CN112415191A - 一种白细胞三烯检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白细胞三烯检测试剂盒，包括细胞分离及细胞刺激用试剂和ELISA试剂；所述细胞分离及细胞刺激用试剂包括葡聚糖、刺激缓冲液和刺激质控；所述ELISA试剂包括微孔板、封板膜、20X洗液、ELISA buffer S0、标准品S1、质控品、空白试剂、标记酶、抗体、pNPP底物和终止液。本发明使用简单，对设备的要求低，实验成本低，应用范围广，用于对围术期过敏反应进行预测，筛选出适合患者的麻醉药品，从而有效避免患者引起严重的过敏反应。

Description

一种白细胞三烯检测试剂盒
技术领域
本发明涉及过敏原检测技术领域，具体涉及一种白细胞三烯检测试剂盒。
背景技术
近年来，随着麻醉过程中大量合成药物的广泛应用，临床中发现麻醉药物诱发的严重过敏反应(Anaphylaxis)也在逐年增高。资料显示，围术期过敏反应发生率介于1/20000～1/3500，更有报道认为发生率可达1/353，因此并非罕见。绝大多数患者的围术期致敏原无法明确，他们再次接受手术时依然要面临再次过敏的风险。目前，尚无麻醉过程中药物诱发严重过敏反应的标准化诊断体系，且国内外缺乏对其高危因素的系统研究。很多麻醉科医生对于围术期过敏反应的认识不足，从而出现诊疗不及时或错误。同时，由于致敏原的检测手段有限，绝大部分仅能凭借病史进行初步的判断。无论医生还是患者，对于改进围术期过敏反应诊疗的意愿都很迫切。
寻找检测围术期严重过敏反应致敏原的有效方法，对于指导患者再次手术用药，降低围术期风险意义重大。致敏原的检测方法分为体内法和体外法。体内法包括皮肤试验(Skin Test,ST)和激发试验等，体外试验包括组胺(Histamine)和类胰蛋白酶(Tryptase)水平检测、sIgE检测等。然而，目前尚无统一明确的围术期致敏原检测方法。
由于存在诱发严重过敏反应的风险，临床中无法采用激发试验(ProvocationTest,PT)这一金标准来确诊围术期致敏原，而ST是临床中致敏原检测最常用的手段，主要包括皮肤点刺试验法(SPT)和皮内试验法(IDT)。由于ST可通过非IgE途径直接刺激皮肤肥大细胞产生组胺而出现假阳性结果，因此目前对其检测致敏原的有效性有一定争议。另外，ST对操作和试验药物浓度要求较为严格，且存在一定的疼痛刺激及诱发全身过敏反应的风险，这些都限制了皮肤试验在围术期致敏原检测中的应用。
体外检测手段避免了患者暴露的风险的同时减少了其他的干扰因素，是皮肤试验有效的补充。sIgE检测是公认可靠的过敏性疾病体外检测方法，常用的检测手段有放射性变应原吸附试验(Radioallergosorbent Test，RAST)和ImmunoCAP系统等。ImmunoCAP系统是目前最先进的sIgE定量检测系统，它是在RAST基础上发展起来的荧光酶免疫检测法(RAST FEIA)，其检测原理是抗原或致敏原在固定相上与特定的人类抗体IgE结合，样品中的抗原与固定相上的抗原竞争性结合IgE，再将酶标抗IgE二抗加入到固有相中，最后测定荧光并与标准曲线比较。ImmunoCAP对sIgE的检测准确可靠，结果与临床相关性好。ImmunoCAP常用于食物和吸入性变应原的检测，具有较高的诊断敏感度和特异度，但其检测围术期过敏反应致敏原的相关资料很少，国内尚未开展相关研究。
IgE介导和非免疫介导的两类严重过敏反应均可发生嗜碱性粒细胞的脱颗粒，同时合成并释放生物活性介质白三烯等。通过变应原刺激嗜碱性粒细胞释放白三烯，用ELISA法检测白三烯含量，可以有效识别诱发严重过敏反应的药物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种白细胞三烯检测试剂盒，该试剂盒用于围术期过敏反应的预测，便于筛选出适合患者的麻醉药品，该试剂盒检测法对检测仪器要求低，成本低，实用性更广。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种白细胞三烯检测试剂盒，包括细胞分离及细胞刺激用试剂和ELISA试剂；所述细胞分离及细胞刺激用试剂包括葡聚糖、刺激缓冲液和刺激质控；所述ELISA试剂包括微孔板、封板膜、20X洗液、ELISA buffer S0、标准品S1、质控品、空白试剂、标记酶、抗体、pNPP底物和终止液。
优选的，在所述微孔板上包被有多克隆鼠抗lgG。
优选的，所述标准品、质控品和空白试剂均为LTD4溶于2％BSA缓冲液基质的冻干粉；其中，所述质控品包括低值质控品和高值质控品，所述低值质控品中LTD4的浓度范围为112-305pg/ml，所述高值质控品中LTD4的浓度范围为492-1338pg/ml；所述空白试剂中LTD4的浓度为32000pg/ml。
优选的，所述标准品S1中LTD4的浓度为3200pg/ml。
优选的，所述试剂盒用于定量检测特异抗原刺激白细胞后的产物sLT。
优选的，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)标准品的制备：为了获得标准曲线，需对标准品S1进行稀释；
a.取3个试管分别标记为S2-S4，并向3个试管中均加入300μL的ELISA buffer S0；
b.取100μL的标准品S1加入到试管S2中，混匀；
c.从试管S2中吸取100μL溶液加入到试管S3中，混匀；
d.再从试管S3中吸取100μL溶液加入到试管S4中，混匀；
S0-S4中的sLT浓度依次为：0pg/ml、3200pg/ml、800pg/ml、200pg/ml、50pg/ml；
(2)白细胞分离：在病人血样中加入葡聚糖提升血液的黏稠度，在室温下静置90min，使红细胞在底层聚集，白细胞和血小板停留在上层的血浆层；然后，将上层液转移至离心管中在离心机内进行离心，使白细胞沉降在底部；去除包含90％以上血小板的上层血浆，向离心管中添加刺激缓冲液进行重悬白细胞，得到细胞悬液，备用；
(3)细胞刺激处理：
a.标记试管：对于每个患者，分别在每个试管上进行标记，
其中：PB＝患者背景；
PC＝抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体刺激质控；
Ax＝过敏原x；
b.细胞刺激反应：
①吸取50μL刺激缓冲液加入到PB试管内；
②吸取50μL刺激质控加入到PC试管内；
③吸取50μL过敏原加入到相应的试管内；
④向上述试管中分别加入200μL步骤(2)中得到的细胞悬液，轻轻旋涡震荡，封口，37℃下水浴孵育40min；
⑤将步骤④中的试管置于离心机内再进行旋涡震荡溶解凝集物，得到细胞上清液，备用；
(4)白细胞三烯(sLT)的检测：
a.根据病人数量、过敏原种类及16孔空白对照、标准品及质控品的数量，来确定所需要的微孔板条数量；
b.用20X洗液工作液洗板一次，300μL/孔，甩板，拍干；
在A1+A2微孔中分别加入100μL空白试剂，对照；
在B1+B2微孔中分别加入100μL ELISA buffer；
在C1+C2微孔中分别加入100μL标准品S4；
在D1+D2微孔中分别加入100μL标准品S3；
在E1+E2微孔中分别加入100μL标准品S2；
在F1+F2微孔中分别加入100μL标准品S1；
在G1+G2微孔中分别加入100μL低值质控品；
在H1+H2微孔中分别加入100μL高值质控品；
c.将步骤(3)中得到的每种细胞上清液分别吸取100μL，加入随后的微孔中，复孔检测；
d.将所述微孔板中的每个微孔中均加入50μL标记酶；
e.再向每个微孔中分别加入50μL抗体；
f.采用封板膜对微孔板进行封板，之后将密封后的微孔板置于振荡器内震荡混匀，再于18-28℃下反应2h或者置于2-8℃下反应16-20h，；
g.揭开封板膜，甩板，注入20X洗液工作液300μL/孔，洗板3次，拍干；
h.并向每个微孔内加入200μL的pNPP底物溶液；
i.采用封板膜对微孔板进行封板，之后将密封后的微孔板再置于振荡器内震荡，于18-28℃下避光孵育30min，取下微孔板的封板膜，并向每个微孔内加入50μL终止液终止反应，混匀；
j.加入底物后30min内将上述微孔板于酶标仪内405nm波长下进行读板，得出每个微孔的OD值；
k.结果计算：根据已知LTD4浓度的系列标准品OD值，通过双对数回归数学模型回归处理得到回归直线y＝ax+b，其中y为OD值，x为sLT浓度，将未知标本的sLT浓度通过其OD值从回归直线上推算出来。
优选的，步骤(2)中病人血样、葡聚糖和刺激缓冲液的添加比例为1:0.25:1。优选的，步骤(2)在18-28℃下进行，且所述离心机的离心力为500xg，离心时间为15min。
优选的，步骤⑤在2-8℃下进行，且所述离心机的离心力为1000xg，离心时间为3min。在低温下进行为了获得稳定的小球，防止sLT降解。
优选的，步骤(3)中的pNPP底物需恢复至18-28℃。
检测原理：病人血中的白细胞沉降分离出来后，同时用刺激缓冲液处理及过敏原刺激，其中的嗜碱性粒细胞产生过敏媒介LTC4及其代谢产物LTD4和LTE4。最开始形成的LTC4可以是IgE依赖型的，也可以是非IgE依赖型的，后者通常描述为假性过敏，新合成的sLT可以用ELISA方法检测。
该试剂盒中各试剂的含量和使用方法如表1：
表1：试剂盒内试剂种类和使用方法
试剂名称 试剂量 复溶
葡聚糖 20ml/瓶 直接使用
刺激缓冲液(含IL-3) 1瓶(冻干粉) 加入50mL超纯除热源水
刺激质控(anti-FcεRI抗体、fMLP) 1瓶(冻干粉) 加入3.5ml超纯除热源水
微孔板(包被多克隆鼠抗IgG) 12*8 96T 使用前洗涤一遍
封板膜
20X洗液 50ml/瓶 去离子水稀释
ELISA buffer 30ml/瓶 直接使用
标准品(LTD4溶于缓冲液基质) 5瓶(冻干)3200pg/ml 1ml去离子水复溶
低/高值质控(LTD4溶于缓冲液基质) 5*2瓶(冻干) 1ml去离子水复溶
空白试剂(LTD4溶于缓冲液基质) 1瓶(冻干)32000pg/ml 2ml去离子水复溶
标记酶(LTD4-AP) 2瓶(冻干) 加5.5mlELISA buffer
抗体(anti-sLTAb) 1瓶11ml 直接使用
pNPP底物 1瓶42ml 直接使用
终止液(2N NaOH) 1瓶11ml 直接使用(腐蚀性试剂)
试剂储存方法和有效期如表2所示：
表2为各种试剂的储存和有效期
Figure BDA0002764995650000071
过敏原种类数对血量的需求如表3所示：
过敏原种数 血量需求(ml)
1-5 2.0
6-10 3.0
11-15 4.0
16-20 5.0
血液采集后24h内完成细胞刺激，血样需要在2-8℃下存放，禁止离心或冻存。
针对刺激质控解释：
对变应和非变应体质，刺激质控范围(减去本底)>200pg/ml。刺激质控证明嗜碱性粒细胞的释放能力。
针对过敏原刺激解释：
对于吸入药剂、食物和乳胶、α-淀粉酶类过敏原，sLT刺激区间定为高于200pg/ml。
对于蜜蜂和黄蜂蜂毒的临床参考值为270pg/ml。
本发明的有益效果是：
本发明的试剂盒使用简单，对设备的要求低，实验成本低，应用范围广，既可以检测食物和吸入性变应原，还可以用于对围术期过敏反应进行预测，筛选出适合患者的麻醉药品，从而有效避免患者引起严重的过敏反应；采用本试剂盒进行过敏原的检测只需要取一次静脉血样即可，减少患者疼痛。
附图说明
图1为实施例中的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种白细胞三烯检测试剂盒，包括细胞分离及细胞刺激用试剂和ELISA试剂；所述细胞分离及细胞刺激用试剂包括葡聚糖、刺激缓冲液和刺激质控；所述ELISA试剂包括微孔板、封板膜、20X洗液、ELISA buffer S0、标准品S1、质控品、空白试剂、标记酶、抗体、PNPP底物和终止液。
其中，标准品、质控品和空白试剂均为LTD4溶于2％BSA缓冲液基质的冻干粉；质控品包括低值质控品和高值质控品，低值质控品中LTD4的浓度范围为112-305pg/ml，高值质控品中LTD4的浓度范围为492-1338pg/ml；空白试剂中LTD4的浓度为32000pg/ml。标准品S1中LTD4的浓度为3200pg/ml。
另外，在微孔板上包被有多克隆鼠抗lgG。
该试剂盒用于定量检测特异抗原刺激白细胞后的产物sLT，sLT为LTC4、LTD4和LTE4的混合物，其值的大小用来反应患者对过敏原是否过敏。
试剂盒中各试剂的产品状态和使用方法按照上述表1描述进行即可。
实施例2
该白细胞三烯检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)标准品的制备：为了获得标准曲线，需对标准品S1进行稀释；
a.取3个试管分别标记为S2-S4，并向3个试管中均加入300μL的ELISA buffer S0；
b.取100μL的标准品S1加入到试管S2中，混匀；
c.从试管S2中吸取100μL溶液加入到试管S3中，混匀；
d.再从试管S3中吸取100μL溶液加入到试管S4中，混匀；
S0-S4中的sLT浓度依次为：0pg/ml、3200pg/ml、800pg/ml、200pg/ml、50pg/ml；
(2)白细胞分离：在病人血样中加入葡聚糖提升血液的黏稠度，病人血样、葡聚糖和刺激缓冲液的添加比例为1:0.25:1，这里病人血液为2ml，在室温下静置90min，使红细胞在底层聚集，白细胞和血小板停留在上层的血浆层；然后，在18-28℃下，将上层液转移至离心管中在离心机内进行离心，离心机的离心力为500xg，离心时间为15min，使白细胞沉降在底部；去除包含90％以上血小板的上层血浆，向离心管中添加刺激缓冲液进行重悬白细胞，得到细胞悬液，备用；
(3)细胞刺激处理：
a.标记试管：对于每个患者，分别在每个试管上进行标记，
其中：PB＝患者背景；
PC＝抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体刺激质控；
Ax＝过敏原x(x＝1-8)；
A1--咪唑大仑；A2--芬太尼；A3--罗库溴铵；A4--利多卡因；A5--舒芬太尼；A6--丙泊酚；A7--依托咪酯；A8--顺式阿曲库胺；
b.细胞刺激反应：
①吸取50μL刺激缓冲液加入到PB试管内；
②吸取50μL刺激质控加入到PC试管内；
③分别吸取50μL过敏原1-过敏原8加入到相应的试管内；
④向上述试管中分别加入200μL步骤(2)中得到的细胞悬液，轻轻旋涡震荡，封口，37℃下水浴孵育40min；
⑤在2-8℃下将步骤④中的试管置于离心机内再进行旋涡震荡溶解凝集物，得到细胞上清液，备用，这里离心机的离心力为1000xg，离心时间为3min。
(4)白细胞三烯(sLT)的检测：
a.根据病人数量、过敏原种类及16孔空白对照、标准品及质控品的数量，来确定所需要的微孔板条数量；
b.用20X洗液工作液洗板一次，300μL/孔，甩板，拍干；
在A1+A2微孔中分别加入100μL空白试剂，对照；
在B1+B2微孔中分别加入100μL ELISA buffer；
在C1+C2微孔中分别加入100μL标准品S4；
在D1+D2微孔中分别加入100μL标准品S3；
在E1+E2微孔中分别加入100μL标准品S2；
在F1+F2微孔中分别加入100μL标准品S1；
在G1+G2微孔中分别加入100μL低值质控品；
在H1+H2微孔中分别加入100μL高值质控品；
c.将步骤(3)中得到的每种细胞上清液分别吸取100μL，加入随后的微孔中，复孔检测；
d.将所述微孔板中的每个微孔中均加入50μL标记酶；
e.再向每个微孔中分别加入50μL抗体；
f.采用封板膜对微孔板进行封板，之后将密封后的微孔板置于振荡器内震荡混匀，再于18-28℃下反应2h或者置于2-8℃下反应16-20h，；
g.揭开封板膜，甩板，注入20X洗液工作液300μL/孔，洗板3次，拍干；
h.并向每个微孔内加入200μL的温度为18-28℃的pNPP底物溶液；
i.采用封板膜对微孔板进行封板，之后将密封后的微孔板再置于振荡器内震荡，于18-28℃下避光孵育30min，取下微孔板的封板膜，并向每个微孔内加入50μL终止液终止反应，混匀；
j.加入底物后30min内将上述微孔板于酶标仪内405nm波长下进行读板，得出每个微孔的OD值；
k.结果计算：根据已知LTD4浓度的系列标准品OD值，通过双对数回归数学模型回归处理得到回归直线y＝-0.975x+2.366，(y为OD值，x为sLT浓度)，推算出上述过敏原的sLT浓度如表1所示。
如图1所示，通过上述检测和计算结果见表4：
表4计算结果
Figure BDA0002764995650000111
Figure BDA0002764995650000121
从图1和上表中可以看出：刺激质控值高于200pg/ml，证明所提取的嗜碱性粒细胞具有释放sLT的能力，高低值质控品值均在范围内，说明实验有效，标准曲线可用。对于药物过敏原，参考区间不低于40pg/ml，所以，A2及A3的值高于40pg/ml，认为患者对此二类麻醉剂芬太尼、罗库溴氨过敏。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种白细胞三烯检测试剂盒，其特征在于，包括细胞分离及细胞刺激用试剂和ELISA试剂；所述细胞分离及细胞刺激用试剂包括葡聚糖、刺激缓冲液和刺激质控；所述ELISA试剂包括微孔板、封板膜、20X洗液、ELISA buffer S0、标准品S1、质控品、空白试剂、标记酶、抗体、PNPP底物和终止液。
2.根据权利要求1所述的白细胞三烯检测试剂盒，其特征在于，在所述微孔板上包被有多克隆鼠抗lgG。
3.根据权利要求1所述的白细胞三烯检测试剂盒，其特征在于，所述标准品、质控品和空白试剂均为LTD4溶于2%BSA缓冲液基质的冻干粉；其中，所述质控品包括低值质控品和高值质控品，所述低值质控品中LTD4的浓度范围为112-305pg/ml，所述高值质控品中LTD4的浓度范围为492-1338pg/ml；所述空白试剂中LTD4的浓度为32000pg/ml。
4.根据权利要求1所述的白细胞三烯检测试剂盒，其特征在于，所述标准品S1中LTD4的浓度为3200pg/ml。
5.根据权利要求1所述的白细胞三烯检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于定量检测特异抗原刺激白细胞后的产物sLT。
6.根据权利要求1所述的白细胞三烯检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
（1）标准品的制备：为了获得标准曲线，需对标准品S1进行稀释；
a.取3个试管分别标记为S2-S4，并向3个试管中均加入300μL的 ELISA buffer S0；
b.取100μL的标准品S1加入到试管S2中，混匀；
c.从试管S2中吸取100μL溶液加入到试管S3中，混匀；
d.再从试管S3中吸取100μL溶液加入到试管S4中，混匀；
S0-S4 中的sLT浓度依次为：0pg/ml、3200pg/ml、800pg/ml、200pg/ml、50pg/ml；
（2）白细胞分离：在病人血样中加入葡聚糖提升血液的黏稠度，在室温下静置90min，使红细胞在底层聚集，白细胞和血小板停留在上层的血浆层；然后，将上层液转移至离心管中在离心机内进行离心，使白细胞沉降在底部；去除包含90%以上血小板的上层血浆，向离心管中添加刺激缓冲液进行重悬白细胞，得到细胞悬液，备用；
（3）细胞刺激处理：
a. 标记试管：对于每个患者，分别在每个试管上进行标记，
其中：PB = 患者背景；
PC = 抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体刺激质控；
Ax=过敏原x；
b.细胞刺激反应：
①吸取50μL刺激缓冲液加入到PB试管内；
②吸取50μL刺激质控加入到PC试管内；
③吸取50μL过敏原加入到相应的试管内；
④向上述试管中分别加入200μL步骤（2）中得到的细胞悬液，轻轻旋涡震荡，封口，37℃下水浴孵育40min；
⑤将步骤④中的试管置于离心机内再进行旋涡震荡溶解凝集物，得到细胞上清液，备用；
（4）白细胞三烯（sLT）的检测：
a.根据病人数量、过敏原种类及16孔空白对照、标准品及质控品的数量，来确定所需要的微孔板条数量；
b.用20X洗液工作液洗板一次，300μL/孔，甩板，拍干；
在A1+A2微孔中分别加入100μL空白试剂，对照；
在B1+B2微孔中分别加入100μL ELISA buffer；
在C1+C2微孔中分别加入100μL标准品S4；
在D1+D2微孔中分别加入100μL 标准品S3；
在E1+E2微孔中分别加入100μL 标准品S2；
在F1+F2微孔中分别加入100μL标准品S1；
在G1+G2微孔中分别加入100μL低值质控品；
在H1+H2微孔中分别加入100μL高值质控品；
c.将步骤（3）中得到的每种细胞上清液分别吸取100μL，加入随后的微孔中，复孔检测；
d.将所述微孔板中的每个微孔中均加入50μL标记酶；
e.再向每个微孔中分别加入50μL抗体；
f.采用封板膜对微孔板进行封板，之后将密封后的微孔板置于振荡器内震荡混匀，再于18-28℃下反应2h或者置于2-8℃下反应16-20h，；
g.揭开封板膜，甩板，注入20X洗液工作液300μL/孔，洗板3次，拍干；
h.并向每个微孔内加入200μL的 pNPP底物溶液；
i. 采用封板膜对微孔板进行封板，之后将密封后的微孔板再置于振荡器内震荡，于18-28℃下避光孵育30min，取下微孔板的封板膜，并向每个微孔内加入50μL终止液终止反应，混匀；
j. 加入底物后30min内将上述微孔板于酶标仪内405nm波长下进行读板，得出每个微孔的OD值；
k.结果计算：根据已知LTD4浓度的系列标准品OD值，通过双对数回归数学模型回归处理得到回归直线y=ax+b，其中y为OD值，x为sLT浓度；将未知标本的sLT浓度通过其OD值从回归直线上推算出来。
7.根据权利要求6所述的白细胞三烯检测试剂盒，其特征在于，步骤（2）中病人血样、葡聚糖和刺激缓冲液的添加比例为1:0.25:1。
8.根据权利要求6所述的白细胞三烯检测试剂盒，其特征在于，步骤（2）在18-28℃下进行，且所述离心机的离心力为500xg，离心时间为15min。
9.根据权利要求6所述的白细胞三烯检测试剂盒，其特征在于，步骤⑤在2-8℃下进行，且所述离心机的离心力为1000xg，离心时间为3min。
10.根据权利要求6所述的白细胞三烯检测试剂盒，其特征在于，步骤（3）中的pNPP底物需恢复至18-28℃。
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