrydyzowania do (a) lub (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji i (d) fragment lub analog (a), (b) lub (c), który koduje bialko swoiste wobec ludzkiej interleukiny-4; 12. Neutralizujace przeciwcialo monoklonalne gryzonia swoiste wobec ludzkiej interleukiny-4 zawierajace lancuch lekki o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jak w Sek Nr Id : 2 i lancuch ciezki o sekwencji aminokwasowej przed- stawionej jak w Sek. Nr Id.: 4. 15. Hybrydoma w ytw arzajaca m onoklonalne przeciwcialo swoiste wobec ludzkiej interleukiny-4 zawierajace lan- cuch lekki o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jak w Sek. Nr Id.. 2 i lancuch ciezki o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jak w Sek. N r Id.. 4. 16. Linia komórkowa hybrydomy 3426A11C1B9 o numerze depozytu ECACC 9 3 1OO62O. PL PL PL PL PL PL

Description

Zgłoszenie to jest kontynuacj ą zgłoszenia US Nr 08/136783, zgłoszonego 14 października 1993, będącego kontynuacją zgłoszenia US Nr 08/117,366 zgłoszonego 7 września 1993, z których oba włączone są tu w całości jako odnośniki.

Niniejszy wynalazek dotyczy białka fuzyjnego o swoistości wiązania przeciwko ludzkiej IL-4, jego kompozycji farmaceutycznych, kodującej je izolowanej sekwencji kwasu nukleinowego, przeciwciała monoklonalnego gryzonia swoistego wobec ludzkiej IL-4 oraz wytwarzającej je hybrydomy i linii komórkowej hybrydomy.

Alergiczne choroby atopowe obejmują zakres od względnie łagodnych, jak sezonowe zapalenie błony śluzowej nosa i zapalenie spojówek do bardziej poważnych jak atopowe zapalenie skóry i astma atopowa, oraz zagrażających życiu jak wstrząs anafilaktyczny. Czynnikiem wiążącym te stany jest odpowiedź odpornościowa organizmu na alergeny, która to odpowiedź obejmuje wytwarzanie przeciwciał immunoglobulin E (IgE) przez predysponowanego genetycznie osobnika (atopia). Zahamowanie wytwarzania przeciwciał IgE od długiego czasu było celem immunoterapii swoistej chorób alergicznych przy użyciu szczepionek odczulających. W ostatnim czasie bezpieczeństwo i efektywność leczenia szczepionkami zostały zakwestionowane, nie zniknęła jednakże potrzeba obniżenia poziomu przeciwciał IgE.

180 125

Interleukina 4 (IL-4) jest mediatorem białkowym układu limfatycznego. Badania limfocytów pochodzących od osobników atopowych wykazały obecność wyższej niż normalna liczby limfocytów T ze zdolnością do wydzielania IL-4 w odpowiedzi na pobudzenie oraz większych ilości IL-4 wydzielanych po pobudzeniu.

Przeciwciała przeciwko IL-4, jak odkryto, hamują IgE, ale nie IgG, czy IgG_2a (Finkelman i in., Ann. Rev. Immunol., 8: 303 (1990)) oraz tworzenie limfocytów T wydzielających IL-5 (Maggi i in., J. Immunol., 148: 2142 (1992)). Ponadto, ostatnie dane wskazują, że IL-4 może zaburzać gromadzenie się eozynofili w tkankach. Patrz, np. Tepper i in., Celi, 62: 457 (1990); Lepper i in., Celi, 57: 503 (1989).

Stąd, pozostaje zapotrzebowanie na antagonistę IL-4 o wysokim powinowactwie, który zmniejszałby stan zapalny wywoływany przez eozynofile zarówno przez zmniejszenie proliferacji komórek wydzielających IL-5 jak i przez zahamowanie mechanizmów adhezji, dzięki którym eozynofile mogą być gromadzone w tkankach i mógłby być zastosowany w leczeniu, zapobieganiu czy diagnozowaniu reakcji alergicznych.

Niniejszy wynalazek dotyczy białka fuzyjnego o powinowactwie wiązania z ludzką interleukiną4 obejmującego regiony zapewniające komplementarność (CDR) uzyskane z niepochodzących od człowieka neutralizujących przeciwciał monoklonalnych (MAb) charakteryzujących się stałądysocjacji równą lub mniejszą niż 2 χ 10'¹⁰ w stosunku do ludzkiej IL-4, oraz pierwszym składnikiem fuzji, w którym przynajmniej jeden, zaś korzystnie wszystkie regiony zapewniające komplementarność (CDR) pierwszego składnika fuzji są zastąpione przez CDRy z przeciwciała monoklonalnego (MAb) niepochodzącego od człowieka. W szczególności, wynalazek dotyczy regionów zapewniających komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. Nr Id.: 22, Sek. Nr Id.: 24 lub Sek. Nr Id.: 26 oraz CDR-y z łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. Nr Id.: 16, Sek. Nr Id.: 18, Sek. Nr Id.: 20 lub Sek. Nr Id.: 28 i region zmienny łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako Sek. Nr Id.: 12 i region zmienny łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako Sek. Nr Id.: 14.

Niepochodzące od człowieka przeciwciała monoklonalne mogą być wybrane spośród grupy składającej się z 3B9 i 6A1 opisanych bardziej szczegółowo w szczegółowym opisie. Korzystnie, białko fuzyjne połączone jest funkcjonalnie z drugim białkiem fuzyjnym, które zawiera cały lub część łańcucha stałego przeciwciała.

Opisano ponadto CDR uzyskane z niepochodzących od człowieka neutralizujących przeciwciał monoklonalnych (MAb) charakteryzujących się stałądysocjacji równąlub mniejszą niż 2 χ 10’¹⁰ M dla ludzkiej IL-4.

Opisano również przeciwciała humanizowane posiadające przynajmniej jeden, a korzystnie sześć regionów zapewniających komplementarność (CDR) uzyskanych z niepochodzącego od człowieka neutralizującego przeciwciała monoklonalnego (MAb) charakteryzującego się stałądysocjacji równąlub mniejszą niż 2 χ 10’¹⁰ M dla ludzkiej IL-4.

Ponadto, opisano przeciwciała chimeryczne zawierające ludzkie regiony stałe łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciał oraz regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego uzyskane z niepochodzącego od człowieka neutralizuj ącego przeciwciała monoklonalnego (MAb) charakteryzującego się stałądysocjacji równąlub mniejszą niż 2 χ 10'¹⁰ M dla ludzkiej IL-4.

Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej jedno (lub więcej) wyżej opisane białko fuzyjne albo przeciwciało monoklonalne oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Opisano również sposób leczenia i/lub zapobiegania stanom alergicznym u ludzi przez podawanie wspomnianemu człowiekowi skutecznej ilości kompozycji farmaceutycznej według wynalazku.

Opisano również sposoby i składniki użyteczne w produkcji rekombinacyjnej białek fuzyjnych, MAb (np. humanizowanych, chimerycznych itp.), ich CDR, Fab czy F(ab)₂ albo ich analogów uzyskanych z nie pochodzącego od człowieka neutralizującego przeciwciała monoklonalnego (MAb) charakteryzującego się stałądysocjacji równąlub mniejszą niż 2 χ 10’¹⁰ M dla ludzkiej IL-4. Składniki te obejmują izolowane sekwencje kwasu nukleinowego kodujące rekombinowane plazmidy zawierające sekwencje kwasu nukleinowego pod kontrolą wybranych sekwencji regulatorowych zdolnych do kierowania ich ekspresją w komórkach gospodarza oraz komórki gospodarza (najkorzystniej ssaka) transfekowane rekombinowanymi plazmidami. Sposób wytwarzania obejmuje hodowanie transfekowanej linii komórkowej gospodarza według wynalazku w takich warunkach, że przeciwciało, najkorzystniej przeciwciało humanizowane, ulega ekspresji we wspomnianych komórkach oraz izolowanie z nich produktu ekspresji.·

Również opisano sposób diagnozowania alergii i innych stanów związanych z nadmierną produkcją immunoglobuliny E u ludzi, który obejmuje doprowadzenie do kontaktu pomiędzy próbkąpłynu biologicznego a białkami fuzyjnymi, MAb (np. humanizowanymi, chimerycznymi itp.) czy Fab według wynalazku i badanie wystąpienia wiązania pomiędzy wspomnianym białkiem fuzyjnym, MAb czy Fab i ludzką IL-4.

Opisano także metodę przesiewania przeciwciał monoklonalnych posiadających wysokie miano w stosunku do ludzkiej IL-4 obejmującą: (a) wykonanie linii komórkowej hybrydomy charakteryzującej się wydzielaniem przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiej IL-4; oraz (b) przesiewanie wspomnianej linii komórkowej hybrydomy sprzężoną z aldehydem ludzką interleukiną4 albo biotynowaną ludzkąinterleukiną4. Najkorzystniej, linia komórkowa hybrydomy przesiewana jest biotynylowaną ludzką interleukiną 4.

Opisano również neutralizujące MAb posiadające wysokie powinowactwo w stosunku do IL-4, lub jego fragment Fab albo fragment F(ab)₂, wytworzony przez przeglądanie biblioteki produktów hybrydomy sprzężoną z aldehydem ludzką interleukiną 4 lub biotynylowaną interleukiną 4.

Niniejszy wynalazek dotyczy neutralizujących przeciwciał monoklonalnych gryzonia swoistych dla ludzkiej interleukiny 4 posiadających powinowactwo wiązania charakteryzujące się stałądysocjacji równą lub mniejszą niż 2 χ 10'¹⁰ M. Przykładowymi przeciwciałami monoklonalnymi posiadającymi podobne charakterystyki (tzn. wiążące się z tym samym epitopem co 3B9 czy 6A1 ze swoistością dla ludzkiej IL-4 i stałą dysocjacji równą lub mniejszą niż 2 χ 10¹⁰ M).

Wynalazek dotyczy również hybrydomy 3426A11C1B9.

Wynalazek dotyczy również wyizolowanej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białka według wynalazku.

Inne aspekty i korzyści niniejszego wynalazku opisane są dalej w następującym szczegółowym opisie ich najkorzystniejszych wykonań.

Krótki opis rysunków

Figura 1 (Identyfikator Sekw. Nr 1 i 2) pokazuje region zmienny łańcucha lekkiego (aminokwasy od 21 do 132) mysiego przeciwciała przeciwko IL-4 3B9 i ludzko/mysiego przeciwciała chimerycznego 3B9 jak również natywną sekwencję sygnałową (aminokwasy od 1 do 20). Fragmenty podkreślone oznaczają CDR (Identyfikatory Sekw. Nr 15 i 16; Identyfikatory Sekw. Nr 17 i 18 i Identyfikatory Sekw. Nr 19 i 20).

Figura 2 (Identyfikatory Sekw. Nr 3 i 4) pokazuje region zmienny łańcucha ciężkiego (aminokwasy od 20 do 140) mysiego 3B9 i natywnąsekwencję sygnałową (aminokwasy od 1 do 19). Fragmenty podkreślone oznaczają CDR (Identyfikatory Sekw. Nr 21 i 22; Identyfikatory Sekw. Nr 23 i 24 i Identyfikatory Sekw. Nr 25 i 26).

Figura 3 (Identyfikatory Sekw. Nr 9 i 10) pokazuje region zmienny łańcucha ciężkiego (aminokwasy od 21 do 141) ludzko/mysiego przeciwciała chimerycznego 3B9 i jego sekwencję sygnałową (aminokwasy od 1 do 19: Identyfikatory Sekw. Nr 5 i 6). Podkreślone fragmenty oznaczająCDR uzyskane z 3B9 (Identyfikatory Sekw. Nr 21 i 22; Identyfikatory Sekw. Nr 23 i 24 i Identyfikatory Sekw. Nr 25 i 26).

Figura 4 (Identyfikatory Sekw. Nr 11 i 12) pokazuje region zmienny łańcucha ciężkiego (aminokwasy od 20 do 141) przeciwciała humanizowanego 3B9 oraz sekwencję sygnałową (aminokwasy od 1 do 19: Identyfikatory Sekw. Nr 5 i 6). Podkreślone fragmenty wykazująCDR

180 125 uzyskane z 3B9 (Identyfikatory Sekw. Nr 54 i 22; Identyfikatory Sekw. Nr 55 i 24 i Identyfikatory Sekw. Nr 56 i 26).

Figura 5 (Identyfikatory Sekw. Nr 13 i 14) pokazuje region zmienny łańcucha lekkiego (aminokwasy od 21 do 131) humanizowanego przeciwciała 3B9 oraz sekwencję sygnałową (aminokwasy od 1 do 20; Identyfikatory Sekw. nr 7 i 8). Fragmenty podkreślone wskazują CDR uzyskane z 3B9 (Identyfikatory Sekw. Nr 53 i 16; Identyfikatory Sekw. Nr 17 i 18 oraz Identyfikatory Sekw. Nr 27 i 28).

Figura 6A (Identyfikatory Sekw. Nr 5 i 6) jest sekwencją sygnałową łańcucha ciężkiego zastosowaną w przykładzie 4, poniżej.

Figura 6B (Identyfikatory Sekw. Nr 7 i 8) jest sekwencją sygnałową łańcucha lekkiego zastosowaną w przykładzie 4, poniżej.

Figura 7 jest schematem plazmidu pIL4chhc3-pcd użytego do ekspresjonowania chimerycznego łańcucha ciężkiego przeciwko IL-4 w komórkach ssaka. Plazmid zawiera gen beta laktamazy (BETA LAC), początek replikacji SV-40 (SV40), sekwencje promotora wirusa cytomegalii (CMV) sekwencję sygnałową, chimeryczną część zmienną łańcucha ciężkiego o Identyfikatorach Sekw. Nr 9 i 10, region stały ludzkiego łańcucha ciężkiego, sygnał poliadenylacji wołowego hormonu wzrostu (BGH), promotor betaglobiny (beta glopro), gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) i jeszcze jedną sekwencję sygnału poliadenylacji z BGH na podłożu pUC19.

Figura 8 jest schematem plazmidu pIL4chlc-pcdn użytego do ekspresjonowania chimerycznego regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała przeciwko IL-4 o Identyfikatorach Sekw. Nr 1 i 2 w komórkach ssaka. Plazmid ten różnił się od pokazanego na Fig. 7 tym, że zawierał chimeryczny region zmienny łańcucha lekkiego zamiast chimerycznego łańcucha ciężkiego, ludzki region stały łańcucha lekkiego i gen oporności na neomycynę (Neo) oprócz DHFR.

Figura 9 jest schematem plazmidu pIL4hzhc-l-pcd zastosowanego do ekspresjonowania regionu zmiennego łańcucha ciężkiego IL-4 o Identyfikatorach Sekw. Nr 11 i 12 w komórkach ssaka. Plazmid ten różnił się od pokazanego na Fig. 7 tym, że zawierał humanizowany region zmienny łańcucha ciężkiego zamiast chimerycznego łańcucha ciężkiego.

Figura 10 jest schematem plazmidu pIL4hzlcl-0-Pcn zastosowanego do ekspresji humanizowanego regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwko IL-4 o Identyfikatorach Sekw. Nr 13 i 14 w komórkach ssaka. Plazmid ten różnił się od pokazanego na Fig. 8 tym, że zawierał humanizowany region zmienny łańcucha lekkiego zamiast chimerycznego łańcucha lekkiego i nie kodował genu DHFR.

Niniejszy wynalazek dostarcza różnych przeciwciał, ich fragmentów i białek fuzyjnych szczególnie przeciwciał humanizowanych, charakteryzujących się swoistością wiązania ludzkiej IL-4, aktywnością neutralizowania i wysokim powinowactwem do ludzkiej IL-4 czego przykładami sąmysie MAb 3B9 i szczurze MAb 6A1. Produkty te sąużyteczne w kompozycjach terapeutycznych i farmaceutycznych do leczenia reakcji alergicznych wywołanych IgE i IL-4. Produkty te są również użyteczne do diagnozowania stanów wywołanych IL-4 przez pomiar (np. w enzymatycznym teście immunosorpcyjnym (ELISA)) poziomu krążącej endogennej IL-4 u ludzi.

I. Definicje „Białko fuzyjne” odnosi się do białka kodowanego przez cząsteczkę fuzyjną, które może być uzyskane przez ekspresję w komórce gospodarza. Takie białka fuzyjne są przeciwciałami konstruowanymi, np. przeciwciałami chimerycznymi lub humanizowanymi, lub fragmentami przeciwciał pozbawionymi całego lub części regionu stałego immunoglobuliny np. Fv, Fab albo F(ab)₂ i temu podobne.

„Cząsteczka fuzyjna” odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego kodującego regiony zapewniające komplementarność (CDRy) z nie pochodzącej od człowieka immunoglobuliny, które są wprowadzone do pierwszego składnika fuzji zawierającego sekwencje ludzkich

180 125 regionów zrębowych. Ewentualnie pierwszy składnik fuzji jest połączony operacyjnie z drugim składnikiem fuzji.

„Pierwszy składnik fuzji” odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego kodującego ludzkie regiony zrębowe albo ludzki region zmienny immunoglobuliny, w którym natywne (albo występujące w naturze) CDRy zastąpiono przez CDRy przeciwciała donorowego. Ludzkie regiony zmienne mogą być łańcuchami ciężkimi immunoglobuliny, łańcuchami lekkimi (lub oboma łańcuchami), ich analogiem lub fragmentem funkcjonalnym. Takie regiony CDR lub CDRy umiejscowione w regionach zmiennych przeciwciał (immunoglobulin) mogą być określone sposobami znanymi w dziedzinie wiedzy. Przykładowo, Kabat i in., (Seąuences of Proteins of Immunological Interest,, wyd. 4., US Department of Health and Humań Services, National Institutes of Health (1987)), wyjawia zasady znajdywania CDR. Dodatkowo, znane są programy komputerowe użyteczne dla identyfikacji struktur/regionów CDR.

Określenie „wysokie miana” dotyczy przeciwciała posiadającego powinowactwo wiązania charakteryzujące się K^ równą lub mniejszą niż 2 χ ΙΟ'¹⁰ M dla ludzkiej IL-4.

Przez „wiązanie swoiste dla ludzkiej IL-4” rozumie się wysokie miano (albo powinowactwo) dla ludzkiej, ale nie wołowej czy mysiej IL-4.

„Drugi składnik fuzji” odnosi się do innej sekwencji nukleotydowej kodującej białko albo peptyd, z którym pierwszy składnik fuzji jest połączony wjednej ramce odczytu albo przy pomocy ewentualnej standardowej sekwencji łączącej (tzn. połączony operacyjnie). Korzystnie jest to immunoglobulina. Drugi składnik fuzji może zawierać sekwencje kwasu nukleinowego kodujące cały region zmienny tego samego (np. homologiczne - pierwszy i drugi składnik białka fuzyjnego uzyskany jest z tego samego źródła) albo dodatkowego (np. heterologiczne) interesującego przeciwciała. Może to być łańcuch ciężki przeciwciała albo łańcuch lekki (lub oba łańcuchy jako część pojedynczego peptydu). Drugi składnik fuzji nie jest ograniczony do szczególnej klasy czy izotypu przeciwciała. Dodatkowo, drugi składnik fuzji może zawierać część regionu stałego immunoglobuliny, jak się to spotyka w Fab czy F(ab)₂ (np. osobna część odpowiedniego ludzkiego regionu stałego czy regionu zrębowego). Taki drugi składnik fuzji może również zawierać sekwencję kodującą białko integralne błony uwidocznione na zewnętrznej powierzchni komórki gospodarza, np. jako część biblioteki fagowej czy sekwencję kodującą białko do wykrywania analitycznego czy diagnostycznego, np. peroksydazę chrzanową β-galaktozydazę itp.

Określenia Fv, Fc, Fab czy F(ab)₂ zastosowane sąw ich powszechnych znaczeniach (patrz, np. Harlow i in., Antibodies; A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

W znaczeniu tu użytym „konstruowane przeciwciało” opisuje rodzaj białka fuzyjnego, np. syntetycznego przeciwciała (tzn. przeciwciała chimerycznego albo humanizowanego), w którym część domen zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego wybranego przeciwciała akceptorowego zastąpiono analogicznymi częściami z jednego lub wielu przeciwciał donorowych posiadających swoistość dla wybranego epitopu. Przykładowo, takie cząsteczki mogą obejmować przeciwciała charakteryzujące się humanizowanym łańcuchem ciężkim połączonym z niemodyfikowanym łańcuchem lekkim (albo chimerycznym łańcuchem lekkim) lub vice versa. Konstruowane przeciwciała mogą charakteryzować się zmianami sekwencji kwasu nukleinowego kodującego regiony zrębowe domen zmiennych łańcuchów lekkich i/lub ciężkich przeciwciała akceptorowego w celu zachowania swoistości wiązania przeciwciała donorowego. Przeciwciała te mogą obejmować zamianę jednego lub wielu CDR (najkorzystniej wszystkich) z przeciwciała akceptorowego przez CDR z opisanego tu przeciwciała donorowego.

„Przeciwciało chimeryczne” dotyczy rodzaju konstruowanego przeciwciała, które zawiera występujący w naturze region zmienny (łańcucha lekkiego i łańcuchów ciężkich) uzyskany z przeciwciała donorowego w połączeniu z regionami stałymi łańcucha lekkiego i ciężkiego uzyskanego z przeciwciała akceptorowego.

„Przeciwciało humanizowane” dotyczy rodzaju konstruowanego przeciwciała posiadającego CDR uzyskane z niepochodzącej od człowieka immunoglobuliny, przy czym pozostałe części cząsteczki uzyskane z immunoglobuliny pochodzą z jednej (lub wielu) ludzkiej

180 125 immunoglobuliny. Dodatkowo, reszty stanowiące podporę zrębową mogą być zmieniane by zachować powinowactwo wiązania (patrz, Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86: 10029-10032 (1989); Hodgson i in., Bio/Technology, 9: 421 (1991)).

Określenie „przeciwciało donorowe” dotyczy przeciwciała (poliklonalnego, monoklonalnego czy rekombinowanego) dostarczającego sekwencji kwasu nukleinowego swych regionów zmiennych, CDR lub ich analogów czy fragmentów funkcjonalnych dla pierwszego składnika fuzji tak by wytworzyć cząsteczkę fuzyjnąi powstałe ekspresjonowane białko fuzyjne o swoistości antygenowej i aktywności neutralizującej charakterystycznej dla przeciwciała donorowego. Jedno z przeciwciał donorowych użytecznych dla zastosowania w wynalazku jest nie pochodzącym od człowieka przeciwciałem monoklonalnym (np. mysim) oznaczonym 3B9. Przeciwciało 3B9 określone jest jako posiadające wysokie miano, swoiste dla ludzkiej IL-4 (tzn. nie rozpoznające wołowej czy mysiej IL-4), neutralizujące przeciwciało o izotypie IgG_t, posiadające sekwencje DNA dla regionu zmiennego łańcucha lekkiego i aminokwasową o Identyfikatorach Sekw. Nr 1 i 2, oraz sekwencje DNA części zmiennej łańcucha ciężkiego i aminokwasową o Identyfikatorach Sekw. Nr 3 i 4, na odpowiednich regionach stałych mysiej IgG.

Określenie „przeciwciało akceptorowe” dotyczy przeciwciała (poliklonalnego, monoklonalnego czy rekombinowanego) heterologicznego w stosunku do przeciwciała donorowego, zapewniającego wszystkie (albo jakąkolwiek część, ale najkorzystniej wszystkie) sekwencje kwasu nukleinowego kodujące regiony zrębowe jego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego i/lub regiony stałe łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego dla drugiego składnika fuzji. Najkorzystniej, przeciwciałem akceptorowym jest przeciwciało ludzkie.

„CDR” określa się jako sekwencje aminokwasowe regionu zapewniającego komplementamość przeciwciała, będące regionami hiperzmiennymi łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin. Patrz, przykładowo, Kabat i in., Seąuences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 4., US Department of Health and Humań Services, National Institutes of Health (1987). W części zmiennej immunoglobuliny występują trzy CDR (lub regiony CDR) łańcucha ciężkiego i trzy CDR łańcucha lekkiego. Stąd, „CDR” w znaczeniu tu użytym odnosi się do wszystkich trzech CDR łańcucha ciężkiego albo wszystkich trzech CDR łańcucha lekkiego (albo, jeżeli to konieczne, zarówno CDR łańcucha ciężkiego jak i łańcucha lekkiego).

CDR zapewniają większość reszt kontaktowych do wiązania przeciwciała z antygenem albo epitopem. Interesujące CDR według wynalazku uzyskane są z sekwencji łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała donorowego i obejmują analogi CDR występujących w naturze, które to analogi posiadają i zachowują wspólną swoistość wiązania i/lub zdolność neutralizowania jak przeciwciało donorowe z którego zostały uzyskane.

Przez określenie „posiadają i zachowują wspólną swoistość wiązania i/lub zdolność neutralizowania” uważa się, że przykładowo, pomimo, iż MAb 3B9 może się charakteryzować pewnym poziomem powinowactwa do antygenu, zaś CDR kodowany przez sekwencję 3B9 w odpowiednim otoczeniu strukturalnym może posiadać niższe lub wyższe powinowactwo, oczekuje się, że CDR 3B9 w podobnym otoczeniu będą rozpoznawać ten sam epitop co 3B9. Przykładowe CDR łańcucha ciężkiego 3B9 obejmują Identyfikator Sekw. Nr 22; Identyfikator Sekw. Nr 24; Identyfikator Sekw. Nr 26, oraz przykładowe CDR łańcucha lekkiego 3B9 obejmują Identyfikator Sekw. Nr 16; Identyfikator Sekw. Nr 18 i Identyfikator Sekw. Nr 20.

„Fragment funkcjonalny” jest częściową sekwencją zmienną łańcucha ciężkiego lub lekkiego (np. z niewielkimi delecjami końca aminowego lub karboksylowego regionu zmiennego przeciwciała), która zachowuje tą samą swoistość wiązania antygenu i/lub zdolność neutralizacji co przeciwciało z którego fragment uzyskano.

„Analog” jest sekwencją aminokwasową zmodyfikowaną przez przynajmniej jeden aminokwas, która to modyfikacja może być wynikiem reakcji chemicznej, podstawieniem albo rearanżacją kilku aminokwasów (tzn. nie więcej jak 10), która to modyfikacja umożliwia sekwencji aminokwasowej zachowanie charakterystyki biologicznej, np. swoistości antygenowej i wysokiego miana czy powinowactwa sekwencji niemodyfikowanej. Przykładowo, mogą być

180 125 wywołane nieme mutacje przez podstawienie, w celu wytworzenia miejsc restrykcyjnych w lub w otoczeniu CDR.

Analogi mogą również powstać jako odmiany alleliczne. „Odmiana alleliczna lub modyfikacja” jest zmianą sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową lub peptydową według wynalazku. Takie odmiany mogą być spowodowane degeneracją kodu genetycznego albo mogą być umyślnie wytworzone w celu uzyskania pożądanej charakterystyki. Odmiany te czy modyfikacje mogą lub nie powodować zmiany w każdej kodowanej sekwencji amino kwasowej. Przykładowo, sekwencje aminokwasowe CDR łańcucha lekkiego o Identyfikatorze Sekw. Nr 16 sąidentyczne z natywnym przeciwciałem mysim i humanizowanym przeciwciałem 3B9. Jednakże, ta sekwencja CDR kodowana jest przez zarówno Identyfikator Sekw. Nr 15 jak i Identyfikator Sekw. Nr 53. Podobnie, CDR o Identyfikatorze Sekw. Nr 22 jest kodowany przez zarówno Identyfikator Sekw. Nr 21 jak i Identyfikator Sekw. Nr 54; CDR o Identyfikatorze Sekw. Nr 24 jest kodowany przez Identyfikator Sekw. Nr 23 jak i Identyfikator Sekw. Nr 55; CDR o Identyfikatorze Sekw. Nr 26 jest kodowany przez Identyfikator Sekw. Nr 25 jak i Identyfikator Sekw. Nr 56.

Określenie „czynniki efektorowe” dotyczy nie będących białkiem cząsteczek nośnikowych z którymi sązwiązane, standardowymi sposobami, białka fuzyjne, i/lub występujące naturalnie lub syntetyczne łańcuchy ciężkie lub lekkie przeciwciała donorowego lub inne fragmenty przeciwciała donorowego. Takie nie białkowe nośniki mogą obejmować standardowe nośniki stosowane w dziedzinie diagnostyki np. perełki polistyrenowe czy wykonane z innego plastiku, polisacharydy, np. stosowane w układzie BIAcore (Pharmacia) albo inne substancje nie białkowe użyteczne w dziedzinie medycyny i bezpieczne w stosowaniu u ludzi i zwierząt. Inne czynniki efektorowe mogą obejmować związki makrocykliczne, chelatujące atom metali ciężkich albo radioizotopy. Takie czynniki efektorowe mogąbyć użyteczne dla zwiększenia okresu półtrwania białka fuzyjnego, np. glikol polietylenowy.

II. Przeciwciała Monoklonalne o Wysokim Powinowactwie do IL-4.

Do zastosowania w konstruowaniu przeciwciał, ich fragmentów i białek fuzyjnych według wynalazku, zastosować można gatunki nie będące człowiekiem (przykładowo, wół, naczelne, gryzonie (np. myszy albo szczury) itp.) w celu wytworzenia pożądanej immunoglobuliny pod wpływem prezentacji natywnej ludzkiej IL-4 lub jej peptydowego epitopu. Standardowe techniki tworzenia hybrydom stosuje się w celu dostarczenia linii komórkowej hybrydomy wydzielającej niepochodzące od człowieka MAb przeciwko IL-4. Hybrydomę taką przesiewa się przy użyciu IL-4 związanej kowalencyjnie z płytką 96-studzienkową albo alternatywnie z biotynylowaną IL-4 stosowaną w teście przesiewowym opisanym szczegółowo w przykładzie 2, poniżej. Tak więc, jedną z cech wynalazku jest sposób wykrywania MAb przeciwko ludzkiej IL-4, w którym układ badawczy unika denaturacji IL-4. W ten sposób odkryto, że można wykryć MAb o wysokich mianach (albo wysokim powinowactwie) w stosunku do ludzkiej IL-4.

Jako jeden z przykładów, wyjawiono produkcję neutralizujących MAb o wysokim mianie pochodzących od dawcy mysiego. MAb 3B9, będące pożądanym mysim (donorowym) przeciwciałem do zastosowania w opracowaniu przeciwciała chimerycznego lub humanizowanego, jak opisane w przykładzie 1, poniżej. MAb 3B9 charakteryzuje się swoistością wiązania z ludzką IL-4, o Kj mniejszej niż 2.0 χ 10’¹⁰ M (około 1.8x10'¹⁰ M) dla ludzkiej IL-4. dla IL-4 fragmentu Fab tego przeciwciała 3B9 jest niższe niż 3 χ 10'¹⁰ M. Epitop dla tego przeciwciała był niemożliwy do zmapowania na peptydzie liniowym IL-4, stąd uważa się, że przeciwciało wiąże epitop nieciągły. Wzorzec wiązania wskazuje na miejsce wiązania w regionie tworzonym przez pętlę B-C (reszty od 60 do 69) i helisę C (reszty od 70 do 93). Regiony te odnosząsię do oznaczeń mapowych wprowadzonych przez Cooka i in., J. Mol/ Biol/. 218: 675-678 (1991). Walter i in.. J. Biol. Chem., 267: 20371-20376 (1992), Wlodaver i in., FEBS Lett., 309: 59-64 (1992), Redfield i in., Biochem., 30: 11029-11035 (1991), Smith i in., J. Mol. Biol., 224: 899-904 (1992), Garrett i in., (1992) i Powers i in., Biochem., 31:4334-4346 (1992) oraz Science, 256: 1673-1677 (1992), załączone tu jako odnośnik.

180 125

Innym pożądanym przeciwciałem donorowym jest szczurze MAb 6A1. Wytwarzanie tego przeciwciała pokazano w przykładzie 7. To MAb charakteryzuje się izotypem IgG_2a i posiada stałą dysocjacji dla hIL-4 niższą niż 2.0 χ 10'¹⁰ M (około 1.6 χ 10'¹⁰ M). Podobnie jak w przypadku 3B9 epitop docelowy 6A1 nie mapuje się napeptydy liniowe IL-4, a więc uważa się że epitop jest epitopem nieciągłym i trójwymiarowym. Wzorzec wiązania mutein IL-4 i aktywność biologiczna wskazuj ąna wiązanie w regionie helisy D ludzkiej IL-4 (aminokwasy od 109 do 127) najprawdopodobniej w okolicy reszty tyrozynowej w pozycji 124.

Wynalazek nie jest ograniczony do zastosowania MAb 3B9, MAb 6A1 lub ich sekwencji hiperzmiennych (tzn. CDR). Mogą być one zastąpione każdym odpowiednim przeciwciałem przeciwko IL-4 o wysokim mianie, charakteryzującym się stałą dysocjacji równą lub niższą niż 2.0 χ 10'¹⁰ M w stosunku do ludzkiej IL-4 i odpowiednim CDR przeciwko IL-4. Gdziekolwiek w poniższym opisie przeciwciało donorowe określane jest jako 3B9 albo 6 Al, określenie to jest użyte wyłącznie dla zobrazowania i prostoty opisu.

III. Fragmenty przeciwciał.

Niniejszy wynalazek obejmuje również zastosowanie fragmentów Fab albo fragmentów F(ab)₂ uzyskanych z MAb skierowanych przeciwko ludzkiej IL-4. Fragmenty te są użyteczne jako czynniki ochronne in vivo przeciwko stanom wywołanym IL-4 i IgE albo in vitro jako część diagnostyki IL-4. Fragment Fab zawiera cały łańcuch lekki i koniec aminowy łańcucha ciężkiego zaś fragment F(ab)₂ zawiera dwa fragmenty Fab połączone wiązaniami dwusiarczkowymi. MAb 3B9, 6A1 i inne o podobnym wysokim powinowactwie stanowią źródło fragmentów Fab i F(ab)₂, które mogą być uzyskane standardowymi metodami np., przez trawienie MAb odpowiednim enzymem proteolitycznym, papainą i/lub pepsyną albo metodami rekombinacyjnymi. Fragmenty Fab i F(ab)₂ są użyteczne jako środki terapeutyczne, profilaktyczne albo diagnostyczne orazjako donory sekwencji obejmujących sekwencje regionów zmiennych i CDR użytecznych dla tworzenia przeciwciał rekombinowanych lub humanizowanych jak to tu opisano.

IV. Sekwencje Nukleotydowe i Aminokwasowe Anty-IL-4.

MAb 3B9 albo inne przeciwciała opisane powyżej mogą dostarczyć sekwencji jak sekwencje peptydowe fragmentów zmiennych łańcuchów ciężkich i/lub lekkich, sekwencji zrębowych, sekwencji CDR, ich fragmentów funkcjonalnych i analogów oraz sekwencji kwasu nukleinowego kodujących je, użytecznych do konstruowania i uzyskiwania różnych białek fuzyjnych (włączając przeciwciała konstruowane), które charakteryzują się swoistością wiązania przeciwciała donorowego.

Jako jeden z przykładów, niniejszy wynalazek dostarcza sekwencji fragmentów zmiennych łańcucha lekkiego fragmentów zmiennych łańcucha ciężkiego z mysiego przeciwciała 3B9 przeciwko IL-4 i sekwencji uzyskanych z nich. Region zmienny łańcucha ciężkiego 3B9 charakteryzuje się resztami aminokwasowymi od 20 do 140 Identyfikatora Sekw. Nr 4. Regiony CDR zaznaczone są przez podkreślenie na figurze 2 i dostarczone są w Identyfikatorze Sekw. Nr 22; Identyfikatorze Sekw. Nr 24 i Identyfikatorze Sekw. Nr 26. Region zmienny łańcucha lekkiego 3B9 charakteryzuje się resztami aminokwasowymi na figurze 1 (Identyfikator Sekw. Nr 2). Regiony CDR znajdują się w pozycjach aminokwasowych 44-58 (Identyfikator Sekw. Nr 16); 74-80 (Identyfikator Sekw. Nr 18) i 113-121 (Identyfikator Sekw. Nr 20).

Dostarczone są chimeryczne regiony zmienne łańcucha ciężkiego oraz nukleotyd sygnałowy i sekwencje aminokwasowe. Sekwencje te są identyczne z łańcuchem ciężkim 3B9 z wyjątkiem sekwencji sygnałowej. Sekwencja sygnałowa chimerycznego łańcucha ciężkiego dostarczona jest w Identyfikatorze Sekw. Nr 5 i 6. Regiony CDR zaznaczono przez podkreślenie na fig. 3 i sąidentyczne z sekwencjąaminokwasowąnatywnychmysich CDR (Identyfikatory Sekw. od Nr 21 do 26). Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego sąidentyczne z niemodyfikowanymi sekwencjami 3B9 (reszty aminokwasowe od 21 do 132; Identyfikator Sekw. Nr 2) korzystając z naturalnych mysich sekwencji sygnałowych (reszty aminokwasowe od 1 do 20; Identyfikator Sekw. Nr 2).

180 125

Humanizowane regiony zmienne łańcucha ciężkiego i sekwencje sygnałowe przedstawiono na fig. 4 (Identyfikatory Sekw. Nr 11 i 12). Sekwencja sygnałowa dostarczona jest również w Identyfikatorach Sekw. Nr 5 i 6. Inne odpowiednie sekwencje sygnałowe znane osobom biegłym w dziedzinie, mogą zastąpić sekwencje sygnałowe opisane tu. Sekwencje aminokwasowe CDR tych konstrukcji są identyczne z natywnymi mysimi i CDR chimerycznych łańcuchów ciężkich i sądostarczone w Identyfikatorze Sekw. Nr 22 (kodowanym przez Identyfikator Sekw. Nr 54), Identyfikatorze Sekw. Nr 24 (kodowanym przez Identyfikator Sekw. Nr 55) i Identyfikatorze Sekw. Nr 56 (kodowanym przez Identyfikator Sekw. Nr 26).

Przykładowa (syntetyczna) sekwencja humanizowanego fragmentu zmiennego łańcucha lekkiego przedstawiona jest na fig. 5 (Identyfikatory Sekw. Nr 13 i 14). Sekwencja sygnałowa obejmuje reszty aminokwasowe od 1 do 19 Identyfikatora Sekw. Nr 8. Sekwencje CDR tej figury oznaczono przez podkreślenie i różnią się one od CDR natywnych mysich CDR pojedynczym aminokwasem o Identyfikatorze Sekw. Nr 20. Stąd, CDR humanizowanego łańcucha lekkiego dostarczone są w Identyfikatorach Sekw. Nr 53 i 16; Identyfikatorach Sekw. Nr 17 i 18 i Identyfikatorach Sekw. Nr 27 i 28. Różnica ta opisana została w przykładzie 3.

Sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku lub ich fragmenty kodujące peptydy części zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego zastosowano w postaci niezmodyfikowanej lub syntetyzowano w celu wprowadzenia pożądanej modyfikacji np. miejsc restrykcyjnych. Izolowane sekwencje występujące naturalnie lub syntetyczne, które uzyskano z MAb 3B9 albo innych pożądanych przeciwciał przeciwko IL-4 o wysokim mianie mogą ewentualnie zawierać miejsca restrykcyjne wspomagające wprowadzanie lub ligację do odpowiednich sekwencji kwasu nukleinowego jak kodujące pożądane regiony zrębowe przeciwciała, ligację z mutagenizowanymi CDR albo fuzję z sekwencjami kwasu nukleinowego kodującymi wybrany drugi składnik fuzji.

Wziąwszy pod uwagę degenerację kodu genetycznego, różne sekwencje kodujące mogą być konstruowane tak by kodowały sekwencje zmienne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego oraz sekwencje CDR według wynalazku jak również ich fragmenty funkcjonalne i analogi posiadające tą samą swoistość antygenową co przeciwciało donorowe. Izolowane sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku albo ich fragmenty, kodujące sekwencje peptydowe łańcucha zmiennego albo CDR mogą być zastosowane do wytwarzania białek fuzyjnych, przeciwciał chimerycznych i humanizowanych, albo innych konstruowanych przeciwciał według wynalazku po operacyjnym połączeniu z drugim składnikiem fuzji.

Sekwencje te są również użyteczne do wprowadzania drogą mutagenezy odpowiednich zmian w sekwencjach kwasu nukleinowego kodujących regiony CDR lub zrębowe i do wprowadzania powstałych zmodyfikowanych lub fuzyjnych sekwencji kwasu nukleinowego do plazmidu w celu ekspresjonowania. Przykładowo, nieme podstawienia w sekwencji regionów zrębowych i kodujących CDR zastosowano do stworzenia miejsc restrykcyjnych ułatwiających wprowadzanie zmutagenizowanych regionów CDR (i/lub zrębowych). Te regiony CDR zastosowano do konstruowania przeciwciał humanizowanych według wynalazku.

Należy nadmienić, że dodatkowo do izolowanych sekwencji kwasu nukleinowego kodujących części białka fuzyjnego i przeciwciał tu opisanych mogą być zastosowane inne sekwencje kwasu nukleinowego jak komplementarne do sekwencji natywnych. Użyteczne sekwencje DNA obejmują sekwencje hybrydyzujące w warunkach swoistości hybrydyzacji (patrz, T. Maniatisi in., Molecular Cloning (A Laboratory Manuał), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387 do 389) z sekwencjami DNA. Przykładem takich warunków swoistości hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 4 x SSC w 65°C poprzedzająca płukanie w 0.1 x SSC w 65°C przez godzinę. Alternatywnie, przykładowymi warunkami swoistości hybrydyzacji jest 50% formamid, 4 x SSC w 42°C. Najkorzystniej, te hybrydyzujące sekwencje DNA są długości przynajmniej 18 nukleotydów, tzn. mniej więcej wielkości CDR.

V. Cząsteczki Fuzyjne i Białka Fuzyjne.

Cząsteczki fuzyjne kodująbiałka fuzyjne obejmujące przeciwciała konstruowane jak przeciwciała chimeryczne i przeciwciała humanizowane. Pożądana cząsteczka fuzyjna zawiera sek

180 125 wencje CDRkodujące peptydy posiadające swoistość antygenowąprzeciwciałaprzeciwko IL-4, najkorzystniej przeciwciała o wysokim powinowactwie jak to dostarczone w niniejszym wynalazku, wprowadzone do pierwszego składnika fuzji (ludzkiego regionu zrębowego albo ludzkiego regionu zmiennego immunoglobuliny).

Najkorzystniej, pierwszy składnik fuzji jest połączony operacyjnie z drugim składnikiem fuzji. Drugi składnik fuzji jest zdefiniowany wyżej, i może obejmować sekwencje kodujące drugi region interesującego przeciwciała, przykładowo region Fc. Drugi składnik fuzji może również obejmować sekwencje kodujące innąimmunoglobulinę, z którymi region stały łańcucha lekkiego i ciężkiego zfuzowano w jednej ramce odczytu lub przy użyciu sekwencji łącznikowej. Przeciwciało konstruowane skierowane przeciwko fragmentom funkcjonalnym lub analogom IL-4 może być przeznaczone do wywołania zwiększonego wiązania z tym samym przeciwciałem.

Drugi składnik fuzji może być związany z czynnikiem efektorowym jak to określono powyżej, włączywszy nie białkowe cząsteczki nośnikowe, z którymi drugi składnik fuzji może być połączony operacyjnie standardowymi metodami.

Fuzja czy połączenie pomiędzy drugimi składnikami fuzji np. sekwencjami przeciwciała i czynnikiem efektorowym może być każdąodpowiedniąmetodąnp. przez standardowe wiązanie kowalencyjne lub jonowe, fuzję białkową czy łącznik heterobifunkcjonalny, np. karbodiimid, glutaraldehyd i temu podobne. Techniki takie znane są w dziedzinie wiedzy i opisane zostały w zwykłych opisach chemicznych i biochemicznych.

Dodatkowo, standardowe sekwencje łącznikowe które w prosty sposób zapewniają pożądaną odległość pomiędzy drugim składnikiem fuzji a czynnikiem efektorowym mogą być skonstruowane w cząsteczce fuzyjnej. Konstrukcja takich łączników jest dobrze znana biegłym w dziedzinie.

Dodatkowo, sekwencje sygnałowe dla cząsteczek według wynalazku mogą być zmodyfikowane w celu zwiększenia ekspresji. Jednym z przykładów pożądanego białka fuzyjnego posiadającego sekwencję aminokwasową o sekwencji mysiego łańcucha ciężkiego, identycznego z częścią zmienną chimerycznego łańcucha ciężkiego (V_H) na fig. 2 (Identyfikator Sekw. Nr 4) posiada oryginalny peptyd sygnałowy zastąpiony przez inną sekwencję sygnałową (reszty aminokwasowe od 1 do 20) (Identyfikator Sekw. Nr 6).

Przykładowe białko fuzyjne zawiera część zmienną peptydu łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego albo sekwencję białkowąposiadającąswoistość antygenowąMAb 3B9 np. V_H (reszty aminokwasowe od 21 do 141 o Identyfikatorach Sekw. Nr 9 i 10) oraz łańcuchy V_L (reszty aminokwasowe od 21 do 132 o Identyfikatorach Sekw. Nr 1 i 2). Jeszcze inne pożądane białko fuzyjne według wynalazku charakteryzuje się sekwencjąaminokwasowązawierającąprzynajmniej jeden zaś najkorzystniej wszystkie CDR regionu zmiennego łańcuchów ciężkich i/lub lekkich cząsteczki mysiego przeciwciała 3B9 z pozostałymi sekwencjami uzyskanymi ze źródła ludzkiego lub ich funkcjonalne fragmenty lub analogi. Patrz, np. humanizowane regiony V_H i V_L o Identyfikatorach Sekw. Nr 11 i 12 oraz Identyfikatorach Sekw. Nr 13 i 14 (fig. 4 i 5).

W jeszcze dalszym wykonaniu konstruowane przeciwciało według wynalazku może być związane z dodatkowym czynnikiem. Przykładowo, procedury rekombinacji DNA mogą być zastosowane do wytworzenia konstruowanego przeciwciała według wynalazku, w którym fragment Fc albo domena CH3 kompletnej cząsteczki przeciwciała zastąpiona została przez enzym albo inną cząsteczkę możliwą do wykrycia (np. efektor polipeptydowy albo cząsteczka reportera wa).

Drugi składnik fuzji może być również operacyjnie połączony z peptydem nie będącym immunoglobuliną, białkiem albo jego fragmentem heterologicznym w stosunku do sekwencji zawierającej CDR posiadającej swoistość antygenową mysiego 3B9. Powstałe białko może wykazywać po ekspresji zarówno swoistość antygenową przeciwko IL-4 jak również charakterystykę nie immunoglobulinową. Charakterystyka składnika fuzji może być np. charakterystyką funkcjonalną innej domeny wiążącej lub receptorowej, charakterystyką leczniczą jeżeli składnik fuzji jest białkiem leczniczym albo innądodatkowącharakterystyką antygenową.

180 125

Dodatkowe pożądane białko według wynalazku może zawierać kompletną cząsteczkę przeciwciała, posiadającego łańcuchy ciężkie i lekkie pełnej długości, albo ich każdy osobny fragment jak fragmenty Fab czy F(ab)₂, dimer łańcuchów ciężkich albo ich jakikolwiek minimalny rekombinowany fragment jak F_v albo przeciwciało jednołańcuchowe (SCA) albo każda inna cząsteczka o tej samej swoistości jak wybrane MAb donorowe np. MAb 3B9 czy 6A1. Białko takie może być zastosowane w postaci białka fuzyjnego albo być zastosowane w postaci nie zfuzowanej.

Gdy drugi składnik fuzji uzyskany jest z innego przeciwciała np. regionu zrębowego czy stałego każdego izotypu czy klasy immunoglobuliny powstaje przeciwciało konstruowane. Konstruowane przeciwciało może zawierać region stały immunoglobuliny (Ig) i regiony zrębowe zmienne z innego źródła np. przeciwciała akceptorowego oraz jedno lub więcej (najkorzystniej wszystkie) CDR z przeciwciała donorowego np. opisanego tu przeciwciała przeciwko IL-4. Dodatkowo, mogą być wykonane zmiany np. delecje, podstawienia czy addycje w domenie zmiennej regionu zrębowego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego MAb akceptorowego na poziomie kwasu nukleinowego lub aminokwasów, albo w regionach CDR donorowych, w celu zachowania swoistości wiązania antygenu przeciwciała donorowego.

Takie przeciwciała konstruowane są opracowane by korzystały z jednego (lub obu) części zmiennych łańcuchów lekkiego i/lub ciężkiego MAb przeciwko IL-4 (ewentualnie zmodyfikowanego jak to opisano) lub jednego lub więcej poniżej określonych CDR łańcuchów ciężkiego lub lekkiego (patrz, przykład 3). Konstruowane przeciwciała według wynalazku są przeciwciałami neutralizującymi tzn. w pożądany sposób blokują wiązanie się receptora z białkiem IL-4. Przykładowo, konstruowane przeciwciało uzyskane z MAb 3B9 jest skierowane przeciwko swoistemu czwartorzędowemu epitopowi ludzkiej IL-4 uważanemu za region pomiędzy pętlą B-C a helisą C, jak to opisano powyżej.

Takie przeciwciała humanizowane mogą obejmować przeciwciało humanizowane zawierające regiony zrębowe wybranej ludzkiej immunoglobuliny lub podtypu, albo chimeryczne przeciwciało zawierające ludzkie regiony stałe łańcucha ciężkiego i lekkiego fuzowane z fragmentami funkcjonalnymi przeciwciała przeciwko IL-4. Odpowiednie ludzkie (lub innego zwierzęcia) przeciwciało akceptorowe może być wybrane z bazy danych np. bazy KABAT, bazy Los Alamos i bazy danych SwissProtein, przez homologię sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych przeciwciała donorowego. Ludzkie przeciwciało charakteryzujące się homologią regionu zrębowego z przeciwciałem donorowym (na podstawie aminokwasów) może być odpowiednie do zapewnienia regionów stałych łańcucha ciężkiego i/lub regionów zrębowych części zmiennej łańcucha ciężkiego do wprowadzenia donorowych CDR. Odpowiednie przeciwciało akceptorowe zdolne do zapewnienia regionów stałych łańcucha lekkiego albo zrębo- wych fragmentów zmiennych może być wybrane w podobny sposób. Należy nadmienić, że łańcuchy lekkie i ciężkie przeciwciała akceptorowego nie muszą konieczne pochodzić z tego samego przeciwciała akceptorowego.

Pożądane heterologiczne regiony zrębowe i stałe wybrane są spośród ludzkich klas i izotypów immunoglobulin, jak np. IgG (podtypy od 1 do 4), IgM, IgA i IgE. Jednakże, przeciwciało akceptorowe nie musi zawierać tylko sekwencji ludzkiej immunoglobuliny. Przykładowo, może być skonstruowany gen, w którym sekwencje DNA kodującego część łańcucha ludzkiej immunoglobuliny sąsfuzowane z sekwencjami DNA kodującymi sekwencje aminokwasowe nie pochodzące z immunoglobuliny jak efektor polipeptydowy czy cząsteczka reporterawa.

Jeden z przykładów szczególnie pożądanego humanizowanego przeciwciała obejmuje CDR 3B9 wprowadzone do regionów zrębowych wybranej sekwencji ludzkiego przeciwciała. Do wytworzenia humanizowanego przeciwciała neutralizującego jeden, dwa, zaś najkorzystniej trzy CDR z regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciała anty-IL-4 wprowadzono do regionów zrębowych sekwencji wybranego ludzkiego przeciwciała, zastępując natywne CDR tego przeciwciała.

Najkorzystniej w humanizowanym przeciwciale domeny zmienne w obu łańcuchach lekkim i ciężkim skonstruowano przez wymianę jednego lub wielu CDR. Jest możliwe zastosowanie wszystkich sześciu CDR, lub ich różnych kombinacji mniej niż sześciu CDR. Najkorzystniej wszystkie sześć CDR jest wymienionych. Możliwe jest wymienienie CDR tylko w ludzkim łańcuchu ciężkim, używając jako łańcucha lekkiego łańcucha niemodyfikowanego z ludzkiego przeciwciała akceptorowego. I odwrotnie, odpowiedni łańcuch lekki może być wybrany z innego ludzkiego przeciwciała przez przeszukiwanie standardowych baz danych przeciwciał. Pozostałość przeciwciała konstruowanego może uzyskana z każdego odpowiedniego ludzkiego przeciwciała akceptorowego.

Konstruowane przeciwciało humanizowane najkorzystniej ma budowę naturalnego przeciwciała ludzkiego albo jego fragmentu i posiada kombinację właściwości koniecznych dla efektywnego zastosowania leczniczego np. leczenia wywołanych przez IL-4 stanów zapalnych u ludzi i zastosowań diagnostycznych.

Jako inny przykład, konstruowane przeciwciało może zawierać CDR regionu zmiennego łańcucha lekkiego 3B9 (Identyfikatory Sekw. Nr 16,18,20 i 28) oraz trzy CDR regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 3B9 (Identyfikatory Sekw. Nr 22, 24 i 26). Powstałe przeciwciało humanizowane charakteryzuje się swoistością wiązania antygenu i wysokim powinowactwem MAb 3B9.

Jest zrozumiałe dla osób biegłych w dziedzinie, że konstruowane przeciwciało może być dalej modyfikowane przez zmiany w aminokwasach domeny zmiennej bez wpływu na swoistość i wysokie powinowactwo przeciwciała donorowego (tzn. analoga). Przykładowo, skonstruowano humanizowane przeciwciała monoklonalne, w których aminokwasem w pozycji 120 łańcucha lekkiego była arginina (Identyfikatory Sekw. Nr 13 i 14) albo treonina (Identyfikatory Sekw. Nr 57 i 58). Oczekuje się że aminokwasy łańcucha lekkiego i ciężkiego mogą być zamieniane przez inne aminokwasy zarówno w regionie zrębowym jak i CDR lub w obu.

Dodatkowo, region stały może być zmieniany w celu wzmacniania lub osłabiania wybiórczych właściwości cząsteczki według wynalazku. Przykładowo, dimeryzacja, wiązanie z receptorem Fc albo zdolność do wiązania i aktywacji dopełniacza (patrz, np. Angal i in., Mol. Immunol., 30:105- 108 (1993), Xu i in., J. Biol. Chem., 269: 3469 - 3474 (1994), Winter i in., EP 307,434-B).

Białko fuzyjne będące przeciwciałem chimerycznym różni się od przeciwciał humanizowanych opisanych powyżej przez dostarczenie całego nie pochodzącego od człowieka regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i lekkiego z przeciwciała donorowego, włączywszy region zrębowy, w połączeniu z ludzkimi regionami stałymi przeciwciał obu łańcuchów. Oczekuje się, że przeciwciała chimeryczne, które zachowają dodatkowe nie pochodzące od człowieka sekwencje pokrewne z przeciwciałami humanizowanymi według wynalazku, mogą wywołać znaczną odpowiedź odpomościowąu ludzi. Przeciwciała takie są użyteczne do zapobiegania i leczenia chorób alergicznych wywoływanych przez IL-4, jak to dyskutowano powyżej.

VI. Produkcja Białek Fuzyjnych i Przeciwciał Konstruowanych.

Najkorzystniej sekwencje zmienne łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego oraz CDR MAb 3B9 (Identyfikatory Sekw. Nr 16,18,20,22,24 i 26) albo inne odpowiednie donorowe MAb (np. 6A1) i kodujące je sekwencje kwasu nukleinowego używane są do konstruowania białek fuzyjnych i przeciwciał konstruowanych, najkorzystniej przeciwciał humanizowanych, według wynalazku, w poniższym procesie. Ta sama lub podobna technika może być zastosowana do innych wykonań wynalazku.

Hybrydoma wytwarzająca wybrane donorowe MAb, np. mysie przeciwciało 3B9 jest klonowana w standardowy sposób, zaś DNA kodujący regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego pozyskiwany jest technikami znanymi osobom biegłym w dziedzinie wiedzy np. techniką opisaną w Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego 3B9 zawierające przynajmniej CDR i części akceptorowych regionów zrębowych domen zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich potrzebnych do zachowania swoistości wiązania donorowego MAb, jak również pozostałe części łańcucha przeciwciała uzyskane z ludzkiej immunoglobuliny uzyskano

180 125 przy użyciu starterów polinukleotydowych i odwrotnej transkryptazy. CDR zidentyfikowano przy użyciu znanych baz danych i przez porównanie z innymi przeciwciałami.

Mysio/ludzkie przeciwciało chimeryczne może być przygotowane i badane pod względem zdolności wiązania. Takie przeciwciało chimeryczne zawiera całe regiony V_H i V_L nie pochodzącego od człowieka przeciwciała donorowego w połączeniu z regionami stałymi ludzkiej Ig dla obu łańcuchów.

Homologiczne regiony zrębowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z ludzkiego przeciwciała zidentyfikowano przy użyciu skomputeryzowanych baz danych np. KABAT i jako przeciwciało akceptorowe wybrano ludzkie przeciwciało wykazujące homologię z 3B9. Sekwencje syntetycznych regionów zmiennych łańcuchów ciężkich zawierające CDR 3B9 w ludzkich regionach zrębowych zaprojektowano z ewentualnymi podstawieniami nukleotydowymi w regionie zrębowym w celu wprowadzenia miejsc restrykcyjnych. Tą zaprojektowaną sekwencję syntetyzowano przy użyciu nakładających się oligonukleotydów, amplifikowano reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) i skorygowano błędy.

Odpowiednie regiony zrębowe łańcucha lekkiego zaprojektowano w podobny sposób.

Przeciwciało humanizowane może być uzyskane z przeciwciała chimerycznego albo korzystnie może być wytworzone syntetycznie przez wprowadzenie CDR MAb donorowego z łańcuchów lekkich i ciężkich do odpowiednich regionów zrębowych łańcucha lekkiego i ciężkiego. Alternatywnie, przeciwciało humanizowane według wynalazku może być wykonane przy użyciu standardowych technik mutagenezy. Tak więc, powstałe przeciwciało humanizowane zawiera ludzkie regiony zrębowe i CDR donorowego MAb. Możliwe są dalsze manipulacje reszt zrębowych. Powstałe przeciwciało humanizowane może być ekspresjonowane w rekombinowanych komórkach gospodarza np. komórkach COS czy CDH. Dodatkowe szczegóły procedury dostarczone są w przykładzie 4. Inne przeciwciała humanizowane mogą być wykonane przy użyciu tej techniki na innym nie pochodzącym od człowieka przeciwciale swoistym dla IL-4, o wysokim mianie.

Przez wprowadzenie sekwencji kodujących białka fuzyjnego w połączenie operacyjne ze standardowymi sekwencjami regulatorowymi zdolnymi do kontrolowania replikacji i ekspresji i/lub sekrecji z komórki gospodarza tworzony jest standardowy wektor ekspresyjny albo plazmid ekspresyjny. Sekwencje regulatorowe obejmują sekwencje promotorowe np. promotor CMV, sekwencje sygnałowe które mogą być uzyskane z innych przeciwciał.

Podobnie, wytworzono drugi wektor ekspresyjny posiadający sekwencje DNA kodujące komplementarny łańcuch ciężki lub lekki przeciwciała. Najkorzystniej, ten drugi wektor ekspresyjny jest identyczny z pierwszym z wyjątkiem sekwencji kodujących i markerów umożliwiających selekcję aby umożliwić o ile to możliwe żeby każdy z peptydów był ekspresjonowany funkcjonalnie.

Wybrana komórka gospodarza jest kotransfekowana standardowymi technikami pierwszym i drugim wektorem albo po prostu transfekowana pojedynczym wektorem w celu stworzenia transfekowanej komórki gospodarza według wynalazku. Transfekowana komórka jest hodowana następnie standardowymi technikami, w celu wytwarzania konstruowanych przeciwciał według wynalazku. Przeciwciało humanizowane obejmujące połączenie pomiędzy oboma rekombinowanymi łańcuchami ciężkimi i/lub lekkimi jest przesiewane w hodowli odpowiednim testem jak ELISA lub RIA. Podobne standardowe techniki mogą być zastosowane do konstruowania innych białek fuzyjnych i cząsteczek według wynalazku.

Odpowiednie wektory do etapów klonowania i wklonowywania używane w tej metodzie i do wytwarzania kompozycji według wynalazku mogą być wybrane przez osobę biegłą w dziedzinie. Przykładowo, mogąbyć zastosowane standardowe wektory szeregu pUC 19. Jeden z zastosowanych wektorów był wektorem pUC19 dostępnym w handlu z wielu źródeł j ak Amersham (Buckinghamshire, Wielka Brytania) albo Pharmacia (Upsalla, Szwecja). Dodatkowo, każdy wektor zdolny do łatwej replikacji, posiada liczne miejsca klonowania i geny markerowe i jest łatwy w użyciu może być użyty do klonowania. Tak więc, wybór wektora do klonowania nie jest czynnikiem ograniczającym niniejszy wynalazek.

180 125

Podobnie wektory stosowane do ekspresji konstruowanych przeciwciał według wynalazku mogąbyć wybrane przez specjalistę spośród dowolnych konwencjonalnych wektorów. Wektory zawierają także sekwencje regulatora operacyjnie połączone z sekwencjami kodującymi DNA regionów immunoglobuliny i zdolne do kierowania replikacją i ekspresją heterologicznych sekwencji DNA w wybranych komórkach gospodarza, takie jak promotory CMV. Wektory te zawierają opisane powyżej sekwencje DNA, które koduj ąprzeciwciało konstruowane łub cząsteczkę fuzyjną. Alternatywnie wektory mogąobejmować wybrane sekwencje immunoglobuliny modyfikowane przez insercję żądanych miejsc restrykcyjnych do łatwej manipulacji.

Wektory ekspresyjne mogątakże być charakteryzowane przez geny markerowe odpowiednie do ekspresji amplifikującej heterologicznych sekwencji DNA, np. gen reduktazy dihydrofolanowej (DHFR) lub gen oporności na neomycynę (neo^R). Inne korzystne sekwencje wektora obejmują sekwencję sygnałową poli A, taką jak sekwencja promotora wołowego hormonu wzrostu (BGH) i beta-globiny (betaglopro). Użyteczne tu wektory ekspresyjne można syntetyzować technikami dobrze znanymi specjalistom.

Składowe części takich wektorów, np. replikony geny selekcyjne, wzmacniacze, promotory, sekwencje sygnałowe itp., można otrzymać ze źródeł naturalnych lub można syntetyzować znanymi sposobami. Służą one do kierowania ekspresją i/lub wydzielaniem produktu rekombinowanego DNA w wybranym gospodarzu. Do tego celu mogą być także wybrane inne odpowiednie wektory ekspresyjne, których liczne typy są znane w technice i służą do ekspresji w komórkach ssaczych, bakteryjnych, owadzich, drożdży i grzybów.

Wynalazek obejmuje także linię komórkowątransfekowanąrekombinowanym plazmidem zawierającym sekwencje kodujące przeciwciała konstruowane lub cząstki fuzyjne. Komórki gospodarza użyteczne do klonowania i innych manipulacji z tymi klonującymi wektorami są także konwencjonalne. Jednak najkorzystniej do replikacji wektorów klonujących i innych etapów w konstruowaniu białek fuzyjnych według wynalazku stosuje się komórki różnych szczepów E. coli.

Odpowiednimi komórkami lub liniami komórkowymi gospodarza dla ekspresji konstruowanego przeciwciała lub białka fuzyjnego według wynalazku są korzystnie komórki eukariotyczne takie jak CHO, COS, komórki fibroblastów (np. 3T3) i między innymi komórki szpikowe, a najkorzystniej komórki ssacze, takie jak komórki CHO lub komórki szpikowe. Można stosować komórki ludzkie umożliwiając w ten sposób modyfikację cząsteczki ludzkimi wzorcami glikozylacji. Alternatywnie, można stosować inne eukariotyczne linie komórkowe. Dobór odpowiednich komórek ssaczych jako gospodarza i metody transformacji, hodowli, amplifikacji, skriningu i wytwarzania i oczyszczania produktu są znane w technice, np. Sambrook i in., jak powyżej.

Jako komórki gospodarza odpowiednie do ekspresji rekombinowanych przeciwciał MAb według wynalazku można stosować komórki bakteryjne. Jednak ponieważ białka wytworzone w wyniku ekspresji w komórkach bakteryjnych majątendencję do niewłaściwego pofałdowania lub mogąbyć w formie niepofałdowanej lub nieglikozylowanej, wytworzone rekombinowane MAb należałoby przesiać uwzględniając ich zdolność do utrzymania zdolności wiązania antygenu. Jeżeli w wyniku ekspresji w komórkach bakteryjnych powstała cząsteczka w formie właściwej pofałdowanej, wówczas dana komórka bakteryjna jest odpowiednim gospodarzem. Na przykład w dziedzinie biotechnologii znane jest stosowanie różnych szczepów E. coli jako komórek gospodarzy do ekspresji. W metodzie tej można stosować różne szczepy B. subtiłis, Streptomyces, inne Bacilli, itp.

W razie potrzeby, można stosować także komórki drożdży oraz komórki owadzie, np. Drosophila i Lepidoptera oraz wirusowe układy ekspresyjne, np. Miller i in., Genetic Eugineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986).

Ogólne metody, za pomocą których można konstruować wektory, metody transfekcji potrzebne do uzyskania komórek gospodarza według wynalazku i sposoby hodowli konieczne do wytworzenia białka fuzyjnego lub przeciwciała konstruowanego według wynalazku w takich

180 125 komórkach gospodarza są konwencjonalnymi technikami. Podobnie po wytworzeniu białka fuzyjne lub konstruowane przeciwciała według wynalazku można oczyszczać od zawartości hodowli komórek standardowymi metodami, w tym metodą strącania siarczanem amonu, na kolumnach z powinowactwem, metodą chromatografii kolumnowej, elektroforezy żelowej, itp. Takie techniki są znane i nie ograniczają wynalazku.

W jeszcze innej metodzie ekspresji humanizowanych przeciwciał można wykorzystać ekspresję w zwierzętach transgenicznych, jak opisana w patencie USA nr 4873316. Dotyczy on układu ekspresyjnego wykorzystującego zwierzęcy promotor kazeiny, który transgenicznie wprowadzony do ssaka powoduje, że samica wytwarza żądane rekombinowane białko w mleku.

Po ekspresji żądanąmetodąprzeciwciało konstruowane bada się na aktywność in vitro stosując odpowiedni test. Obecnie stosuje się konwencjonalny test ELISA do oceny jakości i ilości wiązania konstruowanego przeciwciała z epitopem IL4. Ponadto, inne próby in vitro, np. BIAcore można także stosować do określenia skuteczności neutralizacji przed następującymi potem badaniami klinicznymi na ludziach prowadzonymi w celu oceny trwałości przeciwciała konstruowanego w organizmie.

Sposobem według procedur opisanych dla humanizowanych przeciwciał wytworzonych z 3B9 specjalista może także skonstruować humanizowane przeciwciała z innych przeciwciał wobec IL4, sekwencji regionów zmiennych i peptydów CDR tu opisanych. Konstruowane przeciwciała można wytworzyć za pomocą zmiennych regionów zrębowych potencjalnie rozpoznawanych jeszcze biorców tych przeciwciał jako własne. Można wprowadzić niewielkie modyfikacje do zmiennych regionów zrębowych, aby znacznie zwiększyć wiązanie antygenu bez znaczącego zwiększenia immunogenności wobec biorcy. Takie konstruowane przeciwciała można skutecznie stosować do leczenia zaburzeń wywołanych przez IL4. Można je także stosować do diagnozowania takich zaburzeń.

VII. Zastosowanie terapeutyczne/profilaktyczne

Wynalazek dotyczy również sposobu leczenia ludzi z zaburzeniami alergicznymi, który polega na podawaniu skutecznej dawki przeciwciał obejmujących jedno lub więcej konstruowanych przeciwciał lub opisanych powyżej białek fuzyjnych, albo ich fragmentów.

Wywołaną przez stosowanie cząsteczek według wynalazku odpowiedź terapeutyczną uzyskuje się poprzez wiązanie z ludzką IL4, i w konsekwencji blokowanie uwalniania IgE. Tak więc, cząsteczki według wynalazku, w postaci kompozycji i preparatów nadających się do zastosowania w leczeniu, są wysoce pożądane dla osób z odpowiedzią alergiczną, taką jak alergiczne zapalenie śluzówki, zapalenie spojówek, atopowe zapalenie skóry, astma atopowa i wstrząs anafilaktyczny.

Białka fuzyjne, przeciwciała, konstruowane przeciwciała lub ich fragmenty według wynalazku można również stosować w połączeniu z innymi przeciwciałami, zwłaszcza z ludzkim MAbs reaktywnym w stosunku do innych markerów (epitopów), które są odpowiedzialne za stany przeciwko którym są skierowane konstruowane przeciwciała według wynalazku. Podobnie, MAbs reaktywny z epitopami odpowiedzialnymi za stany chorobowe u wybranych zwierząt, którym to stanom zapobiegają przeciwciała według wynalazku, stosować można również w kompozycjach weterynaryjnych.

Środki terapeutyczne według wynalazku uważa się za wskazane w leczeniu stanów alergicznych od około 2 dni do około 3 tygodni, w razie potrzeby. Przykładowo, do leczenia sezonowego zapalenia błony śluzowej lub podobnych, pożądane może być dłuższe leczenie. Oznacza to znaczący postęp w stosunku do aktualnie używanego protokołu infuzji przy znanym sposobie zaburzeń spowodowanych IL4. Dawka i czas trwania leczenia odnoszą się do stosunkowo względnego czasu obecności cząsteczki według wynalazku w krwiobiegu ludzkim i mogąbyć one ustalane przez specjalistę, w zależności od leczonego stanu i ogólnych warunków zdrowia pacjenta.

Sposobem podawania środka terapeutycznego według wynalazku może być dowolny odpowiedni sposób, który dostarcza środek do gospodarza. Białka fuzyjne, przeciwciała, konstruowane przeciwciała, ich fragmenty oraz kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są

180 125 szczególnie użyteczne przy podawaniu pozajelitowym, tj. śródskómym, domięśniowym, dożylnym lub donosowym.

Środki terapeutyczne według wynalazku wytwarzać można w postaci kompozycji farmaceutycznych zawierających jako składnik aktywny skuteczną ilość konstruowanego (np. humanizowanego) przeciwciała według wynalazku w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Korzystnym środkiem profilaktycznym według wynalazku jest wodna zawiesina lub roztwór zawierający konstruowane przeciwciało, korzystnie buforowane przy fizjologicznym pH, w postaci gotowej do wstrzyknięcia. Kompozycje do podawania pozajelitowego obejmują zazwyczaj roztwór konstruowanego przeciwciała według wynalazku lub jego koktajl rozpuszczony w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, korzystnie nośniku wodnym. Stosować można rozmaite nośniki, np. 0,4% sól fizjologiczna, 0,3% glicyna, itp. Roztwory te są sterylne i zazwyczaj pozbawione rozdrobnionych substancji stałych. Roztwory te można sterylizować stosując konwencjonalne dobrze znane sposoby sterylizowania (np. filtrację). Kompozycje mogą zawierać dopuszczalne farmaceutycznie substancje pomocnicze, jak wymagane do przybliżenia do warunków fizjologicznych, takie jak nastawiające pH lub środki buforujące. Stężenie przeciwciała według wynalazku w takich kompozycjach farmaceutycznych może zmieniać się w szerokim zakresie, np. od mniejszego niż około 0,5%, zwykle takiego lub co najmniej 1%, do tak dużegojak 15 lub 20% wagowych, i będą one dobieranie głównie na podstawie objętości, lepkości itp., zgodnie z konkretnym rodzajem wybranego podawania.

Tak więc, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku do wstrzyknięć domięśniowych zawierać mogą 1 ml sterylizowanej buforowanej wody i pomiędzy około 1 ng do około 100 mg, np. około 50 ng do około 30 mg, lub bardziej korzystnie około 5 mg do około 25 mg konstruowanego przeciwciała według wynalazku. Podobnie kompozycje farmaceutyczne według wynalazku do infuzji dożylnych będą zawierały do około 250 ml sterylnego roztworu Ringera i około 1 do około 30 i korzystnie 5 mg do około 25 mg konstruowanego przeciwciała według wynalazku. Sposoby wytwarzania kompozycji nadających się do podawania pozajelitowego są dobrze znane lub będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie techniki, a bardziej szczegółowo sąopisane np. wRemington's Pharamceutical Science, wyd. 15, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Korzystnie, środek terapeutyczny według wynalazku, obecny jest w kompozycji farmaceutycznej w postaci dawki jednostkowej. Odpowiednie skuteczne terapeutycznie dawki jednostkowe mogą być łatwo określone przez specjalistów w tej dziedzinie techniki. Skuteczną terapeutycznie dawką do leczenia zapaleń u ludzi i zwierząt jest pojedyncza dawka około 0,1 mg do około 20 mg białka lub przeciwciała według wynalazku na 70 kg wagi ciała, i powinna być ona podawana pozajelitowo, korzystnie i.m. (domięśniowo). Dawka taka może, w razie potrzeby być powtarzana w odpowiednich odstępach czasowych odpowiednio dobranych przez lekarza podczas odpowiedzi zapalnej.

Wynalazek obejmuje również podawanie białek fuzyjnych IL4 według wynalazku razem lub kolejno z innymi przeciwciałami lub białkami fuzyjnymi, charakteryzującymi się aktywnościąprzeciwko IL-4, takąjak aktywność przeciwko czynnikowi wzrostu nowotworu lub inna aktywność farmaceutyczna zbieżna ze zdolnością białek fuzyjnych według wynalazku do wiązania się z receptorem IL-4. Te inne przeciwciała są dostępne w handlu i można je odpowiednio dobrać w opisany powyżej sposób.

Białka fuzyjne i konstruowane przeciwciała według wynalazku można również stosować w diagnostyce, takiej jak określenie związanych z IL4 zaburzeń lub ustalenie postępu w leczeniu takich zaburzeń. Jako odczynniki diagnostyczne białka fuzyjne można korzystnie znakować, stosując ELISA lub inne konwencjonalne testy do pomiaru poziomu IL4 w osoczu, surowicy lub innych odpowiednich tkankach. Zakres testów, w których białka fuzyjne są korzystnie stosowane, nie jest ograniczony powyższym ujawnieniem.

Opisane powyżej przeciwciała, konstruowane przeciwciała lub ich fragmenty można liofilizować w celu przechowywania i tuż przed użyciem rekonstytuować w odpowiednim nośniku. Sposób ten okazał się skuteczny z konwencjonalnymi immunoglobulinami i można stosować znane techniki liofilizacji i rekonstytuowania.

180 125

W następujących przykładach, które nie ograniczają zakresu wynalazku, zilustrowano różne aspekty wynalazku, łącznie z konstruowaniem przykładowych konstruowanych przeciwciał i ich ekspresją w odpowiednich wektorach i komórkach gospodarza. Wszystkie aminokwasy oznaczano konwencjonalnymi trzyliterowymi lub jednoliterowymi kodami. Jeśli nie wskazano inaczej, wszystkie enzymy restrykcyjne, plazmidy, inne odczynniki i materiały zakupiono na rynku. Wszystkie zwykłe ligacje klonujące i procedury rekombinowanego DNA przeprowadzono według T. Maniatis i in., cyt. powyżej, lub drugiego wydania (1989), wyd. Sambrook i in., tego samego wydawcy („Sambrook et aL”).

Przykład 1- Wytwarzanie MAb 3B9

A. Procedura immunizacji

Cztery myszy (FI hybrydy Balb/c i C57BL/6) immunizowano podskórnie 50 pg rekombinowanej w E. coli ludzkiej IL4 w kompletnym adiuwancie Freundsa i po 4 tygodniach dootrzewnowe (i.p.) podano dawkę przypominającą - 50 pg IL4 w kompletnym adiuwancie Freundsa. Na podstawie dobrego miana przeciwciał wobec IL4 w surowicy jedną mysz poddano dalszej immunizacji zapomocą200 pgIL4 (i.p. wsoli fizjologicznej)po 8 tygodniach,2 dni później za pomocą 100 pg IL4 (i.p. w soli fizjologicznej) i jeszcze po dwóch dniach 50 pg IL4 (i.p. w soli fizjologicznej). Po 2 dniach od końcowej immunizacji wycięto myszy śledzionę.

B. Procedura fuzji i system skriningu (przesiewania, przeszukiwania)

Do wytwarzania hybrydomy (standardową metodą np. jak opisana przez Kohlera i in., Naturę, 256:495 (1975)) użyto mysich komórek śledziony. Ponad 250 klonów tych komórek przesiano w celu wydzielenia przeciwciała swoistego wobec IL4 stosując dostępny w handlu system BIAcore i testy ELISA na wiązanie IL4, jak opisano poniżej. Wszystkie drugorzędowe klony pochodzące z 3B9 były dodatnie.

Przykład 2 - Testy ELISA i stałe powinowactwa

A. ELISA

Próbę przesiewania, przeprowadzoną jak poniżej, wykonano w celu zmierzenia powinowactwa wobec natywnej ludzkiej IL4. W doświadczeniu 1 płytki z 96 dołkami aktywowane aldehydem powleczono IL4 w stężeniu 1 pg/ml, w ilości 100 μΐ/dołek, w 0,1 M buforze boranowym, pH 8,5 i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. hIL4 związała się kowalencyjnie z płytką. Roztwór IL4 wyciągnięto przez ssanie i miejsca niespecyficznego wiązania (NSB) zablokowano 1% roztworem albuminy z surowicy wołowej (BSA) w buforze TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂,0,02% NaN₃, pH 7,4) przez 60 minut w 37°C. Po przeprowadzeniu tego etapu i każdego z następnych etapów, płytkę przemywano 4-krotnie buforem do przemywania (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃, pH 7,4). Następnie dodano 50 μ! pożywki dla hybrydomy (lub oczyszczonego 3B9 lub fragmentów Fab) i 50 μΐ buforu do próby („assay buffer”) (0,5% wołowa gamma globulina w buforze TBS) i płytki inkubowano przez 60 minut w 37°C. Dodano 100 μΐ biotynylowanego przeciwciała przeciw-mysiego w buforze do próby, na dołek i inkubowano jak powyżej. Dodano 100 μΐ streptawidyny skoniugowanej z alkaliczną fosfatazą na dołek i inkubowano w 37°C przez 30 minut. Dodano 100 μΐ/dołek substratu PNP i inkubowano w 37°C przez 30 minut. Odczyty dokonano przy gęstości optycznej 405 nm.

W doświadczeniu 2 płytki pokryte streptawidyną(l 00 μΐ/dołek, 1 pg/ml w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)) i inkubowano przez noc w 4°C i przeprowadzono próbę w następujący sposób.

Roztwór streptawidyny wyciągnięto przez zasysanie, miejscaNSB zablokowano 1% BSA w buforze TB S (60 minut w 3 7°C). Po tym etapie i po każdym z następnych etapów płytki przemyto cztery razy buforem do przemywania. Dodano 50 μΐ biotynylowanej IL4 z 50 μΐ buforu do próby i inkubowano przez 30 minut w 37°C. Następnie dodano 50 μΐ oczyszczonej 3B9 IgG lub fragmentu Fab (lub pożywki dla hybrydomy) + 50 μΐ buforu do próby, inkubowano w 37°C przez 60 minut. Dodano 100 μΐ koniugatu przeciw-mysiej IgG i alkalicznej fosfatazy i inkubowano ww 37°C przez 60 minut. Dodano 100 μΙΡΝΡ i inkubowano w 37°C przez 30 minut. Odczytów dokonano jak powyżej.

180 125

B. Obliczenie powinowactwo 3B9 wobec IL-4

Wykorzystując wyniki doświadczeń opisanych powyżej i zestawionych jak następuje, obliczono K_d dla 3B9, jak opisano w publikacji Beatty i in., J. Immunol Methods, 100: 173-179 (1987):

^3,1 2 (2 [Ab*] - [Ab])

Ab* = stężenie Ab związanego z 150 ng/ml biotynylowanej hIL4 Ab = stężenie Ab związanego z 300 ng/ml biotynylowanej hIL4 Stałądysocjacji, K_d, obliczono z następującej zależności:

Doświadczenie 1: próba ELISA na płytce z 96 dołkami pokrytej streptawidyną(l 00 ng/dołek). K_d-2,2x 10-'°M(3B9 Fab).

Doświadczenie 2: próba ELISA na płytce z 96 dołkami pokrytej streptawidyną( 100 ng/dołek). K_d = l,4x 10-’°M(3B9 IgG).

C. Specyficzność

MAb 3B9 rozpoznaje ludzkąIL4, ale nie rozpoznaje wołowej lub mysiej IL4. Można to określić jednym z następujących sposobów. Test ELISA można przeprowadzić stosując płytkę z 96 dołkami, którą pokryto IgG przeciw-mysią i następnie zablokowano albuminą z surowicy wołowej. Następnie dodano 50 μ!3Β9 (100 ng/ml) 25 μΐ IL4 nie pochodzącej od człowieka i 25 pl biotynylowanej IL4 i inkubowano przez 60 minut w 37°C, przemyto i dodano streptawidynę skoniugowaną z alkaliczną fosfatazą i PNP.

Podobnie stwierdzono, że MAb 6A1 nie rozpoznaje wołowej ani mysiej IL4.

Przykład 3 - Humanizowane przeciwciało

Zaprojektowano jedno humanizowane przeciwciało tak aby zawierało mysie regiony CDR w zrębie ludzkiego przeciwciała. Tę humanizowaną wersję mysiego przeciwciała 3B9 swoistego wobec IL4 przygotowano w sposób następujący:

A. Klonowanie cDNA

Uzyskano klony cDNA dla ciężkich i lekkich łańcuchów 3B9 z mRNA wyekstrahowanego z linii komórkowej hybrydomy 3B9 (przykład 1) stosując zestaw firmy Boehringer Mannheim. Do syntetyzowania pierwszej nici stosowano startery specyficzne albo wobec mysiego regionu zawiasowego albo wobec stałego regionu kappa.

Starter dla łańcucha kappa jest następujący [Sek. Nr Id.: 29]:

5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3'

Starter dla łańcucha ciężkiego gamma jest następujący [Sek. Nr Id.: 30]: 5'GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC3'.

Dwuniciowy cDNA klonowano bezpośrednio do plazmidów pGEM7f+ [Promega] po czym stransformowano nim E. coli DH5-a[Bethesda Research Labs],

B. Sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowano osiem klonów mysiego cDNA ciężkiego łańcucha i jednego lekkiego łańcucha z powyższej części A. Wyniki sekwencjonowania zmiennych regionów tych klonów przedstawiono na Sek. Nr Id.: 1 i 2 i 3 i 4. Każdy klon zawierał aminokwasy zakonserwowane w zmiennych regionach mysiego ciężkiego łańcucha lub lekkiego łańcucha oraz mysie sekwencje sygnałowe. Sekwencje aminokwasowe CDR są przedstawione poniżej.

Regiony CDR dla ciężkiego łańcucha: Sek. Nr Id.: 22, 24 i 26 (aminokwasy 50-56,71-86 i 119-129 w Sek. Nr Id.: 4), patrz fig. 2. Te sekwencje są kodowane przez Sek. Nr Id.: 21, 23 i 25, odpowiednio.

Regiony CDR dla lekkiego łańcucha: Sek. Nr Id.: 16, 18 i 20 (aminokwasy 45-58, 74-80 i 113-121 w Sek. Nr Id.: 2), patrz fig. 1. Te sekwencje są hodowane przez Sek. Nr Id.: 15, 17 i 19, odpowiednio.

180 125

C. Selekcja ludzkich regionów zrębowych

Po klonowaniu 3B9, sekwencje aminokwasowe regionu zmiennego (aminokwasy 21-132 z Sek. Nr Id.: 2 i aminokwasy 20 do 140 z Sek. Nr Id.: 4) porównano z bazą danych sekwencji ludzkiej immunoglobuliny wykorzystując bazy danych KABAT^R i SWISS, w celu zidentyfikowania ludzkiego regionu zrębowego zarówno dla łańcuchów ciężkich jak i lekkich, które byłyby najbliższe pod względem ciężkich jak i lekkich, które byłyby najbliższe pod względem homologii sekwencji macierzystym mysim łańcuchom. Oprócz tych badań homologii sekwencji ciężkie i lekkie łańcuchy były również badane w stosunku do pozycyjnej bazy danych uzyskanych z modeli strukturalnych domeny Fab w celu oceny potencjalnych niezgodności spowodowanych substytucjami aminokwasów, które mogłyby wpłynąć na prezentację CDR. W niniejszym przypadku nie wykryto w badaniu strukturalnym oczywistych niezgodności; a zatem stosowano DNA kodujące wydedukowane z badań homologii sekwencji aminokwasowych.

Stosowano regiony zrębowe łańcucha ciężkiego przeciwciała otrzymanego z ludzkiej immunoglobuliny szpiczaka (COR) [E. M. Press i N. M. Hogg, Biochem. J., 117: 641-660 (1970)]. Stwierdzono, że sekwencja ta jest homologiczna w około 77% (69,4% identyczności) do regionu łańcucha zmiennego 3B9 na poziomie aminokwasów.

Dla odpowiedniego zmiennego regionu zrębowego lekkiego łańcucha stosowano sekwencję zmiennego regionu zrębowego lekkiego łańcucha ludzkiego przeciwciała zidentyfikowanego w publikacji H. G. Klobeck i in., Nuci. Acids Res., 13: 6515-6529 (1985). Stwierdzono, że sekwencja ludzkiego przeciwciała jest homologiczna w około 80,2% (72,0% identyczności) z mysim zmiennym regionem lekkiego łańcucha 3B9 na poziomie aminokwasów.

W oparciu o mysie regiony CDR 3B9 [Sek. Nr Id.: 15-26] i sekwencję ludzkiego przeciwciała, wytworzono syntetyczny łańcuch ciężki i przeprowadzono PCR w celu wypełnienia i zamplifikowania DNA. Te sekwencje zsyntetyzowano przez nakładanie oligonukleotydów i amplifikowano metodąPCR. Sek. Nr Id.: 31-37 dostarczają5 nakładających się oligonukleotydów i 2 starterów PCR. Stwierdzono, że oligonukleotyd 1 [Sek. Nr Id.: 31] obejmuje zasady 5-121, oligonukleotyd 2 [Sek. Nr Id.: 32] obejmuje zasady 122-241, a oligonukleotyd 3 [Sek. Nr Id.: 33] zasady 242-361. Dwa startery dla dolnej nici Sek. Nr Id.: 34 i Sek. Nr Id.: 35 obejmują zasady 134-110 i 252-230. Skorygowano ewentualne błędy w mapowanej sekwencji, które były wstawione przez PCR. Przeprowadzono ponownie PCR stosując jako starter 5'nukleotydy 1-25 zSek.Nrld.: 36, ajako starter 3'nukleotydy 361-341 zSek.Nrld.: 37.

Syntetyczny region zmienny ligowano do wektora ekspresyjnego pCD razem z syntetyczną sekwencją sygnałową Sek. Nr Id.: 5 i 6 z chimerycznej konstrukcji ciężkiego łańcucha razem ze stałym regionem ludzkiej IgGp Syntetyczny V_H i sygnałowa sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa są przedstawione na fig. 4 [Sek. Nr Id.: 11 i 12], Sekwencje aminokwasowe regionów CDR [Sek. Nr Id.: 22, 24 i 26] są identyczne jak w mysich regionach CDR 3B9. Jednak sekwencje kodujące dla tych regionów CDR [Sek. Nr Id.: 54, 55 i 56] różniąsię od mysich sekwencji kodujących 3B9 [Sek. Nr Id.: 21,23 i 25], Wytworzony wektor ekspresyjny, lL4hzhcl-l-Pcd, jest przedstawiony na fig. 9.

Usunięto regiony genu CDR w oryginalnym zrębie łańcucha lekkiego przez trawienie restrykcyjne i zastąpiono je następującymi syntetycznymi genami dla CDR IL-4, które wytworzono syntetycznie.

Claims (16)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Białko fuzyjne o swoistości wiązania przeciwko ludzkiej interleukinie-4 (IL4), które obejmuje regiony zapewniające komplementamość (CDR) łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. Nr Id.: 22, Sek. Nr Id.: 24 lub Sek. Nr Id.: 26 oraz CDR-y z łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. Nr Id.: 16, Sek. Nr Id.: 18, Sek. Nr Id.: 20, lub Sek. Nr Id.: 28.
2. 2. Białko fuzyjne o swoistości wiązania przeciwko ludzkiej interleukinie-4 (IL4), które obejmuje region zmienny łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako Sek. Nr Id.: 12, i region zmienny łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako Sek. Nr Id.: 14.
3. 3. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że jest humanizowanym przeciwciałem.
4. 4. Białko fuzyjne według zastrz. 3, znamienne tym, że wymienione przeciwciało jest ewentualnie związane z czynnikiem efektorowym wybranym z grupy obejmującej cząsteczkę niebiałkowego nośnika, polistyren i kuleczki z tworzyw sztucznych.
5. 5. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera około 0,004 do około 0,12 mg/ml białka fuzyjnego zawierającego wiązanie swoiste wobec ludzkiej interleukiny-4 (IL4), które obejmuje regiony zapewniające komplementamość (CDR) łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. Nr Id.: 22, Sek. Nr Id.: 24 lub Sek. Nr Id.: 26 oraz CDR-y z łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. Nr Id.: 16, Sek. Nr Id.: 18, Sek. Nr Id.: 20 lub Sek. Nr Id.: 28 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
6. 6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera około 0,02 do około 0,1 mg/ml białka fuzyjnego.
7. 7. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, która jest wybrana z grupy obejmującej:

   (a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko fuzyjne o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako Sek. Nr Id.: 14 lub Sek. Nr Id.: 12;

   (b) sekwencję kwasu nukleinowego komplementarną do (a);

   (c) sekwencję kwasu nukleinowego o 18 lub więcej nukleotydach zdolnądo hybrydyzowania do (a) lub (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji i (d) fragment lub analog (a), (b) lub (c), który koduje białko swoiste wobec ludzkiej interleukiny-4;

   przy czym ta sekwencja ewentualnie zawiera miejsce restrykcji.
8. 8. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 7, znamienna tym, że sekwencja kodująca białko fuzyjne stanowi sekwencję nukleotydowąprzedstawioną na fig. 4, Sek. Nr Id.: 11.
9. 9. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, która jest wybrana z grupy obejmującej:

   (a) sekwencję kwasu nukleinowego kodującą region zapewniający komplementamość (CDR) o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. Nr Id.: 22, Sek. Nr Id.: 24, Sek. Nr Id.: 26; Sek. Nr Id.: 16, Sek. Nr Id.: 18, Sek. Nr Id.: 20 lub Sek. Nr Id.: 28;

   (b) sekwencję kwasu nukleinowego komplementarną do (a);

   (c) sekwencję kwasu nukleinowego o 18 lub więcej nukleotydach zdolnądo hybrydyzowania do (a) lub (b) w ostrych warunkach hybrydyzacji i

   180 125 (d) fragment lub analog (a), (b) lub (c), który koduje białko swoiste wobec ludzkiej interleukiny-4;
10. 10. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 9, znamienna tym, że jest wybrana z grupy sekwencji kodujących region zapewniający komplementamość ciężkiego łańcucha, obejmującej:

    (a) ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC: Id. Sekw. nr : 21, (b) CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC: Id. Sekw. nr : 23, (c)AGA GAG AGT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC:Id. Sekw.nr:25, (d) ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: Id. Sekw. nr : 54, (e) CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC: Id. Sekw. nr : 55, i (f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT: Id. Sekw. nr : 56.
11. 11. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 9, znamienna tym, że jest wybrana z grupy sekwencji kodujących region zapewniający komplementamość lekkiego łańcucha, obejmującej:

    (a) AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC: Id. Sekw. nr : 15, (b) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC : Id. Sekw. nr : 53, (c) GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT: Id. Sekw. nr : 17, (d) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: Id. Sekw. nr : 19, i (e) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: Id. Sekw. nr : 27.
12. 12. Neutralizujące przeciwciało monoklonalne gryzonia swoiste wobec ludzkiej inter- leukiny-4 zawierające łańcuch lekki o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jak w Sek. Nr Id.: 2 i łańcuch ciężki o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jak w Sek. Nr Id.: 4.
13. 13. Przeciwciało według zastrz. 12, znamienne tym, że jest przeciwciałem szczurzym.
14. 14. Przeciwciało według zastrz. 13 o charakterystyce identyfikującej 6A1.
15. 15. Hybrydoma wytwarzająca monoklonalne przeciwciało swoiste wobec ludzkiej interleukiny-4 zawierające łańcuch lekki o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jak w Sek. Nr Id.: 2 i łańcuch ciężki o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jak w Sek. Nr Id.: 4.
16. 16. Linia komórkowa hybrydomy 3426AllClB9o numerze depozytu ECACC 93100620.