KR100988129B1

KR100988129B1 - 인간 항인간 인터루킨-18 항체와 그 단편, 및 이들의이용방법

Info

Publication number: KR100988129B1
Application number: KR1020057020607A
Authority: KR
Inventors: 가즈히사 수기무라; 켄지 나카니시; 토시히로 나카시마
Original assignee: 쥬리디컬 파운데이션 더 케모-세로-쎄라퓨틱 리서치 인스티튜트; 재팬 사이언스 앤드 테크놀로지 에이젼시
Priority date: 2003-04-30
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2010-10-18
Also published as: AU2004235595B2; CN1780911A; KR20060015558A; EP1621616A1; AU2004235595A1; AU2004235595C1; WO2004097019A1; US7491803B2; JP4134166B2; EP1621616A4; CA2523912A1; JPWO2004097019A1; CN100457901C; US20060292145A1

Abstract

본 발명에 따른 인간 유래의 인간 항인간 IL-18 항체는 인간 IL-18에 대한 항체이며, 하기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드로 이루어진 H쇄의 상보성 결정영역과, 하기 (c) 또는 (d)의 폴리펩티드로 이루어진, 인간 인터루킨-18에 대한 L쇄의 상보성 결정영역을 포함하는 것이다. (a) 서열번호 4∼6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, (b) (a)에 기재된 폴리펩티드의 개변체로서, H쇄의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드, (c) 서열번호 10∼12으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, (d) (c)에 기재된 폴리펩티드의 개변체로서, L쇄의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드. 이로 인해, 인간 항인간 IL-18 항체 및 그 이용방법을 제공하는 것이 가능해진다.

Description

인간 항인간 인터루킨-18 항체와 그 단편, 및 이들의 이용방법{Human Antihuman Interleukin-18 Antibody, Fragment Thereof and Method of Using the Same}

본 발명은 인간 항인간 인터루킨-18 항체와 그 단편, 및 이들의 이용방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 인터루킨-18(이하, 인간 IL-18이라 한다)에 결합하여 그 생리활성을 저해하는 인간 항인간 IL-18 항체 및 그 항체 단편(fragment), 그리고 이들의 이용방법에 관한 것이다. 이 항체 및 항체 단편은 IL-18이 원인이 되어 야기되는 염증, 면역이상성 질환의 치료약으로서 기대된다.

아토피성 피부염(atopic dermatitis(AD))은 주로 외적자극에 대한 염증성 피부병변으로, 만성 반복성의 심한 가려움증을 동반하는 질환이다. AD 발증(發症)의 메카니즘은 불명확한 점이 많지만, AD의 발증에는 유전적 배경이 있으며, AD환자의 혈청 중에는 높은 레벨의 IgE가 존재한다. 또한, AD 발증의 메카니즘에는 활성화 T세포, 호염기구, 비만세포가 깊이 관여한다. 특히, 알레르겐(allergen)으로 인한 비만세포 혹은 호염기구 상의 Fcε수용체(FcεR)에 결합된 IgE 분자의 가교에 의 해, 이들 세포가 활성화된다. 그 결과, 2형 헬퍼 T(Th2)세포에서 유래된 사이토카인과 화학매개물질(chemical mediator)이 생산되어 AD가 발증한다고 추정되고 있다. Th2 사이토카인으로서 중요한 것은 IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 등이며, 화학매개물질로서 중요한 것은 히스타민, 세로토닌(serotonin), 류코트리엔(leukotriene) 등이다.

헬퍼 T세포(Th)는 항원자극을 받으면 사이토카인을 생산하는데, 그 생산 패턴에 따라 2개의 아(亞)집단(Th1과 Th2 세포)으로 분류된다. 1형 헬퍼 T(Th1)세포가 자극을 받으면 IFN-γ, IL-2, TNF-β 등의 Th1 사이토카인을 생산하고, 2형 헬퍼 T(Th2)세포가 자극을 받으면 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 등의 Th2 사이토카인을 생산한다. 전자(Th1 세포)는 주로 세포성 면역을 유도하며, 후자(Th2 세포)는 액성 면역을 유도하고, 때로는 알레르기 응답을 유도한다. 나이브 T세포는 IL-12의 존재하에서 항원 자극을 받으면 Th1 세포로 분화하고, 또한 IL-4의 존재하에서 항원 자극을 받으면 Th2 세포로 분화한다.

IL-18은 발견 당시 T 세포나 NK(내츄럴 킬러) 세포로부터 IFN-γ의 생산을 유도하는 인자로서 주목받아 왔다(Okamura, H. et al. Nature 378, 88(1995)). 그러나, IL-18이 이와 같은 기능을 발휘하는 것은 IL-12가 공존하는 경우이다(Nakanishi, K. et al., Annu. Rev. Immunol., 19, 423(2001)). 또한, Th1 사이토카인인 IFN-γ는 Th2 사이토카인인 IL-4의 작용을 저지하므로, IFN-γ을 유도하는 IL-18은 Th2 세포에 의한 면역반응을 억제하여 항 알레르기 작용을 나타낸다고 생각되었다.

기생충을 마우스에 감염시키면, Th2 세포가 유도되어 IgE가 생산된다. 발명자는 감염 직후부터 IL-12 및 IL-18을 투여하면, T세포, NK세포, B세포 등으로부터 IFN-γ의 생산이 유도되어 IgE의 생산이 억제되는 것을 밝혀내었다(Yoshimoto, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, 3948(1997)).

또한, IL-18 만을 투여하면 IgE의 생산이 증강되는 것도 규명하였다(Yoshimoto, T. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA., 96, 13962(1999)). 또한, 그 후의 해석으로부터, IL-18을 정상적인 마우스에 투여하면 IgE의 생산이 유도되는 것도 명확해졌다(Yoshimoto, T. et al., Nat. Immunol,. 1, 132(2000)).

생체 내에 투여된 IL-18은 CD4 양성 T세포(CD4⁺T세포)에 작용하여 CD40 리간드(CD40L)의 발현과 IL-4, IL-5, IL-13 등의 생산을 유도한다(Yosimoto, T. et al., J. Exp. Med., 197, 997(2003)). 또한, 생체내에서 B세포는 IL-18의 자극을 받은 CD4 양성 T세포가 발현하는 CD40L과, IL-4의 자극을 받아 IgE를 생산한다.

IL-18은 in vitro에서, IL-3에 의해 유도된 호염기구와 비만세포에 작용하여 IL-4, IL-3, 히스타민 등의 생산을 유도한다(Konishi, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11340(2002)).

종래의 이론에서는 처음에 언급한 바와 같이, 비만세포 상의 FcεR에 Fc 부위를 통해 결합하는 복수의 IgE분자에 알레르겐이 결합하여 이들 IgE 분자를 가교함으로 인해 비만세포가 활성화된다고 생각되어왔다. 지금도 이 정설은 옳지만, 발명자들은 IL-18이 알레르겐 및 IgE의 개재없이 직접적으로 비만세포나 호염기구 를 활성화하여 IL-4, IL-3, 히스타민 등의 생산을 유도하는 것을 밝혀냈다(Yoshimoto, T. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA., 96, 13962(1999)). 이와 같은 경우도 알레르기성 염증이 발생한다.

IL-18은 생물학적으로 불활성인 전구체(IL-18 전구체)로서 생산되고, 카스파제 1의 작용으로 개열(開裂)되어 활성형이 되며, 세포 밖으로 분비된다(Gu, Y. et al., Science, 275, 206(1997)). 발명자는 피부의 케라티노사이트에서 IL-18 전구체가 생산되어 축적되어 있기 때문에, 피부의 케라티노사이트 특이적으로 카스파제 1을 과잉 발현시킨 마우스(카스파제 1 트랜스제닉 마우스(transgenic mouse))를 제작하였다(Yamanaka, K. et al., J. Immunol., 165, 997(2000)). 그 결과, 이 마우스는 생물학적으로 활성이 있는 IL-18을 대량으로 생산하였다. 또한, 이 마우스는 혈중에 대량의 IgE를 생산하고 있었다(Yoshimoto, T. et al., Nat. Immunol,.1, 132(2000), Konishi, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11340(2002)). 그리고, 이 마우스는 알레르겐이 없는 환경에서 사육되고 있음에도 불구하고, 심한 아토피성 피부염 증세를 보였다(Konishi, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11340(2002)).

그런데, IL-4와 IL-13의 시그널은 Stat6을 통해 표적세포의 핵 내로 전달됨으로써 이들 사이토카인의 작용을 발휘하는 것이 밝혀지고 있다. 발명자들은 stat6을 결손시킨 마우스가 IgE를 생산하지 않는 것을 밝혀냈다(Takeda, K. et al., Nature, 380, 627(1996)). 그리고, 이와 같은 Stat6 유전자를 결손시킨 마우스와, 피부의 케라티노사이트 특이적으로 카스파제 1을 과잉 발현시킨 마우스(카스 파제 1 트랜스제닉 마우스)를 교배하여 stat6 유전자 결손 카스파제 1 트랜스제닉 마우스를 제작하였다. 그 결과, 이 마우스는 전혀 IgE를 만들지 않았지만, 심한 아토피성 피부염 증세를 보이는 것이 밝혀졌다(Konishi, H. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 99, 11340(2002)).

한편, 발명자는 IL-18 유전자를 결손한 마우스와 카스파제 1 트랜스제닉 마우스를 교배함으로써, IL-18 결손 카스파제 1 트랜스제닉 마우스도 제작하였다. 그 결과, 이 마우스는 IgE 생산을 억제당하고는 있었지만, 더욱 더 대량의 IgE을 혈중에서 확인하였다. 그런데, 이 마우스는 IgE를 생산하고 있음에도 불구하고, 아토피성 피부염의 발증이 완전히 억제되고 있었다(Konishi, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11340(2002)).

이들 결과를 보건데, IgE의 생산을 억제하는 것보다도 IL-18의 작용을 억제하는 것이 아토피성 피부염의 치료에 유효하다고 판단된다.

IL-18은 발견 당초 IFN-γ 유도인자로 불리워졌던 것처럼, IL-12와 상승적으로, Th1세포나 NK세포에 작용하여 IFN-γ의 생산을 강력하게 유도한다(Okamura, H. et al. Nature 378, 88(1995)., Nakanishi, K. et al., Annu. Rev. Immunol., 19, 423(2001)). 또한, IL-18은 이들 세포상에 Fas 리간드(FasL)의 발현을 증강시킨다(Tsutsui, H. et al., J. Immunol., 159, 3961(1997)). FasL은 삼량체가 되면 세포의 아포톱시스(apotopsis)를 유도한다.

발명자는 Propionibacterium acnes를 투여한 마우스의 간장에 존재하는 Kupffer세포가, Fas를 발현하고 있다가, FasL의 자극을 받으면, 활성형의 IL-18을 생산하는 것을 보고하였다(Tsutsui, H. et al., Immunity, 11, 359(1999)). 또한, IL-18은 NK세포 및 Th1세포에 작용하여 FasL의 발현을 증강시킨다. 이와 같이 IL-18과 FasL과의 사이에는 포지티브 상관성(positive feedback loop)이 있는 것도 밝혀졌다(Tsutsui, H. et al., J. Immunol., 158, 3961(1997), Tsutsui, H. et al., Immunity, 11, 359(1999), Tsutsui, H. et al., Immunol. Rev., 174, 192(2000)). 그 때문에, 생체내에서 IL-18이 과잉으로 생산되면, 간장이나 장관에서 중대한 장기장애가 일어나는 것이 규명되었다. 이와 같이 IL-18은 소위 Th1병의 원인이 되기도 한다.

이와 같은 질환 이외에도, Th1세포로 인해 유도되는 기관지 천식, 기타 각종 질환에서 IL-18이 병태(病態)에 관여함이 지적되고 있다.

이상과 같이, IL-18의 생산 혹은 활성의 제어는 이와 같은 IL-18 의존성의 아토피성 피부염을 비롯한 IL-18 의존성 질환의 치료법으로서, 혹은 IL-18의 과잉생산이 원인이 되어 질환의 발증을 유도 혹은 더욱 악화시키는 Th1병의 치료법으로서 매우 중요하다.

그 때문에, IL-18의 생리활성을 중화시키는 특이적인 모노클로날 항체를 개발할 수 있다면, IL-18이 관여하는 수많은 질환의 유효한 치료수단이 될 것으로 기대된다.

그런데, 인간 IL-18에 대한 항체(항인간 IL-18 항체)로서는 마우스나 래트(rat) 유래의 모노클로날 항체가 몇 개인가 취득되어 있음에 지나지 않는다(예를 들면, 일본 공개특허공보 특개2000-236884호(2000년 9월 5월 공개), WO00/56771의 국제출원(2000년 9월 28일 공개)).

그러나, 종래의 항인간 IL-18 항체는 주로, 인간 이외의 이종(異種)동물에서 유래된 모노클로날 항체이기 때문에, 인간에게 투여할 경우에는 이물질로서 인식, 배제된다. 따라서, 종래의 항인간 IL-18 항체를 인간 IL-18이 관여하는 질환의 치료약제로서 이용하는 것은 곤란하다. 특히, 만성 자가면역성 질환의 치료에서는 장기간의 계속 투여가 이루어지므로, 투여 항체에 대한 항체의 출현이 문제가 된다.

이 문제를 해결하는 방법으로서, 인간 IL-18에 대한 마우스 모노클로날 항체를 유전자 공학적 수법을 이용하여 인간화하는 것을 생각해 볼 수 있다.

그러나, 마우스 모노클로날 항체를 인간화하면, 항원성은 저하되지만, 만성 자가면역성 질환환자에 대한 반복 투여나 장기 투여를 실시했을 때에는 그 인간화 항IL-18 항체의 활성을 저해하는 등의 항체(저지항체)가 만들어질 가능성도 부정할 수 없다. 그 결과, 현저한 치료효과는 기대할 수 없으며, 경우에 따라서는 중대한 부작용이 발생될 가능성도 있다고 하는 문제를 가지고 있다.

그 때문에, 반복 투여나 장기 투여를 하는 경우에도 안정성이 높은 항인간 IL-18 항체의 개발이 절실히 요망되고 있다.

본 발명은 상기한 과제를 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 안전성과 치료효과를 겸비한 인간 항인간 항인터루킨-18 항체 및 그 단편을 제공함과 아울러, 그들의 이용방법을 제안하는 것에 있다.

본 발명자는 상기 과제를 감안하여 예의 검토한 결과, 건강한 사람의 말초혈 B림프구로 조제한 면역 글로블린 H쇄 및 L쇄의 가변영역(V_H, V_L)을 코딩하는 유전자를 발현한 파지 디스플레이 라이브러리로부터, 완전 인간 항인간 IL-18 항체의 단쇄 가변영역(scFv) 분자(항체 단편)를 취득하여, 그 아미노산 서열 및 그것을 코딩하는 cDNA의 염기서열을 밝혀내었다. 또한, 이 scFv가 인간 IL-18의 생리활성을 저해하는 사실을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 의학상 또는 산업상 유용한 방법·물질로서 하기 A)∼X)의 발명을 포함하는 것이다.

A) 인간 인터루킨-18에 대한, 인간 항인간 인터루킨-18 항체.

B) 이하의 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드로 이루어진 H쇄의 상보성 결정영역과, 하기 (c) 또는 (d)의 폴리펩티드로 이루어진 L쇄의 상보성 결정영역을 포함하는 상기 A)에 기재된 인간 항인간 인터루킨-18 항체 :

(a) 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,

(b) 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 인간 인터루킨-18에 대한 H쇄의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드,

(c) 서열번호 10 내지 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,

(d) 서열번호 10 내지 12로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 인간 인터루킨-18에 대한 L쇄의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드.

C) 이하의 (e) 또는 (f)의 폴리펩티드로 이루어진 H쇄 가변영역과, (g) 또는 (h)의 폴리펩티드로 이루어진 L쇄 가변영역을 포함하는 상기 A) 또는 B)에 기재된 인간 항인간 인터루킨-18 항체 :

(e) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,

(f) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 인간 인터루킨-18에 대한 H쇄 가변영역이 되는 폴리펩티드,

(g) 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,

(h) 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 인간 인터루킨-18에 대한 L쇄 가변영역이 되는 폴리펩티드.

D) 이하의 (e) 또는 (f)의 폴리펩티드로 이루어진, 인간 인터루킨-18에 대한 인간 유래의 항체(인간 항인간 IL-18 항체)의 H쇄 가변영역 단편 :

(f) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 인간 인터루킨-18에 대한 H쇄 가변영역이 되는 폴리펩티드.

E) 이하의 (g) 또는 (h)의 폴리펩티드로 이루어진, 인간 인터루킨-18에 대한 인간 유래의 항체(인간 항인간 IL-18 항체)의 L쇄 가변영역 단편 :

F) 상기 B)에 기재된 H쇄의 상보성 결정영역을 포함하는 H쇄 가변영역 단편 또는 상기 D)에 기재된 H쇄 가변영역 단편과, 상기 B)에 기재된 L쇄의 상보성 결정영역을 포함하는 L쇄 가변영역 단편 또는 상기 E)에 기재된 L쇄 가변영역 단편을 연결하여 된, 인간 인터루킨-18에 대한 인간 유래 항체의 단쇄 가변영역 단편.

G) 상기 B)에 기재된 H쇄의 상보성 결정영역을 포함하는 H쇄 가변영역 단편 또는 상기 D)에 기재된 H쇄 가변영역 단편, 및/또는, 상기 B)에 기재된 L쇄의 상보성 결정영역을 포함하는 L쇄 가변영역 단편 또는 상기 E)에 기재된 L쇄 가변영역 단편에, 인간 유래의 정상영역(constant regiion)을 연결하여 된, 인간 인터루킨-18에 대한 인간 유래의 항체(인간 항인간 IL-18 항체) 또는 그 단편.

H) 상기 항체의 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, scAb, 또는 scFvFc인 상기 G)에 기재된 항체의 단편.

I) 상기 A)∼H) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편에, 수식제가 결합되어 된 수식항체.

J) 상기 A)∼H) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 코딩하는 유전자.

K) 서열번호 1 또는 7로 표시되는 염기서열을 오픈 리딩 프레임영역으로서 갖는 상기 J)에 기재된 유전자.

L) 상기 J) 또는 K)에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.

M) 상기 J) 또는 K)에 기재된 유전자가 도입된 형질전환체.

N) 상기 J) 또는 K)에 기재된 유전자를 숙주에 발현시킴으로써, 인간 유래의 인간 항인간 인터루킨-18 항체 또는 그 단편을 생산하는 방법.

O) 상기 A)∼H) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편, 또는 상기 I)에 기재된 수식항체를 이용한 인간 인터루킨-18 검출기구.

P) 상기 A)∼H) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편, 또는 상기 I)에 기재된 수식항체를 포함하는 인간 인터루킨-18 검출시약을 이용하여, 피검시료 중의 인간 인터루킨-18의 양을 측정하는 면역질환의 진단키트.

Q) 상기 P)에 기재된 검출시약을 이용하여 측정한 피검시료 중의 인간 인터루킨-18의 양에 기초하여 면역질환을 진단하는 방법.

R) 인간 인터루킨-18 안타고니스트(antagonist)를 유효성분으로 하는 인간 인터루킨-18 활성 저해제.

S) 상기 인간 인터루킨-18 안타고니스트가 이하의 어느 한 물질인, 상기 R)에 기재된 인간 인터루킨-18 활성저해제.

이하의 어느 한 물질을 포함하는 인간 인터루킨-18 활성저해제 :

ⅰ) 상기 A)∼C) 중 어느 하나에 기재된 인간 항인간 인터루킨-18 항체,

ⅱ) 상기 D)∼H) 중 어느 하나에 기재된 항체의 단편,

ⅲ) 상기 I)에 기재된 수식항체,

ⅳ) 상기 ⅰ)∼ⅲ) 중 어느 하나에 기재된 항체, 항체의 단편, 또는 수식항체가 인식하는 인간 인터루킨-18상의 항원결정영역에 기초하여 분자 설계된 저분자 화합물.

T) 상기 J) 또는 K)에 기재된 유전자를 포함하는 유전자 치료제.

U) 상기 R) 또는 S)에 기재된 인간 인터루킨-18 활성저해제, 또는 상기 T)에 기재된 유전자 치료제를 포함하는 면역질환치료제.

V) 상기 U)에 기재된 면역질환치료제를 투여하여 치료하는 면역질환 치료방법.

W) 항원과 인간 인터루킨-18로 인한 자극에 의해 헬퍼 T1 세포로부터 생산하는 사이토카인을 저해하는 것을 특징으로 하는 상기 U)에 기재된 면역질환치료제.

X) 인간 IL-18이 관여하는 알레르기, 염증, 만성 면역이상질환에 적용하는 것임을 특징으로 하는 상기 U) 또는 W)에 기재된 면역질환치료제.

본 발명에 따르면, 이제까지와 같이 키메라 항체 또는 인간화 항체가 아니라, 인간 유래의 인간 IL-18에 대한 항체 및 그 단편, 그리고 그들의 이용방법을 제공할 수 있다. 그 때문에, 인간 IL-18이 직접 또는 간접적으로 관여하는 질병의 치료에 있어서, 반복 투여나 장기 투여를 실시하여도 현저한 치료 효과와 높은 안전성을 유지하는 치료약을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적, 특징 및 뛰어난 점은 이하에 나타낸 기재에 의해 충분히 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 이점은 첨부도면을 참조한 하기의 설명으로 명확해질 것이다.

도 1은 실시예 1에 있어서 분리한 클론 scFv의 인간 IL-18에 대한 특이성을 ELISA에 의해 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 실시예 1에 있어서 정제한 인간 유래의 scFv의 인간 IL-18에 대한 특이성을 ELISA에 의해 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 실시예 1에 있어서 scFv(h18-40, h18-108)가 IL-18에 의한 인간 골수 단핵구 KG-1세포로부터의 INF-γ의 생산을 저해하는 것을 나타낸 그래프이다.

도 4는 실시예 1에 있어서 scFv(h18-108)가 IL-18의 인간 골수 단핵구 KG-1세포로의 결합을 저해하는 것을 나타낸 그래프이다.

도 5는 도 4에 있어서 scFv(콘트롤)의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 scFv(h18-108)의 웨스턴블로팅의 결과를 나타낸 도면이다.

도 7은 scFv(h18-108)의 겔 여과 크로마토그래피의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 실시예 2에서의, Th1세포 및 Th2 세포의 자극으로 인해 각 세포로부터 생산된 사이토카인의 양을 나타낸 그래프이다.

도 9는 실시예 2에서의, Th1세포 및 Th2 세포의 자극으로 인해 각 세포 표면의 IL-18Rα쇄의 발현 레벨을 나타낸 도면이다.

도 10은 실시예 2에서의, IL-18의 용량과 Th1세포로부터의 사이토카인의 생산량과의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 11은 실시예 2에서의, Th1세포를 자극한 후의 배양시간과, Th1세포로부터의 사이토카인의 생산량과의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 12는 실시예 2에 있어서, IL-18 자극을 받은 Th1세포에서의, 세포질 IFN-γ 및/또는 IL-13에 양성인 CD4⁺T세포의 비율을 FACS 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 13은 실시예 2에서의, 항CD3 항체자극을 받은 Th1세포 중의 IFN-γ⁺Th1세포의 비율과 IFN-γ⁺Th1세포의 양성 선별예를 나타낸 도면이다.

도 14는 실시예 2에서의, IFN-γ⁺Th1세포를 항CD3과 IL-18에 의해 자극한 경우의 사이토카인의 생산량을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 구체적 양태에 대해 설명한다. 또한, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

(1) 본 발명의 항체 및 그 단편

본 발명자는 인간 인터루킨-18(IL-18)에 대한 인간 항인간 IL-18 항체에 대해 검토한 결과, 파지 디스플레이법에 의해 얻어진 인간 유래의 단쇄 가변영역 단편(scFv)이, 인간 IL-18에 의해 유도되는 시그날 전달 및 INF-γ생산을 저해하는 것을 밝혀냈다. 또한, 이 단쇄 가변영역 단편(scFv)에서의 상보성 결정영역(CDR), H쇄 및 L쇄의 가변영역의 아미노산 서열 및 그들을 코딩하는 유전자의 염기서열을 동정하였다.

서열번호 3은 V_H쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 4∼6은 이 V_H쇄의 상보성 결정영역(CDR 1∼3)의 아미노산 서열을 나타낸다. 즉, 서열번호 3으로 나타낸 V_H쇄의 아미노산 서열에 있어서, 31번째∼35번째의 아미노산 서열이 CDR1(서열번호 4)에 대응하며, 50번째∼66번째의 아미노산 서열이 CDR2(서열번호 5)에, 99번째∼108번째의 아미노산 서열이 CDR3(서열번호 6)에 대응하고 있다.

한편, 서열번호 9는 V_L쇄의 아미노산 서열을 나타내고 있다. 서열번호 10∼이 V_L쇄의 상보성 결정영역(CDR1∼3)의 아미노산 서열을 나타내고 있는 33번째의 아미노산 서열이 CDR1(서열번호 10)에, 49번째∼55번째의 아미노산 서열이 CDR2(서열번호 11)에, 88번째∼98번째의 아미노산 서열이 CDR3(서열번호 6)에 각각 대응하고 있다.

본 발명의 항체 및 그 단편은 상기 V_H쇄 및 V_L쇄, 그리고 그들의 CDR로서, 서열번호 3∼6 및 9∼12로 표시되는 서열로 한정되는 것이 아니라, 그들의 일부가 개변된 변이 폴리펩티드이어도 좋다.

즉, V_H쇄의 CDR로서는 (a) 서열번호 4∼6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 뿐만아니라, (b) 서열번호 4∼6으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 인간 인터루킨-18에 대한 H쇄의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드도 포함된다.

한편, V_L쇄의 CDR로서는 (c) 서열번호 10∼12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 뿐만아니라, (d) 서열번호 10∼12로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 인간 인터루킨-18에 대한 L쇄의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드도 포함된다.

또한, V_H쇄 가변영역은 (e) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 뿐만아니라, (f) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 인간 인터루킨-18에 대한 H쇄 가변영역이 되는 폴리펩티드도 포함된다.

마찬가지로, V_H쇄 가변영역은 (g) 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 뿐만 아니라, (h) 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 인간 인터루킨-18에 대한 L쇄 가변영역이 되는 폴리펩티드도 포함된다.

여기서, 상기 "1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가 된"이란, 부위특이적 돌연변이 유발법과 같은 공지된 변이단백질 제작법에 의해 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가될 수 있을 정도의 수만큼의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들면 상기 (b)의 폴리펩티드는 상기 (a)의 폴리펩티드의 변이 펩티드이며, 여기에서 말하는 '변이'란 주로 공지된 변이단백질 제작법에 의해 인위적으로 도입된 변이를 의미하는데, 천연(예를 들면 인간)에 존재하는 비슷한 변이 폴리펩티드를 단리 정제한 것이어도 좋다.

또한, 상기 '변이'는 후술하는 바와 같이 본 발명의 항체 또는 그 단편을, 치료약으로서 이용할 경우(인간에게 투여하는 경우)에는 인간 유래의 구조 또는 인간이 면역반응을 일으키지 않는 범위에서 실시하며, 검출기구나 진단 키트 등으로서 이용할 경우(인간에게 투여하지 않는 경우)에는 특별히 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그 단편을 인간에게 투여할 경우, 항원을 인식하는 CDR의 고차 구조를 유지하는 범위에서 변이를 실시하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 항체 및 그 단편은 부가적인 폴리펩티드를 포함하는 것이어도 좋다. 이와 같은 폴리펩티드가 부가되는 경우로서는 예를 들면, His나 Myc, Flag 등에 의해 본 발명의 단백질이 에피토프(epitope) 표식되는 등의 경우를 들 수 있다.

또한, CDR은 항원을 인식하는 영역이기 때문에, 인간 IL-18은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 상보성 결정영역(CDR)에 의해 인식된다. 따라서, 적어도 상기 CDR를 갖는 항체는 인간 IL-18을 특이적으로 인식할 수 있다. 즉, 상기 V_H쇄 및 V_L쇄는 적어도 상기 V_H쇄 및 V_L쇄의 CDR을 포함하고 있으면 되며, 그 이외에는 인간 유래의 V_H쇄 및 L쇄의 아미노산 서열이면 된다. 이로써, 인간 IL-18에 대한 특이성은 계속 유지된다. 단, CDR은 H쇄 및 L쇄의 가변영역의 1차 구조와 고차 구조에 의해 특이적으로 구축되고 있다. 이 때문에, 적어도 상기 V_H쇄 및 V_L쇄의 CDR를 포함하며, 그 외의 것을, 인간 유래의 V_H쇄 및 L쇄로부터 인간 항IL-18 항체를 구성할 경우, 인간 IL-18에 대한 특이성을 갖는 항체로 하는 것이 가능하다. 예를 들면, 적어도 CDR의 고차구조를 유지함으로써, 인간 IL-18에 대한 특이성을 갖는 항체로 하는 것이 가능하다.

보다 구체적으로는 본 발명에 따른 항체 및 그 단편으로서는 인간 유래의 것으로, 예를 들면 이하의 가)∼라)에 나타낸 것을 들 수 있다.

가) 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 H쇄의 상보성 결정영역을 포함하는 V_H쇄,

나) 상기 (e) 또는 (f)의 폴리펩티드로 이루어진 V_H쇄,

다) 상기 (c) 또는 (d)에 기재된 L쇄의 상보성 결정영역을 포함하는 V_L쇄,

라) (g) 또는 (h)의 폴리펩티드로 이루어진 V_L쇄,

마) 상기 가) 또는 나)의 V_H쇄와 상기 다) 또는 라)의 V_L쇄를 연결하여 된 단쇄 가변영역 단편(scFv),

바) 상기 가) 또는 나)의 V_H쇄 및/또는 상기 다) 또는 라)의 V_L쇄에 인간 유 래의 정상(定常)영역을 연결하여 된 단편 등이어도 좋다.

상기 마) 및 바)에 있어서, 상기 V_H쇄와 V_L쇄을 연결할 경우, 통상, 적당한 펩티드 링커 등에 의해 연결된다. 이 펩티드 링커로서는 예를 들면 10∼25 아미노산 잔기로 이루어진 임의의 단쇄 펩티드가 사용된다.

또한, 상기 바)에 기재된 상기 V_H쇄 및/또는 V_L쇄에 인간 유래의 정상영역을 연결하여 된 단편(프래그먼트)은 Fab, Fab', F(ab')₂나, 적어도 일부의 Fc부를 갖는 scAb, 또는 scFvFc, 그리고 완전항체이어도 좋다. 또한, scAb란 scFv에 L쇄 또는 H쇄의 정상영역의 일부 도메인(C도메인)이 결합한 것, scFvFc란 scFc에 H쇄 및 L쇄의 전체 정상영역이 결합한 것이다.

또한, 본 발명의 항체 및 그 단편에는 안정성이나 항체가를 향상시키기 위해, 수식제가 결합되어 있어도 좋다. 즉, 본 발명의 항체 및 그 단편은 수식항체이어도 좋다. 이 수식제로서는 예를 들면 당쇄나 고분자 등을 들 수 있다. 당쇄 수식을 실시한 경우에는 그 당쇄가 어떤 생리활성을 가질 가능성이 있지만, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 단순한 고분자 수식을 실시한 경우에는 그 자체가 생리활성을 나타내지 않는다. 또한, PEG화에 의해 간장에서의 흡수를 억제하거나, 혈중에서의 안정성을 향상시키거나 할 가능성이 있다. 즉, 수식제로서는 PEG 등의 단순 고분자가 바람직하다.

또한, 본 발명의 항체 및 그 단편의 수식제에 의한 수식은 상술한 변이펩티드의 제작과 마찬가지로, 치료약으로서 이용할 경우에는 인간이 면역 반응을 일으 키지 않는 범위에서 실시하며, 검출기구나 진단 키트 등으로서 이용할 경우에는 특별히 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그 단편을, 인간에게 투여할 경우, 항원을 인식하는 CDR의 고차구조를 유지하는 범위에서 수식하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 항체는 항체와 구조적으로 관련된 단백질도 포함하는 의미, 즉 면역 글로블린의 의미이다. 또한, 본 발명의 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 중 어느 한 클래스여도 좋다. 바꿔말하면, 단량체이어도 좋으며, 2량체, 3량체, 4량체, 5량체와 같은 다량체이어도 좋다.

후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 상기 scFv에 대해 상세한 해석을 진행한 결과, 하기 실시예에 있어서 상세히 서술하는 바와 같이, 그 작용·성질에 대해 다음과 같은 지견(知見)이 얻어졌다.

[1] 인간 IL-18과 특이적으로 결합한다.

[2] 인간 IL-18에 의해 유도되는 시그널 전달 및 INF-γ의 생산을 저해한다.

이와 같이 상기 scFv는 인간 유래의 아미노산 서열을 가지고 있기 때문에, 항체의 활성을 저지하는 저지항체가 형성될 가능성은 매우 낮다. 또한, 인간 IL-18과 강하게 결합함으로써, 그 생리활성을 저해하는 작용이 있으므로, 인간 IL-18에 의해 야기되는 여러 가지 면역응답을 저해할 수 있다. 따라서, 상기 scFv 및 그것을 포함하는 항체 또는 그 단편은 인간 IL-18이 직접 또는 간접적으로 관여하는 질환, 예를 들면 이 면역 응답에 의해 야기되는 알레르기, 염증, 및 만성 면역이상질환의 치료를 위해 이용할 수 있다. 이와 같은 치료약이 개발되면, 인간 IL- 18이 관여하는 질환의 새로운 치료방법의 확립이 기대된다.

(2) 본 발명에 따른 유전자

본 발명에 따른 유전자는 상기 (1)에서 설명한 항체 또는 그 단편을 코딩하는 유전자이며, 서열번호 1 또는 7로 표시되는 염기서열을 오픈 리딩 프레임(ORF)영역으로서 갖는 유전자, 및 그 염기서열의 일부를 개변한 개변유전자 등이 포함된다.

상기의 유전자는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 코딩하고 있으므로, 적당한 숙주(예를 들면 세균, 효모)에 도입하여 본 발명의 항체 또는 그 단편을 발현시킬 수 있다.

또한, 상기 "유전자"는 상기 (1)의 항체 또는 그 단편을 코딩하는 서열 이외에, 비번역영역(UTR)의 서열이나 벡터 서열(발현 벡터 서열을 포함한다) 등의 서열을 포함하는 것이어도 좋다. 예를 들면, 서열번호 1 또는 7에 기재된 서열을 벡터 서열에 연결하여 본 발명의 유전자를 구성하고, 이를 적당한 숙주에서 증폭시킴으로써, 본 발명의 유전자를 원하는 대로 증폭시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자의 일부 서열을 프로브에 사용하여도 좋다. 또한, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 유전자는 인간 IL-18이 관여하는 질환용 유전자 치료제(유전자 치료약)로서 이용할 수 있다.

(3) 본 발명의 항체 및 그 단편의 취득방법 및 생산방법

상기 (1)에 기재된 항체 및 그 단편은 예를 들면 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 소위 파지 디스플레이법을 이용함으로써 취득할 수 있다. 또한, 상기 (1)에 기재된 항체 및 그 단편은 상기 (2)에 기재된 유전자를 숙주에 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 또한, 항체 및 그 단편의 취득방법 및 생산방법은 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 구체적으로는 건강한 사람의 말초혈 B림프구로부터 mRNA을 추출하여 면역 글로블린 유전자의 V_H쇄, V_L쇄를, 그 양단을 규정하는 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR법에 의해 증폭함으로써, 다양한 서열을 갖는 H쇄, L쇄의 V영역 집단을 얻는다. 이어, 다시 펩티드 링커부분을 코딩하는 DNA, 및 그 양단을 각각 H쇄, L쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭함으로써, H쇄, L쇄의 V영역의 램덤한 조합에 의한 다양한 scFv DNA집단을 조제한다. 얻어진 scFv DNA을 파지미드벡터(pCANTAB5E)에 삽입하여, scFv 디스플레이 파지 라이브러리를 제작한다. 이 라이브러리를 플라스틱 튜브에 고상화한 인간 IL-18과 반응시켜, 세정에 의해 미반응의 scFv 디스플레이 파지를 제거한 후에, 인간 IL-18과 결합되어 있는 scFv 파지 클론을 산으로 용출한다. 분리한 파지 클론으로부터 scFv DNA를 조제하고, 이를 발현벡터에 삽입하여, 이 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주를 통상의 방법에 따라 배양하여 목적하는 scFv 단백만을 얻는 것이다.

또한, 서열번호 1 및 7은 파지 디스플레이 항체법에 의해, 취득한 인간 IL-18에 대한 단쇄 가변영역(scFv)의 V_H쇄 및 V_L쇄을 코딩하는 cDNA의 염기서열이다.

scFv DNA의 발현방법으로서는 예를 들면 대장균에서 발현시킬 수 있다. 대장균의 경우, 통상 사용되는 유용한 프로모터, 항체 분비를 위한 시그널 서열들, 발현시키는 scFv를 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 프로모터로서는 lacZ 프로모터, araB 프로모터 등을 들 수 있다. scFv의 분비를 위한 시그널 서열로서는 대장균의 페리플라즘(periplasm)에 발현시킬 경우, pelB 시그널 서열(Lei, SP., et al, J. Bacteriol., 1987, 169 : 4379-4383)을 사용하면 된다. 배양 상청액중에 분비시키기 위해서는 M13 파지의 g3 단백의 시그널 서열을 사용할 수도 있다.

상기와 같이 발현된 scFv는 세포내외, 숙주로부터 분리하여 균일해질 때까지 정제할 수 있다. 본원 발명에서 발현되는 scFv는 그 C말단에 E tag서열이 부가되어 있으므로, 항E tag 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 용이하게 단시간에 정제할 수 있다. 기타, 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 조합하여 정제하는 것도 가능하다. 예를 들면, 한외여과, 염석, 겔여과/이온교환/소수크로마토 등의 컬럼 크로마토그래피를 조합하면 항체를 분리·정제할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 scFv 단백(폴리펩티드)은 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이 인간 IL-18에 대한 결합활성을 갖는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 인간 항인간 IL-18 항체의 항원결합활성을 측정하는 방법으로서는 ELISA, BIAcore 등의 방법이 있다. 예를 들면 ELISA를 이용할 경우, 인간 IL-18을 고상화한 96 웰 플레이트에 목적의 항 IL-18 항체나 항체 단편을 포함하는 시료, 예를 들면 대장균의 배양 상청액이나 정제 항체를 첨가한다. 이어, 알칼리 포스파타제 등의 효소로 표식한 이차항체를 첨가하고, 플레이트를 인큐베이션, 세정한 후, 발색 기질 파라니트 로페닐포스페이트를 첨가하여 흡광도를 측정함으로써 항원결합활성을 평가할 수 있다.

또한, 본원 발명에 의해 얻어진 scFv 단백은 인간 IL-18에 의해 유도되는 인간 골수 단핵구 KG-1세포로부터의 IFN-γ 생산을 용량의존적으로 억제하는 것도 밝혀졌다.

따라서, 이 scFv 단백은 인간 IL-18의 생물활성을 억제하므로, IL-18의 작용에 의해 야기되는 질환의 예방 또는 치료에 유효할 것으로 기대된다.

(4) 본 발명의 재조합 발현 벡터 등

본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 (2)의 유전자, 즉 상기 (1)의 항체 또는 그 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 것으로, 예를 들면 서열번호 1 또는 7로 표시되는 어떤 염기서열을 갖는 cDNA이 삽입된 재조합 발현벡터를 들 수 있다. 재조합 발현벡터의 제작에는 플라스미드, 파지 또는 코스미드 등을 사용할 수 있는데, 특별히 한정되지 않는다.

이와 같이, 재조합 발현 벡터는 본 발명의 유전자를 포함하는 것이다. 벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않고, 호스트 세포중에서 발현가능한 벡터를 적절히 선택하면 된다. 즉, 호스트 세포의 종류에 따라, 확실하게 유전자를 발현시키기 위해 적절한 프로모터 서열을 선택하고, 이것과 본 발명에 따른 유전자를 각종 플라스미드 등에 삽입한 것을 발현벡터로서 사용하면 된다,

본 발명의 유전자가 호스트 세포에 도입되었는지의 여부, 그리고 호스트 세포중에서 확실하게 발현하고 있는지의 여부를 확인하기 위해, 각종 마커를 이용하 여도 좋다. 예를 들면, 호스트 세포중에서 결실되어 있는 유전자를 마커로서 사용하여, 이 마커와 본 발명의 유전자를 포함하는 프라스미드 등을 발현 벡터로서 호스트 세포에 도입한다. 이로써 마커 유전자의 발현으로부터 본 발명의 유전자 도입을 확인할 수 있다. 혹은 본 발명에 따른 항체 및 그 단편을 융합 단백질로서 발현시켜도 좋으며, 예를 들면 발광해파리 유래의 녹색형광단백질 GFP(Green Fluorescent Protein)을 마커로서 사용하여, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 GFP 융합 단백질로서 발현시켜도 좋다.

상기 호스트 세포는 특별히 한정되지 않으며, 종래의 공지된 각종 세포를 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는 상기 (2) 유전자가 전장(full-length) DNA인 경우의 호스트 세포로서는 인간 또는 마우스 유래의 세포를 비롯하여, 선충 Caenorhabditis elegans, 아프리카발톱개구리(Xenopas laevis)의 난모세포, 각종 포유동물(래트, 토끼, 돼지, 원숭이 등)의 배양세포, 혹은 초파리, 누에나방과 같은 곤충의 배양세포 등의 동물세포를 들 수 있으며, DNA 단편인 경우의 호스트 세포로서는 예를 들면 대장균(Escherichia coli)등의 세균, 효모(출아효모 Saccharomyces cerevisiae나 분열효모 Schizosaccharomyces pombe) 등을 들 수 있는데, 특별히 한정되지 않는다.

상기 발현 벡터를 호스트 세포에 도입하는 방법, 즉 형질전환방법도 특별히 한정되지 않으며, 전기천공법, 인산칼슘법, 리포좀법, DEAE 덱스트란법 등의 종래의 공지된 방법을 적절히 사용할 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 상기 (2)의 유전자, 즉 상기 (1)의 항체 또는 그 단 편을 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체이다. 여기서, "유전자가 도입된"이란 공지된 유전자공학적 수법(유전자 조작기술)에 의해, 대상세포(숙주세포)내에 발현가능하게 도입되는 것을 의미한다. 또한, 상기 "형질전환체"란 세포·조직·기관 뿐만아니라, 동물개체를 포함하는 의미이다. 대상이 되는 동물은 특별히 한정되지 않지만, 소, 돼지, 양, 염소, 토끼, 개, 고양이, 기니피그, 햄스터, 마우스, 래트 등의 포유동물이 예시된다. 특히, 마우스나 래트 등의 설치류 동물은 실험동물·병태(病態)모델동물로서 널리 사용되고 있으며, 그 중에서도 근교계(近交系)가 다수 만들어지고 있고, 수정란의 배양, 체외수정 등의 기술이 마련되어 있는 마우스가 실험동물·병태모델동물로서 바람직하고, 녹아웃 마우스 등은 상기 항체나 그 단편의 또 다른 기능해석, 인간 IL-18이 관여하는 질병의 진당벙법의 개발이나 그 치료방법의 개발 등에 유용하다.

또한, 상기 (1)의 항체 또는 그 단편은 본 발명의 재조합 발현벡터를 사용하여 제작한 본 발명의 형질전환체에 의해서도 생산하는 것이 가능하다.

(5) 본 발명의 항체 및 그 단편의 이용방법

(5-1) 인간 IL-18 검출기구·면역질환의 진단 키트·진단방법

상기 (1)의 항체, 그 항체 진단, 또는 수식항체는 인간 IL-18에 대해 특이적으로 강하게 결합하기 때문에, 인간 IL-18의 검출·측정 등에 이용될 수 있는 가능성이 있다. 즉, 상기 인간 인터루킨-18 검출기구에 따르면, 예를 들면 혈액이나 오줌 등의 시료중에 포함되는 인간 IL-18을 고정도로 검출할 수 있다. 그 때문에, 인간 IL-18이 관여하는 질환의 판정이나 치료효과의 평가를 실시하기 위한 진단용, 치료용으로서 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 인간 IL-18 검출기구는 본 발명의 항체에서의 적어도 CDR의 아미노산 서열을 사용하면 된다. 인간 IL-18 검출기구는 여러 가지 조건 하에서의 IL-18의 검출·측정 등에 이용될 수 있다. 본 발명의 인간 IL-18 검출기구로서는 예를 들면 인간 IL-18과 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 기반(담체)상에 고정화한 항체 팁이나 항체 컬럼 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 면역친화성 크로마토그래피에 의한 인간 IL-18의 정제에도 매우 유용하다. 이 정제방법은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 인간 IL-18과 그 이외 물질의 혼합물에 접촉시켜 항체 또는 그 단편에 인간 IL-18을 흡착시키는 공정과, 흡착한 인간 IL-18을 항체 또는 그 단편으로부터 떼어내어 채취하는 공정을 포함하는 것이다. 이 정제방법에 따르면, IL-18을 단시간 또한 고정도로 정제할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편, 및 그들의 수식항체는 인간 IL-18을 검출하기 위한 시약(인간 IL-18 검출시약)으로서도 광범위한 용도를 갖는다. 즉, 이들의 항체 또는 그 단편에 의한 방사면역검정(radioimmunoassay), 효소면역검정(enzymeimmunoassay), 형광면역검정 등의 표식면역검정을 적용할 때에는 피검시료 중의 인간 IL-18을 신속 또한 정확하게 정성 또는 정량적으로 분석할 수 있다. 이 표식면역검정에서는 상기 항체 또는 그 단편은 예를 들면 방사성 물질, 효소 및/또는 형광물질에 의해 표식하여 사용된다. 또한, 이들 항체 및 그 단편은 인간 IL-18에 특이적으로 반응하여 면역반응을 띠므로, 그 면역반응을 표식물질을 지표로 하여 측정하면, 피검시료 중의 극히 미량의 인간 IL-18을 정밀하게 검출할 수 있다. 표식면역검정은 생물학적 검정에 비해, 한번에 수많은 피검시료를 분석할 수 있을 뿐만아니라, 분석에 필요한 시간과 노력이 적어도 되며, 게다가 분석이 매우 정밀하다는 특징이 있다.

본 발명의 면역질환의 진단키트 및 면역질환을 진단하는 방법은 이와 같은 인간 IL-18의 검출방법에 따라 피검시료(혈액이나 체액, 조직 등) 중의 인간 IL-18의 양을 측정하여, 그 측정결과에 기초하여 면역질환의 진단을 실시하는 것이다. 또한, 상기 '면역질환'은 인간 IL-18이 관여하는 질환이며, 예를 들면 아토피성 피부염, 기도염증, 기도과민성(AHR), 천식 등을 예로 들 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 인간 IL-18의 검출기구에 의한 검출방법은 인간 IL-18을 제조할 때의 공정관리나 제품의 품질관리에 유용하다. 또한, 본 발명의 면역질환의 진단키트 및 진단방법은 조직이나 체액에서의 인간 IL-18의 레벨을 지표로 하는 여러 가지 감수성 질환의 진단이나 각종 면역질환의 치료평가를 실시하기 위해 매우 유용하다.

또한, 일반적으로 진단용으로 사용하는 항체는 마우스, 토끼, 염소 등의 인간 이외의 동물을 면역하여 작성된다. 그러나, 동물의 면역계에서는 자기의 몸을 구성하는 분자에 결합하는 항체를 생산하는 림프구는 배제 또는 불활성화된다. 즉, 동물을 면역하여 작성한 항인간 IL-18 항체 중, 인간 IL-18과 동물의 IL-18에서 매우 닮은 부분을 항원결정영역으로 한 항체는 포함되지 않는다.

이에 비해, 본 발명의 항체는 인간 항인간 IL-18 항체를 제시시킨 파지 라이 브러리로부터 스크리닝된 항체이다. 이 파지에는 동물과 같이 항체를 배제 또는 불활성화하는 기구는 존재하지 않는다. 그 때문에, 본 발명의 항체에는 동물의 면역으로는 제작할 수 없는, 인간, 원숭이, 기타 각종 동물의 IL-18에 공통된 항원결정영역에 결합 특이성을 나타내는 항IL-18 항체가 포함된다. 이와 같은 항체를 본 발명의 검출기구나 진단키트에 사용하면, 인간뿐만 아니라, 원숭이를 비롯한 각종 동물 질환 모델에서의 IL-18 관련질환을 진단할 수 있다.

(5-2) 인간 IL-18 활성저해제 등

상기 (1)의 항체는 인간 IL-18을 특이적으로 인식하는 인간유래의 인간 항인간 IL-18 항체이다. 또한, 이 항체는 인간 IL-18에 특이적으로 결합함과 아울러, 인간 IL-18의 수용체로의 결합을 저해하여 이 수용체를 개재한 시그널 전달도 저해하며, 나아가 인간 IL-18에 의해 유도되는 IFN-γ의 생산도 저해한다.

따라서, 이 항체는 바꿔말하면, 인간 IL-18 안타고니스트이다. 그리고, 이 인간 IL-18 안타고니스트는 인간 인터루킨-18 활성저해제로서 이용할 수 있다.

상기 '인간 IL-18 안타고니스트'로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면이하의 ⅰ)∼ⅳ)의 물질을 들 수 있다 :

ⅰ) 상기 (1)에 기재된 본 발명의 항체,

ⅱ) 상기 (1)에 기재된 본 발명의 항체의 단편,

ⅲ) 상기 (1)에 기재된 본 발명의 항체 또는 그 단편의 수식항체,

ⅳ) ⅰ)∼ⅲ)에 기재된 항체, 항체의 단편, 또는 수식항체가 인식하는 인간 IL-18상의 항원결정영역에 기초하여 분자설계된 저분자 화합물.

여기서, 상기 '인간 인터루킨-18 활성저해제'는 인간 인터루킨-18의 활성을 억제하는 것은 물론, 인간 인터루킨-18의 수용체로의 결합도 길항적으로 저해하는 것이어도 좋으며, 또한 인간 IL-18과 IL-18 수용체와의 복합체에 결합하여 시그널 전달을 저해하는 것이어도 좋다.

또한, 상기 (2)에 기재된 본 발명의 유전자는 인간 IL-18이 관여하는 면역질환에서의 유전자 치료제로서 이용할 수 있다. 이 유전자 치료제를 섭취하면, 체내에서 본 발명의 항체 또는 그 단편이 형성되므로, 상기 인간 IL-18 활성억제제와 동일한 효과가 얻어진다. 또한, 인간 IL-18 항체가 생체내에서 계속 형성되면, 인간 IL-18의 작용을 과잉으로 억제해버리지만, 인간의 경우, IL-18이 결실되었다고 하더라도, IL-1가 IL-18과 동일한 작용을 나타내기 때문에 특별히 문제는 발생하지 않는다.

본 발명의 항체는 인간 IL-18을 특이적으로 인식하는 인간 유래의 인간 항인간 IL-18이다. 즉, 이 항체의 아미노산 서열은 종래의 키메라 항체나 인간화 항체와는 달리 모두 인간에서 유래된 것이다.

따라서, 본 발명의 항체의 작용을 저지하는 항체(저지항체)가 형성될 우려는 없다. 그 때문에, 설사 이 항체를 반복 투여 또는 장기 투여하더라도, 높은 안전성을 계속 유지한 채 효과도 지속하는 것이 가능하다.

그 때문에, 본 발명의 인간 IL-18 활성 저해제 및 유전자 치료제는 인간 IL-18이 관여하는 면역질환의 치료법으로서 유용한 면역질환치료제(면역치료약)으로서 이용가능하다.

또한, 본 발명의 면역질환치료제는 체내에서 그 효과를 발휘하면 되므로, 예를 들면 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(또는 이를 포함하는 인간 IL-18 활성저해제)를 투여하여도 좋으며, 프로드러그(prodrug)화하여 체내에서 대사되어 해당 폴리펩티드가 발현되어도 좋다. 즉, 본 발명의 면역질환치료제는 상기 ⅰ)∼ⅳ)의 인간 IL-18 안타고니스트(인간 IL-18 활성저해제) 또는 상기 유전자 치료제가 프로드러그화되어 있어도 좋다. 즉, 체내에서 활성대사물이 되도록 면역치료약제를 수식하여도 좋다.

또한, 본 발명의 면역질환치료약제에는 1종류 이상의 부형제, 1종류 이상의 결합제, 1종류 이상의 붕괴제, 1종류이상의 활택제, 1종류이상의 완충제 등과 같이 의약품으로서 허용되는 첨가물이 포함되어 있어도 좋다.

이상과 같이, 본 발명의 항체(인간 모노클로날 항체) 및 해당 항체단편 분자는 인간 유래의 항인간 IL-18 항체의 가변영역을 가지며, 인간 IL-18과 강하게 반응하여 IL-18과 IL-18 수용체간의 결합에 저해작용을 나타낸다. 또한, IL-18에 의해 야기되는 여러 가지 면역응답을 저해할 수 있으며, 해당 면역응답에 의해 야기되는 알레르기, 염증 및 면역이상질환의 예방 또는 치료약, 예를 들면 항염증제 혹은 자가면역질환의 치료 및 예방을 위한 약제로서 사용할 수 있다.

또한, 본원발명의 인간 IL-18에 대한 인간 유래 scFv는 IL-18과 특이적으로 결합하여, IL-18에 의해 유도되는 시그널 전달 및 IFN-γ생산을 저해하는 것임이 확인되었다. 따라서, 해당 scFv 및 scFv의 V_H쇄 및 V_L쇄를 인간 정상(定常)영역 또 는 그 일부와 결합시킨 인간 항인간 IL-18 항체 또는 그 항체 단편은 IL-18이 관여하는 질환, 예를 들면 만성 염증성 질환이나 자가면역질환 등의 치료에 적용가능할 것으로 기대된다. 또한, IL-18과는 결합하지만 억제작용을 보이지 않았던 항체를 포함해 이들 항체에서, IL-18의 혈중농도를 측정하여, 병태(病態)의 증상 변동을 모니터링할 수도 있다.

또한, 상술한 바와 같이 본 발명의 항체는 IL-18에 대한 시그널 전달 및 INF-γ 생산을 저해하는 것으로, 그와 같은 특성을 갖는 항체와 인간 IL-18과의 결합 특이성을 나타내는 IL-18상의 항원결정영역을 밝혀내면, 저분자 화합물을 면역질환치료약 개발에 응용하는 것이 가능해진다. 이러한 항원결정영역을 에피토프라 한다. 이 에피토프는 아미노산의 1차 서열 그 자체인 경우나, 혹은 펩티드 사슬의 폴딩방식으로 구축한 입체구조인 경우가 있다. 어느 경우이든, 예를 들면 본 발명자들이 제안한 "모노클로날 항체를 사용한 분자 주형 디자인법"에 의해, 에피토프의 유사화합물(미믹 분자)를 디자인할 수 있다(T. Fukumoto et al., Nature Biotechnology, 16 : 267-270, 1998). 여기서, '저분자 물질'이란 예를 들면 펩티드나 항체 등의 비교적 분자량이 큰 화합물(분자량 1만 이상의 것)이 아니라, 일반적으로 저분자 의약으로서 사용되고 있는, 분자량 1만 미만, 바람직하게는 분자량 3000 미만의 화합물을 나타내고 있다. 또한, 저분자 화합물의 분자량은 작을수록 바람직하다.

또한, 상기 저분자 화합물로서, 펩티드나 보다 저분자량의 화합물을 제작할 경우, 이 미믹 분자의 분자구조에 착안하여 분자설계를 하는, 소위 in sillico 프 로세스에 의해 설계할 수 있다. 이와 같이 in sillico에 의한 분자설계를 함으로써, 저렴하고 동시에 신속하게, 치료약이 될 수 있는 저분자 화합물을 리드 화합물로서 선발할 수 있다.

구체적으로는 예를 들면 후술하는 실시예에서는 인간 항인간 IL-18scFv 항체의 CDR은 서열번호 4∼6, 10∼12로 표시되어 있다. 일반적으로, 항체에 있어서 CDR은 항원을 인식하는 영역(부위)이다. 즉, CDR은 항체의 활성중심이 된다. 즉, 실시예 1에 나타낸 scFv는 CDR에 의해 인간 IL-18을 특이적으로 인식한다. 따라서, 이 CDR의 고차 구조와 거의 일치(바람직하게는 완전히 일치)하도록 저분자 화합물을 설계하면, 그 저분자 화합물은 저분자 의약품으로서 이용될 수 있다. 바꿔 말하면, 저분자 화합물은 CDR의 컨포메이션에 가까워지도록 설계한다. 또한, in sillico 프로세스의 방법은 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면 SBDD(Structure Based Drug Design), CADD(Conputer-Aided Drug Design) 등에 의해, CDR이 갖는 관능기나, CDR의 고차 구조에 기초하여 컴퓨터상에서 설계할 수 있다.

이와 같이 하여 설계한 저분자 화합물은 항체와 같은 단백질(펩티드)에 비해 안정성이 높다. 이 때문에, 이 저분자 화합물은 취급하기 쉬운 의약품으로서 이용될 수 있다.

(5-3) 면역질환 치료약제의 적용예-1

상술한 바와 같이, 본 발명의 인간 IL-18 활성저해제 및 유전자 치료제는 인간 IL-18이 관여하는 면역질환의 치료법으로서 유용한 면역질환치료약제가 된다. 여기서, 면역질환치료약제의 적용예에 대해 설명한다.

Th1 세포 우위의 면역응답은 일반적으로 자가면역질환의 병태로 검토된다. 그러나, Th1 세포 우위의 면역응답은 Th2 세포가 관여하는 질환(천식, 아토피 등)에 대해 방어적이다. 그러나, 이들 연구에서 Th1세포가, Th2 세포가 관여하는 기도과민을 증대시키는 것에 관여함이 밝혀졌다. 또한, Th1세포가 호중구의 증가와 활성화로 인해 기도과민성(AHR)을 유도함이 밝혀졌다.

실제, 천식환자의 기도는 호중구수의 증가뿐만 아니라, IFN-γ, TNFα 및 IL-8 레벨의 증가도 보이는 경우가 있다. 그럼에도 불구하고, 어떻게 Th1세포가 Th2 세포의 영향을 방해하여 병태(病態)를 보이는 지, 그 메카니즘은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 따라서, 기도염증 및 기도과민성이 유도된 경우에 Th1세포가 병태에 관여하는 것을 명확히 규명하는 것은 중요하다.

IL-18은 본래는 항CD3 항체 및 IL-12 존재 하, Th1세포로부터 생산되는 IFN-γ를 증가시키는 인자로서 발견되었다. 이 때문에, IL-12와 IL-18과의 혼합물을 주입하면, in vivo에서 IFN-γ생산세포를 유도하여, Th2 세포가 유도하는 IgE 응답을 저해한다. 그러나, 본 발명자들의 최근 연구에 의해, in vitro에서 유도한 항원특이적 Th1세포 혹은 Th2 세포를, 나이브 호스트 마우스(비감작성 호스트 마우스)에 수동이입 후, 호스트 마우스를 약 1개월간 무처리 상태로 방치해 두면, 이입한 각 세포가 메모리 표현형의 Th1세포 혹은 Th2 세포가 되는 것, 및 이들 세포를 경비적으로 투여한 항원에 의해, 또는 항원 및 IL-18에 의해 자극된 경우에 호스트 동물이 기도염증 증세를 보이는 것이 밝혀졌다(T. Sugimoto et al., J. EXP. Med., 2004, 199, 535-545). 종래의 보고는, IL-13의 중화가 Th2 세포를 이입받은 마우 스의 호산구의 증가와 AHR을 저해한다는 것이었다. 이에 비해, 동일한 처리를 한 Th1세포를 이입받은 마우스에서는 설사 이 처리가 현저하게 기도의 호산구 증가를 감소시키는 것이더라도, AHR가 저해받지 않는다.

이들 결과는 Th1세포가 Th2 세포와는 전혀 다른 양식으로 AHR을 유도하는 것을 시사하고 있다. Th1세포는 항원 및 IL-18에 의한 자극에 대해, 유니크한 응답을 보이며, Th1 사이토카인(IFN-γ), Th2 사이토카인(IL-9, IL-13), 케모카인(RANTES, MIP-1α(마크로파지 유래 염증성 단백질-1α)), 및 GM-CSF를 생산한다. Th2 사이토카인과 GM-CSF는 주로 기관지 천식을 유도하는 인자로서 널리 인정받고 있다. 몇 개인가의 연구에서, Th1세포와 Th2 세포는 서로 저해하는 것이 아니라 오히려 공동함으로써, 기관지 천식의 발증을 유도함과 아울러 그 증상을 증폭하는 사실이 시사되고 있다. 실제, IFN-γ와 IL-13과의 동시투여는 가장 중증의 기관지 천식을 유도한다. 본 발명자들이 발견한 Th1세포의 신규기능은 항원과 IL-18로 자극을 받으면, Th1 사이토카인, Th2 사이토카인, GM-SCF 및 케모카인을 생산함으로써, 다양한 염증성 병태를 유도하는 것이다.

따라서, 인간 Th1 세포도 동일 조건하에서 병태를 나타낼 가능성이 있다.

후술하는 실시예 2에서는 인간 Th1세포가 항원과 IL-18 존재하에서 Th1 사이토카인, Th2 사이토카인, GM-SCF 및 케모카인을 생산하는 것이 확인되었다. 이 실시예에서는 새롭게 유도된 IL-18Rα를 강하게 발현하는 Th1세포가 항CD3 항체와 IL-18에 의한 자극에 의해, IFN-γ, IL-13, GM-CSF, 및 IL-8의 생산을 현저하게 증가시키는 것이 나타났다. 이 결과는 Th1세포가 Th1 사이토카인, Th2 사이토카인 뿐만아니라, GM-CSF, IL-8의 생산에 의해 조직 손상을 유도할 가능성을 나타내고 있다.

이와 같이 IL-18은 항원과 공동으로 Th1세포를 자극함으로써, 중증의 기도염증 및 AHR을 발증한다. 따라서, 예를 들면 상술한 인간 IL-18 안타고니스트(상술한 ⅰ)∼ⅳ))는 그 치료약이 된다.

(5-4) 면역질환치료약제의 적용예-2

이어, 면역질환치료약제의 또 다른 적용예에 대해 설명한다.

이제까지, 아토피성 피부염은 알레르겐 특이적 IgE 항체의존성의 획득형 아토피로서 생각되어 왔다. 이 때문에, 알레르겐 특이적 IgE 항체를 표적으로 하는 IgE 항체 저해제나 항알레르기제 등이 아토피성 피부염의 치료약으로서 사용되어 왔다. 그러나, 이들 치료약으로는 치유할 수 없는 또는 재발을 반복하는 알레르기 환자가 해마다 증가하고 있다.

종래와 같이, 획득형 아토피성 피부염(IgE 항체의존성 아토피성 피부염)을 조준으로 한 치료법으로는 효과가 없는 자연형 아토피의 발증 및 중증도에는 IL-18이 중요한 역할을 하고 있다.

그러나, 그와 같은 증례(症例)에 대한 유효한 치료법은 아직 확립되어 있지 않다.

Th2 세포의 기능에 대해 길항작용을 보이는 Th1세포를, CpGDNA 투여하는 등의 방법으로 유도할 수 있는데, 동시에 유도되는 IL-18은 Th1세포에 작용하여 TH1형 기관지 천식을 유도하는 것이 문제가 된다.

획득형 아토피성 피부염(IgE 항체의존성 아토피성 피부염)의 치료법으로서, 항원특이적 감(減)감작요법이 알려져 있는데, 그 분자기구는 아직 밝혀지지 않았으며, 치료의 유효성도 낮다. 또한, 감(減)감작요법이란, IgE 항체가 관여하는 즉시형 알레르기 반응(I형 알레르기 반응)의 원인 항원인 알레르겐, 특히 흡입성 알레르겐을 생체내에 투여하여(일반적으로는 주사), 알레르겐에 대한 과민반응을 경감시키고자 하는 치료법이다.

IgE 항체의 Fc부에 특이적이며, FcR1부로의 결합을 저해하는 인간형 마우스 항체가 Genentic사에서 개발되어, 알레르기 치료약으로서 유효함이 보고되고 있다(Milgrom H. et al., N. Engl. J. Med., 1999 : 341, 1966-73).

또한, Th2 사이토카인 저해제는 항IL-4 항체, 항IL-5 항체, 항IL-13 항체 및 이들 수용체에 대한 항체는 알레르기 치료약인 항체 의약(의약품)이 될 수 있다고 생각되지만, 아직 유효한 항체 의약은 개발되어 있지 않다.

FK506으로 대표되는 저분자 면역억제제의 저량 사용은 항알레르기 작용을 발휘하는데, 부작용으로서 신장장애 등이 보고되고 있다.

TLR(Toll Like Receptor)를 통한 자극을 더해, IL-12의 생산을 유도하는 수단으로서, CpGDNA가 주목받고 있다. 이 CpGDNA은 비메틸화 CpG 모티브를 갖는 DNA이다. CpGDNA은 특히 Th1반응(마크로파지를 활성화하는 반응)을 강하게 야기하며, 임상 측면에서의 응용이 기대되고 있는 분자이다. 그러나, CpGDNA은 상술한 바와 같이 동시에 유도되는 IL-18은 Th1세포에 작용하여 TH1형의 기관지 천식을 유도하는 것이 문제가 된다.

이와 같이 아토피성 질환은 이제까지 알레르겐 특이적 IgE의존성의 획득형 아토피 질환으로서 논해지고 있으며, 그것을 조준으로 한 IgE 저해제나 항알레르기제 등이 치료약으로서 사용되고 있다. 그러나, 이들 치료약으로는 치유되지 않거나 혹은 재발을 반복하는 환자가 해마다 증가하고 있다.

즉, 종래의 획득형 아토피를 조준으로 한 치료법으로는 효과가 없는 자연형 아토피가 존재하고 있으며, 그 발증에는 IL-18이 중요한 역할을 하고 있다.

종래의 면역학적 사고방식에서는 Th1세포 유도는 Th2 세포기능을 억제함으로써, 항알레르기 작용을 발취하는 것으로 생각되어 왔다. 그러나, 본 발명자들은 IL-18이 Th1세포를 in vivo 조건하에서 자극함으로써, INF-γ, IL-8, 9, 13 등을 생산하며, 난치성 기관지 천식을 유도하는 것을 발견하였다. 이는 알레르기성 염증 발증이 Th1과 Th2의 밸런스가 원인이라는 종래의 정설을 뒤집는 것이다. 즉, 종래의 밸런스 시정을 목표로 하는 치료법을 명확히 부정하는 것이다.

IL-4, 5, 9, 13은 중요한 Th2 사이토카인이다. 한편, 류코트리엔, 히스타민, 세로토닌 등은 중요한 화학매개물질이다. 이들을 각각 억제(저해)하는 기술은 있어도, 그 상류로부터 저지하는 것은 아니다. 즉, 각 사이토카인에 직접 작용하여 그들 기능을 억제(저해)하는 기술은 있어도, 각 사이토카인의 생산을 상류에서 저해하는 기술은 없다. IL-18은 상기 각 사이토카인의 상류에 있기 때문에, IL-18의 활성을 저해함으로써, 알레르기성 질환(알레르기성 염증)에 유효하다고 생각된다.

알레르기성 질환의 발증 메카니즘은 활성화 T세포, 호염기구 및 비만세포가 깊게 관여한다. 특히, 알레르겐에 의한 비만세포 또는 호염기구상의 FcεR에 결합한 IgE 분자의 가교에 의해 이들 세포가 활성화된다. 그 결과, Th2 사이토카인과 화학매개물질이 생산되어 알레르기성 염증(알레르기성 질환)이 유도된다고 생각되고 있다. 그러나, 알레르겐이나 IgE 관여가 없으며, 감염을 계기로 알레르기성 염증이 유도되는 경우가 있다. 항알레르기제, 면역억제제 등 비특이적인 치료법은 존재하지만, IL-18을 특이적으로 억제하는 기술은 개발되지 않았다.

그리고, 이제까지 제작된 항IL-18항체는 마우스 항체를 인간화한 것이기 때문에, 임상응용가능한 항체의약이 될 수는 없다.

본 발명의 항체는 자연형 아토피(IL-18 의존성 질환)를 유도하는 IL-18에 대한, 인간 유래의 인간 항인간 IL-18 모노클로날 항체(완전 인간형 항체)이다. 이제까지, 인간 IL-18에 대한 완전 인간 항체는 개발되지 않았으며, 본 발명의 항체가 국제적으로 유일한 것이다. 이 항체는 임상적용하여도, 마우스 항체와 같이 항원성을 나타내지 않는다. 따라서, 이 항체는 부작용이 없는 뛰어난 항체의약으로서 이용할 수 있다. 이로 인해, 알레르기성 질환, 자연형 아토피, 및 천식 등의 신규 치료법을 확립할 수 있다. 예를 들면, 이 항체는 종래형의 획득면역계의 이상에 기초하는 회득형 아토피(IgE 의존성)을 조준으로 한 치료법으로는 효과가 없는 자연형 아토피(IL-18 의존성)를 표적으로 한 신규의 치료법으로 확립될 수 있다.

후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 이 항체는 여러 가지 in vitro계에서 IL-18의 활성을 억제하였다. 특히, 이 항체는 항원과 IL-18으로 인한 자극에 의해 발생하는 Th1 세포로부터의 Th1 사이토카인과 Th2 사이토카인의 생산억제기능을 가지고 있다. 이 기능은 IL-12의 작용을 손상시키지 않는다는 점에서 중요하다.

따라서, 상기 면역질환치료약은 현재 난치병 중 하나인 알레르기성 염증의 치료표적으로서 중요한 역할을 한다. 또한, 상기 면역질환치료약은 종래의 알레르기성 염증치료약과 전혀 다른 새로운 타입의 치료약을 제작하기 위해 유용하다.

이상과 같이 IL-18은 Th1세포를 자극하여 기관지 천식을 유도한다.

또한, IL-18은 수상세포, 마크로파지 등의 면역계 세포뿐만 아니라, 피부 케라티노사이트, 장관상피세포, 기도상피세포 등 여러 가지 비면역계 세포로부터도 생산한다.

또한, IL-18은 IL-12의 존재하에서 여러 가지 면역계 또는 비면역계 세포로부터 IFN-γ의 생산을 유도한다. 한편, IL-18은 IL-12의 비존재하에, NKT세포, T세포, NK세포로부터 IL-4, IL-13 등의 Th2 사이토카인(헬퍼 T2세포로부터 생산하는 싸이토카인)의 생산을 유도하여 항원비특이적으로 IgE 생산을 유도한다.

또한, IL-18은 항원자극을 받은 Th1세포를 자극하여, Th1 사이토카인에 속하는 IFN-γ의 생산을 증강시킬 뿐만 아니라, Th2 사이토카인에 속하는 IL-9, IL-13, 그리고 대표적인 케모카인인 IL-8의 생산을 유도한다.

또한, IL-18은 OVA 특이적 Th1형 메모리 T세포를 이입한 마우스에, 경비적으로 OVA와 함께 투여(IL-18과 OVA를 투여)함으로써, 폐포와 간질(interstitial space)내로의 호중구·림프구·마크로파지·호산구의 강한 습윤성과 기도과민성을 특징으로 하는 Th1형 기관지 천식을 유도할 수 있다.

또한, IL-18은 항원/IgE 비의존적으로, 직접, 비만세포나 고염기구를 자극한다. 그 결과, 다양한 사이토카인이나 화학전달물질의 생산을 유도하여 자연형 아토피(IL-18 의존성 염증)를 유도한다.

Th2 세포 의존성의 천식은 항IL-5 항체, 혹은 항IL-13 항체에 의해 억제될 수 있다. 그러나, 항원과 IL-18에 의해 자극된 Th1세포가 유도하는 천식에 대해서는 이들 항체에 의한 치료는 효과가 없다. 본 발명의 항체는 상기의 항체로는 효과가 없는 천식의 치료에 유효하다. 즉, 본 발명의 항체는 IL-18에 의해 유도되는 천식(감염이 원인으로 발증하는 천식)에 대해 유효하다.

본 발명은 IL-18이 관여하는 천식 병태의 발견을 포함하며, 또한 종래형 획득면역계의 이상에 기초한 획득형 아토피(IgE 의존성)를 표준으로 한 치료법으로는 효과가 없는 자연형 아토피(IL-18 의존성)를 표적으로 하는 신규의 치료법을 확립하는 측면에서 중요해진다.

또한, 본 발명의 항체는 자연면역계와 획득면역계를 결합시킴에 있어서 중요한 역할을 하는 인간 IL-18에 대한 인간 IL-18 모노클로날 인간 항체(항 인간 IL-18 항체)이다.

이 항체는 종래형 획득면역계의 이상에 기초한 획득형 아토피(IgE 의존성)를 조준으로 한 치료법으로는 효과가 없는 자연형 아토피(IL-18 의존성)를 표적으로 한 새로운 치료법을 제공하는 것이다.

또한, 이 항체는 아토피성 피부염 질환뿐만 아니라, 천식이나 비염, 기타 알레르기성 질환에 대해 신규의 치료법을 제공하는 것이다. 특히, IL-18은 Th1세포 를 자극하여 난치성의 기관지 천식을 발증한다. 이 때문에, 기도 상피에 감염되어 기도상피세포로부터 IL-18의 생산을 유도하는 작용을 보이는 병원체는 기관지 천식을 발증하는 원인이 된다. 따라서, 이 항체는 감염에 의해 발증한 천식에 대해 유효한 치료약이 된다.

본 발명에 따른 항체 및 그 단편은 인간 IL-18의 수용체로의 결합을 저해하는 인간 항인간 IL-18 항체 및 그 단편이다. 따라서, 인간 IL-18이 원인이 되는 다양한 염증성 질환의 치료약(치료방법) 또는 예방약(예방방법)으로서 이용가능하다.

또한, 본 발명은 예를 들면 후술하는 실시예에 나타낸, scFv 항체 중 CDR의 고차 구조에 기초하여 저분자 화합물을 설계함으로써 IL-18 의존의 저분자 의약품(화학합성약제)의 개발에 중요한 수단을 제공한다.

본 발명에서 얻어진 인간 항IL-18 항체는 감염을 계기로 악화되는 아토피성 피부염, 난치성 기관지 천식 치료에 대해 유효하다.

본 발명의 인간 항IL-18 항체는 알레르겐/IgE을 원인으로 하지 않는 IL-18 의존성 염증(예를 들면 자연형 아토피)에 대해 신규의 치료법을 확립할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 인간 항IL-18 항체는 IL-18의 수용체로의 결합을 저해한다. 따라서, 이 항체는 상기와 같은 IL-18이 원인이 되어 발증하는 다양한 염증성 질환의 치료와 예방에 유효하게 된다.

본 발명에서는 인간 단쇄 항체(scFv)를 제시하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터, IL-18에 특이적으로 결합하는 scFv의 단리에 성공하였다. 이 단쇄 항체 도 IL-18의 수용체로의 결합을 특이적으로 저해하는 것이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 또한, 본 발명은 하기 실시예의 기재에 한정되는 것이 아니며, 본 발명의 범위 내에서 여러 가지 변형이 가능하다.

[ 실시예 1]

(1-1) 건강한 사람으로부터의 파지 라이브러리의 구축

파지 라이브러리의 구축은 J. D. Marks들(J. Mol. Biol., 222 : 581-597, 1991)에 의해 보고되고 있는 방법을 참고로, 건강한 사람 20명의 말초혈에서 유래된 림프구를 출발재료로 사용하여 실시하였다. 구축한 V_H(Y)-V_K, V_H(Y)-V_λ, V_H(μ)-V_K, V_H(μ)-V_λ의 각 서브 라이브러리는 각각 1.1×10⁸, 2.1×10⁸, 8.4×10⁷. 5.3×10⁷ 클론의 다양성을 갖는다고 평가받았다.

(1-2) 패닝(panning)

인간 IL-18을 0.1M NaHCO₃1㎖에 용해하여 35mm의 디쉬(이와키)에서 4℃에서 하루밤동안 반응시켜 고정화하였다. 이어, 0.5% 젤라틴/PBS를 이용하여 20℃에서 2시간 블로킹한 후, 0.1% Tween 20-PBS로 6회 세정하였다. 여기에, 건강한 사람으로부터 유래된 항체 파지 라이브러리(단쇄 가변영역 단편(scFv) 제시 파지액)를 0.9㎖(1×10¹²tu/㎖) 첨가하여 반응시켰다.

이어, 이 반응액을 0.1% Tween 20-PBS로 10회 세정한 후, 1.0㎖의 글리신 완충액(pH 2.2)을 첨가하여 IL-18과 결합하는 scFv 제시 파지를 용출하였다. 용출한 파지에, IM Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl, (pH 9.1)을 첨가하여 pH를 조정한 후, 대수증식기의 대장균 TG1에 감염시켰다. 감염 후의 TG1을 3000×g로 10분간 원심분리하여 상청액을 제거하고, 200㎕의 2×YT 배지에서 현탁한 후, SOBAG 플레이트(2% 글루코스, 100㎍/㎖의 암피실린 함유 SOB 플레이트)에 시딩하여 30℃의 부화기내에서 하루밤 배양하였다. 발생한 콜로니는 적량의 2×YT 배지를 첨가하여 스크레이퍼(scraper)(Costar)를 사용해 현탁, 회수하였다.

이 TG1액 50㎕을 30㎖의 2×YTAG 배지에 심고, 헬퍼 파지를 이용해 레스큐(rescue)하여, 스크리닝 후의 파지 라이브러리를 조제하였다. 건강한 사람으로부터 유래된 파지 라이브러리 V_H(Y)-V_K, V_H(Y)-V_λ, V_H(μ)-V_K, V_H(μ)-V_λ 각각에 대해, 상술한 IL-18 고정화 플레이트를 이용하여 패닝(panning)을 총 2회 실시하였다. 2회째의 패닝 후, SOBAG 플레이트로부터 임의로 클론을 추출하여 scFv의 발현 확인 및 IL-18 ELISA에 의한 특이성 확인(스크리닝)과 염기서열의 해석을 실시하였다.

(1-3) IL-18 ELISA에 의한 스크리닝

분리한 클론을 스크리닝하기 위한 ELISA는 인간 IL-18을 ELISA 플레이트에 고정화하여 실시하였다. 구체적으로는 2㎍/㎖의 인간 IL-18, 2.5㎍/㎖의 인간 혈청 알부민(HSA)를 40㎕/well의 ELISA 플레이트(Nunc) 에 넣고 4℃에서 16시간 정치 하여 고정화하였다. 고정화 플레이트는 0.5% BSA, 0.5% 젤라틴 및 5% 스킴밀크를 포함하는 PBS 용액 400㎕/well을 ELISA 플레이트에 넣어 4℃에서 2시간 정치하고 블로킹을 실시하였다.

이어, 이 ELISA 플레이트에, scFv 제시 파지를 포함하는 시료액 40㎕/well을 넣어 반응시킨 후, 시료액을 버리고 세정액으로 5회 세정하였다. 그 후, 이 고정화된 scFv 파지에, 비오틴 표식한 항 M13 모노클로날 항체(Pharmacia biotech)를 첨가하여, 알칼리포스파타제(AP) 표식한 항마우스 IgG 항체를 2차 항체로서 반응시켰다. 이 반응액을 세정액으로 5회 세정한 후, 발색기질액(1g/㎖ p-nitrophenyl phosphate(Wako), 10% 디에탄올아민(Wako)를 포함한는 PBS용액)을 50㎕/well 넣고 차광한 후, 실온∼37℃에서 5∼10분간 발색시켰다. 멀티 플레이트 오토 리더 NJ-2001(Inter Med)로 405nm의 흡광도를 측정한 결과, 평가한 클론 모두가 IL-18에 특이적임을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

(1-4) 클론의 서열분석

이어, 단리한 클론의 scFv 유전자의 V_H쇄 및 V_L쇄 유전자의 DNA 염기서열을 Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit(Applied Biosystems)를 사용하여 결정하였다. ELISA법 및 서열분석 결과, 단리한 클론은 2종류로 분류되었다(h18-40, h18-108).

또한, 서열번호 1 및 7은 클론 번호 h18-108의 V_H쇄 및 V_H쇄 유전자의 염기서열을 각각 표시한다. 또한, 서열번호 3 및 8은 이 V_H쇄 및 V_H쇄의 아미노산 서열을 표시한다.

(1-5) 인간 항IL-18 scFv의 발현과 정제

상기 (1-2, 3)에서 단리한 인간 IL-18에 반응하는 scFv 클론(h18-40·h18-108)으로부터 플라스미드 DNA를 회수하여, 통상의 방법에 따라 대장균 HB1251을 형질전환하였다. 2% 글루코스 및 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 2×YT배지에서 이들의 대장균을 하룻밤 전에 배양한 후, 글루코스 프리의 2×YT배지에 일부 이식하고, 종농도 1mM IPTG, 100㎍/㎖의 암피실린을 첨가하여 다시 하룻밤동안 배양하여 scFv의 발현 유도를 실시하였다. 배양 종료후 균체를 원심회수하여, 1mM EDTA를 포함하는 PBS에 현탁하여 얼음 속에 30분간 균체를 방치하였다. 이어, 8,900×g으로 30분간 원심한 후, 상청액을 회수하여 0.45㎛ 필터로 여과한 후, 페리 플라즘 획분으로부터 scFv를 정제하기 위한 출발재료로 사용하였다.

이와 같이 하여 조제한 정제를 위한 출발재료를 항E tag 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 통상의 방법에 따라 정제하였다. PBS로 투석한 후, 엔도톡신 제거 컬럼 Detoxi-gel(PIERCE사)로 첨부의 프로토콜에 따라 엔도톡신을 제거하였다. 분자량 컷 10,000의 Centricon(Amicon사)으로 농축한 후, 0.45㎛ 필터로 여과하여 정제 표본으로 삼였다.

(1-6) 정제 scFv의 IL-18에 대한 결합성

이어, 정제 scFv(h18-40·h10-108)의 IL-18에 대한 결합성을 ELISA법으로 측정하였다. PBS에 의해 0.5㎍/㎖로 조정한 인간 IL-18을 고상화한 96 웰 플레이트(NUNC. MAXISORP)에, 정제 scFv를 100㎕ 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 0.05% Tween-PBS(이하, PBST로 생략할 수도 있다)로 5회 세정한 후, 퍼옥시다제 표식 항E tag항체와 다시 37℃에서 1시간 반응시켰다. PBST로 5회 세정한 후, 발색기질액을 첨가하여 색을 띠게 하고, 405nm의 흡광도를 측정하여 결합성을 평가하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 2종의 항체(h18-40·h18-108)은 모두 IL-18과 특이적으로 결합하였다.

(1-7) IL-18에 의해 자극받은 인간 골수 단핵구 KG-1세포로부터의 IFN-γ 생산에 대한 작용

IL-18(20ng/100㎕)과 scFv를 반응시킨 후에 KG-1 cell(3×10⁵cells/100㎕) 배양액에 첨가하여 24시간 후의 배양 상청액 중의 IFN-γ의 양을 ELISA(Biosource)에 의해 측정하였다. scFv(h18-40·h18-108)에 관해 IL-18 저해활성을 KG-1 cell의 IFN-γ 생산으로 조사한 결과, 콘트롤 및 scFv(h18-40)에서는 저해활성은 볼 수 없었지만, scFv(h18-108)은 농도의존적으로 KG-1 cell의 IFN-γ생산을 억제하였다. 도 3에 그 결과를 나타낸다.

(1-8) IL-18의 인간 골수 단핵구 KG-1세포로의 결합저해작용

비티온 표식 IL-18(400ng/50㎕)과 scFv(콘트롤 또는 h18-108)를 반응시킨 후에 KG-1 cell(1×10⁶ cells/50㎕) 배양액에 첨가하여 phycoerythrin 표식 스트렙트아비딘(Becton Dickinson)을 반응시켜 플로사이토메트리 해석(Beckman Coulter)을 실시하였다.

도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, scFv(h18-108)가 IL-18의 KG-1 cell로의 결합을 저해하는 지를 플로사이토메트리 해석으로 조사한 결과, 콘트롤 scFv는 IL-18의 결합에 변화를 볼 수 없었지만(도 4), h18-108은 IL-18의 KG-1 셀로의 결합을 농도 의존적으로 저해하였다(도 5).

(1-9) scFv(h18-108)의 특성

인간 IL-18에 대한 특이성을 나타낸 scFv h18-108에 대해, 웨스턴 블로팅을 실시한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 분자량은 약 30kDa이었다. 또한, 겔 여과 크로마토그래피를 실시한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 분리 패턴으로부터, 9할이 모노머의 scFv를 형성하고 나머지 1할이 다이머를 형성하고 있음이 확인되었다.

[ 실시예 2]

실시예 2에서는 IL-18에 의해 자극한 Th1세포 및 Th2 세포로부터 생산하는 사이토카인에 대해 검토하였다.

(2-1) 시약

재조합 인간 IL-2, IL-4, IL-12 및 IFN-γ은 R&D(Minneapolis, MN)로부터 입수하였다. 재조합 IL-18은 MBL사(일본 나고야)로부터 입수하였다. FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트)-항인간CD4mAb(모노클로날 항체) 또는 Cychrome(시트크롬)-항인간 CD4mAb, FITC-항인간 CD45RAmAb, FITC-항인간 IFN-γmAb, PE-항인간 IL-13mAb, 및 항 인간IL-12mAb는 Pharmingen(San Diego, CA)로부터 입수하였다. PE-항인간 IL-18RαmAb(클론 70625), 항인간 CD3εmAb, 및 항인간 IL-4mAb는 R&D로부터 입수하였다.

(2-2) in vitro에서의 Th1세포 또는 Th2 세포의 제작

건강한 도너의 말초혈로부터, 나이브 CD4⁺CD45RA⁺T세포(CD4 및 CD45 양성 T세포)를 단리하였다(K. Nakanishi et.al., Int. Immunol. 12 : 151.). PHA(1㎍/㎖), IL-12(50㎍/㎖), 및 중화 항IL-4mAb(500ng/㎖), 또는 PHA(1㎍/㎖), IL-4(200㎍/㎖), 및 중화 항IL-12mAb(10㎍/㎖)과 함께, 24 웰 플레이트에서 CD4⁺CD45RA⁺T세포(1×10⁶/㎖)를 배양함으로써, Th1세포 및 Th2 세포를 제작하였다. 이와 같이 하여 자극한 T세포를 3일째에 세정하고, 배지에 IL-2를 100U/㎖ 첨가하여 다시 4일간 배양하였다.

(2-3) IFN-γ⁺Th1세포의 단리

IFN-γ+Th1 세포를 단리하기 위해, 분극화한 Th1세포를 고정화 항CD3(5㎍/㎖) 및 IL-2(100U/㎖)와 함께, 24 웰 플레이트 중에서 배양하였다. 이어, 그 배양물에, 생존하는 Th1세포가 IFN-γ의 발현을 풍부하게 하는 처리를 실시하였다. 3시간 후, 부착세포만을 회수하여 항CD45/항IFN-γ 이중 특이성 항체(Milternyi Biotec)와 함께, 5분간 얼음상에서 인큐베이션하였다. 처리한 세포를 바닥이 원추형태인 50㎖의 시험관으로 옮겨 그 시험관을 37℃의 수욕(water bath)에 배치하고, 20㎖의 따뜻한 배양액중에서 5×10⁴세포/㎖의 농도로 세포를 배양하였다. 30분후, 냉각한 0.5% 소혈청 알부민(BSA)을 포함하는 인산 완충액용액(PBS)으로 세포를 세정하였다. 세포 표면에서 포착된 IFN-γ를 PE-항인간 IFN-γ를 사용하여 검출하였 다. 또한, 자동 MACS를 사용하는 항PE 마이크로비즈에 의해 표면에 IFN-γ를 발현한 Th1세포를 확실하게 단리하였다.

(2-4) in vitro 배양

새롭게 분극화한 Th1세포 및 Th2 세포, 및 새롭게 분극화한 Th1세포로부터 선별한 IFN-γ⁺세포를 여러 농도의 IL-18 존재 하, 고정화 항CD3(5㎍/㎖)을 포함한 1×10⁵/0.2㎖/웰로 재배양하였다. 배양개시로부터 6시간∼ 72시간 경과 후 상청액을 회수하고, IL-4, IL-5, IL-8, IL-13, IFN-γ 및 GM-CSF의 함유량을 ELISA(R&G)에 의해 측정하였다.

(2-5) 플로사이토메트리

분극화한 Th1세포(1×10⁶/㎖)를 24 웰 플레이트에서 고정화 CD3만, 및 고정화 CD3과 IL-18(100ng/㎖)에 의해 7시간 재자극하였다. 마지막 3시간은 사이토카인의 분비를 저해하기 위해, 2μM의 모네신을 첨가하였다. 세포질내의 IFN-γ⁺ 및/또는 IL-13⁺세포의 염색에 의한 분석은 문헌(K. Nakanishi et al., J. EXP. Med., 2004, 99, 535-545)에 따라 실시하였다. Th1세포 및 Th2 세포 상의 IL-18Rα의 발현량을 측정하기 위해, 인간 IgG에 의한 FcR의 블로킹 후, 각 세포를 FITC 항인간 CD4, 및 PE 항인간 IL-18Rα쇄 mAb 또는 콘트롤 PE-마우스 IgG1mAB에 의해 30분간 4℃에서 1% FCS를 포함하는 PBS중에서 인큐베이션하였다. 이와 같이 하여 얻어진 샘플을 FACS Calibur(BD Bioscience, San Jose, CA)에 의해 분석하였다.

(2-6) 실험결과

(2-2)∼(2-5)에 따라, 건강한 도너의 말초혈로부터 단리한 나이브 CD4⁺CD45RA⁺T세포를 in vitro에서 Th1세포 및 Th2 세포를 유도하는 조건 하에 연속적으로 7일간 자극하였다.

그 결과를 도 8에 나타낸다. 또한, 도 8에서는 고정화 항CD3에 의해서만 자극한 결과(α-CD3)와, 고정화 항CD3과 IL-18에 의해 자극한 결과(α-CD3+IL-18)을 나타내고 있다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 고정화 항CD3을 이용한 시험에서는 Th2 세포는 상당량의 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생산하였지만, IFN-γ를 생산하지 않았다. 또한, Th1세포는 주로 IFN-γ, IL-8, GM-CSF를 생산하였다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 고정화 항CD3뿐만 아니라 IL-18에 의해 자극하여도, Th2 세포로부터의 Th2 사이토카인의 생산은 증가하지 않았다. 이에 비해, 그 처리로 인해, Th1세포로부터의 IFN-γ, IL-8, IL-13, 및 GM-CSF의 생산은 현저하게 증가하였다.

Th1세포와 Th2 세포와의 IL-18에 대한 응답 차이의 근본이 되는 메카니즘은 주로 Th1세포상으로의 IL-18Rα쇄 발현의 선택성에 의해 설명될 수 있다. 도 9는 상기의 자극에 따른, 각 세포 표면의 IL-18Rα쇄의 발현레벨을 나타내는 도면이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 인간 Th1세포는 고레벨 IL-18Rα쇄를 발현하는 것에 비해, Th2 세포는 IL-18Rα쇄의 발현량이 매우 조금이다. 따라서, IL-18R을 발현하 는 Th1세포는 항CD3과 IL-18에 응답하여, Th1 사이토카인, Th2 사이토카인 및 GM-CSF를 생산하는 성질을 나타낸다.

동시에, 고정화 항CD3에 의해 자극을 받았던 Th1세포의, IL-18 투여량에 따른 응답성(IFN-γ, IL-8, IL-13의 생산)에 대해 검토하였다. 따라서, Th1세포를 여러 농도의 IL-18(∼500ng/㎖)에 의해, 고정화 항CD3 존재 하에 3일간 자극하였다. 도 10은 IL-18의 용량과, Th1세포로부터의 사이토카인의 생산량과의 관계를 나타낸 그래프이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, Th1세포는 IL-18의 존재 하, 용량 의존적으로, IFN-γ, IL-8, IL-13의 생산이 증가하였다. 또한, 항CD3 자극을 받은 Th2 세포를 IL-18에 의해 더욱 자극하여도, 사이토카인 생산의 응답은 증가하지 않았다. 따라서, 도 10에 나타낸 바와 같이, 인간 Th1세포만이 항원 및 IL-18의 자극에 응답하여, Th1 사이토카인, Th2 사이토카인 뿐만 아니라, GM-CSF, IL-8을 생산한다는 특유의 작용을 나타내었다.

이와 같이, IL-18은 분극화한 인간 Th1세포로부터의 IFN-γ, IL-8, IL-13 및 GM-CSF 생산을 유도하였다.

이어, 항CD3과 IL-18에 의한 자극 후의 사이토카인 생산의 속도론을 검토하였다. 도 11은 Th1세포의 자극 후의 배양시간과, Th1세포로부터의 사이토카인의 생산량과의 관계를 나타내는 그래프이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, Th1세포는 자극 후, 비교적 조기에 IFN-γ를 생산하기 시작하였다. 항 CD3에 의한 자극 24시간후에도 대량의 IFN-γ가 검출되었다. 이에 비해, 그 시점에서는 IL-8도 IL-13도 검출되지 않았지만, 자극 72시간 후, IL-8 및 IL-13이 검출되었다. 통상적으론 48 시간동안 측정을 실시하기 때문에, 당초, Th1세포는 IFN-γ만을 생산한다고 간주하였었다. 그러나, 도 11에 나타낸 바와 같이, 72시간 후에, IL-8 및 IL-13을 검출할 수 있었다. 항 CD3에 의해 자극된 Th1세포를 추가로 IL-18에 의해 자극함으로써, 상기의 사이토카인을 보다 빨리 보다 많이 생산하는 것이 가장 중요하다. 이와 같이, IL-18 자극은 Th1세포로부터의 IFN-γ, IL-8, IL-13의 생산을 촉진하여 증가시켰다.

상술한 바와 같이, IL-18 자극은 용량의존적으로 항CD3의 자극을 받은 Th1세포로부터의 IFN-γ, IL-13의 생산을 유도한다(도 10). 그러나, Th0세포가 항원과 IL-18에 대한 응답에, IFN-γ 및 IL-13을 생산할 가능성을 배제할 필요가 있다. 때문에, 이 가능성을 배제하기 위해, IL-18 자극을 받은 Th1세포에서의, 세포질 IFN-γ 및/또는 IL-13에 양성인 CD4⁺T세포의 비율을 FACS 분석에 의해 검토하였다. 그 결과를 도 12에 나타낸다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 고정화 항CD3과 IL-18에 의해 자극받은 인간 Th1세포의 5.65%가 세포질 INF-γ 및 IL-13에 양성이었다. 그런데, 항 CD3에 의해서만 처리한 Th1세포의 불과 1.21%가 세포질 IFN-γ 및 IL-13에 양성이었다. 세포내 IFN-γ 또는 IL-13 염색의 특이성은 아이소타입이 적합한 콘트롤 항체로는 염색되지 않기 때문에 나타났다. 또한, 이와 같은 염색은 과잉 재조합 인간 IFN-γ, 또는 IL-13에 의한 전처리에 의해 완전히 저해된다(데이터는 미도시). 이와 같이 Th1세포가 항CD3과 IL-18에 의해 자극받았을 때, IFN-γ 및 IL-13을 생산하였다.

이어, IL-18에 의한 IFN-γ⁺Th1세포로부터의 IL-13생산 유도에 대해 검토하였다. IFN-γ를 생산하는 Th1세포도 항CD3과 IL-18에 의한 자극을 받으면, IL-13을 생산할 가능성을 검토하는 것은 중요하다. 때문에, IFN-γ를 발현하는 인간 Th1세포로부터 분비된 IFN-γ를, 그 Th1세포의 표면에 고정화한 항IFN-γ 항체에 의해 얻음으로써 정제하였다.

도 13은 항CD3 항체 자극을 받은 Th1세포 중의 IFN-γ⁺Th1세포의 비율과 IFN-γ⁺Th1세포의 양성 선별예를 나타내는 도면이다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 항CD3 항체로 자극을 받은 Th1세포의 23.1%가 세포 표면에서 IFN-γ를 발현하였다. 이어, IFN-γ를 세포 표면에 발현시키는 Th1세포(IFN-γ⁺Th1세포)를 자동 MACS를 이용하여 양성 선별하였다. 99%의 순도로 IFN-γ⁺CD4⁺Th1세포를 정제할 수 있었다. 얻어진 IFN-γ⁺Th1세포를 항CD3 및 IL-18과 함께 배양하여 자극하였다. 도 14는 이 자극으로 인한, IFN-γ⁺Th1세포로부터의 사이토카인의 생산량을 나타낸 그래프이다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 그 자극에 의해 IFN-γ, IL-8 및 IL-13의 생산은 상당히 증가하지만, IL-4의 생산은 증가하지 않았다. 따라서, 고도로 정제된 IFN-γ를 발현하는 살아있는 인간 Th1세포는 그 세포 표면에 IL-18Rα쇄를 강하게 발현하고 있으며, 항CD3과 IL-18에 의한 자극을 받으면, IFN-γ, IL-8, 및 IL-13을 생산한다고 결론지을 수 있다. 이 결과는 인간 Th1 세포가 그 TCR(T세포 항원수용체)에 항 원이 결합하고, 또한 IL-18이 작용하면, 자극을 받은 Th1세포가 IFN-γ, IL-8 및 IL-13의 생산을 증강하는 것을 나타내고 있다. 또한, 도 8, 도 10, 도 11, 도 13 및 도 14에서는 독립된 4회에 걸친 실험의 대표값이며, 각 실험에서는 마찬가지 결과가 얻어졌다.

이상과 같이, Th1세포가 항원과 IL-18에 의해 자극받으면 Th1 사이토카인(IFN-γ등), Th2 사이토카인(IL-9, IL-13), 케모카인(RANTES, MIP-1α, 및 GM-CSF)를 생산한다. 기관지 상피에 대한 IFN-γ와 IL-13의 자극이, 가장 중증의 기관지 천식을 유도한다. 따라서, 실시예 1의 scFv를 투여하여 IL-18의 활성을 저해함으로써, 중증 기관지 천식의 치료가 가능해진다.

또한, 이상에서 서술한 구체적인 실시양태 또는 실시예는 어디까지나 본 발명의 기술내용을 명확히 하기 위한 것으로, 그와 같은 구체예에만 한정하여 협의로 해석되어야 하는 것이 아니며, 본 발명의 정신과 후술하는 특허청구범위 내에서 여러 가지로 변경하여 실시할 수 있는 것이다.

이상과 같이, 본 발명의 인간 IL-18에 대한 항체 및 그 단편은 인간 유래의 것이다. 그 때문에, 인간 IL-18이 직접 또는 간접적으로 관여하는 질병 치료에 있어서, 반복 투여나 장기 투여를 실시하는 경우에도 현저한 치료효과와 높은 안전성을 유지하는 치료약을 제공할 수 있다는 효과가 있다.

<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY <120> Human antibody aganist human interleukin-18, the antibody fragment, and the use therof <150> JP 2003-125948 <151> 2003-04-30 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaggaggc ctggggcctc agtgagggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcact agtcactata tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg ggtggcaata atcaacccta gtgatggcag aacagactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccgtg accagggaca cgtccgcgag cagtgtctac 240 atgggaataa gcagcctgag atctgaggac acggccatgt attactgtgc gagaacagcg 300 cgtggattca gttatgcgac agactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 2 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 2 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg agg agg cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg agg gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc act agt cac 96 Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 tat ata cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg gtg 144 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca ata atc aac cct agt gat ggc aga aca gac tac gca cag aag ttc 192 Ala Ile Ile Asn Pro Ser Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc aga gtc acc gtg acc agg gac acg tcc gcg agc agt gtc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Ser Val Tyr 65 70 75 80 atg gga ata agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt 288 Met Gly Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga aca gcg cgt gga ttc agt tat gcg aca gac tgg ggc cag gga 336 Ala Arg Thr Ala Arg Gly Phe Ser Tyr Ala Thr Asp Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Asn Pro Ser Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Ser Val Tyr 65 70 75 80 Met Gly Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Ala Arg Gly Phe Ser Tyr Ala Thr Asp Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser His Tyr Ile His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ile Ile Asn Pro Ser Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Ala Arg Gly Phe Ser Tyr Ala Thr Asp 1 5 10 <210> 7 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tcctatgagc tgactcagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacaaac ggccaggatc 60 acctgctctg gagatgcatt gccaaaaaaa tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtgat atataaagac agtgagaggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccagctcagg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg actattactg tcaatcagca gacagcagtg gtacttatgt ggtattcggc 300 ggagggaccc agctcaccgt tttaggt 327 <210> 8 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 8 tcc tat gag ctg act cag cca ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga caa 48 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat gca ttg cca aaa aaa tat gct 96 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala 20 25 30 tat tgg tac cag cag aag cca ggc cag gcc cct gtg ctg gtg ata tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 aaa gac agt gag agg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc 192 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 agc tca ggg aca aca gtc acg ttg acc atc agt gga gtc cag gca gaa 240 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 gac gag gct gac tat tac tgt caa 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PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Tyr Val Val 1 5 10

Claims

인간 면역 글로부린 V_H쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3가 각각 서열번호 4, 5 및 6에 표시된 아미노산 서열로 이루어지고, 인간 면역 글로부린 V_L쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3가 각각 서열번호 10, 11 및 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 인간 항체.
서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 항체.
서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 인간 항체.
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제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 인간 항체에 수식제가 결합되어 이루어지는 수식항체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 인간 항체를 코딩하는 유전자.
제 7 항에 있어서, 서열번호 1 또는 7로 표시되는 염기서열을 오픈 리딩 프레임 영역으로서 가지는 유전자.
제 7 항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 7 항의 유전자가 도입된 형질전환체.
제 7 항의 유전자를 숙주에 발현시킴으로써 인간 인터루킨-18에 대한 인간 항체를 생산하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체를 사용한 인간 인터루킨-18 검출기구.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 인간 항체를 포함하는 인간 인터루킨-18 검출시약을 사용하여 피검시료 중의 인간 인터루킨-18의 양을 측정하는 면역질환 진단키트.
제 13 항의 검출시약을 사용하여 측정한 피검시료 중의 인간 인터루킨-18의 양에 기초하여 면역질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 인간항체를 유효성분으로 하는 인간 인터루킨-18 활성저해제.
제 6 항의 수식항체를 유효성분으로 하는 인간 인터루킨-18 활성저해제.
제 7 항의 유전자를 포함하는 유전자 치료제.
제 15 항의 인간 인터루킨-18 활성저해제를 포함하는 면역질환치료제.
제 18 항의 면역질환치료제를 포함하는 면역질환 치료용 조성물.
제 18 항에 있어서, 항원과 인간 인터루킨-18로 인한 자극에 의해 헬퍼 T1 세포로부터 생산하는 사이토카인을 저해하는 것을 특징으로 하는 면역질환치료제.
제 18 항에 있어서, 인간 인터루킨-18이 관여하는 질환인 알레르기, 염증 및 만성 면역이상질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에 적용하는 것임을 특징으로 하는 면역질환치료제.
제 6 항의 수식항체를 이용한 인간 인터루킨-18 검출기구.
제 6 항의 수식항체를 포함하는 인간 인터루킨-18 검출시약을 사용하여, 피검시료 중의 인간 인터루킨-18의 양을 측정하는 면역질환 진단키트.
제 17 항의 유전자 치료제를 포함하는 면역질환 치료제.