BG63549B1 - Рекомбинантни интерлевкин-4-антитела, използвани за лечение на интерлевкин-4- медиирани неразположения - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до химерни и хуманизираниинтерлевкин-4 моноклонални антитела, получени от високоафинитетни моноклонални антитела, до фармацевтични продукти, които ги съдържат, и до методи залечение.

Description

(54) РЕКОМБИНАНТНИ ИНТЕРЛЕВКИН-4АНТИТЕЛА, ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ИНТЕРЛЕВКИН-4-МЕДИИРАНИ НЕРАЗПОЛОЖЕНИЯ

Тази заявка е отчасти продължение на US Serial No 08/136,783, изпълнено на 14 октомври 1993, което е продължение на US Serial No 08/117,366, изпълнено на 7 септември 1993, като и двете са включени в него чрез препращане в тяхната цялост.

Област на изобретението

Настоящото изобретение се отнася главно към областта на фузионните протеини и към протеините, употребявани за лечение и диагностика на състоянията, медиирани от IL4 и излишък на IgE продукция, и по-специално към химерни и хуманизирани IL4 антитела.

Предшестващо състояние на техниката

Атопичните алергични състояния варират от относително леки, като сенните ринити и конюнктивити, до по-сериозни, като атопичните дерматити и атопичната астма, и до застрашаващи живота, като анафилактичния шок. Свързващ тези състояние е имунният отговор на организма към алергени, който включва произвеждането на имуноглобулин Е (IgE) антитела в генетично предразположени индивиди (атопия). Инхибирането на IgE - продукцията дълго време е цел в специфичната имунотерапия на алергичното заболяване чрез използването на десенсибилизиращи ваксини. В последните години обаче, сигурността и ефективността на терапия с ваксина е поставена под въпрос, но желанието да се редуцират нивата на IgE не е намаляло.

Интерлевкин-4 (IL41 е протеинов медиатор в лимфоидната система. Изследванията на лимфоцити отопични индивиди установяват наличието на по-голям брой от нормалния Т- лимфоцити, способни да секретират IL4 в отговор на стимулация, и по-големи количества секретиран IL4 след стимулирането.

Установено е, че анти-11,4 антителата инхибират IgE, но не и IgGl и IgG2d [Finkelman etal, Ann.Rev.Immunol, 8:303 (1990] и продукцията на IL5 секретиращи Т- клетки Maggi et al, J. Immunol., 148:2142 (1992)]. По-нататък съвре менни данни дават основание да се предположи, че IL4 може да повлиява акумулирането на еозинофили в тъканите. Вж. Tepper et al, Cell, 62:457 (19901; Tepper et al, Cell, 57:503 (1989).

Остава нуждата от високоафинитетен IL4 антагонист, който да редуцира еозинофилното възпаление, както, намалявайки полиферацията на IL5 секретиращи клетки, така и чрез инхибиране на адхерентния механизъм, чрез който еозинофилите могат да се акумулират в тъканите, и който да може да се използва за лечение, предпазване или диагностика на алергични реакции.

Описание на изобретението

Изобретението се отнася до фузионен белтък, притежаващ свързващ специфичност за човешки интерлевкин-4 (IL4), който включва области, определящи комплементарността (CDRs) и първи фузионен партньор, където първата тежка верига CDR притежава последователността ThrSerGlvMetGlyValSer (SeQ ID N0:22), втората тежка верига CDR притежава последователHOCTTaHisile ТyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLvsSer (SEQ ID N0:24) и третата тежка верига CDRm, притежава последователността ArgGluThrValPheTyrTrpTyrPheAspVal (SEQ ID NO: 26) ; и първата лека верига CQR притежава последователността LysAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn (SED ID N0:16), втората лека верига CDR притежава последователността AlaAlaSerAsnLeuGluSer (SeQ ID NO 18) и трета лека верига IDR притежавна последователността GlnGlnSerAsnGluAspProProThr (SEQ ID N0:20) или GlnGlnSerAsnGluAspProProArg (SEQ ID NO: 28).

В първи аспект изобретението предлага фузионен белтък, който има свързващ афинитет към човешки интерлевкин-4, включващ области, определящи комплементарността области (ООК), получени от нехуманно неутрализиращо моноклонално антитяло (МаЬ), характеризиращо се с дисоциационна константа, равна или по-малка от 2 х 1О ‘°М за човешки IL4, и първи фузионен патньор, в който поне една, но за предпочитане всички области, определящи комплементарността (ООК), са заместени с ООК от нехуманно моноклонално антитяло (МаЬ). Нехуманизирано неутрализиращо МаЬ може да бъде подробно от групата, състояща се от ЗВ9 и 6А1, както е описано по-пълно в детайлното описание. За предпочитане е фузионният белтък да е свързан с втори фузионен белтък, който съдържа цялата или част от константната имуноглобулинова верига.

В този аспект изобретението осигурява ООК, получени от нехуманни неутрализирани моноклонални антитела (Mabs), характеризиращи се с дисоциационна константа, равна или помалка от 2 х 1О '°М за човешки 114 и молекула нуклеинова киселина, кодираща тези ООК.

В друг аспект изобретението осигурява хуманизирани антитела, имащи поне една, а за предпочитане 6 области, определящи комплементарността (ООК), получени от нехуманни неутрализиращи моноклонални антитела (МаЬ), характеризиращи се с дисоциационна константна, рана или по-малка от 2 х 10 '“ М за човешки IL4.

В друг аспект предложено е химерно антитяло, съдържащо константните области на човешка тежка и лека верига и вариабилните области на тежки и леки вериги, получени от нехуманни човешки неутрализиращи моноклонални антитела (МаЬ, характеризиращи се със дисоциационна константна, равна или по-малка от 2 х 1О ‘°М за човешки IL4.

В друг аспект настоящото изобретение осигурява фармацевтичен продукт, съдържащ един (или повече) от описаните по-горе фузионни протеини или МаЬ (например хуманизирани, химерни и т.н.) фармацевтично приемлив носител.

В по-нататъшен аспект изобретението осигурява метод за лечение и/или предпазване от алергични състояния при хора чрез прилагане на ефективно количество от фармацевтичната композиция на изобретението.

В друг аспект изобретението осигурява методи за рекомбинантно произвеждане на фузионния протеин и компоненти, използвани в него, моноклонални антитела (хуманизирани, химерни), техните ООК, Fab или Fab)2 или техни аналози, които са получени от нехуманни човешки неутрализиращи моноклонални антитела (МКА), характеризиращи се с дисоциационна константа, равна или по-малка от 2 х 1О ‘°М за човешки IL4. Тези съставки включват изолирани последователности нуклеинова киселина, кодиращи същите, рекомбинатни плазмиди, съдържащи последователности нуклеинова киселина, под контрола на избрани регулаторни последователности, които могат да направляват тяхната експресия в клетките на гостоприемника, и клетки на гостоприемник (за предпочитане от бозайници), трансфектирани с рекомбинантните палзмиди. Методът за получаване включва култивирането на тран-сфектираната клетъчна линия на даденото изобретение при такива условия, при които антитялото (за предпочитане хуманизирано) се експресира в указаните клетки, и изолирането на експресирания от тях продукт.

В друг аспект изобретението предлага метод за диагностициране на алегрии и други условия, свързани със свръхпродукция на IgE у човека, който включва контакт на проба от биологична течност с фузионни протеини, моноклонални антитела (напр.хуманизирани, химерни и т.н.) и Fab фрагменти на самото изобретение и изследване на наличието на свързване между посочените фузионни протеини, мо- _t ноклонални антитела или Fab и човешки интерлевкин-4.

В друг свързан аспект е осигурен метод , за скриниране на моноклонални антитела, които имат висок титър за човешки интерлевкин-4, . който се състои от:

а) приготвяне на хибридомна клетъчна _ линия, характеризираща се със секреция на . моноклонално антитяло и човешки интерлевкин-4 и

б) скриниране на посочената хибродомна клетъчна линия с алделихд свързан човешки интерлевкин-4 или биотинилиран човешки интерлевкин-4. Предпочита се хибридомната клетъчна линия да се екранира с биотинилиран човешки интерлевкин-4. Също са осигурени неутрализиращо моноклонално антитяло, имащо висок афинитет за интерлевкин-4. Fab фрагмент или F(ab)₂ фрагмент от него, получени чрез скриниране на библиотека от хибридомни продукти с алдехид-куплиран човешки интерлевкин-4 или биотинилиран човешки интерлевкин-4. В друг аспект изобретението осигурява неутрализиращи моноклонални антитела от гризачи, специфични за човешки интерлевкин-4 и имащи свързващи афинитет, характеризиращ се с дисоциационна константа, равна или помалка от 2 х 10 ^|0М за човешки IL4. Екземпляри от такива моноклонални антитела са миши ЗВ9 моноклонални антитела и плъши 6А1 моноклонални антитела и други моноклонални антитела, имащи същите идентификационни характеристики (т.е. свързващи се към същия епи3 топ (и) като ЗВ9 или 6AI със специфичност за човешки интерлевкин-4 и характеризиращи се с дисоциационна константа, равна или по-малка от 2 х ΙΟ¹⁰ М за човешки IL4). Друг аспект на изобретението ехибридома 3426А11С1В9.

Други аспекта и предимства на изобретението са описан· по-нататък в детайлното описание на преференциалните му части.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1. Последователности с идентификационен № 1 и 2 илюстрира вариабилната област на леката верига (аминокиселини 21-132) на мишо IL4 антитяли ЗВ9 и човешко/мишо ЗВ9 химерно антитяло, както и нативната сигнална последователност (аминокиселини 1-20). Подчертаните части показват области, определящи комплементарността (последователности с идентификационни номера 15 и 16; последователности с идентификационни номера 17 и 18 и последователност с идентификационни номера 19 и 20).

Фигура 2. Последователности с идентификационен № 3 и 4 илюстрира вариабилната област на тежката верига (аминокиселини 20-140) на мишо антитяло ЗВ9 и нативната сигнална последователност (аминокиселини 1-19). Подчертаните части доказват области, определящи комплементарността (последователности с идентификационна номера 21 и 22; последователности с идентификационни номера 23 и 24 и последователности с идентификационни номера 25 и 26)

Фигура 3. (Последователности с идентификационни № 9и 10) илюстрира вариабилната област на тежката вфига (аминокиселини 21-141) на човешко/мишохимерно антитяло ЗВ9 и неговата сигнална последователност (аминокиселини 1-19, последователности с идентификационни Номера 5 и 6). Подчертаните части показват области, определящи комплементарността, получени от ЗВ9 (последователности с идентификационни номера 21 и 22; последователности с идентификационни номера 23 и 24 и последователности с идентификационни номера 25 и 26).

Фигура 4. (Последователности с идентификационни № 11 и 12) илюстрира вариабилната област на тежката крита (аминокиселини 20-141) на хуманизирано «по антитяло ЗВ9 и нативната сигнална последовжгелност (аминокиселини 1-19: последователност» с идентификационни номе ра 5 и 6). Подчертаните части показват области, определящи комплементарността, получени от ЗВ9 (последователности с идентификационни номера 54 и 22; последователности с идентификационни номера 55 и 24 и последователности с идентификационни номера 56 и 26).

Фигура 5. Последователности с идентификационни № 13 и 14 илюстрира вариабилната област на леката верига (аминокиселини 21-131) на хуманизирано антитяло ЗВ9 и сигналната последователност (аминокиселини 1-20: последователности с идентификационни номера 7 и 8). Подчертаните части показват области, определящи комплементарността, получени от ЗВ9 (последователности с идентификационни номера 53 и 16; последователности с идентификационни номера 17 и 18 и последователности с идентификационни номера 27 и 28).

Фигура 6А (Последователности с идентификационен № 5 и 6) е сигнална последователност на тежка верига, използвана в пример 4 по-долу.

Фигура 6В (Последователности с идентификационен № 7 и 8) е сигнална последователност на лека верига, използвана в пример 4 по-долу.

Фигура 7 е схематично изображение на плазмида plL4chhc3-pcd, който се използва за експресиране на химерна IL4 тежка верига в клетки на бозайници. Плазмидът съдържа ген за β-лактамаза (BETA LAC) SV-40-източник нарепликация (SV-40), цитомегаловирусна промоторна секвенция (CMV), сигнална последователност, химерна вариабилна тежка верига на последователности с идентификационни номера 9 и 10, константна област на човешка тежка верига, поли-А сигнал от говежди растежен хормон ((BGH), бетаглуболинов промотор (beta glopro), дихидрофолатен редуктазен ген (DHFR), и BGH последователен полиА сигнал в pUC 19 основа.

Фигура 8 е схематично изображение на плазмид plL4chlc-pcdn, използващ се за експресиране на вариабилната област на химерна IL4 лека верига на последователности с идентификационни номера 1 и 2 в клетки на бозайници. Плазмидът се различава от този на фиг.7 по това, че съдържа вариабилната област на химерна лека верига, вместо тази на химерна тежка верига, константна област на човешка лека верига и неомицинов ген (Neo), прибавен към DHFR.

Фигура 9 е схематично изображение на плазмид plL4hzhc-l-pcd, който се използва за експресиране на синтетична вариабилна област на IL4 тежка верига на последователности с идентификационни № 11 и 12 в клетки от бозайници. Плазмидът се различава от този на фиг.7 по съдържанието на хуманизирана вариабилна област на тежка верига вместо тази химерна тежка верига.

Фигура 10 е схематично изображение на плазмид plL4hzlc 1 -О-Рсп, който се използва за експресиране на хуманизирана вариабилна област на 1L4 лека верига на последователности с идентификационен № 13 и 14 в клетки от бозайници. Плазмидът се различава от този на фиг.8 по съдържанието на хуманизирана вариабилна област на лека верига, вместо тази на химерна лека верига и не кодира DHFR ген.

Техническа същност на изобретението

Изобретението осигурява разнообразие от антитела, техни фрагменти и фузионни белтъци, частично хуманизирани антитела, които се характеризират със свързваща активност спрямо човешки IL4, неутрализираща активност и висок афинитет за човешки IL4 като тези на миши МАЬЗВ или плъши МаЬ6А1. Тези продукти се използват в терапевтични и фармацевнтични продукти за лечение на IL4 медиирани и IgE медиирани алергични реакции. Тези продукти се използват също за диагностика на IL4 медиирани състояния чрез измерване (обикновено чрез ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA) на циркулиращи ендогенни нива на IL4 при хора.

Дефиниции.

“Фузионен протеин” означава протеин, кодиран от фузионна молекула, която може да се получи чрез експресия в избрана клетка гостоприемник. Такива фузионни протеини са конструирани антитела, напр. химерни или хуманизирани, или фрагменти от антитела, на които липсва цялата или част от имуноглобулиновата константна област, т.е. Fv, Fab или F(ab)₂ и сходни на тях.

“Фузионна молекула” означава последователност от нуклеинова киселина, кодираща областите, определящи комплементарността (ООК) за хуманни имонуглобулини, които се включват в първия фузионен партньор, съ държащ човешки рамкови вариабилни последователности. По избор първият партньор на фузията може да бъде свързан към втори фузионен партньор.

“Първи фузионен партньор” означава нуклеиново киселинна последователност, кодираща човешка рамкова или човешка имуноглобулинова вариабилна област, в която нативните (или естествено намиращи се) ООК, са заместени с такива на донорното антитяло. Човешката вариабилна област може да бъде имуноглобулинова тежка верига, лека верига (или и двете), техен аналог или фрагмент от тях. Такива ООК или части от тях, локализирани във вариабилната област на антителата (имуноглобулините) могат да бъдат установени с познати методи. Напр. Kabat et al., [Sequences of Proteins of immunological Interest, 4 th Ed., US Department of Heal+h and Human Servicrs, National Institutes of Health (1987)], разкрива правила за локализиране на ООК. В добавка могат да се използват и компютърни програми, които са полезни за идентифициране на ОКК области (структури).

Терминът “висок титър” се отнася до антитела със свързващ афинитет, характеризиращ се с K_d равна или по-малка от 2 х 10¹⁰М за човешки IL4.

Под “свързваща специфичност за човешки IL4” се разбира висок титър (или афинитет) за човешки, неговежди и немиши IL4.

“Втори партньор на фузията” се отнася до друга нуклеотидна последователност, кодираща протеин или полипепдид, към който се слива първият фузионен партньор в рамките или посредством факултативна конвенционална свързваща последователност (напр.оперативно свързана). За предпочитане това е имуноглобулин. Вторият фузионен партньор може да включва последователност от нуклеинова киселина, кодираща цялата константна област за същото антитяло, което ни интересува (т.е. хомоложна - първият и вторият фузионен партньор се получават от един и същ източник) или добавъчна (т.е. хетероложна). Тя може да бъде тежка или лека имуноглобулинова верига (или двете, като част от един полипептид). Вторият фузионен партньор не е органичен относно определен имуноглобулинов клас или изотип. Вторият фузионен партньор може да съдържа част от константната област на имуноглобулин, както е установено във Fab и F(ab)2,

т.е. дискретна част от подходяща човешка константна или рамкова област). Такъв втори фузионен партньор може също да съдържа последователност, кодираща интегрален мембранен протеин, разположен върху външната повърхност на клетката на гостоприемника, напр. като част от фаговата екранна библиотека или последователност, кодираща протеин за аналитично или диагностично определяне - напр. пероксидаза от хрян, β-галактозидаза и др.

Термините Fv, Fc, Fab или F(ab)2 се използват с тяхното стандартно значение (вж. Напр. Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Gold Sprihg Harbour Laboratory, 1988)).

Както е употребен тук, терминът “конструктивно антитяло” представлява вид фузионен протеин, т.е. синтетично антитяло (например химерно или хуманизирано), в което част от леко-и/или тежковерижните вариабилни домени на избрано актепторно антитяло са заменени с аналогични части от едно или повече донорни антитела, които са специфични за избрания епитоп. Такава молекула може да включва антитела, характеризирани чрез хуманизирана тежка верига, асоциирана с немодифицирана (или химерна) лека верига или обратно. Конструираните антитела могат също да се характеризират с промяна на нуклеиново-киселинната последователност, кодираща рамковите области на леките или тежки вариабилни домени, с оглед да се запази свързващата специфичност на донорното антитяло. Тези антитела могат да имат смяна на една или повече ООК (за предпочитане всичките) от акцепторното антитяло с ООК от донорното антитяло, описано тук.

“Химерно антитяло” означава изкуствено конструирано антитяло, на което ООК са получени от хуманен донорен имуноглобулин, а останалите имуноглобулинови части на молекулата произлизат от един или повече човешки имуноглобулини. В добавка рамковите поддържащи участъци могат да бъдат променени така, че да предпазват афинитета на свързване (вж. Напр. Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032(1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)).

Терминът “донорно антитяло” се отнася за антитяло (поликлонално, моноклонално или рекомбинантно), което придава нуклеиново-киселинни последователности от вариабилната си област, ООК или други функционални фраг менти или техни аналози към първия фузионен партньор, така че да осигурява на фузионната молекула и резултантния експресиран фузионен протеин антигенна специфичност и неутрализираща активност, характерна за донорното антитяло. Донорно антитяло, подходящо за използване в настоящото изобретение, е нехуманното неутрализиращо моноклонално антитяло (т.е. мишо), обозначено като ЗВ9. Антитялото ЗВ9 се определя като високотигърно, специфично за човешки- IL4 (т.е. не разпознава говежди или миши 1L4), неутрализиращо антитяло от изотип lgGl, съдържащо вариабилна лека верига ДНК и аминокиселинни последователности с идентификационни номера 1 и 2, и вариабилна тежка верига ДНК и аминокиселинни последователности с идентификационни номера 3 и 4 върху подходяща миша IgG константна област.

Терминът “акцепторно антитяло” означава антитяло (поликлонално, моноклонално или рекомбинантно), хетероложно спрямо донорното антитяло, което съдържа всички (или част, но за предпочитане е всички) последователности нуклеинови киселини, кодиращи рамковите области на неговата тежка и/или лека верига, а също и/или тежките и/или леките константни области към втория фузионен партньор. Препоръчва се акцепторното антитяло да е човешко.

ООК се дефинират като аминокиселинни последователности, определящи областите на комплементарност на дадено антитяло, които са хипервариабилните области на имуног.табулиновата лека и тежка верига. Вж пр. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Institutes of Health (1987). Във вариабилната област на един имуноглобулин има по три за тежката и за леката верига ООК. Следователно ООК, както е дефинирано тук, касае всичките три ООК на тежката или всичките ООК на леката верига (или и на двете, ако е подходящо).

ООК осигуряват мнозинството от контактните остатъци за свързване на антитялото към антиген или епитоп. ООК, които са обект на интерес в даденото изобретение, се получават от вариабилните последователности в тежката и лека верига на донорното антитяло и включват аналози на естествено съществуващите ООК, които аналози споделят или запазват същата антигенсвързваща специфич6 ност и/или неутрализираща способност като донорното антитяло, от което са получени. Под “споделяне на антигенсвързващата специфичност или неутрализираща способност” се разбира например, че въпреки, че МКА ЗВ9 могат да се характеризират с определено ниво на афинитет към антигена и ООК, кодирани от нуклеинови последователности в една подходяща структурна среда може да имат по-нисск или по-висок афинитетц очаква се, че ООК на ЗВ9 ще разпознава същия епитоп като ЗВ9. Примерни ООК на тежка верига на ЗВ9 включват последователности с идентификационни номера 22; 24; 26. Примерни ООК на лека верига на ЗВ9 включват последователности с идентификационни номера 16; 18; 20.

“Функционален фрагмент” е частична вариабилна последователност от тежка или лека верига (напр.минорни делеции при амино- или карбоксилния край на вариабилната област на имуноглобулина), която съдържа същата антигенсвързваща специфичност и/или неутрализираща способност, както антитяло, от което е взет фрагмента. “Аналог” е аминокиселинна последователност с модифицирана поне една аминокиселина, аминокиселина, като модификацията може да бъде химична, cy6cTrjw [rs или разместване на няколко аминокиселини (не повече от десет) и която модификация позволява аминокиселинните последователности да запазят биологичните си характеристики, т.е. антигенната специфичност и високия титър или афинитет на немодифицираната последователност. Например “мълчливите” мутации могат да се конструират чрез заместване така, че да се създадат места за рестрикция с ендонуклеаза във или около ООК.

Аналозите могат също да произлизат като алелни вариации.

“Алелна вариация или модификация” е промяна в нуклеиново-киселинната последователност, кодираща аминокиселинните или пептидните последователности на изобретението. Такива вариации и модификации могат да се дължат на дегенерация в генетичния код или могат да бъдат специално конструирани, така че да осигуряват желани характеристики. Тези вариации или модификации могат да доведат или не до промени в дадена кодирана аминокиселинна последователност. Например аминокиселинните последователности в лековерижната ООК с идентификационен № 16 са иден тични с нативните мишо и хибридизирано ЗВ9 антитяло. Тези ООК секвенции се кодират от двете последователности: с идентификационни номера 16 и 53. Сходно ООК с идентификационен № 22 се кодират от двете последователности: с идентификационен № 21 и 54; ООН с идентификационен № 24 се кодират от двете последователности; с идентификационен № 23 и 55; ООК с идентификационен № 26 се кодират от двете последователности: с идентификационен № 25 и 56.

Терминът “ефекторни агенти” се отнася до непротеинови молекули — носители, към които чрез конвенционални методи могат да бъдат асоциирани фузионните протеини и/или естествени или синтетични леки и тежки вериги на донорното антитяло, или други негови фрагменти. Такива непротеинови носители могат да бъдат конвенционални носители, използвани в областта на диагностика, например полистиренови или други пластмасови сферички, полизахариди, например използваните в BIA core (Pharmacia) система, или други непротеинови субстанции, използвани в медицината и безопасни за прилагане на хора и животни. Други ефекторни агенти могат да включват макроцикъл за хелатиране на тежки метални атоми или радиоизотопи. Такива ефекторни агенти могат да бъдат полезни за повишаване времето на полуживот на фузионните протеини, например полиетиленгликол.

II. Високоафинитетни IL4 моноклонални антитела.

За конструирането на антитела, фрагменти или фузионни протеини в това изобретение могат да се използват клетки от организми, непринадлежащи към човешкия вид (напр.говежди, овчи, от примати, гризачи (мишки и плъхове) и т.н.) и да се генерират желаните имуноглобулини чрез представяне на нативен човешки IL4 или пептиден епитоп от него. За получаване на хибридомна клетъчна линия, секретираща нехуманно моноклонално антитяло, към IL4 се използват конвенционални лабораторни техники. Такива хибридоми след това се скринират чрез използване на IL4, ковалентно свързан към 96-гнездна плака или алтернативно с биотинилиран IL4 за прилагане в скриниращото изследване, както детайлно е описано в пример 2 по-долу. Следователно, характерна черта на самото изобретение е метод за откриване на моноклонални ан7 титела за човешки интрелевкнн-4, в който опитната постановка избягва денатуриране на IL4. По този начин е установено, че могат да се откриват високотитърни (или високоафинитетни) моноклонални антитела към човешки.

Като пример на първо време е показано получаването на високотитьрно неутрализиращо моноклонално антитяло от миши донор MAb ЗВ9, което е исканото (донорно) антитяло за използване при-развитието на химерно или хуманизирано антитяло. То е детайлно описано в пример 1 по-долу. MAb ЗВ9 се характеризира с антигенсвързваща специфичност за човешкиIL4 с K_d, по-малка от 2.0 х 1О ‘°М (около 1.8 х 10 ^|0М) за IL4. Епитопът на това антитяло на може да бъде картиран към IL4 с линеарни пептиди, и следователно се смята, че епитопът се свързва към несъседен епитоп. Начинът на свързване предполага свързваща страна при областта В-С бримка (остатъци 60-69) С (спирала остатъци 70-93). Тези области се отнасят до обозначенията на картата, дадени в Cook е al, J.Mol.Biol., 218:675-678 (1991). Walter et al, J.Biol.Chem., 267:20371-20376 (1992), Wlodaver et al, FEBS Lett., 309:59-64 (1992), Redfield et al, Biochem., 30:11029-11035 (1991). Smith et al, J. Mol. Biol.,224:899-904 (1992), Garret et al, (1992), and Powers et al. Mol.Biol., Biochem.31:4334-4346 (1992) and Science, 256:1673-1677 (1992), включени чрез справка тук.

Друго желано донорно антитяло е плъше MAb, 6А1.

Получаването на това антитяло се дава по-долу в пример 7. Това моноклонално антитяло е от изотип IgG2 и има дисоциационна константа за човешки-Ц.4 по-малка от 2.0 х 10'¹⁰М (около 1.6 х 1О ‘*М) за IL4. Както при ЗВ9, епитопът мишена на 6А1 не може да се картира с IL4 линеарни протеини, поради което се смята, че е непоследователен (несъседен) и тридимензионален. Начинът на свързване към IL4 мутеини и неговата биологична активност показва свързване в D спирална област на човешки IL4 (аминокиселинни остатъци 109-127), най-вероятно около тирозина при аминокиселинен остатък # 124.

Изобретението не се ограничава с използването на моноклонални антитела ЗВ9, 6А1 или техните хипервариабилни (т.е.ООК) последователности. Всяко друго високотитьрно IL4 антитяло, характеризиращо се с дисоциационна константа, равна или по-малка от 2.0 х ΙΟΙ ОМ за човешки IL4 и съответстваща антиIL4 ООК, може да ги замести. Където в последващото описание донорното антитяло се идентифицира като ЗВ9 или 6А1, това обозначение се прави само за илюстриране и опростяване на описанието.

^т. Антитялови фрагменти

Изобретението включва също използването на Fab- или F(ab’)₂ фрагменти, получени от моноклонални антитела, насочени срещу човешки IL4. Тези фрагменти са полезни in vivo като агенти, протективни срещу IL4 и IgEмедиирани състояния или in vitro като част от диагностиката на IL4. Fab фрагментът съдържа цялата лека верига и амино-крайния участък на тежката верига; F(ab’)₂ фрагментът е формиран от два Fab фрагмента, свързани чрез дисулфидни връзки. Mab ЗВ9, 6А1 и други IL4 свързващи антитела със сходен висок афинитет осигуряват източници на Fab- и F(a b’)₂ фрагменти, които могат да се получат чрез конвенционални методи, примерно чрез разграждане на моноклоналното антитяло с подходящи протеолитични ензими, папаин и/или пепсин или рекомбинантни методи. Тези Fabи F(ab’)₂ фрагменти самите са полезни като терапевтични, профилактични и диагностични агентг, а също като донори на последователности, включващи вариабилните области и ООК, използвани за формиране на рекомбинантни или хуманизирани антителац както е описано тук.

Анти- IL4 аминокиселинни и нуклеотидни последователности, които представляват интерес.

Моноклоналните ЗВ9 или други антитела, описани по-горе, могат да доставят последователности, например вариабилни тежки или леки пептидни последователности, рамкови последователности, ООК последователности, функционални фрагменти и техни аналози и нуклеиновокиселинни последователности, които ги кодират, използващи се в проектирането и получаването на различни фузионни протеини (включително конструирани антитела), които се характеризират с антиген-свързващата специфичност на донорното антитяло.

Като пример изобретението предоставя последователности от вариабилни лека и тежка верига на IL4 мишо антитяло ЗВ9 и последователности, получени от тях.

Вириабилната област на тежката верига на ЗВ9 се характеризира от аминокиселинните остатъци от 20 до 140 на последователност с идентификационен № 4. ООК областите са показани чрез подчертаване на фиг.2 и са предоставени в последователности с идентификационни номера 22, 24 и 26. Клон от вариабилната област на леката верига на ЗВ9 се характеризира с аминокиселинни остатъци от 21 до 132 от фиг. 1 [последователност с идентификационен номер 2]. ООК са от аминокиселинните остатъци 44-58 [последователност с идентификационен № 16]; 74-80 [последователност с идентификационен № 18] и 113-121 [последователност с идентификационен № 20].

Осигурени са химерна вариабилна област на тежката верига и сигнални нуклеотидна и аминокиселинна последователност. Тези последователности са идентични с тежката верига на ЗВ9, с изключение на сигналната последователност. Химерната сигнална последователност на тежката верига е дадена в последователности с идентификационни номера 5 и 6. ООК са показани чрез подчертаване на фиг.З и са идентични в аминокиселинните си последователности с нативинте миши ООК [последователности с идентификационни номера 2126]. Нукелеотидните и аминокиселинните последователности на вариабилната област на химерната лека верига са идентични с немодифицираните последователности от ЗВ9 (аминокиселинни остатъци 21-132 от последователност с идентификационен № 2), използват естествените миши сигнални секвенции (аминокиселинни остатъци 1-20 от последователност с идентификационен № 2).

Хуманизирана вариабилна област на тежка верига и сигнална последователност са илюстрирани на фиг.4 [последователности с идентификационни номера 11-12]. Сигналната последователност е дадена също в последователности с идентификационни номера 5 и 6. Други подходящи сигнални последователности, познати на професионалистите, могат да заместят сигналните последователности, илюстрирани тук. ООК аминокиселинните последователности на тази конструкция са идентични с нативните миши ООК и ООК на химерната тежка верига и са дадени чрез последователности с идентификационни номера 22 (кодирана чрез последователност с идентификационен № 54), 24 (кодирана чрез последователност с идентификационен № 55) и 26 (кодирана чрез последователност с идентификационен № 56).

Примерна (синтетична) хуманизирана вариабилна последователност на лека верига и илюстрирана на фиг.5 [последователности с идентификационни номера 13 и 14]. Сигналната последователност обхваща аминокиселинни остатъци от 1 до 19 на последователност с идентификационен № 8. Последователностите на ООК на тази фигура са обозначени чрез подчертаване и се различават от нативните миши OQK по единична аминокиселина на последователност с идентификационен № 20. Следователно, ООК на хуманизираната лека верига са осигурени чрез последователности с идентификационен № 53 и 16, последователности с идентификационен № 17 и 18 и последователности с идентификационен № 27 и 28. Тази разлика е показана в детайли в пример 3.

Нуклеиновокиселинните последователности на това изобретение или фрагментите от тях, кодиращи пептидните секвенции на вариабилните леки и тежки вериги, се използват в немодифицирана форма или се синтезират, за да им се придадат желани модификации, напр. места за рестрикция. Изолираните естествено съществуващи или алтернативно синтезирани нуклеиновокиселинни последователности, получени от MAb ЗВ9 или от други подходящи IL4 антитела, може по избор да съдържат места за рестриктази, за да се постигне инсерция или лигиране в подходящи нуклеиновокиселинни последователности, например да се кодира по желание антиялова рамкова област, лигирани или мутагенизирани ООК или фузии с нуклеиновокиселинни последователности, кодиращи избран втори фузионен партньор.

Водейки сметка за дегенерацията на генетичния код, могат да бъдат конструирани различни кодиращи секвенции, които кодират аминокиселинни последователности на вариабилинте леки или тежки вериги, ООК последователности на изобретението, както и функционални фрагменти и техни аналози, които имат антигенна специфичност като донорното антитяло.

Изолираните нукелиновокиселинни последователности на това изобретение, или техни фрагменти, кодиращи пептидите на валиабилноверижните секвенции или ООК, могат да бъдат използвани за получаване на фузионни протеини, химерни или хуманизирани антитела или други конструирани антитела на това изобретение, когато са оперативно свързани с втори фузионен партньор.

Тези последователности могат да бъдат също полезни за мутагенно получаване на специфични изменения в нуклеиновокиселинните последователности, кодиращи ООК или рамковите области, и за инкорпориране на получените модифицирани или фузионни нуклеиновокиселинни последователности в плазмиди за експресия. Например “мълчаливи” замествания в нуклеотидната последователност на рамковите и ООК кодиращите области се използват за създаване на места за смилане с рестрикционни ензими, които облекчават инсерцията на мутагенизирани ООК (и/или рамкови) области. Тези ООК се използват при конструирането на хуманизирано антитяло в това изобретение. Трябва да се отбележи, че в прибавка към изолираните нуклеиновокиселинни последователности, кодиращи части от фузионния протеин и антителата, описани тук, могат да бъдат използвани други нуклеиновокиселинни последователности, като такива, комплементарни на нативните последователности. Полезни ДНК последователности са също тези, които хибридизират при строго определени хибридазационни условия [вж T.Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), стр. 387 до 389] към ДНК последователностите. Пример на такива строги хибридизационни условия е хибридизирането при 4 х SSC при 65°С, последвано от миене във 0.1 X SSC за 1 h. Алтернативно, пример за строго хибридизационно условие е 50% формамид 4 X SSC при 42°С. За предпочитане тези хибридизиращи ДНК последователности са дълги поне 18 нуклеотиди, т.е. колкото размера на ООК.

V. Фузионни молекули и фузионни протеини

Фузионните молекули могат да кодират фузионни протеини, които включват конструирани антитела, каквито са химерните и хуманизираните антитела. Желателната фузионна молекула съдържа ООК, кодиращи пептиди, имащи антигенна специфичност на IL4 антитяло, за предпочитане високоафинитетно антитяло, както е осигурено в настоящото изобретение, включено в първия фузионен партньор (човешка рамкова или човешка имуноглобулинова вариабилна област). За предпочитане първият фузионен партньор е оперативно свързан към втори фузионен партньор. Вторият фузионен партньор е дефиниран по-горе и може да включва последо вателност, кодираща втора област от интерес в антитялото, напр. Fc област. Вторите фузионни партньори може също да включват последователности, кодиращи други имуноглобулини, към които константната област на леката или тежката верига е фузирана в рамка, или чрез линкерна последователност. Конструираните антитела срещу функционални фрагменти или аналози на IL4 могат да бъдат проектирани да разкриват повишено свързване със самото антитяло.

Вторият фузонен партньор може също да бъде асоцииран с ефекторни агенти, както е дефинирано по-горе, включително непротеинови молекули - носители, към които вторият фузионен партньор може да бъде свързан чрез конвенционални методи. Фузията или свързването между втория фузионен партньор, напр. антитялова последователност и ефекторен агент, може да стане чрез всякакви удобни методи, например чрез конвенционални ковалентни или йонни връзки, протеиново сливане или хетеробифункционални крос-линкери, напр.карбодиимид, глутаралдехид и подобни. Такива техники сапознати в практиката и охотно описвани в конвенционалните химични и биохимични текстове.

Конвенционалните линкерни секвенции, които просто осигуряват желаното пространство между втория фузионен партньор и ефекторния агент, могат да бъдат конструирани във фузионната молекула. Проектирането на такива линкери е добре познато на професионалистите. Сигналните последователности за молекулите на изобретението могат да бъдат модифицирани така, че да повишават експресията. Като пример в желания фузионен протеин, имащ последователност като тази на миша тежка верига, която е идентична с химерната вариабилна тежка верига (VH) на фиг.2 (последователност с идентификационен № 4) оригиналният сигнален пептид е заместен с друга сигнална последователност (аминокиселинни остатъци 1-20 от последователност с идентификационен № 6).

Един примерен фузионен протеин съдържа пептид или протеин от вариабилна тежка или лека верига, който има антигенната специфичност на MAb ЗВ9, т.е. VH [аминокиселинни остатъци 21-141 от последователности с идентификационни № 9 и 10] и VL вериги [аминокиселинни остатъци 21-132 от последо10 вателности с идентификационен № 1 и 2]. Тъй като други желани фузионни протеини на това изобретение се характеризират с аминокиселинна секвенция, съдържаща поне една, а препоръчително всички ООК на вариабилната област на тежката и/или леката верига на мишо антитяло ЗВ9, а останалите му последователности са получени от човешки източник или функционални фрагменти на техни аналози. Виж примерно хуманизираните VH и VL области на последователности с идентификационни номера 11 и 12 и последователности с идентификационни номера 13 и 14 (фиг. 4 и 5).

В по-нататъшното формиране, конструираното антитяло на изобретението може да бъде прикрепено към добавъчен агент. Например процедурата на рекомбинантната ДНК технология може да се използва за получаване на конструирано антитяло на изобретението. Fc фрагментът на СНЗ домена на пълната антитялова молекула е заместен с ензим или друга откриваема молекула (като ефекторна или репортерна молекула).

Вторият фузионен партньор може също да бъде оперативно свързан към неимуноглобулинов в пептид, протеин или фрагмент от тях, хетероложен спрямо ООК съдържащата последователност, имаща антигенната специфичност на мишо ЗВ9. Резултантният протеин може да проявява както анти-1Ь4 антигенна специфичност, така и характеристика на неимуноглобулин по време на експресия. Това свойство на фузионния партньор може да бъде примерно функционално свойство, като друг свързващ или рецепторен домен, или терапевтично свойство, ако фузионният партньор сам по себе си е терапевтичен протеин, или допълнителна антигенна характеристика.

Друг желателен протеин на това изобретение може да съдържа пълна антиятлова молекула, съдържаща тежки и леки вериги в пълната им дължина или някакъв дискретен фрагмент от тях, като Fab или F(ab)2 фрагменти, димер на тежка верига или някакви минимални рекомбинантни фрагменти като Fv или едноверижно антитяло, или някаква друга молекула със същата специфичност като избраното донорно моноклонално антитяло, например МаЬЗВ9 или 6А1. Такъв протеин може да се използва за формиране на фузионен протеин или може да се използва в нефузирана форма.

Като вторият фузионен партньор е по лучен от друго антитяло, например някакъв изотип или клас от имуноглобулинова рамкова или константна област, се получава конструирано антитяло. Конструираните антитела могат да включват имуноглобулинови константни области и вариабилни рамкови области от един източник, примерно акцепторното антитяло, и една или повече (за предпочитане всички) ООК от донорното антитяло, например анTH-IL4 антитялото, описано тук. Измененията, т.е. делециите, субституциите или добавките към рамковата област на вариабилните домени на тежката и/или леката верига на акцепторното антитяло на нуклеиновокиселинно или аминокиселинно ниво, или на донорните ООК могат да бъдат направени с цел да се запази антигенносвързващата специфичност на донорното антитяло.

Такива конструирани антитела са проектирани да използват една (или и двете) вариабилни тежки или леки вериги на IL4 моноклоналното антитяло (по избор модифицирано както е описано) или една или повече от подолу идентифицирани тежко или леко верижни ООК (вж пример 3). Конструираните антитела на изобретението са неутрализиращи, т.е. те избирателно блокират свързването към рецептора на IL4 протеина. Например, конструираното антитяло, получено от МаЬЗВ9, е насочено срещу специфичен терциерен протеинов епитоп на човешкия IL4, за който се смята, че е при В-С бримката ->С спиралната област, както е описано по-горе.

Такива конструирани антитела могат да включват хуманизирано антитяло, съдържащо рамкови области на избран човешки имуноглобулин или субтип, или химерно антитяло, съдържащо константни области от човешка лека и тежка верига, фузирани към функционални фрагменти на IL4 антитялото. Подходящо човешко (или от друго животно) акцепотрно антитяло може да бъде селекционирано от конвенционалните базови данни, например базовите данни КАВАТ, базовите данни в Лос Аламос, базовите данни на Swiss Protein, чрез хомология към нуклеотидните и аминокиселинните последователности на донорното антитяло. Човешко антитяло, характеризиращо се с хомоложност спрямо рамковите области на донорното антитяло (или на аминокиселинна база) може да е подходящо за осигуряване на константната област на тежката верига и/или на вариабилната рамкова област на тежката верига за инсерция на донорните ООК. Подходящо акцепторно антитяло, способно на даде лековерижни константни или вариабилни области, може да бъде избрано по сходен начин. Трябва да се отбележи, че тежката и леката верига на акцепторното антитяло не се изисква да произлизат от същото акцепторно антитяло.

Желателно е хетероложната рамкова и константна област да се избират от човешките имуноглобулинови класове и изотипове, като IgG (субтипове от 1 до 1) IgM, IgA и IgE. Акцепторното антитяло няма нужда да съдържа само човешки имуноглобулинови протеинови последователности. Например може да бъде конструиран ген, в който ДНК секвенция кодира част от човешка имувоглобулинова верига и е претърпяла фузия с ДНК секвенция, кодираща неимуноглобулинова аминокиселинна последователност катополипептидна ефекторна или репортерна молекула.

Пример за особено жално хуманизирано антитяло съдържа ООК наЗВ9, вмъкнати в рамковата област на избрана човешка антитялова последователност. За неутрализиращи хуманизирани антитела, една, две или за предпочитане три ООК от вариабилните области на леката и/или тежка верига на IL4 антитяло са вмъкнати в рамковата област на избрана човешка антитялова последователност, замествайки нативните ООК на последната. Предпочита се в хуманизирано антитяло вариабилните домени в тежката и лека човешка верига да бъдат конструирани с една или повече замени на ООК. Възможно е да се използват всичките шест ООК или различни комбинации от по-малко от шест ООК. Предпочита се да се заменят всичките шест ООК. Възможно е да се заменят ООК само в тежката човешка верига, използвайки като лека верига немодифицираната лека верига на човешкото акцепторно антитяло. Алтернативно също може да се използва съвместима лека верига, избрана от друго човешко антитяло, чрез прибягване до конвенционалните антитялови базови данни. Остатъкът от конструираното антитяло може да се получи от всеки подходящ акцепторен човешки имуноглобулин. Така конструираното хуманизирано антитяло има за предпочитане структура на естествено човешко антитяло или негов фрагмент и съдържа комбинация от свойства, необходими за терапевтичното му използване, т.е. за лечение на IL4 медиирани възпалителни заболявания у човека или за диагностични цели. Като друг пример, конструираното антитяло може да съдържа три ООК от вариабилната област на леката верига на ЗВ9 [последователности с идентификационни номера 16, 18, 20 и 28] и три ООК от вариабилната област на тежката верига на ЗВ9 [последователности с идентификационни номера 22,24, и 26]. Полученото хуманизирано антитяло се характеризира с антигенсвързващата специфичност и висок афинитет на моноклоналното тяло ЗВ9.

Трябва да се разбере от специалистите, че конструираното антитяло може да бъде понататък модифицирано чрез промени в аминокиселинните на вариабилните домени, без да е необходимо да се повлиява специфичността или високия афинитет на донорното антитяло (напр.аналог). Например хуманизирано моноклонално антитяло е конструирано така, че аминокиселинният остатък в леката верига при позиция 120 е аргинин [последователности с идентификационни номера 13 и 14] или треонин [последователности с идентификационни номера 57 и 58]. Предвижда се аминокиселини в леката и тежката верига да могат да се заместват с други аминокиселини дори в рамковите области на вариабилинте домени и/или ООК.

Константната област може да се промени така, че да се повишат или намалят селективните свойства на молекулите на настоящото изобретение. Например димеризиране, свързване към Fc рецепторите или способност да се свързва и активира комплемент (вж Angal et al., Mol Immunol, 30:105-108 (1993), Xu et al., J.Biol. Chem.269:3469-3474 (1994), Winter et al., EP307, 434-B). Фузионен протеин, който е химерно антитяло, се различава от хуманизираните антитела, описани по-горе, поради това, че осигурява изцяло нехуманно донорно антитяло с вариабилни области на леката и тежката верига, включително рамковите области в асоциация с човешки имуноглобулинови константни области за двата вида вериги. Предполага се, че химерните антитела, които съдържат допълнителни нехуманни последователности спрямо хуманизираните антитела, могат да предизвикат значителен имунен отговор у хора.

Такива антитела са полезни за профилактика и лечение на IL4 медиирани алергич12 ни разстройства, както се обсъжда по-долу.

У².Получаване на фузионни протеини и конструирани антитела.

За предпочитане е последователностите на вариабилните леки и/или тежки вериги ООК на Mab ЗВ9 [последователности с идентификационни номера 16, 18, 20, 22, 24 и 26] или други подходящи донорни моноклонални антитела (например 6А1) и кодиращите ги нуклеиновокиселинни последователности да се използват за конструиране на фузионни протеини и инженерни антитела (за предпочитане хумантизирани) в това изобретение чрез използване на следния процес. Същите или сходни техники могат да се използват за получаване на други съставки на това изобретение.

Хибридома, продуцираща избрано донорно антитяло (в частност моноклонално антитяло ЗВ9), се клонира конвенционално, и ДНК на вариабилните области на нейните тежки и леки вериги се получават чрез техники, познати на специалистите, т.е. техники, описани в Sambrook et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2 nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Вариабилните области на леката и тежката верига на ЗВ9, съдържащи поне ООК и тези части от рамковата област на вариабилните домени на леката и/или тежката верига на акцепторното моноклонално антитяло, които са необходими за запазване на свързващата специфичност на донорното антитяло, както и останалите имуноглобулинови части на антитяловата верига, получени от човешки имуноглобулин, се получават чрез използване на полинуклеотидни праймери и обратна транскриптаза. ООК се идентифицират чрез използване на позната база данни и чрез сравнение с други антитела.

Мишо/човешкото антитяло може след това да се приготви и изследва за свързваща способност. Такова химерно антитяло съдържа целите V_H и V_L области на нехуманното донорно антитяло, свързани с човешки имуноглобулинови константни области от двете вериги.

Хомоложни рамкови области на тежковерижните вариабилни области от човешкото антитяло се идентифицират чрез използване на компютризирани бази данни, напр. KABAT^R и като акцепторно антитяло се избира човешко антитяло, хомоложно на ЗВ9. Последователностите на синтетичните тежковерижни ва риабилни области, съдържащи ООК на ЗВ9 в човешки антитялови рамки, се оформят с незадължителни нуклеотидни размествания в рамковите области, за да се инкорпорират места за рестрикция. Така оформената последователност след това се синтезира чрез препокриващи се олигонуклеотиди, амплифицирани чрез полимеразна верижна реакция (PCR) и се коригират за грешки.

Подходяща лековерижна вариабилна рамкова област се оформя по сходен начин.

Хуманизирано антитяло може да се получи от химерно антитяло или за предпочитане да се приготви синтетично чрез подходящо включване на ООК от леки и тежки вериги на донорното антитяло в избрани рамки на леката и тежка вериги. Алтернативно, хуманизирано антитяло на изобретението може да се приготви чрез използване на стандартни техники за мутагеназа. Така полученото хуманизирано антитяло съдържа човешки рамкови области и ООК на донорното моноклонално антитяло. Може да има последващо манипулиране на рамковите остатъци.

Полученото хуманизирано антитяло може да бъде експресирано в рекомбинантни клетки от гостоприемник, например COS и СНО клетки. Допълнителни подробности от тази процедура са дадени в пример 6. Други хуманизирани антитела могат да бъдат получени чрез използване на тази техника върху други подходящи 1Ь4-специфични, неутрализиращи, нехуманни високотитърни антитела.

Конвенционален експресионен вектор или рекомбинантен плазмид се получава чрез поставяне на кодиращите последователности за фузионния протеин в оперативна асоциация с конвенционалните регулаторни контролни последователности, способни да контролират репликацията и експресията в клетките на гостоприемника и секретирането от тях. Регулаторните последователности включват промоторна секвенция, например CMV промотор, и сигнални последователности, които могат да бъдат получени от други познати антитела. Сходно, втори екпресионен вектор се получава, ако имаме ДНК последователност, която кодира комплементарна антитялова лека и тежка верига. Препоръчва се вторият експресионен вектор да е идентичен на първия до такава степен, че кодиращите последователности и селективните маркери да подсигуряват докол13 кото е възможно всяка полипептидна верига функционално да се експресира. Избрана клетка-гостоприемник се ко-трансфектира по конвенционалните техники с първия и втория вектор или просто се трансфектира с единичен вектор, за да се създаде трансфектирана клетка гостоприемник на даденото изобретение, която съдържа рекомбинантни или синтетични леки и тежки вериги. Трансфектираната клетка след това се култивира по конвенционалните техники, за да се получи конструираното антитяло от изобретението. Хуманизираното антитяло, което включва асоциация на рекомбинантни тежки и/или леки вериги, се с1д)инира от културата по подходящ начин, например ELISA или RIA. Сходни конвенционални техники могат да се използват за конструиране на други фузионни протеини и молекули на това изобретение.

Подходящи вектори за стъпките на клониране и субклониране, които се използват, могат да бъдат подбрани от специалист. Например могат да се използват конвенционалните pUC серии от клониращи вектори. Един от използваните вектори е pUC19, който може да се купи от търговските фирми като Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) или Pharmacia (Uppsala, Sweden). В допълнение, всеки вектор, който се реплицира охотно, има изобилие от клониращи места и маркиращи гени и се манипулира лесно, може да се използва за клониране.

Селекцията на клониращ вектор не е лимитиращ фактор на това изобретение.

Векторите, използвани за експресия на конструирани антитела, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат избрани от специалист от всеки конвенционален вектор. Векторите също съдържат избрани регулаторни последователности, които са в оперативна асоциация с ДНК кодиращите последователности на имуноглобулиновите области и са способни да направляват репликацията и експресията на хетероложни ДНК последователности в избрани клетки от гостоприемник като CNV промоторите. Тези вектори съдържат по-горе описаните ДНК последователности, които кодират конструираното антитяло или фузионната молекула.

Алтернативно, векторите могат да включват избраните имуноглобулинови секвенции, модифицирани чрез инсерция на желани рестрикционни места за по-лесно манипулиране. Експре сионните вектори могат също да се характеризират с маркиращи гени, удобни за амплифициране на експресията на хетероложните ДНК последователности, например дихидрофолатен редуктазен ген от бозайници (DHFR) или ген за резистентност към неомицин (neoR). Други предпочитани векторни последователности включват поли-А сигнална секвенция, като тази от говежди растежен хормон (BGH) и 3-г.тобулинова промоторна секвенция (betaglopro). Експресионните вектори, които се използват тук, могат и да се синтезират чрез техники, познати на специалистите.

Компонентите на такива вектори, т.е. репликони, селективни гени, умножители (енхансери), промотори, сигнални последователности и т.н., могат да се получат от естествени източници или да се синтезират чрез познати процедури за използване за направляване на експресята и/или секрецията на продукта на рекомбинантната ДНК в избрания гостоприемник. Други подходящи експресионни вектори, на които се знаят типовете номера, са познати в областта и се използват за тази цел при бозайници, бактерии, насекоми, дрожди и гъби.

Изобретението също включва клетъчна линия, трансфектирана с рекомбинантен плазмид, съдържащ кодиращите последователности на конструираното антитяло или фузионните му молекули. Клетките на гостопиремник, използвани за клониране и други манипулации, също са конвенционални. С най-голямо предпочитание за репликация на клониращите вектори и другите етапи на конструирането на фузионните протеини се използват клетки от различни щамове E.coli. Подхоядщи клетки гостоприемници или клетъчни линии за експресия на конструираното антитяло или фузионния протеин на изобретението са предпочитаните еукариотни клетки като СНО, COS, фибробластни клетки (примерно ЗТЗ) и други миелоидни клетки, а най-вече се предпочитат клетки от бозайници като СНО и миелоидни клетки. Човешки клетки могат да се използват, като дават възможност на молекулата да бъде модифицирана чрез глюкозилиране. Също се използват и други еукариотни клетъчни линии. Селекцията на подходящи клетки от бозайници за гостоприемник и методите за трансформация, култивиране, амплифициране, скрининг и получаване на продукта и не14 говото пречистване, са познати. Вж Sambrook et al, цитирани по-горе.

Бактериалните клетки могат да бъдат полезни за гостопиремник за експресия на мноклонални антитела на настоящото изобретение. Обаче съгласно тенденцията на протеините, експресирани в бактериални клетки, да бъдат в ненагъната или неправилно нагъната форма или в негликозилирана форма, всяко рекомбинантно антитяло, получено в бактериална клетка, трябва да бъде скринирано за запазване на антигенсвързващата способност. Ако молекулите, експресирани от бактериални клетки, се получат в правилно нагъната форма, бактериалната клетка е желан гостоприемник. Например различните щамове E.coli, използвани за експресия, са добре познати като клетки на гостоприемник в биотехнологията. Различни щамове В. Subtilis, Streptomyces, други бацили и сходни, могат да се използват в този метод.

Когато е желателно, щамове дрожди, познати на специалистите, също могат да се използват като гостоприемници, както и клетки от насекоми, напр. Drosophila и Lepidoptera и вирлусни експресионни системи. Виж Miller et al., Genetic Engeneering, 8:277-298, Plenum Press (1986) и цитатите в нея.

Главните методи, чрез които векторите на изобретението могат да се конструират, методите за трансфекция за получаване на клетки на гостоприемник на изобретението и методите за култивиране, необходими за получаване на фузионни протеини и на конструирани антитела на изобретението от същия гостоприемник, всички са конвенционални техники. По този начин, веднъж получен, фузионния протеин или конструираното антитяло могат да се пречистят от клетъчната култура съгласно стандартни процедури, включващи преципитация с амониев сулфат, афинитетни колони, колонна хроматография, гел електрофореза и сходни. Тези техники са общоприети и не ограничават изобретението.

Друг метод за експресия на хуманизирани антитела може да използва експресията в трансгенни животни, както е описано в US 4 873 316. Той се отнася до експресионна система, съдържаща човешки казеинов промотор, който, когато се включи трансгенно в бозайници, прави възможно женските да продуцират желания рекомбинантен протеин в млякото си. Веднъж експресирано по желания метод, конструираното антитяло се изпробва за in vitro активност чрез подходящо изследване. Понастоящем се използват конвенционални ELISA набори за изпитване на качественото и количествено свързване на конструираното антитяло към IL4 епитоп. В допълнение могат да се използват и други in vitro методи като BIAcore (Pharmacia) за потвърждаване на неутрализиращата ефикасност преди по-нататъшните клинични изследвания при хора, правени, за да се установи персистирането на конструираното антитяло в организма, въпреки обикновените механизми на клирънс. Следвайки процедурите, описани за хуманизирани антитела, получени от ЗВ9, специалистите могат да конструират хуманизирани антитела от други донорни IL4 антитела, последователности от вариабилни области и ООК пептиди, описани тук. Конструирани антитела могат да се получат чрез рамки на вариабилна област, потенциално разпознавани като “свои” от реципиента на конструираното антитяло. Минорни модификации на рамките на вариабилните области могат да бъдат осъществени, за да предизвикат голямо * повишение на антигенното свързване без забележимо увеличение на имуногенността у реципиента. Такива конструирани антитела могат ефективно да повлияват човек при IL4 медиирани състояния. Те могат да бъдат също така полезни за диагнозата на тези състояния.

VII. Терапевтично/профилактично използване

Изобретението се отнася също така до метод за лечение на хора, показващи алергични разстройства, който се състои в прилагане на ефективна доза антитела, включващи едно или повече от конструираните антитела или фузионни протеини, описани тук, или фрагменти от тях.

Терапевтичният отговор, предизвикан чрез използване на молекулите на това изобретение, се получава чрез свързване към човешкия IL4 и впоследствие блокиране на освобождаването на IgE. Така молекулите съгласно изобретението в препарати и форми, подходящи за терапевтично използване, са много желани за тези индивиди, които проявяват алергичен отговор, като алергични ринити, конюнктивити, дерматити, атопична астма и анафилактичен шок.

Фузионният протеин, антителата, кон15 струираните антитела и техните фрагменти от това изобретение, могат да се използват в съчетание с други антитела, особено човешки моноклонални антитела, реагиращи с други маркери (епитопи), отговорни за състоянието, срещу които конструираното антитяло съгласно изобретението е насочено. Сходно, моноклонални антитела, реагиращи с епитопи. отговорни за състоянието в избрано животно, срещу които антитялото съгласно изобретението е насочено, могат да се използват във ветеринарната практика.

Терапевтичните агенти на това изобретение се смята, че са желани за лечение на алергични състояния в продължение на 2 дни до 3 седмици или колкото е необходимо. Например по-дълго лечение може да е желателно, когато се лекува сезонен ринит или сходно състояние. Това представлява значително преимущество пред понастоящем използваните инфузионни средства за лечение на IL4 медиирани разстройства. Дозата и продължението на лечението са свързани с присъствието на молекулите съгласно изобретението в циркулацията при човека, и могат да бъдат нагласявани от специалисти в зависимост от състоянието, което се лекува, и общото здравословно състояние на пациента.

Начинът на прилагане на терапевтичния агент на изобретението може да бъде всеки подходящ път, който доставя агента на пациента. Фузионните протеини, антителата, конструираните антитела и фрагментите от тях и фармацевтичните продукти на изобретението, са особено полезни за парентерално приложение, т.е. подкожно, интрамускулно, интравенозно или интраназално.

Терапевтичните агенти съгласно изобретението могат да се приготвят като фармацевтични продукти, съдържащи ефективно количество от конструираното (т.е. хуманизирано) антитяло на изобретението като активна съставка във фармацевтично приемлив носител. В профилактичните агенти съгласно изобретението, се използва водна суспензия или разтвор, съдържащ конструираното антитяло, за предпочитане буфериран при физиологично pH, готов за инжектиране. Композицията за парентерално прилагане обикновено се състои от разтвор на конструираното антитяло съгласно изобретението или коктейл от него, разтворен във фармацевтично приемлив носител, обикновено во ден носител. Могат да се използват варианти на водни носители, например 0,4% разтвор на натриев хлорид, 0,3% глицин и сходни. Тези разтвори са стерилни и обикновено не съдържат твърди частици. Разтворите могат да се стерилизират с конвенционални, добре познати стерилизационни техники (напр. филтрация). Продуктите могат да съдържат фармацевтично приемливи добавъчни субстанции, според изискванията на физиологичните условия, като вещества, нагласящи pH, буфериращи агенти и т.н. Концентрацията на антитялото на изобретението в такива фармацевтични форми може да варира широко, т.е. от помалко от 0,5, обикновено поне 1, до 15-20% тегл. и може да се избира съгласно обема на течността, вискозитета и т.н. съгласно избрания метод на прилагане.

Така, фармацевтичните продукти съгласно изобретението за интрамускулно инжектиране могат да бъдат приготвени да съдържат 1 ml стерилна буферирана вода и в нея от 1 до 100 mg, т.е. около 50 до 30 mg или за предпочитане от около 5 до 25 mg от конструираното антитяло съгласно изобретението. Сходно, фармацевтичните препарати от изобретението за интравенозно инжектиране могат да съдържат до 250 ml разтвор на Рингер и от 1 до 30 или за предпочитане 5 до 25 mg от конструираното антитяло от изобретението. Актуални методи за приготвяне на парентерално приложими композиции са познати на специалистите и са описани по-детайлно в примерно Remington’s Pharmaceutical Science, 5^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Предпочита се терапевтичният агент на изобретението, когато е във фармацевтичен препарат, да бъде даден под формата на единици доза. Подходящата терапевтична доза може да се определи лесно от специалисти. За ефективно лечение на възпалителни заболявания при човека и животните една доза е приблизително 0,1 до 20 mg протеин или антитяло за 70 kg телесно тегло, която може да бъде приложена парентерално, за предпочитане интрамускулно. Такава доза може, ако е необходимо, да се повтори след определени интервали от време, според лекуващия лекар по време на възпалителния отговор.

Изобретението също съдържа приложението на IL4 фузионни протеини от изобретението, конкурентно или последователно с дру16 ги антитела или фузионни протеини, които се характеризират с анти-1Ь4 активност, като анти-туморен некротичен фактор или други фармацевтични съставки, съвместими с IL4 рецептор-свързващата способност на фузионните протеини на това изобретение. Такива други антитела са достъпни по търговски път или могат да бъдат оформени по методите, описани тук. Фузионните протеини и конструираните антитела на това изобретение могат да бъдат също така използвани в диагностични режими за определяне на IL4 медиирани разстройства или трасирайки успеха за лечение на такива разстройства. Като диагностични реагенти тези фузионни протеини могат да бъдат конвенционално белязани за използване чрез ELISA и други конвенционални методи за измерване нивата на IL4 в серума, плазмата или друга подходяща тъкан. Естеството на тези изследвания, в които се използват фузионните протеини, е конвенционално, и те не ограничават писаното тук.

Антителата, конструираните антитела и фрагментите от тях, описани тук, могат да бъдат лиофилизирани за съхранение и възстановени в подходящ носител преди употреба. С обикновени имуноглобулини е показано, че тази техника е ефективна и познатите лиофилизационни и възстановителни методи могат да се използват.

Следните примери илюстрират различните аспекти на това изобретение, включвайки конструирането на екземпляри от инженерни антитела и тяхната експресия в подходящи вектори и клетки-гостоприемници, които не ограничават обхвата на това изобретение. Всички аминокиселини са идентифицирани чрез конвенционалните три букви или чрез еднобуквен код. Всички необходими рестрикционни ензими, плазмиди и други реагенти и други материали се получават от търговски източници, ако не е написано друго. Всички основни клониращи свързвания - (лигатури) и други рекомбинантни ДНК методи са направени по Maniatis et al., цитиран по-горе, както и от неговото второ издание от Samlrook et al.

Пример 1. Получаване на моноклонално антитяло ЗВ9

А. Имунизационна процедура

Четири мишки (F1 хибриди на Balb/c и C57BL/6 се имунизират подкожно с 50 pg рекомбинантен Е. coli човешки IL4 в пълен адю вант на Freund и четири седмици по-късно се инжектират с 50 mg IL4 в непълен адювант на Freund. На базата на добър серумен титър на антитяло към IL4 едната мишка получава понататъшна имунизация с 200 mg IL4 (i.p. във физиологичен разтвор) на осмата седмица, два дни по-късно със 100 mg IL4 (i.p. във физиологичен разтвор) и два дни по-късно с 50 mg IL4 (i.p. във физиологичен разтвор). Два дни след последната имунизация се прави спленектомия.

В. Фузионна процедура и скринингова система

Мишите далачни клетки се използват, за да се получат хибридоми (чрез стандартни процедури, както е описано от Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), от които повече от 250 клона клетки се скринират за секреция на антитела към IL4, използвайки търговски достъпната BIAcore система и ELISA изследвания, както е описано по-долу, за свързване с IL4. Пет гнезда дават положителни резултати. Само един клон от мишите, ЗВ9, е силно положителен. Всички вторични клонове от ЗВ9 са положителни.

Пример 2. ELISA изследвания и афинитетни константи

A. ELISA

Скриниращото изследване, направено както следва, е оформено за измерване на афинитета към човешки IL4. За експеримента, една 96-гнездна плака, активирана с алдехид, се покрива с IL4 в концентрация 1 pg/ml, 100 pg/гнездо, 0,1М боратен буфер, pH 8,5 и се инкубира през нощта при стайна температура. Човешкият IL4 се свързва ковалентно с плаката. Разтворът на IL4 се изсмуква и неспецифичните места за свързване се блокират с 1 % говежди серумен албумин в TBS-буфер (50 mM Tris, 150 тМ NaCl, 1 тМ MgCl_2> 0,02% NaN₃, pH 7,4) за 60 min при 37°С. Следвайки това и всяка от следващите стъпки, плаката се измива четирикратно с миещ буфер (10 mM Tris, 150 тМ NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃, pH 7,4). После се прибавят 50 μί хибридомна среда (или пречистено ЗВ9 или Fab фрагменти) и 50 μί работен буфер (0,5% говежди γ-глобулин в TBS буфер) и плаките се инкубират за 60 min при 37°С. 100 μΙ биотинилирано анти-мишо антитяло се прибавят за гнездо в работен буфер и се инкубират както преди. 100 μΙ алкална фосфатаза, конюгирана със стрептавидин, се прибавя за гнездо и се инкубира 30 min при 37°С, 100 μΐ за гнездо ΡΝΡ субстрат се прибавят и се инкубира 30 min при 37°С.

Отчитанията се правят при дължина на вълната 405 nm. За експеримент 2 плаки, покрити със стрептавидин (100 μΐ/гнездо, 1 μg/ml във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) се инкубират до следващия ден при 4°С и се изследват както следва. Стрептавидиновият разтвор се аспирира, неспецифичните места на свързване се блокират с 1 % BSA в TBS буфер (60 min при 37°С). След това и всяка следваща стъпка плаките се мият 4 пъти с миещ буфер. 50 μΐ биотинилиран IL4 се прибавят с 50 μΐ работен буфер и се инкубират 30 min при 37°С.

След това се прибавят 50 μΐ пречистен ЗВ9 IgG или Fab фрагмент (или хибридомна среда) плюс 50 μΐ работен буфер и се инкубира 60 min при 37°С. 100 μΐ анти мишо-IgG, конюгирано с алкална фосфатаза, се прибавя и се инкубира 60 min при 37°С. 100 μΐ ΡΝΡ субстрат се прибавя и се инкубира 30 min при 37°С. Отчитането се провежда както по-горе.

В. Пресмятане на афинитета на ЗВ9 към IL4

Използвайки резултатите от експериментите, описани по-горе и сумирани както следва, се изчислява K_d за ЗВ9, както е описано от Beatty et al., J. Immunol. Methods, 100:173-179 (1987):

2(2[Ab*]-[Ab])

Ab* = концентрацията антитела, свързани c 150 ng/ml биотинилиран hIL4

Ab = концентрацията антитела, свързани c 300 ng/ml биотинилиран hIL4

Дисоциационната константа K_d се изчислява от връзката

N-Експеримент 1. ELISA изследване на покрити със стрептавидин 96-гаездни плаки (100 ng/гнездо).

K_d = 2,2 х 10¹⁰ Μ (ЗВ9 Fab).

Експеримент 2. ELISA изследване на покрити със стрептавидин 96-гнездни плаки (100 ng/гнездо).

K_d - 1,4 х 10 ^,β Μ (ЗВ9 IgG).

С. Специфичност

Моноклоналното антитяло ЗВ9 разпознава човешки IL4, но не разпознава говежди или миши IL4. Това се установява по следния начин. Провежда се ELISA изследване на 96гнездни плаки, покрити с анти-мишо IgG и след това блокирани с говежди серумен албумин, като във всяко гнездо има 50 μΐ ЗВ9 (100 ng/ml), 25 μΐ нехуманни IL4 и 25 μΐ 6hothh-IL4. Инкубират се 60 min при 37°С, следва миене, конюгирана със стрептавидин алкална фосфатаза и PNP.

Сходно се намира, че Mab 6А1 не разпознава говежди или миши IL4.

Пример 3. Хуманизирано антитяло

Хуманизираното антитяло се оформя така, че да съдържа миши ООК в човешка антитялова рамка. Хуманизпраната версия на IL4 специфично мишо антитяло ЗВ9 се приготвя чрез следните манипулации:

A. Клониране на кДНК кДНК клоновете са получени от тежки или леки вериги на ЗВ9 чрез мРНК, екстрахирана от ЗВ9 хибридомна клетъчна линия (пример 1), използвайки набор от Boehringer Mannheim. Праймери, специфични едновременно за мишата шарнирна област или за к-константната област, се използват за синтеза на първата верига.

к-верижният праймер е (последователност с идентифик. № 29): 5’-СТААСАСТСАТTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3’ у-верижният праймер е (последователност с идентифик. № 30): 5’-GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC-3’.

Двойноверижната кДНК се клонира директно в плазмидите pGEM7f+[Promega], които се трансформират в Е. coli DH5-a [Bethesda Research Labs].

B. Секвениране на ДНК

Секвенират се осем тежко- и един лековерижен кДНК клона от точка А. Резултатите от секвенирането на вариабилната област на тези клонове са показани в последователности с идентификационни №№: 1, 2,3 и 4. Всеки клон съдържа консервативни аминокиселини, които се намират между мишата тежко- или лековерижна вариабилна област и мишите сигнални последователности. ООК на аминокиселинните последователности са изброени по-долу. ООК за тежката верига са последователности с идентификационни №№: 22, 24 и 26 (аминокиселини 50-56, 71-86 и 119-129 на последователност с идентификационен № 4). Вж фиг. 2. Тези секвенции се кодират от последователности с идентификационни №№: 21, 23 и 25 респективно. ООК за леката верига са последователности с идентификационни №№: 16,18 и 20 (аминокиселини 45-58. 74-80 и 113-121 на последователност с идентификационен № 2). Вж фиг. 1. Тези секвенции се кодират от последователности с идентификационни №№: 15, 17 и 19 респективно.

С. Селекция на човешките рамкови участъци (области).

След клонирането на ЗВ9 аминокиселинните последователности на вариабилната област (аминокиселини 21-132 на последователност с идентификационен № 2 и аминокиселини 20-140 на последователност с идентификационен № 4) се сравняват с човешките имуноглобулинови последователности от базата данни, използвайки KABAT^R и SWISS, за да се идентифицира човешката рамкова област за леката и тежка верига, която най-тясно ще съвпадне с мишия родител по хомоложност на последователностите. В прибавка на това търсене за хомоложност на последователностите, тежката и лека вериги също се изследват срещу позиционни базови данни, получени от структурни модели на Fab домена, за да се преценят потенциални конфликти, дължащи се на аминокиселинни замествания, които могат да повлияят ООК. В настоящия случай такива очевидни конфликти не са отбелязани, следователно, кодиращата ДНК съгласно дедукция с аминокиселинната последователност може да се използва.

Използват се тежковерижните рамкови области на дадено антитяло, получено от човешки миеломен имуноглобулин (COR) [Е. М. Press и Ν. М. Hogg, Biochem. J„ 117:641-660 (1970)]. Намерено е, че тази последователност е близо 77% хомоложна (69,4% идентичност) на вариабилната област на ЗВ9 на аминокиселинно ниво. За подходяща лековерижна рамкова област се използва лековерижната рамкова последователност на антитялото, идентифицирано в Н. G. Klobeck et al., Nucl. Acids Res., 13:65156529 (1985). Установено е, че човешката антитялова последователност е приблизително 80,2% хомоложна (72,0% идентичност) на вариабилната лековерижна област на аминокиселинно ниво.

Давайки мишите ЗВ9 ООК [(последователност с идентификационни №№: 15-26] и последователностите на човешкото антитяло, е получена синтетична тежка верига и се прилага PCR, за да се запълни и умножи ДНК. Тези последователности се синтезират чрез следните препокриващи се нуклеотиди и се умножават с PCR.

Последователности с идентификационни №№: 31-37 осигуряват пет препокриващи се олигонуклеотиди и два PCR праймера. Олиго (нуклеотидна) 1 (последователност с идентификационен № 31) е намерено, че се простира от бази 5 до 121. Олиго 2 (последователност с идентификационен № 32) обхваща бази 122-241, а олиго 3 (последователност с идентификационен № 33) обхваща бази 242-361. Двата праймера на долния край на веригата (последователност с идентификационен № 34 и последователност с идентификационен № 35) обхващат бази 134-110 и 253-230. Всяка грешка в картираните субстанции, получена вследствие PCR, е коригирана. PCR отново се провежда, използвайки 5’ праймерни нуклеотиди 1-25 (последователност с идентификационен № 36) и 3’ праймерни нуклеотиди 361-341 (последователност с идентификационен № 37). Синтетичната вариабилна област се лигира в експресионен вектор pCD по дължината със синтетичната сигнална последователност (последователност с идентификационни №№ 5 и 6) от химерната тежковерижна конструкция с IgGl човешка константна област. Синтетичната V_H и сигналните нуклеотидна и аминокиселинна последователност са дадени на фиг. 4: (последователност с идентификационни №№ 11 и 12). Аминокиселинните последователности на ООК (последователности с идентификационни №№ 22, 24 и 26) са идентични на мишите ЗВ9 ООК. Обаче кодиращите последователности за тези ООК (последователности с идентификационни №№ 54, 55 и 56) се различават от мишите последователности, кодиращи ЗВ9 (последователности с идентификационни №№ 21,23 и 25). Резултантният експресионен вектор IL4zhcl -1 Ped е показан на фиг. 9.

ООК областите на предварително съществуващата рамкова област са подложени на смилане с рестриктази и заменени със следните синтетични IL4 ООК гени, получени по изкуствен начин.

За ООК 1:

Последователност с идентификационен № 38: 5’ CTAGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGG3’

Последователност с идентификационен № 39: (ITIOCAGnGAlGGIOGCIinCIOTXCAGAGACAC^G

Последователност с идентификационен Νθ 40: TCGAGAGGCCTCCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAGCAGAAACCC

Последователност с идентификационен № 41: GGGTTTCTGCTGATACCAGTTCATATAACTATCACCATCATAATCAACACTTTGGGAGGCCTC

За ООК 2:

Последователност с идентификационен № 44: GGGCAGCCTCCTAAGTTGCrCATTTACGCTGCATCCAATCTAGAA TCTGGGGTAC

Последователност с идентификационен № 45: CCCAGATTCTAGATTGGATGCAGCGTAAATGAGCAACTTAGGAGGCTGCCC

За ООК 3:

Последователност с идентификационен № 42: ATACTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCCGAGGTTCGGCGGAGGGAC

Последователност с идентификационен № 43: CTTGGTCCCTCCGCCGAACCTCGGAGGATCCTCATTACTTTGCTGACAGTAGT

Нуклеотидните и аминокиселинни последователности за синтетичните VL и сигнални секвенции са дадени на фиг. 5 (последователности с идентификационни №№ 13 и 14). Аминокиселинните последователности на първите две ООК (последователности с идентификационни №№ 16 и 18) са идентични за съответните миши ЗВ9 ООК. Обаче кодиращата последователност на първата ООК (последователност с идентификационен № 53) се различава от мишата ЗВ9 кодираща секвенция (последователност с идентификационен № 15). По-нататък в последната ООК се конструират два хуманизирани участъка от мишата ЗВ9 последователност. Единият (последователност с идентификационен № 28) се различава по една аминокиселина (последователност с идентификационен № 20) от нативната миша ЗВ9 секвенция. Последователност с идентификационен № 128 се кодира от последователност с идентификационен № 27. Синтетичната лековерижна вариабилна област се лигира в експресионния вектор по посоката на сигналната секвенция (последователности с идентификационни №№ 7 и 8). Един от получените експресионни вектори, IL4zhcl-0-Pcn, е даден на фиг. 10. Тези синтетични вариабилни последователности на лека та или тежка верига се използват в конструирането на хуманизирано антитяло.

Пример 4. Експресия на хуманизирано моноклонално антитяло в COS и СНО клетки.

Правят се субклонове на pUC18 за V_H, за да се прибави сигнална последователност от човешко антитяло (последователност с идентификационен № 5). За V_L pUC18 субклоновете се правят, за да се прибави сигнална секвенция (последователност с идентификационен №7).

Хуманизираната тежка верига, получена от IgGl изотип, проявява 89,3% хомоложност (83,4% идентичност) на аминокиселинно ниво с мишата тежка верига от ЗВ9. Тази синтетична V_H е осигурена в аминокиселини 20-141 на (последователности с идентификационни №№ 11 и 12).

Хуманизираната лека верига, човешка κ-верига показва 92,0% хомоложност (86,6% идентичност) с ЗВ9 на аминокиселинно ниво. Синтетичната V_L (аминокиселини 21-131 на последователности с идентификационни №№ 13 и 14) съдържа ЗВ9 ООК и е оформена и синтезирана, както е описано по-горе за синтетични тежки вериги.

ДНК фрагментите, съдържащи техния съответен сигнал, свързан към вариабилната област на тежката или лека верига, се включва в експресионни плазмиди, базиращи се на pUC 19 в клетка от бозайници, съдържащи CMW промотори и константни области на човешки тежка или лека верига на химера, получена в пример 5 по-долу чрез конвенциални методи (Maniatis et al., цитирано по-горе, за да се получат плазмидите и IL4hzhcl-l-Pcd (тежка верига) (фиг. 9) и IL4zhlcl-0-Pcn (лека верига) (фиг. 10). HZHC и HZLC се котрансфектират в COS клетките и супернатантите се изследват чрез ELISA, както е описано непосредствено по-горе за присъствие на хуманизирано антитяло след три и пет дни. Друго хуманизирано антитяло е конструирано с IgG4 изотип.

Посочените по-горе примери описват получаването на примерно конструирано антитяло. Сходни процедури могат да се следват за получаването на други конструирани антитела чрез използване на други анти-1Ь4 антитела (напр. 6А1-пример 7), получено по сходен начин.

Пример 5. Конструиране на химерно ан20 титяло

А. Химерната тежка верига се конструира чрез изолиране на миша вариабилна тежковерижна област от оригинално мишо Mab ЗВ9 като EcoRI-Bstll рестрикционен фрагмент. Ма- 5 лък ДНК олигомер е оформен и синтезиран за свързване на мишата вариабилна област с човешката IgGl константна област (Bstll-Apal): 5’ праймер: Последователност с идентификационен № 50: GTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGC 3’ праймер: Последователност с идентификационен №51: CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACG

Тези два фрагмента се лигират в плазмид pCD (вж фиг. 7) (обработен с EcoRI и Ара!), който вече кодира човешката IgGl константна област. Този клон не се експресира, следователно дивият тип 5’UTR и синалната последователност са отделени и пренесени с последователност с идентификационни №№ 5 и 6.

Тъй като няма удобно място за рестриктаза при 3’ края на сигналната последователност, се вмъква BstEll място (т.е. “мълчалива” мутация) чрез PCR. Използват се следните PCR праймери: 5’ праймер: Последователност с идентификационен № 48: 5’CAGGTTACCCTGAAAGAGTC3’ 3’ праймер: Последователност с идентификационен № 49: 5OAAGTAGTCCTTGACCAG3’

Рестрикционният фрагмент Bstll-PstI след това се изолира от този плазмид. Оформя се и се синтезира нова сигнална последователност и 5’ UTR, имащи EcoRI и BstEII краища. 5’ праймер: Последователност с идентификационен № 46: AATTCGAGGACGCCAGCACATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGCAG 3’ праймер: Последователност с идентификационен № 47: GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGAGCAACAGAGAAATGAAGACCTGGGTCTGCAACACCATGTTGCTGGCGTCCTCG

Химерната лека верига се конструира чрез използване на PCR техника към оригиналната миша ЗВ9 лека верига, която е клонирана в pGEM72f(+) [Promega]. Използваните праймери са търговски достъпните pUC18 универсален обратен праймер при 5’ края (EcoRI) и 3’ праймер, който придава Narl участък. [5’CATCTAGATGGCGCCGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGG ТСССЗ’ Последователност с идентификационен № 52], който се използва за фузиране на мишата вариабилна област към човешката константна област. Тази вариабилна област след това се лигира към експресионен вектор р CDN (EcoRI Narl) (фиг. 8), която вече съдържа човешка к-област.

Супернатантите на средата се събират на третия и на петия ден и се изследват с ELISA, както следва: ELISA плаки, покрити с 0,1 pg козе антитяло, специфично за Fc областта на човешките антитела. Супернатантите се прибавят за един час. Прибавя се хрянова пероксидаза, конюгирана с козе антитяло, специфично за целия човешки IgG. След това се прибавя пероксидазен субстрат АВТС (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) за 1 h. Отчита се експресията на химерното антитяло. Във втора ELISA супернатантата от COS клетки се свързва специфично към рекомбинантния човешки IL4 протеин. Този резултат потвърждава, че са клонирани гени, кодиращи антитяло, специфично за IL4.

В. От тази химерна тежка верига може също да се получи хуманизирана тежка верига. Хуманизираната тежка верига се оформя чрез вмъкване на миши ООК в човешка рамкова област. Избраната човешка рамка е, както е описано по-горе, най-хомоложната протеинова последователност от швейцарската колекция, базираща се на миша ЗВ9 V_H (аминокиселини 20-140 от последователност с идентификационен № 4). Тази хуманизирана последователност от тежката верига (EcoRI Apal) се получава синтетично и се провежда PCR, за да се запълни и умножи ДНК, както е описано по-горе. Тази синтетична вариабилна област се лигира върху експресионния вектор pCD (EcoRI Apal) заедно със синтетичната сигнална последователност с идентификационни №№ 5 и 6 от химерната тежковерижна конструкция и константната област от човешко IgG 1.

Сходно, хуманизирана лека верига може да се получи от химерна лека верига, както е описано за тежката верига. Този ген (EcoRV Narl) също се получава синтетично. Хуманизираната V_L се лигира в експресионния вектор pCN, изрязан с EcoRV Narl, заедно със сигналната последователност (EcoRV EcoRV). Експресионният вектор осигурява човешката к константна област.

Пример 6. Пречистване и термодинамика хуманизирани моноклонални антитела.

Пречистването на СНО експресирани химерни и хуманизирани ЗВ9 може да се постигне 5 с конвенционална протеин А (или G) афинитетна хроматография, следвана от йонообменна и молекулно-ситова хроматография. Сходни процеси успешно се използват за пречистване на други моноклонални антитела с чистота >95% (например към респираторен синцитиален вирус и малариен спорозоитен антиген).

Афинитетът и детайлната термодинамика на свързването на IL4 към хуманизирано ЗВ9 и мишо ЗВ9 (пример 1) се определят чрез титриране микрокалориметрично. Този метод измерва свързващите реакции чрез топлината на реакцията (вж Wiseman et al.. Anal. Biochem. 179:

131-137 (1989). Намерено е, че афинитетът на двете антитела е толкова голям, че не може да се измерва директно при околната температура. Изследвани са две положения: I) афинитетът е измерен при 60°С, където е достатъчно слаб, за да бъде измерен директно, и II) температурната зависимост от свързващата енталпия е измерена при 30-60°С. Заедно тези данни позволяват пресмятането на афинитета в голям температурен обхват, като се използва уравнението на Гибс-Хелмхолц. Обобщение от термодинамиката на свързване на IL4 с хуманизирани и миши ЗВ9 са представени на таблица 1. Основавайки се на промените в свободната енергия, енталпията, ентропията и топлинния капацитет на тези две моноклонални антитела, термодинамцките им на свързване не се различават.

Термодинамика на свързването на IL4 към хуманизирано и мишо ЗВ9 антитяло при pH 7,4, 150 mM NaCl и 25°С
МаЬ	К , пикомолове а	dG kcal/mol IL4	dH kcal/mol IL4	-TDS kcal/mol IL4	dC cal mol IL4/oK
Хуманизирано ЗВ9	11	-13,6 ± 0,6	-21,8 ± 2	8,2 ± 2,1	-580±160
Мишо ЗВ9	19	-13,3 ±0,6	-20,5 ± 1	7,2 ± 1,2	-660 ± 200

IL4 афинитетът за хуманизирано и мишо ЗВ9 антитяло се измерва четирикратно и двукратно, респективно.

Пример 7. Получаване и характеризиране на плъше моноклонално антитяло.

Mab 6А1, избрано за високоафинитетно свързване се получава от имунизиран плъх, като се използва същия имунизационен протокол, както е описано за мишка в пример 1. 6А1 се селекционира от хибридоми (специално хибридома 3426А11С1В9), получена от плъх, имунизиран с човешки IL4. K_d за 6А1 се изчислява, както е описано от Beatty et al., J. Immunol. Methods, 100: 173-179 (1987) и e 2 x 10'° M.

Хибридома 3426Al 1C1B9 е депозирана в Европейската колекция за животински клетъчни култури (ЕСАСС), Public Health Laboratory Service Cenntre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, United Kingdom, под № 93100620, и е приета като патентен депозит в съответствие с Договора от Будапеща от 1977 г., отнасящ се до депозита на микроорганизми за целите на патентните процедури.

Пример 8. Биологична активност на моноклоналнитеантитела: ЗВ9 (хуманизирано), ЗВ9 (мишо) и 6А1

Провеждат се следните изследвания, като се използва процедурата, описана по-долу.

A. Свързване към гликозилиран rhlL4

По-горе идентифицираните антитела се получават към негликозилиран рекомбинантен човешки IL4, произведен в Е. coli. Тъй като нативният човешки IL4 е гликозилиран, то важно е да се потвърди свързването към продукт, секретиран от клетъчна линия на бозайник. ЗВ9 се свързва еднакво добре към гликозилиран и негликозилиран рекомбинантен човешки IL4 и следователно не е насочен към епитоп, който е маскиран върху естествения човешки IL4.

B. Инхибиране на IL4 свързването към рецептор

Способността на ЗВ9 да инхибира свързването на IL4 към неговия рецептор е изучено с използването на ^l23I-rhIL4 свързващ се към клетъчна линия на гибон MLA [ATCC TIB201], която има приблизително по 6000 рецептора на клетка. MLA клетките се инкубират с ^1М1IL4 за 30 min при 37°С. Поглъщането на радиоактивността се определя в γ-брояч, след отделяне на клетките, свързали ^l2JI-IL4 чрез центрофугиране в маслен градиент. Неспецифичното свърз-ване се определя чрез инкубиране в сто-кратен моларен излишък на немаркиран IL4 [Park et al., J. Exp. Med. 166: 476488 (1987)1. IC_J0 стойността за немаркиран IL4 в това изпитване е 22 рМ, докато сумата от (прибавения) IL4 е 83 рМ. За интактното мишо (IgG) ЗВ9 IC_J0 е 63 рМ и 93 рМ за Fab фрагмента. При друга концентрация на IL4 (218 рМ), сумата за мишо (IgG) ЗВ9 е 109 рМ.

C. Инхибиране на лимфоцитната пролиферация

Използва се методът, описан от Spits et al., J. Immunol., 139: 1142-1147 (1987). Човешки лимфоцити от периферна кръв се инкубират за три дни с фитохемаглутинин (Т клетъчен митоген), за да се дезорганизира IL4 рецептора. Получените бластни клетки се стимулират след това три дни с IL4. Пролиферацията се измерва чрез включването на ³Н тимидин. В клетъчната пролиферация се измерва по метода на Callard et al., in Lymphokines and Interferons. A Practical Approach, Ch. 19, p. 345, модифициран както следва. Пречистени човешки тонзиларни В клетки се стимулират три дни с IL4 и имобилизирано анти-IgM. Пролиферацията се измерва чрез включването на ³Н тимидин.

ЗВ9 (мишо) инхибира инкорпорирането на ЗН тимидин в човешките Т лимфоцити, стимулирани с 133рМ IL4 и човешки тонзиларни В лимфоцити, стимулирани с 167 рМ IL4. IL2стимулирани Т лимфоцити не се повлияват. 1С₅₀ за инхибирането на Т клетъчната пролиферация е 30 рМ, а за В клетъчната пролиферация 103 рМ. Съответстващите стойности за Fab фрагмента на ЗВ9 (мишо) са 108 и 393 рМ.

D. Инхибиране на CD23 индукцията

CD23 е нискоафинитетен рецептор за IgE(FcERII) и се индуцира върху мембраната на почиващи В лимфоцити чрез ниски концентрации на IL4, като е необходимо условие за $ продукция на IgE. Пречистени човешки тонзиларни В клетки се стимулират за 2 дни с IL4. Процентът на клетките, експресиращи CD23 клетките, се определя чрез флоу-цитометрия (Defranceetal., J. Exp. Med. 165:1459-1467 (1987)). ЗВ9 (мишо) инхибира CD23 експресията върху човешки тонзиларни В лимфоцити, стимулирани с 8,3 рМ IL4 със стойност на IC50 от 136 рМ.

E. Инхибиране на IgE секрецията

За разлика от другите изследвания, където IL4 се прибавя в ЕС50 концентрации [Реге etal., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6880-6884 (1988), IgE секрецията се измерва в присъствието на концентрации от IL4, даващи максимална секреция, с цел да се редуцира променливостта, присъща на тази система. Т-клетъчната пролиферация се измерва както следва. Човешки лимфоцити от периферна кръв се инкубират с IL4 от 10 до 18, за предпочитане 12 дни. Концентрацията на IgE в супернатантата на културата се определя с ELISA.

IgE секрецията се инхибира от ЗВ9 (мишо) и Fab фрагмент от ЗВ9 в присъствието на 1,7 пМ IL4. даващ IC50 стойности от 1,9 и 5,0 пМ респективно. Експериментът се повтаря, използвайки по-ниска концентрация на IL4, 667 рМ, редуциращи стойността на IC50 до 0,65 пМ за ЗВ9 (мишо).

F. Резюме и интерпретация на данните

Моларните отношения на IL4 към различни антитела, изисквани за инхибиране на функцията 50% в биоизследвания, са дадени на таблица 2.

Таблица 2. Сравнителна активност на ЗВ9, 6А1 и хуманизирано ЗВ9 (IgGl и IgG4 варианти) в IL4 зависими биоизследвания
Изследване	IC50 (рМ) [обхват] п
	Мишо ЗВ9	Мишо ЗВ9 (Fab)	Плъше 6А1	Хуманизирано ЗВ9
	IgGl	IgG4*
RBA Т клетки В клетки CD23 индукция IgE синтеза	63 [17-109] 2 30 [10-40] 4 103 [79-120] 3 136[53-272] 4 658 [3701070] 6	93 108 393 216 1170	>5000 87 187 80 623	44 [30-56]3 47[10-80]3 333 54[35-83]3	40 79
		[412-833] 3

η - брой на проведените тестове * - IgG 1 и IgG4 вариантите са изследвани по различно време.

Във всички изследвания, с изключение на IgE секрецията, IL4 се прибавя в приблизително ED50 концентрации. Моларните отношения на антитялото към IL4, необходими за 50% инхибиране са сходни за хуманизирано ЗВ9, мишо ЗВ9 и 6А1 в две изследвания на лимфоцитната пролиферация, но са по-високи за хуманизирано ЗВ9 в изследването на CD23 индукцията. Последният метод е много чувствителен и изисква много ниско (ок. 5%) окупиране на рецепторите (Kruse et al., EMBO J. 12, 5121 1993) и както се вижда от резултатите, получени с мишо ЗВ9, дължащи се на вариации вътре в изследването. Сравнение на активностите на плъше 6А1 и мишо ЗВ9 антитела демонстрира сходен профил на функционално действие, но и един неочакван неуспех на 6а 1 да инхибира напълно свързването на радиойодиран IL4 към неговия рецептор. Радиойодираният IL4, използван в това изследване, се приема, че е йодиран в достъпния тирозинов остатък 124. Когато способността на 6А1 да инхибира експресията на CD23, индуцирана от небелязан или йодиран IL4 се сравнява, се вижда, че инхибирането е по-малко ефикасно срещу йодирания лиганд. Тези резултати показват, че 6А1 се свързва с IL4 в района на тирозиновия остатък 124, но не специфично с него.

Съгласно настоящите данни, 6А1 е неутрализиращо антитяло с висок афинитет, което се свързва с IL4 в област, много различна от тази на ЗВ9.

Пример 9. Фармакокинетика

Фармакокинетиката на човешкото ЗВ9 се изследва в мъжки плъхове от линия Sprague Dawley. Хуманизирано ЗВ9 се прилага на четири животни като iv компактна доза 1 mg/kg тегло. Събирането на кръв продължава 5 седмици след дозата. Концентрациите на хуманизирано ЗВ9 в човешка плазма се определят с ELISA, като се използва сандвичев метод с IL4/ античовешко IgG. Опитът се провежда така, че да се потвърди не само присъствието на циркулиращ човешки IgG, но също и неговата способност да се свързва към рекомбинантен човешки IL4.

Резултатите от това изследване са дадени в таблица 3.

Таблица 3

Фармакокинетика на хуманизирано ЗВ9 в мъжки плъхове от линия Sprague Dawley (доза: 1 mg/kg iv цяла)

	Clp (mL/h/kg)
Плъх 1	0,442
Плъх 2	0,655
Плъх 3	0,555
Плъх 4	0,447
Средно	0,525
Стандартно отклонение	0,101

Съкращението на фармакокинетичния параметър е следното: С1р проявен плазмен клирънс

Данните показват, че вариациите между отделните животни са относително малки и че изчистването на ЗВ9 от кръвната плазма изглежда има две фази. Забележимият плазмен клирънс е нисък (0,5 mL/h/kg). Полуживотът изглежда е 11 дни. Така фармакокинетичните характеристики на хуманизирано ЗВ9 антитяло от СНО клетки са съвместими с другите хуманизирани моноклонални антитела у плъхове. Дългият полуживот на хуманизираното ЗВ9 антитяло в плъхове също показва, че когато се приложи у хора, то вероятно ще бъде активно за продължителен период от време.

Многобройни вариации и модификации на настоящото изобретение се включени в погоре установените спецификации и се очаква да са очевидни за специалистите. Например човешките рамкови области или техни модификации. различни от тези, описани по-горе, могат да се използват при конструирането на хуманизирани антитела. Такива модификации и промени на съставките и процесите на настоящото изобретение се смята, че са включени в обхвата на патентните претенции, приложени тук.

Claims (38)

1. Патентни претенции

   1. Фузионен протеин, притежаващ свързваща специфичност за човешки интерлевкин4 (IL4), характеризиращ се с това, че включва области, определящи комплементарността (CDRs) и първи фузионен партньор, където първата тежка верига CDR притежава последователността ThrSerGlyMetGlyValSer (SEQ ID NO: 22), втората тежка верига CDR притежава последователността Hislle TyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer (SEQ ID NO: 24) и третата тежка верига CDR притежава последователността ArgGluThrValPheTyrTrpTyrPheAspVal (SEQ ID NO: 26); и първата лека верига CDR притежава последователността LysAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn (SEQ ID NO: 16), втората лека верига CDR притежава последователността AlaAlaSerAsnLeuGluSer (SEQ ID NO: 18) и третата лека верига CDR притежава последователността GlnGInSerAsnGluAspProProThr (SEQ ID NO: 20) или GlnGlnSerAsnGluAspProProArg (SEQ ID NO: 28)
2. 2. Фузионен протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че е оперативно свързан към втори фузионен партньор.
3. 3. Фузионен протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че нехуманното неутрализиращо моноклонално антитяло е избрано от групата, състояща се от ЗВ9 и 6А1.
4. 4. Фузионен протеин съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че вторият фузионен партньор съдържа всички или част от константните имуноглобулинови тежки или леки вериги или и двете.
5. 5. Фузионен протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че последователността на първия фузионен партньор е тежковерижна последователност от аминокиселини 21-50, 56-71, 88-119 и 131-141 от SEQ ID NO: 12.
6. 6. Фузионен протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че последователността на първия фузионен партньор е лековерижна последователност от аминокиселини 20-42, 58-72, 80-111 и 121-131 на SEQ ID NO: 14.
7. 7. Фузионен протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че аминокиселинните последователности на областите, определящи комплементарността за тежка верига, са:

   (a) ThrSerGlyMetGlvValSer: последователност с идентификационен № 22;

   (b) Hislle Tyr TrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: последователност с идентификационен № 24 или (c) ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: последователност с идентификационен № 26.
8. 8. Фузионен протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че аминокиселинните последователности на областите, определящи комплементарността за лека верига, са:

   (a) LeuAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAsp-

   SerTyrMetAsn: последователност с идентификационен № 16;

   (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: последователност с идентификационен № 18, или (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: последователност с идентификационен № 28.
9. 9. Фузионен протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че аминокиселинните последователности на областите, определящи комплементарността за лека верига, са:

   (a) LeuAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: последователност с идентификационен № 16;

   (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: последователност с идентификационен № 18, или (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: последователност с идентификационен № 20.
10. 10. Имуноглобулинова тежковерижна област, определяща комплементарността (ООК), характеризираща се с това, че аминокиселинната й последователност е избрана от групата, състояща се от:

    (a) ThrSerGlyMetGlyValSer: последователност с идентификационен № 22;

    (b) Hislle Tyr TrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: последователност c идентификационен № 24 или (c) ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: последователност с идентификационен № 26.
11. 11. Имуноглобулинова лековерижна област, определяща комплементарността (ООК), характеризираща се с това, че аминокиселинната й последователност е избрана от групата, състояща се от (a) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: последователност с идентификационен № 18;

    (b) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: последователност с идентификационен № 28 или (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: последователност с идентификационен № 20.
12. 12. Молекула нуклеинова киселина, кодираща област, определяща комплементарността (ООК) на имуноглобулинова тежка верига, характеризираща се с това, че аминокиселинната й последователност е избрана от групата, съдържаща:

    (a) ACT ТСТ GGT ATG GGT GTG AGC: последователност с идентификационен № 21;

    (b) САС АТТ ТАС TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AACCCATCCCTGAAGAGC: последователност с идентификационен № 23;

    (c) AGA GAG ACT GTG ТСТ ТАС TGG

    ТАС ТТС GAT GTC: последователност с идентификационен № 25;

    (d) ACC ТСС GGT ATG GGT GTT TCC: последователност с идентификационен № 54;

    (e) САС АТС ТАС TGG GAC GAC GAC AAA CGT ТАС AAC CCG AGC CTG ААА ТСС: последователност с идентификационен № 55 и (f) CGC GAA ACC GTT ТТС ТАС TGG ТАС ТТС GAC GTT: последователност с идентификационен № 56.
13. 13. Молекула нуклеинова*киселина, кодираща област, определяща комплементарността (ООК) на имуноглобулинова лека верига, характеризираща се с това, че аминокиселинната й последователност е избрана от групата, съдържаща:

    (a) AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG ААС: последователност с идентификационен № 15;

    (b) AAG GCC ТСС CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AGC: последователност с идентификационен № 53;

    (c) GCT GCA ТСС ААТ СТА GAA ТСТ: последователност с идентификационен № 17;

    (d) CAG CAA AGT ААТ GAG GAT CCT CCG ACG: последователност c идентификационен № 19;

    (e) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: последователност c идентификационен № 27.
14. 14. Хуманизирано антитяло, съдържащо тежка и лека верига, характеризиращо се с това, че притежава дисоциационна константа, равна или по-малка от 2 х ΙΟ¹⁰ М за човешки IL4, в което рамковите области на споменатите тежка и лека верига се получават от поне едно избрано човешко антитяло и аминокиселинните последователности на областите, определящи комплементарността на всяка от споменатите вериги, е получена от нечовешко неутрализиращо моноклонално антитяло, специфично за човешки IL4, характеризиращо се с дисоциационна константа, равна или по-малка от 2 х ΙΟ¹⁰ М за човешки IL4.
15. 15. Антитялото съгласно претенция 14. характеризиращо се с това, че е факултативно свързано към ефекторен агент, избран от група непротеинови молекули - носители, полистирен и пластмасови частички.
16. 16. Химерно антитяло, състоящо се от тежка и лека верига, характеризиращо се с дисоциационна константа, равна или по-малка от

    2 х 10 ^|0М за човешки IL4.
17. 17. Фармацевтичен продукт, характеризиращ се с това, че съдържа фузионния протеин от претенция 1 и фармацевтично приемлив носител.
18. 18. Метод за лечение на алергии и други състояния, свързани със свръхпродукция на IgE у човека, характеризиращ се с това, че включва етап на прилагането при нужда на ефективно количество от фузионния протеин, отговаряш на претенция 1.
19. 19. Изолирана нуклеиново киселинна последователност, характеризираща се с това. че е избрана от групата, състояща се от:

    (a) нуклеиново киселинна последователност, кодираща фузионния протеин, отговарящ на претенция 1;

    (b) нуклеиново киселинна последователност, комплементарна на (а);

    (c) нуклеиново киселинна последователност от 18 и повече нуклеотиди, способна да се хибридизира с (а) или (Ь) при строго определени условия и (d) фрагмент или аналог на (а), (Ь) или io. кодиращ протеин, който се характеризира с това, че има специфичност към човешки IL4; и факултативно съдържаща място за въздействие с рестрикционни ензими.
20. 20. Изолираната нуклеиново киселинна последователност съгласно претенция 19, характеризираща се с това, че последователността. кодираща фузионния протеин, включва нуклеиново киселинната последователност на фиг. 5: последователност с идентификационен № 13.
21. 21. Изолираната нуклеиново киселинна последователност съгласно претенция 19, характеризираща се с това, че последователността. кодираща фузионния протеин включва нуклеиново киселинната последователност на фиг. 4: последователност с идентификационен №11.
22. 22. Изолирана нуклеиново киселинна последователност, характеризираща се с това, че е избрана от групата, състояща се от:

    (a) нуклеиново киселинна последователност, кодираща област, определяща комплементарността (ООК), в която тази ООК е получена от неутрализиращо мишо моноклонално антитяло, специфично за човешки IL4, характеризиращо се с дисоциационна константа, равна или по-малка от 2 х ΙΟ'¹⁰ М;

    (b) нуклеиново киселинна последователност, комплементарна на (а);

    (c) нуклеиново киселинна последователност от 18 и повече нуклеотиди, способна да се хибридизира с (а) или (Ь) при строго определени условия и (d) фрагмент или аналог на (а), (Ь) или (с), който кодира протеин, характеризиращ се с това, че е специфичен за човешки IL4.
23. 23. Изолираната нуклеиново киселинна последователност съгласно претенция 22, характеризираща се с това, че е избрана от групата тежковерижни области, определящи комплементарността, съставена от:

    (a) ACT ТСТ GGT ATG GGT GTG AGC: последователност с идентификационен № 21;

    (b) САС АТТ ТАС TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AACCCATCCCTGAAGAGC: последователност с идентификационен № 23;

    (c) AGA GAG ACT GTG ТСТ ТАС TGG ТАС ТТС GAT GTC: последователност с идентификационен № 25;

    (d) ACC ТСС GGT ATG GGT GTT TCC: последователност c идентификационен № 54;

    (e) САС ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT ТАС AAC CCG AGC CTG AAA TCC: последователност c идентификационен № 55 и (f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT: последователност c идентификационен № 56.
24. 24. Изолираната нуклеиново киселинна последователност съгласно претенция 22, характеризираща се с това, че е избрана от групата лековерижни области, определящи комплементарността, съставена от:

    (a) AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG ААС: последователност с идентификационен № 15;

    (b) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AGC: последователност с идентификационен № 53;

    (c) GCT GCA TCC ААТ СТА GAA ТСТ: последователност с идентификационен № 17;

    (d) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: последователност c идентификационен № 19;

    (e) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: последователност c идентификационен № 27.
25. 25. Рекомбинантен плазмид, характеризиращ се с това, че включва нуклеиново киселинната последователност на претенция 19.
26. 26. Рекомбинантен плазмид, характеризиращ се с това, че включва нуклеиново кисе- линната последователност на претенция 22.
27. 27. Клетка-гостоприемник, трансфектирана с рекомбинантен плазмид от претенция 25.
28. 28. Клетка-гостоприемник, трансфектирана с рекомбинантен плазмид от претенция 26.
29. 29. Метод за получаване на хуманизирано антитяло, специфично за човешки интерлевкин-4, характеризиращ се с това, че включва култивиране на клетъчна линия, трансфектирана с рекомбинантния плазмид от претенция 25, под контрола на избрана регулаторна последователност, способна да направлява експресията му в дадената клетка.
30. 30. Метод за диагностициране на алергии и други състояния, свързани със свръхпродукция на IgE у човека, характеризиращ се с това, че проба от биологична течност с висок титър на моноклонални антитела за човешки IL4 влиза в контакт с изследван за наличие на свързване между казаното моноклонално антитяло и човешкия интерлевкин-4.
31. 31. Метод за скриниране на моноклонални антитела, имащи висок титър за човешки интерлевкин-4, който се характеризира със следното:

    (a) получаване на хибридомна клетъчна линия, характеризираща се със секретиране на моноклонално антитяло за човешки интерлевкин-4; и (b) скриниране на тази хибридомна клетъчна линия с куплиран с алдехид човешки интерлевкин-4 или биотинилиран човешки интерлевкин-4.
32. 32. Неутрализиращо моноклонално антитяло, имащо висок титър за човешки интерлевкин-4, Fab фрагмент или F (ab) 2 фрагмент от него, получено чрез скриниране на библиотека от хибридомни продукти с куплиран с алдехид човешки интерлевкин-4 или биотинилиран човешки интерлевкин-4.
33. 33. Неутрализиращо моноклонално антитяло от гризачи, специфично за интерлевкин-4 и характеризиращо се с дисоциационна константа, равна или по-малка от 2 х 10¹⁰ М.
34. 34. Моноклонално антитяло съгласно претенция 33, характеризиращо се с това, че посоченият гризач е мишка.
35. 35. Моноклонално антитяло съгласно претенция 34, характеризиращо се с това, че съдържа лековерижната аминокиселинна последователност с идентификационен № 2 и тежковерижната аминокиселинна последователност с идентификационен № 4.
36. 36. Моноклонално антитяло съгласно претенция 33, характеризиращо се с това, че посоченият гризач е плъх.
37. 37. Моноклонално антитяло съгласно претенция 36, характеризиращо се с това, че прите- жава идентификационна характеристика на 6А1
38. 38. Хибридома, притежаваща хибридизационните характеристики на клетъчна линия 3426А11С1В9.