JP2014508511A - 抗ｉｌ−１８抗体およびそれらの使用 - Google Patents

抗ｉｌ−１８抗体およびそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、インターロイキン−１８についての特異的結合親和性を有するヒト、ヒト化および／またはキメラ抗体ならびにそれらの断片、誘導体／コンジュゲートおよび組成物を提供する。本発明は、ＩＬ−１８活性の増加に伴う疾患の診断および治療のためのそれらの抗体の使用を含み、治療においては医薬組成物の形態である。

Description

本発明は、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）に結合し、その生物学的効果を阻害する抗体分子に関する。抗ＩＬ−１８抗体は、例えば、ＩＬ−１８レベルの上昇に伴う障害、例として、炎症、心血管および自己免疫疾患の診断および治療において有用であり得る。
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、自然免疫応答および獲得免疫応答の両方において役割を担う強力なサイトカインである。ＩＬ−１８は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）１型免疫応答の一次エフェクター分子の１つであるＩＦＮ−γの産生のその誘導能について最初に同定された（Ｏｋａｍｕｒａ他（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７８：８８−９１）。続いて、ある設定において、ＩＬ−１８は、追加の応答、例えばＴｈ２の発達にも寄与し得ることが示された（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ他（２００１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：４２３−７４）。分化（ＣＤ）４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のクラスターに対するその刺激効果に加えて、ＩＬ−１８は、種々の細胞型、例として好中球、単球／マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、上皮および内皮細胞に対する炎症関連効果の幅広のスペクトルを有することが示されている。
ＩＬ−１８は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）スーパーファミリーに属し、ＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）と同様に、最初に不活性細胞内ポリペプチドのプロＩＬ−１８（２４ｋＤａ）として合成される。プロペプチドの酵素的開裂は、ＩＬ−１８の生物学的に活性の成熟形態（１８ｋＤａ）を放出する。ＩＬ−１８は、免疫応答に関与するマクロファージおよび他の細胞により産生される。ＩＬ−１８は、その生理学的役割とは別に、重度の炎症反応にも寄与し、ある炎症障害、例えば自己免疫疾患におけるその役割の指標を提供する。ＩＬ−１８は、部分的には、ＩＬ−１８に結合し、ＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒ）へのその結合を遮断し、それによりＩＬ−１８活性を抑制する内因性ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）により調節される。しかしながら、ある状況において、この負のフィードバックループは、ＩＬ−１８の生物学的効果を適切に抑制するのに不十分である一方、自然免疫応答を開始させるのに十分なＩＬ−１８生物学的活性を依然として提供する。
ＩＬ−１８の生物学的活性は、ＩＬ−１８が細胞結合ＩＬ−１８Ｒに結合したときに生成され、他のサイトカインの発現をもたらす細胞シグナリングを開始させる。ＩＬ−１８Ｒは、β鎖がＩＬ−１８結合モチーフを含有し、α鎖が細胞内シグナリングドメイン（ＴＩＲ）を含有する機能的複合体を形成する２つのＩｇＧ様ポリペプチド鎖を含むヘテロダイマーである（Ｔｏｒｉｇｏｅ他（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：２５７３７）。ＩＬ−１８は、最初にＩＬ−１８Ｒαにに結合すると考えられ、次いでβ鎖がリクルートされて機能的ヘテロダイマーが形成される。α／β複合体へのＩＬ−１８の結合は、細胞内シグナリングカスケードの活性化をもたらす。したがって、ＩＬ−１８ＲαへのＩＬ−１８の結合の遮断は、所望されないＩＬ−１８の抑制において有用であり得る。
ＩＬ−１８は、多数のヒト疾患、主として自己免疫または炎症疾患および癌に関与している。乾癬患者は、皮膚病巣および血液循環の両方においてＩＬ−１８の増加を有する（Ｆｌｉｓｉａｋ他（２００６）１１：１９４）。血漿ＩＬ−１８レベルの上昇が、多発性硬化症の患者の脳脊髄液および血漿中で観察されている（Ｆａｓｓｂｅｎｄｅｒ他（１９９９）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５３：１１０４；Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ他（２００１）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５７：３４２）。炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）の患者は、血液循環中のＩＬ−１８レベルの上昇を有する（Ｌｕｄｗｉｃｚｅｋ他（２００５）Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１６：２７；Ｗｉｅｒｃｉｎｓｋａ−Ｄｒａｐａｌｏ他（２００５）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１：６０５）。関節リウマチ（ＲＡ）の患者は、滑液中のＩＬ−１８レベルの上昇を有する（Ｇｒａｃｉｅ他（１９９９）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０４：１３９３）。ＩＬ−１８は、全身症状を有する他の関節炎疾患、例えばスティル病（Ｋａｗａｓｈｉｍａ他（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４４（３）：５５０−６０）および全身性若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）（Ｍａｅｎｏ他（２００２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４６（９）：２５３９−４１；Ｓｈｉｍｉｚｕ他（２０１０）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ４９（９）：１６４５−５３）を有する患者の血清中で増加することも示されており、疾患重症度のマーカーとして提案されている（Ｋａｗａｇｕｓｈｉ他（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４４（７）：１７１６−７；Ｌｏｔｉｔｏ他（２００７）Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３４（４）：８２３−３０）。これらの自己炎症障害において、血液循環ＩＬ−１８は、疾患の活性期の間および合併症、例えばマクロファージ活性化症候群を発症する患者の下位群においてさらに増加することが示された（Ｓｈｉｍｉｚｕ他（２０１０）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ４９（９）：１６４５−５３）。ＩＬ−１８レベルは、全身的、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者の肺組織の両方において増加することも示され、ＩＬ−１８は肺胞マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および気道上皮細胞に関連する（Ｉｍａｏｋａ他（２００９）Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ．３１：２８７−９７；Ｋａｎｇ他（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８（３）：１９４８−５９；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ他（２００７）Ｌｕｎｇ １８５：１６１−７１；Ｒｏｖｉｎａ他（２００９）Ｒｅｓｐｉｒ Ｍｅｄ．１０３：１０５６−６２）。ＩＬ−１８は、ＣＯＰＤ併存疾患にも寄与し得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ他（２００７）Ｌｕｎｇ １８５：１６１；Ｌａｒｓｅｎ他（２００８）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ８０：４７）。
心血管疾患において、血液循環ＩＬ１８の血漿または血清レベルの上昇が、急性冠症候群、心筋梗塞、冠動脈アテローム性動脈硬化症、および不安定狭心症において計測された（Ｍａｌｌａｔ他（２００２）Ｈｅａｒｔ ８８：４６７；Ｈｕｌｔｈｅ他（２００６）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １８８：４５０；Ｍａｌｌａｔ他（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０４：１５９８）。血清ＩＬ−１８レベルは、頸動脈の内膜中膜厚にも関連する（Ｙａｍａｇａｍｉ他（２００４）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２５：１４５８）。
癌のいくつかの型も、ＩＬ−１８発現レベルの上昇に関連する。しかしながら、ＩＬ−１８の役割は、悪性疾患において二重であり得る（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（２００８）Ｃａｎｃｅｒ ＆ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ ２５：３０７）。一方で、ＩＬ−１８は、血管新生促進性であり得、それにより腫瘍発達を促進し得、他方、細胞免疫応答、例えば、ＮＫ細胞媒介細胞傷害を刺激し得、それにより抗腫瘍形成作用物質として作用し得る（Ｋｉｍ他（２００７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２６：１４６８）。
これらの臨床観察の多くは、ヒト疾患の動物モデルにおいても裏付けられている。これらの試験は、ＩＬ−１８依存性の疾患機構および介入のための潜在的標的としてのＩＬ−１８の両方に対処した。最も広く使用される多発性硬化症についての動物モデルである実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）におけるＣＮＳ病変の発達は、ＩＬ−１８Ｒαエンゲージメントに依存性であることが示された（Ｇｕｔｃｈｅｒ他（２００６）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：９４６）。動物へのＩＬ−１８の投与は、ＲＡのコラーゲン誘導関節炎モデルにおいて疾患を悪化させることが示された（Ｇｒａｃｉｅ他（１９９９）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０４：１３９３）一方、ＩＬ−１８の欠損またはＩＬ−１８中和療法は疾患の重症度を減衰させた（Ｂａｎｄａ他（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：２１００）。ＩＬ−１８ノックアウトマウスは、実験的誘導大腸炎に耐性である（Ｈｏｖｅｔ他（２００１）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １２１：１３７２）一方、ＩＬ−１８を過剰発現するトランスジェニック動物はより影響を受けやすい（Ｉｓｈｉｋｕｒａ他（２００３）Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １８：９６０）。ＩＬ−１８中和治療は、腸炎症を減衰させる（Ｌｏｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ（２００２）Ｐａｔｈｏｂｉｏｌ ７０：１６４）。
ＣＯＰＤを発症させた動物モデルにおいて、タバコ煙は、ＩＬ−１８発現を肺組織中で局所的に増加させることが示された（Ｋａｎｇ他（２００８）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１８：２７７１，Ｋａｎｇ他（２００７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８：１９４８）。このモデルにおいて、ＩＬ−１８Ｒα遺伝子の破壊を介するＩＬ−１８シグナリングの損傷は、肺炎症、細胞アポトーシスおよび肺気腫の減少をもたらした（Ｋａｎｇ他（２００７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８：１９４８）。逆に、マウスの肺中のＩＬ−１８の過剰発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ、好中球および好酸球のリクルートメントを特徴とする肺炎症ならびに気腫表現型を有する肺に関連した（Ｈｏｓｈｉｎｏ他（２００７）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７６：４９）。慢性肺炎症に加えて、ＩＬ−１８は、ウイルスまたは細菌誘発性悪化に関連し得る。タバコ煙マウスモデルにおいて、ＩＬ−１８レベルは、ポリ（Ｉ：Ｃ）によるマウスの処理またはインフルエンザによる感染によりさらに増強することおよび炎症、肺胞リモデリングおよびアポトーシスに寄与することが示された（Ｋａｎｇ他（２００８）前掲）。
多数の実験的動物モデルは、心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症の発達におけるＩＬ−１８の役割に対処した。ＡｐｏＥ−／−マウスへの組換えＩＬ−１８の投与は、アテローム性動脈硬化症病巣サイズの増加および血漿ＩＦＮγレベルの上昇をもたらした（Ｔｅｎｇｅｒ他（２００５）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２５：７９１）。ＡｐｏＥ−／−マウスにおける、天然に生じるＩＬ−１８インヒビター、ＩＬ−１８ＢＰの過剰発現は、アテローム性動脈硬化症の低減およびより「安定」な病巣を示すプラーク表現型の大きな変化をもたらした（Ｍａｌｌａｔ他（２００１）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ８９：Ｅ４１）。二重ノックアウトＡｐｏＥ−／−ｘＩＬ−１８−／−マウスの表現型は、ＩＬ−１８ＢＰ過剰発現ＡｐｏＥ−／−マウスと、病巣がより小さく、それらの表現型がより「安定」である点で類似する（Ｅｌｈａｇｅ他（２００３）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ５９：２３４）。ラット血管損傷モデルにおける中和抗ＩＬ−１８抗体の投与は、新生内膜形成を顕著に減少させ、その結果、内膜内細胞増殖の低減、ならびにＩＦＮγおよびＩＬ−６遺伝子発現に相当した（Ｍａｆｆｉａ他（２００６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１４：４３０）。さらに、ＩＬ−１８−／−マウスは、過食症、肥満およびインスリン耐性を受けやすい（Ｎｅｔｅａ他（２００６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：６５０）。
上記のとおり、ＩＬ−１８は、疾患を媒介する炎症促進性サイトカイン、ならびに感染および癌に対する宿主防御に重要な免疫賦活性サイトカインとみなすことができる。
高親和性で構成的に発現される血液循環ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、ＩＬ−１８についての細胞表面受容体と競合し、ＩＬ−１８活性を中和し、天然抗炎症および免疫抑制分子として作用し得る。ヒトにおいて、選択的スプライシングから生じるＩＬ−１８ＢＰの４つの異なるアイソフォーム（ａ、ｂ、ｃおよびｄ）が同定されている。ＩＬ−１８ＢＰａおよびＩＬ−１８ＢＰｃのみが、ヒトＩＬ−１８に結合し、その生物学的活性を中和することが示されており、アイソフォームａはアイソフォームｃよりも１０倍高い親和性を有する（Ｋｉｍ他（２０００）ＰＮＡＳ ９７ １１９０−１１９５）。ヒトＩＬ−１８のコンピュータモデリングは、ＩＬ−１８ＢＰの大きい疎水性ポケット中に埋め込まれた逆荷電アミノ酸残基と相互作用する２つの荷電残基Ｇｌｕ−４２およびＬｙｓ−８９を同定した。細胞表面ＩＬ−１８受容体アルファ鎖は、ＩＬ−１８結合についてＩＬ−１８ＢＰと競合するが、ＩＬ−１８受容体アルファ鎖は、ＩＬ−１８ＢＰと顕著な相同性を共有しない。
可溶性ＩＬ−１８の構造は、ＮＭＲ分光法により決定されており、β−トレフォイルを形成する１２個のストランドからなる（Ｋａｔｏ他（２００３）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：９６６）。３つの特異的表面領域が同定されている。Ｉ部位は、コアバレルの片側上に局在する５つの残基（Ａｒｇ１３、Ａｓｐ１７、Ｍｅｔ３３、Ａｓｐ３５およびＡｓｐ１３２）により形成され、ＩＬ−１８Ｒαへの結合を担う。ＩＩ部位は、β−バレルの頂部に局在する６つの残基（Ｌｙｓ４、Ｌｅｕ５、Ｌｙｓ８、Ａｒｇ５８、Ｍｅｔ６０およびＡｒｇ１０４）により形成され、同様にＩＬ−１８Ｒα結合に重要である。β−バレルの底部においてＩＩ部位の反対側に局在するＩＩＩ部位（Ｌｙｓ７９、Ｌｙｓ８９、ａｓｐ９８）は、ＩＬ−１８Ｒβへの結合である（Ｋａｔｏ他（２００３）前掲）。
ＩＬ−１８に結合する抗体は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第６７０６４８７号明細書、国際公開第２００１／０５８９５６号パンフレット、欧州特許第１６２１６１６号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１４７６１０号明細書；欧州特許第０９７４６００号明細書；および国際公開第０１５８９５６号パンフレットを参照）。しかしながら、治療用途においてＩＬ−１８の生物学的活性を低減させる抗ＩＬ−１８抗体が依然として必要とされている。
本発明の態様は、ＩＬ−１８ＲおよびＩＬ−１８ＢＰの一方または両方へのＩＬ−１８の結合を阻害し、それによりＩＬ−１８活性を低減させるインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）の単離された結合メンバーを提供する。
本発明の結合メンバーは、Ｉｌ−１８分子上のＩＬ−１８ＢＰ結合部位に全体的または部分的に重複するエピトープに結合し得る。ＩＬ−１８分子上のＩＬ−１８ＢＰ結合部位を図１３に示す。
例えば、本発明の結合メンバーは、残基Ｔｙｒ１、Ｇｌｙ３、Ｌｅｕ５、Ｇｌｕ６、Ｌｙｓ８、Ｍｅｔ５１、Ｌｙｓ５３、Ａｓｐ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｎ５６、Ｐｒｏ５７、Ａｒｇ５８、Ｇｌｙ５９、Ｍｅｔ６０、Ａｒｇ１０４、Ｓｅｒ１０５、およびＰｒｏ１０７の１つ以上を含むヒトＩＬ−１８のエピトープに結合し得る。
本発明の結合メンバーは、ＩＬ−１８活性の増加に関連する疾患、例えば急性冠症候群（ＡＣＳ）；アテローム性動脈硬化症；および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の診断および治療において有用であり得る。
本発明の結合メンバーは、試料中の遊離ＩＬ−１８の量の計測においても有用であり得る。
増加濃度の抗体１ｓｃＦｖ（三角）によるヒトＩＬ−１８、ＩＬ−１８受容体アルファおよびＩＬ−１８受容体ベータ複合体の形成の阻害を示す。Ｙ軸は、ＩＬ−１８受容体複合体へのＩＬ−１８の特異的結合を、いかなるｓｃＦｖも不存在下で観察された全結合の割合として表す。データは、ＳＥＭとともに二重点の平均値を表す。 グラフＡにおいて、増加濃度の抗体１ＩｇＧ２（三角）によるヒトＩＬ−１８、ＩＬ−１８受容体アルファおよびＩＬ−１８受容体ベータ複合体の形成の阻害を、グラフＢにおいて、増加濃度の抗体１ＩｇＧ２（三角）によるアカゲザルＩＬ−１８、ＩＬ−１８受容体アルファおよびＩＬ−１８受容体ベータ複合体の形成の阻害を示す。Ｙ軸は、ＩＬ−１８受容体複合体へのＩＬ−１８の特異的結合を、いかなるＩｇＧも不存在下で観察された全結合の割合として表す。データは、ＳＥＭとともに二重点の平均値を表す。 増加濃度の抗体１ＩｇＧ２（円）によるヒトＩＬ−１８−ＦＨへのＩＬ−１８ＢＰａ−Ｆｃの結合の阻害を示す。Ｙ軸は、ＩＬ−１８ＢＰａ−ＦｃへのＩＬ−１８の特異的結合を、いかなるＩｇＧも不存在下で観察された全結合の割合として表す。データは、ＳＥＭとともに二重点の平均値を表す。 増加濃度の抗体９ｓｃＦｖ（円）および抗体１０ｓｃＦｖ（四角）によるヒトＩＬ−１８への抗体６ＧＬ結合の阻害を示す。Ｙ軸は、抗体６ＧＬへのＩＬ−１８の特異的結合を、いかなるｓｃＦｖも不存在下で観察された全結合の割合として表す。データは、ＳＥＭとともに二重点の平均値を表す。 増加濃度の抗体９ｓｃＦｖ（四角）、抗体１０ｓｃＦｖ（円）および抗体７ｓｃＦｖ（三角）の存在下で外因性ヒトＩＬ−１８およびＴＮＦαにより刺激したＫＧ−１細胞によるＩＦＮγ放出の阻害を示す。Ｙ軸は、ＩＦＮγ放出を、中和抗体の不存在下で観察される最大応答の割合として表す。データは、ＳＥＭとともに二重ウェルの平均値を表す。 増加濃度の生殖細胞系列化抗ＩＬ−１８ＩｇＧの存在下で外因性ヒトＩＬ−１８およびＴＮＦαにより刺激したＫＧ−１細胞によるＩＦＮγ放出の阻害を示す。抗体１１ＧＬ（円）、抗体１２ＧＬ（四角）、抗体８ＧＬ（菱形）（ＩｇＧ２に全て変換）、および対照ＩｇＧ（三角）の中和効果をグラフＡに示す。ＩｇＧ１ＴＭに変換した抗体１２ＧＬ（白四角）および対照ＩｇＧ（白三角）の中和効果をグラフＢに示す。Ｙ軸は、ＩＦＮγ放出を、中和抗体の不存在下で得られる最大応答の割合として表す。データは、ＳＥＭとともに二重ウェルの平均値を表す。 増加濃度の生殖細胞系列化抗体１２ＩｇＧ１ＴＭ（四角）および対照ＩｇＧ（三角）の存在下でＬＰＳおよびヒトＩＬ−１２により刺激したヒト（グラフＡ）およびカニクイザル（グラフＢ）起源のＰＢＭＣによるＩＦＮγ放出の阻害を示す。Ｙ軸は、ＩＦＮγ放出を、中和抗体の不存在下で得られる最大応答の割合として表す。データは、ＳＥＭとともに３つのドナーの平均値を表す。 増加濃度の生殖細胞系列化抗体１２ＩｇＧ１ＴＭ（円）および対照ＩｇＧ（三角）の存在下でヒトＩＬ−１８により刺激したヒト好中球上のＣＤ１１ｂ上方調節の阻害を示す。Ｙ軸は、未処理細胞中の発現レベルを差し引いた後のＣＤ１１ｂ発現の幾何平均を表す。データは、ＳＥＭとともに二重ウェルの平均値を表す。 増加濃度の生殖細胞系列抗体１２ＩｇＧ１ＴＭ（四角）および対照ＩｇＧ（三角）の存在下でヒトＩＬ−１８およびｆＭＬＦＦにより刺激したヒト好中球による活性酸素種（ＲＯＳ）産生の阻害を示す。Ｙ軸は、未処理細胞において見られるレベルを差し引いた後のＲＯＳ産生（ＦＬ−２チャネル中）陽性の細胞の割合を表す。データは、ＳＥＭとともに二重ウェルの平均値を表す。 増加量の抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭ（グラフＡ）の存在下でヒトＩＬ−１８により刺激したＫＧ−１細胞によるＩＦＮγ放出の用量依存性誘導および抗体のＫＤを決定するために使用した対応するＳｃｈｉｌｄプロット（グラフＢ）を示す。 増加濃度の抗体１２ＧＬＩｇＧ２（円）によるヒトＩＬ−１８−ＦＨへのヒトＩＬ−１８ＢＰａ−Ｆｃ結合の阻害を示す。Ｙ軸は、ＩＬ−１８ＢＰａ−ＦｃへのＩＬ−１８の特異的結合を、いかなるＩｇＧも不存在下で観察された全結合の割合として表す。データは、ＳＥＭとともに二重点の平均値を表す。 ＩＬ−１８（灰色）のポリペプチド鎖が抗体１２ＧＬ（黒色）と複合体化するＩＬ−１８：抗体１２ＧＬの複合体を示す。 抗体１２ＧＬ（上部）およびＩＬ−１８ＢＰ（下部）と相互作用するＩＬ−１８配列内の残基（灰色、下線）（すなわち、エピトープ）を示す。 ＩＬ−１８と相互作用する抗体１２ＧＬ配列内の残基（灰色、下線）（すなわち、パラトープ）を示す。 ｐＣＬＤ−１１２８プラスミドのマップを示す。 組換えＩＬ−１８ＢＰを用いる遊離ＩＬ−１８についてのアッセイにおける組換えＩＬ−１８からのシグナルの濃度依存性阻害を示す。 遊離ＩＬ−１８についてのアッセイにおける３つのヒト唾液試料中の内因性遊離ＩＬ−１８からのシグナルの組換えＩＬ−１８ＢＰおよび抗体１２ＧＬによる阻害を示す。
本発明は、ＩＬ−１８に結合する結合メンバー、例として、ヒト、ヒト化および／またはキメラ抗体、ならびにそれらの断片、誘導体／コンジュゲートおよび組成物を提供する。本明細書に記載の結合メンバーは、ＩＬ−１８ＢＰおよび／またはＩＬ−１８ＲへのＩＬ−１８の結合をモジュレートし得、ＩＬ−１８の例えばインビボ、エクスビボまたはインビトロ生物学的活性の減少において有用であり得る。ＩＬ−１８に結合する結合メンバーは、例えば、試料中のＩＬ−１８の存在の検出においても有用であり得る。
本発明の一態様は、ＩＬ−１８ＲおよびＩＬ−１８ＢＰの一方または両方へのＩＬ−１８の結合を阻害し、それによりＩＬ−１８活性を低減させるＩＬ−１８についての単離された結合メンバーを提供する。
単離された結合メンバーは、ＩＬ−１８ＢＰ結合部位に完全にまたは部分的に重複するＩｌ−１８分子上のエピトープに結合し得る。
ＩＬ−１８ＢＰ結合部位を図１３に示す。
例えば、ＩＬ−１８についての単離された結合メンバーは、ヒトＩＬ−１８の残基Ｔｙｒ１、Ｇｌｙ３、Ｌｅｕ５、Ｇｌｕ６、Ｌｙｓ８、Ｍｅｔ５１、Ｌｙｓ５３、Ａｓｐ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｎ５６、Ｐｒｏ５７、Ａｒｇ５８、Ｇｌｙ５９、Ｍｅｔ６０、Ａｒｇ１０４、Ｓｅｒ１０５およびＰｒｏ１０７または他の種、例えば霊長類、例えばアカゲザルのＩＬ−１８からの対応する残基の１つ以上を含むＩＬ−１８のエピトープに特異的に結合し得る。
ＩＬ−１８についての結合メンバーは、ヒトＩＬ−１８のＴｙｒ１、Ｇｌｙ３、Ｌｅｕ５、Ｇｌｕ６、Ｌｙｓ８、Ｍｅｔ５１、Ｌｙｓ５３、Ａｓｐ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｎ５６、Ｐｒｏ５７、Ａｒｇ５８、Ｇｌｙ５９、Ｍｅｔ６０、Ａｒｇ１０４、Ｓｅｒ１０５、およびＰｒｏ１０７からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または全１７個の残基を含むＩＬ−１８エピトープに結合し得る。
例えば、ＩＬ−１８エピトープは、残基Ｔｙｒ１、Ｇｌｙ３、Ｌｅｕ５、Ｍｅｔ５１、Ｌｙｓ５３、Ａｓｐ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｎ５６、Ｐｒｏ５７、Ａｒｇ５８、Ｇｌｙ５９、Ｍｅｔ６０、Ａｒｇ１０４およびＳｅｒ１０５を含み得る。場合により、エピトープは、残基Ｇｌｕ６、Ｌｙｓ８およびＰｒｏ１０７をさらに含み得る。
一部の好ましい実施形態において、ＩＬ−１８についての結合メンバーは、Ｔｙｒ１、Ｇｌｙ３、Ｌｅｕ５、Ｍｅｔ５１、Ｌｙｓ５３、Ａｓｐ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｎ５６、Ｐｒｏ５７、Ａｒｇ５８、Ｇｌｙ５９、Ｍｅｔ６０、Ａｒｇ１０４およびＳｅｒ１０５からなるＩＬ−１８エピトープに結合し得る。
ＩＬ−１８の配列を、エピトープ残基を示して図１３に記載する。
ＩＬ−１８エピトープの一部として同定されたＩｌ−１８残基は、本明細書において、結合したＩＬ−１８／抗体複合体中の抗体可変ドメインの１つ以上の残基の０．５ｎｍ（５Å）以内に位置することが示される。一部の実施形態において、結合したＩＬ−１８／抗体複合体中の抗体可変ドメインのより多くの残基に近接して（例えば、０．７５ｎｍ以内または１ｎｍ以内）さらに局在する他のＩｌ−１８残基も、ＩＬ−１８エピトープの一部とみなすことができる。
ＩＬ−１８は、特に記載のない限りヒトＩＬ−１８である。ヒトＩＬ−１８の多数の多形変異体が公知である。最も一般的な２つの多形変異体は、ＳＮＰデータベースにおいてアクセッション番号ｒｓ２８５４７４６（Ａ３２Ｇ）およびｒｓ９２８２７３４（Ｈ１５８Ｐ）を有する。ヒトＩＬ−１８の配列は、公共データベース上で入手可能であり（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３６０６；ＮＣＢＩ ＮＰ＿００１５５３．１ＧＩ：４５０４６５３；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１４１１６−１）、成熟ヒトＩＬ−１８配列は配列番号１６９に示す。非ヒトＩＬ−１８は、ヒト以外の種、例えば齧歯類または非ヒト霊長類において天然に生じるＩＬ−１８のオルソログを指す。他の種、例としてアカゲザルからのＩＬ−１８配列は当技術分野において公知であり、公共データベース、例えばＧｅｎｂａｎｋ上で入手可能である。ヒトＩＬ−１８中の指定の残基に対応する他の種からのＩＬ−１８配列中の残基は、配列アラインメントツールを使用して容易に同定することができる。
組換え発現成熟ヒトおよびアカゲザルＩＬ−１８を使用して、本明細書に記載の抗体分子を選択およびスクリーニングした。非ヒトオルソログ、例えば齧歯類およびアカゲザルＩＬ−１８を、種交差反応分析についての本明細書に記載の実験において使用した。
記載の結合メンバーはヒトＩＬ−１８に結合する。結合メンバーは、他の種からのＩＬ−１８中の標的エピトープにも結合し得る。例えば、本明細書に記載の結合メンバーは、非ヒト霊長類、例えばアカゲザルおよび／またはカニクイザルからのＩＬ−１８に結合し得る。一部の実施形態において、結合メンバーは、齧歯類ＩＬ−１８、例えばマウスまたはラットＩＬ−１８への結合も示し得ず、実質的な結合も示し得ない。
本明細書に記載の結合メンバーは、本明細書に記載の標的ＩＬ−１８エピトープに特異的であり、この標的エピトープに非標的エピトープ、例えばＩＬ−１８以外のタンパク質からのエピトープに対して高い親和性で結合する。例えば、結合メンバーは、他のヒトサイトカイン、例えばＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｆ７よりも少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍または少なくとも２０００倍大きいＩＬ−１８についての結合親和性を示し得る。
結合メンバーは、１０−２ｓ−１未満、好ましくは、１０−３ｓ−１未満、より好ましくは、１０−４ｓ−１未満、例えば、９×１０−５以下、典型的には２から９×１０−５ｓ−１のヒトＩＬ−１８および場合によりアカゲザルＩＬ−１８についての解離定数（ｋｄ）を示し得る。（例えば、本明細書に記載のＢｉａｃｏｒｅにより計測された抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭについて２．９×１０−５ｓ−１）。
結合メンバーは、１０ｎＭ未満（例えば、本明細書に記載のＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて計測された抗体１、ＫＤ＝９．９６ｎＭ）；好ましくは、１ｎＭ未満、より好ましくは、５００ｐＭ未満、より好ましくは、１００ｐＭ未満、さらにより好ましくは好ましくは、７０ｐＭ未満（例えば、抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭ、ＫＤ＝本明細書に記載のＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて計測された６３ｐＭ）のヒトＩＬ−１８についての親和性（ｋＤ）を示し得る。結合メンバーの結合キネティクスおよび親和性（平衡解離定数ＫＤと表現）は、標準的技術を使用して、例えば表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析を使用して、または本明細書に記載のとおり細胞ベースアッセイ（Ｓｃｈｉｌｄプロット／ｐＡ２分析）を薬理学的に使用して測定することができる。
本明細書に記載の結合メンバーは、ＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒ）および／またはＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）へのＩＬ−１８の結合を阻害し得る。例えば、結合メンバーは、ＩＬ−１８Ｒ（ＩＬ−１８Ｒα、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション＃Ｑ１３４７８；ＩＬ−１８Ｒβ、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション＃Ｏ９５２５６）および／またはＩＬ−１８ＢＰ、例えばＩＬ−１８ＢＰアイソフォームａ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション＃Ｏ９５９９８）とＩＬ−１８への結合について競合し得る。
競合は、標準的技術、例えば実施例に記載のＩＬ−１８／ＩＬ−１８ＢＰホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ（商標））競合アッセイを使用して計測することができる。例えば、結合メンバーは、好適なアッセイ、例えばＨＴＲＦ（商標）ＩＬ−１８／Ｉｌ−１８ＢＰ競合アッセイにおいて例えば１０ｎＭにおいて計測されたＩＬ−１８へのＩＬ−１８ＢＰ結合の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の阻害を示し得る。
本明細書に記載の結合メンバーは、ＩＬ−１８の生物学的活性を阻害し得る。結合メンバーによるＩＬ−１８活性の阻害は、例えば、本明細書に記載のアッセイにおいて、結合メンバーがＩＬ−１８に結合し、それを阻害することを示す。ＩＬ−１８活性の阻害は、ＩＦＮγ産生の減少により簡便に計測することができる。阻害は、例えばＥＬＩＳＡにより他の可溶性メディエーター、例えばＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＣＸＣＬ１６、ＧＭ−ＣＳＦ、ｓＩＣＡＭ−１、およびＭＭＰの放出により計測することもできる。
ＩＦＮγおよび他の可溶性メディエーターの産生および放出を計測する技術は当技術分野において周知であり、その技術には、細胞ベースアッセイ、例えばＫＧ−１アッセイおよびＰＢＭＣアッセイ；免疫学的技術、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティングおよび免疫沈降；親和性クロマトグラフィーおよび他の生化学的アッセイが含まれる。
ＩＬ−１８活性の阻害は、細胞上の活性化マーカー、例えばＣＤ１１ｂの発現の減少または酸化的ストレスのメディエーター、例えば活性酸素種（ＲＯＳ）の産生の減少により計測することもできる。ＣＤ１１ｂまたはＲＯＳのモジュレーションを計測する技術は当技術分野において周知であり、その技術には、細胞ベースアッセイ、例えば好中球刺激アッセイ；免疫学的技術、例えばフローサイトメトリーのための免疫染色および他の生化学的アッセイが含まれる。
ＩＬ−１８活性の阻害は、部分的または全体的（すなわち、中和）であり得る。例えば、結合メンバーは、ＩＬ−１８活性を、結合メンバー不存在下の活性に対して１００％、または少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％だけ阻害し得る。
結合メンバーの中和効力を測定することができる。効力は、通常、ＩＣ５０値として、特に記載のない限りｎＭで表現される。機能アッセイにおいて、ＩＣ５０は、生物学的応答をその最大値の５０％だけ低減させる抗体分子の濃度である。リガンド結合試験において、ＩＣ５０は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％だけ低減させる濃度である。ＩＣ５０は、結合メンバー濃度の対数の関数として最大生物学的応答の％をプロットし、ソフトウェアプログラム、例えばＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）またはＯｒｉｇｉｎ（Ｏｒｉｇｉｎ Ｌａｂｓ）を使用してシグモイド関数をデータにフィットさせてＩＣ５０値を作成することにより算出することができる。効力を計測または測定する好適なアッセイは、当技術分野において周知である。
本明細書に記載の結合メンバーは、例えば、ＩＬ−１８誘発性のＩＦＮγ放出により計測された２６０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または０．５ｎＭ未満のＩＬ−１８についてのＩＣ５０値（効力の幾何平均として表現）を示し得る。ＩＦＮγ放出についての好適なアッセイには、本明細書に記載のＫＧ−１およびＰＢＭＣアッセイが含まれる。
第１の種（例えばヒト）からのＩＬ−１８を使用するアッセイにおいて算出された結合メンバーの中和効力を、第２の種（例えばアカゲザルＩＬ−１８）からのＩＬ−１８を使用する同一アッセイにおける結合メンバーの中和効力と比較して、２つの種のＩＬ−１８についての結合メンバーの交差反応性の程度を評価することができる。本明細書に記載の結合メンバーは、非ヒトＩＬ−１８アッセイにおけるものよりもヒトＩＬ−１８アッセイにおける中和効力が大きいことがある。例えば、ヒトＩＬ−１８についての結合メンバーの中和効力は、アカゲザルＩＬ−１８についてのものよりも大きいことがある。
結合メンバーは、抗体フレームワーク内の１つ以上のＣＤＲ、例えばＣＤＲのセット（すなわち、抗体抗原結合ドメイン）を有する抗体分子を含み得る。例えば、抗体分子は、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含み得る。抗体分子のＶＨおよびＶＬドメインも、本発明の一部として提供される。周知のとおり、ＶＨおよびＶＬドメインは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、およびフレームワーク領域（「ＦＷ」）を含む。ＶＨドメインはＨＣＤＲのセットを含み、ＶＬドメインはＬＣＤＲのセットを含む。抗体分子は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインならびに／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含み得る。ＶＨまたはＶＬドメインは、フレームワークをさらに含み得る。ＶＨまたはＶＬドメインフレームワークは、典型的には、４つのフレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４を含み、それらには以下の構造でＣＤＲが組み入れられている：ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＣＤＲ２−ＦＷ３−ＣＤＲ３−ＦＷ４。
本発明の態様による抗体ＶＨおよびＶＬドメイン、ＦＷおよびＣＤＲの例を、表１０および１１ならびに本開示の一部を形成する付属の配列表に列記する。本明細書に開示される全てのＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲのセット、ＨＣＤＲのセットおよびＬＣＤＲのセットならびにそれらの要素の組合せは、本発明の態様を表す。本明細書に記載のとおり、「ＣＤＲのセット」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。したがって、ＨＣＤＲのセットはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指し、ＬＣＤＲのセットはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を指す。特に記載のないかぎり、「ＣＤＲのセット」には、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲが含まれる。典型的には、本発明の抗体分子は、モノクローナル抗体である。
他の実施形態において、結合メンバーは、以下にさらに考察するとおり、通常、１つ以上のＣＤＲ、例えば非抗体タンパク質足場中のＣＤＲのセットにより提供される非抗体分子内の抗原結合部位を含み得る。
表１０、１１および配列表に示すＣＤＲ配列およびフレームワーク配列のセットを有する抗体１と称する親抗体分子の単離を、本明細書に記載する。最適化のプロセスを介して、抗体クローンのパネルを称する抗体１から作製し、それらを抗体１ＧＬ、抗体２、抗体３、抗体４、抗体５、抗体６、抗体６ＧＬ、抗体７、抗体７ＧＬ、抗体８＿ＧＬ、抗体９、抗体１０、抗体１１、抗体１１ＧＬ、および抗体１２ＧＬと称する。これらの最適化クローンのＣＤＲ配列および可変ドメイン配列は、表１０および１１に参照し、配列表に記載する。例えば、表１１は、ＨＣＤＲ１が配列番号３（Ｋａｂａｔ残基３１〜３５ｂ）であり、ＨＣＤＲ２が配列番号４（Ｋａｂａｔ残基５０〜６５）であり、ＨＣＤＲ３が配列番号５（Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２）であり、ＬＣＤＲ１が配列番号８（Ｋａｂａｔ残基２４〜３４）であり、ＬＣＤＲ２が配列番号９（Ｋａｂａｔ残基５０〜５６）であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１０（Ｋａｂａｔ残基８９〜９７）であるＣＤＲのセットを抗体１が有することを示す。抗体２は、それぞれ、配列番号２３、２４、２５、２８、２９、および３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を有する。他の最適化抗体クローンは、表１１に同様に示し、それも本発明の態様として提供する。
本発明によるＩＬ−１８についての結合メンバーは、本明細書に記載の１つ以上のＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、ならびに場合によりＣＤＲのセットを形成するためのＣＤＲ１およびＣＤＲ２も含み得る。ＣＤＲまたはＣＤＲのセットは、抗体１ＣＤＲもしくは抗体１ＣＤＲの組であり得、またはＣＤＲもしくは抗体１ＧＬ、抗体２、抗体３、抗体４、抗体５、抗体６、抗体６ＧＬ、抗体７、抗体７ＧＬ、抗体８ＧＬ、抗体９、抗体１０、抗体１１、抗体１１ＧＬ、および抗体１２ＧＬのいずれかのＣＤＲのセットであり得、または本明細書に記載のそれらの変異体であり得る。
一部の実施形態において；
ＨＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基３１〜３５ｂからなる７アミノ酸長であり得；
ＨＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜６５からなる１６アミノ酸長であり得；
ＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２からなる１５アミノ酸長であり得；
ＬＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基２４〜３４からなる１１アミノ酸長であり得；
ＬＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜５６からなる７アミノ酸長であり得；および／または
ＬＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基８９〜９７からなる９アミノ酸長であり得る。
結合メンバーは、表１１に列記される抗体のいずれかのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３、例えば表１１に列記される抗体のいずれかのＣＤＲのセットを含み得る。結合メンバーは、それらの抗体のいずれか１つのＶＨＣＤＲのセットを含み得る。場合により、それは、それらの抗体の１つのＶＬＣＤＲのセットも含み得る。ＶＬＣＤＲは、ＶＨＣＤＲと同一または異なる抗体からのものであり得る。表１１に列記される抗体のいずれかのＨＣＤＲのセットを含むＶＨドメイン、および／または表１１に列記される抗体のいずれかのＬＣＤＲのセットを含むＶＬドメインも、本明細書に提供される。
本明細書に記載のインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）に特異的に結合する結合メンバーは：
（ａ）配列番号１５３と同一の、またはそれに対して１、２、もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５４と同一の、またはそれに対して１、２、３もしくは４つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１５５と同一の、またはそれに対して１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１５８と同一の、またはそれに対して１、２、３もしくは４つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１５９と同一の、またはそれに対して１、２、３もしくは４つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号１６０と同一の、またはそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、または９つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３
を含み得る。
結合メンバーは、親抗体の抗体１または１つ以上の置換、例えば最大１５、最大１６、もしくは最大１７個の置換をＨおよび／もしくはＬＣＤＲの開示のセット内に有する表１１に列記される抗体のいずれかのＨおよび／またはＬＣＤＲのセットを含み得る。例えば、本発明の抗体分子は、１７、１６または１５以下の置換、例えば１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個の置換を有する抗体１、抗体１ＧＬ、抗体２、抗体３、抗体４、抗体５、抗体６、抗体６ＧＬ、抗体７、抗体７ＧＬ、抗体８ＧＬ、抗体９、抗体１０、抗体１１、抗体１１ＧＬ、および抗体１２ＧＬのいずれか１つからのＨおよび／またはＬＣＤＲのセットを含み得る。置換は、潜在的に、ＣＤＲのセット内の任意の残基において作製することができる。
例えば、好適な抗体分子は、ＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み得、ＣＤＲのセットは、以下からの１７、１６または１５以下のアミノ酸置換を有する：
（ｉ）
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列の配列番号３であり；
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列の配列番号４であり；
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列の配列番号５であり；
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列の配列番号８であり；
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列の配列番号９であり；
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列の配列番号１０である、
抗体１ＣＤＲのセット：
（ｉｉ）
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列の配列番号１４３であり；
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列の配列番号１４４であり；
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列の配列番号１４５であり；
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列の配列番号１４８であり；
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列の配列番号１４９であり；
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列の配列番号１５０である、
抗体１１ＧＬ ＣＤＲのセット：または
（ｉｉｉ）
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列の配列番号１５３であり；
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列の配列番号１５４であり；
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列の配列番号１５５であり；
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列の配列番号１５８であり；
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列の配列番号１５９であり；
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列の配列番号１６０である、
抗体１２ＧＬ ＣＤＲのセット。
一部の実施形態において、置換は、ＩＬ−１８／ｍＡｂ複合体中のＩＬ−１８残基から０．５ｎｍ（５Å）を超えて離れて局在する残基において作製することができる（図１４参照）。例えば、ＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基９５、９６、１００Ａ、１００Ｂ、１００Ｃ、１００ｆ、１００ｇ、１０１および１０２から選択される１、２、３、４または５つの位置における置換を含み得る。ＨＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０、５１、５４〜５７および５９〜６５から選択される１、２、３または４つの位置における置換を含み得る。ＨＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基３１〜３４、３５ａおよび３５ｂから選択される１、２または３つの位置における置換を含み得る。好適なＬＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基８９、９０、９５および９７から選択される１、２、３、または４つの位置における置換を含み得る。ＬＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜５６から選択される１、２、３または４つの位置における置換を含み得る。ＬＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基２４から２９、３１、３３および３４から選択される１、２、３、または４つの位置における置換を含み得る。
一部の実施形態において、置換は、表１１に示す抗体１ＧＬ、抗体２、抗体３、抗体４、抗体５、抗体６、抗体６ＧＬ、抗体７、抗体７ＧＬ、抗体８ＧＬ、抗体９、抗体１０、抗体１１、抗体１１ＧＬ、および抗体１２ＧＬのいずれかにおいて置換される位置において作製することができる。したがって、１つ以上の置換は、以下の残基の１つ以上におけるものであり得る：
ＨＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９９、１００ａ、１００ｂおよび１００ｄ；
ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、および９７。
結合メンバーは、
Ｋａｂａｔ残基９５が、Ｔｈｒであり；
Ｋａｂａｔ残基９６が、Ｐｒｏであり
Ｋａｂａｔ残基９７が、Ａｌａであり；
Ｋａｂａｔ残基９８が、Ｔｙｒであり；
Ｋａｂａｔ残基９９が、ＡｓｐもしくはＰｈｅであり；
Ｋａｂａｔ残基１００が、Ｇｌｙであり；
Ｋａｂａｔ残基１００Ａが、ＡｓｐもしくはＧｌｎであり；
Ｋａｂａｔ残基１００Ｂが、ＡｌａもしくはＡｓｐであり；
Ｋａｂａｔ残基１００Ｃが、Ａｒｇであり
Ｋａｂａｔ残基１００Ｄが、ＡｌａもしくはＴｈｒであり；
Ｋａｂａｔ残基１００Ｅが、Ａｓｐであり；
Ｋａｂａｔ残基１００Ｆが、Ｐｈｅであり；
Ｋａｂａｔ残基１００Ｇが、Ｐｈｅであり；
Ｋａｂａｔ残基１０１が、Ａｓｐであり；および／または
Ｋａｂａｔ残基１０２が、Ｖａｌである
ＨＣＤＲ３を含み得る。
例えば、ＨＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９９はＰｈｅであり得；Ｋａｂａｔ残基１００ａはＧｌｎであり得；Ｋａｂａｔ残基１００ｂはＡｓｐであり得；および／またはＫａｂａｔ残基１００ｄはＴｈｒであり得る。
結合メンバーは、
Ｋａｂａｔ残基９２が、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、またはＡｌａであり；
Ｋａｂａｔ残基９３が、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＩｌｅであり；および／または
Ｋａｂａｔ残基９４が、ＴｈｒまたはＰｒｏである、
ＬＣＤＲ３を含み得る。
例えば、結合メンバーは、
Ｋａｂａｔ残基８９が、ＧｌｎもしくはＡｌａであり；
Ｋａｂａｔ残基９０が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、もしくはＡｓｎであり；
Ｋａｂａｔ残基９１が、ＳｅｒもしくはＩｌｅであり；
Ｋａｂａｔ残基９２が、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、もしくはＡｌａであり；
Ｋａｂａｔ残基９３が、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、もしくはＩｌｅであり；
Ｋａｂａｔ残基９４が、ＴｈｒまたはＰｒｏであり；
Ｋａｂａｔ残基９５が、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、もしくはＧｌｎであり、
Ｋａｂａｔ残基９６が、Ｔｒｐであり、および／または
Ｋａｂａｔ残基９７が、ＴｈｒもしくはＡｓｐである
ＬＣＤＲ３を含み得る。
一部の好ましい実施形態において、ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９２がＨｉｓであり得；Ｋａｂａｔ残基９３はＨｉｓであり得；および／またはＫａｂａｔ残基９４はＰｒｏであり得る。
結合メンバーの一部の例において、ＨＣＤＲ１は、配列番号３、１０３、１１３または１５３の１つであり得；ＨＣＤＲ２は、配列番号４、１０４、１２４、または１３４の１つであり得る。例えば、ＨＣＤＲ１は、配列番号１５３であり得；ＨＣＤＲ２は、配列番号１５４であり得る。
ＨＣＤＲ３は、配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、１１５、１２５、１３５、１４５、または１５５の１つであり得る。例えば、ＨＣＤＲ３は、配列番号１５５であり得る。
ＬＣＤＲ１は、配列番号１５８であり得；ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列は、アミノ酸配列の配列番号１５９であり得る。
ＬＣＤＲ３は、配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、または１６０の１つであり得る。例えば、ＬＣＤＲ３は、配列番号１６０であり得る。
上記のとおり、結合メンバーは、１つ以上のＣＤＲ、例えばＣＤＲのセットを抗体フレームワーク内に有する抗体分子を含み得る。例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲまたはＣＤＲのセットは、フレームワーク（例えば、ヒトフレームワーク）中にグラフトして抗体分子を提供することができる。フレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメント配列のものであり得る。したがって、フレームワークは、生殖細胞系列化されていてよく、それによりフレームワーク内の１つ以上の残基が、最も類似するヒト生殖細胞系列フレームワーク中の等価位置における残基に適合するように変更されている。当業者は、生殖細胞系列化前に抗体のフレームワーク配列に配列が最も近縁の生殖細胞系列セグメントを選択し、抗体の親和性または活性を試験して生殖細胞系列化が本明細書に記載のアッセイにおいて抗原結合または効力を顕著に低減させないことを確認することができる。ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメント配列は当業者に公知であり、例えば、ＶＢＡＳＥコンピレーション（ＶＢＡＳＥ，ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＵＫ，１９９７，ｈｔｔｐ／／ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）から評価することができる。
本明細書に記載の結合メンバーは、ヒト生殖細胞系列フレームワーク中のＨＣＤＲのセットを含むＶＨドメイン、例えばＶｈ４ＤＰ６６（４〜６１）を有する単離されたヒト抗体分子であり得る。したがって、ＶＨドメインフレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３は、ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントのフレームワーク領域Ｖｈ４ＤＰ６６（４〜６１）を含み得、および／またはフレームワーク残基を、このヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントのフレームワーク残基に適合するように突然変異させることにより生殖細胞系列化することができる。ＦＷ４は、ヒト生殖細胞系列ｊセグメントＪＨ２のフレームワーク領域を含み得る。ＶＨＦＷ１のアミノ酸配列は、配列番号１６１であり得る。ＶＨＦＷ２のアミノ酸配列は、配列番号１６２であり得る。ＶＨＦＷ３のアミノ酸配列は、配列番号１６３であり得る。ＶＨＦＷ４のアミノ酸配列は、配列番号１６４であり得る。通常、結合メンバーは、例えば、ヒト生殖細胞系列フレームワーク、例えばＶカッパ１Ｌ１２中のＬＣＤＲのセットを含むＶＬドメインも有する。したがって、ＶＬドメインフレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントＶカッパ１Ｌ１２のフレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３を含み得、および／またはフレームワーク残基を、このヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントのフレームワーク残基に適合するように突然変異させることにより生殖細胞系列化することができる。ＦＷ４は、ヒト生殖細胞系列ｊセグメントＪＫ２のフレームワーク領域を含み得る。ＶＬＦＷ１のアミノ酸配列は、配列番号１６５であり得る。ＶＬＦＷ２のアミノ酸配列は、配列番号１６６であり得る。ＶＬＦＷ３のアミノ酸配列は、配列番号１６７であり得る。ＶＬＦＷ４のアミノ酸配列は、配列番号１６８であり得る。生殖細胞系列化ＶＨまたはＶＬドメインは、１つ以上のバーニア残基において生殖細胞系列化していてもいなくてもよいが、通常されていない。
本発明の抗体分子は、
Ｋａｂａｔ残基６が、ＧｌｎもしくはＧｌｕであり得；
Ｋａｂａｔ残基１０が、ＡｒｇもしくはＧｌｙであり得；
Ｋａｂａｔ残基１３が、ＬｙｓもしくはＧｌｕであり得；および／または
Ｋａｂａｔ残基１６が、ＧｌｎもしくはＧｌｕであり得る、
重鎖ＦＷ１を含み得る。
本発明の抗体分子は、Ｋａｂａｔ残基４１がＡｌａもしくはＰｒｏである重鎖ＦＷ２および／またはＫａｂａｔ残基７４がＰｒｏもしくはＳｅｒである重鎖ＦＷ３を含み得る。
本発明の抗体分子は、Ｋａｂａｔ残基３がＶａｌもしくはＧｌｎである軽鎖ＦＷ１；Ｋａｂａｔ残基４２がＡｒｇ、ＬｙｓもしくはＧｌｙである軽鎖ＦＷ２；Ｋａｂａｔ残基７０がＡｓｐもしくはＧｌｕであり、および／またはＫａｂａｔ残基８１がＧｌｕもしくはＡｓｐである軽鎖ＦＷ３；ならびに／またはＫａｂａｔ残基９９がＧｌｙもしくはＳｅｒである軽鎖ＦＷ４を含み得る。
例えば、本明細書に記載の抗体分子またはＶＨドメインは、重鎖フレームワーク領域の以下のセット：
ＦＷ１配列番号１６１；
ＦＷ２配列番号１６２；
ＦＷ３配列番号１６３；
ＦＷ４配列番号１６４；
を含み得、
または１、２、３、４、５、６もしくは７つのアミノ酸変化、例えば置換を有する重鎖フレームワーク領域の前記セットを含み得る。
本明細書に記載の抗体分子またはＶＬドメインは、軽鎖フレームワーク領域の以下のセット：
ＦＷ１配列番号１６５；
ＦＷ２配列番号１６６；
ＦＷ３配列番号１６７；
ＦＷ４配列番号１６８；
含み得、
または１、２、３、４、５、もしくは６つのアミノ酸変化、例えば置換を有する軽鎖フレームワーク領域の前記セットを含み得る。
アミノ酸変化は、置換、挿入または欠失であり得る。
例えば、抗体分子は、
重鎖ＦＷ１が、配列番号１６１であり；
重鎖ＦＷ２が、配列番号１６２であり；
重鎖ＦＷ３が、配列番号１６３であり；
重鎖ＦＷ４が、配列番号１６４であり；
軽鎖ＦＷ１が、配列番号１６５であり；
軽鎖ＦＷ２が、配列番号１６６であり；
軽鎖ＦＷ３が、配列番号１６７であり；
軽鎖ＦＷ４が、配列番号１６８であり；
一組の重鎖および軽鎖フレームワーク領域のセットを含み得、
または１１個以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸変化、例えば置換を有する重鎖および軽鎖フレームワーク領域の前記セットを含み得る。例えば、重鎖および軽鎖フレームワーク領域の前記セット中に１または２つのアミノ酸置換が存在し得る。
非生殖細胞系列化抗体分子は、生殖細胞系列化抗体分子と比較して同一のＣＤＲを有するが、異なるフレームワークを有する。付属の配列表中に本明細書に示す抗体配列のうち、抗体１、抗体６、抗体７、抗体８、抗体１１、および抗体１２の配列は、生殖細胞系列化されている。抗体２、抗体３、抗体４、抗体５、および抗体９および抗体１０の生殖細胞系列化抗体は、他の抗体について本明細書に示すＶＨおよびＶＬドメイン配列のフレームワーク領域を生殖細胞系列化することにより産生することができる。
典型的には、ＶＨドメインは、ＶＬドメインと対合して抗体抗原結合部位を提供するが、上記考察のとおり、ＶＨまたはＶＬドメインを単独で使用して抗原に結合させることができる。例えば、抗体１２ＧＬＶＨドメイン（配列番号１５２）は、抗体１２ＧＬＶＨおよびＶＬドメインの両方を含む抗体抗原結合部位が形成されるように、抗体１２ＧＬＶＬドメイン（配列番号１５７）と対合していてよい。類似の実施形態は、本明細書に開示される他の抗体のＶＨおよびＶＬドメインについて提供される。他の実施形態において、抗体１２ＧＬＶＨは、抗体抗体１２ＧＬＶＬ以外のＶＬドメインと対合する。軽鎖の多角性は、当技術分野において十分に確立されている。ここでも、類似の実施形態が、本明細書に開示される他のＶＨおよびＶＬドメインについて本発明により提供される。したがって、親抗体１のまたは最適化クローン抗体１ＧＬ、抗体２、抗体３、抗体４、抗体５、抗体６、抗体６ＧＬ、抗体７、抗体７ＧＬ、抗体８ＧＬ、抗体９、抗体１０、抗体１１、抗体１１ＧＬ、および抗体１２ＧＬのいずれかのＶＨは、異なる抗体からのＶＬドメインと対をなしていてよく、例えば、ＶＨおよびＶＬドメインは、抗体１、抗体１ＧＬ、抗体２、抗体３、抗体４、抗体５、抗体６、抗体６ＧＬ、抗体７、抗体７ＧＬ、抗体８ＧＬ、抗体９、抗体１０、抗体１１、抗体１１ＧＬ、および抗体１２ＧＬから選択される異なる抗体からのものであり得る。
単離された結合メンバーは、
（ｉ）ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号１４２に示され、ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号１４７に示され、
（ｉｉ）ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号１４２と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸置換を有し、ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号１４７と比較して８、９、１０、１１、１２または１３個のアミノ酸置換を有し；または
（ｉｉｉ）ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号１４２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号１４７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する、
ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み得る。
単離された結合メンバーは、
（ｉ）ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号１５２に示され、ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号１５７に示され、
（ｉｉ）ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号１５２と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸置換を有し、ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号１５７と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個のアミノ酸置換を有し；または
（ｉｉｉ）ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号１５２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号１５７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する、
ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み得る。
単離された結合メンバーは、
（ｉ）ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号１０２に示され、ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号１０７に示され、
（ｉｉ）ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号１０２と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸置換を有し、ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号１０７と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個のアミノ酸置換を有し；または
（ｉｉｉ）ＶＨドメインアミノ酸配列が配列番号１０２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＶＬドメインアミノ酸配列が配列番号１０７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する、
ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み得る。
一部の実施形態において、抗体分子は、抗体定常領域、例えばｓｃＦｖを欠損し得る。
他の実施形態において、抗体分子は、抗体定常領域を含み得る。抗体分子は、全抗体、例えばＩｇＧ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４であり得、または下記の抗体断片もしくは誘導体であり得る。抗体分子は、他のフォーマット、例えばＹＴＥ（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ他（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６９：５１７１−５１８０；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ他（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３３）：２３５１４−２４）および／またはＴＭ突然変異（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ他（２００８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ６４：７００−４）をＦｃ領域中に有するＩｇＧ１も有し得る。
抗体１２＿ＧＬのＶＨおよびＶＬドメインをコードするベクターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を、ブダペスト条約の下Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）（ＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＵＫ）に、２０１０年１１月２３日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１７８６で寄託した。寄託されたＶＨおよびＶＬドメインのヌクレオチド配列を配列番号１５２および１５７に示す。
本明細書に記載の結合メンバーは、寄託アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１７８６の核酸配列および／またはベクターによりコードされるＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、抗体−抗原結合部位または抗体分子を含み得る。
本明細書に記載の結合メンバーは、寄託アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１７８６の核酸、ベクターまたは細胞系から産生または産生可能であり得る。例えば、結合メンバーは、寄託アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１７８６の細胞系の核酸またはベクターの発現により産生することができる。核酸またはベクターは、任意の簡便な発現系により発現させることができる。あるいは、結合メンバーは、寄託アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１７８６の細胞系により発現させることができる。
本発明の態様は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１７８６の細胞系中に含有されるＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸；アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１７８６の細胞系中に含有される前記核酸を含むベクター；ならびにアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１７８６の細胞または細胞系も提供する。
本発明の別の態様は、
（ｉ）ＩＬ−１８に結合し、
（ｉｉ）抗体分子、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ３、および／または表１０および１１に列記されるＣＤＲのセットを含む、
任意の抗体分子と、ＩＬ−１８への結合について競合する抗体抗原結合部位または本明細書に記載の抗体分子を含む結合メンバーを提供する。
例えば、結合メンバー、例えば抗体分子は、
（ｉ）配列番号１５２の配列を有するＶＨドメインおよび配列番号１５７の配列を有するＶＬドメイン；
（ｉｉ）配列番号１５２と比較して１５個以下、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を有する配列を有するＶＨドメイン；および配列番号１５７と比較して１３個以下、例えば１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を有する配列を有するＶＬドメイン；または
（ｉｉｉ）配列番号１５２および配列番号１５７とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメイン
を含む抗体分子と競合し得る。
結合メンバー間の競合は、例えばＥＬＩＳＡを使用して、および／または生化学的競合アッセイ、例えばタグ付けされていない１つ以上の他の結合メンバーの存在下で検出することができる指定のレポーター分子を結合メンバーにタグ付けすることにより、インビトロで容易にアッセイすることができ、同一エピトープまたは重複するエピトープに結合する結合メンバーの同定が可能となる。このような方法は当業者に容易に公知であり、本明細書においてより詳細に記載される。
さらなる態様において、本発明は、本発明による結合メンバー、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする配列を含む単離された核酸、ならびに本発明の結合メンバー、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを調製する方法であって、前記核酸を前記結合メンバー、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの産生を生じさせるための条件下で発現させること、およびそれを回収することを含む方法を提供する。
例えば、本発明の態様は、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１および１７０の単離されたＶＨドメイン核酸配列；配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６および１７１の単離されたＶＬドメイン核酸配列；ならびにＶＨおよびＶＬ核酸配列の対合を含む単離された核酸、構築物およびベクターを提供する。
本発明の別の態様は、例えば、表１０および１１または配列表において本明細書に開示されるＶＨＣＤＲまたはＶＬＣＤＲ配列をコードする単離された核酸を提供する。
本発明の別の態様は、例えば、調節エレメントに機能的に連結している上記の単離された核酸を含むベクター、例えばプラスミドまたはファージベクターを提供する。
さらなる態様は、本発明の核酸および／またはベクターを含有する、またはそれらにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−１８、好ましくは遊離ＩＬ−１８（すなわち、ＩＬ−１８ＢＰに結合していないＩＬ−１８）の計測における本発明の結合メンバーの使用、および例えば個体から得られた試料中の遊離ＩＬ−１８を計測するアッセイ方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明の結合メンバーを含有する組成物、ならびにＩＬ−１８を阻害および／または中和する方法、例としてヒトまたは動物体を治療により治療する方法におけるそれらの使用を提供する。
本発明による結合メンバーは、治療または診断する方法、例えばヒトまたは動物体における（例えば、ヒト患者における）疾患または障害を治療（予防的治療を含み得る）する方法であって、前記患者に有効量の本発明の結合メンバーを投与することを含む方法において使用することができる。本発明により治療可能な病態には、本明細書の他箇所に詳細に考察されるＩＬ−１８が役割を担う任意のもの、例えばＩＬ−１８レベルの上昇に関連する病態が含まれる。
本発明のこれらのおよび他の態様を以下により詳細に記載する。
結合メンバー
結合メンバーという用語は、互いに結合する分子のペアの一方のメンバーを説明する。結合ペアのメンバーは、天然に由来し得、または全体的もしくは部分的に合成により産生することができる。分子のペアの一方のメンバーは、分子のペアの他のメンバーに結合し、したがってそのメンバーの特定の空間的および極性組織化に相補的であるその表面上の領域、または空洞を有する。結合ペアのタイプの例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質である。本発明は、抗原−抗体タイプの反応に関する。
結合メンバーは、通常、抗原結合部位を有する分子を含む。例えば、結合メンバーは、抗体分子または抗原結合部位を含む非抗体タンパク質であり得る。
抗原結合部位は、非抗体タンパク質足場、例えばフィブロネクチンまたはシトクロムＢなど［Ｈａａｎ ＆ Ｍａｇｇｏｓ（２００４）ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）：Ａ１−Ａ６；Ｋｏｉｄｅ他（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８４：１１４１−１１５１；Ｎｙｇｒｅｎ他（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３−４６９１］の上のＣＤＲの配置により、またはタンパク質足場内のループのアミノ酸残基をランダム化もしくは突然変異させて所望の標的についての結合特異性を付与することにより提供することができる。タンパク質中の新規結合部位の遺伝子操作のための足場は、Ｎｙｇｒｅｎ他［前掲］により詳細に記載されている。抗体模倣体のためのタンパク質足場は、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第００３４７８４号パンフレットに開示されており、発明者らは、少なくとも１つのランダム化ループを有するフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインを含むタンパク質（抗体模倣体）を記載している。１つ以上のＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲのセットまたはＨＣＤＲ３および／もしくはＬＣＤＲ３をグラフトする好適な足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーにより提供することができる。足場は、ヒトまたは非ヒトタンパク質であり得る。非抗体タンパク質足場の利点は、それが少なくとも一部の抗体分子よりも小さいおよび／または製造容易な足場分子中の抗原結合部位を提供し得ることである。小サイズの結合メンバーは、有用な生理学的特性、例えば、細胞に流入する能力、組織中に深く浸透もしくは他の構造内の標的に到達する能力、または標的抗原のタンパク質空洞内に結合する能力を付与し得る。非抗体タンパク質足場中の抗原結合部位の使用は、Ｗｅｓｓ，２００４［Ｗｅｓｓ，Ｌ．：ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１−Ａ７，２００４］に記載されている。安定な骨格および１つ以上の可変ループを有するタンパク質が典型的であり、ループのアミノ酸配列は、特異的にまたはランダムに突然変異させて標的抗原に結合する抗原結合部位を作出する。このようなタンパク質には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのプロテインＡ、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば第１０フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン）、リポカリンならびにガンマクリスタリンおよび他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）足場（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のＩｇＧ結合ドメインが含まれる。他のアプローチの例には、シクロチド（分子内ジスルフィド結合を有する小タンパク質）に基づく合成「マイクロボディ」、マイクロタンパク質（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標），Ａｍｕｎｉｘ）およびアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ）が含まれる。
抗体配列および／または抗原結合部位に加えて、結合メンバーは、例えばペプチドまたはポリペプチド、例えば折り畳みドメインを形成する、または分子に抗原結合能に加えた別の機能的特徴を付与するための他のアミノ酸を含み得る。結合メンバーは、検出可能な標識を担持し得、または毒素もしくは標的化部分もしくは酵素（例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して）にコンジュゲートしていてよい。例えば、結合メンバーは、触媒部位（例えば、酵素ドメイン中）および抗原結合部位を含み得、抗原結合部位が抗原に結合し、したがって触媒部位を抗原に標的化する。触媒部位は、抗原の生物学的機能を例えば開裂により阻害し得る。
留意されるとおり、ＣＤＲは非抗体足場により担持され得るが、本発明のＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、またはＣＤＲのセットを担持するための構造は、一般に、ＣＤＲまたはＣＤＲのセットが、再編成される免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然に生じるＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲまたはＣＤＲのセットに対応する位置において局在化される抗体重鎖または軽鎖配列またはその実質的な部分である。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ他，１９８７［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．アメリカ合衆国保健福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）．１９８７］およびその更新情報を参照して決定することができる。多数の学術的および市販のオンライン資源がこのデータベースのクエリーに利用可能である。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｋａｂａｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｂｙ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５（１９９６），１３０−１３３および関連するオンライン資源、現在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｉｍｋａｂ．ｈｔｍｌのウェブアドレス参照。
ＣＤＲ領域またはＣＤＲにより、Ｋａｂａｔ他１９９１［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ他（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．アメリカ合衆国保健福祉省，公共サービス（Ｐｕｂｌｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅ），アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ），ワシントン］、および後続の版により定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを含有する。ＣＤＲという用語は、本明細書において、場合に応じて、それが認識する抗原またはエピトープについての抗体の親和性による結合を担う大部分のアミノ酸残基を含有するそれらの領域の１つまたはそれらの領域のいくつか、またはさらに全体を示すために使用される。
６つの短いＣＤＲ配列のうち、重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きいサイズ可変性を有する（本質的には、それを生じさせる遺伝子の配置の機構に起因するより大きい多様性）。それは、２アミノ酸ほど短いこともあるが、公知の最長サイズは２６である。ＣＤＲ長はまた、特定の基礎フレームワークにより収容され得る長さにより変動し得る。機能的には、ＨＣＤＲ３は、部分的に、抗体の特異性の決定において役割を担う（Ｓｅｇａｌ他，ＰＮＡＳ，７１：４２９８−４３０２，１９７４；Ａｍｉｔ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３，１９８６；Ｃｈｏｔｈｉａ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７，１９８７；ｈｏｔｈｉａ他，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３，１９８９；Ｃａｔｏｎ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：１９６５−１９６８，１９９；Ｓｈａｒｏｎ他，ＰＮＡＳ，８７：４８１４−４８１７，１９９０；Ｓｈａｒｏｎ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：４８６３−４８６９，１９９０；およびＫａｂａｔ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：１７０９−１７１９，１９９１）。
抗体分子
抗体は、天然であるかまたは部分的もしくは完全に合成により産生されるかにかかわらず、免疫グロブリンを説明する。この用語はまた、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質を包含する。ここで、本発明は天然形態の抗体に関するものではなく、すなわちそれらはその天然環境中に存在しないが、それらは天然源から単離することができたか、または精製により得ることができたか、またはそうでなければ遺伝子組換え、もしくは化学合成により得ることができたものであり、その場合、下記のとおりそれらは非天然アミノ酸を含有し得ることが理解されなければならない。抗体抗原結合部位を含む抗体断片には、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄなどの分子が含まれる。１つ以上の抗体抗原結合部位を含む種々の他の抗体分子が遺伝子操作されており、それには、例えばＦａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）が含まれる。抗体分子およびそれらの構築および使用のための方法はＨｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１２６−１１３６ ２００５に記載されている。
モノクローナルおよび他の抗体を採用し、組換えＤＮＡ技術の技術を使用して標的抗原に結合する他の抗体またはキメラ分子を産生することが可能である。そのような技術は、異なる免疫グロブリンの定常領域とフレームワーク領域に対する抗体の免疫グロブリン可変領域、またはＣＤＲをコードするＤＮＡを導入することを必要し得る。例えば欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号明細書、英国特許第２１８８６３８Ａ号明細書または欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号明細書、および大多数の後続の文献を参照。ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞を遺伝子突然変異または他の変化に供することができ、それらは、産生される抗体の結合特異性を変化させてもさせなくてもよい。
抗体は多数の手法で改変することができるため、用語「抗体分子」は、要求される特異性を有する抗体抗原結合部位を有し、および／または抗原と結合する、任意の結合メンバーまたは物質を包含すると解釈すべきである。したがって、この用語は抗体の断片および誘導体を包含し、それには、天然であるか完全にまたは部分的に合成されたものであるかにかからわず、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドが含まれる。したがって、別のポリペプチド（例えば別の種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属するポリペプチド）に融合された抗体抗原結合部位または等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は欧州特許出願公開第Ａ−０１２０６９４号明細書および欧州特許出願公開第Ａ−０１２５０２３号明細書、および大多数の後続文献に記載されている。
抗体工学分野で利用可能なさらなる技術によりヒト抗体およびヒト化抗体を単離することが可能になる。例えば、ヒトハイブリドーマはＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｄｕｂｅｌ［Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ ＆ Ｄｕｂｅｌ，Ｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＬＬＣ；２００１，ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５］により記載のとおり作製することができる。結合メンバーを生成する別の確立技術であるファージディスプレイは、多数の刊行物、例えばＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｄｕｂｅｌ［前掲］および国際公開第９２／０１０４７号パンフレット（さらに以下で考察される）、および米国特許５９６９１０８号明細書、米国特許第５５６５３３２号明細書、米国特許第５７３３７４３号明細書、米国特許第５８５８６５７号明細書、米国特許第５８７１９０７号明細書、米国特許第５８７２２１５号明細書、米国特許第５８８５７９３号明細書、米国特許第５９６２２５５号明細書、米国特許第６１４０４７１号明細書、米国特許第６１７２１９７号明細書、米国特許第６２２５４４７号明細書、米国特許第６２９１６５０号明細書、米国特許第６４９２１６０号明細書、米国特許第６５２１４０４号明細書に詳細に記載されている。
マウス抗体遺伝子が不活性化され、ヒト抗体遺伝子により機能的に置き換えられている一方、マウス免疫系のインタクトな他の構成要素を残すトランスジェニックマウスを、ヒト抗体の単離に使用することができる［Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ他（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ，１５（２）：１４６−１５６］。ヒト化抗体は、当技術分野において公知の技術、例えば、国際公開第９１／０９９６７号パンフレット、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、欧州特許第５９２１０６号明細書、米国特許第５６５，３３２号明細書および国際公開第９３／１７１０５号パンフレットに開示されているものを使用して産生することができる。さらに、国際公開第２００４／００６９５５号パンフレットは、非ヒト抗体の可変領域のＣＤＲ配列についてのカノニカルＣＤＲ構造タイプを、ヒト抗体配列、例えば生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントのライブラリーからの対応するＣＤＲについてのカノニカルＣＤＲ構造タイプと比較することによる、ヒト抗体遺伝子からの可変領域フレームワーク配列の選択に基づいて、抗体をヒト化するための方法を記載している。非ヒトＣＤＲと類似のカノニカルＣＤＲ構造タイプを有するヒト抗体可変領域は、ヒトフレームワーク配列を選択するメンバーヒト抗体配列のサブセットを形成する。サブセットメンバーをヒトＣＤＲ配列と非ヒトＣＤＲ配列との間のアミノ酸類似性に基づいてさらにランク付けすることができる。国際公開第２００４／００６９５５号パンフレットの方法において、選択したサブセットメンバーヒトフレームワークを使用して、ヒトＣＤＲ配列を非ヒトＣＤＲ対応物により機能的に置き換えるキメラ抗体を構築するためのフレームワーク配列を提供するために最高位にランキングされたヒト配列を選択し、それにより非ヒト抗体とヒト抗体との間のフレームワーク配列を比較する必要なく、高親和性および低免疫原性のヒト化抗体を提供する。この方法により作製されたキメラ抗体も開示される。
合成抗体分子は、例えばＫｎａｐｐｉｋ他［Ｋｎａｐｐｉｋ他Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６，５７−８６］またはＫｒｅｂｓ他［Ｋｒｅｂｓ他Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４ ２００１ ６７−８４］により記載されるとおり、合成され、好適な発現ベクター内でアセンブルされたオリゴヌクレオチドにより生成された遺伝子から発現させることにより作出することができる。
全抗体の断片は抗原に結合する機能を達成し得ることが示されている。結合断片の例は（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ断片［Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ他，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６（１９８９）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４；Ｈｏｌｔ他（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１，４８４−４９０］；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）［Ｂｉｒｄ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ他，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８］；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｉｘ）遺伝子融合により構築された「ダイアボディ」、多価または多重特異性断片（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；［Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４−６４４８，１９９３］）である。ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋を取り込むことによりＦｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子を安定化することができる［Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６］。ＣＨ３ドメインに連結されたｓｃＦｖを含むミニボディを作製することもできる［Ｈｕ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６］。結合断片の他の例は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に少数の残基、例として抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインの付加によりＦａｂ断片と異なるＦａｂ’、および定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持するＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨである。
Ｑｕｉ他［Ｑｕｉ他，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９２１−９２９ ２００７］は、フレームワーク領域によって連結されている２つのＣＤＲしか含有しない抗体分子を記載した。ＶＨまたはＶＬドメインからのＣＤＲ３は、他のドメインのＣＤＲ１またはＣＤＲ２ループに連結された。選択ＣＤＲ１またはＣＤＲ２のＣ末端とＣＤＲ３のＮ末端がＦＲ領域を介して連結された。Ｑｕｉ他は最少の疎水性パッチを有するＦＲ領域を選択した。試験抗体についての最良の組合せは、ＶＨＦＲ２によりＶＨＣＤＲ３に連結されたＶＬＣＤＲ１であることが見出された（ＶＨＣＤＲ１−ＶＨＦＲ２−ＶＬＣＤＲ３）。約３ｋＤａの分子量においてこれらの抗体分子は、完全免疫グロブリン（約１５０ｋＤａ）またはｓｃＦｖ（約２８ｋＤａ）と比較して改善された組織浸透性の点で利点を提供する。
本発明の抗体断片は、酵素、例えばペプシンもしくはパパインによる消化などの方法および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の開裂により、本明細書に列記される抗体のいずれかから出発して得ることができる。別の様式において、本発明に含まれる抗体断片は、同様に当業者に周知の遺伝子組換え技術またはそうでければ自動ペプチドシンセサイザー、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などにより供給されるものを用いるペプチド合成、または核酸合成および発現により得ることができる。
本発明の機能的抗体断片には、化学修飾、特にＰＥＧ化、またはリポソームへの取り込みにより半減期が増加した任意の機能的断片が含まれる。
ｄＡｂ（ドメイン抗体）は抗体の単量体の抗原結合性小断片であり、すなわち抗体重鎖または軽鎖の可変領域である。ＶＨｄＡｂはラクダ科動物（例えばラクダ、ラマ）に天然に生じ、ラクダ科動物を標的抗原により免疫化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞からｄＡｂ遺伝子を直接クローニングすることにより産生することができる。ｄＡｂは細胞培養物中で産生可能でもある。それらの小さいサイズ、良好な溶解度および温度安定性により、それらは特に生理学的に有用であり、選択および親和性成熟に好適である。ラクダ科動物のＶＨｄＡｂは「ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）」の名称で治療用途に開発中である。本発明の結合メンバーは、実質的に本明細書に記載されるＶＨもしくはＶＬドメイン、または実質的に本明細書に記載されるＣＤＲセットを含むＶＨもしくはＶＬドメインを含むｄＡｂであり得る。
二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる可変領域が同一分子中で組み合わされている第二世代のモノクローナル抗体を形成する［Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｌｅｎ １９９９ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｒｅｖ．１８：４１１−４１９］。それらの使用は、新規エフェクター機能をリクリートするかまたは腫瘍細胞表面上のいくつかの分子を標的化するそれらの能力から、診断分野および治療分野の両方で実証されている。二重特異性抗体を使用すべき場合、これらは二重特異性抗体は種々の手法で製造することができる慣用の二重特異性抗体であり得［Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４，４４６−４４９ １９９３］、例えば化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製し、または上記の二重特異性抗体断片のいずれかであり得る。これらの抗体は、化学的方法［Ｇｌｅｎｎｉｅ Ｍ Ｊ他，１９８７ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，２３６７−２３７５；Ｒｅｐｐ Ｒ他，１９９５ Ｊ．Ｈｅｍａｔ．３７７−３８２］または体細胞法［Ｓｔａｅｒｚ Ｕ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｅｖａｎ Ｍ．Ｊ．１９８６ ＰＮＡＳ ８３；Ｓｕｒｅｓｈ Ｍ．Ｒ他，１９８６ Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０−２２８］によって得ることができるが、同様に優先的に、ヘテロ二量体化を強制することが可能で、したがって目的の抗体の精製プロセスを促進する遺伝子工学技術により得ることができる［Ｍｅｒｃｈａｎｄ他，１９９８ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７−６８１］。二重特異性抗体の例には、異なる特異性を有する２つの抗体の結合ドメインを使用し、短いフレキシブルペプチドを介して直接連結することができるＢｉＴＥ（商標）技術の二重特異性抗体が含まれる。これは短い単一ポリペプチド鎖上で２つの抗体を組み合わせる。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用して、Ｆｃ領域を用いずに構築することができ、潜在的に抗イディオタイプ反応の効果を低減する。
二重特異性抗体は、完全ＩｇＧとして、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、ダイアボディとして、またはそうでなければ二重特異性ｓｃＦｖとして構築することができる。さらに、当技術分野において公知の定型的な方法を使用して２つの二重特異性抗体を連結し、四価抗体を形成することができる。
二重特異性完全抗体とは対照的に二重特異性ダイアボディが特に有用であることがある。それというのも、それらは容易に構築することができ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させることができるためである。適切な結合特異性のダイアボディ（および多数の他のポリペプチド、例えば抗体断片）は、ファージディスプレイ（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット）を使用してライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームが一定に保持され、例えばＩＬ−１８に対して指向される特異性を有する場合、他方のアームが変動するライブラリーを作製することができ、適切な特異性の抗体を選択することができる。Ｒｉｄｇｅｗａｙ他，１９９６［Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，１９９６］に記載の代替の遺伝子操作方法により二重特異性完全抗体を作製することができる。
当技術分野においてＩＬ−１８に対する抗体を得るための種々の方法が利用可能である。抗体は、当業者に周知の標準的方法にしたがって得ることができる、特にヒト、マウス、キメラまたはヒト化起源のモノクローナル抗体であり得る。
一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的断片の調製について、特に手引き「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」［Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．７２６，１９８８］に記載の技術またはＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５］により記載されたハイブリドーマからの調製の技術を参照することが可能である。
モノクローナル抗体は、例えば、ＩＬ−１８、または前記モノクローナル抗体により認識されるエピトープを含有するその断片の１つにより免疫化された動物細胞から得ることができる。それらを含む好適な断片およびペプチドまたはポリペプチドは本明細書に記載されており、それらを使用して動物を免疫化してＩＬ−１８に対する抗体を生成することができる。前記ＩＬ−１８、またはその断片の１つは、特に、ＩＬ−１８またはその断片をコードするｃＤＮＡ配列に含有される核酸配列から出発する遺伝子組換えにより、ＩＬ−１８および／またはその断片のペプチド配列に含まれるアミノ酸の配列から出発するペプチド合成により、通常の作業方法に従って産生することができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ＩＬ−１８、または前記モノクローナル抗体により認識されるエピトープを含有するその断片の１つが事前に固定化された親和性カラム上で精製することができる。より具体的には、モノクローナル抗体は、プロテインＡおよび／またはＧ上でのクロマトグラフィーにより精製し、次いで残留するタンパク質汚染物質ならびにＤＮＡおよびＬＰＳ自体を排除する目的のイオン交換クロマトグラフィーを行うかまたは行わずに、次いで二量体または他の多量体の存在に起因する潜在的凝集物を排除するためのセファロースゲル上での排除クロマトグラフィーを行うかまたは行わずに達成することができる。一実施形態において、これらの技術の全部を同時にまたは連続的に使用することができる。
抗原結合部位
抗原結合部位は、標的抗原の全体または部分と結合し、それと相補的な分子の部分を説明する。抗体分子において、それは抗体抗原結合部位と称され、標的抗原の全体または部分と結合し、それと相補的な抗体の部分を含む。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定部分にのみ結合し得、その部分はエピトープと称される。抗体抗原結合部位は１つ以上の抗体可変ドメインにより提供することができる。抗体抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。
国際公開第２００６／０７２６２０号パンフレットは、免疫グロブリンドメインのベータストランド間で拡張する構造（非ＣＤＲ）ループ中の抗原結合部位の遺伝子操作を記載している。抗原結合部位は、ＣＤＲの天然位置と離隔した抗体分子の領域中で、例えばＶＨまたはＶＬドメインのフレームワーク領域中で、または抗体定常ドメイン、例えばＣＨ１および／またはＣＨ３中で、遺伝子操作することができる。構造領域中で遺伝子操作された抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲのセットにより形成された抗原結合部位に追加的な、またはそれに代わるものであり得る。複数の抗原結合部位が抗体分子中に存在する場合、それらは同一抗原（標的抗原）に結合し得、それにより結合メンバーの価数を増加させる。あるいは、複数の抗原結合部位は、異なる抗原（標的抗原および１つ以上の別の抗原）に結合し得、これを使用してエフェクター機能を追加することができ、抗体分子の半減期を延長させるかまたはそのインビボ送達を改善させる。
単離された
「単離された」は、本発明の結合メンバー、またはそのような結合メンバーをコードする核酸が、一般に本発明による状態を指す。したがって、本発明による結合メンバー、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびにコード核酸分子およびベクターは、実質的に純粋または均質な形態で、例えばそれらの天然環境から単離および／または精製されている状態、または核酸の場合、要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まないかまたは実質的に含まない状態で提供することができる。単離されたメンバーおよび単離された核酸は、それらが天然に付随する材料、例えばその天然環境、またはそれらが調製される環境（例えば細胞培養物）中で（そのような調製がインビトロもしくはインビボで実施される組換えＤＮＡ技術によるものである場合）、それらが見出される他のポリペプチドまたは核酸を含まないかまたは実質的に含まない。メンバーおよび核酸は希釈剤またはアジュバントとともに製剤化することができ、実際的な目的のために依然として単離されており、例えば、メンバーは、イムノアッセイで使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用する場合、通常ゼラチンまたは他の担体と混合し、または診断もしくは治療において使用する場合、薬学的に許容可能な担体または希釈剤と混合する。結合メンバーは、天然にまたは異種真核細胞（例えばＣＨＯまたはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）細胞）の系によってグリコシル化されているか、または（例えば原核細胞中の発現により産生される場合）非グリコシル化状態であり得る。
抗ＩＬ−１８抗体分子を含む不均一調製物もまた、本発明の部分を構成する。例えば、そのような調製物は、完全長重鎖およびＣ末端リジンを欠く重鎖を有し、種々の程度のグリコシル化を有し、ならびに／または誘導体化アミノ酸、例えばピログルタミン酸残基を形成するＮ末端グルタミン酸の環化物を有する抗体の混合物であり得る。
本明細書において使用される語句「実質的に記載される」とは、本明細書に記載の結合メンバーのＶＨまたはＶＬドメインの関連ＣＤＲの特徴が、本明細書に配列が記載される指定領域と同一であるかまたは高度に類似することを指す。本明細書に記載のとおり１つ以上の可変ドメインの指定領域に関する語句「高度に類似する」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸置換をＣＤＲおよび／またはＶＨもしくはＶＬドメイン中で作製することができることが企図される。
上記のとおり、本発明による結合メンバーは、ＩＬ−１８の生物学的活性をモジュレートし、中和し得る。本明細書に記載のとおり、本発明のＩＬ−１８結合メンバーは、その中和効力について最適化することができる。一般に、効力の最適化は、選択された結合メンバーの配列（通常は抗体の可変ドメイン配列）を突然変異させて結合メンバーのライブラリーを生成することを含み、次いでそのライブラリーを効力に関してアッセイし、より強力な結合メンバーを選択する。こうして選択された「効力最適化」結合メンバーは、ライブラリーを生成した結合メンバーよりも高い効力を有する傾向がある。これにもかかわらず、最適化を行わずに高い効力の結合メンバーを得ることもでき、例えば、初期スクリーニング、例えば生化学的中和アッセイから高い効力の結合メンバーを直接得ることができる。「効力最適化」結合メンバーは、ＩＬ−１８の特定の活性または下流機能の中和の効力が最適化されている結合メンバーを指す。アッセイおよび効力は本明細書の他の箇所により詳細に記載される。本発明は、効力最適化および／または非最適化結合メンバーの両方、ならびに選択された結合メンバーから効力を最適化する方法を提供する。したがって、本発明は、当業者が、高い効力を有する結合メンバーを生成することを可能にする。
さらなる態様において、本発明は、抗原に結合し得る１つ以上の結合メンバーを得る方法であって、本発明による結合メンバーのライブラリーおよび前記抗原を接触させること、ならびに前記抗原に結合し得るライブラリーの１つ以上の結合メンバーを選択することを含む方法を提供する。
ライブラリーは、粒子または分子複合体、例えば複製可能な遺伝子パッケージ、例えば酵母粒子、細菌粒子またはバクテリオファージ（例えばＴ７）粒子、ウイルス、細胞または共有結合性、リボソーム性または他のインビトロディスプレイ系上でディスプレイすることができ、それぞれの粒子または分子複合体は、その上にディスプレイされる抗体ＶＨ可変ドメイン、および場合によりディスプレイされるＶＬドメイン（存在する場合）もコードする核酸を含有する。ファージディスプレイは、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットおよび例えば米国特許第５９６９１０８号明細書、米国特許第５５６５３３２号明細書、米国特許第５７３３７４３号明細書、米国特許第５８５８６５７号明細書、米国特許第５８７１９０７号明細書、米国特許第５８７２２１５号明細書、米国特許第５８８５７９３号明細書、米国特許第５９６２２５５号明細書、米国特許第６１４０４７１号明細書、米国特許第６１７２１９７号明細書、米国特許第６２２５４４７号明細書、米国特許第６２９１６５０号明細書、米国特許第６４９２１６０号明細書および米国特許第６５２１４０４号明細書に記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。リボソームディスプレイは、Ｈａｎｅｓ Ｊ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ Ａ．（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９７年５月 １３；９４（１０）：４９３７−４２；国際公開第０１／７５０９７号パンフレットおよび国際公開第２００６／０７２７７３号パンフレットに記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
抗原に結合し得、バクテリオファージまたは他のライブラリー粒子もしくは分子複合体上にディスプレイされる結合メンバーの選択後、前記選択された結合メンバーをディスプレイするバクテリオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から核酸を採取することができる。前記選択された結合メンバーをディスプレイするバクテリオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から採取された核酸の配列を有する核酸からの発現による結合メンバーまたは抗体ＶＨもしくはＶＬ可変ドメインの後続の産生にそのような核酸を使用することができる。
前記選択された結合メンバーの抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインは、そのようなＶＨドメインを含む結合メンバーと同様に、単離された形態で提供することができる。
ＩＬ−１８に結合する能力をさらに試験することができ、さらに、ＩＬ−１８との結合について、例えば本明細書に列記される抗体のいずれか（例えばｓｃＦｖフォーマットおよび／またはＩｇＧフォーマット、例えばＩｇＧ２またはＩｇＧ１）と競合する能力も試験することができる。本明細書の他箇所にさらに考察されるとおり、ＩＬ−１８を中和する能力を試験することができる。
結合メンバーは、表１０および１１に列記される抗体のいずれか、例えばｓｃＦｖ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ１ＴＭもしくはＩｇＧ１の親和性で、またはより良好な親和性で、ＩＬ−１８に結合し得る。抗体結合親和性を表５に示す。
結合メンバーは、本明細書に列記される抗体のいずれか、例えばｓｃＦｖ、ＩｇＧ２ ＩｇＧ１の効力で、または増加した効力で、ＩＬ−１８の生物学的活性を中和し得る。
異なる結合メンバーの結合親和性および中和効力を適切な条件下で比較することができる。
本明細書に記載のＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの変異体、例としてアミノ酸配列が本明細書に記載されているもの、およびＩＬ−１８についての結合メンバー中で用いることができるものは、配列を変化または突然変異させ、所望の特性を有する抗原結合メンバーをスクリーニングする方法を用いて得ることができる。所望の特性の例には、限定されるものではないが、以下の特性が含まれる：
・抗原に特異的な既知の抗体に対して増加した、抗原についての結合親和性
・抗原活性が既知である場合、抗原に特異的な既知の抗体に対して増加した、抗原活性の中和性
・指定モル比における、抗原に対する既知の抗体またはリガンドとの、指定の競合能力
・複合体を免疫沈降させる能力
・指定エピトープに結合する能力
・線形エピトープ、例えば、本明細書に記載のペプチド結合スキャン（例えば線形および／または拘束コンフォメーションでスクリーニングされたペプチドを使用する）を使用して同定されたペプチド配列
・不連続残基により形成されたコンフォメーショナルエピトープ
・ＩＬ−１８、または下流の分子の新規生物学的活性をモジュレートする能力。
そのような方法も本明細書に提供される。
本明細書に開示される抗体分子の変異体を産生し、本発明において使用することができる。多変量データ分析技術を構造／特性−活性関係に対して適用する場合の計算化学の手引き［例えば、Ｗｏｌｄ他，Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ−Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．：Ｂ．Ｋｏｗａｌｓｋｉ）；Ｄ．Ｒｅｉｄｅｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｈｏｌｌａｎｄ，１９８４（ＩＳＢＮ９０−２７７−１８４６−６参照］に従って、周知の数学的技術、例えば統計回帰、パターン認識および分類［例えば、Ｎｏｒｍａｎ他，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９８年４月）ＩＳＢＮ：０４７１１７０８２８；Ｋａｎｄｅｌ，Ａｂｒａｈａｍ他，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ ＰＴＲ，（１９９５年５月１１日），ＩＳＢＮ：０１３３４１８８４７；Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ，Ｗｏｊｔｅｋ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ ２２（Ｐａｐｅｒ））．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；（２０００年１２月），ＩＳＢＮ：０１９８５０７０８９；Ｗｉｔｔｅｎ，Ｉａｎ Ｈ．他，Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｗｉｔｈ Ｊａｖａ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｒｇａｎ Ｋａｕｆｍａｎｎ；（１９９９年１０月１１日），ＩＳＢＮ：１５５８６０５５２５；Ｄｅｎｉｓｏｎ Ｄａｖｉｄ Ｇ．Ｔ．（Ｅｄｉｔｏｒ）ｅｔ ａｌ Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ （Ｗｉｌｅｙ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；（２００２年７月），ＩＳＢＮ：０４７１４９０３６９；Ｇｈｏｓｅ，Ａｒｕｐ Ｋ他，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｏｏｌｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＩＳＢＮ：０−８２４７−０４８７−８参照］を使用して抗体の定量的活性−特性関係を導き出すことができる。抗体の特性は、抗体配列、機能的および３次元構造の経験的および理論的モデル（例えば、接触候補残基の分析または算出上の物理化学的特性）から導き出すことができ、これらの特性は個々におよび組み合わせて考慮することができる。
ＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成される抗体抗原結合部位は、典型的には、ポリペプチドの６つのループにより形成され：３つは軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からのものであり、３つは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からのものである。既知の原子構造の抗体の分析により、抗体結合部位の配列と３次元構造との間の関係が解明されている［Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ他，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）２２７，７９９−８１７；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，他Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）２７３（４），９２７−９４８］。これらの関係は、ＶＨドメイン中の第３領域（ループ）を除いて、結合部位ループが少数の主鎖コンフォメーション：カノニカル構造の１つを有することを意味する。特定ループ中で形成されるカノニカル構造は、そのサイズならびにループおよびフレームワーク領域の両方の重要部位におけるある残基の存在により決定されることが示されている。
配列−構造関係のこの研究は、抗体のＣＤＲループの３次元構造の維持に重要な、したがって結合特異性を維持する、配列が既知であるが３次元構造が未知の抗体中の残基を予測するために使用することができる。これらの予測は、予測を先の最適化実験からの出力と比較することにより確認することができる。構造的アプローチにおいて、任意の無料で利用可能なまたは市販のパッケージ、例えばＷＡＭ［Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ，Ｎ．Ｒ．ｕ．ａｎｄ Ｒｅｅｓ，Ａ．Ｒ（２０００）．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１２，８１５−８２４］を使用して抗体分子のモデルを作出することができる［Ｃｈｏｔｈｉａ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３，７５５−７５８（１９８６）］。次いで、タンパク質視覚化および分析ソフトウエアパッケージ、例えばＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）またはＤｅｅｐ Ｖｉｅｗ［Ｇｕｅｘ，Ｎ．ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９７）１８，２７１４−２７２３］を使用してＣＤＲ中のそれぞれの位置における置換候補を評価することができる。次いで、この情報を使用して活性に対して最小または有益な効果を有する可能性が高い置換を作製することができる。
ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬドメインおよび結合メンバーのアミノ酸配列内で置換を作製するために必要とされる技術は、一般に当技術分野において利用可能である。活性に対して最小または有益な影響を有すると予測されてもされなくてもよい置換を有する変異体配列を作製し、ＩＬ−１８に結合し、および／またはそれらを中和する能力および／または任意の他の所望の特性について試験することができる。
本明細書に配列が具体的に開示されている任意のＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異体を、考察されるとおり本発明により用いることができる。
上記のとおり、本発明の態様は、ＶＨドメイン配列が以下の付属の配列表に示される本明細書に列記される抗体のいずれかのＶＨドメインと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含み；および／またはＶＬドメイン配列が付属の配列表に示される表１１に列記される抗体のいずれかのＶＬドメインと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含む結合メンバー、例えば抗体分子を提供する。
本発明の態様は、ＶＨＣＤＲ配列が本明細書に示される本明細書に列記される抗体のいずれかのＶＨＣＤＲのセットと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨＣＤＲのセットを有するＶＨドメインを含み；および／またはＶＬＣＤＲ配列が本明細書に示される本明細書に列記される抗体のいずれかのＶＬＣＤＲのセットと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬＣＤＲのセットを有するＶＬドメインを含む結合メンバー、例えば抗体分子を提供する。
２つのアミノ酸配列の同一性％を算出するために使用できるアルゴリズムには、例えばＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０］、ＦＡＳＴＡ［Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ （１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ８５：２４４４−２４４８］、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム［Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７］（例えばデフォルトパラメータを用いる）が含まれる。
特定の可変ドメインは、１つ以上のアミノ酸配列変化（アミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入）を含み得、約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２個未満である。
変更形態は、１つ以上のフレームワーク領域および／または１つ以上のＣＤＲ中で作製することができる。変更形態は、通常、機能の損失をもたらさず、したがって、こうして変更したアミノ酸配列を含む結合メンバーはＩＬ−１８に結合し、および／またはそれを中和する能力を保持し得る。それは、例えば本明細書に記載のアッセイにおいて計測された場合、変更形態が作製されていない結合メンバーと同一の定量的結合および／または中和能力を保持し得る。こうして変更したアミノ酸配列を含む結合メンバーは、ＩＬ−１８に結合し、および／またはそれを中和する能力の改善を示し得る。
変更形態は、１つ以上のアミノ酸残基を、天然に存在しないかもしくは非標準アミノ酸により置き換えること、１つ以上のアミノ酸残基を、天然に存在しないかもしくは非標準形態に改変すること、または１つ以上の天然に存在しないかもしくは非標準アミノ酸を配列内に挿入することを含み得る。本発明の配列中の変更の数および位置の例は、本明細書の他箇所に記載されている。天然に存在するアミノ酸には、２０種の「標準」Ｌ−アミノ酸が含まれ、それらの標準一文字コードによりＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして同定される。非標準アミノ酸には、ポリペプチド骨格中に取り込むことができるかまたは既存のアミノ酸残基の改変から生じ得る任意の他の残基が含まれる。非標準アミノ酸は天然に存在しても天然に存在しなくてもよい。いくつかの天然に存在する非標準アミノ酸が当技術分野において公知であり、例えば４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルセリンなどである［Ｖｏｅｔ ＆ Ｖｏｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｗｉｌｅｙ）１９９５］。Ｎ−アルファ位置において誘導体化されているアミノ酸残基はアミノ酸配列のＮ末端に局在するにすぎない。本発明においては通常、アミノ酸はＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸であってもよい。したがって、変更形態は、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に改変するかまたはＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸により置き換えることを含む。アミノ酸のメチル化、アセチル化および／またはリン酸化形態も既知であり、本発明におけるアミノ酸をそのような改変に供することができる。
本発明の抗体ドメインおよび結合メンバー中のアミノ酸配列は上記の非天然または非標準アミノ酸を含み得る。非標準アミノ酸（例えばＤ−アミノ酸）は、合成中に、またはアミノ酸配列の合成後に「元の」標準アミノ酸の改変または置き換えによりアミノ酸配列中に取り込むことができる。
非標準および／または天然に存在しないアミノ酸の使用により、構造的および機能的多様性を増加させ、したがって本発明の結合メンバーにおける所望のＩＬ−１８結合および中和特性を達成するための潜在性を増加させることができる。さらに、Ｄ−アミノ酸および類似体は、動物、例えばヒトへの投与後のＬ−アミノ酸を有するポリペプチドのインビボ分解により標準Ｌ−アミノ酸と比較して異なる薬物動態学的プロファイルを有することが示されている。このことは、一部のインビボ適用についてはＤ−アミノ酸が有利であることを意味する。
本発明のＣＤＲ由来配列を担持する新規ＶＨまたはＶＬ領域は、全可変ドメイン内の突然変異を生成する１つ以上の選択ＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム突然変異導入を使用して生成することができる。そのような技術はエラープローンＰＣＲを使用したＧｒａｍ他［Ｇｒａｍ他，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０］により記載されている。一部の実施形態において、全可変ドメインまたはＣＤＲのセット内で１または２つのアミノ酸置換を作製する。
使用することができる別の方法はＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する直接突然変異導入である。そのような技術は、Ｂａｒｂａｓ他［Ｂａｒｂａｓ他，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３］およびＳｃｈｉｅｒ他［Ｓｃｈｉｅｒ他，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７］により開示されている。
全ての上記技術は、当技術分野においてそれ自体公知であり、当業者は、そのような技術を使用して当技術分野における定型的な方法論を使用して本発明の結合メンバーを提供することができる。
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−１８についての抗体抗原結合部位を得る方法であって、本明細書に記載のＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を用いて、ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを提供し、場合により、こうして提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせること、およびＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬ組合せを試験して、ＩＬ−１８についての結合メンバーまたは抗体抗原結合部位（場合により１つ以上の所望の特性、例えばＩＬ−１８活性を中和する能力を有する）を同定することを含む方法を提供する。前記ＶＬドメインは本明細書に実質的に記載されるアミノ酸配列を有し得る。本明細書に開示されるＶＬドメインの１つ以上の配列変異体を１つ以上のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法を用いることができる。
上記のとおり、本明細書に実質的に記載されるＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト抗体可変ドメインまたはその実質的部分中のＣＤＲとして取り込むことができる。本明細書中に実質的に記載されるＨＣＤＲ３配列は本発明の実施形態を表し、これらのそれぞれはヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的部分中のＨＣＤＲ３として取り込むことができる。
本発明において用いられる可変ドメインは、任意の生殖細胞系列もしくは再編成ヒト可変ドメインから得ることができ、もしくはそれに由来し得、または既知のヒト可変ドメインのコンセンサスまたは実際の配列に基づく合成可変ドメインであり得る。可変ドメインは非ヒト抗体に由来するものであり得る。組換えＤＮＡ技術を使用してＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリー中に本発明のＣＤＲ配列（例えばＣＤＲ３）を導入することができる。例えば、Ｍａｒｋｓ他［Ｍａｒｋｓ他 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３］は、抗体可変ドメインのレパートリーを産生する方法であって、可変ドメイン領域の５’末端に指向されるかまたはそれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに使用してＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する方法を記載している。Ｍａｒｋｓ他は、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３とどのように組み合わせることができるかをさらに記載している。類似の技術を使用して、本発明のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフリングし、シャッフリングされた完全ＶＨまたはＶＬドメインをコグネイトＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて本発明の結合メンバーを提供することができる。次いで、好適な結合メンバーを選択することができるように、レパートリーを好適な宿主系、例えば国際公開第９２／０１０４７号パンフレット（参照により全体として本明細書に組み込まれる）、または後続の多数の文献のいずれか、例としてＫａｙ，Ｗｉｎｔｅｒ ＆ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ［Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（１９９６）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ］のファージディスプレイ系中でディスプレイすることができる。レパートリーは、１０４個の個々のメンバー以上、例えば少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個または少なくとも１０１０個のメンバー以上のいずれかから構成され得る。他の好適な宿主系には、限定されるものではないが、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイおよび共有結合ディスプレイが含まれる。
ＩＬ−１８についての結合メンバーを調製する方法であって：
（ａ）置き換えるべきＣＤＲ３を含むかまたはＣＤＲ３コード領域を欠くＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供すること；
（ｂ）前記レパートリーを、ＶＨＣＤＲ３、例えば表１１に示されるＶＨＣＤＲ３について本明細書に実質的に記載されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせて前記ドナー核酸がレパートリー中のＣＤＲ３領域中に挿入されるようにしてＶＨドメインをコードする核酸の産物レパートリーを提供すること；
（ｃ）前記産物レパートリーの核酸を発現させること；
（ｄ）ＩＬ−１８についての結合メンバーを選択すること；および
（ｅ）前記結合メンバーまたはそれをコードする核酸を回収すること
を含む方法を提供する。
ここでも、置き換えるべきＣＤＲ３を含むかまたはＣＤＲ３コード領域を欠くＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと本発明のＶＬＣＤＲ３を組み合わせる類似の方法を用いることができる。
同様に、１つ以上の、または全ての３つのＣＤＲを、ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリー中にグラフトし、次いでＩＬ−１８についての結合メンバーについてスクリーニングすることができる。
例えば、表１１に列記される抗体の１つ以上からのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／もしくはＨＣＤＲ３、例えば、ＨＣＤＲのセットを用いることができ、ならびに／または本明細書に列記される抗体の１つ以上からのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／もしくはＬＣＤＲ３、例えばＬＣＤＲのセットを用いることができる。
同様に、本明細書に開示される他のＶＨおよびＶＬドメイン、ＣＤＲのセットならびにＨＣＤＲのおよび／またはＬＣＤＲのセットを用いることができる。
免疫グロブリン可変ドメインの実質的部分は少なくとも３つのＣＤＲ領域をそれらの介在フレームワーク領域と一緒に含み得る。部分は第１および第４フレームワーク領域の一方または両方の少なくとも約５０％を含んでもよく、５０％は第１フレームワーク領域のＣ末端の５０％であり、第４フレームワーク領域のＮ末端の５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端における追加の残基は、天然に存在する可変ドメイン領域に通常付随しない残基であり得る。例えば、本発明の結合メンバーの構築を組換えＤＮＡ技術により行ってクローニングまたは他の操作ステップを促進するために導入されるリンカーによりコードされるＮまたはＣ末端残基の導入をもたらすことができる。他の操作ステップには、本発明の可変ドメインをさらなるタンパク質配列に連結させるためのリンカーの導入が含まれ、そのタンパク質配列には、本明細書の他箇所にさらに詳細に考察される抗体定常領域、他の可変ドメイン（例えばダイアボディの産生における場合）または検出可能／機能的標識が含まれる。
本発明の一部の態様において、結合メンバーはＶＨおよびＶＬドメインのペアを含むが、ＶＨまたはＶＬドメイン配列のいずれかに基づく単一の結合ドメインは本発明のさらなる態様を形成する。単一の免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインは特異的様式で標的抗原に結合し得ることが公知である。例えば、上記ｄＡｂについての考察を参照のこと。
いずれの単一結合ドメインの場合でも、これらのドメインを使用して、ＩＬ−１８に結合し得る２ドメイン結合メンバーを形成し得る相補的ドメインについてスクリーニングすることができる。これは、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に開示されるいわゆる階層的二重コンビナトリアルアプローチ（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｄｕａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用するファージディスプレイスクリーニング法により達成することができ、その方法において、ＨまたはＬ鎖クローンのいずれかを含有する個々のコロニーを使用して、他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全ライブラリーを感染させ、得られた２鎖結合メンバーを例えば参考文献に記載のファージディスプレイ技術に従って選択する。この技術もＭａｒｋｓ他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３に開示されている。
本発明の結合メンバーは、抗体定常領域またはその部分、例えばヒト抗体定常領域またはその部分をさらに含み得る。例えば、ＶＬドメインをそのＣ末端において、ヒトＣκまたはＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに付着させることができる。同様に、ＶＨドメインに基づく結合メンバーをそのＣ末端で、任意の抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭならびに任意のアイソタイプサブクラスのいずれか、特にＩｇＧ２、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４由来の免疫グロブリン重鎖の全体または部分（例えばＣＨ１ドメイン）に付着させることができる。ＩｇＧ２は、そのエフェクター機能の欠損により一部の実施形態において有利であり得る。他の実施形態において、ＩｇＧ１は、そのエフェクター機能および製造容易性により有利であり得る。これらの特性を有し、可変領域を安定化する任意の合成または他の定常領域変異体も本発明において有用であり得る。
結合メンバーは、検出可能または機能的標識により標識することができる。したがって、検出可能および／または定量可能なシグナルを得るために、結合メンバーまたは抗体分子をイムノコンジュゲートの形態で提供することができる。イムノコンジュゲートは検出可能または機能的標識とコンジュゲートされた本発明の抗体分子を含み得る。標識は、シグナルを産生するかまたはシグナルの産生を誘導し得る任意の分子であり得、それには、限定されるものではないが、蛍光標識、放射性標識、酵素、化学発光標識または光増感剤が含まれる。したがって、蛍光または発光、放射能、酵素活性または吸光度を検出することによって結合を検出および／または計測することができる。
好適な標識には、例として、限定されるものではないが、以下のものが含まれる
− 酵素、例えばアルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ；
− 色素；
− 蛍光標識または蛍光剤、例えばフルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミン化合物および誘導体、ＧＦＰ（ＧＦＰは「緑色蛍光タンパク質」を表す）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、およびフルオレサミン；フルオロフォア、例えばランタニドクリプテートおよびキレート、例えばユーロピウムなど（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒおよびＣｉｓ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、
− 化学発光標識または化学発光剤、例えばイソルミノール、ルミノールおよびジオキセタン；
− 生物発光標識、例えばルシフェラーゼおよびルシフェリン；
− 増感剤；
− 補酵素；
− 酵素基質；
− 放射性標識、例として限定されるものではないが、臭素７７、炭素１４、コバルト５７、フッ素８、ガリウム６７、ガリウム６８、水素３（トリチウム）、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２３ｍ、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、水銀１０７、水銀２０３、リン３２、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、スカンジウム４７、セレン７５、硫黄３５、テクネチウム９９、テクネチウム９９ｍ、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、イットリウム１９９および本明細書に記載の他の放射性標識；
− 粒子、例えばラテックスまたは炭素粒子：金属ゾル；微結晶；リポソーム；細胞など（色素、触媒または他の検出可能な基によりさらに標識することができる）；
− ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジンなどの分子；
− 毒素部分、例えばシュードモナス外毒素（ＰＥまたはその細胞傷害性断片もしくは突然変異体）、ジフテリア毒素またはその細胞傷害性断片もしくは突然変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥもしくはＦ、リシンまたはその細胞傷害性断片、例えばリシンＡ、アブリンまたはその細胞傷害性断片、サポリンまたはその細胞傷害性断片、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞傷害性断片およびブリオジン１（ｂｒｙｏｄｉｎ １）またはその細胞傷害性断片の群から選択される毒素部分など。
好適な酵素および補酵素の例は、米国特許第４２７５１４９号明細書、および米国特許第４３１８９８０号明細書に開示されている。好適な蛍光剤および化学発光剤も、米国特許第４２７５１４９号明細書に開示されている。標識には、特異的なコグネイト検出可能部分、例えば標識アビジンまたはストレプトアビジンへの結合を介して検出することができる化学的部分、例えばビオチンがさらに含まれる。検出可能な標識は、当技術分野において公知の慣用化学反応を使用して本発明の抗体に付着させることができる。
イムノコンジュゲートまたはそれらの機能的断片は、当業者に公知の方法により調製することができる。それらは、直接またはスペーサー基もしくは連結基、例えばポリアルデヒド、例えばグルタルアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレン−トリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）の仲介により、またはカップリング剤、例えば治療コンジュゲートについて上記のものの存在下で、酵素または蛍光標識にカップリングすることができる。フルオレセインタイプの標識を含有するコンジュゲートはイソチオシアネートと反応させることにより調製することができる。
直接または上記キレート剤、例えばＥＤＴＡ、ＤＴＰＡを介して治療放射性同位体を抗体にカップリングする既存の当技術分野において公知の方法を、診断において使用することができる放射性元素に使用することもできる。同様に、クロラミンＴ法［Ｈｕｎｔｅｒ Ｗ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ Ｆ．Ｃ．（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １９４：４９５］によるナトリウム１２５による標識化またはそうでなければ米国特許第４４２４２００号明細書）の技術によるかもしくは米国特許第４４７９９３０号明細書により記載されるとおりＤＴＰＡを介して付着させるテクネチウム９９ｍによる標識化を実施することが可能である。
標識が、外部手段、例えば視覚的試験、電磁放射線、熱、および化学試薬により検出可能なシグナルを産生し得る多数の方法が存在する。本発明の抗体に結合する別の結合メンバー、または担体に標識を結合させることもできる。
標識は、シグナルを直接産生し得、したがってシグナルの産生に追加の構成要素は要求されない。多数の有機分子、例えば蛍光剤は紫外光および可視光を吸収し得、光吸収はこれらの分子にエネルギーを移動させ、それらを励起エネルギー状態に上昇させる。次いで、この吸収エネルギーは第２の波長における発光により消散する。この第２の波長での発光も、標識アクセプター分子にエネルギーを移動させ得、得られるエネルギーは、発光、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によりアクセプター分子から消散する。シグナルを直接産生する他の標識には、放射性同位体および色素が含まれる。
あるいは、標識は、シグナルを産生するために他の構成要素を必要とし得、そしてシグナル産生系は計測可能なシグナルを産生するために要求される全ての構成要素を含み、その場合それには、基質、補酵素、エンハンサー、追加の酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、アクチベーター、補因子、インヒビター、スカベンジャー、金属イオン、およびシグナル生成物質の結合に要求される特異的結合物質が含まれ得る。好適なシグナル産生系についての詳細な考察は米国特許第５１８５２４３号明細書に見出すことができる。
本発明の態様は、ＩＬ−１８への本明細書に提供される結合メンバーの結合を生じさせるかまたは可能にすることを含む方法を提供する。上記のとおり、そのような結合はインビボで例えば結合メンバー、または結合メンバーをコードする核酸の投与後に生じ得、またはそれはインビトロで例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降、親和性クロマトグラフィー、および生化学的もしくは細胞ベースアッセイ、例えばＫＧ−１もしくはＰＢＭＣ細胞アッセイにおいて生じ得る。
本発明はまた、本発明による結合メンバーを例えばバイオセンサ系で用いることにより抗原のレベルを直接計測することを提供する。例えば、ＩＬ−１８への結合を検出および／または計測する方法は、（ｉ）前記結合メンバーをＩＬ−１８に曝露することおよび（ｉｉ）ＩＬ−１８への前記結合メンバーの結合を検出することを含み得、結合は本明細書に記載の任意の方法または検出可能な標識を使用して検出する。この方法、および本明細書に記載の任意の他の結合検出方法は、方法実施者が、例えば検出可能な標識を視覚的に観察することにより直接解釈することができる。あるいは、この方法、または本明細書に記載の任意の他の結合検出方法は、オートラジオグラフ、写真、コンピュータ印刷物、フローサイトメトリーレポート、グラフ、チャート、結果物を含有する試験管もしくは容器もしくはウェル、または本方法の結果の任意の他の視覚的もしくは物理的表現の形態でレポートを作成し得る。
一部の実施形態において、結合メンバーにより結合されるＩＬ−１８は、遊離ＩＬ−１８（すなわち、ＩＬ−１８ＢＰに結合していないＩＬ−１８）であり得る。遊離ＩＬ−１８は、ＩＬ−１８の生物学的に活性な形態である。
ＩＬ−１８への結合メンバーの結合の量を測定することができる。定量は、診断目的である得る試験試料中の抗原の量に関連し得る。ＩＬ−１８結合についてのスクリーニングおよび／またはその定量は、例えば本明細書に言及される疾患または障害および／または異常なＩＬ−１８発現および／または活性を伴う任意の他の疾患または障害についての患者のスクリーニングにおいて有用であり得る。
本発明の診断方法は、（ｉ）対象から組織または体液試料を得ること、（ｉｉ）前記組織または体液試料を１つ以上の本発明の結合メンバーに曝露すること；および（ｉｉｉ）対照試料と比較して結合したＩＬ−１８を検出することを含み得、対照と比較したＩＬ−１８結合の量の増加が、異常なレベルのＩＬ−１８の発現または活性を示し得る。試験すべき組織または体液試料には、血液、血清、尿、生検材料、腫瘍、または異常なＩＬ−１８レベルを含有すると疑われる任意の組織が含まれる。異常なＩＬ−１８レベルまたは活性について陽性であると試験された対象はさらに、本明細書に以下に開示される治療方法によって恩恵を受け得る。
当業者は、本明細書に開示される方法に照らして、その優先性および一般的知識に従って、抗原への結合メンバーの結合を測定する好適な様式を選択することができる。
試料中の結合メンバーの反応性を任意の適切な手段によって測定することができる。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は一候補である。放射性標識抗原を非標識抗原（試験試料）と混合し、結合メンバーに結合させる。結合した抗原を未結合抗原から物理的に分離し、結合メンバーと結合している放射性抗原の量を測定する。試験試料中に存在する抗原が多ければ、結合メンバーに結合する放射性抗原が少ない。レポーター分子に連結された抗原または類似体を使用して、非放射性抗原とともに競合結合アッセイを使用することもできる。レポーター分子は、スペクトルにより単離される吸収または発光特性を有する蛍光色素、リン光体またはレーザー色素であってよい。好適な蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッド、ならびにランタニドキレートまたはクリプテートが含まれる。好適な発色色素には、ジアミノベンジジンが含まれる。
他のレポーターには、高分子コロイド粒子または粒子状材料、例えば有色性、磁性または常磁性のラテックスビーズ、および視覚的に観察されるか、電子的に検出されるか、または別の方法で記録される対象の検出可能なシグナルを直接または間接的に生じさせることができる生物学的もしくは化学的に活性な作用物質が含まれる。これらの分子は、例えば、発色させるかまたは変色させるかまたは電気的特性の変化を生じさせる反応を触媒する酵素であり得る。これらは、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的スペクトル吸収または発光をもたらすように分子的に励起可能であり得る。これらには、バイオセンサーとともに使用される化学実体が含まれ得る。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出系を用いることができる。
個々の結合メンバー−レポーターコンジュゲートにより生成されるシグナルを使用して、試料（正常および試験試料）中の該当する結合メンバーの結合についての定量可能な絶対的または相対的データを導き出すことができる。
本明細書に記載のインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）についての単離された結合メンバーは、ＩＬ−１８への結合についてＩＬ−１８ＢＰと競合し得、したがって、ＩＬ−ＢＰに結合しているＩＬ−１８と遊離ＩＬ−１８（すなわち、ＩＬ−１８ＢＰに結合していないＩＬ−１８）との区別において有用であり得る。
本発明の単離された結合メンバーは、遊離ＩＬ−１８の検出および／または計測において有用であり得る。遊離ＩＬ−１８を検出および／または計測する方法は、（ｉ）本発明による結合メンバーを遊離ＩＬ−１８に曝露することならびに（ｉｉ）遊離ＩＬ−１８への前記結合メンバーの結合を検出および／または計測することを含み得る。遊離ＩＬ−１８への結合メンバーの結合は、任意の簡便な方法、例えば本明細書に記載の方法を使用して検出および／または計測することができる。
本発明の方法は、試料中の遊離ＩＬ−１８の量の測定において有用であり得る。
試料中の遊離ＩＬ−１８を計測する方法は：
試料を本発明の結合メンバーと接触させることおよび
試料への結合メンバーの結合を測定すること
を含み得る。
試料への結合メンバーの結合は、試料中の遊離ＩＬ−１８の存在の指標である。試料への結合メンバーの結合の量は、試料中の遊離ＩＬ−１８の量の指標であり得る。
アッセイは、ＩＬ−１８に結合する第１の結合メンバーおよび同様にＩＬ−１８に結合するが第１の結合メンバーとは異なるＩＬ−１８上のエピトープに結合する第２の結合メンバーの使用を含み得る。第１または第２の結合メンバーの一方は、本発明の結合メンバーであり、第１または第２の結合メンバーの他方は、公知のＩＬ−１８結合メンバー、例えば抗ＩＬ−１８抗体であり得る。好適な公知のＩＬ−１８結合メンバーは、当技術分野において利用可能である。
一部の簡便なアッセイフォーマットにおいて、前記第１または第２の結合メンバーの一方は、固体支持体上で固定化されていてよく、他方は固定化されていなくてよい。
結合メンバーは、当技術分野において公知の多数の異なる手法において固体担体上に固定化することができる。例えば、結合メンバーは、例えば、プラスチック固体担体の場合、例えば、静電および／または疎水相互作用を介して固体担体に直接吸着させることができる。あるいは、結合メンバーは、固体担体に共有結合させることができる。この場合、固体担体は、化学的に修飾して機能的化学基、例えばヒドロキシルまたはアミン基を担体の表面上に導入または活性化し、架橋剤、例えばグルタルアルデヒドを使用して担体を架橋して固体担体への第１のメンバーの共有結合を促進することができる。さらなる代替例において、結合メンバーは、例えば、ビオチンとアビジンとの相互作用による特異的結合相互作用により、またはプロテインＡもしくはプロテインＧを固体担体に固定化し、次いで結合メンバー自体に特異的結合させることにより固体担体に間接的に付着させることができる。
遊離ＩＬ−１８の検出に好適な多くの異なるアッセイフォーマットが、当技術分野において公知であり、それには非競合および競合アッセイならびにイムノアッセイが含まれる。
非競合アッセイフォーマットは、例えば、固体担体においてＩＬ−１８に結合する第１の結合メンバーを固定化することを含み得る。次いで、固定化された結合メンバーを目的の試料と接触させることができる。試料がＩＬ−１８を含有する場合、それは固定化された結合メンバーと結合する。次いで、ＩＬ−１８に結合する第２の結合メンバーを添加し、結合させる。一部の実施形態において、固定化された第１の結合メンバーは、本発明の結合メンバーであり得る。他の実施形態において、第２の結合メンバーは、本発明の結合メンバーであり得る。
検出を可能とするため、第２の結合メンバーを検出可能な標識により標識することができる。あるいは、第２の結合メンバーの結合は、第２の結合メンバーに特異的に結合し、検出可能な標識により標識された第３の結合メンバー、例えば抗体を使用して測定することができる。試料中の遊離ＩＬ−１８分子は、固定化された第１の結合メンバーにより捕捉し、それにより担体において固定化する。第２の結合メンバーは、捕捉された遊離ＩＬ−１８に結合し、担体において固定化する。第２の結合メンバーは捕捉された遊離ＩＬ−１８に結合し、担体にそれ自体固定化する。一部の実施形態において、標識された第３の結合メンバーは、第２の結合メンバーに結合し得、担体において固定化することもできる。
第３の結合メンバーは、例えば、第２の結合メンバー（例えば、抗ＩｇＧ抗体）に直接結合し得、または第２の結合メンバーに連結または融合している親和性タグに結合し得る。
好適な親和性タグには、ビオチンまたはペプチジル配列、ＭＲＧＳ（Ｈ）６、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ（商標））、Ｔ７−、Ｓ−（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ポリ−Ａｒｇ（Ｒ５〜６）、ポリ−Ｈｉｓ（Ｈ２〜１０）、ポリ−Ｃｙｓ（Ｃ４）ポリ−Ｐｈｅ（Ｆ１１）ポリ−Ａｓｐ（Ｄ５〜１６）、Ｓｔｒｅｐｔ−タグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、インフルエンザ−ＨＡタグ（Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９５）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２９，１７０−９）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅタグ（Ｓｔａｍｍｅｒｓ，Ｄ．Ｋ．ｅｔ ａｌ（１９９１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２８３，２９８−３０２）、Ｔａｇ．１００（Ｑｉａｇｅｎ；哺乳動物ＭＡＰキナーゼ２に由来する１２アミノ酸タグ）、Ｃｒｕｚ ｔａｇ ０９（商標）（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）およびＣｒｕｚ ｔａｇ ２２（商標）（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）が含まれる。
次いで、固体担体に直接または間接的に結合した標識された第２または第３の結合メンバーの量を計測し、それにより検出された標識された結合メンバーの量が、試料中に存在する遊離ＩＬ−１８の量に直接比例する。
例えば、試料中の遊離ＩＬ−１８を計測する方法は；
試料をＩＬ−１８に結合する第１の結合メンバーと接触させること、および；
試料中のＩＬ−１８への前記第１の結合メンバーの結合を、ＩＬ−１８に結合する第２の結合メンバーを使用して測定すること
を含み得、
前記第１または第２の結合メンバーの一方が本発明の結合メンバーであり、前記第１または第２の結合メンバーの他方が、ＩＬ−１８への結合について本発明の結合メンバーと競合しない抗ＩＬ−１８結合メンバーである。
上記のとおり、第１の結合メンバーは、本発明の結合メンバーであり得、第２の結合メンバーは、ＩＬ−１８への結合について本発明の結合メンバーと競合しない抗ＩＬ−１８結合メンバーであり得；または第２の結合メンバーは本発明の結合メンバーであり得、第１の結合メンバーは、ＩＬ−１８への結合について本発明の結合メンバーと競合しない抗ＩＬ−１８結合メンバーであり得る。
目的の試料中の遊離ＩＬ−１８の存在を決定するための競合アッセイは、本発明の結合メンバーを固体担体において固定化することを含み得る。次いで、標識されたＩＬ−１８を添加し、固定化された本発明の結合メンバーに結合させ、次いで試料を添加する。試料が遊離ＩＬ−１８を含有する場合、それは固定化された本発明の結合メンバーへの結合について、標識されたＩＬ−１８と競合する。次いで、固体担体に結合した標識されたＩＬ−１８の量を計測する。この場合、検出される標識されたＩＬ−１８の量は、試料中に存在する遊離ＩＬ−１８の量に反比例する。
好適な試料には、生物学的体液の試料、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、胆汁、尿、皮脂、唾液または血清が含まれる。試料は、個体、例えば霊長類、例えばヒトまたはサルから、標準的技術を使用して得ることができる。
本明細書において称される検出可能な標識は、シグナルを産生または誘導して産生することができる任意の標識、例として、限定されるものではないが、蛍光剤、化学発光剤（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）、着色標識（例えば、ラテックス[ブルー]またはコロイダルゴールド[レッド]）、放射性標識、酵素、および磁気標識であり得る。したがって、表面、例えばキャピラリー孔の表面において結合した標識の量は、蛍光または発光、発色、放射能、酵素活性、または磁場の変化を検出することにより検出および／または計測することができる。検出可能な標識は、慣用の化学反応を使用して結合メンバーに付着させることができる。好ましくは、検出可能な標識は、例えばデジタルカメラまたはフラットベッドスキャナを有する光学インタロゲーションにより検出可能な標識である。光学インタロゲーションにより検出することができる標識には、蛍光剤、化学発光剤および着色標識が含まれる。光学的検出のためにシグナルを生成することができる機構には、（必ずしも限定されるものではないが）：光吸収、光散乱、光回折、光反射、蛍光または発光が含まれる。
本明細書に記載の遊離ＩＬ−１８の計測は、生物学的に活性なＩＬ−１８のレベルを試料中で正確に測定することを可能とする。
遊離ＩＬ−１８の計測は、疾患状態、例として炎症疾患、自己免疫疾患、例えば続発性血球貪食症候群、マクロファージ活性化症候群、関節リウマチ、およびＩ型糖尿病、ならびに心血管疾患、例えば冠動脈疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および急性冠症候群の診断および／または予後診断において有用であり得る。
遊離ＩＬ−１８の計測は、治療に対する疾患状態の応答性の評価においても有用であり得る。
治療に対する個体における疾患状態の応答性を評価する方法は：
上記のとおり、本発明の結合メンバーを使用する前記治療前および後に個体から得られた試料中の遊離ＩＬ−１８の量を計測すること
を含み得、
遊離ＩＬ−１８のレベルの減少は、個体が治療に対して応答性であることを示す。
遊離ＩＬ−１８のレベルまたは量は、本明細書に記載のとおり本発明の結合メンバーを使用する前記投与前に個体から得られた第１の試料中および前記投与後に個体から得られた第２の試料中で計測することができ、第１の試料および第２の試料中の遊離ＩＬ−１８のレベルまたは量の差、例えば、減少が、疾患状態が前記治療に対して応答性であることを示す。
個体における疾患状態の治療をモニタリングする方法は：
（ａ）個体を治療のレジメンに供すること；および
（ｂ）上記の方法を使用して個体から得られた試料中で遊離ＩＬ−１８のレベルまたは量を前記治療の間モニタリングすること
を含み得、
治療の間に得られた試料中の遊離ＩＬ−１８のレベルまたは量の低減が、レジメンが個体における疾患状態の治療に有効であることを示す。
治療の間に患者から得られた試料中の遊離ＩＬ−１８のレベルまたは量の持続変化の不存在下、本方法は、さらに；
（ｃ）治療のレジメンを変え、変えたレジメンに個体を供すること；
（ｄ）本明細書に記載の方法を使用して個体から得られた試料中の遊離ＩＬ−１８のレベルをモニタリングすること、ならびに
（ｅ）工程ｃ）およびｄ）を、遊離ＩＬ−１８のレベルの持続変化が観察されるまで繰り返すこと
を含み得、
治療の間に持続される遊離ＩＬ−１８のレベルまたは量の変化、例えば低減が、変えたレジメンが個体における疾患状態の治療に有効であることを示す。
治療の間の遊離ＩＬ−１８のレベルまたは量の持続変化の存在下、本方法は、さらに；
（ｃ）治療のレジメンを変え、変えたレジメンに個体を供すること；
（ｄ）本明細書に記載の方法を使用して個体から得られた試料中の遊離ＩＬ−１８のレベルをモニタリングすること、ならびに
（ｅ）工程ｃ）およびｄ）を、遊離ＩＬ−１８のレベルの最大変化が観察されるまで繰り返すこと
を含み得、
治療の間に持続される遊離ＩＬ−１８のレベルまたは量の最大変化が、変えたレジメンが個体における疾患状態の治療に有効であることを示す。
遊離ＩＬ−１８の計測は、臨床試験のための患者のコホートの同定においても有用であり得る。
患者のコホートを同定する方法は：
（ａ）疾患状態を有する患者の集団を同定すること
（ｂ）上記のとおり本発明の結合メンバーを使用して集団の患者から得られた試料中の遊離ＩＬ−１８の量を計測すること；
（ｃ）閾値超または未満である遊離ＩＬ−１８の量を含有する試料を同定すること、および；
（ｄ）同定された試料から患者のコホートを同定すること
含み得る。
同定された患者のコホートは、全て、高または低レベルの遊離ＩＬ−１８（すなわち、閾値超または未満のレベル）を有し得る。
疾患状態には、炎症および自己免疫疾患、例えば、続発性血球貪食症候群、マクロファージ活性化症候群、関節リウマチ、およびＩ型糖尿病、および冠動脈疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および急性冠症候群が含まれ得る。
上記のとおり患者においてモニタリングおよび／または評価することができる好適な治療は、当技術分野において周知である。
本明細書に記載の結合メンバーを含むキットも、本発明の態様として提供される。キットにおいて、例えば以下でさらに記載されるとおり、結合メンバーを標識して、試料中のその反応性の測定を可能にすることができる。さらに、結合メンバーを固体担体に付着させても付着させなくてもよい。キットの構成要素は一般に滅菌されており、密封バイアルまたは他の容器中に存在する。結合メンバーが有用である診断分析または他の方法においてキットを用いることができる。キットは、上記方法において使用することができる。キットは、方法、例えば本発明による方法における構成要素の使用についての指示書を含有し得る。そのような方法を支援するかまたはその実施を可能にするための付属材料を本発明のキット内に含めることができる。付属材料には、第１の結合メンバーに結合する第２の異なる結合メンバーが含まれ、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位体または酵素）にコンジュゲートされる。抗体ベースのキットは、免疫沈降を実施するためのビーズも含み得る。キットのそれぞれの構成要素は、一般にそれ自体の好適な容器中に存在する。したがって、これらのキットは一般にそれぞれの結合性メンバーに好適な個別の容器を含む。さらに、キットはアッセイならびにアッセイの実施から得られたデータを解釈および分析するための方法を実施するための指示書を含み得る。
本発明はまた、競合アッセイにおいて抗原レベルを計測するための上記結合メンバーの使用、すなわち、本発明により提供される結合メンバーを競合アッセイにおいて用いることによって試料中の抗原のレベルを計測する方法を提供する。これは、結合抗原を未結合抗原から物理的に分離することが要求されない場合であり得る。レポーター分子を結合メンバーに連結し、結合時に物理的または光学的変化が生じるようにすることが１つの可能性である。レポーター分子は、検出可能なシグナルを直接または間接的に生成し得、そのシグナルは定量可能であり得る。レポーター分子の連結は、直接または間接的に共有結合により、例えばペプチド結合を介してまたは非共有結合によるものであり得る。ペプチド結合を介する連結は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果であり得る。
上記のとおり、本発明は、本明細書に定義の任意の結合メンバー、例えば表１１に列記される抗体のいずれか、例えばＩｇＧ２、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１三重突然変異（ＴＭ；Ｏｇａｎｅｓｙａｎ他（２００８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４（Ｐｔ６）：７００−４）フォーマットのものとＩＬ−１８への結合について競合する結合メンバーに及ぶ。結合メンバー間の競合は、例えば、他方のタグ付けされていない結合メンバーの存在下で検出することができる特異的レポーター分子を一方の結合メンバーにタグ付けすることによりインビトロで容易にアッセイすることができ、同一エピトープまたは重複するエピトープに結合する結合メンバーの同定を可能とする。競合は、例えばＥＬＩＳＡを使用して測定することができる。競合は、例えばＥＬＩＳＡを使用して測定することができ、ＥＬＩＳＡでは、ＩＬ−１８をプレートに固定化し、タグ付けまたは標識された第１の結合性メンバーを、タグ付けも標識もされていない１つ以上の他の結合メンバーとともにプレートに添加する。タグが付いている結合メンバーと競合する、タグ付けされていない結合性メンバーの存在は、タグ付けされた結合メンバーにより放出されるシグナルの減少により観察される。
例えば、本発明は、ＩＬ−１８結合化合物を同定する方法であって、（ｉ）ＩＬ−１８を担体に固定化すること、（ｉｉ）前記固定化されたＩＬ−１８を、タグ付けまたは標識された少なくとも１つの本発明の結合メンバーおよびタグ付けも標識もされていない１つ以上の試験結合化合物と、同時にまたは段階的様式で接触させること、および（ｉｉｉ）タグ付けされた結合メンバーからの結合タグの量の減少を観察することにより、新規ＩＬ−１８結合化合物を同定することを含む方法を含む。そのような方法は、マルチウェルまたはアレイフォーマットを使用してハイスループット様式で実施することができる。そのようなアッセイは、溶液中で実施することもできる（例えば米国特許第５，８１４，４６８号明細書参照）。上記のとおり、結合の検出は、方法実施者が、例えば検出可能な標識またはその存在の減少を視覚的に観察することにより直接解釈することができる。あるいは、本発明の結合方法は、オートラジオグラフ、写真、コンピュータ印刷物、フローサイトメトリーレポート、グラフ、チャート、結果物を含有する試験管もしくは容器もしくはウェル、または本方法の結果の任意の他の視覚的もしくは物理的表現の形態のレポートを作成し得る。
エピトープマッピングにおいて競合アッセイを使用することもできる。ある例において、エピトープマッピングを使用して、場合により最適化された中和および／またはモジュレート特性を有し得るＩＬ−１８結合メンバーが結合するエピトープを同定することができる。そのようなエピトープはリニアまたはコンフォメーショナルエピトープであり得る。コンフォメーショナルエピトープは、ＩＬ−１８の少なくとも２つの異なる断片を含み得、前記断片はＩＬ−１８がその３次元または４次元構造にフォールディングされる場合に互いに近接して位置してコンフォメーショナルエピトープを形成し、それがＩＬ−１８のインヒビター、例えばＩＬ−１８結合メンバーにより認識される。競合についての試験において、抗原のペプチド断片、特に、目的のエピトープを含むかまたは本質的にそれからなるペプチドを用いることができる。エピトープ配列に加えて両端に１つ以上のアミノ酸を有するペプチドを使用することができる。本発明による結合メンバーは、抗原についてのその結合が、挙げられた配列を有するかまたは含むペプチドにより阻害されるようなものであり得る。
本発明はさらに、本明細書に記載の結合メンバーをコードする、単離された核酸配列を提供する。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み得る。一方で、本発明は、上記定義の本発明のＣＤＲまたはＣＤＲのセットまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１）をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、少なくとも１つの上記ポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物を提供する。
本発明はまた、１つ以上の上記構築物を含む組換え宿主細胞系を提供する。提供される任意のＣＤＲまたはＣＤＲのセットまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１ＴＭ）をコードする核酸配列は、そのコードされる産物を産生する方法であって、そのコード核酸配列からの発現を含む方法とともに本発明の態様を形成する。核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、発現を簡便に達成することができる。発現による産生後、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または結合メンバーを、任意の好適な技術を使用して単離および／または精製し、次いで適宜使用することができる。
本発明による核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、完全にまたは部分的に合成であり得る。本明細書に記載のヌクレオチド配列への言及は、文脈上特に要求されない限り、指定配列を有するＤＮＡ分子を包含し、Ｔの代わりにＵが用いられる指定配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
別の態様は、抗体ＶＨ可変ドメインの産生方法であって、コード核酸配列からの発現を生じさせることを含む方法を提供する。そのような方法は、前記抗体ＶＨ可変ドメインの産生のための条件下で宿主細胞を培養することを含み得る。
ＶＬ可変ドメインならびにＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む結合メンバーを産生する類似の方法が、本発明のさらなる態様として提供される。
産生方法は、産物を単離および／または精製する工程を含み得る。産生方法は、産物を、少なくとも１つの追加の構成要素、例えば薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物に製剤化することを含み得る。
種々の異なる宿主細胞におけるクローニング系およびポリペプチドの発現系が周知である。好適な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母およびバキュロウイルス系ならびにトランスジェニック植物および動物が含まれる。原核細胞中での抗体および抗体断片の発現は、当技術分野において十分確立されている。概説に関しては、例えばＰｌｕｃｅｋｔｈｕｎ［Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５−５５１（１９９１）］を参照のこと。一般的な細菌宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
培養物中の真核細胞中での発現も、結合メンバーを産生するための任意選択として当業者が利用可能である［Ｃｈａｄｄ ＨＥ ａｎｄ Ｃｈａｍｏｗ ＳＭ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８８−１９４；Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＤＣ ａｎｄ Ｋｒｕｍｍｅｎ Ｌ（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１１７；Ｌａｒｒｉｃｋ ＪＷ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ ＤＷ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：４１１−４１８］。
当技術分野において、異種ポリペプチドの発現に利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚性腎細胞、ヒト胚性網膜細胞および多数の他の細胞が含まれる。
適切な調節配列、例としてプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を適宜含有する好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミド、例えばファージミド、またはウイルス、例えば「ファージ」であり得る［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ］。例えば核酸構築物の調製、突然変異導入、シークエンシング、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析のための多数の公知技術およびプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌ他［ Ａｕｓｕｂｅｌ他ｅｄｓ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９９］に詳細に記載されている。
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示されている核酸を含有する宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞はインビトロであり得、培養物中で存在し得る。そのような宿主細胞は、インビボであり得る。宿主細胞がインビボで存在すれば、本発明の結合メンバーを「イントラボディ」または細胞内抗体として細胞内で発現させることが可能になり得る。イントラボディは遺伝子治療に使用することができる。
別の態様は、本発明の核酸を宿主細胞中に導入することを含む方法を提供する。導入は、任意の利用可能な技術を用い得る。真核細胞について、好適な技術には、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介形質移入およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクシニアまたは昆虫細胞についてバキュロウイルスを使用する形質導入が含まれ得る。宿主細胞、特に真核細胞での核酸の導入では、ウイルスまたはプラスミドベースの系を使用することができる。プラスミド系はエピソームとして維持するか、または宿主細胞中または人工染色体中に取り込むことができる。取り込みは、単一または複数の遺伝子座における１コピー以上のランダムまたはターゲティングされた統合であり得る。細菌細胞について、好適な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用する形質移入が含まれ得る。
導入後に、例えば遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を生じさせるかまたは可能にすることができる。発現産物の精製は、当業者に公知の方法により達成することができる。
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）中に統合することができる。標準的技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることにより統合を促進することができる。
本発明はまた、発現系中で上記構築物を使用して上記結合メンバーまたはポリペプチドを発現させることを含む方法を提供する。
本明細書に記載の結合メンバーは、ヒトまたは動物対象、例えばヒトにおける診断または治療の方法において使用することができる。ＩＬ−１８についての結合メンバーを使用してＩＬ−１８に関連する障害および／またはＩＬ−１８の活性の減少が有益である障害を治療することができる。
ＩＬ−１８についての結合メンバーを使用して個体におけるＩＬ−１８の活性を減少させることができる。したがって、本発明は、個体におけるＩＬ−１８の活性を減少させる方法であって、ＩＬ−１８の活性の減少が必要とされる個体に、ＩＬ−１８の活性を減少させるように、有効量の１つ以上の本発明の結合メンバーを単独で、または当技術分野において公知のまたは本明細書に記載の別の適切な医薬品との併用治療レジメンにおいて投与することを含む方法を提供する。
本明細書に記載の結合メンバーは、以下に列記される病態の治療において使用することができる：
１．骨および関節：例えば、先天的股異形成に対して原発性および続発性の骨関節炎／変形性関節症に関連するか、もしくはそれを含む関節炎；頸部および腰部脊椎症、ならびに腰部および頸部疼痛；関節リウマチ；スティル病；血清反応陰性脊椎関節症、例として強直性脊椎関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎および未分化脊椎関節症；敗血症性関節炎および他の感染関連関節症ならびに骨障害、例えば結核、例としてポッツ病およびポンセ症候群；急性および慢性の結晶誘導性滑膜炎、例として尿酸性痛風、ピロリン酸カルシウム蓄積症、ならびにカルシウムアパタイトに関連する腱、滑液胞および滑液炎症；ベーチェット病；原発性および続発性シェーグレン症候群；全身性硬化症および限局性強皮症；全身性エリテマトーデス、混合結合組織疾患、および未分化結合組織疾患；炎症性筋疾患、例として皮膚筋炎および多発性筋炎；リウマチ性多発性筋痛；川崎病；若年性関節炎、例として全身性若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）および全ての関節分布の特発性炎症性関節炎および関連症候群；マクロファージ活性化症候群；リウマチ熱およびその全身性合併症；血球貪食症候群；血球貪食リンパ組織球増加症；ＣＡＰ症候群；血管炎、例として巨細胞動脈炎、高安動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、結節性多発性動脈炎、顕微鏡的多発性動脈炎、ならびにウイルス感染、過敏性反応、クリオグロブリン、およびパラプロテインと関連する血管炎；腰部疼痛；家族性地中海熱、マックル・ウェルズ症候群；ならびに家族性ヒベルニアン熱、菊池病；薬剤誘導性関節痛、腱炎、および筋疾患；
２．傷害に起因する筋骨格障害の疼痛および結合組織再形成［例えば、スポーツによる傷害］または疾患：関節炎（例えば、関節リウマチ、骨関節炎、痛風または結晶性関節炎）、他の関節疾患（例えば、椎間板変性または側頭下顎骨関節変性）、骨再形成疾患（例えば、骨粗鬆症、パジェット病または骨壊死）、多発性軟骨炎、強皮症、混合結合組織障害、脊椎関節症または歯周疾患（例えば、歯周炎）；
３．心血管：腎虚血；卒中；アテローム性動脈硬化症；動脈硬化症；腹部大動脈瘤；末梢動脈疾患；狭心症；急性冠症候群；心筋梗塞；鬱血性心不全；血管再開通術後の再狭窄；脳血管疾患、例として多発性脳梗塞性認知症；末梢血管疾患、例として勃起機能不全；冠状循環および末梢循環に影響する障害；心筋炎、炎症および自己免疫心筋症、例として心筋サルコイド；虚血性再かん流傷害；心内膜炎、弁膜炎、および大動脈炎、例として感染性（例えば、梅毒）；血管炎；近位静脈および末梢静脈の障害、例として静脈炎および血栓症、例として深静脈血栓症および静脈瘤の合併症；
４．内分泌疾患：真性糖尿病、例として２型糖尿病および糖尿病性合併症、例えば糖尿病性ネフロパシー、ニューロパシーおよびレチノパシー。
５．気道：気道の閉塞性疾患、例として喘息、例として断続的および持続的の両方ならびに全ての重症度の気管支性、アレルギー性、内在性、外来性、運動誘導性、薬剤誘導性（例としてアスピリンおよびＮＳＡＩＤ誘導性）および粉塵誘導性喘息、ならびに他の原因の気道過敏性；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気管支炎、例として感染性および好酸球性気管支炎；肺気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；サルコイドーシス；農夫肺および関連疾患；過敏性肺炎；肺線維症、例として特発性繊維化性肺胞炎、特発性間質性肺炎、抗新生物治療および慢性感染に併発する線維症、例として結核およびアスペルギルス症ならびに他の真菌感染；肺移植の合併症；肺血管の血管性および血栓性障害、ならびに肺高血圧；鎮咳活性、例として気道の炎症および分泌病態に関連する慢性の咳、ならびに医原性の咳の治療；急性および慢性鼻炎、例として薬物性鼻炎、および血管運動神経性鼻炎；通年性および季節性アレルギー性鼻炎、例として神経性鼻炎（花粉症）；鼻ポリープ；急性ウイルス感染、例として風邪、ならびに呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、コロナウイルス（例としてＳＡＲＳ）およびアデノウイルスに起因する感染；
６．皮膚：乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎もしくは他の湿疹様皮膚炎、および遅延型過敏反応；植物性皮膚炎および光線皮膚炎；脂漏性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、扁平苔癬、硬化性萎縮性苔癬、壊疽性膿皮症、皮膚サルコイド、円板状エリテマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管性浮腫、血管炎、毒性紅斑、皮膚好酸球増加症、円形脱毛症、男性型禿頭症、スイート症候群、ウェーバー・クリスチャン症候群、多形性紅斑；感染性および非感染性の蜂巣炎；脂肪織炎；皮膚リンパ腫、非メラノーマ皮膚癌および他の異形成病変；薬剤誘導性障害、例として固定薬疹；
７．眼：眼瞼炎；結膜炎、例として通年性および春季アレルギー性結膜炎；虹彩炎；前部および後部ブドウ膜炎；脈絡膜炎；自己免疫；網膜に影響する変性障害もしくは炎症疾患；眼炎、例として交感性眼炎；サルコイドーシス；感染、例としてウイルス、真菌、および細菌感染；
８．胃腸管：舌炎、歯肉炎、歯周炎；食道炎、例として逆流性食道炎；好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、大腸炎、例として潰瘍性大腸炎、直腸炎、肛門掻痒症；セリアック症、過敏性腸症候群、および腸から遠くでの効果を有し得る食品関連アレルギー（例えば、偏頭痛、鼻炎または湿疹）；
９．腹部：肝炎、例として自己免疫性、アルコール性およびウイルス性肝炎；肝臓の線維症および肝硬変；胆嚢炎；急性および慢性の膵炎；
１０．尿生殖器：腎炎、例として間質性腎炎および糸球体腎炎；ネフローゼ症候群；膀胱炎、例として急性および慢性（間質性）膀胱炎ならびにハンナー潰瘍；急性および慢性尿道炎、前立腺炎、精巣上体炎、卵巣炎ならびに卵管炎；外陰膣炎；ペイロニー病；勃起機能不全（男性および女性の両方）；
１１．同種移植片拒絶反応：例えば、腎臓、心臓、肝臓、肺、骨髄、皮膚もしくは角膜の移植後もしくは輸血後の急性および慢性拒絶反応；または慢性移植片対宿主病；
１２．ＣＮＳ：アルツハイマー病ならびに他の認知障害、例としてＣＪＤおよびｎｖＣＪＤ；アミロイドーシス；多発性硬化症および他の脱髄症候群；脳のアテローム性動脈硬化症および血管炎；側頭動脈炎；重症筋無力症；急性および慢性疼痛（中枢もしくは末梢起源の急性、断続的もしくは持続的なもの）、例として内臓痛、頭痛、片頭痛、三叉神経痛、非定型顔面痛、関節および骨の疼痛、癌および腫瘍侵襲から生じる疼痛、ニューロパシー性疼痛症候群、例として糖尿病性、ヘルペス後およびＨＩＶ関連性ニューロパシー；ニューロサルコイドーシス；悪性の感染または自己免疫プロセスの中枢および末梢神経系合併症；
１３．他の自己免疫およびアレルギー障害、例として橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病、好酸球性筋膜炎、超ＩｇＥ症候群、抗リン脂質症候群；
１４．炎症または免疫学的構成要素による他の障害、例として後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ハンセン病、セザリー症候群、および腫瘍随伴症候群；
１５．癌、例として任意のタイプの転移性または非転移性固形腫瘍または悪性リンパ腫、例えば白血病、肉腫、皮膚癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌および脳癌。
本明細書に記載の結合メンバーを使用してそのような障害を治療することができ、それには予防的治療および障害の重症度もしくはその症状の１つ以上の軽減、または発症の遅延もしくはそのリスクの軽減が含まれる。
したがって、本発明は、本明細書に挙げられる障害のいずれかの少なくとも１つの症状を治療またはその重症度を軽減する方法であって、その治療または軽減を必要とする患者に、上記障害のいずれかの少なくとも１つの症状の重症度が軽減されるように、有効量の１つ以上の本発明の結合メンバーを単独で、または当技術分野において公知もしくは本明細書に記載の別の適切な医薬品との併用治療レジメンにおいて投与することを含む方法を提供する。
本発明の結合メンバーは、動物および疾患の動物モデル、例えば霊長類モデル、例えばアカゲザルまたはカニクイザルモデルにおいて使用することができる。好適な動物モデルには、ヒト細胞により再構成された免疫不全非ヒト哺乳動物、例えばマウスまたはラットも含まれ得る。
したがって、本明細書に記載の結合メンバーは、ＩＬ−１８、例えばＩＬ−１８発現および／または活性、特に異常な発現／活性が関与する疾患または障害の治療における治療剤として有用である。治療方法は、有効量の本明細書に記載の結合メンバーを、治療を必要とする患者に投与することを含み得、ＩＬ−１８の異常な発現および／または活性を減少させる。治療方法は、（ｉ）例えば上記診断方法を使用して、異常なＩＬ−１８レベルまたは活性を示す患者を同定すること、および（ｉｉ）有効量の本明細書に記載の結合メンバーを患者に投与することを含み得、ＩＬ−１８の異常な発現および／または活性を減少させる。有効量は、治療される特定の疾患または障害の少なくとも１つの症状の重症度を減少または低下させるためにＩＬ−１８の異常な発現および／または活性を減少させる量であり、必ずしも疾患または障害を治癒させる量ではない。
本発明はまた、ＩＬ−１８の少なくとも１つの効果にアンタゴナイズする方法であって、前記ＩＬ−１８の少なくとも１つの効果がアンタゴナイズされるように有効量の１つ以上の本発明の結合メンバーと接触させるかまたはそれを投与することを含む方法を提供する。本発明の方法によりアンタゴナイズすることができるＩＬ−１８の効果には、その受容体および／またはＩＬ−１８ＢＰへの結合、ならびにそれらの結合反応の結果として生じる任意の下流の効果が含まれる。
したがって、本発明のさらなる態様は、提供される結合メンバーを投与することを含む治療方法、そのような結合メンバーを含む医薬組成物、および投与用医薬品の製造における、例えば結合メンバーを薬学的に許容可能な賦形剤とともに製剤化することを含む医薬品または医薬組成物の作製方法におけるそのような結合メンバーの使用を提供する。薬学的に許容可能な賦形剤は、医薬組成物に入るが二次反応を引き起こさず、例えば結合メンバーの投与を容易にし、体内でのその寿命および／またはその効力を増加させ、溶液中のその溶解度を増加させ、またはそうでなければその保存を改善する化合物または化合物の組合せであり得る。これらの薬学的に許容可能なビヒクルは周知であり、選択される活性化合物の性質および投与様式に応じて、当業者により適合させる。
本明細書に記載の結合メンバーは、通常、結合メンバーに加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明による医薬組成物、および本発明により使用される医薬組成物は、結合メンバーに加えて、当業者に周知の薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または他の材料を含み得る。そのような材料は無毒で、活性成分の効力を干渉しないべきでである。担体または他の材料の厳密な性質は投与経路に依存し、経路は、以下で考察されるとおり、経口、吸入、気管内、局所、関節内、嚢内であるかまたは注射による経路であり得る。
経口投与用の医薬組成物、例えば単一ドメイン抗体分子（例えば「ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）」）なども、本発明において想定される。そのような経口製剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、液体または半固体形態であり得る。錠剤は、固体担体、例えばゼラチンまたはアジュバントを含み得る。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールを含めることができる。
静脈内注射、または罹患部位における注射（例えば、関節内注射）について、活性成分は、パイロジェンフリーの、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液の形態である。当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸化リンガー注射液を使用して、好適な溶液を調製することが十分に可能である。保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤および／または他の添加物を必要に応じて用いることができ、それには、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；単糖、二糖および他の炭水化物、例としてグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
本明細書に記載の結合メンバーは、分子の物理化学的特性および送達経路に応じて、液体、半固体または固体形態で製剤化することができる。製剤は、賦形剤、または賦形剤の組合せ、例えば：糖、アミノ酸および界面活性剤を含み得る。液体製剤は、広範囲の抗体濃度およびｐＨを含み得る。固体製剤は、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、または超臨界流体技術による乾燥により産生することができる。抗ＩＬ−１８の製剤は、意図される送達経路に依存し：例えば、肺送達用製剤は、吸入時に肺に深く浸透することを保証する物性を有する粒子からなり得；局所製剤（例えば瘢痕、例えば真皮瘢痕治療用の局所製剤）は、薬物が作用部位に留まる時間を延長する粘性改変剤を含み得る。結合メンバーは、結合メンバーを急速な放出から保護する担体とともに調製することができ、例えば制御放出製剤であり、それには、移植片、経皮貼付剤、およびマイクロカプセル化送達系が含まれる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤を調製するための多数の方法が当業者に公知である［Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｄ．，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク，１９７８］。
抗ＩＬ−１８治療は、経口で（例えば単一ドメイン抗体分子（例えば「ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）」）など）、注射により（例えば皮下、関節内、静脈内、腹膜内、動脈内または筋肉内注射により）、吸入により、気管内、嚢内経路（膀胱内への点滴注入）によって、または局所的（例えば眼内、鼻内、経直腸、創傷内、皮膚上）に施すことができる。治療は、パルス注入により、特に傾斜用量の結合メンバーを用いて施行することができる。投与経路は、治療の物理化学的特性により、疾患に関する特別な配慮により、または効力を最適化するかもしくは副作用を最小化する必要性により決定することができる。特定の一投与経路は静脈内経路である。本発明の医薬組成物を投与する別の経路は皮下経路である。抗ＩＬ−１８治療は診療所における使用に制限されないことが想定される。したがって、無針デバイスを使用する皮下注射も有利である。
組成物は、単独でまたは他の治療と組み合わせて、治療すべき病態に応じて同時にもしくは連続して投与することができる。
ＩＬ−１８についての結合メンバーは、追加の医薬構成要素と組み合わせた併用療法の部分として使用することができる。併用治療、特に抗ＩＬ−１８結合メンバーおよび１つ以上の他の薬物の組合せを使用して顕著な相乗効果を提供することができる。ＩＬ−１８についての結合メンバーは、本明細書に列記される病態の１つ以上の治療のために、別の１つまたは複数の治療剤と同時にまたは連続してまたは組合せ調製物として投与することができる。
本発明による結合メンバーは、以下の薬剤の１つ以上と組み合わせてまたはそれらに加えて提供することができる：
− サイトカインまたはサイトカイン機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えばサイトカインシグナリング経路に作用する薬剤、例えばＳＯＣＳ系のモジュレーター）、例えばアルファ−、ベータ−および／またはガンマ−インターフェロン；インシュリン様成長因子Ｉ型（ＩＧＦ−１）、その受容体および関連結合タンパク質；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−３７の１つ以上、および／またはインターロイキンアンタゴニストまたはインヒビター、例えばアナキンラ；インターロイキンファミリーメンバーの受容体のインヒビターまたはそのような受容体の特定サブユニットのインヒビター（例えば、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ（商標）；Ｒｏｃｈｅ）、ヒトＩＬ−６受容体に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）インヒビター、例えば抗ＴＮＦモノクローナル抗体（例えばインフリキシマブ、アダリムマブおよび／またはＣＤＰ−８７０）および／またはＴＮＦ受容体アンタゴニスト、例えば免疫グロブリン分子（例えばエタネルセプト）および／または低分子量薬剤、例えばペントキシフィリン；
− Ｂ細胞のモジュレーター、例えばＢリンパ球を標的化するモノクローナル抗体（例えばＣＤ２０（リツキシマブ）またはＭＲＡ−ａＩＬｌ６Ｒ）またはＴリンパ球を標的化するにするもの（例えばＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＨｕＭａｘ Ｉｌ−１５またはアバタセプト）；
− 破骨細胞活性を阻害するモジュレーター、例えばＲＡＮＫＬに対する抗体；
− ケモカインまたはケモカイン受容体機能のモジュレーター、例えばＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ２Ａ、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０およびＣＣＲ１１（Ｃ−Ｃファミリーについて）；ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ５およびＣＸＣＲ６（Ｃ−Ｘ−Ｃファミリーについて）ならびにＣＸ３ＣＲ１（Ｃ−Ｘ３−Ｃファミリーについて）のアンタゴニスト；
− マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、すなわちストロメライシン、コラゲナーゼおよびゼラチナーゼならびにアグリカナーゼ、特にコラゲナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、コラゲナーゼ−２（ＭＭＰ−８）、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）、ストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）、ストロメライシン−２（ＭＭＰ−１０）および／またはストロメライシン−３（ＭＭＰ−１１）および／またはＭＭＰ−９および／またはＭＭＰ−１２の１つ以上のインヒビター、例えばドキシサイクリンなどの薬剤；
− ロイコトリエン生合成インヒビター、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）インヒビターまたは５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）アンタゴニスト、例えばジレウトン；ＡＢＴ−７６１；フェンレウトン；テポキサリン；Ａｂｂｏｔｔ−７９１７５；Ａｂｂｏｔｔ−８５７６１；Ｎ−（５−置換）−チオフェン−２−アルキルスルホンアミド；２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールヒドラゾン；メトキシテトラヒドロピラン、例えばＺｅｎｅｃａ ＺＤ−２１３８；化合物ＳＢ−２１０６６１；ピリジニル置換２−シアノナフタレン化合物、例えばＬ−７３９，０１０；２−シアノキノリン化合物、例えばＬ−７４６，５３０；インドールおよび／またはキノリン化合物、例えばＭＫ−５９１、ＭＫ−８８６および／またはＢＡＹｘ１００５；
− フェノチアジン−３−１、例えばＬ−６５１，３９２；アミジノ化合物、例えばＣＧＳ−２５０１９ｃ；ベンゾキサラミン（ｂｅｎｚｏｘａｌａｍｉｎｅｓ）、例えばオンタゾラスト；ベンゼンカルボキシミドアミド、例えばＢＩＩＬ２８４／２６０；および化合物、例えばザフィルルカスト、アブルカスト、モンテルカスト、プランルカスト、ベルルカスト（ＭＫ−６７９）、ＲＧ−１２５２５、Ｒｏ−２４５９１３、イラルカスト（ＣＧＰ４５７１５Ａ）およびＢＡＹｘ７１９５からなる群から選択されるロイコトリエン（ＬＴ）Ｂ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４の受容体アンタゴニスト；
− ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）インヒビター、例えばメチルキサンタニン（ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈａｎｉｎｅ）、例えばテオフィリンおよび／またはアミノフィリン；および／または選択的ＰＤＥアイソザイムインヒビター、例えばＰＤＥ４インヒビターおよび／またはアイソフォームＰＤＥ４Ｄのインヒビターおよび／またはＰＤＥ５のインヒビター；
− ヒスタミン１型受容体アンタゴニスト、例えばセチリジン、ロラタジン、デスロラタジン、フェキソフェナジン、アクリバスチン、テルフェナジン、アステミゾール、アゼラスチン、レボカバスチン、クロルフェニラミン、プロメタジン、シクリジン、および／またはミゾラスチン（一般に、経口、局所または非経口で適用される）；
− プロトンポンプインヒビター（例えばオメプラゾール）または胃保護性ヒスタミン２型受容体アンタゴニスト；
− ヒスタミン４型受容体のアンタゴニスト；
− アルファ−１／アルファ−２アドレナリン受容体アゴニスト血管収縮性交感神経様作用剤、例えばプロピルヘキセドリン、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、エフェドリン、シュードエフェドリン、塩酸ナファゾリン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸キシロメタゾリン、塩酸トラマゾリンおよび塩酸エチルノルエピネフリン；
− 抗コリン作動剤、例えばムスカリン受容体（Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３）アンタゴニスト、例えばアトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート、臭化イプラトロピウム、臭化チオトロピウム、臭化オキシトロピウム、ピレンゼピンおよびテレンゼピン；
− ベータ−アドレナリン受容体アゴニスト（例としてベータ受容体サブタイプ１〜４）、例えばイソプレナリン、サルブタモール、ホルモテロール、サルメテロール、テルブタリン、オルシプレナリン、メシル酸ビトルテロールおよび／またはピルブテロール、例えばそのキラルエナンチオマー；
− クロモン、例えばクロモグリク酸ナトリウムおよび／またはネドクロミルナトリウム；
− ＰＤＥ−４インヒビター、例えばロフルミラスト
− グルココルチコイド、例えばフルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニド、および／またはフランカルボン酸モメタゾン；
− 核ホルモン受容体、例えばＰＰＡＲをモジュレートする薬剤；
− 免疫グロブリン（Ｉｇ）もしくはＩｇ調製物またはＩｇ機能をモジュレートするアンタゴニストもしくは抗体、例えば抗ＩｇＥ（例えばオマリズマブ）；
− 他の全身または局所適用の抗炎症剤、例えばサリドマイドもしくはその誘導体、レチノイド、ジトラノールおよび／またはカルシポトリオール；
− アミノサリチル酸およびスルファピリジンの組合せ、例えばスルファサラジン、メサラジン、バルサラジド、およびオルサラジン；ならびに免疫調節剤、例えばチオプリン；およびコルチコステロイド、例えばブデソニド；
− 抗菌剤、例えばペニシリン誘導体、テトラサイクリン、マクロライド、ベータ−ラクタム、フルオロキノロン、メトロニダゾールおよび／もしくは吸入アミノグリコシド；ならびに／または抗ウイルス剤、例えばアシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、シドフォビル；アマンタジン、リマンタジン；リバビリン；ザナマビル（ｚａｎａｍａｖｉｒ）および／またはオセルタマビル（ｏｓｅｌｔａｍａｖｉｒ）；プロテアーゼインヒビター、例えばインジナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよび／またはサキナビル；ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばジダノシン、ラミブジン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン；非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばネビラピン、エファビレンツ；または抗体、例えばパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（商標））；
− 心血管作動剤、例えばチアジドまたはループ利尿薬；血管拡張剤、例えばニトログリセリン、カルシウムチャネルブロッカー、アルファ−アドレナリン受容体ブロッカー、ベータ−アドレナリン受容体ブロッカーまたはアルファおよびベータ−アドレナリン受容体ブロッカーの組合せ、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アンギオテンシン−２受容体アンタゴニスト；アルドステロンアンタゴニストまたはカリウム保持性利尿薬；脂質低下剤、例えばスタチン、コレステロール吸収インヒビターおよび／またはフィブレート；血液細胞形態のモジュレーター、例えばペントキシフィリン；血栓溶解剤および／または抗凝血剤、例えば血小板凝集インヒビター；
− ＣＮＳ作動剤、例えば抗うつ剤（例えばセルトラリン）、抗パーキンソン薬（例えばデプレニル、Ｌ−ドーパ、ロピニロール、プラミペキソール；ＭＡＯＢインヒビター、例えばセレギンおよびラサギリン；ｃｏｍＰインヒビター、例えばｔａｓｍａｒ；Ａ−２インヒビター、ドーパミン再取り込みインヒビター、ＮＭＤＡアンタゴニスト、ニコチンアゴニスト、ドーパミンアゴニストおよび／またはニューロン一酸化窒素シンターゼのインヒビター）および抗アルツハイマー薬、例えばドネペジル、リバスチグミン、タクリン、ＣＯＸ−２インヒビター、プロペントフィリンまたはメトリホネート；
− 急性および慢性疼痛を治療するための薬剤、例えば中枢または末梢作用鎮痛薬、例えばオピオイド類似体または誘導体、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、アミトリプチリンまたは他の抗うつ剤、パラセタモール、または非ステロイド性抗炎症剤；
− 非経口または局所適用（吸入を含む）局所麻酔剤、例えばリグノカインまたはその類似体；
− 抗骨粗鬆症剤、例えばホルモン剤、例えばラロキシフェン、またはビホスホネート、例えばアレンドロネート；
− （ｉ）トリプターゼインヒビター；（ｉｉ）血小板活性化因子（ＰＡＦ）アンタゴニスト；（ｉｉｉ）インターロイキン変換酵素（ＩＣＥ）インヒビター；（ｉｖ）ＩＭＰＤＨインヒビター；（ｖ）接着分子インヒビター、例としてＶＬＡ−４アンタゴニスト；（ｖｉ）カテプシン；（ｖｉｉ）キナーゼインヒビター、例えばチロシンキナーゼのインヒビター（例えばＢｔｋ、Ｉｔｋ、Ｊａｋ３ＭＡＰ インヒビターの例にはゲフィチニブ、メシル酸イマチニブが含まれる）、セリン／スレオニンキナーゼ（例えばＭＡＰキナーゼ、例えばｐ３８、ＪＮＫ、プロテインキナーゼＡ、ＢおよびＣならびにＩＫＫのインヒビター）、または細胞周期調節に関与するキナーゼ（例えばサイクリン依存性キナーゼ）；（ｖｉｉｉ）グルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼインヒビター；（ｉｘ）キニン−Ｂ１．−および／またはＢ２．−受容体アンタゴニスト；（ｘ）抗痛風剤、例えばコルヒチン；（ｘｉ）キサンチンオキシダーゼインヒビター、例えばアロプリノール；（ｘｉｉ）尿酸排泄剤、例えばプロベネシド、スルフィンピラゾン、および／またはベンズブロマロン；（ｘｉｉｉ）成長ホルモン分泌促進剤；（ｘｉｖ）トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦβ）；（ｘｖ）血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；（ｘｖｉ）線維芽細胞成長因子、例えば塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）；（ｘｖｉｉ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；（ｘｖｉｉｉ）カプサイシンクリーム；（ｘｉｘ）タキキニンＮＫ．ｓｕｂ１．および／またはＮＫ．ｓｕｂ３．受容体アンタゴニスト、例えばＮＫＰ−６０８Ｃ、ＳＢ−２３３４１２（タルネタント）および／またはＤ−４４１８；（ｘｘ）エラスターゼインヒビター、例えばＵＴ−７７および／またはＺＤ−０８９２；（ｘｘｉ）ＴＮＦ−アルファ変換酵素インヒビター（ＴＡＣＥ）；（ｘｘｉｉ）誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）インヒビターまたは（ｘｘｉｉｉ）ＴＨ２細胞上で発現される化学誘引物質受容体相同分子（例えばＣＲＴＨ２アンタゴニスト）；（ｘｘｉｖ）Ｐ３８のインヒビター（ｘｘｖ）Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の機能をモジュレートする薬剤および（ｘｘｖｉ）プリン受容体の活性をモジュレートする薬剤、例えばＰ２Ｘ７；（ｘｘｖｉｉ）転写因子活性化、例えばＮＦｋＢ、ＡＰＩ、および／またはＳＴＡＴＳのインヒビターまたは（ｘｘｖｉｉｉ）カスパーゼインヒビター、例えばＢｏｃ−Ａｓｐ−ＦＭＫ、ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、Ａｃ−ＷＥＨＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＹＶＡＤＣＨＯ、ｔ−ブトキシカルボニル−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ、およびｔ−ブトキシカルボニル−ＡＥＶＤ−ＣＨＯ。
インヒビターは特異的であるか、または混合インヒビター、例えば上記の分子（例えば受容体）または分子クラスの２つ以上を標的化するインヒビターであり得る。
結合メンバーは、化学療法剤または別のチロシンキナーゼインヒビターと会合させて同時投与でまたはイムノコンジュゲートの形態で使用することもできる。前記抗体の断片は、組換え機構または生化学的カップリングおよび次いで上記抗体の特異性を、ＩＬ−１８が関連する活性に関与する他の分子を認識し得る他の抗体の特異性と会合させることにより得られる二重特異性抗体において使用することもできる。
炎症性疾患、例えば、上記炎症性病態、例えば関節リウマチ、骨関節炎、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、乾癬、全身性エリテマトーデス、全身性若年性特発性関節炎、自己免疫疾患、座瘡、血管炎、およびスティル病の治療について、本発明の結合メンバーを、１つ以上の薬剤、例えば局所適用であるか全身適用であるかにかかわらず非ステロイド性抗炎症剤（以後ＮＳＡＩＤ）、例として非選択的シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１／ＣＯＸ−２インヒビター、例えばピロキシカム、ジクロフェナク、プロピオン酸、例えばナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェンおよびイブプロフェン、フェナメート、例えばメフェナム酸、インドメタシン、スリンダク、アザプロパゾン、ピラゾロン、例えばフェニルブタゾン、サリチレート、例えばアスピリン）；選択的ＣＯＸ−２インヒビター（例えばメロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルマロコキシブ（ｌｕｍａｒｏｃｏｘｉｂ）、パレコキシブおよびエトリコキシブ）；シクロオキシゲナーゼ阻害一酸化窒素ドナー（ＣＩＮＯＤ）；グルココルチコステロイド（局所、経口、筋肉内、静脈内または関節内経路による投与のいずれでもよい）；メトトレキセート、レフルノミド；ヒドロキシクロロキン、ｄ−ペニシラミン、オーラノフィンまたは他の非経口もしくは経口金製剤；鎮痛薬；ジアセレイン；関節内治療薬、例えばヒアルロン酸誘導体；および栄養補助食品、例えばグルコサミンと組み合わせることができる。
本明細書に記載の結合メンバーは癌を治療するための既存の治療剤と組み合わせて使用することもできる。組み合わせて使用するために好適な薬剤には、以下のものが含まれる：
（ｉ）内科的腫瘍学において使用される抗増殖性／抗悪性腫瘍薬およびその組合せ、例えばＧｌｅｅｖｅｃ（メシル酸イマチニブ）、アルキル化剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロランブシル、ブスルファンおよびニトロソウレア）；代謝拮抗剤（例えば葉酸拮抗剤、例えばフルオロピリミジン、例えば５−フルオロウラシルおよびテガフール、ラルチトレキセド、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、ヒドロキシウレア、ゲムシタビンおよびパクリタキセル）；抗腫瘍性抗生物質（例えばアントラサイクリン、例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシン）；有糸分裂阻害剤（例えばビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンおよびタキソイド、例えばタキソールおよびタキソテール）；およびトポイソメラーゼインヒビター（例えばエピポドフィロトキシン、例えばエトポシドおよびテニポシド、アムサクリン、トポテカンおよびカンプトセシン）；
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤、例えば抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン（ｉｏｄｏｘｙｆｅｎｅ））、エストロゲン受容体下方調節因子（例えばフルベストラント）、抗アンドロゲン剤（例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（例えばゴセレリン、ロイプロレリンおよびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば酢酸メゲストロール）、アロマターゼインヒビター（例えばアナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール（ｖｏｒａｚｏｌｅ）およびエキセメスタンとして）および５α−レダクターゼのインヒビター、例えばフィナステリド；
（ｉｉｉ）癌細胞侵襲を阻害する薬剤（例えばメタロプロテイナーゼインヒビター、例えばマリマスタットおよびウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体機能のインヒビター）；
（ｉｖ）成長因子機能のインヒビター、例えば、そのようなインヒビターには、成長因子抗体、成長因子受容体抗体（例えば抗ｅｒｂｂ２抗体トラスツズマブおよび抗ｅｒｂｂ１抗体セツキシマブ［Ｃ２２５］）、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、チロシンキナーゼインヒビターおよびセリン／スレオニンキナーゼインヒビター、例えば上皮細胞成長因子ファミリーのインヒビター（例えばＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼインヒビター、例えばＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＡＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ＣＩ １０３３））、例えば血小板由来成長因子ファミリーのインヒビターおよび例えば肝細胞成長因子ファミリーのインヒビターが含まれ；
（ｖ）血管新生阻害剤、例えば血管内皮成長因子の効果を阻害するもの（例えば抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ、国際公開第９７／２２５９６号パンフレット、国際公開第９７／３００３５号パンフレット、国際公開第９７／３２８５６号パンフレットおよび国際公開第９８／１３３５４号パンフレットに開示されている化合物等の化合物および他の機構により作用する化合物（例えばリノマイド、インテグリンαｖβ３機能のインヒビターおよびアンギオスタチン）；
（ｖｉ）血管損傷剤、例えばコンブレタスタチンＡ４および国際公開第９９／０２１６６号パンフレット、国際公開第００／４０５２９号パンフレット、国際公開第００／４１６６９号パンフレット、国際公開第０１／９２２２４号パンフレット、国際公開第０２／０４４３４号パンフレットおよび国際公開第０２／０８２１３号パンフレット（そのそれぞれは、全体として本明細書に組み込まれる）に開示されている化合物；
（ｖｉｉ）アンチセンス治療薬、例えば上記列挙される標的に指向されるもの、例えばＩＳＩＳ２５０３、抗ｒａｓアンチセンス；
（ｖｉｉｉ）遺伝子治療アプローチ、例として例えば異常遺伝子、例えば異常ｐ５３または異常ＢＲＣＡ１もしくはＢＲＣＡ２を置き換えるアプローチ、ＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ治療）アプローチ、例えばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌性ニトロレダクターゼ酵素を使用するアプローチおよび化学療法または放射線療法に対する患者の耐容性を増加させるアプローチ、例えば多剤耐性遺伝子治療；ならびに
（ｉｘ）免疫療法アプローチ、例として例えば患者腫瘍細胞の免疫原性を高めるエクスビボおよびインビボアプローチ、例えばサイトカイン、例えばインターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子による形質移入、Ｔ細胞不応答を減少させるアプローチ、形質移入された免疫細胞、例えばサイトカインにより形質移入された樹状細胞を使用するアプローチ、サイトカインにより形質移入された腫瘍細胞系を使用するアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を使用するアプローチ。
ＩＬ−１８についての結合メンバーおよび上記の追加医薬構成要素の１つ以上を医薬品の製造において使用することができる。医薬品は個体に対する別個または組合せ投与用であり得、したがって結合メンバーおよび追加の構成要素を組合せ調製物または別個の調製物として含み得る。別個の調製物を使用して、別個の連続する投与または同時投与を促進し、異なる経路、例えば経口および非経口投与による構成要素の投与を可能にする。
提供される組成物は、哺乳動物に投与することができる。通常、投与は「治療有効量」で行われ、それは患者に利益を示すために十分な量である。そのような利益は少なくとも１つの症状の少なくとも改善であり得る。実際の投与量、ならびに投与の割合および時間経過は、治療されるものの性質および重症度、治療対象の具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、疾患の原因、組成物の送達部位、結合メンバーのタイプ、投与方法、投与計画および医師に公知の他の要因に依存する。治療の処方、例えば用量などの決定は一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度および／または治療される疾患の進行に依存し得る。抗体の適切な用量は当技術分野において周知である。投与される医薬品のタイプに応じて本明細書またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００５）に記載の具体的用量を適宜使用することができる。本発明の結合メンバーの治療有効量または好適な用量は、そのインビトロ活性および動物モデルにおけるインビボ活性を比較することにより決定することができる。試験動物における有効投与量をヒトに対して外挿する方法が公知である。厳密な用量は、多数の要因、例として抗体が診断用であるか、予防用であるかまたは治療用であるか、治療すべき領域のサイズおよび位置、抗体の厳密な性質（例えば完全抗体、断片またはダイアボディ）および抗体に付着している任意の検出可能な標識または他の分子の性質に依存する。典型的な抗体用量は、全身適用について１００μｇから１ｇの範囲であり、局所適用について１μｇから１ｍｇの範囲である。最初に高負荷用量を投与し、次いで１回以上の低用量を投与することができる。典型的には、抗体は完全抗体であり、例えばＩｇＧ１アイソタイプである。これは成体患者の単回治療についての用量であり、小児および乳児に関して比例的に調節することができ、分子量に比例して他の抗体フォーマットについて調節することもできる。治療は、医師の裁量において毎日、週２回、毎週または毎月の間隔で繰り返すことができる。治療は、皮下投与について２から４週毎であり得、静脈内投与について４から８週毎であり得る。治療は定期的であり得、投与間の期間は約２週間以上、例えば約３週間以上、約４週間以上、または約月１回である。治療は、外科手術前および／もしくは後に施すことができ、ならびに／または外科治療の解剖部位に直接投与または適用することができる。
本発明の種々のさらなる態様および実施形態は、本開示に照らして当業者に明らかである。
本明細書に挙げられる全ての文献、例として、データベースリファレンスおよびアクセッション番号、特許、特許出願および刊行物は、全ての目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される「および／または」は、他方を有するかまたは有さない２つの指定の特徴または構成要素のそれぞれの指定の開示と解釈すべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが個々に本明細書に記載されるかのとおり（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの指定の開示と解釈すべきである。
特に文脈に記載のない限り、上記特徴の記載および定義は、本発明のいかなる特定の態様にも実施形態にも限定されるものではなく、記載される全ての態様および実施形態に等しく当てはまる。
本発明のある態様および実施形態を、目下、実施例として、および付属の図面および表を参照して説明する。
実施例１
抗−１８抗体生成およびリード選択
１．１ 組換えヒトＩＬ−１８抗原の発現および精製
細菌発現のためのヒトＩＬ−１８（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｑ１４１１６−１；配列番号１６９）を、ｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３＊中で発現させた。構築物は、Ｎ末端ＧＳＴタグ、ヒスチジンタグ（８×Ｈｉｓ）をＸａ因子開裂部位と一緒に含むようにインハウスで生成した。可溶性発現後、タンパク質を標準的親和性クロマトグラフィーを使用する精製に付し、次いでＸａ因子開裂し、サイズ排除精製して生物学的に活性なヒトＩＬ−１８を生成した。
ヒトＩＬ−１８のバキュロウイルス発現のため、構築物は、Ｎ末端Ｆｌａｇタグおよびヒスチジンタグを有するように設計した。構築物をｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中にクローニングし、製造業者の指示書に従って昆虫細胞中の発現のための目的ベクターｐＤＥＳＴ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）に移した。タンパク質は、標準的親和性およびサイズ排除クロマトグラフィー技術により精製した。
ＩＬ−１８のビオチン化を、ＥＺ−ｌｉｎｋビオチン−ＢＭＣＣ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ；カタログ番号２１９００）を使用して遊離システイン上でＳＨ基を介して行った。
１．２ 選択
繊維状ファージＭ１３に基づくファージミドベクター中にクローニングされたナイーブヒト一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリーを選択に使用した（Ｖａｕｇｈａｎ他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（３）：３０９−１４；Ｌｌｏｙｄ他（２００９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．（３）：１５９−６８；Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ他（２００１）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｅｄ．ｂｙ Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｓ．Ｄｕｂｅｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐ９３；Ｇｒｏｖｅｓ他（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３１３（１−２）：１２９−３９）。Ｖａｕｇｈａｎ他（（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（３）：３０９−１４）およびＨａｗｋｉｎｓ他（（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２６，８８９−８９６）により本質的に既に記載されているとおり、組換えヒトＩＬ−１８（Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．，日本，名古屋）に基づく一連の選択サイクルを使用してファージディスプレイライブラリーから抗ＩＬ−１８特異的ｓｃＦｖ抗体を単離した。簡潔に述べると、パニング選択の第１ラウンドについて、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）中のヒトＩＬ−１８を、Ｎｕｎｃ（商標）ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ；カタログ番号４３９４５４）のウェル上に４℃において一晩、事前に吸着させたラット抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体、クローン１５９−１２Ｂ（Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｊａｐａｎ；カタログ番号Ｄ０４５−３）により特異的に捕捉させた。ウェルをＰＢＳにより洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｍａｒｖｅｌ（３％ｗ／ｖ）により１時間ブロッキングした。４倍過剰の捕捉抗体、ラット抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体を含有するＰＢＳ−Ｍａｒｖｅｌ（３％ｗ／ｖ）中の精製ファージを除外プレート（ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートのウェル上に吸着させたラット抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体）のウェルに１時間添加してからコーティングされた抗原（組換えヒトＩＬ−１８）と１時間結合させた。未結合ファージをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％ｖ／ｖ）およびＰＢＳを使用する一連の洗浄サイクルにより除去した。結合したファージ粒子を溶出させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細菌中に感染させ、次の選択ラウンドのためにレスキューした（Ｖａｕｇｈａｎ他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（３）：３０９−３１４）。第２ラウンドの選択を、ファージ粒子を１００ｎＭのビオチン化ＩＬ−１８とインキュベートすることにより溶液中で実施し、次いで上記のラット抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体捕捉選択の第３ラウンドを実施した。
１．３ ＩＬ−１８受容体アルファおよびベータ鎖へのＩＬ−１８結合の未精製ｓｃＦｖによる阻害
ペリプラズム調製物からの未精製ｓｃＦｖを、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を使用するホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ（登録商標）、ＣＩＳ Ｂｉｏ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）受容体リガンド結合アッセイにおいてスクリーニングした。ヒトＩＬ−１８Ｒアルファ鎖（［ＩＬ−１８Ｒα］；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号８１６−ＬＲ）のユウロピウムクリプテート標識を、トリスビピリジン−Ｅｕ３＋−クリプテート−ＮＨＳ（ＣＩＳ ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス，バニョル・シュル・セズ（Ｂａｇｎｏｌｓ−ｓｕｒ−Ｃｅｚｅ）；カタログ番号６５ＥＵＳＡＢＡ）をｐＨ８のＰＢＳ中で製造業者の指示書に従って使用して達成した。ヒトＩＬ−１８Ｒベータ鎖（［ＩＬ−１８Ｒβ］；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号１１８−ＡＰ）は、ＥＺｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ；カタログ番号２１３３５）をｐＨ８のＰＢＳ中で使用して遊離アミンを介してビオチン化した。ＨＴＲＦ（商標）アッセイにおいて、未精製ｓｃＦｖ試料は、ヒト組換えＩＬ−１８のその受容体、ユウロピウムクリプテート標識ヒトＩＬ−１８Ｒαおよびビオチン化ヒトＩＬ−１８Ｒβへの結合相互作用について競合した。選択産物は、５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．４、０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５Ｍのソルビトール中で調製されたｓｃＦｖを含有する未精製細菌ペリプラズム抽出物としてスクリーニングした。５マイクロリットルの未精製ｓｃＦｖ試料をＣｏｓｔａｒ（登録商標）３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ；カタログ番号７７７７６−８１８）に添加した。この後に、５μｌの６ｎＭ組換えヒトＩＬ−１８（インハウス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）を添加し、次いで１０ｎＭのビオチン化ＩＬ−１８Ｒβ、２．５ｎＭのユウロピウムクリプテート標識ＩＬ−１８Ｒαおよび３０ｎＭのストレプトアビジンＸｌｅｎｔ！（Ｃｉｓ Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス，バニョル・シュル・セズ（Ｂａｇｎｏｌｓ−ｓｕｒ−Ｃｅｚｅ）；カタログ番号６１１ＳＡＸＬＢ）を含有する１０μｌの混合物を添加した。非特異的結合は、対照マウスモノクローナル抗ヒトＩＬ−１８抗体（Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．，日本，名古屋；クローン１２５−２Ｈ）を５ｎＭ最終濃度においてペリプラズム抽出物に代えて使用して測定した。全ての希釈は、０．４ＭのＫＦおよび０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ（アッセイ緩衝液）中で実施した。アッセイプレートを、室温において４時間インキュベートしてから、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）を使用してユウロピウム分子を３２０ｎｍにおいて励起させ、ユウロピウム分子についての６２０ｎｍにおける発光およびＸＬ６６５分子についての６６５ｎｍ発光波長を計測することにより時間分解蛍光を読み取った。
データを、それぞれの試料についてデルタＦ％値を算出することにより分析した。デルタＦを式１に従って決定した。
式１：
Figure 2014508511
続いて、デルタＦ％値を使用して特異的結合％を式２に記載のとおり算出した。
式２：
Figure 2014508511
１．４ ＩＬ−１８受容体アルファおよびベータ鎖へのＩＬ−１８結合の精製ｓｃＦｖによる阻害
未精製ペリプラズム抽出物としてＩＬ−１８受容体アルファおよび受容体ベータ結合相互作用に対して顕著な阻害効果を示したｓｃＦｖ抽出物を、ＤＮＡシーケンシングに供した（Ｖａｕｇｈａｎ他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−３１４；Ｏｓｂｏｕｒｎ他（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２，１８１−１９６）。特有の配列を有するｓｃＦｖを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させ、親和性クロマトグラフィーにより精製した（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ他（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９４．９３１−９３７により記載のとおり）。未精製ｓｃＦｖペリプラズム抽出物を精製ｓｃＦｖに置換して、セクション１．３に記載のＨＴＲＦ（商標）アッセイにおける希釈系列の精製ｓｃＦｖを試験することにより平均ｓｃＦｖ（ａｖ ｓｃＦｖ）の効力を測定した。
セクション１．３に記載のとおりデルタＦ％値および特異的結合％を算出することによりデータを分析した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して、４パラメータロジスティック式を使用する曲線フィッティングにより算出した（式３）。
式３：
Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０ｅｘｐ（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））
Ｘは、濃度の対数である。
Ｙは、特異的結合である
図１に説明されるとおり、抗体１の精製ｓｃＦｖ調製物は、ＩＬ−１８受容体複合体の形成を１２ｎＭ（ｎ＝１）のＩＣ５０値で阻害した。
１．５ 抗体１ｓｃＦｖのＩｇＧ２への再フォーマット化
完全ヒト抗体重鎖および軽鎖をそれぞれ発現するベクター中に可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをサブクローニングすることにより、抗体１ｓｃＦｖをＩｇＧ２に再フォーマット化した。哺乳動物細胞中で完全ＩｇＧ２重鎖を発現させるためのヒト重鎖定常ドメインおよび調節エレメントを含有する哺乳動物発現ベクター（ｐＥＵ９．２）中に可変重鎖をクローニングした。同様に、哺乳動物細胞中で完全ＩｇＧ軽鎖を発現させるためのヒトカッパ軽鎖定常ドメインおよび調節エレメントの発現のための哺乳動物発現ベクター（ｐＥＵ３．４）中に可変軽鎖ドメインをクローニングした。重鎖および軽鎖の発現のためのベクターは、Ｐｅｒｓｉｃ他，（１９９７）Ｇｅｎｅ １８７：９−１８に最初に記載された。抗体１をＩｇＧ２として得るため、重鎖および軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ哺乳動物細胞中に一過的に形質移入し、抗体を発現させ、培地中に分泌させた。回収した培地を精製前に遠心分離により澄明化した。ＩｇＧは、プロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。培養上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ ｐＨ８緩衝液中で事前に平衡化した１ｍｌカラム上にロードした。０．１ＭのシトレートｐＨ３を使用してカラムから１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ１０中にＩｇＧを直接溶出させた。溶出物は、ＮＡＰ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１×ＤＰＢＳへの緩衝液交換に付した。精製ＩｇＧは、０．２マイクロメートル滅菌濾過し、内毒素について分析し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより特性決定し、２８０ｎｍにおける吸光度により濃度測定した。
１．６ 抗体１ＩｇＧ２によるＩＬ−１８受容体アルファおよびベータへのＩＬ−１８結合の阻害
上記のとおり、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＲαおよびＩＬ−１８Ｒβ複合体の形成を提示した精製抗体１ｓｃＦｖを、組換えＩｇＧ２に変換した。精製抗体１ＩｇＧ２を系列希釈し、セクション１．３に記載のＨＴＲＦ（商標）ＩＬ−１８リガンド受容体アッセイにおいて試験した。抗体１のＩｇＧ２調製物は、ヒトＩＬ−１８／ヒトＩＬ−１８受容体複合体の形成を２．９ｎＭ（幾何平均、ｎ＝２；図２Ａ）のＩＣ５０値で阻害した。
一部の実験において、組換えヒトＩＬ−１８を、組換えアカゲザルＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号２５４８−ＲＭ；アクセッション番号ＡＡＫ１３４１６）により１．５ｎＭの最終濃度において置換した。アカゲザルＩＬ−１８のアミノ酸配列は、カニクイザルＩＬ−１８と１００％の相同性を提示する。標識ヒトＩＬ−１８受容体、検出試薬およびアッセイパラメータは、セクション１．３に記載したものと同一であった。抗体１ＩｇＧ２の調製物は、組換えアカゲザルＩＬ−１８／ヒトＩＬ−１８受容体複合体の形成を５．４ｎＭのＩＣ５０値で阻害した（幾何平均、Ｎ＝２；図２Ｂ）。
１．７ ＩＬ−１８により刺激したＫＧ−１細胞のＩＦＮ産生の抗体１ＩｇＧ２による阻害
組換えヒトＩＬ−１８の生物学的活性を中和する抗体１ＩｇＧ２の効力を、ＫＧ−１細胞アッセイを使用して確認した。ＫＧ−１細胞（ヒト骨髄性白血病細胞系）は、外因性組換えヒトＩＬ−１８に応答してＩＬ−１８ＲαおよびＩＬ−１８Ｒβ鎖を発現し、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）を産生することが示されている（Ｋｏｎｉｓｈｉ他（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０９（２）：１８７−１９１）。ＫＧ−１細胞（ＥＣＡＣＣ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；カタログ番号８６１１１３０６）を、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェル平底組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ；カタログ番号３５９６）中に、培養培地（５％ｖ／ｖの加熱不活化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ；カタログ番号１５１４０−１２２］を含有するＩＭＤＭ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ；カタログ番号２１９８０−０３２］）中で１０５個の細胞／１００μｌ／ウェルにおいてプレーティングした。ＩＬ−１８と相乗作用してＩＦＮγ産生を誘導することが示された組換え腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号２１０−ＴＡ）を、１．１ｎＭの最終濃度において添加した。抗体１ＩｇＧ２の効力を測定するため、Ｕ底９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ；カタログ番号６５０２０１）中で培養培地中で抗体の系列希釈物（７００ｎＭから０．１ｎＭの細胞アッセイにおける最終濃度）を作製することにより試験溶液を調製した。組換えヒトＩＬ−１８（インハウス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）をそれぞれのウェルに添加して３ｎｇ／ｍｌから８ｎｇ／ｍｌの細胞アッセイにおける最終濃度を得た。濃度は、最終濃度および１．１ｎＭのＴＮＦαの存在下で最大ＩＦＮγ分泌の約５０％増加を与える用量に基づき選択した。抗体１／ＩＬ−１８混合物を室温において３０〜４５分間インキュベートしてから１００μｌの試料を上記のとおり調製したＫＧ−１細胞に移した。細胞を加湿雰囲気中で３７℃／５％ＣＯ２中で２２〜２４時間インキュベートした後、１５０μｌの上清をそれぞれのウェルから回収し、ＩＦＮγの濃度を下記のとおり測定した。
簡潔に述べると、Ｎｕｎｃ（商標）黒色９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ；カタログ番号４３７１１１）を、４μｇ／ｍｌの捕捉抗ＩＦＮγ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；カタログ番号５５１２２１；クローンＮＩＢ４２）により一晩コーティングした。次いで、プレートをＰＢＳにより洗浄し、それぞれのウェル中で３％のミルク粉末（Ｍａｒｖｅｌ）を含有する２００μｌのＰＢＳによりブロッキングすることにより非特異的結合を防止した。プレートを室温において１時間インキュベートし、ＰＢＳにより３回洗浄した。次いで、ウェルを、１００μｌの１／２に希釈した実験試料または標準曲線（濃度範囲４００００〜３９ｐｇ／ｍｌ）を確立するために使用する系列希釈した組換えヒトＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号２８５−ＩＦ）により充填した。これらの試料を室温において１時間インキュベートし、次いで０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中でプレートを３回洗浄した。プレートへのＩＦＮγ結合を検出するため、１００μｌのビオチン化抗ＩＦＮγ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；カタログ番号５５４５５０；クローン４Ｓ．Ｂ３）を１μｇ／ｍｌの最終濃度において添加し、室温において１時間インキュベートした。０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中でプレートを３回洗浄した後、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ；カタログ番号４００２−００１０）中で１／１０００に希釈した１００μｌのＤＥＬＦＩＡ（登録商標）Ｅｕ−標識ストレプトアビジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ；カタログ番号１２４４−３６０）を添加した。プレートを室温において１時間さらにインキュベートし、次いでＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ；カタログ番号１２４４−１１４）を使用して７回洗浄した。１００マイクロリットルのＤＥＬＦＩＡ増強溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ；カタログ番号４００１−００１０）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを室温において暗所で１０分間インキュベートした。次いで、解離増強時間分解蛍光を計測するＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を使用してそれぞれのウェル中の応答を測定した。
実験データは、抗体の不存在下でＩＬ−１８により刺激したＫＧ−１細胞について得られたユウロピウムカウント数を使用して正規化し、ＩＦＮγ放出の５０％を阻害する抗体の濃度（ＩＣ５０）を測定した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して、４パラメータロジスティック式（セクション１．４の式３）を使用する曲線フィッティングにより算出した。
精製ＩｇＧ２として試験した場合の抗体１のＩＣ５０は、２５８ｎＭであった（幾何平均、ｎ＝４，９５％ＣＩ：１２１〜５５０ｎＭ）。
１．８ 表面プラズモン共鳴を使用するＩＬ−１８への抗体１ＩｇＧ２の結合親和性の測定。
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）バイオセンサ装置を使用して抗体１と組換え発現ヒトＩＬ−１８との相互作用のキネティックパラメータを評価した。これらの実験は、本質的にはＫａｒｌｓｓｏｎ他（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５（１−２）：２２９−２４０により記載のとおり実施した。
バイオセンサは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学効果を使用して、バイオセンサチップのデキストラン層に共有結合しているリガンド分子上を流動させる分析物分子の相互作用から生じる表面濃度の変化を試験する。典型的には、規定濃度の分析物種をカップリングさせたリガンド上に通過させ、任意の結合を局所的なＳＰＲシグナルの増加（会合相）として検出する。これに緩衝液流動の期間が続き、この間、表面固定化リガンドからの分析物種の解離をシグナルの減少（解離相）として観察することができる。次いで、残留分析物をチップ結合リガンドからストリッピングし、この手順をいくつかの異なる分析物濃度において繰り返すことができる。実験は、カップリングさせたリガンドの絶対結合能もキネティックプロファイルも、実験全体の間に顕著に変化せず、実験を通して用いられる一連の対照を使用してモニタリングすることができるように設計する。ＥＤＴＡを含有する特許ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ−ＥＰ＋；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を分析物試料のための希釈緩衝液として、および解離相の間の流動緩衝液として典型的に使用する。実験データは、「共鳴単位」（ＲＵ）として記録し、それは、経時的なＳＰＲシグナルに直接対応する任意の単位である。ＲＵは、チップ表面上の屈折率の変化に直接比例し、同様にそれは結合した分析物の質量のおおよその尺度である。次いで、特許ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアパッケージを使用してデータを処理し、結合モデルをデータセットにフィットさせることができる。戻り会合（ｋａ；Ｍ−１ｓ−１）および解離（ｋｄ；ｓ−１）速度定数は、解離（ＫＤ；Ｍ）親和性定数の算出を可能とする。
抗体１ＩｇＧ２とＩＬ−１８分析物との結合の親和性を、約６００ＲＵの最終表面密度に特許ＣＭ３チップ表面へのアミン連結により抗体を共有結合させるアッセイを使用して推定した。チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２の対にした１５秒間のインジェクションによるサイクルの間に再生して抗体に結合したＩＬ−１８を除去した。再生は、抗体結合活性の顕著な損失をもたらさなかった。
組換えヒトＩＬ−１８の一連の希釈物（０．４〜２００ｎＭ）を、正確に１：１結合モデルにフィットすることができるセンサグラムを観察するために十分な時間量について抗体１ＩｇＧ２上を連続的に通過させた。ブランク参照フローセルデータは、それぞれのＩｇＧデータセットから差し引き、ゼロ濃度緩衝液ブランクは、主データセットから差し引いた二重参照であっていかなる緩衝液アーティファクトまたは（最小）非特異的結合効果も低減させた。次いで、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアを使用してそれぞれの分析物タイター測定からのデータに１：１ラングミュアモデルを同時にフィットさせた。
データの妥当性は、算出されたカイ２乗およびＴ値（パラメータ値／オフセット）を使用して評価し、その最小許容値は＜２および＞１００にそれぞれ拘束され、残留物を使用するフィットの全体的成功について評価した（＜２ＲＵ）。
組換えヒトＩＬ−１８を分析物として使用すると、抗体１ＩｇＧ２会合定数（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）および親和性定数（ＫＤ）は、それぞれ７．３５×１０５Ｍ−１ｓ−１、７．３２×１０−３ｓ−１および９．９６ｎＭであった。
１．９ 表面プラズモン共鳴バイオセンサを使用する抗体１ＩｇＧ２の結合特異性の分析
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００バイオセンサ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、抗体１ＩｇＧ２と一連の組換え発現ＩＬ−１８タンパク質およびＩＬ−１８生物学に関連するタンパク質との相互作用の特異性を評価した。
抗体１と分析物タンパク質との結合相互作用は、抗体１を約６００ＲＵの最終表面密度にＣＭ３チップ表面へのアミン連結により抗体を共有結合させるアッセイを使用して分析した。ランニング緩衝液中で希釈した２００ナノモル濃度溶液の組換えヒトＩＬ−１８、アカゲザルＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号２５４８−ＲＭ）、ラットＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号５２１−ＲＬ−０２５）、ヒトＩＬ−１ベータ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号２０１−ＬＢ）またはヒトＩＬ−１Ｆ７／ＦＩＬ１ゼータ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号１９７５−ＩＬ−０２５）を、チップ表面上にインジェクトした。その後、チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２の対にしたインジェクションによるサイクルの間に再生して抗体に結合したＩＬ−１８を除去した。
抗体１に提示されたタンパク質のうち、ＩｇＧがヒトおよびアカゲザルＩＬ−１８にのみ選択的に結合することが観察された。組換えラットＩＬ−１８もヒトＩＬ−１ベータもヒトＩＬ−１Ｆ７／ＦＩＬ１ゼータも顕著な結合は観察されなかった。
１．１０ ＩＬ−１８結合タンパク質エピトープ競合アッセイにおける抗体１の特性決定
抗体１がヒトＩＬ−１８へのヒトＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の結合を阻害し得るか否かを決定するため、エピトープ競合アッセイを開発した。精製ｓｃＦｖまたはＩｇＧ２としての希釈系列の抗体１を、ｓｃＦｖについて４８９３ｎＭから４１．４ｐＭ、ＩｇＧ２について９８７ｎＭから１６．８ｐＭの範囲で調製した。１０マイクロリットルのそれぞれの希釈物を、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ；カタログ番号３６７６）中に移した。別個に、１．７３ｎＭのクリプテート標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｃｉｓ Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｂａｇｏｌｓ−ｓｕｒ−Ｃｅｚｅ，フランス；カタログ番号６１ＦＧ２ＫＬＢ）を、ＦＬＡＧおよびＨｉｓタグを含有する３．２ｎＭのバキュロウイルス産生ＩＬ−１８（インハウス）と合わせた。５マイクロリットルのこの混合物を、抗体１ｓｃＦｖまたはＩｇＧ２を有するアッセイプレートに添加した。ヒトＩＬ−１８ＢＰａ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号１１９ＢＰ）を、ＥＺ ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ；カタログ番号２１３３５）をｐＨ８のＰＢＳ中で使用して遊離アミンを介してビオチン化した。０．８ｎＭのビオチン化ＩＬ−１８ＢＰａ−Ｆｃを、２０ｎＭのストレプトアビジンＸｌｅｎｔ！（Ｃｉｓ Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．カタログ番号６１１ＳＡＸＬＢ）と合わせ、５μｌのこの溶液をアッセイプレートに添加した。
非特異的結合は、ヒトＩＬ−１８（インハウスで生成）を２５ｎＭの最終濃度で使用して規定した。全ての希釈は、０．４ＭのＫＦおよび０．１％のＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（アッセイ緩衝液）中で実施した。
アッセイプレートを室温において４時間インキュベートし、次いで４℃において一晩インキュベートしてから、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光波長における時間分解蛍光を読み取った。結果は、セクション１．３および１．４に記載の式を使用して算出した。
精製ｓｃＦｖ抗体１の調製物は、２４４６ｎＭにおいて８６％の平均阻害率を生成した。抗体１のＩｇＧ２調製物は、このアッセイにおいて４９３ｎＭにおいて６８％の平均阻害率を生成した（図３）。
実施例２
抗体最適化
２．１ 標的化突然変異導入による抗体１の最適化
標的化突然変異導入アプローチおよび親和性ベースファージディスプレイ選択を使用して、ヒトおよびアカゲザルＩＬ−１８の両方に対する親和性の改善のために抗体１を最適化した。抗体１に由来するラージｓｃＦｖ−ファージライブラリーを、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ（２００４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，２００４．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓにより記載される標準的分子生物学的技術を使用して可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）のオリゴヌクレオチド指向突然変異導入により作出した。
ライブラリーを、親和性ベースファージディスプレイ選択に供して、ＩＬ−１８の組換えヒトおよびアカゲザル形態についてより高い親和性を有する変異体を選択した。選択は、本質的には、既に記載されているとおり実施した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５６：７７−８８）。簡潔に述べると、ｓｃＦｖファージ粒子を溶液中の組換えビオチン化組換えヒトＩＬ−１８（ｂｉｏ−ｈｕＩＬ−１８、インハウス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）とインキュベートした。次いで、抗原に結合したｓｃＦｖ−ファージを、製造業者の推奨に従ってストレプトアビジンコート常磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ；Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ２８０）上で捕捉した。次いで、選択されたｓｃＦｖ−ファージ粒子を既に記載されているとおりレスキューし（Ｏｓｂｏｕｒｎ他（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２（３）；１８１−９６）、選択プロセスを減少濃度のビオチン化ヒトＩＬ−１８（３ラウンドにわたり２５ｎＭから５００ｐＭ）の存在下で繰り返した。このプロセスは、生化学的エピトープ競合アッセイ（セクション２．３）およびＫＧ−１細胞アッセイ（表１）において改善された効力を有する抗体２、抗体３、抗体４および抗体５の単離をもたらした。
親和性ベース選択の３ラウンドの競合時、ＶＨおよびＶＬランダム化ライブラリーを組換えて、クローンがランダムに対合した個々にランダム化されたＶＨおよびＶＬ配列を含有する単一ライブラリーを形成した。次いで、選択を、減少濃度のビオチン化ヒトＩＬ−１８（さらなる３ラウンドにわたり５００ｐＭから２０ｐＭ）の存在下で上記のとおり継続し、改善されたクローン抗体６および抗体７の単離をもたらした。
２．２ ランダム突然変異導入によるリード抗体の最適化
組換えヒトおよびアカゲザルＩＬ−１８への結合を改善し得るｓｃＦｖ可変ドメイン内の重要な残基を同定するためのランダム突然変異導入アプローチを使用して、抗体６および抗体７をさらに最適化した。抗体６および７の可変領域全体にわたるランダム突然変異の導入によりラージｓｃＦｖ−リボソームディスプレイライブラリーを生成した。この生成は、Ａ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（商標）ＰＣＲランダム突然変異導入キット（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ；カタログ番号６３０７０３）を製造業者の指示書に従って使用する２ラウンドの突然変異導入により達成して、突然変異導入１ラウンド当たり核酸配列の１キロベース当たり平均８．１個の突然変異を取り込んだ。選択は、本質的には、既に記載されているとおり実施した（Ｈａｎｅｓ他（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２８：４０４−４３０）。簡潔に述べると、標的化ＣＤＲ３ランダム化戦略から同定した２つのリードクローン（抗体６および抗体７）のランダム突然変異導入ライブラリーを、ｍＲＮＡに転写し、続いてプールして１つのライブラリーを作出した。翻訳停止のプロセスを使用して、ｍＲＮＡ−リボソーム−ｓｃＦｖ複合体を形成した（Ｈａｎｅｓ Ｊ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ Ａ．（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９７年５月 １３；９４（１０）：４９３７−４２）。次いで、これらの複合体を、減少濃度のビオチン化ヒトＩＬ−１８またはビオチン化アカゲザルＩＬ−１８（３ラウンドにわたり１ｎＭから３０ｐＭ）の存在下でインキュベートする３ラウンドの選択に供して、ＩＬ−１８のヒトおよびアカゲザル形態の両方についてより高い親和性を有する変異体について選択した。次いで、抗原と結合したそれらの複合体をストレプトアビジンコート常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））上で捕捉した。非特異的リボソーム複合体を洗い流し、結合したリボソーム複合体からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写し、次いでＰＣＲにより増幅した。このＤＮＡを次のラウンドの選択に使用し、および／またはスクリーニングのためにクローンアウトした。リボソームディスプレイ構築物をＮｃｏ１／Ｎｏｔ１制限エンドヌクレアーゼにより消化し（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ）、次いでＮｃｏ１／Ｎｏｔ１消化ｐＣＡＮＴＡＢ６中にＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ）（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４７：１５７−１７１，）を使用してライゲートすることにより、リボソームディスプレイにより単離されたｓｃＦｖをファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ６中にクローニングした。
この最適化戦略は、改善されたクローン抗体９および抗体１０の単離をもたらした。
さらなる点突然変異を抗体７、抗体９および抗体１０中に部位特異的突然変異導入により導入し、抗体８ＧＬ、抗体１１、抗体１１ＧＬおよび抗体１２ＧＬをもたらした。これらの点突然変異は、ＨＣＤＲ１（Ｓｅｒ３１Ａｌａ）およびＨＣＤＲ２（Ｉｌｅ５１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ６５Ｇｌｙ）中のものであった。
２．３ エピトープ競合アッセイを使用する改善されたクローンの同定
セクション２．１に記載の標的化突然変異導入アプローチからの選択ラウンド２および３からランダムに選択された８８０個のｓｃＦｖを細菌中で発現させ、未精製ｓｃＦｖをエピトープ競合ＨＴＲＦ（商標）アッセイフォーマット中でスクリーニングした。このアッセイにおいて、未精製ｓｃＦｖは、ユウロピウムクリプテート標識ヒトＩＬ−１８（インハウス）への結合について抗体１ＩｇＧ２と競合した。組換えヒトＩＬ−１８のユウロピウムクリプテート標識は、トリスビピリジン−Ｅｕ３＋−クリプテート−４−カルボキシ−４’−（マレイミドプロピオンアミド−２−アミノエチル−アミノカルボニル）（Ｃｉｓ ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス，バニョル・シュル・セズ（Ｂａｇｎｏｌｓ−ｓｕｒ−Ｃｅｚｅ）；カタログ番号６５ＥＵＭＡＢＡ）を中性ｐＨのＰＢＳ中で使用して達成した。選択産物は、５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．４、０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５Ｍのスクロース中で調製された未精製ｓｃＦｖを含有する未希釈または希釈ペリプラズム抽出物としてスクリーニングし、０．４ＭのＫＦおよび０．１％のＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（アッセイ緩衝液）中で希釈した。２４ナノモル濃度の抗体１ＩｇＧ２および３０ｎＭの抗ヒトＦｃＸＬ６６５（Ｃｉｓ Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，フランス，バニョル・シュル・セズ（Ｂａｇｎｏｌｓ−ｓｕｒ−Ｃｅｚｅ）；カタログ番号６１ＨＦＣＸＬＡ）を、アッセイ緩衝液中で一緒に希釈した。１０マイクロリットルのこの溶液をＣｏｓｔａｒ（登録商標）３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ；カタログ番号３６７６）に移した。５マイクロリットルの未精製ｓｃＦｖをアッセイプレートに添加し、次いで１．２ｎＭに希釈したユウロピウムクリプテート標識組換えヒトＩＬ−１８を添加した。非特異的結合は、モノクローナルマウス抗ヒトＩＬ−１８クローン１２５−２Ｈ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を２０ｎＭの最終濃度において使用して測定した。アッセイプレートを室温において３時間インキュベートしてから、セクション１．３に記載のとおりＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を使用して６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの発光波長における時間分解蛍光を読み取った。データは、セクション１．３に記載の式を使用して特異的結合％として算出した。顕著な阻害特性を示し、抗体１ＩｇＧ２がＩＬ−１８に結合するのを妨げるｓｃＦｖを、ＤＮＡシーケンシングに供し、特有の配列を有するｓｃＦｖを精製調製物として調製した。
精製ｓｃＦｖ抗体の効力は、上記の抗体１ＩｇＧ２エピトープ競合アッセイにおいて同一条件を使用して希釈系列の精製ｓｃＦｖ調製物を試験することにより測定した。抗体２、抗体３、抗体４および抗体５の精製ｓｃＦｖ調製物は、抗体１ＩｇＧ２とユウロピウムクリプテート標識ヒトＩＬ−１８との相互作用をそれぞれ０．５、０．６、０．６および０．１７ｎＭ（ｎ＝１）のＩＣ５０値で阻害した。
組換え後標的化突然変異導入選択からのスクリーニングは、上記と同一のエピトープ競合アッセイを使用したが、但しユウロピウムクリプテート標識ＩＬ−１８濃度を０．２ｎＭの最終アッセイ濃度に低減させた。このアッセイを使用して改善されたクローンを同定し、それらをセクション２．４に記載のＫＧ−１機能細胞アッセイにおける直接プロファイリングのために事前に取り出した。このアプローチから、抗体６および抗体７を改善されたｓｃＦｖとして同定した。これらのリード抗体をさらに最適化するため、ランダム突然変異導入アプローチをセクション２．２に記載のとおり続けた。
ランダム突然変異導入選択からのｓｃＦｖを細菌中で発現させ、未精製ｓｃＦｖをＨＴＲＦ（商標）エピトープ競合アッセイフォーマット中でスクリーニングした。このアッセイは、生殖細胞系列化（ＧＬ）抗体６ＩｇＧ２（セクション２．７に記載のＩｇＧの生殖細胞系列化）へのユウロピウムクリプテート標識ＩＬ−１８の結合を阻害する未精製ｓｃＦｖの能力を試験した。上記と同一のフォーマットを使用したが、但し抗体１ＩｇＧ２を１２ｎＭの最終濃度の抗体６ＧＬＩｇＧ２に置き換え、ユウロピウムクリプテート標識組換えヒトＩＬ−１８を０．２ｎＭの最終濃度において使用した。このアッセイにおいて非特異的結合を規定するため、抗体６ＧＬＩｇＧ２を対照ウェルから排除した。
ランダム突然変異導入選択のスクリーニングから同定されたヒットをランク付けし、最良のｓｃＦｖをシーケンシングおよび精製した。ｓｃＦｖの効力を測定するため、希釈系列の精製ｓｃＦｖを上記のとおり抗体６ＧＬＩｇＧ２エピトープ競合アッセイにおいて試験した。抗体９および抗体１０の精製調製物は、抗体６ＧＬＩｇＧ２とユウロピウムクリプテート標識組換えヒトＩＬ−１８との相互作用を、それぞれ５．２および５．７ｎＭ（ｎ＝１）のＩＣ５０値で阻害した（図４）。
２．４ ＩＬ−１８により刺激したＫＧ−１細胞によるＩＦＮ□産生の最適化クローン（ｓｃＦｖ）による阻害
標的化突然変異導入およびランダム突然変異導入により生成した精製最適化ｓｃＦｖ抗体の効力も、ヒトおよびアカゲザルＩＬ−１８をアゴニストとして使用するＩＦＮγ放出ＫＧ−１細胞アッセイにおいて測定した。アッセイは、セクション１．７に記載のとおり設定した。一部の実験において、ヒトＩＬ−１８を組換えアカゲザルＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ；カタログ番号２５４８−ＲＭ／ＣＦ）により置き換え、４ｎｇ／ｍｌの最終濃度において使用した。ｓｃＦｖを、１００ｎＭから０．０３ｎＭの最終濃度範囲において試験した。精製ｓｃＦｖ抗体についての効力の例を表１に提供する。抗体７、抗体９および抗体１０ｓｃＦｖについての代表的データを図５に示す。
２．５ ｓｃＦｖのＩｇＧ２およびＩｇＧ１ＴＭへの再フォーマット化
完全ヒト抗体重鎖および軽鎖をそれぞれ発現するベクター中に可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをサブクローニングすることにより、ｓｃＦｖをＩｇＧ２に再フォーマット化した。哺乳動物細胞中で完全ＩｇＧ２重鎖を発現させるためのヒト重鎖定常ドメインおよび調節エレメントを含有する哺乳動物発現ベクター（ｐＥＵ９．２）中に可変重鎖をクローニングした。同様に、哺乳動物細胞中で完全ＩｇＧ軽鎖を発現させるためのヒトカッパ軽鎖定常ドメインおよび調節エレメントの発現のための哺乳動物発現ベクター（ｐＥＵ３．４）中に可変軽鎖ドメインをクローニングした。抗体をＩｇＧ２として得るため、重鎖および軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ哺乳動物細胞中に一過的に形質移入し、抗体を発現させ、培地中に分泌させた。回収した培地を精製前に遠心分離により澄明化した。ＩｇＧは、プロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。培養上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ ｐＨ８緩衝液中で事前に平衡化した１ｍｌカラム上にロードした。０．１ＭのシトレートｐＨ３を使用してカラムから１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ１０中にＩｇＧを直接溶出させた。溶出物は、ＮＡＰ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１ｘＤＰＢＳへの緩衝液交換に付した。精製ＩｇＧは、０．２マイクロメートル滅菌濾過し、内毒素について分析し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより特性決定し、２８０ｎｍにおける吸光度により濃度測定した。
抗体１２ＧＬも、定常ドメイン内に３つの単一アミノ酸置換（ＴＭ）を含有するヒトＩｇＧ１アイソタイプに変換した（［ＩｇＧ１ＴＭ］；Ｏｇａｎｅｓｙａｎ他（２００８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４（Ｐｔ６）：７００−４）。簡潔に述べると、ＩｇＧ軽鎖遺伝子は、抗体可変ドメイン配列に融合している分泌リーダー配列およびヒトカッパＫｍ３定常ドメイン配列から構成した。ＩｇＧ重鎖遺伝子は、ＴＭ改変を有するヒトガンマ１（ｆ）定常ドメイン配列を有する抗体可変ドメインに融合している分泌リーダー配列から構成した。軽鎖および重鎖遺伝子をコードするＤＮＡ配列を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中での高レベル発現について最適化して（配列番号１７０および１７１参照）（Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からそれぞれ発現カセットベクターｐＥＥ１２．４およびｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）中にＤＮＡクローニングした。次いで、フランキング転写調節配列を含む抗体重鎖遺伝子を抗体軽鎖プラスミド中に挿入して二重抗体遺伝子、タンデムベクター（ｐＣＬＤ−１１２８）（図１５参照）を作出した。ｐＣＬＤ−１１２８プラスミドを線形化し、既知組成培地（ＣＤ−ＣＨＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中での懸濁液培養において成長するように事前に適合させたＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）をＣＨＯ宿主細胞系中に形質移入した。ＣＨＯゲノム中に統合させたｐＣＬＤ−１１２８プラスミドのコピーを含有する形質移入体を、メチオニンスルホキシミンを含有するグルタミン不含ＣＤ−ＣＨＯ培地中での成長により選択した。
高収量の抗体を発現するプールを選択し、拡張させてフェドバッチ産生培養物を接種した。接種後約１４日目、培養回収物を遠心分離および／または濾過により澄明化して細胞および細胞デブリスを除去した。次いで、得られた培養上清から、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより抗体を回収し、次いで好適な緩衝液にＰＤ１０緩衝液交換した。
２．６ ＩＬ−１８により刺激したＫＧ−１細胞によるＩＦＮγ産生の最適化クローン（ＩｇＧ）による阻害
ＫＧ−１細胞アッセイにおける最も強力なｓｃＦｖクローンを、上記のとおり（セクション２．５）ＩｇＧに変換し、この細胞アッセイにおいて２０ｎＭから０．００２ｎＭの最終濃度範囲において再試験した。精製ＩｇＧ抗体についての効力の例を表２に提供する。
２．７ 生殖細胞系列化
抗体１および親和性最適化抗ＩＬ−１８抗体のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を、ＶＢＡＳＥデータベース（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２２４：４８７−４９９）中の既知のヒト生殖細胞系列配列にアラインし、最も近縁な生殖細胞系列を配列類似性により同定した。最適化抗体系列のＶＨドメインについて、これはＶｈ４＿ＤＰ−６６＿（４−６１）であった。ＶＬドメインについて、これはＶκ１＿Ｌ１２であった。不変のままであったバーニア残基（Ｆｏｏｔｅ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２４（２）：４８７−９９）を除き、生殖細胞系列化プロセスは、ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク残基を最も近縁な生殖細胞系列配列に復帰させて同等にヒト抗体に適合させることであった。産生した全ての抗体のＶＨおよびＶＬドメイン配列を表１２および１３に示す。これらのアミノ酸残基の生殖細胞系列化は、適切な突然変異導入プライマーを用いる標準的な部位特異的突然変異導入技術を使用して実施した。次いで、ランダム突然変異導入戦略からＣＤＲ中に導入された変化を完全に生殖細胞系列化された骨格中に導入した。次いで、ＩｇＧ２またはＩｇＧ１ＴＭフォーマットの生殖細胞系列化抗体を、ＫＧ−１細胞アッセイにおいて再評価して効力の顕著な低減が存在しなかったことを確認した。生殖細胞系列化（ＧＬ）抗体の効力の例を表３に提供する。抗体８ＧＬ、抗体１１ＧＬおよび抗体１２ＧＬＩｇＧの代表的データを図６に示す。
２．８ ＬＰＳおよびＩＬ−１２により刺激したヒトＰＢＭＣによるＩＦＮγ産生の生殖細胞系列化最適化クローン（ＩｇＧ）による阻害
生殖細胞系列化ＩｇＧを、組換えヒトおよびアカゲザルＩＬ−１８を阻害するそれらの効力の他、内因的に産生されるＩＬ−１８を中和するそれらの能力について試験した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒト軟膜血液またはカニクイザル血液から精製し、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ；カタログ番号Ｌ−６１４３）および組換えヒトＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ；カタログ番号２１９−ＩＬ）により刺激して、ＩＬ−１８依存性機構を介してＩＦＮγ放出を誘発した。内因性ＩＬ−１８にアンタゴナイズし、結果的にＩＦＮγ産生を遮断する最適化生殖細胞系列化ＩｇＧの能力を、このアッセイにおいて評価した。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを培養培地（１０％ｖ／ｖの熱不活化ＦＢＳ［ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１２０７６Ｃ］、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ；カタログ番号１５１４０−１２２］を含有するＲＰＭＩ−１６４０［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ；カタログ番号６１８７０−０１０］）中で、３００ｇにおける遠心分離により１０分間洗浄した。ＰＢＭＣを培養培地中で再懸濁し、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェル平底組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ；カタログ番号３５９６）中に、４×１０５個の細胞／１００μｌ／ウェル（抗体８ＧＬＩｇＧ２、抗体１１ＬＩｇＧ２および抗体１２ＧＬＩｇＧ２の評価について）または２×１０５個の細胞／１００μｌ／ウェル（抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭについて）においてプレーティングした。最適化生殖細胞系列化ＩｇＧの効力を測定するため、Ｕ底９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ；Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ；カタログ番号６５０２０１）中の培養培地中でＩｇＧの系列希釈物（２．５ｐＭから１６．７ｎＭの細胞アッセイにおける最終濃度）を作製することにより試験溶液を調製した。５０マイクロリットルのこれらの溶液を、ＰＢＭＣを含有するプレートのウェルに移した。内因性ＩＬ−１８の産生を誘発するため、次いでＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ；カタログ番号Ｌ−６１４３）および組換えヒトＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ；カタログ番号２１９−ＩＬ）（両方１ｎｇ／ｍｌ最終）の５０μｌの混合物を添加することにより細胞を刺激した。細胞を加湿雰囲気中で３７℃／５％ＣＯ２において２４時間インキュベートした後、１５０μｌの上清をそれぞれのウェルから回収し、ＩＦＮγの濃度をセクション１．７に記載のとおり測定した。
抗体の不存在下でＬＰＳおよびＩＬ−１２により刺激したＰＢＭＣについて得られたユウロピウムカウント数を使用して実験データを正規化し、ＩＦＮγ放出の５０％を阻害する抗体の濃度（ＩＣ５０）を測定した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して４パラメータロジスティック式（セクション１．４の式３）を使用する曲線フィッティングにより算出した。
このアッセイにおける生殖細胞系列化（ＧＬ）抗体についての効力の例を、表４に提供する。ヒトおよびカニクイザルＰＢＭＣに基づくアッセイにおける抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭについての代表的データを図７に示す。
２．９ 抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭによる一次好中球上のＩＬ−１８誘導性ＣＤ１１ｂ上方調節の阻害
ＣＤ１１ｂは、活性化の間に好中球上で上方調節されることが示されている。これらの細胞は、多数の炎症性障害において重要な役割を担い、インビトロＩＬ−１８誘導性ＣＤ１１ｂ上方調節を阻害する抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭの能力をフローサイトメトリーにより測定した。
新たな末梢血を健常ヒトボランティアから得、等容量の２．４％のデキストラン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号１７−０３２０−０１）を血液に添加し、反転により十分に混合した。次いで、赤血球を１時間沈降させた。次いで、パーコールを１０×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｉｓｌｅｙ ＵＫ；カタログ番号１４２０００５９）により９：１に希釈することにより不連続パーコール勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号１７−０８９１−０１）を調製して１００％の原液を作製した。この原液をさらに１ｘＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｉｓｌｅｙ ＵＫ；カタログ番号１４１９０）により希釈して７２％溶液および６７％溶液を形成した。次いで、３ミリリットルの７２％溶液を１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ（登録商標）チューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ；カタログ番号３５２０９６）に添加し、３ｍｌの６２％溶液を７２％溶液上に層状化させた。赤血球枯渇後、赤血球枯渇細胞懸濁液を１５ｍｌチューブ中で６２％溶液の頂部上に層状化させた。これらのチューブを、ブレーキをかけずに１１３８×ｇにおいて２０分間遠心分離した。顆粒球層を、７２％および６２％のパーコールの界面からＰＢＳを含有する新たな５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ（登録商標）チューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ；カタログ番号３５２０７０）中に取り出し、次いで３００ｘｇにおいて１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、顆粒球を５０ｍｌのＰＢＳ中で再懸濁し、トリパンブルー排除色素を使用してカウントした。次いで、顆粒球を２００ｘｇにおいて５分間ペレット化し、刺激緩衝液（ＲＰＭＩ−１６４０［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｉｓｌｅｙ ＵＫ；カタログ番号６１８７０］および２％のＢＳＡ［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ；カタログ番号Ａ９５７６］）中で１〜２×１０６／ｍｌにおいて再懸濁した。１００マイクロリットルの細胞懸濁液を丸底９６ウェルポリスチレン組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ；カタログ番号６５０２０１）のウェル中に分注した。次いで、添加５分前に事前混合した抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭ（２．５５ｐＭから１６．７ｎＭの範囲）および２．７８ｎＭの組換えヒトＩＬ−１８（インハウス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）のタイター測定物を含有する１００μｌの溶液により細胞を処理した。プレートを加湿５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃において２時間インキュベートした。
次いで、細胞を３００ｘｇにおいて４℃で３分間遠心分離することによりペレット化し、上清を排除した。細胞を１５０μｌのＰＢＳ中で再懸濁し、再度遠心分離した。次いで、細胞を、０．１μｇのＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ヒトＣＤ１１ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ；カタログ番号１１−０１１８、クローンＩＣＲＦ４４）を含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳを有するＰＢＳ）中で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を１５０μｌの氷冷ＰＢＳ中で、３００ｘｇにおいて４℃の３分間の遠心分離により２回洗浄してから１５０μｌのＰＢＳ中３．７％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ；カタログ番号Ｆ１６３５−１ＧＡ）中で固定した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）を使用してＣＤ１１ｂ発現のモジュレーションを測定した。好中球を、それらの特徴的な前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）特性により同定した。対応する集団をゲーティングし、ＦＬ−１チャネル（励起波長４８８ｎｍ、フィルター５３０／３０）中で蛍光を分析してＣＤ１１ｂ発現レベルを評価した。
抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭは、ヒト好中球上のＣＤ１１ｂのＩＬ−１８誘導性上方調節を、２．０３２ｎＭ（９５％ＣＩ：１．０２１〜４．０４６ｎＭ；ｎ＝７）の幾何平均ＩＣ５０で阻害し得た（図８）。
２．１０ 一次好中球によるＩＬ−１８誘導性活性酸素種産生の抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭによる阻害
適切な同時刺激物質、例えばホルミル化ペプチドの存在下、ＩＬ−１８は好中球による多数の炎症性促進メディエーター、例として活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を促進することが示された（Ｅｌｂｉｎ他（２００５）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３）：４３６−４６）。好中球によるホルミルペプチド誘導性ＲＯＳ産生のＩＬ−１８誘導性増強をインビトロで阻害する抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭの能力を、フローサイトメトリーにより評価した。
セクション２．９に記載のとおりヒト血液から好中球を単離した後、細胞を１×１０６個／ｍｌにおいて１．５μｇ／ｍｌのＲＯＳ感受性色素ヒドロエチジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ ＵＫ；カタログ番号Ｄ１１３４７）を含有するＲＰＭＩ−１６４０中で再懸濁し、加湿５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃において１５分間インキュベートした。次いで、細胞を３００ｘｇにおいて５分間遠心分離によりペレット化し、上清を除去し、２％のＢＳＡを有する５０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中で再懸濁した。１回のさらなる遠心分離後、細胞を２％のＢＳＡを有するＲＰＭＩ−１６４０中で３〜５×１０６個／ｍｌの濃度において最後に再懸濁した。５０マイクロリットルのこの細胞懸濁液を９６ウェルポリスチレン組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ；カタログ番号６５０２０１）中にプレーティングした。次いで、添加５分前に事前混合した抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭ（２．５５ｐＭから１６．７ｎＭの範囲）および２．７８ｎＭの組換えヒトＩＬ−１８（インハウス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）のタイター測定物を含有する１００μｌの溶液により細胞を処理した。プレートを加湿５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃において２時間インキュベートした。次いで、細胞を４００ｎＭのｆＭＬＦＦ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号Ｈ−４２９４）を含有する２％のＢＳＡを有する５０μｌのＲＰＭＩ１６４０により刺激した。細胞を加湿５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃においてさらに１０分間インキュベートした。次いで、細胞を１５０μｌの氷冷ＰＢＳ中で、３００ｘｇにおいて４℃の３分間の遠心分離により２回洗浄してから１５０μｌのＰＢＳ中３．７％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ；カタログ番号Ｆ１６３５−１ＧＡ）中で固定した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）を使用してＲＯＳの産生を測定した。好中球を、それらの特徴的な前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）特性により同定した。対応する集団をゲーティングし、ＦＬ−２チャネル（励起波長４８８ｎｍ、フィルター５８５／４２）中で蛍光を分析してＲＯＳレベルを評価した。
抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭは、ヒト好中球におけるｆＭＬＦＦ誘導性ＲＯＳ産生のＩＬ−１８媒介性増強を、０．２００ｎＭ（ｎ＝２）の幾何平均ＩＣ５０で阻害し得た（図９）。
２．１１ 表面プラズモン共鳴を使用するＩＬ−１８への抗体８ＧＬおよび抗体１２ＧＬＩｇＧの結合親和性の測定。
上記セクション（セクション１．８）に詳述したとおりＢＩＡｃｏｒｅ２０００またはＴ−１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）バイオセンサ装置を使用して抗ＩＬ−１８抗体、抗体８ＧＬおよび抗体１２ＧＬと、組換え発現ヒトＩＬ−１８（インハウス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）またはアカゲザルＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ；カタログ番号２５４８−ＲＭ）との相互作用のキネティックパラメータを評価した。
本質的には、それぞれのＩｇＧとＩＬ−１８分析物との結合の親和性を、アミン連結によりＣＭ３またはＣＭ５チップにＩｇＧを共有結合し、組換えＩＬ−１８の希釈物（０．４〜２００ｎＭ）をチップ表面上で連続的に通過させることにより評価した（セクション１．８参照）。得られたデータを１：１ラングニュアモデル（同時ｋａｋｄ）にフィットさせ、平均値を表５に報告する。
２．１２ 細胞ベースアッセイを使用する抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭ親和性の薬理学的測定：ｐＡ２分析
競合アンタゴニストの親和性を定量するための主要な薬理学的ツールは、Ｓｃｈｉｌｄ分析である。このアプローチを使用して、機能アッセイにおけるアンタゴニスト親和性を推定する系非依存性手段を決定することができる。この方法は、アンタゴニスト濃度およびその親和性がアゴニスト応答のアンタゴニズムを決定するという概念に基づく。アンタゴニズムは定量することができ、アンタゴニストの濃度が既知であるため、アンタゴニストの親和性を測定することができる。このアンタゴニズムは、用量比（ＤＲ）と称される、アンタゴニストの存在下および不存在下で計測されるアゴニストの等活性（ｅｑｕｉａｃｔｉｖｅ）濃度の比を計測することにより定量する。
用量比は、結合メンバーの不存在下のアゴニスト（典型的にはＩＬ−１８）ＥＣ５０と、単一濃度の結合メンバーの存在下のアゴニストのＥＣ５０との比を取ることにより算出することができる。次いで、ｌｏｇ（ＤＲ−１）として表現する用量比を、ｌｏｇ［結合メンバー］に対する線形回帰において使用してＳｃｈｉｌｄ回帰をもたらすことができる。したがって、結合メンバーの濃度毎に、対応するＤＲ値が存在し；それらを、ｌｏｇ［結合メンバー］に対するｌｏｇ（ＤＲ−１）の回帰としてプロットする。アンタゴニズムが競合的である場合、式が
Ｌｏｇ（ＤＲ−１）＝ｌｏｇ［Ｂ］−ｌｏｇＫＢ
（式中、[Ｂ]は結合メンバーの分子濃度である）
であるＳｃｈｉｌｄ式に従ってｌｏｇ（ＤＲ−１）とｌｏｇ［結合メンバー］の間に線形関係が存在する。
これらの状況下では、縦座標の０の値は、ｌｏｇ［Ｂ］＝ｌｏｇＫＢであるｘ軸の切片を与える。したがって、ｌｏｇ（ＤＲ−１）＝０をもたらす結合メンバーの濃度は、ｌｏｇＫＢ、結合メンバー−受容体複合体の平衡解離定数に等しい。これは、結合メンバー親和性を推定するための系非依存性定量である。伝統的には、このアプローチを、受容体アンタゴニストの親和性を測定するために使用するが、リガンド中和に関する類似する想定に基づいて、用量比の算出は、細胞上でのＩＬ−１８活性を中和する結合メンバー親和性の推定も可能にすべきである。ＫＢ値は対数プロットから得られるため、それらは対数正規分布している。この特定の濃度の負の対数を、経験的にｐＡ２と呼び、これはアゴニスト用量応答曲線の２倍のシフトをもたらすアンタゴニストの濃度である。アンタゴニストの効力は、式
ｐＡ２＝ｌｏｇ（ＤＲ−１）−ｌｏｇ［Ｂ］
から用量比についての単一値をもたらす単一濃度のアンタゴニストからｐＡ２を算出することにより定量することができる。
［Ｂ］は、元の最大以下の応答を引き出すアゴニスト濃度を倍加するために必要であるアンタゴニストのモル濃度である。
ＤＲ＝用量比であり、アンタゴニストの存在下および不存在下で計測されたアゴニストの等量活性の濃度の比を計測することにより定量される。
ｐＡ２は、用量応答アッセイデータから算出することができる。
ｐＡ２法を使用してヒトＩＬ−１８についての抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭ親和性を測定するため、ＫＧ−１細胞をセクション１．７に記載のとおりプレーティングした。抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭの系列希釈物（２０ｎＭ、６．６６ｎＭ、２．２２ｎＭ、０．７４ｎＭ、０．２ｎＭおよび０の細胞アッセイにおける最終濃度）を培養培地中で調製し、細胞に添加した。組換えヒトＩＬ−１８の系列希釈物（４２ｎＭから０．２５ｐＭの細胞アッセイにおける最終濃度）も培養培地中で調製し、それぞれの抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭ濃度についてＩＬ−１８の用量範囲が試験されるように細胞に添加した。細胞を加湿雰囲気中３７℃／５％ＣＯ２において２２〜２４時間インキュベートした後、１５０μｌの上清をそれぞれのウェルから回収し、ＩＦＮγの濃度をセクション１．７に示すとおり測定した。一部の実験において、ヒトＩＬ−１８をアカゲザルＩＬ−１８により置き換え、種々の濃度の抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭ（６０ｎＭ、２０ｎＭ、６．６６ｎＭ、２．２２ｎＭ、０．７４ｎＭ、０．２５ｎＭおよび０の最終濃度）の存在下で１２５ｎＭから０．２５ｎＭの最終濃度において使用した。
実験データをプロットしてそれぞれの抗体濃度、ＫＧ−１細胞によるＩＦＮγ産生の５０％増加を誘発するために要求されるＩＬ−１８の量（ＥＣ５０）を決定した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して、４パラメータロジスティック式を使用する曲線フィッティングにより算出した。次いで、ＥＣ５０値および抗体濃度を使用してＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍにおいてＳｃｈｉｌｄプロットを作成し、上記のとおりｐＡ２およびＫＤ値を決定した。図１０は、抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭによるＫＧ−１細胞に対するヒトＩＬ−１８効果の用量依存性阻害の例ならびｐＡ２およびＫＤ値の決定を可能とする対応するＳｃｈｉｌｄプロットを示す。
ＫＧ−１細胞ベースアッセイを使用して抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭについて得られたｐＡ２およびＫＤ値を表６にまとめる。
２．１３ 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサを使用する抗体８ＧＬおよび抗体１２ＧＬの結合特異性の分析
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００またはＴ−１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）バイオセンサ装置を使用して抗ＩＬ−１８抗体、抗体８ＧＬおよび抗体１２ＧＬと、一連の組換え発現ＩＬ−１８および関連タンパク質との相互作用の特異性を評価した。
上記に詳述したとおり（セクション１．９）、それぞれのＩｇＧと種々の分析物との結合相互作用を、ＣＭ５チップへのアミン連結によりＩｇＧを共有結合させ、組換えタンパク質をチップ表面上に通過させるアッセイを使用して推定した。抗体８ＧＬおよび抗体１２ＧＬは、ヒトおよびアカゲザルＩＬ−１８に結合することが見出されたが、マウスＩＬ−１８への結合も、ラットＩＬ−１８への結合も、ヒトＩＬ−１Ｆ７への結合も、ヒトＩＬ−１βへの結合も示さなかった（表７）。
２．１４ ＩＬ−１８ＢＰエピトープ競合アッセイにおける抗体１２ＧＬの特性決定
精製抗体１２ＧＬＩｇＧ２の希釈系列物を調製して、抗体がＩＬ−１８とＩＬ−１８ＢＰとの結合相互作用を阻害し得るか否かを決定し、したがって抗体１２ＧＬが組換えヒトＩＬ−１８上のＩＬ−１８ＢＰと同一のコンフォメーショナルエピトープに結合したことを示し得るか否かを判定した。このアッセイはセクション１．１０に記載のとおり設定した。
結果は、セクション１．３および１．４に記載のものと同一の式を使用して算出した。
図１１に説明するとおり、抗体１２ＧＬＩｇＧ２は、０．２ｎＭ（９５％ＣＩ：０．１〜０．４ｎＭ、ｎ＝４）のＩＣ５０を生成した。
２．１５ ＩＬ−１８ＢＰへのＩＬ−１８結合の抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭによる阻害
ヒトＩＬ−１８への結合についての抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭとＩＬ−１８ＢＰとの競合の評価を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００またはＴ１００と類似の様式で作動するＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用してさらに評価した。この実験において、１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭまたはＩＬ−１８ＢＰａ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ；カタログ番号１１９−ＢＰ）の３つの異なる密度（２３０〜６３４０ＲＵの範囲）のアミン連結表面は、１００ｎＭ溶液（１０ＲＵから３３０ＲＵの最終密度）からヒトＩＬ−１８（インハウス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）を捕捉させ、次いで安定化させた。その後、さらなる抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭおよびＩＬ−１８ＢＰを１００ｎＭにおいて、捕捉されたＩＬ−１８上で通過させ、得られたセンサグラムを調査してそれらがＩＬ−１８への結合であるか否かを決定した。さらなる結合は、抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭまたはＩＬ−１８ＢＰａ−Ｆｃの組合せのいずれにおいても観察されなかった。このことは、抗体１２ＧＬＩｇＧ１ＴＭおよびＩＬ−１８ＢＰａがＩＬ−１８上の重複するエピトープを有する指標を提供する。
実施例３
結晶学的試験
３．１ ヒトＩＬ−１８および抗体１２ＧＬＦａｂ断片の精製
ヒトＩＬ−１８構築物、セクション１．１に挙げたＨｉｓ−ＧＳＴ−ＩＬ−１８を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で可溶性発現に付した。タンパク質は、標準的な親和性クロマトグラフィーにより精製し、次いでＸａ因子開裂した。次いで、開裂したタンパク質をアニオン交換クロマトグラフィーおよび標準的な親和性クロマトグラフィーにより精製していかなる汚染開裂タグも除去し、次いで結晶解析のために遠心分離濃縮デバイスを使用してタンパク質を濃縮した。
抗体１２ＧＬＩｇＧを馴化培地からＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）への吸着およびそれからの溶出により精製した。５ｍｇのパパインと１００ｍｇのＩｇＧとの比において３０ｍＭのシステインを含有するリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２中でパパイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）中で、精製抗体１２ＧＬ（＋３０ｍＭのシステイン）をインキュベートしてＦａｂ断片を産生した。９６分間インキュベートした後、消化をヨードアセトアミドの添加により終結させて５０ｍＭの最終濃度とした。消化物をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にｐＨ７．２において適用することによりＦａｂ断片を精製し、次いで未結合Ｆａｂ断片を回収した。濃縮後、脱塩ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＦａｂを５０ｍＭの酢酸ナトリウム、３０ｍＭの塩化ナトリウム＋２％ｗ／ｖのソルビトール、ｐＨ５．５０に緩衝液交換した。
３．２ ＩＬ−１８および抗体１２ＧＬＦａｂ複合体形成
抗体１２ＧＬＦａｂおよびヒトＩＬ−１８（インハウス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）を、１：１のモル比（ＩＬ−１８がわずかに過剰）で混合し、＋４℃において一晩穏やかに撹拌した。形成された複合体を過剰のＩＬ−１８から、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で２．５ｍＬ／分において平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ２６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。複合体を単一ピークとして溶出させ、回収し、１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ遠心分離デバイスを使用して１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
３．３ 結晶化、データ回収および構造決定
広範な蒸気拡散結晶化試験を、タンパク質緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中１５ｍｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１８：抗体１２ＧＬＦａｂ複合体について設定して結晶化条件を同定した。タンパク質を遠心分離してから１００ｎＬタンパク質溶液および１００ｎＬウェル溶液を有するＩｎｔｅｌｌｉ−ｐｌａｔｅ Ｆｌａｔ ｌｅｄｇｅ（Ａｒｔ Ｒｏｂｂｉｎｓ）中でシッティングドロップを設定した。第１の結晶は、エタノール、３−メチル−１，５−ペンタジオール（ＭＰＤ）またはその両方を含有するドロップ中で数週間以内に現れた。結晶は、針または針の束として現れ、回折実験に有用でなかった。結晶はＵＶ顕微鏡観察によりタンパク質であることを確認した。
結晶化条件の最適化全体にわたりシーディングを使用した。回折に試験する結晶を得るため、数ラウンドのマイクロおよびマクロシーディングを実施した。マイクロシーディングのためのシードストックは、３０μＬのウェル溶液中で結晶を破砕することにより得た。シードストックを希釈し、種々の希釈物を結晶化ドロップに添加し、例えば、１０ｎＬの希釈物シードストックを２００ｎＬのドロップに添加した。マクロシーディングも使用し、針様結晶の束をより小さい細片に破壊し、それらを新たな結晶化ドロップに移した。
データ回収に使用した結晶は、＋２０℃において３５〜４０％のエタノールを含有する５００μＬウェル溶液を有するＮｅｘｔａｌプレート（Ｑｉａｇｅｎ）中でハンギングドロップから得た。マクロシーディングを使用して、結晶の細片を、タンパク質およびウェル溶液を１：１の比で含有する新たな３μＬの結晶化ドロップに移した。最良の結晶は、マクロシーディングされたドロップ中で現れたが、おそらく、より大きい細片よりも小さい核の結果であった。得られた約２００μｍの棒形状結晶を遠隔データ収集のためにフランス，グルノーブル（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＥＳＲＦ）に送った。データは、ＥＳＲＦにおいてＩＤ２３−１ビームラインにおいてＡＤＳＣ Ｑ３１５Ｒ検出器上で１００Ｋ．において単一結晶から２．５Åまで収集した。
データは、１００Ｋにて単一結晶から収集した。データセットは、ＭＯＳＦＬＭ（Ｌｅｓｌｉｅ，Ａ（１９９１）Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｖ ｐｐ．２７−３８）を使用して統合し、Ｓｃａｌａ（ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ）によりスケーリングした。データ収集統計を表８に示す。結晶は、細胞寸法ａ＝ｂ＝９５．１、ｃ＝３１６．９、α＝β＝９０、γ＝１２０を有する空間群Ｐ３１２１に属した。非対称単位は、３．１のＭａｔｔｈｅｗ係数および６０％の溶媒含有率を生じさせるＩＬ−１８−Ｆａｂ複合体の２つのコピーを含有する。
ＩＬ−１８：抗体１２ＧＬＦａｂ複合体の構造を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ登録番号３Ｆ６２（Ｋｒｕｍｍ他（２００８）ＰＮＡＳ １０５（５２）：２０７１１−２０７１５）および１ＡＱＫ（Ｆａｂｅｒ他（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２５３−３７０）にそれぞれ由来するＩＬ−１８および抗体１２ＧＬＦａｂについての検索モデルを有するプログラムＰｈａｓｅｒ（ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ １９９４）を使用する分子置換法により決定した。
最初の検索モデル（１ＡＱＫ＿可変）は、後続のループ：ＬＣ９３〜９９、ＨＣ２７〜３２、５１〜５８、７３．７６、および１０１−１０７が除去された１ＡＱＫ（重鎖残基２〜１２２、軽鎖２〜１１１）からＦａｂ可変ドメインを含有した。Ｐｈａｓｅｒは、空間群Ｐ３１２１で単一解を与えた。このモデルの１つのコピーが見出され、この解の固定を保持しながら、１つのループ（５４〜６１）が除去された３Ｆ６２（ＩＬ−１８：ＩＬ−１８ＢＰ複合体）から抽出したＩＬ−１８検索モデルを次に配置した。この解を固定し、連続的な検索を１ＡＱＫ（ＬＣ残基１１２〜２１６およびＨＣ１２３〜２２６）からの抗体１２ＧＬＦａｂ定常ドメインについて行った。ＩＬ−１８：抗体１２ＧＬＦａｂ（１ＡＱＫ＿可変）複合体の第２のコピーを、非対称単位で配置した。１ＡＱＫＨＣ（重鎖１２３〜２２６）からの定常ドメインを検索し、見出した。しかしながら、Ｐｈａｓｅｒは、ＦａｂＬＣ定常の位置を同定し得なかった。モデルは、ａｕｔｏｂｕｓｔｅｒ（Ｇｌｏｂａｌ ｐｈａｓｉｎｇ）リジッドボディリファインメントにおいてランさせた。得られたマップは良質なものであり、抗体１２ＧＬＦａｂ側鎖をプログラムＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ Ｐ．ｅｔ ａｌ（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ６６：４８６−５０１）においてリモデリングしてシーケンシングし、Ｃｏｏｔプログラムを使用して手作業でミッシングループを再構築して抗体１２ＧＬ配列に適合させた。ミッシングループは、Ｃｏｏｔにおいて密度差マップに構築した。ａｕｔｏｂｕｓｔｅｒリファインメントの追加のサイクル後、第２の分子中の最後のＬＣ定常ドメインをＣｏｏｔにおいて手作業で配置しなければならなかった。Ｆａｂ鎖は、Ｋａｂａｔナンバリング（Ｋａｂａｔ他（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）に従ってナンバリングした。完全モデルをプログラムＲｅｆｍａｃ５（ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ １９９４）により最終Ｒ因子２４．５％および２８．６％のフリーＲ因子にリファインした。
３．４ ＩＬ−１８：抗体１２ＧＬＦａｂ複合体の結晶構造
ヒトＩＬ−１８：抗体１２ＧＬ複合体の結晶を、空間群Ｐ３１２１で得た。電子密度マップの全体の質は良好であり、残基の９７％の明確なモデリングを可能とした。特に、エピトープおよびパラトープ領域を十分に規定した。ＩＬ−１８の最終モデルは、残基１〜１５６を含有する。２つのループ領域を電子密度で無秩序化し（残基３３〜４１および１３１〜１３２）、それらの一部をモデルから除外した。同一のループを、エクトウイルス（ｅｃｔｏｖｉｒｕｓ）（ＰＤＢアクセッションコード３Ｆ６２；Ｋｒｕｍｍ他 ２００８（前掲））からのＩＬ−１８ＢＰとの複合体中のＩＬ−１８の公開結晶構造のモデルから除外し、未結合ＩＬ−１８の溶液構造で高度にフレキシブルであると報告する（ＰＤＢコード１Ｊ０Ｓ；Ｋａｔｏ他（２００３）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １０（１１）：９６６−９７１）。抗体１２ＧＬＦａｂの最終モデルは、軽鎖（ＬＣ）残基１〜２１３（非対称単位の第２の分子について１〜２１２）および重鎖（ＨＣ）１〜２２６からなる。最終モデルは、ＩＬ−１８−抗体１２ＧＬＦａｂ複合体の２つのコピーおよび７９個の水分子を含有する。
結晶構造は、それぞれのＩＬ−１８分子が１つの抗体１２ＧＬＦａｂ断片に結合していることを示す（図１２）。この結晶構造は、ＩＬ−１８と、原子詳細において試験すべき抗体１２ＧＬとのエピトープ相互作用を可能とする。これらを表９に記録し、残基番号は鎖指標（Ｈ：抗体１２ＧＬ重鎖、Ｌ：抗体１２ＧＬ軽鎖）を含有する。距離は、ＣＣＰ４プログラムＣＯＮＴＡＣＴ（ＣＣＰ４，１９９４）を使用して得た。２つの複合体の１つを記載することが必要であるにすぎない。それというのも、それらは等価であるためである。相互作用は、抗体断片の重鎖および軽鎖の両方から相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。エピトープの一部を形成するＩＬ−１８中のアミノ酸残基は、Ｔｙｒ１、Ｇｌｙ３、Ｌｅｕ５、Ｇｌｕ６、Ｌｙｓ８、Ｍｅｔ５１、Ｌｙｓ５３、Ａｓｐ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｎ５６、Ｐｒｏ５７、Ａｒｇ５８、Ｇｌｙ５９、Ｍｅｔ６０、Ａｒｇ１０４、Ｓｅｒ１０５およびＰｒｏ１０７である。抗体１２ＧＬ軽鎖から寄与される残基は、Ｇｌｙ２８、Ｓｅｒ３０、Ｔｒｐ３２、Ｓｅｒ９１、Ｈｉｓ９２、Ｈｉｓ９３およびＰｒｏ９４である。これらは、軽鎖フレームワーク１、残基Ａｓｐ１からの単一アミノ酸寄与である。重鎖から寄与される残基は、Ｔｙｒ３５、Ｔｙｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｔｙｒ５８、Ａｌａ９７、Ｔｙｒ９８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００、Ｔｈｒ１００ＤおよびＡｓｐ１００Ｅである。
ＩＬ−１８の全体構造は、０．８７Å２の全Ｃα標準偏差を有するＩＬ−１８：ＩＬ−１８ＢＰ複合体（３Ｆ６２；Ｋｒｕｍｍ他 ２００８（前掲））からのＩＬ−１８に高度に類似する。しかしながら、ＩＬ−１８：ＩＬ−１８ＢＰ複合体と比較して１つのループ（残基５５〜５９）の３Å位置シフトが存在する。このシフトにもかかわらず、パラトープとの多数の相互作用点を担持するループの全コンフォメーションは、依然として全く類似する。対照的に、ループ（５５〜５９）のコンフォメーションは、未結合ＩＬ−１８の報告されたＮＭＲ溶液構造（Ｋａｔｏ他 ２００３（前掲））およびＩＬ−１８：１２５−２Ｈ複合体（Ａｒｇｉｒｉａｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ（２００９）ＪＢＣ２８４：２４４７８−２４４８９）の結晶構造から、それぞれ５Åおよび７Åの最大シフトで大きくずれる。抗体１２ＧＬの結合様式は、近年公開された結晶構造（Ｋｒｕｍｍ他 ２００８（前掲））に示されるとおりエクトウイルスからのＩＬ−１８ＢＰとほぼ完全に重複する。ＩＬ−１８：抗体１２ＧＬＦａｂ複合体の結晶構造は、本質的に１２５−２Ｈ（２ＶＸＴ；Ａｒｇｉｒｉａｄｉ他 ２００９（前掲））と抗体１２ＧＬエピトープとの重複が存在しないことを表す。
種交差反応性に関して、抗体１２ＧＬはマウスＩＬ−１８と交差反応性でないが、カニクイザルＩＬ−１８と交差反応性である。カニクイザルおよびヒトＩＬ−１８エピトープは、１００％同一である。
実施例４
遊離ＩＬ−１８アッセイ
遊離ＩＬ−１８の濃度を、エレクトロルミネセント（ＥＣＬ）イムノアッセイにより測定した。
０．６２５μｇ／ｍｌの濃度の抗体１２ＧＬを、９６ウェルプレート（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｌａｔｅ，Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の炭素電極上に一晩コーティングした。ウェルを洗浄し、続いてＩ−ブロック緩衝液（Ｔｒｏｐｉｘ）と１から３時間インキュベートした。スタンダードおよびＱＣ濃縮物を、Ｉ−ブロック緩衝液中で組換えヒトＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から調製した。ウェルを洗浄し、スタンダード、ＱＣおよび未希釈試験試料を室温において３０分間インキュベートした。ウェルを洗浄し、０．５μｇ／ｍｌのビオチン化検出抗体（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）をウェルに添加した。１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン−スルホタグ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）をそれぞれのウェルに添加した。３０分間のインキュベーション時間の後、ウェルを洗浄し、読取り緩衝液（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）をそれぞれのウェルに添加した。ＥＣＬシグナルをＳｅｃｔｏｒ Ｉｍｍａｇｅｒ２４００（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）上で読み取った。結果を図１６および１７に示す。
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Claims (95)

  1. ヒトＩＬ−１８上のＩＬ−１８ＢＰ結合部位と完全にまたは部分的に重複するヒトＩＬ−１８のエピトープに特異的に結合するヒトＩｌ−１８についての単離された抗体分子。
  2. 残基Ｔｙｒ１、Ｇｌｙ３、Ｌｅｕ５、Ｇｌｕ６、Ｌｙｓ８、Ｍｅｔ５１、Ｌｙｓ５３、Ａｓｐ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｎ５６、Ｐｒｏ５７、Ａｒｇ５８、Ｇｌｙ５９、Ｍｅｔ６０、Ａｒｇ１０４、Ｓｅｒ１０５およびＰｒｏ１０７の１つ以上を含むヒトＩＬ−１８のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体分子。
  3. 前記エピトープが、残基Ｔｙｒ１、Ｇｌｙ３、Ｌｅｕ５、Ｇｌｕ６、Ｌｙｓ８、Ｍｅｔ５１、Ｌｙｓ５３、Ａｓｐ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｎ５６、Ｐｒｏ５７、Ａｒｇ５８、Ｇｌｙ５９、Ｍｅｔ６０、Ａｒｇ１０４、Ｓｅｒ１０５およびＰｒｏ１０７を含む、請求項２に記載の抗体分子。
  4. ＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒ）および／またはＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）へのＩＬ−１８結合を阻害する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体分子。
  5. ＩＬ−１８への結合についてＩＬ−１８ＢＰと競合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体分子。
  6. ＩＬ−１８へのＩＬ−１８ＢＰ結合の少なくとも９０％の阻害を示す、請求項５に記載の抗体分子。
  7. ヒトＩＬ−１８に１ｎＭ未満のＩＣ５０値において結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体分子。
  8. ９ １０−５ｓ−１未満のヒトＩＬ−１８についての解離定数（ｋｄ）を示す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体分子。
  9. １０ｎＭ未満、好ましくは１００ｐＭ未満のヒトＩＬ−１８についての親和性（ｋＤ）を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体分子。
  10. 規定される親ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のセットを含み、
    ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列の配列番号１５３を有し；
    ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列の配列番号１５４を有し；
    ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列の配列番号１５５を有し；
    ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列の配列番号１５８を有し；
    ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列の配列番号１５９を有し；
    ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列の配列番号１６０を有し；
    または１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する親のＣＤＲのセットを含む、
    請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体分子。
  11. （ａ）配列番号１５３と同一の、またはそれに対して３つ以下のアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１；
    （ｂ）配列番号１５４と同一の、またはそれに対して４つ以下のアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；
    （ｃ）配列番号１５５と同一の、またはそれに対して５つ以下のアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；
    （ｄ）配列番号１５８と同一の、またはそれに対して４つ以下のアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１；
    （ｅ）配列番号１５９と同一の、またはそれに対して４つ以下のアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；および
    （ｆ）配列番号１６０と同一の、またはそれに対して９つ以下のアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３
    含む、請求項９に記載の抗体分子。
  12. ＨＣＤＲ３において、
    Ｋａｂａｔ残基９７が、Ａｌａであり；
    Ｋａｂａｔ残基９８が、Ｔｙｒであり；
    Ｋａｂａｔ残基９９が、ＡｓｐまたはＰｈｅであり；
    Ｋａｂａｔ残基１００が、Ｇｌｙであり；
    Ｋａｂａｔ残基１００Ｄが、ＡｌａまたはＴｈｒであり；
    Ｋａｂａｔ残基１００Ｅが、Ａｓｐである、
    請求項１０または１１に記載の抗体分子。
  13. ＨＣＤＲ３において、
    Ｋａｂａｔ残基９５が、Ｔｈｒであり；
    Ｋａｂａｔ残基９６が、Ｐｒｏであり
    Ｋａｂａｔ残基９７が、Ａｌａであり；
    Ｋａｂａｔ残基９８が、Ｔｙｒであり；
    Ｋａｂａｔ残基９９が、ＡｓｐもしくはＰｈｅであり；
    Ｋａｂａｔ残基１００が、Ｇｌｙであり；
    Ｋａｂａｔ残基１００Ａが、ＡｓｐもしくはＧｌｎであり；
    Ｋａｂａｔ残基１００Ｂが、ＡｌａもしくはＡｓｐであり；
    Ｋａｂａｔ残基１００Ｃが、Ａｒｇであり
    Ｋａｂａｔ残基１００Ｄが、ＡｌａもしくはＴｈｒであり；
    Ｋａｂａｔ残基１００Ｅが、Ａｓｐであり；
    Ｋａｂａｔ残基１００Ｆが、Ｐｈｅであり；
    Ｋａｂａｔ残基１００Ｇが、Ｐｈｅであり；
    Ｋａｂａｔ残基１０１が、Ａｓｐであり；および／または
    Ｋａｂａｔ残基１０２が、Ｖａｌである、
    請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗体分子。
  14. ＨＣＤＲ３において、
    ＨＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９９が、Ｐｈｅであり；
    ＨＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基１００ａが、Ｇｌｎであり；
    ＨＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基１００ｂが、Ａｓｐであり；および／または
    ＨＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基１００ｄが、Ｔｈｒである、
    請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の抗体分子。
  15. ＨＣＤＲ３が、配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、１１５、１２５、１３５、１４５、または１５５のいずれか１つである、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の抗体分子。
  16. ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列の配列番号１５５である、請求項１５に記載の抗体分子。
  17. ＨＣＤＲ２において、
    Ｋａｂａｔ残基５２が、Ｔｙｒであり；
    Ｋａｂａｔ残基５３が、Ｔｙｒであり；
    Ｋａｂａｔ残基５８が、Ｔｙｒである、
    請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の抗体分子。
  18. ＨＣＤＲ１において、
    Ｋａｂａｔ残基３５が、Ｔｙｒである、
    請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の抗体分子。
  19. ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９２が、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、もしくはＡｌａであり；
    ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９３が、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、もしくはＩｌｅであり；および／または
    ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９４が、ＴｈｒもしくはＰｒｏである、
    請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体分子。
  20. ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９１が、ＳｅｒもしくはＩｌｅであり；
    ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９２が、Ｈｉｓであり；
    ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９３が、Ｈｉｓであり；および／または
    ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９４が、Ｐｒｏである、
    請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の抗体分子。
  21. ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基８９が、ＧｌｎもしくはＡｌａであり；
    ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９０が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、もしくはＡｓｎであり；
    ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９１が、ＳｅｒもしくはＩｌｅであり；
    ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９５が、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、もしくはＧｌｎであり
    ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９６が、Ｔｒｐであり、および／または
    ＬＣＤＲ３のＫａｂａｔ残基９７が、ＴｈｒもしくはＡｓｐである、
    請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の抗体分子。
  22. ＬＣＤＲ３が、配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、または１６０である、請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の抗体分子。
  23. ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列の配列番号１６０である、請求項２１に記載の抗体分子。
  24. ＨＣＤＲ１が、配列番号３、１０３、１１３または１５３であり；ＨＣＤＲ２が、配列番号４、１２４、１３４、１４４、または１５４である、請求項９〜２１のいずれか一項に記載の抗体分子。
  25. ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列の配列番号１５３であり；および／またはＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列の配列番号１５４である、請求項２２に記載の抗体分子。
  26. ＬＣＤＲ１において、
    Ｋａｂａｔ残基３０が、Ｓｅｒであり；
    Ｋａｂａｔ残基３２が、Ｔｒｐである、
    請求項１０〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子。
  27. ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列の配列番号１５８であり；および／または
    ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列の配列番号１５９である、
    請求項１０〜２６のいずれか一項に記載の抗体分子。
  28. 抗体１、抗体１ＧＬ、抗体２、抗体３、抗体４、抗体５、抗体６、抗体６ＧＬ、抗体７、抗体７ＧＬ、抗体８ＧＬ、抗体９、抗体１０、抗体１１、抗体１１＿ＧＬ、および抗体１２ＧＬの抗体のいずれかについての表１１に示すＣＤＲのセットを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体分子。
  29. 抗体ＶＨドメインおよび抗体ＶＬドメインを含み、
    前記ＶＨドメインが、それぞれ配列番号１５３、１５４および１５５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み；
    前記ＶＬドメインが、それぞれ配列番号１５８、１５９および１６０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む、
    請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体分子。
  30. 前記重鎖および／または軽鎖フレームワーク領域が、ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメント配列に生殖細胞系列化されている、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体分子。
  31. ＶＬ ＦＷ１ ｋａｂａｔ残基１が、Ａｓｐである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体分子。
  32. 配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、および１５２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体分子。
  33. 前記ＶＨドメインが、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、および１５２から選択される、請求項３２に記載の抗体分子。
  34. 配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、１２７、１３７、１４７、および１５７から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体分子。
  35. 前記ＶＬドメインが、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、１２７、１３７、１４７、および１５７から選択される、請求項３４に記載の抗体分子。
  36. 抗体ＶＨドメインおよび抗体ドメインＶＬを含み、前記抗体ＶＨドメインおよび前記抗体ＶＬドメインのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２および７、それぞれ配列番号１２および１７；それぞれ配列番号２２および２７；それぞれ配列番号３２および３７；それぞれ配列番号４２および４７；それぞれ配列番号５２および５７；それぞれ配列番号６２および６７；それぞれ配列番号７２および７７；それぞれ配列番号８２および８７；それぞれ配列番号９２および９７；それぞれ配列番号１０２および１０７；それぞれ配列番号１１２および１１７；それぞれ配列番号１２２および１２７；それぞれ配列番号１３２および１３７；それぞれ配列番号１４２および１４７；またはそれぞれ配列番号１５２および１５７と少なくとも９０％同一である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体分子。
  37. 抗体ＶＨドメインおよび抗体ＶＬドメインを含み、前記抗体ＶＨドメインおよび前記抗体ＶＬドメインのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２および７、それぞれ配列番号１２および１７；それぞれ配列番号２２および２７；それぞれ配列番号３２および３７；それぞれ配列番号４２および４７；それぞれ配列番号５２および５７；それぞれ配列番号６２および６７；それぞれ配列番号７２および７７；それぞれ配列番号８２および８７；それぞれ配列番号９２および９７；それぞれ配列番号１０２および１０７；それぞれ配列番号１１２および１１７；それぞれ配列番号１２２および１２７；それぞれ配列番号１３２および１３７；それぞれ配列番号１４２および１４７；またはそれぞれ配列番号１５２および１５７である、請求項３６に記載の抗体分子。
  38. 前記抗体ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号１５２と少なくとも９０％同一であり、前記抗体ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号１５７と少なくとも９０％同一である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体分子。
  39. 前記抗体ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号１５２であり、前記抗体ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号１５７である、請求項３８に記載の抗体分子。
  40. 配列番号１５２のアミノ酸配列を有する抗体ＶＨドメインおよび抗体ＶＬドメイン配列の配列番号１５７を含む抗体分子と、ＩＬ−１８への結合について競合する抗体分子。
  41. 寄託アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１７８６の核酸配列によりコードされるＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体分子。
  42. ｓｃＦｖである、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体分子。
  43. 抗体定常領域を含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体分子。
  44. モノクローナル抗体である、請求項４３に記載の抗体分子。
  45. キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、請求項４４に記載の抗体分子。
  46. ＩｇＧである、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の抗体分子。
  47. ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項４６に記載の抗体分子。
  48. ＹＴＥおよびＴＭ突然変異をＦｃ領域中に有するＩｇＧ１である、請求項４７に記載の抗体分子。
  49. 請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子の単離されたＶＨドメイン。
  50. 請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子の単離されたＶＬドメイン。
  51. 請求項１〜４８のいずれか一項に記載の単離された抗体分子および薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
  52. ヒトまたは動物体の治療方法において使用される、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子を含む組成物。
  53. 個体におけるＩＬ−１８活性の減少において使用される、請求項５２に記載の組成物。
  54. 個体におけるＩＬ−１８発現または活性の増加に関連する疾患の治療において使用される、請求項５２または５３に記載の組成物。
  55. 前記疾患が、炎症、心血管または自己免疫疾患である、請求項５４に記載の組成物。
  56. 前記疾患が、急性冠症候群（ＡＶＳ）；アテローム性動脈硬化症；および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）から選択される、請求項５５に記載の組成物。
  57. 個体におけるＩＬ−１８の活性を減少させるための医薬品の製造のための、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子の使用。
  58. 個体におけるＩＬ−１８発現または活性の増加に関連する疾患の治療のための医薬品の製造のための、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の抗体分子の使用。
  59. 前記疾患が、炎症、心血管または自己免疫疾患である、請求項５８に記載の使用。
  60. 前記疾患が、急性冠症候群（ＡＶＳ）；アテローム性動脈硬化症；および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）から選択される、請求項５９に記載の使用。
  61. 個体を治療する方法であって、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子を前記個体に投与することを含む方法。
  62. 前記抗体分子が、前記個体におけるＩＬ−１８の活性を減少させる、請求項６１に記載の方法。
  63. 個体におけるＩＬ−１８発現または活性の増加に関連する疾患の治療のための、請求項６１または６２に記載の方法。
  64. 前記疾患が、炎症、心血管または自己免疫疾患である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記疾患が、急性冠症候群（ＡＣＳ）；アテローム性動脈硬化症；および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）から選択される、請求項６４に記載の方法。
  66. 請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項４９に記載のＶＨドメインまたは請求項５０に記載のＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  67. 請求項６６に記載の核酸によりインビトロで形質転換された宿主細胞。
  68. 抗体ＶＨまたはＶＬドメインを産生する方法であって、前記抗体分子ＶＨまたはＶＬドメインの産生のための条件下で請求項６７に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
  69. 前記抗体分子ＶＨドメインまたはＶＬドメインを単離および／または精製することをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記抗体分子ＶＨドメインまたはＶＬドメインを、少なくとも１つの追加の構成要素を含む組成物に製剤化することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
  71. ヒトＩＬ−１８についての抗体抗原結合ドメインを産生する方法であって、
    ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む親ＶＨドメイン（前記親ＶＨドメインＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、表１１に示されるＨＣＤＲのセットである）のアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入を用いて、前記親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを提供し、場合によりこうして提供した前記ＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせて１つ以上のＶＨ／ＶＬ組合せを提供すること；ならびに
    前記親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体である前記ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬ組合せを試験してＩＬ−１８についての抗体抗原結合ドメインを同定すること
    を含む方法。
  72. 前記親ＶＨドメインが、配列番号１５２に記載のＶＨドメインである、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記１つ以上のＶＬドメインを、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む親ＶＬドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入の手法により提供し、前記親ＶＬドメインＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、表１１に示されるＣＤＲのＶＬセットであり、それぞれが前記親ＶＬドメインのアミノ酸配列変異体である１つ以上のＶＬドメインを産生する、請求項７１または７２に記載の方法。
  74. 前記親ＶＬドメインが、配列番号１５７に記載のＶＬドメインである、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記親ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体である前記ＶＨドメインを、ＣＤＲ突然変異導入により提供する、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. ＩｇＧ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体分子の構成要素としての前記抗体抗原結合ドメインを産生することをさらに含む、請求項７１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. ヒトＩＬ−１８に結合する結合メンバーを産生する方法であって、
    ＶＨドメインをコードする出発核酸またはＶＨドメインをそれぞれコードする核酸の出発レパートリーを提供すること（前記ＶＨドメインが、置き換えるべきＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３を含み、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３コード領域を欠く）；
    前記出発核酸または出発レパートリーを、表１１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／またはＨＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするドナー核酸またはその突然変異により産生されたドナー核酸と組み合わせて前記ドナー核酸が前記出発核酸または出発レパートリー中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域中に挿入されるようにしてＶＨドメインをコードする核酸の産物レパートリーを提供すること；
    前記産物レパートリーの核酸を発現させて産物ＶＨドメインを産生すること；
    場合により、前記産物ＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせること；
    産物ＶＨドメインおよび場合によりＶＬドメインを含む、ＩＬ−１８についての結合メンバーを選択すること；ならびに
    前記結合メンバーまたはそれをコードする核酸を回収すること
    を含む方法。
  78. 前記ドナー核酸を、前記ＨＣＤＲ１および／またはＨＣＤＲ２の突然変異により産生する、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記ドナー核酸をＨＣＤＲ３の突然変異により産生する、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記ドナー核酸を、核酸のランダム突然変異により提供することを含む、請求項７７に記載の方法。
  81. 回収した結合メンバー内に含まれる産物ＶＨドメインを抗体定常領域に付着させることをさらに含む、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記産物ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むＩｇＧ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体分子を提供することを含む、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の方法。
  83. ＩＬ−１８に結合する前記抗体抗原結合ドメインまたは結合メンバーを、ＩＬ−１８ＲへのヒトＩＬ−１８の結合阻害能について試験することをさらに含む、請求項７７〜８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. ヒトＩＬ−１８に結合し、ＩＬ−１８ＲへのヒトＩＬ−１８結合を阻害する抗体分子を含む結合メンバーを得る、請求項７７〜８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記抗体分子が、ｓｃＦｖである、請求項７７〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記抗体分子が、ＩｇＧである、請求項７７〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  87. 抗体分子組成物を産生する方法であって、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の方法を使用して抗体分子を得ることと、前記抗体分子を、少なくとも１つの追加の構成要素を含む組成物に製剤化することとを含む方法。
  88. 試料中のＩＬ−１８を計測する方法における、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子の使用。
  89. ＩＬ−１８が、遊離ＩＬ−１８である、請求項８８に記載の使用。
  90. ＩＬ−１８を検出および／または計測する方法であって；
    （ｉ）請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子をＩＬ−１８に曝露することならびに
    （ｉｉ）ＩＬ−１８への前記結合メンバーの結合を検出および／または計測すること
    を含む方法。
  91. 試料中のＩＬ−１８を計測する方法であって；
    （ｉ）試料を請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子と接触させること；および
    （ｉｉ）前記試料への前記抗体分子の結合を測定すること
    を含み、
    前記試料への前記抗体分子の結合が前記試料中のＩＬ−１８の量を示す、方法。
  92. 試料中のＩＬ−１８を計測する方法であって；
    前記試料を、ＩＬ−１８に結合する第１の抗体分子と接触させること、および；
    ＩＬ−１８に結合する第２の抗体分子を使用して、前記試料中でのＩＬ−１８への前記第１の抗体分子の結合を測定すること
    を含み、
    前記第１または第２の抗体分子の一方が、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子であり、前記第１または第２の結合メンバーの他方が、ＩＬ−１８への結合について請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体分子と競合しない抗ＩＬ−１８抗体分子である方法。
  93. 前記試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）、胆汁、尿、皮脂、唾液または血清試料である、請求項９１または９２に記載の方法。
  94. 前記ＩＬ−１８が、遊離ＩＬ−１８である、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記ＩＬ−１８が、遊離ＩＬ−１８である、請求項９１〜９４のいずれか一項に記載の方法。
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