ES2308974T3 - Anticuerpos de il-18 recombinantes y su uso. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal neutralizador de rata específico para interleucina-18 humana, que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
Description
Anticuerpos de IL-18
recombinantes y su uso.
La presente invención se refiere generalmente al
campo de anticuerpos y anticuerpos alterados, útiles en el
tratamiento y diagnóstico de estados mediados por
IL-18 y, más específicamente, a anticuerpos
quiméricos y humanizados mAbs, Fabs.
La interleucina-18 humana es una
citoquina recientemente identificada que es sintetizada como una
proteína precursora de 193 aminoácidos biológicamente inactivos
(Ushio et al., J. Immunol. 156:4274, 1996). La escisión de
la proteína precursora, por ejemplo, por caspasa-1 o
caspasa-4 libera la proteína madura de 156
aminoácidos (Gu et al., Science 275: 206, 1997; Ghayur et
al., Nature 386:619, 1997) que exhibe actividades biológicas
que incluyen la coestimulación de la proliferación de células T, el
aumento de la citotoxicidad de células NK, la inducción de la
producción IFN-\gamma por células T y células NK y
la potenciación de la diferenciación del tipo 1 de helper T (Th1)
(Okamura et al., Nature 378:88, 1995; Ushio et al., J.
Immunol. 156: 4274, 1996; Micallef et al., Eur. J. Immunol.
26:1647, 1996; Kohno et al., J. Immunol. 158:1541, 1997;
Zhang et al., Infect. Immunol. 65: 3594,1997; Robinson et
al., Immunity 7:571, 1997). Además, la IL-18 es
un inductor eficaz de mediadores proinflamatorios de monolitos
humanos que incluyen IL-8, factor \alpha de
necrosis tumoral (TNF-\alpha) y prostaglandina
E_{2}(PCE_{2}) Ushio, S. et al., J. Immunol.
156:4274-4279, 1996; Puren, A. J. et al., J.
Clin. Invest. 10:711-721, 1997; Podolin et
al., J. Immunol. submitted, 1999).
La proteína relacionada con receptores de
IL-1 previamente clonada (IL-lRrp)
(Parmet et al., J. Biol. Chem. 271: 3967,1996) fue
recientemente identificada, como una subunidad del receptor de
IL-18 (Kd = 18 nM) (Torigoe et al., J. Biol.
Chem. 272:25737, 1997). Una segunda subunidad del receptor de
IL-18 exhibe homología respecto a la proteína
accesoria del receptor IL-1 y ha sido denominada
AcPL (para proteína de tipo accesorio). La expresión tanto de
IL-1Rrp y AcPL es requerida para la activación de
NF-\kappaB y JNK inducida por
IL-18 (Born et al., J. Biol. Chem.
273:29445, 1998). Además de NF-\kappaB y JNK, la
IL-18 señaliza a través de la quinasa asociada a
receptor de IL-1 (IRAK), p561ck (LCK) y quinasa de
proteína activada por mitogenes (MAPK) (Micallef et al.,
Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996; Matsumoto et al., Biophys
Biochem. Res. Comm. 234:454, 1997; Tsuji-Takayama
et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237: 126, 1997).
Las células Th1, que producen citoquinas
proinflamatorias como IFN-\gamma,
IL-2 y TNF-\gamma Mosmann et
al., J. Immunol. 136:2348, 1986) han estado implicadas en la
mediación de muchas enfermedades autoinmunes, incluida la
esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide (RA) o diabetes de
tipo 1 o dependiente de insulina (IDDM), enfermedad de inflamación
intestinal (IBD) y soriasis (Mosmann and Sad, Immunol. Today 17:138,
1996). Por tanto, el antagonismo de una citoquina promotora de Th1
como IL-18 sería de esperar que inhiba el desarrollo
de la enfermedad. El mAbs específico para IL-18
podría ser usado como un antagonista.
Ha sido demostrada la función de
IL-18 en el desarrollo de enfermedades autoinmunes.
Consecuentemente, ha sido demostrado que la expresión de
IL-18 es significativamente aumentada en el
páncreas y el bazo del ratón diabético no obeso (GNOD)
inmediatamente antes de la aparición de la enfermedad (Rothe et
al., J. Clin. Invest. 99: 469, 1997). Análogamente, los niveles
de IL-18 se ha mostrado que están considerablemente
elevados en el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide
(Kawashima et al., Arthritis and Rheumatism 39:598, 1996).
Además de ello, se ha demostrado que la administración de
IL-18 aumenta la gravedad clínica de la
encefalomielitis alérgica experimental (EAE) de múridos, una
enfermedad autoinmune mediada por Th1 que es un modelo para la
esclerosis múltiple. Además, se ha mostrado que la neutralización de
antisuero de IL-18 anti-rata evita
el desarrollo de EAE en ratas Lewis hembras (Wildbaum et
al., J. Immunol. 161:6368, 1998). Consecuentemente, la
IL-18 es una diana deseable para el desarrollo de un
nuevo producto terapéutico para la autoinmunidad.
Taniguchi et al., J. Immunol. Methods
206: 107, describen siete mAbs de IL-18
anti-humana de múridos y seis de ratas que se unen
a cuatro sitios anticénicos distintos. Uno de los mAbs de múridos
(nº 125-2H) y los seis mAbs de ratas inhiben la
producción de IFN-\gamma inducida por
IL-18 por células KG-1, y los mAbs
de rata exhiben actividades neutralizadoras 10 veces inferiores al
nº 125-2H. Como se demuestra mediante un ensayo de
transferencia Western, tres de los mAbs de múridos, pero ninguno de
los mAbs de rata, son fuertemente reactivos con
IL-18 humana unida a membrana. Además, se describe
un ensayo inmunoabsorbente de unión enzimática (ILISA) para
detectar IL-18, utilizando nº 125-2H
y un mAb de rata. El límite de detección de este ensayo ELISA es de
10 pg/ml.
La solicitud de patente europea EP 0.712.931
describe dos mAbs de IL-18
anti-humana de ratón H1 (IgG 1) y H2 (IgM). Como se
demuestra mediante un ensayo de transferencia Western, los dos mAbs
reaccionan con la IL-18 humana unida a membrana,
pero no con IL-12 humana unida a membrana. El H1 es
utilizado en un protocolo de cromatografía de inmunoafinidad para
purificar IL-18 humana y en un ensayo ELISA para
medir IL-18 humana. El H2 es utilizado en un
radioinmunoensayo para medir IL-18 humana.
La neutralización de anticuerpos de
IL-18 puede ser potencialmente útil para aliviar
enfermedades autoinmunes y síntomas relacionados en el hombre. Por
tanto hay una necesidad en la técnica de un antagonista de
IL-18 de afinidad elevada, como un anticuerpo
monoclonal neutralizador para interleucina-18
humana, que reduzca la diferenciación y proliferación de Th1 y, por
tanto, los síntomas de enfermedades autoinmunes y relacionadas.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona un anticuerpo monoclonal neutralizador de rata para
interleucina-18 humana, que comprende una región
variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena pesada que tiene una
secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 9.
NO: 9.
En otro aspecto, la invención proporciona un
anticuerpo monoclonal humanizado específico para
interleucina-18 human, que comprende las siguientes
regiones determinantes complementarias (CDR):
CDRL1 de SEQ ID NO: 4
CDRL2 de SEQ ID NO: 6
CDRL3 de SEQ ID NO: 8
CDRH1 de SEQ ID NO: 12
CDRH2 de SEQ ID NO: 14
CDRH3 de SEQ ID NO: 16
En un aspecto relacionado, la presente invención
proporciona fragmentos de Fab neutralizadores o sus fragmentos de
F(Ab')_{2} de los anticuerpos monoclonales de rata o
humanizados de la presente invención.
En otro aspecto, la invención proporciona un
anticuerpo monoclonal quimérico específico para
interleucina-18 humana, que comprende una región
variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: y una región variable de cadena pesada que tiene una
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una composición farmacéutica de un anticuerpo o
fragmento según la presente invención y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona el uso del anticuerpo de la presente invención, o
fragmentos Fab neutralizadores o fragmentos F(ab')_{2} de
la invención en la elaboración de un medicamento para el
tratamiento de estados en seres humanos seleccionados entre el grupo
que consiste en: enfermedad autoinmune, esclerosis múltiple,
artritis reumatoide, diabetes de tipo 1, enfermedad de inflamación
intestinal y soriasis.
Todavía en otro aspecto, la presente invención
proporciona un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la
invención o un fragmento Fab neutralizador o fragmento
F(ab')_{2} de la invención.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención se describen adicionalmente en la descripción detallada y
sus realizaciones preferidas.
La Fig. 1 [SEQ ID NO: 1 y 2] ilustra la región
variable de cadenas ligeras para el anticuerpo de rata 2 C10. La
Fig. 1 incluye datos de secuencias para las dos cadenas. Las áreas
enmarcadas indican las CDR [SEQ ID NO: 3-8]. El
área en letra negrita indica la secuencia de cebador degenerado.
La Fig. 2 [SEQ ID NO: 9 y 10] ilustra la región
variable de cadenas pesadas para el anticuerpo de rata 2C10. La
Fig. 2 incluye datos de secuencia para las dos cadenas. Las áreas
enmarcadas indican las CDR [SEQ ID NO: 11-16]. El
área con letra negrita indica la secuencia de cebador
degenerado.
La Fig. 3 [SEQ ID NO: 17 y 18] ilustra la región
variable de cadenas ligeras para el anticuerpo de múrido 13G9. La
Fig. 3 incluye datos de secuencias para las dos cadenas. Las áreas
enmarcadas indican las CDR [SEQ ID NO: 19-24]. El
área con letra negrita indica la secuencia de cebador
degenerado.
La Fig. 4 [SEQ ID NO: 25 y 26] ilustra la región
variable de cadenas pesadas para el anticuerpo de múrido 13G9. La
Fig. 4 incluye datos de secuencias para las dos cadenas. Las áreas
enmarcadas indican las CDR [SEQ ID NO: 27-32]. El
área con letra negrita indica la secuencia de cebador
degenerado.
La Fig. 5 [SEQ ID NO: 33 y 34] ilustra la región
variable de cadenas ligeras para el anticuerpo de rata 14 B7. La
Fig. 5 incluye datos de secuencias para las dos cadenas. Las áreas
enmarcadas indican las CDR [SEQ ID NO: 35-40]. El
área con letra negrita indica la secuencia de cebador
degenerado.
La Fig. 6 [SEQ ID NO: 41 y 42] ilustra la región
variable de cadenas pesadas para el anticuerpo de rata 14 B7. La
Fig. 6 incluye datos de secuencias para las dos cadenas. Las áreas
enmarcadas indican las CDR [SEQ ID NO: 43-48]. El
área con letra negrita indica la secuencia de cebador
degenerado.
La presente invención proporciona anticuerpos y
sus fragmentos, que están caracterizados por una especifidad de
unión a IL-18 humana, actividad neutralizadora y
afinidad elevada por IL-18. Los anticuerpos de la
presente invención se prepararon mediante técnicas convencionales
de hibridomas para generar nuevos anticuerpos neutralizadores.
Estos productos son útiles en composiciones terapéuticas y
farmacéuticas para tratar trastornos mediados por
IL-18, por ejemplo, enfermedades autoinmunes que
incluyen esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide (RA),
diabetes de tipo 1 o dependiente de insulina (IDDM), enfermedad de
inflamación intestinal (IBD) y soriasis (Mosmann and Sad, Immunol.
Today 17: 138, 1996). Estos productos son útiles también en el
diagnóstico de estados mediados por IL-18 mediante
la medición (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente de unión
enzimática (ELISA)) de niveles endógenos de IL-18
en seres humanos o IL-18 liberada ex vivo a
partir de células activadas.
"Anticuerpo alterado" se refiere a una
proteína codificada por una región codificadora de inmunoglobulina
alterada, que puede ser obtenida mediante expresión en una célula
hospedante seleccionada. Estos anticuerpos alterados son
anticuerpos tratados por ingeniería genética (por ejemplo,
anticuerpos quiméricos o humanizados) o fragmentos de anticuerpos
que carecen de la totalidad o de parte de una región constante de
inmunoglobulina, por ejemplo, Fv, Fab o F(ab)_{2} y
similares.
"Región codificadora de inmunoglobulina
alterada" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica un anticuerpo alterado de la invención. Cuando el
anticuerpo alterado es un anticuerpo injertado a CDR o humanizado,
las secuencias que codifican las regiones determinantes
complementarias (CDR) a partir de una inmunoglobulina no humana son
insertadas en un primer asociado de inmunoglobulina que comprende
secuencias marcos humanas variables. Opcionalmente, el primer
asociado de inmunoglobulina está funcionalmente conectado a un
segundo asociado de inmunoglobulina.
"Primer asociado de inmunoglobulina" se
refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un marco
humano o región variable de inmunoglobulina humana en la que las
regiones nativas (o que se producen de forma natural) que codifican
CDR son sustituidas con las regiones que codifican CDR de un
anticuerpo donante. La región variable humana puede ser una cadena
pesada de inmunoglobulina, una cadena ligera (o ambas cadenas), un
análogo o fragmentos funcionales de las mismas. Estas regiones de
CDR, ubicadas en la región variable de anticuerpos
(inmunoglobulinas) pueden ser determinadas mediante procedimientos
conocidos en la técnica. Por ejemplo, Kabat et al.
(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U. S.
Department of Health and Human Services, National Institutes of
Health (1987)) describen normas para ubicar CDR. Además, son
conocidos programas de ordenador que son útiles para identificar
regiones/estructuras de CDR.
"Neutralizador" se refiere a un anticuerpo
que inhibe la actividad de IL-18 evitando la unión
de IL-18 humana a su receptor específico o
inhibiendo la señalización de IL-18 a través de su
receptor, en el caso de que se produzca la unión. Un mAb es
neutralizador si es eficaz en un 90%, preferentemente eficaz en un
95% y lo más preferentemente eficaz en un 100% para inhibir la
actividad de IL-18 medida en el ensayo de
neutralización de IL-18, véase el Ejemplo 1 y la
Tabla I.
La expresión "afinidad elevada" se refiere
a un anticuerpo que tiene una afinidad de unión caracterizada por
una K_{d} igual o menor a 3,9 x 10^{-11} M para
Il-18 humana al ser determinada mediante análisis de
biosensores ópticos (véase el Ejemplo 2 y la Tabla I).
Mediante "especifidad de unión por
IL-18 humana" se quiere indicar una afinidad más
elevada por la IL-18 humana que por la de múridos u
otra IL-18.
"Segundo asociado de inmunoglobulina" se
refiere a otra secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o
péptido a la que está fusionado el primer asociado de
inmunoglobulina en un marco o por medio de una secuencia conectora
convencional opcional (es decir, funcionalmente conectados).
Preferentemente es un gen de inmunoglobulina. El segundo asociado
de inmunoglobulina puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos
que codifique la región constante completa para el mismo (es decir,
homólogos - el primero y segundo anticuerpos alterados son derivados
de la misma fuente) o un anticuerpo adicional (es decir,
heterólogo) de interés. Puede ser una cadena pesada o cadena ligera
de inmunoglobulina (o las dos cadenas como parte de un único
polipéptido). El segundo asociado de inmunoglobulina no está
limitado a una clase o isotipo particular de inmunoglobulina.
Además, el segundo asociado de inmunoglobulina puede comprender
parte de una región constante de inmunoglobulina como se encuentra
en Fab o F(ab)_{2} (es decir, una parte discreta de
una región constante humana apropiada o región marco). Este segundo
asociado de inmunoglobulina puede comprender también una secuencia
que codifique una proteína de membrana integral expuesta a la
superficie externa de una célula hospedante, por ejemplo, como parte
de una biblioteca expresada en fagos, o una secuencia que codifique
una proteína para una detección analítica o de diagnóstico, por
ejemplo, peroxidasa de rábano,
\beta-galactoxidasa, etc.
Los términos Fv, Fc, Fd, Fab o
F(ab)_{2} son usados con sus significados estándar
(véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
un "anticuerpo tratado por ingeniería genética" describe un
tipo de anticuerpo alterado, es decir, un anticuerpo sintético de
longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo quimérico o
humanizado en oposición a un fragmento de anticuerpo) en el que una
parte de los dominios variables de cadenas ligeras y/o pesadas de
un anticuerpo aceptor seleccionado está sustituida por partes
análogas de uno o más anticuerpos donantes que tienen especificad
por el epitopo seleccionado. Por ejemplo, estas moléculas pueden
incluir anticuerpos caracterizados por una cadena pesada humanizada
asociada a una cadena ligera sin modificar (o cadena ligera
quimérica) o viceversa. Los anticuerpos tratados por ingeniería
genética pueden estar caracterizados también por una alteración de
las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las regiones
marcos de dominios variables ligeros y/o pesados de anticuerpos
aceptores con el fin de retener la especificad de unión de los
anticuerpos donantes. Estos anticuerpos pueden comprender la
sustitución de una o más CDR (preferentemente todas) del anticuerpo
aceptor con CDR de un anticuerpo donante descrito en la presente
memoria descriptiva.
Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un
tipo de anticuerpo tratado por ingeniería genética que contiene una
región variable que se produce de forma natural (cadena ligera y
cadenas pesadas) derivada de un anticuerpo donante en asociación
con regiones constantes de cadenas ligeras y pesadas derivadas de un
anticuerpo aceptor.
Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un
tipo de anticuerpo tratado por ingeniería genética que tiene sus
CDR derivadas de una inmunoglobulina donante, y las partes restantes
derivadas de inmunoglobulina de la molécula son derivadas de una (o
más) inmunoglobulina(s) humana(s). Además, los
residuos de soportes marcos pueden ser alterados para conservar la
afinidad de unión (véase, por ejemplo, Queen et al., Proc.
Natl Acad Sci USA. 86: 10029-10032 (1989). Hodgson
et al., Bio/Technology, 9: 421 (1991)).
La expresión "anticuerpo donante" se
refiere a un anticuerpo (monoclonal o recombinante) que contribuye a
las secuencias de ácidos nucleicos de sus regiones variables, CDR,
u otros fragmentos o análogos funcionales de las mismas para un
primer asociado de inmunoglobulina, con el fin de proporcionar la
región codificadora de inmunoglobulina alterada y el anticuerpo
alterado expresado resultante con la especifidad antigénica y
actividad neutralizadora características del anticuerpo donante. Un
anticuerpo donante adecuado para ser usado en esta invención es un
anticuerpo monoclonal neutralizador no humano (es decir, de rata)
denominado 2C10. El anticuerpo 2C10 es definido como un anticuerpo
neutralizador específico de IL-18 humana (es decir,
no reconoce IL-18 de múridos) y de afinidad elevada
de isotipo IgG_{1}, que tiene el DNA de cadena ligera variable y
las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y 2 y, respectivamente,
el DNA de cadena pesada variable y las secuencias de aminoácidos de
SEQ ID NO: 9 y 10 en una región constante de IgG de múridos
adecuada.
La expresión "anticuerpo aceptor" se
refiere a un anticuerpo (monoclonal o recombinante) heterólogo
respecto al anticuerpo donante, que contribuye a la totalidad (o
cualquier parte, pero preferentemente la totalidad) de las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican sus regiones marcos de
cadenas pesadas y/o ligeras y/o sus regiones constantes de cadenas
pesadas y/o ligeras para el primer asociado de inmunoglobulina.
Preferentemente un anticuerpo humano es el anticuerpo aceptor.
"CDR" se define como las secuencias
aminoácidos de regiones determinantes de complementaridad de un
anticuerpo, que son las regiones hipervariables de cadenas pesadas
y ligeras de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Kabat et
al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed.,
U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes
of Health (1987). Hay tres CDR de cadena ligera (o regiones de CDR)
en la parte variable de una inmunoglobulina. Por tanto, "CDR",
como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la
totalidad de las tres CDR de cadena pesada, o la totalidad de las
tres CDR de cadena ligera (o las CDR de cadena tanto pesada como
ligera, si es apropiado).
Las CDR proporcionan la mayoría de residuos de
contacto para la unión del anticuerpo al antígeno o epitopo. Las
CDR de interés de esta invención son derivadas de secuencias de
cadenas pesadas y ligeras variables de anticuerpos donantes, e
incluyen análogos de las CDR que se producen de forma natural,
análogos que comparten o retienen también la misma especifidad de
unión a antígenos y/o capacidad neutralizadora que el anticuerpo
donante del que derivan.
Mediante "compartir la especifidad de unión a
antígenos o capacidad neutralizadora" se quiere indicar, por
ejemplo, que aunque el mAb AC 10 puede estar caracterizado por un
cierto nivel de afinidad antigénica, una CDR codificada por una
secuencia de ácidos nucleicos de 2C10 en entorno estructural
apropiado puede tener una afinidad inferior o superior. No
obstante, es esperado que las CDR de 2C10 en estos entornos
reconozcan el (o los) mismo(s) epitopo(s) que 2C10.
Ejemplos de CDR de cadena ligera de 2C10 incluyen
SEQ ID NO: 3;
SEQ ID NO: 5;
SEQ ID NO: 7;
\vskip1.000000\baselineskip
y ejemplos de CDR de cadena pesada de 2C10
incluyen
SEQ ID NO: 11;
SEQ ID NO: 13; y
SEQ ID NO: 15.
Un "fragmento funcional" es una secuencia
variable parcial de cadena pesada o ligera (es decir, deleciones
menores en la terminación amino o carboxi de la región variable de
inmunoglobulina) que retiene la misma especifidad de unión
antigénica y/o capacidad neutralizadora que el anticuerpo de cuyo
fragmento deriva.
Un "análogo" es una secuencia de
aminoácidos modificada en al menos un aminoácido, en la que dicha
modificación puede ser química o una sustitución o transposición de
unos pocos aminoácidos (es decir, no más de 10), modificación que
permite que las secuencia de aminoácido que permite que la secuencia
de aminoácidos retenga las características biológicas, por ejemplo,
especifidad antigénica y afinidad de unión, de la secuencia sin
modificar. Por ejemplo, pueden ser construidas mutaciones
(silentes), a través de sustituciones, cuando son creados ciertos
sitios de restricción de endonucleasa en el interior o en los
contornos de regiones que codifican CDR.
Pueden surgir también análogos como variaciones
alélicas. Una "variación o modificación alélica" es una
alteración en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica las
secuencias de aminoácidos o péptidos de la invención. Estas
variaciones o modificaciones pueden ser debidas a una degeneración
en le código genético o pueden ser deliberadamente tratadas por
ingeniería genética para proporcionar las características deseadas.
Estas variaciones o modificaciones pueden dar lugar o no a
alteraciones en cualquier secuencia de aminoácidos codificada.
La expresión "agentes efectores" se refiere
a moléculas portadoras no proteicas a las que pueden estar asociados
los anticuerpos alterados y/o cadenas ligeras o pesadas naturales o
sintéticas del anticuerpo donante u otros fragmentos del anticuerpo
donante, por medios convencionales. Estos portadores no proteicos
pueden incluir portadores convencionales usados en el campo del
diagnóstico, por ejemplo, gránulos de poliestireno u otros
plásticos, polisacáridos, por ejemplo, como los usados en el sistema
BIAcore [Pharmacia] u otras sustancias no proteicas útiles en el
campo médico y seguras para una administración a seres humanos y
animales. Otros agentes efectores pueden incluir un macrociclo,
para la quelación de un átomo de metal pesado, o radioisótopos.
Estos agentes efectores pueden ser útiles también para aumentar la
semi-vida de los anticuerpos alterados, por
ejemplo, polietilenglicol.
Para ser usados en la construcción de los
anticuerpos, anticuerpos alterados y fragmentos de esta invención,
puede ser empleada una especie no humana (por ejemplo, bovina,
ovina, de mono, pollo, roedor (por ejemplo, múrido y rata), etc.),
para generar una inmunoglobulina deseable tras una presentación con
IL-18 humana nativa o un epitopo péptido de la
misma. Se emplean técnicas convencionales de hibridomas para
proporcionar una línea celular de hibridoma que secrete mAb no
humano para IL-18. Estos hibridomas son seguidamente
seleccionados en cuanto a la unión usando IL-18
aplicada como revestimiento a placas de 96 pocillos como se describe
en la sección de Ejemplos o, alternativamente, con
IL-18 biotinilada unida a una placa revestida con
estreptavidina.
Un ejemplo de mAb neutralizador de afinidad
elevada de la presente invención es mAb 2C10, un anticuerpo de rata
que puede ser usado para el desarrollo de un anticuerpo quimérico o
humanizado, descrito más en detalle en los ejemplos posteriores. El
mAb 2C10 se caracteriza por una especifidad de unión antigénica para
IL-18 humana de aproximadamente K_{d} 3,9 x
10^{-11} M. Este mAb está caracterizado por ser el isotipo
IgG_{1,K}.
Siempre que en la descripción siguiente el
anticuerpo donante es identificado como 2C10, esta denominación se
hace para una mayor ilustración y simplicidad de la descripción
solamente.
La presente invención incluye también el uso de
fragmentos de Fab o fragmentos de F(ab')_{2} derivados de
mAbs dirigidos contra IL-18 humana. Estos fragmentos
son útiles como agentes protectores in vivo contra estados
mediados por IL-18 y Th1 o in Vitro como
parte de un diagnóstico de IL-18. Un fragmento Fab
contiene la cadena de longitud completa y la parte
amino-terminal de la cadena pesada; y un fragmento
F(ab')_{2} es el fragmento formado por dos fragmentos de
Fab unidos mediante enlaces de disulfuro. El mAb 2C10 proporciona
la fuente de fragmentos de Fab y fragmentos de F(ab')_{2}
que pueden ser obtenidos mediante medios convencionales, por
ejemplo, escisión del mAb con las enzimas proteolíticas apropiadas,
papaína y/o pepsina o mediante procedimientos recombinantes. Estos
fragmentos de Fab y F(ab')_{2} son útiles por sí mismos
como agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico y como
donantes de secuencias que incluyen las regiones variables y
secuencias de CDR útiles en la formación de anticuerpos
recombiantes o humanizados, como se describe en la presente memoria
descriptiva.
Los fragmentos de Fab y F(ab')_{2}
pueden ser construidos a través de una biblioteca de fagos
combinatoriales (véase, por ejemplo, Winter et al., Ann.
Rev. Immunol., 12:433-455 (1994)). O a través de
inversión de cadenas de inmunoglobulina (véase, Marks et
al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)) en las
que la inmunoglobulina Fd o V_{h} de un anticuerpo seleccionado
(por ejemplo, 13G9) se permite que se asocien con un repertorio de
inmunoglobulinas de cadenas ligera, V_{L} (o V_{K}) para formar
nuevos Fab. Inversamente, la inmunoglobulina de cadena ligera de un
anticuerpo seleccionado se puede permitir que se asocie con un
repertorio de inmunoglobulinas de cadena pesada, V_{H} (o Fd)
para formar nuevos Fab.
El mAb 2C10 u otros anticuerpos anteriormente
descritos pueden contribuir a las secuencias, como las secuencias
de péptidos de cadena pesada y/o ligera variables, secuencias
marcos, secuencias de CDR, fragmentos funcionales y sus análogos y
las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, útiles para
diseñar y obtener diversos anticuerpos alterados que están
caracterizados por la especificad de unión antigénica del anticuerpo
donante.
Como un ejemplo, la presente invención
proporciona secuencias de cadenas ligeras variables y cadenas
pesadas variables del mAb 2C10 de IL-18 y
secuencias derivadas de las mismas.
Las secuencias de ácidos nucleicos de esta
invención, o sus fragmentos, que codifican las secuencias de
péptidos de cadenas ligeras variables y cadenas pesadas variables
son útiles también para la inducción mutagénica de cambios
específicos en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las
CDR o regiones marcos y para la incorporación de la secuencia
modificada o de ácidos nucleicos de fusión resultante en forma de un
plásmido para expresión.
Teniendo en cuenta la degeneración del código
genético, pueden ser construidas diversas secuencias codificadoras
que codifiquen las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y
ligeras variables, y secuencias de CDR de la invención así como
fragmentos y análogos funcionales de las mismas que comparten la
especificidad antigénica del anticuerpo donante. Las secuencias de
ácidos nucleicos aisladas de esta invención, o sus fragmentos, que
codifican las secuencias de péptidos de cadenas variables o CDR,
pueden ser usadas para producir anticuerpos alterados, por ejemplo,
anticuerpos quiméricos o humanizados, u otros anticuerpos tratados
por ingeniería genética de esta invención, cuando son funcionalmente
combinadas con un segundo asociado de inmunoglobulina.
Debe apreciarse que además de las secuencias de
ácidos nucleicos aisladas que codifican partes del anticuerpo
alterado y anticuerpos descritos en la presente memoria descriptiva,
otras de estas secuencias de ácidos nucleicos están abarcadas por
la presente invención, como las complementarias para las secuencias
nativas que codifican CDR o complementarias para las regiones
marcos humanos modificados que rodean las regiones que codifican
CDR. Las secuencias de DNA útiles incluyen las secuencias que se
hibridan bajo condiciones restrictivas de hibridación [véase, T.
Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold
Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389]para las
secuencias de DNA. Un ejemplo de este estado restrictivo de
hibridación es la hibridación a 4XSSC a 65ºC, seguida de un lavado
en 0,1XSSC a 65ºC durante una hora. Alternativamente, un ejemplo de
estado restrictivo de hibridación es en formamida al 50%, 4XSSC a
42ºC. Preferentemente, estas secuencias de DNA de hibridación
tienen una longitud de al menos aproximadamente 18 nucleótidos, es
decir, aproximadamente el tamaño de una CDR.
Las moléculas de inmunoglobulinas alteradas
pueden codificar anticuerpos alterados que incluyen anticuerpos
tratados por ingeniería genética como anticuerpos quiméricos y
anticuerpos humanizados. Una región codificadora de inmunoglobulina
alterada deseada contiene regiones codificadoras de CDR que
codifican péptidos que tienen las especifidad antigénica de un
anticuerpo de IL-18, preferentemente un anticuerpo
de afinidad elevada como los proporcionados por la presente
invención, insertado en un primer asociado de inmunoglobulina (una
región variable de inmunoglobulina marco humano o humana).
Preferentemente, el primer asociado de
inmunoglobulina está funcionalmente conectado a un segundo asociado
de inmunoglobulina. El segundo asociado de inmunoglobulina se
definió anteriormente y puede incluir una secuencia que codifique
una segunda región de anticuerpos de interés, por ejemplo, una
región de Fc. Los segundos asociados de inmunoglobulina pueden
incluir también secuencias que codifiquen otra inmunoglobulina a la
que está fusionada la región constante de cadena ligera o pesada en
un marco o por medio de una secuencia conectora. Los anticuerpos
tratados por ingeniería genética contra fragmentos funcionales o
análogos o IL-18 pueden ser diseñados para provocar
una unión mejorada con el mismo anticuerpo. El segundo asociado de
inmunoglobulina puede estar también asociado con agentes efectores
como se definieron anteriormente, que incluyen moléculas portadoras
no proteicas, a las que puede estar funcionalmente conectado el
segundo asociado de inmunoglobulina por medios convencionales.
La fusión o conexión entre los segundos
asociados de inmunoglobulina, por ejemplo, secuencias de
anticuerpos, y el agente efector puede ser por cualquier medio
adecuado, por ejemplo, por enlaces covalentes o iónicos
convencionales, funciones proteicas o reticuladores
hetero-bifuncionales, por ejemplo, carbodiimida,
glutaraldehído y similares. Estas técnicas son conocidas en el
estado de la técnica y se describen fácilmente en textos
convencionales de química y bioquímica.
Adicionalmente, las secuencias de conectores
convencionales que proporcionan simplemente una cantidad deseada de
espacio entre el segundo asociado de inmunoglobulina y el agente
efector pueden ser construidas también en la región codificadora de
inmunoglobulina alterada. El diseño de estos conectores es bien
conocido por los expertos en la técnica.
Además, las secuencias de señales para las
moléculas de la invención pueden ser modificadas para aumentar la
expresión.
Un ejemplo de anticuerpo alterado contiene una
secuencia de péptidos o proteínas de cadena ligera y/o pesada
variable que tiene la especifidad antigénica de mAb 2C10, por
ejemplo, las cadenas V_{H} y V_{L}. Todavía, otro anticuerpo
alterado deseable de esta invención está caracterizado por la
secuencia de aminoácidos que contiene las CDR de la región variable
de las cadenas pesadas y/o ligeras de la molécula 2C10 de anticuerpo
de rata, y las secuencias restantes son derivadas de una fuente
humana o un fragmento o análogo funcional de las mismas.
Todavía, en una realización adicional, el
anticuerpo tratado por ingeniería genética de la invención puede
tener unido al mismo un agente adicional. Por ejemplo, puede ser
usado el procedimiento de la tecnología de DNA recombinante para
producir un anticuerpo tratado por ingeniería genética de la
invención en el que el fragmento Fc o dominio CH2 CH3 de una
molécula de anticuerpo completo ha sido sustituido con una enzima u
otra molécula detectable (es decir, un efector de polipéptido o
molécula reportera).
El segundo asociado de inmunoglobulina puede
estar también funcionalmente conectado a un péptido que no es de
inmunoglobulina, una proteína o fragmento de la misma heterólogo
respecto a la secuencia que contiene CDR, por ejemplo, que tiene la
especifidad antigénica de 2C10 de rata. La proteína resultante puede
exhibir especifidad antigénica
anti-IL-18 así como las
características del componente que no es de inmunoglobulina tras la
expresión. Esa característica del asociado de fusión puede ser, por
ejemplo, una característica funcional como otro dominio de unión o
receptor o una característica terapéutica si el asociado de fusión
es en sí mismo una proteína terapéutica o características
antigénicas adicionales.
Otra proteína deseable de esta invención puede
comprender una molécula de anticuerpo completo, que tenga cadenas
pesadas y ligeras de longitud completa, o cualquier fragmento
discreto de las mismas, como los fragmentos de Fab o
F(ab')_{2}, un dímero de cadena pesada o cuales quiera
fragmentos recombinantes mínimos de los mismos como un F_{v} o un
anticuerpo de cadena única (SCA) o cualquier otra molécula con la
misma especifidad que el mAb 2C10. Esta proteína puede ser usada en
la forma de un anticuerpo alterado, o puede ser usada en su forma
sin
fusionar.
fusionar.
Siempre que el segundo asociado de
inmunoglobulina derive de un anticuerpo diferente del anticuerpo
donante, por ejemplo, cualquier isotipo o clase de marco de
inmunoglobulina o regiones constantes, tiene lugar un anticuerpo
tratado por ingeniería genética. Los anticuerpos tratados por
ingeniería genética pueden comprender regiones constantes de
inmunoglobulina (Ig) y regiones marcos variables de una fuente, por
ejemplo, el anticuerpo aceptor y una o más (preferentemente todas)
de las CDR del anticuerpo donante, por ejemplo, el anticuerpo
anti-IL-18 descrito en la presente
memoria descriptiva. Además, se pueden hacer alteraciones, por
ejemplo, de deleciones sustituciones o adiciones de la región
marco de dominio variable ligero y/o pesado del mAb aceptor a los
niveles de ácidos nucleicos o aminoácidos o las regiones de CDR
donantes con el fin de retener la especifidad de unión antigénica
del anticuerpo donante.
Estos anticuerpos tratados por ingeniería
genética están diseñados para emplear una (o las dos) de las cadenas
pesadas y/o ligeras variables del mAb de IL-18
(opcionalmente modificado como se describe) o una o más CDR de
cadena pesada o ligera identificadas con posterioridad. Los
anticuerpos tratados por ingeniería genética se espera que sean
neutralizadores, es decir, deseablemente bloquean la unión al
receptor de la proteína de IL-18 y bloquean o
evitan también la proliferación de células dependientes de
IL-18.
Estos anticuerpos tratados por ingeniería
genética pueden incluir un anticuerpo humanizado que contenga las
regiones marcos de una inmunoglobulina o subtipo humano seleccionado
o un anticuerpo quimérico que contenga las regiones constantes de
cadenas pesadas o ligeras humanas fusionadas a los fragmentos
funcionales del anticuerpo de IL-18. Un aceptor
humano (o de otro animal) adecuado puede ser uno seleccionado de una
base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAT®,
base de datos los Alamos y base de datos Swiss Protein, por
homología a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del
anticuerpo donante. Un anticuerpo humano caracterizado por una
homología a las regiones marcos del anticuerpo donante (en una base
de aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región
constante de cadena pesada y/o una región marco variable de cadena
pesada para la inserción de las CDR donantes. Un anticuerpo aceptor
adecuado capaz de donar regiones marcos constantes o variables de
cadena ligera puede ser seleccionado de una manera similar. Debe
apreciarse que las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo aceptor
no es necesario que procedan del mismo anticuerpo aceptor.
Deseablemente, el marco heterólogo y las
regiones constantes se seleccionan a partir de clases e isotipos de
inmunoglobulinas humanas como IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA y IgE.
Sin embargo el anticuerpo aceptor no es necesario que comprenda
solamente secuencias de proteínas de inmunoglobulinas humanas. Por
ejemplo, puede ser construido un gen en el que una secuencia de DNA
que codifique parte de una cadena de inmunoglobulina humana esté
fusionada a una secuencia de DNA que codifique unas secuencias de
aminoácidos que no es de inmunoglobulina como un efector
polipéptido o molécula reportera.
Un ejemplo de un anticuerpo humanizado
particularmente deseable contendría CDR de 2C10 insertadas en las
regiones marcos de una secuencia de anticuerpos humanos
seleccionados. Para neutralizar anticuerpos humanizados, se
insertan una, dos, o preferentemente tres CDR de las regiones
variables de cadena pesada y/o cadena ligera del anticuerpo de
IL-18 en las regiones marcos de la secuencia de
anticuerpos humanos seleccionados, sustituyendo las CDR nativas de
este último anticuerpo.
Preferentemente, en un anticuerpo humanizado,
los dominios variables en las cadenas tanto pesadas como ligeras
humanas han sido tratados por ingeniería genética mediante una o más
sustituciones de CDR. Es posible usar la totalidad de las seis CDR,
o diversas combinaciones de menos de seis CDR. Preferentemente son
sustituidas la totalidad de las seis CDR. Es posible sustituir las
CDR solamente en la cadena pesada humana, usando como cadena ligera
la cadena ligera sin modificar del anticuerpo aceptor humano.
Todavía, alternativamente, puede ser seleccionada una cadena ligera
compatible a partir de otro anticuerpo humano recurriendo a las
bases de datos de anticuerpos convencionales. El resto del
anticuerpo tratado por ingeniería genética puede ser derivado de
cualquier inmunoglobulina humana aceptora adecuada.
Por tanto, el anticuerpo humanizado tratado por
ingeniería genética tiene preferentemente la estructura de un
anticuerpo humano natural o un fragmento del mismo, y posee la
combinación de propiedades necesaria para un uso terapéutico
eficaz, por ejemplo, el tratamiento de enfermedades inflamatoria
mediadas por IL-18 en el hombre o para usos de
diagnósticos.
Como otro ejemplo, un anticuerpo tratado por
ingeniería genética puede contener CDR de la región de cadena
ligera de 2C10.
El anticuerpo humanizado resultante debe estar
caracterizado por la misma especifidad de unión antigénica y
afinidad elevada de mAb 2C10.
Debe entenderse por los expertos en la técnica
que un anticuerpo tratado por ingeniería genética puede ser
adicionalmente modificado mediante cambios en aminoácidos de
dominios variables sin afectar necesariamente a la especifidad y
afinidad elevada del anticuerpo donante (por ejemplo, un análogo).
Está anticipado que los aminoácidos de cadena pesada y ligera
pueden ser sustituidos con otros aminoácidos en los marcos de
dominios variables por las CDR o ambos.
Además, es posible usar la totalidad de las seis
CDR, o diversas combinaciones de menos de seis CDR. Preferentemente
son sustituidas la totalidad de las seis CDR. Es posible sustituir
las CDR solamente en la cadena pesada humana, usando como cadena
ligera la cadena ligera sin modificar del anticuerpo aceptor humano.
Todavía, alternativamente, puede ser seleccionada una cadena ligera
compatible a partir de otro anticuerpo humano recurriendo a las
bases de datos convencionales. El resto del anticuerpo tratado por
ingeniería genética puede ser derivado de cualquier inmunoglobulina
humana aceptora adecuada.
Por tanto, el anticuerpo humanizado tratado por
ingeniería genética tiene preferentemente la estructura de un
anticuerpo humano natural o fragmento del mismo y posee la
combinación de propiedades requerida para un uso terapéutico
eficaz, por ejemplo, tratamiento de enfermedades inflamatorias
mediadas por IL-18 en el hombre o para usos de
diagnóstico.
Como otro ejemplo, un anticuerpo tratado por
ingeniería genética puede contener CDR de la región de cadena
ligera variable de 2C10.
El anticuerpo humanizado resultante debe estar
caracterizado por la misma especifidad de unión antigénica y
elevada afinidad de mAb 2C10.
Debe entenderse por los expertos en la técnica
que un anticuerpo tratado por ingeniería genética puede ser
adicionalmente modificado mediante cambios en aminoácidos de
dominios variables sin afectar necesariamente a la especifidad y la
elevada afinidad del anticuerpo donante (es decir, un análogo). Está
anticipado que los aminoácidos de cadenas ligeras y pesadas pueden
ser sustituidos con otros aminoácidos en los marcos de dominios
variables o las CDR o ambos.
Además, la región constante puede ser alterada
para aumentar o disminuir las propiedades selectivas de las
moléculas de la presente invención. Por ejemplo, la dimerización,
unión a receptores de Fc o la capacidad de unir y activar un
complemento (véase, por ejemplo, Angal et al., Mol. Immunol.
30: 105-108 (1993), Xu et al., J. Biol.
Chem, 269: 3469-3474 (1994), Winter et al.,
documento EP 307,434-B).
Un anticuerpo alterado que es un anticuerpo
quimérico difiere de los anticuerpos humanizados anteriormente
descritos por proporcionar las regiones variables de cadenas pesadas
y cadenas ligeras de anticuerpos donantes no humanos completos,
incluidas las regiones marcos, en asociación con regiones constantes
de inmunoglobulinas humanas para ambas cadenas. Está anticipado que
los anticuerpos quiméricos que retienen una secuencia no humana
adicional relativa a los anticuerpos humanizados de esta invención
pueden provocar una respuesta inmune significativa en seres
humanos.
Estos anticuerpos podrían ser útiles en la
prevención y tratamiento de trastornos mediados por
IL-18, como se expone con posterioridad.
Preferentemente, las secuencias de cadenas
ligeras y/o pesadas variables y las CDR de mAb 2 C10 y sus
secuencias codificadoras de ácidos nucleicos son utilizadas en la
construcción de anticuerpos alterados, preferentemente anticuerpos
humanizados de esta invención, mediante el siguiente procedimiento.
Se pueden emplear también las mismas técnicas o similares para
generar otras realizaciones de esta invención.
Un hibridoma que produce un mAb donante
seleccionado, por ejemplo, el anticuerpo de rata 2C10, es
convenientemente clonado y el DNA de sus regiones variables de
cadena pesada y ligera son obtenidas mediante técnicas conocidas
por un experto en la técnica, por ejemplo, las técnicas descritas
por Sambrook et al., (Molecular Cloning (A Laboratory
Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Las
regiones pesadas y ligeras variables de 2C10 que contienen al menos
la regiones codificadoras de CDR y las partes de las regiones marcos
de dominios variables ligeros y/o pesados de mAb aceptores
requeridas con el fin de retener la especifidad de unión a mAb
donante así como las partes restantes derivadas de inmunoglobulina
de la cadena de anticuerpo derivada de una inmunoglobulina humana,
pueden ser obtenidas usando cebadores de polinucleótidos y
transcriptasa inversa. Las regiones codificadoras de CDR son
identificadas usando una base de datos conocidas y mediante
comparación con otros anticuerpos.
Seguidamente se puede preparar un anticuerpo
quimérico de rata/humano y ser ensayado en cuanto a la capacidad de
unión. Este anticuerpo quimérico contiene las regiones V_{H} y
V_{L} de los anticuerpos donantes no humanos completos, en
asociación con regiones constantes de Ig humana para las dos
cadenas.
Un anticuerpo humanizado puede ser derivado del
anticuerpo quimérico o, preferentemente, ser preparado por vía
sintética insertando las regiones codificadoras de CDR de mAb humano
de las cadenas pesadas y ligeras apropiadamente en el marco
seleccionado de cadenas pesadas y ligeras. Alternativamente, se
puede preparar un anticuerpo humanizado de la invención usando
técnicas de mutagénesis estándar. Por tanto, el anticuerpo
humanizado resultante contiene regiones marcos humanas y regiones
codificadoras de CDR de mAb donantes. Puede haber una manipulación
posterior de los residuos de los marcos. El anticuerpo humanizado
resultante puede ser expresado en células hospedantes
recombinantes, por ejemplo, células de COS, CHO o de mieloma. Se
pueden preparar otros anticuerpos humanizados usando esta técnica
sobre otros anticuerpos no humanos adecuados, de afinidad elevada,
neutralizadores, específicos para IL-18.
Se puede producir un vector de expresión
convencional o plásmido recombinante colocando estas secuencias
codificadoras para el anticuerpo alterado en asociación funcional
con secuencias de control reguladoras convencionales capaces de
controlar la replicación y expresión y/o secreción a partir de una
célula hospedante. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias
promotoras, por ejemplo, promotor de CMV y secuencias señalizadoras,
que pueden ser derivadas de otros anticuerpos conocidos.
Análogamente, se puede producir un segundo vector de expresión que
tenga una secuencia de DNA que codifique un cadena ligera o pesada
del anticuerpo complementario. Preferentemente, este segundo vector
de expresión es igual al primero excepto en lo que se refiere a las
secuencias codificadoras y marcadores seleccionables, con el fin de
asegurar en lo posible que es funcionalmente expresada cada cadena
de polipéptido. Alternativamente, las secuencias codificadoras de
cadenas pesadas y ligeras para el anticuerpo alterado pueden
residir en un único vector.
Una célula hospedante seleccionada es
co-transfectada mediante técnicas convencionales con
el primero y segundo vectores (o sencillamente transfectada
mediante un único vector) para crear la célula hospedante
transfectada de la invención, que comprende las cadenas tanto
recombinantes como ligeras y pesadas sintéticas. La célula
transfectada es seguidamente cultivada mediante técnicas
convencionales para producir el anticuerpo tratado por ingeniería
genética de la invención. El anticuerpo humanizado que incluye la
asociación de la cadena pesada y/o la cadena ligera recombinantes
es seleccionado a partir del cultivo mediante un ensayo apropiado,
como ELISA o RIA. Se pueden emplear técnicas convencionales
similares para construir otros anticuerpos alterados y moléculas de
esta invención.
Los vectores adecuados para las etapas de
clonación y subclonación empleados en los procedimientos y la
construcción de las composiciones de esta invención pueden ser
seleccionados por un experto en la técnica. Por ejemplo, se puede
usar la serie pUC convencional de vectores de clonación. Un vector
usado es pUC19, que está disponible en el comercio a partir de
sedes suministradoras como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o
Pharmacia (Uppsala. Suecia). Adicionalmente, se puede usar para la
clonación cualquier vector que sea capaz de una fácil replicación,
que tenga abundancia de sitios de clonación y genes seleccionables
(por ejemplo, resistencia a los antibióticos) y sea fácilmente
manipulado. Por tanto, la selección del vector de clonación no es un
factor limitativo en esta invención.
Análogamente, se pueden seleccionar los vectores
empleados para la expresión de los anticuerpos tratados por
ingeniería genética según esta invención por un experto en la
técnica a partir de cualquier vector convencional. Los vectores
contienen también secuencias reguladoras seleccionadas (como
promotores de CMV) que dirigen la replicación y expresión de
secuencias heterólogas de DNA en células hospedantes seleccionadas.
Estos vectores contienen las secuencias de DNA anteriormente
descritas que codifican el anticuerpo tratado por ingeniería
genética o región codificadora de inmunoglobulina alterada. Además,
los vectores pueden incorporar las secuencias seleccionadas de
inmunoglobulina modificadas por la inserción de sitios de
restricción deseables para una fácil manipulación.
Los vectores de expresión pueden estar
caracterizados también por genes adecuados para amplificar la
expresión de las secuencias heterólogas de DNA, por ejemplo, el gen
de dihidrofolato reductasa (DHFR) de mamíferos. Otras secuencias de
vectores preferidos incluyen una secuencia señalizadora de poli A,
como la hormona del crecimiento bovino (BGH) y la secuencia
promotora de betaglobina (betaglopro). Los vectores de expresión
útiles en la presente invención pueden ser sintetizados mediante
técnicas bien conocidos por los expertos en esta técnica.
Los componentes de estos vectores, por ejemplo,
replicones, genes de selección, mejoradotes, promotores, secuencias
señalizadotas y similares, pueden ser obtenidos a partir de fuentes
comerciales o naturales o ser sintetizados mediante procedimientos
conocidos para ser usados en la dirección de la expresión y/o
secreción del producto del DNA recombinante en un hospedante
seleccionado. Se pueden seleccionar también para estos fines otros
vectores de expresión apropiados de los que son conocidos numerosos
tipos en la técnica para la expresión en mamíferos, bacterias,
insectos, levaduras y hongos.
La presente invención abarca también una línea
celular transfectada con un plásmido recombinante que contiene las
secuencias codificadoras de los anticuerpos tratados por ingeniería
genética o sus moléculas de inmunoglobulinas alteradas. Las células
hospedantes útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos
vectores de clonación son también convencionales. Sin embargo, lo
más deseablemente, se usan células de diversas cepas de E.
coli para la replicación de los vectores de clonación y otras
etapas en la construcción de anticuerpos alterados de esta
invención.
Las células o líneas celulares hospedantes
adecuadas para la expresión del anticuerpo tratado por ingeniería
genética o anticuerpo alterado de la invención son preferentemente
células de mamíferos como una célula de CHO, COS o de fibroblastos
(por ejemplo, 3T3) y células mieloides y más preferentemente una
célula de CHO o mieloide. Pueden ser usadas células humanas,
haciendo posible así que la molécula sea modificada con modelos de
glicosilación humanos. Alternativamente, pueden ser empleadas otras
líneas celulares eucarióticas. La selección de las células
hospedantes de mamíferos adecuadas y los procedimientos para la
transformación, cultivo, amplificación, selección y producción y
purificación de productos son conocidos en la técnica. Véase, por
ejemplo, la publicación de Sambrook et al., anteriormente
citada.
Las células bacterianas pueden manifestarse
útiles como células hospedantes adecuadas para la expresión de los
Fabs recombinantes de la presente invención (véase, por ejemplo,
Plückthun. A., Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992)).
Sin embargo, debido a la tendencia de las proteínas expresadas en
células bacterianas a estar en una forma sin desplegar o
inapropiadamente plegada o en una forma no glicosilada, cualquier
Fab recombinante producido en una célula bacteriana tendría que ser
seleccionada en cuanto a la retención de la capacidad de unión a
antígenos. Si la molécula expresada en la célula bacteriana se
produjo en una forma apropiadamente plegada, esa célula bacteriana
sería un hospedante deseable. Por ejemplo, diversas cepas de E.
coli usadas para una expresión son bien conocidas como células
hospedantes en el campo de la biotecnología. Pueden ser empleadas
también diversas cepas de B. subtilis, Streptomyces y
otros bacilos y similares en este procedimiento.
Cuando se desee, están disponibles también como
células hospedantes cepas de células de levaduras conocidas por los
expertos en la técnica, así como células de insectos, por ejemplo,
Drosophila y Lepidoptera y sistemas de expresión virales. Véase,
por ejemplo, Miller et al., Genetic Engineering, 8:
277-298, Plenum Press (1986) y referencias citadas
en la misma.
Los procedimientos generales mediante los que
pueden ser construidos los vectores de la invención, los
procedimientos de transfección requeridos para producir las células
hospedantes de la invención y los procedimientos de cultivo
necesarios para producir el anticuerpo alterado de la invención a
partir de esta célula hospedante son todos de técnicas
convencionales. Análogamente, una vez producidos, los anticuerpos
alterados de la invención pueden ser purificados a partir de los
contenidos de cultivos celulares según procedimientos estándar en la
técnica, que incluyen precipitación con sulfato de amonio, columnas
de afinidad, cromatografía de columna, electroforesis sobre gel y
similares. Estas técnicas están dentro de los conocimientos del
estado de la técnica y no limitan esta
invención.
invención.
Todavía, otro procedimiento de expresión de los
anticuerpos humanizados puede utilizar una expresión en un animal
transgénico, como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.873.316.
Esta se refiere a un sistema de expresión que usa el promotor de
caseína del animal que cuando es incorporado por vía transgénica en
un animal permite que la hembra produzca la proteína recombinante
deseada en su leche.
Una vez expresado mediante el procedimiento
deseado, el anticuerpo tratado por ingeniería genética es
seguidamente examinado en cuanto a la actividad in vitro
mediante el uso de un ensayo apropiado. Los formatos de ensayos
ELISA actualmente convencionales se emplean para valorar la unión
cualitativa y cuantitativa del anticuerpo tratado por ingeniería
genética a IL-18. Adicionalmente, se pueden usar
también otros ensayos in Vitro para verificar la eficacia
neutralizadora antes de los posteriores estudios clínicos humanos
realizados para evaluar la persistencia del anticuerpo tratado por
ingeniería genética en el cuerpo, a pesar de los mecanismos
habituales de desaparición.
Siguiendo los procedimientos generales descritos
para preparar anticuerpos humanizados, un experto en la técnica
puede construir también anticuerpos humanizados a partir de otros
anticuerpos de IL-18 donantes, secuencias de
regiones variables y péptidos de CDR descritos en la presente
memoria descriptiva. Los anticuerpos tratados por ingeniería
genética pueden ser producidos con marcos de regiones variables
potencialmente reconocidos como "propios" por los receptores
del anticuerpo tratado por ingeniería genética. Se pueden realizar
modificaciones menores para los marcos de regiones variables para
efectuar grandes aumentos de la unión a antígenos sin una
inmunogenicidad apreciablemente aumentada para el receptor. Estos
anticuerpos tratados por ingeniería genética pueden tratar
eficazmente un ser humano para estados mediados por
IL-18. Estos anticuerpos pueden ser usados también
en el diagnóstico de estos estados.
Se describe también un procedimiento para tratar
seres humanos que experimentan síntomas relacionados autoinmunes,
como MS, que comprende administrar una dosis eficaz de anticuerpos
que incluyen uno o más de los anticuerpos tratados por ingeniería
genética o anticuerpos alterados descritos en la presente memoria
descriptiva, o sus fragmentos.
La respuesta terapéutica inducida mediante el
uso de las moléculas de esta invención es producida mediante la
unión a la IL-18 humana y por tanto, el bloqueo
posterior de la estimulación de Th1. Por tanto, las moléculas de la
presente invención, cuando están en preparaciones y formulaciones
apropiadas para un uso terapéutico, son altamente deseables para
las personas que experimentan una enfermedad autoinmune como, pero
sin limitación, MS, RA, IDDM, IBD y soriasis.
Los anticuerpos alterados, anticuerpos y sus
fragmentos de esta invención pueden ser usados también conjuntamente
con otros anticuerpos, particularmente mAbs humanos reactivos con
otros marcadores (Epitopos) responsables del estado contra el que
se dirige el anticuerpo tratado por ingeniería genética de la
invención.
Los agentes terapéuticos de esta invención se
cree que son deseables para el tratamiento de estados autoinmunes
de aproximadamente 2 días hasta 6 meses o en la medida necesaria.
Por ejemplo, pueden ser deseables tratamientos más largos cuando se
trata MS o similares. La dosis y la duración del tratamiento se
refieren a la duración relativa de las moléculas de la presente
invención en la circulación humana, y pueden ser ajustadas por un
experto en la técnica dependiendo del estado que esté siendo tratado
y la salud general del paciente.
El modo de administración del agente terapéutico
de la invención puede ser cualquier vía adecuada que suministre el
agente al hospedante. Los anticuerpos alterados, anticuerpos,
anticuerpos tratados por ingeniería genética y sus fragmentos, y
las composiciones farmacéuticas de la invención, son particularmente
útiles para una administración parenteral, es decir, por vía
subcutánea, intramuscular, intravenosa o intranasal.
Los agentes terapéuticos de la invención pueden
ser preparados en forma de composiciones farmacéuticas que
contienen una cantidad eficaz del anticuerpo tratado por ingeniería
genética (por ejemplo, humanizado) de la invención como un
ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En el
agente profiláctico de la invención, se prefiere una suspensión o
solución acuosa que contenga el anticuerpo tratado por ingeniería
genética, preferentemente tamponado a un pH fisiológico, en una
forma lista para una inyección. Las composiciones para una
administración parenteral comprenderán comúnmente una solución del
anticuerpo tratado por ingeniería genética de la invención o un
cóctel del mismo disuelto en un vehículo farmacéuticamente
aceptable, preferentemente un vehículo acuoso. Se puede emplear una
diversidad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina al
0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y
generalmente están exentas de materia en forma de partículas. Estas
soluciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas de
esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo,
filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares
farmacéuticamente aceptables en la medida necesaria, para
aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes para
ajustar el pH y tamponantes, etc. La concentración del anticuerpo
de la invención en esta formulación farmacéutica puede variar
ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente 0,5%,
habitualmente al menos aproximadamente 1% hasta tanto como 15 o 20%
en peso, y se seleccionará principalmente basada en volúmenes de
fluidos, viscosidades, etc. Según el modo de administración
particular seleccionado.
Por tanto, una composición farmacéutica de la
invención para una inyección intramuscular se podría preparar para
que contenga 1 ml de agua tamponada esterilizada y entre
aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg, por ejemplo,
aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg y, más
preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg de
un anticuerpo tratado por ingeniería genética de la invención.
Análogamente, una composición farmacéutica de la invención para una
infusión intravenosa se podría preparar para que contenga
aproximadamente 250 ml de solución de Ringer esterilizada y
aproximadamente 1 a aproximadamente 30 y preferentemente 5 mg a
aproximadamente 25 mg de anticuerpo tratado por ingeniería genética
de la invención. Los procedimientos reales para preparar
composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidos o
serán evidentes para los expertos en la técnica y se describen más
en detalle, por ejemplo, en la publicación Remington's
Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton,
Pennsylvania.
Es preferido que el agente terapéutico de la
invención, cuando esté en una preparación farmacéutica, esté
presente en formas de dosificación unitarias. La dosis
terapéuticamente eficaz apropiada puede ser determinada fácilmente
por los expertos en la técnica. Para tratar eficazmente un trastorno
inflamatorio en un ser humano u otro animal, se debe administrar
por vía parenteral una dosis de aproximadamente 0,1 mg a
aproximadamente 20 mg por 70 kg de peso corporal de una proteína o
un anticuerpo de esta invención, preferentemente por vía i.v. o
i.m. (intramuscular) esta dosis debe ser repetida, si es necesario,
en intervalos de tiempo apropiados seleccionados en la medida
apropiada por un facultativo durante la enfermedad.
Los anticuerpos alterados y anticuerpo tratados
por ingeniería genética de esta invención pueden ser usados también
en regímenes de diagnósticos, como para la determinación de
trastornos mediados por IL-18 o para trazar el
progreso del tratamiento de estos trastornos. Como reactivos de
diagnóstico, estos anticuerpos alterados pueden ser
convenientemente marcados para ser usado en formatos de ensayos
ELISA y otros convencionales para la medición de niveles de
IL-18 en suero, plasma u otro tejido apropiado o
para la liberación de células humanas en cultivo. La naturaleza del
ensayo en el que son usados los anticuerpos alterados es
convencional y no limita esta
descripción.
descripción.
Por tanto, una realización se refiere a un
procedimiento para ayudar al diagnóstico de una enfermedad
autoinmune y otros asociados con la producción excesiva de células
T Th1 en un paciente, que comprende las etapas de determinar la
cantidad de IL-18 humana en una muestra (plasma o
tejido) obtenida de dicho paciente y comparar dicha cantidad
determinada con la cantidad media de IL-18 humana en
la población normal, con lo que la presencia de una cantidad
significativamente elevada de IL-18 en la muestra
del paciente es una indicación de enfermedad autoinmune y otros
estados asociados con la producción en exceso de células T Th1.
Los anticuerpos, anticuerpos alterados o sus
fragmentos descritos en la presente memoria descriptiva pueden ser
liofilizados para un almacenamiento y reconstituidos en un vehículo
adecuado antes de ser usados. Esta técnica se ha mostrado que es
eficaz con inmunoglobulinas convencionales y pueden ser empleadas
técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en el estado
de la técnica.
Los siguientes ejemplos ilustran diversos
aspectos de esta invención que incluyen la construcción de ejemplos
de anticuerpos tratados por ingeniería genética y su expresión en
vectores adecuados y células hospedantes, y no están concebidos
como una limitación del alcance de esta invención. Todos los
aminoácidos son identificados mediante códigos de tres letras
convencionales o letras únicas. Todas las enzimas de restricción,
plásmidos y otros reactivos y materiales se obtuvieron de fuentes
comerciales salvo que se indique otra cosa. Todo el tratamiento
general de clonación y otra metodología de DNA recombinante fueron
como se presenta por T. Maniatis et al., anteriormente
citada, o su segunda edición (1989), eds. Sambrook et al.,
por el mismo editor ("Sambrook et al.").
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se inmunizaron ratones (híbridos F1 de Balb/c y
C57BL/6) o ratas (Sprague Dawley) con 30 \mug de
IL-18 recombinante en adyuvante y cuatro semanas
después con 30 \mug de IL-18 en adyuvante.
Basándose en un buen título de anticuerpo en suero para
IL-18, los animales recibieron una inmunización
adicional de 10-30 \mug de IL-18
(i.p. en solución salina). Tres días después de la inmunización
final, se realizó una esplenectomía. Se usaron células de bazo de
ratón o rata para preparar hibridomas mediante procedimientos
estándar. (Zola, H. Ed., Monoclonal Antibodies. CRC Press Inc.
1987). Los hibridomas positivos se clonaron mediante el
procedimiento de dilución
limitante.
limitante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificaron mAbs mediante cromatografía
ProsepA (Bio Processing, Consett, Reino Unido) respectivamente
usando las instrucciones del fabricante. Los mAbs eran > 95%
puros mediante SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó el isotipo de todos los mAbs de
rata y ratón mediante estuches de ensayo disponibles en el comercio
(Zymed, Amersham) y se encontró que eran IgG1 kappa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se biotiniló IL-18 usando un
estuche de ensayo adquirido de la entidad Molecular Probes Inc.
usando una relación 10:1 de reactivo de biotinilación. La
biotinilación no tuvo ningún efecto sobre la actividad biológica de
IL-18.
\newpage
Se revistieron placas de 96 pocillos con
estreptavidina (2 \mug/ml, 100 \mul/pocillo en PBS) mediante
incubación durante una noche a 4ºC. Seguidamente la solución se
aspiró y los sitios de unión no específica se bloquearon con 250
\mul/pocillo de albúmina de suero bovino al 1% (BSA) en tampón de
TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,02% de Catón, pH 7,4) durante
5-60 minutos a TA (temperatura ambiente). A
continuación de esto y de cada una de las etapas siguientes, la
placa se lavó cuatro veces con tampón de lavado (Tris 10 mM, NaCl
150 mM, 0,05% de Tween 20, 0,02% Kathon, pH 7,4). A cada pocillo se
añadieron 100 \mul de
biotina-IL-18 (100 mg/ml) en tampón
del ensayo (0,5% de BSA, 0,05% de gamma-globulina
bovina, 0,01% de % Tween 40, ácido dietilenotriaminopentaacético 20
\muM en tampón de TBS) y las placas se incubaron durante 30
minutos a TA en un agitador-incubador. A cada
pocillo se añadieron seguidamente 50 \mul de medio de hibridoma y
50 \mul del tampón del ensayo y se incubó durante 60 minutos a TA
en un agitador-incubador. Seguidamente se añadieron
a cada pocillo 100 \mul de 0,5 \mug/ml de anticuerpo
anti-ratón o anti-rata marcado con
Eu^{3+} en tampón del ensayo. Finalmente se añadieron 200
\mul/pocillo de mejorador (Wallac) y se incubó durante 5 minutos
a PA y se midió la fluorescencia resuelta en el tiempo. Los
hibridomas que tenían recuentos > que 100 K fueron expandidos en
placas de 24 pocillos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la especifidad de los 18 Mabs
anti-IL-18 generados se revistieron
placas de 96 pocillos, se bloquearon y se incubaron con
biotina-IL-18 como anteriormente.
Todas las incubaciones siguientes se realizaron en un
agitador-incubador a TA. Después de lavar los
pocillos se añadieron 50 \mul de IL-18 (3
\mug/ml) o tampón del ensayo y 50 \mul de mAb y se incubó
durante 60 minutos. Después de lavar los pocillos se añadieron 100
\mul de 0,5 \mug/ml de anticuerpo anti-ratón o
anti-rata marcado con Eu^{3}+ en tampón del ensayo
durante 60 minutos, los pocillos se lavaron y seguidamente se
añadieron 100 \mul/pocillo de mejorador (Wallac) y se incubó
durante 5 minutos a TA y se midió el tiempo de fluorescencia
resuelta en el tiempo. Todos los hibridomas positivos mostraron un
desplazamiento de la unión con IL-18.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló PBMC de donantes sanos mediante
gradiente de Ficol-Paque (Pharmacia) y se cultivó en
placas de 96 pocillos en medios de 10% de FBS DMEMF12 con 1
\mug/ml de ConA (Sigma) en presencia de IL-18 (5
mg/ml) y/o Mabs. Después de 18 h de cultivo a 37ºC, 5% de CO_{2}
en aire y 90% de humedad, se retiraron medios de 25 \mul y se
midió la concentración de interferón-gamma (IFNg)
mediante inmunoensayo. Los resultados, obtenidos a partir de la
media de tres experimentos, se recogen en la Tabla I.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la afinidad del mAbs purificado en el
biosensor óptico BIAcore (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Suecia)
usando un caudal de 30 \mul/minuto. Los datos cinéticos se
evaluaron usando las relaciones previamente descritas (Karlsson
et al, J. Immunol. Meth., 145: 229-240
(1991)) y que se incorpora como referencia en su totalidad. El mAb
(diluido en tampón de HBS, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, 0,01% de
tween-20, pH 7,4) se inyectó sobre una superficie
de IgG Fc anti-ratón de conejo o IgG Fc
anti-rata de cabra, seguido de flujo de tampón y se
registró el RU. Seguidamente se inyectó Il-18
(diluida en tampón de HBS) durante 180 segundos seguido de un flujo
tampón durante 500 segundos y se registró el RU. La superficie del
dispositivo detector se regeneró mediante una inyección de ácido
fosfórico 0,1 M. Las velocidades de activación (Kass) y velocidades
de desactivación (Kdiss) de la unión se calcularon usando un
programa de ordenadora BIAcore y estas conjuntamente produjeron una
constante de equilibrio calculada (K_{d}) de 12 x 10^{-9} M
para mAb 13G9, 3,9 x 10^{-11} M para mAb 2C10 y 1,5 x 10^{-10}
M para mAb 14B7. Véase la
Tabla I.
Tabla I.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de epitopos de Mabs purificados se
midió en el programa BIAcore. Usando un caudal de 10 \mul/minuto,
se inyectó el primer Mab (diluido en tampón de HBS) sobre una
superficie de IgG Fc anti-ratón de conejo o la
superficie de IgG Fc anti-rata de cabra, seguido de
una inyección de IL-18 durante 240 s, una inyección
de Mabs bloqueador durante 48 s y una inyección del segundo Mab
durante 240 s segundo. La superficie fue regenerada mediante una
inyección de ácido fosfórico 0,1 M y el RU se registró después de
cada inyección. Se encontró que los Mab 13G9, 2C10 y 14B7 tenían
epitopos similares o superpuestos.
Ejemplo
3
Los genes pesados y ligeros variables fueron
clonados a partir de células de hibridoma usando procedimientos de
biología molecular estándar descritos brevemente como sigue. El RNA
total se aisló a partir de células de hibridoma usando reactivo
TRIzoI (Life Technologies Cat. Nº 15596-026) según
el protocolo del fabricante. El RNA fue sometido a transcripción
inversa con un estuche de ensayo de RT-PCR según las
instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim Cat. No.
1483-188) usando un oligonucleótido
poli-dT para el cebado. A continuación de la
síntesis del cDNA de la primera cadena, las regiones V pesadas y
ligeras fueron amplificadas por PCR usando cebadores específicos de
regiones constantes en 3' y cebadores en 5' degenerados. Las
secuencias de cebadores en 5' degenerados fueron diseñadas para
codificar las secuencias de aminoácidos N-terminales
previamente determinadas de las regiones de cadenas pesadas o
ligeras variables. Las secuencias de longitud completa a partir de
clones múltiples se obtuvieron a partir de cada amplificación por
PCR y se alinearon para proporcionar un consenso. Consecuentemente,
las 17 primeras bases de la secuencia de DNA para las cadenas tanto
pesadas como ligeras son generadas por PCR-cebador,
sin embargo, la secuencia de proteína traducida es nativa.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
deducidos para los anticuerpos de hibridomas 2C10, 13G9 y 14B7 se
muestran en las figuras 1-6. En cada caso, la CDR y
las secuencias de nucleótidos que los codifican están enmarcadas.
Las secuencias de cebadores degenerados están en letra negrita.
<110> Holmes, Stephen D.
\hskip1cmHo, Yen Sen
\hskip1cmTaylor, Alexander
\hskip1cmAbdel-Meguid, Sherin S.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Antagonistas de
IL-18 recombinantes útiles en el tratamiento de
trastornos mediados 1L-18
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P50897
\vskip0.400000\baselineskip
<149> 60/125,299
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-03-19
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ for Windows Version 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(324)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región V cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CDR I cadena ligera VK2C10
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR II cadena ligera VK2C10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR III cadena ligera VK2C10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(378)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región V cadena pesada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
<21G> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220> CDR I cadena pesada VH2C10
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR II cadena pesada VH2C10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR III cadena pesada VH2C10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(342)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región V cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR I cadena ligera VK 13G9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR II cadena ligera VK13G9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR III cadena ligera CK 13G9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 369
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(369)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región V cadena pesada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR I cadena pesada VH13G9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR II cadena pesada VH13G9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
<21G> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR III cadena pesada VH 13G9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(324)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región V cadena ligera
\newpage
<40> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR I cadena ligara VK14B7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR II cadena ligera CK14B7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR III caena ligra VK14B7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(368)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región V cadena pesada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR I cadena pesada VH14B7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR II cadena pesada VH14B7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR III cadena pesada VH14B7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (7)
1. Un anticuerpo monoclonal neutralizador de
rata específico para interleucina-18 humana, que
comprende una región variable de cadena ligera que tiene una
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y la región variable de
cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
9.
2. Un anticuerpo monoclonal humanizado
específico para interleucina-18 humana, que
comprende las siguientes regiones determinantes complementarias
(CDR):
CDRL1 de SEQ ID NO: 4
CDRL2 de SEQ ID NO: 6
CDRL3 de SEQ ID NO: 8
CDRH1 de SEQ ID NO: 12
CDRH2 de SEQ ID NO: 14
CDRH3 de SEQ ID NO: 16
3. Un anticuerpo monoclonal quimérico específico
para interleucina-18 humana, que comprende la región
variable de cadenas ligera y pesada del anticuerpo de la
reivindicación 1.
4. Un fragmento Fab neutralizador o fragmento
F(ab')_{2} del mismo, del anticuerpo de la reivindicación
1 o 2.
5. Un ácido nucleico, que codifica un anticuerpo
de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
6. Una composición farmacéutica, que comprende
el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
7. Uso del anticuerpo o fragmento Fab
neutralizador o F(ab')_{2} de cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de estados seleccionados entre el
grupo que consiste en enfermedad autoinmune, esclerosis múltiple,
artritis reumatoide, diabetes de tipo 1, enfermedad de inflamación
intestinal o soriasis.
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