JP2000236884A

JP2000236884A - ペプチド

Info

Publication number: JP2000236884A
Application number: JP11177846A
Authority: JP
Inventors: Takehiro Nishida; 毅弘西田; Takanori Okura; 隆則大倉; Tadao Tanimoto; 忠雄谷本; Masashi Kurimoto; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2000-09-05

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒトに投与してインターロイキン−１８の
生理作用を効果的に中和する物質の提供を課題とする。【解決手段】抗インターロイキン−１８抗体における相
補性決定領域のアミノ酸配列の一部又は全てを含有し、
インターロイキン−１８の生理作用を中和する性質を具
備する人為的に創製されたペプチドを提供することによ
って解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は新規な生理活性ペ
プチドに関するものであり、詳細には、インターロイキ
ン−１８の生理作用を中和する、人為的に創製されたペ
プチドに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン−１８（以下、「ＩＬ
−１８」と略記する。）は、免疫系における情報伝達物
質であるサイトカインの一種である。ＩＬ−１８は、特
開平８−２７１８９号公報、特許第２７２４９８７号掲
載公報及びハルキ・オカムラら『ネイチャー』、第３７
８巻、第６，５５２号、８８乃至９１頁（１９９５年）
に見られるように、発見当初、インターフェロン−γ誘
導因子（ＩＧＩＦ）として記載されていたが、その後、
シンペイ・ウシオら『ザ・ジャーナル・オブ・イムノロ
ジー』、第１５６巻、４，２７４乃至４，２７９頁（１
９９６年）における提案にしたがって、「ＩＬ−１８」
と呼称されるようになった。成熟型のＩＬ−１８は１５
７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有し、免疫担当
細胞において生理活性物質として有用なインターフェロ
ン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を
誘導する性質と、キラー細胞の細胞障害性を増強した
り、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備している。
これらの性質故に、ＩＬ−１８は抗ウイルス剤、抗菌
剤、抗腫瘍剤、抗免疫疾患剤などの医薬品として広範な
用途が期待され、鋭意研究が進められている。なお、配
列表における配列番号２１及び２２には、それぞれ、ヒ
ト及びマウスの成熟型のＩＬ−１８のアミノ酸配列が示
されている。

【０００３】前述のとおり、ＩＬ−１８にかぎらず、サ
イトカインは、本来、免疫系における情報伝達を担う物
質として産生され、分泌される。正常に機能している免
疫系は、サイトカインが本来あるべきタイミングで分泌
され、然るべき細胞に情報を伝達することによって制御
されていると考えられる。これによって免疫系は、病原
菌やウイルスなど異物の侵入や腫瘍細胞など異物の発生
に対して適切に作動することができる。これに対し、サ
イトカインが生体内で過剰に産生されたり、外部から過
剰に投与されたりすると、免疫系のバランスに片寄りを
生じ、生体に諸種の悪影響を及ぼす場合がある。例え
ば、マサノリ・カワシマら、『リューマトロジー・イン
・ヨーロッパ，ジャーナル・フォー・エデュケーション
・アンド・インフォメーション・イン・リューマトロジ
ー』、第２６巻、増補２号、７７頁（１９９７年）にお
ける、自己免疫疾患の患者の体液に特異的に高いレベル
のＩＬ−１８が認められたとの報告は、自己免疫疾患な
どの炎症性の疾患の発症と、ＩＬ−１８の生体内での過
剰な産生との関連を示唆している。したがって、ＩＬ−
１８関連疾患を治療・予防する医薬品を開発するために
は、ＩＬ−１８そのものの生理作用の解明とともに、Ｉ
Ｌ−１８の生理作用を効果的に中和ないし阻害し、ヒト
へ投与し得る物質が確立され量産されることが不可欠で
ある。

【０００４】ところで、個々のサイトカインに対する中
和物質の確立ないし創製が、近年斯界において精力的に
試みられている。有効な物質として期待されるものに
は、サイトカインに対する中和抗体、可溶性のサイトカ
イン受容体及びサイトカインのアンタゴニスト等があ
る。これらのうちで、中和抗体は、標的となるサイトカ
インに対する特異性の高さや中和能の高さ故に、ひとき
わ強い期待が寄せられている。しかしながら従来の慣用
の技術により得られる抗体の多くはヒト以外の哺乳類起
源である。それ故、ヒトに対して抗原性を示し、投与さ
れたヒトの免疫系により速やかに排除される場合があ
り、反復投与が必ずしも奏効しないという問題がある。
また、斯かる抗体はヒトに投与すると、拒絶反応やアナ
フィラキシー等の副作用を惹起する場合もある。一方、
これらの、抗体の抱える問題点を解決するための方策も
いくつか提案されてはいるものの、いずれも汎用化され
ていると言える状況にはなく、ごく限られたサイトカイ
ンの中和物質の報告例が僅かに認められるに過ぎない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の第一の課題は、ヒトを含む哺乳類に投与して、
ＩＬ−１８の生理作用を効果的に中和する物質を提供す
ることにある。

【０００６】この発明の第二の課題は、斯かる物質をコ
ードするＤＮＡを提供することにある。

【０００７】この発明の第三の課題は、斯かる物質の製
造方法を提供することにある。

【０００８】この発明の第四の課題は、斯かる物質の感
受性疾患剤としての用途を提供するものである。

【０００９】この発明の第五の課題は、斯かる物質のＩ
Ｌ−１８中和剤としての用途を提供することにある。

【００１０】この発明の第六の課題は、斯かる物質を用
いるＩＬ−１８の中和方法を提供することにある。

【００１１】この発明の第七の課題は、斯かる物質のＩ
Ｌ−１８阻害剤としての用途を提供することにある。

【００１２】この発明の第八の課題は、斯かる物質を用
いるＩＬ−１８の阻害方法を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者がこれらの課題
を解決すべく、抗ＩＬ−１８抗体に着目し、先ずはじめ
に、その可変領域のアミノ酸配列を決定するとともに、
そのアミノ酸配列の一部又は全てを含有する種々のペプ
チドを人為的に創製した。その結果、その創製されたペ
プチドが特異的にＩＬ−１８に結合し、極めて効果的に
ＩＬ−１８を中和するという独自の知見を得た。そし
て、斯かる創製されたペプチドは、過剰な免疫反応に起
因する、自己免疫疾患など炎症性の疾患や免疫不全症を
はじめとする種々の疾患の治療・予防に奏効することが
判明した。斯かる創製されたペプチドは、それをコード
するＤＮＡを用いて所望量を製造できることも確認され
た。この発明は以上の知見に基づき完成されたものであ
る。

【００１４】すなわち、この発明は前記第一の課題を、
抗ＩＬ−１８抗体における可変領域のアミノ酸配列の一
部又は全てを含有し、かつ、ＩＬ−１８の生理作用を中
和する性質を具備する人為的に創製されたペプチドによ
り解決するものである。

【００１５】この発明は、前記第二の課題を、斯かるペ
プチドをコードするＤＮＡにより解決するものである。

【００１６】この発明は、前記第三の課題を、斯かるペ
プチドをコードするＤＮＡを発現させる工程と、生成さ
れるペプチドを採取する工程を含んでなる、ペプチドの
製造方法により解決するものである。

【００１７】この発明は、前記第四の課題を、斯かるペ
プチドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤により
解決するものである。

【００１８】この発明は、前記第五の課題を、斯かるペ
プチドを有効成分として含んでなるＩＬ−１８中和剤に
より解決するものである。

【００１９】この発明は、前記第六の課題を、斯かるペ
プチドを作用させることを特徴とするＩＬ−１８の中和
方法により解決するものである。

【００２０】この発明は、前記第七の課題を、斯かるペ
プチドを有効成分として含んでなるＩＬ−１８阻害剤に
より解決するものである。

【００２１】この発明は、前記第八の課題を、斯かるペ
プチドを作用させることを特徴とするＩＬ−１８の阻害
方法により解決するものである。

【００２２】

【発明の実施の形態】この発明は、抗ＩＬ−１８抗体に
おける可変領域のアミノ酸配列の一部又は全てを含有
し、ＩＬ−１８の生理作用を中和する（以下、単に「Ｉ
Ｌ−１８を中和する」と言う場合がある。）性質を具備
する、人為的に創製されたペプチドに関するものであ
る。この発明でいう抗ＩＬ−１８抗体とは、通常、ＩＬ
−１８で免疫感作した哺乳動物の抗体産生細胞により産
生される、ＩＬ−１８を認識するイムノグロブリンであ
り、その起源やクラス、抗原としてのＩＬ−１８の起源
は問わない。

【００２３】いずれのクラスに属するいずれの起源の抗
体も、一般に、２本の軽鎖と２本の重鎖がＳ−Ｓ結合を
介して連結された構造の基本単位からなる。軽鎖及び重
鎖ともに、Ｎ末端部のおよそ１１０アミノ酸からなる配
列は抗体ごとに多様性が認められるが、それ以外の部分
は同種抗体同士では比較的よく保存されている。前者は
可変領域、後者は定常領域と呼ばれている。可変領域
は、その中でもとりわけ抗体ごとに多様性の認められる
部分と比較的保存された部分とにさらに分けられ、それ
ぞれ、相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ」と言う。）及
び枠組構造と呼ばれている。軽鎖及び重鎖の可変領域に
は、それぞれ４種類の枠組構造と３種類のＣＤＲがあ
り、これらが交互に連結された構造をとっている。抗体
と抗原との特異的結合にはこの可変領域が関わるが、そ
のうちで、とりわけＣＤＲが深く関わっている。この発
明のペプチドは、抗ＩＬ−１８抗体における軽鎖及び重
鎖の可変領域のアミノ酸配列の一部又は全て、あるい
は、斯かる可変領域における６種類のＣＤＲのアミノ酸
配列の一部又は全てを含有する。

【００２４】抗ＩＬ−１８抗体におけるＣＤＲを含む可
変領域のアミノ酸配列は、通常以下のようにして決定さ
れる。先ずはじめに、抗ＩＬ−１８抗体を産生する細胞
からＲＮＡを調製する。斯かる抗体産生細胞として、同
じ特許出願人による特開平８−２１７７９８号公報や特
開平８−２３１５９８号公報などに記載の方法により調
製されるヒト又はマウスＩＬ−１８に対する単一クロー
ン抗体を産生するハイブリドーマを用いることができ
る。また、同じ特許出願人による特許第２７２４９８７
号公報や特開平８−２７１８９号公報などに記載の方法
で得られる、ヒト又はマウスのＩＬ−１８を抗原に用い
て常法にしたがい免疫感作した、通常、ヒト以外の哺乳
動物から摘出・調製される脾細胞を当該抗体産生細胞と
して用いることもできる。ヒトからリンパ球を採取し、
斯かるリンパ球を上記の如きＩＬ−１８で生体外で刺激
して得られる細胞を当該抗体産生細胞として用いること
もできる。調製されたＲＮＡを用いて構築されるｃＤＮ
Ａライブラリー、望ましくは、ｃＤＮＡ発現ライブラリ
ーの検索や、斯かるＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法
などにより、抗ＩＬ−１８抗体をコードするｃＤＮＡを
クローン化する。ｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築と検
索に関しては、エス・ポール監修、『メソッズ・イン・
モレキュラー・バイオロジー』、第５１巻、３５５乃至
３９４頁、（１９９５年、ヒューマナ・プレス発行）に
は、その手法が詳述されている。クローン化されたｃＤ
ＮＡの塩基配列を解読して抗ＩＬ−１８抗体のＣＤＲを
含む可変領域のアミノ酸配列を決定することができる。
因みに、後記実施例で詳述する抗ＩＬ−１８単一クロー
ン抗体『＃１２５−２ＨｍＡｂ』は、軽鎖における可変
領域のアミノ酸配列として配列表における配列番号１に
示すアミノ酸配列を、重鎖における可変領域のアミノ酸
配列として配列表における配列番号２に示すアミノ酸配
列をそれぞれ含有している。また、斯かる軽鎖及び重鎖
における３種類のＣＤＲは、それぞれ、配列表における
配列番号３乃至５及び６乃至８に示すアミノ酸配列を含
有している。

【００２５】この発明のペプチドは、以上に述べたよう
な、抗ＩＬ−１８抗体の可変領域のアミノ酸配列の一部
又は全てを含有し、ＩＬ−１８の生理作用を中和する性
質を具備する、人為的に創製されてなるもの全般を包含
し、天然物としてのＩＬ−１８中和抗体とは区別され
る。斯かるペプチドの、ＩＬ−１８の生理作用を中和す
る性質は、例えば、後記実施例に詳述する、ＩＬ−１８
の生理作用のひとつである、免疫担当細胞におけるＩＦ
Ｎ−γの産生誘導に対する阻害能を試験する方法により
確認することができる。斯かるペプチドは、通常、ヒト
以外の哺乳類起源の抗体における定常領域のアミノ酸配
列を完全には含有しない。なお、この発明でいうＩＬ−
１８とは、それ単独の形態のものならびに、ＩＬ−１８
としてのアミノ酸配列、例えば、配列表における配列番
号２１又は２２のいずれかに示すアミノ酸配列を含有す
る、ＩＬ−１８同士が会合した二量体ないしはそれ以上
の多量体の形態や、さらには、ＩＬ−１８以外の物質、
例えば、アルブミンなどの他の蛋白質と会合した複合体
としての形態にあり、且つ、ＩＬ−１８としての生理作
用を示す物質全般を意味する。

【００２６】この発明のペプチドの具体的な形態として
は、上述のごとき、抗ＩＬ−１８抗体の可変領域のアミ
ノ酸配列の一部又は全てを、必要に応じて適宜の異種の
アミノ酸配列を介して連結させたペプチド、詳細には、
抗ＩＬ−１８抗体の軽鎖及び重鎖における可変領域のア
ミノ酸配列を適宜のリンカーとしての配列を介して連結
した、いわゆる、「一本鎖可変領域断片」（以下、「ｓ
ｃＦｖ」と言う。）としてのペプチドや、斯かる可変領
域もしくは、斯かる可変領域におけるＣＤＲのアミノ酸
配列を必要に応じてその周辺部のアミノ酸数個ととも
に、ヒト由来の抗体の対応部分に移植して連結した、ヒ
ト化された単一クローン抗体、いわゆる、「キメラ抗
体」を含む「ヒト化抗体」が挙げられる。単一クローン
抗体『＃１２５−２ＨｍＡｂ』のアミノ酸配列を利用す
る例としては、斯かる抗体における可変領域のアミノ酸
配列の一部又は全てを、グリシン及びセリンからなるリ
ンカーとしてのアミノ酸配列を介して連結した、配列表
における配列番号９又は１０に示すアミノ酸配列を有す
るｓｃＦｖとしてのペプチドや、斯かる抗体における可
変領域のアミノ酸配列の一部又は全てを含有するキメラ
抗体としてのペプチド、さらには、斯かる抗体の可変領
域におけるＣＤＲとしての、配列表における配列番号３
乃至８に示すアミノ酸配列の一部又は全てとともにヒト
起源の枠組構造のアミノ酸配列の一部又は全てを含有す
るヒト化抗体としてのペプチドなどを挙げることができ
る。また、この発明のペプチドの別の形態としては、Ｉ
Ｌ−１８を中和する、天然物としての抗ＩＬ−１８抗体
の酵素的及び／又は化学的消化物、より具体的には、蛋
白質分解酵素のパパイン又はペプシンで斯かる抗体を消
化して得られる抗原結合断片（一般に「Ｆａｂ」と略記
される。）又は二量体の形態の抗原結合断片（一般に
「Ｆ（ａｂ′）₂」と略記される。）としてのペプチド
が挙げられる。

【００２７】これらの形態のペプチドのうち、ｓｃＦｖ
や抗体の酵素的及び／又は化学的消化物としてのペプチ
ドは、ヒトに投与した際の抗原性の主要な原因と考えら
れる、抗体における定常領域のアミノ酸配列を実質的に
欠きながら、ＩＬ−１８中和能を維持していることか
ら、ヒトへの反復投与が奏効し易いという特徴がある。
また、ｓｃＦｖとしてのペプチドは、分子量がもとの抗
体に比べて低減されているためにヒトに投与した際の組
織への浸透性に優れ、且つ、微生物を宿主とする形質転
換体を用いる製造が容易なことから、安価に提供できる
という利点もある。一方、キメラ抗体を含むヒト化抗体
としてのペプチドは、抗原との結合に関わる部分以外は
実質的にヒト起源であり、ヒトに対して抗原性を示し難
く且つヒト体内でＩＬ−１８中和能を発揮する上、斯か
るヒト化抗体は、ヒト体内の補体系を中心とする機構に
よってＩＬ−１８とともにヒト体内で速やかに除去され
る点で、もとの抗体に比べて優れた特徴を有している。

【００２８】また、以上に例示されるようなアミノ酸配
列と性質を有するペプチドに加えて、斯かるアミノ酸配
列、すなわち、可変領域のアミノ酸配列やＣＤＲのアミ
ノ酸配列における一部のアミノ酸を他のアミノ酸で置換
したり、他のアミノ酸を付加したり、さらには、一部の
アミノ酸を欠失させることにより得られるアミノ酸配列
を有するペプチドであっても、所期の性質を実質的に消
失しないかぎりこの発明のペプチドに包含される。例え
ば、上記に例示されるアミノ酸配列におけるシステイン
の一又は複数を他のアミノ酸、望ましくは、グリシン、
セリンなどの親水性アミノ酸やアラニン、バリンなどの
疎水性アミノ酸で置換したり、斯かるシステインを含む
数個のアミノ酸からなる部分を欠失させたアミノ酸配列
を有するペプチドは、本来のアミノ酸配列を有するペプ
チドに比べて安定性が高まる場合があり有用である。ま
た、上記に例示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又は
Ｃ末端に数個のヒスチジンを連結させると、所期の性質
を維持しつつ、本来のアミノ酸配列を有するペプチドに
比べてその精製が容易となる場合がある。さらに、当該
ペプチドの薬効、体内動態、副作用、ヒトに対する抗原
性及びＩＬ−１８中和能を含む生理作用や、安定性、Ｉ
Ｌ−１８に対する特異性・親和性などを改善するため
に、ＣＤＲのアミノ酸配列を構成する全アミノ酸の最大
３０％、望ましくは、最大１０％のアミノ酸を他のアミ
ノ酸、例えば、物性や分子量の類似する他のアミノ酸な
どで置換して、斯かるＣＤＲの一部のアミノ酸配列を含
有するペプチドをさらに創製することもできる。したが
って、斯様にアミノ酸が置換された、ＣＤＲのアミノ酸
配列の一部を有するものであっても、この発明のペプチ
ドに包含される。また、この発明のペプチドには、異な
る２種類以上の抗ＩＬ−１８抗体に由来する可変領域な
いしはＣＤＲのアミノ酸配列を適宜組合わせて含有して
なるものであっても、それが所期の性質を具備する限り
包含される。

【００２９】この発明のペプチドは、通常、組換えＤＮ
Ａ技術を応用して製造される。すなわち、この発明のペ
プチドは、当該ペプチドをコードするＤＮＡを人為的に
発現させ、生成したペプチドを採取して製造される。こ
の発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡに加えて、
組換えＤＮＡ技術を用いる当該ペプチドの製造方法を提
供するものでもあり、この発明の製造方法によるときに
は、所望量の当該ペプチドが容易に得られる。

【００３０】この発明のペプチドをコードするＤＮＡ
は、通常、上述のような、この発明で用いる抗ＩＬ−１
８抗体のアミノ酸配列を決定する過程で得られるｃＤＮ
Ａを材料として、遺伝子工学的手法を適宜組み合わせて
得ることができる。詳細には、斯かるｃＤＮＡにおける
所望の塩基配列、例えば、可変領域やＣＤＲを含む部分
をコードする塩基配列を、発明の実施の形態に応じて選
択される、適宜の異種のアミノ酸配列をコードする塩基
配列を介して連結する。塩基配列の連結は慣用のＰＣＲ
法を適用して行うことができる。実施の形態がｓｃＦｖ
としてのペプチドの場合には、当該抗体における重鎖及
び軽鎖それぞれの可変領域の一部又は全てに対する塩基
配列を、適宜のリンカー、例えば、数個ないし数十個
の、グリシンやセリンなどからなるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を介して連結する。その５′末端部に所
望のシグナルペプチドをコードする塩基配列を連結する
ことも随意である。実施の形態がキメラ抗体としてのペ
プチドの場合には、当該抗体における重鎖及び軽鎖それ
ぞれの可変領域の一部又は全てに対する塩基配列を、公
知のヒト起源の抗体における重鎖及び軽鎖の定常領域に
対する塩基配列と連結する。実施の形態が、ヒト起源の
枠組構造のアミノ酸配列の一部又は全てを含むヒト化抗
体の場合には、当該抗体におけるＣＤＲのアミノ酸配列
と、必要に応じて、その周辺のアミノ酸数個を含む部分
に対するＤＮＡを、公知のヒト起源の抗体における可変
領域に対する塩基配列に移植して連結する。斯かるヒト
起源の抗体は、もとの抗ＩＬ−１８抗体と同様の３次元
構造を有するものが望ましい。この発明のＤＮＡの具体
例としては、配列表における配列番号９又は１０に示す
アミノ酸配列を有するこの発明のペプチドをコードす
る、それぞれ、配列表における配列番号１９又は２０に
示す塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。斯かるＤＮ
Ａは、先述の単一クローン抗体『＃１２５−２ＨｍＡ
ｂ』を産生するハイブリドーマより得られるｃＤＮＡに
おける、配列番号１１の塩基配列の一部及び配列番号１
２の塩基配列を、グリシン及びセリンからなるアミノ酸
配列コードする塩基配列を介して、ＰＣＲ法を適用して
連結することにより得ることができる。なお、ジェイ・
エス・ヒューストンら、『プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ』、
第８５巻、５８７９乃至５８８３頁（１９８８年）、及
びエル・ライチマンら、『ネイチャー』、第３３２巻、
３２３乃至３２７頁（１９８８年）などには、それぞ
れ、ｓｃＦｖ及び、キメラ抗体を含むヒト化抗体の基本
的な手法に関する記載がある。

【００３１】また、斯界においては一般に、あるペプチ
ドをコードするＤＮＡを人為的に発現させるに際し、そ
のＤＮＡの発現効率を改善したり、あるいは、ペプチド
そのものの物性を改善する目的で、ＤＮＡにおける塩基
の１又は複数を他の塩基で置換したり、ＤＮＡに適宜の
塩基配列を連結することがある。この発明のＤＮＡにお
いても斯かる変更は当然可能であり、具体的には、最終
的に得られるペプチドが所期の性質を失わない範囲で、
前述のごときこの発明のペプチドをコードするＤＮＡに
おける５′末端及び／又は３′末端に適宜の制限酵素に
よる認識部位、開始コドン、終止コドン、プロモータ
ー、エンハンサーなどの塩基配列を連結し得ることは言
うまでもない。したがって、この発明でいうＤＮＡと
は、前述のごときペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤ
ＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、さ
らには、それらのＤＮＡがコードするアミノ酸配列を変
更することなく、塩基の１又は複数を他の塩基で置換し
たＤＮＡの全てを包含することとなる。

【００３２】斯かるＤＮＡは、微生物及び動植物由来の
適宜の宿主に導入して発現させることができる。この発
明のＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入
される。組換えＤＮＡはこの発明のＤＮＡと複製可能な
ベクターを含んでなり、ＤＮＡさえ入手できれば、通常
一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製するこ
とができる。この発明のＤＮＡを挿入し得るベクターと
しては、例えば、ｐＥＴ、ｐＫＫ２２３−３、ｐｃＤＮ
ＡＩ／Ａｍｐ、ＢＣＭＧＳＮｅｏ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、
ｐＫＹ４、ｐＳＶ２−ｎｅｏ、ｐＳＶ−２ｇｐｔ、ｐＣ
ＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳな
どのプラスミドベクターが挙げられる。複製可能なベク
ターは、通常、プロモーター、エンハンサー、複製起
点、転写終結部位、スプライシング配列及び／又は選択
配列などの、この発明のＤＮＡが個々の宿主において発
現するための適宜塩基配列を含んでなる。なお、プロモ
ーターとして、例えば、熱ショック蛋白質プロモーター
や、あるいは、同じ特許出願人による特開平７−１６３
３６８号公報に開示されたインターフェロン−αプロモ
ーターを用いるときには、形質転換体における当該ＤＮ
Ａの発現を外部刺激により人為的に制御できることにな
る。

【００３３】斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入
するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体
的には、まず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複
製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により
切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片を連
結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特
異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＡｃｃＩ、Ｂａｍ
ＨＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏ
ｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、Ｓｐ
ｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、ＤＮＡ断片
とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片
とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者を
アニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガー
ゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡ
は、微生物や動物由来の宿主において無限に複製可能で
ある。

【００３４】斯かる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入し
て当該ペプチドの製造に用いられる。宿主としては、斯
界において慣用される適宜の微生物や植物、脊椎動物及
び無脊椎動物を含む動物に由来する細胞、さらには動植
物体そのものを用いることができる。この発明のＤＮＡ
は、斯様な適宜の宿主に導入された形態のＤＮＡをも包
含する。この発明のペプチドをより安価に提供するため
には、大腸菌や枯草菌などの微生物を宿主とするのが望
ましい。この発明のペプチドの最終用途が医薬品である
場合には、酵母や動物由来の宿主が比較的望ましい。動
物由来の宿主細胞の具体例としては、例えば、３Ｔ３−
Ｓｗｉｓｓａｌｂｉｎｏ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−９
２）、Ｃ１２７Ｉ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６１
６）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）、
ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−７０）、ＣＯＳ−１
細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５０）、ＨｅＬａ細胞
（ＡＴＣＣＣＣＬ−２）、ＭＯＰ−８細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１７０９）及びそれらの変異株を始めとす
る、ヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細
胞、間質系細胞及び造血系細胞が挙げられる。斯かる宿
主にこの発明のＤＮＡを導入するには、例えば、公知の
ＤＥＡＥ−デキストラン法、燐酸カルシウム法、エレク
トロポレーション法、リポフェクション法、マイクロイ
ンジェクション法、さらには、レトロウイルス、アデノ
ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなど
によるウイルス感染法などを用いればよい。斯くして得
られる形質転換体から当該ペプチドを産生するクローン
を選択するには、形質転換体を培養培地で培養し、当該
ペプチドの産生が観察されたクローンを選択すればよ
い。なお、哺乳類由来の宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ
技術については、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光
雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９
９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医
学別冊バイオマニュアルシリーズ３遺伝子クローニン
グ実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述され
ている。

【００３５】ところで、斯界においては、所望のＤＮＡ
が上述のようにして得られている場合、斯かるＤＮＡを
適宜の動植物体に導入してなる、いわゆる、トランスジ
ェニック動物やトランスジェニック植物を得ることは慣
用となっている。この発明による、適宜の宿主に導入さ
れた形態のＤＮＡには、斯かるトランスジェニック動物
乃至トランスジェニック植物も包含される。トランスジ
ェニック動物を得るには、概略としては、先ず、この発
明のＤＮＡを、必要に応じてプロモーターやエンハンサ
ーなど所望の他のＤＮＡとともに、宿主動物の種に応じ
て選択される適宜のベクターに組み込み、斯かる組換え
ＤＮＡをマイクロインジェクション法、エレクトロポレ
ーション法や当該ＤＮＡを含有する組換えウイルスの感
染などにより、宿主として用いる動物の受精卵や胚性幹
細胞に導入する。宿主動物としては、マウス、ラット、
ハムスターなど実験動物として汎用される齧歯類のほ
か、山羊、羊、ブタ、牛などの家畜として常用される哺
乳動物も飼育の容易さの点で有用である。次に、このよ
うにして得られる、当該ＤＮＡの導入された細胞を、斯
かる細胞と同種の偽妊娠雌動物の卵管内又は子宮内に移
植する。その後、自然分娩や帝王切開などにより生まれ
る新生児の中から、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ
法などを適用してこの発明のＤＮＡが導入されたトラン
スジェニック動物を選択すればよい。斯くしてこの発明
のＤＮＡを導入してなるトランスジェニック動物は得る
ことができる。なお、以上述べた、トランスジェニック
動物に関しては、例えば、村松正實、岡山博人、山本雅
編集、『実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブッ
ク』、１９９６年、羊土社発行、２６９乃至２８３頁
に、その手法が詳述されている。一方、トランスジェニ
ック植物を得るための方法も、斯界では種々確立されて
いる。例えば、常法にしたがって、植物への感染性を有
するアグロバクテリウム属微生物の『Ｔｉプラスミド』
などのプラスミドをベクターとして用いて、斯かるベク
ターにこの発明のＤＮＡを組込み、得られる組換えＤＮ
Ａを植物体や植物のプロトプラストに導入したり、重金
属の微粒子をこの発明のＤＮＡでコートし、斯かる微粒
子をパーティクルガンを用いて植物体や植物のプロトプ
ラストに直接注入することにより効率よくＤＮＡを導入
することができる。宿主植物としては種々のものを用い
ることができるが、ジャガイモ、大豆、小麦、大麦、
米、トウモロコシ、トマト、レタス、アルファルファ、
リンゴ、桃、メロンなどの食用の植物は、この発明のペ
プチドの、ヒトによる摂取に際しての安全性の面から有
用である。斯くして得られる植物体ないしは植物のプロ
トプラストに、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法を
適用して所期のＤＮＡを含むものを選択し、プロトプラ
ストの場合にはそれを植物体として再生させれば、この
発明のＤＮＡを導入してなるトランスジェニック植物を
得ることができる。なお、トランスジェニック植物を得
るための手法に関しては、ジェーン・ケイ・セトロウ編
集、『ジェネティック・エンジニアリング』、第１６
巻、１９９４年、プレナム・プレス発行、９３乃至１１
３頁に種々概説されている。

【００３６】この発明のペプチドは、当該ペプチドをコ
ードするＤＮＡを発現させる工程と、当該工程により生
成したペプチドを採取する工程を含むこの発明の製造方
法により所望量を製造することができる。当該ＤＮＡ
は、通常、先述のようにして得られる、当該ペプチドを
コードするこの発明のＤＮＡを導入してなる形質転換体
細胞や、トランスジェニック動物又はトランスジェニッ
ク植物を、培養、飼育乃至栽培する工程で発現される。
形質転換体細胞の培養に用いる培地としては、形質転換
体細胞を培養するための慣用の培養培地を用いればよ
く、斯かる培養培地は、通常、緩衝水を基材とし、これ
にナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオ
ン、燐イオン、塩素イオンなどの無機イオンと、宿主の
代謝能力に応じた微量元素、炭素源、窒素源、アミノ
酸、ビタミンなどを加え、必要に応じて、さらに血清、
ホルモン、細胞成長因子、細胞接着因子などを含有せし
めて構成される。個々の培養培地としては、例えば、Ｌ
ブロス培地、Ｔブロス培地、１９９培地、ＤＭＥＭ培
地、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＭＣＤＢ
１０４培地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＥＭ培地、ＲＤ培
地、ＲＩＴＣ８０−７培地、ＲＰＭＩ−１６３０培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＷＡＪＣ４０４培地などが挙
げられる。斯かる培養培地に形質転換体を約１×１０⁴
乃至１×１０⁷個／ｍｌ、望ましくは、約１×１０⁵乃至
１×１０⁶個／ｍｌ接種し、必要に応じて新鮮な培養培
地と取替えながら、温度３７℃前後で１日乃至１週間、
望ましくは、２乃至４日間浮遊培養又は単層培養する
と、当該ペプチドを含む産物としての培養物が得られ
る。形質転換体の種類や培養条件にもよるが、斯くして
得られる培養物は、通常、１ｌ当り当該ペプチドを約１
μｇ乃至１００ｍｇ含む。

【００３７】一方、先述のようにして得られる、この発
明のＤＮＡを導入してなるトランスジェニック動物の飼
育ないしはトランスジェニック植物の栽培により、この
発明のＤＮＡを発現させる場合には、当該動物ないし植
物を慣用の方法により飼育ないし栽培し、導入したＤＮ
Ａの形態、例えば、それに含まれるプロモーターやエン
ハンサーなどに応じて、適宜の外部刺激を与えた後、所
望の組織・器官や、血液、乳及び骨髄液を含む体液など
を採取する。斯くしてこの発明のペプチドを含む産物が
得られる。斯くして得られる産物は、通常、新鮮重量１
ｇ当たり当該ペプチドを約１ｎｇ乃至１００μｇ含む。

【００３８】このようにして得られたこの発明のペプチ
ドを含む培養物ないし産物は、必要に応じて、超音波、
細胞溶解酵素及び／又は界面活性剤により菌体又は細胞
を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ペプチド
を含む画分を菌体若しくは細胞又はそれらの破砕物から
分離し、引き続いて、当該ペプチドを精製して用いるこ
とができる。精製には、生理活性蛋白質を精製するため
の斯界における慣用の方法が適用される。斯かる方法の
具体例としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分
別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ゲル電気泳動、等電点電気泳動などが挙げられる。これ
らの方法を適用して分離される画分を、この発明のペプ
チドが有する所期の性質、例えば、ＩＬ−１８の中和能
や、ＩＬ−１８への結合能、分子量、等電点などについ
て試験し、所期の性質を示した画分を採取すれば、当該
ペプチドは精製することができる。そして、最終使用形
態に応じて、精製ペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又
は固状にすればよい。なお、この発明のペプチドが、特
定の物質に親和性を示すアミノ酸配列を含有している場
合は、斯かる親和性物質を利用してこの発明のペプチド
を精製することもできる。例えば、この発明のペプチド
が数個のヒスチジンからなるアミノ酸配列を含有する場
合、斯かる配列はニッケルイオンに親和性を示すので、
当該ペプチドはニッケルイオンの固定化された水不溶性
担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより
容易に精製することができる。また、この発明のペプチ
ドはＩＬ−１８に特異的に結合するので、ＩＬ−１８の
固定化された水不溶性担体を用いるアフィニティークロ
マトグラフィーもこの発明のペプチドの精製に有用であ
る。

【００３９】斯くして得られるこの発明のペプチドはＩ
Ｌ−１８の生理作用を中和する性質を具備する。同じ特
許出願人による特許第２７２４９８７号公報及び特開平
８−２７１８９号公報などに、免疫担当細胞におけるＩ
ＦＮ−γの産生の誘導能や、キラー細胞の生成の誘導
能、キラー細胞の細胞障害性の増強能が記載されている
ように、ＩＬ−１８は多面的な生理作用を有することが
明らかとなっている。また、過剰なＩＬ−１８は生体に
おける炎症を惹起する場合がある。この発明のペプチド
はこのようなＩＬ−１８の生理作用を中和し、斯かる生
理作用に起因する生体における炎症の惹起を抑制し得
る。

【００４０】この発明のペプチドは、ヒトを含む哺乳類
において、免疫系を活性化するＩＬ−１８の生理作用を
中和して免疫反応を抑制して調節する性質を有するの
で、過剰な免疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防
に著効を発揮する。免疫系は、本来、有害な異物から生
体を防御するためのものであるが、ときとして、その働
き故に、却って、生体に有害な結果をもたらすことがあ
る。哺乳類に、例えば、腎臓、肝臓、心臓、骨髄、血液
などの臓器や皮膚、角膜、血管、心臓弁などの組織を移
植すると、同種異系抗原に対する拒絶反応や免疫反応に
より、Ｔ細胞が活性化され、リンパ球が増殖したり、炎
症が生じることがある。症状の程度こそ違え、同様の現
象は、例えば、アレルゲンのように、宿主が固有のもの
と見做さない異種異系抗原が侵入した場合にも観察され
る。自己免疫疾患においては、本来、固有のものと見做
されるべき成分がアレルギー反応を惹起する。この発明
のペプチドは、ヒトを含む哺乳類に投与すると、斯かる
免疫反応を抑制又は調節し、それらに起因する各種疾患
の治療・予防に著効を発揮する。したがって、この発明
でいう感受性疾患とは免疫反応の亢進に起因する疾患で
あって、この発明のペプチドが直接又は間接に作用して
治療又は予防し得るすべての疾患ということになり、個
々の感受性疾患としては、例えば、上記のごとき移植に
伴う拒絶反応や、移植片対宿主疾患、高ＩＬ−１８血症
を伴う諸疾患、悪性貧血、萎縮性胃炎、インスリン抵抗
性糖尿病、ウェジナー肉芽腫症、円板状エリテマトーデ
ス、潰瘍性大腸炎、寒冷凝集素症、グッドパスチャー症
候群、クローン病、交感性眼炎、甲状腺機能亢進症、若
年性糖尿病、シェーグレン症候群、自己免疫性肝炎、自
己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、進行性全身性硬化
症、全身性エリテマトーデス、多発性寒冷血色素尿症、
多発性筋炎、多発性結節性動脈炎、多発性硬化症、特発
性アジソン病、特発性血小板減少性紫班病、バセドウ
病、白血球減少症、血球貪食症候群、ベーチェット病、
早発性更年期、慢性関節リウマチ、成人スチル病、スチ
ル病、リウマチ熱、慢性甲状腺炎、ホジキン病、ＨＩＶ
感染症、喘息、アトピー性皮膚炎、接触皮膚アレルギ
ー、アレルギー性鼻炎、花粉症及びハチ毒アレルギーを
含む自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び免疫不全症が
挙げられる。なお、この発明のペプチドは、ＩＦＮ−γ
の過剰産生や過剰投与などに起因する敗血症ショックの
治療や予防にも有効である。また、この発明のペプチド
は、例えば、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、中毒
性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、劇症肝炎、ウイルス性
肝硬変、アルコール性肝硬変、中毒性肝硬変、胆汁性肝
硬変、胆汁うっ滞性肝障害、肝細胞癌、急性肝炎、脂肪
肝、肝臓腫瘍、肝血管障害などの肝疾患、胆管炎、胆嚢
炎、原発性硬化性胆管炎、胆嚢腫瘍、胆管腫瘍などの胆
嚢・胆道疾患、急性膵炎、慢性膵炎、膵機能不全、膵臓
腫瘍及び膵嚢胞などの膵疾患、急性腎炎、慢性腎不全、
腎癌、腎虚血、腎結石、糸球体腎炎、糸球体炎、糸球体
硬化などの腎臓並びに糸球体疾患の治療・予防、さらに
は、それらの疾患に伴う、例えば、食欲不振、倦怠感、
疲労感、腹痛、背痛、黄疸、発熱、肝性脳症、腹水、出
血傾向などの症状を緩和又は解消する効果もある。その
際、例えば、プロトポルフィリン、チオプリン、マロチ
ラート、肝臓加水分解物、グリチルリチン、ジクロロ酢
酸ジイソプロピルアミン、メチルメチオニンスルホニウ
ムクロリド、グルタチオン、タウリン、シアニダノー
ル、インターフェロン、ビタミンＢ₁、ビタミンＢ₂、ビ
タミンＢ₆、ビタミンＢ₁₂、チオクト酸、小紫胡湯、大
紫胡湯、紫胡桂枝湯、アスパラギン酸、甘草、メチオニ
ンなどの肝細胞の機能を促進する薬剤を併用してもよ
い。また、生体内において、ＩＬ−１８がＦａｓリガン
ドの産生を増強したり、逆に、ＦａｓリガンドがＩＬ−
１８の細胞からの分泌を誘導する場合があるので、この
発明のペプチドは、Ｆａｓ及びＦａｓリガンドが関与す
る免疫疾患一般の治療・予防にも有効である。加えて、
この発明のペプチドは、虚血、虚血性心筋症、脳虚血、
脳底動脈片頭痛、脳底部異常血管網症、脳卒中、脳底部
動脈瘤、動脈硬化症、血管内皮障害、糖尿病、腸管膜血
管閉塞症及び上腸管膜動脈症候群を含む循環器系疾患、
パーキンソン病、脊髄筋肉萎縮症、筋萎縮性側策硬化
症、アルツハイマー病、痴呆症、脳血管性痴呆症、エイ
ズ痴呆症及び脳脊髄炎を含む神経系疾患の症状を緩和し
たり、予防する効果もある。

【００４１】斯くして、有効成分としてこの発明のペプ
チドを含んでなる感受性疾患剤は、上記のごとき感受性
疾患を治療・予防するための抗自己免疫疾患剤、抗アレ
ルギー剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、増血剤、白血球増多
剤、血小板増多剤、鎮痛剤、解熱剤、肝機能改善剤など
として多種多様な用途を有することとなる。剤型並びに
感受性疾患の種類及び症状にもよるが、この発明の感受
性疾患剤は、通常、液状、懸濁状、ペースト状又は固形
状に調製され、この発明のペプチドを０．００００１乃
至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０００１乃至
２０％（ｗ／ｗ）含んでなる。

【００４２】この発明の感受性疾患剤は、当該ペプチド
単独の形態はもとより、それ以外の生理的に許容され
る、例えば、担体、賦形剤、希釈剤、アジュバント、安
定剤、さらには、必要に応じて、他の生理活性物質の１
若しくは複数種類との組成物としての形態をも包含す
る。安定剤としては、例えば、血清アルブミンやゼラチ
ンなどの蛋白質、グルコース、シュークロース、ラクト
ース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マル
チトール、マンニトール、ラクチトールなどの糖質及び
クエン酸塩若しくは燐酸塩を主体とする緩衝剤が、ま
た、併用し得る他の生理活性物質としては、例えば、Ｆ
Ｋ５０６、グルココルチコイド、シクロフォスファミ
ド、ナイトロゲンマスタード、トリエチレンチオフォス
ファミド、ブズルファン、フェニラミンマスタード、ク
ロランブシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリ
ン、６−チオグアニン、６−アザグアニン、８−アザグ
アニン、フルオロウラシル、シタラビン、メトトレキセ
ート、アミノプテリン、マイトマイシンＣ、塩酸ダウノ
ルビシン、アクチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ３、
塩酸ブレオマイシン、塩酸ドキソルビシン、サイクロス
ポリンＡ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビ
ンブラスチン、ヒドロキシウレア、塩酸プロカルバジ
ン、副腎皮質ホルモン、金製剤などの他に、ＩＬ−１８
以外のサイトカインの受容体アンタゴニストやＩＬ−１
８以外のサイトカインの中和剤、例えば、インターロイ
キン−１受容体蛋白質、インターロイキン−２受容体蛋
白質、インターロイキン−５受容体蛋白質、インターロ
イキン−６受容体蛋白質、インターロイキン−８受容体
蛋白質及びインターロイキン−１２受容体蛋白質に対す
るそれぞれの抗体、さらには、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮ
Ｆ−β受容体、インターロイキン−１受容体、インター
ロイキン−５受容体及びインターロイキン−８受容体に
対するそれぞれのアンタゴニストなどが挙げられる。

【００４３】さらに、この発明の感受性疾患剤は投薬単
位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤と
は、当該ペプチドを、例えば、１回当りの用量又はその
整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０まで）
に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に一体
の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態
の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、シロッ
プ剤、錠剤、カプセル剤、外用剤などが挙げられる。当
該疾患剤は経口的に投与しても非経口的に投与してもよ
く、いずれの場合にも感受性疾患の治療・予防に効果を
発揮する。当該疾患剤の用量は、通常は、感受性疾患患
者の体内のＩＬ−１８レベルに基づき選定される。体内
のＩＬ−１８レベルは、例えば、患者より採取される血
液、関節液及び骨髄液などの体液や尿などの生物学的試
料を、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号
公報に記載の検出方法や、特開平１０−９６７３０号公
報に記載の診断方法などに供して測定することができ
る。測定値を、同様にして測定される健常者における基
準値と比較すれば、斯かる患者の体内におけるＩＬ−１
８の過剰量が推測される。斯くして推測される、患者に
おけるＩＬ−１８の過剰量を中和し得る量のこの発明の
ペプチドを含む当該疾患剤をその患者に投与すればよ
い。ＩＬ−１８を中和し得るこの発明のペプチドの量
は、当該ペプチドの形態やその投与経路により異なる
が、通常は、ＩＬ−１８の量に対してモル比で１／２な
いしはそれ以上である。斯くして選定される用量の当該
疾患剤を、感受性疾患の種類・症状や、過剰なＩＬ−１
８の検出された部位を勘案して、１度に又は２度以上に
分けて、経口投与するか皮内、皮下、筋肉内又は静脈内
に非経口投与すればよい。当該疾患剤は、通常は、当該
ペプチド量として成人当り約１μｇ乃至１ｇ／回、より
望ましくは、約１０μｇ乃至１００ｍｇ／回の用量で、
１乃至４回／日又は１乃至５回／週の頻度で１日乃至１
年間に亙って投与される。

【００４４】ところで、この発明のペプチドをコードす
るＤＮＡは、いわゆる、「遺伝子療法」にも有用であ
る。すなわち、通常の遺伝子療法においては、この発明
のＤＮＡを、例えば、レトロウイルス、アデノウイル
ス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクター
に挿入するか、カチオニックポリマーや膜融合型リポソ
ームなどのリポソームに包埋し、この状態で、生体内で
の過剰なＩＬ−１８に起因する疾患に罹患した患者に直
接注入するか、あるいは、患者からリンパ球を採取し、
生体外で導入した後、患者に自家移植するのである。ま
た、養子免疫遺伝子療法においては、効果細胞にこの発
明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入
すると、例えば、腫瘍細胞やウイルス感染細胞などの標
的細胞に対する効果細胞の細胞障害性が高まり、養子免
疫療法を強化することができる。さらに、腫瘍ワクチン
遺伝子療法においては、患者から摘出した腫瘍細胞にこ
の発明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして
導入し、生体外で一定数に達するまで増殖させた後、患
者に自家移植するのである。移植された腫瘍細胞は患者
体内においてワクチンとして作用し、強力且つ抗原特異
的な抗腫瘍免疫を発揮する。斯くして、この発明のＤＮ
Ａは、例えば、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、感染症及び
免疫不全症を始めとする各種疾患の遺伝子療法、さらに
は、臓器移植やアレルギー性疾患に伴う拒絶反応や過剰
な免疫反応の抑制に著効を発揮することとなる。なお、
これらの遺伝子療法を実施するための一般的手順は、例
えば、島田隆、斉藤泉、小澤敏也編集、『実験医学別冊
バイオマニュアルＵＰシリーズ遺伝子治療の基礎技
術』、１９９６年、羊土社発行にも詳述されている。

【００４５】また、この発明のペプチドには、ＩＬ−１
８を認識し、結合して、その生理作用を中和ないし阻害
する性質があるので、当該ペプチドを有効成分とするこ
の発明の中和剤及び阻害剤並びに、ＩＬ−１８に当該ペ
プチドを作用させるこの発明の中和方法及び阻害方法
は、ＩＬ−１８の過剰産生やＩＬ−１８の過剰投与に起
因する種々の疾患の治療に有用である。さらに、この発
明のペチプチドはＩＬ−１８を認識し、結合する性質が
あるので、当然のことながら、ＩＬ−１８を精製したり
検出するためのアフィニティークロマトグラフィーや標
識アッセイにおいても有用である。また、これに加え、
この発明のペプチドは、ＩＬ−１８に対する作動薬や拮
抗薬の、生体内又は生体外での検索にも有用である。

【００４６】以下、この発明の実施の形態につき、実施
例を挙げて説明する。なお、以下の実施例１乃至３にお
いて用いられる手法は斯界において慣用のものであり、
例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医
学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発
行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニ
ュアルシリーズ３遺伝子クローニング実験法』、１９
９３年、羊土社発行などにも詳述されている。

【００４７】

【実施例１】〈ペプチド及びそれをコードするＤＮＡ〉

【００４８】

【実施例１−１】〈抗ＩＬ−１８抗体の選択〉

【００４９】

【実施例１−１（ａ）】〈抗ＩＬ−１８抗体を産生する
ハイブリドーマの選択〉同じ特許出願人による特許第２
７２４９８７号公報に記載の、形質転換体によるポリペ
プチドの製造方法にしたがって、配列表における配列番
号２１に示すアミノ酸配列有するヒトＩＬ−１８として
のポリペプチドを調製した。同じ特許出願人による特開
平８−２３１５９８号公報に記載の方法したがって、こ
のポリペプチドを抗原として用いてＢＡＬＢ／ｃマウス
を免疫感作し、免疫感作されたマウスより脾細胞を調製
した。引き続き、特開平８−２３１５９８号公報に記載
の方法に準じて、得られた脾細胞をマウス骨髄種由来の
Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８
１）との融合反応に供してハイブリドーマを生成させ、
これをマイクロプレートに適量ずつ分注した後、３７℃
で１週間培養した。

【００５０】引き続き、同じ特許出願人による特開平８
−２３１５９８号公報に記載の方法にしたがって、各ウ
ェルのハイブリドーマの培養上清と先に得たヒトＩＬ−
１８との反応性をエンザイムイムノアッセイにより調
べ、斯かる反応性ある培養上清を産生したハイブリドー
マに限界希釈法を適用して、抗ヒトＩＬ−１８抗体を産
生する、数種類のハイブリドーマの単一クローンを得
た。

【００５１】得られたハイブリドーマの単一クローンを
９６ウェルマイクロプレートの個々のウェルで常法にし
たがって培養した後、それぞれの培養上清のＩＬ−１８
中和能を判定した。ＩＬ−１８中和能は、ＩＬ−１８の
生理作用のひとつである、免疫担当細胞におけるＩＦＮ
−γの産生誘導に対する被験試料の阻害効果を調べるこ
とにより判定した。免疫担当細胞としてヒト急性骨髄性
白血病患者の骨髄細胞に由来するＫＧ−１細胞（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ−２４６）を用い、被験試料として上記培養
上清を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭ
Ｉ１６４０培地（ｐＨ７．４）により各種の適宜の倍率
に希釈して得た希釈物を用いた。先ず、常法にしたがっ
て、予め所期の細胞数に達するまで増殖させたＫＧ−１
細胞を、細胞密度３×１０⁶個／ｍｌになるように１０
％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０
培地（ｐＨ７．４）に浮遊させ、９６ウェルマイクロプ
レートにウェル当たり０．１ｍｌずつ分注した。一方、
上記で得たヒトＩＬ−１８の５ｎｇ／ｍｌ溶液０．０５
ｍｌと、被験試料のいずれか又は対照として１０％（ｖ
／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地
（ｐＨ７．４）０．０５ｍｌとを混合した後、各ウエル
に添加した。３７℃で５％ＣＯ₂インキュベーター中２
４時間インキュベートした後、各ウェルから培養上清を
０．１ｍｌずつ採取し、産生されたＩＦＮ−γの量を通
常の酵素免疫測定法により測定した。ＩＦＮ−γの標準
品として、米国国立公衆衛生研究所から入手したヒトＩ
ＦＮ−γ（Ｇｇ２３−９０１−５３０）を用いた。その
結果、いくつかのハイブリドーマの培養上清が、対照に
認められたＩＬ−１８によるＩＦＮ−γの産生の誘導
を、用量依存的に、極めて顕著に阻害することが判明し
た。これらのうち、とりわけ強い阻害能を示したハイブ
リドーマの単一クローンを選択し、『＃１２５−２Ｈ』
と命名した。

【００５２】

【実施例１−１（ｂ）】〈抗ＩＬ−１８抗体の調製〉実
施例１−１（ａ）で選択したハイブリドーマのクローン
『＃１２５−２Ｈ』を、同じ出願人による特開平８−２
３１５９８号公報に記載の方法にしたがって、ＢＡＬＢ
／ｃマウスの腹腔内で増殖させた。マウスより腹水を採
取し、引き続き特開平８−２３１５９８号公報に記載の
方法にしたがって、腹水より、ハイブリドーマ『＃１２
５−２Ｈ』の産生した単一クローン抗体を精製した。常
法にしたがって分析したところ、この単一クローン抗体
は、ＩｇＧ₁のクラスに属するものであった。実施例１
−１（ａ）に記載のＩＬ−１８中和能の判定法に準じて
試験したところ、この単一クローン抗体は、極めて効果
的に且つ用量依存的にＩＬ−１８によるＫＧ−１細胞
（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４６）におけるＩＦＮ−γの産
生誘導を阻害するものであり、ＩＬ−１８中和抗体であ
ることが確認された。斯くして得た単一クローン抗体を
『＃１２５−２ＨｍＡｂ』と命名した。

【００５３】

【実施例１−２】〈抗ＩＬ−１８抗体における可変領域
のアミノ酸配列〉実施例１−１（ａ）で得たハイブリド
ーマのクローン『＃１２５−２Ｈ』を、常法にしたがっ
て、１０％（ｖ／ｖ）ウシ血清を補足したＲＰＭＩ１６
４０培地（ｐＨ７．４）に浮遊させ、培養規模を拡大し
ながら５％ＣＯ₂インキュベーター中で培養した。所期
の細胞密度に達した時点で、培養した細胞を微量反応管
に採取した後、燐酸食塩緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と記
す。）で細胞を３回洗浄し、再度新鮮なＰＢＳに懸濁し
た。細胞懸濁物を新たな微量反応管に、一本当たり５×
１０⁶個の細胞数となるように採り、バイオテクス社製
のＲＮＡ調製用試薬『ウルトラスペックＬＳＩＩ』
を１ｍｌずつ添加し懸濁した。この懸濁物にクロロホル
ムを微量反応管当たり０．２ｍｌ添加し、１５秒間撹拌
後、氷上で５分間保持した。遠心分離して形成される上
層を採取し、これと等量の２−プロパノールを添加・混
合した後、氷上で５分間保持した。遠心して上清を除去
し、沈澱を、７５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で２回
洗浄し、減圧乾燥し、滅菌蒸留水に溶解して、『＃１２
５−２Ｈ』由来の全ＲＮＡ画分を得た。この画分を一部
とり、２６０ｎｍにおける吸光度を測定してＲＮＡ濃度
を算出した。

【００５４】２本の微量反応管に上記で得た全ＲＮＡを
それぞれ１μｇとり、滅菌蒸留水を添加して反応管当り
の全量を１０．１μｌとした。これらの微量反応管を７
０℃で５分間保持し、氷上で冷却した後、常法にしたが
い逆転写酵素反応に供した。いずれの微量反応管も、反
応液量は２０μｌとし、反応液中の各成分の終濃度は、
５ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．２５ｍＭｄ
ＮＴＰミックス、０．０１μｇ／μｌランダムヘキサ
デオキシリボヌクレオチド、２ｍＭジチオトレイトー
ル、０．８７５単位／μｌＲＮａｓｅインヒビター、
及び１０単位／μｌ逆転写酵素とした。温度は、２５
℃で１０分間、４２℃で３０分間及び９９℃で５分間の
順で制御した後、４℃にまで冷却した。

【００５５】次に、常法にしたがい、上記の２本の反応
管で得た逆転写酵素反応産物をそれぞれ鋳型として用い
る２種類のＰＣＲ反応、すなわち、抗体の軽鎖における
可変領域をコードするｃＤＮＡ断片を増幅するためのＰ
ＣＲ反応（以下、「ＰＣＲ反応Ａ」と言う。）及び、抗
体の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡ断片を増幅す
るためのＰＣＲ反応（以下、「ＰＣＲ反応Ｂ」と言
う。）を行った。プライマーとしてのオリゴヌクレオチ
ドは、エス・タラン・ジョーンズら『バイオテクノロジ
ー』、第９巻、８８乃至８９頁（１９９１年）に記載さ
れたＰＣＲプライマーを参考にしてデザインし、常法に
したがって調製した。ＰＣＲ反応Ａで用いたセンスプラ
イマーは配列表における配列番号２３に示す塩基配列の
オリゴヌクレオチドであり、アンチセンスプライマーは
配列表における配列番号２４に示す塩基配列のオリゴヌ
クレオチドであった。ＰＣＲ反応Ｂで用いたセンスプラ
イマーは配列表における配列番号２５に示す塩基配列の
オリゴヌクレオチドであり、アンチセンスプライマーは
配列表における配列番号２６に示す塩基配列のオリゴヌ
クレオチドであった。ＰＣＲ反応の液量は、Ａ、Ｂいず
れも１００μｌとした。ＰＣＲ反応Ａ及びＢにおける反
応液中の各成分の終濃度は、いずれも、１０ｍＭＫＣ
ｌ、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０．
１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００、１０μｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン、０．１２５ｍＭｄＮＴＰミッ
クス、適量の上記センスプライマー、適量の上記アンチ
センスプライマー、及び０．０２５単位／μｌＰｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン製）とした。温
度制御は、ＰＣＲ反応Ａ、Ｂともに、９４℃で１分間、
６０℃で１分間及び７２℃で１分間の順でインキュベー
トするサイクルを４０回とした。

【００５６】それぞれのＰＣＲ反応産物より、増幅され
たｃＤＮＡを通常のポリエチレングリコール沈澱により
採取し、その一部を、ストラタジーン製『ｐＣＲ−Ｓｃ
ｒｉｐｔＣａｍＳＫ（＋）クローニングキット』
を用い、添付の説明書にしたがって操作して、プラスミ
ドベクター『ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＣａｍＳＫ
（＋）』との連結反応に供した。連結反応産物の一部
で、ストラタジーン製大腸菌コンピテントセル『ＸＬ１
−ＢｌｕｅＭＲＦ′ Ｋａｎ』株を、添付の説明書に
したがい操作して形質転換した。形質転換した大腸菌
を、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬ寒天
平板培地に接種し、３７℃で一晩静置培養した。生成し
たコロニーを、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを
含むＬブロス培地にそれぞれ接種し、３７℃で一晩振盪
培養した。培養物より菌体を採取し、常法により、菌体
より組換えＤＮＡを採取した。通常のジデオキシ法によ
り塩基配列を解読したところ、ＰＣＲ反応Ａに由来する
組換えＤＮＡは配列表における配列番号２７に示す塩基
配列を、ＰＣＲ反応Ｂに由来する組換えＤＮＡは配列表
における配列番号２８に示す塩基配列を含有しており、
それぞれの塩基配列はそこに併記したアミノ酸配列をコ
ードしていることが判明した。

【００５７】抗体の軽鎖及び重鎖における可変領域は、
通常、４種類の枠組構造が３種類のＣＤＲを介して連結
してなる、互いに類似した構造を有している。また、同
種抗体同士の場合、一般に、枠組構造のアミノ酸配列は
比較的よく保存されているのに対して、ＣＤＲのアミノ
酸配列は抗体ごとに多様性が見られる。そこで、上記で
明らかにしたアミノ酸配列と、マウス抗体についてすで
に報告されている可変領域のアミノ酸配列とを比較・照
合することにより、単一クローン抗体『＃１２５−２Ｈ
ｍＡｂ』の軽鎖及び重鎖における可変領域と、それぞれ
におけるＣＤＲのアミノ酸配列の決定を試みた。その結
果、当該抗体の軽鎖における可変領域は、配列表におけ
る配列番号２７に併記したアミノ酸配列における第２１
乃至１２８番目のアミノ酸からなる配列、すなわち、配
列番号１に示すアミノ酸配列を有し、重鎖における可変
領域は、配列表における配列番号２８に併記したアミノ
酸配列における第２０乃至１３２番目のアミノ酸からな
る配列、すなわち、配列番号２に示すアミノ酸配列を有
すると結論された。また、当該軽鎖における３種類のＣ
ＤＲは、それぞれ、配列表における配列番号３乃至５に
示すアミノ酸配列を、当該重鎖における３種類のＣＤＲ
は、それぞれ、配列表における配列番号６乃至８に示す
アミノ酸配列を有すると結論された。なお、以上の配列
番号１乃至８に示すアミノ酸配列をコードする、ハイブ
リドーマ『＃１２５−２Ｈ』由来のＤＮＡの塩基配列
は、それぞれ、配列表における配列番号１１乃至１８に
示されている。

【００５８】

【実施例１−３】〈ペプチド及びそれをコードするＤＮ
Ａ〉

【００５９】

【実施例１−３（ａ）】〈ＤＮＡ、組換えＤＮＡ及び形
質転換体の調製〉実施例１−２で明らかにした、単一ク
ローン抗体『＃１２５−２ＨｍＡｂ』の軽鎖及び重鎖に
おける可変領域のアミノ酸配列、すなわち、配列表にお
ける配列番号１及び２に示すアミノ酸配列の一部又は全
てを含有する、ｓｃＦｖとしてのペプチドをコードする
ＤＮＡを、通常の遺伝子工学的手法を組み合わせて以下
のようにして調製した。先ず、実施例１−２に記載の方
法にしたがって、ハイブリドーマ『＃１２５−２Ｈ』由
来の全ＲＮＡを調製し、全ＲＮＡを２本の微量反応管内
で逆転写酵素反応に供した。引き続き、それぞれの反応
産物を鋳型に用い、別個のＰＣＲ反応、すなわち、配列
表における配列番号１２に示す塩基配列を含むＤＮＡ断
片を増幅するための反応（以下、「ＰＣＲ反応Ｃ」と言
う。）、及び、配列表における配列番号１１に示す塩基
配列の一部を含有するＤＮＡ断片を増幅するための反応
（以下、「ＰＣＲ反応Ｄ」と言う。）を行った。ＰＣＲ
反応Ｃにおいて、センスプライマー及びアンチセンスプ
ライマーは、それぞれ、配列表における配列番号２９及
び３０に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。
ＰＣＲ反応Ｄにおいて、センスプライマー及びアンチセ
ンスプライマーは、それぞれ、配列表における配列番号
３１及び３２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを用
いた。これらのプライマーは、いずれも実施例１−２で
明らかにした塩基配列に基づきデザインし、常法にした
がって調製したオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲ反応
Ｃ及びＤにおける各成分の組成は、いずれも、実施例１
−３に記載のＰＣＲ反応Ａの場合と同一とした。温度制
御は、いずれも、９４℃で１分間、３５℃で１分間及び
７２℃で１分間の順でインキュベートするサイクルを３
回繰り返した後、９４℃で１分間、６０℃で４５秒及び
７２℃で１分間インキュベートするサイクルを３２回繰
り返し、その後４℃で保持した。

【００６０】実施例１−２に記載の方法にしたがって、
ＰＣＲ反応Ｃ及びＤの産物より増幅されたＤＮＡを採取
し、採取したＤＮＡをプラスミドベクター『ｐＣＲ−Ｓ
ｃｒｉｐｔＣａｍＳＫ（＋）』との連結反応に供
し、連結反応産物で大腸菌を形質転換し、形質転換体を
培養し、培養物から組換えＤＮＡを採取した。ジデオキ
シ法により分析して、ＰＣＲ反応Ｃ及びＤ由来の組換え
ＤＮＡが、それぞれ配列表における配列番号１２の塩基
配列及び配列番号１１の塩基配列の一部を含有すること
を確認した。ＰＣＲ反応Ｃ由来の組換えＤＮＡを制限酵
素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで、ＰＣＲ反応Ｄ由来の組換
えＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで東洋紡販売のプラスミ
ドベクター『ｐＥＴ−３ａ』を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢ
ａｍＨＩで消化した。これらの消化物の適量ずつを微量
反応管に合一した後、混合物を宝酒造製ライゲーション
キット『ライゲーション・キット・バージョン２』を用
いて添付の説明書にしたがい操作して連結反応を行っ
た。常法にしたがい連結反応産物で宝酒造製大腸菌コン
ピテントセル『ＪＭ１０９』株を形質転換し、形質転換
体を培養し、培養物から組換えＤＮＡを採取した。ジデ
オキシ法により分析して、斯かる組換えＤＮＡが、配列
表における配列番号９に示すアミノ酸配列をコードする
配列番号１９に示す塩基配列を含有することを確認し、
『ｐＥｓｃＦｖ＃１２５−２Ｈ』と命名した。配列番号
９に示すアミノ酸配列は、単一クローン抗体『＃１２５
−２ＨｍＡｂ』の重鎖における可変領域のアミノ酸配列
（配列番号２）、グリシン及びセリンからなるリンカー
としてのアミノ酸配列、及び同抗体の軽鎖における可変
領域のアミノ酸配列（配列番号１）の一部が、Ｎ末端か
らこの順で連結されてなるものである。図１に示すよう
に、組換えＤＮＡ『ｐＥｓｃＦｖ＃１２５−２Ｈ』にお
いては、Ｔ７プロモーター及びリボゾーム結合配列の下
流に、開始コドン、配列番号１９に示す塩基配列及び終
止コドンがこの順で連結されていた。常法にしたがい、
組換えＤＮＡ『ｐＥｓｃＦｖ＃１２５−２Ｈ』で東洋紡
販売の大腸菌コンピテントセル『ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐ
ＬｙｓＳ』株を形質転換し、斯かる組換えＤＮＡの導入
された形質転換体を得た。この形質転換体を『ＥｓｃＦ
ｖ＃１２５−２Ｈ』と命名した。

【００６１】

【実施例１−３（ｂ）】〈形質転換体によるペプチドの
製造〉常法によりＬブロス培地中で３７℃で振盪条件下
一晩前培養した、実施例１−３（ａ）で得た形質転換体
『ＥｓｃＦｖ＃１２５−２Ｈ』の培養物を、５００ｍｌ
容三角フラスコに調製した１００ｍｌの、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌクロラムフェニ
コールを含むＴブロス培地に１ｍｌ接種し、培養物の６
００ｎｍにおける吸光度（セル幅１ｃｍ）を測定しつ
つ、３７℃で振盪培養した。吸光度が約０．５に達した
時点で、培養物にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する。）を終濃
度０．４ｍＭになるように添加し、引き続き約５時間培
養を継続した。

【００６２】培養物から菌体を遠心分離により回収し、
−８０℃で凍結させた。凍結菌体を解凍し、０．５Ｍ
尿素及び０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄を含む０．０１Ｍト
リス緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、単に「０．５Ｍ尿素
溶液」と言う。）に懸濁し、超音波処理した後、３７℃
で１時間振盪して菌体を破砕した。遠心分離により菌体
破砕物から不溶性画分を回収して封入体含有画分を得
た。封入体含有画分を、０．５Ｍ尿素溶液に懸濁し、超
音波処理し、０．５Ｍ尿素溶液で洗浄して、洗浄封入体
画分を得た。洗浄封入体画分を６．０Ｍ尿素及び０．
１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄を含む０．０１Ｍトリス緩衝液
（ｐＨ８．０）で可溶化した。遠心分離して残存する不
溶物を除去した後、可溶化物を、担体としてアマシャム
ファルマシアバイオテク製『スーパーデックス７５ＨＲ
１０／３０』を用い、溶離液としてＰＢＳを用いるゲル
濾過で分離し、溶出したボイド画分を回収した。回収し
た画分を８．０Ｍ尿素を含むＰＢＳに対して透析して
蛋白質成分を変性させた後、透析外液の尿素濃度を下げ
ることにより、変性蛋白質成分を再生させる操作を数回
繰り返した。引き続いて、透析物を先述の方法に準じて
ゲル濾過により分離し、分子量約２５乃至３０キロダル
トンに相当する画分を採取した。採取した画分の液量は
約２ｍｌ、蛋白質成分の含量は約１００μｇ／ｍｌであ
った。通常のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と言
う。）で分析したところ、採取した画分は、分子量約２
９キロダルトンのペプチドを約９５％以上の純度で含ん
でいた。

【００６３】

【実施例１−３（ｃ）】〈ペプチドによるＩＬ−１８の
生理作用の中和〉実施例１−３（ｂ）で得たペプチド含
有画分を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲ
ＰＭＩ１６４０培地で、１２００、７２００又は４３２
００倍希釈し、これら希釈物のＩＬ−１８中和能を実施
例１−１に記載のＩＬ−１８の中和能の判定方法にした
がって調べた。結果を図２に示す。

【００６４】図２に見られるように、実施例１−３
（ｂ）で得たペプチド含有画分は、対照に見られる、Ｉ
Ｌ−１８の生理作用によるＫＧ−１細胞におけるＩＦＮ
−γの産生の誘導を用量依存的に阻害した。斯かるペプ
チドのＳＤＳ−ＰＡＧＥで見積もられた分子量は、配列
表における配列番号９に示すアミノ酸配列の計算上の分
子量（約２５キロダルトン）に見合うものである。以上
の実施例１−１乃至１−３（ｃ）に示した結果は、実施
例１−３（ｂ）で得たペプチドが、抗ＩＬ−１８抗体で
ある単一クローン抗体における可変領域のアミノ酸配列
としての、配列表における配列番号１及び２に示すアミ
ノ酸配列の一部又は全てを含有する、ＩＬ−１８の生理
作用を中和する、人為的に創製されたこの発明のペプチ
ドであることを示している。また以上の結果は、実施例
１−３（ａ）で得たＤＮＡは、この発明のペプチドをコ
ードする、この発明のＤＮＡであり、実施例１−３
（ｂ）に見られるように、斯かるＤＮＡを用いるこの発
明のペプチドの製造方法によれば、斯かるペプチドが良
好に製造できることを示している。

【００６５】

【実施例１−３（ｄ）】〈ペプチドのＩＬ−１８への特
異的結合〉実施例１−１（ａ）に記載の方法で調製した
ヒトＩＬ−１８を常法にしたがって¹²⁵Ｉで標識し、
０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ
（以下、「ＢＳＡ／ＰＢＳ」と言う。）で希釈し、¹²⁵
Ｉ標識ヒトＩＬ−１８濃度が８ｎｇ／μｌの¹²⁵Ｉ標識
ヒトＩＬ−１８溶液を調製した。２本の微量反応管それ
ぞれに、この¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８溶液０．５μ
ｌ、及び実施例１−３（ｂ）で得た、この発明のペプチ
ドを含有する、分子量約２５乃至３０キロダルトンに相
当するゲル濾過画分６．５μｌを注入した。一方の微量
反応管に３μｌのＢＳＡ／ＰＢＳを、残る一方の微量反
応管に３μｇの未標識ヒトＩＬ−１８を含む３μｌのＢ
ＳＡ／ＰＢＳをさらに注入した後、両微量反応管を４℃
で１時間振盪した。それぞれに０．５μｌのピアース製
架橋試薬『ＢＳ³』の４ｍＭ水溶液を加えて氷上で３０
分間静置して架橋反応に供した。それぞれに０．５μｌ
の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を加え１５分間静置
して反応を終結した。反応産物を分子量マーカーととも
に、還元剤としてＤＴＴを用いる通常のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅに供し、泳動後のゲルを常法にしたがってオートラジ
オグラフィーに供した。結果を図３に示す。

【００６６】図３に見られるように、未標識のＩＬ−１
８未添加の系には、分子量約４４キロダルトンの位置に
顕著なバンドが認められた。この結果は、実施例１−３
（ｂ）で得た、計算上の分子量約２５キロダルトンのこ
の発明のペプチドと、計算上の分子量約１８キロダルト
ンの¹²⁵Ｉ標識ヒトＩＬ−１８がおよそ１対１のモル比
で結合したことを示している。そして、このバンドが過
剰量の未標識のＩＬ−１８の添加により消失したことか
ら、実施例１−３（ｂ）のペプチドはヒトＩＬ−１８と
特異的に結合するものであることが判明した。実施例１
−３（ｄ）と実施例１−３（ｃ）の結果は、この発明の
ペプチドがＩＬ−１８に特異的に結合することによって
その生理作用を中和することを示している。

【００６７】

【実施例２】〈ペプチド及びそれをコードするＤＮＡ〉

【００６８】

【実施例２−１】〈ＤＮＡ、組換えＤＮＡ及び形質転換
体の調製〉アンチセンスプライマーとして、常法にした
がって調製した、配列表における配列番号３３に示す塩
基配列のオリゴヌクレオチドを用いたこと以外は、実施
例１−３（ａ）に記載のＰＣＲ反応Ｄと同一の条件でＰ
ＣＲ（以下、「ＰＣＲ反応Ｅ」と言う。）を行った。こ
れと並行して、実施例１−３（ａ）に記載のＰＣＲ反応
Ｃと同一の条件でＰＣＲを行った。

【００６９】実施例１−３（ａ）に記載の方法にしたが
って、ＰＣＲ反応Ｃ及びＥの産物から増幅されたＤＮＡ
を採取し、採取したＤＮＡをプラスミドベクター『ｐＣ
Ｒ−ＳｃｒｉｐｔＣａｍＳＫ（＋）』との連結反応
に供し、反応産物で大腸菌を形質転換し、形質転換体を
培養し、培養物から組換えＤＮＡを採取した。ジデオキ
シ法により分析して、ＰＣＲ反応Ｃ及びＥ由来の組換え
ＤＮＡが、それぞれ配列表における配列番号１２の塩基
配列及び配列番号１１の塩基配列の一部を含有すること
を確認した。ＰＣＲ反応Ｃ由来の組換えＤＮＡを制限酵
素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで、ＰＣＲ反応Ｅ由来の組換
えＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで、実施例１−３（ａ）
で用いたプラスミドベクター『ｐＥＴ−３ａ』を制限酵
素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、これらの消化物の
適量ずつを微量反応管に合一した後、混合物を宝酒造製
ライゲーションキット『ライゲーション・キット・バー
ジョン２』を用いて添付の説明書にしたがい操作して連
結反応を行った。常法にしたがい、連結反応産物で宝酒
造製大腸菌コンピテントセル『ＪＭ１０９』株を形質転
換し、形質転換体を培養し、培養物から組換えＤＮＡを
採取した。ジデオキシ法により分析して、斯かる組換え
ＤＮＡが、配列表における配列番号１０に示すアミノ酸
配列をコードする配列番号２０に示す塩基配列を含有す
ることを確認し、『ｐＥｓｃＦｖ＃１２５−２Ｈ．Ｈ
Ｔ』と命名した。配列番号１０に示すアミノ酸配列は、
単一クローン抗体『＃１２５−２ＨｍＡｂ』の重鎖にお
ける可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）、グリシン
及びセリンからなるリンカーとしてのアミノ酸配列、同
抗体の軽鎖における可変領域のアミノ酸配列（配列番号
１）の一部、及びヒスチジンが６個連なった配列が、Ｎ
末端からこの順で連結されてなるものである。図４に示
すように、組換えＤＮＡ『ｐＥｓｃＦｖ＃１２５−２
Ｈ．ＨＴ』においては、Ｔ７プロモーター及びリボゾー
ム結合配列の下流に、開始コドン、配列番号２０に示す
塩基配列、及び終止コドンがこの順で連結されていた。
常法にしたがい、組換えＤＮＡ『ｐＥｓｃＦｖ＃１２５
−２Ｈ．ＨＴ』で、実施例１−３（ａ）で用いた大腸菌
コンピテントセル『ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ』株
を形質転換し、斯かる組換えＤＮＡの導入された形質転
換体得た。この形質転換体を『ＥｓｃＦｖ＃１２５−２
Ｈ．ＨＴ』と命名した。

【００７０】

【実施例２−２】〈形質転換体によるペプチドの製造〉
実施例１−３（ｂ）における形質転換体『ＥｓｃＦｖ＃
１２５−２Ｈ』の培養法に準じて、実施例２−１の方法
で得た形質転換体『ＥｓｃＦｖ＃１２５−２Ｈ．ＨＴ』
を１００ｍｌの培養規模で培養した。引き続き、実施例
１−３（ｂ）に記載の方法にしたがって培養物から菌体
を回収し、菌体を破砕して封入体含有画分を得、封入体
画分を洗浄して洗浄封入体画分を得た。洗浄封入体画分
に６Ｍ塩酸グアニジンを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．０）（以下、単に「６Ｍ塩酸グアニジン
溶液」と言う。）を同画分の液量に対して１０％加え、
４℃で一晩撹拌して封入体を可溶化した。得られた可溶
化物を、予め６Ｍ塩酸グアニジン溶液で平衡化したキア
ジェン製アフィニティークロマトグラフィー用ゲル『Ｎ
ｉ−ＮＴＡアガロース』（５ｍｌ）のカラムに負荷し、
６Ｍ塩酸グアニジン溶液の後、５０ｍＭイミダゾール
及び６Ｍ尿素を含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）を通液して非吸着物を除去した。その
後、カラムに２５０ｍＭイミダゾール及び６Ｍ尿素
を含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を
通液して吸着物を溶出させ回収した。回収した画分を６
Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で蛋白質成分の濃度０．１ｍｇ／ｍｌ以下にま
で希釈し、０．４ＭＬ−アルギニン塩酸、２ｍＭＥ
ＤＴＡを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０）（以下、「ＴＥＡ緩衝液」と言う。）に対して４℃
で透析して蛋白質成分を再生させた。この透析操作を３
回繰り返した後、１０ｍＭ酸化型グルタチオンを含む
ＴＥＡ緩衝液に対して４℃で６日間透析した。透析物を
限外濾過膜を用いて濃縮し、さらにＰＢＳに対して透析
した。通常の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したとこ
ろ、得られた透析物は、分子量約２９キロダルトンのペ
プチドを約９５％以上の純度で含むものであった。透析
物を凍結乾燥し、約１ｍｇの当該ペプチドを含む固状物
を得た。

【００７１】上記で得た固状物を、１０％（ｖ／ｖ）ウ
シ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で適宜の各種の
ペプチド濃度になるように溶解して被験試料とし、実施
例１−３（ｃ）に記載の方法にしたがってＩＬ−１８中
和能を試験した。また、別途、実施例１−１（ｂ）の方
法で得た単一クローン抗体『＃１２５−２ＨｍＡｂ』を
上記と同じ組成の培地で適宜の各種の抗体濃度になるよ
うに希釈して被験試料とし、同様にＩＬ−１８中和能を
試験した。対照に認められたＩＦＮ−γ産生量に対す
る、被験試料添加系におけるＩＦＮ−γ産生量の百分率
を求め阻害率とした。結果を図５に示す。

【００７２】図５に見られるように、本実施例で得たペ
プチドは、用量依存的に、ＩＬ−１８の生理作用による
ＫＧ−１細胞におけるＩＦＮ−γの産生誘導を効果的に
阻害した。斯かるペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥで見積も
られた分子量は、配列表における配列番号１０に示すア
ミノ酸配列の計算上の分子量（約２６キロダルトン）に
見合うものである。以上の結果は、斯かるペプチドが、
抗ＩＬ−１８抗体における可変領域のアミノ酸配列とし
ての、配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸
配列の一部又は全てを含有し、ＩＬ−１８の生理作用を
中和する、人為的に創製された、この発明のペプチドで
あることを示している。さらに、図５の結果は、本実施
例で得たこの発明のペプチドが、抗ＩＬ−１８単一クロ
ーン抗体『＃１２５−２ＨｍＡｂ』のおよそ２倍のモル
濃度で、斯かる抗体と同程度のＩＬ−１８中和能を発揮
したことを示している。斯かる抗体がＩｇＧ₁に属し、
１分子当たり２個の抗原結合部位を有するのに対し、本
実施例によるこの発明のペプチドは１分子当たり１個の
抗原結合部位を有するものと想定される。したがってこ
の結果は、本実施例によるこの発明のペプチドがもとの
抗体と同程度に効果的にＩＬ−１８を中和すること、並
びに、配列表における配列番号１及び２のアミノ酸配列
の一部又は全てが、ＩＬ−１８を中和するペプチドの人
為的な創製に極めて有効に用い得ることを示している。
また以上の結果は、本実施例で得たＤＮＡは、この発明
のペプチドをコードするこの発明のＤＮＡであり、斯か
るＤＮＡを用いるこの発明のペプチドの製造方法によれ
ば、この発明のペプチドが良好に製造できることを示し
ている。なお、実施例１−３（ｄ）に準じてＩＬ−１８
に対する結合性を調べたところ、本実施例の方法で得ら
れるペプチドも同様に、ＩＬ−１８に特異的に結合する
ことが確認された。

【００７３】

【実施例３】〈ペプチド及びそれをコードするＤＮＡ〉
キメラ抗体としての形態のこの発明のペプチドは以下の
ようにして調製する。先ず、ヒトイムノグロブリンの軽
鎖（κ鎖）の定常領域をコードする塩基配列を含むＤＮ
Ａを、ピー・エー・ハイターら、『セル』、第２２巻、
１９７乃至２０７頁（１９８０年）に記載の方法にした
がって、ヒト遺伝子ライブラリーより単離する。次に、
単離したＤＮＡを鋳型として、通常のＰＣＲにより、実
質的に軽鎖の定常領域をコードする塩基配列のみからな
るＤＮＡ（「ヒト軽鎖定常領域ＤＮＡ」という。）を得
る。引き続いて、実施例１−２に記載のＰＣＲ反応Ａに
準じてＰＣＲを行い、配列表における配列番号２７にお
ける第１乃至３８４番目の塩基からなる配列を有するＤ
ＮＡ（「マウス軽鎖可変領域ＤＮＡ」という。）を得
る。これらのヒト軽鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス軽鎖可
変領域ＤＮＡを鋳型として、ロバート・エム・ホートン
ら、『メソッズ・イン・エンザイモロジー』、第２１７
巻、２７０乃至２７９頁（１９９３年）に記載の『オー
バーラップ・エクステンション法』を適用して、マウス
軽鎖可変領域ＤＮＡの下流にヒト軽鎖定常領域ＤＮＡが
連結され、５′末端及び３′末端部分に制限酵素認識配
列を含んでなるＤＮＡを得る。一方、発現ベクターとし
て、『ｐＳＶ２−ｎｅｏ』（ＡＴＣＣ３７１４９）な
どのような、大腸菌における複製起点、哺乳類の細胞内
で機能するプロモーター及び／又はエンハンサー、それ
らの制御下に位置する制限酵素認識配列、選択配列など
を含むＤＮＡを準備する。この発現ベクターと、上記で
得たヒト軽鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス軽鎖可変領域Ｄ
ＮＡを含むＤＮＡとを、それぞれ、制限酵素で切断した
後、混合し、リガーゼを用いて連結して、キメラ抗体の
軽鎖をコードするＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡを得
る。

【００７４】これとは別途、ＩｇＧのクラスに属するヒ
トイムノグロブリンの重鎖（γ鎖）の定常領域をコード
する塩基配列を含むＤＮＡを、エヌ・タカハシら、『セ
ル』、第２９巻、６７１乃至６７９頁（１９８２年）に
記載の方法にしたがって、ヒト遺伝子ライブラリーより
単離する。単離したＤＮＡにおいて、重鎖の定常領域を
コードする部分は、当該論文に記載のとおり、４個の独
立したエクソンからなる。単離したＤＮＡを鋳型とし
て、前記『オーバーラップ・エクステンション法』を適
用して、４個のエクソンを連結してなるＤＮＡ（「ヒト
重鎖定常領域ＤＮＡ」という。）を得る。引き続いて、
実施例１−２に記載のＰＣＲ反応Ｂに準じてＰＣＲを行
い、配列表における配列番号２８における第１乃至４２
３番目の塩基からなる配列を有するＤＮＡ（「マウス重
鎖可変領域ＤＮＡ」という。）を得る。これらのヒト重
鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス重鎖可変領域ＤＮＡを鋳型
として、前記『オーバーラップ・エクステンション法』
を適用して、マウス重鎖可変領域ＤＮＡの下流にヒト重
鎖定常領域ＤＮＡが連結され、５′末端及び３′末端部
分に制限酵素認識配列を含んでなるＤＮＡを得る。一
方、発現ベクターとして、『ｐＳＶ２−ｇｐｔ』（ＡＴ
ＣＣ３７１４５）などのような、大腸菌における複製
起点、哺乳類の細胞内で機能するプロモーター及び／又
はエンハンサー、それらの制御下に位置する制限酵素認
識配列、選択配列などを含むＤＮＡを準備する。この発
現ベクターと、上記で得たヒト重鎖定常領域ＤＮＡ及び
マウス重鎖可変領域ＤＮＡを含むＤＮＡとを、それぞ
れ、制限酵素で切断した後、混合し、リガーゼを用いて
連結して、キメラ抗体の重鎖をコードするＤＮＡを含ん
でなる組換えＤＮＡを得る。

【００７５】次に、以上の、キメラ抗体の軽鎖及び重鎖
をコードするＤＮＡをそれぞれ含んでなる組換えＤＮＡ
を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）など
の哺乳類の株化細胞にエレクトロポレーション法により
同時に導入する。ＤＮＡの導入の結果得られる細胞群
を、発現ベクターにおける選択配列に基づいて選択し、
選択された細胞をそれぞれ培養する。それぞれの培養上
清につき、実施例１−３（ｃ）に記載の方法によりＩＬ
−１８の生理作用の中和能の有無を調べる。所期の中和
能が認められた培養上清の由来する細胞に限界希釈法を
適用し、単一細胞とし、キメラ抗体の形態のこの発明の
ペプチドを産生する形質転換体を得る。この形質転換体
を、培養規模を拡大しつつ培養して、その培養上清か
ら、通常の抗体の精製方法にしたがい抗体を精製し、キ
メラ抗体の形態のこの発明のペプチドを得る。斯くして
得られるこの発明のペプチドは、抗ＩＬ−１８単一クロ
ーン抗体『＃１２５−２ＨｍＡｂ』と同様に、効果的に
ＩＬ−１８の中和能を発揮する。また、本実施例にした
がって得られるペプチドの枠組構造と相同性を有するヒ
ト起源の抗体の枠組構造をデータベースを用いて検索
し、相同性の認められたヒト起源の枠組構造と同様のア
ミノ酸配列を有するよう、本実施例によるＤＮＡを改変
し、発現させれば、ヒト起源の枠組構造を有するヒト化
抗体としてのペプチドが得られる。さらに、斯くして得
られるヒト化抗体のアミノ酸配列に基づいて、慣用の蛋
白質構造解析用のソフトウェアを用いてその立体構造を
予測し、抗ＩＬ−１８単一クローン抗体『＃１２５−２
ＨｍＡｂ』のアミノ酸配列から同様にして予測される立
体構造と比較し、『＃１２５−２ＨｍＡｂ』により近い
立体構造を持つようにさらにＤＮＡを改変し、発現させ
れば、『＃１２５−２ＨｍＡｂ』と実質的に同等の機能
を発揮するヒト化抗体が得られる。本実施例にしたがっ
て得られるペプチド並びに、斯かるペプチドを改変して
得られるヒト化抗体としての形態のペプチドは、感受性
疾患の治療に有用である。

【００７６】

【実施例４】〈液剤〉安定剤として林原製結晶トレハロ
ース粉末『トレハオース』を１％（ｗ／ｖ）含む生理食
塩水に、実施例１及び２の方法にしたがって得たいずれ
かのペプチドを濃度１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、
常法にしたがって精密濾過により除菌して液剤を得た。

【００７７】安定性に優れた本品は、自己免疫疾患を含
む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤、
点鼻剤などとして有用である。

【００７８】

【実施例５】〈乾燥注射剤〉安定剤としてシュークロー
スを１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水１００ｍｌに実施例
１及び２の方法にしたがって得たいずれかのペプチド１
００ｍｇを溶解し、常法にしたがって精密濾過により除
菌した後、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し
た後、密栓した。

【００７９】安定性に優れた本品は、自己免疫疾患を含
む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として
有用である。

【００８０】

【実施例６】〈軟膏剤〉滅菌蒸留水に和光純薬工業製カ
ルボキシビニルポリマー『ハイビスワコー１０４』と林
原製結晶トレハロース粉末『トレハオース』をそれぞれ
濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になる
ように溶解し、実施例１及び２の方法にしたがって得た
いずれかのペプチドを均一に混合した後、ｐＨ７．２に
調整して、１ｇ当りこの発明のペプチドを約１ｍｇ含む
ペースト状物を得た。

【００８１】延展性と安定性に優れた本品は、自己免疫
疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための軟膏剤と
して有用である。

【００８２】

【実施例７】〈錠剤〉林原製無水結晶α−マルトース粉
末『ファイントース』に実施例１及び２の方法により得
たいずれかのペプチドと細胞賦活剤としてのルミンを均
一に混合し、得られた混合物を常法により打錠して製品
１錠（約２００ｍｇ）当りこの発明のペプチド及びルミ
ンをそれぞれ約１ｍｇ含む錠剤を得た。

【００８３】摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も有
する本品は、自己免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予
防するための錠剤として有用である。

【００８４】

【実験】〈急性毒性試験〉常法にしたがって、８週齢の
マウスに実施例４乃至７の方法により得た種々剤型の感
受性疾患剤を経皮、経口又は腹腔内に注射投与した。そ
の結果、被検試料のＬＤ₅₀は、ペプチドの量に換算する
と、いずれの投与経路によっても約１ｍｇ／ｋｇマウス
体重以上であった。このことは、この発明のペプチドが
ヒトを含む哺乳類に投与する医薬品に配合して安全であ
ることを裏付けている。

【００８５】

【発明の効果】以上説明したとおり、この発明はＩＬ−
１８の生理作用を効果的に中和するペプチドの人為的な
創製に基づくものである。この発明のペプチドは、ヒト
を含む哺乳類において免疫反応を抑制し調節する性質を
有するので、臓器移植に伴う拒絶反応の緩和や、過剰な
免疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防に著効を発
揮する。さらに、この発明のペプチドを用いる阻害剤、
阻害方法、中和剤、中和方法は、ＩＬ−１８が直接又は
間接に関与する種々の疾患の治療や、臓器移植に伴う拒
絶反応や過剰な免疫反応の抑制にも有効である。斯くも
有用なるこの発明のペプチドは、この発明の製造方法に
より所望量を容易に製造することができる。加えて、こ
の発明のペプチドは、ＩＬ−１８に対する作動薬や拮抗
薬を検索するための試薬としても有用である。

【００８６】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する
発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある
発明であると言える。

【００８７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kabuhiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo <120> PEPTIDE <130> 10058804 <150> JP 177,580/98 <151> 1998-6-24 <150> JP 289,044/98 <151> 1998-10-12 <150> JP 365,023/98 <151> 1998-12-22 <160> 33 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Lys 20 25 30 Leu Tyr Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Phe Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ala <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Lys Leu Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Phe Ile Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gly Leu Arg Phe 1 <210> 9 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially produced peptide in the form of a single chain variable region fragment (scFv) which neutralizes IL-18 <400> 9 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Phe Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly 145 150 155 160 Ser Lys Leu Tyr Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg 165 170 175 Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu 195 200 205 Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Ile Lys 225 230 235 <210> 10 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially produced peptide in the form of a single chain variable region fragment (scFv) which neutralizes IL-18 <400> 10 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Phe Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly 145 150 155 160 Ser Lys Leu Tyr Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg 165 170 175 Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu 195 200 205 Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Ile Lys His His His 225 230 235 240 His His His <210> 11 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc tta tct gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa aga gtc agt ctc act tgt cgg gca agt cag gac att ggt agt aaa 96 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Lys 20 25 30 tta tac tgg ctt caa cag gaa cca gat gga act ttt aaa cgc ctg atc 144 Leu Tyr Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg Leu Ile 35 40 45 tac gcc aca tcc agt tta gat tct ggt gtc ccc aag agg ttc agt ggc 192 Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt agg tct ggg tca gat tat tct ctc acc atc agc agc ctt gag tct 240 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gta gac tat tac tgt cta caa tat gct agt tct ccg tac 288 Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gca ata aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Ile Lys Arg 100 105 <210> 12 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 gag atc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgt aag gct tct ggt tac tca ttc act gac tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 ttc att tac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144 Phe Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gat att gat cct tat aat ggt gat act agt tac aac cag aag ttc 192 Gly Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 agg gac aag gcc aca ttg act gtt gac cag tcc tcc acc aca gcc ttc 240 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 atg cat ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat ttc tgt 288 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga ggc cta cgg ttc tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct 336 Ala Arg Gly Leu Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 gca 339 Ala <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 cgg gca agt cag gac att ggt agt aaa tta tac 33 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Lys Leu Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 gcc aca tcc agt tta gat tct 21 Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser 1 5 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 cta caa tat gct agt tct ccg tac acg 27 Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 ggt tac tca ttc act gac tac ttc att tac 30 Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Phe Ile Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 gat att gat cct tat aat ggt gat act agt tac aac cag aag ttc agg 48 Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 gac 51 Asp <210> 18 <211> 12 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 ggc cta cgg ttc 12 Gly Leu Arg Phe 1 <210> 19 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA to code for the amino acid sequence of SEQ ID NO:9 <400> 19 gag atc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgt aag gct tct ggt tac tca ttc act gac tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 ttc att tac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144 Phe Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gat att gat cct tat aat ggt gat act agt tac aac cag aag ttc 192 Gly Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 agg gac aag gcc aca ttg act gtt gac cag tcc tcc acc aca gcc ttc 240 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 atg cat ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat ttc tgt 288 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga ggc cta cgg ttc tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct 336 Ala Arg Gly Leu Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 gca ggt gga ggt gga ggc gga tcc ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc 384 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 gga tcg gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc tta tct gcc tct 432 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 ctg gga gaa aga gtc agt ctc act tgt cgg gca agt cag gac att ggt 480 Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly 145 150 155 160 agt aaa tta tac tgg ctt caa cag gaa cca gat gga act ttt aaa cgc 528 Ser Lys Leu Tyr Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg 165 170 175 ctg atc tac gcc aca tcc agt tta gat tct ggt gtc ccc aag agg ttc 576 Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe 180 185 190 agt ggc agt agg tct ggg tca gat tat tct ctc acc atc agc agc ctt 624 Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu 195 200 205 gag tct gaa gat ttt gta gac tat tac tgt cta caa tat gct agt tct 672 Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser 210 215 220 ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gca ata aaa 711 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Ile Lys 225 230 235 <210> 20 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial DNA to code for the amino acid sequence of SEQ ID NO:10 <400> 20 gag atc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgt aag gct tct ggt tac tca ttc act gac tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 ttc att tac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144 Phe Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gat att gat cct tat aat ggt gat act agt tac aac cag aag ttc 192 Gly Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 agg gac aag gcc aca ttg act gtt gac cag tcc tcc acc aca gcc ttc 240 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 atg cat ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat ttc tgt 288 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga ggc cta cgg ttc tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct 336 Ala Arg Gly Leu Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 gca ggt gga ggt gga ggc gga tcc ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc 384 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 gga tcg gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc tta tct gcc tct 432 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 ctg gga gaa aga gtc agt ctc act tgt cgg gca agt cag gac att ggt 480 Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly 145 150 155 160 agt aaa tta tac tgg ctt caa cag gaa cca gat gga act ttt aaa cgc 528 Ser Lys Leu Tyr Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg 165 170 175 ctg atc tac gcc aca tcc agt tta gat tct ggt gtc ccc aag agg ttc 576 Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe 180 185 190 agt ggc agt agg tct ggg tca gat tat tct ctc acc atc agc agc ctt 624 Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu 195 200 205 gag tct gaa gat ttt gta gac tat tac tgt cta caa tat gct agt tct 672 Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser 210 215 220 ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gca ata aaa cat cac cat 720 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Ile Lys His His His 225 230 235 245 cac cat cac 729 His His His <210> 21 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE <222> (73) <223> "Xaa" means an amino acid of isoleucine or threonine. <400> 21 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155 <210> 22 <211> 157 <212> PRT <213> Mus Musculus <220> <221> UNSURE <222> (70) <223> "Xaa" means an amino acid of methionine or threonine. <400> 22 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 Val Lys Asp Ser Lys Xaa Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide as sense primer to amplify a cDNA fragment coding for an antibody light chain variable region <400> 23 actagtcgac atgaggrccc ctgctcagwt tyttggmwtc ttg 43 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide as antisense primer to amplify a cDNA fragment coding for an antibody light chain variable region <400> 24 ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide as sense primer to amplify a cDNA fragment coding for an antibody heavy chain variable region <400> 25 actagtcgac atggratgga gckggrtctt tmtctt 36 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide as antisense primer to amplify a cDNA fragment coding for an antibody heavy chain variable region <400> 26 ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28 <210> 27 <211> 407 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(407) <220> <221> sig peptide <222> (1)...(60) <400> 27 atg agg gcc cct gct cag att ttt ggc ttc ttg ttg ctc ttg ttt cca 48 Met Arg Ala Pro Ala Gln Ile Phe Gly Phe Leu Leu Leu Leu Phe Pro 1 5 10 15 ggt acc aga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc tta tct 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gcc tct ctg gga gaa aga gtc agt ctc act tgt cgg gca agt cag gac 144 Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 att ggt agt aaa tta tac tgg ctt caa cag gaa cca gat gga act ttt 192 Ile Gly Ser Lys Leu Tyr Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Phe 50 55 60 aaa cgc ctg atc tac gcc aca tcc agt tta gat tct ggt gtc ccc aag 240 Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt agg tct ggg tca gat tat tct ctc acc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 agc ctt gag tct gaa gat ttt gta gac tat tac tgt cta caa tat gct 336 Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala 100 105 110 agt tct ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gca ata aaa cgg 384 Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Ile Lys Arg 115 120 125 gct gat gct gca cca act gta tc 407 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 130 135 <210> 28 <211> 412 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(412) <220> <221> sig peptide <222> (1)...(60) <400> 28 atg gga tgg agc ggg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga cct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Gly Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Pro Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tct gag atc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag 96 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag gtc tcc tgt aag gct tct ggt tac tca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 act gac tac ttc att tac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt 192 Thr Asp Tyr Phe Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 gag tgg att gga gat att gat cct tat aat ggt gat act agt tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc agg gac aag gcc aca ttg act gtt gac cag tcc tcc acc 288 Gln Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Thr 85 90 95 aca gcc ttc atg cat ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336 Thr Ala Phe Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat ttc tgt gca aga ggc cta cgg ttc tgg ggc caa ggg act ctg gtc 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Leu Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 act gtc tct gca gcc aaa acg aca ccc c 412 Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide as sense primer to amplify a DNA fragment containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:12 <400> 29 gtcatatgga gatccagctg cagcagt 27 <210> 30 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide as antisense primer to amplify a DNA fragment containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:12 <400> 30 gaggatccgc ctccacctcc acctgcagag acagtgacca gag 43 <210> 31 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide as sense primer to amplify a DNA fragment containing a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:11 <400> 31 tggatccggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggac atccagatga 50 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide as antisense primer to amplify a DNA fragment containing a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:11 <400> 32 ccggatcctt attttattgc cagcttggtc c 31 <210> 33 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide as antisense primer to amplify a DNA fragment containing a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:11 <400> 33 tggatcctta gtgatggtga tggtgatgtt ttattgccag cttgg 45

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明のペプチドをコードする塩基配列を含
有する組換えＤＮＡ『ｐＥｓｃＦｖ＃１２５−２Ｈ』の
構造を示す図である。

【図２】この発明のペプチドが、ＩＬ−１８の生理作用
である、免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生の誘導
を、用量依存的に中和する様子を示す図である。

【図３】この発明のペプチドが、ＩＬ−１８に特異的に
結合する様子を示す、ディスプレー上に表示したＳＤＳ
−ＰＡＧＥ像の中間調画像である。

【図４】この発明のペプチドをコードする塩基配列を含
有する組換えＤＮＡ『ｐＥｓｃＦｖ＃１２５−２Ｈ．Ｈ
Ｔ』の構造を示す図である。

【図５】この発明のペプチドが、ＩＬ−１８の生理作用
である、免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生の誘導
を、用量依存的に中和する様子を示す図である。

【符合の説明】Ｐ_T7 Ｔ７プロモーターＲＢＳリボゾーム結合配列Ｉｎｉｔ開始コドンｓｃＦｖこの発明のペプチドをコードするＤＮ
ＡＶＨ抗ＩＬ−１８抗体の重鎖における可変
領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列Ｌｉｎｋｅｒリンカーとしてのアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列ＶＬ抗ＩＬ−１８抗体の軽鎖における可変
領域のアミノ酸配列の一部をコードする塩基配列ＣＤＲ抗ＩＬ−１８抗体における相補性決定
領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列ＦＲ抗ＩＬ−１８抗体における枠組構造の
アミノ酸配列をコードする塩基配列Ｈｉｓ₆ ヒスチジン６個が連結されたアミノ酸
配列をコードする塩基配列Ｔｅｒｍ終止コドンｏｒｉ大腸菌における複製起点Ａｍｐアンピシリン耐性遺伝子Ｔ７ｔｅｒｍＴ７ターミネーター

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 EA04 GA11 4B064 AG01 AG27 CA01 CA10 CA11 CA19 CC24 DA03 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 CA53 DA39 DA59 MA66 NA03 ZB072 ZB082 ZB112 4C085 AA13 AA14 BB17 DD62 GG02 GG03 GG04 GG05 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA22 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗インターロイキン−１８抗体における
可変領域のアミノ酸配列の一部又は全てを含有し、イン
ターロイキン−１８の生理作用を中和する性質を具備す
る人為的に創製されたペプチド。
【請求項２】抗インターロイキン−１８抗体が単一ク
ローン抗体である請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】抗インターロイキン−１８抗体がヒト又
はマウス由来のインターロイキン−１８を抗原とする請
求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】インターロイキン−１８の生理作用によ
る炎症の惹起を抑制する請求項１、２又は３に記載のペ
プチド。
【請求項５】抗インターロイキン−１８抗体の可変領
域が配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸配
列を含有する請求項１乃至４のいずれかに記載のペプチ
ド。
【請求項６】抗インターロイキン−１８抗体の可変領
域における相補性決定領域のアミノ酸配列の一部又は全
てのアミノ酸配列を含有する請求項１乃至５のいずれか
に記載のペプチド。
【請求項７】配列表における配列番号３乃至８に示す
アミノ酸配列の一部又は全てを含有する請求項１乃至６
のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】配列表における配列番号９又は１０に示
すアミノ酸配列を有する請求項１乃至７のいずれかに記
載のペプチド。
【請求項９】ヒト化された単一クローン抗体としての
請求項１乃至８に記載のペプチド。
【請求項１０】請求項１乃至９のいずれかに記載のペプ
チドをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】配列表における配列番号１１及び１２に
示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列の一部又は
全てを含有する請求項１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】配列表における配列番号１３乃至１８に
示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列の一部又は
全てを含有する請求項１０又は１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】配列表における配列番号１９又は２０に
示す塩基配列、又はそれらのいずれかに相補的な塩基配
列を有する請求項１０、１１又は１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】遺伝子の縮重に基づき、コードするアミ
ノ酸配列を変えることなく、１個又は２個以上の塩基を
他の塩基で置換した請求項１０、１１、１２又は１３に
記載のＤＮＡ。
【請求項１５】自律複製可能なベクターに挿入された請
求項１０乃至１４のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１６】動物、植物又は微生物由来の宿主に導入
された請求項１０乃至１５のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１７】請求項１乃至９のいずれかに記載のペプ
チドをコードするＤＮＡを発現させる工程と、生成した
ペプチドを採取する工程を含んでなるペプチドの製造方
法。
【請求項１８】生成したペプチドを塩析、透析、濾過、
濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等
電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、
逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動を含む
工程により採取する請求項１７に記載のペプチドの製造
方法。
【請求項１９】有効成分として請求項１乃至９のいずれ
かに記載のペプチドを含んでなる感受性疾患剤。
【請求項２０】安定剤として血清アルブミン、ゼラチ
ン、糖質及び／又は緩衝剤を含んでなる請求項１９に記
載の感受性疾患剤。
【請求項２１】抗自己免疫疾患剤としての請求項１９又
は２０に記載の感受性疾患剤。
【請求項２２】免疫抑制剤としての請求項１９又は２０
に記載の感受性疾患剤。
【請求項２３】抗炎症剤としての請求項１９又は２０に
記載の感受性疾患剤。
【請求項２４】請求項１乃至９のいずれかに記載のペプ
チドを有効成分として含んでなるインターロイキン−１
８中和剤。
【請求項２５】請求項１乃至９のいずれかに記載のペプ
チドを作用させることを特徴とするインターロイキン−
１８の中和方法。
【請求項２６】請求項１乃至９のいずれかに記載のペプ
チドを有効成分として含んでなるインターロイキン−１
８阻害剤。
【請求項２７】請求項１乃至９のいずれかに記載のペプ
チドを作用させることを特徴とするインターロイキン−
１８の阻害方法。