JP2003524587A - 多発性骨髄腫を処置するための、ｃｄ３８に対する、遺伝子操作した抗体の使用 - Google Patents
多発性骨髄腫を処置するための、ｃｄ３８に対する、遺伝子操作した抗体の使用Info
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Abstract
(57)【要約】
抗体又はそのフラグメントを含んで成る融合ポリペプチドを提供する。前記融合ポリペプチドは、多発性骨髄腫を処置するための、治療用組成物において有用である。
Description
【０００１】発明の背景
多発性骨髄腫は、致死の新生物であり、形質細胞のクローンの蓄積を特徴とし
、しばしばＩｇ鎖の分泌を伴う。前記の腫瘍による骨髄の侵入は、貧血、低ガン
マグロブリン血症、及び顆粒球減少症と関連し、これらは細菌の感染を伴う。主
にＩＬ−６及びＩＬ−１βの濃度が上昇する、異常なサイトカイン環境は、しば
しば骨粗鬆症の増大をもたらし、骨の痛み、骨折、及び高カルシウム血症を導く
。
、しばしばＩｇ鎖の分泌を伴う。前記の腫瘍による骨髄の侵入は、貧血、低ガン
マグロブリン血症、及び顆粒球減少症と関連し、これらは細菌の感染を伴う。主
にＩＬ−６及びＩＬ−１βの濃度が上昇する、異常なサイトカイン環境は、しば
しば骨粗鬆症の増大をもたらし、骨の痛み、骨折、及び高カルシウム血症を導く
。
【０００２】
積極的な化学療法及び移植にもかかわらず、多発性骨髄腫は、一般に致死の血
漿増殖性障害である。他のアプローチとして、何人かの研究者が免疫療法の戦略
を提案してきた。従来の化学療法の非特異性と対照的に、抗体及び天然のリガン
ドは、標的のガン細胞に特異的に結合することができる。毒性分子又は放射性同
位体に結合した抗体は、免疫毒素又は免疫抱合体を形成し、これは標的細胞を特
異的に殺す潜在的な利点を有している。多発性骨髄腫へのその様なアプローチの
１つは、ＩＬ−６のシグナリング系を標的にしてきた。ＩＬ−６は自己分泌又は
傍分泌のいずれかにおいて機能する、骨髄腫細胞の主要な増殖因子であると示唆
されてきた。ＩＬ−６を中和する、２つのマウスのモノクローナル抗体は、前記
の疾患の白血病性変異体を有する患者の、骨髄腫細胞の増殖を抑制したが、腫瘍
は６０日後に再発した。同様に、ＩＬ−６Ｒは遮断抗体（Ａｂ）及びＩＬ−６−
細胞毒素抱合体、その両方の標的として研究されてきた。
漿増殖性障害である。他のアプローチとして、何人かの研究者が免疫療法の戦略
を提案してきた。従来の化学療法の非特異性と対照的に、抗体及び天然のリガン
ドは、標的のガン細胞に特異的に結合することができる。毒性分子又は放射性同
位体に結合した抗体は、免疫毒素又は免疫抱合体を形成し、これは標的細胞を特
異的に殺す潜在的な利点を有している。多発性骨髄腫へのその様なアプローチの
１つは、ＩＬ−６のシグナリング系を標的にしてきた。ＩＬ−６は自己分泌又は
傍分泌のいずれかにおいて機能する、骨髄腫細胞の主要な増殖因子であると示唆
されてきた。ＩＬ−６を中和する、２つのマウスのモノクローナル抗体は、前記
の疾患の白血病性変異体を有する患者の、骨髄腫細胞の増殖を抑制したが、腫瘍
は６０日後に再発した。同様に、ＩＬ−６Ｒは遮断抗体（Ａｂ）及びＩＬ−６−
細胞毒素抱合体、その両方の標的として研究されてきた。
【０００３】
免疫毒素は理論的に高度に特異的な腫瘍細胞致死因子であるが、現在使用され
ている免疫毒素はいくつかの重大な問題、例えば免疫原性、循環する免疫毒素の
腫瘍細胞に対する限定の接触能、及び副作用を有しており、これらはガン治療に
対するそれらの効力を大きく限定している。特に、前記の毒素に対する中和抗体
は、免疫抑制剤の使用を伴うとしても、前記の免疫毒素への暴露後すぐに展開し
、その結果、患者におけるそれらの繰り返しの投与及び治療上の効力を大きく妨
げている。ヒト化したマウス抗体の使用は、大部分、標的部分の免疫原性問題を
解決したが、高度に免疫原性の毒素部分に対する問題は残っている。更に、免疫
毒素の別の潜在的な問題は、腫瘍抗原が独占的に腫瘍特異的な抗原ではなく；い
くつかの正常なヒトの組織もまた、かなり低い濃度にもかかわらず、前記抗原を
提示するという事実である。
ている免疫毒素はいくつかの重大な問題、例えば免疫原性、循環する免疫毒素の
腫瘍細胞に対する限定の接触能、及び副作用を有しており、これらはガン治療に
対するそれらの効力を大きく限定している。特に、前記の毒素に対する中和抗体
は、免疫抑制剤の使用を伴うとしても、前記の免疫毒素への暴露後すぐに展開し
、その結果、患者におけるそれらの繰り返しの投与及び治療上の効力を大きく妨
げている。ヒト化したマウス抗体の使用は、大部分、標的部分の免疫原性問題を
解決したが、高度に免疫原性の毒素部分に対する問題は残っている。更に、免疫
毒素の別の潜在的な問題は、腫瘍抗原が独占的に腫瘍特異的な抗原ではなく；い
くつかの正常なヒトの組織もまた、かなり低い濃度にもかかわらず、前記抗原を
提示するという事実である。
【０００４】
従って、多発性骨髄腫細胞に高度に特異的であるが、低い免疫原性を持つか又
は全く持たない治療的な分子が必要とされている。
は全く持たない治療的な分子が必要とされている。
【０００５】発明の要約
本発明は、ＣＤ３８抗原に特異的に結合するポリペプチドの少なくとも一部、
これに連結する、ＤＮＡ結合タンパク質であるポリペプチドの少なくとも一部、
を含んで成る遺伝子操作（組換え）した融合ポリペプチドを提供する。従って、
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドをコードする、単離して、そして精製
された核酸分子、例えばＤＮＡ分子、配列又はセグメントを提供する。本発明の
融合ポリペプチドは、以下に記述する本発明の治療用組成物において有用であり
、この組成物はＣＤ−３８発現細胞の存在又は増殖を特徴とする症状を抑制する
か又は処置することができる。
これに連結する、ＤＮＡ結合タンパク質であるポリペプチドの少なくとも一部、
を含んで成る遺伝子操作（組換え）した融合ポリペプチドを提供する。従って、
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドをコードする、単離して、そして精製
された核酸分子、例えばＤＮＡ分子、配列又はセグメントを提供する。本発明の
融合ポリペプチドは、以下に記述する本発明の治療用組成物において有用であり
、この組成物はＣＤ−３８発現細胞の存在又は増殖を特徴とする症状を抑制する
か又は処置することができる。
【０００６】
ＣＤ３８は細胞表面抗原であり、大部分の骨髄腫患者からの悪性形質細胞上に
、事実上全て、高密度で発現することが知られている。ＣＤ３８は休止期のナチ
ュラルキラー細胞、活性Ｔ細胞及びＢ細胞、並びに骨髄前駆細胞上に存在するが
、しばしば１％以下の正常な骨髄細胞を含んで成る正常な形質細胞上に、それは
高密度で発現する。これらの集団を補充するために必要な初期の幹細胞は、ＣＤ
３８ネガティブである。
、事実上全て、高密度で発現することが知られている。ＣＤ３８は休止期のナチ
ュラルキラー細胞、活性Ｔ細胞及びＢ細胞、並びに骨髄前駆細胞上に存在するが
、しばしば１％以下の正常な骨髄細胞を含んで成る正常な形質細胞上に、それは
高密度で発現する。これらの集団を補充するために必要な初期の幹細胞は、ＣＤ
３８ネガティブである。
【０００７】
好ましくは、ＣＤ３８結合ポリペプチドは抗体、そのフラグメント又は変異体
、例えば（Ｆａｂ′）2 ，Ｆａｂ，Ｆｖ、Ｆｄ、軽鎖若しくは重鎖の二量体、キ
メラ抗体又は一本鎖抗体、例えば一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
更に好ましくは、前記ＣＤ３８結合ポリペプチドは、一本鎖可変領域フラグメン
ト（ｓｃＦｖ）であって、任意にヒト化される組換え抗体である。本発明の好ま
しい態様は、ハイブリドーマが分泌する抗ＣＤ３８抗体由来の免疫グロブリンの
重鎖と、これに連結している前記のものと同一のハイブリドーマ由来の免疫ブロ
ブリンの軽鎖を含んで成る融合ポリペプチドである。好ましくは、前記の連結は
親水性のペプチド架橋によるものである。前記の融合ポリペプチドはＣＤ３８抗
原に対する親和性及び特異性を有しており、そしてＣＤ３８＋細胞、例えば骨髄
腫細胞によって取込まれる。
、例えば（Ｆａｂ′）2 ，Ｆａｂ，Ｆｖ、Ｆｄ、軽鎖若しくは重鎖の二量体、キ
メラ抗体又は一本鎖抗体、例えば一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
更に好ましくは、前記ＣＤ３８結合ポリペプチドは、一本鎖可変領域フラグメン
ト（ｓｃＦｖ）であって、任意にヒト化される組換え抗体である。本発明の好ま
しい態様は、ハイブリドーマが分泌する抗ＣＤ３８抗体由来の免疫グロブリンの
重鎖と、これに連結している前記のものと同一のハイブリドーマ由来の免疫ブロ
ブリンの軽鎖を含んで成る融合ポリペプチドである。好ましくは、前記の連結は
親水性のペプチド架橋によるものである。前記の融合ポリペプチドはＣＤ３８抗
原に対する親和性及び特異性を有しており、そしてＣＤ３８＋細胞、例えば骨髄
腫細胞によって取込まれる。
【０００８】
本発明は更に、一本鎖の融合ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を提
供する。前記の組換えＤＮＡ分子は： ａ）ＣＤ３８特異的抗体の軽鎖のＦｖ領域及び、ＣＤ３８特異的抗体の重鎖のＦ
ｖ領域をコードするＤＮＡ配列（ここで、前記の融合タンパク質はＣＤ３８+ 細
胞に結合する）；並びに、 ｂ）ＤＮＡに特異的に結合するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、 を含んで成る。従って、本発明はまた、：ａ）ＣＤ３８特異的抗体の軽鎖及び重
鎖のＦｖ領域；並びにｂ）ＤＮＡ結合ポリペプチド（ここで、前記のＦｖ領域及
び前記のＤＮＡ結合ポリペプチドは組換えによって融合し、ＣＤ３８+ 細胞と特
異的に結合する一本鎖のポリペプチドを形成する）を含んで成る、組換えによっ
て製造される一本鎖の融合ポリペプチドを提供する。
供する。前記の組換えＤＮＡ分子は： ａ）ＣＤ３８特異的抗体の軽鎖のＦｖ領域及び、ＣＤ３８特異的抗体の重鎖のＦ
ｖ領域をコードするＤＮＡ配列（ここで、前記の融合タンパク質はＣＤ３８+ 細
胞に結合する）；並びに、 ｂ）ＤＮＡに特異的に結合するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、 を含んで成る。従って、本発明はまた、：ａ）ＣＤ３８特異的抗体の軽鎖及び重
鎖のＦｖ領域；並びにｂ）ＤＮＡ結合ポリペプチド（ここで、前記のＦｖ領域及
び前記のＤＮＡ結合ポリペプチドは組換えによって融合し、ＣＤ３８+ 細胞と特
異的に結合する一本鎖のポリペプチドを形成する）を含んで成る、組換えによっ
て製造される一本鎖の融合ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明の好ましいＤＮＡ結合ポリペプチドは、限定しないが、プロタミン、ヒ
ストン又はポリリジンを含む。更に好ましくは、前記のＤＮＡ結合ポリペプチド
はプロタミンである。ＤＮＡ結合ポリペプチド遺伝子をＣＤ３８結合ポリペプチ
ド遺伝子に連結させるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）重複伸長技術を
適用することができる。１つの好ましい態様において、前記のＤＮＡ結合ポリペ
プチドは抗体、酵素又は細胞毒性因子ではない。
ストン又はポリリジンを含む。更に好ましくは、前記のＤＮＡ結合ポリペプチド
はプロタミンである。ＤＮＡ結合ポリペプチド遺伝子をＣＤ３８結合ポリペプチ
ド遺伝子に連結させるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）重複伸長技術を
適用することができる。１つの好ましい態様において、前記のＤＮＡ結合ポリペ
プチドは抗体、酵素又は細胞毒性因子ではない。
【００１０】
本発明の融合ポリペプチド、及び細胞毒性因子をコードするＤＮＡ分子を含ん
で成る、治療用組成物もまた提供される。従って、前記の融合ポリペプチドは輸
送体として働いて、細胞毒性因子をコードする治療用遺伝子、例えばジフテリア
毒素Ａ、レクチン、シュードモナス外毒素Ａ、サポナリア・オフィシナリス（Sa
ponaria officinalis)ＳＯ−６（Soria, Pharma. Res., 21, 35 (1989)）又はリ
シンの様な毒素の遺伝子；チミジンキナーゼ又はニトロレダクターゼの様な細胞
を自殺させるものの遺伝子；化学療法のための遺伝子を活性化するタンパク質、
例えばガンシクロビア若しくはマイトマイシンＣ；リボザイム、ＲＮアーゼ、あ
るいはアンチセンス配列（例えば、ＢＣＬ２配列）を、ＣＤ３８＋細胞、例えば
骨髄腫細胞に導入する。このことは、抗ＣＤ３８抗体又はそのヒト化版が、その
様な抗体でコートされた細胞を分解する宿主エフェクター細胞の結果として、多
発性骨髄腫の処置に有用であることを示しているＷＯ９６／１６９９０と対照的
である。好ましくは、前記の治療用遺伝子がコードする細胞毒性因子のうちの、
わずかな分子のみの発現は、その遺伝子を発現する細胞を殺すのに十分である。
前記の治療用遺伝子が、細胞又は組織特異的転写単位、例えば細胞又は組織特異
的プロモーター及び／又はエンハンサーに、作用可能に連結していることが好ま
しい。好ましい転写単位は、以下の細胞において発現を方向づけるものであり、
それらはＢ細胞｛例えば、Ｉｇ重鎖遺伝子、Ｉｇκ遺伝子、Ｉｇλ遺伝子、ＢＣ
Ｌ−６遺伝子（Dalla Favera et al., C.S.H. Symp. Quant. Biol., 59, 117 (1
994)）、ＣＤ１９遺伝子、ＣＤ２０遺伝子、又はＣＤ２２遺伝子（Kerhl et al.
, Immunol. Today, 15, 432 (1994)）由来の転写単位｝、Ｔ細胞｛例えばＩＬ−
４遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−２Ｒ遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子、ＩＬ−５
遺伝子、ＩＬ−１３遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子及びＦａｓリガンド遺伝子（Na
gata et al., Prog. Mol. Subcell. Biol., 16, 87 (1996))由来の転写単位｝又
は骨髄細胞である。骨髄特異的転写単位は、限定しないが、米国特許第５，５０
２，１７６号に開示されたもの、並びにＰＵ．１遺伝子（Fisher et al., Stem Cells , 16, 25 (1998)）、ＣＤ１１ｃ若しくはＣＤ１８遺伝子（Corbi et al., Leuk. & Lymph. , 25, 415 (1997))、ＩｇＨエンハンサー、ＣＳＦ受容体Ｇ，Ｇ
Ｍ及び／又はＧ遺伝子（Zhang et al., Cur. Top. Micro. & Immunol., 211, 13
7 (1996)）、あるいはＣ／ＥＢＰ，Ｒｕｎｔ／ＰＥＢＰ２／ＣＢＦ又はＥｔｓ遺
伝子（Clarke et al., J. Leuko. Biol., 63, 153 (1998)）由来の転写単位を含
む。
で成る、治療用組成物もまた提供される。従って、前記の融合ポリペプチドは輸
送体として働いて、細胞毒性因子をコードする治療用遺伝子、例えばジフテリア
毒素Ａ、レクチン、シュードモナス外毒素Ａ、サポナリア・オフィシナリス（Sa
ponaria officinalis)ＳＯ−６（Soria, Pharma. Res., 21, 35 (1989)）又はリ
シンの様な毒素の遺伝子；チミジンキナーゼ又はニトロレダクターゼの様な細胞
を自殺させるものの遺伝子；化学療法のための遺伝子を活性化するタンパク質、
例えばガンシクロビア若しくはマイトマイシンＣ；リボザイム、ＲＮアーゼ、あ
るいはアンチセンス配列（例えば、ＢＣＬ２配列）を、ＣＤ３８＋細胞、例えば
骨髄腫細胞に導入する。このことは、抗ＣＤ３８抗体又はそのヒト化版が、その
様な抗体でコートされた細胞を分解する宿主エフェクター細胞の結果として、多
発性骨髄腫の処置に有用であることを示しているＷＯ９６／１６９９０と対照的
である。好ましくは、前記の治療用遺伝子がコードする細胞毒性因子のうちの、
わずかな分子のみの発現は、その遺伝子を発現する細胞を殺すのに十分である。
前記の治療用遺伝子が、細胞又は組織特異的転写単位、例えば細胞又は組織特異
的プロモーター及び／又はエンハンサーに、作用可能に連結していることが好ま
しい。好ましい転写単位は、以下の細胞において発現を方向づけるものであり、
それらはＢ細胞｛例えば、Ｉｇ重鎖遺伝子、Ｉｇκ遺伝子、Ｉｇλ遺伝子、ＢＣ
Ｌ−６遺伝子（Dalla Favera et al., C.S.H. Symp. Quant. Biol., 59, 117 (1
994)）、ＣＤ１９遺伝子、ＣＤ２０遺伝子、又はＣＤ２２遺伝子（Kerhl et al.
, Immunol. Today, 15, 432 (1994)）由来の転写単位｝、Ｔ細胞｛例えばＩＬ−
４遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−２Ｒ遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子、ＩＬ−５
遺伝子、ＩＬ−１３遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子及びＦａｓリガンド遺伝子（Na
gata et al., Prog. Mol. Subcell. Biol., 16, 87 (1996))由来の転写単位｝又
は骨髄細胞である。骨髄特異的転写単位は、限定しないが、米国特許第５，５０
２，１７６号に開示されたもの、並びにＰＵ．１遺伝子（Fisher et al., Stem Cells , 16, 25 (1998)）、ＣＤ１１ｃ若しくはＣＤ１８遺伝子（Corbi et al., Leuk. & Lymph. , 25, 415 (1997))、ＩｇＨエンハンサー、ＣＳＦ受容体Ｇ，Ｇ
Ｍ及び／又はＧ遺伝子（Zhang et al., Cur. Top. Micro. & Immunol., 211, 13
7 (1996)）、あるいはＣ／ＥＢＰ，Ｒｕｎｔ／ＰＥＢＰ２／ＣＢＦ又はＥｔｓ遺
伝子（Clarke et al., J. Leuko. Biol., 63, 153 (1998)）由来の転写単位を含
む。
【００１１】
従って、本発明は、選択的にＣＤ３８細胞表面分子を標的にするが、免疫原性
が弱いか又は全くそれを持たない治療用組成物を提供し、好ましくは免疫原タン
パク質ではなく、むしろ治療用遺伝子が、環状ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡ
の形態で宿主哺乳類に導入される。その結果、前記の治療用組成物を哺乳類、例
えば骨髄腫の患者に、特に前記の治療用遺伝子によってコードされる前記細胞毒
性因子に対する重大な抗体応答の展開無しに、繰り返し投与することが可能であ
ろう。更に、本発明の治療用組成物は、他のＣＤ３８＋形質細胞増加症、例えば
原発性アミロイド症、重要性が結論づけられていない単一クローン性高ガンマグ
ロブリン血症及び急性骨髄性白血病を有する患者の細胞を殺すのに重要である。
好ましくは、前記組成物中の融合ポリペプチドの、抗体部分のヒト化版は、ヒト
における使用のために適用される。
が弱いか又は全くそれを持たない治療用組成物を提供し、好ましくは免疫原タン
パク質ではなく、むしろ治療用遺伝子が、環状ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡ
の形態で宿主哺乳類に導入される。その結果、前記の治療用組成物を哺乳類、例
えば骨髄腫の患者に、特に前記の治療用遺伝子によってコードされる前記細胞毒
性因子に対する重大な抗体応答の展開無しに、繰り返し投与することが可能であ
ろう。更に、本発明の治療用組成物は、他のＣＤ３８＋形質細胞増加症、例えば
原発性アミロイド症、重要性が結論づけられていない単一クローン性高ガンマグ
ロブリン血症及び急性骨髄性白血病を有する患者の細胞を殺すのに重要である。
好ましくは、前記組成物中の融合ポリペプチドの、抗体部分のヒト化版は、ヒト
における使用のために適用される。
【００１２】
更に、組換えによって製造される一本鎖の融合ポリペプチドを、腫瘍細胞の増
殖が抑制されるのに十分な濃度で、医薬として許容される担体と一緒に含んで成
る医薬組成物が提供される。前記の融合ポリペプチドは：ａ）抗体の一本鎖のＦ
ｖ領域（ここで、前記Ｆｖ領域は、前記抗体のＶH 及びＶL 領域を含んで成る）
；及びｂ）ＤＮＡ結合ポリペプチド（ここで、前記Ｆｖ領域及び前記のＤＮＡ結
合ポリペプチドは組換えによって融合され、ＣＤ３８+ 細胞に特異的に結合する
単一分子を形成する）、を含んで成る。
殖が抑制されるのに十分な濃度で、医薬として許容される担体と一緒に含んで成
る医薬組成物が提供される。前記の融合ポリペプチドは：ａ）抗体の一本鎖のＦ
ｖ領域（ここで、前記Ｆｖ領域は、前記抗体のＶH 及びＶL 領域を含んで成る）
；及びｂ）ＤＮＡ結合ポリペプチド（ここで、前記Ｆｖ領域及び前記のＤＮＡ結
合ポリペプチドは組換えによって融合され、ＣＤ３８+ 細胞に特異的に結合する
単一分子を形成する）、を含んで成る。
【００１３】
細胞を、有効量の本発明の組成物と接触させることを含んで成る、ＣＤ３８＋
細胞の増殖を抑制する方法も提供される。好ましくは、前記組成物は、多発性骨
髄腫、原発性アミロイド症、単一クローン性高ガンマグロブリン血症、又は急性
骨髄性白血病を抑制又は処置するのに効果的な量で哺乳類に投与される。
細胞の増殖を抑制する方法も提供される。好ましくは、前記組成物は、多発性骨
髄腫、原発性アミロイド症、単一クローン性高ガンマグロブリン血症、又は急性
骨髄性白血病を抑制又は処置するのに効果的な量で哺乳類に投与される。
【００１４】
本発明の融合ポリペプチドの、ＣＤ３８結合部分もまた、いずれかの注目の遺
伝子をＣＤ３８＋細胞に導入するトランスフェクション剤として有用であり、血
液細胞が他の常用の手法によってトランスフェクションされにくいとき、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで、又はｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＡＲＨ−７７ ＳＣＩＤマウスの
様な動物モデルで行われる。
伝子をＣＤ３８＋細胞に導入するトランスフェクション剤として有用であり、血
液細胞が他の常用の手法によってトランスフェクションされにくいとき、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで、又はｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＡＲＨ−７７ ＳＣＩＤマウスの
様な動物モデルで行われる。
【００１５】
本発明の別の態様は、細胞毒性因子、例えば放射性同位元素（例えば 125Ｉ，
131Ｃｓ，32Ｐ，90Ｙ，14Ｃ， 3Ｈ、及び35Ｓ）に連結、例えば化学的に融合し
ている本発明の融合ポリペプチドであって、すなわちそれは放射性免疫抱合体で
あり、あるいは別の分子、例えば薬剤、毒素、補因子、基質、阻害剤、磁気標識
、蛍光標識、化学発光標識などに連結しているものである。
131Ｃｓ，32Ｐ，90Ｙ，14Ｃ， 3Ｈ、及び35Ｓ）に連結、例えば化学的に融合し
ている本発明の融合ポリペプチドであって、すなわちそれは放射性免疫抱合体で
あり、あるいは別の分子、例えば薬剤、毒素、補因子、基質、阻害剤、磁気標識
、蛍光標識、化学発光標識などに連結しているものである。
【００１６】本発明の詳細な説明 定義
２０個の天然のアミノ酸、５個の天然の核酸及び１１個の核酸縮重体（ゆらぎ
体）のために使用する略語は、常用の使用法に従う。前記のポリペプチドの表記
法において、左手方向がアミノ末端方向であり、そして右手方向がカルボキシ末
端方向である。前記の核酸の表記法において、左手方向が５′方向であり、そし
て右手方向が３′方向である。
体）のために使用する略語は、常用の使用法に従う。前記のポリペプチドの表記
法において、左手方向がアミノ末端方向であり、そして右手方向がカルボキシ末
端方向である。前記の核酸の表記法において、左手方向が５′方向であり、そし
て右手方向が３′方向である。
【００１７】
“核酸”の用語は、一本鎖又は二本鎖の形態の、デオキシリボヌクレオチド又
はリボヌクレオチドポリマーを意味し、そして特に断らない限り、天然のヌクレ
オチドと同じように機能することができる、天然のヌクレオチドの知られている
類似体を含むだろう。
はリボヌクレオチドポリマーを意味し、そして特に断らない限り、天然のヌクレ
オチドと同じように機能することができる、天然のヌクレオチドの知られている
類似体を含むだろう。
【００１８】
“コードする核酸”又は“コードする核酸配列”の句は、特異的なポリペプチ
ド、タンパク質又はペプチドの発現を方向づける核酸、すなわちＤＮＡ又はＲＮ
Ａを意味する。前記の核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列及びタンパ
ク質に翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。前記の核酸配列は完全長の核酸配列
及び完全長の核酸配列由来の短かい配列の両方を含む。特定の核酸配列は、天然
の配列又は特異的な宿主細胞において好ましいコドンを提供するために導入して
もよい配列の、縮重コドンを含む。前記の核酸配列は、別々の一本鎖又は二本鎖
のいずれかとして、センス及びアンチセンスの両方を含む。本発明の単離された
“変異体”の核酸配列は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも約９０％、
及び更に好ましくは少なくとも約９５％の、しかし１００％以下の、隣接してい
るヌクレオチド配列の相同性又は同一性を、本発明の融合ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列又は細胞毒性因子をコードするＤＮＡに対して有する。例
えば、融合ポリペプチドをコードする核酸分子の変異体が、少なくとも８０％、
好ましくは少なくとも約９０％、及び更に好ましくは少なくとも９５％の、しか
し１００％以下の、隣接したヌクレオチドの配列相同性又は同一性を、配列番号
１を含んで成るヌクレオチド配列に対して有する。更に、本発明の変異体核酸分
子は、相当する非変異体核酸分子に存在しないヌクレオチド塩基、及び相当する
野生型核酸分子と比較したときの内部欠失を含んでいてもよい。
ド、タンパク質又はペプチドの発現を方向づける核酸、すなわちＤＮＡ又はＲＮ
Ａを意味する。前記の核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列及びタンパ
ク質に翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。前記の核酸配列は完全長の核酸配列
及び完全長の核酸配列由来の短かい配列の両方を含む。特定の核酸配列は、天然
の配列又は特異的な宿主細胞において好ましいコドンを提供するために導入して
もよい配列の、縮重コドンを含む。前記の核酸配列は、別々の一本鎖又は二本鎖
のいずれかとして、センス及びアンチセンスの両方を含む。本発明の単離された
“変異体”の核酸配列は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも約９０％、
及び更に好ましくは少なくとも約９５％の、しかし１００％以下の、隣接してい
るヌクレオチド配列の相同性又は同一性を、本発明の融合ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列又は細胞毒性因子をコードするＤＮＡに対して有する。例
えば、融合ポリペプチドをコードする核酸分子の変異体が、少なくとも８０％、
好ましくは少なくとも約９０％、及び更に好ましくは少なくとも９５％の、しか
し１００％以下の、隣接したヌクレオチドの配列相同性又は同一性を、配列番号
１を含んで成るヌクレオチド配列に対して有する。更に、本発明の変異体核酸分
子は、相当する非変異体核酸分子に存在しないヌクレオチド塩基、及び相当する
野生型核酸分子と比較したときの内部欠失を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の融合ポリペプチドの、単離された“変異体”は、少なくとも約５０％
、好ましくは少なくとも約８０％、及び更に好ましくは少なくとも９０％の、し
かし１００％以下の隣接したアミノ酸配列の相同性又は同一性を、配列番号１に
よってコードされるアミノ酸配列に対して有するポリペプチドである。例えば、
前記変異体は、前記の相当する非変異体ポリペプチド、例えば配列番号１にコー
ドされるポリペプチドの少なくとも約１０％の生物学的活性、例えばＣＤ３８へ
の結合活性を有することが好ましい。保存アミノ酸置換は、例えば酸性アミノ酸
としてアスパラギン酸−グルタミン酸；塩基性アミノ酸としてリジン／アルギニ
ン／ヒスチジン；疎水性アミノ酸としてロイシン／イソロイシン、メチオニン／
バリン、アラニン／バリン；親水性アミノ酸としてセリン／グリシン／アラニン
／スレオニンであることが好ましい。本発明はまた、非保存的置換を有するポリ
ペプチド又はペプチドを記載している。非保存的置換は、別のもののために上文
に記載したクラスのうちの１つのメンバーを交換することを必要とする。前記の
置換が導入された後、前記の変異体は生物学的活性をスクリーニングされる。
、好ましくは少なくとも約８０％、及び更に好ましくは少なくとも９０％の、し
かし１００％以下の隣接したアミノ酸配列の相同性又は同一性を、配列番号１に
よってコードされるアミノ酸配列に対して有するポリペプチドである。例えば、
前記変異体は、前記の相当する非変異体ポリペプチド、例えば配列番号１にコー
ドされるポリペプチドの少なくとも約１０％の生物学的活性、例えばＣＤ３８へ
の結合活性を有することが好ましい。保存アミノ酸置換は、例えば酸性アミノ酸
としてアスパラギン酸−グルタミン酸；塩基性アミノ酸としてリジン／アルギニ
ン／ヒスチジン；疎水性アミノ酸としてロイシン／イソロイシン、メチオニン／
バリン、アラニン／バリン；親水性アミノ酸としてセリン／グリシン／アラニン
／スレオニンであることが好ましい。本発明はまた、非保存的置換を有するポリ
ペプチド又はペプチドを記載している。非保存的置換は、別のもののために上文
に記載したクラスのうちの１つのメンバーを交換することを必要とする。前記の
置換が導入された後、前記の変異体は生物学的活性をスクリーニングされる。
【００２０】
“単離した”又は“実質的に精製した”の用語は、本発明の組換えによって製
造したポリペプチド、又は細胞毒性因子をコードするＤＮＡを言及するとき、本
質的に他の細胞性成分を含まない化学的組成物を意味する。その様な組成物は、
好ましくは均一な状態にあるが、それは乾燥又は水性の溶液に存在していてもよ
い。精製度及び等質性は、典型的に分析的な化学技術、例えばポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィー（ポリペプチド用）、あるい
はＡ260 ／Ａ280 比（核酸用）を用いて決定される。調製物中に存在する支配的
な種であるポリペプチドは実質的に精製される。一般に、実質的に精製し又は単
離したポリペプチド又は核酸分子は、調製物中に存在する全ての高分子の種のう
ち８０％以上を含んで成る。好ましくは、前記のポリペプチド又は核酸分子は、
存在する全ての高分子の種の９０％以上に相当するまで精製される。更に好まし
くは、前記のポリペプチド又は核酸分子は、９５％以上に精製され、そして最も
好ましくは前記のポリペプチド又は核酸分子は、本質的に均一になるまで精製さ
れ、ここで他の高分子の種は従来技術によって検出されない。
造したポリペプチド、又は細胞毒性因子をコードするＤＮＡを言及するとき、本
質的に他の細胞性成分を含まない化学的組成物を意味する。その様な組成物は、
好ましくは均一な状態にあるが、それは乾燥又は水性の溶液に存在していてもよ
い。精製度及び等質性は、典型的に分析的な化学技術、例えばポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィー（ポリペプチド用）、あるい
はＡ260 ／Ａ280 比（核酸用）を用いて決定される。調製物中に存在する支配的
な種であるポリペプチドは実質的に精製される。一般に、実質的に精製し又は単
離したポリペプチド又は核酸分子は、調製物中に存在する全ての高分子の種のう
ち８０％以上を含んで成る。好ましくは、前記のポリペプチド又は核酸分子は、
存在する全ての高分子の種の９０％以上に相当するまで精製される。更に好まし
くは、前記のポリペプチド又は核酸分子は、９５％以上に精製され、そして最も
好ましくは前記のポリペプチド又は核酸分子は、本質的に均一になるまで精製さ
れ、ここで他の高分子の種は従来技術によって検出されない。
【００２１】
本明細書で使用する場合、“リガンド”又は“結合部分”は、“標的”分子と
反応するか、又は他の方法でそれを認識し、そして特異的に結合することができ
る分子である。リガンド及びそれら各自の標的分子は、対になる種を表わす。典
型的な対になる種は、限定しないが、酵素／基質、受容体／作用薬、抗体／抗原
、及びレクチン／炭水化物を含む。リガンドとその標的との間の結合は、共有又
は非共有の相互作用、あるいは共有及び非共有の相互作用の組合わせによって媒
介されてもよい。２つの種の相互作用が非共有結合の複合体を生成するとき、発
生する結合は典型的に静電的な、水素結合、又は親水性／親油性の相互作用によ
るものである。従って、“特異的結合”は、リガンドとその標的分子との間に、
抗体／抗原又は酵素／基質の相互作用の特性を有する、結合複合体を生成する相
互作用が存在する場合に生じる。具体的に、リガンドの例は、限定しないが、抗
体、リンホカイン、サイトカイン、受容体タンパク質、例えばＣＤ３８、溶解し
た受容体タンパク質、例えば可溶性ＣＤ３８、ホルモン、増殖因子などを含み、
これらは特異的に所望の標的細胞に結合する。
反応するか、又は他の方法でそれを認識し、そして特異的に結合することができ
る分子である。リガンド及びそれら各自の標的分子は、対になる種を表わす。典
型的な対になる種は、限定しないが、酵素／基質、受容体／作用薬、抗体／抗原
、及びレクチン／炭水化物を含む。リガンドとその標的との間の結合は、共有又
は非共有の相互作用、あるいは共有及び非共有の相互作用の組合わせによって媒
介されてもよい。２つの種の相互作用が非共有結合の複合体を生成するとき、発
生する結合は典型的に静電的な、水素結合、又は親水性／親油性の相互作用によ
るものである。従って、“特異的結合”は、リガンドとその標的分子との間に、
抗体／抗原又は酵素／基質の相互作用の特性を有する、結合複合体を生成する相
互作用が存在する場合に生じる。具体的に、リガンドの例は、限定しないが、抗
体、リンホカイン、サイトカイン、受容体タンパク質、例えばＣＤ３８、溶解し
た受容体タンパク質、例えば可溶性ＣＤ３８、ホルモン、増殖因子などを含み、
これらは特異的に所望の標的細胞に結合する。
【００２２】
“結合特異性”、又は“特異的に免疫反応性がある”の句は、不均一な集団の
タンパク質及び他の生物学的製剤の存在下で、タンパク質の存在の決定要因であ
る結合反応を意味する。従って、特定の条件下で、本発明の融合ポリペプチドは
、特定のタンパク質、すなわちＣＤ３８に結合し、そして試料中に存在する他の
タンパク質又は炭水化物に、有意な量で結合しない。ＣＤ３８への特異的結合は
、その様な条件下で、特定のタンパク質又は炭水化物への、その特異性で選択さ
れる抗体を必要としてもよい。様々なイムノアッセイの型は、特定のタンパク質
又は炭水化物と特異的に免疫反応性がある抗体を選択するために使用することが
ある。例えば、固層ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質又は炭水化物と特
異的に免疫反応性がある抗体を選択するために慣例通りに使用される。特異的な
免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイの型及び条件
の記載のために、Harlow and Lane (1998) Antibodies, Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor Publications, New Yorkを参照のこと。
タンパク質及び他の生物学的製剤の存在下で、タンパク質の存在の決定要因であ
る結合反応を意味する。従って、特定の条件下で、本発明の融合ポリペプチドは
、特定のタンパク質、すなわちＣＤ３８に結合し、そして試料中に存在する他の
タンパク質又は炭水化物に、有意な量で結合しない。ＣＤ３８への特異的結合は
、その様な条件下で、特定のタンパク質又は炭水化物への、その特異性で選択さ
れる抗体を必要としてもよい。様々なイムノアッセイの型は、特定のタンパク質
又は炭水化物と特異的に免疫反応性がある抗体を選択するために使用することが
ある。例えば、固層ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質又は炭水化物と特
異的に免疫反応性がある抗体を選択するために慣例通りに使用される。特異的な
免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイの型及び条件
の記載のために、Harlow and Lane (1998) Antibodies, Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor Publications, New Yorkを参照のこと。
【００２３】
“組換えＤＮＡ”、“組換え核酸”又は“組換えによって製造したＤＮＡ”の
用語は、その天然の又は内因性の供給源から単離され、そして化学的又は酵素的
に、天然の隣接しているか又は内部のヌクレオチドを挿入、欠失又は変更するこ
とで修飾されたＤＮＡを意味する。隣接しているヌクレオチドは上述したヌクレ
オチドの配列又は副配列から上流又は下流にあるヌクレオチドであり、一方、内
部のヌクレオチドは所望の配列又は副配列の中に生じるヌクレオチドである。
用語は、その天然の又は内因性の供給源から単離され、そして化学的又は酵素的
に、天然の隣接しているか又は内部のヌクレオチドを挿入、欠失又は変更するこ
とで修飾されたＤＮＡを意味する。隣接しているヌクレオチドは上述したヌクレ
オチドの配列又は副配列から上流又は下流にあるヌクレオチドであり、一方、内
部のヌクレオチドは所望の配列又は副配列の中に生じるヌクレオチドである。
【００２４】
本明細書で使用する“標識抗体”の用語は、標識の存在の検出（例えば、生物
学的試料への結合）が前記の抗体の存在を示す様な、標識に結合した抗体を意味
する。
学的試料への結合）が前記の抗体の存在を示す様な、標識に結合した抗体を意味
する。
【００２５】
“細胞毒性因子”は、細胞と接触したときに、その細胞の死をもたらす分子を
意味する。本発明の細胞毒性因子は、限定しないが、細菌又は植物の毒素の様な
因子、薬剤、例えばシクロホスファミド（ＣＴＸ；サイトキサン）、クロラムブ
シル（ＣＨＬ；ロイケラン）、シスプラチン（ＣｉｓＰ；ＣＤＤＰ；プラチノー
ル）、ブスルファン（ミレラン）、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、
ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣ、及
び他のアルキル化剤；メトトレキサート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ−１６；
ベペシド）、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、
シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ダカルバジン（
ＤＴＩＣ）、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣｄＡ）、及び他の抗代謝物
質；アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；アドリアマイシン）、ダウ
ノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンを含む抗生物
質、及び他の抗生物質；アルカロイド、例えばビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビン
ブラスチンなど；並びに静細胞因子の糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン
（ＤＥＸ；デカドロン）及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾンを含む抗
ガン剤、ヌクレオチド酵素阻害剤、例えばヒドロキシウレアなどを含む。上文の
抗ガン剤の合成及び調製は公知であり、様々な情報源に記載されており、そして
それ故に本明細書では繰り返さないだろう。抗ガン剤の合成及び調製のための例
示的な情報源は、Physician's Desk Reference, Barnhart, eds., Medical Econ
omics Company, Inc., Oradell, New Jersey, 1992, Merck Index, 11th Editio
n, Merck & Co., 1989を含む。
意味する。本発明の細胞毒性因子は、限定しないが、細菌又は植物の毒素の様な
因子、薬剤、例えばシクロホスファミド（ＣＴＸ；サイトキサン）、クロラムブ
シル（ＣＨＬ；ロイケラン）、シスプラチン（ＣｉｓＰ；ＣＤＤＰ；プラチノー
ル）、ブスルファン（ミレラン）、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、
ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣ、及
び他のアルキル化剤；メトトレキサート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ−１６；
ベペシド）、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、
シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ダカルバジン（
ＤＴＩＣ）、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣｄＡ）、及び他の抗代謝物
質；アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；アドリアマイシン）、ダウ
ノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンを含む抗生物
質、及び他の抗生物質；アルカロイド、例えばビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビン
ブラスチンなど；並びに静細胞因子の糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン
（ＤＥＸ；デカドロン）及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾンを含む抗
ガン剤、ヌクレオチド酵素阻害剤、例えばヒドロキシウレアなどを含む。上文の
抗ガン剤の合成及び調製は公知であり、様々な情報源に記載されており、そして
それ故に本明細書では繰り返さないだろう。抗ガン剤の合成及び調製のための例
示的な情報源は、Physician's Desk Reference, Barnhart, eds., Medical Econ
omics Company, Inc., Oradell, New Jersey, 1992, Merck Index, 11th Editio
n, Merck & Co., 1989を含む。
【００２６】
細胞毒性因子をコードするＤＮＡ分子が本発明の治療用組成物中に存在する場
合、前記のＤＮＡは好ましくは細菌又は植物の毒素であるポリペプチドをコード
する。これらのポリペプチドは、限定しないが、例えば天然又は修飾のシュード
モナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン、アブリン、ゲロニン
、モモルジンII、細菌性ＲＩＰ、例えばシガ毒素（Shiga)及びシガ毒素様毒素の
ａ鎖、ルフィン（luffin）[Islam et al., Agricultural Biological Chem., 54 (5) : 1343-1345 (199 ）を参照のこと］、アトリコサンシン（atrichosanthi
n）[Chow et al., J. Biol. Chem., 265 : 8670-8674 (1990)を参照のこと］、
モモルジンI［Ho et al., BBA, 1088 : 311-314 (1991)を参照のこと］、ミラビ
リス（Mirabilis)の抗ウィルス性タンパク質［Habuka et al., J. Biol. Chem.,
264 (12) : 6629-6637 (1989)を参照のこと］、アメリカヤマゴボウの抗ウィル
ス性タンパク質［Kung et al., Agric. Biol. Chem., 54 (12) : 3301-3318 (19
90）を参照のこと］、バイオジン（biodin）２（米国特許第５，５９７，５６９
号）、サポリン（Saporin)［Benatti et al., Eur. J. Biochem., 183 : 465-47
0 (1989)を参照のこと］の様なポリペプチド、及び遺伝子操作したその変異体を
含む。天然のＰＥ及びＤＴは高度に毒性のある化合物であり、典型的に肝臓毒性
を通じて死をもたらす。好ましくは、ＰＥ及びＤＴは前記毒素の天然の標的成分
、例えばＰＥのドメインＩａ及びＤＴのＢ鎖を除去する形態に修飾される。当業
者は、本発明が特定の細胞毒性因子に限定されないことを理解するだろう。
合、前記のＤＮＡは好ましくは細菌又は植物の毒素であるポリペプチドをコード
する。これらのポリペプチドは、限定しないが、例えば天然又は修飾のシュード
モナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン、アブリン、ゲロニン
、モモルジンII、細菌性ＲＩＰ、例えばシガ毒素（Shiga)及びシガ毒素様毒素の
ａ鎖、ルフィン（luffin）[Islam et al., Agricultural Biological Chem., 54 (5) : 1343-1345 (199 ）を参照のこと］、アトリコサンシン（atrichosanthi
n）[Chow et al., J. Biol. Chem., 265 : 8670-8674 (1990)を参照のこと］、
モモルジンI［Ho et al., BBA, 1088 : 311-314 (1991)を参照のこと］、ミラビ
リス（Mirabilis)の抗ウィルス性タンパク質［Habuka et al., J. Biol. Chem.,
264 (12) : 6629-6637 (1989)を参照のこと］、アメリカヤマゴボウの抗ウィル
ス性タンパク質［Kung et al., Agric. Biol. Chem., 54 (12) : 3301-3318 (19
90）を参照のこと］、バイオジン（biodin）２（米国特許第５，５９７，５６９
号）、サポリン（Saporin)［Benatti et al., Eur. J. Biochem., 183 : 465-47
0 (1989)を参照のこと］の様なポリペプチド、及び遺伝子操作したその変異体を
含む。天然のＰＥ及びＤＴは高度に毒性のある化合物であり、典型的に肝臓毒性
を通じて死をもたらす。好ましくは、ＰＥ及びＤＴは前記毒素の天然の標的成分
、例えばＰＥのドメインＩａ及びＤＴのＢ鎖を除去する形態に修飾される。当業
者は、本発明が特定の細胞毒性因子に限定されないことを理解するだろう。
【００２７】
“シュードモナス外毒素”（ＰＥ）の用語が本明細書で使用される場合、完全
長の天然の（自然に発生した）ＰＥ又は修飾されたＰＥを意味する。その様な修
飾は、限定されないが、ドメインＩａの除去、ドメインII及びIII の様々なアミ
ノ酸の欠失、一アミノ酸置換（例えば、５９０及び６０６位でのＧｌｎによるＬ
ｙｓの置換）、並びにカルボキシル末端での１又は複数の配列の付加を含めても
よい。Siegall et al., J. Biol. Chem., 264 : 14256-14261 (1989)を参照のこ
と。従って、例えばＰＥ３８はアミノ酸２５３〜３６４及び３８１〜６１３から
成る、短縮されたシュードモナス外毒素を意味する。ＰＥの天然のＣ末端、ＲＥ
ＤＬＫ（残基６０９〜６１３）は、配列ＫＤＥＬ，ＲＥＤＬで置換されていても
よく、そしてＬｙｓ５９０及びＬｙｓ６０６は、それぞれＧｌｎに変異していて
もよい。
長の天然の（自然に発生した）ＰＥ又は修飾されたＰＥを意味する。その様な修
飾は、限定されないが、ドメインＩａの除去、ドメインII及びIII の様々なアミ
ノ酸の欠失、一アミノ酸置換（例えば、５９０及び６０６位でのＧｌｎによるＬ
ｙｓの置換）、並びにカルボキシル末端での１又は複数の配列の付加を含めても
よい。Siegall et al., J. Biol. Chem., 264 : 14256-14261 (1989)を参照のこ
と。従って、例えばＰＥ３８はアミノ酸２５３〜３６４及び３８１〜６１３から
成る、短縮されたシュードモナス外毒素を意味する。ＰＥの天然のＣ末端、ＲＥ
ＤＬＫ（残基６０９〜６１３）は、配列ＫＤＥＬ，ＲＥＤＬで置換されていても
よく、そしてＬｙｓ５９０及びＬｙｓ６０６は、それぞれＧｌｎに変異していて
もよい。
【００２８】
“ジフテリア毒素”（ＤＴ）の用語は、本明細書で使用する場合、完全長の天
然のＤＴ又は修飾されたＤＴを意味する。修飾は、典型的にＢ鎖の標的ドメイン
の除去を含み、そして更に具体的に、Ｂ鎖のカルボキシル領域の短縮を含む。
然のＤＴ又は修飾されたＤＴを意味する。修飾は、典型的にＢ鎖の標的ドメイン
の除去を含み、そして更に具体的に、Ｂ鎖のカルボキシル領域の短縮を含む。
【００２９】
Ｉ．ＣＤ３８結合部分
好ましいＣＤ３８結合部分は、ＣＤ３８への結合親和性を有するとして定義さ
れるポリペプチド又は化合物である。更に好ましいＣＤ３８結合部分は、抗ＣＤ
３８抗体（天然又は組換えであって、いずれかの供給源に由来するもの）、例え
ばＴＨＢ７，ＡＴ／３１５、及びそのフラグメントである。
れるポリペプチド又は化合物である。更に好ましいＣＤ３８結合部分は、抗ＣＤ
３８抗体（天然又は組換えであって、いずれかの供給源に由来するもの）、例え
ばＴＨＢ７，ＡＴ／３１５、及びそのフラグメントである。
【００３０】
本明細書で使用する場合、“抗体”の用語は、実質的に免疫グロブリン遺伝子
又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントでコードされる１又は複数のポリペプ
チドから成るタンパク質を意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ，
λ，α，γ，Δ，ε及びμの定常領域遺伝子、並びに種々の免疫グロブリン可変
領域遺伝子を含む。軽鎖はκ又はλのいずれかに分類される。重鎖はγ，μ，α
，Δ又はεに分類され、これらは順に免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ，ＩｇＭ
，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥとしてそれぞれ分類される。
又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントでコードされる１又は複数のポリペプ
チドから成るタンパク質を意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ，
λ，α，γ，Δ，ε及びμの定常領域遺伝子、並びに種々の免疫グロブリン可変
領域遺伝子を含む。軽鎖はκ又はλのいずれかに分類される。重鎖はγ，μ，α
，Δ又はεに分類され、これらは順に免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ，ＩｇＭ
，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥとしてそれぞれ分類される。
【００３１】
基本的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含んで成ることが知ら
れている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一な対から成り、各対は１つ
の“軽鎖”（約２５kD）及び１つの“重鎖”（約５０〜７０kD）を有している。
各鎖のＮ末端は、重に抗原の認識に重要な、約１００〜１１０又はそれ以上のア
ミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶL ）及び可変重鎖（ＶH ）の用語は
、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ意味する。
れている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一な対から成り、各対は１つ
の“軽鎖”（約２５kD）及び１つの“重鎖”（約５０〜７０kD）を有している。
各鎖のＮ末端は、重に抗原の認識に重要な、約１００〜１１０又はそれ以上のア
ミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶL ）及び可変重鎖（ＶH ）の用語は
、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ意味する。
【００３２】
抗体は完全な免疫グロブリンとして、あるいは、例えばＦａｂＦｃ2 ，Ｆａｂ
，Ｆｖ，Ｆｄ，（Ｆａｂ′）2 、軽鎖及び重鎖の可変領域のみを含むＦｖフラグ
メント、可変領域及び定常領域の一部を含むＦａｂ又は（Ｆａｂ）′2 フラグメ
ント、一本鎖抗体（Bird et al., Science, 242 : 424-426 (1988) ; Huston et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 5879-5883 (1998)。両者は、引用に
よって本明細書に組入れられる）、ＣＤＲ移植抗体などを含む、様々な形態にお
ける修飾体として存在していてもよい。Ｆｖの重鎖及び軽鎖は、同一の抗体、又
はキメラＦｖ領域を製造することによる異なる抗体に由来していてもよい。前記
抗体は、動物（特にマウス若しくはラット）又はヒト起源のものであってもよく
、あるいはキメラ（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-
6855 (1984）。これは、引用によって本明細書に組入れられる）、又はヒト化し
たもの（Jones et al., Nature, 321, 522-525 (1986）、及び英国特許出願公開
第８７０７２５２号。両者は引用によって本明細書に組入れられる）であっても
よい。本明細書で使用する場合、“抗体”の用語は、これらの様々な形態を含む
。本明細書で提供する案内並びに上述した引用及びHarlow & Lane, Antibodies : a Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)の様な刊行物
に記載されている、当業者に公知のそれらの方法を用いることによって、本発明
の抗体を直ちに製造することができる。
，Ｆｖ，Ｆｄ，（Ｆａｂ′）2 、軽鎖及び重鎖の可変領域のみを含むＦｖフラグ
メント、可変領域及び定常領域の一部を含むＦａｂ又は（Ｆａｂ）′2 フラグメ
ント、一本鎖抗体（Bird et al., Science, 242 : 424-426 (1988) ; Huston et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 5879-5883 (1998)。両者は、引用に
よって本明細書に組入れられる）、ＣＤＲ移植抗体などを含む、様々な形態にお
ける修飾体として存在していてもよい。Ｆｖの重鎖及び軽鎖は、同一の抗体、又
はキメラＦｖ領域を製造することによる異なる抗体に由来していてもよい。前記
抗体は、動物（特にマウス若しくはラット）又はヒト起源のものであってもよく
、あるいはキメラ（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-
6855 (1984）。これは、引用によって本明細書に組入れられる）、又はヒト化し
たもの（Jones et al., Nature, 321, 522-525 (1986）、及び英国特許出願公開
第８７０７２５２号。両者は引用によって本明細書に組入れられる）であっても
よい。本明細書で使用する場合、“抗体”の用語は、これらの様々な形態を含む
。本明細書で提供する案内並びに上述した引用及びHarlow & Lane, Antibodies : a Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)の様な刊行物
に記載されている、当業者に公知のそれらの方法を用いることによって、本発明
の抗体を直ちに製造することができる。
【００３３】
ＣＤ３８結合抗体は可変軽鎖（ＶL ）及び可変重鎖（ＶH ）を含んで成るＦｖ
領域であってもよい。前記の軽鎖及び重鎖は直接的に、又はリンカーを通じて連
結していてもよい。本明細書で使用する場合、リンカーは、前記の軽鎖及び重鎖
に共有結合し、そして十分な空間及び自由度を前記の２つの鎖の間に提供する分
子を意味し、その結果、それらはそれらが向かうエピトープに特異的に結合する
配置を達成することができる。タンパク質リンカーが特に好ましいのは、それら
が前記融合ポリペプチドのＩｇ部分の固有成分として発現することができる場合
である。
領域であってもよい。前記の軽鎖及び重鎖は直接的に、又はリンカーを通じて連
結していてもよい。本明細書で使用する場合、リンカーは、前記の軽鎖及び重鎖
に共有結合し、そして十分な空間及び自由度を前記の２つの鎖の間に提供する分
子を意味し、その結果、それらはそれらが向かうエピトープに特異的に結合する
配置を達成することができる。タンパク質リンカーが特に好ましいのは、それら
が前記融合ポリペプチドのＩｇ部分の固有成分として発現することができる場合
である。
【００３４】
本発明の好ましい態様は、ＶH 及びＣH 、又はその一部を含んで成る、組換え
によって製造され、ＤＮＡ結合ポリペプチドに連結する抗体を含んで成る融合ポ
リペプチドである。前記の融合ポリペプチド並びにＶL 及びＣL 、又はその一部
を含んで成る抗体は一緒に、直鎖又は環状のあらかじめ選択したＤＮＡ分子を、
あらかじめ選択した標的分子を産生する細胞又は組織に向かわせるのに有用な組
換え抗体を形成する。
によって製造され、ＤＮＡ結合ポリペプチドに連結する抗体を含んで成る融合ポ
リペプチドである。前記の融合ポリペプチド並びにＶL 及びＣL 、又はその一部
を含んで成る抗体は一緒に、直鎖又は環状のあらかじめ選択したＤＮＡ分子を、
あらかじめ選択した標的分子を産生する細胞又は組織に向かわせるのに有用な組
換え抗体を形成する。
【００３５】
本発明の別の好ましい態様は、組換えによって製造した一本鎖のｓｃＦｖ抗体
、好ましくはヒト化ｓｃＦｖである。特に、この発明はＤＮＡ結合ポリペプチド
に連結する組換え一本鎖抗体を提供し、そしてＤＮＡに特異的に結合するそれら
の能力のために、これらの抗体は、ＤＮＡ結合ポリペプチドに結合するＤＮＡを
、あらかじめ選択した標的分子、すなわちＣＤ３８を産生する細胞又は組織に向
かわせる標的部分として有用である。
、好ましくはヒト化ｓｃＦｖである。特に、この発明はＤＮＡ結合ポリペプチド
に連結する組換え一本鎖抗体を提供し、そしてＤＮＡに特異的に結合するそれら
の能力のために、これらの抗体は、ＤＮＡ結合ポリペプチドに結合するＤＮＡを
、あらかじめ選択した標的分子、すなわちＣＤ３８を産生する細胞又は組織に向
かわせる標的部分として有用である。
【００３６】
本発明の組換え一本鎖抗体は、当業者に知られ、そして利用可能ないずれかの
方法によって前記のＤＮＡ結合ポリペプチド及び、任意に放射性核種又は上述し
た活性を有する他の分子に融合するか、あるいは他の方法で結合することができ
る。前記の２つの成分は、様々な公知の化学的手法のいずれかによって、共に化
学的に結合することができる。例えば、前記の連結は異種の二機能的架橋、例え
ばＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによるものであってもよ
い。様々な免疫毒素の製造、及び化学的抱合法は当業界で公知であり、そして例
えば“Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates : Aiming The Magic Bullet,”T
horpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press
, pp. 168-190 (1982) ; Waldmann, Science, 252 : 1657 (1991) ; Vitetta et
al., 1987, Science, 238 : 1098 ; Pastan et al., 1986 ; Cell, 47 : 641；
及びThorpe et al., 1987, Cancer Res., 47 : 5924において見出すことができ
、これらは引用によって本明細書に組入れられる。これらの方法は、一般に前記
のＤＮＡ結合ポリペプチドと前記抗体を、前記の２つのポリペプチド間にジスル
フィド結合を導入する架橋剤によって抱合させる。還元不可能な連結を用いて調
製された免疫毒素は、ジスルフィド結合によって架橋した同様の毒素と比べて、
一貫してほとんど細胞毒性を示さなかった。
方法によって前記のＤＮＡ結合ポリペプチド及び、任意に放射性核種又は上述し
た活性を有する他の分子に融合するか、あるいは他の方法で結合することができ
る。前記の２つの成分は、様々な公知の化学的手法のいずれかによって、共に化
学的に結合することができる。例えば、前記の連結は異種の二機能的架橋、例え
ばＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによるものであってもよ
い。様々な免疫毒素の製造、及び化学的抱合法は当業界で公知であり、そして例
えば“Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates : Aiming The Magic Bullet,”T
horpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press
, pp. 168-190 (1982) ; Waldmann, Science, 252 : 1657 (1991) ; Vitetta et
al., 1987, Science, 238 : 1098 ; Pastan et al., 1986 ; Cell, 47 : 641；
及びThorpe et al., 1987, Cancer Res., 47 : 5924において見出すことができ
、これらは引用によって本明細書に組入れられる。これらの方法は、一般に前記
のＤＮＡ結合ポリペプチドと前記抗体を、前記の２つのポリペプチド間にジスル
フィド結合を導入する架橋剤によって抱合させる。還元不可能な連結を用いて調
製された免疫毒素は、ジスルフィド結合によって架橋した同様の毒素と比べて、
一貫してほとんど細胞毒性を示さなかった。
【００３７】
他の好ましい試薬は、２−イミノチオラン塩酸塩（２ＩＴ）、ナトリウムＳ−
４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオ硫酸塩（ＳＭ
ＢＴ）及び２ＩＴ又はスクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２
−ピリジルジチオ）−トルエン及び２ＩＴである。各群の試薬は、ジスルフィド
結合を前記のＤＮＡ結合ポリペプチドと前記抗体との間に導入し、ここでこれら
は還元可能であるが、前記の結合はまた、分解に対して耐性があり、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで前記の抱合体の安定性を提供する。リソソーム又は
エンドソームへの前記の標的細胞による取込みによって、前記の結合は還元され
る。例えば、前記の組換えＰＥ分子を抗体と一緒に使用するために、アミノ酸２
８７位のシステインを有するＰＥ分子の形態が、前記の毒素を前記抗体又は他の
リガンドに、システインのチオール部分を通して会合させるのに好ましい。
４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオ硫酸塩（ＳＭ
ＢＴ）及び２ＩＴ又はスクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２
−ピリジルジチオ）−トルエン及び２ＩＴである。各群の試薬は、ジスルフィド
結合を前記のＤＮＡ結合ポリペプチドと前記抗体との間に導入し、ここでこれら
は還元可能であるが、前記の結合はまた、分解に対して耐性があり、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで前記の抱合体の安定性を提供する。リソソーム又は
エンドソームへの前記の標的細胞による取込みによって、前記の結合は還元され
る。例えば、前記の組換えＰＥ分子を抗体と一緒に使用するために、アミノ酸２
８７位のシステインを有するＰＥ分子の形態が、前記の毒素を前記抗体又は他の
リガンドに、システインのチオール部分を通して会合させるのに好ましい。
【００３８】
好ましい態様において、前記のＣＤ３８結合部分はまた、組換え的手段によっ
て、例えば前記抗体及びＤＮＡ結合ポリペプチドの両方をコードする核酸を製造
するための組換えＤＮＡ技術の使用を通じて、ＤＮＡ結合ポリペプチドに融合し
、そして組換えＤＮＡ配列を宿主細胞、例えば真核細胞、例えば哺乳類、例えば
ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞、あるいは原核細胞、例えばＥ．コリ（coli）宿主で発現
することができる。前記の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを、ｃＤＮＡ又
はゲノムの形態において、当業者に知られている、いずれかのクローニング方法
によってクローン化することができる。例えば、引用によって本明細書に組入れ
られる、Sambrook et al., Molecular Cloning : a Laboratory Manual, Cold S
pring Harbor Laboratory, (1989）を参照のこと。
て、例えば前記抗体及びＤＮＡ結合ポリペプチドの両方をコードする核酸を製造
するための組換えＤＮＡ技術の使用を通じて、ＤＮＡ結合ポリペプチドに融合し
、そして組換えＤＮＡ配列を宿主細胞、例えば真核細胞、例えば哺乳類、例えば
ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞、あるいは原核細胞、例えばＥ．コリ（coli）宿主で発現
することができる。前記の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを、ｃＤＮＡ又
はゲノムの形態において、当業者に知られている、いずれかのクローニング方法
によってクローン化することができる。例えば、引用によって本明細書に組入れ
られる、Sambrook et al., Molecular Cloning : a Laboratory Manual, Cold S
pring Harbor Laboratory, (1989）を参照のこと。
【００３９】
本発明の融合ポリペプチドの、様々な標識への融合又は抱合は、高度に特異的
な検出マーカーを生成し、これは前記の抗体が結合する特定の分子、すなわちＣ
Ｄ３８を有する細胞又は組織が存在しているか又はしていないかを検出するため
に使用することができる。あるいは、前記の融合ポリペプチドは、別の特異的な
結合部分である分子、例えばリガンドに、化学的に抱合するか、又は融合してい
てもよい。この形態において、前記の融合ポリペプチドは、高度に特異的な二機
能的リンカーとして働くことができる。このリンカーは、前記の融合タンパク質
が結合する細胞又は細胞成分との間を結合させ、そしてその相互作用を増強する
ために働くことができる。
な検出マーカーを生成し、これは前記の抗体が結合する特定の分子、すなわちＣ
Ｄ３８を有する細胞又は組織が存在しているか又はしていないかを検出するため
に使用することができる。あるいは、前記の融合ポリペプチドは、別の特異的な
結合部分である分子、例えばリガンドに、化学的に抱合するか、又は融合してい
てもよい。この形態において、前記の融合ポリペプチドは、高度に特異的な二機
能的リンカーとして働くことができる。このリンカーは、前記の融合タンパク質
が結合する細胞又は細胞成分との間を結合させ、そしてその相互作用を増強する
ために働くことができる。
【００４０】
Ａ．抗体又はそのフラグメントをコードする遺伝子の調製
抗体、軽鎖及び重鎖の両方又はその一部、例えば一本鎖のＦｖ領域をコードす
る遺伝子を、ハイブリドーマの細胞系からクローン化することができる。前記の
ものは全て、同一の一般的な戦略を用いてクローン化することができる。典型的
に、例えば前記のハイブリドーマ細胞から抽出されるポリ（Ａ）+ ＲＮＡは、無
作為な六量体をプライマーとして用いて逆転写される。Ｆｖ領域のために、前記
のＶH 及びＶL ドメインは、別々に２つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
って増幅される。重鎖配列は、前記の抗ＣＤ３８の重鎖の、アミノ末端のタンパ
ク質配列にそれぞれ従い設計される５′末端プライマー、及び共通な免疫グロブ
リンの定常領域配列に従う、３′末端プライマーを用いて増幅することができる
（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th edi
tion. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Servic
e, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)。これらは引用によ
って本明細書に組入れられる）。軽鎖のＦｖ領域は、前記の抗ＣＤ３８の軽鎖の
アミノ末端タンパク質配列に従い設計される５′末端プライマー及びプライマー
Ｃ−κとの組合わせを用いて増幅される。当業者は、多くの適当なプライマーが
、Ｆｖ領域を得るために適用されてもよいことを認識するだろう。
る遺伝子を、ハイブリドーマの細胞系からクローン化することができる。前記の
ものは全て、同一の一般的な戦略を用いてクローン化することができる。典型的
に、例えば前記のハイブリドーマ細胞から抽出されるポリ（Ａ）+ ＲＮＡは、無
作為な六量体をプライマーとして用いて逆転写される。Ｆｖ領域のために、前記
のＶH 及びＶL ドメインは、別々に２つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
って増幅される。重鎖配列は、前記の抗ＣＤ３８の重鎖の、アミノ末端のタンパ
ク質配列にそれぞれ従い設計される５′末端プライマー、及び共通な免疫グロブ
リンの定常領域配列に従う、３′末端プライマーを用いて増幅することができる
（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th edi
tion. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Servic
e, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)。これらは引用によ
って本明細書に組入れられる）。軽鎖のＦｖ領域は、前記の抗ＣＤ３８の軽鎖の
アミノ末端タンパク質配列に従い設計される５′末端プライマー及びプライマー
Ｃ−κとの組合わせを用いて増幅される。当業者は、多くの適当なプライマーが
、Ｆｖ領域を得るために適用されてもよいことを認識するだろう。
【００４１】
前記のＰＣＲ生成物は、適当なクローニングベクターにサブクローン化される
。正確なサイズの挿入断片をＤＮＡの制限によって含むクローンが同定される。
次に、前記の重鎖又は軽鎖のコード領域のヌクレオチド配列を、二本鎖のプラス
ミドＤＮＡから、クローニング部位に適当な配列決定プライマーを用いて決定す
ることができる。商業的に入手可能なキット（例えば、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商
標）キット、United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio, USA)を、Ｄ
ＮＡの配列決定を容易にするために使用することができる。
。正確なサイズの挿入断片をＤＮＡの制限によって含むクローンが同定される。
次に、前記の重鎖又は軽鎖のコード領域のヌクレオチド配列を、二本鎖のプラス
ミドＤＮＡから、クローニング部位に適当な配列決定プライマーを用いて決定す
ることができる。商業的に入手可能なキット（例えば、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商
標）キット、United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio, USA)を、Ｄ
ＮＡの配列決定を容易にするために使用することができる。
【００４２】
従って、前記のＦｖ領域をコードするＤＮＡを、いずれかの適当な方法によっ
て調製することができ、それは例えば増幅技術、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣ
Ｒ）（Wu and Wallace, Genomics, ４ : 560 (1989), Landegren, et al., Scie nce , 241 : 1077 (1988)及びBarringer, et al., Gene, 89 : 117 (1990)を参照
のこと）、転写増幅（Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 1173
(1989)を参照のこと）、及び自己維持型配列複製（Guatelli, et al., Proc. Na tl. Acad. Sci. USA , 87 : 1874 (1990)を参照のこと）、適当な配列のクローニ
ング及び制限、又は直接的な化学合成法、例えばホスホトリエステル法（Narang
et al., Meth. Enzymol. 68 : 109-151 (1979))；ジエチルホスホールアミダイ
ト法（Beaucage et al., Tetra. Lett., 22 : 1859-1862 (1981)）；及び固体支
持（solid support)法（米国特許第４，４５８，０６６号）を含んでおり、この
段落のその様な全ての参考文献は、引用によって本明細書に組入れられる。
て調製することができ、それは例えば増幅技術、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣ
Ｒ）（Wu and Wallace, Genomics, ４ : 560 (1989), Landegren, et al., Scie nce , 241 : 1077 (1988)及びBarringer, et al., Gene, 89 : 117 (1990)を参照
のこと）、転写増幅（Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 1173
(1989)を参照のこと）、及び自己維持型配列複製（Guatelli, et al., Proc. Na tl. Acad. Sci. USA , 87 : 1874 (1990)を参照のこと）、適当な配列のクローニ
ング及び制限、又は直接的な化学合成法、例えばホスホトリエステル法（Narang
et al., Meth. Enzymol. 68 : 109-151 (1979))；ジエチルホスホールアミダイ
ト法（Beaucage et al., Tetra. Lett., 22 : 1859-1862 (1981)）；及び固体支
持（solid support)法（米国特許第４，４５８，０６６号）を含んでおり、この
段落のその様な全ての参考文献は、引用によって本明細書に組入れられる。
【００４３】
化学合成は一本鎖のオリゴヌクレオチドを製造する。これを、相補的な配列を
用いるハイブリダイゼーション、又は前記の一本鎖を用いる、ＤＮＡポリメラー
ゼによる多量体化によって二本鎖ＤＮＡに変換することができる。完全な一本鎖
のＦｖ領域を化学合成することが可能であると同時に、その後共にライゲーショ
ンされる、いくつかの短かい配列（約１００〜１５０塩基）を合成することが好
ましい。
用いるハイブリダイゼーション、又は前記の一本鎖を用いる、ＤＮＡポリメラー
ゼによる多量体化によって二本鎖ＤＮＡに変換することができる。完全な一本鎖
のＦｖ領域を化学合成することが可能であると同時に、その後共にライゲーショ
ンされる、いくつかの短かい配列（約１００〜１５０塩基）を合成することが好
ましい。
【００４４】
あるいは、副配列をクローン化し、そして前記の適当な副配列を、適当な制限
酵素を用いて開裂することができる。次に、前記のフラグメントを、所望のＤＮ
Ａ配列を生成するためにライゲーションすることができる。
酵素を用いて開裂することができる。次に、前記のフラグメントを、所望のＤＮ
Ａ配列を生成するためにライゲーションすることができる。
【００４５】
一旦、前記のＦｖ可変軽鎖及び重鎖のＤＮＡが得られれば、前記の配列を、直
接的に又はペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を通じて、当業者に公知の
技術を用いて、一緒にライゲーションすることができる。１つの態様において、
重鎖及び軽鎖領域は、前記の重鎖のＦｖドメインのカルボキシル末端及び前記の
軽鎖のＦｖドメインのアミノ末端で開始する、自由なペプチドリンカー（例えば
Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ）3 ）によって連結する。前記の全配列は、一本鎖の抗原結合タ
ンパク質の形態で、前記のＦｖドメインをコードする。
接的に又はペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を通じて、当業者に公知の
技術を用いて、一緒にライゲーションすることができる。１つの態様において、
重鎖及び軽鎖領域は、前記の重鎖のＦｖドメインのカルボキシル末端及び前記の
軽鎖のＦｖドメインのアミノ末端で開始する、自由なペプチドリンカー（例えば
Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ）3 ）によって連結する。前記の全配列は、一本鎖の抗原結合タ
ンパク質の形態で、前記のＦｖドメインをコードする。
【００４６】
Ｂ．抗体融合ポリペプチドの調製
一旦、ＣＤ３８結合ポリペプチドをコードし、発現したときに、特異的な結合
活性を示すＤＮＡ配列が同定された場合、その領域を含んで成る融合ポリペプチ
ドを、当業者に知られている方法によって調製することができる。従って、前記
のＦｖ領域をコードする遺伝子は、ＤＮＡ結合部分、好ましくはポリペプチドで
ある部分に融合される。任意に、前記のＦｖ遺伝子及びＤＮＡ結合部分の遺伝子
は、ペプチドコネクターをコードするセグメントに連結する。生じた融合ポリペ
プチドはまた、任意に別の分子（例えば放射性核種）に連結することができる。
前記のペプチドコネクターは、単に前記のＣＤ３８標的部分と前記のＤＮＡ結合
部分との間に空間を提供し、そしてこれらの領域の間の移動度を促進し、それら
を各々、それらの至適な配置に到達させることが出来る様に存在していてもよい
。前記のコネクターを含んで成るＤＮＡ配列はまた、クローニングを容易にする
ための配列（例えばプライマー部位又は制限部位）を提供することができ、ある
いは前記の標的部分をコードする配列と、前記のＤＮＡ結合タンパク質をコード
する配列との間の読み枠を保護することができる。その様なコネクターペプチド
の設計は、当業者に公知である。
活性を示すＤＮＡ配列が同定された場合、その領域を含んで成る融合ポリペプチ
ドを、当業者に知られている方法によって調製することができる。従って、前記
のＦｖ領域をコードする遺伝子は、ＤＮＡ結合部分、好ましくはポリペプチドで
ある部分に融合される。任意に、前記のＦｖ遺伝子及びＤＮＡ結合部分の遺伝子
は、ペプチドコネクターをコードするセグメントに連結する。生じた融合ポリペ
プチドはまた、任意に別の分子（例えば放射性核種）に連結することができる。
前記のペプチドコネクターは、単に前記のＣＤ３８標的部分と前記のＤＮＡ結合
部分との間に空間を提供し、そしてこれらの領域の間の移動度を促進し、それら
を各々、それらの至適な配置に到達させることが出来る様に存在していてもよい
。前記のコネクターを含んで成るＤＮＡ配列はまた、クローニングを容易にする
ための配列（例えばプライマー部位又は制限部位）を提供することができ、ある
いは前記の標的部分をコードする配列と、前記のＤＮＡ結合タンパク質をコード
する配列との間の読み枠を保護することができる。その様なコネクターペプチド
の設計は、当業者に公知である。
【００４７】
ポリペプチドの製造及び単離の方法は、当業者に公知である。従って、例えば
、Chaudhary et al., Nature, 339 : 394-97 (1989) ; Batra et al., J. Biol. Chem. , 265 : 15198-15202 (1990) ; Batra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 86 : 8545-8549 (1989) ; Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A , 87 : 1066-1070 (1990)の全てが引用によって本明細書に組入れられ、これら
は様々な一本鎖の抗体ポリペプチドの調製を記載している。
、Chaudhary et al., Nature, 339 : 394-97 (1989) ; Batra et al., J. Biol. Chem. , 265 : 15198-15202 (1990) ; Batra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 86 : 8545-8549 (1989) ; Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A , 87 : 1066-1070 (1990)の全てが引用によって本明細書に組入れられ、これら
は様々な一本鎖の抗体ポリペプチドの調製を記載している。
【００４８】
一般に、融合ポリペプチドの製造は、前記のＦｖ軽鎖及び重鎖、並びにそれら
が融合する、いずれかの他のタンパク質をコードするＤＮＡを別々に調製し、そ
してプラスミド又は他のベクター内の前記ＤＮＡ配列を組換え、特に望ましい融
合ポリペプチドをコードするコンストラクトを形成せしめることを含む。しかし
ながら、より簡単なアプローチは、前記の特定のＦｖ領域をコードするＤＮＡを
、所望の第２のポリペプチドを既にコードしているコンストラクトに挿入するこ
とを含む。前記のＦｖ領域をコードするＤＮＡ配列は、当業者に公知の技術を用
いて、前記のコンストラクトに挿入される。
が融合する、いずれかの他のタンパク質をコードするＤＮＡを別々に調製し、そ
してプラスミド又は他のベクター内の前記ＤＮＡ配列を組換え、特に望ましい融
合ポリペプチドをコードするコンストラクトを形成せしめることを含む。しかし
ながら、より簡単なアプローチは、前記の特定のＦｖ領域をコードするＤＮＡを
、所望の第２のポリペプチドを既にコードしているコンストラクトに挿入するこ
とを含む。前記のＦｖ領域をコードするＤＮＡ配列は、当業者に公知の技術を用
いて、前記のコンストラクトに挿入される。
【００４９】
それぞれのＦｖにとって、前記のＶH 及びＶL 配列は、それらの各プラスミド
における前記の重鎖及び軽鎖を、鋳型として用いてＰＣＲ増幅したものである。
増幅プライマーは、それらの末端で、翻訳開始部位に相補的な配列、ペプチドリ
ンカー及びコネクターを持つように設計され、ここで、これらは一本鎖のＦｖ−
ＤＮＡ結合タンパク質発現ベクターに共通しているものである。前記のＰＣＲ生
成物は精製され、そしてヘルパーファージによるｐＵＣ１７の救出によって調製
したｐＵＣ１７のＤＮＡに相当するウラシル含有一本鎖ＤＮＡにアニールされる
。前記のアニールしたＰＣＲ生成物は、前記の一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて
伸長する（例えば、ＭＵＴＡＧＥＮＥ（商標）の変異プロトコール、Biorad, He
rcules, Calif., USA を参照のこと）。完全なＤＮＡを使用して、細胞を形質転
換し、そして前記の融合ポリペプチドを発現させることができる。
における前記の重鎖及び軽鎖を、鋳型として用いてＰＣＲ増幅したものである。
増幅プライマーは、それらの末端で、翻訳開始部位に相補的な配列、ペプチドリ
ンカー及びコネクターを持つように設計され、ここで、これらは一本鎖のＦｖ−
ＤＮＡ結合タンパク質発現ベクターに共通しているものである。前記のＰＣＲ生
成物は精製され、そしてヘルパーファージによるｐＵＣ１７の救出によって調製
したｐＵＣ１７のＤＮＡに相当するウラシル含有一本鎖ＤＮＡにアニールされる
。前記のアニールしたＰＣＲ生成物は、前記の一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて
伸長する（例えば、ＭＵＴＡＧＥＮＥ（商標）の変異プロトコール、Biorad, He
rcules, Calif., USA を参照のこと）。完全なＤＮＡを使用して、細胞を形質転
換し、そして前記の融合ポリペプチドを発現させることができる。
【００５０】
あるいは、２つのコンストラクトのうち、一方がＶH ＣH 、又はその一部、あ
るいはＤＮＡ結合ポリペプチド融合体をコードし、そして残りがＶK ＣK 、又は
その一部をコードするように調製することができる。両方のコンストラクトでト
ランスフェクションした宿主細胞は、組換えの抗体融合ポリペプチドを発現する
。
るいはＤＮＡ結合ポリペプチド融合体をコードし、そして残りがＶK ＣK 、又は
その一部をコードするように調製することができる。両方のコンストラクトでト
ランスフェクションした宿主細胞は、組換えの抗体融合ポリペプチドを発現する
。
【００５１】
Ｃ．可変ドメインと混合した融合ポリペプチドをコードするＤＮＡの調製
関連しているが異なる抗体に由来する可変重鎖及び軽鎖のドメインを含むキメ
ラＦｖ領域は、前記の重鎖及び軽鎖のドメイン両方が、同一の抗体に由来する場
合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びグｉｎ ｖｉｖｏで、Ｆｖ領域よりも有意に大きい安
定性を示すことがある。キメラＦｖ領域をコードする核酸は、上述した方法を用
いて容易に調製される。前記のＶH 及びＶL 配列は、それらの各プラスミドの、
重鎖及び軽鎖を、上述した様に鋳型として用いてＰＣＲ増幅したものである。し
かしながら、同一の抗体由来のＶH 及びＶL のＤＮＡを用いる代わりに、前記の
ＶH 及びＶL のＤＮＡは異なる抗体から選択される。前記のＤＮＡは、前記のｐ
ＵＣ１７ ＤＮＡに相当するウラシル含有一本鎖ＤＮＡにアニールされ、そして
前記の融合タンパク質のＤＮＡの合成は、上述した様に完了する。
ラＦｖ領域は、前記の重鎖及び軽鎖のドメイン両方が、同一の抗体に由来する場
合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びグｉｎ ｖｉｖｏで、Ｆｖ領域よりも有意に大きい安
定性を示すことがある。キメラＦｖ領域をコードする核酸は、上述した方法を用
いて容易に調製される。前記のＶH 及びＶL 配列は、それらの各プラスミドの、
重鎖及び軽鎖を、上述した様に鋳型として用いてＰＣＲ増幅したものである。し
かしながら、同一の抗体由来のＶH 及びＶL のＤＮＡを用いる代わりに、前記の
ＶH 及びＶL のＤＮＡは異なる抗体から選択される。前記のＤＮＡは、前記のｐ
ＵＣ１７ ＤＮＡに相当するウラシル含有一本鎖ＤＮＡにアニールされ、そして
前記の融合タンパク質のＤＮＡの合成は、上述した様に完了する。
【００５２】
当業者は、前記のＤＮＡ結合部分を除去し、そして前記のＣＤ３８結合部分、
例えばキメラ又は単一の抗体のＦｖ領域を単独で発現させることができることを
理解するだろう。前記のＣＤ３８結合部分は、例えば直接的に、毒素又は他の治
療用因子、治療用因子のための担体、例えばリポソーム、又は様々な標識及びマ
ーカー、例えば蛍光標識との様々な化学的抱合体において使用することができる
。
例えばキメラ又は単一の抗体のＦｖ領域を単独で発現させることができることを
理解するだろう。前記のＣＤ３８結合部分は、例えば直接的に、毒素又は他の治
療用因子、治療用因子のための担体、例えばリポソーム、又は様々な標識及びマ
ーカー、例えば蛍光標識との様々な化学的抱合体において使用することができる
。
【００５３】
Ｄ．ヒト化抗体
モノクローナル抗体がヒト抗体ではないので、標識抗体又は標的部分としてこ
れらの抗体を含むポリペプチドの、いずれかの繰り返しの投与は、投与される非
ヒト抗体への、抗体の形成をもたらすことができる（Parren et al., Hum. Anti bod. Hybridomas , ３ : 137-145 (1992)）。この免疫応答は、いくつかの場合に
長期の治療を除外することができる。従って、ほとんど免疫原性のない分子を製
造することが望ましい。
れらの抗体を含むポリペプチドの、いずれかの繰り返しの投与は、投与される非
ヒト抗体への、抗体の形成をもたらすことができる（Parren et al., Hum. Anti bod. Hybridomas , ３ : 137-145 (1992)）。この免疫応答は、いくつかの場合に
長期の治療を除外することができる。従って、ほとんど免疫原性のない分子を製
造することが望ましい。
【００５４】
ほとんど免疫原性のない分子の製造における最初の段階として、非ヒト、例え
ばマウスの抗体のＦｖ部分は、本発明の融合タンパク質のマウス抗体のＦｖ部分
を置換して使用することができる様にヒト化される。ヒト化抗体は、いくつか又
は全てのアミノ酸残基が、同類のヒト抗体において見出される相当するアミノ酸
残基で置換される非ヒト抗体である。ヒト化によって、前記抗体の抗原性の潜在
能力が低下する。
ばマウスの抗体のＦｖ部分は、本発明の融合タンパク質のマウス抗体のＦｖ部分
を置換して使用することができる様にヒト化される。ヒト化抗体は、いくつか又
は全てのアミノ酸残基が、同類のヒト抗体において見出される相当するアミノ酸
残基で置換される非ヒト抗体である。ヒト化によって、前記抗体の抗原性の潜在
能力が低下する。
【００５５】
抗体の可変ドメインは様々な方法でヒト化されてきており、例えばＣＤＲ移植
（Riechmann et al., Nature, 332 : 323-327 (1988)）、暴露されている残基の
置換（Padlan, Mol. Immunol., 28 : 489-498 (1991)）及び可変ドメインの再表
面形成（Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 : 963-973 (1994))
であり、これらは全て、引用によって本明細書に組入れられる。再表面形成を最
低限に抑える試みは、最大の抗原結合親和性を維持するための、いくつかのマウ
スの骨格残基の保存を必要とする、抗体の可変ドメインに特に適している。しか
しながら、直接的なＣＤＲ移植の試みもまた、前記のマウスの骨格残基を全く保
存していないか（Jones et al., Nature, 321 : 522-525 (1986)及びVerhoeyen
et al., Science, 239 : 1534-1536 (1988))又は１若しくは２つのマウスの残基
のみを保存している（Riechmann et al., Nature, 332 : 323-327 (1988) ; Que
en et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 10029-10033 (1989)）、いくつ
かの抗体のヒト化のために好結果で使用されてきた（ここで、全ての参考文献が
引用によって本明細書に組入れられる）。
（Riechmann et al., Nature, 332 : 323-327 (1988)）、暴露されている残基の
置換（Padlan, Mol. Immunol., 28 : 489-498 (1991)）及び可変ドメインの再表
面形成（Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 : 963-973 (1994))
であり、これらは全て、引用によって本明細書に組入れられる。再表面形成を最
低限に抑える試みは、最大の抗原結合親和性を維持するための、いくつかのマウ
スの骨格残基の保存を必要とする、抗体の可変ドメインに特に適している。しか
しながら、直接的なＣＤＲ移植の試みもまた、前記のマウスの骨格残基を全く保
存していないか（Jones et al., Nature, 321 : 522-525 (1986)及びVerhoeyen
et al., Science, 239 : 1534-1536 (1988))又は１若しくは２つのマウスの残基
のみを保存している（Riechmann et al., Nature, 332 : 323-327 (1988) ; Que
en et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 10029-10033 (1989)）、いくつ
かの抗体のヒト化のために好結果で使用されてきた（ここで、全ての参考文献が
引用によって本明細書に組入れられる）。
【００５６】
本発明の抗体を治療用の適用のために向上させるために、前記のＦｖ部分は“
骨格交換”として言及される方法によってヒト化される。この試みにおいて、骨
格残基は高度に相同性のあるヒトＶH 又はＶL の供与体の、ヒト骨格残基と異な
ることが同定される。次に、これらの異なる骨格残基は、ヒトの残基に同時に変
異させられる。前記の変異は、Ｅ．コリで発現することができ、そして生じたヒ
ト化変異体の素速い精製及び解析を行わせる一本鎖カセットから調製した、一本
鎖ＤＮＡの鋳型に導入される。
骨格交換”として言及される方法によってヒト化される。この試みにおいて、骨
格残基は高度に相同性のあるヒトＶH 又はＶL の供与体の、ヒト骨格残基と異な
ることが同定される。次に、これらの異なる骨格残基は、ヒトの残基に同時に変
異させられる。前記の変異は、Ｅ．コリで発現することができ、そして生じたヒ
ト化変異体の素速い精製及び解析を行わせる一本鎖カセットから調製した、一本
鎖ＤＮＡの鋳型に導入される。
【００５７】
この試みが、ＣＤＲ移植の原理又は暴露されている残基の置換と協力するが、
逸脱するのは、いくつかの通常暴露されていない残基がヒト化され、同時にいく
つかの通常暴露されている他の残基がヒト化されないためである。あるマウス残
基を保存するための決定は、これらの特定の残基を変異させる効果に関する知識
、前記のＦｖフラグメントの結合親和性、又は構造モデルにおいて観察される他
のＦｖ残基とこれらの残基との可能な相互作用に基づいている。例えば、ＡｂＦ
ｖ領域はＡｂＭパッケージ（Oxford Molecular Ltd., Oxford, UK)を用いてモデ
ル化することができ、これは相同性のアルゴリズムと高次構造生成技術とを組合
わせたものを実行する。溶媒和モデルの最も急な降下を行うエネルギーの最小化
及び一定温度のシミュレーション（３０ｋで５０００秒）はＳＹＢＹＬ（Tripos
, St. Louis, Missouri）を用いて行われた。
逸脱するのは、いくつかの通常暴露されていない残基がヒト化され、同時にいく
つかの通常暴露されている他の残基がヒト化されないためである。あるマウス残
基を保存するための決定は、これらの特定の残基を変異させる効果に関する知識
、前記のＦｖフラグメントの結合親和性、又は構造モデルにおいて観察される他
のＦｖ残基とこれらの残基との可能な相互作用に基づいている。例えば、ＡｂＦ
ｖ領域はＡｂＭパッケージ（Oxford Molecular Ltd., Oxford, UK)を用いてモデ
ル化することができ、これは相同性のアルゴリズムと高次構造生成技術とを組合
わせたものを実行する。溶媒和モデルの最も急な降下を行うエネルギーの最小化
及び一定温度のシミュレーション（３０ｋで５０００秒）はＳＹＢＹＬ（Tripos
, St. Louis, Missouri）を用いて行われた。
【００５８】
更に具体的に、ヒト化は前記の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを、配列のデータ
ベース、例えばＧＥＮＥＢＡＮＫ又はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴにおいて同定された
最良のヒトホモログと、上述した様な標準的な配列比較ソフトウェアを用いて重
ね合わせることによって達成される。モノクローナル抗体の可変ドメインの結晶
構造に基づく構造モデルに対する、配列の解析及び比較（(Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 86 : 10029-10033 (1989)及びSatow et al., J. Mol. Biol. , 190 : 593-604 (1986)) ; Protein Data bank Entry IMCP)は、前記のマ
ウス抗体とそのヒト対応物との間で異なる骨格残基の同定を行う。
ベース、例えばＧＥＮＥＢＡＮＫ又はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴにおいて同定された
最良のヒトホモログと、上述した様な標準的な配列比較ソフトウェアを用いて重
ね合わせることによって達成される。モノクローナル抗体の可変ドメインの結晶
構造に基づく構造モデルに対する、配列の解析及び比較（(Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 86 : 10029-10033 (1989)及びSatow et al., J. Mol. Biol. , 190 : 593-604 (1986)) ; Protein Data bank Entry IMCP)は、前記のマ
ウス抗体とそのヒト対応物との間で異なる骨格残基の同定を行う。
【００５９】
野生型抗ＣＤ３８をコードするＶH 及びＶL 遺伝子のセグメント（例えば、プ
ラスミドｐＵＣ１７内のもの）は、部位特異的変異法によって、独立してヒト化
することができる。当業者は、一旦前記のＦｖ領域がクローン化され、そして配
列決定されると、様々な残基を部位特異的変異法によって変化させることは、当
業者に公知の標準的な技術を用いる機械的作業であることを理解するだろう（Ku
nkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 488-492 (1985))。
ラスミドｐＵＣ１７内のもの）は、部位特異的変異法によって、独立してヒト化
することができる。当業者は、一旦前記のＦｖ領域がクローン化され、そして配
列決定されると、様々な残基を部位特異的変異法によって変化させることは、当
業者に公知の標準的な技術を用いる機械的作業であることを理解するだろう（Ku
nkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 488-492 (1985))。
【００６０】
親抗体の一本鎖誘導体に相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をクロ
ーン化し、そして発現させるための技術は、上述した様に当業者に公知である。
ーン化し、そして発現させるための技術は、上述した様に当業者に公知である。
【００６１】
II．カセット及び組換えポリペプチドの発現
当業者に公知の方法を、コード配列及び適当な転写／翻訳調節シグナルを含む
発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏでの組換え／遺
伝子学的技術を含む。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkに記
載の技術を参照のこと。
発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏでの組換え／遺
伝子学的技術を含む。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkに記
載の技術を参照のこと。
【００６２】
様々な宿主発現系を、前記のコード配列を発現させるために利用することがで
きる。これらは、限定しないが、微生物、例えば、細菌を、前記のコード配列を
含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発
現ベクターで形質転換したもの；酵母を、前記のコード配列を含む組換え酵母発
現ベクターで形質転換したもの；植物細胞系を、前記のコード配列を含む、組換
えウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウィルス、ＴＭＶ）で感染させたか、あるいは組換えプラスミド発
現ベクター、例えばＴｉプラスミドで形質転換したものを含む。
きる。これらは、限定しないが、微生物、例えば、細菌を、前記のコード配列を
含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発
現ベクターで形質転換したもの；酵母を、前記のコード配列を含む組換え酵母発
現ベクターで形質転換したもの；植物細胞系を、前記のコード配列を含む、組換
えウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウィルス、ＴＭＶ）で感染させたか、あるいは組換えプラスミド発
現ベクター、例えばＴｉプラスミドで形質転換したものを含む。
【００６３】
使用する宿主／ベクター系に依存して、構成的及び誘導的プロモーター、転写
増幅因子、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適当な転写及び翻訳因子
のうちのいずれかを、前記の発現ベクターにおいて使用することができる（例え
ば、Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol., 153 : 516-544 ; WO97/11761
及びWO96/06167を参照のこと）を使用することができる。例えば、細菌系でクロ
ーン化するとき、誘導可能なプロモーター、例えばベクテリオファージλのｐＬ
；ｐｌａｃ，ｐｔｒｕｐ，ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ
ー）などを使用してもよい。組換えＤＮＡ又は合成技術で製造されるプロモータ
ーもまた、前記の挿入されるコード配列の、調節され、そして高レベルな転写を
提供するために使用することができる。
増幅因子、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適当な転写及び翻訳因子
のうちのいずれかを、前記の発現ベクターにおいて使用することができる（例え
ば、Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol., 153 : 516-544 ; WO97/11761
及びWO96/06167を参照のこと）を使用することができる。例えば、細菌系でクロ
ーン化するとき、誘導可能なプロモーター、例えばベクテリオファージλのｐＬ
；ｐｌａｃ，ｐｔｒｕｐ，ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ
ー）などを使用してもよい。組換えＤＮＡ又は合成技術で製造されるプロモータ
ーもまた、前記の挿入されるコード配列の、調節され、そして高レベルな転写を
提供するために使用することができる。
【００６４】
更なる態様は、一方の発現カセットにおいてヒトプロタミンポリペプチドに融
合した抗ＣＤ３８抗体のＦｄをコードするキメラ遺伝子及び他方の発現カセット
において抗ＣＤ３８κ鎖コード遺伝を含む発現ベクターを含む。あるいは、それ
ぞれの発現カセットは別々の発現ベクター、例えばプラスミド上にあってもよい
。
合した抗ＣＤ３８抗体のＦｄをコードするキメラ遺伝子及び他方の発現カセット
において抗ＣＤ３８κ鎖コード遺伝を含む発現ベクターを含む。あるいは、それ
ぞれの発現カセットは別々の発現ベクター、例えばプラスミド上にあってもよい
。
【００６５】
自身の抗体領域を組込んだ前記の組換えＦｖ領域及び融合タンパク質は、Ｅ．
コリ、他の細菌宿主、酵母、並びに様々な高等真核細胞、例えばＣＯＳ，ＣＨＯ
及びＨｅＬａ細胞系、及び骨髄腫細胞系を含む、様々な宿主細胞において発現す
ることができる。特に好ましい宿主はＥ．コリである。前記の組換えタンパク質
の遺伝子は、それぞれの宿主にとって適当な発現調節配列に作用可能に連結する
だろう。Ｅ．コリの場合、これはプロモーター、例えばＴ７，ｔｒｐ、又はλプ
ロモーター、リボソーム結合部位及び好ましくは転写終結シグナルを含む。真核
細胞の場合、前記の調節配列はプロモーター及び好ましくは免疫グロブリン遺伝
子、ＳＶ４０、サイトメガロウィルスなどに由来するエンハンサー、並びにポリ
アデニル化配列を含み、そしてスプライシングの供与体及び受容体の配列を含ん
でいてもよい。
コリ、他の細菌宿主、酵母、並びに様々な高等真核細胞、例えばＣＯＳ，ＣＨＯ
及びＨｅＬａ細胞系、及び骨髄腫細胞系を含む、様々な宿主細胞において発現す
ることができる。特に好ましい宿主はＥ．コリである。前記の組換えタンパク質
の遺伝子は、それぞれの宿主にとって適当な発現調節配列に作用可能に連結する
だろう。Ｅ．コリの場合、これはプロモーター、例えばＴ７，ｔｒｐ、又はλプ
ロモーター、リボソーム結合部位及び好ましくは転写終結シグナルを含む。真核
細胞の場合、前記の調節配列はプロモーター及び好ましくは免疫グロブリン遺伝
子、ＳＶ４０、サイトメガロウィルスなどに由来するエンハンサー、並びにポリ
アデニル化配列を含み、そしてスプライシングの供与体及び受容体の配列を含ん
でいてもよい。
【００６６】
本発明の発現ベクターを、選択した宿主細胞内に、公知の方法で移すことがで
き、例えばＥ．コリには塩化カルシウム形質転換法であり、そして哺乳類細胞に
はリン酸カルシウム処理法又はエレクトロポレーションである。プラスミドで形
質転換した細胞は、前記のプラスミド上に含まれる遺伝子、例えばａｍｐ，ｇｐ
ｔ，ｎｅｏ及びｈｙｇ遺伝子によって与えられた抗生物質に対する耐性で選択す
ることができる。
き、例えばＥ．コリには塩化カルシウム形質転換法であり、そして哺乳類細胞に
はリン酸カルシウム処理法又はエレクトロポレーションである。プラスミドで形
質転換した細胞は、前記のプラスミド上に含まれる遺伝子、例えばａｍｐ，ｇｐ
ｔ，ｎｅｏ及びｈｙｇ遺伝子によって与えられた抗生物質に対する耐性で選択す
ることができる。
【００６７】
一旦発現すれば、前記の組換え融合ポリペプチドは、当業界の標準的な手順に
従い精製することができ、ここで、これは硫酸アンモニウム沈澱、親和性カラム
、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含んでいる（一般的に、R. S
copes. Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Me thods in Enzymology Vol. 182 : Guide to Protein Purification , Academic P
ress, Inc., New York (1990))。少なくとも約９０〜９５％の等質性の、実質的
に純粋な組成物が好ましく、そして９８〜９９％又はそれ以上の等質性が医薬の
使用にとって最も好ましい。一旦部分的に又は所望の均質性まで精製されると、
前記のポリペプチドは、治療用に用いることができる。
従い精製することができ、ここで、これは硫酸アンモニウム沈澱、親和性カラム
、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含んでいる（一般的に、R. S
copes. Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Me thods in Enzymology Vol. 182 : Guide to Protein Purification , Academic P
ress, Inc., New York (1990))。少なくとも約９０〜９５％の等質性の、実質的
に純粋な組成物が好ましく、そして９８〜９９％又はそれ以上の等質性が医薬の
使用にとって最も好ましい。一旦部分的に又は所望の均質性まで精製されると、
前記のポリペプチドは、治療用に用いることができる。
【００６８】
当業者は、化学合成、生物学的発現、又は精製の後、融合ポリペプチドが、前
記の天然の抗体を実質的に異なる高次構造を有することがあることを認識するだ
ろう。この場合には、前記のポリペプチドを変性させ、そして還元し、そしてそ
の次に前記のポリペプチドを好ましい高次構造に再生させることが必要であろう
。前記のポリペプチドを還元し、そして変性させ、そして再生を導入する方法は
当業者に公知である（Debinski et al., J. Biol. Chem., 268 : 14065-14070 (
1993) ; Kreitman and Pastan, Bioconjug. Chem., ４ : 581-585 (1993)；及び
Buchner, et al., Anal. Biochem., 205 : 263-270 (1992）参照のこと。これら
は引用によって本明細書に組入れられる）。例えばDebinski等は、グアニジン−
ＤＴＥ中の封入体タンパク質の変性及び還元を記載している。前記ポリペプチド
は続いて、酸化グルタチオン及びＬ−アルギニンを含む酸化還元緩衝液中で再生
される。
記の天然の抗体を実質的に異なる高次構造を有することがあることを認識するだ
ろう。この場合には、前記のポリペプチドを変性させ、そして還元し、そしてそ
の次に前記のポリペプチドを好ましい高次構造に再生させることが必要であろう
。前記のポリペプチドを還元し、そして変性させ、そして再生を導入する方法は
当業者に公知である（Debinski et al., J. Biol. Chem., 268 : 14065-14070 (
1993) ; Kreitman and Pastan, Bioconjug. Chem., ４ : 581-585 (1993)；及び
Buchner, et al., Anal. Biochem., 205 : 263-270 (1992）参照のこと。これら
は引用によって本明細書に組入れられる）。例えばDebinski等は、グアニジン−
ＤＴＥ中の封入体タンパク質の変性及び還元を記載している。前記ポリペプチド
は続いて、酸化グルタチオン及びＬ−アルギニンを含む酸化還元緩衝液中で再生
される。
【００６９】
当業者は、修飾を前記の融合ポリペプチドに対して、それらの生物学的活性を
減少させることなしに行うことができることを認識するだろう。修飾のいくつか
は、クローニング、発現、又は前記の融合ポリペプチドの抗体部分の、前記の融
合ポリペプチドへの取込みを容易にするために行われることがある。その様な修
飾は当業者に公知であり、そして例えば開始部位を提供するためにアミノ末端に
付加したメチオニン、又は都合よく位置する制限部位又は終止コドンを作製する
ための末端で置き換えられる付加アミノ酸を含む。
減少させることなしに行うことができることを認識するだろう。修飾のいくつか
は、クローニング、発現、又は前記の融合ポリペプチドの抗体部分の、前記の融
合ポリペプチドへの取込みを容易にするために行われることがある。その様な修
飾は当業者に公知であり、そして例えば開始部位を提供するためにアミノ末端に
付加したメチオニン、又は都合よく位置する制限部位又は終止コドンを作製する
ための末端で置き換えられる付加アミノ酸を含む。
【００７０】
当業者は、他の修飾が行われてもよいことを認識するだろう。従って、例えば
アミノ酸置換が、前記融合ポリペプチドの特異性又は結合親和性を増大させる様
に作製されてもよい。あるいは、前記分子の非必須領域が短かくされるか、又は
完全に削除されてもよい。従って、前記分子の活性に関与していない分子の領域
が存在する場合、それらは削除されるか、又は前記分子の活性成分間の正確な空
間的関係を維持することを与える、より短かいセグメントで置換されていてもよ
い。あるいは、更に自由なセグメントをドメイン間領域中に据えることで、その
結果、前記分子の折りたたみ又は製造を容易にすることができる（Brinkmann, e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 3075-3079 (1992))。
アミノ酸置換が、前記融合ポリペプチドの特異性又は結合親和性を増大させる様
に作製されてもよい。あるいは、前記分子の非必須領域が短かくされるか、又は
完全に削除されてもよい。従って、前記分子の活性に関与していない分子の領域
が存在する場合、それらは削除されるか、又は前記分子の活性成分間の正確な空
間的関係を維持することを与える、より短かいセグメントで置換されていてもよ
い。あるいは、更に自由なセグメントをドメイン間領域中に据えることで、その
結果、前記分子の折りたたみ又は製造を容易にすることができる（Brinkmann, e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 3075-3079 (1992))。
【００７１】
ＣＤ３８発現細胞に対する結合活性は、融合ポリペプチドｓｃをコードするＤ
ＮＡを有するベクターでトランスフェクションした細胞からの培養培地を用いる
、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出され、一方、結合活性は、
ベクターのみで形質転換した細胞の培地中に観察されない。分泌融合ポリペプチ
ドは、無血清の培養培地から、抗ヒトＩｇ、例えばＩｇＧκ鎖のモノクローナル
抗体と結合した親和性カラムを用いることによって精製される。前記のカラムに
結合した融合ポリペプチドは、１００mMのグリシン（pH２．４）で溶出され、濃
縮され、そして非還元及び還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で解析される。
ＮＡを有するベクターでトランスフェクションした細胞からの培養培地を用いる
、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出され、一方、結合活性は、
ベクターのみで形質転換した細胞の培地中に観察されない。分泌融合ポリペプチ
ドは、無血清の培養培地から、抗ヒトＩｇ、例えばＩｇＧκ鎖のモノクローナル
抗体と結合した親和性カラムを用いることによって精製される。前記のカラムに
結合した融合ポリペプチドは、１００mMのグリシン（pH２．４）で溶出され、濃
縮され、そして非還元及び還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で解析される。
【００７２】
本発明の治療用組成物のＤＮＡ結合活性は、ゲルシフトアッセイによって試験
される。放射性標識したＤＮＡフラグメント又はプラスミドＤＮＡ全体と混合さ
れる前記融合ポリペプチドの量が増大するにつれ、アガロースゲルに移動するＤ
ＮＡフラグメント又はプラスミドＤＮＡ全体の量が減少し、アガロースゲルに侵
入するＤＮＡは更に遅く移動する。反対に、前記融合ポリペプチドの抗体部分と
インキュベートしたＤＮＡは、アガロースゲル中でのその移動度において、有意
な変化は示さない。前記融合ポリペプチドの、前記細胞表面上のＣＤ３８に対す
る結合活性は、それがＤＮＡと結合した後、更に蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣ
Ｓ）によって試験される。前記融合ポリペプチド又は前記融合ポリペプチド−Ｄ
ＮＡ複合体のいずれかと一緒にインキュベートしたＣＤ３８+ 細胞はポジティブ
な染色を示す。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抱合抗体と一緒
に、直接的にインキュベートした細胞はまた、ネガティブな染色を示す。
される。放射性標識したＤＮＡフラグメント又はプラスミドＤＮＡ全体と混合さ
れる前記融合ポリペプチドの量が増大するにつれ、アガロースゲルに移動するＤ
ＮＡフラグメント又はプラスミドＤＮＡ全体の量が減少し、アガロースゲルに侵
入するＤＮＡは更に遅く移動する。反対に、前記融合ポリペプチドの抗体部分と
インキュベートしたＤＮＡは、アガロースゲル中でのその移動度において、有意
な変化は示さない。前記融合ポリペプチドの、前記細胞表面上のＣＤ３８に対す
る結合活性は、それがＤＮＡと結合した後、更に蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣ
Ｓ）によって試験される。前記融合ポリペプチド又は前記融合ポリペプチド−Ｄ
ＮＡ複合体のいずれかと一緒にインキュベートしたＣＤ３８+ 細胞はポジティブ
な染色を示す。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抱合抗体と一緒
に、直接的にインキュベートした細胞はまた、ネガティブな染色を示す。
【００７３】
III ．医薬組成物、投与量、及び投与経路
本発明の融合ポリペプチド及び医薬組成物は、非経口、局所（topical)、経口
、又は局所（local)の投与、例えばエーロゾル若しくは経皮投与、予防及び／又
は治療のための処置のために有用である。前記の医薬組成物は、投与方法に依存
する様々な単位投与量形態で投与することができる。例えば、経口投与に適した
単位投与量形態は、粉末、錠剤、丸剤、カプセル及びロゼンジを含む。本発明の
融合ポリペプチド及び医薬組成物は、経口投与される場合、消化から保護されね
ばならないことが認識される。これは典型的に、組成物と前記のポリペプチド及
び／又はＤＮＡとを混合させ、それらに酸及び酵素の加水分解に対する耐性を与
えるか、あるいは前記のポリペプチド及び／又はＤＮＡを、適当に耐性の担体、
例えばリポソームに詰めることによって達成される。ポリペプチド及び／又はＤ
ＮＡを消化から保護する手段は当業者に公知である。
、又は局所（local)の投与、例えばエーロゾル若しくは経皮投与、予防及び／又
は治療のための処置のために有用である。前記の医薬組成物は、投与方法に依存
する様々な単位投与量形態で投与することができる。例えば、経口投与に適した
単位投与量形態は、粉末、錠剤、丸剤、カプセル及びロゼンジを含む。本発明の
融合ポリペプチド及び医薬組成物は、経口投与される場合、消化から保護されね
ばならないことが認識される。これは典型的に、組成物と前記のポリペプチド及
び／又はＤＮＡとを混合させ、それらに酸及び酵素の加水分解に対する耐性を与
えるか、あるいは前記のポリペプチド及び／又はＤＮＡを、適当に耐性の担体、
例えばリポソームに詰めることによって達成される。ポリペプチド及び／又はＤ
ＮＡを消化から保護する手段は当業者に公知である。
【００７４】
本発明の融合ポリペプチド及び医薬組成物は、非経口投与、例えば静脈内投与
又は体腔若しくは器官の内腔への投与に有用である。投与のための前記組成物は
、一般に前記融合ポリペプチド及び／又はＤＮＡを医薬として許容される担体、
好ましくは水性担体に溶解した溶液を含んで成るだろう。様々な水性担体を使用
することができ、例えば緩衝塩溶液などである。これらの溶液は滅菌され、そし
て一般に不所望の物質を含まない。これらの組成物は常用の、公知の滅菌技術に
よって滅菌することができる。前記組成物は生理学的条件に近づけるために必要
な、医薬として許容される補助物質、例えばpHを調節し、そして緩衝化する薬剤
、毒性調節剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩
化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでいてもよい。これらの製剤中の、融
合ポリペプチド及び／又はＤＮＡの濃度は、広範に変化し、そして主に液体の体
積、粘度、体重などに依存して、特定の選択した投与経路及び前記の患者の必要
性に従い投与されるだろう。
又は体腔若しくは器官の内腔への投与に有用である。投与のための前記組成物は
、一般に前記融合ポリペプチド及び／又はＤＮＡを医薬として許容される担体、
好ましくは水性担体に溶解した溶液を含んで成るだろう。様々な水性担体を使用
することができ、例えば緩衝塩溶液などである。これらの溶液は滅菌され、そし
て一般に不所望の物質を含まない。これらの組成物は常用の、公知の滅菌技術に
よって滅菌することができる。前記組成物は生理学的条件に近づけるために必要
な、医薬として許容される補助物質、例えばpHを調節し、そして緩衝化する薬剤
、毒性調節剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩
化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでいてもよい。これらの製剤中の、融
合ポリペプチド及び／又はＤＮＡの濃度は、広範に変化し、そして主に液体の体
積、粘度、体重などに依存して、特定の選択した投与経路及び前記の患者の必要
性に従い投与されるだろう。
【００７５】
従って、静脈内投与のための典型的な医薬組成物は患者１人当たり、１日当た
り、約０．０１〜約１００、好ましくは約０．１〜約１０μｇであろう。好まし
くは前記組成物は、少なくとも約１：１、更に好ましくは約１：２、及びより更
に好ましくは１：５の比率のＤＮＡ分子：融合ポリペプチド分子を含んで成る。
患者１人当たり、１日当たり約０．１mgから１０００mgまでの投与量は、特に隠
れた部位及び、血流の無い部位、例えば体腔又は器官の内腔に投与する場合に使
用することができる。非経口投与が可能な組成物を製造するための実際の方法は
、当業者に知られているか又は明らかであり、そしてRemington's Pharmaceutic al Science , 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (198
0)の様な刊行物に更に、詳細に記載されている。
り、約０．０１〜約１００、好ましくは約０．１〜約１０μｇであろう。好まし
くは前記組成物は、少なくとも約１：１、更に好ましくは約１：２、及びより更
に好ましくは１：５の比率のＤＮＡ分子：融合ポリペプチド分子を含んで成る。
患者１人当たり、１日当たり約０．１mgから１０００mgまでの投与量は、特に隠
れた部位及び、血流の無い部位、例えば体腔又は器官の内腔に投与する場合に使
用することができる。非経口投与が可能な組成物を製造するための実際の方法は
、当業者に知られているか又は明らかであり、そしてRemington's Pharmaceutic al Science , 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (198
0)の様な刊行物に更に、詳細に記載されている。
【００７６】
前記融合ポリペプチド又はそのカクテル（すなわち、他のタンパク質を有する
もの）を含む組成物を、治療用の処置のために投与することができる。治療用の
適用において、組成物は疾患に苦しむ患者に、前記の疾患及びその合併症を治療
するか又は少なくとも部分的に抑制するのに十分な量で投与される。これを達成
するために適した量は、“治療的に有効な投与量”として定義される。この使用
にとって有効な量は、前記の疾患の苦しさ及び患者の健康の一般的な状態に依存
するだろう。
もの）を含む組成物を、治療用の処置のために投与することができる。治療用の
適用において、組成物は疾患に苦しむ患者に、前記の疾患及びその合併症を治療
するか又は少なくとも部分的に抑制するのに十分な量で投与される。これを達成
するために適した量は、“治療的に有効な投与量”として定義される。この使用
にとって有効な量は、前記の疾患の苦しさ及び患者の健康の一般的な状態に依存
するだろう。
【００７７】
前記組成物の１又は複数回の投与は、患者が必要とし、そして耐性がある投与
量及び頻度に依存して投与されるだろう。あらゆる事象において、前記組成物は
前記患者を有効に処置するために、本発明のポリペプチド及びＤＮＡの十分な量
を提供すべきである。
量及び頻度に依存して投与されるだろう。あらゆる事象において、前記組成物は
前記患者を有効に処置するために、本発明のポリペプチド及びＤＮＡの十分な量
を提供すべきである。
【００７８】
本発明は、ＣＤ３８の異常な（高い）発現又は異常の誘因に関する疾患又は障
害のいずれかにおいて、治療的な価値を持つべきである。例えば、ＣＤ３８は免
疫機能の、多くの基本的な制御過程における役割を果たすことが信じられている
。例えば、Ｂ細胞リンパ腫、自己免疫状態、Ｂ細胞特異的増殖性異常（例えば白
血病）、又は過敏性応答の調節などである。更に、本発明の融合ポリペプチド及
び組成物はまた、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、非ホジキン病リンパ腫、慢
性関節リウマチ、及び抗体を介さない自己免疫疾患における使用を有する。
害のいずれかにおいて、治療的な価値を持つべきである。例えば、ＣＤ３８は免
疫機能の、多くの基本的な制御過程における役割を果たすことが信じられている
。例えば、Ｂ細胞リンパ腫、自己免疫状態、Ｂ細胞特異的増殖性異常（例えば白
血病）、又は過敏性応答の調節などである。更に、本発明の融合ポリペプチド及
び組成物はまた、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、非ホジキン病リンパ腫、慢
性関節リウマチ、及び抗体を介さない自己免疫疾患における使用を有する。
【００７９】
本発明の治療用組成物は治療用の使用のために、追加の活性成分を、例えば常
用の医薬として許容される担体又は希釈剤中で、生理学的に無害の安定化剤及び
補形薬と一緒に組合わせることができる（Berkow (Ed.), The Merck Manual, Ma
rck, Rathway, New Jerseyを参照のこと）。これらの組合わせは、濾過滅菌し、
そして投薬容器での凍結乾燥又は安定化水性製剤での保存によって、投与量形態
に据えることができる。
用の医薬として許容される担体又は希釈剤中で、生理学的に無害の安定化剤及び
補形薬と一緒に組合わせることができる（Berkow (Ed.), The Merck Manual, Ma
rck, Rathway, New Jerseyを参照のこと）。これらの組合わせは、濾過滅菌し、
そして投薬容器での凍結乾燥又は安定化水性製剤での保存によって、投与量形態
に据えることができる。
【００８０】
有効な治療に必要な試薬の量は、投与の手段、標的部位、前記の患者の生理学
的状態、及び投与される他の薬剤を含む多くの異なる因子に依存する。従って、
治療用の投与量は安全性及び効きめを最適化するために滴定されるべきである。
典型的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する投与量は、これらの試薬のｉｎ ｓｉｔ
ｕ投与に有用な量で、有用な手引きを提供するだろう。特定の障害の処置のため
の、有効な投与量での動物試験は更に、ヒトの投与量の予言的な示唆を提供する
だろう。様々な考えが記載されており、例えばGilman et al. (Eds.), (1990) G oodman and Gilman's : The Pharmacological Basis of Therapeutics , 8th ed.
, Pergamon Press, Tarrytown, New York 及びRemington's Pharmaceutical Sci ences , 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania である
。投与方法は、前記文献中及び以下で、例えば経口、静脈内、腹膜内、又は筋肉
内の投与、経皮拡散などのために議論されている。医薬として許容される担体は
、水、塩溶液、緩衝液、及び、例えばThe Merck Index, Merck & Co., Rahway,
New Jerseyに記載の他の化合物を含んでいてもよい。例えば、Avis et al (Eds. ), (1993) Pharmaceutical Dosage Forms : Parenteral Medications , Dekker,
New York、及びLeiberman et al. (Eds.), (1990) Pharmaceutical Dosage Form s : Disperse Systems , Dekker, New Yorkもまた参照のこと。除放製剤又は除放
装置を、連続的な投与のために利用してもよい。
的状態、及び投与される他の薬剤を含む多くの異なる因子に依存する。従って、
治療用の投与量は安全性及び効きめを最適化するために滴定されるべきである。
典型的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する投与量は、これらの試薬のｉｎ ｓｉｔ
ｕ投与に有用な量で、有用な手引きを提供するだろう。特定の障害の処置のため
の、有効な投与量での動物試験は更に、ヒトの投与量の予言的な示唆を提供する
だろう。様々な考えが記載されており、例えばGilman et al. (Eds.), (1990) G oodman and Gilman's : The Pharmacological Basis of Therapeutics , 8th ed.
, Pergamon Press, Tarrytown, New York 及びRemington's Pharmaceutical Sci ences , 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania である
。投与方法は、前記文献中及び以下で、例えば経口、静脈内、腹膜内、又は筋肉
内の投与、経皮拡散などのために議論されている。医薬として許容される担体は
、水、塩溶液、緩衝液、及び、例えばThe Merck Index, Merck & Co., Rahway,
New Jerseyに記載の他の化合物を含んでいてもよい。例えば、Avis et al (Eds. ), (1993) Pharmaceutical Dosage Forms : Parenteral Medications , Dekker,
New York、及びLeiberman et al. (Eds.), (1990) Pharmaceutical Dosage Form s : Disperse Systems , Dekker, New Yorkもまた参照のこと。除放製剤又は除放
装置を、連続的な投与のために利用してもよい。
【００８１】
治療用製剤が、いずれかの常用の投与量製剤で投与されてもよい。前記の活性
成分を単独で投与することは可能であるが、それを医薬製剤として提示すること
が好ましい。前記の製剤は、少なくとも１つの活性成分を、１又は複数の許容さ
れるその担体と一緒に含んで成る。各担体は、他の成分と適合し、そして前記患
者に有害でないという意味で、医薬として及び生理学的に許容されねばならない
。前記製剤は経口、経腸、経鼻、又は非経口投与（皮下、筋肉内、静脈内及び皮
内投与を含む）に適したものを含む。前記製剤は、簡便に単位投与量形態で存在
していてもよく、そして製薬業界で公知のいずれかの方法によって製造すること
ができる：例えばGilman et al., (Eds.), (1990) Goodman and Gilman's : The Pharmacological Basis of Therapeutics , 8th ed., Pergamon Press ; 及びRe mington's Pharmaceutical Sciences , 17th ed. (1990), Mack Publishing Co.,
Easton, Pennsylvaniaである。更に、本発明は他の化学療法剤及び化学予防剤
と組合わせるか、又は一緒に使用してもよい。
成分を単独で投与することは可能であるが、それを医薬製剤として提示すること
が好ましい。前記の製剤は、少なくとも１つの活性成分を、１又は複数の許容さ
れるその担体と一緒に含んで成る。各担体は、他の成分と適合し、そして前記患
者に有害でないという意味で、医薬として及び生理学的に許容されねばならない
。前記製剤は経口、経腸、経鼻、又は非経口投与（皮下、筋肉内、静脈内及び皮
内投与を含む）に適したものを含む。前記製剤は、簡便に単位投与量形態で存在
していてもよく、そして製薬業界で公知のいずれかの方法によって製造すること
ができる：例えばGilman et al., (Eds.), (1990) Goodman and Gilman's : The Pharmacological Basis of Therapeutics , 8th ed., Pergamon Press ; 及びRe mington's Pharmaceutical Sciences , 17th ed. (1990), Mack Publishing Co.,
Easton, Pennsylvaniaである。更に、本発明は他の化学療法剤及び化学予防剤
と組合わせるか、又は一緒に使用してもよい。
【００８２】
特に、本発明の治療用組成物を、注射可能な又は局所用の調製物のいずれかに
調製してもよい。非経口製剤は知られており、そして本発明の使用、好ましくは
筋肉内又は静脈内投与にとって適している。治療用として有効な量の前記融合ポ
リペプチド及び／又はＤＮＡを含む前記製剤は、滅菌液性溶液、液性懸濁液、又
は凍結乾燥したもののいずれかであり、そして任意に安定化剤又は補形薬を含む
。凍結乾燥した組成物は、適当な希釈剤、例えば注射のための水、塩溶液、０．
３％グリシンなどで、宿主の体重のkg当たり約０．０１mg〜２０mgの濃度で再構
成される。典型的に、本発明の医薬組成物は、治療として有効な投与量の、患者
のkg当たり約０．０１mg〜約５mgの範囲で投与される。本発明の医薬組成物の、
好ましい治療として有効な投与量は、２，３日から２週間にわたり、毎日静脈内
注入によって投与される患者の体重の、kg当たり約０．０１mg〜約０．５mgの範
囲内であり、これらはそれぞれ、１時間にわたり、逐次服用の患者の、投与量漸
増の養生法で与えられる。
調製してもよい。非経口製剤は知られており、そして本発明の使用、好ましくは
筋肉内又は静脈内投与にとって適している。治療用として有効な量の前記融合ポ
リペプチド及び／又はＤＮＡを含む前記製剤は、滅菌液性溶液、液性懸濁液、又
は凍結乾燥したもののいずれかであり、そして任意に安定化剤又は補形薬を含む
。凍結乾燥した組成物は、適当な希釈剤、例えば注射のための水、塩溶液、０．
３％グリシンなどで、宿主の体重のkg当たり約０．０１mg〜２０mgの濃度で再構
成される。典型的に、本発明の医薬組成物は、治療として有効な投与量の、患者
のkg当たり約０．０１mg〜約５mgの範囲で投与される。本発明の医薬組成物の、
好ましい治療として有効な投与量は、２，３日から２週間にわたり、毎日静脈内
注入によって投与される患者の体重の、kg当たり約０．０１mg〜約０．５mgの範
囲内であり、これらはそれぞれ、１時間にわたり、逐次服用の患者の、投与量漸
増の養生法で与えられる。
【００８３】
本発明に従う治療用組成物は、皮膚科学用補形剤中に、治療的に有効な濃度の
前記融合ポリペプチド及び／又はＤＮＡを含めることによって、局所治療のため
の局所用調製物に調製されることがある。投与すべき量、及び前記の局所用製剤
中の濃度は、選択した賦形剤、前記患者の臨床上の状態、全身性の毒性及び前記
製剤の安定性に依存する。従って、医師は前記製剤中の適当な濃度の治療用薬剤
、及び前記の適当な量の製剤を含む適当な調製物を、臨床上の経験に依存して投
与される問題の患者又は同じ様な患者に適用することを知っている。局所用製剤
のための、前記治療用組成物の濃度は、約０．１mg／ml〜約２５mg／ml以上の範
囲である。典型的に、前記の局所用製剤のための、前記組成物中の前記薬剤の濃
度は、約１mg／ml〜約２００mg／ml以上の範囲にある。本発明に従う組成物の固
体分散液、及び溶解した調製物を使用してもよい。従って、前記賦形剤中で使用
すべき正確な濃度は、治療の応答を最適化するために、適当な実験操作にかけら
れる。例えば、約１０mgの融合ポリペプチド／１００mgの、細胞毒性因子をコー
ドするＤＮＡ／１００mgの賦形剤、これ以上のものは、１％ｗ／ｗのヒドロゲル
賦形剤と一緒に有用であることがある。適当な賦形剤、更にゲルは、鉱油、石油
などを用いた、水中油滴型又は油中水滴型乳濁液である。
前記融合ポリペプチド及び／又はＤＮＡを含めることによって、局所治療のため
の局所用調製物に調製されることがある。投与すべき量、及び前記の局所用製剤
中の濃度は、選択した賦形剤、前記患者の臨床上の状態、全身性の毒性及び前記
製剤の安定性に依存する。従って、医師は前記製剤中の適当な濃度の治療用薬剤
、及び前記の適当な量の製剤を含む適当な調製物を、臨床上の経験に依存して投
与される問題の患者又は同じ様な患者に適用することを知っている。局所用製剤
のための、前記治療用組成物の濃度は、約０．１mg／ml〜約２５mg／ml以上の範
囲である。典型的に、前記の局所用製剤のための、前記組成物中の前記薬剤の濃
度は、約１mg／ml〜約２００mg／ml以上の範囲にある。本発明に従う組成物の固
体分散液、及び溶解した調製物を使用してもよい。従って、前記賦形剤中で使用
すべき正確な濃度は、治療の応答を最適化するために、適当な実験操作にかけら
れる。例えば、約１０mgの融合ポリペプチド／１００mgの、細胞毒性因子をコー
ドするＤＮＡ／１００mgの賦形剤、これ以上のものは、１％ｗ／ｗのヒドロゲル
賦形剤と一緒に有用であることがある。適当な賦形剤、更にゲルは、鉱油、石油
などを用いた、水中油滴型又は油中水滴型乳濁液である。
【００８４】
本発明に従う治療用組成物は、任意に、経皮用の治療系の使用によって局所的
に投与されてもよい〔Barry, Dermatological Formulations, p. 181 (1983) 及
びその中に記載の文献〕。その様な局所用の輸送系は、低分子量の薬剤の経皮（
transdermal)投与のために設計されてもよいが、それらは経皮（percutaneous）
輸送することもできる。更に、その様な系は、速度を調節する微孔性膜の適当な
選別によって、治療用のポリペプチド及び／又はＤＮＡの投与に直ちに適合する
ことができる。
に投与されてもよい〔Barry, Dermatological Formulations, p. 181 (1983) 及
びその中に記載の文献〕。その様な局所用の輸送系は、低分子量の薬剤の経皮（
transdermal)投与のために設計されてもよいが、それらは経皮（percutaneous）
輸送することもできる。更に、その様な系は、速度を調節する微孔性膜の適当な
選別によって、治療用のポリペプチド及び／又はＤＮＡの投与に直ちに適合する
ことができる。
【００８５】
全身性又は局所用の輸送のための、前記の治療用組成物の局所用製剤は、非経
口投与のために上述した補形薬並びに局所用製剤において使用される他の補形薬
、例えば補助溶媒、界面活性剤、油、湿潤剤、皮膚軟化剤、保存薬、安定化剤及
び抗酸化剤を適用してもよく、そして含んでいてもよい。医薬として許容される
緩衝液、例えばＴｒｉｓ又はリン酸緩衝液を使用してもよい。前記の局所用製剤
はまた、任意に１又は複数の様々に命名されている薬剤、増強剤、界面活性剤、
反応促進剤、吸着促進剤又は浸透増強剤、例えば前記の治療用組成物及び他の薬
剤の経皮浸透を増強する薬剤を含んでいてもよい。その様な薬剤は、望ましくは
当業者に知られているであろう以下の特徴：薬理学的不活性、体液若しくは電解
質損失の非促進、治療用組成物との適合性（不活性化しないこと）、及びクリー
ム、ゲル若しくは他の所望の局所輸送系へ調製可能なこと、のうちのいくつか又
は全てを持つべきである。
口投与のために上述した補形薬並びに局所用製剤において使用される他の補形薬
、例えば補助溶媒、界面活性剤、油、湿潤剤、皮膚軟化剤、保存薬、安定化剤及
び抗酸化剤を適用してもよく、そして含んでいてもよい。医薬として許容される
緩衝液、例えばＴｒｉｓ又はリン酸緩衝液を使用してもよい。前記の局所用製剤
はまた、任意に１又は複数の様々に命名されている薬剤、増強剤、界面活性剤、
反応促進剤、吸着促進剤又は浸透増強剤、例えば前記の治療用組成物及び他の薬
剤の経皮浸透を増強する薬剤を含んでいてもよい。その様な薬剤は、望ましくは
当業者に知られているであろう以下の特徴：薬理学的不活性、体液若しくは電解
質損失の非促進、治療用組成物との適合性（不活性化しないこと）、及びクリー
ム、ゲル若しくは他の所望の局所輸送系へ調製可能なこと、のうちのいくつか又
は全てを持つべきである。
【００８６】
本発明に従う治療用組成物はまた、肺への局所輸送を達成するために、エアロ
ゾルによって投与してもよい。これは、前記治療用組成物を含む水性エアロゾル
、リポソーム調製物又は固体粒子を製造することによって達成される。通常、水
性エアロゾルは、常用の医薬として許容される担体及び安定化剤と一緒に、前記
治療用組成物の水性溶液又は懸濁液を調製することによって製造される。前記の
担体及び安定化剤は、前記の特定の組成物の必要に応じて変化するが、典型的に
：非イオン性界面活性剤（Tweens, Pluronics 、又はポリエチレングリコール）
；血清アルブミンの様な無毒タンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レ
シチン；アミノ酸、例えばグリシン；及び緩衝液、塩、糖又は糖アルコールを含
む。前記製剤はまた、粘液溶解剤及び気管支拡張剤を含んでもよい。前記製剤は
殺菌される。エアロゾルは一般に、等張液から製造される。前記粒子は、任意に
標準的な肺の界面活性剤を含む。
ゾルによって投与してもよい。これは、前記治療用組成物を含む水性エアロゾル
、リポソーム調製物又は固体粒子を製造することによって達成される。通常、水
性エアロゾルは、常用の医薬として許容される担体及び安定化剤と一緒に、前記
治療用組成物の水性溶液又は懸濁液を調製することによって製造される。前記の
担体及び安定化剤は、前記の特定の組成物の必要に応じて変化するが、典型的に
：非イオン性界面活性剤（Tweens, Pluronics 、又はポリエチレングリコール）
；血清アルブミンの様な無毒タンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レ
シチン；アミノ酸、例えばグリシン；及び緩衝液、塩、糖又は糖アルコールを含
む。前記製剤はまた、粘液溶解剤及び気管支拡張剤を含んでもよい。前記製剤は
殺菌される。エアロゾルは一般に、等張液から製造される。前記粒子は、任意に
標準的な肺の界面活性剤を含む。
【００８７】
前記エアロゾルは、水性又は非水性（例えば、フルオロカーボンプロペラント
）懸濁液中で、前記粒子から形成してもよい。その様な粒子は、例えば前記治療
用組成物又はその誘導体あるいはリポソーム若しくはマイクロカプセルを取込ん
だ組成物又はその誘導体を含む。前記エアロゾルは、肺刺激物質、すなわち急性
気管支収縮、咳、肺水腫又は組織破壊を起こす物質を含むべきでない。しかしな
がら、非刺激性吸収増強剤は、本明細書での使用に適している。音波噴霧器は、
好ましくはエアロゾルの製造において使用される。音波噴霧器は、前記組成物又
はその誘導体が、前記組成物の減成を招くことがある剪断にさらされることを最
小化する。
）懸濁液中で、前記粒子から形成してもよい。その様な粒子は、例えば前記治療
用組成物又はその誘導体あるいはリポソーム若しくはマイクロカプセルを取込ん
だ組成物又はその誘導体を含む。前記エアロゾルは、肺刺激物質、すなわち急性
気管支収縮、咳、肺水腫又は組織破壊を起こす物質を含むべきでない。しかしな
がら、非刺激性吸収増強剤は、本明細書での使用に適している。音波噴霧器は、
好ましくはエアロゾルの製造において使用される。音波噴霧器は、前記組成物又
はその誘導体が、前記組成物の減成を招くことがある剪断にさらされることを最
小化する。
【００８８】
あるいは、本発明の組成物は、引用によって本明細書に組入れられる、Steine
r 等の米国特許第４，９２５，６７３号に記載のプロテイノイド被包の様な輸送
系によって、経口的に投与されてもよい。典型的に、本発明に従う組成物の治療
として有効な経口投与量は、１日当たり約０．０５mg／kg体重〜約５０mg／kg体
重の範囲である。好ましい有効量は、１日当たり約０．０５mg／kg体重〜約５mg
／kg体重の範囲である。
r 等の米国特許第４，９２５，６７３号に記載のプロテイノイド被包の様な輸送
系によって、経口的に投与されてもよい。典型的に、本発明に従う組成物の治療
として有効な経口投与量は、１日当たり約０．０５mg／kg体重〜約５０mg／kg体
重の範囲である。好ましい有効量は、１日当たり約０．０５mg／kg体重〜約５mg
／kg体重の範囲である。
【００８９】
本発明に従う組成物は、局所よりもむしろ、全身系に投与することができ、こ
れは筋肉内、皮下、鞘内又は腹腔内からの、あるいは血管の隙間、特に関節への
注射、例えば、約１μｇ／cc関節の液体／日以上の投与量での関節内注射による
。前記の投与量は、使用する前記の具体的な組成物の特性、例えばその活性及び
生物学的半減期、前記製剤中での組成物の濃度、医師の熟練の範囲で十分な投与
する部位及び割合、前記の患者を悩ます疾患に関連する前記患者の臨床上の耐性
などに依存するであろう。
れは筋肉内、皮下、鞘内又は腹腔内からの、あるいは血管の隙間、特に関節への
注射、例えば、約１μｇ／cc関節の液体／日以上の投与量での関節内注射による
。前記の投与量は、使用する前記の具体的な組成物の特性、例えばその活性及び
生物学的半減期、前記製剤中での組成物の濃度、医師の熟練の範囲で十分な投与
する部位及び割合、前記の患者を悩ます疾患に関連する前記患者の臨床上の耐性
などに依存するであろう。
【００９０】
本発明の組成物は、溶液で投与してもよい。前記溶液のpHは、pH５〜９．５、
好ましくはpH６．５〜７．５の範囲内であるべきである。その組成物は、適当な
医薬として許容される緩衝液、例えばリン酸、Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン−ＨＣｌ又はクエン酸などを有する溶液であるべきである。緩衝液の
濃度は、１〜１００mMの範囲内であるべきである。前記の組成物溶液はまた、塩
、例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウムを、５０〜１５０mMの濃度で含んでい
てもよい。有効量の安定化剤、例えばアルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロ
タミン又はプロタミンの塩を更に含んでいてもよく、そして溶液を含む組成物又
は前記溶液を調製する組成物に加えてもよい。
好ましくはpH６．５〜７．５の範囲内であるべきである。その組成物は、適当な
医薬として許容される緩衝液、例えばリン酸、Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン−ＨＣｌ又はクエン酸などを有する溶液であるべきである。緩衝液の
濃度は、１〜１００mMの範囲内であるべきである。前記の組成物溶液はまた、塩
、例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウムを、５０〜１５０mMの濃度で含んでい
てもよい。有効量の安定化剤、例えばアルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロ
タミン又はプロタミンの塩を更に含んでいてもよく、そして溶液を含む組成物又
は前記溶液を調製する組成物に加えてもよい。
【００９１】
前記組成物の全身系投与は、毎日行ってもよく、そして脈管内注射が許容され
るが、一般的に筋肉内注射による。前記の投与はまた、鼻腔内又は他の非腸管外
経路であってもよい。本発明の組成物はまた、血液を含むある組織に据えられる
、中心体、リポソーム又は他の微粒子輸送系を経由して投与されてもよい。局所
用調製物は、毎日直接的に、皮膚又は粘膜に適用され、そしてその後、好ましく
は包帯、ポリオレフィンフィルム又は前記局所用製剤に不透過性の他のバリアで
覆うことによって吸収され、すなわち保護される。
るが、一般的に筋肉内注射による。前記の投与はまた、鼻腔内又は他の非腸管外
経路であってもよい。本発明の組成物はまた、血液を含むある組織に据えられる
、中心体、リポソーム又は他の微粒子輸送系を経由して投与されてもよい。局所
用調製物は、毎日直接的に、皮膚又は粘膜に適用され、そしてその後、好ましく
は包帯、ポリオレフィンフィルム又は前記局所用製剤に不透過性の他のバリアで
覆うことによって吸収され、すなわち保護される。
【００９２】
“単位投与量”の用語及びその文法的な相当語句は、本明細書で使用する場合
、一元の投与としてヒトの患者及び他の温血動物にとって適した、生理的に別々
の単位を意味し、それぞれの単位は、必要とされる生理的に許容される担体、例
えば希釈剤又は賦形剤と共同して、所望の治療効果を生むために計算された、前
記の２つの活性成分のうち少なくとも１つのあらかじめ決定される有効な及び強
化する量を含んでいる。この発明の単位投与量形態のための記述は、（ａ）前記
活性成分の独特な性質及び達成すべき特定の治療効果、並びに（ｂ）ヒト及び他
の動物における、治療目的の使用のための活性成分などを合成する業界に固有の
限定、によって指示され、そしてこれらに直接的に依存する。この発明に従う適
当な単位投与量形態の例は、錠剤、カプセル、丸剤、粉末小包、顆粒、オブラー
トなど、前記したもののいずれかのうちの、分離したあつまり、並びに液体溶液
、乳濁液及び懸濁液である。ｉｎ ｖｉｖｏで投与される各活性成分の量は、前
記患者の年齢及び体重、処置すべき特定の疾患及びその深刻さ、投与の頻度、並
びに投与経路に依存する。
、一元の投与としてヒトの患者及び他の温血動物にとって適した、生理的に別々
の単位を意味し、それぞれの単位は、必要とされる生理的に許容される担体、例
えば希釈剤又は賦形剤と共同して、所望の治療効果を生むために計算された、前
記の２つの活性成分のうち少なくとも１つのあらかじめ決定される有効な及び強
化する量を含んでいる。この発明の単位投与量形態のための記述は、（ａ）前記
活性成分の独特な性質及び達成すべき特定の治療効果、並びに（ｂ）ヒト及び他
の動物における、治療目的の使用のための活性成分などを合成する業界に固有の
限定、によって指示され、そしてこれらに直接的に依存する。この発明に従う適
当な単位投与量形態の例は、錠剤、カプセル、丸剤、粉末小包、顆粒、オブラー
トなど、前記したもののいずれかのうちの、分離したあつまり、並びに液体溶液
、乳濁液及び懸濁液である。ｉｎ ｖｉｖｏで投与される各活性成分の量は、前
記患者の年齢及び体重、処置すべき特定の疾患及びその深刻さ、投与の頻度、並
びに投与経路に依存する。
【００９３】
いずれかの処置養生法において、前記治療用組成物は、単独で、あるいは限定
しないが免疫抑制剤、耐性誘導剤、増強剤及び副作用軽減剤を含む、他の治療用
薬剤、組成物などを含むカクテルで患者に投与されてもよい。特に好ましいのは
、宿主のアレルギー性反応を抑制するのに有用な免疫抑制剤である。好ましい免
疫抑制剤は、プレドニゾン、メルファラン、プレドニゾロン、ＤＥＣＡＤＲＯＮ
（Merck, Sharp & Dohme, West Point, Pennsylvania）、シクロホスファミド、
シクロスポリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、アザチオプリン及
びｉ．ｖ．ガンマグロブリン又はそれらの組合わせを含む。好ましい増強剤は、
モネンシン（monensin）、塩化アンモニウム、ペルヘキシリン、ベラパミル、ア
マンタジン及びクロロキンを含む。これらの薬剤は全て、一般的に許容され、効
きめのある投与量範囲、例えばPhysician's Desk Reference, 41st Ed., Publis
her Edward R. Barnahart, N.J. (1987)に開示されているもので投与される。特
許協力条約（ＰＣＴ）の特許出願ＷＯ８９／０６９７６７は、１９８９年８月１
０日に公表され、そしてこれは引用によって本明細書に組入れられる。
しないが免疫抑制剤、耐性誘導剤、増強剤及び副作用軽減剤を含む、他の治療用
薬剤、組成物などを含むカクテルで患者に投与されてもよい。特に好ましいのは
、宿主のアレルギー性反応を抑制するのに有用な免疫抑制剤である。好ましい免
疫抑制剤は、プレドニゾン、メルファラン、プレドニゾロン、ＤＥＣＡＤＲＯＮ
（Merck, Sharp & Dohme, West Point, Pennsylvania）、シクロホスファミド、
シクロスポリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、アザチオプリン及
びｉ．ｖ．ガンマグロブリン又はそれらの組合わせを含む。好ましい増強剤は、
モネンシン（monensin）、塩化アンモニウム、ペルヘキシリン、ベラパミル、ア
マンタジン及びクロロキンを含む。これらの薬剤は全て、一般的に許容され、効
きめのある投与量範囲、例えばPhysician's Desk Reference, 41st Ed., Publis
her Edward R. Barnahart, N.J. (1987)に開示されているもので投与される。特
許協力条約（ＰＣＴ）の特許出願ＷＯ８９／０６９７６７は、１９８９年８月１
０日に公表され、そしてこれは引用によって本明細書に組入れられる。
【００９４】
IV．診断のためのアッセイ及びキット
細胞毒性因子をコードするＤＮＡを、ガン患者の腫瘍に対して標的化すること
に加えて、本発明の融合ポリペプチドはまた、腫瘍の解剖学的位置を検出するた
めに、ある型の腫瘍細胞に有用であることがある。その様な決定は、それぞれの
特定の患者における抗腫瘍治療の次なる計画にとって有用であることがある。特
に、組織切片（例えば生検材料）、液性試料（例えば血液）又は細胞学的製剤に
おける免疫組織化学的診断は、本発明の融合ポリペプチドを用いて行うことがで
きる。
に加えて、本発明の融合ポリペプチドはまた、腫瘍の解剖学的位置を検出するた
めに、ある型の腫瘍細胞に有用であることがある。その様な決定は、それぞれの
特定の患者における抗腫瘍治療の次なる計画にとって有用であることがある。特
に、組織切片（例えば生検材料）、液性試料（例えば血液）又は細胞学的製剤に
おける免疫組織化学的診断は、本発明の融合ポリペプチドを用いて行うことがで
きる。
【００９５】
好ましい態様において、検出は前記融合ポリペプチドに結合した標識の検出に
よる。ポリペプチドの標識手段は当業者に公知である。標識は、共有結合を通し
て直接的に連結しているか、又は典型的に前記標識及び抗体とそれぞれ共有結合
を形成することができる反応部位を有する連結分子を通して、共有的に連結して
いてもよい。通常のアプローチは、前記ポリペプチド及び標識を、アビジン又は
ストレプトアビジン又はビオチンのいずれかで標識することであり、これらは順
番に、不可逆的に互いに結合する。
よる。ポリペプチドの標識手段は当業者に公知である。標識は、共有結合を通し
て直接的に連結しているか、又は典型的に前記標識及び抗体とそれぞれ共有結合
を形成することができる反応部位を有する連結分子を通して、共有的に連結して
いてもよい。通常のアプローチは、前記ポリペプチド及び標識を、アビジン又は
ストレプトアビジン又はビオチンのいずれかで標識することであり、これらは順
番に、不可逆的に互いに結合する。
【００９６】
適当な標識は当業者に公知である。“標識”の用語は、本明細書で使用する場
合、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段で検出可能な
組成物を意味する。例えば、有用な標識は放射性分子、例えば32Ｐ，14Ｃ， 125 Ｉ， 3Ｈ、及び35Ｓ、蛍光染料、例えばフルオレセイン又はローダミン、高電子
密度試薬、酵素（一般にＥＬＩＳＡで使用するもの）、発光酵素、例えばルシフ
ェラーゼなどを含む。
合、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段で検出可能な
組成物を意味する。例えば、有用な標識は放射性分子、例えば32Ｐ，14Ｃ， 125 Ｉ， 3Ｈ、及び35Ｓ、蛍光染料、例えばフルオレセイン又はローダミン、高電子
密度試薬、酵素（一般にＥＬＩＳＡで使用するもの）、発光酵素、例えばルシフ
ェラーゼなどを含む。
【００９７】
この発明はまた、研究又は診断目的のキットを含む。キットは、典型的に本発
明の融合ポリペプチドを含む１又は複数の容器、及び任意に細胞毒性因子をコー
ドするＤＮＡ分子を含む第２の容器を含む。好ましくは、前記の細胞毒性因子を
コードするＤＮＡ配列は、宿主細胞へのトランスフェクション及び宿主細胞での
発現に適したプラスミドにおいて提供される。前記プラスミドは、前記宿主細胞
内で前記ＤＮＡの発現を制御するプロモーター（しばしば誘導可能なプロモータ
ー）を含んでいてもよい。前記プラスミドはまた、他のＤＮＡ配列の、前記プラ
スミドへの挿入を容易にする適当な制限部位を含んでいてもよい。前記プラスミ
ドはまた、コードされるタンパク質のクローニング及び発現を容易にする、多く
の他の因子を含んでいてもよい。その様な因子は当業者に公知であり、そして例
えば、選択可能なマーカー、開始コドン、終止コドンなどを含む。
明の融合ポリペプチドを含む１又は複数の容器、及び任意に細胞毒性因子をコー
ドするＤＮＡ分子を含む第２の容器を含む。好ましくは、前記の細胞毒性因子を
コードするＤＮＡ配列は、宿主細胞へのトランスフェクション及び宿主細胞での
発現に適したプラスミドにおいて提供される。前記プラスミドは、前記宿主細胞
内で前記ＤＮＡの発現を制御するプロモーター（しばしば誘導可能なプロモータ
ー）を含んでいてもよい。前記プラスミドはまた、他のＤＮＡ配列の、前記プラ
スミドへの挿入を容易にする適当な制限部位を含んでいてもよい。前記プラスミ
ドはまた、コードされるタンパク質のクローニング及び発現を容易にする、多く
の他の因子を含んでいてもよい。その様な因子は当業者に公知であり、そして例
えば、選択可能なマーカー、開始コドン、終止コドンなどを含む。
【００９８】
前記融合ポリペプチドは、標識と共に派生したそれら自身であり、あるいは、
それらは次の検出を提供する２次標識と結合してもよい。上述した様に、その様
な標識は放射性標識、蛍光標識、酵素標識、すなわち西洋ワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）などを含めてもよい。前記のキットはまた、適当な２次標識（例え
ばヒツジ抗マウス−ＨＲＰなど）を含んでいてもよい。前記のキットはまた、前
記融合ポリペプチドの結合、非特異的に結合している抗体の除去、及び結合した
標識の検出を容易にする様々な試薬を含んでいてもよい。その様な試薬は当業者
に公知である。
それらは次の検出を提供する２次標識と結合してもよい。上述した様に、その様
な標識は放射性標識、蛍光標識、酵素標識、すなわち西洋ワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）などを含めてもよい。前記のキットはまた、適当な２次標識（例え
ばヒツジ抗マウス−ＨＲＰなど）を含んでいてもよい。前記のキットはまた、前
記融合ポリペプチドの結合、非特異的に結合している抗体の除去、及び結合した
標識の検出を容易にする様々な試薬を含んでいてもよい。その様な試薬は当業者
に公知である。
【００９９】
上述の研究及び診断用のキットを使用する方法は一般的に公知であり、そして
一般的に前記キットの取扱い説明書において提供される。
一般的に前記キットの取扱い説明書において提供される。
【０１００】
本発明は、以下の例によって更に記述されるだろう。
【０１０１】例１ 抗ＣＤ３８ｓｃＦｖコンストラクトの製造
特定の抗体（Ａｂ）が、本発明の治療用組成物において有用であるかどうかを
決定するために、正常な細胞（ＣＤ３８ネガティブ細胞）及びＣＤ３８を高レベ
ルで発現する細胞に対する前記抗体の結合を決定する。特異的結合は、限定しな
いが、フローサイトメトリーを含む、当業者に公知の方法によって決定すること
ができる。フローサイトメトリーのための細胞は、ＰＢＳ＋５％ＦＣＳで洗浄さ
れ、そして同じ緩衝液でおよそ１０6 ／mlに懸濁される。Ａｂの添加の後、細胞
を４℃で３０〜６０分間インキュベートし、ＰＢＳ＋５％ＦＣＳ中で複数回洗浄
する。結合Ａｂは、前記細胞を抗マウスＩｇ又は抗ヒトＩｇのＦＩＴＣ抱合体（
Becton Dickinson及びSigma)と一緒に、３０分間４℃でインキュベートすること
によって可視化する。洗浄後、反応はＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）を用
いて、フローサイトメトリーによって解析される。ＦＩＴＣ−標識抗ＣＤ３８（
クローンＨＢ７；Becton Dickinson）は、ＣＤ３８発現のためのポジティブコン
トロールとして使用することができる。阻害の研究のため、前記の一次Ａｂは前
記細胞と４５分間インキュベートされ、そしてその後、洗浄無しで二次Ａｂを加
えられる。更に４５分後、前記細胞を洗浄し、そしてその後可視化する。
決定するために、正常な細胞（ＣＤ３８ネガティブ細胞）及びＣＤ３８を高レベ
ルで発現する細胞に対する前記抗体の結合を決定する。特異的結合は、限定しな
いが、フローサイトメトリーを含む、当業者に公知の方法によって決定すること
ができる。フローサイトメトリーのための細胞は、ＰＢＳ＋５％ＦＣＳで洗浄さ
れ、そして同じ緩衝液でおよそ１０6 ／mlに懸濁される。Ａｂの添加の後、細胞
を４℃で３０〜６０分間インキュベートし、ＰＢＳ＋５％ＦＣＳ中で複数回洗浄
する。結合Ａｂは、前記細胞を抗マウスＩｇ又は抗ヒトＩｇのＦＩＴＣ抱合体（
Becton Dickinson及びSigma)と一緒に、３０分間４℃でインキュベートすること
によって可視化する。洗浄後、反応はＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）を用
いて、フローサイトメトリーによって解析される。ＦＩＴＣ−標識抗ＣＤ３８（
クローンＨＢ７；Becton Dickinson）は、ＣＤ３８発現のためのポジティブコン
トロールとして使用することができる。阻害の研究のため、前記の一次Ａｂは前
記細胞と４５分間インキュベートされ、そしてその後、洗浄無しで二次Ａｂを加
えられる。更に４５分後、前記細胞を洗浄し、そしてその後可視化する。
【０１０２】
正常、ＭＧＵＳ（Kylc and Lust, Sem. Hemato., 26, 176 (1989))、及び多発
性骨髄腫の患者由来の骨髄細胞を、抗ＣＤ３８抗体で染色した（図１）。各試料
の形質細胞集団のために、同じ機会を設けた後、わずかに０．１９％の正常細胞
が、クローンＭＧＵＳ形質細胞（１．９％）又は骨髄腫細胞（３１．４％）と比
較できるレベルで、ＣＤ３８を発現した。
性骨髄腫の患者由来の骨髄細胞を、抗ＣＤ３８抗体で染色した（図１）。各試料
の形質細胞集団のために、同じ機会を設けた後、わずかに０．１９％の正常細胞
が、クローンＭＧＵＳ形質細胞（１．９％）又は骨髄腫細胞（３１．４％）と比
較できるレベルで、ＣＤ３８を発現した。
【０１０３】
一旦、ＣＤ３８特異的抗体が同定されると、組換えＤＮＡ技術を、これらの抗
体の一部を操作するために適用することができる。免疫グロブリン分子による抗
原認識に重要な可変重鎖（ＶH ）及び軽鎖（ＬH ）ドメインをコードする遺伝子
は、一方の可変領域のカルボキシル末端と、一連の親水性ペプチドをコードする
、他方の使用するヌクレオチドのアミノ末端との連結を通して遺伝学的に修飾す
ることができる。化学的に生成したＦａｂと比較して、これらのｓｃＦｖタンパ
ク質は、元々の抗体の特異性を保持し、そして親和性における比較的重要でない
変化によって、かなりの安定性を有することができる。ＰＣＲ技術が、ｓｃＦｖ
を製造するために特に有用であるのは、ＶH 及びＶL 領域が、ハイブリドーマ細
胞から容易にクローン化され、そして新規の機能ドメインと組合わせることがで
きるためである。ＣＤ３８に特異的なｓｃＦｖ遺伝子は、抗ＣＤ３８ハイブリド
ーマＨＢ７（ＡＴＣＣ取得番号第ＨＢ−１３６号）から、ＰＣＲによって単離し
たＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子から製造した。
体の一部を操作するために適用することができる。免疫グロブリン分子による抗
原認識に重要な可変重鎖（ＶH ）及び軽鎖（ＬH ）ドメインをコードする遺伝子
は、一方の可変領域のカルボキシル末端と、一連の親水性ペプチドをコードする
、他方の使用するヌクレオチドのアミノ末端との連結を通して遺伝学的に修飾す
ることができる。化学的に生成したＦａｂと比較して、これらのｓｃＦｖタンパ
ク質は、元々の抗体の特異性を保持し、そして親和性における比較的重要でない
変化によって、かなりの安定性を有することができる。ＰＣＲ技術が、ｓｃＦｖ
を製造するために特に有用であるのは、ＶH 及びＶL 領域が、ハイブリドーマ細
胞から容易にクローン化され、そして新規の機能ドメインと組合わせることがで
きるためである。ＣＤ３８に特異的なｓｃＦｖ遺伝子は、抗ＣＤ３８ハイブリド
ーマＨＢ７（ＡＴＣＣ取得番号第ＨＢ−１３６号）から、ＰＣＲによって単離し
たＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子から製造した。
【０１０４】
ＶH 及びＶL 遺伝子は、続いて７５０塩基対のＶH −リンカー−ＶL ｓｃＦｖ
を生成するための適当に構築したオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲ重
複伸長技術を用いて、取扱い説明書に従う発現モジュール／組換えファージ抗体
系を用いて融合した（Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ)。任意に、前
記Ｉｇの定常領域の少なくとも一部を前記コンストラクトに導入してもよく、こ
れは所望の特性、例えば、特に本発明の溶液中での増強した安定性をもたらすこ
とがある。全てのコンストラクトは、ＰＣＲが導入した誤りを有するあらゆるク
ローンを除外するために配列決定される。
を生成するための適当に構築したオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲ重
複伸長技術を用いて、取扱い説明書に従う発現モジュール／組換えファージ抗体
系を用いて融合した（Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ)。任意に、前
記Ｉｇの定常領域の少なくとも一部を前記コンストラクトに導入してもよく、こ
れは所望の特性、例えば、特に本発明の溶液中での増強した安定性をもたらすこ
とがある。全てのコンストラクトは、ＰＣＲが導入した誤りを有するあらゆるク
ローンを除外するために配列決定される。
【０１０５】
タンパク質の発現及び精製のために、ベクター、例えばＮｏｖａｇｅｎ（Madi
son, Wisconsin）のｐＥＴベクターを使用してもよい。ｐＥＴ２９ベクターは、
素速いアッセイ及び親和性精製のための開裂可能なＳタグ配列にＮ末端を融合さ
せる。多重クローン化部位は、注目の他のＤＮＡの挿入を行い、その結果、生じ
たものは、開始コドンに関して正確な読み枠の融合ポリペプチドをコードする。
son, Wisconsin）のｐＥＴベクターを使用してもよい。ｐＥＴ２９ベクターは、
素速いアッセイ及び親和性精製のための開裂可能なＳタグ配列にＮ末端を融合さ
せる。多重クローン化部位は、注目の他のＤＮＡの挿入を行い、その結果、生じ
たものは、開始コドンに関して正確な読み枠の融合ポリペプチドをコードする。
【０１０６】
ｓｃＦｖコンストラクトの発現は、約２９kDa の分子量を有するタンパク質を
生成せしめた。ＣＤ３８ポジティブＡＲＨ細胞を、コントロールの上清、又は２
つの異なるｓｃＦｖコンストラクトＦ５−１及びＣ５−２から発現したｓｃＦｖ
ポリペプチドとインキュベートした。続いて、各試料をＥタグ（ｓｃＦｖ分子内
に位置する１５アミノ酸のセグメント）に対する抗体、あるいは導入したＳタグ
（上文を参照のこと）に対する抗体、及び蛍光二次抗体とインキュベートした。
平均チャンネル数の増大（枠内に記載）は、前記の２つのクローンのそれぞれか
ら発現したｓｃＦｖポリペプチドの、ＣＤ３８ポジティブＡＲＨ細胞に結合する
能力を示している。平均チャンネル数の差異は、ＣＤ３８ネガティブ細胞では観
察されなかった（図２）。
生成せしめた。ＣＤ３８ポジティブＡＲＨ細胞を、コントロールの上清、又は２
つの異なるｓｃＦｖコンストラクトＦ５−１及びＣ５−２から発現したｓｃＦｖ
ポリペプチドとインキュベートした。続いて、各試料をＥタグ（ｓｃＦｖ分子内
に位置する１５アミノ酸のセグメント）に対する抗体、あるいは導入したＳタグ
（上文を参照のこと）に対する抗体、及び蛍光二次抗体とインキュベートした。
平均チャンネル数の増大（枠内に記載）は、前記の２つのクローンのそれぞれか
ら発現したｓｃＦｖポリペプチドの、ＣＤ３８ポジティブＡＲＨ細胞に結合する
能力を示している。平均チャンネル数の差異は、ＣＤ３８ネガティブ細胞では観
察されなかった（図２）。
【０１０７】
前記ｓｃＦｖポリペプチドの取込みは、ウェスタンブロット解析によって検出
した。あらかじめ前記ｓｃＦｖポリペプチドとインキュベートした、ＣＤ３８を
発現する８２２６骨髄腫細胞のウェスタンブロット解析は、２９kDa のバンドを
生成せしめた（図３）。前記の２９kDa のバンドは、ＣＤ３８ネガティブ細胞で
は観察されなかった。合計の取込み（Ｔ）と、酸洗浄後の取込みとの間に、差異
が観察されなかったことは、（ａ）前記ｓｃＦｖポリペプチドが、ＣＤ３８＋腫
瘍細胞によってエンドサイトーシスされることを示している（図３）。前記ｓｃ
Ｆｖポリペプチドが効果的に取込まれるという発見が重要であるのは、全ての抗
体分子がエンドサイトーシスされないからである。
した。あらかじめ前記ｓｃＦｖポリペプチドとインキュベートした、ＣＤ３８を
発現する８２２６骨髄腫細胞のウェスタンブロット解析は、２９kDa のバンドを
生成せしめた（図３）。前記の２９kDa のバンドは、ＣＤ３８ネガティブ細胞で
は観察されなかった。合計の取込み（Ｔ）と、酸洗浄後の取込みとの間に、差異
が観察されなかったことは、（ａ）前記ｓｃＦｖポリペプチドが、ＣＤ３８＋腫
瘍細胞によってエンドサイトーシスされることを示している（図３）。前記ｓｃ
Ｆｖポリペプチドが効果的に取込まれるという発見が重要であるのは、全ての抗
体分子がエンドサイトーシスされないからである。
【０１０８】
ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子、例えばプロタミン遺伝子（American Tissue Cu
lture Collection (ATCC)取得番号第１０７５０７号から入手可能）は、続いて
前記ｓｃＦｖコンストラクトに３′を接続（融合）させる（図４）。ヒトプロタ
ミンは、小さい塩基性のＤＮＡ結合タンパク質であり、これは容量が限られてい
る精子の頭部への詰め込みのために、ヒトのゲノムＤＮＡ全体を凝縮させる。正
電荷のプロタミンは、負電荷のＤＮＡのリン酸主鎖と強く相互作用し、中性及び
安定なＤＮＡ−プロタミン複合体をもたらす。前記のｓｃＦｖプロタミン分子は
、前記毒素をコードするプラスミドＤＮＡと相互作用し、可溶性タンパク質複合
体を形成することができる（図５）。
lture Collection (ATCC)取得番号第１０７５０７号から入手可能）は、続いて
前記ｓｃＦｖコンストラクトに３′を接続（融合）させる（図４）。ヒトプロタ
ミンは、小さい塩基性のＤＮＡ結合タンパク質であり、これは容量が限られてい
る精子の頭部への詰め込みのために、ヒトのゲノムＤＮＡ全体を凝縮させる。正
電荷のプロタミンは、負電荷のＤＮＡのリン酸主鎖と強く相互作用し、中性及び
安定なＤＮＡ−プロタミン複合体をもたらす。前記のｓｃＦｖプロタミン分子は
、前記毒素をコードするプラスミドＤＮＡと相互作用し、可溶性タンパク質複合
体を形成することができる（図５）。
【０１０９】
前記ｓｃＦｖ−プロタミンポリペプチドの、ジフテリア毒素の（ＤＴ−ａ）プ
ラスミド複合対へのＤＮＡ結合能力（複合体形成）は、ゲル移動度シフトアッセ
イによって評価される。前記プラスミドを、前記ｓｃＦｖプロタミンポリペプチ
ドの量を増大しながら、０．２Ｍ ＮａＣｌ中で、室温で３０分間インキュベー
トし、そして電気泳動のために、０．８％アガロースゲルにかけた。ＣＤ３８ポ
ジティブ骨髄腫細胞の細胞毒性は、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖプロタミンポリペプチド
単独、ＤＴ−ａプラスミド単独、及び抗ＣＤ３８プロタミンＤＴ−ａ複合体中で
の前記細胞のインキュベーション後に、トリパンブルー染色することによって測
定する。これらの複合体は、抗原発現細胞、例えば多発性骨髄腫細胞に、受容体
が介するエンドサイトーシスによって取込まれる。続く、前記プラスミドＤＮＡ
からの毒素タンパク質の産生は、前記細胞の選択的な死をもたらす。
ラスミド複合対へのＤＮＡ結合能力（複合体形成）は、ゲル移動度シフトアッセ
イによって評価される。前記プラスミドを、前記ｓｃＦｖプロタミンポリペプチ
ドの量を増大しながら、０．２Ｍ ＮａＣｌ中で、室温で３０分間インキュベー
トし、そして電気泳動のために、０．８％アガロースゲルにかけた。ＣＤ３８ポ
ジティブ骨髄腫細胞の細胞毒性は、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖプロタミンポリペプチド
単独、ＤＴ−ａプラスミド単独、及び抗ＣＤ３８プロタミンＤＴ−ａ複合体中で
の前記細胞のインキュベーション後に、トリパンブルー染色することによって測
定する。これらの複合体は、抗原発現細胞、例えば多発性骨髄腫細胞に、受容体
が介するエンドサイトーシスによって取込まれる。続く、前記プラスミドＤＮＡ
からの毒素タンパク質の産生は、前記細胞の選択的な死をもたらす。
【０１１０】
Ｂ細胞における発現の標的化は、毒素遺伝子を、組織特異的転写制御因子、例
えば免疫グロブリンのプロモーター及びエンハンサーと連結させることによって
達成することができる。例えば、ｐＴＨ７３ ＤＴ−ａ（Maxwell et al., 1992
）は、免疫グロブリン重鎖のエンハンサー及び免疫グロブリンκ鎖のプロモータ
ーを含むコンストラクトであり、これらはＤＴ−ａ遺伝子の転写を制御し、形質
細胞を成熟させる。更に、前記のＤＴ−ａ遺伝子は細胞の結合及び取込みに必要
な、天然のジフテリア毒素のドメインの配列を欠失している。従って、溶解した
細胞から放出される発現タンパク質は、周囲の細胞に影響を与えない。
えば免疫グロブリンのプロモーター及びエンハンサーと連結させることによって
達成することができる。例えば、ｐＴＨ７３ ＤＴ−ａ（Maxwell et al., 1992
）は、免疫グロブリン重鎖のエンハンサー及び免疫グロブリンκ鎖のプロモータ
ーを含むコンストラクトであり、これらはＤＴ−ａ遺伝子の転写を制御し、形質
細胞を成熟させる。更に、前記のＤＴ−ａ遺伝子は細胞の結合及び取込みに必要
な、天然のジフテリア毒素のドメインの配列を欠失している。従って、溶解した
細胞から放出される発現タンパク質は、周囲の細胞に影響を与えない。
【０１１１】参考文献
【表１】
【表２】
【０１１２】
全ての刊行物、特許及び特許出願が引用によって本明細書に組入れられる。前
述した明細書において、この発明は、それ自身のある好ましい態様に関して記述
され、そして多くの詳細は例示のために記述されてきたが、当業者には本発明が
更なる態様を可能とし、本明細書に記載の詳細のいくつかが、本発明の基本的な
原理を逸脱することなしに大きく変更できることが明らかであるだろう。
述した明細書において、この発明は、それ自身のある好ましい態様に関して記述
され、そして多くの詳細は例示のために記述されてきたが、当業者には本発明が
更なる態様を可能とし、本明細書に記載の詳細のいくつかが、本発明の基本的な
原理を逸脱することなしに大きく変更できることが明らかであるだろう。
【図１】
図１は、正常及び骨髄腫細胞への抗ＣＤ３８抗体の結合の、ＦＡＣＳ解析を表
す。
す。
【図２】
図２は、ＣＤ３８+ ＡＲＨ−９細胞への抗ＣＤ３８ｓｃＦｖの結合の、ＦＡＣ
Ｓ解析を表す。
Ｓ解析を表す。
【図３】
図３は、ＣＤ３８+ ８２２６骨髄腫細胞におけるｓｃＦｖ抗体（コンストラク
トＦ５−１及びＣ５−２により発現）の取込みを示す、ウェスタンブロット解析
を表す。Ｔ＝全取込み。Ａ＝酸洗浄後。
トＦ５−１及びＣ５−２により発現）の取込みを示す、ウェスタンブロット解析
を表す。Ｔ＝全取込み。Ａ＝酸洗浄後。
【図４】
図４は、本発明の例示的な融合ポリペプチドの線図を示す。ＶH ＝重鎖の可変
領域；Ｌ＝リンカー；ＶL 軽鎖の可変領域；Ｐ＝タンパク質。
領域；Ｌ＝リンカー；ＶL 軽鎖の可変領域；Ｐ＝タンパク質。
【図５】
図５は、ＣＤ３８+ 発現細胞への本発明の治療用組成物の結合を示す。２つの
四角を有する円は、ジフテリア毒素Ａをコードするプラスミド分子を示す。
四角を有する円は、ジフテリア毒素Ａをコードするプラスミド分子を示す。
【図６Ａ】
図６Ａは、ＣＤ３８に特異的に結合するｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配
列（配列表１）を表す。
列（配列表１）を表す。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、ＣＤ３８に特異的に結合するｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配
列（配列表１）を表す。
列（配列表１）を表す。
【図６Ｃ】
図６Ｃは、ＣＤ３８に特異的に結合するｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配
列（配列表１）を表す。
列（配列表１）を表す。
【図６Ｄ】
図６Ｄは、ＣＤ３８に特異的に結合するｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配
列（配列表１）を表す。
列（配列表１）を表す。
【図６Ｅ】
図６Ｅは、ＣＤ３８に特異的に結合するｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配
列（配列表１）を表す。
列（配列表１）を表す。
【図６Ｆ】
図６Ｆは、ＣＤ３８に特異的に結合するｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配
列（配列表１）を表す。
列（配列表１）を表す。
【図６Ｇ】
図６Ｇは、ＣＤ３８に特異的に結合するｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配
列（配列表１）を表す。
列（配列表１）を表す。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 35/02 Ａ６１Ｐ 43/00 １２１
43/00 １２１ Ｃ０７Ｋ 16/28
Ｃ０７Ｋ 16/28 19/00
19/00 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91
// Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02
(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ
Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ
，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，
ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ
Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ
，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，
ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ
Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ
，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，
ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ
Ａ，ＺＷ
(72)発明者 ドノバン，キャスリーン エー．
アメリカ合衆国，ミネソタ 55901，ロチ
ェスター，リバー ブラッフス レーン
ノースウエスト 38
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA36 BA80 CA04
DA02 EA04 GA14 HA01 HA12
HA15
4B064 AG01 AG26 CA10 CA19 CC24
DA05
4C084 AA02 AA13 BA35 CA53 DC50
NA14 ZB262 ZB272
4C085 AA14 AA16 AA27 BB31 BB41
BB43 DD62
4H045 AA11 AA30 BA41 CA41 DA75
EA28 FA71 FA74
Claims (18)
- 【請求項１】 治療用組成物であって、 （ａ）ＣＤ３８又はその一部に特異的に結合するポリペプチドと、これと連結し
ている、ＤＮＡ又はその一部に特異的に結合するポリペプチドを含んで成る融合
ポリペプチド；及び （ｂ）細胞又は組織特異的転写単位に作用可能に連結する細胞毒性因子をコード
するＤＮＡ配列 、を含んで成る組成物。 - 【請求項２】 ＣＤ３８に特異的に結合する前記ポリペプチドが抗体である
、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】 前記抗体が、ハイブリドーマＨＢ７によって分泌される抗体
から得られる、請求項２に記載の組成物。 - 【請求項４】 ＤＮＡに特異的に結合する前記ポリペプチドがプロタミンで
ある、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項５】 前記の細胞毒性因子がジフテリア毒のＡ鎖、細胞自殺タンパ
ク質、シュードモナス外毒素、あるいは化学療法剤を活性化する酵素又はタンパ
ク質である、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項６】 前記の転写単位がＢ細胞に特異的である、請求項１に記載の
組成物。 - 【請求項７】 前記の転写単位がＴ細胞に特異的である、請求項１に記載の
組成物。 - 【請求項８】 前記の転写単位が骨髄腫細胞に特異的である、請求項１に記
載の組成物。 - 【請求項９】 前記抗体がヒト化した抗体である、請求項２に記載の組成物
。 - 【請求項１０】 前記の融合ポリペプチドに連結した放射性同位体を更に含
んで成る、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１１】 前記抗体がｓｃＦｖ抗体である、請求項２又は９に記載の
組成物。 - 【請求項１２】 ＣＤ３８に特異的に結合するポリペプチドの少なくとも一
部及びＤＮＡに特異的に結合するポリペプチドの少なくとも一部を含んで成る、
単離して、そして精製した融合ポリペプチド。 - 【請求項１３】 ＣＤ３８＋細胞の生育を阻害する方法であって、有効量の
、請求項１に記載の組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞と接触させることを含んで
成る方法。 - 【請求項１４】 請求項１２に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸セ
グメントを含んで成る、単離して、そして精製した核酸分子。 - 【請求項１５】 多発性骨髄腫、原発性アミロイド症、単一クローン性高ガ
ンマグロブリン血症、又は急性骨髄性白血病の抑制又は処置の方法であって、前
記の処置が必要な哺乳類に有効量の、請求項１に記載の組成物を投与することを
含んで成る方法。 - 【請求項１６】 一本鎖の融合ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子
であって： （ａ）ＣＤ３８に特異的な抗体の軽鎖のＦｖ領域及びＣＤ３８に特異的な抗体の
重鎖のＦｖ領域をコードするＤＮＡ配列（ここで、前記の融合タンパク質は、Ｃ
Ｄ３８+ 細胞に結合する）；並びに、 （ｂ）ＤＮＡに特異的に結合するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、 を含んで成る組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項１７】 組換えにより製造した一本鎖の融合ポリペプチドであって
： （ａ）ＣＤ３８特異的抗体の軽鎖及び重鎖のＦｖ領域；並びに、 （ｂ）ＤＮＡ結合ポリペプチド（ここで、前記Ｆｖ領域及び前記ＤＮＡ結合ポリ
ペプチドは、組換えによって融合し、ＣＤ３８+ 細胞に特異的に結合する一本鎖
のポリペプチドを形成する）、 を含んで成るポリペプチド。 - 【請求項１８】 組換えによって製造した一本鎖の融合ポリペプチドを、腫
瘍細胞の増殖を抑制するのに十分な濃度で、医薬として許容される担体と一緒に
含んで成る医薬組成物であって、前記融合ポリペプチドが： （ａ）抗体の一本鎖のＦｖ領域（ここで、前記Ｆｖ領域は、前記抗体のＶH 及び
ＶL 領域を含んで成る）；並びに、 （ｂ）ＤＮＡ結合ポリペプチド（ここで、前記Ｆｖ領域及び前記のＤＮＡ結合ポ
リペプチドは組換によって融合し、ＣＤ３８+ 細胞に特異的に結合する単一分子
を形成する）、 を含んで成る医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8827798P | 1998-06-05 | 1998-06-05 | |
| US60/088,277 | 1998-06-05 | ||
| PCT/US1999/012512 WO1999062526A2 (en) | 1998-06-05 | 1999-06-04 | Use of genetically engineered antibodies to cd38 to treat multiple myeloma |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003524587A true JP2003524587A (ja) | 2003-08-19 |
| JP2003524587A5 JP2003524587A5 (ja) | 2006-07-13 |
Family
ID=22210441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000551782A Pending JP2003524587A (ja) | 1998-06-05 | 1999-06-04 | 多発性骨髄腫を処置するための、ｃｄ３８に対する、遺伝子操作した抗体の使用 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20010031261A1 (ja) |
| EP (1) | EP1085882A2 (ja) |
| JP (1) | JP2003524587A (ja) |
| AU (1) | AU770718B2 (ja) |
| CA (1) | CA2329940A1 (ja) |
| WO (1) | WO1999062526A2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007142241A1 (ja) * | 2006-06-05 | 2007-12-13 | Hiroshima University | 抗ｃｄ３８抗体を細胞表面に有する免疫担当細胞 |
| JP2012510463A (ja) * | 2008-11-28 | 2012-05-10 | サノフイ | Ｃｄ３８を特異的に認識する抗体とシタラビンを含有する抗腫瘍性組合せ剤 |
| JP2012510461A (ja) * | 2008-11-28 | 2012-05-10 | サノフイ | Ｃｄ３８を特異的に認識する抗体およびメルファランを含有する抗腫瘍性組合せ剤 |
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|---|---|---|---|---|
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| US20110110937A1 (en) * | 2004-05-12 | 2011-05-12 | Simon Michael R | Composition and method for introduction of rna interference sequences into targeted cells and tissues |
| US20050260214A1 (en) * | 2004-05-12 | 2005-11-24 | Simon Michael R | Composition and method for introduction of RNA interference sequences into targeted cells and tissues |
| US20110117088A1 (en) * | 2004-05-12 | 2011-05-19 | Simon Michael R | Composition and method for introduction of rna interference sequences into targeted cells and tissues |
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| EP2799451A1 (en) * | 2005-05-24 | 2014-11-05 | MorphoSys AG | Generation and profiling of fully human HuCAL GOLD®-derived therapeutic antibodies specific for human CD38 |
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| US20070106233A1 (en) * | 2005-10-20 | 2007-05-10 | Percutaneous Systems, Inc. | Systems and methods for dilating and accessing body lumens |
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| EP2191841A1 (en) | 2008-11-28 | 2010-06-02 | Sanofi-Aventis | Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and vincristine |
| DK2580243T3 (da) | 2010-06-09 | 2020-01-13 | Genmab As | Antibodies against human cd38 |
| PT2608809T (pt) | 2010-08-27 | 2019-08-26 | Gilead Biologics Inc | Anticorpos para a metaloproteinase 9 da matriz |
| HUE031956T2 (en) | 2010-09-27 | 2017-08-28 | Morphosys Ag | Anti-CD38 antibody and lenalidomide or bortezomib for the treatment of multiple myeloma and NHL |
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