CZ20013362A3 - Rekombinantní antagonisté IL-18 pro léčbu onemocnění zprostředkovaných IL-18 - Google Patents

Description

Rekombinantní antagonisté IL-18 pro léčbu onemocnění zprostředkovaných IL-18

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká oblasti protilátek a pozměněných protilátek, které jsou použitelné pro léčbu a diagnostiku onemocnění zprostředkovaných IL-18, přesněji mAb, Fab, chimérických a humanizovaných protilátek.

Dosavadní stav techniky

Lidský interleukin-18 je nedávno identifikovaný cytokin, který je syntetizován ve formě biologicky inaktivního prekursorového proteinu velikosti 193 aminokyselin (Ushio et al., J. Immunol. 156: 4274, 1996). Štěpení tohoto prekursorového proteinu, například kaspasou 1 nebo kaspasou-4, uvolňuje 156 aminokyselinový zralý protein (Gu et al., Science 275: 206, 1997; Ghayur et al., Nátuře 386:619, 1997), který vykazuje své biologické aktivity, mezi které patří ko-stimulace proliferace T-lymfocytů, zesílení cytotoxicity NK buněk, indukce produkce IFN-gamma T-lymfocyty a NK budkami, a potenciace diferenciace pomocných T-lymfocytů typu 1 (Thl) (Okamura et al., nátuře 378: 88, 1995; Ushio et al., J. Immunol. 156: 4274, 1996; Micallef et al., Eur. J. Immunol. 26: 1647, 1996; Kohno et al., J. Immunol. 158: 1541, 1997; Zhang et al., ínfect Immunol. 65: 3594, 1997; Robinson et al., Immunity 7: 571, 1997). Dále, IL-18 je účinným induktorem lidských monocytárních prozánětlivých mediátorů, včetně IL-8, faktoru nekrosy nádorů-alfa (TNF-alfa) a prostaglandinu E_a (PGE₂) (Ushio, S. et al., J. Immunol. 156: 4274-4279, 1996; Puren, A.J. et al., J. Clin. Invest. 10: 711-721, 1997; Podolin et al., J. Immunol. odevzdáno, 1999).

Dříve klonovaný protein příbuzný s receptorem pro IL-1 (IL-lRrp) (Parnet et al., J. Biol. Chem. 271: 3967, 1996) byl nedávno identifikován jako podjednotka IL-18 receptoru (Kd = 18 nM) (Torigoe et al., J. Biol. Chem. 272: 25737, 1997). Druhá podjednotka IL-18 receptoru vykazuje homologii s doplňkovým proteinem IL-1 receptoru a byla označena jako AcPL (jako podobný doplňkovému proteinu). Exprese IL-lRrp a AcPL je nutná pro aktivaci NF-kB a JNK indukovanou IL-18 Born et al., J. Biol. Chem. 273: 29445, 1998). Kromě NF-kB a JNK signalizuje IL-18 prostřednictvím kinasy asociované s IL-1 receptorem (IRÁK), p561ck (LCK) a protein kinasy aktivované mitogenem (MAPK) (Micallef et al., Eur. J. Immunol. 26: 1647, 1996; Matsumoto et al., Biophys Biochem. res. Comm. 234: 454, 1997; Tsuji-Takayama et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237: 126, 1997).

Thl lymfocyty, které produkují prozánětlivé cytokiny jako jsou IFN-gamma, IL-2 a TNF-beta (Mosmann et al., J. Immunol. 136: 2348, 1986), se pravděpodobně účastní na mnoha autoimunitních onemocněních, včetně roztroušené sklerosy (MS), revmatoidní artritidy (RA), diabetes mellitus dependentního na insulinu (IDDM, typ 1), zánětlivých onemocnění střevních (IBD) a psoriasy (Mossmann and Sad, Immunol. Today, 17: 138, 1996). Proto se předpokládá, že antagonizování cytokinů stimulujícího Thl, jako je IL-18, bude inhibovat vznik onemocnění. mAb specifické pro IL-18 mohou být použity jako antagonisté.

Byla prokázána role IL-18 při vzniku autoimunitních onemocnění. Tak bylo prokázáno, že exprese IL-18 je signifikantně zvýšena ve slinivce břišní a slezině neobézních diabetických (NOD) myší bezprostředně před vznikem diabetů (Rothe et al., J. Clin. Invest. 99: 469, 1997). Obdobně, bylo prokázáno, že koncentrace IL-18 jsou značně zvýšené v synoviální kapalině pacientů s revmatoidní artritidou (Kawashima et al., Arthritis and Rheumatism 39: 598, ······ · ·· · · φ φ φ φ φ · φ · · φ φ φ φ φ φ φ φ

1996). Dále bylo prokázáno, že podání IL-18 zesiluje klinickou závažnost myší experimentální alergické encephalomyelitidy (EAE), autoimunitního onemocnění zprostředkovaného Thl, které je modelem pro roztroušenou sklerosu. Dále bylo prokázáno, že neutralizující anti-krysí IL-18 antisérum brání vzniku EAE u samic Lewisových krys (Wildbaum et al., J. Immunol. 191: 6368, 1998). Proto je IL-18 žádoucím cílem pro vývoj nových terapeutik pro léčbu autoimunitních onemočnění.

Taniguchi et al. J. Immunol. Methods 206: 107, popisuje sedm myších a šest krysích anti-lidský IL-18 mAb, které se váží na čtyři různá antigenní místa. Jedna z myších mAb (125-2H) a šest krysích mAb inhibují produkci IFN-gamma indukovanou KG-1 buňkami, kdy krysí mAb vykazují neutralizační aktivity 10-krát nižší než 125-2H. Jak bylo prokázáno westernovou hybridizací, tři myší mAb, ale žádná z krysích mAb, jsou silně reaktivní s lidským IL-18 vázaným na membránu. Dále, je popsán enzymový imunosorbentní test (ELISA) pro detekci lidského IL-18, který využívá 125-2H a krysí mAb. Limitem detekce tohoto ELISA testu je 10 pg/ml.

Evropská patentová přihláška EP 0712931 popisuje dvě myší anti-lidský IL-18 mAb, H1 (IgGl) a H2 (IgM). Jak je prokázáno westernovou hybridizací, reagují obě mAb s lidským IL-18 vázaným na membránu, ale ne s lidským IL-12 vázaným na membránu. H1 je použita v imunoafinitní chromatografií pro přečištění lidského IL-18 a v ELISA pro měření IL-18. H2 je použita v radioimunotestu pro měření lidského IL-18.

Neutralizační IL-18 protilátky mohou být potenciálně použity pro zmírnění autoimunitních onemocnění a souvisejících příznaků u člověka. Proto v oboru existuje potřeba vysoce afinitních antagonistů IL-18, jako jsou neutralizační monoklonální protilátky k lidskému interleukinu 18, které budou redukovat diferenciaci a ······ · ··9 9

9 · · « · · · ··

9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

99 999 9999 99999 proliferaci Thl a tak autoimunitní onemocnění a související příznaky.

Podstata vynálezu

V prvním aspektu vynález poskytuje hlodavčí (například krysí a myší) neutralizační monoklonální protilátky specifické pro lidský interleukin 18, které mají vazebnou afinitu charakterizovanou i disociační konstantnou rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x 10³-¹ M, jak je popsáno v podrobném popisu. Příklady takových «* · monoklonálních protilátek jsou krysí monoklonální protilátka 2C10 a myší monoklonální protilátky jako je 14B7 a 13G9. Dalším aspektem vynálezu jsou hybridomy jako je 19522C10 (2) F2 (1) AI, 195214B7(1H10 a 187413G9(3)F12.

V příbuzném aspektu poskytuje předkládaný vynález neutralizační Fab fragmenty nebo jejich F(ab’)_a fragmenty specifické pro lidský interleukin-18 produkované delecí Fc regionu hlodavčích neutralizačních monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje pozměněnou protilátku specifickou pro lidský interleukin-18, která obsahuje regiony určující komplementaritu (CDR) odvozené z non-lidské neutralizační monoklonální protilátky (mAb), která má vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantnou rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x 1O~^{V * * * 1X} M pro lidský interleukin-18, a molekuly nukleové kyseliny kódující tyto protilátky. Když je pozměněnou protilátkou humanizovaná protilátka, tak jsou sekvence kódující regiony určující komplementaritu (CDR) z non-lidského imunoglobulinu insertovány do prvního imunoglobulinového partnera, ve které je alespoň jeden, lépe všechny regiony určující, komplementaritu (CDR), nahrazen CDR z non-lidské monoklonální ······ · ·· · · • · · · 9 · · · ·· • · ♦ ·· β · • 9 9 9 9999 φ· ·· 999 ·····<· protilátky. Výhodně je první imunoglobulinový partner operabilně navázán také na druhý imunoglobulinový partner, který obsahuje celý nebo část konstantního řetězce imunoglobulinů.

V příbuzném aspektu poskytuje předkládaný vynález CDR odvozené z non-lidských neutralizačních monoklonálních protilátek (mAb), které mají vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantnou rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x 10'^xx M pro lidský interleukin-18, a molekuly nukleové kyseliny kódující tyto CDR.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje chimérickou protilátku obsahující konstantní regiony lidského těžkého a lehkého řetězce a variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce odvozené z non-lidských neutralizačních monoklonálních protilátek, které mají vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantnou rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x 10^-xl M pro lidský interleukin-18.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje jednu (nebo více) výše uvedených pozměněných protilátek a farmaceuticky přijatelný nosič.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob léčby onemocnění u člověka, která jsou asociovaná s nadměrnou produkcí Thl, například autoimunitních onemocnění, kde uvedený způsob zahrnuje podání účinného množství farmaceutického prostředku podle předkládaného vynálezu uvedenému jedinci.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje způsoby pro a složky pro rekombinantní produkci pozměněných protilátek (například geneticky upravených protilátek, CDR, Fab nebo F(ab')₂ fragmentů nebo jejich analogů), které jsou odvozené z non-lidských • · 9 9 9 9-9 9 9 9

Φ Φ Φ Φ φ ·

ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ·Φ·Φ· »· φ.φ Φ neutralizačních monoklonálních protilátek (mAb), které mají vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantnou rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x 10^-3L1 M pro lidský interleukin-18. Mezi uvedené složky patří izolované sekvence nukleové kyseliny kódující tyto složky, rekombinantní plasmidy obsahující sekvence nukleové kyseliny pod kontrolou vybraných regulačních sekvencí, které mohou řídit expresi v hostitelských buňkách (výhodně savčích) transfektováných rekombinantními plasmidy. Způsob produkce zahrnuje kultivaci transfektovaných hostitelských buněk podle předkládaného vynálezu za podmínek, při kterých je pozměněná protilátka, výhodně humanizovaná protilátka, exprimována v uvedených buňkách, a izolaci exprimovaného produktu.

Ještě jiným aspektem vynálezu je způsob pro diagnostiku onemocnění spojených s nadměrnou produkcí Thl u člověka, který zahrnuje získání vzorku biologické kapaliny od pacienta a kontaktování protilátek a pozměněných protilátek podle předkládaného vynálezu se vzorkem za podmínek, při kterých se tvoří komplex IL-18/protilátka (monoklonální nebo pozměněná) a detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti uvedeného komplexu IL-18/protilátka.

Další aspekty a výhody předkládaného vynálezu jsou popsány dále v podrobném popisu a jeho výhodných provedeních.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 (SEQ ID NO: 1 a 2) ukazuje variabilní region lehkého řetězce pro krysí protilátku 2010. Obr. 1 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 3-8). Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primeru.

Obr. 2 (SEQ ID NO: 9a 10) ukazuje variabilní region těžkého ·*···· 4 ·« · ·9 • · · «··» t ·· * • · · · · φ ·t • · » · · · ♦ · · ♦ · ·· ··· ···· ·· ··· řetězce pro krysí protilátku 2C10. Obr. 2 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 11-16). Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primeru.

Obr. 3 (SEQ ID NO: 17 a 18) ukazuje variabilní region lehkého řetězce pro myší protilátku 13G9. Obr. 3 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 19-24) . Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primeru.

Obr. 4 (SEQ ID NO: 25 a 26) ukazuje variabilní region těžkého řetězce pro myší protilátku 13G9. Obr. 4 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 27-32) . Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primeru.

Obr. 5 (SEQ ID NO: 33 a 34} ukazuje variabilní region, lehkého řetězce pro krysí protilátku 14B7. Obr. 5 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 35-40) . Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primeru.

Obr. 6 (SEQ ID NO: 41 a 42) ukazuje variabilní region těžkého řetězce pro krysí protilátku 14B7. Obr. 6 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 13-48) . Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primeru.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje různé protilátky, pozměněné protilátky a jejich fragmenty, které jsou charakterizované vazebnou specificitou pro lidský IL-18, neutralizační aktivitou a vysokou afinitou pro lidský IL-18, jak je doloženo příkladem krysí monoklonální protilátky 2C10, myší monoklonální protilátky 13G9 a krysí monoklonální protilátky 14B7. Protilátky podle předkládaného • · · vynálezu se připravily běžnými technikami hybridomů používanými pro generování nových neutralizačních protilátek. Tyto produkty jsou použitelné pro léčbu onemocnění zprostředkovaných IL-18, například autoimunitních onemocněních, včetně roztroušené sklerosy (MS), revmatoidnní artritidy (RA), diabetes mellitus dependentního na insulinu (IDDM, typ 1), zánětlivých onemocnění střevních (IBD) a prosiasy (Mossmann and Sad, Immunol. Today, 17: 138, 1996). Tyto produkty jsou také použitelné pro diagnostiku onemocnění zprostředkovaných IL-18 pomocí měření (například ELISA testem) endogenních koncentrací IL-18 u člověka nebo IL-18 uvolňovaného ex vivo z aktivovaných buněk.

I. Definice

Pozměněná protilátka je protein kódovaný pozměněným regionem kódujícím imunoglobuliny, který může být získán expresí ve vybrané hostitelské buňce. Takové pozměněné protilátky jsou geneticky upravené protilátky (například chimérické nebo humanizované protilátky) nebo protilátky bez celého nebo části konstantního imunoglobulinového regionu, například Fv, Fab nebo F(ab')₂ fragmenty a podobně.

Pozměněný region kódující imunoglobulin je sekvence nukleové kyseliny kódující pozměněou protilátku podle předkládaného vynálezu. Když je pozměněnou protilátkou protilátka s přeneseným CDR nebo humanizovaná protilátka, tak jsou sekvence, které kódují regiony určující komplementaritu (CDR) z non-lidského imunoglobulinu, insertovány do prvního imunoglobulinového partneru obsahujícího variabilní pracovní sekvence. Volitelně je první imunoglobuliový partner operativně navázán na druhý imunoglobulinový partner.

První imunoglobulinový partner” je sekvence nukleové kyseliny • · · · kódující lidský pracovní rámec nebo variabilní region lidského imunoglobulinu, ve kterém jsou přirozené regiony kódující CDR nahrazeny regiony kódujícími CDR z dárcovské protilátky. Lidský variabilní region může být těžký řetězec imunoglobulinu, lehký řetězec imunoglobulinu, jejich analog nebo funkční fragment. Takové CDR regiony, umístěné ve variabilním regionu protilátek (imunoglobulinů), mohou být určeny za použití známých metod. Například Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)) popisuje pravidla pro lokalizaci CDR. Kromě toho jsou známé počítačové programy, které jsou použitelné pro identifikaci CDR regionů/struktur.

Neutralizační” označuje protilátku, která inhibuje aktivitu IL-18 tím, že brání vazbě lidského IL-18 na specifický receptor, nebo tím, že inhibuje signalizaci IL-18 prostřednictvím jeho receptoru, když dojde k vazbě. mAb je neutralizační, pokud je z 90% účinná, výhodně z 95% účinná a nejlépe ze 100% účinná v inhibici aktivity IL-18, jak je měřena v IL-18 neutralizačním testu, viz příklad 1 a tabulka 1.

Termín vysoceafinitní označuje protilátku s azebnou afinitou charakterizovanou K rovnou nebo menší než 3.9 x ΙΟ^-3-¹ M pro cl lidský IL-18, jak je určeno analýzou optickým biosenzorem (viz příklad 2 a tabulka 1).

Termín vazebná specificita pro lidský IL-18” znamená vyšší afinitu pro lidský IL-18 než pro myší nebo jiný IL-18.

Termín druhý imunoglobulinový partner označuje jinou nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo pepti, na který je první imunoglobulinový partner fúzován ve čtecím rámci nebo prostřednictvím volitelné běžné spojovací sekvence (t.j. je • · · · · · · φ φ φ φ · φ φ φ φ φ • · φφ φ φφφφ

4··· 4 Φ 4« ·· ♦ · ······· φφ φ operativně navázán). Výhodně se jedná o imunoglobulinový gen. Druhý imunoglobulinový partner může obsahovat sekvenci nukleové kyseliny kódující celý konstantní region stejné (t.j. homologní

- první a druhá pozměněná protilátka jsou ze stejného zdroje) nebo jiné (t.j. heterologní) požadované protilátky. Může se jednat o imunoglobulinový těžký nebo lehký řetězec (nebo o oba řetězce jako součásti jednoho polypeptidu). Druhý imunoglobulinový partner není omezen na určitou třídu nebo izotyp imunoglobulinu. Dále, druhý imunoglobulinový partner může obsahovat část imunoglobulinového konstantního regionu, jak je tomu u Fab nebo F(ab')₂ (t.j. diskrétní část vhodného lidského konstantního regionu nebo pracovního regionu). Takový druhý imunoglobulinový partner může také obsahovat sekvenci kódující integrální membránový protein přítomný na vnějším povrchu hostitelských buněk, například jako část fágové zobrazovací knihovny, nebo sekvenci kódující protein pro analytickou nebo diagnostickou detekci, například křenovou peroxidasu, beta-galaktosidasu atd.

Termíny Fv, Fc, Fd, Fab a F(ab’)_a mají standardní významy (viz např. Harlow et al., Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring harbor Laboratory (1988)).

Termín geneticky upravená protilátka označuje typ pozměněné protilátky, t.j. kompletní syntetickou protilátku (například chimérickou nebo humanizovanou protilátku, narozdíl od fragmentu protilátky), ve které jsou části variabilních domén lehkého a/nebo těžkého řetězce vybrané akceptorové protilátky nahrazeny • analogickými částmi z jedné nebo více donorových protilátek, které mají specificitu pro vybraný epitop. Například mohou takové » molekuly zahrnovat protilátky charakterizované tím, že obsahují humanizovaný těžký řetězec asociovaný s nemodifikovaným lehkým řetězcem (nebo chimérickým řetězcem) nebo naopak. Upravené protilátky mohou být také charakterizované alterací sekvence • · ♦ ·· φ • · » · · φ · · ♦ • · · · φ φ · • · ♦ · φ · · φ φ • φ · · φφ φ φ • Φ ·φ ·Φ· φ··φ ·Φ nukleové kyseliny kódující pracovní regiony variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce, což vede k zachování vazebné specificity dárcovské protilátky. Tyto protilátky mohou zahrnovat nahrazení jednoho nebo více CDR (výhodně všech) v akceptorové protilátce CDR z dárcovké protilátky, která je zde popsána.

Termín chimérická protilátka” označuje typ upravené protilátky, která obsahuje přirozený variabilní region (lehký řetězec a těžké řetězce) z dárcovské protilátky ve spojení s konstantními regiony lehkého a těžkého řetězce z akceptorové protilátky.

Termín humanizovaná protilátka označuje typ upravené protilátky, která má své CDR odvozené od non-lidského dárcovského imunoglobulinu a zbývající imunoglobulinové části molekuly odvozené od jednoho (nebo více) lidských imunoglobulinů. Dále, zbytky pracovního regionu mohou být pozměněny tak, aby byla zachována vazebná afinita (viz například Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology 9: 421 (1991)).

Termín dárcovské protilátka označuje protilátku (monoklonální nebo rekombinantní), která dodává sekvence nukleové kyseliny pro své variabilní regiony, CDR nebo jejich jiné funkční fragmenty nebo analogy, pro první imunoglobulinový partner, aby byl získán pozměněný region kódující imunoglobulin a nakonec aby byla exprimovaná pozměněná protilátka s antigenní specificitou a neutralizační aktivitou charakteristickou pro dárcovkou protilátku. Jednou dárcovskou protilátkou vhodnou pro použití v tomto vynálezu je non-lidská neutralizační monoklonální protilátka (t.j. krysí) označená jako 2C10. Protilátka 2C10 je definována jako vysoceafinitní neutralizační protilátka specifická pro lidský IL-18 (t.j. nerozpoznávající myší IL-18) izotypu _K mající DNA • · · · · · · ·· ·· • · · ···· «·· • · · © · ♦ ♦ • 999 9 9 9 9 9 • 9 99 999 9999 99 999 a aminokyselinové sekvence variabilního lehkého řetězce SEQ ID NO: 1 a 2 a DNA a aminokyselinové sekvence variabilního těžkého řetězce SEQ ID NO: 9 a 10 na vhodném myším konstantním regionu IgG.

Termín akceptorová protilátka” označuje protilátku (monoklonální nebo rekombinantní) heterologní k donorové protilátce, která dodává všechny (nebo část, ale výhodně všechny) sekvence nukleové kyseliny kódující pracovní regiony těžkého a/nebo lehkého řetězce a/nebo konstantní regiony těžkého a/nebo lehkého řetězce pro první imunoglobulinový partner. Výhodně je akceptorovou protilátkou lidská protilátka.

CDR jsou definovány jako komplementaritu určující regiony aminokyselinových sekvencí protilátky, které jsou hypervariabilními regiony lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinů. Viz například Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4.vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Ve variabilní části imunoglobulinu jsou přítomny tři CDR těžkého řetězce a tři CDR lehkého řetězce. Termín CDR” tedy označuje všechny tři těžké řetězce CDR nebo všechny tři lehké řetězce CDR (nebo CDR těžkého i lehkého řetězce, pokud je to vhodné).

CDR dodávají většinu kontaktních zbytků pro vazbu protilátky na antigen nebo epitop. Požadované CDR podle předkládaného vynálezu j sou odvozeny od variabilních sekvencí těžkého a lehkého řetězce dárcovské protilátky a patří mezi ně analogy přirozených CDR, kde tyto analogy si také zachovávají stejnou vazebnou specificitu pro antigen a/nebo neutralizační schopnost jako dárcovská protilátka, ze které jsou odvozeny.

Výrazem sdílí vazebnou specificitu pro antigen nebo ·· Φ···

neutralizační schopnost” se míní to, že ačkoliv ačkoliv mAb 2C10 může být charakterizována určitou úrovní afinity pro antigen, může mít CDR kódovaný sekvencí nukleové kyseliny 2C10 ve vhodném strukturálním prostředí nižší nebo vyšší afinitu. Předpokládá se, že CDR 2C10 bude v takovém prostředí rozpoznávat stejný epitop jako 2C10. Příklady CDR lehkého řetězce 2C10 jsou:

SEQ	ID	NO:	3;
	SEQ	ID	NO:	5;
<	SEQ	ID	NO:	7; a

příklady CDR těžkého řetězce 2C10 jsou:

SEQ	ID	NO:	11;
SEQ	ID	NO:	13; a
SEQ	ID	NO:	15.

Funkční fragment je část variabilní sekvence těžkého nbeo lehkého řetězce (například s drobnými delecemi na amino- neo karboxylovém konci variabilního regionu imunoglobulinu), která si zachovává stejnou vazebnou specificitu pro antigen a/nebo neutralizační schopnost jako protilátka, ze které je fragment odvozen.

Analog je aminokyselinová sekvence modifikovaná alespoň jednou aminokyselinou, kde uvedená modifikace může být chemická nebo substituce nebo reuspořádání několika aminokyselin (t.j. ne více než 10), kde tato modifikace umožňuje zachování biologických charakteristik aminokyselinové sekvence, například specificity pro antigen a vysoké afinity, nemodifikované sekvence. Například mohou být vytvořeny (silentní) mutace, pomocí substitucí, které vytvářejí místa pro restrikční endonukleasy v nebo okolo regionů kódujících CDR.

Analogy mohou být také alelické variace. Alelická variace nebo modifikace je alterace sekvence nukleové kyseliny kódující ·· ···· ♦ ···· • · · · · · ti 9 ti ·

9 9 9 9 9 9 99 •ti ·· ··· ···« ····· aminokyselinové nebo peptidové sekvence podle předkládaného vynálezu, takové variace nebo modifikace mohou být způsobeny degenerací genetického kódu nebo mohou být vytvořeny pro dosažení požadovaných charakteristik. Tyto variace a modifikace mohou, ale nemusí vést k alteracím jakékoliv kódované aminokyselinové sekvence.

Termín efektorová činidla označuje molekuly neproteinových nosičů, na které mohou být pozměněné protilátky a/nebo přirozené nebo syntetické lehké nebo těžké řetězce donorové protilátky navázány běžnými prostředky, mezi takové neproteinové nosiče patří běžné nosiče používané v diagnostice, například polystyrénové nebo plastové korálky, polysacharidy, jak jsou používané například v BIAcore (Pharmacia) systému, nebo jiné neproteinové substance použitelné v medicíně a bezpečné pro podání lidem nebo zvířatům. Mezi další efektorová činidla patří makrocykly pro chelataci iontů těžkých kovů, nebo radioizotopy. Taková efektorová činidla mohou být také použita pro zvýšení poločasu pozměněných protilátek, jak je tomu například u polyethylenglykolu.

II. Vysoce afinitní IL-18 monoklonální protilátky

Pro konstrukci protilátek, pozměněných protilátek a fragmentů protilátek podle předkládaného vynálezu mohou být použity non-lidské druhy (například skot, ovce, opice, kuřata, hlodavci (například myši a krysy) atd.) pro generování požadovaných imunoglobulinů po setkání s přirozeným lidským IL-18 neo jeho peptidovým epitopem. Běžné hybridomové techniky se použijí pro získání hybridomní buněčné linie secernující non-lidské mAb k 11-18. takové hybridomy se potom testují na vazbu pomocí 96-jamkových ploten potažených IL-18, jak je popsáno v části Příkladů, nebo alternativně pomocí biotinylovaného IL-18 navázaného na plotny potažené streptavidinem.

99		« 0«	• 0
9 ·	•	0 0 0 0	0 0	0 0
• 0	•	0 0	0 0
• ·	• ·	• 0	0 9
S0	··	0 · 0 0 00 0	9 9	0 ·

Jedním příkladem vysoce afinitní neutralizační mAb podle předkládaného vynálezu je mAb 2C10, krysí protilátka, která může být použita pro vývoj chimérické nebo humanizované protilátky, a tato protilátka je popsána podrobněji v příkladech. 2C10 mAb je charakterizována vazebnou specificitou pro lidský IL-18 s K_a přibližně 3,9 x 1Ο^_1Χ M. Tato mAb je izotypu IgG, .

Jinou vhodnou dárcovkou protilátkou je myší mAb 13G9. Tato mAb je izotypu IgG_x . mAb má disociační konstantu pro IL-18 přibližně 12 x 10~⁹ M.

Jinou vhodnou dárcovkou protilátkou je krysí mAb 14B7. Tato mAb má disociační konstantu pro IL-18 přibližně 1,5 x 10~^xo M a je také izotypu IgG_{x K}Předkládaný vynález není omezen na použití 13G9, 2C10, 14B7 nebo jejich hypervariabilních (t.j. CDR) sekvencí. Jakákoliv jiná vhodná vysoceafinitní IL-18 protilátka charakterizovaná disociační konstantou rovnou nebo menší než 3,9 x 10^-xx M pro lidský IL-18 a příslušné anti-IL18 CDR může být také použita. Když je v následujícím popisu dárcovská protilátka popsána jako 13G9, 2C10, 14B7, tak je to pouze z důvodu zjednodušení popisu.

III. Fragmenty protilátek

Předkládaný vynález také zahrnuje použití Fab fragmentů nebo F(ab')₂ fragmentů odvozených z mAb proti lidskému IL-18. Tyto fragmenty jsou použitelné jako činidla chránící in vivo před stavy zprostředkovanými IL-18 nebo TH1, nebo in vitro jako součást diagnostických prostředků pro IL-18. Fab fragment obsahuje celý lehký řetězec a amino-koncovou část těžkého řetězce; a F(ab')₂ fragment je fragment tvořený dvěma Fab fragmenty vázanými disulfidovými vazbami. Mab 13G9, 2C10, 14B7 a jiné vysoce afinitní

16	«9 9*99	· 1	r
	• · 9	t · · 9 · 9	«9
	• · ·	• 9 · ·	9
	• » · S	• 9 9 9«	9
	• 9 9 ·	9 9 · 9	•
	·· ··	9 «9 ·»··	9 9 9

protilátky k IL-18 jsou zdroji Fab fragmentů a F(ab')₂ fragmentů, které mohou být získány běžnými prostředky, například štěpením mAb vhodnými proteolytickými enzymy, papainem a/nebo pepsinem, nebo rekombinantními způsoby. Tyto Fab fragmenty a F(ab')₂ fragmenty jsou sami o sobě použitelné jako terapeutická, profylaktická nebo diagnostická činidla, a jako donory sekvencí včetně variabilních regionů a CDR sekvencí použitelných v přípravě rekombinantních nebo humanizovaných protilátek podle předkládaného vynálezu.

Fab a F(ab')₂ fragmenty mohou být připraveny pomocí kombinatoriální fágové knihovny (viz například Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994)) nebo pomocí míšení imunoglobulinových řetězců (viz např. Marks et al.,

Bio/technology 10: 779-783 (1992), kde obě práce jsou uvedeny jako odkazy ve své úplnosti), kde v těchto způsobech se Fd nebo V_k imunoglobulin dané protilátky (například 13G9) nechá asociovat s repertoárem lehkých imunoglobulinů, (nebo V_k), za zisku nových Fab. Naopak, lehký řetězec imunoglobulinu z dané protilátky se může nechat asociovat s repertoárem těžkých řetězců imunoglobulinu, V_h (nebo Fd) za zisku nových Fab.

IV. Požadované anti-IL-18 aminokyselinové a nukleotidové sekvence mAb 2C10 nebo jiné protilátky popsané výše mohou dodávat sekvence, jako například variabilní peptidové sekvence lehkého a/nebo těžkého řetězce, pracovní sekvence, CDR sekvence, funkční fragmenty a jejich analogy, a nukleotidové sekvence kódující tyto sekvence, které jsou použitelné pro navrhování a získání různých pozměněných protilátek, které mají vazebnou specificitu pro antigen dárcovské protilátky.

Například předkládaný vynález poskytuje variabilní sekvence lehkého a těžkého řetězce z 11-18 mAb 2C10 a sekvence odvozené z

těchto sekvencí.

Sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, nebo jejich fragmenty, kódující variabilní peptidové sekvence lehkého řetězce a těžkého řetězce, jsou použitelné pro vkládání specifických změn v sekvencích nukleové kyseliny kódujících CDR a pracovní regiony, a pro inkorporaci vzniklých modifikovaných nebo fúzních sekvencí nukleové kyseliny do plasmidů za účelem exprese.

Když se bere v úvahu degenerace genetického kódu, tak mohou být konstruovány různé kódující sekvence, které kódují variabilní aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce a CDR sekvence podle předkládaného vynálezu, stejně jako jejich funkční fragmenty a analogy, které mají stejnou antigenní specificitu jako dárcovská protilátka. Izolované sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, nebo její fragmenty, kódující peptidové sekvence variabilního řetězce nebo CDR, mohou být použity pro produkci pozměněných protilátek, například chimérických nebo humanizovaných protilátek, nebo jiných geneticky upravených protilátek podle předkládaného vynálezu, když jsou operativně kombinovány s druhým imunoglobulinovým partnerem.

Je třeba si uvědomit, že kromě izolovaných sekvencí nukleové kyseliny kódujících části pozměněné protilátky a protilátek, spadají další takové sekvence nukleové kyseliny do rozsahu předkládaného vynálezu, jako například sekvence komplementární k sekvencím kódujícím přirozené CDR nebo komplementární k modifikovanými lidským pracovním regionům okolo regionů kódujících CDR. Použitelnými DNS sekvencemi jsou ty sekvence, které hybridizují za přísných hybridizačnich podmínek (viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387-389) na DNA sekvence. Příkladem takových přísných hybridizačních podmínek je hybridizace při • ·· · • · · · · ·· · 9 ·»··*··

4xSSC při 65 °C, následovaná promytím v O,1XSSX při 65 °C po dobu 1 hodiny. Alternativním příkladem přísných hybridizačních. podmínek je 50% formamid, 4XSSC při 42 °C. Výhodně mají tyto hybridizující DNA sekvence délku alespoň 18 nukleotidů, t.j. přibližně velikost CDR.

V. Pozměněné imunoglobulinvé molekuly a pozměněné protilátky

Pozměněné imunoglobulinové molekuly mohou kódovat pozměněné protilátky, mezi které patří geneticky upravené protilátky, jako jsou chimérické protilátky a humanizované protilátky. Požadovaný pozměněný region kódující imunoglobulin může obsahovat regiony kódující CDR, které kódují peptidy mající antigenní specificitu protilátky proti IL-18, výhodně vysoce afinitní protilátky podle předkládaného vynálezu, které jsou insertovány do prvního imunoglobulinového partnera (lidského pracovního rámce nebo variabilního regionu lidského imunoglobulinu).

Výhodně je první imunoglobulinový partner navázán na druhý imunoglobulinový partner. Druhý imunoglobulinový partner je definován výše a může obsahovat sekvenci kódující požadovaný region druhé protilátky, například Fc region. Druhý imunoglobulinový partner může také obsahovat sekvence kódující jiný imunoglobulin, na které je konstantní region lehkého nebo těžkého řetězce navázán ve čtecím rámci nebo pomocí spojovací sekvence. Mohou být navrženy upravené protilátky namířené proti funkčním fragmentům nebo analogům IL-18, aby bylo dosaženo silnější vazby stejné protilátky.

Druhý imunoglobulinový partner může být také asociován s efektorovým činidlem, jak byla popsána výše, včetně neproteinových nosičů, na které může být druhý imunoglobulinový partner navázán běžnými prostředky.

Fúze nebo vazba mezi druhými imunoglobulinovými partnery, například protilátkovými sekvencemi, a efektorovým činidlem, může být provedena jakýmikoliv vhodnými prostředky, například běžnou kovalentní nebo iontovou vazbou, proteinovou fúzí, nebo pomocí hetero-bifunkčních spojovacích skupin, jako je například karbodiimid, glutaraldehyd a podobně. Takové techniky jsou známé v oboru a jsou popsány v běžných chemických a biochemických učebnicích.

Dále, běžné spojovací sekvence, které pouze dodávají prostor mezi druhým imunoglobulinovým partnerem a efektorovým činidlem, mohou být také obsaženy v regionu kódujícím pozměněný imunoglobulin. Takové spojovací skupiny jsou dobře známé v oboru.

Signální sekvence pro molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být modifikovány tak, aby bylo dosaženo zesílení exprese.

Příkladem pozměněné protilátky obsahují peptidové nebo proteinové sekvence variabilního těžkého a/nebo lehkého řetězce mající antigenní specificitu pro mAb 2C10, například V_h a V_l řetězců. Ještě jiná výhodná pozměněná protilátka podle předkládaného vynálezu je charakterizována aminokyselinovou sekvencí obsahující alespoň jeden, výhodně všechny, CDR variabilního regionu těžkého a/nebo lehkého řetězce krysí protilátky 2C10 a zbývající sekvence odvozené z lidského zdroje nebo jeho funkčního fragmentu nebo analogu.

V ještě dalším provedení může být upravená protilátka podle předkládaného vynálezu navázána na další činidlo. Například, rekombinantní DNA technologie může být použita pro produkci upravené protilátky podle předkládaného vynálezu, ve které je Fc fragment nebo CH2 CH3 doména kompletní protilátky nahrazena enzymem nebo jinou detekovatelnou molekulou (t.j. polypeptidovou • · ···· « ♦· · ·

9 9 9 9 9 9 « · · * · · · · « » efektorovou nebo reportérovou molekulou).

Druhý imunoglobulinový partner může být také operativně navázán na neimunoglobulinový peptid, protein nebo fragment heterologní k sekvenci obsahující CDR, například mající antigenní specificitu krysí 2C10. Výsledný protein může mít po expresi jak antigenní specificitu k IL-18, tak neimunoglobulinové charakteristiky. Těmito charakteristikami fúzního partnera mohou být, například, funkční charakteristiky jako je jiná vazba nebo receptorová doména, nebo terapeutické charakteristiky, pokud je fúzní partner sám terapeutický protein, nebo další antigenní charakteristiky.

Jiným výhodným proteinem podle předkládaného vynálezu může být kompletní protilátková molekula obsahující kompletní těžké a lehké řetězce nebo jakékoliv jejich samostatné fragmenty, jako jsou Fab nebo F(ab’)₂ fragmenty, dimer těžkého řetězce nebo jakékoliv jejich minimální rekombinantní fragmenty, jako je F_v nebo jednořetězcová protilátka (SCA) nebo jakákoliv jiná molekula se stejnou specificitou jako vybraná dárcovská mAb, například mAb 2C10. Takový protein může být použit ve formě pozměněné protilátky nebo může být použit v nefúzované formě.

I když je druhý imunoglobulinový partner odvozen od protilátky odlišné od dárcovské protilátky, například od pracovních regionů nebo konstantních regionů jakéhokoliv izotypu nebo třídy imunoglobulinů, vzniká geneticky upravená protilátka. Upravené protilátky mohou obsahovat konstantní regiony a variabilní pracovní imunoglobulinové regiony z jednoho zdroje, například z akceptorové protilátky, a jeden nebo více (výhodně všechny) CDR z dárcovské protilátky, například z anti-IL-18 protilátky, která je zde popsána. Dále mohou být provedeny alterace, například delece, substituce nebo adice pracovního regionu variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové mAb, nebo CDR regionů donorové • · · · · · • · · • · · • 9 · 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 • 9 9 9

9999999 · · <* protilátky, za účelem zachování vazebné specificity pro antigen dácovské protilátky.

Takové upravené protilátky jsou navržené tak, aby využívaly jeden (nebo oba) variabilní těžké a/nebo lehké řetězce 11-18 mAb (volitelně modifikované popsaným způsobem) nebo jeden nebo více níže identifikovaných CDR těžkého nebo lehkého řetězce. Předpokládá se, že upravené protilátky budou neutralizační, t.j. budou blokovat vazbu receptoru na IL-18 protein a také budou blokovat nebo bránit proliferaci buněk závislých na IL-18.

Takové upravené protilátky mohou zahrnovat humanizované protilátky obsahující pracovní regiony vybraného lidského imunoglobulinu nebo podtypu imunoglobulinu, nebo chimérické protilátky obsahující lidské těžké a lehké konstantní regiony fúzované na funkční fragmenty IL-18 protilátky. Vhodnou lidskou (nebo jinou živočišnou) akceptorovou protilátkou může být protilátka vybraná z běžné databáze, například z KABAT^R databáze, Los Alamos databáze a Swiss Protein databáze, podle homologie s nukleotidovou a aminokyselinovou sekvencí dárcovské protilátky. Lidská protilátka charakterizovaná homologií s pracovními regiony dárcovské protilátky (na úrovni aminokyselin) může být vhodná pro dodání konstantního regionu těžkého řetězce a/nebo variabilního pracovního regionu těžkého řetězce pro inserci do dárcovského CDR. Vhodná akceptorová protilátka dodávající konstantní nebo variabilní pracovní regiony lehkého řetězce může být vybrána stejným způsobem. Je třeba uvést, že těžké a lehké řetězce akceptorové protilátky nemusí pocházet ze stejné akceptorové protilátky.

Požadované heterologní pracovní a konstantní regiony jsou vybrány z lidských imunoglobulinových tříd a podtypů, jako je IgG (podtypy 1 až 4) , IgM, IgA a IgE. Nicméně, akceptorová protilátka nemusí obsahovat pouze lidské imunoglobulinové sekvence. Například může být připraven gen, ve kterém je DNA sekvence kódující část lidského imunoglobulinového řetězce fúzována na DNA sekvenci kódující neimunoglobulinovou aminokyselinovou sekvenci, jako je polypeptidový efektor nebo reporterová molekula.

Jeden příklad zejména výhodné humanizované protilátky obsahuje CDR 2C10 insertovaný do pracovních regionů vybrané lidské protilátky. Pro neutralizační humanizované protilátky jsou jeden, dva nebo lépe tři CDR z variabilních regionů těžkého a/nebo lehkého řetězce IL-18 protilátky insertovány do pracovních regionů vybrané lidské protilátky, kde nahrazují přirozené CDR této protilátky.

Výhodně jsou v humanizované protilátce variabilní domény v lidských těžkých a lehkých řetězcích upraveny jednou nebo více náhradami CDR. Je možno použít všech šesti CDR nebo různé kombinace méně než šesti CDR. Výhodně se nahradí všech šest CDR. je možno nahradit CDR pouze v lidském těžkém řetězci a jako lehkého řetězce použít nemodifikovaný lehký řetězec z lidské akceptorové protilátky. Alternativně, kompatibilní lehký řetězec může být vybrán z jiné lidské protilátky z běžné databáze protilátek. Zbytek upravené molekuly může být odvozen z jakéhokoliv vhodného akceptorového lidského imunoglobulinu.

Upravená humanizovaná protilátka ma tedy výhodně strukturu přirozené lidské protilátky nebo jejího fragmentu a má kombinaci vlastností nutných pro účinné terapeutické použití, například pro léčbu zánětlivých onemocnění zprostředkovaných IL-18 u člověka, nebo pro diagnostické použití.

Jako jiný příklad může upravená protilátka obsahovat CDR variabilního regionu lehkého řetězce 2C10 a CDR variabilního * · · ·

regionu těžkého řetězce 13G9. Vzniklá humanizovaná protilátka by měla být charakterizována stejnou vazebnou specificitou pro antigen a vysokou afinitou jako mAb 2C10.

Odborníci v oboru by si měli uvědomit, že upravená protilátka může být dále modifikována změnami v aminokyselinách variabilní domény bez toho, že by byla nutně ovlivněna specificita a vysoká afinita dárcovské protilátky (t.j. jedná se analog). Předpokládá se, že aminokyseliny těžkého a lehkého řetězce mohou být substituovány jinými aminokyselinami v pracovním regionu variabilní domény nebo v CDR nebo v obou.

Dále, konstantní region může být pozměně za účelem zesílení nebo zeslabení vybraných vlastností moleku podle předkládaného vynálezu, například dimerizace, vazby na Fc receptory nbeo schopnosti vázat a aktivovat komplement (viz např. Angal et al., Mol. Immunol. 30: 105-108 (1993); Xu et al., J. Biol. Chem. 269: 3469-3474 (1994); Winter et al., EP 307434-B).

Pozměněná protilátka, kterou je chimérická protilátka, se liší od humanizované protilátky popsané výše tím, že obsahuje celý variabilní region těžkého a lehkého řetězce non-lidské dárcovské protilátky, včetně pracovních regionů, společně s konstantními regiony lidského imunoglobulinu pro oba řetězce. Přepokládá se, že chimérické protilátky, které si obsahují další non-lidské sekvence ve srovnání s humanizovanými protilátkami podle předkládaného vynálezu, mohou vyvolat u člověka významnou imunitní reakci.

Takové protilátky mohou být použitelné v prevenci a léčbě onemocnění zprostředkovaných IL-18, jak je popsáno dále.

VI. Produkce pozměněných protilátek a geneticky upravených protilátek • · · · · · · · • · · ♦ ······« «· ·

Variabilní sekvence lehkých a/nebo těžkých řetězců a CDR mAb 2C10 nebo jiných vhodných dárcovských protilátek a jejich kódující nukleové kyseliny jsou použity pro konstrukci pozměněných protilátek, výhodně humanizovaných protilátek, podle předkládaného vynálezu, za použití následujícího postupu. Stejné nebo podobné techniky mohou být použity pro přípravu jiných provedení tohoto vynálezu.

Hybridom produkující vybranou dárcovskou protilátku, například krysí protilátku 2C10, se běžným způsobem klonuje a DNA pro jeho variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce se získá technikami známými odborníkům v oboru, například technikami popsanými v Sambrook et al. (Molecular Cloning (A Laboratory manual), 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce 2C10 obsahující alespoň regiony kódující CDR a ty části pracovních reginů variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové mAb nutné pro zachování vazebné specificity dárcovské mAb, stejně jako zbývající imunoglobulinové části protilátkových řetězců z lidského imunoglobulinu, mohou být získány za použití polynukleotidových primerů a reverzní transkriptasy. Regiony kódující CDR se identifikují pomocí známých databází a srovnáním s jinými protilátkami.

Potom může být připravena krysí/lidská chimérická protilátka a může být testována na vazebnou schopnost. Taková chimérická protilátka obsahuje celé V_h a V_l regiony non-lidské dárcovské protilátky a konstantní regiony lidského Ig pro oba řetězce.

Humanizovaná protilátka může být odvozena z chimérické protilátky nebo, výhodněji, může být připravena synteticky insercí regionů kódujících CDR dárcovské mAb z těžkých a lehkých řetězců do vybraného pracovního rámce těžkého a lehkého řetězce. Alternativně může být humanizovaná protilátka podle předkládaného vynálezu připravena standardními technikami mutagenese. Získaná humanizovaná protilátka obsahuje lidské pracovní regiony a regiony kódující CDR dárcovské protilátky. Mohou být provedeny další úpravy zbytků pracovního rámce. Získaná humanizovaná protilátka může být exprimována v rekombinantní hostitelské buňce, jako jsou COS, CHO nebo myelomové buňky. Touto technikou mohou být připraveny jiné humanizované protilátky za použití jiných vhodných neutralizačních, vysoce afinitních non-lidských protilátek specifických pro IL-18.

Běžné expresní vektory nebo rekombinantní plasmidy mohou být připraveny umístěním těchto kódujících sekvencí pro pozměněnou protilátku do operativní vazby s běžnými regulačními kontrolními sekvencemi schopnými kontroly replikace a exprese v, a/nebo sekrece z hostitelské buňky. Mezi regulační sekvence patří promotorové sekvence, jako je například CMV promotor, a signální sekvence, které mohou být získány ze známých protilátek. Obdobně může být připraven druhý expresní vektor, který obsahuje DNA sekvenci, která kóduje komplementární lehký nebo těžký řetězec protilátky. Výhodně je tento druhý expresní vektor identický jako první expresní vektor s výjimkou kódující sekvence a selektovatelných markérů, aby bylo co možná nejlépe zajištěno to, že každý polypeptidový řetězec je funkčně exprimován. Alternativně mohou být kódující sekvence pro těžký a lehký řetězec pozměněné protilátky umístěny na jediném vektoru.

Vybraná hostitelská buňka se současně transfektuje běžnými technikami jak prvním, tak druhým vektorem (nebo se jednoduše transfektuje jediným vektorem) za zisku transfektováné hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu obsahující oba buď rekombinantní, nebo syntetické lehké a těžké řetězce.

Transfektováná buňka se potom kultivuje běžnými technikami za zisku geneticky upravené protilátky podle předkládaného vynálezu.

Humanizovaná protilátka, která je tvořena spojením rekombinantního těžkého a/nebo lehkého řetězce, se vyhledává v kultuře pomocí vhodného testu, jako je ELISA nebo RIA. Podobné běžné techniky mohou být použity pro konstrukci jiných pozměněných protilátek a molekul podle předkládaného vynálezu.

Vhodné vektory pro klonování a subklonování použité ve způsobech a přípravě prostředků podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány odborníkem v oboru. Například může být použito běžné pUC série klonovacích vektorů. Jedním použitelným vektorem je pUC19, který je komerčně dostupný od dodavatelů jako je Amersham (Buckinghamshire, Velká Británie) nebo Pharmacia (Uppsala, Švédsko). Dále, jakýkoliv vektor, který je snadno replikovatelný, má dostatek klonovacích míst a selektovatelných genů (například pro resistenci na antibiotika) a snadno se s ním pracuje, může být použit pro klonování. Proto není výběr klonovacího vektoru limitujícím faktorem pro předkládaný vynález.

Obdobně, vektory použité pro expresi upravených protilátek podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány odborníkem v oboru z mnoha běžných vektorů. Vektory také obsahují vybrané regulační sekvence (jako jsou CMV promotory), které řídí replikaci a expresi heterologních DNA sekvencí ve vybrané hostitelské buňce. Tyto vektory obsahují výše popsané DNA sekvence, které kódují upravenou protilátku nebo pozměněný region kódující imunoglobulin. Dále mohou vektory obsahovat vybrané imunoglobulinové sekvence modifikované insercí požadovaných restrikčních míst pro snadnou manipulaci.

Expresní evktory mohou být také charakterizovány geny vhodnými pro amplifikaci exprese heterologních DNA sekvencí, například savčí gen pro dihydrofolat reduktasu (DHFR). mezi jiné výhodné vektorové sekvence patří póly A signální sekvence, například z • · · · * · ·· · hovězího růstového hormonu (BGH) a promotorové sekvence betaglobinu (betaglopro). Použitelné expresní vektory mohou být syntetizovány technikami dobře známými odborníkům v oboru.

Složky takových vektorů, například replikony, selekční geny, zesilovače transkripce, promotory, signální sekvence a podobně, mohou být získány z komerčních nebo přirozených zdrojů nebo mohou být syntetizovány známými postupy, a potom jsou tyto složky použity pro řízení exprese a/nebos ekrece produktu rekombinantní DNA ve vhodném hostiteli. V oboru známé expresní vektory různých typů pro savčí, bakteriální, hmyzí, kasinkovou a mykotickou exprese mohou být tak vybrány pro tento účel.

Předkládaný vynález také zahrnuje buněčnou linii transfektovanou rekombinantním plasmidem obsahujícím kódující sekvence upravené protilátky nebo jejích imunoglobulinoyych molekul. Hostitelské buňky vhodné pro klonování a jiné manipulace s těmito klonovacími vektory jsou také běžné. Nicméně, pro replikaci klonovacích vektorů a další stupně konstrukce pozměněných protilátek podle předkládaného vynálezu se nejvýhodněji použijí různé kmeny E. colí.

Vhodné hostitelské buňky nebo buněčné linie pro expresi upravené protilátky nebo pozměněné protilátky podle předkládaného vynálezu jsou výhodně savčí buňky jako CHO, COS, fibroblasty (například 3T3) a myeloidní buňky, nejlépe CHO nebo myeloidní buňky. Mohou být použity lidské buňky, což umožňuje dosažení lidského charakteru glykosylace molekuly. Alternativně mohou být použity jiné eukaryotické linie. Výběr vhodných savčích hostitelských buněk a způsobů pro transformaci, kultivaci, amplifikaci, testování a produkci produktu a přečištění, je v oboru známé. Viz, například, Sambrook et al., citovaný výše.

·«··** · · · ··9 • · · ·· · 9 9 ·|· • · · · · 9 ·9 • · 99 9««··· ···· 99 9 ·9 ·· ·· 9·· ···· ·9999

Bakteriální buňky mohou být vhodné jako hostitelské buňky vhodné pro expresí rekombínantních Fab podle předkládaného vynálezu (viz např. Pluckthun, A., Immunol. Rev. 130: 151-188 (1992)). Nicméně, vzhledem k tendenci proteinů exprimovaných v bakteriálních buňkách být v nesložené nebo nesprávně složené formě nebo v neglykosylováné formě, musí být každý rekombinantní Fab produkovaný v bakteriální buňce testován na zachování vazebné schopnosti pro antigen. Pokud je molekula exprimovaná v bakteriální buňce produkována ve správně složené formě, tak bude tato bakterie vhodným hostitelem. Například, různé kmeny E. coli používané pro expresi jsou dobře známými hostitelskými buňkami v oblasti biotechnologií, v tomto způsobu mohou být také použity různé kmeny B. subtilis, Streptomyces, jiných bacilů a podobně.

Pokud je to žádoucí, mohou být kmeny kvasinek známé v oboru také použity jako hostitelské buňky, stejně jako hmyzí buňky, například Drosophila a Lepidoptera a virové expresní systémy. Viz například Miller et al., Genetic Engineering 8: 277-298, Plenům Press (1986) a odkazy zde citované.

Obecné způsoby, kterými mohou být připraveny vektory podle předkládaného vynálezu, způsoby transfekce nutné pro produkci hostitelských buněk podle předkládaného vynálezu a způsoby kultivace nutné pro produkci pozměněné protilátky podle předkládaného vynálezu z takových hostitelských buněk, jsou všechno běžné techniky.Obdobně, po produkci mohou být pozměněné protilátky podle předkládaného vynálezu přečištěny z buněčného obsahu za použití standardních technik, včetně srážení síranem amonným, afinitních kolon, chromatografie na koloně, gelové elektroforesy a podobně. Takové techniky jsou známé v oboru a nelimitují předkládaný vynález.

Ještě jiný způsob exprese humanizovaných protilátek může ···· • 4 · 444'44

4 4 4 4 44

4444 4 4 44 ·4 444 4444 444 využívat expresi v transgenním zvířeti, jak je popsáno v US patentu 4873316. Tento patent popisuje expresní systém využívající promotoru zvířecího kaseinu, který po transgenní inkorporaci do savce umožňuje produkci rekombinantního proteinu v mléku samic.

Po expresi požadovaným způsobem se upravená protilátka testuje na aktivitu in vitro pomocí vhodného testu. V současnosti se využívá běžných ELISA testovacích formátů pro hodnocení kvalitativní a kvantitativní vazby upravené protilátky na IL-18. Kromě toho mohou být pro verifikaci neutralizační aktivity použity jiné testy in vitro před tím, než se provedeou klinické studie na lidech pro hodnocení persistence upravené protilátky v těle za působení obvyklých vylučovacích mechanismů.

Podle obecných postupů popsaných pro přípravu humanizovaných protilátek může odborník v oboru také konstruovat humanizované protilátky z jiných dárcovských IL-18 protilátek, variabilních regionů a CDR peptidů, které zde byly popsány. Upravené protilátky mohou být produkovány s pracovními regiony variabilních regionů potenciálně rozpoznávanými jako vlastní příjemcem upravené protilátky. Malé modifikace pracovních regionů variabilních regionů mohou způsobit velké zvýšení vazby na antigen bez významného zvýšení imunogenicity pro příjemce. Takové upravené protilátky mohou účinně léčit onemocnění zprostředkované 11-18 u člověka. Takové protilátky mohou být také použitelné pro diagnostiku takových onemocnění.

VII. Terapeutické/profylaktické použití

Předkládaný vynález se také týká způsobu léčby lidí s příznaky souvisejícími s autoimunitní reakcí, jako je MS, kde uvedený způsob zahrnuje podání účinné dávky protilátek včetně jedné nebo více upravených protilátek podle předkládaného vynálezu nebo

9 9·9 9 9 99 9 · 9 99 99999 • 9 9 9 99« • 9 9 9 99999 ·· ·· 999 9999 99999 jejich fragmentů.

Terapeutická odpověď indukovaná použitím molekul podle předkládaného vynálezu je produkována vazbou na lidský IL-18 a následným blokováním stimulace Thl. Tak jsou molekuly podle předkládaného vynálezu, v prostředcích a přípravcích pro terapeutické použití, vhodné pro jedince s autoimunitním onemocněním, jako je například MS, RA, IDDM, IBD a psoriasa.

Pozměněné protilátky, protilátky a jejich fragmenty podle předkládaného vynálezu mohou být také použity společně s jinými protilátkami, zejména s lidskými mAb reaktivními s jinými markéry (epitopy) odpovědnými za stavy, proti kterým je namířena upravená protilátka podle předkládaného vynálezu.

Předpokládá se, že terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu jsou vhodná pro léčbu autoimunitních onemocnění v délce od 2 dnů do 6 měsíců nebo podle potřeby. Delší léčba může být žádoucí například tehdy, když se léčí MS nebo podobné onemocnění. Dávka a trvání léčby souvisí s relativním přetrváváním molekul podle předkládaného vynálezu v lidské cirkulaci a tyto veličiny mohou být upraveny odborníkem v oboru podle léčeného onemocnění a celkového zdravotního stavu pacienta.

Způsob podání terapeutického činidla podle předkládaného vynálezu může být jakýkoliv vhodný způsob, kterým je možno dodat činidlo hostiteli. Pozměněné protilátky, protilátky, geneticky upravené protilátky a jejich fragmenty, a farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu jsou zejména vhodné pro parenterální podání, t.j. podkožní, intramuskulární, intravenosní nebo intranasální.

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou být • · · · · 9 • · · ·· · · · · · • · · · · · « • · 9 9 · · · «· • · · · 9 9 99 ♦ · ·· 999 9999 999 připravena jako farmaceutické prostředky obsahující účinné množství upravené (například humanizované) protilátky podle předkládaného vynálezu jako aktivní složku ve farmaceuticky přijatelném nosiči. U profylaktických činidel podle předkládaného vynálezu se upřednostňuje vodná suspenze nebo roztok obsahující upravenou protilátku, výhodně pufrované na fyziologické pH, ve formě připravené pro injekční podání. Prostředky pro parenterální podání budou obvykle obsahovat roztok upravené protilátky podle předkládaného vynálezu nebo jejich směs rozpuštěný ve farmaceuticky přijatelném nosiči, výhodně ve vodném nosiči. Mohou být použity různé vodné nosiče, například 0,4% salinický roztok, 0,3% glycin a podobně. Tyto roztoky jsou sterilní a neobsahují částečky. Tyto roztoky mohou být sterilizovány běžnými, dobře známými sterilizačními technikami (například filtrací). Prostředky mohou osbahovat farmaceuticky přijatelné pomocné substance nutné pro přiblížení se fyziologickým podmínkám, jako jsou činidla upravující pH a pufrovací činidla atd. Koncentrace protilátky podle předkládaného vynálezu v takových farmaceutických prostředcích se může velmi lišit, t.j. od méně než 0,5% , obvykle okolo 1%, do až 15 nebo 20% hmotnostních a bude vybrána hlavně podle objemu kapalin, viskozity atd., pro konkrétní vybraný způsob podání.

Tak mohou být farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu pro intramuskulární injekci osbahovat 1 ml sterilní pufrované vody a přibližně 1 ng až přibližně 100 mg, například 50 ng až přibližně 30 mg, nebo lépe přibližně 5 mg až přibližně 25 mg, upravené protilátky podle předkládaného vynálezu. Podobně, farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu pro intravenosní infusi mohou obsahovat přibližně 250 ml sterilního Ringrova roztoku a přibližně 1 až přibližně 30 a výhodně 5 mg až přibližně 25 mg upravené protilátky podle předkládaného vynálezu. Způsoby přípravy prostředků pro parenterální podání jsou dobře ♦ · · · · · φ φ φφφ φ φ · ·· · ····« • · · φ φ · ·· ·· · · φ · φ ·· φ • φ · φ φφ φ φ φ ♦ Φ ·· ··· ···· φφ φφφ známé odborníkům v oboru a jsou podrobněji popsány, například, v Remington's Pharmaceutical Science, 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Je výhodné, aby terapeutické činidlo podle předkládaného vynálezu, když je ve farmaceutickém prostředku, bylo ve formě dávkových jednotek. Vhodná terapeuticky účinná dávka může být snadno určena odborníkem v oboru. Pro účinnou léčbu zánětlivých onemocnění u člověka nebo jiného zvířete by měla být jedna dávka od přibližně 0,1 mg do přibližně 20 mg na 70 kg tělesné hmotnosti proteinu nebo protilátky podle předkládaného vynálezu podána parenterálně, výhodně i.v. nebo i.m. (intramuskulárně). Taková dávka může být, pokud je to nutné, opakována ve vhodných časových intervalech vybraných lékařem během léčby onemocnění.

Pozměněné protilátky a upravené protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být také použity v diagnostických režimech, například v testech pro určení onemocnění zprostředkoavné IL-18nebo pro sledování progrese onemocnění. Jako diagnostická činidla mohou být tyto protilátky běžně značeny pro použití v ELISA a jiných běžných testech pro měření koncentrace IL-18 v séru, plasmě nebo jiné vhodné tkáni, nebo pro měření uvolňování IL-18 v lidských buňkách v kultuře. Testy, ve kterých jsou pozměněné protilátky použity, jsou běžné a neomezují předkládaný vynález.

Tak se jedno provedení předkládaného vynálezu týká způsobu pro diagnostiku autoimunitního onemocnění a jiných stavů asociovaných s produkcí Thl T-lymfocytů u pacientů, který zahrnuje kroky určení množství lidského IL-18 ve vzorku (plasmy nebo tkáně) získaného od uvedeného pacienta a srovnání uvedeného určeného množství s průměrným množstvím lidského IL-18 v normální populaci, kde přítomnost signifikantně zvýšeného množství IL-18 ve vzorku od ·« ···· pacienta ukazuje na přítomnost autoimunitního onemocnění a jiných stavů spojených s nadbytkem produkce Thl T-lymfocytů.

Protilátky, pozměněné protilátky a jejich fragmenty zde popsané mohou být lyofilizovány pro skladování a rekonstituovány pomocí vhodného nosiče před použitím. Bylo prokázáno, že tato technika je účinná pro běžné imunoglobuliny a mohou být použity v oboru známé techniky lyofilizace a rekonstituce.

Následující příklady ilustrují různé aspekty vynálezu včetně knstrukce příkladných upravených protilátek a jejich exprese ve vhodných vektorech a hostitelských buňkách, a nijak neomezují rozsah vynálezu. Všechny aminokyseliny jsou označeny běžným trojpísměnným nebo jednopísmenným kódem. Všechny nutné restrikční enzymy, plasmidy a jiná činidla a materiály jsou získané z komerčních zdrojů, pokud není uvedeno jinak. Všechny obecné způsoby klonování a jiné techniky rekombinatní DNA metodologie jsou provedené podle T. Maniatis et al., výše, nebo druhého vydání této publikace (1989), ed. Sambrook et al., stejný yvdavatel (Sambrook et al.”).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Produkce mAb k 11-18

A. Příprava monoklonální protilátky

Myši (Pl hybridy Balb/c a C57BL/6) nebo krysy (Sprague Dawley) se imunizují 30 ug rekombinantního IL-18 v adjuvans a o 4 týdny později 30 ug IL-18 v adjuvans. Podle dobrého sérového titru protilátek proti IL-18 byla zvířatům podána další imunizace 10-30 ug IL-18 (i.p. v salinickém roztoku. Tři dny po poslední imunizaci byla provedena splenektomie. Myší nebo krysí buňky sleziny se

		···«	* · ·
•	•	•	• · · ·	• ·	• ·
•	•		• 9	• ♦
•	•	• ·	• ·	• ·
	• ·	• ·	··· ····	··	··

použily pro přípravu hybridomů za použití standardních technik (Zola, H., ed., Monoclonal Antibodies, CRC Press lne., 1987). Pozitivní hybridomy se klonovaly metodou limitního ředění.

B. Přečištění mAb mAb se přečistily pomocí ProsepA (Bio Processing, Consett, UK) chromátografie podle návodu výrobce. mAb měly více než 95% čistotu podle SDS-PAGE.

C. Izotypování mAb

Všechny krysí a myší mAb byly izotypovány za použití komerčně dostupných kitů (Zymed, Amersham) a bylo zjištěno, že náleží do třídy IgGl kappa.

Příklad 2: Testy

A. Biotinylace IL-18

IL-18 se biotinyloval za použití kitu zakoupeného od Molecular Probes, lne., za použití poměru 10:1 biotxnylačního činidla. Biotinylace neměla žádný vliv na aktivitu IL-18.

B. Testování hybridomů

96-jamkové plotny byly potaženy streptavidinem (2 ug/ml, 100 ug/jamku v PBS) inkubací přes noc při teplotě 4 °C. Roztok se potom aspiroval a nespecifická vazebná místa se blokovala 250 ug/jamku 1% hovězího sérového albuminu (BSA) v TBS pufru (50 mM Trís, 150 mM NaCl, 0,02% Kathon, pH 7,4) po dobu 5-60 minut při teplotě místnosti. Po tomto a každém dalším kroku se plotna promyla 4-krát v promývacím pufru (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% •Λ ·44« • 44 »

«4 · -»'···

9 9 1> · 4 ♦'4 • » > W ·· 4 4· »· 4* 4*4 ···» 44>f«

Tween 20, 0,02% Kathon, pH 7,4). Do každé jamky se přidalo 100 ul biotin-IL-18 (100 ng/ml) v testovacím pufru (0,5% BSA, 0,05% hovězí gamma-globulin, 0,1% Tween 40, 20 uM kyseliny diethylentriaminpentaoctové v TBS pufru) a plotny se inkubovaly přes noc po dobu 30 minut při teplotě místnosti v inkubátoru za třepání. Potom se do každé jamky přidalo 50 ul hybridomového media a 50 ul testovacího pufru a provedla se inkubace po dobu 60 minut při teplotě místnosti v inkubátoru za třepání. Do každé jamky se potom přidalo 100 ul 0,5 ug/ml Eu³“^- značené anti-myší nebo anti-krysí protilátky v testovacím pufru. Nakonec se přidalo 200 ug/jamku zesilovacího činidla (Wallac) a proevdla se inkubace po dobu 5 minut při teplotě místnosti a měřila se fluorescence v čase. Hybridomy s hodnotami > 100 K se expandovaly do 24 jamkových ploten.

C. Imunotesty

Pro stanovení specificity připravených anti-IL-18 mAb se

96-jamkové plotny potáhly, blokovaly se a inkubovaly se s biotinem-IL18 způsobem uvedeným výše. Všechny následující inkubace se provedly v inkubátoru za třepání při teplotě místnosti. Po promytí jamek 50 ul IL-18 (3 ug/ml) nebo testovacím pufrem se přidalo 50 uM mAb a provedla se inkubace po dobu 60 minut. Po promytí jamek se na dobu 60 minut přidalo 100 ul 0,5 ug/ml Eu³⁺ značené anti-myší nebo anti-krysí protilátky v testovacím pufru a jamky se potom promyly 100 ul/jamku zesilovacího činidla (Wallac) a provedla se inkubace po dobu 5 minut při teplotě místnosti a měřila se fluorecence v čase. Všechny pozitivní hybridomy vykazovaly odstranění vazby IL-18.

D. Neutralizační test

PBMC od zdravých dárců se izolovaly Ficol-Paque (Pharmacia)

.··.···:

• e · • · · · • · · · « · · · gradientem a kultivovaly se v 96-jamkových plotnách v 10% FBS DMEM/F12 mediu s 1 ug/ml ConA (Sigma) za přítomnosti IL-18 (5 ng/ml) a/nebo mAb. Po 18 hodinové kultivaci při teplotě 37 °C, 5% CO ve vzduchu, 90% vlhkosti, se odebralo 25 ul media a koncentrace interferonu gamma (IFNg) se měřila imunotestem. Výsledky, získané z průměrůu 3 pokusů, jsou shrnuty v tabulce 1.

E. Měření afinity monoklonální protilátky

Afinita přečištěných mAb se měřila pomocí BIAcore optického biosenzoru (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden) za použití průtoku 30 ul/min. Data kinětiky se hodnotila pomocí vztahů popsaných dříve (Karlsson et al., J. Immunol. Meth. 145: 229-240 (1991), která jsou zde uvedena jako odkaz ve své úplnosti. mAb (ředěné v HBS pufru, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,01% Tween-20, pH 7,4) se injikovaly přes králičí anti-myší IgG Fc nebo kozí anti-krysí IgG Fc povrch a potom se pufr nechal protékat a zaznamenávala se RU. Potom se po dobu 180 sekund injikoval IL-18 (ředěný v HBS pufru) a pufr se nechal protékat po dobu 500 sekund a zaznamenávaly se RU. Povrch sensorového čipu se regeneroval injekcí 0,1 M kyseliny fosforečné. Vstupní hodnoty (Kass) a výstupní hodnoty (Kdiss) vazby se vypočetly za použití BIAcore softwaru a společně vedly k zisku rovnovážné konstanty (K) 12xl0^-9 M pro mAb 13G9, 3,9xl0^-11 pro mAb 2C10 a 1,5 x 10^-10 pro mAb 14B7. Viz tabulka 1.

F. Analýza epitopů monoklonální protilátky

Analýza epitopů přečištěných mAb byla měřena v BIAcore. Při použití průtoku 10 ul/min se první mAb (ředěná v HBS pufru) přes králičí anti-myší IgG Fc nebo kozí anti-krysí IgG Fc povrch a potom se provedla injekce IL-18 na dobu 240 sekund a injekce blokovacích mAb po dobu 48 sekund a injekce druhé mAb po dobu 240 sekund. Povrch se regeneroval injekcí 0,1 M kyseliny fosforečné a RU se zaznamenávaly po každé injekci. Bylo zjištěno, že mAb 13G9, 2C10 a 14B7 mají podobné nebo překrývající se epitopy.

Tabulka 1: Afinita a neutralizační aktivita mAb reaktivních s lidským IL-18

mAb	Kd (pM)a	Neutralizace IC (nM)to
2C10 (krysí)	39	0,1
14B7 (krysí)	150	0,2
13G9 (myší)	12000	3,0

^a Určeno analýzou optickým biosensorem (BIAcore) (25 °C)

Inhibice produkce IFN-gamma (v nM) PBMC v reakci na 5 ng/ml lidského IL-18.

Příklad 3: CDR sekvence

Klonování genu a analýza sekvence:

Geny variabilních těžkých a lehkých řetězců se klonovaly z hybridomových buněk za použití standardních molekulárně biologických metod, které jsou stručně popsány dále. Celková RNA se izolovala z hybridomových buněk za použití TRIzol činidla (Life Technologies kat. č. 15596-026) podle návodu výrobce. RNA se reverzně transkribovala pomocí RT-PCR kitu podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim kat. č. 1483-188) za použití poly-dT oligonukleotidu pro priming. Po syntéze prvního řetězce cDNA se těžké a lehké V regiony amplifikovaly PCR za použití 3’ primerů specifických pro konstantní region a degenerovaných 5’ primerů. Degenerované 5’-primerové sekvence se navrhly tak, aby k dovály • · · · · · dříve určené N-koncové aminokyselinové sekvence variabilních regionů těžkého nebo lehkého řetězce. Kompletní sekvence z mnoha klonů se získaly z každé PCR amplifikace a sestavily se tak, aby byla získána konvenční sekvence. Tak je prvních 17 baží DNA sekvence pro těžké a lehké řetězce generováno PCR primerem, nicméně translatovaná proteinová sekvence je přirozená.

Nukleotidové a odvozené aminokyselinové sekvence pro hybridomové protilátky 2C10, 13G9 a 14B7 jsou uvedeny na obr. 1-6. V každém případě jsou CDR a jejich kódující nukleotidové sekvence orámečkované. Degenerované primerové sekvence jsou uvedeny tučně.

• · • · · ·

Seznam sekvencí <110> Holmes, Stephen D.

Ho, Yen Sen

Taylor, Alexander

Abdel-Meguid, Sherin S.

<120> Rekombinantní antagonisté IL-18 pro léčbu onemocnění zprostředkovaných IL-18 <130> P50897 <140> 60/125299 <141> 1999-03-19 <160> 48 <170> FastSEQ pro Windows Verze 3.0 <210> 1 <211> 324 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> CDS <222> (1)....(324) <223> V region lehkého řetězce

<400>

1

gac

att

caa

atg

acc

cag

tet

cca

get

tcc

ctg

tet

gca

tet

ctg -gga

48

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Leu Gly

1

5

10

15

gaa

act

gtc

tcc

atc

gaa

tgt

ctg

gca

agt

gag

gac

ata

tac

act tat

96

Glu

Thr

V$1

Ser

Ile

Glu

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Asp

Ile

Tyr

Thr Tyr

20

25

30

* · · · · ·

tta

aca

tgg

tat

cag

cag

aaa

cca

995

aaa

tet

cct

caa

ClC

ctg atc

Leu

Thr

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

35

40

-

45

tat ggt

gca Ala

aat Asn

aag Lys

ttg caa Leu Gin 55

gat Asp

ggg Gly

gtc Val

cca Pro

tea Ser 60

cgg Arg

ttc Phe

agt Ser

ggc Gly

192

Tyr

Gly 50

agt

gga

tet

ggc

aca

cag

tat

tet

ctc

aag

atc

age

ggc

ata

caa

cct

240

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Gly

Ile

Gin

Pro

65

70

75

80

gaa

gat

gaa

ggg

gat

tat

ttc

tgt

eta

cag

ggt

tcc

aag

ttt

ccg

ctc

288

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Leu

Gin

Gly

Ser

Lys

Phe

Pro

Leu

85

90

95

acg

ttc

ggt

tet

ggg

acc

aag

ctg

gag

atc

aaa

cgg

324

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

<210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Leu

Gly

1

5

10

15

Glu

Thr

Val

Ser

Ile

Glu

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Asp

Ile

Tyr

Thr

Tyr

20

25

30

Leu

Thr

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Gly

Ala

Asn

Lys

Leu

Gin

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Gly

Ile

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Leu

Gin

Gly

Ser

Lys

Phe

Pro

Leu

85

90

95

• · ······ · · · ·· • · · · · r ·· * · · · · ·

4» · · ♦ · ·· • · · · · · · · ·· · · · ·

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100105 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> CDS <222> (1)...(33) <223> cdr i lehkého řetězce VK2C10

A		<400>	3
	ctg	gca	agt	gag	gac	ata	tac	act	tat	tta	aca
-	Leu	Ala	Ser	Glu	Asp	Ile	Tyr	Thr	Tyr	Leu	Thr
	1				5					10

<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 4

Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Tyr Leu Thr

10 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> CDS <222> (1)...(21) <223> CDR II lehkého řetězce VK2C10 <400> 5 ggt gca aat aag ttg caa gat

Gly Ala Asn Lys Leu Gin Asp

5 • φ

<210>	6
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Rattus norvegicus
<400>	6
Gly Ala Asn	Lys Leu Gin Asp
1	5
<210>	7
<211>	27
<212>	DNA
<213>	Rattus norvegicus

<220>

<221>	CDS
<222>	(1) .. - (27)
<223>	CDR lij lehkého řetězce VK2C10

<400> 7

cta cag ggt tcc aag ttt ccg ctc acg

Leu Gin Gly Ser Lys Phe Pro Leu Thr

1 5

	<210>	8
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Rattus	norvegicus
	<400>	8
Leu	Gin Gly	Ser Lys	; Phe Pro Leu Thr
1		5
	<210>	9
	<211>	378
	<212>	DNA
	<213>	Rattus	norvegicus

<222> (1)...(378) <223> v region těžkého řetězce <400> 9 <220>

<221> CDS

gag gtc

cag cta Gin Leu

cag Gin 5

cag Gin

tet Ser

ggg Gly

get Ala

gag ctt Glu Leu 10

gtg aga

ccc Pro

ggg acc Gly Thr 15

48

Glu 1

Val

Val

Arg

tet

gtg

aag

tta

tet

tgc

aaa

gtt

tet

ggc

gaa

ata

agt

aca

gga

tac

96

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Val

Ser

Gly

Glu

Ile

Ser

Thr

Gly

Tyr

20

25

30

tat

ttc

cac

ttt

gtg

agg

ega

agg

cct

gga

cag

ggt

ctg

gaa

tgg

ata

144

Tyr

Phe

His

Phe

Val

Arg

Arg

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

gga

agg

att

gat

cct

gag

gat

gat

agt

act

aaa

tat

get

gag

agg

ttc

192

Gly

Arg

.Ile

Asp

Pro

Glu

Asp

Asp

Ser

Thr

Lys

Tyr

Ala

Glu

Arg

Phe

50

55

60

aaa

gac

agg

gcg

acg

ctc

act

gca

caa

aca

tec

tcc

aac

aca

gcc

tac

240

Lys

Asp

Arg

Ala

Thr

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

ctg

aac

ctc

age

age

ctg

acc

tet

gag

gac

act

gca

act

tat

ttt

tgt

288

Leu

Asn

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

acc

aca

tgg

cgg

ata

tac

ega

gat

agt

tet

ggc

ege

ccc

ttc

tat

gtt

336

Thr

Thr

Trp

Arg

Ile

Tyr

Arg

Asp

Ser

Ser

Gly

Arg

Pro

Phe

Tyr

.Val

100

105

110

atg

gat

gcc

tgg

ggt

caa

gga

get

tea

gtc

act

gtc

tcc

tea

378

Met

Asp

Ala

Trp

Gly

Gin

Gly

Ala

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 125 <210> 10 <211> 126

<212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10

Glu Val 1

Gin Leu

Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu

Val

Arg

Pro Gly Thr 15

5

10

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Val

Ser

Gly

Glu

Ile

Ser

Thr

Gly

Tyr

20

25

30

Tyr

Phe

His

Phe

Val

Arg

Arg

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

•40

45

Gly

Arg

Ile

Asp

Pro

Glu

Asp

Asp

Ser

Thr

Lys

Tyr

Ala

Glu

Arg

Phe

50

55

60

Lys

Asp

Arg

Ala

Thr

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Asn

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Thr

Thr

Trp

Arg

Ile

Tyr

Arg

Asp

Ser

Ser

Gly

Arg

Pro

Phe

Tyr

Val

100

105

110

Met

Asp

Ala

Trp

Gly

Gin

Gly

Ala

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Rattus norvegicus

<220>

<221> CDS

<222> (1) . . . (15)

<223> CDR -j- těžkého řetězce VH2C10

	<400>	11
gga	tac	tat	ttc	cac
Gly	Tyr	Tyr	Phe	His

5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Rattus norvegicus

<400> 12

Gly Tyr Tyr Phe His

5 • · 9 9 9 9 • · 9 *99 • · · · 9 9 99 ·· · · ····»·· 99 9 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> CDS <222> (1)...(51) <223> _CDR ji těžkého řetězce VH2C10 <400> 13

agg

at-t

gat

cct

gag

gat

gat

agt

act

aaa

tat

gct

gag

agg

ttc

aaa

48

Arg

Ile

Asp

Pro

Glu

Asp

Asp

Ser

Thr

Lys

Tyr

Ala

Glu

Arg

Phe

Lys

1

5

10

15

gac						51
	<210>	14
	<211>	16
	<212>	PRT
	<213>	Rattus norvegicus
	<400>	14
Arg	Ile Asp	Pro Glu Asp Asp Ser	Thr Lys	Tyr Ala Glu Arg	Phe Lys
1		5	10		15
	<210>	15
	<211>	51
	<212>	DNA
	<213>	Rattus norvegicus
	<220>
	<221>	CDS
	<222>	(1)..-(51)
	<223>	CDR III těžkého	řetězce	VH2C10

<400> 15 ·· • ·· * ♦ · • · • 9 tgg

Trp cgg ata

Arg Ile tac ega gat agt tc

Tyr Arg Asp Ser Ser

					• • • ·	• • · • ·	·· · · ♦ · · · 9 9 9 9 9 9 •999999 9 9 99 9
ggc	ege	ccc	ttc	tat	gtt	acg	gat 4 8
Gly	Arg	Pro	Phe	Tyr	Val	Met	Asp
	10					15

gcc

Trp <210>

<211>

<212>

<213>

<400>

Arg Ile

PRT

Rattus norvegicus

Tyr

Arg Asp Ser Ser

Gly

Arg

Pro

Phe

Tyr

Val

Met

Asp <210> 17 <211> 342 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)...(342) <223> v region lehkého řetězce <400> 17 ·

gac Asp 1

gtt Val

gtt Val

a tg Met

act Thr 5

caa Gin

act Thr

cct Pro

ctc Leu

tcc Ser 10

ctg cct

gtc Val

agt Šer

ctt Leu 15

gga Gly

48

Leu

Pro

gat

caa

gcc

tcc

atc

tet

tgc

aga

tet

agt

cag

age

ctt

gta

cac

agt

96

Asp

Gin

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

His

Ser

20

25

30

aat

gga

aac

acc

tat

tta

cat

tgg

tac

ctg

cag

aag

cca

ggc

cag

tet

144

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

35

40

45

cca

aag

ctc

ctg

atc

tac

aaa

gtt

tcc

aac

ega

ttt

tet

ggg

gtc

cca

192

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

240 • · 9

99

9 9'

9 99

99 9

gac Asp 65

agg Arg

ttc Phe

agt Ser

ggc Gly

agt Ser 70

gga Gly

tca Ser

ggt Gly

aca Thr

gat Asp 75

ttc Phe

aca Thr

ctc Leu

aag Lys

atc Ile 80

agc

aga

gtg

gag

gct

gag

gat

ctg

gga

gtt

tat

ttc

tgc

tet

caa

agt

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gly

Val

Tyr

Phe

Cys

Ser

Gin

Ser

85

90

95

aca

cat

gtt

cct

ccg

tac

acg

ttc

gga

ggg

ggg

acc

aag

ctg

gaa

ata

Thr

His

Val

Pro

Pro

Tyr

Thr

• Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

100

105

110

288

336 aaa cgg

Lys Arg

342 <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18

Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

Ser

Leu 15

Gly

1

5

10

Asp

Gin

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

His

Ser

20

25

30

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

35

40

45

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gly

Val

Tyr

Phe

Cys

Ser

Gin

Ser

85

90

95

Thr

His

Val

Pro

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

100 105 110

Lys Arg <210> 19 <211> 48 • 0 000 0 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1) -. . (48) <223> CDR I lehkého řetězce VK13G9 <400> 19

aga

tet

agt

cag

age

ctt

gta·

cac

agt

aat

ssa

aac

acc

tat

tta

cat

48

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

His

1

5

10

15

<210> 20 <211> 16
	<212> <213>	PRT Mus musculus
	<400>	20
Arg	Ser Ser	Gin	Ser Leů Val His Ser Asn	Gly Asn	Thr Tyr Leu His
1			5 10		15
	<210>	21
	<211>	21
	<212>	DNA
	<213>	Mus	musculus
	<220>
	<221>	CDS
	<222>	(1) .	.. (21)
	<223>	CDR	II lehkého řetězce	VK13G9
	<400>	21
aaa	gtt tec	aac	ega ttt tet			21
Lys	Val Ser	Asn	Arg Phe Ser
1			5

<210>	22
<211>	7
<212>	PRT

• ♦ ··♦♦ 0 *· ·♦

0 * *000 0 0 0

0 0 · · · ·

0 0. 0 0 0 0 0 0

0000 00 00

00 *000000 0* *

		<213>	Mus	musculus
		<400>	22
	Lys	Val Ser	Asn	Arg Phe Ser
	1			5
		<210>	23
		<211>	30
		<212>	DNA
		<213>	Mus	musculus
		<220>
		<221>	CDS
		<222>	(1) ·	. . (30)
		<223>	CDR III lehkého
		<400>	23
	tet	caa agt	aca	cat gtt cct	ccg
	Ser	Gin Ser	Thr	His Val Pro	Pro
	1			5
		<210>	24
		<211>	10
		<212>	PRT
		<213>	Mus	musculus
		<400>	24
	Ser	Gin Ser	Thr	His Val Pro	Pro
	1			5
		<210>	25
		<211>	369
		<212>	DNA
*		<213>	Mus	musculus

řetězce VK13G9 tac acg 30

Tyr Thr .

Tyr Thr <220>

<221> CDS <222> (1)...(369) ^<223> v region řetězce <400> 25 • · · ·· · · ·· 99 • · · · · · · · φ φ • · ♦ · · · · • · ··»···· • · · · · · · · ·· ·· ··· ···· ·· ·

caa Gin 1

gtt Val

act Thr

ctt Leu

aag Lys 5

gag Glu

tet Ser

ggc Gly

cct Pro

ggg ata ttg aag

ccc Pro

tca cag

48

Gly 10

Ile

Leu

Lys

Ser 15

Gin

acc

ctc

agt

ctg

act

tgt

tet

ttc

tet

ggg

ttt

tet

ctg

agc

act

tet

96

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ser

20

25

30

ggt

atg

ggt

att

gcc

tgg

gtt

cgt

cag

cct

tca

ggg

aag

ggt

ctg

gag

144

Gly

Met

Gly

Ile

Ala

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

35

40

45

tgg

ctg

gca

gac

att

tgg

tgg

gat

gat

aat

aag

tat

tat

aat

cca

tcc

192

Trp

Leu

Ala

Asp

Ile

Trp

Trp

Asp

Asp

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

ctg

gag

agc

cag

ctc

aca

atc

tcc

aag

gat

acc

tcc

aga

aac

cag

gta

240

Leu

Glu

Ser

Gin

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Arg

Asn

Gin

Val

65

70

.75

80

ttc

ctc

acg

atc

acc

agt

gtg

gac

act

gca

gat

tet

gcc

act

tat

tac

288

Phe

Leu

Thr

Ile

Thr

Ser

Val

Asp

Thr

Ala

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

tgt

gct

cgt

cat

cat

tac

gac

ggt

agt

agc

ctc

ctg

cct

atg

gac

tac

336

Cys

Ala

Arg

His

His

Tyr

Asp

Gly

Ser

Ser

Leu

Leu

Pro

Met

Asp

Tyr

100

105

110

tgg

ggt

caa

gga

acc

tca

gtc

acc

gtc

tcc

tca

369

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 26 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26

Gin

Val

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Ile

Leu

Lys

Pro

Ser

Gin

1

5

10

15

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ser

• · · ♦» · • · * ·

20

25

30

Gly

Met

Gly

Ile

Ala

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Leu

Ala

Asp

Ile

Trp

Trp

Asp

Asp

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Glu

Ser

Gin

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Arg

Asn

Gin

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Thr

Ile

Thr

Ser

Val

Asp

Thr

Ala

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

His

His

Tyr

Asp-

Gly

Ser

Ser

Leu

Leu

Pro

Met

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 ···· · · ·· · ·· ·« ··« ···· «« · <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1) . . .(21) <223> CDR I těžkého řetězce VH13G9 <400> 27 act tet ggt atg ggt att gcc

Thr Ser Gly Met Gly Ile Ala <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28

Thr Ser Gly Met Gly Ile Ala

5 <210> 29 <211> 48 <212> DNA ·· ·««· ♦ ·· • · « ···· 9 9 • 9 · · · · · <213> Mus musculus • · · » t · ·· ·· ·· ··· ·♦·· <220>

<221> CDS <222> (1)...(48) <223> CDR n těžkého řetězce VH13G9 <400> 29

gac

att

tgg

tgg

gat

gat

aat

aag

tat

tat

aat

cca

tcc

ctg

gag

agc

48

Asp

Ile

Trp

Trp

Asp

Asp

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Glu

Ser

1

5

10

15

	<210> 30 <211> 16
<212> <213>	PRT Mus musculus
	<400>	30
Asp	Ile Trp	Trp	Asp Asp Asn Lys	Tyr Tyr Asn Pro	Ser Leu Glu Ser
1			5	10	15
	<210>	31
	<211>	39
	<212>	DNA
	<213>	Mus	musculus

<220>

<221> CDS <222> (1)...(39) <223> CDR III těžkého řetězce VH13G9 <400> 31

cat	cat	tac	gac	ggt agt	agc	ctc	ctg	cct	atg gac tac	39
His	His	Tyr	Asp	Gly Ser	Ser	Leu	Leu	Pro	Met Asp Tyr
1				5				10

<210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32

··	»···	O *»9	9« 9
*	•	•	99 9 «	9	9	99
•	•	•	• ·	9	9	•
		• 9	• · 9	•	•	•
• * ·	•	• 9 .	• 9 • 9· 99«·	• 9«	9	9 ···

His His Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Leu Pro Met Asp Tyr

<210>	33
<211>	324
<212>	DNA
<213>	Rattus norvegicus

<220>

<221>	CDS
<222>	(1)...(324)
<223>	V region lehkého řetězce

<400> 33

gat att

caa Gin

atg Met

acg cag tet cca get

tcc Ser 10

ctg Leu

tet Ser

gca Ala

tet Ser

ctg gga

48

Asp 1

Ile

Thr 5

Gin

Ser Pro Ala

Leu 15

Gly

gaa

act

gtc

tcc

atc

gaa

tgt

cta

gca

agt

gag

gac

ata

tac

agt

tat

96

Glu

Thr

Val

Ser

Ile

Glu

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Asp

Ile

Tyr

Ser

Tyr

20

25

30

tta

gca

tgg

tat

caa

cag

aag

cca

ggg

aaa

tet

cct

cag

ctc

ctg

atc

144

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

35

40

45

tat

gcc

aca

aaa

agg

ttg

caa

gat

ggg

gtc

cca

tea

cgg

ttc

agt

ggc

192

Tyr

Ala

Thr

Lys

Arg

Leu

Gin

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

agt

gga

tet

ggc

aca

cag

tat

tet

ctc

aaa

ata

age

gac

atg

caa

cct

240

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Asp

Met

Gin

Pro

65

70

75

80

gaa

gat

gaa

ggg

gat

tat

ttc

tgt

cta

cag

aat

tcc

aag

ttt

ccg

gtc

288

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Leu

Gin

Asn

Ser

Lys

Phe

Pro

Val

85

90

95

acg

ttc

ggt

tet

ggg

acc

aag

ctg

gag

atc

aaa

cgg

324

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100 105

<210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 34

Asp

Tle

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Leu

Gly

1

5

10

15

Glu

Thr

Val

Ser

Ile

Glu

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Asp

Ile

Tyr

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Thr

Lys

Arg

Leu

Gin

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser'

Gly

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Asp

Met

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Leu

Gin

Asn

Ser

Lys

Phe

Pro

Val

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

<210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> CDS <222> (1)...(33) <223> j ]__ehkého řetězce VK14B7'

	<400>	35
cta	gca	agt	gag	gac	ata	tac	agt	tat	tta	gca
Leu	Ala	Ser	Glu	Asp	Ile	Tyr	Ser	Tyr	Leu	Ala
1				5					10

<210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 36

Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> CDS <222> (1)...(21)

CDR II lehkého řetězce CK14B7 <400> 37 gcc aca aaa agg ttg caa gat

Ala Thr Lys Arg Leu Gin Asp <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 38

Ala Thr Lys Arg Leu Gin Asp <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> CDS <222> (1) ... (21) <223> _{CDR IZI} lehkého řetězce VK14B7 <400> 39 cta cag aat tcc aag ttt ccg gtc acg

Leu Gin Asn Sex* Lys Phe Pro Val Thr <210>

<211>

<212>

<213>

<400>

Leu Gin Asn <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<221>

<222>

<223>

PRT

Rattus norvegicus

Ser Lys Phe Pro Val Thr

368

DNA

Rattus norvegicus

CDS (1)...(368)

V region těžkého řetězce <400> 41

gag gtt

cag Gin

ctt Leu

cag cag tet

ggg get

gag Glu 10

ctt Leu

gtg aga cct ggg

acc Thr

48

Glu 1

Val

Gin 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Val Arg Pro

Gly 15

tet

gtg

aag

ttt

tet

tgc

aaa

gtt

tet

ggc

gat

acc

cct

aca

aca

tac

'96

Ser

Val

Lys

Phe

Ser

Cys

Lys

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Pro

Thr

Thr

Tyr

20

25

30

tac

gtg

cac

ttt

gtg

aga

caa

agg

cct

gga

cag

ggt

ctg

gaa

tgg

.ata

144

Tyr

Val

His

Phe

Val

Arg

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

gga

agg

att

gat

cct

gag

gat

act

agt

act

aaa

tat

get

gag

aag

ttc

192

Gly

Arg

Ile

Asp

Pro

Glu

Asp

Thr

Ser

Thr

Lys

Tyr

Ala

Glu

Lys

Phe

50

55

60

aga

aat

aag

gcg

aca

ttc

act

gca

gat

cca

tcc

tcc

aac

aca

gcc

tac

240

Arg

Asn

Lys

Ala

Thr

Phe

Thr

Ala

Asp

Pro

Ser

Ser

• • · Asn

• · · • 4 Thr Ala

• · • * · · · · · Tyr

• 4 • tt

65

70

75

80

cta

aac

ctc

agc

agc

ctg

acc

cct

gag

gac

act

gca

acc

tat ttt

tgt

288

Leu

Asn

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr Phe

Cys

85

90

95

acc

ata

atg

cgg

tac

cat

agt

acc

tat

agg

gtc

tat

gtt

atg gat

ttc

336

Thr

Ile

Met

Arg

Tyr

His

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Tyr

Val

Met Asp

Phe

100

105

110

tgg

ggt

caa

gga

act

gca

gtc

act

gtc

tcc

tc

368

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Ala

Val

Thr

Val

Ser

115

120 <210> 42 <211> 122 <212> PRT <213> Ráttus norvegicus <400> 42

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

Pro

Gly

Thr

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Phe

Ser

Cys

Lys

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Pro

Thr

Thr

Tyr

20

25

30

Tyr

Val

His

Phe

Val

Arg

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Asp

Pro

Glu

Asp

Thr

Ser

Thr

Lys

Tyr

Ala

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Arg

Asn

Lys

Ala

Thr

Phe

Thr

Ala

Asp

Pro

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Asn

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

• Cys

85

90

95

Thr

Ile

Met

Arg

Tyr

His

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Tyr

Val

Met

Asp

Phe

*

100

105

110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Ala

Val

Thr

Val

Ser

•

115

120

<210> 43 <211> 15 <212> DNA ······ · ·· · · • · · · · · » 9 9 9

9 9 9 9 9 9

	• · · · • · · · <213> Rattus norvegicus	• . · · · ··«·«·· 9 9
	<220> <221> CDS <222> (1)...(15) <223> CDR j těžkého řetězce VH14B7
	<400> 43
aca	tac tac gtg cac	15
Thr 1	Tyr Tyr Val His 5

<210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 44

Thr Tyr Tyr Val His <210> 45 <211> 51 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> CDS <222> (1)...(51) ^<223> ČDR II těžkého řetězce VH14B7

<400>

45

agg

att gat

cct

gag

gat

act

agt

act

aaa

tat

gct

gag

aag

ttc

aga

Arg

Ile Asp

Pro

Glu

Asp

Thr

Ser

Thr

Lys

Tyr

Ala

Glu

Lys

Phe

Arg

1

5

10

15

aat <210> 46 <211> 16 <212> PRT

Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Arg

15 <213> Rattus norvegicus <400> 46

Arg Ile Asp Pro Glu Asp Thr Ser

1		5
	<210> <211> <212> <213>	47 42 DNA Rattus norvegicus

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(42)

<223> CDR lil těžkého řetězce VH14B7

<400>

.47

atg

cgg

tac

cat

agt

acc

tat agg

gtc

tat

gtt

atg

gat

ttc

Met

Arg

Tyr

His

Ser

Thr

Tyr Arg

Val

Tyr

Val

Met

Asp

Phe

1

5

10

<210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 48

Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp

Phe

•e

Claims (26)

1. Hlodavci neutralizační monoklonální protilátka vyznačující se tím, že je specifická pro lidský interleukin-18 a mající vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x ΙΟ^-11

M.

2. Monoklonální protilátka podle nároku 1 vyznačující se tím, že se jedná o krysí monoklonální protilátka.

3. Monoklonální protilátka podle nároku 1 vyznačující se tím, že se jedná o myší monoklonální protilátka.

4. Monoklonální protilátka podle nároku 2 vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce SEQ ID NO: 1 a aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce SEQ ID NO: 9.

5. Monoklonální protilátka podle nároku 3 vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce SEQ ID NO: 17 a aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce SEQ ID NO: 25.

6. Monoklonální protilátka podle nároku 2 vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce SEQ ID NO: 33 a aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce SEQ ID NO: 41.

7. Monoklonální protilátka podle nároku 2 vyznačující se tím, že má identifikační charakteristiky 2C10, 14B7 nebo 13G9.

8. Hybridom vyznačující se monoklonální protilátku podle nároku 4.

9. Hybridom vyznačující se t í m, že produkuje tím, že produkuje monoklonální protilátku podle nároku 5.

10. Hybridom vyznačující se tím, že produkuje monoklonální protilátku podle nároku 6.

11. Hybridom vyznačující se tím, že má identifikační charakteristiky buněčné linie 19522C10(2)F2(1)Al, 195214B7(l)H10 a 187413G9(3)F12.

12. Neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')₂ fragment vyznačující se tím, že je produkovaný delecí Fc regionu monoklonální protilátky podle nároku 1.

13. Pozměněná protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, vyznačující se tím, že pracovní regiony uvedených těžkých a lehkých řetězců jsou odvozeny od alespoň jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence regionů určujících komplementaritu každého uvedeného řetězce jsou odvozeny od monoklonální protilátky podle nároku 1.

14. Region určující komplementaritu (CDR) imunoglobulinového lehkého řetězce vyznačující se tím, že jeho aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující:

(a) SEQ ID NO: 3 (b) SEQ ID NO: 5 (c) SEQ ID NO: 7 (d) SEQ ID NO: 19

(e) SEQ (f) SEQ (g) SEQ (h) SEQ (i) SEQ

ID

ID

ID

ID

ID

NO: 21

NO: 23

NO: 35

NO: 37

NO: 39.

15. Region určující komplementaritu (CDR)imunoglobullnového těžkého řetězce vyznačující se tím, že jeho aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující:

(a) SEQ ID NO: 11 (b) SEQ ID NO: 13 (c) SEQ ID NO: 15 (d) SEQ ID NO: 27 (e) SEQ ID NO: 29 (f) SEQ ID NO: 31 (g) SEQ ID NO: 43 (h) SEQ ID NO: 45 (i) SEQ ID NO: 47 .

16. Molekula nukleové kyseliny vyznačující se tím, že kóduje region určující komplementaritu (CDR) podle nádoru 14.

17. Molekula nukleové kyseliny vyznačující se tím, že kóduje region určující komplementaritu (CDR) podle nádoru 15.

18. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje pozměněnou protilátku podle nároku 13 a farmaceuticky přijatelný nosič.

19. Způsob léčby stavů spojených s autoimunitním onemocněním vyznačující se tím, že zahrnuje krok podání účinného množství pozměněné protilátky podle nároku 13 uvedenému jedinci.

20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedeným onemocněním je roztroušená sklerosa.

21. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedeným onemocněním je revmatoidní artritida typu 1 nebo diabetes mellitus závislý na insulinu.

22. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedeným onemocněním je zánětlivé onemocnění střevní.

23. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedeným onemocněním je psoriasa.

24. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny vyznačuj ící se t í m, že je vybrána ze skupiny zahrnující:

(a) sekvenci nukleové kyseliny kódující pozměněnou protilátku podle nároku 13;

(b) sekvenci nukleové kyseliny komplementární k (a); a (c) fragment nebo analog (a) nebo (b), který kóduje protein mající specificitu pro lidský interleukin-18;

kde uvedená sekvence volitelně obsahuje restrikční místo.

25. Způsob pro hodnocení přítomnosti nebo nepřítomnosti lidského IL-18 u člověka vyznačující se t í m, že zahrnuje zahrnuje získání vzorku biologické kapaliny od pacienta a kontaktování monoklonální protilátky podle nároku 1 s takovým vzorkem za podmínek, při kterých se tvoří komplex IL-18/ monoklonální protilátka; a detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti uvedeného komplexu IL-18/monoklonální protilátka.

26. Způsob pro diagnostiku autoimunitního onemocnění vyznačující se t í m, že zahrnuje krok určení množství lidského IL-18 ve vzorku od pacienta způsobem podle nároku 25, a srovnání tohoto množství s průměrným množstvím lidského IL-18 v normální populaci, kde přítomnost významně vyššího množství lidského IL-18 u pacienta ukazuje na přítomnost autoimunitního onemocnění.