JP3236667B2

JP3236667B2 - ヒト型モノクローナル抗体およびそれをコードする遺伝子、ハイブリドーマ並びに抗腫瘍剤

Info

Publication number: JP3236667B2
Application number: JP16284992A
Authority: JP
Inventors: 斉子細川; 俊明田川; 容子平川; 典彦伊藤; 一博長池
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1991-06-28
Filing date: 1992-06-22
Publication date: 2001-12-10
Anticipated expiration: 2016-12-10
Also published as: JPH05304987A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、癌の診断、治療に使用
し得る新規なモノクローナル抗体、それをコードするＤ
ＮＡおよびその抗体を産生するハイブリドーマ並びに該
抗体と制癌剤等を封入したリポソームとを結合させるこ
とにより得られる抗腫瘍剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、固形癌に治療薬として充分な効果
を示す抗癌剤は存在しない。一方、古くから薬剤を適用
組織、器官に集中させその効果を高めるターゲティング
という概念があり、この手法により癌に対して特異的に
薬物を集中できれば固形癌の治療も可能ではないかと予
想されてきた。量産可能なマウスモノクローナル抗体の
作成法が確立（ミルシュタイン＆ケーラー、Ｎａｔｕｒ
ｅ、１９７５）されて以来、その特異性を利用して抗癌
剤、毒素等を癌組織に集積させる試みが多数なされ、そ
の効果が認められてきている。

【０００３】これまで抗体と薬剤の結合は、化学的に薬
剤を修飾して結合する方法、すなわち抗体と薬剤を直接
結合する方法や、デキストラン等の水溶性高分子を介し
結合する方法等が試みられている。しかし、それらの方
法では抗体１分子あたりに結合できる薬剤量が少ないこ
と、また薬剤の修飾により活性が低下するなどの問題が
指摘されている。

【０００４】一方、薬剤を修飾することなく大量に運ぶ
手段として、リポソームに薬剤を封入しその表面に抗体
を結合する方法、すなわち抗体結合リポソームが提案さ
れており、その優れた抗腫瘍効果が多数報告されてきた
〔今野ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅｒｃｈ４７，４４
７１（１９８７）、橋本ら、特開昭５８−１３４０３２
号公報〕。

【０００５】

【発明が解決しようとする問題点】しかしながら、抗体
に関しては、実際の治療においては、免疫応答に起因す
るアナフィラキシーなどの副作用から、連続投与が難し
いとされるマウスモノクローナル抗体〔Ａ．ＬｏＢｕ
ｇｌｉらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，４２２０，（１９８９）〕に対
し、ヒト型モノクローナル抗体の使用がより好ましいと
されている。ところが、ヒト型モノクローナル抗体の作
成法はマウスモノクローナル抗体の作成法と比較し、目
的とする抗体を産生するヒトＢ細胞を効率的に得るため
の能動的免疫法が困難であること、抗体産生細胞を無限
増殖化させる効率的方法が確立されていないことなどか
ら、未だ充分に腫瘍細胞に反応するヒト型モノクローナ
ル抗体を取得することは、困難な状況にある。

【０００６】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、上記の
ような問題のない、癌組織に対し抗癌剤、毒素等のター
ゲッティング治療を可能とするためのヒト型モノクロー
ナル抗体を提供すべく鋭意検討した結果、特に癌細胞の
膜表面にその抗原を持つ新規なヒト型モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを作製し、さらに該抗体を
制癌剤等を封入したリボソームに結合させることによ
り、ターゲッティング療法に有効に使用し得る抗腫瘍剤
が得られることを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。

【０００７】すなわち、本発明の要旨は、癌患者由来リ
ンパ球とマウスミエローマ細胞との融合細胞により産生
され、癌細胞の膜表面抗原に特異的に結合するヒト型モ
ノクローナル抗体およびそれをコードする遺伝子、該モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ並びに該モ
ノクローナル抗体を含有する抗腫瘍剤に存する。本発明
のヒト型モノクローナル抗体は、例えば、重鎖可変領域
が配列表の配列番号１３、１４および１５のアミノ酸配
列を含むものが挙げられ、より具体的には重鎖可変領域
が配列表の配列番号１６、１７および１８のアミノ酸配
列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列表の配列番号１９、
２０および２１のアミノ酸配列を含むものや、重鎖可変
領域が配列表の配列番号２２、２３および２４のアミノ
酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列表の配列番号２
５、２６および２７のアミノ酸配列を含むもの等が挙げ
られるが、これらに限定されるわけではない。もとよ
り、本発明においては、上記抗原との反応性を損なわな
い範囲で一部のアミノ酸を置換、挿入、削除あるいは追
加する等の改変を行ったものも本発明のモノクローナル
抗体に含まれる。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
係るハイブリドーマは、Ａ．Ｉｍａｍらの方法〔Ｃａｎ
ｃｅｒＲｅｓａｒｃｈ４５，２６３（１９８５）〕
に準じて、まず、癌患者から摘出された癌所属のリンパ
節から、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールを
用いてマウスミエローマ細胞と融合して得られる。得ら
れたハイブリドーマの上清を用いて、パラフォルムアル
デヒド固定した各種癌細胞株に対し、エンザイムイムノ
アッセイにより陽性を示す抗体を産生するハイブリドー
マを選択し、クローニングを行う。

【０００９】さらに、ハイブリドーマの上清から、常法
〔Ｒ．Ｃ．Ｄｕｈａｍｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ３１，２１１（１９７９）〕によりモノ
クローナル抗体を精製、蛍光物質でラベルし、生癌細胞
株、各種の赤血球、白血球等に対する反応性をフローサ
イトメトリーで検出することにより、制癌細胞株に対し
ては反応性を示す抗体を、赤血球、白血球に対しては、
反応性を示さない抗体を選別する。また、癌患者から摘
出される癌組織から単離される癌細胞、および同一患者
の同一組織の非癌部から単離される正常細胞に対する反
応性を比較して、癌細胞に、より多量の抗体が結合し、
正常細胞には反応がないか、もしくは健常人由来の抗体
と同程度の反応性しかない抗体を選別する。

【００１０】かくして選別されたハイブリドーマが産生
する抗体をコードするＤＮＡの塩基配列は、たとえば、
以下の方法によって得られる。抗体産生ハイブリドーマ
から、チオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法〔Ｃａ
ｓａｒａら，ＤＮＡ，２，３２９（１９８３）〕でｍＲ
ＮＡを調製して、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてそ
のｃＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、ｃＤＮＡ
に（ｄＧ）テーリングを行い、このｄＧテールにハイブ
リダイズするポリＣと、既に遺伝子が取得されているヒ
ト抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の各々共通な配列部分を
プローブとしてＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃ
ＤＮＡを増幅させる。その後、ＤＮＡの末端平滑化を行
い、電気泳動法によってゲルから切りだしたＤＮＡをｐ
ＵＣ１１９等のクローニングベクターに挿入し、Ｓａｎ
ｇｅｒらのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３，（１９７
７）〕によってその塩基配列が決定される。

【００１１】その結果、本発明の抗体は、例えば、重鎖
可変領域が配列表の配列番号１３、１４および１５のア
ミノ酸配列を含むものが挙げられ、具体的には重鎖可変
領域が配列表の配列番号１６、１７および１８のアミノ
酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列表の配列番号１
９、２０および２１のアミノ酸配列を含むものや、重鎖
可変領域が配列表の配列番号２２、２３および２４のア
ミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列表の配列番
号２５、２６および２７のアミノ酸配列を含むもの等が
挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【００１２】配列表の配列番号１３、１４および１５の
アミノ酸配列は、１６、１７および１８のアミノ酸配
列、２２、２３および２４のアミノ酸配列は、重鎖可変
領域の中でも『超可変領域』と呼ばれ、同様に配列表の
配列番号１９、２０および２１のアミノ酸配列、２５、
２６および２７のアミノ酸配列は、軽鎖可変領域の中で
も『超可変領域』と呼ばれる。かかる領域は、免疫グロ
ブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合
親和性を決定するものである。従って本願発明において
は、かかる超可変領域以外の重鎖可変領域は他の抗体由
来であっても構わない。

【００１３】本願発明において特に好適なモノクローナ
ル抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が夫々配列
表の配列番号５および６のアミノ酸配列で表されるも
の、並びに配列番号１１および１２のアミノ酸配列で表
されるものである。重鎖および軽鎖の定常領域の塩基配
列はＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
１４，１７７９（１９８６）、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ
ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
２５７，１５１６（１９８２）およびＣｅｌｌ２２，
１９７（１９８０）に記載のものと同じ配列を有する。

【００１４】本抗体は、本抗体を産生するハイブリドー
マを牛胎児血清含有ｅＲＤＦ、ＲＰＭＩ１６４０培養
液等を用いて培養するか、または、配列表の配列番号３
および４、もしくは９および１０等の塩基配列で表わさ
れる可変領域をコードするＤＮＡにさらに重鎖および軽
鎖の定常領域をコードするＤＮＡが夫々連結された遺伝
子を化学合成し、その遺伝子の発現を可能とする公知の
種々の発現ベクター、例えば、動物細胞における発現ベ
クターとして、ｐＫＣＲＨ２〔三品ら、Ｎａｔｕｒｅ，
３０７，６０５，（１９８４）〕から図１または図２に
示した手順で構築することができるｐＫＣＲ（ΔＥ）／
ＨとｐＫＣＲＤに挿入し、ＣＨＯ細胞（チャイニーズ
ハイスター卵巣細胞）等の宿主中で発現させることに
より得ることができる。例えば、重鎖遺伝子の両端にＨ
ｉｎｄ III部位を付加したものをｐＫＣＲ（ΔＥ）／Ｈ
のＨｉｎｄ III部位に挿入し、またこのプラスミドのＳ
ａｌＩ部位にＤＨＦＲ遺伝子等の選択マーカー遺伝子を
挿入する。一方、軽鎖遺伝子の両端にはＥｃｏＲＩ部位
を付加したものをｐＫＣＲＤのＥｃｏＲＩ部位に挿入
し、さらにこのプラスミドのＳａｌＩ部位にもＤＨＦＲ
遺伝子を挿入する。両プラスミドをＣＨＯｄｈｆｒ
^-〔ＵｒｌａｕｂＧ．＆ＣｈａｓｉｎＬ．Ａ．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，
７７，４２１６（１９８０）〕等の細胞にリン酸カルシ
ウム法で導入し、ヌクレオチドを含まないαＭＥＭ培養
液等で増殖する細胞から、さらに抗体を産生する細胞を
選別することによって得ることができる。抗体は、これ
らの細胞を培養した培養液から、ＰｒｏｔｅｉｎＡを
セルロファイン、アガロース等の支持体に結合させたカ
ラム等に吸着し、溶出させること等によって精製され
る。

【００１５】本発明の抗腫瘍剤において、上記抗体を担
持するリポソームは二重の脂質層からなり、該脂質層が
多重層になったもの、あるいは一層のものいずれも
使用することができる。構成成分としては、フォスファ
チジルコリン、コレステロール、フォスファチジルエタ
ノールアミン、さらに電荷をあたえる物質としてのフォ
スファチジン酸等が用いられる。例えば、構成成分の使
用割合として、フォスファチジルコリン１ｍｏｌに対し
コレステロールは０．３〜１ｍｏｌ、好ましくは０．４
〜０．６ｍｏｌ、フォスファチジルエタノールアミンは
０．０１〜０．２ｍｏｌ好ましくは０．０２〜０．１ｍ
ｏｌ、フォスファチジン酸は０〜０．４ｍｏｌ好ましく
は０〜０．１５ｍｏｌの組成比を用いることができる。
リポソームの製造方法には公知の方法を用いることがで
きる。たとえば溶媒を除去した脂質混合物をホモジナイ
ザー等で乳化し、凍結融解後、マルチラメラリポソーム
を得る。さらに適当な粒径に調整するために超音波処
理、高速ホモジナイズ、あるいは均一ポアを持つメンブ
ランで加圧ろ過する方法〔ＨｏｐｅＭ．Ｊ．らＢｉ
ｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃ
ｔａ８１２，５５（１９８５）〕等で調整する。この
時、好ましいサイズとして３０ｎｍから２００ｎｍのリ
ポソームが選択される。

【００１６】リポソームに内封させる薬剤としては、ア
ドリアマイシン、ダウノマイシン、マイトマイシン、シ
スプラチン、ピンクリスチン、エビルビシン、メトトレ
キセート、５Ｆｕ、マクラシノマイシン等の抗癌剤、リ
シンＡ、ジフテリアトキシン等の毒素、アンチセンスＲ
ＮＡ等を用いることができる。薬剤の封入は、脂質を薬
剤水溶液で水和することでリポソームに封入することが
できる。またアドリアマイシン、ダウノマイシン、エピ
ルビシンについては、ｐＨ勾配を利用したリモートロー
ディング法（ＬａｗｒｅｎｃｅＤ．Ｍ．らＣａｎｃｅ
ｒＲｅｓｅｒｃｈ４９，５９２２（１９８９））を
用いて封入することもできる。

【００１７】このリポソーム表面上にモノクローナル抗
体を結合させる方法としては、精製固体に疎水性の物質
をつけることでリポソームに挿入させる方法、ホスファ
チジルエタノールアミンと抗体をグルタールで架橋させ
る方法等もあるが、好適には、抗体をチオール化した
後、マレイミド基を導入した脂質を含むリポソームを作
製し、制癌剤または腫瘍細胞に対する毒素を封入したマ
レイミド基を有するリポソームと反応させることによっ
てリポソームの表面に結合することができる。また、残
存マレイミド基には、チオール化したポリアルキレング
リコール部分を含む化合物等を反応させることによって
リポソームの表面修飾を行うことも可能である。

【００１８】抗体へのチオール基の付与は、固体のアミ
ノ基に対し通常タンパク質のチオール化に用いるＮ−ス
クシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート（ＳＰＤＰ）や、イミノチオラン、メルカプトア
ルキルイミデート等の化合物を用いて行う方法、または
抗体の内在性ジチオール基を還元してチオール基とする
方法が用いられるが、内在性チオール基を用いる方法が
活性維持の点からより好ましい。抗体は、ペプシン等の
酵素でＦ（ａｂ）′₂化し、さらにジチオスレイトール
（ＤＴＴ）等で還元し、Ｆａｂ′化して新たに生ずる１
〜３個のチオール基をリポソームとの結合反応に供する
ことができる。マレイミド基含有リポソームとチオール
化抗体の結合は中性の緩衝液（ｐＨ６．５−７．５）
中、２〜１６時間反応することで達成される。

【００１９】本発明の抗腫瘍剤の製剤化には、公知の方
法つまり、脱水法（特表平２−５０２３４８号公報）、
安定化剤を加え液剤として用いる方法（特開昭６４−９
３３１号公報）、凍結乾燥法（特開昭６４−９９３１号
公報）等の製剤化法を用いることができる。本発明の抗
腫瘍剤は、血管内投与法や、腹腔内等、局所投与法で用
いることができ、その投与量は、リポソームに含有され
た薬剤によって、それぞれ最適な量とすることができ
る。アドリアマイシン封入体を例に取れば投与量はアド
リアマイシン量として５０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは
１０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下
で用いることができる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例により本発明についてより詳細
に説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定され
るものではない。

【００２１】実施例１（癌患者癌所属リンパ節由来リンパ球とマウスミエロー
マとの細胞融合によるヒト型モノクローナル抗体ＧＡＨ
産生株の樹立）（１）リンパ球の調製大腸癌患者から摘出された癌所属リンパ節をハサミとメ
スによって細かくほぐし、さらに培養液Ａ（ｅＲＤＦ
〔極東製薬工業社製〕＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン
硫酸塩）中でステンレスネットを用いて細胞を分散させ
た。この細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離して上清を除去し、さらに新鮮な培養液Ａに懸濁して
遠心洗浄を行い、最終的に２．６×１０⁷個の細胞を得
た。

【００２２】（２）細胞融合リンパ球は、ポリエチレングリコール（ベーリンガー／
マンハイム社製）を用いマウスミエローマ細胞（１×１
０⁷細胞）と常法に従い融合した。融合した細胞は、培
養液Ａに１０μＭヒポキサンチン、０．０４μＭアミノ
プテリン、１．６μＭチミジン、１０％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）を添加した培養液（ＨＡＴ添加培養液）にリ
ンパ球数が５．４×１０⁵／ｍｌの密度になるよう懸濁
し、１００μｌずつ９６ウェル−プレートに接種し、３
７℃でＣＯ₂インキュベーター中で培養した。培養液
は、適時、半量ずつ上記のＨＡＴ添加培養液で置換して
ハイブリドーマのコロニーが出現するまで培養を行っ
た。ハイブリドーマのコロニーの出現は、すべてのウェ
ルに確認された。各ウェルの培養上清について、下記試
験例１の方法に従い、固定癌細胞株、即ち、大腸癌株Ｃ
−１〔佐藤ら、医学のあゆみ、９６，８７６，（１９７
６）〕〔免疫生物研究所から入手〕、胃癌株ＭＫＮ４５
〔内藤ら、癌と化学療法，５，８９，（１９７８）〕
〔免疫生物研究所から入手〕に対する反応性を測定し
た。陽性ウェルの出現率は、Ｃ−１株に対しては、７．
３％（３５ウェル）、ＭＫＮ４５株に対しては、４．６
％（２２ウェル）であり、両細胞株に反応性を示したウ
ェルは、６ウェルであった。この両細胞株に反応性が認
められたウェルのうちから、ハイブリドーマのクローニ
ングを行った。クローニングは、限界希釈法により、３
回行ない、ハイブリドーマクローンＧＡＨを樹立した。

【００２３】実施例２（モノクローナル抗体ＧＡＨの精製と標識化）（１）ハイブリドーマＧＡＨの培養とモノクローナルＧ
ＡＨ抗体の精製牛胎児血清をプロテインＡ−アガロース〔レプリジェン
社製〕カラムにかけ、そのカラムを素通りさせてプロテ
インＡ−アガロースカラムに吸着する物質を除去した血
清を作成した。ハイブリドーマＧＡＨの培養には、この
血清を３％添加したｅＲＤＦ〔極東製薬社製〕培養液を
用いた。ＧＡＨ抗体は、ハイブリドーマＧＡＨを培養し
た培養液をプロテインＡ−アガロースカラムにかけ、抗
体を吸着させ、その後溶出させることによって精製し
た。上記の血清を培養に用いることによって、血清由来
の抗体、プロテインＡ−アガロースに吸着する物質の混
入がない精製ＧＡＨ抗体が得られた。ＧＡＨ抗体は、ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で純粋なＩｇＧであることが確
認された。

【００２４】（２）ＧＡＨ抗体の蛍光標識化精製したＧＡＨ抗体に、ＣｏｏｎｓＡ．Ｈ．の方法に
より、蛍光物質であるＦＩＴＣ（フルオレセインイソチ
オシアネート）を標識した。炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）
に抗体を透析し、ＦＩＴＣ溶液を反応させた後、ゲル濾
過法によって蛍光標識された抗体と遊離のＦＩＴＣを分
離した。蛍光標識された抗体が回収されてきた画分の吸
光度、ＯＤ_280nmとＯＤ_495nmを測定し、標識率を算出
した。標識抗体の抗体とＦＩＴＣの結合モル比（Ｆ／Ｐ
比）は、０．９３であった。

【００２５】試験例１（ヒト型モノクローナル抗体の癌細胞株への反応性の検
討）（１）癌細胞株と維持ヒト癌細胞株として、大腸癌株Ｃ−１、胃癌株ＭＫＮ４
５の各細胞株を用いた。これらの細胞株は、培養液Ｂ
（１０％ＦＣＳ含有ｅＲＤＦ）で３７℃、５％ＣＯ₂の
条件で維持、増殖させた。

【００２６】（２）癌細胞株に対する反応性の検討ａ．固定癌細胞株を用いた反応性の測定癌細胞株は、９６ウェル−プレートで３日から４日間、
一層になるまで培養を行い、上清を除去後、１０ｍＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．４、０．１５ＭＮａＣｌ溶液（Ｐ
ＢＳ）で２回洗浄したのち、２％−パラホルムアルデヒ
ド固定（室温、２０分）を行った。ＰＢＳで５回洗浄し
たのち、５％−ＢＳＡ（牛血清アルブミン）含有ＰＢＳ
溶液を２００μｌ／ウェル入れ、３７℃、２時間放置
し、ブロッキングを行った。このプレートをＰＢＳで５
回洗浄し、これに５０μｌのハイブリドーマ培養上清を
加えた。３７℃、２時間反応させたのち、ＰＢＳで５回
洗浄し、５０μｌのアルカリホスファターゼを結合した
ヒト抗体に対するヤギ抗体（１０００倍希釈、カペル社
製）を加え、３７℃、１時間の反応を行った。反応後、
ＰＢＳで５回洗浄したのち、２５ｍＭｐ−ニトロフェ
ニルホスフェート含有０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液−１ｍＭ
ＭｇＣｌ（ｐＨ９．５）を５０μｌ／ウェル加え、室
温で１時間ないし一夜反応させたのち、４０５ｎｍにお
ける吸光度をマイクロプレートフォトメーター〔コロナ
社製〕によって測定した。上記実施例１の（２）の通
り、反応性を検討した培養癌細胞株、Ｃ−１、ＭＫＮ４
５に陽性が確認できたウェルからクローニングを行い、
ハイブリドーマ株ＧＡＨを得た。ＧＡＨの培養上清から
精製した抗体についても同様の反応性が得られた。

【００２７】ｂ．生癌細胞に対する反応性フラスコまたはシャーレで培養した癌細胞の上清を除去
し、０．０２％−ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ溶液を加えて室温
３０分放置し、細胞を浮遊化させた。この細胞は、培養
液Ｂで遠心洗浄し、約１×１０⁶／２００μｌの細胞密
度となるよう、上記実施例２の（２）で得た蛍光標識し
たＧＡＨ抗体（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含有する血
清（健常人由来）に懸濁し、０℃、６０分間反応させ
た。その後、２０００ｒｐｍで２分間遠心して上清を除
去し、さらに細胞を１ｍｌのＰＢＳに懸濁して遠心洗浄
を行なった後、細胞を１０μｇ／ｍｌのプロピジウムア
イオダイド（ＰＩ）を含有するＰＢＳ３００μｌに懸濁
した。この細胞懸濁液をフローサイトメーター（ＦＣ
Ｍ）、ＦＡＣＳ４４０〔ベクトン・ディッキンソン社
製〕にかけ、細胞個々に結合した蛍光量（ＦＩＴＣ及び
ＰＩ）を測定した。系に含まれていた死細胞には、ＰＩ
が取り込まれてその核酸中に入り込み、ＰＩの蛍光を発
するので、データ処理上ＰＩの蛍光を持つ死細胞群を除
去することができる。蛍光量（５種）のマーカー（クオ
ンタティブキット）〔オーソ・ダイアグノスティックシ
ステムズ社製〕をＦＣＭに同一条件下でかけ、それを指
標にして細胞１個当たりの平均結合ＦＩＴＣ量を算定
し、その値と、実施例２の（２）で算出した標識抗体の
Ｆ／Ｐ比から、生癌細胞の１個当たりの平均結合抗体数
を算定し、その結果を表１に示した。

【００２８】

【表１】表１ ───────────────────────────────── 抗体癌細胞株 ────────────────────────── ＧＡＨＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧ ───────────────────────────────── ＭＫＮ４５３．５×１０⁴ ０．１５×１０⁴ Ｃ−１０．６×１０⁴ ＜０．１×１０⁴ ───────────────────────────────── ＧＡＨ抗体を用いた場合、胃癌細胞株、大腸癌細胞株に
対し、コントロールとして用いた健常人血清由来ＩｇＧ
抗体（ＧＡＨと同様の方法によって蛍光標識化した）の
約６〜２３倍量の抗体が結合した。

【００２９】試験例２（ヒト型モノクローナル抗体ＧＡＨの血液系細胞に対す
る反応性）健常人７名および癌患者３名の抹消血から、
木下の方法〔赤血球系細胞の分離，新版日本血液学全書
１３，８００（１９７９）〕によって、赤血球を分離
した。白血球については、健常人抹消血をヘパリンを加
えて採血し、１０ｍｌに対して２ｍｌの６％デキストラ
ン生理食塩水溶液を加え、混合し、室温で５０分放置し
て血漿層を得、１５００ｒｐｍ，５分間の遠心によって
白血球を得た。これらの細胞に対する反応性は、生癌細
胞株に対する反応性を測定した方法と同様、ＦＣＭによ
って測定した。ただしＰＩは無添加である。白血球につ
いては、さらにＦＣＭでの細胞の前方散乱と側方散乱か
ら、主細胞種である、小リンパ球（ｌｉｍｐｈｏｃｙｔ
ｅ）、顆粒球（ｇｒａｎｙｕｌｏｃｙｔｅ）、単球（ｍ
ｏｎｏｃｙｔｅ）、血小板の群に分け〔Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ３，３３７（１９８５）〕、それぞれ
に対する反応性を調べた。結果を表２に示した。

【００３０】

【表２】表２ ───────────────────────────────── 抗体細胞 ────────────────────────── ＧＡＨＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧ ───────────────────────────────── 白血球小リンパ球陰性陰性顆粒球０．４９×１０^4* ０．４８×１０^4* 単球０．４１×１０^4* ０．４３×１０^4* 血小板陰性陰性赤血球（１０種）陰性陰性 ───────────────────────────────── ＊：細胞１個当たりの平均抗体結合数ＧＡＨ抗体は、赤血球、小リンパ球には反応性が認めら
れなかった。顆粒球、単球については、コントロール抗
体（試験例１と同様）の反応性と同等であった。

【００３１】試験例３（ヒト型モノクローナル抗体ＧＡＨの新鮮癌組織、非癌
部組織由来細胞に対する反応性）ＧＡＨ抗体の癌細胞結
合特異性を検討するため、癌患者の癌組織と同時に摘出
された同一患者、同一臓器の新鮮組織から、細胞を単離
し、それぞれの細胞に対するＧＡＨ抗体の反応性を測定
した。組織からの細胞の単離は、時田らの方法〔癌の臨
床，３２，１８０３（１９８６）〕に従った。組織をゴ
ム板の上に敷いたテフロンシートにのせ、カミソリで叩
いて細切し、１ｍｍのステンレスメッシュに移し、培養
液をいれたシャーレのなかでふるい、メッシュを通過し
た微小細胞集塊のはいった液を１０００ｒｐｍで遠心
し、浮遊した脂肪と懸濁した壊死部分を捨て、遠心洗浄
を繰り返した。細胞塊を２３ゲージのカテラン針につけ
た注射器でパンピングして分散した。この様にして得ら
れた細胞に対する反応性は、上記した生癌細胞株に対す
る反応性を検討した場合と同様、ＦＣＭによって測定し
た。結果を表３に示した。

【００３２】

【表３】ＧＡＨ抗体の癌組織由来細胞に対する平均結合抗体数
は、非癌部由来細胞に対する結合数と比較して顕著に多
く、また、コントロール抗体と比較した場合でも胃癌で
５１倍、大腸癌で７倍であり、ＧＡＨ抗体が癌細胞の膜
上により多く出現してくる抗原を認識していることが示
唆された。

【００３３】実施例３（ヒト型モノクローナル抗体ＧＡＨ軽鎖のサブクラス決
定）実施例２の（１）で得られたＧＡＨ抗体を還元状態
でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、重鎖と軽鎖に分離して泳動
されたタンパクをトランスファーメンブレン（Ｐｏｌｙ
ｖｉｎｙｌｉｄｅ−ｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜）
〔ミリポア社製〕にブロットし、この膜を５％ＢＳＡ溶
液でブロッキングした後、ヒトκ鎖、またはヒトλ鎖に
対するヤギ抗体にパーオキシダーゼが結合したもの〔カ
ペル社製〕を反応させた。洗浄後、酵素基質として０．
０１５％Ｈ₂Ｏ₂含有０．０５％（ｗ／ｖ）４−クロロ
ナフトール溶液を反応させた。その結果、ＧＡＨ抗体の
軽鎖は、抗ヒトκ鎖抗体と反応し、発色によってバンド
が出現し、κ鎖であることが示された。

【００３４】（ヒト型モノクローナル抗体ＧＡＨ遺伝子
の取得と塩基配列の決定）ａ．ポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと略す）
法による抗体ＧＡＨをコードするｃＤＮＡの調製実施例１の（２）で得られたＧＡＨ抗体産生ハイブリド
ーマよりチオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法（Ｄ
ＮＡ２，３２９（１９８３））に従いポリ（Ａ）を有
するＲＮＡを下記の如く調製した。ハイブリドーマ１×
１０⁷の細胞を５Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７）および８
％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールからなる溶液
７．５ｍｌに可溶化し、さらに、１ｇ／２．５ｍｌにな
るよう塩化セシウムを加え、混合した。この可溶化物
８．０ｍｌを遠心管に入っている５．７Ｍ塩化セシウム
溶液３．５ｍｌ上に静かにのせ、ＨｉｔａｃｈｉＲＰ
Ｓ４０Ｔローターにて３０，０００ｒｐｍ、２３．５時
間遠心後ＲＮＡを沈澱として回収した。このＲＮＡの沈
澱を０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）からなる溶液
４００μｌに溶解しフェノール−クロロホルムで抽出
後、エタノール沈澱により回収した。得られたＲＮＡ約
６４μｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）および
１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液４０μｌに溶かした。こ
のうち２１μｌからｍＲＮＡピューリフィケーションキ
ット〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕によ
って、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約２．６４μｇを得
た。

【００３５】このポリ（Ａ）ｍＲＮＡ１．１μｇを１
０μｌの水に溶かし、オリゴｄ（Ｔ）１２−１８プライ
マー〔ファルマシア社製〕１．５μｇ、１０ｍＭ４ｄ
ＮＴＰ〔宝酒造社製〕３μｌ、逆転写酵素〔ライフサイ
エンス（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）社製〕４０ｕ、Ｒ
ＮＡ分解酵素阻害剤〔宝酒造社製〕３０ｕ、５倍濃度の
逆転写酵素緩衝液〔２５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．
３）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、２５０ｍＭ塩化カリ
ウム〕６μｌを加え、水を加えて計３０μｌの系とし、
４１℃で１時間反応させた。上記反応液からエタノール
沈澱を行って、ｃＤＮＡを得た。

【００３６】得られたｃＤＮＡを１５．３μｌの水に溶
解した。この溶液に、５倍濃度の末端デオキシヌクレオ
チド転位酵素緩衝液〔２５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）、５０ｍＭ塩化マグネシウム〕４．８μｌ、末
端デオキシヌクレオチド転位酵素〔ファルマシア社製〕
１２ｕ、１０ｍＭｄＧＴＰ〔宝酒造社製〕２．４μｌ
を加え、計２４μｌの系とし、３７℃で１．５時間反応
させて、ｃＤＮＡの３′末端にポリｄ（Ｇ）を付加し
た。その後７０℃で１５分間加熱して酵素を失活させ
た。

【００３７】この様にして得られたｃＤＮＡを基質とし
てＰＣＲを行った。ＰＣＲは、パーキンエルマーシ
ータスディーエヌエーサーマルサイクラー
（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓＤＮＡＴ
ｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ）を使用して、使用説明書
に基づいて行った。すなわち上記反応終了液２μｌに重
鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅させるための
プライマーとしてｃＤＮＡ３′末端に付加したｄＧテー
ルにハイブリダイズするポリＣ（１５ヌクレオチド）４
０ｐｍｏｌｅｓと、ヒトＩｇＧ抗体ですべて共通であ
る。可変領域の一部（配列番号：５のアミノ酸配列の１
１３番〜１１９番）から定常領域にまたがる領域に対応
する一鎖ＤＮＡプライマー（配列番号：１，３７ヌクレ
オチド）〔ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒ
ｃｈ１４，１７７９（１９８６）〕２５ｐｍｏｌｅ
ｓ、また、軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅
させるためのプライマーとしてポリＣ４０ｐｍｏｌｅ
ｓと、ヒトκ鎖のＪ領域の一部（配列番号：６のアミノ
酸配列の１１３番〜１１４番）から定常領域にまたがる
領域に対応する一鎖ＤＮＡプライマー（配列番号：２，
２１ヌクレオチド）（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆ
ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２５７，
１５１６（１９８２）、Ｃｅｌｌ２２，１９７（１９
８０））４０ｐｍｏｌｅｓ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液
（１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ
塩化カリウム、１５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％
（ｗ／ｖ）ゼラチン）１０μｌ、１０ｍＭ４ｄＮＴＰ
〔宝酒造社製〕２μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝
酒造社製）２．５ｕに、水を加え、１００μｌの系とし
た。反応は、９４℃、１分間（変性ステップ）、５５
℃、２分間（アニーリングステップ）、７２℃、３分間
（伸長ステップ）のインキュベーションを３０サイクル
行った後、さらに７２℃、７分間インキュベーションを
行った。得られた反応液をエタノール沈澱し、その沈澱
物を３０μｌの水に溶かし、クレノー断片〔宝酒造社
製〕２ｕ、１ｍＭ４ｄＮＴＰ４μｌ、１０倍濃度の
末端平滑化緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．
６）、１００ｍＭ塩化マグネシウム）４μｌを加え、計
４０μｌの反応系とし、３７℃で３０分間反応させ、２
本鎖の平滑末端をもったｃＤＮＡを得た。

【００３８】ｂ．ｃＤＮＡの塩基配列の決定得られたｃＤＮＡ溶液を２％アガロース電気泳動により
解析した結果、約５００ｂｐのバンドが認められた。こ
の約５００ｂｐのバンドを常法に従ってアガロースゲル
より切り出し、クローニングベクターのｐＵＣ１１９の
ＳｍａＩ部位に挿入してジデオキシ法によってその塩基
配列を決定した。その結果、該ＰＣＲフラグメントの塩
基配列中、重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする塩基配
列は、夫々、配列番号：３、配列番号：４に示したとお
りであった。決定した塩基配列から予想される前記ハイ
ブリドーマが産生するＧＡＨ抗体の重鎖及び軽鎖の可変
領域のアミノ酸配列は、夫々、配列番号：５及び配列番
号：６で示す通りである。また、塩基配列の結果から、
ＧＡＨ抗体のサブクラスはＩｇＧｌであることが判明し
た。このアミノ酸配列及び塩基配列が明らかにされたＤ
ＮＡ断片は、上述の様な方法をくり返すことなく、ＤＮ
Ａ合成機により再現性よく取得することができる。

【００３９】実施例４（癌患者癌所属リンパ節由来リンパ球とマウスミエロー
マとの細胞融合によるヒト型モノクローナル抗体１−３
−１産生株の樹立）（１）リンパ球の調製肺癌患者から摘出された癌所属リンパ節から、実施例１
の（１）と同様にしてリンパ球の調製を行い、最終的に
３×１０⁷の細胞を得た。

【００４０】（２）細胞融合リンパ球は、ポリエチレングリコール（ベーリンガー／
マンハイム社製）を用いマウスミエローマ細胞（８×１
０⁶細胞）と常法に従い融合した。融合した細胞は、実
施例１の（２）と同様に、ＨＡＴ添加培養液にリンパ球
数が５．２×１０⁵／ｍｌの密度になるよう懸濁し、１
００μｌずつ９６ウェル−プレートに接種し、適時、半
量ずつ上記のＨＡＴ添加培養液で置換してハイブリドー
マのコロニーが出現するまで培養を行った。ハイブリド
ーマのコロニーの出現は、すべてのウェルに確認され
た。各ウェルの培養上清について、実施例１の（２）と
同様に試験例１の（２）のａに示した方法で、固定癌細
胞株即ち大腸癌株Ｃ−１、胃癌株ＭＫＮ４５に対する反
応性を測定した。陽性ウェルの出現率は、Ｃ−１株に対
しては、１６．３％（９４ウェル）、ＭＫＮ４５株に対
しては、６．３％（３６ウェル）であり、両細胞株に反
応性を示したウェルは、４ウェルであった。この両細胞
株に反応性が認められたウェルのうちから、ハイブリド
ーマのクローニングを行った。クローニングは、限界希
釈法により、３回行ない、ハイブリドーマクローン１−
３−１を樹立した。

【００４１】実施例５（モノクローナル抗体１−３−１の精製と標識化）（１）ハイブリドーマ１−３−１の培養とモノクローナ
ル抗体１−３−１の精製ハイブリドーマ１−３−１の培養には、実施例２の
（１）に示した血清を３％添加したｅＲＤＦ〔極東製薬
社製〕培養液を用いた。１−３−１抗体は、ハイブリド
ーマ１−３−１を培養した培養液をプロテインＡ−アガ
ロースカラムにかけ、抗体を吸着させ、その後溶出させ
ることによって精製した。１−３−１抗体は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで純粋なＩｇＭであることが確認された。

【００４２】（２）１−３−１抗体の蛍光標識化精製した１−３−１抗体に、実施例２の（２）と同様に
してＦＩＴＣを標識し、蛍光標識された抗体が回収され
てきた画分の吸光度、ＯＤ_280nmとＯＤ_495nmを測定
し、標識率を算出した。Ｆ／Ｐ比は、６．７であった。

【００４３】試験例４（ヒト型モノクローナル抗体の癌細胞株への反応性の検
討）（１）癌細胞株と維持ヒト大腸癌株Ｃ−１、胃癌株ＭＫＮ４５は、試験例１の
（１）と同様、培養液Ｂで３７℃、５％ＣＯ₂の条件で
維持、増殖させた。

【００４４】（２）癌細胞株に対する反応性の検討生癌細胞に対する反応性フラスコまたはシャーレで培養した癌細胞の上清を除去
し、０．０２％−ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ溶液を加えて室温
３０分放置し、細胞を浮遊化させた。この細胞は、培養
液Ｂで遠心洗浄し、約１×１０⁶／２００μｌの細胞密
度となるよう、ＰＢＳに懸濁し、最終濃度が、５０μｇ
／ｍｌとなるよう上記実施例５の（１）で得られた１−
３−１抗体を加え、０℃、６０分間反応させた。その
後、２０００ｒｐｍで２分間遠心して上清を除去し、１
％ＢＳＡ含有ＰＢＳでＦＩＴＣ標識化抗ヒト抗体〔カペ
ル社製〕を５００倍に希釈した溶液、２００μｌを添加
して細胞を懸濁させ、さらに０℃、６０分間反応させ
た。反応後、２０００ｒｐｍで２分間遠心して上清を除
去し、細胞を１ｍｌのＰＢＳに懸濁して遠心洗浄を行な
った後、細胞を１０μｇ／ｍｌのＰＩを含有するＰＢＳ
３００μｌに懸濁した。この細胞懸濁液をＦＣＭにか
け、個々の細胞に結合した蛍光量（ＦＩＴＣ及びＰＩ）
を測定した。１−３−１抗体の大腸癌細胞株Ｃｌ、胃癌
細胞株ＭＫＮ４５それぞれに対する反応性を図３及び図
４に示した。横軸に癌細胞１個当たりの蛍光強度、縦軸
に癌細胞数が示されている。コントロールとして、市販
のヒトＩｇＭ抗体〔カペル社製〕を用い、同様に癌細胞
株に対する反応性を調べた。図中、１−３−１抗体の反
応性は点線で、コントロールは実線で示した。これよ
り、１−３−１抗体は癌細胞に対し強い結合性を有する
ことがわかる。

【００４５】試験例５（ヒト型モノクローナル抗体１−３−１の新鮮癌組織、
非癌部組織由来細胞に対する反応性）１−３−１抗体の
癌細胞結合特異性を検討するため、癌患者の癌組織と同
時に摘出された同一患者、同一臓器の新鮮組織から、細
胞を単離し、それぞれの細胞に対する１−３−１抗体の
反応性を測定した。組織からの細胞の単離は、上記試験
例３と同様時田らの方法に従った。この様にして得られ
た細胞に対する反応性は、上記した生癌細胞株に対する
反応性を検討した場合と同様、ＦＣＭによって測定し
た。ただし、これらの細胞は、培養液Ｂで遠心洗浄し、
約１×１０⁶／２００μｌの細胞密度となるよう、上記
実施例５の（２）で得た蛍光標識した１−３−１抗体
（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含有する血清（健常人由
来）に懸濁し、０℃、６０分間反応させた後、２０００
ｒｐｍで２分間遠心して上清を除去し、細胞を１ｍｌの
ＰＢＳに懸濁して遠心洗浄を行ない、細胞を１０μｇ／
ｍｌのＰＩを含有するＰＢＳ３００μｌに懸濁した。そ
の後、この細胞懸濁液をＦＣＭにかけ、細胞個々に結合
した蛍光量（ＦＩＴＣ及びＰＩ）を測定した。蛍光量
（５種類）のマーカー（クオンタティブキット：前述）
をＦＣＭに同一条件下でかけ、それを指標にして細胞１
個当たりの平均結合ＦＩＴＣ量を算定し、その値と実施
例５の（２）で算出した標識抗体のＦ／Ｐ比から生癌細
胞の１個当たりの平均結合抗体数を算定し、その結果を
以下表４に示す。

【００４６】

【表４】１−３−１抗体の非癌部由来細胞に対する反応性は、コ
ントロールとした健常人抹しょう血由来抗体（１−３−
１と同様の方法により蛍光標識化）と同程度かそれ以下
であったのに対し、癌組織由来細胞に対する平均結合抗
体数は、非癌由来細胞に対する結合数と比較して顕著に
多く、また、コントロール抗体と比較した場合にも、胃
癌、大腸癌とも１０倍であり、１−３−１抗体が癌細胞
の膜上により多く出現してくる抗原を認識していること
が示唆された。

【００４７】実施例６（ヒト型モノクローナル抗体１−３−１軽鎖のサブクラ
ス決定）抗体としてＧＡＨ抗体のかわりに、実施例５の
（１）で得られた１−３−１抗体を用いた以外は、前記
実施例３に示した方法と同様にして、１−３−１抗体軽
鎖のサブクラスを決定した。その結果、１−３−１抗体
の軽鎖は、抗ヒトλ鎖抗体と反応し、発色によってバン
ドが出現し、λ鎖であることが示された。

【００４８】（ヒト型抗体１−３−１遺伝子の取得と塩
基配列の決定）ａ．ポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと略す）
法による抗体１−３−１をコードするｃＤＮＡの調製実施例４の（２）で得られた１−３−１抗体産生ハイブ
リドーマよりチオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法
（ＤＮＡ２，３２９（１９８３））に従いポリ（Ａ）
を有するＲＮＡを調製した。用いたハイブリドーマの細
胞数が２×１０⁸である以外は、すべて実施例３で示し
たとおりにして、該ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡ
約１．８ｍｇを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）お
よび１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液１ｍｌに溶かした。
このうち２３０μｌからｍＲＮＡピューリフィケーショ
ンキット（前述）によって、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮ
Ａ約２０μｇを得た。

【００４９】このポリ（Ａ）ｍＲＮＡ４．３μｇを１
０μｌの水に溶かし、実施例３と同様、オリゴｄ（Ｔ）
１２−１８プライマー０．６μｇ、１０ｍＭ４ｄＮＴ
Ｐ２μｌ、逆転写酵素４０ｕ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤３
０ｕ、５倍濃度の逆転写酵素緩衝液６μｌを加え、水を
加えて計３０μｌの系とし、４２℃で１時間反応させ
た。上記反応液からエタノール沈澱を行って、ｃＤＮＡ
を得た。

【００５０】得られたｃＤＮＡを２０μｌの水に溶解し
た。このうちの１０μｌに、５倍濃度の末端デオキシヌ
クレオチド転位酵素緩衝液５μｌ、末端デオキシヌクレ
オチド転位酵素１１ｕ、１０ｍＭｄＧＴＰ２．５μ
ｌを加え、水６．５μｌを加え計２５μｌの系とし、３
７℃で１時間反応させて、ｃＤＮＡの３′末端にポリｄ
（Ｇ）を付加した。その後７０℃で１０分間加熱して酵
素を失活させた。

【００５１】この様にして得られたｃＤＮＡを基質とし
てＰＣＲを行った。ＰＣＲは、上記反応終了液２．５μ
ｌに重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅させる
ためのプライマーとしてｃＤＮＡ３′末端に付加したｄ
ＧテールにハイブリダイズするポリＣ（１４ヌクレオチ
ド）２５ｐｍｏｌｅｓと、ＩｇＭの定常領域の塩基配列
部分に対応する一鎖ＤＮＡプライマー（配列番号：７，
１７ヌクレオチド）〔ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲ
ｅｓｅａｒｃｈ１８，４２７８（１９９０）〕２５ｐ
ｍｏｌｅｓ、また、軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮ
Ａを増幅させるためのプライマーとしてポリＣ２５ｐ
ｍｏｌｅｓと、λ鎖の定常領域の塩基配列部分に対応す
る一鎖プライマー（配列番号：８，１９ヌクレオチド）
〔Ｎａｔｕｒｅ２９４，５３６（１９８１）〕２５ｐ
ｍｏｌｅｓを用いた以外はすべて実施例３で示した方法
と同様に行い、本鎖の平滑末端をもったｃＤＮＡを得
た。

【００５２】ｂ．ｃＤＮＡの塩基配列の決定得られたｃＤＮＡ溶液を２％アガロース電気泳動により
解析した結果、約５００ｂｐのバンドが認められた。こ
の約５００ｂｐのバンドを常法に従ってアガロースゲル
より切り出し、クローニングベクターのｐＵＣ１１９の
ＳｍａＩ部位に挿入してジデオキシ法によってその塩基
配列を決定した。その結果、該ＰＣＲフラグメントの塩
基配列中、重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする塩基配
列は、夫々、配列番号：９、配列番号：１０に示したと
おりであった。決定した塩基配列から予想される前記ハ
イブリドーマが産生する１−３−１抗体の重鎖及び軽鎖
の可変領域のアミノ酸配列は、夫々、配列番号：１１及
び配列番号：１２で示す通りである。このアミノ酸配列
及び塩基配列が明らかにされたＤＮＡ断片は、上述の様
な方法を繰り返すことなく、ＤＮＡ合成機により再現性
よく取得することができる。

【００５３】実施例７（アドリアマイシン含有ＧＡＨ抗体結合リポソームの作
製）ａ．チオール化抗体の作製抗腫瘍細胞反応性ＧＡＨ抗体（ＩｇＧ）を０．１Ｍ−酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）で１／４０ｍｏｌ量のペプシン
〔ＣｏｏｐｅｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製〕を加え、
３７℃で一夜反応させてＦ（ａｂ′）₂化し、陽イオン
交換樹脂（ｍｏｎｏＳ）〔ファルマシア社製〕による
クロマト分離によってＦ（ａｂ′）₂を単離した。分離
条件は、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中、０か
ら０．５ＭＮａＣｌを含有する同緩衝液の直線勾配に
より行った。単離されたＦ（ａｂ′）₂を０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中
で、抗体１ｍｇにつき１０％ＤＴＴ１２μｌを加え、
室温で８０分間放置した。反応終了後、ＰＢＳに平衡化
したゲルろ過カラム（ＰＤ−１０）で脱塩し、チオール
化Ｆａｂ′抗体を調製した。

【００５４】ｂ．チオール化ポリエチレングリコールの
作製Ｌ−シスチン４８ｍｇを０．４Ｍほう酸緩衝液１０ｍｌ
に溶解し、２，４−ビス（ポリエチレングリコール）−
６−クロロ−ｓ−トリアジン（活性化ＰＥＧ２）〔生化
学工業社製〕２００ｍｇを加え室温で一夜反応した。得
られたシステイン結合ＰＥＧにＤＴＴ６２ｍｇを加え
３７℃で６時間反応させることでシステイン結合ＰＥＧ
を含む溶液を得た。さらに反応液をゲル濾過（ＧＨ−２
５生化学工業）等で脱塩し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ（ＰＢＳ）に置換し
た後ＰＢＳで平衡化したチオプロピルセファロース６Ｂ
（ファルマシア）７ｍｌに添加し、非結合物をＰＢＳで
洗浄除去した。ゲルに結合したシステイン結合ＰＥＧ
を、５０ｍＭ−ＤＴＴを含むＰＢＳで溶出後、ゲル濾過
等で余剰のＤＴＴを脱塩除去し標品（チオール化ＰＥ
Ｇ）を得た。

【００５５】ｃ．マレイミド化−ジパルミトイルフォス
ファチジルエタノールアミンの作製ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン１２
７ｍｇ、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スク
シンイミド（ＥＭＣＳ）８０ｍｇ、トリエチルアミン４
４ｕｌをクロロホルム／メタノール：５／１の溶液に加
え、窒素気流下で３時間反応させた。その後、さらに２
０ｍｇのＥＭＣＳを追加しさらに室温で３時間反応させ
た。反応溶液のニンヒドリン反応が陰性になったことを
確認後、減圧乾固し、少量のクロロホルムに再溶解し
た。マレイミド化ジパルミトイルフォスファチジルエタ
ノールアミンはＵＮＩＳＩＬ〔ガスクロ工業社製〕を用
いたクロマトグラフィーで精製した。クロロホルムで平
衡化した同カラムに添加しクロロホルム／メタノール：
１０／１の溶離液で展開し目的物質を得た。

【００５６】ｄ．マレイミド基含有アドリアマイシン封
入リポソームの作製ＤＰＰＣ（ジパルミトイルフォスファチジルコリン）／
ｃｈｏｌ（コレステロール）／マレイミド化ＤＰＰＥ
（ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン）
が、１８／１０／３（ｍｏｌ比）からなる固形脂質混合
物（日本精化社製〕１００ｍｇに０．４Ｍクエン酸緩衝
液ｐＨ４を１ｍｌ加え攪はんし、さらに凍結融解を５回
繰り返し水和することによりマルチラメラリポソームを
作製した。ついでマルチラメラリポソームを２００ｎｍ
のポアサイズをもつポリカーボネート膜〔ヌクレオポ
ア，マイクロサイエンス社製〕を装着した加圧装置（ｅ
ｘｔｒｕｄｅｒ；ＬｉｐｅｘＢｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ
ｓ）で６０℃に加温しつつ１０回加圧濾過を繰り返すこ
とで製粒されたリポソームを得た。このリポソーム溶液
を１ＭＮａＯＨ溶液で中和し６０℃に加温しつつ脂質
重量の１／１０重量のアドリアマイシン〔協和発酵社
製〕を加えた。リポソーム内外のｐＨ勾配に従って９７
％以上のアドリアマイシンが能動的にリポソームに封入
され、マレイミド基含有アドリアマイシン封入リポソー
ムが作製された。

【００５７】ｅ．マレイミド基含有アドリアマイシン封
入リポソームへのチオール化抗体の結合とＰＥＧ修飾脂質１００ｍｇからなる上記マレイミド含有アドリアマ
イシン封入リポソームにチオール化Ｆａｂ′抗体、５ｍ
ｇを加え、３７℃で８時間反応させ、さらに５μｍｏｌ
のチオール化ＰＥＧを加え、ＰＢＳ中室温で６時間反応
させることによりＰＥＧ修飾抗体結合アドリアマイシン
封入リポソームを作製した。さらにセファロースＣＬ６
Ｂ（ファルマシア社製〕でゲル濾過し未反応のシステイ
ン結合ＰＥＧを分離した。

【００５８】試験例６（アドリアマイシン封入ＧＡＨ抗体結合ＰＥＧ修飾リポ
ソームの薬効確認）ＧＡＨ抗体の反応性が認められ、ま
たヌードマウス移植系で集積性が認められるヒト胃癌細
胞株ＭＫＮ４５を用い抗腫瘍効果を検討した。治療実験
は培養したＭＫＮ４５細胞１×１０⁶個をヌードマウ
ス皮下に移植し、１０日後、腫瘍重量が約１００ｍｇに
なった時点から開始した。結果を図５に示した。治療開
始当日、３日および７日経過後にアドリアマイシン封入
ＧＡＨ抗体結合ＰＥＧ修飾リポソームをアドリアマイシ
ン換算で５ｍｇ／ｋｇ、尾静脈投与した（図中、◇で表
示）。また、コントロール群としてリン酸緩衝生理食塩
水（図中、◆で表示）、アドリアマイシン単独（図中、
□で表示）、アドリアマイシン封入ＰＥＧ修飾リポソー
ム（図中、×で表示）投与群（各群６〜７匹）を設け
た。その腫瘍増殖の経時変化を測定するため、バッテル
−コロンバス法に従って腫瘍の短径×短径×長径／２の
計算式で推定腫瘍重量を求め、その推移を治療開始時点
での腫瘍重量を基準として示した。横軸は治療実験開始
後の経過日数を示す。図中（↓）は薬剤投与日を示す。
これよりアドリアマイシン封入モノクローナル抗体結合
ＰＥＧ修飾リポソームの強い抗腫瘍効果が示された。

【００５９】

【発明の効果】本発明で得られたヒト型モノクローナル
抗体を用いることにより、癌組織に対する抗癌剤、毒素
等のターゲッティング治療が可能である。また、本発明
の抗腫瘍剤は、ヒト型モノクローナル抗体を含むので、
癌組織に特異的であり、連続投与が可能である。

【００６０】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：３７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源ヒトＩｇＧ抗体配列 G GCC CTT GGT GGA GGC TGA AGA GAC GGT GAC CAT TCT 37

【００６１】配列番号：２配列の長さ：２１配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源ヒトＩｇＧ抗体配列 TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT 21

【００６２】配列番号：３配列の長さ：３５７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCA 45 CAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTC TCT GGT GGC TCC ATC AGC 90 AGT TGT GGT TTC TAC TGG AAC TGG ATC CGC CAG CAC CCA GGG AAG 135 GGC CTG GAG TGG ATT GGG TAC ATC TAT TAC AGT GGG AGC ACC TAC 180 TAC AAC CCG TCC CTC AAG AGT CGA GTT ACC ATA TCG CTA GAC ACG 225 TCT AAG AGC CAG TTC TCC CTG AAG CTG AGC TCT CTG ACT GCC GCG 270 GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGG TCT ACC CGA CTA CGG GGG 315 GCT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACA ATG GTC ACC GTC TCT TCA 357

【００６３】配列番号：４配列の長さ：３４２配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CCA GAC TCC CTG GCT GTG TCT CTG 45 GGC GAG AGG GCC ACC ATC AAC TGC AAG TCC AGC CAG AGT GTT TTA 90 TAC AAC TCC AAC AAT AAG AAA TAC TTA GCT TGG TAC CAG CAG AAA 135 CCA GGA CAG CCT CCT AAG CTG CTC ATT TAC TGG GCA TCT ACC CGG 180 GAA TCC GGG GTC CCT GAC CGA TTC AGT GGC AGC GGG TCT GGG ACA 225 GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG GCT GAA GAT GTG GCA 270 GTT TAT TAC TGT CAG CAG TAT TAT AGT ACT CCG TGG ACG TTC GGC 315 CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGA 342

【００６４】配列番号：５配列の長さ：１１９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser 20 25 30 Ser Cys Gly Phe Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr 50 55 60 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr 65 70 75 Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala 80 85 90 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Arg Leu Arg Gly 95 100 105 Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 110 115 119

【００６５】配列番号：６配列の長さ：１１４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu 20 25 30 Tyr Asn Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 50 55 60 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 65 70 75 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 80 85 90 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly 95 100 105 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 110 114

【００６６】配列番号：７配列の長さ：１７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源ヒトＩｇＭ抗体配列 C GAG GGG GAA AAG GGT T 17

【００６７】配列番号：８配列の長さ：１９配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源ヒトＩｇＭ抗体配列G AAG CTC CTC AGA GGA GGG 19

【００６８】配列番号：９配列の長さ：３６６配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列 CAG CTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG 45 GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTC TCT GGT GGC TCC ATC AGC 90 AGT AGT AGT TAC TAC TGG GGC TGG ATC CGC CAG CCC CCA GGG AAG 135 GGG CTG GAG TGG ATT GGG AGT ATC TAT TAT AGT GGG AGC ACC TAC 180 TAC AAC CCG TCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCC GTA GAC ACG 225 TCC AAG AAC CAG TTC TCC CTG AAG CTG AGC TCT GTG ACC GCC GCA 270 GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGG GGG AGC TAC GGG GGC TAC 315 TAC TAC GGT ATG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC 360 TCC TCA 366

【００６９】配列番号：１０配列の長さ：３２４配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列 TAT GAG CTG ACA CAG CCA CCC TCG GTG TCA GTG TCC CCA GGA CAG 45 ACG GCC AGG ATC ACC TGC TCT GGA GAT GCA TTG CCA AAG CAA TAT 90 GCT TAT TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGC CAG GCC CCT GTG CTG GTG 135 ATA TAT AAA GAC AGT GAG AGG CCC TCA GGG ATC CCT GAG CGA TTC 180 TCT GGC TCC AGC TCA GGG ACA ACA GTC ACG TTG ACC ATC AGT GGA 225 GTC CAG GCA GAA GAC GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAA TCA GCA GAC 270 AGC AGT GGT ACT TAT GAG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC 315 GTC CTA GGT 324

【００７０】配列番号：１１配列の長さ：１２２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser 20 25 30 Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr 50 55 60 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr 65 70 75 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala 80 85 90 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Gly Gly Tyr 95 100 105 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser 122

【００７１】配列番号：１２配列の長さ：１０８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列 Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr 20 25 30 Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val 35 40 45 Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp 80 85 90 Ser Ser Gly Thr Tyr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 95 100 105 Val Leu Gly 108

【００７２】配列番号：１３配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：癌細胞の膜表面にその抗原を持つヒト型モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞配列 Ile Ser Ser Xaa Xab Xac Tyr Trp 1 5 Xaa : Cys or Ser, Xab : Gly or Ser, Xac : Phe or Tyr

【００７３】配列番号：１４配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：癌細胞の膜表面にその抗原を持つヒト型モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞

【００７４】配列番号：１５配列の長さ：４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：癌細胞の膜表面にその抗原を持つヒト型モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞

【００７５】配列番号：１６配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞

【００７６】配列番号：１７配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞

【００７７】配列番号：１８配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞

【００７８】配列番号：１９配列の長さ：１７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Asn Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Leu Ala 1 5 10 15

【００７９】配列番号：２０配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞

【００８０】配列番号：２１配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞

【００８１】配列番号：２２配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞

【００８２】配列番号：２３配列の長さ：１４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列 Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 1 5 10

【００８３】配列番号：２４配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞

【００８４】配列番号：２５配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞

【００８５】配列番号：２６配列の長さ：４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞

【００８６】配列番号：２７配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞

【００８７】配列番号：２８配列の長さ：２４配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：癌細胞の膜表面にその抗原を持つヒト型モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞

【００８８】配列番号：２９配列の長さ：３６配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：癌細胞の膜表面にその抗原を持つヒト型モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞配列 ATT GGG WRY ATC TAT TAY AGT GGG AGC ACC TAC TAC 36 W : T or A, R : A or G, Y : C or T

【００８９】配列番号：３０配列の長さ：１２配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：癌細胞の膜表面にその抗原を持つヒト型モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞配列 GGK RYK GAC KWC 12 K : G or T, R : G or A, Y : C or T W : A or T

【００９０】配列番号：３１配列の長さ：２７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 ATC AGC AGT TGT GGT TTC TAC TGG 27

【００９１】配列番号：３２配列の長さ：３６配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 ATT GGG TAC ATC TAT TAC AGT GGG AGC ACC TAC TAC 36

【００９２】配列番号：３３配列の長さ：２７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 TCT ACC CGA CTA CGG GGG GCT GAC TAC 27

【００９３】配列番号：３４配列の長さ：５１配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 AAG TCC AGC CAG AGT GTT TTA TAC AAC TCC AAC AAT AAG AAA TAC TTA GCT 51

【００９４】配列番号：３５配列の長さ：２１配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 TGG GCA TCT ACC CGG GAA TCC 21

【００９５】配列番号：３６配列の長さ：２７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体ＧＡＨ産生ハイブリドーマ細胞配列 CAG CAG TAT TAT AGT ACT CCG TGG ACG 27

【００９６】配列番号：３７配列の長さ：３０配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列 ATC AGC AGT AGT AGT TAC TAC TGG GGC TGG 30

【００９７】配列番号：３８配列の長さ：４２配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列 ATT GGG AGT ATC TAT TAT AGT GGG AGC ACC TAC TAC AAC CCG 42

【００９８】配列番号：３９配列の長さ：３６配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列 GGG AGC TAC GGG GGC TAC TAC TAC GGT ATG GAC GTC 36

【００９９】配列番号：４０配列の長さ：２７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列GAT GCA TTG CCA AAG CAA TAT GCT TAT 27

【０１００】配列番号：４１配列の長さ：１２配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列 AAA GAC AGT GAG 12

【０１０１】配列番号：４２配列の長さ：３３配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源細胞の種類：ヒト抗体１−３−１産生ハイブリドーマ細
胞配列 CAA TCA GCA GAC AGC AGT GGT ACT TAT GAG GTA 33

【図面の簡単な説明】

【図１】ベクターｐＫＣＲＤの構築の概略図を示す。

【図２】ベクターｐＫＣＲ（ΔＥ）／Ｈの構築の概略図
を示す。

【図３】１−３−１抗体の大腸癌細胞株Ｃ１に対する反
応性を示す。

【図４】１−３−１抗体の胃癌細胞株ＭＫＮ４５に対す
る反応性を示す。

【図５】ヌードマウス移植癌に対するアドリアマイシン
封入ＧＡＨ抗体結合ＰＥＧ修飾リポソームの抗腫瘍効果
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/577 15/00 ＣＣ１２Ｒ 1:91）ＺＮＡＡ (72)発明者平川容子神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者伊藤典彦神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者長池一博神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化成株式会社総合研究所内 (56)参考文献特開平５−192181（ＪＰ，Ａ) 特開平２−142489（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．158, Ｎｏ．１（1983）ｐ．53−65 Ｊｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，Ｖｏｌ．80，Ｎｏ．６（1989) ｐ．546−553 Ｊｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，ｖｏｌ．82，Ｎｏ．２（1991) ｐ．213−218 ＮｉｈｏｎＵｎｉｖ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．26，Ｎｏ．５（1985) ｐ．313−327 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．80，Ｎｏ. 20（1983）ｐ．6327−6331

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ
細胞との細胞融合によって産生され、癌細胞の膜表面抗
原に特異的に結合するヒト型モノクローナル抗体であっ
て、重鎖可変領域が、配列表の配列番号１６、１７およ
び１８のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が、配
列表の配列番号１９、２０および２１のアミノ酸配列を
含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ
細胞との細胞融合によって産生され、癌細胞の膜表面抗
原に特異的に結合するヒト型モノクローナル抗体であっ
て、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、夫々、配列表
の配列番号５および６のアミノ酸配列で表されることを
特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項３】癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ
細胞との細胞融合によって産生され、癌細胞の膜表面抗
原に特異的に結合するヒト型モノクローナル抗体であっ
て、重鎖可変領域が、配列表の配列番号２２、２３およ
び２４のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が、配
列表の配列番号２５、２６および２７のアミノ酸配列を
含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項４】癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ
細胞との細胞融合によって産生され、癌細胞の膜表面抗
原に特異的に結合するヒト型モノクローナル抗体であっ
て、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、夫々、配列表
の配列番号１１および１２のアミノ酸配列で表されるこ
とを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項５】請求項１に記載のモノクローナル抗体を
コードするＤＮＡ。
【請求項６】重鎖可変領域をコードする領域が、配列
表の配列番号３１、３２および３３の塩基配列を含み、
かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列表の配列番
号３４、３５および３６の塩基配列を含むことを特徴と
する請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】請求項２に記載のモノクローナル抗体を
コードするＤＮＡ。
【請求項８】重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコー
ドする領域が、夫々、配列表の配列番号３および４の塩
基配列を有することを特徴とする請求項７記載のＤＮ
Ａ。
【請求項９】請求項３に記載のモノクローナル抗体を
コードするＤＮＡ。
【請求項１０】重鎖可変領域をコードする領域が、配
列表の配列番号３７、３８および３９の塩基配列を含
み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列表の配
列番号４０、４１および４２の塩基配列を含むことを特
徴とする請求項９記載のＤＮＡ。
【請求項１１】請求項４に記載のモノクローナル抗体
をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコ
ードする領域が、夫々、配列表の配列番号９および１０
の塩基配列を有することを特徴とする請求項１１記載の
ＤＮＡ。
【請求項１３】請求項１記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ。
【請求項１４】請求項２記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ。
【請求項１５】請求項３記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ。
【請求項１６】請求項４記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ。
【請求項１７】腫瘍細胞に対する毒素または制癌剤を
内包するリポソームの表面に、請求項１記載のモノクロ
ーナル抗体を担持させた抗腫瘍剤。
【請求項１８】腫瘍細胞に対する毒素または制癌剤を
内包するリポソームの表面に、請求項２記載のモノクロ
ーナル抗体を担持させた抗腫瘍剤。
【請求項１９】腫瘍細胞に対する毒素または制癌剤を
内包するリポソームの表面に、請求項３記載のモノクロ
ーナル抗体を担持させた抗腫瘍剤。
【請求項２０】腫瘍細胞に対する毒素または制癌剤を
内包するリポソームの表面に、請求項４記載のモノクロ
ーナル抗体を担持させた抗腫瘍剤。