RO116809B1 - Anticorp recombinant, monoclonal, compozitie farmaceutica si metoda de tratament cu aceasta - Google Patents
Anticorp recombinant, monoclonal, compozitie farmaceutica si metoda de tratament cu aceasta Download PDFInfo
- Publication number
- RO116809B1 RO116809B1 RO9600509A RO9600509A RO116809B1 RO 116809 B1 RO116809 B1 RO 116809B1 RO 9600509 A RO9600509 A RO 9600509A RO 9600509 A RO9600509 A RO 9600509A RO 116809 B1 RO116809 B1 RO 116809B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- human
- monoclonal
- sequence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 16
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 104
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 103
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 94
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 79
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 43
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 claims description 43
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 32
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 32
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 3
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 3
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims description 2
- NXDXECQFKHXHAM-HJGDQZAQSA-N Arg-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NXDXECQFKHXHAM-HJGDQZAQSA-N 0.000 claims description 2
- BWMMKQPATDUYKB-IHRRRGAJSA-N Arg-Tyr-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BWMMKQPATDUYKB-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 2
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- BKOIIURTQAJHAT-GUBZILKMSA-N Asp-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 BKOIIURTQAJHAT-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N Asp-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 2
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 claims description 2
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- JMEWFDUAFKVAAT-WDSKDSINSA-N Met-Asn Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O JMEWFDUAFKVAAT-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 2
- BMHIFARYXOJDLD-WPRPVWTQSA-N Met-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BMHIFARYXOJDLD-WPRPVWTQSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 2
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 claims description 2
- ZXLUWXWISXIFIX-ACZMJKKPSA-N Ser-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZXLUWXWISXIFIX-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 2
- UKKROEYWYIHWBD-ZKWXMUAHSA-N Ser-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UKKROEYWYIHWBD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 2
- SGAOHNPSEPVAFP-ZDLURKLDSA-N Thr-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SGAOHNPSEPVAFP-ZDLURKLDSA-N 0.000 claims description 2
- JWHOIHCOHMZSAR-QWRGUYRKSA-N Tyr-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JWHOIHCOHMZSAR-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims description 2
- NAHUCETZGZZSEX-IHPCNDPISA-N Tyr-Trp-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N NAHUCETZGZZSEX-IHPCNDPISA-N 0.000 claims description 2
- AIWLHFZYOUUJGB-UFYCRDLUSA-N Val-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AIWLHFZYOUUJGB-UFYCRDLUSA-N 0.000 claims description 2
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 claims description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 claims description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 claims description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 208000024711 extrinsic asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 claims description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims 2
- GQEXFCQNAJHJTI-IHPCNDPISA-N Trp-Phe-Asp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N GQEXFCQNAJHJTI-IHPCNDPISA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 32
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 100
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 57
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 43
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 43
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 37
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 36
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 11
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010027654 Allergic conditions Diseases 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100035923 4-aminobutyrate aminotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101001000686 Homo sapiens 4-aminobutyrate aminotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 2
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- WWJZWCUNLNYYAU-UHFFFAOYSA-N temephos Chemical compound C1=CC(OP(=S)(OC)OC)=CC=C1SC1=CC=C(OP(=S)(OC)OC)C=C1 WWJZWCUNLNYYAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000801195 Homo sapiens TLE family member 5 Proteins 0.000 description 1
- 241000282620 Hylobates sp. Species 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100232925 Mus musculus Il4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000036284 Rhinitis seasonal Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000032957 Seasonal conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- UIRVSEPRMWDVEW-RNXOBYDBSA-N Trp-Tyr-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)N UIRVSEPRMWDVEW-RNXOBYDBSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 101150014721 cdr gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000056245 human TLE5 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 150000002678 macrocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006213 negative regulation of lymphocyte proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- -1 promoters Proteins 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010911 splenectomy Methods 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Prezenta inventie se refera la un anticorp recombinant, monoclonal, in care regiunea variabila a lantului greu cuprinde, in ordine, prima regiune determinanta a complementaritatii avand secventa de aminoacizi prezentata in SECV NR.22, a doua regiune determinanta a complementaritatii avand secventa de aminoacizi prezentata in SECV NR.24, a treia regiune determinanta a complementaritatii avand secventa de aminoacizi prezentata in SECV NR.26, iar regiunea variabila a lantului usor cuprinde, in ordine, prima regiune determinanta a complementaritatii avand secventa de aminoacizi prezentata in SECVNR.16, a doua regiune determinanta a complementaritatii avand secventa de aminoacizi prezentata in SECV NR.18, a treia regiune determinanta a complementaritatii avand secventa de aminoacizi prezentata si SECV NR.20, la o compozitie farmaceutica cu acesta, si la o metoda de tratare a alergiilor si a altor conditii asociate cu producerea in exces a IgE la un om, folosind compozitia farmaceutica.
Description
Invenția se referă la un anticorp recombinant monoclonal, la o compoziție farmaceutică cu acesta și la o metodă de tratare a alergiilor și a altor condiții asociate cu producerea în exces a IgE la un om utilizată în tratamentul și diagnosticarea condițiilor mediate de IL4.
Este cunoscut din US 5041381 un anticorp monoclonal având specificitate de legare a interleukinei 4 umane.
Este, de asemenea, cunoscut că bolile alergice sunt relativ minore, cum ar fi, rinita și conjunctivita sezonieră, mai serioase, cum ar fi, astmul și dermatita atopică și periculoase pentru viață ca șocul anafilactic. Legat de aceste condiții este răspunsul io imun al corpului la alergeni, răspuns care implică producerea anticorpilor de imunoglobulină E (IgE) la indivizi predispuși genetic (atopi). Inhibarea producerii IgE a fost un țel îndelungat în imunoterapia bolii alergice prin folosirea vaccinurilor de desensibilizare. Totuși, în anii din urmă, siguranța și eficacitatea terapiei prin vaccinare a fost pusă sub semnul întrebării, dar dorința de a reduce nivelurile IgE nu a cunoscut 15 o scădere.
Interleukina 4 (IL4) este o proteină mediatoare din sistemul limfoid. Studiile limfocitelor de la indivizi atopici au arătat prezența unui număr mai mare de limfocite T capabile să secrete IL4 ca răspuns al stimulării și cantități mai mari de IL4 secretate după simulare.
Anticorpul anti-IL4 s-a dovedit că inhibă IgE, dar nu și IgG sau lgG2a (Finkelman și colab., Ann.Rev.lmmunol., 8:303 (1990)) și producerea de IL5 secretată de celulele T (Magg și colab., J.lmmunol. 148:2142(1992)). în plus, date recente sugerează că IL4 poate afecta acumularea eozinofilelor în țesuturi. Vezi, de exemplu, Tepper și colab., Cell, 62:457 (1990); Tepper și colab., Cell, 57:503(1989).
Rămâne ca o necesitate în domeniu, producerea unui antagonist IL4 de înaltă afinitate, care ar reduce inflamația eozinofilică, atât prin reducerea proliferării care secretă IL5, cât și prin inhibarea unui mecanism prin care eozinofilele se pot acumula în țesuturi și pot fi folosite pentru tratarea, prevenirea sau diagonisticul reacțiilor alergice.
Problema pe care o rezolvă invenția este de a obține un anticorp monoclonal recombinant, o compoziție farmaceutică și punerea la punct a unei metode de tratare a alergiilor și a altor condiții asociate cu producerea în exces IgE la un om.
Anticorpul monoclonal recombinant, conform invenției, este constituit din regiunea variabilă a lanțului greu care cuprinde în ordine, prima regiune determinantă 35 a complementarității având secvența Thr Ser Gly Met Gly Val Ser (SECV NR. 22), a doua regiune determinantă a complementarității având secvența His lle Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser (SECV NR. 24), a treia regiune determinantă a complementarității având secvența Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val (SECV NR. 26); iar regiunea variabilă a lanțului ușor cuprinde, în ordine, prima 4 0 regiune determinantă a complementarității având secvența Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (SECV NR. 16), a doua regiune determinantă a complementarității având secvența Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (SECV NR. 18), a treia regiune determinantă a complementarității având secvența Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr (SECV NR. 20).
Compoziția farmaceutică, conform invenției, conține 0,5...20%, în greutate, anticorp monoclonal definit în revendicarea 1 și un purtător acceptabil farmaceutic.
RO 116809 Bl
Metoda de tratare a alergiilor și a altor condiții asociate cu producerea în exces a IgE la un om, conform invenției, constă în aceea că se administrează o compoziție farmaceutică definită în revendicarea 15, astfel, încât cantitatea de anticorp recombinant monoclonal definit în revendicarea 1, să fie cuprinsă, în intervalul 50 0,1...20 mg/70 kg corp, parenteral, de preferință, intramuscular, la un interval de timp cuprins, între 2 zile până la 3 săptămâni.
Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avanaje:
- reduce durata tratamentului în cazul tratării condițiilor alergice;
- moleculele purtător determină creșterea timpului de înjumătățire al 55 proteinelor de fuziune.
Invenția de față furnizează o proteină de fuziune care are afinitate de legare pentru interleukina-4 și care cuprinde regiuni care determină complementaritate (CDR1 ] derivată de la un anticorp de neutralizare non-uman (Mab) caracterizat printr-o disociere constantă, egală sau mai mică de 2 x 1Q1OM, pentru IL4 umană și un prim par- 60 tener de fuziune în care, cel puțin una și, de preferință, toate regiunile care determină complementaritatea (CDR-uri) ale primului partener de fuziune sunt înlocuite prin CDRuri de la anticorpul monoclonal non-uman (Mab). Anticorpul monoclonal de neutralizare non-uman poate fi ales dintr-un grup care constă din 3B9 și 6A1, așa cum este descris mai pe larg în descrierea detaliată. De preferință, proteina de fuziune este 65 legată funcțional la o a doua proteină de fuziune care cuprinde în totalitate sau parțial un lanț constant de imunoglobulină.
Invenția furnizează CDR-uri derivate de la anticorpi monoclonali de neutralizare non-umani (Mab) caracterizat printr-o disociere constantă, egală sau mai mică de 2 x 1O'10 M pentru IL4 umană și molecule de acid nucleic care codifică astfel de CDR- 70 uri.
Invenția asigură anticorpi umanizați care au, cel puțin una și, de preferință, șase regiuni care determină complementaritate (CDR-uri) derivate de la anticorpi monoclonali de neutralizare non-umani (Mab) caracterizați printr-o disociere constantă, egală sau mai mică de 2 x 1Ο·1°Μ pentru IL4 umană. 75 într-un alt aspect, este dat un anticorp himeric care conține regiuni constante ale lanțului greu și ușor uman și regiuni variabile ale lanțului greu și ușor derivate de la anticorpi monoclonali de neutralizare non-umani (MAb) caracterizați printr-o disociere constantă, egală sau mai mică de 2 x 1O'10 M și pentru IL4 umană.
Invenția asigură, de asemenea, o compoziție farmaceutică care conține una 8o (sau mai multe) dintre proteinele de fuziune sau MAb-uri (de exemplu, umanizați, himerici etc.) și un purtător acceptabil farmaceutic.
Invenția asigură o metodă pentru tratarea și/sau prevenirea condițiilor alergice la oameni prin administrarea la numiții oameni ai unei cantități eficiente din compoziția farmaceutică a invenției. 85
Invenția de față furnizează metode și componente utile în producerea proteinelor de fuziune recombinante, MAb-uri (de exemplu, umanizați, himerici, etc.), CDR-uri ale acestora, un Fab (fragment antigen bindidinol) sau F(ab)2 sau analog al acestora care este derivat de la anticorpi monoclonali de neutralizare non-umani (MAb), caracterizați printr-o disociere constantă, egală sau mai mică de 2 x 1Ο·1°Μ pentru IL4 90 uman. Aceste componente includ secvențe izolate de acid nucleic care recodifică, plasmizi recombinanți care conțin secvențele de acid nucleic sub controlul substanțelor
RO 116809 Bl reglatoare selectate capabile să orienteze expresia acestora în celule gazdă și celulele gazdă (de preferință, de la mamifere) transfectate cu plasmizii recombinând. Metoda de producere implică cultivarea unei linii de celule gazdă transfectate ale prezentei invenții în condiții, astfel, încât se exprimă un anticorp, de preferință, un anticorp umanizat în numitele celule și izolarea produsului exprimat din acestea.
Invenția prezintă și o metodă de diagnosticare a alergiilor și a altor condiții asociate cu producerea în exces a imunoglobulinei E la om, care cuprinde contactarea unei probe de fluid biologic cu proteinele de fuziune, MAb-uri (de exemplu, umanizați, himerici, etc.) și Fab-uri ale invenției de față și cercetarea pentru găsirea legării între numita proteină de fuziune, MAb sau Fab și interleukina-4 umană.
Invenția, asigură o metodă pentru căutarea anticorpilor monoclonali care au un titru ridicat pentru interleukina-4 umană care cuprinde: (a) prepararea unei linii celulare hibridomice, caracterizată prin secreția unui anticorp monoclonal față de interleukina-4 umană; și (b) cercetarea numitei linii celulare hibridomice cu interleukină-4 umană cuplată cu aldehidă sau interleukină-4 umană biotinilată. De preferință, linia celulară hibridomică este cercetată cu interleukină-4 umană biotinilată.
De asemenea, este asigurat un MAb de neutralizare care are afinitate ridicată pentru IL4, un fragment Fab sau un fragment F(ab’)2 al acestora, produs prin cercetarea unei bănci de produse ale hibridomului cu interleukină-4 umană cuplată aldehidă sau IL4 umană biotinilată.
Invenția de față asigură anticorpi monoclonali de neutralizare de rozătoare, specifici pentru interleukină-4 umană și care au afinitate de legare, caracterizați printro disociere constantă, egală cu sau mai mică cu 2 x 1Ο·1ΟΜ. Exemple de astfel de anticorpi monoclonali sunt MAb 3B9 murin și MAb, 6A1 de șobolan și alți MAb-uri având aceleași caracteristici de identificare (cu alte cuvinte, se leagă la același epitop (i) ca 3B9 sau 6A1 cu o specificitate pentru IL4 uman și o disociere constantă, egală sau mai mică decât circa 2 x 1Ο·1ΟΜ). Alt aspect al invenției este hibridomul 3426AIICIB9.
Invenția furnizează o diversitate de anticorpi, fragmente ale acestora și proteine de fuziune, în special, anticorpi umanizați, care se caracterizează prin specificitate de legare IL4 umană, activitate de neutralizare și afinitate înaltă pentru IL4 umană, așa cum s-a exemplificat cu MAb 3B9 murin sau MAb 6A1 de șobolan. Aceste produse sunt utile în terapie și compoziții farmaceutice pentru tratarea condițiilor alergice mediate IL4 și mediate IgE. Aceste produse sunt, de asemenea, utile în diagnosticarea condiției mediate IL4 prin măsurarea (de exemplu, prin ELISA) a nivelurilor endogene de IL4 aflate în circulație, la oameni.
“Proteina de fuziune se referă la o proteină codificată printr-o moleculă de fuziune, care poate fi obținută prin expresie într-o celulă gazdă aleasă. Asemenea proteine de fuziune sunt anticorpi obținuți prin inginerie genetică, de exemplu, anticorpi himeri - sau umanizați, sau anticorpi fragmentați cărora le lipsește o parte a regiunii constante de imunoglobulină, de exemplu, Fv, Fab, sau F(ab)a și alții asemenea.
“Moleculă de fuziune” se referă la o secvență de acid nucleic care codifică regiuni care determină complementaritatea (CDR-uri) față de o imunoglobulină nonumană care este inserată într-un prim partener de fuziune cuprinzând secvențele cadru variabil uman. Opțional, primul partener de fuziune este linkat operațional la un al doilea partener de fuziune.
RO 116809 Bl
140 “Primul partener de fuziune” se referă la o secvență de acid nucleic care codifică un cadru uman sau regiunea variabilă de imunoglobulină în care CDR-urile native (sau întâlnite în mod natural) sunt înlocuite prin CDR-uri ale anticorpului donor. Regiunea variabilă umană poate fi un lanț greu de imunoglobulină, un lanț ușor (sau ambele lanțuri), un analog sau fragmente funcționale ale acestora. Astfel de CDR-uri sau regiuni CDR, localizate în regiunea variabilă a anticorpilor (imunoglobuline) se pot determina prin metode cunoscute în domeniu. De exemplu, Kabat și colab., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Ediția a 4-a., U.S. Department of Health and Human Services, Național Institute of Health (1987)), descrie reguli pentru localizarea CDR-urilor. în plus, sunt cunoscute programe de calculator utile pentru identificarea regiunilor/structurilor CDR.
Termenul titru ridicat” se referă la un anticorp care are o afinitate de legare caracterizată printr-un Kd egal sau mai mic cu 2 x 1O10 M pentru IL4 umană.
Prin “specificitate de legare pentru IL4 umană” se înțelege un titru ridicat (sau afinitate) pentru IL4 umană, nu bovină sau murină.
“Al doilea partener de fuziune” se referă la altă secvență nucleotidică care codifică o proteină sau peptidă la care primul partener de fuziune este fuzionat în cadru prin intermediul unei secvențe linker opționale convenționale (altfel spus, lincată operațional). De preferință ea este o imunoblobulină. Cel de-al doilea partener de fuziune poate să includă o secvență de acid nucleic care același (adică, omolog - prima și a doua proteină de fuziune sunt derivate de la aceeași sursă) sau un anticorp de interes suplimentar (cu alte cuvinte, heterolog). El poate fi un lanț greu sau ușor de imunoblobulină (sau ambele lanțuri ca parte a unei polipeptide unice). Al doilea partener de fuziune nu este limitat la o clasă sau izotip particular de imunoglobulină. în plus, al doilea partener de fuziune poate cuprinde partea regiunii constante a unei imunoglobuline, cum este cea găsită într-un Fab sau F(ab)2 (cu alte cuvinte, o parte distinctă a unei regiuni constante umane, corespunzătoare, sau regiunea cadru). Al doilea partener de fuziune poate cuprinde, de asemenea, o secvență care codifică o proteină membranară expusă la exteriorul suprafeței unei celule gazdă, de exemplu, ca parte a unei bănci fagice prezente sau o secvență care codifică o proteină pentru detecție analitică sau diagnostic, de exemplu, peroxidază de hrean, ^galactozidază, etc.
Termenii Fv, Fc, Fab sau F(ab]2 sunt folosiți cu semnificațiile lor standard (vezi, de exemplu, Harlow și colab., Antibodies A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
Așa cum s-a folosit aici, un “anticorp prelucrat” descrie un tip de proteină de fuziune, cu alte cuvinte, un anticorp sintetic (de exemplu, un anticorp himeric sau umanizat) în care o porțiune a domeniilor variabile ale lanțului ușor și/sau greu ale unui acceptor ales sunt înlocuite prin părți analoage de la unul sau mai mulți anticorpi donori care au specificitate pentru epitopul ales. De exemplu, asemenea molecule pot include anticorpi caracterizați printr-un lanț greu umanizat asociat cu un lanț ușor nemodificat (sau lanț ușor himeric), sau vice versa. Anticorpii prelucrați prin inginerie genetică pot fi caracterizați, de asemenea, prin modificarea secvențelor de acid nucleic care codifică regiuni cadru ale domeniului variabil ușor și/sau greu ale anticorpului receptor în scopul păstrării specificității de legare a anticorpului donor. Acești anticorpi pot cuprinde înlocuirea unuia sau mai multor CDR-uri (de preferință, toate) de la anticorpul acceptor cu CDR-uri de la un anticorp donor descris aici.
145
150
155
160
165
170
175
180
RO 116809 Bl
Un “anticorp himeric” se referă la un tip de anticorp prelucrat care conține regiunea variabilă întâlnită în mod natural (lanț ușor și lanțuri grele) derivată de la un anticorp donor în asociere cu regiunile constante ale lanțului ușor și greu derivate de la un anticorp acceptor.
Un “anticorp umanizat” se referă la un tip de anticorp prelucrat care are CDRurile sale derivate de la o imunoglobulină donoare non-umană, părțile moleculei care nu sunt derivate de la aceea imunoglobulină fiind derivate de la una (sau mai multe) imunoglobuline umane. în plus, resturile cadrului suport pot fi modificate pentru a păstra afinitatea de legare (vezi, de exemplu, Quenn și colab., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86: 10029-10032(1989), Hodgson și colab., Bio/Technology, 9:421(1991)).
Termenul “anticorp donor”, se referă la un anticorp (policlonal, monoclonal, sau recombinant) care contribuie cu secvențe de acid nucleic ale regiunilor sale variabile, CDR-uri sau alte fragmente funcționale sau analogi ai acestora la un prim partener de fuziune, astfel, încât să asigure molecula de fuziune și proteina de fuziune exprimată care rezultă cu specificitatea antigenică și activitatea de neutralizare caracteristice anticorpului donor. Un anticorp donor potrivit pentru utilizare în această invenție este un anticorp monoclonal de neutralizare non-uman (adică murin) desemnat ca 389. Anticorpul 3B9 este definit ca specific IL4-uman cu titru înalt (cu alte cuvinte, nu recunoaște IL4 bovină sau murină), anticorp de neutralizare al izotipului lgGn având ADN-ul lanțului ușor variabil și secvențele aminoacide ale SECVID NR: 1 și 2 și ADN-ul lanțului greu variabil și secvențele aminoacide ale SECV ID Nr: 3 și 4 pe o regiune constantă corespunzătoare IgG murină.
Termenul “anticorp acceptor” se referă la un anticorp (policlonal, monoclonal sau recombinant) heterolog la anticorpul donor, care contribuie cu toate (sau unele porțiuni, de preferință, toate) ale secvențelor acidului nucleic care codifică regiunile cadru ale lanțurilor sale greu și/sau ușor și/sau regiunile sale constante ale lanțului său greu și/sau ușor la cel de-al doilea partener de fuziune. De preferință, un anticorp uman este anticorpul receptor.
“CDR-uri” sunt definite ca secvențele aminoacide a regiunii care determină complementaritate ale unui anticorp care sunt regiunile hipervariabile ale lanțurilor grele și ușor ale imunoglobulinei. Vezi, de exemplu, Kabat și colab., Sequences of Proteins of Immunological Ingterest, Ed.4, U.S. Department of Health and Human Services național Institutes of Health (1987). Există trei CDR-uri lanț greu și trei CDRuri lanț ușor (sau regiuni CDR) în porțiunea variabilă a unei imunoglobuline. Astfel, CDR-uri” așa cum s-au folosit aici se referă la toate cele trei CDR-uri lanț greu sau cele trei CDR-uri lanț ușor (sau la toate CDR-urile lanț ușor și lanț greu, dacă este corespunzător).
CDR-urile asigură majoritatea resturilor de contact pentru legarea anticorpului la antigen sau epitop. CDR-urile de interes din această invenție sunt derivate de la secvențele lanțului variabil greu și ușor ale anticorpului donor și includ analogi ai CDRurilor întâlnite în mod natural, analogi care, de asemenea, împărtășesc sau păstrează aceiași specificitate antigenică de legare și/sau capacitate de legare ca anticorpul donor de la care ei s-au derivat.
Prin ‘împărtășesc specificitate de legare antigenică sau capacitate de neutralizare” se înțelege, de exemplu, că deși MAb 3B9 poate fi caracterizat printr-un anumit nivel al afinității antigenice și un CDR codificat printr-o secvență de acid nucleic a 3B9
RO 116809 Bl într-un mediu structural corespunzător poate avea o afinitate mai scăzută sau mai ridicată, este de așteptat să recunoască totuși același epitop(i) ca 3B9. Exemple de CDR-uri lanț greu ale 3B9 includ SECVID NR: 22; SECV ID NR: 24; SECV ID NR: 26; și exemple de CDR-uri lanț ușor de 3B9 includ SECV ID NR: 16; SECV ID NR: 18 și SECV ID NR: 20.
Un “fragment funcțional” este o secvență parțial variabilă de lanț greu sau ușor (de exemplu, deleții minore la terminusul amino sau carboxi al regiunii variabile a imunoglobulinei], care păstrează aceiași specificitate de legare antigenică și/sau capacitate de neutralizare ca anticorpul de la care s-a derivat fragmentul.
Un “analog” este o secvență aminoacidă modificată prin cel puțin un aminoacid, în care numita modificare poate fi chimică sau o substituție sau o rearanjare a câtorva aminoacizi (altfel spus, nu mai mulți de 10), modificare care permite secvenței aminoacide să păstreze caracteristicile biologice, de exemplu, specificitatea antigenică și titru sau afinitate ridicată a secvenței nemodificată. De exemplu, mutațiile făcute pot fi interpretate prin intermediul substituțiilor în sensul de a crea situri de restricție endonucleazică în sau regiunile care înconjoară CDR.
Analogii pot, de asemenea, să apară ca variații alelice. 0 “variație sau modificare alelică” este o alterare în secvența de acid nucleic care codifică secvențele aminoacide sau peptidice ale invenției. Astfel de variații sau modificări pot fi datorate degenerescenței în cadrul genetic sau pot fi făcute deliberat prin inginerie pentru a asigura caracteristicile dorite. Aceste variații sau modificări pot sau nu pot avea ca urmare alterări în orice secvență aminoacidă. De exemplu, secvențele aminoacide ale CDR lanț ușor SECV ID NR: 16 sunt identice față de anticorpul murin 3B9 nativ sau umanizat. Cu toate acestea, această secvență CDR este codificată prin ambele SECV ID NR: 15 și SECV ID NR: 53. în mod similar, CDR cu SECV.ID NR: 22 este codificată prin SECV ID NR: 21 și SECV ID NR: 54; CDR cu SECV ID NR: 24 este codificată prin SECV ID NR: 23 și SECV ID NR: 55; și CDR cu SECV ID NR: 26 este codificată prin SECV ID NR: 25 și SECV ID NR:56.
Termenul “agenți efectori” se referă la molecule purtător neproteice la care proteinele de fuziune și/sau lanțul ușor sau greu natural sau sintetic al anticorpului donor sau alte fragmente ale anticorpului donor se pot asocia prin mijloace convenționale. Asemenea purtători neproteici pot include purtători convenționali folosiți în diagnosticare, de exemplu, polistiren sau alte bile de plastic, polizaharide, de exemplu, precum cei folosiți în sistemul BIAcore (Pharmacia), sau alte substanțe neproteice utile în domeniul medical și siguri pentru administrare la oameni și animale. Alți agenți efectori pot include un macrociclu pentru chelatizarea unui atom de metal greu sau radioizotopi. Asemenea agenți efectori pot fi utili, de asemenea, pentru creșterea timpului de înjumătățire al proteinelor de fuziune, de exemplu, polietilen glicolul.
Anticorpi monoclonali IL4 de înaltă afinitate
Pentru utilizarea în construcția anticorpilor, a fragmentelor și a proteinelor de fuziune ale acestei invenții, se poate folosi o specie non-umană (de exemplu, bovină, ovină, primată sau de la rozător (de exemplu, murină și de șobolan, etc.) pentru a genera imunoglobulina dorită cu înfățișare IL4 umană nativă sau un epitop peptidic al acesteia. Tehnicile hibridomice convenționale sunt folosite pentru a furniza o linie celulară hibrodomică care secreta un MAb non-uman față de IL4. Astfel de hibridomi sunt triați apoi folosind IL4 atașată covalent la plăci cu 96-godeuri sau alternativ cu IL4
235
240
245
250
255
260
265
270
275
RO 116809 Bl biotinilată pentru folosire într-un test de triere, așa cum este descris în detalii în exemplul 2 de mai jos. Astfel, unul din aspectele invenției de față este o metodă pentru detectarea MAb-urilor pentru IL4 umană în care sistemele de analiză evită denaturarea IL4. în asemenea manieră, s-a descoperit că pot fi detectați MAb-uri de titru ridicat (sau înaltă afinitate) pentru IL4 umană.
Ca exemplu, pentru prima oară este descrisă producerea unui MAb de neutralizare de titru ridicat de la donor murin. MAb 3B9, care este un anticorp (donor) murin de dorit pentru utilizare în dezvoltarea unui anticorp himeric sau umanizat, este descris în detaliu în exemplul 1 de mai jos. 3B9 MAb se caracterizează printr-o specificitate de legare antigenică pentru IL4 umană, cu un Kj mai mic de 2,0 x 1O10M (circa
I, 8 x 1O'1oM) pentru IL4. K^-ul pentru IL4 al unui fragment Fab al acestui 3B9 este mai mic decât circa 3x1CT10M. Epitopul acestui anticorp nu poate fi configurat la IL4 cu peptide lineare și plecând de la aceasta epitopul se consideră a fi legat la un epitop învecinat. Imaginea legării sugerează un sit de legare la regiunea buclă B-C (resturile 60 - 69) - helix C (resturile 70 - 93). Aceste regiuni se referă la desemnările hărții dată de Cook și colab., J.Mol.Bio., 218: 675 - 678 (1991), Walter și colab.,
J. Biol.Chem., 267:20371-20376 (1992), Wlodaver et al. FEBS Lett., 309: 59-64 (1992), Redfield și colab., Biochem., 30:11029-11035 (1991), Smith și colab., J.Mol.Bio., 224:899-904 (1992), Garrett și colab., (1992) și Powers și colab., Biochem., 31: 4334-4346 (1992) și Science, 256: 1673-1677(1992), încorporate aici ca referințe.
Alt anticorp donor dorit este MAb, 6A1 de șobolan. Producerea acestui MAb este dată mai jos în exemplul 7. Acest MAb se caracterizează ca fiind de izotip lgG2a și având o disociere constantă pentru IL4 mai mică de 2,0 x 1O10M (circa 1,6 x 10 10M). Ca și cu 3B9, epitopul țintă al acestui 6A1 nu se configurează cu peptide lineare IL4 și epitopul este considerat prin urmare a fi neînvecinat și tridensional. Imaginea legării la muteina IL4 și activitatea sa biologică indică legarea în regiunea helixului D a IL4 umană (resturile aminoacide 109 - 127), cel mai probabil în jurul tirozinei, la restul aminoacid numărul 124.
Această invenție nu este limitată la folosirea de 3B9 MAb, 6A1 MAb sau secvențele lor hipervariabile (CDR-uri). Oricare alți anticorpi IL4 de titru înalt corespunzător caracterizați printr-o disociere constantă, egală sau mai mică decât 2x1010M pentru IL4 umană și CDR-urile corespunzătoare anti-IL4 îi pot substitui pe aceștia. în descrierea care urmează unde anticorpul donor este identificat ca 3B9 sau 6A1, această desemnare este făcută numai pentru ilustrare și simplificarea descrierii.
Fragmente de anticorp
Invenția de față include, de asemenea, utilizarea fragmentelor Fab sau fragmentelor F(ab’)2 derivate de la MAb-uri direcționate împotriva IL4 umană. Aceste fragmente sunt utile in vivo, ca agenți protectori împotriva condițiilor mediate IL4 și IgE sau in vitro ca părți ale unui IL4 de diagnostic. Un fragment Fab conține în întregime lanțul ușor și porțiunea amino terminală a lanțului greu; un fragment F(ab')2 este format din două fragmente Fab legate prin punți disulfurice. MAb-uri 3B9, 6A1 și alți anticorpi similari de înaltă afinitate care leagă IL4, asigură surse de fragmente Fab și fragmente F(ab’)2 care pot fi obținute prin mijloace convenționale, de exemplu, clivarea MAb cu enzimele proteolitice adecvate, papaină și/sau pepsină sau prin metode recombinante. Aceste fragmente Fab și F(ab’)2 sunt utile ele însăle ca agenți
RO 116809 Bl terapeutici, profilactici sau de diagnostic și ca donori de secvențe care includ regiunile variabile și secvențele CDR utile în formarea anticorpilor recombinanți sau umanizați asemenea celor descriși aici.
Secvențe aminoacide și nucleotidice antHL4 de interes
MAb 3B9 sau alți anticorpi descriși mai sus pot aduce secvențe precum secvențe peptidice variabile ale lanțului greu și/sau ușor, secvențe cadru, secvențe CDR, fragmente funcționale și analogi ai acestora și secvențele de acid nucleic care le codifică, utile în desemnarea și obținerea diverselor proteine de fuziune (inclusiv anticorpi obținuți prin inginerie) care sunt caracterizați prin specificitate de legare antigenică a anticorpului donor.
Ca un exemplu, invenția de față asigură, astfel, secvențele lanțului variabil ușor și lanțului variabil greu de la anticorpul 3B9 IL4 murin și secvențe derivate de la acesta. Regiunea variabilă a lanțului greu al lui 3B9 este caracterizat prin resturile aminoacide 20 până la 140 ale SECV ID NR: 4. Regiunile CDR sunt indicate prin sublinierea din fig.2 și sunt date în SECV ID NR: 22; SECV ID NR.:24; și secv ID NR:26. Regiunea variabilă a clonei lanțului ușor a lui 3B9 se caracterizează prin resturile aminoacide 21 la 132 din fig. 1 (SECV ID NR:2). Regiunile CDR sunt de la resturile aminoacide 44-58 (SECV ID NR: 16); 74-80 (SECV ID NR: 18); și 113-121 (SECV ID NR: 20).
Sunt fuzionate regiunea variabilă a catenei grele himerice și secvențele nucleotidice semnal și aminoacide. Aceste secvențe sunt identice lanțului greu 3B9 cu excepția secvenței semnalului. Secvența semnal a lanțului greu himeric este dată de SECV ID NR: 5 și 6. Regiunile CDR sunt indicate prin sublinierea din fig.3 și sunt identice în secvența aminoacidă pentru-CDR-urile murine native (SECV ID NR: 21-26). Secvențele nucleotidice și aminoacide ale regiunii lanțului ușor himeric sunt identice secvențelor 3B9 nemodificate (resturile aminoacide 21-132 ale SECV ID NR: 2), folosind secvențele semnal naturale de șoareci (resturile aminoacide 1-20 ale SECV ID NR: 2).
O regiune variabilă a lanțului greu umanizat și secvențe semnal sunt ilustrate în fig.4 (SECV ID NR: 11 și 12). Secvența semnal este dată de asemenea, în SECV ID NR; 5 și 6. Alte secvențe semnal corespunzătoare, cunoscute pentru cel cu pregătire în domeniu, pot fi substituite pentru secvențele semnal exemplificate aici. Secvențele aminoacide CDR ale acestui construct himeric sunt date în SECV ID NR: 22 (codificată prin SECV ID NR:54), SECV ID NR: 24 (codificată prin SECV ID NR: 55) și SECV ID NR: 56 (codificată prin SECV ID NR:26).
Un exemplu de secvență variabilă de lanț ușor umanizat (sintetic) este ilustrat în fig.5 (SECV ID NR:13 și 14). Secvența semnal cuprinde resturile aminoacide 1 la 9 ale SECV ID NR:8. Secvențele CDR din această figură sunt desemnate prin subliniere și diferă de CDR-ul murin nativ printr-un singur aminoacid al SECV ID NR. 20. Astfel, CDR-urile lanțului ușor umanizat sunt furnizate prin SECV ID NR: 53 și 12, SECV ID NR: 17 și 18 și SECV ID NR:27 și 28. Această diferență este descrisă în detaliu în exemplul 3.
Secvențele de acid nucleic ale acestei invenții, sau fragmente ale acestora, care codifică lanțul ușor variabil și secvențe peptidice ale lanțului greu sunt folosite în formă nemodificată sau sunt sintetizate pentru a introduce modificări dorite, de exemplu, situri de restricție. Secvențe de acid nucleic, izolate de la cele întâlnite în
325
330
335
340
345
350
355
360
365
RO 116809 Bl mod natural sau alternativ, sintetice, care sunt derivate de la MAb 3B9 sau alți anticorpi IL4 doriți de titru înalt, pot conține opțional situri de restricție pentru a facilita inserarea sau ligarea într-o secvență de acid nucleic potrivită precum cea care codifică o regiune cadru de anticorp dorit, ligare cu CDR-uri mutate sau fuziunea cu o secvență de acid nucleic care codifică un al doilea partener selectat pentru fuziune.
Luând în considerare degenerescența codului genetic, pot fi construite diverse secvențe codificatoare care codifică secvențe aminoacide care codifică lanțul variabil greu și ușor și secvențe CDR ale invenției, precum și fragmente funcționale și analogii acestora care împărtășesc specificitatea antigenică a anticorpului donor. Secvențele izolate de acid nucleic ale acești invenții sau fragmente ale acestora, care codifică secvențe peptidice variabile ale lanțului sau CDR-uri se pot folosi pentru a produce proteine de fuziune, anticorpi himerici sau umanizați sau alți anticorpi obținuți prin inginerie genetică ai acestei invenții când s-au combinat operațional cu un al doilea partener de fuziune.
Aceste secvențe sunt, de asemenea, utile pentru introducerea mutagenică a schimburilor specifice în secvențele de acid nucleic care codifică CDR-uri sau regiuni cadru și pentru încorporarea secvenței aminoacide modificate rezultate sau de fuziune într-un plasmid pentru expresie. De exemplu, substituțiile făcute în secvența nucleotidică a regiunilor care codifică cadrul și CDR s-au folosit pentru a crea situri de restricție enzimatică care au facilitat inserția regiunilor CDR mutate (și/sau cadru). Aceste regiuni CDR s-au folosit în construcția unui anticorp umanizat al acestei invenții.
Ar fi de remarcat că, în plus față de secvențele izolate de acid nucleic care codifică porțiuni ale proteinei de fuziune și anticorpii descriși aici, pot fi folosite alte astfel de secvențe de acid nucleic, cum ar fi, cele complementare la secvențe native. Secvențe ADN utile includ acele secvențe care hibridizează în condiții de hibridizare stringente (vezi, T.Marinatis și colab., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pp. 387 la 389) la secvențele ADN. Un exemplu, al unei astfel de condiție de hibridizare stringentă este hibridizarea 4 x SSC la 65°C, urmată de o spălare în 0,1 x SSC la 65°C pentru o oră. Alternativ, o condiție exemplificatoare de hibridizare stringentă este în 50% formamidă, 4 x SSC la 42°C. De preferință, aceste secvențe ADN hibridizate sunt ca mărime de cel puțin 18 nucleotide lungime, adică, aproximativ mărimea unui CDR.
Molecule de fuziune și proteine de fuziune
Molecule de fuziune pot codifica proteine de fuziune care includ anticorpii obținuți prin inginerie, precum anticorpii umanizați. 0 moleculă de fuziune dorită conține secvențe CDR care codifică peptide având specificitatea antigenică a unui anticorp IL4, de preferință, un anticorp de afinitate ridicată cum s-a asigurat prin prezenta invenție, inserat într-un prim partener de fuziune (un cadru uman sau regiunea variabilă a imunoglobulinei umane).
De preferință, primul partener de fuziune este linkat operațional la un al doilea partener de fuziune. Cel de-al doilea partener de fuziune este definit mai sus și poate include o secvență care codifică o a doua, regiune anticorp de interes, de exemplu, o regiune Fc. Așa-numiții al doilea partener de fuziune pot include, de asemenea, secvențe care codifică alte imunoglobuline la care regiunea constantă a lanțului ușor sau greu este fuzionată în cadru sau prin intermediul unei secvențe linker. Anticorpii
RO 116809 Bl obținuți prin inginerie genetică orientați împotriva fragmentelor funcționale sau analogilor IL4 pot fi desemnați pentru a provoca sporirea legării cu același anticorp.
Al doilea partener de fuziune poate fi asociat, de asemenea, cu agenți efectori cum s-a definit mai sus, incluzând molecule purtător neproteice, la care cel de-al doilea partener de fuziune poate fi linkat operațional prin mijloace convenționale.
Fuziunea sau linkajul dintre cei doi parteneri de fuziune de exemplu, secvențe anticorp și agentul efector, se pot face prin orice mijloace potrivite, de exemplu, prin legături convenționale covalente sau ionice, fuziuni de proteine sau linkeri reticulați hetero-bifuncționali, de exemplu, carbodiimidă, glutaraldehidă și alte asemenea. Asemenea tehnici sunt cunoscute în domeniu și sunt descrise în lucrări de chimie și biochimie convențională.
Suplimentar, în molecula de fuziune pot fi, de asemenea, construite secvențe linker convenționale care asigură, simplu, mărimea dorită a spațiului dintre al doilea partener de fuziune și agentul efector. De asemenea, astfel de linkeri sunt binecunoscuți celor cu pregătire în domeniu.
Pentru sporirea expresiei pot fi modificate suplimentar, secvențele semnal pentru moleculele invenției. Ca un exemplu, o proteină de fuziune dorită având o secvență aminoacidă a secvenței lanțului greu murin, care este identică lanțului variabil greu himeric (VH) din fig.2 (SECV ID NR:4), a avut peptida semnal originală înlocuită cu alte secvențe semnal (resturile aminoacide 1-20) (SECV ID NR: 6).
proteină de fuziune exemplificatoare, conține o peptidă variabilă a lanțului greu și/sau ușor sau secvența proteinei având specificitatea antigenică a MAb 3B9, de exemplu, lanțurile VH (resturile aminoacide 21-141 ale SECV ID NR: 9 și 10) și VL (resturile aminoacide 21-132 ale SECV ID NR: 1 și 2). 0 altă proteină de fuziune dorită a acestei invenții se caracterizează prin secvență aminoacidă care conține, cel puțin una și, de preferință, toate CDR-urile regiunii variabile ale lanțurilor grele și/sau ușoare ale moleculei anticorpului murin 3B9, secvențe care rămân fiind derivate de la o sursă umană sau un fragment funcțional sau un analog al acesteia. Vezi, de exemplu, regiunile VH și VL umanizate ale SECV ID NR: 11 și 12 și SECV ID NR: 13 și 14 (fig. 4 și 5).
într-o altă realizare, anticorpul invenției obținut prin inginerie genetică poate avea atașat la el un agent suplimentar. De exemplu, poate fi folosită procedura tehnologiei ADN recombinant pentru a produce un anticorp prelucrat prin inginerie genetică conform din invenție în care fragmentul Fc sau domeniul CH3 al moleculei complete a anticorpului a fost înlocuit printr-o enzimă sau altă moleculă detectabilă (cu alte cuvinte, o polipeptidă efectoare sau moleculă raportoare).
Cel de-al doilea partener de fuziune poate, de asemenea, să fie linkat operațional la o peptidă non-imunoglobulină, proteină sau fragment al acestora, heterolog la secvența care conține CDR, având specificitatea antigenică a 3B9 murin. Proteina rezultată poate prezenta la expresie, atât specificitate antigenică anti-IL4, cât și caracteristicile non-imunoglobulinei. Aceea caracteristică a partenerului de fuziune, poate fi, de exemplu, o caracteristică funcțională, cum ar fi o altă legare sau un alt domeniu receptor, sau o caracteristică terapeutică dacă partenerul de fuziune este el însuși o proteină terapeutică sau caracteristici antigenice suplimentare.
altă proteină preferată a acestei invenții poate cuprinde o moleculă anticorp completă, având lanțurile greu și ușor de lungime întreagă sau orice fragment alcătuit
415
420
425
430
435
440
445
450
455
460
RO 116809 Bl din elemente diferite ale acestora, ca fragmente Fab sau F(ab’)2, un lanț greu dimer sau orice fragment recombinant al acestora precum Fv sau un anticorp monolanț (SCA) sau orice altă moleculă cu aceiași specificitate ca MAb donor ales, de exemplu, MAb 3B9 sau 6A1. Astfel de proteină poate fi folosită sub forma unei proteine de fuziune sau se poate folosi în forma sa nefuzionată.
De câte ori cel de-al doilea partener de fuziune este derivat de la alt anticorp, de exemplu, orice cadru de izotip sau clasă de imunoglobulină sau regiune constantă, rezultă un anticorp prelucrat prin inginerie. Anticorpii obținuți prin inginerie pot cuprinde regiuni constante de imunoglobulină (Ig) și regiuni cadru de la o sursă, de exemplu, anticorpul acceptor și una sau mai multe (de preferință, toate) CDR-urile de la anticorpul donor, de exemplu, anticorpul anti-IL4 descris aici. în plus, se pot face modificări, de exemplu, deleții, substituții sau adiții la nivelurile acidului nucleic sau aminoacizilor regiunii cadru a domeniului variabil ușor și/sau greu al MAb acceptor, sau regiunilor CDR donoare în scopul păstrării specificității de legare antigenice a anticorpului donor.
Asemenea anticorpi obținuți prin inginerie sunt desemnați să folosească unul (sau ambele) lanțuri variabile greu și/sau ușor ale MAb IL4 (opțional modificate cum s-a descris) sau unul sau mai multe CDR-uri ale lanțului greu sau ușor identificate în continuare (vezi, exemplul 3). Anticorpii obținuți prin inginerie ai invenției sunt de neutralizare, cu alte cuvinte, ei blochează legarea la receptorul proteinei IL4. De exemplu, anticorpul prelucrat prin inginerie genetică, derivat de la MAb 3B9 este orientat împotriva unui epitop proteină terțiară specific al IL4 umane, presupus a fi la regiunea buclă B-C - helix C, așa cum s-a descris mai sus.
Astfel de anticorpi prelucrați prin inginerie pot include un anticorp umanizat care conține regiunile cadru ale unei imunoglobuline umane alese sau subtip sau un anticorp himeric care conține regiuni constante ale lanțului greu și ușor uman fuzionat la fragmente funcționale de anticorp IL4. Un anticorp uman acceptor corespunzător (sau de alt animal) poate fi unul ales dintr-o bază de date convențională, de exemplu, KABAT*91 database, Los Alamos database și Swiss Protein database, prin omologie la secvențele nucleotidice și aminoacide ale anticorpului donor. Un anticorp uman caracterizat printr-o omologie la regiunile cadru ale anticorpului donor (pe baza unui aminoacid) poate fi adecvat pentru a furniza o regiune constantă a lanțului greu și/sau o regiune cadru variabilă a lanțului greu pentru inserarea CDR-urilor donorului. Un anticorp acceptor potrivit capabil să doneze regiuni constante ale catenei ușoare sau regiuni cadru variabile se poate alege în mod similar. Ar fi de remarcat că lanțurile grele și ușoare ale anticorpului acceptor nu este necesar să fie originare de la același anticorp acceptor.
Regiunile heteroloage constante și cadru dorite sunt alese de la clase și izotipuri de imunoglobulină umană, ca IgG (subtipurile 1 la 4), IgM, IgA și IgE. Cu toate acestea, anticorpul acceptor nu este nevoie să cuprindă numai secvențe proteice de imunoglobulină umană. De exemplu, poate fi construită o genă în care o secvență ADN care codifică partea lanțului de imunoglobulină umană este fuzionată la o secvență ADN care codifică o secvență aminoacidă non-imunoglobulinică, cum ar fi, o polipeptidă efectoare sau o moleculă raportoare.
Un exemplu al unui anticorp umanizat dorit în mod special conține CDR-uri ale lui 3B9 inserate pe regiunile cadru ale unei secvențe de anticorp uman ales. Pentru
RO 116809 Bl anticorpi umanizați de neutralizare, una, două sau de preferință, trei CDR-uri din regiunile variabile ale lanțului greu și/sau lanțului ușor ale anticorpului IL4 sunt inserate în regiunile cadru ale secvenței anticorpului uman ales, care înlocuiesc CDR-urile native ale ultimului anticorp.
De preferință, într-un anticorp umanizat, domeniile variabile în ambele lanțuri greu și ușor au fost modificate prin inginerie genetică prin una sau mai multe înlocuiri CDR. Este posibil să se folosească toate șase CDR-urile sau diverse combinații de mai puțin de șase CDR-uri. Este posibil să se înlocuiască CDR-uri numai în lanțul greu uman, folosind ca lanț ușor lanțul ușor nemodificat de la anticorpul uman acceptor. Ca alternativă, se poate selecta un lanț ușor compatibil de la alt anticorp uman recurgând la baze de date de anticorpi convenționali. Restul anticorpului modificat prin inginerie se poate deriva de la orice imunoglobulină umană acceptoare corespunzătoare.
Anticorpul umanizat modificat astfel prin inginerie are de preferință structura unui anticorp uman natural sau un fragment al acestuia și posedă combinarea proprietăților cerute pentru folosire terapeutică eficientă, de exemplu, tratamentul bolilor inflamatorii mediate de IL4 la om sau pentru utilizări în diagnostic.
Ca un alt exemplu, un anticorp modificat prin inginerie poate să conțină trei CDR-uri ale regiunii variabile a lanțului ușor al 3B9 (SECV ID NR: 16, 18, 20 și 28) și trei CDR-uri ale regiunii variabile a lanțului greu al lui 3B9 (SECV ID NR: 22, 24 și 26). Anticorpul umanizat rezultat este caracterizat prin specificitatea de legare antigenică și afinitatea înaltă a MAb 3B9.
Se va înțelege de către cei specializați în domeniu că un anticorp obținut prin inginerie poate fi modificat în continuare prin schimbări în aminoacizii domeniului variabil fără să se afecteze în mod necesar specificitatea și afinitatea ridicată a anticorpului donor (altfel spus, un analog). De exemplu, s-au construit anticorpi monoclonali umanizați în care restul aminoacid al lanțului ușor la poziția 120 a fost o arginină (SECV ID NR:13 și 14) sau treonină (SECV ID NR:57 și 58). Se anticipează ca aminoacizii lanțului greu și ușor pot fi substituiți prin alți aminoacizi, fie în cadrele domeniului variabil, fie în CDR-uri sau în ambele.
în plus, regiunea constantă poate fi modificată pentru a spori sau descrește selectiv proprietățile moleculelor invenției de față. De exemplu, dimerizarea, legarea la receptori Fc sau capacitatea de a lega și activa complementul (vezi, de exemplu, Angal și colab., Mol.lmmunnol., 30:105-108 (1993), Xu și colab., J.Biol.Chem., 269:3469-3474(1994), Winter și colab., EP 307434-B)
O proteină de fuziune care este un anticorp himeric diferă de anticorpii umanizați descriși mai sus prin asigurarea regiunilor variabile întregi ale lanțului greu și lanțului ușor ale anticorpului donor non-uman, care includ regiunile cadru, în asociere cu regiuni constante de imunoglobulină umană pentru ambele lanțuri. Se anticipează că anticorpii himerici care păstrează în plus secvența non-umană față de anticorpii umanizați ai acestei invenții pot provoca un răspuns imun considerabil la oameni.
Astfel de anticorpi sunt utili în prevenirea și tratamentul tulburărilor alergice mediate de IL4, așa cum s-a discutat mai sus.
510
515
520
525
530
535
540
545
RO 116809 Bl
Producerea proteinelor de fuziune și anticorpilor prelucrați prin inginerie genetică
De preferință, secvențele variabile ale lanțului ușor și/sau greu și CDR-urile MAb 3B9 (SECV ID NR:16, 18, 20, 22, 24 și 26) sau alți MAb-uri donori corespunzători (de exemplu, 6A1) și secvențele lor codificatoare de acid nucleic sunt utilizate în construcția proteinelor de fuziune și a anticorpilor prelucrați prin inginerie, de preferință, anticorpii umanizați ai acestei invenții, prin următorul procedeu. Aceleași tehnici sau tehnici similare se pot folosi, de asemenea, pentru a genera alte realizări ale acestei invenții.
Un hibridom care produce un MAb donor selectat, de exemplu, anticorpul murin 3B9, se donează convențional și se obține ADN-ul regiunilor variabile ale lanțului său greu și ușor prin tehnici cunoscute pentru un specialist în domeniu, de exemplu, tehnicile descrise în Sambrook și colab., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), ediția a-ll-a, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Regiunile variabile grea și ușoară ale lui 3B9 care conțin cel puțin CDR-urile și acele porțiuni ale regiunii domeniului cadrului ușor și/sau greu ale MAb acceptor necesare în vederea păstrării specificității de legare a MAb donor, precum și părțile derivate care rămân de la imunoglobulină ale lanțului anticorpului derivat de la o imunoglobulină umană se obțin folosind primeri polinucleotidici și revers transcriptaza. Sunt identificate CDR-urile folosind o bază de date cunoscută și prin comparație cu alți anticorpi.
Apoi, poate fi preparat un anticorp himeric șoarece/om și analizat pentru capacitatea de legare. Un astfel de anticorp himeric conține în întregime regiunile VH și VL ale anticorpului non-uman donor, în asociere cu regiuni Ig constante umane pentru ambele lanțuri.
Regiuni cadru omoloage ale unei regiuni variabile de lanț greu de la un anticorp uman s-au identificat folosind baze de date computerizate, de exemplu, «ABAT™ și s-a selectat ca anticorp acceptor, un anticorp uman având omologie la 3B9. Secvențele regiunilor variabile ale lanțului greu sintetic conținând CDR-uri 3B9 în cadrele anticorpului uman s-au desemnat cu înlocuiri nucleotidice opționale în regiunile cadru pentru a încorpora situri de restricție. Această secvență desemnată se sintetizează apoi prin oligonucleotide de suprapunere, se amplifică prin reacție polimerazică în lanț (PCR) și i se corectează erorile.
într-o manieră similară, s-a desemnat o regiune cadru variabilă corespunzătoare de lanț ușor.
De la anticorpul himeric poate fi derivat un anticorp umanizat sau, de preferință, făcut sintetic prin inserarea CDR-urilor MAb din lanțurile greu și ușor corespunzătoare în cadrul ales al lanțului greu și ușor. Alternativ, un anticorp umanizat al invenției poate fi preparat folosind tehnici standard de mutageneză, astfel, anticorpul umanizat rezultat conține regiunile cadru umane și CDR-uri MAb donoare. Acestea pot fi supuse ulterior manipulării resturilor cadrului. Anticorpul umanizat rezultat poate fi exprimat în celule gazdă recombinante, de exemplu, celule COS sau CHO. Detalii suplimentare ale acestei proceduri sunt furnizate în exemplul 4. Alți anticorpi umanizați pot fi preparați folosind această tehnică asupra altor anticorpi adecvați, nonumani specifici IL4, de neutralizare, de titru înalt.
Un vector de expresie convențional sau un plasmid recombinant se produce prin plasarea acestor secvențe de codificare pentru proteina de fuziune în asociere
RO 116809 Bl
600 operațională cu secvențe de control reglatoare convenționale capabile să controleze replicarea și expresia în, și/sau secreția dintr-o celulă gazdă. Secvențele reglatoare includ secvențe promotor, de exemplu, promotor CMV și secvențe semnal care pot fi derivate de la alți anticorpi cunoscuți. în mod similar, este produs un al doilea vector de expresie care are o secvență ADN care codifică un lanț complementar ușor sau greu de anticorp. De preferință, acest al doilea vector de expresie este identic primului cu excepții în măsura în care se poate ca secvențele codificatoare și markerii selectabili să fie implicați, astfel, încât să asigure cât mai mult posibil ca fiecare lanț polipeptidic să fie exprimat funcțional.
O celulă gazdă selectată este cotransfectată prin tehnici convenționale cu ambii vectori, primul și al doilea, sau este transfectată simplu printr-un vector unic pentru a crea celula gazdă transfectată a invenției care cuprinde ambele lanțuri ușor și greu recombinant sau sintetic. Celula transfectată se cultivă apoi prin tehnici convenționale pentru a produce anticorpul obținut prin inginerie genetică, din invenție. Anticorpul umanizat care include asocierea lanțului greu și/sau lanțul ușor, ambele recombinante, este triat din cultură printr-un test adecvat ca ELISA sau RIA. Tehnici convenționale similare se pot folosi pentru a construi alte proteine de fuziune și molecule ale acestei invenții.
Vectorii corespunzători pentru etapele de donare și subclonare folosite în metodele și construirea compozițiilor acestei invenții se pot alege de către un specialist în domeniu. Unul din vectorii folosiți este pUC19, care este accesibil comercial de la furnizori ca Amersham (Buckinghamshire, Regatul Unit] sau Pharmacia (Uppsala, Suedia). Suplimentar, poate fi folosit pentru donare orice vector care este capabil să se replice cu ușurință, are numeroase situsuri de donare și gene marker și este ușor de manipulat. Astfel, alegerea vectorului de donare nu este un factor limitativ în această invenție.
Similar, vectorii folosiți pentru expresia anticorpilor obținuți prin inginerie, conform acestei invenții, pot fi aleși de către specialistul în domeniu de la oricare dintre vectorii convenționali. Vectorii conțin, de asemenea, secvențe reglatoare selectate care sunt în asociere funcțională cu secvențele ADN care codifică regiunile imunoglobulinei și sunt capabile să orienteze replicarea și expresia secvențelor ADN heteroloage în celulele gazdă alese asemenea promotorilor CMV. Acești vectori conțin secvențele ADN descrise mai sus care codifică pentru anticorpul obținut prin inginerie sau molecula de fuziune. Alternativ, vectorii pot încorpora secvențe de imunoglobulină modificate prin încorporarea siturilor de restricție dorite pentru manipulare cu ușurință.
Vectorii de expresie se pot caracteriza, de asemenea, prin gene marker corespunzătoare pentru amplificarea expresiei secvențelor ADN heteroloage, de exemplu, gena dihidrofolat reductazei (DHFR) de la mamifere sau gena de rezistență la neomicină (neoR). Alte secvențe vector preferate includ o secvență semnal poliA, precum cea de la hormonul bovin de creștere (BGH) și secvența promotoare de betaglobină (betaglopro). Vectorii de expresie utili aici pot fi sintetizați prin tehnici bine cunoscute pentru cei cu pregătire în domeniu.
Componentele unor de vectori, de exemplu, repliconi, gene de selecție, intensificatori, promotori, secvențe semnal și altele asemenea, pot fi obținute din surse naturale sau se pot sintetiza prin proceduri cunoscute pentru folosire în orientarea
605
610
615
620
625
630
635
640
RO 116809 Bl expresiei și/sau secretarea produsului ADN-ului recombinant într-o gazdă aleasă. Alți vectori de expresie adecvați ale căror numeroase tipuri sunt cunoscute în domeniu pentru expresia în cazul mamiferelor, bacteriilor, insectelor, drojdiilor și fungilor pot fi, de asemenea, aleși pentru acest scop.
Prezenta invenție cuprinde, de asemenea, o linie celulară transfectată cu o plasmidă recombinantă care conține secvențele care codifică anticorpii prelucrați prin inginerie genetică sau moleculele de fuziune ale acestora. Celule gazdă utile pentru donare și alte manipulări ale acestor vectori de donare sunt, de asemenea, convenționale. Totuși, în cea mai mare parte celulele folosite pentru replicarea vectorilor de donare și alte etape din construcția proteinelor de fuziune ale acestei invenții sunt de la diverse tulpini E.coli.
Celule gazdă sau linii de celulele corespunzătoare pentru expresia anticorpului sau proteinei de fuziune din invenție sunt, de preferință, o celulă eucariotă ca CHO, COS, o celulă fibroblastică (de exemplu, 3T3) și printre altele celule mieloide și, cel mai preferat, o celulă de mamifer ca o celulă CHO sau o celulă mieloidă. Pot să fie folosite celule umane, aceasta făcând posibilă modificarea moleculei pentru a avea aspecte de glicozilare umane. Alternativ, pot fi folosite alte linii celulare eucariote. Selecția celulelor mamifere gazdă potrivite și metode pentru transformare, cultură, amplificare, trierea și producerea produsului ca și de purificarea acestuia, sunt cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, Sambrook și colab., citat mai sus.
Celulele bacteriene se pot dovedi utile pentru expresia MAb-urilor recombinante ale prezentei invenții. Totuși, datorită tendinței proteinelor exprimate în celulele bacteriene de a fi într-o formă desfășurată sau sub formă înfășurată necorespunzător sau sub formă neglicozilată, orice MAb recombinant produs într-o celulă bacteriană, va trebui să fie triat pentru menținerea capacității de legare antigenică. Dacă molecula exprimată de către celula bacteriană s-a produs într-o formă înfășurată corespunzător, acea celulă bacteriană va fi o gazdă dorită. De exemplu, diverse tulpini ale E.coli'folosite pentru expresie sunt binecunoscute ca celule gazdă în domeniul biotehnologiilor. Diverse tulpini ale B.subtilis, Spreptomyces, alți bacili și altele asemenea pot să fie folosiți la fel în această metodă.
Unde se dorește, tulpini ale celulelor de drojdie cunoscute pentru specialiștii în domeniu sunt, de asemenea, accesibile ca celule gazdă, precum și celulele de insecte, de exemplu, Drosophila și Lepidoptere și sisteme de expresie virală. Vezi, de exemplu, Miller și colab., Genetic engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986) și referințele citate aici.
Metodele generale prin care pot fi construiți vectorii invenției, metodele de transfecție necesare pentru a produce celulele gazdă ale invenției și metodele de cultură necesare pentru producerea proteinei de fuziune sau anticorpului prelucrat prin inginerie ale invenției din astfel de celule gazdă, sunt toate tehnici convenționale. De asemenea, o dată produse, proteinele de fuziune sau anticorpii invenției se pot purifica din conținuturile culturii celulare, conform procedurilor standard din domeniul incluzând precipitare cu sulfat de amoniu, coloane de afinitate, cromatografie în coloană, electroforeză în gel și altele asemenea. Asemenea tehnici sunt în stadiul anterior al tehnicii și nu limitează această invenție.
încă o altă metodă de expresie a anticorpilor umanizați poate utiliza expresia într-un animal transgenic, precum cel descris US 4873316. Acesta se referă la un
RO 116809 Bl sistem de expresie care folosește promotorul caseinei animalului care, atunci când se încorporează transgenic într-un mamifer permite femelei să producă proteina recombinantă dorită în laptele său.
O dată exprimat prin metoda dorită, anticorpul obținut prin inginerie se examinează pentru activitate in vitro folosind un test adecvat. Formatele test ELISA, în prezent convenționale, sunt folosite pentru a testa legarea calitativă și cantitativă a anticorpului obținut prin inginerie la un epitop IL4. Suplimentar, se pot folosi, de asemenea, alte teste in vitro, de exemplu, BIAcore (Pharmacia), pentru a verifica eficacitatea neutralizării înainte de studiile clinice umane realizate pentru evaluarea persistenței anticorpului în organism în ciuda mecanismelor obișnuite de epurare.
Urmând procedurile descrise pentru anticorpii umanizați preparați de la 3B9, un specialist în domeniu poate construi, de asemenea, anticorpi umanizați de la alți anticorpi donori IL4, secvențele regiunii variabile și peptidele CDR descrise aici. Anticorpii prelucrați pot fi produși cu cadrele regiunii variabile potențial recunoscute ca “seif” de către receptorii anticorpului prelucrat. Modificări minore la cadrele regiunii variabile pot fi introduse pentru a efectua creșteri mari în legarea antigenică fără o creștere apreciabilă a imunogenității pentru receptor. Astfel de anticorpi prelucrați pot trata eficient un om pentru condiții mediate de IL4. Astfel de anticorpi pot fi.de asemenea, utili în diagnosticarea unor asemenea condiții.
Utilizări terapeutice/profilactice
Această invenție se referă, de asemenea, la o metodă de tratare la oameni a unei tulburări alergice, care cuprinde administrarea unei doze eficiente de anticorpi incluzând unul sau mai mulți anticorpi sau proteine de fuziune descrise aici sau fragmente ale acestora.
Răspunsul terapeutic indus prin folosirea moleculelor acestei invenții se produce prin legare la IL4 umană și astfel blocarea ulterioară a eliberării IgE. Astfel, moleculele prezentei invenții în preparate și formulări corespunzătoare pentru folosire terapeutică sunt foarte necesare pentru acele persoane care prezintă un răspuns alergic, cum ar fi, rinită alergică, conjunctivite, dermatice atopice, astm atopic și șoc anafilactic.
Proteinele de fuziune, anticorpii, anticorpii prelucrați prin inginerie sau fragmentele acestora din această invenție se pot folosi, de asemenea, în legătură cu alți anticorpi în special MAb-uri umani reactivi cu alți markeri (epitopi) responsabili pentru condiția împotriva căreia este orientat anticorpul invenției. în mod similar, MAb-uri reactive cu epitopi responsabili pentru condiția asociată cu producerea în exces a IgG la un animal ales, împotriva căruia este direcționat anticorpul invenției, se pot folosi în compoziții veterinare.
Agenții terapeutici ai acestei invenții sunt considerați a fi necesari pentru tratamentul condițiilor alergice de la circa 2 zile până la circa 3 săptămâni sau, atât cât este nevoie. De exemplu, tratamente mai lungi pot fi necesare când se tratează rinita sezonieră și altele asemenea. Aceasta reprezintă un avans considerabil față de protocolul de infuzare folosit în mod obișnuit cu tratamentele anterioare ale tulburărilor mediate IL4. Doza și durata tratamentului este în legătură cu durata relativă a moleculelor prezentei invenții în circulația umană și poate fi corectată de către un specialist în domeniu în funcție de condiția de tratat și starea generală de sănătate a pacientului.
690
695
700
705
710
715
720
725
730
RO 116809 Bl
Modul de administrare al agentului terapeutic al invenției poate fi orice rută adecvată care eliberează agentul la gazdă. Proteinele de fuziune, anticorpii, anticorpii obținuți prin inginerie și fragmente ale acestora și compozițiile farmaceutice ale invenției sunt utile în mod deosebit pentru administrare parenterală, altfel spus, subcutanat, intramuscular, intravenos sau intranazal.
Agenții terapeutici ai invenției pot fi preparați sub formă de compoziții farmaceutice care conțin o cantitate eficientă a anticorpului (de exemplu, umanizat) obținut prin prelucrare în invenție, ca ingredient activ într-un purtător acceptalbil farmaceutic. Ca agent profilactic, al invenției, este preferată o suspensie sau soluție apoasă care conține anticorpul prelucrat, de preferință, tamponat la pH fiziologic, într-o formă gata pentru injectare. Compozițiile pentru administrare parenterală vor cuprinde de obicei, o soluție a anticorpului prelucrat al invenției sau un amestec al acestuia dizolvat într-un purtător acceptabil farmaceutic, de preferință, un purtător apos. Poate fi folosită o diversitate de purtători apoși, de exemplu, soluție salină 0,4%, glicină 0,3% și altele asemenea. Aceste soluții sunt sterile și în general, lipsite de material granulat. Aceste soluții se pot steriliza prin tehnici de sterilizare convenționale binecunoscute (de exemplu, filtrare). Compozițiile pot conține substanțe auxiliare acceptabile farmaceutic atât cât este necesar pentru aproximarea condițiilor fiziologice, cum ar fi, pentru ajustarea pH-ului, agenți de tamponare, etc. Concentrația anticorpului invenției într-o astfel de formulare farmaceutică poate varia larg, de la mai puțin de circa 0,5%,de obicei la sau la cel puțin circa 1 % până la 15 sau 20%, în greutate și se va alege pentru început pe baza volumelor de fluid, a viscozității, etc., conform modului particular de administrare ales.
Astfel, o compoziție farmaceutică pentru injectare intramusculară ar putea fi preparată pentru a conține 1 ml apă sterilă tamponată și .între circa 1 până la circa 100 mg, de exemplu, circa 50 până la circa 30 mg sau, mai preferat, circa 5 până la circa 25 mg din anticorpul prelucrat prin inginerie al invenției. în mod similar, o compoziție farmaceutică a invenției pentru infuzare intravenoasă ar putea fi făcută să conțină până la circa 250 ml soluție Ringer sterilă și circa 1 până la circa 30 și de preferință 5 mg până la circa 25 mg din anticorpul prelucrat prin inginerie al invenției. Metodele actuale pentru prepararea compozițiilor administrabile parenteral sunt bine cunoscute sau vor fi evidente pentru cel cu pregătire în domeniu și sunt descrise mai detaliat în, de exemplu, Remington’s Pharmaceutical Science, ediția a 15-a, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Este de preferat ca agentul terapeutic al invenției, când este prezent într-un preparat farmaceutic să fie prezent sub formă de unități dozate. Doza terapeutică eficientă corespunzătoare se poate determina ușor de către cei cu pregătire în domeniu. Pentru a trata eficient o tulburare inflamatoare la un om sau un animal s-ar putea administra o doză, de aproximativ 0,1 până la aproape 20 mg per 70 kg greutate corporală dintr-o proteină sau un anticorp al acestei invenții parenteral, de preferință, i.m. (intramuscular). Asemenea doză poate, dacă este necesar, să fie repetată la intervale de timp selectate ca adecvate de către medic.
Invenția cuprinde, de asemenea, administrarea proteinelor de fuziune IL4 ale acestei invenții în același timp sau secvențial cu alți anticorpi sau proteine de fuziune caracterizate prin activitate anti-IL4, cum ar fi, activitatea factorului antitumoral de necroză sau alte activități farmaceutice compatibile cu capacitate de legare la
RO 116809 Bl receptorul IL4 a proteinelor de fuziune ale acestei invenții. Asemenea alți anticorpi sunt accesibili comercial sau pot fi desemnați într-un mod similar celui descris aici.
Proteinele de fuziune și anticorpii prelucrați prin inginerie ai acestei invenții pot fi folosiți, de asemenea, în regimuri de diagnostic, cum ar fi, pentru determinarea tulburărilor mediate IL4 sau pentru urmărirea progresului tratamentului unor astfel de tulburări. Ca reactivi de diagonisticare, aceste proteine de fuziune pot fi marcate convențional pentru utilizare în ELISA și alte formate test convenționale pentru măsurarea nivelurilor IL4 în ser, plasmă sau alt țesut corespunzător. Natura testului în care sunt folosite proteinele de fuziune este convențională și nu limitează această descriere.
Anticorpii, anticorpii prelucrați prin inginerie sau fragmentele acestora descrise aici se pot liofiliza pentru depozitare și se pot reconstitui într-un purtător adecvat înaintea folosirii. Această tehnică s-a dovedit a fi eficientă pentru imunoglobuline convenționale și pot fi folosite tehnicile de liofilizare și reconstituire cunoscute în domeniu.
Următoarele exemple ilustrează diverse aspecte ale acestei invenții, incluzând construcția de anticorpi exemplificatori prelucrați prin inginerie și expresia acestora în vectori adecvați și celule gazdă și nu se vor interpreta ca limitând întinderea acestei invenții. Toți aminoacizii sunt identificați prin codurile convenționale de trei litere sau o singură literă. Toate enzimele de restricție necesare, plasmide și alți reactivi și materiale s-au obținut din surse comerciale în afara cazurilor unde s-a indicat în alt fel. Toate metodologiile de donare, ligare și alte aspecte ale ADN recombinant s-au realizat ca în T.Maniatis și colab.,citat mai sus, sau a doua ediție a acestuia (1989), editori Sembrook et al.
în continuare, se prezintă 9 exemple de realizare a invenției, în legătură și cu fig. 1...1O, care reprezintă:
-fig.1, (SECV ID NR: 1 și 2) ilustrează regiunea variabilă a lanțului ușor (aminoacizii 21-132) pentru anticorpul 3B9IL4 murin și anticorpul himeric uman/murin 3B9 precum și secvența semnal nativă (aminoacizii 1-20). Porțiunile subliniate indică CDRuri (SECV ID NR: 15 și 16; SECV ID NR: 17 și 18; și SECV ID Nr: 19 și 20);
- fig.2, (SECV ID NR: 3 și 4) ilustrează regiunea variabilă a lanțului greu (aminoacizii 20-140) ai 3B9 murin și secvența semnal nativă (aminoacizii 1-19). Porțiunile subliniate indică CDR-uri (SECV ID NR: 21 și 22; SECV ID NR: 23 și 24 și SECV ID NR: 25 și 26);
- fig.3, (SECV ID NR: 9 și 10) ilustrează regiunea variabilă a lanțului greu (aminoacizii 21-141) ai anticorpului himeric uman/murin 3B9 și secvența sa semnal (aminoacizii 1-19). SECV ID NR:5 și 6). Porțiunile subliniate indică CDR-urile derivate de la 3B9 (SECV ID NR: 21 și 22; SECV ID NR: 23 și 24 și SECV ID NR: 25 și 26);
- fig.4, (SECV ID NR: 11 și 12) ilustrează regiunea variabilă a lanțului greu (aminoacizii 20-141) ai anticorpului umanizat 3B9 și o secvență semnal (aminoacizii 1-19). SECV ID NR: 5 și 6). Porțiunile subliniate indică CDR-urile derivate de la 3B9 (SECV ID NR: 54 și 22; SECV ID NR: 55 și 24 și SECV ID NR: 56 și 26);
- fig.5, (SECV ID NR: 13 și 14) ilustrează regiunea variabilă a lanțului ușor (aminoacizii 21-131)ai anticorpului umanizat 3B9 și o secvență semnal (aminoacizii 120). SECV ID NR: 7 și 8). Porțiunile subliniate arată CDR-urile derivate de la 3B9 (SECV ID NR: 53 și 16; SECV ID NR: 17 și 18 și SECV ID NR: 27 și 28);
- fig.6A, (SECV ID NR: 5 și 6) este o secvență semnal a lanțului greu folosită în exemplul 4 de mai jos;
780
785
790
795
800
805
810
815
820
RO 116809 Bl
- fig.6B, (SECV ID NR: 7 și 8) este o secvență semnal a lanțului ușor folosită în exemplul 4 de mai jos;
- fig.7 este un desen schematic al plasmidei plL4chhc3-pcd folosit pentru a exprima un lanț greu himeric IL4 în celule de mamifere. Plasmida conține o genă betalactamază (BETA LAC), o origine a replicării SV-40(SV40), o secvență promotor citomegalovirus (CMV), o secvență semnal, lanțul greu variabil himeric al SECV.ID NR.: 9 și 10, o regiune constantă a lanțului greu uman, un semnal poli A de la hormonul de creștere bovin(BGH), un promotor beta-globină, (beta gloprol), o genă dihidrofolat reductaza (DHFR), o altă secvență semnal poli A de la hormonul de creștere bovin (BGH) ca fond într-un pUC19;
- fig.8, este o reprezentare schematică a plasmidului plL4chlc-pcdn folosit pentru a exprima regiunea variabilă a lanțului ușor himeric IL4 al SECV.ID NR.:1 și 2 în celule de mamifere. Plasmida diferă de cea din fig.7 prin faptul că ea conține o regiune variabilă a lanțului ușor himeric în locul lanțului greu himeric, o regiune constantă a lanțului ușor uman și o genă neomicină (Neo) în plus la DHFR;
- fig.9, este o reprezentare schematică a plasmidei plL4hzhc-1-pcd folosit pentru a exprima regiunea variabilă a lanțului greu IL4 sintetic al SECV.ID NR.:11 și 12 în celule de mamifere. Plasmida diferă de cea din fig.7 conținând mai degrabă regiunea variabilă a lanțului greu umanizat decât cea a lanțului greu himeric;
- fig. 10, este o reprezentare schematică a plasmidei plL4hzlcl-o-Pcn folosit pentru a exprima regiunea variabilă a lanțului ușor IL4 umanizat a SECV.IL NR.:13 și 14 în celule de mamifere. Plasmida diferă de cea din fig.8 conținând mai degrabă o regiune variabilă a lanțului ușor umanizat, decât lanțul ușor himeric și nu codifică gena DHFR.
Exemplul 1. Producerea de MAb 3B9
A. Procedura de imunizare
S-au imunizat 4 șoareci (hibrizi FI de Balb/c și C57BL/6) subcutanat cu 50 IL4 umană recombinantă E. coli în adjuvant Freunds complet și 4 săptămâni mai târziu s-a amplificat intraperitoneal (i.p.) cu 50 pg IL4 în adjuvant Freunds incomplet. Pe baza unui titru bun de anticorp seric față de IL4 un șoarece a primit ulterior imunizări de 200 pg IL4 (i.p. în ser fiziologic) la 8 săptămâni, 2 zile mai târziu cu 100 pg IL4 (i.p. în ser fiziologic) și două zile mai târziu cu 50 pg IL4 (i.p. în soluție salină). Două zile după imunizarea finală s-a realizat o splenectomie.
B. Procedura de fuziune și sistemul de căutare
S-au folosit celule splenice de șobolan pentru prepararea hibridomilor (prin proceduri standard, așa cum s-a descris, de exemplu, de către Kohler și colab., Nature, 256: 495 (1975)) de la care s-au triat mai mult de 250 clone de celule pentru secreția anticorpului față de IL4 folosind sistemul accesibil comercial BIAcore și teste ELISA, așa cum este descris mai jos pentru legare IL4. Cinci godeuri au dat un răspuns pozitiv. Numai 1 clonă de la șoareci, 3B9 a fost puternic pozitivă. Toate clonele secundare derivate de la 3B9 au fost pozitive.
Exemplul 2. Teste ELISA și constante de afinitate
A. ELISA
Testul de triere realizat,după cum urmează, a fost destinat să măsoare afinitatea pentru IL4 umană nativă. Pentru experimentul 1 plăci cu 96- godeuri activitate cu aldehidă s-au acoperit cu IL4 la un /zg/ml, 100 μΙ/godeu în tampon borat 0,1 M,
RO 116809 Bl
875 pH = 8,5 și s-au incubat peste noapte, la temperatura camerei hlL4 s-a atașat covalent pe placă. Soluția de IL4 s-a aspirat și siturile de legare nespecifică (NSB) s-au blocat cu 1% albumină serică bovină (BSA) în tampon TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCI, 1 mM MgC12, 0,02% NaN3, pH = 7,4), timp de 60 min, la 37°C. După aceasta și fiecare din etapele care urmează, placa s-a spălat de 4 ori în tampon de spălare (10 mM Tris, 150 mM NaCI, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN3, pH 7,4). După aceasta s-au adăugat 50 μ\ mediu de hibridom (sau 3B9 purificat sau fragmente Fab) și 50 μΙ tampon de testare (0,5% gam^globlulină bovină în tampon TBS) și plăcile s-au incubat 60 min, la 37°C. S-au adăugat 100 μΙ de anticorp antișoarece biotinilat per godeu în tampon de testare și s-a incubat ca mai sus. S-au adăugat 100 μΙ streptovidina conjugată cu fosfatază alcalină per godeu și s-au incubat (30 min, la 37°C). S-au adăugat 100 μΙ/godeu substrat PNP și s-a incubat 30 min,la 37°C). Citirile s-au făcut la o densitate optică de 405 nm.
Pentru experimentul 2, plăci acoperite cu streptavidină (100 μΙ/godeu, 1 μg/ml în ser fiziologic tamponat cu fosfat p25W0 (PBS) s-au incubat peste noapte, la 4°C și s-au analizat după cum urmează. Soluția de streptavidină s-a aspirat și situsuri NSB s-au blocat cu 1% BSA în tampon TBS (60 min, la 37°C). După această etapă și fiecare dintre etapele care urmează plăcile s-au spălat de 4 ori în tampon de spălare. S-au adăugat 50 μΙ IL4 biotinilată cu 50 μΙ tampon de testare și s-a incubat 30 min, la 37°C. După aceasta s-au adăugat 50 μΙ 3B9 IgG purificat sau fragment Fab (sau mediu de hibridom) plus 50 μΙ tampon de testare și s-au incubat 60 min,la 37qC. S-au adăugat 100 μΙ conjugat IgG anti-șoarece cu fosfatază alcalină și s-a incubat 60 min, la 37°C. S-au adăugat 100 μΙ substrat PNP și s-au incubat 30 min, la 37°C. Citirile s-au făcut ca mai sus.
B. Calcularea afinității lui 3B9 pentru IL4
Folosind rezultatele experimentelor descrise mai sus și rezumând după cum urmează, s-a calculat Kd pentru 3B9, așa cum s-a descris în Beatty și colab., J.lmmunnol. Methods, 100: 173-179(1987):
880
885
890
895
900 ann 2[2Ab*-Ab]
Ab* = concentrația de Ab legată la 150 ng/ml hlL4 biotinilată Ab = concentrația de Ab legată la 300 ng/ml hlL4 biotinilată Constantele de disociere, Kd, s-au calculat din relația:
905
Experiment 1: analiză ELISA pe o placă cu 96 godeuri acoperită cu streptavidină (100 ng/godeu). I^ = 2,2 x 1O10M(3B9 Fab);
Experiment 2: analiză ELISA pe o placă cu 96 godeuri acoperită cu streptavidină (100 ng/godeu). Kd = 1,4 x 1O10M(3B9 IgG).
C. Specificitate
MAb 3B9 recunoaște IL4 umană, dar nu recunoaște IL4 bovină sau murină. O cale pentru a determina aceasta este cea care urmează. S-a realizat o un test ELISA folosind o placă cu 96 godeuri acoperită cu IgG anti-șoarece și în continuare
910
915
RO 116809 Bl blocată cu albumină serică bovină pe care s-au incubat, 60 min, la 37°C, 50 μΙ 3B9 (100 ng/ml), 25 μΙ IL4 non-umană și 25 μΙ IL4-biotină, urmată de o spălare, fosfatază alcalină conjugată cu streptavidină și PNP.
în mod similar, MAb 6A1 s-a găsit a nu recunoaște IL4 bovină sau murină.
Exemplul 3. Anticorp umanizat
S-a desemnat un anticorp umanizat care să conțină CDR-uri murine într-un cadru de anticorp uman. Această versiune umanizată a anticorpului 3B9 de șoarece specific IL4 s-a preparat realizând următoarele manipulări.
A. Clonare cADN
S-au făcut clare CADN pentru lanțurile greu și ușor ale lui 3B9 din mARN extras din linia celulară hibridomică 3B9 (exemplul 1) folosind o trusă Boehringer Mannheim. Pentru sinteza primei catene s-au folosit primeri specifici, fie pentru regiunea balama de la șoarece, fie pentru regiunea constantă Kappa.
Primerul lanțului kappa este (SECV ID NR: 29):
5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3’
Primerul lanțului greu gamma este (SECV ID NR: 30):
5'-GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC-3'
S-a donat cADN-ul dublu catenar direct în plasmide pGEM7f+(Promega) care apoi s-au transformat în E.coli DH5-a(Bethesda Research Labs).
B. Secvențializarea ADN
S-au secvențat opt clone cADN de lanț greu murin și o clonă de lanț ușor murine din partea A de mai sus. Rezultatele secvențării regiunilor variabile ale acestor clone sunt prezentate în SECV ID Nr: 1, 2, 3 și 4. Fiecare clonă a conținut aminoacizi cunoscuți a fi conservați printre regiunile variabile ale lanțului greu de șoarece sau regiuni variabile de lanț ușor și secvențe semnal murine. Secvențele aminoacide CDR sunt listate mai jos.
Regiunile CDR pentru lanțul greu sunt SECV ID NR: 22, 24 și 26 (aminoacizii 50-56, 71-86, și 119-129 ai SECV ID NR: 4),(vezi, fig.2). Aceste secvențe sunt codificate prin SECV ID NR:21, SECV ID NR: 23 și respectiv, SECV ID NR: 25. Regiunile CDR pentru lanțul ușor sunt SECV ID NR: 16, 18 și 20 (aminoacizii 45-58, 74 - 80 și 113-121 ai SECV ID NR: 2),(vezi, fig. 1). Aceste secvențe sunt codificate prin SECV ID NR: 15, 17 și respectiv, 19.
C. Selectarea cadrelor umane
După donarea lui 3B9, secvențele aminoacide ale regiunii variabile (aminoacizii 21-132 ai SECV ID NR: 2 și aminoacizii 20 - 140 ai SECV ID NR: 4) s-au comparat cu o bază de date a secvenței de imunoglobuline umană folosind bazele de date «ABAT191 și SWISS în scopul identificării unui cadru uman pentru ambele lanțuri greu și ușor, care ar putea să se potrivească cât mai strâns în omologia de secvență precursoare murină. Suplimentar la aceste căutări pentru omologie de secvență, lanțurile greu și ușor s-au evaluat, de asemenea, împotriva unei baze de date poziționale generate de la modele structurale ale domeniului Fab pentru a evalua conflictele potențiale datorate substituțiilor aminoacide care pot influența prezentarea CDR. Pentru cazul de fața, nu s-a detectat nici un conflict evident în căutarea structurală; prin urmare, s-a folosit ADN-ul codificator dedus din cercetările omologiei secvenței aminoacide.
S-au folosit regiuni cadru de lanț greu ale unui anticorp obținut de la o imunoblobulină mielomică umană (CDR) (E.M.Press și N.M. Hogg, Biochem.J., 117:641RO 116809 Bl
660 (1970)). Această secvență s-a dovedit a fi aproximativ 76% omoloagă (69,4% identitate) la regiunea lanțului variabil 3B9 la nivel aminoacid.
Pentru o regiune cadru variabilă corespunzătoare de lanț ușor s-a folosit secvența cadru variabilă de lanț ușor a anticorpului uman identificată în H.G.KIobeck și colab., Nucl.Acids Res., 13:6515-6529(1985). Secvența anticorpului uman s-a găsit a fi aproximativ 80,2% omoloagă (72,0% identitate) la regiunea lanțului ușor variabil 3B9 la nivel aminoacid.
Date fiind CDR-urile 3B9 murine (SECV ID NR: 15-26) și secvența anticorpului uman s-a făcut un lanț greu sintetic și s-a realizat PCR pentru a completa și în amplifica ADN-ul. Aceste secvențe s-au sintetizat prin următoarele oligonucleotide de suprapunere și s-au amplificat prin PCR. SECV ID NR: 31-37 asigură 5 oligonucleotide de suprapunere și 2 primeri PCR. Oligonucleotida 1 (SECV ID NR: 31) s-a găsit împrejurul bazelor 5-121. Oligonucleotida 2 (SECV ID NR:32) este găsită în jurul bazelor 122241, și oligonucleotida 3 (SECV ID NR: 33) este găsită în jurul bazelor 242-361. Cei doi primeri ai benzii de bază SECV ID NR: 34 și SECV ID NR:35 înconjoară bazele 134-110 și bazele 253-230. S-au corectat orice erori în secvența configurată care s-a inserat prin PCR. S-a realizat din nou PCR folosind ca primer 5'nucleotide 1-25 SECV ID NR: 36 și ca primer 3' nucleotidele 361-341 SECV ID NR:37.
Regiunea variabilă sintetică s-a ligat în vectorul de expresie pCD alături de secvența semnal sintetică SECV ID NR: 5 și 6 din construcția catenei grele himerice alături de regiunea constanta umană lgGv Secvența nucleotidică semnal și VH sintetică și secvențele aminoacide sunt date în fig.4 (SECV ID NR: 11 și 12). Secvențele aminoacide ale CDR-urilor (SECV ID NR: 22, 24 și 26) sunt identice la CDR-urile 3B9 murine. Totuși, secvențele care codifică pentru aceste CDR-uri (SECV ID NR: 54, 55 și 56) diferă de secvențele care codifică 3B9 murin (SECV ID NR: 21, 23 și 25). Vectorul de expresie rezultat, IL4 hzhcl-1-Pcd este prezentat în fig.9.
Regiunile genei CDR ale unui cadru de lanț ușor preexistent s-au digerat restrictiv, s-au îndepărtat și s-au înlocuit cu următoarele gene sintetice IL4 CDR care s-au făcut sintetic.
Pentru CDR1:
SECV ID NR:38: 5'-CTAGCTGTGTCTCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGG-3' SECV ID NR:39: CCTTGCAGTTGATGGTGGCCCTCTCGCCCAGAGACACAG
SECV ID NR:40: TCGAGAGGCCTCCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGA ACTGG
SECV ID NR:41: GGGTTTCTGCTGATACCAGTTCATATAACTATCACCATCATAATCAACA CTTTGGAGGCCTC
Pentru CDR2:
SECV ID NR:44: GGGCAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTACGCTGCATCCAATCTAGAATC TGGGGTAC
SECV ID NR:45: CCCAGAGGCTAGATTGGATGCAGCGTAAATGAGCAACTTAGGAGGCT GCCC
Pentru CDR3:
SECV ID NR: 42: ATACTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCCGAGGTTCGGCGGA GGGAC
SECV ID NR: 43: TTGGTCCCTCCGCCGAACCTCGGAGGATCCTCATTACTTTGCTGACA GTAGT
965
970
975
980
985
990
995
1000
1005
RO 116809 Bl
Secvența nucleotidică semnal, lanțul VL sintetic și secvențele aminoacide sunt date în fig.5 (SECV ID NR:13 și 14). Secvențele aminoacide ale primelor două CDR-uri (SECV ID NR: 16 și 18) sunt identice cu CDR-urile corespunzătoare 3B9 murine. Cu toate acestea, secvența care codifică pentru primul CDR (SECV ID NR: 53) diferă de secvența care codifică 3B9 murin (SECV ID NR: 15). în plus, în ultimul CDR s-au construit 2 constructe umanizate ale secvenței aminoacide 3B9. Unul (SECV ID NR: 28), diferă printr-un singur aminoacid (SECV ID NR: 20) de secvența 3B9 murină nativă. SECV ID NR: 28 este codificată prin SECV ID NR: 27. Regiunile ușoare variabile sintetice s-au ligat în vectorul de expresie împreună cu secvența semnal (SECV ID NR: 7 și 8). Unul dintre vectorii de expresie rezultați, IL4hzlcl-0-Pcn este ilustrat în fig. 10.
Aceste secvențe variabile de lanț ușor și/sau greu sintetice s-au folosit în construcția unui anticorp umanizat.
Exemplul 4. Expresia MAb umanizat în celule COS și CHO
S-au obținut subclone pUC18 pentru VH pentru a se adăuga o secvență semnal obținută inițial de la un anticorp uman SECV ID NR:5. Pentru VL s-au obținut subclone pUC18 pentru a se adăuga o secvență semnal SECV ID NR:7.
Lanțul greu umanizat derivat de la un izotip lgGn prezintă 89,3% omologie (84,3% identitate) la nivel aminoacid cu lanțul greu de la 3B9 murin. Acest VH sintetic este dat în aminoacizii 20-141 ai SECV ID nr: 11 și 12.
Lanțul ușor umanizat, un lanț kappa uman prezintă 92,0% omologie (86,6% identitate) cu 3B9 la nivel aminoacid. Acest VL sintetic (aminoacizi 21 la 131 ai SECV DINR: 13 și 14) care conțin CDR-urile 3B9 s-au desemnat și s-au sintetizat cum s-au descris mai sus pentru lanțurile grele sintetice.
Fragmentele ADN conținând semnalele lor respective lincate, fie la regiunile umanizate variabile grea sau ușoară, s-au inserat în plasmide de expresie în celule de mamifere bazate pe pUCI9, care conțin promotori CMV și regiuni constante de lanț greu sau lanț ușor uman ale himerelor produse în exemplul 5 de mai jos, prin metode convenționale (Maniatis și colab., citat mai sus) pentru a da plasmide IL4hzhcl-1 Pcd (lanț greu) (fig.9) și IL4hzlcl-o-Pcn), (lanț ușor) (fig. 10). Plasmidele HZHC și ZHLC sunt co-transfectate în celule COS și supernatantele se analizează prin ELISA descrisă imediat mai sus pentru prezența anticorpului umanizat după 3 și 5 zile. Alt anticorp umanizat s-a construit cu izotip lgG4.
Exemplul de mai sus descrie prepararea unui exemplu de anticorp exemplificator prin inginerie. Proceduri similare pot fi urmate pentru dezoltarea altor anticorpi prelucrați prin inginerie, folosind anticorpi anti-IL4 (de exemplu, 6A1 (exemplul 7)) dezvoltat prin mijloace convenționale.
Exemplul 5. Construcția anticorpului himeric
A. S-a construit un lanț greu himeric prin izolarea regiunii lanțului greu variabil murin de la MAb 3B9 original de șoarece ca un fragment de restricție EcoRI-BstEII. S-a desemnat și s-a sintetizat un oligomer ADN mic care a leagă regiunea variabilă de șoarece cu regiunea constantă lgG1 umană (BstEII-Apal): primer 5': SECV.ID NR.:5O: GTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGCA; primer 3':SECV. ID NR.: 51: CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACG.
Aceste două fragmente s-au ligat în plasmidul pCD (vezi fig.7) (digerat cu EcoRI și Apal) care deja codifică regiunea constantă IgGI umană. Această clonă nu s-a
RO 116809 Bl exprimat; prin urmare, tipul sălbatic 5'UTR și secvența semnal s-au deletat și s-au înlocuit cu SECV.ID NR: 5 și 6.
Deoarece, nu a fost accesibil un situs de restricție endonucleazică convenabil la capătul 3' al secvenței semnal s-a introdus un situs BstEII (adică, o mutație tăcută) prin intermediul PCR. S-au folosit următorii primeri PCR: SECV.ID NR.:48: primer 5': 5'CAGGTTACCCTGAAAGAGTC3' SECV.ID NR.:49: primer 3': 5'GAAGTAGTCCTTGACCAG3.
S-a izolat apoi un fragment de restricție BstEII-Pstl din acest plasmid. Apoi, s-au desemnat și sintetizat o nouă secvență semnal și 5'UTR având capetele EcoRI și BstEII.
SECV.ID NR.:46: primer 5':AATTCGAGGACGCCAGCAACATGGTGTTGCA GACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGAG
SECV ID NR:47: primer 3’: GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGAGCAACAGAG AAATGAAGACCTGGGTCTGCAACACCATGTTGCTGGCGTAATCG
Lanțul ușor himeric s-a construit aplicând tehnica PCR lanțului ușor original 3B9 murin care s-a donat în pGEM72f(+) (Promega). Primerii folosiți au fost accesibili comercial, primul invers universal pUC18 la capătul 5' (EcoRI) și un primer 3',care introduce un situs Nari (5'CATCTAGATGGCGCCGCCACAGTACGTTTGAT-CTCCAGCTTGGTCCC3' SECV ID NR:52), folosit pentru a fuziona regiunea variabilă de șoarece la regiunea constantă umană. Aceasta regiune variabilă s-a ligat în vectorul de expresie pCDN (EcoRI Nari) (Fig.8) care deja conține regiunea kappa, umană.
S-au colectat supernatantele mediilor 3 și 5 zile mai târziu și s-au analizat prin ELISA descrisă după cum urmează: plăci ELISA s-au acoperit cu 0,1 //g dintr-un anticorp de capră specific pentru regiunea Fc a anticorpilor umani. S-au adăugat supernatantele mediilor pentru o oră. S-a adăugat un anticorp-capră conjugat cu o peroxidază de hrean specific pentru un anticorp întreg IgG uman. Aceasta a fost urmată de adăugarea substratului peroxidazic ABTS (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) pentru o oră. S-a detectat expresia anticorpului himeric. într-o a doua ELISA supernatantele celulei COS conținând anticorpul himeric legat specific la proteina IL4 umană recombinantă. Acest rezultat a confirmat că genele care codifică un anticorp specific pentru IL4 au fost donate.
B. De asemenea, s-a putut obține un lanț greu umanizat de la acest lanț greu himeric. Lanțul greu umanizat s-a desemnat prin inserarea CDR-urilor murine într-un cadru uman. Cadrul uman ales a fost cum s-a descris mai sus, secvența proteică cea mai omoloagă din baza de date pentru proteine SWISS față de VH 3B9 murin (aminoacizii 20-140 ai SECV ID NR:4). Această secvență de lanț greu umanizat (EcoRI Apal) s-a obținut sintetic și s-a realizat PCR pentru a completa în și amplifica secvența ADN cum s-a descris mai sus. Această regiune variabilă sintetică s-a ligat în vectorul de expresie pCD (EcoRI Apal) împreună cu secvența semnal sintetică SECV ID NR: 5 și 6 de la construcția lanțului greu himeric și o regiune constantă IgG., umană.
în mod similar poate fi derivat un lanț ușor umanizat de la lanțul ușor himeric așa cum s-a descris pentru lanțul greu. Această genă (EcoRV Nari) s-a obținut, de asemenea, sintetic. S-a ligat VR umanizată în vectorul de expresie pCN digerat cu EcoRI Nari alături de o secvență semnal (EcoRI EcoRV). Vectorul de expresie a furnizat regiunea constantă kappa umană.
1055
1060
1065
1070
1075
1080
1085
1090
1095
RO 116809 Bl
Exemplul 6. MAb umanizat - purificare și termodinamică
Purificarea de CHO exprimat himeric și 3B9 umanizat poate fi obținută prin cromatografie de afinitate convențională de proteină A (sau G) urmată de cromatografie de schimb ionic și cromatografie pe site moleculare. Procedee similare au fost folosite cu succes pentru purificarea până la mai mult de 95% puritate a altor MAb-uri (de exemplu, pentru virusul respirator sincițial și antigenii circumsporozoitului malarie).
Afinitatea și termodinamica detaliate ale legării IL4 la MAb 3B9 umanizat și 3B9 murin (exemplul 1) s-au determinat prin titrare microcalorimetrică. Această metodă măsoară reacțiile de legare pe baza căldurilor lor intrinseci de reacție (vezi, de exemplu, Wiseman și colab., Anal.Biochem.179: 131-137 (1989)). Afinitatea ambilor MAb s-a găsit a fi foarte apropiată pentru a se măsura direct la temperatura mediului. Astfel, a avut loc o abordare termodinamică: i) s-a măsurat afinitatea, la 6O°C unde ea a fost suficient de slabă pentru a fi măsurată direct; și (ii) dependența de temperatură entalpiei de legare s-a măsurat, de la 30 la 6O°C. împreună, aceste date au permis calcularea afinității pe un domeniu larg de temperaturi folosind ecuația Gibbs-Helmholz.
Un rezumat al termodinamicii legării IL4 la anticorpii 3B9 umanizați și murin este prezentat în tabelul 1. Pe baza schimbărilor în energia liberă, entalpie, entropie și capacitate calorică a celor doi MAb termodinamicile legării nu pot fi distinse.
Tabelul 1
| Termodinamica legării hlL4 la 3B9 umanizat și murin la pH=7,4 150 mM NaCI și 25°C | |||||
| MAb | Kd pmol | AG kcal/ mol IL4 | ΔΗ kcal/ mol IL4 | -TAS kcal/ mol IL4 | AC cal/mol IL4/°K |
| 3B9 umanizat | 11 | -13,6±0,6 | -21,18±2 | 8,2+2,1 | -58O±16O |
| 3B9 murin | 19 | -13,3±0,6 | -20,5+1 | 7,2+1,2 | -660+200 |
Afinitățile IL4 ale 3B9 umanizat și murin s-au măsurat în quadruplicat și, respectiv, duplicat.
Exemplul 7. Producerea și caracterizarea MAb de șobolan
MAb 6A1, ales pentru afinitate înaltă de legare s-a derivat de la un șobolan imunizat folosind același protocol de imunizare cum s-a descris pentru șoarecele din exemplul 1. S-a selectat 6A1 din hibridomi (mai precis hibridom 3426A11CIB9) preparat de la șobolani imunizați cu IL4 umană.
S-a calculat Kd pentru 6A1, așa cum s-a descris în Beatty și colab., J.lmmunol.Methods, 1OO: 173-179 (1987) ca fiind 2 x 1O1QM.
Hibridomul 3426AIICIB9 s-a depozitat pe 6 octombrie 1993 sub numărul de acces 93100620 în Colecția Europeană de culturi de celule animale (ECACC), Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Regatul Unit și a fost acceptat ca un depozit de brevet în conformitate cu Tratatul de la Budapesta din 1977, care guvernează depozitul de microorganisme în scopurile procedurii de brevetare.
RO 116809 Bl
Exemplul 8. Activitatea biologică a MAb: 3B9 (umanizat), 3B9(murin] și 6A1 S-au realizat următoarele analize folosind procedurile descrise mai jos.
A. Legare de rhlL4 glicozilat
Anticorpii identificați mai sus s-au obținut față de IL4 umană recombinantă neglicolizată (rhlL4), care s-a produs în E.coli. Din cauză că IL4 umană nativă este glicozilată a fost important să se confirme legarea la material secretat de către o linie celulară mamiferă. 3B9 se leagă la fel de bine, atât la IL4 glicozilată, cât și IL4 umană recombinantă neglicozilată și prin urmare nu este îndreptată spre un epitop, care ar putea fi mascat pe IL4 umană naturală.
B. Inhibarea legării IL4 la receptor
Capacitatea lui 3B9 de a inhiba legarea IL4 la receptorul său s-a studiat folosind legarea 125l-rhlL4 față de linia celulară de gibon, MLA (ATCC TIB 201) care poartă aproximativ 6000 receptori pe celulă. Celulele MLA s-au incubat cu 125l - IL4, 30 min, la 37°C. Absorbția radiactivității s-a determinat într-un container gamma după separarea 125-IL4 legată de celulă, prin centrifugare, într-un gradient de ulei. Legarea nespecifică s-a determinat prin incubare în prezență de IL4 nemarcat în exces molar de 100 x (Park și colab., J.Exp.Med.,166: 476-488 (1987)). Valoarea IC50 pentru IL4 nemarcat în această analiză a fost 22 pM când cantitatea de IL4 (adăugată) a fost 83 pM. Pentru 3B9 (IgG) murin intact IC^ a fost 63 pM și 93 pM pentru fragmentul Fab. La altă concentrație a IL4 (218 pM) cantitatea testată pentru 3B9 (IgG) murin a fost 109 pM.
C. Inhibatea proliferării limfocitului
Folosind metoda descrisă în J.lmmunol., 193:1142-1147(1987), de Spits și colab., s-au incubat limfocite din sânge periferic uman timp de trei zile cu fitohemaglutinină, un mitogen al celulei T, pentru reglarea receptorului IL4. Celulele blastice rezultante s-au stimulat apoi trei zile în plus cu IL4. Proliferarea se măsoară prin 3H timidinăîncorporată. Proliferarea celulei B s-a măsurat prin testul lui Callard și colab., din Lymfokines and Interferons. A Practicai Approach, Ch. 19, p. 345, modificat după cum urmează. Celule B din amigdale s-au purificat și s-au stimulat, timp de 3 zile cu IL4 și s-au imobilizat anti-IgM. Proliferarea s-a măsurat prin încorporarea de 3H timidină.
încorporarea 3H timidinei inhibată de 3B9(murin) de către limfocite T din sânge periferic uman s-a stimulat cu 133pM IL4 și limfocite B din amigdale umane stimulate prin 167 pM IL4. Limfocite T stimulate IL2 nu au fost afectate. IC50 pentru incubarea proliferării celulei T a fost 30pM, și pentru proliferarea celulei B a fost 103 pM. Valorile corespunzătoare pentru fragmentul Fab al lui 3B9(murin) au fost 108 și 393 pM.
D. Inhibarea inducerii CD23
CD23 este receptorul de afinitate scăzută pentru IgE (FcERII) și este indus pe membrana celulelor B (limfocite) în repaus prin concentrații scăzute de IL4, atât cât este necesar pentru producerea IgE. Celule B purificate din amigdale umane s-au stimulat, timp de 2 zile, cu IL4. Procentul celulelor care exprimă receptorul CD23 se determină prin citometrieîn flux (Defrance și colab., J.Exp.Med., 165: 1459-1467 (1987)). 3B9 (murin) a inhibat expresia CD23 pe limfocite B din amigdale umane stimulate cu 8,3 pM IL4 cu o valoare IC50 de 136 pM.
1145
1150
1155
1160
1165
1170
1175
1180
1185
RO 116809 Bl
E. Inhibarea secreției IgE
Spre deosebire de alte teste unde s-a adăugat IL4 la concentrații EC50 (Pere și colab., Proc.Natl. Acad.Sci., 85:6880-6884 (1988), secreția IgE s-a investigat în prezența concentrațiilor de IL4 dând secreție maximă în scopul reducerii variabilității inerente din acest sistem. Proliferarea celulei T s-a măsurat după cum urmează. S-au incubat limfocite din sânge periferic uman cu IL4, între 10-18, de preferință, 12 zile. Concentrația de IgE în supernatantele culturii se determină prin ELISA.
Secreția IgE s-a inhibat prin 3B9 (murin), și fragmentul Fab al lui 3B9, în prezența a 1,7 nM IL4 dând valori IC^ de 1,9 și, respectiv, 5,0 nM. Experimentul s-a repetat folosind o concentrație mai scăzută de IL4, 667 pM, care a redus valoarea IC50 până la 0,65 nM pentru 3B9 (murin). Raportul molar al anticorpului (IgG) față de IL4 a rămas neschimbat (1:1) pe domeniile concentrațiilor examinate.
F. Rezumatul și interpretarea datelor
Rapoartele molare ale IL4 față de diferite MAb-uri necesare pentru inhibare 50% a funcției în bioteste sunt date în tabelul 2:
Tabelul 2
| Activitate comparativă a MAb-urilor 3B9, 6A1 și 3B9 umanizat variante lgG1 și | |||||
| lgG4) în bioteste dependente IL4 | |||||
| Test | ICsot | jM) [domeniu)n | |||
| 3B9 murin | 3B9 murin (Fab) | 6AI de șobolan | 3B9 umanizat | ||
| igGi | lgG4 | ||||
| RBA | 63(17-109)2 | 93 | >50000 | ||
| celulă T | 30[1040)4 | 108 | 87 | 44[30-56)3 | 40 |
| celulă B | 103(79-120)3 | 393 | 187 | 47[1O-8O)3 | 79 |
| inducere CD23 | 136[53-272]4 | 216 | 80 | 333 | |
| Sintază IgE | 685(370-1070]6 | 1170 | 623(412-833]9 | 54[35-83]3 | 406 |
n - numărul de teste separate realizate.
* Variantele lgG1 și lgG4 s-au analizat la diferite momente.
în toate analizele, cu excepția secreției IgE, IL4 s-a adăugat la concentrații EDS0 aproximative. Rapoartele molare de anticorpi față de IL4 necesari pentru inhibare 50% au fost similare pentru 3B9 umanizat, 3B9 murin și 6A1 în două teste de proliferare a limfocitului dar au fost mai mari pentru 3B9 umanizat în testul inducției CD23. Ultimul este un test deosebit de sensibil necesitând aparent ocuparea foarte redusă a receptorului (aproximativ 5%) (Kruse și colab., EMBO J.12: 5121, 1993) și așa cum este evident din rezultatele obținute cu 3B9 murin supus variației analizei intermediare.
RO 116809 Bl
1230 comparație a activităților 6A1 de șobolan și 3B9 murin a demonstrat un profil similar al efectelor funcționale, dar un eșec neașteptat al 6A1 de a inhiba în întregime legarea IL4 marcat cu iod radioactiv la receptorul său. IL4 marcată cu iod radioactiv folosită în testul de legare la receptor este considerata a fi marcată cu iod radioactiv la tirozina de la poziția 124. Când s-e comparat capacitatea lui 6A1 de a inhiba expresia CD23 indusă fie prin IL4 nemarcată sau marcată s-a constatat că inhibiția a fost mai puțin eficientă împotriva ligandului marcat cu iod radioactiv. Aceste rezultate arată că 6A1 se leagă la IL4 în regiunea însă fără să fie specifică a tirozinei 124.
Astfel, pe baza datelor curente, 6A1 este un anticorp de neutralizare de înaltă afinitate care se leagă la o regiune a IL4 foarte diferită, decât 3B9.
Exemplul 9. Farmacocinetică
Farmacocinetica lui 3B9 umanizat s-au investigat în șobolani masculi Sprague Dawley. S-a administrat 3B9 umanizat la 4 animale ca un bol iv dozat la 1 mg/kg, și s-a continuat prelevarea de probe de sânge, timp de 5 săptămâni după administrare. Concentrațiile plasmatice de 3B9 umanizat s-au determinat folosind o ELISA sandwich IL4/lgG anti-uman desemnată pentru a confirma nu numai prezența IgG, în circulația sanguină umană, ci, de asemenea, și capacitatea sa de a se lega la IL4 umană recombinantă.
Rezultatele acestui studiu sunt prezentate pe scurt în tabelul 3:
Tabelul 3
1235
1240
1245
Farmacocinetica 3B9 umanizat În șobolani masculi Sprague-Dawley [doză: bol iv 1 mg/kg)
| Clp (ml/h/kg) | |
| Șobolan 1 | 0,442 |
| Șobolan 2 | 0,655 |
| Șobolan 3 | 0,555 |
| Șobolan 4 | 0,447 |
| Medie | 0,525 |
| Abatere standard | 0,101 |
Clp=epurare plasmatică aparentă
1250
1255
Datele au indicat că variabilitatea între animale a fost relativ mică și dispariția 3B9 umanizat din plasă pare a fi bifazică. Epurarea plasmatică aparentă a fost scăzută (0,5 ml/h/kg). Timpul de înjumătățire pare a fi, de 11 zile. Astfel, caracteristicile farmacocinetice ale 3B9 umanizat derivat în celula CHO sunt conforme cu alți anticorpi monoclonali umanizați la șobolani. Timpul de înjumătățire în circulație, lung, al 3B9 umanizat la șobolani sugerează, de asemenea, că administrat de om 3B9 umanizat va fi la fel de eficient pe o perioadă îndelungată de timp.
Numeroase modificări și variații ale prezentei invenții, incluse în descrierea de mai sus, vor fi evidente pentru un specialist în domeniu. De exemplu, regiunile cadrului uman sau modificările acestora altele, decât în anticorpii descriși mai sus, pot fi folosiți în construirea de anticorpi umanizați. Astfel de modificări și alterări ale compozițiilor și procedeelor invenției de față sunt considerate a fi cuprinse în sfera revendicărilor anexate prezentei descrieri.
Claims (18)
- RO 116809 BlRevendicări1. Anticorp recombinant monoclonal, caracterizat prin aceea că regiunea variabilă a lanțului greu cuprinde, în ordine, prima regiune determinantă a complementarității având secvența Thr Ser Gly Met Gly Val Ser (SECV NR. 22), a doua regiune determinantă a complementarității având secvența His lle Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser (SECV NR. 24), a treia regiune determinantă a complementarității având secvența Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Phe Asp Val (SECV NR. 26); iar regiunea variabilă a lanțului ușor cuprinde, în ordine, prima regiune determinantă a complementarității având secvența Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (SECV NR. 16), a doua regiune determinantă a complementarității având secvența Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (SECV NR. 18), a treia regiune determinantă a complementarității având secvența Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr (SECV NR. 20).
- 2. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că se leagă la același epitop ca anticorpul monoclonal 3B9.
- 3. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că se leagă la același epitop ca anticorpul monoclonal 6A1.
- 4. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, concurează cu anticorpul monoclonal 3B9 și 6A1 pentru legarea interleukinei 4 umane.
- 5. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, concurează cu anticorpul monoclonal produs prin linia de celule hibridoma 3426A11C1B9 pentru legarea interleukinei 4 umane.
- 6. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că are specificitate de legare a regiunii invariabile a lanțului greu de imunoglobulină, a regiunii invariabile a lanțului ușor de imunoglobulină, sau a ambelor.
- 7. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că prezintă o disociere constantă egală sau mai mică de 2x101 °M,pentru interleukina 4 umană.
- 8. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că regiunea invariabilă a lanțului greu cuprinde, în ordine, următorii aminoacizi 21-50, 58-71, 88-119 și 131-141 ai SECV NR. 12.
- 9. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că regiunea invariabilă a lanțului ușor cuprinde, în ordine, următorii aminoacizi 2042, 58-72, 80-111 și 121-131 ai SECV NR. 14.
- 10. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că este legat operațional la un agent efector ales dintr-un grup care constă dintr-o moleculă purtătoare, polistiren și bile de plastic.
- 11. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că acidul nucleic care codifică proteinele din regiunea determinantă a complementarității a lanțului greu de imunoglobulină este ales dintre:ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC SECV NR. 21CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGCSECV NR. 23RO 116809 BlAGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC SECV NR. 25ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC SECV NR. 54CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTGAAA TCC SECV NR. 55CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT SECV NR. 56
- 12. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că acidul nucleic care codifică proteinele din regiunea determinantă a complementarității a lanțului ușor de imunoglobulină este ales dintre:AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AACSECV NR. 15 AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AACSECV NR. 53 GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT SECV NR.17CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG SECV NR.19CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG SECV NR.27
- 13. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că poate fi folosit într-o metodă de diagnosticare a alergiilor și a altor condiții asociate cu producerea în exces a imunoglobulinei E la om prin contactarea unei probe de fluid biologic cu titru înalt pentru IL-4 cu anticorpul monoclonal recombinant și detectarea prezenței sau absenței complexului dintre IL-4 și anticorpul monoclonal recombinant.
- 14. Anticorp recombinant monoclonal, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că se obține prin cultivarea unei linii de celule transfectate cu plasmida recombinantă care conține acidul nucleic care codifică proteinele din regiunea determinantă a complementarității, sub controlul secvențelor reglatoare selectate, capabile să conducă expresia acestuia în celule.
- 15. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că, conține 0,5...20%. în greutate, anticorp recombinant monoclonal definit în revendicarea 1 și un purtător acceptabil farmaceutic.
- 16. Metodă de tratare a alergiilor și a altor condiții asociate cu producerea în exces a IgE la un om, caracterizată prin aceea că se administrează o compoziție farmaceutică definită în revendicarea 15, astfel, încât cantitatea de anticorp recombinant monoclonal definit în revendicarea 1, să fie cuprinsă, în intervalul 0,1...20 mg/70 kg corp, parenteral, de preferință, intramuscular, un interval,de timp cuprins între 2 zile până la 3 săptămâni.
- 17. Metodă de tratare, conform revendicării 16, caracterizată prin aceea că dozele și durata de tratament pot fi corectate prin determinarea anticorpilor din circulație.
- 18. Metodă de tratare, conform revendicării 16, caracterizată prin aceea că este tratată rinita alergică, conjunctivitele, dermatitele atopice, astmul atopic și șocul anafilactic.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RO9600509A RO116809B1 (ro) | 1996-03-11 | 1996-03-11 | Anticorp recombinant, monoclonal, compozitie farmaceutica si metoda de tratament cu aceasta |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RO9600509A RO116809B1 (ro) | 1996-03-11 | 1996-03-11 | Anticorp recombinant, monoclonal, compozitie farmaceutica si metoda de tratament cu aceasta |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO116809B1 true RO116809B1 (ro) | 2001-06-29 |
Family
ID=20103416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO9600509A RO116809B1 (ro) | 1996-03-11 | 1996-03-11 | Anticorp recombinant, monoclonal, compozitie farmaceutica si metoda de tratament cu aceasta |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO116809B1 (ro) |
-
1996
- 1996-03-11 RO RO9600509A patent/RO116809B1/ro unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0730609B1 (en) | Recombinant il4 antibodies useful in treatment of il4 mediated disorders | |
| RU2162711C2 (ru) | Рекомбинантные il4-антитела, используемые для лечения нарушений, связанных с действием il4 | |
| JP5177444B2 (ja) | Ｉｌ−５により媒介される疾病の治療に有用な組み換えｉｌ−５アンタゴニスト | |
| EP1299421B1 (en) | Antibodies to human mcp-1 | |
| US7399837B2 (en) | Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders | |
| JP2008029355A (ja) | Ｉｌ−５により媒介される疾病の治療に有用な組み換えｉｌ−５アンタゴニスト | |
| CZ20013362A3 (cs) | Rekombinantní antagonisté IL-18 pro léčbu onemocnění zprostředkovaných IL-18 | |
| AU2001283903A1 (en) | Antibodies to human MCP-1 | |
| US5928904A (en) | DNA encoding recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders | |
| US5783184A (en) | Method for treatment and diagnosis of IL-5 mediated disorders | |
| US5914110A (en) | Recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders | |
| US7807793B2 (en) | Recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders | |
| RO116809B1 (ro) | Anticorp recombinant, monoclonal, compozitie farmaceutica si metoda de tratament cu aceasta | |
| KR100509993B1 (ko) | Il-5 매개된 질환의 치료에 유용한 재조합 il-5 길항제 | |
| MXPA01009514A (en) | Recombinant il-18 antagonists useful in treatment of il-18 mediated disorders |