CZ20031983A3 - Specifické protilátky pro selektivní léčbu rakoviny - Google Patents

Description

Specifické protilátky pro selektivní léčbu rakoviny 71ϊ

Oblast techniky [1.] Předkládaný vynález se týká tkáňového cílení a identifikace, s použitím metody fágového displeje (phage display technologie), peptidů a polypeptidů, které se specificky vážou k cílovým buňkám. Takovými peptidy a polypeptidy jsou molekuly Fv, jejich konstrukty, fragmenty jak konstruktů, tak fragmentů. Konkrétně, peptidy a polypeptidy mohou mít protirakovinnou účinnost a/nebo jsou asociovány nebo konjugovány s protirakovinnými látkami, zejména proti rakovině krve.

Dosavadní stav techniky [2.] Tkáňové selektivní cílení terapeutických látek je nově vznikající disciplínou ve farmaceutickém průmyslu. Nová léčba rakoviny na základě cílení byla navržena ke zvýšení specifičnosti a účinnosti léčby za snížení toxicity, a tím zvýšení celkové účinnosti. Byly vyvinuty myší monoklonální protilátky (MAb's) proti antigenům asociovaným s nádory ve snaze o cílení toxinu, radionukleotidu a chemoterapeutických konjugátů na nádory. Kromě toho byly diferenciační antigeny, jako CD19, CD20, CD22 a CD25, využity jako nádorově specifické cíle v ošetřování hematopoetických malignit. Ačkoliv byl tento postup rozsáhle studován, má několik omezení. Jedním z omezení je obtížnost izolace vhodných monoklonálních protilátek, které vykazují selektivní vazbu. Druhým omezením je potřeba vysoké protilátkové imunogenity, jako předpokladu pro úspěšnou izolaci protilátky. Třetím omezením je vyvolání imunitní odpovědi u pacienta proti • · · · ·· ··· ··· ··· ·· ·· myším protilátkám (huraan anti-mouse antibody - HAMA response), která má často za následek kratší biologický poločas myší protilátky v séru, brání opakovaným ošetřením, čímž snižuje terapeutickou hodnotu protilátky. Poslední uvedené omezení stimulovalo zájem jak o konstruování chimérických nebo humanizovaných monoklonálních protilátek myšího původu, tak i o nalezení lidských protilátek.

[3.] Existuje mnoho faktorů, které ovlivňují terapeutickou účinnost monoklonálních protilátek (MAbs) pro léčbu rakoviny. Tyto faktory zahrnují specifičnost exprese antigenu na nádorové buňce, hladinu exprese, antigenní heterogenitu a dostupnost hmoty nádoru. Leukémie a lymfomy jsou obecně citlivější na léčbu protilátkami, než pevné nádory, jako jsou karcinomy. MAbs se rychle vážou k leukemickým a lymfatickým buňkám v krevním řečišti a snadno penetrují k maligním buňkám v lymfatických tkáních, čímž se lymfoidní nádory stávají vynikajícími kandidáty na léčbu s pomocí monoklonálních protilátek. Ideální systém by měl přinášet identifikaci Mab k rozpoznání markérů na buněčném povrchu kmenových buněk, které produkují maligní buněčné potomstvo.

[4.] Pro nalezení/produkci MAbs byly použity fágové knihovny pro selekci náhodných jednořetězcových Fvs (scFvs), které se vážou k izolovaným, predeterminovaným cílovým proteinům, jako jsou protilátky, hormony a receptory. Kromě toho, použití protilátkových expozičních (displejových) knihoven (antibody display libraries)obecně a fágových scFv knihoven obzvláště napomáhá alternativnímu způsobu nalezení jedinečných molekul pro cílení na specifické, dosud nerozpoznané a neurčené látky buněčného povrchu.

• · · · · ·

[5.] Leukémie, lymfomy a myelomy jsou nádory, které vznikají v kostní dřeni a lymfatických tkáních a jsou zapojeny do nekontrolovaného růstu buněk. Akutní lymfoblastická leukémie („ALL) je heterogenní onemocnění, které je definováno specifickými klinickými a imunologickými znaky. Tak jako u jiných forem ALL, nejsou rozhodující příčiny většiny případů B-buněčné ALL („B-ALL) známy, ačkoliv v mnoha případech vzniká onemocnění na základě získaných genetických změn v DNA jedné buňky, které způsobují, že se buňka stává abnormální a kontinuálně se množící.

[6.] Akutní myeloidní leukémie (AML) je heterogenní skupina neoplazmat (novotvarů) s progenitorovou buňkou, která za normálních podmínek dává vzniknout terminálně diferencovaným buňkám z myeloidní řady (erytrocytům,. granulocytům, monocytům a destičkám). Podobně jako u jiných forem neoplasie, je AML spojena se získanými genetickými změnami, které vedou v záměnu normálně diferencovaných myeloidních buněk relativně nediferencovanými blasty, které vykazují jeden nebo více typů časné myeloidní diferenciace. Obecně se AML vyvíjí v kostní dřeni a v menším stupni v sekundárních hematopoetických orgánech. AML primárně postihuje dospělé s vrcholem incidence mezi 15. až 40. rokem věku, ale je rovněž známo, že postihuje jak děti, tak starší dospělé jedince. Téměř všichni pacienti s AML vyžadují léčbu bezprostředně po diagnóze, aby bylo dosaženo klinické remise, ve které nejsou prokazatelné abnormální hladiny cirkulujících nediferencovaných blastických bunělf.

[7.] Až dosud byla připravena řada monoklonálních protilátek, které indukují cytolytickou aktivitu proti • · · · nádorovým buňkám. Humanizovaná verze monoklonální protilátky MuMAb4D5, směrovaná na extracelulární doménu receptoru růstového faktoru P185 (HER2), byla povolena FDA (Food and Drug Administration) a používána k léčbě lidských nádorů prsu (US Patenty č. 5 821 337 a 5 720 954). Po navázání je protilátka schopna inhibovat růst nádorových buněk, který je závislý na receptoru růstového faktoru HER2. Kromě toho byla nedávno povolena chimérická protilátka proti CD20, která způsobuje rychlou depleci periferních B buněk, včetně těch, které jsou spojeny s lymfomem, a je v současnosti používána v klinické léčbě „low-grade B-cell non Hodgkin's lymphoma (pomalu rostoucího lymfoblastického lymfomu).

[8.] Ve vývoji je řada dalších humanizovaných chimérických protilátek, nebo jsou používány v klinických zkouškách. Kromě toho, humanizovaný Ig, který specificky reaguje s antigenem CD33 exprimovaným na normálních myeloidních buňkách, stejně jako na většině typů myeloidních leukemických buněk, byl konjugován s protinádorovým léčivem calicheamicinem, CMA-676 (Sievers et al., Blood. Supplement, 308, 504a (1997)). Tento konjugát, známý jako léčivo MYLOTARG , získal nedávno schválení FDA (Caron et al., Cancer Supplement, 73, 10491056 (1994)). Vzhledem ke své cytolytické aktivitě byla další protilátka proti CD33 (HumM195), která je v současnosti v klinických zkouškách, konjugována s několika cytotoxickými látkami, včetně geloninového toxinu (McGraw et al., Cancer Immunol.Immunother., 39, 367374 (1994)), a radioizotopy ¹³¹I (Caron et al, Blood 83,

1760-1768 (1994)), ⁹⁰Y (Jurcic et al., Blood Supplement,

92, 613a (1998)) a ²¹³Bi (Humm et al., Blood Supplement, 38:231P (1997)).

·· ···· · · ·· ··«· ··· ·· ·· · · » • · ··· * « · · · • · ·* « · · · · · [9.] Chimérická protilátka proti leukocytárnímu antigenu CD-45 (cHuLym3) je v preklinické fázi pro léčbu lidské leukémie a lymfomů (Sun et al., Cancer Immunol. Immunother. , 48, 595-602 (2000)) jako kondiciující pro transplantaci kostní dřeně. Ve zkouškách in vitro, byla pozorována specifická lyže buněk v testu ADCC (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) (Henkart, Immunity,

1, 343-346 (1994); Squier and Cohen, Current Opin.Immunol., 6, 447-452 (1994)).

[10.] Ačkoliv se tyto předběžné výsledky zdají být slibné, mají následující omezení. Konečný produkt obsahuje , nehumánní sekvence, které vedou k problematické imunitní odpovědi na materiál, který není lidského původu, jako je HAMA. Tato HAMA odpověď brání opakovanému ošetření a vede u produktu ke kratšímu biologickému poločasu v séru. Kromě toho umožňují výše uvedené metody izolaci pouze jediného typu protilátky a umožňují pouze izolaci protilátek proti známým a purifikovaným antigenům. Dále, tyto metody nejsou natolik selektivní, aby umožnily izolaci protilátek proti markérům buněčného povrchu, které jsou přítomny na normálních buňkách stejně jako na maligních buňkách.

[11.] Z tohoto důvodu by byla žádoucí metoda, která překonává výše diskutovaná omezení. Kromě toho by taková metoda v ideálním případě například umožňovala identifikaci cílových ligandů nebo markérů na rakovinných buňkách nebo na buňkách zúčastněných ve zprostředkování metastáze rakovinných buněk. Navíc by taková metoda rovněž umožňovala přípravu protilátek k takovým cílům. Ukazuje se, že metoda fágového displeje nabízí takové možnosti.

• · · · · · • · · • · ·9· • · · • · · · · [12.] Použití metody fágového displeje umožnilo izolaci scFvs obsahujících zcela lidské sekvence. Tak například, nedávno byla vyvinuta zcela lidská protilátka proti lidskému receptoru TGFb2, založená na klonu scFv odvozeném pomocí fágového displeje. Tento scFv, převedený do zcela lidského IgG4, který je schopen kompetice o vazbu s TGFb2 (Thompson et al., J. Immunol. Methods, 227, 17-29 (1999), má silnou antiproliferativní aktivitu. Tato technologie, známá odborníkům v oboru, je detailněji popsaná v následujících publikacích: Smith, Science, 228, 1315 (1985); Scott et al., Science, 249, 386-390 (1990); Cwirla et al., PNAS, 87, 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249, 404-406 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 13(14), 3245-3260 (1994); Bass et al., Proteins, 8, 309-314 (1990); McCafferty et al., Nátuře, 348, 552-554 (1990); Nissim et al., EMBO J., 13, 692-698 (1994); US Patenty č. 5 427 908,

432 018, 5 223 409 a 5 403 484, lib.

[13.] S použitím metody fágového displeje identifikovali původci předkládaného vynálezu buněčné markéry přítomné na nebo v buňkách v chorobném nebo maligním stavu. Z tohoto důvodu je předmětem vynálezu identifikace peptidů a polypeptidů, které rozpoznávají buněčné markéry, které jsou podstatně exponované (vystavené, odkryté) nebo zvýšeně exprimované (overexpressed), konkrétně na nebo v buňkách v chorobném nebo maligním stavu.

[14. Dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je použití a rozvinutí metody fágového displeje, jako prostředku pro identifikaci takových peptidů a polypeptidů.

• · · ·

[15.] Dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je identifikace takových peptidu a polypeptidů pomocí imunologické křížové reaktivity.

[16.] Ještě dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je, že uvedené peptidy a polypeptidy jsou zcela lidského původu.

[17.] Ještě dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je, že takové peptidy a polypeptidy jsou izolovány proti antigenům, které nemusejí být nezbytně imunogenní.

[18.] Ještě dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je poskytnutí peptidů nebo polypeptidů, které brání, zpomalují nebo léčí rakovinu, konkrétně rakovinu krve včetně leukémie nebo lymfomu.

[19.] Ještě dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu místního cílení rakovinných buněk takovými peptidy a polypeptidy buďto samotnými, nebo asociovanými nebo vázanými s protirakovinným agens a/nebo diagnostickou značkou nebo markérem.

[20.] Ještě dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je poskytnutí metody pro přípravu cílových agens proti požadovaným ligandům.

[21.] Ještě dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je identifikace specifických motivů, které umožňují rozpoznání buněčných markérů, jež jsou v maligním stavu zvýšeně exprimovány, a které mohou být použity ke konstrukci cílové nebo diagnostické značky nebo markéru pro protirakovinné agens.

«· ·· [22.] Ještě dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je poskytnutí kompozice obsahující účinné množství takových peptidů, polypeptidů nebo motivů asociovaných nebo vázaných s protirakovinným agens nebo s diagnostickou značkou nebo markérem.

[23.] Bylo prokázáno, že scFv penetrují tkáněmi a jsou odstraněny z krve rychleji než protilátka o úplné velikosti, protože mají menší velikost. Adams, G.P., et al., Br.J.Cancer 77, 1405-1412 (1988); Hudson, P.J., Curr. Opin. Immunol. 11(5), 548-557 (1999); Wu, A.M., et al., Tumor Targeting 4, 47 (1999). Z tohoto důvodu jsou scFv často použity v diagnostice zahrnující radioaktivní značky, jako je zobrazení nádorů, což umožňuje mnohem rychlejší odstranění radioaktivního značení z těla. Celá řada scFV multimerů cílených proti nádorům je v současné době v preklinickém hodnocení stability in vivo a účinnosti. Adams, G.P., et al., Br.J. Cancer ΊΊ, 1405-1412 (1988); Wu, A.M. et al., Tumor Targeting 4, 47 (1999).

[24.] Jednořetězcové fragmenty Fv (scFv) jsou obsaženy ve variabilních doménách těžkých (V_H) a lehkých (V_L) řetězců protilátky, spojených dohromady polypeptidovým linkerem. Linker je dostatečně dlouhý, aby umožnil (V_H) a (V_L) doménám poskládání do funkční domény Fv, která umožňuje scFv rozpoznávat a vázat svůj cíl s podobnou nebo zvýšenou afinitou základní (parent) protilátky. Běžně používaný linker obsahuje zbytky glycinu a šeřinu, které poskytují flexibilitu a proteázovou odolnost.

[25.] Monomery scFv jsou typicky navrhovány s C-koncem V_H domény připojeným polypeptidovým linkerem • · · 9 • · ·· · k N-terminálnímu zbytku V_L. Případně je zavedena inverzní orientace: C-terminální konec V_L domény je spojen s N-terminálním koncem V_H pomocí polypeptidového linkeru. Power, B., et al., J. Immun. Meth. 242, 193-204 (2000). Polypeptidový linker je typicky o délce přibližně dvanácti aminokyselinových zbytků. Jestliže je linker redukován na přibližně tři až dvanáct aminokyselin, nemohou se scFvs poskládat do funkční domény Fv a místo tohoto asociují s druhým scFv za tvorby diabody (dimerů). Dalši snížení délky likéru na méně než tři aminokyseliny podporuje asociaci scFv do trimerů nebo tetramerů v závislosti na délce linkeru, složení a doménové orientaci Fv. B.E.Powers, P.J.Hudson, J.Immuno. Meth. 242 (2000) 193-194.

[26.] Nedávno bylo prokázáno, že multivalentní protilátkové fragmenty, jako jsou dimery, trimery a tetramery, často poskytují očividně vyšší afinitu k cíli ve srovnání s vazbou základní protilátky. Vyšší afinita nabízí mnoho výhod včetně ideální farmakologické kinetiky při cílených aplikacích na nádory.

[27.] Vyšší vazebná afinita těchto multivalentních forem je žádoucí v diagnostických a terapeutických režimech. Tak například, scFv může být použit jako blokující agens vazby cílového receptoru, a tím blokuje vázání „přirozeného ligandu. V takových případech je žádoucí mít vyšší afinitní asociaci mezi scFv a receptorem tak, aby byla snížena možnost oddělení, která může umožnit nežádoucí vazbu přirozeného ligandu na cíl. Kromě toho, tato vysoká afinita je významná zejména tehdy, jestliže cílové receptory jsou zúčastněny v adhezi a rolování (rolling), nebo, jestliže jsou cílové receptory na buňkách, • ♦ · ·

..........

které jsou přítomny v místech vysokého proudění (high sheer flow), jakými jsou krevní destičky.

[28.] Z tohoto důvodu jsou předmětem vynálezu multivalentní formy Yl a Y17 scFv. Tyto multivalentní formy zahrnují, bez omezení, dimery, trimery a tetramery, které jsou zde někdy uváděny jako diabodies, triabodies resp. tetrabodies .

Podstata vynálezu [29.] Předkládaný vynález poskytuje identifikaci peptidů a polypeptidů, které se vážou selektivně a/nebo specificky k cílovým buňkám, zejména k buňkám rakoviny krve, jejich konstrukci, použití jich samotných, nebo v asociaci či v kombinaci, konjugovaných nebo fúzovaných s jedním nebo více farmaceutickým agens.

[30.] Jedno provedení podle předkládaného vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt fragmentu mající zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se váže selektivně a/nebo specificky k cílové buňce ve prospěch jiných buněk, přičemž vazebná selektivita nebo specifičnost je primárně determinována první hypervariabilní oblastí a Fv je jednořetězcový Fv („scFv) nebo disulfidový Fv („dsFv), případně mající jednu nebo více identifikátorových sekvencí (tags).

[31.] V jiném provedení podle předkládaného vynálezu je poskytnut peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou nebo konstrukt fragmentu, mající zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se váže selektivně a/nebo specificky k podstatně exponovanému ·· ···· • · ♦ · ♦·· · · Z z * :: : · · · · i ; .

* · · · · ·« · ii ..... ..........

a/nebo zvýšeně exprimovanému vazebnému místu na nebo v cíli obsahujícím buňku ve prospěch jiných buněk, na kterých nebo ve kterých není vazebné místo podstatně dostupné a/nebo exprimované, a kde vazebná selektivita nebo specifičnost je primárně determinována první hypervariabilní oblastí, a kde Fv je scFv nebo dsFv, případně mající jednu nebo více identifikátorových,sekvencí (tags).

[32.] V dalším provedení podle předkládaného vynálezu je poskytnut peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt fragmentu mající zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se váže selektivně a/nebo specificky k cílové buňce ve prospěch jiných buněk, přičemž molekula Fv obsahuje první řetězec, mající první, druhou a třetí hypervariabilní oblast, a druhý řetězec, mající první, druhou a třetí hypervariabilní oblast, přičemž jedna z hypervariabilních oblastí prvního řetězce má sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24, a přičemž jedna z hypervariabilních oblastí druhého řetězce má sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202, a kde prvními, druhými a třetími hypervariabilními oblastmi jsou oblast CDR3, CDR2 a CDR1 v uvedeném pořadí, a kde Fv je scFv nebo dsFv, případně mající jednu nebo více identifikátorových sekvencí (tags).

[33.] V dalším provedení vynálezu (a) každý první a druhý řetězec obsahuje první hypervariabilní oblast vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24, (b) první hypervariabilní oblasti prvních a druhých řetězců jsou identické a jsou vybrány ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24, • · (c) první hypervariabilní oblast prvního řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24 , a první hypervariabilní oblast druhého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-2002, nebo (d) první hypervariabilní oblast prvního řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-2002, a první hypervariabilní oblast druhého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.

[34.] V dalším provedením podle předkládaného vynálezu je poskytnut peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt fragmentu, který se váže k neznámému ligandu na první buňce mající první a druhé stadium, kde vazba je účinná ve druhém stadiu, avšák nikoliv podstatně v prvním stadiu, a v důsledku imunologické křížové reaktivity se váže specificky nebo selektivně k ligandu na druhé buňce, přičemž Fv je scFv nebo dsFv, případně mající jednu nebo více identifikátorových sekvencí (tags).

[35.] V dalším provedení podle předkládaného vynálezu je,poskytnuta metoda identifikace cílící molekuly, která se váže imunologickou křížovou reakcí k neznámému vazebnému místu na prvních a druhých buňkách zahrnující (a) jeden nebo více kroků biopanningu (vybrání), který je prováděn na první cílové buňce tak, že ve druhém stadiu, avšak nikoliv v prvním stadiu, dochází k podstatné expozici nebo vystavení vazebného místa obsahujícího neznámý ligand za vzniku první populace rozpoznávacích molekul;

♦ · ···· • · · • · ···

·· · · · (b) následný biopanning a/nebo selekční stupně zahájené na výsledném produktu rozpoznávacích molekul z kroku (a), který je prováděn na druhé buňce exprimující vazebné místo obsahující neznámý ligand mající imunologickou křížovou reaktivitu k neznámému ligandu první buňky, a je tak produkována druhá populace rozpoznávacích molekul;

(c) amplifikaci a purifikaci druhé populace rozpoznávacích molekul ze stupně (b); a (d) konstrukci peptidů nebo polypeptidů z rozpoznávacích míst z purifikovaných rozpoznávacích molekul z kroku (c), které obsahují cílové molekuly, jež jsou selektivní a/nebo specifické pro neznámé ligandy na druhé buňce [36.] Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu je poskytnut vazebný motiv obsahující aminokyselinovou sekvenci Ri-X Phe Pro-R2, kde R_x a R₂ každý zahrnuje 0-15 aminokyselinových zbytků a kde X je buďto Arg, Gly nebo Lys.

[37.] Ještě v dalším provedení podle předkládaného vynálezu je poskytnut způsob produkce cílících agens zahrnující následující kroky:

(a) izolaci a selekci jedné nebo více cílících molekul, obsahujících primární rozpoznávací místo metodou, biopanningu přímo na cílové buňce, nebo postupem biopanningu nepřímo na první cílové buňce ve druhém, avšak nikoliv v prvním stadiu, a následně biopanningu přímo na druhé cílové buňce k získání jedné nebo více cílících molekul;

·· ···· • · · • · ··· • · · · • · « ·· ··· ·· ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· identifikaci jedné nebo z jedné nebo více (b) amplifikaci, purifikaci a více cílících molekul;

(c) konstrukci cílového agens cílících molekul nebo jejich rozpoznávacích míst;

přičemž cílícím agens může být peptid, polypeptid, protilátka nebo fragment protilátky nebo její multimer.

[38.] V dalším provedení podle předkládaného vynálezu je poskytnut peptid nebo polypeptid mající vzorec nebo strukturu:

A - X - B, kde X je hypervariabilní oblast CDR3 ze 3 až 30 aminokyselin; každý z A a B mohou být aminokyselinové řetězce o délce od 1 do 1000 aminokyselin, kde A je aminokonec a B je karboxykonec.

Stručný popis obrázků [39.] Vynález je zde popsán detailněji v příkladech provedení, nikoliv však omezujícím způsobem, s odkazy na doprovodné níže uvedené obrázky.

[40.] Obrázek 1 znázorňuje vazbu fágových klonů (phage cloně binding) k fixovaným destičkám, jak bylo stanoveno EAI zkouškou. Hodnoty jsou uvedeny jako funkce absorbance při 405 nm.

[41.] Obrázky 2a, 2b a 2c znázorňují vazbu mononukleárních buněk ze vzorků, získaných od tří jednotlivých pacientů s AML, na scFvs, jak byla stanovena FACS analýzou. Je uvedena fluorescenční intenzita buněk vázaných se dvěma FITC-značenými testovanými vzorky (kontrolní scFv a scFv klon Yl) ·· ····

[42.] Obrázek 3 znázorňuje vazbu Y-I k destičkám (3a) a monocytům (3b), které byly purifikovány Ficcolem, stanovenou FACS analýzou. Je uvedena fluorescenční intenzita buněk vázaných se dvěma FITC-značenými testovanými vzorky (kontrolní scFv a scFv klon Yl) [43.] Obrázek 4 znázorňuje vazbu FITC-značeného scFv klonu Yl ke kmenovým buňkám CD34+ z pupečníkové krve. Vstupující CD34+ buňky v kanálu FL3-H byly analyzovány v kanálu FLI-H na svoji vazbu k FITC-značené negativní kontrole scFv (Obr. 4a), nebo k FITC značenému scFv klonu Yl (Obr. 4b). Obrázek 4c představuje FSC a SSC bodový graf analýzy vzorku téhož FITC-značeného scFv klonu Yl, jako v případě 4b. Kruhem vyznačené oblasti na obrázcích 4b a 4c zobrazují subpopulaci buněk CD34+, která se váže s scFv klonem Yl.

[44.] Obrázek 5 znázorňuje FACS analýzu vzorků získaných od dvou pacientů s pre-B-ALL buňkami: jednoho od dítěte (5a, 5c, 5e) a druhého od dospělého pacienta (5b,

5d, 5f). Byla provedena metoda dvojího barvení s použitím PE-značeného CD19 (markér pro normální periferní B-buňky, Obrázky 5a, 5c) nebo PE-značeného CD34 (markér pro kmenové buňky, Obrázek 5d), společně s FITC-značenou negativní kontrolou scFv (5a, 5b) nebo FITC-značeným Y-I scFV (5c,

5d). Obrázek 5b uvádí dvojitou negativní kontrolu. Je uvedena fluorescenční intenzita (osa x) buněk vázaných s FITC-značeným vzorkem (scFv klon Yl), ve srovnání s barvením negativního kontrolního vzorku (5e a 5f).

[45.] Obrázek 6 uvádí výsledky srovnávací studie vazby s použitím buněk Jurkat. Je znázorněna FACS analýza vazby ·· ♦··· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· • * · ·· ·· • · · · · · · • · · · ♦ · • · · · · * · ··· ··· ··· scFv monomery, diabodies kontrolou.

buněk Jurkat s FITC-značenými Y-I a triabodies společně s negativní [46.] Obrázek 4 poskytuje výsledky studie srovnávající vazbu IgG-Y-I a scFv-ΥΙ. Byla provedena metoda dvojího barvení pro srovnání vazebnosti IgG-ΥΙ o úplné délce ve srovnání s scFv-ΥΙ formou. Pět nanogramů IgG-ΥΙ bylo použito pro FACS analýzu na buňkách RÁJI (Yl negativní buňky; Obrázek 7a) a na buňkách Jurkat (Yl pozitivní buňky; Obrázek 7b). Pro detekci byl použit značený PE kozí protilidský IgG.

[47.] Obrázek 8 ukazuje srovnání vazby mezi dimerem Yl, Yl scFv (C0NY1) a Yl IgG.

[48.] Obrázek 9 ukazuje srovnání vazby mezi dimerem Yl se sulfidovým můstkem a Yl scFv (CONY1).

[49.] Obrázek 10 je graf znázorňujícího profil Superdex 75 pro Yl-cys-kak.

[50.] Obrázek 11 se týká velikosti dimerů ve srovnání s monomerem za redukčních a neredukčních podmínek.

[51.] Obrázek 12 poskytuje výsledky zkoušky ELISA.

[52.] Obrázek 13 uvádí schéma epitopů protilátek antiGPIba.

[53.] Obrázek 14 je aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:.203.

·· ···· ·· ··*· « · • · · « ·· ···

Podrobný popis vynálezu [54.] Specifičnost je zde definována jako rozpoznání cílového ligandu jednou nebo více doménami v peptidu nebo polypeptidu podle vynálezu a k němu následné navázání.

[55.] Selektivita je zde definována jako schopnost cílící molekuly vybrat a vázat buňku jednoho typu nebo buněčného stadia ze směsi buněčných typů nebo buněčných stadií, všech buněčných typů nebo buněčných stadií, které mohou být specifické k cílící molekule.

[56.] Konzervativní aminokyselinová substituce je zde definována jako záměna jedné nebo dvou aminokyselin v aminokyselinovém složení peptidu, polypeptidu nebo proteinu, nebo jeho fragmentu. Substituce se týká aminokyselin, které mají obecně podobné vlastnosti (jako je kyselost, bazicita, aromatičnost, velikost, pozitivní nebo negativní náboj, polarita, nepolarita), takovým způsobem, že substituce podstatným způsobem nemění charakteristiku peptidu, polypeptidu nebo proteinu (tj. náboj, izoelektrický bod, afinitu, aviditu, konformaci, rozpustnost) nebo aktivitu. Typické substituce, které mohou být prováděny pro takové konzervativní záměny aminokyselin, mohou být v rámci následujících skupin aminokyselin:

(i) glycin (G), alanin (A) , valin (V), leucin (L) a izoleucin (I) (ii) kyselina asparagová (D) a kyselina glutamová (E) (iii) alanin (A), serin (S) a threonin (T) (iv) histidin (H), lysin (K) a arginin (R) (v) asparagin (N) a glutamin (Q) (vi) fenylalanin (F), tyrosin (Y) a tryptofan (W).

·· ···· • · ··· · · Σ Z ί ϊ : · :

...............

[57.] Konzervativní aminokyselinové substituce mohou být prováděny v oblastech lemujících hypervariabilní oblasti primárně zodpovědných za selektivní a/nebo specifické vazebné charakteristiky v molekule, stejně jako v jiných částech molekuly, jako je kazeta variabilní části těžkého řetězce. Kromě toho nebo alternativně mohou být modifikace doprovázeny rekonstrukcí molekul pro tvorbu protilátek o úplné délce, diabodies (dimeru), triabodies (trimerů) a/nebo tetrabodies (tetramerů), nebo minibodies či microbodies.

[58.] V popise vynálezu a v patentových nárocích je Fv definován jako molekula, která je vytvořena z variabilní oblasti těžkého řetězce lidské protilátky a z variabilní oblasti lehkého řetězce lidské protilátky, které mohou být odlišné nebo shodné, a ve které je variabilní oblast těžkého řetězce spojena, svázána, fúzována nebo kovalentně připojena, asociována s variabilní oblastí lehkého řetězce.

[59.] Fragment molekuly Fv je definován jako jakákoliv molekula menší než původní Fv, která si stále uchovává selektivní a/nebo specifické vazebné charakteristiky původního Fv. Příklady takových fragmentů zahrnují bez omezení (1) minibody, jež obsahuje fragment těžkého řetězce pouze z Fv, (2)microbody, jež obsahuje malou frakcionační jednotku z variabilní oblasti těžkého řetězce (PCT přihláška č. PCT/IL99/00581), (3) podobné protilátky obsahující fragment lehkého řetězce a (4) podobné protilátky obsahující funkční jednotku z variabilní oblasti lehkého řetězce.

[60.] Protirakovinné agens je agens s protirakovinnou aktivitou, které inhibuje růst nebo diferenciaci • · · · rakovinných nebo nezralých prekancerozních buněk, nebo s jakoukoliv aktivitouu, která inhibuje metastázu rakovinných buněk. Podle předkládaného vynálezu je protirakovinné agens též látka s antiangiogenní aktivitou, která brání, inhibuje, retarduje nebo zastavuje angiogenezi nádorové tkáně, nebo je též látkou s antiadhesní aktivitou, která inhibuje, retarduje nebo zastavuje adhezi a metastatickou invazi rakovinných a prekancerozních buněk.

[61.] Inhibíce růstu rakovinné buňky je zde definována jako (i) prevence rakovinného nebo metastatického růstu, (ii) snížení rakovinného nebo metastatického růstu, (iii) úplné zabránění procesu růstu rakovinné buňky nebo metastatického procesu, s tím, že buňka zůstává intaktní a živá, nebo (iv) zabití rakovinné buňky. Konkrétně, inhibice rakovinného růstu může být aplikována proti rakovině krve, tj. AML, mnohočetnému myelomu, chronické lymfatické leukémii.

[62.] Fágemid je definován jako částice fága, která nese plasmidovou DNA. Vzhledem k tomu, že nese plasmidovou DNA, nemá fágemidová částice dostatečný prostor pro obsažení úplného komplementu fágového genomu. Komponentou, která chybí ve fágovém genomu, je podstatná informace pro sbalení (packaging) fágové partikule. Aby mohl být fág propagován, je nutné kultivovat požadované fágové partikule s kmenem pomocného fága (helper phage strain), který doplňuje chybějící informaci pro sbalení.

[63.] Podle předkládaného vynálezu je kazetou, užitou pro polypeptidy, míněna určitá sekvence po sobě následujících aminokyselin, která slouží jako čtecí rámec je považována za jednu jednotku a je s ní jako s takovou • · · · zacházeno. Aminokyseliny mohou být zaměněny, inzerovány, odstraněny, nebo připojeny na jednom nebo obou koncích. Podobně mohou být aminokyselinové úseky (stretches) zaměněny, inzerovány, odstraněny nebo připojeny na jednom nebo obou koncích.

[64.] Zde použitý výraz imunoglobulinová (Ig) molekula je definována jako kterákoliv z pěti tříd imunoglobulinů, tj. IgG, IgA, IgD, IgE nebo IgM. Třída IgG zahrnuje několik podtříd včetně, bez omezení, IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4.

[65.] Farmaceutická kompozice se týká prostředku, který obsahuje peptid nebo polypeptid podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, excipient nebo ředidlo.

[66.] Farmaceutické agens se týká látky, která je užitečná v profylaktickém ošetření nebo diagnostice savců, zahrnujících, bez omezení, člověka, hovězí dobytek, koně, vepře, myši, psy, kočky, nebo jakákoliv jiná teplokrevná zvířata. Farmaceutické agens je vybráno ze skupiny zahrnující radioizotop, toxin, oligonukleotid, rekombinantní protein, fragment protilátky a protinádorové agens. Příklady takových farmaceutických látek zahrnují, bez omezení, protivirová agens včetně acycloviru, gancicloviru, zidovudinu; látky s účinností proti trombóze/restenóze zahrnující cilostazol, dalteparin sodium, reviparin sodium a aspirin; protizánětlivá činidla zahrnující zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtolmetin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib a nimesulfid; látky proti autoimunitě zahrnující leflunomid, denileukin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotid a cyklofosfamid; a antiadhezivní/antiagregační • · látky zahrnující limaprost, clorcromen a kyselinu hyaluronovou.

[67.] Antileukemické agens je látka s antileukemickou aktivitou. Tak například, antileukemická agens zahrnují takové látky, které inhibují nebo zastavují růst leukemických nebo nezralých preleukemických buněk, látky, které zabíjejí leukemické nebo preleukemické buňky, látky, které zvyšují vnímavost leukemických nebo preleukemických buněk k jiným antileukemickým látkám, a látky, které inhibují metastázu leukemických buněk. Podle předkládaného vynálezu může být antileukemickým agens též látka s antiangiogenní aktivitou, která brání, inhibuje, retarduje nebo zastavuje vaskularizaci tumorů.

[68.] Výraz „afinita je zde použit jako míra vazebné síly (asociační konstanta) mezi receptorem (tj. jedním vazebným místem na protilátce) a ligandem (tj. antigenní determinantou). Síla součtu všech nekovalentních interakcí mezi jedním vazebným místem pro antigen na protilátce a jedním epitopem je afinitou protilátky pro tento epitop. Protilátky s nízkou afinitou vážou antigen slabě a mají tendenci snadno disociovat, zatímco protilátky s vysokou afinitou vážou antigen pevněji a zůstávají ve vazbě déle. Výraz „avidita se od afinity liší, neboť vyjadřuje valenci interakce antigen-protilátka.

[69.] Specifičnost interakce antigen-protilátka:

Ačkoliv reakce antigen-protilátka je specifická, v některých případech protilátka vyvolaná jedním antigenem může křížově reagovat s jiným nesouvisejícím antigenem. Takovéto křížové reakce se objevují, jestliže dva odlišné antigeny nesou homologní nebo podobné epitopy, nebo jejich • · ··· Σ · ·· · ····· * I · « · · • · : · i ···’ ..........

kotevní oblast (anchor region), nebo jestliže protilátky specifické pro jeden epitop se vážou k nepříbuznému epitopu majícímu podobné chemické vlastnosti.

[70.] Blasty (blastické buňky) jsou buňky v nezralém stadiu buněčného vývoje odlišitelné vyšším poměrem cytoplasma:jádro od nevyvíjejících se buněk.

[71.] Destičky jsou cytoplasmatickými fragmenty megakaryocytů, podobné disku, které vznikají v sinu kostní dřeně a následně cirkulují v periferní krvi. Destičky mají několik funkcí včetně hlavní role při srážení krve.

Destička obsahuje v centrální části granule a periferně čistou protoplasmu, avšak žádné zřetelné jádro.

[72.] Výraz.epitop je zde použit ve významu antigenní determinanty nebo antigenního místa, které interaguje s protilátkou, fragmentem protilátky, protilátkovým komplexem nebo s komplexem obsahujícím jejich vazebný fragment, nebo s T-buněčným receptorem. Výraz epitop je zde zaměnitelně použit s výrazy ligand, doména a vazebná oblast.

[73.] Daná buňka může na svém povrchu.exprimovat protein mající vazebné místo (nebo epitop) pro určitou protilátku, avšak toto vazebné místo může existovat ve skryté (kryptické) formě (tj. může být sféricky bráněno nebo blokováno, nebo může postrádat znaky nutné pro vazbu s protilátkou) v buňce ve stadiu, které může být nazváno prvním stadiem (stadium I). Stadiem I může být například normální zdravý status. Jestliže epitop existuje v kryptické formě, není určitou protilátkou rozpoznáván, tj. nenastává vazba protilátky s tímto epitopem nebo • · ···· • · ·

2*3 s danou buňkou ve stadiu I. Nicméně, epitop může být odhalen například tím, že prodělá vlastní modifikaci, nebo může být odblokován modifikací sousedících nebo asociovaných molekul, nebo tím, že jeho oblast prodělá konformační změnu. Příklady modifikací zahrnují změny ve poskládání, změny v posttranslačních modifikacích, změny ve fosfolipidizaci, změny v sulfataci, změny v glykosylaci a podobně. Takové modifikace se mohou objevit, jestliže buňka vstupuje do odlišného stadia, které lze nazvat druhým stadiem (stadium II). Příklady druhého stadia zahrnují aktivaci, proliferaci, transformaci nebo maligní status. Epitop může po modifikaci být exponován a protilátka se může navázat.

[74.] Zde používaný termín „Fab fragment je monovalentní fragment odvozený od imunoglobulinu vázající antigen. Fab fragment sestává z lehkého řetězce a části těžkého řetězce.

[75.] Polyklonální protilátky jsou produktem imunitní reakce (odpovědi) a jsou tvořeny řadou odlišných Blymfocytů. Monoklonální protilátky jsou odvozeny od jediné buňky.

[76.] Výraz aglutinace zde znamená proces, ve kterém baktérie, buňky, disky a jiné částice podobné velikosti adherují a tvoří shluky. Proces je podobný precipitaci, avšak částice jsou větší a jsou spíše v suspenzi než v roztoku.

[77.] Výraz agregace znamená shlukování destiček indukované in vitro , a thrombinu a kolagenu, jako součástí ·· ···· postupného mechanismu vedoucího k tvorbě sraženin nebo hemostatických krevních koláčů.

[78.] Vzorek exprese (expression pattern) genu může být studován analýzou množství genového produktu produkovaného za různých podmínek, v určitých časech, v různých tkáních a podobně. Za gen se zvýšenou expresí (over-expressed) je považován ten, jehož množství genového produktu je vyšší, než množství produktu nalézané u normální kontroly, tj. zdravé kontroly.

[79.] Promotor je oblast DNA, na kterou se váže RNA polymeráza a iniciuje transkripci.

[80.] Protilátky nebo imunoglobuliny jsou proteinové molekuly, které se vážou k antigenu. Sestávají z jednotek čtyř polypeptidových řetězců (2 těžké a 2 lehké) spojených vzájemně disulfidovými můstky. Každý z řetězců má konstatní a variabilní oblast. Mohou být rozděleny do pěti tříd, IgG, IgM, IgA, IgD a IgE, na základě jejich složky těžkého řetězce. Jsou produkovány B lymfocyty a rozpoznávají zvláštní cizorodé antigenní determinanty a ulehčují odstranění (clearing) antigenu.

[81.] Protilátky mohou být produkovány a používány v mnoha formách, včetně komplexů protilátek. Zde používaný výraz „protilátkový komplex nebo „protilátkové komplexy znamená komplex jedné nebo více protilátek s jinou protilátkou nebo s fragmentem či fragmenty protilátky, nebo komplex dvou nebo více protilátkových fragmentů.

• · [82.] Fragment F(ab')2 je bivalentní fragment imunoglobulinu vázající antigen, získaný štěpením pepsinem. Obsahuje oba lehké řetězce a část obou těžkých řetězců.

[83.] Fragment Fc je část imunoglobulinu nevázající antigen. Obsahuje karboxy-koncovou část těžkých řetězců a vazebná místa pro Fc receptor.

[84.] Fragmentem Fd je variabilní oblast a první konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu.

[85.] Kontaminujícími proteiny jsou ty, které nejsou specificky selektovány a které mohou být přítomny ve vzorku.

[86.] Peptidová mimetika jsou malé molekuly, peptidy, polypeptidy, lipidy, polysacharidy nebo jejich konjugáty, které mají stejný funkční účinek nebo aktivitu, jako jiné entity, jako jsou protilátky.

[87.] Fágemidy jsou plasmidové vektory navržené tak, aby obsahovaly počátek replikace (origin) z vláknitého fága, jako je fág M13, nebo fd.

[88.] Existuje široké spektrum onemocnění, která zahrnují nemocné, pozměněné, nebo jinak modifikované buňky, jež na svém povrchu exprimují buněčně specifické a/nebo pro nemoc specifické ligandy. Ligandy mohou být použity k uskutečnění rozpoznání, selekce, diagnostiky a léčby specifických onemocnění pomocí rozpoznání, selekce, diagnostiky a ošetření každé jednotlivé buňky. Předmět vynálezu poskytuje peptidy nebo polypeptidy, které obsahují molekulu Fv, její konstrukt, její fragment a konstrukt ·· ···· ·· ····

26*·· z jejího fragmentu, nebo fragment konstruktu, které všechny mají zvýšené vazebné charakteristiky. Vazebné charakteristiky umožňují peptidové nebo polypeptidové molekule selektivně a/nebo specificky se vázat k cílové buňce ve prospěch jiných buněk, přičemž vazebná specifičnost a/nebo selektivita je primárně determinována první hypervariabilní oblastí. Fv může být scFv nebo dsFv.

[89.] Výše popsaná molekula Fv může být použita k cílení na nemocnou buňku. Nemocnou buňkou může například být rakovinná buňka. Příklady typů rakoviny, které jsou přístupné diagnostice a/nebo léčbě specifickým cílením, zahrnují, bez omezení, karcinom, sarkom, leukémii, adenom, lymfom, myelom, blastom, seminom a melanom. Leukémie, lymfom a myelom jsou typy rakoviny, které vznikají v kostní dřeni a lymfatických tkáních a jsou zúčastněny v nekontrolovaném růstu buněk.

[90.] Nedávno byly vyvinuty nové přístupy pro diagnostiku a léčbu nemocí, zejména rakoviny. Mezi nimi používá postup cílení na nádor (tumor targeting approach) cílící molekuly, které mohou být selektovány a produkovány různými způsoby. Jeden z přístupů identifikace možných cílících molekul je metoda fágového displeje. Fágový displej je technika, ve které peptidy, polypeptidy, protilátky nebo proteiny vznikají a jsou selektovány na základě jejich exprese a displeje na povrchu vláknitého bakteriofága ve fúzi s obalovým proteinem fága, a s DNA kódující displejový protein, spočívající uvnitř fágového virionu. Technikou fágového displeje je produkován scFv, který je obsažen ve variabilní doménách každého z těžkých a lehkých řetězců protilátky, spojených flexibilním »· ···· ·· ···· aminokyselinovým polypeptidovým spacerem (Nissim et. al., EMBO J., 13, 692-698 (1994)).

[91.] Fágová expresní knihovna (phage display library, rovněž nazývaná phage peptide/antibody library, phage library nebo peptide/antibody library) obsahuje velkou populaci fága (obecně 10⁸ - 10⁹) , ve které každá fágová částice exprimuje odlišnou peptidovou nebo polypeptidovou sekvenci. Peptidové nebo polypeptidové fragmenty mohou být konstruovány o variabilní délce. Tyto produkované peptidy mohou být odvozeny, bez omezení, od lehkých nebo těžkých řetězců lidských protilátek.

[92.] Podle předkládaného vynálezu byla používána scFV protilátkové knihovna, připravená technikou fágového displeje, pro získání a produkci cílících molekul. Byla použita průtoková cytometrie, zejména fluorescenční třídění aktivovaných buněk (fluorescence-activated cell sorting, FACS), pro identifikaci a izolaci specifických klonů fágů, peptidů nebo polypeptidů, které rozpoznávají cílové buňky. Protilátkové fragmenty scFv exprimované fágy jsou přístupné k in vitro skríningu, obohacení a selekci klonů o vysoké afinitě (US Patent č. 5 821 337; US Patent č. 5 720 954). Proto knihovna tohoto typu nabízí účinné prostředky pro generování nových nástrojů pro výzkum a klinické aplikace a má řadu předností proti konvenčním postupům (Caron et al., Cancer Supplement, 73, 1049-1056 (1994). Knihovna obsahuje potenciál pro velkou diversitu molekul protilátek (Nissim et al., EMBO J., 692-698 (1994)). V daném případě může být použita stabilní lidská cDNA jako kontinuální zdroj materiálu pro produkci protilátek (US Patent č. 5 843 439). Rozpoznání molekul a selekce nejsou ovlivněny in vivo imunigenitou kandidátských cílících proteinů.

• · •28·’· [93.] Přestože afinitní selekce fágy produkovaných protilátek poskytuje vhodnou metodu pro obohacení scFvs reaktivních s antigeny z rozsáhlých knihoven, vyžaduje násobné stupně pro izolaci jednotlivého klonu a charakterizaci rozpustného scFv. Fragmenty scFvs mohou být modifikovány ke zlepšení jejich afinit a/nebo avidid pomocí konzervativních aminokyselinových substitucí, nebo pomocí produkce fragmentů scFv, nebo konstruktů uvedených fragmentů.

[94.] Fragmenty scFvs podle předmětného vynálezu specifické proti odlišným lidským buňkám a tkáním mohou být asociovány, kombinovány, fúzovány nebo vázány s různými farmaceutickými agens a/nebo radioaktivními izotopy ve farmaceuticky přijatelném množství, případně s farmaceuticky účinným nosičem za vzniku kompozic obsahujících léčivo a peptid (drug-peptide compositions), produktů fúze nebo konjugátů, majících účinnost proti onemocnění a/nebo rakovině a/nebo vhodných pro diagnostické účely.

[95.] Klony fágů jsou selektovány a identifikovány mnohostupňovým postupem známým jako biopanning. Biopanning je prováděn inkubací fágy produkovaných proteinových variant ligandů (fágové expresní knihovny) s cíli, s odstraněním nenavázaných fágů promývací technikou, a specifickou elucí vázaných fágů. Eluované fágy jsou případně amplifikovány před vzetím do dalších vazebných cyklů k cíli. Po několika cyklech jsou jednotlivé klony fágů charakterizovány a sekvence peptidů vytříděných pomocí fágů jsou stanoveny sekvenováním odpovídající DNA fágového virionu.

• · ·· ···· » · ·

I · · ·· » · · ·· · [96.] Fragment scFv získaný tímto způsobem je rovněž nazýván jako ústřední sloučenina (lead compound). Tato ústřední sloučeniny je definována jako sloučenina, jejíž konečná struktura obsahuje základní (core) peptid nebo polypeptid. Ústřední sloučenina může být modifikována nebo zvětšena, avšak musí si uchovat základní peptid nebo polypeptid, nebo některou z jeho konzervativně modifikovaných forem. Například může být provedena modifikace Fv cestou aminokyselinové substituce na N-konci, na karboxy-konci, nebo v jakékoliv z oblastí CDR, nebo v oblastech proti směru a po směru k nim. Modifikace také zahrnují, bez omezení, fúzované proteiny, vazbu s léčivy nebo toxiny, konstrukci multimerů a zvětšení na molekuly protilátky o úplné délce. Jednou z upřednostňovaných kategorií ústředních sloučenin tak, jak je poskytnuta podle předkládaného vynálezu, je scFv získaný jako konečný produkt biopanningového postupu.

[97.] Provedení podle vynálezu poskytuje alespoň jednu nepřirozenou modifikaci peptidu nebo polypeptidu. Nepřirozená modifikace může poskytnout peptid nebo polypeptid více imunogenní nebo více stabilní. Nepřirozené modifikace zahrnují, bez omezení, peptidové modifikace, semipeptidové modifikace, modifikace cyklických peptidu, modifikace N-konce, modifikace C-konce, modifikace peptidových vazeb, modifikace základní struktury peptidu a modifikace zbytků.

[98.] Selekce protilátek proti specifických fágovým antigenům velkou měrou závisí na biopanningu proti imobilizovanému jednotlivému antigenu. Jestliže je použito celých buněk jako cíle, je selekce limitována. Podle předkládaného vynálezu byly použity celé buňky pro selekci ·· ···· »·· • · ··· ···· • ♦ • · • · • · · ·· specifických protilátek, které rozpoznávají povrchové determinanty leukemických buněk, přičemž specifický receptor nebyl dříve znám nebo charakterizován. Tato metoda nedovoluje snadnou úpravu koncentrace antigenu nebo odstranění nežádoucích reakcí dominantních protilátek.

Kromě toho se může fág obohacovat látkami, které jsou výsledkem displeje mnohonásobných kopií scFv, na rozdíl od látek produkovaných klony s vyšší afinitou. Nicméně, výhody tohoto postupu ho činí neocenitelným prostředkem pro izolaci nových molekul lidských protilátek.

[99.] Provedení podle vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou nebo konstrukt fragmentu, který se váže k neznámému ligandu na první buňce v prvním a druhém stadiu, přičemž vázání je účinné ve druhém stadiu, avšak nikoliv podstatně v prvním stadiu buňky, kdy se na základě křížové imunoreaktivity specificky nebo selektivně váže k ligandu na druhé buňce, a kde Fv je scFv nebo dsFv, případně mající jednu nebo více identifikátorových sekvencí (tags).

[100.] Další provedení podle vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid, kde selektivní a/nebo specifická vazba peptidů nebo polypeptidů k ligandu druhé buňky je primárně determinována první hypervariabilní oblastí.

[101.] Další provedení podle vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid, ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 mající aminokyselinovu sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.

[102.] Dalším provedením podle vynálezu je poskytnutí peptidů nebo polypeptidů, ve kterém první hypervariabilní • · · • · · · · • · · ·

oblastí je oblast CDR3 mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24 a ve kterém vazebná selektivita nebo specifičnost je sekundárně ovlivněna druhou hypervariabilní oblastí a/nebo třetí hypervariabilní oblastí a/nebo jednou nebo více oblastí proti směru a/nebo jednou nebo více oblastí po směru lemujících první, druhou a třetí hypervariabilní oblast v uvedeném pořadí.

[103.] Další provedení poskytuje ligand druhé buňky vázaný peptidem nebo polypeptidem podle vynálezu. Jeden z takových dvou-buněčných postupů spočíval v následujícím: Megakaryocyty jsou velké mnohojaderné buňky odvozené z hematopoetických kmenových buněk v kostní dřeni. Destičky se oddělují z cytoplasmy megakaryocytů a vstupují do periferní krve. In vitro působí cytokiny ve velkém rozsahu na kmenové buňky. Tak například, thrombopoetin zvyšuje počet destiček přímým zvýšením diferenciace kmenových buněk na megakaryocyty. Z tohoto důvodu exprimují tyto buňky řadu markérů buněčného povrchu, které jsou rovněž nalézány u nezralých buněk.

[104.] Maligní krevní buňky (leukémie a lymfomu) jsou charakterizovány jako nevyzrálé buňky, které exprimují proteiny buněčného povrchu, normálně nalézané u částečně diferencovaných hematopoetických progenitorů. Z tohoto důvodu jsou destičky lákavým zdrojem pro identifikaci povrchových markérů nezralých buněk exprimovaných na nemocných nebo maligních krevních buňkách. V jednom z postupů diskutovaném níže byly použity specifické buňky jako, bez omezení, jsou destičky nesoucí neznámé ligandy, pro počáteční kroky biopanningu. Byla provedena následná selekce klonů s požadovanými cílovými buňkami, jejichž • · · · cílové markéry buněčných povrchů jsou neznámé, tj. takové, bez omezení, jako jsou buňky AML. V tomto postupu fágové klony získané biopanningem na destičkách mohou poskytovat nástroj pro rozpoznávání a vazbu ligandů na nemocných nebo maligních buňkách, které jsou předmětem zájmu.

[105.] Cíle, jak byly popsány výše, zahrnují buňky odvozené z izolovaných tkání. Izolovanými tkáněmi mohou být nemocné tkáně, konkrétněji rakovinné tkáně. Rakovinné tkáně mohou být odvozeny od jakýchkoliv forem malignit včetně, bez omezení, karcinommu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.

[106.] Kromě metody biopanningu výše popsané je další postup založen na izolaci peptidu nebo polypeptidu, který váže ligand na buňce, jenž byl stanoven přímým vybráním (panningem) tohoto ligandu.

[107.] Předkládaný vynález poskytuje peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt fragmentu. Konstruktem může být multimer (tj. diabody, triabody, tetrabody) nebo molekula Ig o úplné délce; fragmentem může být minibody nebo microbody. Všechny odvozené konstrukty a fragmenty si uchovávají vazebné charakteristiky tak, aby se vázaly selektivně a/nebo specificky k cílové buňce ve prospěch jiných buněk. Vazebná selektivita a/nebo specifičnost je primárně determinována první hypervariabilní oblastí, přičemž Fv je scFv nebo dsFv, případně mající identifikátorovou sekvenci (tag) .

[108.] V jednom provedení vynálezu je identifikátorová sekvence inzerována nebo připojena k peptidu Fv nebo • · ···· • ·· • · · · · • to toto ·· · · <

polypeptidu pro usnadnění jeho přípravy a identifikace a pro diagnostiku. Identifikátorová sekvence může být z molekuly později odstraněna. Identifikátorovou sekvencí mohou být, bez omezení, následující sekvence: AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, Protein C, S-TAG1®, T7, V5, VSV-G (Jarvik and Telmer, Anri. Rev. Gen., 32, 601-618 (1998) a KAK (lysin-alaninlysin). Upřednostňovanou identifikátorovou sekvencí je cmyc nebo KAK.

[109.] Dva variabilní řetězce molekuly Fv podle předloženého vynálezu mohou být vzájemně spojeny spacerem o délce 0-20 aminokyselinových zbytků. Spacer může být větvený nebo nevětvený. Linkerem je přednostně 0-15 aminokyselinových zbytků, ještě výhodněji pak je linkerem (Gly4Ser)3 pro získání jednořetězcového Fv („scFv).

Fragment scFv je možné získat z fágové displejové knihovny.

[110.] Fv molekula sama o sobě sestává z prvního řetězce a ze druhého řetězce, přičemž každý z řetězců obsahuje první, druhou a třetí hypervariabilní oblast. Hypervariabilní smyčky uvnitř variabilní oblasti (domény) lehkých a těžkých řetězců jsou nazývány komplementaritu určující oblasti (Complementary Determining Regions, CDR).

V každém těžkém a lehkém řetězci existují oblasti CDR1,

CDR2 a CDR3. Tyto oblasti tvoří vazebné místo pro antigen a mohou být specificky modifikovány pro dosažení zvýšené vazebné aktivity. Přirozeně nejvariabilnější z těchto oblastí je oblast CDR3 těžkého řetězce. Oblast CDR3 je považována za nejexponovanější oblast molekuly Ig a jak bylo zde ukázáno a prokázáno, je místem primárně zodpovědným za pozorované selektivní a/nebo specifické vazebné charakteristiky.

• · · [111.] Jedno z provedení podle vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid obsahující molekuly Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt z fragmentu, který má zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se váže selektivně a/nebo specificky k podstatně exponovanému a/nebo zvýšeně exprimovanému vazebnému místu na nebo v cíli, obsahujícím buňku ve prospěch jiných buněk, na nebo ve kterých není vazebné místo v podstatě dostupné a/nebo exprimované, přičemž vazebná selektivita nebo specifičnost je primárně determinována první hypervariabilní oblastí, a kde Fv je scFv nebo dsFv, případně mající jednu nebo více identifikátorových sekvencí.

[112.] V dalším provedení poskytuje vynález peptid nebo polypeptid, v němž první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.

[113.] V ještě v dalším provedení vynálezu je poskytnut peptid nebo polypeptid, ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 mající aminokyselinovu sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 8-24, přičemž vazebná selektivita nebo specifičnost je sekundárně ovlivněna druhou hypervariabilní oblastí a/nebo třetí hypervariabilní oblastí a/nebo jednou nebo více oblastmi proti směru a/nebo jednou nebo více oblastmi po směru, lemujících první, druhé a třetí hypervariabilní oblasti v uvedeném pořadí, přičemž druhými a třetími hypervariabilními oblastmi jsou oblast CDR2 a oblast CRDl.

[114.] Jedno z provedení podle vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid, který se váže k cílové buňce, • « • · · · · · · · · ·· ··· ··· ··· *· ·· kterou je aktivovaná, excitovaná, modifikovaná, pozměněná, porušená nebo nemocná buňka. Další provedení podle vynálezu poskytuje cílovou buňku, kterou je rakovinná buňka. Cílová buňka může být vybrána ze skupiny zahrnující, bez omezení, karcinom, sarkom, leukémii, adenom, lymfom, myelom, blastom, seminom a melanom. V upřednostňovaném provedení je rakovinnou buňkou leukemická buňka. Nejvýhodněji je leukemickou buňkou buňka AML.

[115.] Peptidem nebo polypeptidem podle vynálezu je rovněž jakýkoliv konstrukt nebo modifikovaný konstrukt z Fv, který si uchovává jednu nebo více hypervariabilních oblastí těžkých a/nebo lehkých řetězců a má selektivní a/nebo specifické vazebné charakteristiky. Konstrukt nebo modifikovaný konstrukt zahrnuje, bez omezení, scFv, dsFv, multimery, jako jsou dimery, trimery, tetramery a podobně (rovněž nazývané jako diabodies, triabodiesy, tetrabodies), a protilátka o úplné délce, jakož i jakýkoliv jiný multimer, který může z něho být konstruován a který inkorporuje jednu nebo více hypervariabilních domén protilátky. Peptidem nebo polypeptidem podle předkládaného vynálezu je také fragment z jakéhokoliv konstruktu nebo modifikovaného konstruktu, který má některé nebo všechny vazebné charakteristiky původního konstruktu.

[116.] Peptidem nebo polypeptidem podle předloženého vynálezu je rovněž konstrukt nebo jeho fragment mající některou nebo všechny selektivní a/nebo specifické vazebné charakteristiky původního konstruktu. Zde popsané Fvs se selektivně a/nebo specificky vážou k cílovým buňkám a mohou být spojeny, konjugovány s protirakovinným agens nebo agens proti onemocnění.

··«··· · · • · · ·· ·· · ····· · · · ·· * · · » · · • · * · · · ·· ·· · ··· · · · [117.] Peptidy, polypeptidy, jejich fragenty, jejich konstrukty a fragmenty konstruktu odvozené od Fv podle vynálezu mohou být připraveny buďto v prokaryotních nebo eukaryotních expresních systémech. V jednom z provedení podle vynálezu je eukaryotním expresním systémem savčí systém, a peptid nebo polypeptid je produkován v savčím expresním systému a po purifikaci je v podstatě prostý od savčích kontaminant. Eukaryontní buněčný systém, jak je definován podle předkládaného vynálezu, se týká expresního systému pro produkci peptidů nebo polypeptidů metodami genového inženýrství, kde hostitelskými buňkami jsou eukaryonta. V jiném provedení podle vynálezu používá prokaryotní systém pro produkci peptidu nebo polypeptidů systém E. coli, jako hostitele pro expresní vektor. Peptid nebo polypeptid produkovaný v systému E. coli je po purifikaci v podstatě prostý od kontaminujících proteinů E.coli. Použití prokaryotních expresních systémů může vést k přidání methioninového zbytku k N-konci některých nebo všech sekvencí, poskytnutých podle předloženého vynálezu. Odstranění N-terminálního methioninového zbytku po přípravě peptidu nebo polypeptidů s úplnou expresí peptidu nebo polypeptidů může být provedeno metodami odborníkům v oboru běžně známými, jako například, bez omezení, s použitím aminopeptidázy z Aeromonas za vhodných podmínek (US.Patent č. 5 763 215) .

[118.] Předmět podle vynálezu poskytuje přípravu scFv na základě peptidu Fv podle vynálezu. Promotory, včleněné do vektorů, které jsou použity pro klonování a amplifikaci scFv v prokaryotních systémech, mohou být vybrány ze širokého výběru. Promotorem je sekvence DNA, která je umístěna proti směru od strukturních genů a je schopna řídit expresi genů. Promotory jsou nalézány v přirozeném

• · · · · • · · · • · · • · # · · stavu na chromosomu (chromosomech) organismu a mohou být rovněž včleněny do prokaryotních a eukaryotních expresních vektorů. Promotory včleněné do specifických lokusů na požadovaném fragmentu DNA poskytují jemně naladěnou a přesně řízenou expresi genu, který je předmětem zájmu.

Podle předkládaného vynálezu byla použita řada promotorů v konstruktech, které obsahují gen kódující vybraný Fv. Promotory zahrnují, bez omezení, následující: deo, P1-P2, osmB, λ P_L, p-lac-U5, SRa 5 a CVM časný promotor. Deo je dvouřetězcový DNA plasmid, který po zavedení do vhodného E. coli hostitele učiní hostitele schopným provádět expresi DNA kódující požadovaný přirozeně se vyskytující polypeptid nebo polypeptidový analog za řízení pomocí promotoru deo P1-P2, konstitutivního deoxyribonukleotidového promotoru, odvozeného z E.coli. Další popis poskytuje US Patent č. 5 795 776 (Fischer, 18.8.1998) a US Patent č. 5 945 304 (Fischer, 31.10.1999).

[119.] Exprese E.coli osmB promotoru je řízena osmotickým tlakem. Vektory nesoucí tento promotor mohou být použity k produkci vysokých hladin širokého spektra rekombinantních eukaryotních a prokaryotních polypeptidů za řízení promotoru osmB v hostiteli E.coli. Další popis poskytuje US Patent č. 5 795 776 (Fischer, 18.8.1998) a US Patent č. 5 945 304 (Fischer, 31.10.1999).

[120.] λ P_L je teplotou indukovatelný promotor z bakteriofága λ, řízený termolabílním represorem cl⁸⁵⁷ . Pro další diskusi viz Hendrix et al., Lambda II, Cold Spring Harbor Laboratory (1983) .

[121.] p-lac-U5 je promotor lacZ (Gilbert and MullerHill, PNAS (US), 58, 2415 (1967).

[122.] SRoc5 je savčí cDNA expresní systém sestávající z časného promotoru opičího viru 40 (simian virus 40, SV 40) a segmentu R-U5, kterou je dlouhá terminální repetice viru lidské T-buněčné leukémie typu 1. Tento expresní systém je v široké řadě buněčných typů jednou až dvakrát účinnější, než časný promotor SV40 {Takebe et al.,

Molecular and Cellular Biology, 8, 466-472 (1988)).

[123.] Lidský cytomegalovirový promotor, známý jako CMV intermediate/early enhancer/promotor,je podle předkládaného vynálezu nej výhodněji používán k prosazení konstitutivní exprese klonových DNA inzertů v savčích buňkách. CVM promotor je popsán v Schmidt, E.V et al., Mol. Cell. Biol., 10, 4406 (1990) a v US Patentu č. 5 168 062 a 5 385 839.

[124.] Ve výhodném provedení podle vynálezu je promotor pro indukci fágemidového systému v prokaryontech vybrán ze skupiny zahrnující promotory deo, osmB, λ P_L, p-lac-U5 a CVM. Ve výhodnějším provedení vynálezu je použit p-lac-U5 promotor pro indukci fágemidového systému v E.coli.

V nejvýhodnějším provedení je použit promotor CVM.

[125.] Provedení podle vynálezu, tj. peptid nebo polypeptid jako předmět vynálezu, obsahuje: (a) vedoucí sekvenci, která je přítomna pouze v kódované sekvenci, avšak chybí ve zralém proteinu; (b) variabilní oblasti těžkého řetězce v rozsahu 135-145 aminokyselin, včetně první hypervariabilní oblasti 4-12 aminokyselin, která je předmětem modifikací; (c) oblast spaceru z 20 aminokyselin, který může být zkrácen nebo eliminován; (d) variabilní oblast lehkého řetězce, která je rovněž předmětem specifických zde následně popsaných modifikací; (e) • · · · · · • · · • · · • · · « · w · ·· ·♦ předmětem specifických zde následně popsaných modifikací;

(e) identifikátorová sekvence umožňující detekci, která není případně přítomna ve finálním injektovatelném produktu. Spacer, který je v scFv obecně dlouhý přibližně 15 aminokyselinových zbytků, umožňuje dvěma variabilním řetězcům (těžkému a lehkému) poskládání do funkční domény Fv. Funkční doména Fv si uchovává selektivní a/nebo specifickou zvýšenou vazebnou aktivitu.

[126.] V jiném provedení je výše popsaná část (d) následována identifikátorovou sekvencí nebo značkou, které mohou být použity pro konjugční, diagnostické a/nebo identifikační účely. V tomto provedení je identifikátorová sekvence navržena tak, aby spojovala peptid nebo polypeptid podle vynálezu s agens pro léčbu nebo diagnostiku cílových buněk.

[127.] Oblast spaceru scFv může být lineární nebo větvená a obecně obsahuje zbytky glycinu nebo šeřinu, v násobcích vzorce (Gly4Ser)_n, má obecně délku celkem 0-20 aminokyselin, zejména 0-15 aminokyselin, a je lineární. Změnou délky spacerů, pokud je to vhodné, může být získána řada multimerů. V jednom z provedení podle vynálezu má spacer délku 0-5 aminokyselin. V jiném provedení,je délka spaceru < 3 aminokyseliny (jak je detailně uvedeno níže).

[128.] Příkladem aminokyselinové sekvence molekuly scFv je následující předmět vynálezu:

ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC _χ Y„_ L__ b__-^P_--T.-A-_ů__ů._?__í;_-íí__íť__i-__A__A__Q__P__ A

ATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTG _M_AEVQLVESGGGVVRPGGSL

121 AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGGCATGAGCTGGGTCCGC

RLSCAASGFTFDDYGMSWVR

181 CAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAATTGGAATGGTGGTAGCACA

QAPGKGLEWVSGINWNGGST

241 GGTTATGCAGACTCTGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCC

GYADSVKGRFTXSRDNAKNS

301 CTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACCGGCCGGTGTATTACGTGGCAAGA

101 LYLQMNSLRAEDT AVYYCAR

361 ATGAGGGCTCCTGTGATTTGGGCCCAAGTAACCCTGGTCACCGTGTCGAGAGTGGGAGGC

121 | M R A P V ij WGQGTLVTVSRGGG

421 GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACACAGGACCCTGCT

141 GSGGGGSGGGGSSELTQDPA

481 GTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGC

161 VSVALGQTVRITCQGDSLRS

541 TATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCAGGACCAGGCCCCTTGTCTTGTCATCATGGGT

181 YYASW YQQKPGQAPVLVIYG

601 AAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACA

201 KNNRPSGIPDRFSGSSSGNT

661 GCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCC

221 ASLTITGAQAEDEADYYCNS

721 CGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT

241 rdssgnhvvf'gggtkltvlg

781 GCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCATAG 2 61 A A A EQKLISEEDLNGAA * [129.] Vedoucí sekvence je podtržena přerušovanou čarou. Oblast V_H odpovídá aminokyselinové sekvenci vyznačené tučným písmem. Tento specifický klon je odvozen od základní linie V_H3-DP32; nicméně, základní linie každého z klonů je závislá na svém zvláštním původu (viz níže). Aminokyselinová sekvence v rámečku kóduje V_H-CDR3 sekvenci, což je hypervariabilní oblast ve skupině všech klonů odvozených z této knihovny. Oblastí spaceru, přiléhající k V_H a V_L oblastem, je flexibilní polypeptid znázorněný ··«··« · · ·····♦ « · · ·· ·· · · · ····· · · · · · aminokyselinami zobrazenými kurzívou. Konečně je uvedena oblast V_L. Fúzovaný fragment V_L ve všech klonech je odvozen od jednoho nemutovaného genu V zárodečné linie IFLV3SI, a je následován c-myc tag sekvencí, podtrženou vlnovkou.

Úplná aminokyselinová sekvence je identická se SEQ ID NO: 25.

[130.] Zdroje fragmentů V_H (ze 49 základních linií (germline)) byly nejprve vytvořeny pomocí PCR z přeskupených V-genů periferních krevních lymfocytů z neimunizovaných lidí (označeno jako „naivě repertoire, „přirozený zdroj) od poskytovatele knihovny. Původ (základní linie) sekvence V_H může být idetifikován testem homologíe (Blast search) s použitím následujících webových stránek:

[131.] Vazebné charakteristiky protilátky mohou být optimalizovány jedním z mnoha způsobů. Jeden ze způsobu optimalizace protilátky ke zvýšení vazebné aktivity, ve srovnání s původní ústřední sloučeninou, je založen na záměně aminokyselinových zbytků v ústřední sloučenině, k zavedení vyšší variability nebo k prodloužení sekvence. Tak například, úplná původní oblast V_L může být zaměněna oblastí Vl z odlišného subtypu protilátky.

[132.] Dalším způsobem pro optimalizaci afinity je konstruování fágemidové expresní mutagenezní knihovny. Ve fágové expresní mutagenezní knihovně jsou syntetizovány oligonukleotidy tak, že každá aminokyselina základní (core) sekvence uvnitř CDR3 řetězce V_H a V_L je nezávisle substituována jakoukoliv jinou aminokyselinou, přednostě konzervativním způsobem známým v oboru. Předmět vynálezu poskytuje soubor specifických protilátkových scFv ·< ···· * · ·· »··· ·»· · · ·» · · · • ···· · · · · · ·· · · · ···· · ·· « · · · · · ♦ ·· ··· ··· ··· ·· ·· exprímovaných fágem, kde exprimované protilátkové fragmenty a rozpustné protilátkové fragmenty, které mohou být extrahovány z fágových virionů, mají stejnou biologickou aktivitu.

[133.] Použitá fágová expresní knihovna byla zkonstruována z krevních lymfocytů neimunizovaného člověka a Fv peptid byl selektován proti dříve necharakterizovaným a nepurifikovaným antigenům na povrchu cílové buňky. Zde použitý výraz dříve necharakterizované a nepurifikované antigeny se týká ligandů přítomných na povrchu buněk, které nebyly dosud identifikovány, charakterizovány, izolovány nebo purifikovány prostředky molekulární biochemie před předkládaným vynálezem a které byly zjištěny nebo předpovězeny v předkládaném vynálezu na základě pozorované selektivní a/nebo specifické vazby s izolovanými protilátkovými fragmenty.

[134.] Fragment scFv podle předkládaného vynálezu vykazuje zvýšenou vazebnost k cílové buňce. Zvýšená vazebnost směřuje ke specifickým povrchovým markérům. Specifickými povrchovými markéry jsou molekuly, které jsou maskovány (sequestered) v buněčné membráně a jsou přístupné k cirkulujícím rozpoznávajícím molekulám. Přítomnost povrchových antigenů umožnila vývoj technologie fágového displeje via zde popsanou metodu biopanningu. Podle předloženého vynálezu jsou povrchové markéry zúčastněny v charakterizaci a rozlišení mezi různými typy buněk, stejně tak, jako slouží jako vazebné místo pro Fvs v jejich různých formách. Může být odlišena řada hematopoetických buněčných typů podle jejich charakteristických povrchových markérů, podobně, nemocné a rakovinné buňky exprimuji • · · · · · • · · • · ··· • · ♦ ♦ · ♦

povrchové markéry, které jsou jedinečné pro jejich typ a stav.

[135.] Selekce klonů scFv může být provedena dvěma odlišnými biopanningovými strategiemi:

1.

přímá selekce s použitím nemocné nebo rakovinné buňky jako cílové buňky, a stupňová selekce s použitím první, tj.

normální buňky ve druhém, tj. aktivovaném, excitovaném, modifikovaném, pozměněném, porušeném stadiu, kde vazebné místo první buňky ve druhém stadiu obsahuje neznámý ligand, který je podstatně exponován nebo exprimován. Prostřednictvím imunologické křížové reakce se může zbývající klon po následujícím biopanningu nebo selekčních krocích vázat selektivně a/nebo specificky k novému a neznámému ligandu na druhé buňce. Po další případné amplifikaci a následné purifikaci mohou být zkonstruovány cílící molekuly z rozpoznávacích míst purifikovaných rozpoznávacích molekul, které jsou selektivní a/nebo specifické pro neznámý ligand na druhé buňce.

[136.] V jednom provedení vynálezu může první buňkou být normální buňka, přičemž první stadium je neaktivovaný stav, a druhé stadium je aktivovaný, excitovaný, modifikovaný, pozměněný nebo porušený stav. Druhou buňkou ve stupňové selekci může být lidská buňka. V jiném provedení podle vynálezu je druhou buňkou ve stupňové selekci nemocná buňka. Ve výhodnějším provedení je druhou buňkou ve stupňové selekci rakovinná buňka, jako je, bez ·· ···· · · ·· ···· • · · ·· ·· · · · ····· · · · · · omezení, karcinom, sarkom, leukémie, adenom, lymfom, myelom, blastom, seminom a melanom. Ve výhodnějším provedení je druhou buňkou leukemická buňka.

V nejvýhodnějším provedení je druhou buňkou buňka AML.

[137.] Výhodnější provedení podle vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid, jehož selektivní a/nebo specifická vazebnost k ligandu druhé buňky je primárně determinována první hypervariabilní oblastí. V ještě výhodnějším provedení je první hypervariabilní oblastí oblast CDR3, která má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.

[138.] V jiném provedení podle předkládaného vynálezu je poskytnut lígand druhé buňky, který se váže s peptidem nebo polypeptidem podle vynálezu. Další provedení poskytuje jakoukoliv molekulu, která rozpoznává a váže se k ligandu, jenž se váže s peptidem nebo polypeptidem podle vynálezu.

[139.] Zvýšené vazba k rakovinné buňce je pravděpodobnější díky zvýšené expresi ligandu a/nebo expozici vazebného místa u rakovinné buňky, ve srovnání s expresí normální buňky. Zde použitý výraz zvýšená exprese (overexpression) ligandu je definován jako exprese genu nebo jeho produkt, který je normálně tlumený (silent) v určitém stadiu buněčného cyklu, nebo je zvýšena exprese genu, který je za normálních, nemaligních podmínek exprimován určitým typem buňky na základní úrovni.

[140.] Ve výhodnějším provedení podle vynálezu je cílová buňka získaná biopanningem obsažena v buněčné suspenzi. Hematopoetické buňky jsou získány v suspenzi a biopanning může být prováděn smícháním fágové knihovny se ·· ···· · · ·· ···· ··· ·· ·· · · · • · · · · · · ·· · • · · · 9 ···· · • · · · · · · · · ·· ·*· ··· ··· ·· ·· suspenzí krevních buněk s následným promytím několika pufry. Fágy se extrahují od lidských buněk, amplifikují se a je stanovena sekvence displej ováného fragmentu protilátky.

[141.] V ještě výhodnějším provedení vynálezu obsahuje suspenze krevních buněk leukemické buňky. Ve výhodnějším provedení suspenze krevních buněk obsahuje buňky AML.

V jiném provedení předmětu vynálezu je cílová buňka odvozena od izolovaného orgánu nebo jeho části.

[142.] V dalším provedení předmětu vynálezu je cílová buňka nebo druhá buňka odvozena od buněčné linie. Buněčné linie mohou být kultivovány a zpracovány tak, aby mohly napomáhat ve stanovení vazebných charakteristik klonů Fv. Kromě toho mohou buněčné linie být užitečné ve vývoji diagnostických kitů.

[143.] Ve výhodném provedení je buněčnou linií hematopoetická buněčná linie, jako je, bez omezení, některá z následujích buněčných linií: Jurkat, MOLT-4, HS-602,

0937, TF-I, THP-1, KG-1, ML-2 a HUT-78.

[144.] Ve výhodném provedení vynálezu je oblast CDR3 sestavena, inzerována, spojena nebo fúzována do nebo za kteroukoliv z 84 kazet (SEQ ID NO: 30-113). Ve výhodnějším provedení je oblast CDR3 sestavena, inzerována, spojena nebo fúzována k nebo za kteroukoliv ze 49 kazet (SEQ ID: 30-32, 35, 37-39, 41, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 57, 59-68,

70, 71, 76-85, 87, 89-92, 94, 97, 99, 103, 106, 112 a 113).

V nejvýhodnějším provedení je oblast CDR3 sestavena, inzerována, spojena nebo fúzována k C-konci kazety o SEQ ID ·· ···· · » ·· ···· • · · ·· ·· · · · • · ··· « · · · · • · ·· « · · · · · ·· « · · ···· ·· ··· ··· ··· ·· ··

NO: 61, nebo k sekvenci, která má alespoň 90% sekvenční podobnost s kteroukoliv z výše uvedených sekvencí.

[145.] V jednom z provedení je aminokyselinová sekvence kazety zdánlivě neměnná, zatímco zaměněná, inzerovaná nebo připojená sekvence může být vysoce variabilní. Kazeta může být obsažena v řadě domén, z nichž každá zahrnuje funkci rozhodující pro finální produkt. Kazeta podle zvláštního provedení podle předkládaného vynálezu obsahuje od N-konce, čtecí rámec oblasti 1 (FRl), CDR1, čtecí rámec oblasti 2 (FR2), CDR2 a čtecí rámec oblasti 3 (FR3).

[146.] V provedení podle vynálezu je možné zaměnit odlišné oblasti uvnitř kazety. Tak například, v kazetě mohou být hypervariabilní oblasti CDR2 a CDRl zaměněny nebo modifikovány nekonzervativními nebo výhodně konzervativními substitucemi aminokyselin. Konkrétněji, oblasti kazety CDR2 a CDRl, sestávající ze sekvence po sobě následujících aminokyselin, vybrané ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-113 nebo jejich fragment, mohou být zaměněny sekvencí SEQ ID NO:115 a 114 v uvedeném pořadí. Nejkonkrétněji, oblasti kazety CDR2 a CDRl, sestávající ze sekvence po sobě následujících aminokyselin, vybrané ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-32, 35, 37-39, 41, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 57, 59-68, 70, 71, 76-85, 87, 89-92, 94, 97, 99, 103, 106, 112 a 113 nebo jejich fragment, mohou být zaměněny sekvencí SEQ ID NO: 115 a 114 v uvedeném pořadí.

[147.] Ve výhodném provedení podle vynálezu obsahuje peptid nebo polypeptid těžký a lehký řetězec, přičemž každý řetězec obsahuje první, druhou a třetí hypervariabilní oblast, kterými jsou CDR3, CDR2 a CDRl oblasti v uvedeném pořadí. Vazebná selektivita a specifičnost jsou ·· ···· • · · • · · · · • · * ·

• · determinovány zejména CDR3 oblastí řetězce, rozhodně CDR3 oblastí lehkého řetězce a výhodně CDR3 oblastí těžkého řetězce, a druhotně oblastmi CDR2 a CDR1 lehkého řetězce, výhodně pak těžkého řetězce. Vazebná selektivita a specifičnost mohou být druhotně ovlivněny oblastmi lemujícími proti a po směru první, druhé a/nebo třetí hypervariabilní oblasti.

[148.] Ve výhodném provedení oblast CDR3 peptidu nebo polypeptidu má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.

[149.] Ve výhodnějším provedení má oblast CDR3 těžkého řetězce aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24, CDR2 má aminokyselinovou sekvenci identickou se SEQ ID NO:115, a oblast CDRl má aminokyselinovou sekvenci identickou se SEQ ID NO:114.

[150.] V nejvýhodnějším provedení podle vynálezu má oblast CDR3 aminokyselinovu sekvenci identickou se SEQ ID NO: 8.

[151.] Kromě těžkého a lehkého řetězce obsahuje Fv flexibilní spacer z 0-20 aminokyselinových zbytků. Spacerem může být větvený nebo přímý řetězec. Dvě možné sekvence špaceru jsou identické se SEQ ID NO: 123 a 124.

[153.] Výhodným provedením podle vynálezu je scFv se sekvencí CDR3 identickou se SEQ ID NO:8 a s úplnou sekvencí scFv identickou se SEQ ID NO:25.

·· ···« * · ·· ···· • · · ·· ·· e · · • · ··· · · · · · ·· · · · · · « · ·· ··· 999 999 99 99 [153.] Jiným provedením vynálezu je scFv se sekvencí CDR3 identickou se SEQ ID NO:20 a s úplnou sekvencí scFv identickou se SEQ ID NO:203.

[154.] Ve výhodnějším provedení podle vynálezu mají oblasti CDR3, CDR2 a CDRl aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8, 115 a 114 v uvedeném pořadí.

[155.] V dalším provedení podle vynálezu obsahuje peptid Fv oblast CDRl a CDR2 variabilního těžkého řetězce, který sám o sobě obsahuje kazetu s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30113; oblast CDR3, výhodně variabilního těžkého řetězce, která má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24; oblast proti směru, lemující CDR3 oblast, která má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:117; oblast po směru, lemující CDR3 oblast, která má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 116; spacer z 0-20 aminokyselinových zbytků o sekvenci SEQ ID NO: 123 nebo 124; variabilní oblast lehkého řetězce se sekvencí, kterou je SEQ ID NO: 7.

[156.] Podobně, v dalším provedení oblast lemující CDR2 oblast proti směru, má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 119; oblast lemující CDR2 oblast po směru, má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 118, oblast lemující CDRl oblast proti směru, má aminokyselinovu sekvenci SEQ ID NO: 121 a oblast lemující oblast CDRl po směru, má aminokyselinovu sekvenci SEQ ID NO:120.

[157.] Ve výhodném provedení podle vynálezu je poskytnut peptid nebo polypeptid, ve kterém druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou CDR2 a CDRl hypervariabilní • · · · · ·

oblast, v uvedeném pořadí, a ve kterém aminokyselinovou sekvencí pro CDR3 je SEQ ID NO:8, aminokyselinovou sekvencí pro CDR2 je SEQ ID NO: 115, aminokyselinovou sekvencí pro CDR1 je SEQ ID NO:114, a ve kterém oblast lemující oblast CDR3 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:117, oblast lemující oblast CDR3 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:116, oblast lemující oblast CDR2 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 119, oblast lemující oblast CDR2 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 118, oblast lemující oblast CDR1 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:121 a oblast lemující oblast CDR1 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:120.

[158.] Jiné provedení podle vynálezu poskytuje molekulu Fv, která obsahuje první řetězec, mající první, druhou a třetí hypervariabilní oblast, a druhý řetězec, mající první druhou a třetí hypervariabilní oblast, ve které jedna z hypervariabilních oblastí prvního řetězce má sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24, a ve které jedna z hypervariabilních oblastí druhého řetězce má sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202, a ve které první, druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou CDR3, CDR2 a CDR1 oblast v uvedeném pořadí, přičemž Fv je scFv nebo dsFv, mající jednu nebo více identifikátorových sekvencí.

[159.] Jiné provedení podle vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid (i) ve kterém každý z prvního a druhého řetězce obsahuje první hypervariabilní oblast vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24; nebo (ii) ve kterém první hypervarabilní oblasti prvních a druhých řetězců jsou identické a jsou vybrány ze skupiny sestávající ze SEQ ID

NO: 8-24, nebo (iii) ve kterém první hypervariabilní oblast prvního řetězce je· vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24 a prvni hypervariabilní oblast druhého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202; nebo ve kterém první hypervariabilní oblast prvního řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125202 a první hypervariabilní oblast druhého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.

[160.] Další provedení podle vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid, ve kterém druhou a třetí hypervariabilní oblastí prvního řetězce jsou SEQ ID NO: 114 a 115 v uvedeném pořadí.

[161.] Pokud se jedná o všechny aminokyselinové sekvence z 25 aminokyselinových zbytků zde popsaných a podrobně uvedených (např. CDR oblasti, CDR lemující oblasti), je třeba chápat a jako další provedení podle vynálezu vzít v úvahu, že tyto aminokyselinové sekvence zahrnují ve svém rozsahu i sekvence s jednou nebo dvěmi aminokyselinovými substitucemi, a že substitucemi jsou výhodně konzervativní aminokyselinové záměny. Pokud se jedná o všechny aminokyselinové sekvence z > 25 aminokyselinových zbytků zde popsaných a podrobně uvedených, je třeba chápat a jako další provedení podle vynálezu vzít v úvahu, že tyto aminokyselinové sekvence zahrnují ve svém rozsahu i sekvence s 90% sekvenční podobností s původní sekvencí' (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, (1997)). Podobné nebo homologní aminokyseliny jsou definovány jako neidentické aminokyseliny, které vykazují podobné vlastnosti, např. kyselost, zásaditost, aromatičnost, velikost, pozitivní nebo negativní náboj, polaritu a nepolaritu.

[162.] Procento aminokyselinové podobnosti nebo homologie nebo sekvenční podobnosti je stanovováno srovnáním aminokyselinových sekvencí dvou odlišných peptidů nebo polypeptidů. Dvě sekvence jsou seřazeny vedle sebe (alignment) obvykle s použitím jednoho z řady počítačových programů navržených pro tento účel, a jsou porovnávány aminokyselinové zbytky v každé pozici. Takto je stanovena aminokyselinová identita nebo homologie. Poté je použit algoritmus pro stanovení procenta aminokyselinové podobnosti. Obecně je upřednostňováno porovnávat aminokyselinové sekvence vzhledem ke značně zvýšené citlivosti pro detekci spletitých vztahů mezi molekulami peptidů, polypeptidů nebo proteinů. Proteinové porovnání může vzít v úvahu přítomnost konzervativních aminokyselinových substitucí, zatímco chybné párování (mismatch) může poskytnout pozitivní skóre, jestliže neidentické aminokyseliny mají podobné fyzikální a/nebo chemické vlastnosti (Altschul et al., Nucleic Acids Res.,

25, 3389-3402 (1997).

[163.] V provedení podle vynálezu mohou tři hypervariabilní oblasti každého z lehkých a těžkých řetězců být vzájemně zaměněný mezi dvěmi řetězci a mezi třemi hypervariabilními místy uvnitř a/nebo mezi řetězci.

[164.] Pro odborníka v oboru je zřejmé, že prokázání specifické a/nebo selektivní vazby peptidů nebo polypeptidů podle vynálezu vyžaduje použití vhodné^negativní kontroly. Vhodnou negativní kontrolou může být peptid nebo polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je téměř identická s peptidem nebo polypeptidem podle vynálezu, pouze s jediným rozdílem v hypervariabilní oblasti. CDR3.

• ·

Jinou vhodnou negativní kontrolou může být peptid nebo polypeptid, který má stejnou velikost a/nebo obecně trojrozměrnou strukturu, jako peptid nebo polypeptid podle vynálezu, ale má zcela nepříbuznou aminokyselinovou sekvenci. Další vhodnou negativní kontrolou může být peptid nebo polypeptid se zcela odlišnými fyzikálními a chemickými vlastnostmi ve srovnání s peptidem nebo polypeptidem podle vynálezu. Nicméně, i jiné negativní kontroly mohou být rovněž použity.

[165.] Další provedení poskytuje molekulu nukleové kyseliny, přednostně molekulu DNA, kódující Fv peptid nebo polypeptid podle vynálezu.

[166.] Ve výhodném provedení podle vynálezu a za účelem optimalizace selektivní vazby Fv, mohou sekvence CDR3, které přinášejí primární vazebnou selektivitu a/nebo specifičnost fragmentu Fv, být přeneseny na jakoukoliv jinou základní linii (germline) těžkého řetězce.

Konkrétněji, mohou být přeneseny na jednu z 84 možných základních linií těžkých řetězců. Těchto 84 základních linií (SEQ ID NO: 30-113) obsahuje (a) základní linii, ze které byl požadovaný fágový klon původně izolován, (b) 48 dodatečných základních linií dostupných ve fágové expresní knihovně a (c) 35 alternativních základních linií zde požadovaných (Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227(3): 776798 (1992)). Místní lineární nebo trojrozměrné okolí oblasti CDR3, ve shodě s vlastní oblastí CDR3, může hrát potenciální úlohu ve vedení nebo stimulaci správného vázání CDR3. Tak například, peptidy mající jakoukoliv ze sekvencí CDR3, zde uvedených jako SEQ ID NO: 8-24 a 125 a odvozených od jakékoliv ze 49 základních sekvencí (SEQ ID: 30-32, 35, 37-39, 41, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 57, 59-68, 70, 71, 76• ·

• · · · * · · • · · · ·

85, 87, 89-92, 94, 97, 99, 103, 106, 112 a 113, jsou rovněž zahrnuty do předmětu vynálezu.

[167.] Základní linie DP-32 je kazetou pro několik klonů podle předkládaného vynálezu. Pro přípravu fágové expresní knihovny je C-konec této základní linie zaměněn konsensus sekvencí. Sedm karboxyterminálních aminokyselin ze SEQ ID NO: 61 bylo zaměněno sekvencí o sedmi aminokyselinách ze SEQ ID NO:122.

[168.] CDR3 oblasti Fvs podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat základní vnitřní (core) sekvenci Arg/ciy/LysPhePro, která se specificky váže k buňkám AML. Osm příkladů takových oblastí CDR3 je uvedeno v Tabulce 2. Ačkoliv v každém případě motiv koinciduje se třemi Nterminálními aminokyselinovými zbytky oblasti CDR3, může být umístěn kdekoliv v oblasti CDR3. Jinak řečeno, motiv je vazebný motiv, který je použit pro výstavbu nebo konstrukci kotvy nebo vazebné oblasti části rozsáhlejší vazebné nebo cílící, nebo rozpoznávací molekuly, nebo je použit samostatně jako cílový nosič (target vehicle).

[169.] V dalším provedení podle předkládaného vynálezu je poskytnut vazebný motiv obsahující aminokyselinovou sekvenci Ri~X Phe Pro-R₂, kde každý z Ri a R₂ obsahuje 0-15, výhodně 1-9 aminokyselinových zbytků, a kde X je buďto Arg, Gly nebo Lys. Nejvýhodněji obsahuje CDR3 aminokyselinovou sekvenci R_x-X Phe Pro-R₂, kde každý z Ri a R₂ obsahuje 0-15 aminokyselinových zbytků, a kde X je buďto Arg, Gly nebo Lys.

[170.] V jiném provedení peptidu nebo polypeptidů podle předkládaného vynálezu může být buďto k C-konci nebo k N• · · · · ·

konci peptidu přidáno 1-1000 aminokyselin, přičemž peptid si uchovává svoji biologickou aktivitu. V preferovaném provedení vynálezu může být přidáno 150-500 aminokyselin buďto k C-konci, nebo k N-konci peptidu nebo polypeptidů, přičemž peptid si uchovává svoji biologickou aktivitu.

V dalším provedení podle vynálezu může být přidáno 800-1000 aminokyselin buďto k C-konci, nebo k N-konci peptidu nebo polypeptidů, přičemž peptid si uchovává svoji biologickou aktivitu.

[171.] Příkladem rozšíření základní vnitřní aminokyselinové sekvence je výstavba imunoglobulinu Ig o úplné délce s použitím ústřední sloučeniny jako základu Ig. Například Ig o úplné délce může příslušet k imunoglobulinové třídě, která může indukovat endogenní cytolytickou aktivitu via komplement nebo aktivaci buněčné cytolytické aktivity (např. IgGl, IgG2 nebo IgG3). Ig o úplné délce může příslušet k imunoglobulinové třídě silně se vázajících protilátek (např. IgG4). Při vazbě může Ig o úplné délce fungovat jedním nebo více z mnoha způsobů, např. vystupuje jako signál pro obranný mechanismus těla k iniciaci imunitní odpovědi transdukcí intracelulárního buněčného signalizování, nebo tím, že způsobí zničení cílové buňky.

[172.] Jedno výhodné provedení podle předkládaného vynálezu poskytuje Ig molekulu exprimovanou jako rekombinantní polypeptid a produkovanou v eukaryontním buněčném systému. Ve výhodném provedení podle vynálezu je Ig polypeptidem IgG polypeptid, který je produkován v savčím buněčném systému. Ve výhodnějším provede-ní obsahuje savčí buněčný systém promotor CVM.

• · • · · · [173.] Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje IgG molekula hypervariabilní oblast CDR3, CDR2 a CDRl, jak v lehkých, tak v těžkých řetězcích. Ve výhodnějším provedení podle vynálezu obsahuje molekula Fv oblast CDR3, CDR2 a CDR1 mající sekvence SEQ ID NO: 8, 115 a 114, v uvedeném pořadí. Oblasti CDR3, CDR2 a CDRl mohou být oblastmi těžkého nebo lehkého řetězce.

[174.] Další provedení podle vynálezu poskytuje molekulu IgG , která má lehký řetězec se sekvencí identickou se SEQ ID NO: 27 a těžký řetězec se sekvencí identickou se SEQ ID NO: 26, nebo má těžký a lehký řetězec mající alespoň 90% sekvenční podobnost k těmto sekvencím.

V nejvýhodnějším provedení podle vynálezu dva těžké řetězce IgG jsou identické a dva lehké řetězce IgG jsou identické.

[175.] V jiném provedení peptid podle předmětného vynálezu je kontruován tak, aby byl složen do multivalentních forem Ev.

[176.] Předkládaný vynález poskytuje peptid nebo polypeptid Yl a Y17 obsahující molekulu scFv. Zde použitý scFv je definován jako molekula, která je vytvořena z variabilní oblasti těžkého řetězce lidské protilátky a z variabilní oblasti lehkého řetězce lidské protilátky, které mohou být shodné nebo odlišné, a ve které je variabilní oblast těžkého řetězce spojena, svázána, fúzována nebo kovalentně připojena, nebo asociována s variabilní oblastí lehkého řetězce.

[177.] Yl a X17 scFv konstruktem může být multimer (např. dimer, trimer, tetramer a podobně) molekul scFv, které zahrnují jednu nebo více hypervariabilních domén ···· protilátky Yl nebo Y17. Všechny od scFv odvozené konstrukty a fragmenty si uchovávají zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se selektivně a/nebo specificky vážou k cílové buňce ve prospěch jiných buněk. Vazebná selektivita a/nebo specifičnost je primárně determinována hypervariabilními oblastmi.

[178.] Hypervariabilní smyčky uvnitř variabilních domén lehkých a těžkých řetězců jsou nazývány komplementaritu určující oblasti (hypervariabilní úseky, Complementary Determining Regions, CDR). V každém z těžkých a lehkých řetězců existují oblasti CDRl, CDR2 a CDR3.

Nejvariabilnější z těchto oblastí je oblast CDR3 těžkého řetězce. Oblast CDR3 je považována za nej exponovanější oblast molekuly Ig, a jak zde bylo prokázáno, je místem primárně zodpovědným za pozorované selektivní a/nebo specifické vazebné charakteristiky.

[179.] Peptid Yl a Y17 podle předmětného vnyálezu může být kostruován tak, aby byl složen do multivalentních forem Fv. Multimerní formy Yl a Y17 byly zkonstruovány pro zlepšení vazebné afinity a specifičnosti a ke zvýšení jejich biologického poločasu v krvi.

[180,] Multivalentní formy scFv byly produkovány i jinými odborníky. Jeden z přístupů spojuje dva scFvs pomocí linkerů. Jiný přístup pro spojení zahrnuje použití disulfidových vazeb mezi dvěmi scFvs. Nejjednodušší přistup pro přípravu dimerních nebo trimerních Fv zveřejnil Hollinger et al., PNAS, 90, 6444-6448 (1993) a A. Kortt, et al., Protein Eng., 10, 423-433 (1977). Jedna z metod byla navržena tak, že dimery scFvs jsou připravovány přidáním sekvence FOS a JUN proteinové oblasti za vzniku leucinového

zipperu mezi nimi na C-konci scFv. Kostelny S.A. et al., J.Immunol. 1992, Mar 1; 148(5):1547-53,- De Kruif J. et al., J. Biol. Chem. 1996 Mar 29; 271(13):7630-4. Jiná metoda byla navržena pro přípravu tetramerů přidáním sekvence kódující streptavidin na C-konec scFv. Streptavidin je složen ze čtyř podjednotek, a jestliže je scFv-streptavidin poskládán, přizpůsobují se 4 podjednotky tak, že tvoří tetramer. Kipriyanov SM et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 1995; 6(3):93-101. V dalším způsobu přípravy dimerů, trimerů a tetramerů je do proteinu, který je předmětem zájmu, zaveden volný cystein. Pro křížové spojení volných cysteinů požadovaného proteinu byl použit křížový linker na bázi peptidu s variabilním počtem (2 až 4) maleinimidových skupin. Cochran J.R. et al., Immunity, 2000 Mar; 12(3)24150.

[181.] V tomto systému byla fágová knihovna (jak byla popsána výše) navržena k expresi scFvs, které se mohou skládat do monovalentní formy oblasti Fv protilátky. Kromě toho, jak bylo diskutováno výše, je konstrukt vhodný pro bakteriální expresi. Fragmenty scFv připravené metodami genetického inženýrství obsahují variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce připojené ke kontinuálně kódovanému flexibilnímu peptidovému špaceru o 15 aminokyselinách. Výhodným spacerem je (Gly4Ser)₃'. Celková délka tohoto špaceru s aminokyselinovými složkami poskytuje neobjemný spacer, který dovoluje oblastem VH a VL poskládat se do funkční domény Fv, která poskytuje účinnou vazbu k cíli.

[182.] Předkládaný vynález je zaměřen na multimery Yl a X17, které byly připraveny způsoby známými v oboru. Výhodný způsob přípravy multimerů, zejména dimerů, zahrnuje použití cysteinových zbytků pro tvorbu disulfidových můstků mezi • · · · • ·* «

• · · • · · • · · « • · · · 9· ·* monomery. V tomto provedení jsou dimery vytvářeny přidáním cysteinu na karboxylový konec scFvs (označeno jako Yl-cys scFv nebo Yl dimer), tak, aby byla usnadněna tvorba dimeru. Poté, co byl připraven konstrukt DNA (viz Příklad 2D a 6D) a použit pro transfekci, byly Yl dimery exprimovány v produkčním vektoru a znovu poskládány in vitro. Protein byl analyzován pomocí SDS-PAGE, HPLC a FACS. Byly provozovány dvoulitrové fermentační dávky protilátek. Po expresi Yl-cys v kmeni E.coli BL21 bylo provedeno opětovné poskládání proteinu (refolding) v argininu. Po refoldingu byl protein dialyzován a purifikován Q-sepharosou a gelovou filtrací (Sephadex 75). SDS-PAGE (neredukovanou) a gelovou filtrací byly detekovány dva píky. Produkty odpovídající pikům byly jednotlivě odebrány a analyzovány FACS. Vazba monomeru a dimeru k buňkám Jurkat byla kontrolována pomocí FACS. Vazba dimerů vyžadovala pouze 1/100 množství monomerní protilátky pro stejnou úroveň barvení, které naznačuje, že dimer má vyšší aviditu. Byly stanoveny podmínky pro refolding dimeru a po následujících stupních dialýzy, chromatografie a gelové filtrace byl získán materiál obsahující > 90 % dimerů (mg množství).

Purifikovaný dimer byl charakterizován gelovou filtrací a analýzou SDS-PAGE za oxidačních podmínek. Vazebná kapacita dimerů byla potvrzena radioreceptorovou zkouškou, ELISA analýzou a FACS analýzou.

[183.] Protilátkový fragment CONY1 scF je odvozen od Yl scFv. DNA sekvence kódující myc tag fragmentu scFv byla odstraněna a na nahrazena syntetickou oligonukleotidovou sekvencí kódující aminokyseliny lysin, alanin,lysin (KAK).

[184.] Pro porovnání vazebnosti monomeru scFv (rovněž označovaném jako CONY1) a dimeru Yl byly provedeny pokusy • · · · vazebné kompetice in vitro na buňkách KG-1. Kromě toho tyto pokusy rovněž porovnávaly vazbu Yl IgG o úplné délce s monomery scEv Yl. K uskutečnění studie byl Yl IgG značen biotinem. Studie odhalila kompetici mezi Yl IgG a IgG YlBiotin. Kompetice nebyla zjištěna mezi nerelevantním lidským IgG a značeným Yl IgG. Částečná kompetice byla pozorována mezi Yl scFvs (5 μρ a 10 μg) a Yl IgG-Biotin (50 ng). Studie rovněž prokázaly, že 1 ng IgGYl-FITC se vázal na buňky KG-1 (bez séra) ve stejném rozsahu, jako 1 pg scFv-FITC, avšak v přítomnosti séra, většina vazeb Yl IgG byla „blokována. Studie rovněž ukázaly, že vazebnost dimeru Yl je alespoň 20krát vyšší, než vazebnost scFv monomeru, jak bylo zjištěno analýzou pomocí radioreceptorové zkoušky, ELISA analýzy nebo FACS analýzy.

[185.] V dalším provedení podle vynálezu byl přidán lysin-alanin-lysin kromě cysteinu na karboxylový konec (zde označováno jako Yl-cys-KAK scFv). Aminokyselinová sekvence tohoto scFv konstruktu je uvedena níže.

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG 60

YADSVKGRFTISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARM RAPVIWGQGT LVTVSRGGGG 120

121 SGGGGSGGGG SSELTQDPAV SVALGQTVRITCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGK 180

181 NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSR DSSGNHVVFG GGTKLTVLGG 240 241 GGCKAK [186.] Yl-cys-KAK byl připraven v baktériích pomocí vektoru λ-pL. Exprese v λ-pL vektoru byla indukována zvýšením teploty na 42 °C. Inkluzní protilátky byly získány z indukovaných kultur a byly semipurifikovány vodnými roztoky tak, aby byly odstraněny nežádoucí vodorozpustné proteiny. Inkluzní protilátky byly solubilizovány v guanidinu, redukovány DTT a in vitro ponechány v roztoku ·· ··«· • · · • · ··· * 9 ·♦

9 «

·· · ·<

na bázi argininu/oxidovaného glutathionu pro refolding. Po refoldingu byl protein dialyzován a koncentrován tangenciální průtokovou filtrací vůči pufru obsahujícím močovino /fosfátový pufr. Protein byl opětovně purifikován a koncentrován iontovou chromatografií na SP-sloupci.

[187.] Aby bylo dosaženo vyšších hladin exprese CONY1 scFv v E.coli, stejně jako Yl-cys-KAK scFv, byl do polohy 2 N-terminální sekvence scFv konstruktu zaveden alaninový zbytek. S takto nově modifikovaným konstruktem bylo získáno čtyřnásobné zvýšení hladiny exprese.

[188.] Byla provedena zkouška ELISA pro zjištění vazebných rozdílů mezi monomerem (CONY1 scFv rovněž označený jako Yl-ΚΑΚ) a dimerem ΥΙ-cys KAK (cysteinový dimer) k antigenu GPIb (glycocalicin), odvozeném od destiček. Polyklonální anti-jednořetězcová protilátka a/nebo nový polyklonální anti-V_L (odvozený od králíků) a anti-králičí HRP byly použity pro detekci vazby k GPIb. Dimer byl přibližně 20-100krát aktivnější než monomer. Tak například, pro dosažení 0,8 O.D. jednotek bylo použito 12,8 mg/ml monomeru ve srovnání s pouhým 0,1 mg/ml dimeru. Viz Obrázek 2.

[189.] Dimer byl charakterizován SDS-PAGE elektroforézou, gelovou filtrační chromatografií, ELISA analýzou, vazbou v radioreceptorové zkoušce a FACS analýzou. Zřejmá afinita dimeru byla vyšší než u monomeru díky působení avidity. Tento účinek byl potvrzen metodou ELISA ke glycocalicinu, FACS k buňkám KG-1 a kompeticí v radioreceptorové zkoušce.

·^; ··’ ♦.···: :: : · : · · * : ’·

..... .:. .:. ·..·♦..· [190.] HPLC byla prováděna k získání profilu dimeru po rěfoldingu a purifikaci z gelového filtračního sloupce Superdex 75. Na Obrázku 10 je první pík pro Yl-cys-kak (dimer) vlevo(~10,8 minut) a následující pík je pro monomer (~ 12 minut). Podle proteinových velikostních markérů putujících na stejném sloupci má dimer přibližně 52 kDa a monomer 26 kDa. Rovnováha mezi dimerem a monomerem může být změněna úpravou podmínek rěfoldingu (koncentrace oxidovaného činidla a koncentrace proteinu v pufru pro refolding). Dimer a monomer byly odděleny chromatografíí na sloupci Superdex 75.

[191.] Na Obrázku 11 je znázorněn gel se smíšenou populací dimerů a monomerů. V redukované formě jsou monomery pozorovány díky redukci mezi dvěmi monomery a v neredukované formě jsou pozorovány dvě populace (jako v pokuse s gelovou filtrací ), a to monomerní frakce o přibližně 3.0' kDa a dimer o přibližně 60 kDa.

[192.] Kromě toho FACS vazebná analýza k buňkám KG-1 prokázala, že dimer je senzitivnější než monomer, jestliže byla prováděna dvou- nebo třístupňová vazebná zkouška. Dimery přímo značené FITC vykazovaly mírnou převahu (použito lOx méně materiálu) oproti monomeru. Radioreceptorová zkouška na KG-1 buňkách, ve které byly dimery použity jako kompetitory, prokázala, že dimer je 30x účinnější než monomer.

[193.] Pozměňování délky spacerů je další výhodnou metodou tvorby dimerů, trimerů a tetramerů (často v oboru označovaných jako diabodies, triabodies a tetrabodies v uvedeném pořadí). Dimery se tvoří za podmínek, kdy spacer spojující dva variabilní řetězce scFv je obecně zkrácen.

·· ···· ·:···.. · ♦ · · · • ϊ ? * * »·«« ,

·.... ·..·♦,.·

Tento zkrácený spacer zabraňuje variabilním řetězcům téže molekuly poskládat se do funkční domény Fv. Místo toho domény jsou nuceny párovat se s komplementárními doménami jiných molekul za vzniku dvou vazebných domén. Ve výhodném způsobu byl použit spacer pouze o 5 aminokyselinách (Gly₄Ser)pro konstrukci diabody. Tento dimer může být vytvořen ze dvou identických scFvs, nebo ze dvou odlišných populací scFvs a může si uchovávat selektivní a/nebo specifickou zvýšenou vazebnou aktivitu základních (parent) scFv(s), a/nebo vykazovat zvýšenou vazebnou sílu nebo afinitu.

[194.] Podobným způsobem jsou vytvářeny diabodies za podmínek, kdy spacer spojující dva variabilní řetězce scFv je obecně zkrácený na méně než 5 aminokyselinových zbytků, což zabraňuje variabilním řetězcům téže molekuly poskládat se do funkční domény Fv. Tři oddělené molekuly scFv asociují za vzniku trimeru. Ve výhodném provedení jsou triabodies získány úplným odstraněním flexibilního spaceru. Triabody může být vytvořena ze tří identických scFv nebo ze dvou nebo tří odlišných populací scFv a uchovává si selektivní a/nebo specifickou zvýšenou vazebnou aktivitu základního (parent) scFv(s) a/nebo vykazuje zvýšenou vazebnou sílu nebo afinitu.

[195.] Tetrabodies jsou podobně vytvářeny za podmínek, kdy spacerové spojení dvou variabilních řetězců scFv je obecně zkráceno na méně než 5 aminokyselinových zbytků, což zabraňuje dvěma variabilním řetězcům z téže molekuly poskládat se do funkční domény Fv. Čtyři oddělené molekuly scFv asociují za vzniku tetrameru. Tetrabodies mohou být vytvořeny ze čtyř identických scFv nebo 1-4 jednotlivých jednotek z odlišných populací scFv a měly by si uchovávat • · ·« ···« » · « ► · ··· selektivní a/nebo specifickou zvýšenou vazebnou aktivitu základního (parent) scFv(s) a/ nebo vykazovat zvýšenou vazebnou sílu nebo afinitu.

[196.] To, zda se v případě, kde spacer je obecně kratší než 5 aminokyselinových zbytků, budou vytvářet triabodies nebo tetrabodies, závisí na aminokyselinové sekvenci konkrétních scFv(s) ve směsi a na reakčních podmínkách.

[197.] Ve výhodném provedení jsou tetramery vytvářeny prostřednictvím asociace biotin/streptavidin. Byl vytvořen nový fermentační konstrukt, který je schopen být enzymaticky značen biotinem (zde označován jako Yl-bíotag nebo Yl-B). Sekvence, která je substrátem pro enyzm BirA, byla přidána k C-konci Yl. Enzym BirA připojuje biotin k lysinovému zbytku uvnitř sekvence. Yl—biotag byl klonován a exprimován v E.coli. Inkluzní materiál protilátky byl izolován a refoldován. Čistota poskládaného proteinu byla > 95% a > 100 mg bylo získáno z kultury o objemu 1 litr (malé měřítko, neoptimalizované podmínky). Pomocí HPLC, SDS-PAGE a hmotové spektroskopie bylo zjištěno, že molekulová hmotnost této formy je podobná scFv. Bylo zjištěno, že Yl-biotag je nejkonzistentnější reagens pro analýzu FACS. Jenomže, jestliže byla studována vazba Ylbiotag a KG-1 buněk v přítomnosti séra, byly vyžadovány vysoké koncentrace (lOx více) oproti srovnatelné vazbě v nepřítomnosti séra. Nicméně,.> tento konstrukt nabídl výhodu specifické biotinylace, kde vazebné místo molekuly zůstává intaktní. Kromě toho je každá molekula značena pouze jedním biotinem, tj. každá molekula dostává jeden biotin na karboxylový konec.

·· ····

·· ···· • · · * · · ·· • · · · • · · ·· ·· · [198.] Limitované značení jedním biotinem na molekulu v požadované poloze umožnilo produkci tetramerů se streptavidinem. Tetramery se vytvářely inkubací Yl-B se streptávidin-PE.

[199.] Analýza FACS naznačila, že tetramery vytvářené z Yl-biotag a Streptavidin-PE byly v nepřítomnosti séra 100 až lOOOkrát citlivější než Yl scFv monomery. Tetramery Ylbiotag se streptavidin-PE se specificky vážou k jedné vůči Yl reaktivní buněčné linii (KG-1). Odlišnost této reakce od vazby pozadí byla velmi vysoká a poskytla vysokou citlivost pro detekci malých množství receptorů. Vyhodnocení FACS úplné normální krve s tetramery Yl-SAV naznačilo, že není přítomna žádná vysoce reaktivní populace. Monocyty a granulocy byly pozitivní v malém rozsahu. U buněčných linií, u nichž byly získány pozitivní výsledky, jako s KG-1 buňkami, byly tetramery alespoň lOOkrát reaktivnější.

[200.] Poté byly tetramery inkubovány s buněčnými vzorky. Nízká dávka tetramerů Yl (5 ng) se dobře váže s buněčnou linií (KG-1) a poskytuje 10 až 20krát vyšší odpověď, než byla dosud pozorována s jinými protilátkovými formami Yl. Minoritní reakce byla zjištěna, jestliže byly testovány negativní buněčné linie s různými dávkami tetramerů.

[201.] Provedení podle vynálezu poskytuje metodu identifikace cílící molekuly, která se váže na neznámé imunologicky křížově reaktivní vazebné místo na prvních a druhých buňkách, zahrnující (a) jeden nebo více stupňů biopanningu, které jsou prováděny na první cílové buňce, jež je ve druhém stadiu, avšak nikoliv v prvním stadiu, a podstatně exponuje nebo vystavuje vazebné místo obsahující neznámý ligand, tak, aby byla získána první populace • · · ·

·· ···· ♦ · · · • · · · · • · · · • · · ·· ··· · rozpoznávacích molekul; (b)následující biopanning a/nebo selekční kroky, zahájené s výsledným kmenem rozpoznávacích molekul ze stupně (a), které jsou prováděny na druhé buňce, jež vystavuje vazebné místo obsahující neznámý ligand mající imunologickou křížovou reaktivitu k neznámému ligandu první buňky, tak, že je produkována druhá populace rozpoznávacích molekul; (c) amplifikaci, purifikaci druhé populace rozpoznávacích molekul ze stupně (b); a(d) konstrukci peptidů nebo polypeptidů z rozpoznávacích míst purifikovaných rozpoznávacích molekul ze stupně (c), které obsahují cílící molekuly, jež jsou selektivní a/nebo specifické pro neznámé ligandy na druhé buňce.

[202.] Ve výhodném provedení je první buňka normální buňkou, první stadium je neaktivovaný stav a druhé stadium je aktivovaný, excitovaný, modifikovaný, pozměněný nebo poškozený stav. Ve výhodnějším provedení je druhá buňka nemocná buňka. V ještě preferovanějším provedení je nemocnou buňkou rakovinná buňka. Rakovinnou buňkou může být, bez omezení, buňka karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.

V upřednostňovaném provedení je rakovinnou buňkou leukemická buňka. Nejvýhodněji je leukemickou buňkou buňka AML.

[203.] Provedení podle předkládaného vynálezu poskytuje použití peptidu nebo polypeptidů případně asociovaného, vázaného, spojeného, kombinovaného, svázaného nebo fúzovaného s farmaceutickým agens pro přípravu léčiva. Ve výhodném provedení má léčivo účinnost proti nemocným buňkám. V ještě výhodnějším provedení je aktivita zaměřena proti rakovinným buňkám. Rakovinnou buňkou může být, bez omezení, buňka karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, • · · · · • · · · · « * * · · · · ··· ··· ·· lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.

V upřednostňovaném provedení je rakovinnou buňkou leukemická buňka. Nej výhodněji je leukemickou buňkou buňka AML.

[204.] Další provedení podle vynálezu poskytuje farmaceutickou kompozici obsahující směsi monomerních scFvs a/nebo směsi diabodies nebo triabodies nebo tetrabodies, které jsou zkonstruovány z odlišných scFvs.

[205.] Další provedení vynálezu poskytuje použití peptidu nebo polypeptidů asociovaného nebo vázaného, spojeného, kombinovaného, svázaného nebo fúzovaného s farmaceutickým agens pro přípravu léčiva. Léčivo může mít aktivitu proti nemocným buňkám, konkrétněji proti rakovinným buňkám. Rakovinnou buňkou může být, bez omezení, buňka karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu. V upřednostňovaném provedení je léčivo aktivní proti leukemickým buňkám.

V nejvýhodnějším provedení je léčivo aktivní proti AML buňkám. Aktivita léčiva proti uvedeným buňkám může způsobovat retardaci rakovinného růstu, kompletní prevenci jakéhokoliv růstu, nebo zabití rakovinných buněk.

[206.] V provedení podle vynálezu spočívá účinnost léčiva nebo farmaceutické kompozice v inhibici buněčného růstu.

[207.] Peptid nebo polypeptid podle vynálezu může být použit pro přípravu kompozice, přednostně farmaceutické kompozice, pro.použití k inhibici růstu rakovinných buněk, výhodně buněk leukémie, nejvýhodněji buněk AML. V provedení podle vynálezu může být peptid nebo polypeptid použit pro • · • · přípravu kompozice pro použití k inhibici růstu rakovinné buňky, kde uvedená kompozice obsahuje alespoň jednu sloučeninu mající farmaceutický ligand selektivní a/nebo specifický pro rakovinnou buňku.

[208.] Peptid nebo polypeptid podle předmětného vynálezu může být podáván pacientovi samostatně, nebo obsažený v léčivu nebo ve farmaceutické kompozici v asociaci, konjugaci, vázaný nebo fúzovaný s farmaceuticky účinným množstvím farmaceutického agens, a s farmaceutickým účinným nosičem, případně s adjuvans. Takové farmaceutické kompozice mohou zahrnovat proteiny, ředidla, konzervační látky a antioxidans (viz Osol et al. (eds.), Remington's Pharmaceutical Sciences (16^thed), Mack Publishing Company, (1980)).

[209.] V dalším provedení je farmaceutickým agens protilátka nebo její fragment, která je spojena s peptidem nebo polypeptidem podle vynálezu peptidovou vazbou.

[210.] Ve výhodném provedení je toxinem například gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE) , PE40, PE38, diftérický toxin, ricin nebo jejich, modifikace nebo deriváty.

[211.] Ve výhodném provedení zahrnují radioizotopy gamma-zářiče, positron-záříče a zářiče rentgenového záření, které mohou být použity pro lokalizaci a/nebo terapii, a beta-zářiče a alfa-zářiče, které mohou být použity pro léčení.

[212.] Ve specifickém provedení podle vynálezu je terapeutický radioizotop vybrán ze skupiny zahrnující ^nlindium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ·· ···· < ·« • · · · · • · · • · ·

^81mkrypton, ³³xenon, yttríum, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium a podobně.

[213.] V dalším provedení předmětného vynálezu je protirakovinné agens vybráno ze skupiny zahrnující doxorubicin (adriamycin), morpholinodoxorubicin, methoxymorpholinyldoxorubicin, cis-platinu, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyklofosfamid, prednison, daunorubicin, morfolinodaunorubicin, methoxymorfolinyldaunorubicin, idarubicin, chlorambucil, interferon alfa, hydroxymočovinu, temozolomid, thalidomid a bleomycin a jejich deriváty.

[214.] Provedení podle vynálezu poskytuje způsob inhibice růstu rakovinných buněk, který zahrnuje kontaktování rakovinné buňky s množství peptidu nebo polypeptidu podle vynálezu. Ve výhodném provedení může rakovinnou buňkou být, bez omezení, buňka karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu. Ve výhodnějším provedení je rakovinnou buňkou buňka leukémie. V nej výhodnějším provedení je leukemickou buňkou buňka AML. Provedení podle vynálezu umožňuje ošetření pacienta in vivo a ex vivo. Specifičtější provedení vynálezu umožňuje ex vivo čištění (purging) autologní kostní dřeně k odstranění abnormálních kmenových buněk.

[215.] V dalším konkrétním provedení vynálezu může krev leukemického pacienta cirkulovat ex vivo přes systém obsahující peptid nebo polypeptid podle vynálezu ·· ···· ·· ···· • · · • · ··· • · · · • · · ·· ··· konjugovaný s protirakovinným agens. Po odstranění vázaných buněk a nevázaného protirakovinného agens, mohou být krevní buňky znovu zavedeny do těla pacienta. Jinak řečeno, krev leukemického pacienta může cirkulovat ex vivo přes systém obsahující peptid nebo polypeptid podle vynálezu připojený k pevné fázi. Buňky, které procházejí systémem a nevážou se k peptidů nebo polypeptidu podle vynálezu přichyceném na pevné fázi, mohou znovu být zavedeny do těla pacienta.

[216.] V jiném výhodném provedení vynálezu je peptid nebo polypeptid využíván k ex vivo odstranění abnormálních kmenových buněk z autologní kostní dřeně v suspenzi před implantací. Purging abnormálních kmenových buněk může být prováděn protékáním suspenze přes pevný nosič (jako jsou, avšak bez omezení, magnetické kuličky nebo afinitní sloupce), ke kterému jsou peptid nebo polypeptid podle vynálezu (tj. cílící molekula), její konstrukty, fragmenty, fragmenty konstruktů, nebo konstrukty fragmentů vázány. Takto ex vivo přečištěná kostní dřeň může pak být použita pro autologní transplantaci kostní dřeně. Toto výhodné provedení je založeno na identifikaci fágemidového klonu (Yl) podle předloženého vynálezu, který se váže ke kmenovým buňkám uvolňovaným z kostní dřeně leukemických dárců, ale neváže se na kmenové buňky z kostní dřeně zdravých dárců. Podobně, Yl fágemidový klon se váže k blastickým buňkám, které byly analýzou FACS stanoveny jako abnormální, stejně jako k buňkám leukémie.

[217.] Blastické buňky jsou zde definovány jako primární buňky, které jsou prekursory pro všechny cirkulující buňky v savčím organismu. Díky svým progenitorovým vlastnostem, nejsou blastické buňky v dospělém organismu nalézány jako cirkulující • ·

........

v signifikantních množstvích. Přítomnost cirkulujících blastických buněk bez exogenní stimulace může indikovat malignitu, např. hematopoetického systému, a jejich následné zmizení může indikovat remisi maligního onemocnění.

[218.] V dalším provedení podle vynálezu je farmaceutická kompozice použita pro profylaxi.

[219.] Ve výhodném provedení jsou dva nebo více peptidů nebo polypeptidů kombinovány pro vytvoření směsi.

[220.] Zde používaný výraz směs je definována jako dvě nebo více molekul částic různých druhů, které jsou obsaženy v jednom přípravku. Odlišné druhy molekul nevytváří ani kovalentní, ani nekovalentní chemické vazby.

[221.] V jednom provedení předmětu vynálezu je peptid nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu spojen, fúzován nebo konjugován s farmaceutickým agens.

[222.] V dalším provedení předmětného vynálezu je vazbou mezi peptidem a farmaceutickým agens vazba přímá.

Zde použitý výraz přímá vazba mezi dvěmi nebo více sousedícími molekulami je získána prostřednictvím chemické vazby mezi prvky nebo skupinami prvků v molekulách. Chemickou vazbou může být například iontová vazba, kovalentní vazba, hydrofobní vazba, hydrofilní vazba , elektrostatická vazba nebo vodíková vazba. Vazby mohou být, bez omezení, vybrány ze skupiny zahrnující amin, karboxy, amid, hydroxyl, peptid a disulfid. Přímou vazbou může výhodně být vazba rezistentní k proteázám.

• · · · [223.] V dalším provedení je vazba mezi peptidem a farmaceutickým agens ovlivňována linkerovou sloučeninou. Tak, jak je zde v popise a v nárocích používáno, je linkerová sloučenina definována jako sloučenina, která spojuje dvě nebo více sloučenin dohromady. Linker může mít přímý nebo rozvětvený řetězec. Sloučenina s rozvětveným řetězcem může být služena ze dvouvětevných, třívětevných nebo čtyřvětevných sloučenin. Linkerovou sloučeninou může být, bez omezení, dikarboxylová kyselina, maleimido hydrazid, PDPH, hydrazid karboxylové kyseliny a malý peptid. Příklady jiných linkerových sloučenin zahrnují: dikarboxylové sloučeniny, jako je kyselina jantarová, kyselina glutarová, kyselina adipová; maleimido hydrazidy, jako jsou hydrazid N- [g-maleimidokapronové kyseliny], 4-[Nmaleimidomethyl]cyklohexan-l-karboxylhydrazíd, a hydrazid N-[fc-maleimidoundekanové kyseliny];PDPH linker, jako je (3[2-pyridyldithio]propionyl hydrazid) konjugovaný se sulfhydrylovým reaktivním proteinem; hydrazidy karboxylových kyselin vybrané z kyselin o 2-5 atomech uhlíku; a přímé vazby využívající malých peptidových linkerů mezi volným cukrem například protirakovinné látky doxorubicinu a scFv. Malé peptidy zahrnují bez omezení AU1, AU5, Btag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH,

IRS, KT, Protein C, S-TAG®, T7, V5, VSV-G a KAK Tag.

[224.] Může být použita jakákoliv známá metoda podání peptidu nebo polypeptidů podle předmětného vynálezu, jako je způsob podání intravenózní, intramuskulární, subkutánní, topický, intratracheální, intrathekální, intraperitoneální, intralymfatický, nasální, sublinguální, orální, rektální, vaginální, respirační, bukální, intradermální, transdermální nebo intrapleurální.

• · · · [225.] Pro intravenózní podání je prostředek výhodně přípraven tak, aby množství podané pacientovi bylo účinným množstvím od přibližně 0,1 mg do přibližně 10Ό0 mg v požadované kompozici. Výhodněji, podané množství bude v rozmezí od přibližně 1 mg do přibližně 500 mg v požadované kompozici. Kompozice podle vynálezu jsou účinné v širokém dávkovacím rozsahu a závisejí na takových faktorech, jako je specifikum ošetřované nemoci, biologický poločas peptidové nebo polypeptidové farmaceutické kompozice v těle pacienta, fyzikální a chemické charakteristiky farmaceutického agens a farmaceutické kompozice, způsob podání farmaceutické kompozice, zvláštnosti pacienta, který je ošetřován nebo diagnostifikován, stejně jako jiné parametry, o kterých se ošetřující lékař domnívá, že jsou důležité.

[226.] Farmaceutická kompozice pro orální podání může být ve formě tablet, tekutiny, emulze, suspenze, sirupu, pilulek, kapslí nebo kapsulí. Farmaceutická kompozice může být podána také jako zařízení.

[227.] Farmaceutická kompozice pro topické podání může být ve formě krému, masti, lotio, náplasti, roztoku, suspenze nebo gelu.

[228.] Kromě toho může být kompozice připravována jako pevný, tekutý nebo postupně uvolňovaný prostředek.

[229.] Kompozice obsahující protilátkové fragmenty připravené podle vynálezu může obsahovat běžná farmaceuticky přijatelná ředidla a nosiče. Tablety, pilulky a kapsule mohou obsahovat běžné excipienty, jako jsou laktóza, škrob a stearát hořečnatý. Čípky mohou obsahovat

excipienty, jako jsou vosky a glycerol. Injektovatelné roztoky obsahují sterilní apyrogenní média, jako je fyziologický roztok, a mohou obsahovat pufrovací činidla, stabilizační činidla nebo konzervační látky. Rovněž mohou být použity běžné enterické potahovací látky.

[230.] Předmětný vynález rovněž zahrnuje způsob produkce protilátkových fragmentů syntetickými způsoby známými v oboru.

[231.] Provedení podle vynálezu zahrnuje farmaceutické kompozice obsahující alespoň jeden peptid nebo polypeptid podle vynálezu připojený, vázaný, kombinovaný, ve vazbě nebo fúzovaný se zobrazovacím agens pro použití v diagnostice lokalizace a/nebo zobrazení nádoru.

[232.] Další provedení podle vynálezu poskytuje diagnostický kit pro in vitro analýzu účinnosti ošetření před, během a po ošetření, který obsahuje zobrazovací agens zahrnující peptid podle vynálezu spojené s indikativní markerovou molekulou. Vynález dále poskytuje způsob použití zobrazovacího agens pro diagnostickou lokalizaci a /nebo zobrazení nádoru, konkrétně tumoru, který zahrnuje následující kroky:

a) kontaktování buněk s kompozicí,

b) měření radioaktivity vázané na buňky, a

c) vizualizaci tumoru.

[233.] Ve výhodném provedení podle vynálezu, je zobrazovacím agens v kitu fluorescenční barvivo a kit umožňuje analýzu účinnosti ošetření nádorů, konkrétněji rakoviny krve, jako je leukémie, lymfom a myelom. Analýza FACS je použita ke stanovení procenta buněk obarvených • · zobrazovacím agens a intenzity barvení v každém stupni onemocnění, tj. bezprostředně po diagnóze, během léčby, během remise a během relapsu.

[234.] Vynález dále poskytuje kompozici obsahující účinné množství zobrazovacího agens, peptid podle vynálezu a fyziologicky přijatelný nosič.

[235.] Ve výhodném provedení je molekulou indikativního markéru jakýkoliv v oboru známý markér, který je, bez omezení, vybrán ze skupiny zahrnující radioaktivní izotop, prvek neprůsvitný v rentgenovém záření, paramagnetický ion, nebo fluorescenční molekula apod.

[236.] Ve specifickém provedení podle vynálezu může být indikativním radioaktivním izotopem být bez omezení ^luindium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechneciurn, ^121mtellur, ^122mtellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium.

[237.] Podle dalšího provedení vynálezu je indikativním markerovou molekulou fluorescenční markerová molekula.

Podle ještě výhodnějšího provedení je fluorescenční markerovou molekulou fluorescein, phycoerythrin, nebo rhodamid, nebo jejich modifikace či konjugáty.

[238.] Předmětný vynález se rovněž zabývá kompozicí obsahující účinné množství zobrazovacího agens podle vynálezu, k němu připojené farmaceutické agens a fyziologicky přijatelný nosič.

·· · · • · · · · • · · · • · · • · ·· · [239.] Vynález rovněž poskytuje způsob zobrazování orgánů nebo buněk, který zahrnuje kontaktování orgánů nebo buněk, jež mají být zobrazeny, se zobrazovacím agens podle vynálezu za takových podmínek, kdy se zobrazovací agens váže k orgánu a buňkám, zobrazení navázaného agens a následně zobrazení orgánu nebo buněk.

[240.] Předmětný vynález dále poskytuje způsob léčby orgánů in vivo, který zahrnuje kontaktování orgánu, jenž má být ošetřen, s kompozicí podle vynálezu za takových podmínek, kdy se kompozice váže k orgánu, a tímto ošetřování orgánu.

[214.] Ve výhodném provedení podle vynálezu může být peptid nebo polypeptid použit cílení na maligní buňky, konkrétněji na leukemické buňky celé krve, monitorováním a zobrazením buněk, např. analýzou FACS. Předmětem ošetření jsou vzorky nádorových buněk, které vykazují ve srovnání s normálními buňkami vyšší skóre (např. čtyřikrát vyšší).

[242.] Vynález poskytuje metodu léčby pacienta trpícího rakovinou, která zahrnuje podání peptidu nebo polypeptidu podle vynálezu v množství účinném k léčbě rakoviny. Ve výhodném provedení je rakovina vybrána ze skupiny zahrnující karcinom, sarkom, leukémii, adenom, lymfom, myelom, blastom, seminom a melanom. Ve výhodnějším provedení je rakovinou leukémie a v nejvýhodnějším specifickém provedení je leukémií AML.

[243.] V nejvýhodnějším provedení se peptid nebo polypeptid podle vynálezu specificky nebo selektivně váže k buňkám AML. Vynález poskytuje ligand přítomný na buňkách • · ♦· · ·

AML, který je vázán k peptidů nebo polypeptidů podle vynálezu, a dále poskytuje peptid nebo polypeptid, který se váže k řečenému ligandu.

[244.] Nové protilátkové fragmenty podle přemětného vynálzeu nebo jejich odpovídající peptidomimetika jsou použity k přípravě kompozic nebo léčiv k ošetření různých nemocí a stavů.

[245.] Předkládaný vynález poskytuje způsob produkce cíleného agens, který zahrnuje následující kroky:

a) izolaci a selekci jedné nebo více cílících molekul obsahujících primární rozpoznávací místo metodou biopanningu přímo na cílové buňce nebo metodou biopanningu nepřímo na první cílové buňce ve druhém, nikoliv však v prvním stadiu, a následné metodou biopanningu přímo na druhé cílové buňce pro produkci jedné nebo více cílících molekul;

b)

c) amplifikaci, purifikaci a identifikaci jedné nebo více cílících molekul; a konstrukci cíleného agens z jedné nebo více cílících molekul nebo z jejich rozpoznávacích míst, kde cílícím agens může být peptid, polypeptid, protilátka nebo fragment protilátky, nebo její multimer.

[246.] Cílené agens může být dodatečně konstruováno tak, aby bylo vázáno, spojeno, kombinováno, ve vazbě nebo fúzováno, nebo v asociaci s farmaceutickým agens.

[247.] Ve výhodném provedení podle vynálezu je cílené agens látka zaměřená proti onemocnění nebo proti rakovině.

• · ···· [248.] V jiném preferovaném provedení podle vynálezu je farmaceutické agens vybráno ze skupiny zahrnující radioizotop, toxin, oligonukleotid, rekombinantní protein, fragment protilátky a protirakovinné agens. Radioizotop může být vybrán ze skupiny zahrnující ¹¹¹índium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechneciurn, ^121mtellur, ^122mtellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium.

[249.] V dalším provedení může být toxin vybrán ze skupiny zahrnující gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE),

PE40, PE38, diftérický toxin, ricin nebo jejich modifikace a deriváty.

[250.] V ještě dalším provedení vynálezu je protirakovinné agens vybráno ze skupiny zahrnující doxorubicin (adriamycin), morfolinodoxorubicin, methoxymorfolinyldoxorubicin, cis-platinu, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabin (Ara-C), cyklofosfamid, prednison, daunorubicin, morfolinodaunorubicín, methoxymorfolinyldaunorubicín, idarubicin, fludarabin, chlorambucil, interferon alfa, hydroxymočovinu, temozolomid, thalidomid a bleomycin a jejich deriváty.

[251.] Předmětný vynález poskytuje způsob identifikace fragmentů protilátek pomocí(a) biopanningu, který zahrnuje inkubaci displejové fágové knihovny s buňkami odvozenými z krve; (b) promytí k odstranění nenavázaného fága; (c) • * • · · · · ···· ·· ··· ··· ··· ·· ·· vymytí (eluci) vázaného fága od krevních buněk; (d) amplifikaci výsledného vázaného fága; a (e) stanovení vytříděných (displejováných) peptidových sekvencí vázaného fága tak, aby byl identifikován peptid.

[252.] Předkládaný vynález poskytuje peptid nebo polypeptid mající vzorec o struktuře:

A-X-B, kde X je hypervariabilní oblast CDR3 ze 3 až 30 aminokyselin; a každý z A a B mohou být aminokyselinové řetězce o délce 1 až 1000 aminokyselin, přičemž A je aminokonec a B je karboxykonec.

[253.] Ve výhodném provedení vynálezu je A 1 až 250 aminokyselinových zbytků a B je 350-500 aminokyselinových zbytků.

[254.] V jiném preferovaném provedení je v peptidu oblastí CDR3 5-13 aminokyselinových zbytků.

[255.] V dalším výhodném provedení je X ve výše uvedeném vzorci aminokyselinová sekvence vybraná ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO:8-24.

[256.] V dalším provedení vynálezu je peptid nebo polypeptid částí rozsáhlejší nebo úplné protilátky nebo multimeru.

[257.] V ještě dalším provedení obsahuje dimerní molekula dva peptidy nebo polypeptidy, z nichž jeden je peptid nebo polypeptid podle vynálezu. Dimerní molekula může obsahovat dva identické peptidy nebo polypeptidy podle vynálezu.

·· ···· [258.] V jiném výhodném provedení je X v uvedené dimerní molekule aminokyselinová sekvence vybraná ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.

[259.] Jiné provedení poskytuje molekulu nukleové kyseliny kódující peptid nebo polypeptid nebo dimerní molekulu podle vynálezu.

[260.] Vynález poskytuje použití peptidu nebo polypeptidu, případně v asociaci, vazbě, kombinaci, spojení nebo fúzi s farmaceutickým agens pro výrobu léčiva.

[261.] Vynález dále poskytuje použití peptidu nebo polypeptidu pro výrobu léčiva, které má účinnost proti nemocné buňce, konkrétněji proti rakovinné buňce. Rakovinná buňka může být vybrána ze skupiny zahrnující karcinom, sarkom, leukémii, adenom, lymfom, myelom, blastom, seminom a melanom. Konkrétněji, rakovinnou buňkou může být buňka leukémie a nejkonkrétněji, leukemickou buňkou může být buňka AML.

[262.] Zaměnitelným systémem, jak je v předkládaném vynálezu definován a diskutován níže v příkladech, je konstrukt nukleové kyseliny, který byl navržen tak, aby byla možná výměna nebo záměna obnovené variabilní oblasti uvnitř řečeného konstruktu, aniž by byly nutné další zpracování nebo přestavba molekuly. Takový systém dovoluje rychlou a pohodlnou přípravu požadované molekuly nukleové kyseliny.

Příklady provedení ·· ····

• · * · · · • · · · · ·· ··· ♦·· ··· [263.] Následující příklady provedení jsou předkládány pro pochopení vynálezu, ale nejsou zamýšleny a neměly by být vykládány způsobem omezujícím rozsah vynálezu. Ačkoliv jsou popsány specifické reagencie a reakční podmínky, mohou být prováděny modifikace, které jsou míněny tak, že spadají do rozsahu vynálezu. Následující příklady jsou proto poskytnuty pro další ilustraci vynálezu.

Příklad 1:

[264.] 1. Příprava buněk, bakteriálních kmenů, scFv fágové expresní knihovny, bezbuněčných membrán a purifikace proteinů pro biopanning:

[265.] 1.1 Příprava leukemických buněk. Vzorky krve byly získány od pacientů s leukémií. Mononukleární buňky (primární buňky) byly odděleny od ostatních krevních buněk na Ficollu (Iso-prep, Robbins Scientific Corp., Sunnyvale, CA, USA). Byla provedena centrifugace při 110 x g po dobu 25 minut. Buňky na rozhraní byly sebrány a dvakrát promyty. PBS. Po té byly buňky resuspendovány v RPMI + 10% fetálním telecím séru (fetal calf sérum, FCS) a spočítány.

K lymfocytům. byl pro dlouhodobé uchovávání přidán 10% FCS a 10% DMSO, a po té byly zmraženy pří -70 °C.

[266.] 1.2 Příprava fixovaných destiček. Koncentrát destiček získaný z krevní banky byl inkubován po dobu 1 hodiny při 37 °C. Byl přidán shodný objem 2,0% paraformaldehydu a destičky byly fixovány po dobu 18 hodin při 40 °C. Destičky byl dvakrát promyty ledovým fyziologickým roztokem (centrifugací po dobu 10 min při 2500 x g), resuspendovány v 0,01% HEPES ve fyziologickém roztoku a s použitím mikroskopu spočítány.

·· 9999 ·· ···· * · · • · 9 99

9 · • · · ·· ·· · ·· [267.] Byla ověřena citlivost destiček k plasmatickému von Willebrandovu faktoru a ristocetinu. Plasmatický von Willebrandův faktor (vWF; 18 μ9/ιη1) a ristocetin (0,6 mg/ml) byly přidány k fixovaným destičkám a agregace destiček byla indukována a monitorována lumi-agregometrem. Chronolog.

[268.] 1.3 Bakteriální kmeny - TG-1 a HB2151: Čerstvé bakteriální kultury, připravené pro infekci růstem buněk E.coli TG-1 k Αβοο o hodnotě 0,5-0,9 (exponencielně rostoucí buňky), byly použity pro propagaci fága a buňky E.coli HB2151 byly použity pro produkci scFv proteinu.

[269.] 1.4 Zdroj scFv expresní fágové knihovny.

Knihovna scFv (Nissim et al., EMBO J., 13, 692-698 (1994)) byla poskytnuta Dr.A.Nissimem se souhlasem MRC. Knihovna byla původně konstruována jako fágemidová knihovna pro expresi (displaying) fragmentů scFv, ve které V_H a V_L domény byly spojeny flexibilním polypeptidem. Exprimované scFv ve fágemidové knihovně byly fúzovány k N-konci minoritního obalového proteinu plil fága (minor coat protein plil), který byl následně subklonován do vektoru pHENl (Nissim et al., EMBO J., 13, 692-698 (1994)). Repertoár protilátkových fragmentů byl nejprve generován pomocí PCR z přeskupených V-genů periferních krevních lymfocytů z neimunizovaných lidí (označovaný jako „přirozený zdroj, repertoár).

K diversifikaci repertoáru byly do banky zavedeny náhodné nukleotidové sekvence kódující CDR3 těžkého řetězce o 4-12 zbytcích ze 49 klonů lidských VH genových segmentů.

Fúzovaný V_L fragment ve všech klonech je odvozen od jednoho nemutovaného V genu základní linie (germline) IGLV3S1, za vzniku jednonádobové knihovny přibližně o 10⁸ klonech.

·· ····

• · [270.] 1.5 Příprava membrán z buněk AML. K peletu obsahujícímu 10⁸ promytých buněk byl přidán 1 ml ledového lyžujícího roztoku (0,3M sacharóza, 5mM EDTA, lmM PMSF), pak byl odstřeďován po 20 minut při 11 000 x g při 4 °C. Supernatantová tekutina byla odstraněna, pelet byl resuspendován v TE (lOmM Tris, lmM EDTA, lmM PMSF) a supernatant byl odstraněn shodně, jak je uvedeno výše. Konečný pelet byl resuspendován v 6 ml PBS při A₂8o o hodnotě 0,4 a byl použit k navázání na 3 MaxiSorp imunozkumavky (NUNC) při 37 °C po dobu 2 hodin. Po navázání byly zkumavky třikrát promyty PBS, blokovány MPBS (2% odstředěné mléko v PBS) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Před biopanningem byly zkumavky dodatečně třikrát promyty PBS.

Příklad 2 [271.] 2. Příprava fágemidových částic: metoda biopanningu [272.] 2.1 Fágemidová selekce a amplifikace: Eágemidy, které exprimují epitopy specifického zájmu, byly z knihovny selektovány pomocí čtyřstupňového způsobu biopanningu:

a) Navázání fágemidových částic k cíli, konkrétně

b)

c)

d) navázání fágemidových částic k promytým cílovým buňkám nebo buněčným membránám Odstranění nenavázaných fágemidových částic, konkrétně odstranění extenzivním promýváním Eluce vázaných fágemidových částic Propagace a amplifikace eluovaných fágemidových částic, konkrétně propagece a amplifikace v E.coli.

·· ····

• · [273.] 2.2. Identifikace klonů: Čtyřstupňový způsob biopanningu byl obecně opakován 3-5 krát. Selektované fágemidové klony byly jednotlivě propagovány a dále charakterizovány pomocí:

a) DNA sekvenování

b) porovnání vazby fágů k několika buněčným typům ex vivo

c) infekce E.coli HB2151 pro produkci rozpustných scFv [274.] 2.3 Sekvenční analýza: DNA kódující scFv o délce ~ 800 bp uvnitř fágemidových částic, byla amplifikována pomocí PCR s použitím upstream primeru #203743 (5'GAAATACCTATTGCCTACGG) a downstream primeru #181390 (5'TGAATTTTCTGTATGAGG). Fragmenty DNA byly plně sekvenovány od obou konců automatickým DNA sekvenátorem ABI PRISM (310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer) s použitím ABI PRISM Big Dye termination cycle sequencing křtu a výše uvedených primerů. Pro sekvenování byly použity dva další primery, primer #191181 (5'-CGATCCGCCACCGCCAGAG) a jeho komplementární primer #191344 (5'- CTCTGGCGGTGGCGGATCG), které jsou umístěny v oblasti flexibilního polypeptidového spojení mezi těžkými a lehkými řetězci.

Příklad 3 [275.] 3.Protokoly biopanningu [276.] 3.1 Základní protokol biopanningu: Metoda biopanningu je nedílnou součástí metody fágového displeje, popsaná výše. V předkládaném vynálezu byly použity tři protokoly biopanningu:

·· ··· · • · · • · · ·· • · · · • · · • · · · · • · ·· ··

a) Protokol AM (panning membrán AML buněk/bakteriální eluce, následně panning celých AML buněk/eluoe trypsinem)

b) Protokol YPR (panning fixovaných lidských destiček/kyselá eluce)

c) Protokol YPNR (panning fixovaných lidských destiček/kyselá eluce).

[277.] Protokoly jsou detailně popsány níže:

[278.] 3.1.1 Protokol AM [279.] 3.1.1.1 Předmytí: Alikvoty o 1 ml, obsahující 2xl0⁷ zmražených buněk AML od pacientů uchovávané při -70 °C, byly krátce rozmraženy při 37 °C a bezprostředně naředěny do 10 ml ledového 2% PBS-Milk (MPBS). Buňky byly odstředěny 5 minut při 120 x g při teplotě místnosti (room temperature, RT), dvakrát promyty, resuspendovány v MPBS a spočítány hemocytometrem. Buněčné membrány byly připraveny tak, je popsáno v Části 1.5.

[280.] 3.1.1.2 Selekce byla prováděna na imobilizovaných membránách buněk AML přidáním 2 ml MPBS obsahujícím 10¹² fágemidů z původní Nissim knihovny.

Zkumavky byly pomalu třepány po dobu 30 minut, pak byly inkubovány po dalších 90 minut bez třepání, oba stupně byly prováděny při teplotě místnosti. Následovaly tři cykly panníngu na membránách buněk AML, jeden cyklus panningu byl proveden na celých buňkách AML. .

[281.] 3.1.1.3 Promývání: K odstranění nadbytečných nevázaných fágemidů byl obsah zkumavek dekantován a

• ·

I · · * ·· ·· zkumavky byly desetkrát promyty s PBS, 0,1% Tween a následovalo 10 promytí pouze s PBS.

[282.] 3.1.1.4 Eluce: Exponenciálně rostoucí buňky E.coli TG-1 (20ml) byly přímo přidány do zkumavky a inkubovány za pomaléhoo třepání při 37 °C po dobu 30 minut. Jak je uvedeno výše, byly alikvoty naneseny na plotny pro titraci a zbývající objem byl nanesen pro amplifikaci.

[283.] 3.1.1.5 Amplifikace: Kolonie z velkých destiček byly seškrabány a shromážděny. Alikvot (~10⁷) buněk E.coli TG-1 rezistentních na ampicilin byly pěstovány v tekutém médiu k A₆oo o hodnotě ~ 0,5, pak byly buňky infikovány pomocným fágem (VSC-M13, Strategene) pro produkci rozsáhle amplifikovaného fágemidového zásobního kmene (stock). Fágemidy byly uvolněny PEG precipitačním postupem (18a). Amplifikovaný TI 6MI kmen (~ 10¹¹ fágemidů/ml) byl použit pro následující cykly panningu. Selekce byla opakována po dva další cykly s použitím 10¹¹ fágemidů dříve amplifikovaného zásobního kmene. Amplifikovaný kmen, získaný ze třetího panningu na ímobilizovaných membránách, byl označen T16M3.

[284.] 3.1.1.6 Re-panning na celých buňkách:

Amplifikovaný kmen T16M3,ze třetího membránového panningu, byl použit pro vybrání intaktních buněk AML. Selekce byla prováděna v konečném objemu 0,5 ml MPBS obsahujícím 2xl0⁷ buněk a 10¹⁰ fágemidových jednotek tvořících kolonie (CFU, colony forming units)(Nissim knihovna), a 10¹³ bakteriofága M13 standardního typu (wild-type), za pomalého třepání po dobu 2 hodin při 4 °C. Navázané fágemidy byly z promytého buněčného peletu eluovány 50 μΐ roztoku obsahujícím trypsin:EDTA (Ό,25%:0,05%), pak byly neutralizovány ·· ···· přidáním 50 μΐ FCS. Pro titraci a amplifikaci byl použit 1 ml kultury E.coli TG-I (A_6Oo = 0,5). Amplifikovaný konečný kmen byl označen T16M3.1.

[285.] 3.1.2 Protokol YPR [28 6.] 3.1.2.1 Selekce :Selekce klonů byla provedena panningem 10⁸ fixovaných lidských destiček s 10¹¹ fágemidů (Nissim knihovna) v 1 ml PBS/HEPES/1%BSA pufru. Vázání se uskutečnilo během jedné hodiny při RT a promíchávání vzorku rotací.

[287.] 3.1.2.2 Promytx buněk: Destičky byly promyty pětkrát na nízkootáčkové centrifuze (3500 x g) a resuspendovány tak, jak je uvedeno výše.

[288.] 3.1.2.3 Eluce: Fágemidy navázané v prvém cyklu byly od fixovaných destiček eluovány technikou kyselé eluce:

[289.] Destičky byly inkubovány po 10 minut při RT s 200 μΐ 0,lM glycinu (pH 2,2). Po neutralizaci s 0,5 TrisHC1, pH 8,0 a centrifugaci, byly zbývající fágy vázané na destičky eluovány přidáním 200 μΐ trypsin-EDTA (0,25%/0,05%) a neutralizací přidáním 50 μΐ FCS. Buňky byly odstraněny centrifugaci, tekutiny supernatantu obsahující eluované fágy byly, jak v kyselém, tak v trypsinovém elučním protokolu, shromážděny a označeny YPR(a)-l a YPR(t)-l kmeny v uvedeném pořadí. Tyto kmenyy byly pak amplifikovány přidáním 1 ml exponenciálně rostoucích buněk TG-1 po 30 minut při 37 °C. Alikvot byl nanesen pro titraci na plotny a zbývající infikované buňky E.coli byly naneseny na plotny 2 x TV/AMP 15 cm. Plotny byly inkubovány přes noc ·· ···· « · · • · ··· • · · • · · ·· ··· při 30 °C. Výsledek po každém cyklu panningu byl stanoven spočítáním kolonií na titrační plotně.

[290.] 3.1.2.4 Amplifikace: Klony byly amplifikovány tak, jak je popsáno v Části 3.1.1.5. Amplifikované kmeny s obsahem ~ 10¹² fágemidů/ml z kyselého a trypsinového protokolu, označené jako Rl(a) a R(t) kmenyy v uvedeném pořadí, byly kombinovány a použity pro následné cykly panningu.

[291.] 3.1.2.5 Druhý a třetí cyklus panningu byly provedeny tak, jak byl popsán první panningový cyklus postupu YPR s následujícími modifikacemi: (i) Pro druhý panning bylo použito 10¹² Rl(a) v kombinaci s 10¹² Rl(t) a (ii) eluce byla prováděna pouze s glycinem (pH 2,2).

Amplifikovaný eluát z druhého cyklu byl označen R2. (iii) Pro třetí cyklus biopanníngu bylo použito 10¹² R2 a eluce byla prováděna shodně jako ve druhém cyklu. Amplifikovaný kmen ze třetího cyklu byl označen R3.

[292.] 3.1.3 YPNR protokol [293.] 3.1.3.1 Biopanning a promývání byly v podstatě prováděny tak, jak je popsáno pro protokol YPR. Nicméně, v tomto protokolu (i) eluce byla prováděna po každém ze tří cyklů glycinem (pH 2,2), a (ii) první panning a amplifikace byly následovány dvěmi dodatečnými cykly panningu bez amplifikace. První, druhý a třetí cyklus byly označeny jako YPNR1, YPNR2 a YPN v uvedeném pořadí.

»» «>»·«

[294.] 3.2. Selekce negativních kontrolních scFv klonů ·· ···· ·· ···· « · • ··· • · · · · · · · ’ ·· ··· ··· ··· ·· ·· [295.] 3.2.1 Sekvence N14 CDR3 : Pro všechny vazebné pokusy byl vybrán jeden klon z „přirozené knihovny (před selekcí). Z tohoto klonu byly připraveny kmen fága a rozpustný scFv, označený N14. Sekvenční analýza potvrzuje, že náleží ke genové rodině V_H4-DP65. Sekvence 11-meru V_H4DP65, kódovaného tímto klonem označeným jako N14 CDR3, je následující (SEQ ID NO:28).

Phe Leu Thr Tyr Asn Ser Tyr Glu Val Pro Thr [296.] 3.2.2.Sekvence C181 CDR3: V pokusech vazebné analýzy byl použit další negativní klon C181. Klon C181 (reaktivní s částicemi rekombinantního viru hepatitidy B [HBV ]) náleží do rodiny V_H3-DP35, a sekvence 9-meru V_H3DP35, kódovaná tímto klonem označeným jako C181 CDR3, je následující (SEQ ID NO:29):

Thr Asn Trp Tyr Leu Arg Pro Leu Asn

Příklad 4:

[297.] 4. Produkce, purifikace, značení a charakterizace klonů scFv [298.] 4.1 Produkce rozpustných scFv: pHENl, vektor použitý ke konstrukci původní fágemidové knihovny, byl navržen s amber stop kodónem kódovaným ve spojení genu scFv a genu plil. Proto, jestliže jsou vektory ze selektovaných klonů zavedeny fágemidovou infekcí do E.coli HB2151 1, který je non-supresorovým kmenem, umožňuje tento systém produkci a sekreci rozpustných scFv do bakteriální periplasmy (Harrison et al.,Methods in Enzymology, 267, 83109 (1996)). Fragmenty scFv jsou pak snadno získatelné z kultivační půdy. Rozpustné scFv jsou produkovány za • · řízení promotorem lacZ (Gilbert and Muller-Hill, PNAS (US) , 58, 2415 (1967), který je indukován IPTG.

[299.] Sekvence kódující c-myc tag (10 aminokyselin Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu; SEQ ID NO:123) je obsažena ve vektoru proti směru k amber mutaci. C-konec exprimovaného scFv může nést c-myc tag, který může být detekován s použitím myších anti-myc tag protilátek (získaných z hybridomu 9E10 uloženém v European Collection of Cell Culture (ECACC)).

[300.] 4.2. Purifikace scFv na afinitním sloupci s Protein-A-kuličkami: Fragmenty scFv ze selektovaných klonů a z kontrolního klonu C181 náležejí všechny k V_H3 rodině, což umožňuje purifikaci na Protein-A afinitním sloupci.

Byly připraveny periplasmatické frakce (100-250 ml) z indukovaných kultur každého klonu a inkubovány s ProteinA-Sepharose kuličkami. Vázané scFv byly získány ze sloupce kyselou elucí (0,1 M glycin, pH 3,0), následovanou eluční neutralizací s Tris, pH 8,0. Koncentrace získaného proteinu byla stanovena měřením Α₂80λ následovala výměna PBS pufru dialýzou nebo na sloupci G-25 Sepharose [301.] Purifikace N14-scFv na sloupci Sephacryl S-200:

Fragment scFv negativního klonu N14 náleží ke genové rodině V_h4 a nemůže proto být purifikován na Protein-A afinitním sloupci. Pro purifikaci scFv-N14 byl celkový protein v periplasmatické frakci ze 200 ml indukované kultury precipitován 60% síranem amonným. Pelet byl resuspendován do 2 ml 0,lxPBS, 5mM EDTA, 5mM PMSF a nanesen na sloupec Sephacryl S-200 (1,5x90 cm) předem uvedený do rovnováhy promývacím pufrem (0,lx PBS, 5 mM EDTA). Proteiny byly frakcionovány a frakce obsahující N14-scFv (tak, jak byly • · • · ·· ··· ·.·· ··· ·· detekovány SDS-PAGE a Western analýzou) byly shromážděny, lyofilizovány a suspendovány v 1/10 objemu H₂O. Nl4-scFv (neznačený a značený s FITC) byl pak použit jako negativní kontrola v pokusech s FACS analýzou.

[302.] 4.4.Značení purifikovaných scFv s FITC:

Přibližně 1 miligram purifikovaného scFv z každého postupu byl resuspendován v PBS a spojen s FITC s použitím FluoroTag FITC konjugačního komerčního kitu (Sigma cat. #FITC-1), podle návodu výrobce.

[303.] 4.5 Kvalitativní analýza purifikovaného a značeného scFv [304.] 4.5.1 Po purifikaci a označení FITC byl profil každého vzorku (značeného a neznačeného) analyzován pomocí SDS-PAGE, Western blotu, HPLC s použitím sloupce Superdex75 (A280 a A495) a fluorometrií. Analýza prokázala 80% čistotu N14-scFv a 90% čistotu klonů V_H3, s přibližně 2 molekulami FITC konjugovanými ke každé molekule scFv (F/P poměr 2:1).

[305.] 4.5.2 Vazebná aktivita po značení FITC byla hodnocena pro potvrzení zachování specifičnosti scFv (viz Příklad 5).

[306.] 4.6 Biochemická charakterizace fágemidových klonů: Byly použity různé typy analýz ke zjištění struktury a stanovení čistoty různých vzorků scFv (viz Příklad 8) včetně SDS PAGE, hmotové spektroskopie, (pouze pro Yl a Y17 scFv) a HPLC. Byly použity Westernová analýza a EIA pro identifikaci scFv; FACS byla použita pro charakterizaci vazby scFv.

• · · · · • · · · ·

Příklad 5 [307.] 5. Vazebná zkouška [308.] Vazba vybraných klonů s buňkami byla hodnocena na dvou úrovních, na úrovni fágemidu a na úrovni rozpustného scFv.

[309.] 5.1. Vazba na úrovni fágemidu [310.] K tomuto účelu byl fágemidový kmen připraven jednotlivě z každého selektovaného klonu.

[311.] 5.1.1 Koloniový test: V jedné sadě pokusů byla směs 10⁹ specifických fágemidů, odvozených z biopanningového protokolu, který poskytuje infikované ampicilin resistentní E.coli, a 10¹¹ standardního (wildtype) fága M13, který nenese ampicilinovou resistenci a slouží jako „blocker, inkubována s 10⁵ buněk, vybraných z řady buněčných typů. Po inkubaci a promytí byly navázané fágy eluovány trypsinem, a alikvot byl použit pro infikování E.coli TG-1. E.coli byly pak vysety na 2xTY/AMP plotny a inkubovány přes noc při 30 °C. Byl spočítán a porovnán počet získaných kolonií pro každý klon. Výsledky uvádějí míru vazebné afinity a specifičnosti fágemidů.

[312.] 5.1.2 White/Blue koloniový test: V tomto testu , ve kterém každý pokus zahrnuje vnitřní kontrolu, byl specifický fágemid smísen ve stejném poměru jako v Části 5.1.1 uvedené výše, tj. 1/100, s jiným kontrolním fágemidem označeným pGEM7 (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA). Tento fágemid nese rezistenci k ampícilinu; nicméně, • · · · neexprimuje jakýkoliv rekombinantní polypeptid na N-konci svého genu plil. Po infekci TG-1 a inkubaci na ampicilinových plotnách obsahujících 1 mM X-gal byly kolonie spočítány. Získané kolonie, které obsahují pGEM7 jsou modré, zatímco kolonie získané ze specifických fágemidů jsou bílé. Pak byl spočítán činitel obohacení, odvozený z poměru vstup/výstup (input/output) bílých/modrých kolonií (pěstovaných na stejné plotně) pro každou testovanou zkumavku.

[313.] 5.3.3 EIA fágemidů [314.] Vazba fágemidů k selektovaným buňkám: Přibližně 5xl0⁵ selektovaných buněk bylo fixováno aceton/methanolem (1:1) na povrchu destiček o 24 jamkách. Vazebný test vyžadoval 10⁹ fágemidů. Vázání bylo prováděno při 37 °C po dobu 1 hodiny, pak následovalo extenzivní promytí s PBS/Tween (0,05%). Po extenzivním promytí PBS byly plotny inkubovány s králičím anti-M13, anti-králičí IgG-HPR a substátem. Intenzita získaného zbarvení byla odečtena na ELISA readeru při A₄os a byla proporcionální k množství navázaných fágemidů.

[315.] 5.1.3.2 Vazba fágemidů k fixovaným destičkám:

Polystyrénové mikrotitrační destičky byly potaženy 10⁸ fixovaných destiček a byly inkubovány přes noc při 4 °C. Přibližně 1O¹⁰ fágemidů bylo použito k vyhodnocení vazby. Promývání a inkubace destiček a stanovení vazebné úrovně byly provedeny tak, jak je popsáno výše v části 5.1.3.1.

[316.] 5.1.4 Vazebné zkoušky byly provedeny ke specifickým proteinům, vybraným ze skupiny sestávající z lidského růstového hormonu (hGH), fibrinogenu, • · • · · · • ··· fibronectinu, BSA, SM (skim milk) a gly^/cocalicin (proteolytický fragment GPIb). Vazba byla testována následujícím způsobem. Na polystyrénové mikrotitrační destičky byl navázán jeden z testovaných proteinů, v množství 2 μρ/^π^η. Po navázání (coating) následovala inkubace přes noc pří 4 °C. Po extenzivním promytí PBS byly destičky inkubovány s králičím anti-M13, anti-králičím BRP a substrátem. Úroveň vazby byla měřena intenzitou vzniklého zbarvení. Optická denzita byla měřena při A405. Každý vzorek byl testován dvakrát a byl vypočten průměr.

[317.] 5.2 Vazebné testy na úrovni scFv: Vázání scFvs produkovaných v periplasmě HB2151 bylo porovnáno s několika buněčnými typy ve dvou odlišných testech, pomocí EIA a FACS analýzy.

[318.] EIA rozpustných scFv: Přibližně 5xl0⁵ buněk AML bylo ínkubováno s 5-10 μρ celkového proteinu. Vázání bylo prováděno při 4 °C po dobu 1 hodiny, následovala EIA s použitím myších anti-myc protilátek, anti-myší HRP a substrátem. Nadbytek nevázaných protilátek byl odstraněn po každém kroku promýváním buněk třikrát s PBS. Intenzita získaného zbarvení byla odečtena na ELISA plate readeru (O.D.405). Jak je uvedeno výše, intenzita zbarvení je proporcionální k úrovni vázání.

[319.] 5.2.2 FACS analýza buněk [320.] 5.2.2.1 Analýza buněk barvených postupem „threestep staining”: Analýza FACS byla prováděna pro testování a potvrzení specifičnosti selektovaných klonů. Postup „three step staining'¹ byl nejprve proveden s použitím surového extraktu nebo purifikovaného scFv, následovalo použití ···· myších anti-myc protilátek a nakonec FITC nebo PEkonjugovaných anti-myších protilátek.

[321.] Analýza FACS vyžaduje 5-8xl0⁵buněk, které byly purifikovány Ficollem a respuspendovány v PBS+1% BSA.

Vázání probíhalo po dobu 1 hodiny při 4 °C. Po každém kroku byly buňky promyty a resuspendovány v PBS+1%BSA. Po konečném barvicím kroku byly buňky fixovány resuspendováním v PBS, 1% BSA, 2% formaldehydu a pak byly odečteny pomocí FACS (Becton-Dickinson).

[322.] 5.2.2.2 Barvení buněk pomocí FIT-značených scFv v „single staining step (jednostupňovém barvení): FITCznačený scFv byl inkubován s 5-8xl0⁵ Ficollem purifikovaných buněk v PBS+1%BSA. Vázání bylo provedeno po dobu 1 hodiny při 4 °C. Po té byly buňky promyty a fixovány jako v části 5.2.2.1 uvedené výše a odečteny pomocí FACS.

Příklad 6: Výsledky panningu a sekvenování [323.] 6.1 Výsledky AM protokolu [324.] 6.1.1 Výsledky panningu podle AM protokolu:

Odhad počtu fágemidů použitých pro panning (input) a odhad počtu vázaných fágemidů eluovaných podle AM protokolu . (output) jsou souhrnně uvedeny v následující tabulce (Tabulka 1) • · • « ·· ·· · ···· • · ·

Tabulka 1. Výsledky panningu získané podle AM protokolu.

Vstupní kmen	Zdroj buněk	Eluce	Výstup	Amplifikovaný kmen
Nissim	Membrány	Bakteriální	3xl04	T16M1
knihovna	AML	TG-1
ŽxlO11
T16MI-1011	Membrány	Bakteriální	6,4xlOb	T16M2
	AML	TG-1
T16M2-1011	Membrány	Bakteriální	To*	T16M3
	AML	TG-1
T16M3-1O10	Buňky AML	Trypsin	2xl06	T16M3.1

[325.] Je třeba upozornit na obohacení výstupu, získaném v každém následujícím panningu. Kromě toho neexistuje pokles ve výstupu, jestliže je použit T16M3 pro panning celých AML buněk, což naznačuje, že vázané fágemidy jsou pravděpodobně specifické ke složkám na vnějším buněčném povrchu, nebo že tento specifický systém může obsahovat relativně velký počet nespecifických vázaných fágemidů.

[326.] 6.1.2 Výsledky sekvenování klonů podle AML protokolu: Ačkoliv klony byly sklizeny a sekvenovány z výstupních kmenů T16M1, T16M2 a T16M3, výsledky níže zde uvedené se týkají hlavně těch klonů, které byly odvozeny od T16M3.1 výstupního kmene (z panningu intaktních AML buněk). Klony AM10, AMU a AM12 byly identifikovány v kmeni T16M3, nikoliv však v následném výstupu.

[327.] Aminokyselinové sekvence displejované ve V_H-CDR3 a jejich frekvence v testovaném výstupu klonů jsou souhrnně uvedeny v Tabulce 2.

Tabulka 2. Klony selektované podle AM biopanningového protokolu z výstupů T16M3 a T16M3.1.

Klon tt	v„- CDR velikost	Sekvence V„-CDR3	Základ- ní linie	Frekvence v T16M3 vvstunu	Frekvence v T16M3.1 výstupu
AMI	8	Pro	Trp	Asp	Asp	Val	Thr	Vh3-	5/31	8/51
			Pro	Pro				DP47
			1	2	3	4
			5	6	7	8
AM2	12		Gly	Phc	Pro	Arg	lle	Vh3-	11/31	20/51
			Thr	Pro	Pro	Ser	Ala	DP46
			Glu	lle
			1	2	3	4	5
			6	7	8	9	10
			11	12
AM3	5		Gly	Phe	Pro	Met	Pro	V„3-	1/31	2/51
			1	2	3	4	5	DP46
AM6	10		Gly	Phe	Pro	His	Ser	Vh3-	4/31	6/51
			Ser	Ser	Val	Ser		DP46
			Arg 1	2	3	4	5
			6	7	8	9	10
AM7	II		Are	Phc	Pro	Met		V„3-	3/31	4/51
			Arg	His	Glu	Lys	Thr	DP46
			Asn	Tyr
			1	2	3	4	5
			6 11	7	8	9	10
AMS	8		Arg	Phe	Pro	Pro	Thr	Vh3-	6/31	8/5.1
			Ala	Thr	lie			DP46
			1	2	3	4	5
			6	7	8
AM9	7		Thr	Gin	Arg	Arg		V„3-	0/31	2/51
			Asp	Leu	Gly			DP87
			1	2	3	4	5
			6	7
AM10	II		Lys	Phc	Pro	Gly		Vh3-	0/31	1/31
			Gly	Thr	Val	Arg		DP46
			Gly	Leu	Lys
			1	2	3	4	5
			6 11	7	8	9	10
AM1I	12		Gly	Phe	Pro	Val	lie	Vh3-	0/31	1/31
			Val	Glu	Gin	Arg		DP49
			Gin	Ser	Thr
			1	2	3	4	5
			6	7	8	9	10
			11	12
AMI2	10		Are	Phe	Pro	Gin		VK3-	0/31	1/31
			Are	Val	Asn	Asn		DP46
			Are	Val
			1	2	3	4	5
			6	7	8	9	10

·· ···· • · · • · · · ·

• · [328.] Aminokyselinová sekvence Arg/_GiyPhe Pro je přítomna u sedmi z desíti izolovaných klonů uvedených v Tabulce 2 a představuje tak motiv. Kromě toho je třeba upozornit, že identifikovaný motiv představuje v každém případě tři N-koncové aminokyseliny oblasti CDR3. Podle toho může tento motiv být účinnou kotvou nebo vazebným místem sám o sobě nebo v kombinaci s jinými aminokyselinovými zbytky přesahujícími buďto za jeden, nebo za oba konce oblasti CDR3 jako součást rozsáhlejšího peptidů nebo polypeptidů tvořícím molekulu Fv.

[329.] Jiné oblasti CDR3 s vysokou vazebnou afinitou k buňkám AML mohou být konstruovány na základě vnitřní základní (core) sekvence Arg/_GlyPhePro. Mohou být konstruovány obměnou kteréhokoliv z výše uvedených 5-12 merů adicemi, delecemi, nebo mutacemi, jestliže je zachována základní vnitřní sekvence Arg/_GlyPhePro.

[330.] Oblasti CDR3 podle vynálezu mají aminokyselinovou sekvenci Rl-Arg/_Gi_yPhePro-R2, kde R1 zahrnuje 0-15 aminokyselin, výhodně 0-9, nejvýhodněji 0-1 aminokyselinu a R2 zahrnuje aminokyselinovou sekvenci z 115 aminokyselin, nej výhodněji 1-9 aminokyselin. R1 a R2. jsou aminokyselinové sekvence, které nemají nepříznivý účinek na specifickou vazbu sekvence Arg/_Gi_yPhePro k buňkám AML.

[331.] V lehkém řetězci výše uvedených klonů je oblast CDR3 identická a je znázorněna v SEQ ID NO:125.

[332.] 6.2 Výsledky YPR a YPNR protokolů.

····

• · · • · ··· • » • · ·· ··· [333.] 6.2.1 Výsledky panningu podle YPR a YPNR protokolů: Odhad počtu fágemidů použitých pro panning (vstup) a odhad počtu eluovaných vázaných fágemidů (výstup) jsou souhrnně uvedeny v následujících tabulkách (Tabulka 3, 4) .

Tabulka 3. Výsledky panningu podle YPR protokolu

Vstupní kmen	Eluce	Výstup	Amplifikovaný kmen
Nissim knihovna	Kyselina	107	Rl(a)
1011	Trypsin	4xl07	Rl(t)
Směs [Rl(a)-1012 + Rl(t)-	Kyselina	5xl05	R2
1012]
R2-1012	Kyselina	3xl08	R3

[334.] Tabulka 3 demonstruje, že výtěžek eluce trypsinem vede ke 4násobně vyššímu výstupu ve srovnání s elucí kyselinou v prvním cyklu.

[335.] Re-panning podle protokolu YPNR bez amplifikačního stupně minimalizoval možnost výhodného zmnožení fágemidové nebo bakteriální infekce. Výsledný výstup je uveden v Tabulce 4 ·· ·«·· • · · • · ··· * · · • · « ·· ·· · ·· *·· • · : : · • · · ·· ·· ·· ·*

Tabulka 4. Výsledky panningu podle YPNR protokolu

Vstupní kmen	Eluce	Výstup	Eluovaný kmen
Nissim knihovna 1011	Kyselina	3xl07	YPNR1
YPNRl-3xlO7	Kyselina	4xl05	YPNR2
YPNR2-4xlO5	Kyselina	103	YPNR3

[336.] Podle očekávání výsledky uvedené v Tabulce 4 vykazují snížení výtěžku fága po každém cyklu panningu. Tento protokol byl použit proto, aby se zabránilo systematické chybě vznikající díky amplifikaci nespecifických fágů.

[337.] 6.2.2 Výsledky sekvenování klonů podle YPR a YPNR protokolů: Několik klonů ze třetího panningu podle obou protokolů bylo vybráno pro sekvenování.

Aminokyselinové sekvence uvedené v Tabulce 5 jsou aminokyselinovými sekvencemi CDR3 oblasti těžkého řetězce (V_h-CDR3). V této tabulce jsou rovněž uvedeny základní linie (germline) frekvence, se kterou se sekvence vyskytovaly ve výstupu R3.

,··.:··· • ··· ··· ····

100

Tabulka 5: Klony z Y-řady selektované podle YPR biopanningového protokolu s výstupem R3.

Klon #

V„-CDR3 velikost

Sekvence Vh-CDR3

Základní linie

Frekvence

Yl	6		Met Val 1 5	Arg Ile 2 6	Ala 3	Pro 4	VM-DP32	14/30
Y16	6		Thr	Gly	Gin	Ser	Vh3-DP26	1/30
			Ile	Lys	Arg	Ser
			1	2	3	4
			5	6	7	8
YI7	6		Leu	Thr	His	Pro	Vh3-DP32	7/30
			Tyr	Phe
			1	2	3	4
			5	6
Y-27	6		Leu	Arg	Pro	Pro	Vh3-DPS2	3/30
			Olu	Ser
			1	2	3	4
			5	6
Y-44	11	Thr	Ser	Lys	Asn	Thr	Vh3-DP32	2/30
			Ser	Ser	Ser	Lys
			Arg	His
			1	2	3	4
			5	6	7	δ
			9	10	11
Y-45	12	Arg	Tyr	Tyr	Cys	Arg	Vh3-DP49	1/30
			Ser	Ser	Asp	Cys
			Thr	Val	Ser
			1	2	3	4
			5	6	7	8
			9	10	11	12
Y-52	10		Phe	Arg	Arg	Met	V„3-DP49	1/30
			Gin	Thr	Val	Pro
			Ala	Pro
			1	2	3	4
			5	6	7	8
			9	10

[338.] Většina klonů izolovaných podle YPNR protokolu byla shodně typu Yl.

[339.] Oblast CDR3 lehkého řetězce výše uvedených klonů je identická a je znázorněna v SEQ ID NO:125.

• · · · ·· ··· ··· ···

101 [340.] 7. Výsledky stanovení vazby [341.] 7.1 Vazba vybraných fágemidových klonů k buňkám AML (série klonů AM): Vazebná zkouška pro stanovení vazby fágemidu k buňkám, „White/Blue colony test popsaný v Příkladu 5, byla provedena s klony AM. S výjimkou klonu AM7 nebylo zjištěno žádné preferenční vázání k testovaným buňkám. Bylo pozorováno signifikantní, avšak neselektivní vázání klonu AM7 ke všem cílovým buňkám, buďto jako fágemidu, nebo jako purifikovaný scFv. Výsledky neprokazují žádné obohacení(enrichment) série klonů AM.

[342.] 7.2 Vazba série klonů Y [343.] 7.2.1 Vazba fágemidu - EIA s použitím fixovaných destiček: Po třech cyklech panningu s'použitím dvou odlišných protokolů byly fágové klony testovány pomocí EIA na vazbu k fixovaným destičkám. Byl připraven fágemidový kmen z každého selektovaného klonu a tyto klony byly testovány ve dvou souborech EIA. Každý vzorek byl testován duplicitně a byl vypočten průměr. Výsledky jsou souhrnně uvedeny na Obrázku 1 a naznačují, že šest z devíti klonů série Y vykazuje pozitivní EIA reakci. Nejvyšší stupeň vazby byl spojen s klony Yl, Y16, Y17 a Y-27. Fágový kmen M13 (standardní bakteriofág, wild-type) a E6 (selektovaný na leukemických buňkách CLL) byly použity jako negativní kontroly. Dominantní klon, fág Yl, vykazoval nejvyšší vazbu k fixovaným destičkám, a společně s Y17 vykazoval signifikantně vyšší vazbu, než fágové klony M13 nebo E6.

Příklad 8 [344.] 8. Podrobná charakterizace scFvs a vazba klonů

102 [345.] 8.1 Struktura a identifikace scFv: Přirozená struktura Y-I byla hodnocena anlýzou HPLC na sloupci Superdex 75 a hmotovou spektroskopií. Výsledky první z metod naznačují přítomnost monomerů, dimerů a tetramerů ve vzorku. Hmotová spektroskopie byla dostatečně citlivá k identifikaci očekávaných molekulové hmotnosti 26,5 kD a v případech, kdy byl odštěpen c-myc tag, byla získána molekulová hmotnost 24 kD.

[346.] Nicméně výsledky SDS-PAGE naznačují, že intaktní neštěpená molekula má zjevnou molekulovou hmotnost 30 kD, přestože očekávaná molekulová hmotnost je 26,5 kD, podle nukleotidové sekvence a podle výsledků hmotové spektroskopie, uvedených výše. Western analýza, používající c-myc-specifické protilátky, potvrdila výsledek stanovení molekulové hmotnosti pomocí SDS-PAGE na 30 kD a podpořila předpoklad, že c-myc tag je přítomna na konci intaktní molekuly. Diskrepance mezi výsledky obou metod je způsobena mírou přesnosti, stejně jako podmínkami provedení SDS-PAGE, které mohou měnit zjevnou molekulovou hmotnost testovaného proteinu.

[347.] Vazba destičkami selektovaných klonů k leukemickým buňkám: Jak bylo poznamenáno v úvodu, markéry buněčného povrchu destiček mohou být exprimovány na nezralých (premature) hematopoetických buňkách. Vazba destičkami selektovaných klonů byla testována FACS analýzou. FACS analýza byla prováděna po barvení celé krve, následovaném lyží RBC, nebo na mononukleárních buňkách purifikovaných Iso-prep(Ficoll). ScFvs byly připraveny z každého klonu, purifikovány na proteinu A, značeny FITC (jak je popsáno v Částech 4.1-4.4). Aby byla umožněna « · · · · ·

103 produkce intaktního scFv v nesupresorovém kmenu E.coli HB2151, byl amber kodón (TAG), nalezený ve V_H-CDR3 klonu Y27, mutován cílenou mutagenezí(DNA site-directed mutagenesis) tak, aby byla kódována kyselina glutamová (GAG). Cílovými buňkami pro takové pokusy byly buňky izolované z čerstvých vzorků krve od různých pacientů s leukémií. Vzorky byly získány ze tří Medical Centers v Izraeli.

[348.] Klony Yl a Y17 vykazovaly přednostní vazbu k testovaným leukemickým buňkám, zatímco všechny ostatní klony ze série Y poskytovaly vazbu pouze na úrovni pozadí. Tabulka 6 uvádí vazbu Y-I a Y-17 značených FITC k řadě leukemických buněk.

Tabulka 6 Vazebná specifita Y-I k leukemickým buňkám

Linie B buněk

ScFv	AML	CML	B- CLL	B- ALL	Mnohonásobný myelom	T- leukémie	Normální lymfocyty
N14/C181	0/68	0/6	0/6	0/6	0/5	0/3	0/18
Yl	54/68	2/6	1/6	3/6	4/5	2/3	0/15
Y17	3/3	N.D. *	1/1	2/2	N.D.*	N.D.*11/	11/11

* nestanovováno [349.] Výsledky, uváděné jako frakce v Tabulce 6, reprezentují podíl pacientů, jejichž buňky byly FACS analýzou identifikovány jako pozitivně reagující s každou testovanou protilátkou. V čitateli zlomku je uveden počet pozitivních pacientů, ve jmenovateli je uveden celkový počet testovaných pacientů pro danou kombinaci scFv/buněčný typ. Y-17 se silně vázal ke všem testovaným buňkám; tato vazba je proto považována za neselektivní. Nicméně, bylo zjištěno, že vazba Yl je vysoce selektivní u řady vzorků • · · · • ·

• · · · · • · « * • 9 9 +9 99 9 *

104 leukemických buněk, zejména tam, kde se jedná o akutní fázi leukémie. Vazba ΥΙ-scFv byla dále analyzována tak, jak je popsáno níže.

[350.] Reprezentativní výsledky vazby Yl ke třem vzorkům AML jsou uvedeny na Obrázku 3. V každém případě velký podíl buněčné populace fluoreskuje o signifikantně vyšší intenzitě, než je intenzita fluorescenčního pozadí získaného barvením s negativním kontrolním scFv. Tyto výsledky naznačují, pro každého pacienta, že se Yl váže k odlišným frakcím z celkové buněčné populace. Y-l pík po pravé straně v každém grafu je považován za minimální počet buněk v populaci, které se vážou k Yl, a pod tímto pikem je uveden podíl pravděpodobně reprezentující minimální podíl buněk vázajících se k Yl v každém vzorku z celkového počtu buněk.

[351.] Vazba Y-I k normálním krevním buňkám: Vazba Yl k normálním krevním buňkám, purifikovaným na Ficollu, byla analyzována podle odlišných typů krevních buněk. Ačkoliv nebyla zjištěna vazba k normálním lymfocytům, vázal se Yl k Ficollem purifikovaným monocytům u 9 z 28 subjektů (9/28), k destičkám u 5 z 8 subjektů (5/8) a k červeným krvinkám (red blood cell, RBC) u 1 ze 4 subjektů (1/4). Nicméně protilátky specifické proti CD14 se vázaly k buňkám ve všech preparátech monocytů a v mnoha preparátech obsahujících neutrofily. Souhrn této analýzy uvádí Tabulka 7.

• · · · «>*

105 !

.2.

·· ·· «9

Tabulka 7 FACS analýza vazby scFv k Ficollem purifikovaným normálním krevním buňkám

Protilátka	Lymfocyty	Monocyty	Neutrofily	Destičky	RBCs
N14	0/18	0/4	0/4	0/3	0/4
Yl	0/28	9/28	0/4	5/8	1/4
CD14	0/15	14/14	8/14	0/5	0/4

[352.] Tyto vazebné výsledky uvádějí podíl z normálních krevních vzorků, u nichž bylo FACS analýzou potvrzeno, že pozitivně reagují s každou testovanou protilátkou. Je třeba upozornit, že FITC-Y1 scFv vykazuje relativně nízkou vazebnou afinitu k destičkám, ačkoliv byl selektován na fixovaných destičkách.

[353.] Obrázek 4 zobrazuje vazbu Yl k Ficollem purifikovaným destičkám (4a) a k buňkám odvozeným od monocytů (4b). Posun v populaci buněk monocytů je vyšší, než posun pozorovaný u destiček, s vypočteným průměrem fluorescence 30krát a 5krát vyšším, v uvedeném pořadí, než měla negativní kontrola. Toto zjištění je nejpravděpodobněji dáno charakteristikou destiček, které násobně adherují k Ficollem purifikovaným monocytům. Následné pokusy prokázaly, že jestliže byly zkoumány celé krevní vzorky, nebyla zjištěna vazba Yl k žádným z testovaných monocytů, granulocytů, destiček nebo RBC. Podobně, nebyla zjištěna vazba k destičkám, jestliže byly získány z plazmy bohaté na destičky (platelet rich plasma, PRP). Za shodných vazebných podmínek (ve vzorku celé krve, po lyži RBC pomocí FACS lyžujícího roztoku [Becton Dickenson], se Yl vázal ke leukemickým buňkám způsobem podobným tomu, jaký byl zjištěn po purifikaci Ficollem. Lze tedy shrnout, že za přirozených podmínek je Y-l epitop na

106 destičkách nebo monocytech skryt. Během purifikace Ficollem je epitop exponován, čímž se stává přístupným pro rozpoznání Yl, zatímco u leukemických buněk je epitop exponován jak za purifikovaných, tak za nepurifikovaných podmínek.

[354.] Kromě testování vazby k normálním hematopoetickým buněčným progenitorům lymfatických a myeloidních linií, byla testována vazba Yl k hematopoetickým kmenovým .buňkám (buňkám CD34 + ) z pupečníkové krve. Obrázek 5 uvádí vazebné výsledky FITC značených scFv klonů ke kmenovým buňkám CD34+ z pupečníkové krve; Obrázek 5a znázorňuje výsledky vazby CD34+ odvozených buněk k FITC značené scFv negativní kontrole, a Obrázek 5b znázorňuje tutéž analýzu vazby CD34+ odvozených buněk k FITC značenému scFv klonu Yl. Obrázek 5c uvádí FSC a SSC bodový graf (dot plot) analýzy téhož FITC značeného scFv klonu Y-I, jako je 5b. Výsledky této analýzy prokázaly přítomnost dvou subpopulací CD34+ kmenových buněk získaných z pupečníkové krve s rozdíly v dopředném rozptylu (forward scatter, FSC), jakožto zobrazení buněčné velikosti. Yl se váže k menším buňkám ze dvou populací. Zakroužkované oblasti na Obrázcích 5b a 5c vymezují subpopulace buněk CD34+, které se vážou ke klonu Yl scFv. Další analýza prokázala, že buňky o menší velikosti jsou mrtvé buňky přítomné v buněčné populaci, a vazba Yl může snad naznačovat přítomnost intracelulárního ligandu rozpoznávaného Yl.

[355.] Rovněž byl proveden pokus na buňkách periferní krve od zdravých dárců předem ošetřených GM-CSF (ošetření GM-CSF mobilizuje kmenové buňky k jejich uvolňování do » · ·· ·< C · • · »·

107 krevního řečiště). Byly získány výsledky podobné těm, které jsou uvedeny na Obrázku 5.

[356.] 8.4 Porovnáni vazebné specifičnosti Yl scFv k různým buněčným markérům na buňkách AML: Bylo provedeno porovnání barvení Yl na Ficollem purifikovaných periferních buňkách a buňkách kostní dřeně od pacientů s AML s barvením těčhto buněk pomocí řady jiných protilátek. Výsledky takové FACS analýzy, pro vzorky získané od 14 pacientů, jsou sumarizovány v Tabulce 8. Je třeba upozornit na signifikantní variabilitu ve frekvenci obarvených buněk ve vzorcích z různých jedinců a pro všechny testované markéry, včetně Yl. Nepřítomnost korelace mezi vazbou různých markérů a vazbou Yl svědčí o tom, že Yl se neváže k jakémukoliv z ligandů, které jsou vázány jinými testovanými markéry, a že tedy Y-I ligand nevytváří některý z testovaných buněčných povrchových markérů.

Tabulka 8 Porovnání vazby Yl scFv a vazby protilátek k různým buněčným markérům

AML pacient	Yl	CD13	CD14	CD33	CD34	bm/pb**
1	0	ND	2,5	47	4	PB
2	34	88	0	80	83	PB
3	66	100	20	87	9	BM
4	86	83	2	73	3	BM
5	100	100	0	100 .	0	BM
6	0	72	0	49	1	BM
7	59	20	93	100	0	BM
8	40	86	40	48	6,5	BM
9	70	75	67	75	1	PB
10	25	24	55	82	5	PB
11	26	76	17	83	52	PB

· ·« ···· * < · · « · · »· « » ♦ · • · · · · · «···· ·♦♦··* · ·

108

12	60	40	60	94	ND	PB
13	17	ND	13	75	15	PB
14	0	24	27	70	0	BM

BM/PB - kostní dřen/periferní krev [357.] Výsledky jsou vyjádřeny jako procento buněk ve Ficollem purifikovaných vzorcích od daných pacientů, které byly FACS analýzou identifikovány jako pozitivně reagující s každou jednotlivou protilátkou.

[358.] Podle koncentrace Yl (~ 1 μg/5xl0⁵) , požadované pro detekci vazby, naznačují výsledky, že Yl scFv má relativně vysokou vazebnou afinitu ke specifickému ligandu na buňkách AML.

[359.] Kromě výsledků uvedených v Tabulce.8, které uvádějí vazbu Yl k buňkám AML, bylo prokázáno (Tabulka 6), že Yl se rovněž může vázat k většině jiných testovaných leukemických buněk, včetně B-ALL buněk, ačkoliv velikost vzorku pro tyto jiné leukemické vzorky byla limitována. Obrázek 6 uvádí FACS analýzu vazby Yl scFv k pre-B-ALL buňkám získaným od dvou pacientů. Byla provedena metoda dvojího barvení s použitím buďto komerčně dostupného PEznačeného CD19 (markér pro normální periferní B-buňky; Obrázky 6a, 6c), nebo s PE-značeným CD34 (markér pro kmenové buňky; Obr. 6d), společně s FITC-značeným negativním kontrolním scFv nebo FITC-značeného Yl scFv. Obrázek 6b je dvojitá negativní kontrola. Je uvedena fluorescenční intenzita (osa x) buněk vázaných FITCznačeným vzorkem (scFv klonem Yl), v poměru ke vzorku negativní kontroly barvení (6e a 6f). Výsledky na Obrázku 6 prokazují, že většina leukemických, pre-B-ALL buněk v ·· ···· · · ·· ···« • · · · · *· »· · « · · ·· · « · « 9 ** ♦ ♦ * * C « · β • Λ 9 9 Μ · 9 « · *· 999 999 999 99 99

109 každém ze dvou testovaných vzorků je pozitivní na Yl buněčné barvení díky vazbě Yl.

[360.] 8.5 Vazba Yl-scFv k buněčným liniím: Několik buněčných linií, odvozených od maligních hematopoetických linií, bylo podrobeno zjištění, zde mají schopnost být rozpoznávány pomocí Yl. FACS analýza prokazuje, že Yl se váže k mnoha z testovaných buněk (Tabulka 9). Je třeba uvést, že byla testována pouze jedna lidská B-buněčná linie a jedna myší myeloidní linie. Významné je, že vazba byla omezena na exponencielně rostoucí.buňky. Buňky ve stacionární fází se obecně nevážou k Yl, což naznačuje, že exprese ligandu k Yl je regulována během životního cyklu buněk. Kromě toho, síla vazby reagujících buněk se liší. Toto zjištění dokládá, že u odlišných buněk existují rozdíly v hladinách exprese nebo afinity ligandů .

Tabulka 9 Vazba Yl k hematopoetickým buněčným liniím

Typ	Vysoce reaktivní	Středně reaktivní	Nízce reaktivní
Lidská myeloidní	KG-1; THP-1; U937;Tf-l; MEG	HL-60; HEL; K- 562; MC1010	NB-4
Lidská B-buňka			Namalwa; Daudi; UMUČ3; RÁJI
Lidská T-buňka	Jurkat; Hs-602	CCRF-CEM; Molt-4;Hut-78
Myší myeloidní			Ml; P388D1;, PU5-1.8; WEHI- 274.1

[361.] 8.6 Vazba purifikovaného Yl v přítomnosti DTT:

Na základě vyselektování klonu Yl byl dále vyvinut způsob ·· ···« · * ·· ··»· • * · «·Α· 9 9 9

9 9 99 9 9 9 9 » ιιη*· * * ^β ·-*·

J_ ]_ Ο ** ··· «·· 9 99 9» 99 produkce scFv. Výsledky FTLC analýzy šarží· Yl prokazují, že protein může multimerizovat s převahou vytváření monomerů a tetramerů, přičemž poměr mezi těmito dvěma formami se liší vzorek od vzorku. Aby byl získán homogenní materiál, bylo během afinitní purifikace na sloupci Protein A-Sepharose přidáno 5 mM DTT, který byl následně odstraněn výměnou pufru PBS. Ve skutečnosti po působení DTT většina (> 90 %) materiálu bylo nalezeno v monomerní frakci. Žádný signifikantní rozdíl nebyl nalezen mezi vazbou monomerní formy Yl (purifikovaný v přítomnosti DTT a analyzovaném na HPLC) a vazbou směsi forem Yl.

[362.] 8.7. Yl je specifickým klonem k leukemickým buňkám: Yl kazeta patří k základní linii (germline) V_HDP32. Bylo izolováno několik dalších klonů ze stejné základní linie, které jsou detailně popsány v Příkladu 6. Tyto klony zahrnují Y17, Y-27 a Y-44. Primární sekvence (tj. kazeta základní linie) všech těchto klonů se liší pouze v jejich oblastech CDR3. Nicméně, pouze Yl vykazuje selektivitu k leukemickým buňkám. Sekvence CDR3 těchto klonů jsou souhrnně uvedeny v Tabulce 10 a vazebné profily klonů jsou souhrnně uvedeny v Tabulce 11.

Tabulka 10: Sekvence CDR3 klonů izolovaných z V_H3-DP-

Klon #			Sekvence Vh-CDR3		Základní
						linie
Yl	Met	Arg	Ali	Pro	Val	Ile	Vh3-DP32
		1 6	2	3	4	5
Y17	Leu	Thr	His	Pro	Tyr	Phe	Vh3-DP32
		1	2	3	4	5
		6
Y-27	Leu	Arg	Pro	Pro	Glu	Ser	Vh3-DP32
		1	2	3	4	5
		6
Y-44	Thr	Ser	Lys	Asn	Thr	Ser	Vh3-DP32
		Ser	Ser	Lys	Arg	His
		1	2	3	4	5
		6	7	8	9	10
		11

111 k · ···♦ • · « · • ·

Tabulka 11: Vazebné profily klonů izolovaných z V_H3DP-32

Klon #	Vazebná specifičnost
Yl	Váže se k mnoha leukemickým buňkám
Y17	Váže se k všem testovaným hematopoetickým buňkám, včetně normálních lymfocytů
Y-27	Neváže se k žádným testovaným hematopoetickým buňkám
Y-44	Neváže se k žádným testovaným hematopoetickým buňkám

[363.] Tabulky 10 a 11 uvádějí, že ačkoliv primární sekvence jsou v rámci čtyř klonů identické s výjimkou oblasti V_h-CDR3, vazebné profily se signifikantně liší, klon od klonu. Toto zjištění posiluje představu, že sekvence V_HCDR3 hraje významnou úlohu ve specifičnosti vazebného místa k antigenu. Je třeba uvést, že ani délka sekvence CDR3, ani specifičnost základní kazety, ve které je CDR3 umístěna, nejsou primárně určující pro vazebnou specifičnost. Každý z Y17 a Y-27 obsahuje 6-mer CDR3, tak jako Yl, a těžký řetězec všech tří klonů je odvozen z identické základní linie. V případě Y17 a Y-27 nebyla selektivní vazba k hematopoetickým buňkám prokázána.

Příklad 9 [364.] 9.1 Konstrukce triabodies: Vektor pHEN-Yl, kódující původní Yl, byl amplifikován s použitím PCR pro obě V_L a V_H oblasti samostatně. Sense oligonukleotid 5'AACTCGAGTGAGCTGACACAGGACCCT a anti-sense oligonukleotid 5'TTTGTCGACTCATTTCTTTTTTGCGGCCGCACC byly použity pro PCR reakci řetězce V_L. Produkt cDNA o očekávané velkosti ~ 350

112

··· · ·< n ·· bp byl purifikován, sekvenován a štěpen s restrikčními enzymy Xhol a Notl.

[365.] Stejný postup byl proveden pro amplifikaci oblasti V_H (s použitím sense oligonukleotidu 5'ATGAAATACCTATTGCCTACGG a anti-sense oligonukleotidu 5'AACTCGAGACGGTGACCAGGGTACC). V_H PCR produkt byl štěpen s restrikčními enzymy Ncol a Xhol. Byla provedena procedura trojnásobné ligace do vektoru pHEN, předem štěpeného s Ncol-Notl. Konečný vektor byl označen pTria-Yl.

[366.] Po transformaci E.coli bylo izolováno několik klonů pro další analýzu, která zahrnovala sekvenování DNA, expresi proteinu a extrakci z periplasmatického prostoru baktérie. SDS-PAGE za redukčních podmínek a analýza Western blot byly provedeny pro potvrzení velikosti triabodies Yl.

[367.] 9.2 Konstrukce diabodies [368.] Vektor pTria-Yl z výše uvedeného provedení byl linearizován s restrikčním enzymem Xhol a syntetické komplementární dvouřetězcové oligonukleotidy (5'TCGAGAGGTGGAGGCGGT a 5'-TCGAACCGCCTCCACCTC) byly preanelovány a ligovány do místa Xhol mezi Yl-těžký a Yl-lehký řetězec. Tento nový vektor byl označen pDia-Yl. Tak, jak bylo popsáno pro triabodies, bylo provedeno sekvenování DNA a exprese proteinu.

[369.] 9.3 Exprese a purifikace diabodies a triabodies [370.] Exprese v E.coli byla v podstatě taková, jak je popsáno výše pro scFv-ΥΙ. Nicméně, purifikace diabodies Yl a triabodies Yl z periplasmy transformovaných buněk E.coli »* ·*·<

·· ·♦·« ♦ · · ·· ♦· · · · « · ··· 9 9 · « ·

9 » ♦ 9 9 9 9 9 · • » 9 · «I · · 9 9 ·· ·*· ·♦· ··« 99 99

113 byla odlišná. Forma monomeru scFv Yl může být purifikována na afinitním sloupci naplněném Protein A- Sepharose kuličkami. Multimerní formy Yl jsou však tímto postupem purifikovány neúčinně. Proto byly periplasmatické proteiny extrahovány z baktérií, precipitovány přes noc 60% síranem amonným, resuspendovány v H₂O a naneseny na Sephacryl-200 (Pharmacia) sloupec gelové chromatografie (size exclusion), předem ekvilibrovaný s 0,lxPBS. Frakce byly shromážděny a analyzovány pomocí HPLC a jednotlivé frakce obsahující buďto dimerní nebo trimerní formy byly soustředěny pro značení FITC a analýzu FACS.

[371.] 9.4 Vazba Yl diabodies a triabodies k buňkám.

[372.] Byla provedena analýza FACS na buňkách Jurkat s použitím troj stupňového barvícího postupu („three step staining proceduře). Nejprve jsou barveny surové extrakty nebo purifikované neznačené scFv, pak myší anti-myc protilátky a nakonec FITC- nebo PE konjugované anti-myší protilátky. FACS analýza vyžaduje 5-8xl0⁵ buněk, které byly purifikovány Ficollem a resuspendovány v PBS+1%BSA. Vázání bylo prováděno po dobu 1 hodiny při 4 °C. Po každém kroku byly buňky promyty a resuspendovány v PBS+1%BSA. Po konečném barvícím stupni byly buňky fixovány pomocí resuspendování v PBS, 1% BSA, 2% formaldehydu a po té odečteny pomocí FACS (Becton-Dickinson).

[373.] Vazba ΥΙ-scFv byla porovnána pro diabodies a triabodies. V této analýze (Obrázek 7) byl vazebný profil všech tří forem velmi podobný, což naznačuje, že výše uvedené modifikace v molekule nepozměňují, nezakrývají nebo neruší zřejmou vazebnou afinitu Yl k tomuto ligandu.

114 ·♦ ·♦·· » · · • · · ·· • · · ♦ » · · 9 ·*·<

[374.] 9.5 Produkce Yl-cys-KAK (cysteinového dimeru) [375.] Jeden litr bakteriální kultury λρΤ,-yl-cys-KAK byl indukován při 42 °C po 2-3 hodiny. Kultura byla centrifugována při 5000 RPM po dobu 30 minut. Pelet byl respuspendován ve 180 ml TE (50mM Tris-HCl pH 7,4, 20mM EDTA). Bylo přidáno 8 ml lysozymu (ze zásobního roztoku 5 mg/ml) a inkubováno 1 hodinu. Dále bylo přidáno 20 ml 5M NaCl a 25 ml 25% Tritonu a inkubováno po další hodinu. Směs byla centrifugována při 13 000 RMP po 60 minut při 4 °C. Supernatant byl odstraněn. Pelet byl resuspendován v TE pomocí tkáňového homogenizátoru. Tento postup byl opakován 3-4krát až do světle šedého zabarvení inkluzních tělísek (peletu). Inkluzní tělíska byla sulubilizována v 6M guanidin-HCl, 0,lM Tris pH 7,4, 2mM EDTA (1,5 gramů inkluzních tělísek v 10 ml solubilizačního pufru poskytlo ~ 10 mg/ml rozpustného proteinu). Takový vzorek byl nejprve inkubován po alespoň 4 hodiny. Koncentrace proteinu byla změřena a upravena na koncentraci' 10 mg/ml. Byl přidán DTT na konečnou koncentraci 65 mM a při teplotě místnosti probíhala inkubace přes noc. Opětovné svinutí (refolding) bylo iniciován zředěním (kapku po kapce) 10 ml proteinu na roztok obsahující 0,5 M argininu, 0,1 M Tris pH 8, 2 mM EDTA, 0,9 mM GSSG. Roztok pro refolding byl inkubován při ~ 10 °C po 48 hodin. Roztok pro refolding s obsahem proteinu byl dialyzován proti pufru obsahujícím 25 mM fosfátový pufr pH 6, 100 mM močoviny, a zakoncentrován na 500 ml. Koncentrovaný/dialyzovaný roztok byl navázán na sloupec SPSepharose a protein byl eluován gradientem NaCl (až k 1M).

[376.] 9.6 Studium afinity S-S Yl-dimeru ve srovnání s CONYl a ΥΙ-IgG s použitím radioreceptorové vazebné zkoušky (Radioreceptor Binding Assay, RRA) na buňkách KG-1.

*· ··♦<

115 ·· ···* ·*· ··«· » · · 9 9 · ·# · « 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 · · · · · ·» 999 999 999 99 99 [377.] Systém zkoušky zahrnoval použití radioaktivních ligandu, které byly připraveny jodizací s ¹²⁵I s použitím chloraminu T na konstrukt Yl-IgG nebo Bolton-Hunter reagens na CONY1 (Yl scFv) konstrukt. Testovací zkumavky obsahovaly 5xl0⁶ buněk KG-1 na 2 ml a značený izotopový indikátor s různým množstvím neznačeného kompetitoru v PBS + 0,1 % BSA, pH 7,4. Po jedné hodině inkubace za třepání při 4 °C byly buňky důkladně promyty ledovým pufrem a použity pro vyhodnocení radioaktivity.

[378.] Ve zkoušce RRA, používající značený Yl-IgG, byly použity 2 ng/zkumavku ¹²⁵I-Yl-IgG a kompetice byla prováděna s každou ze tří molekul. Získané výsledky jsou uvedeny na Obrázku 8. Výsledky zobrazené na tomto obrázku ukazují, že afinita S-S dimeru Yl byla 30krát vyšší, než afinita CONY1. Přibližný odhad afinity Y—IgG v tomto pokuse je 2xl0^-8 M. Odpovídající afinita dimeru je proto 4χ10^_θ M.

[379.] Ve druhé zkoušce RRA, používající značený CONY1, bylo použito 100 ng/zkumavku ¹²⁵I-Yl-IgG a kompetice byla prováděna s každou ze tří molekul. Získané výsledky jsou uvedeny na Obrázku 9. Výsledky zobrazené na tomto obrázku ukazují, že afinita S-S dimeru Yl byla 20krát vyšší, než afinita CONY1. Přibližný odhad afinity CONY1 v tomto pokuse je 10⁶ M. Odpovídající afinita dimeru je proto 5xl0^-8 M.

[380.] 9.7 ELISA ke GC (glycocalicinu) [381.] 100 μΐ purifikovaného glycocalicinu bylo inkubováno přes noc při 4 °C v plochých maxisorp plotnách o 96 jamkách. Plotna byla promyta PBTS (PBS + 0,05%Tween) 3krát, pak 200 ml PBTS-milk (PBTS + 2% odtučněné mléko) po ·· ···· • 4 ···«

9 * · · · · 4 · ·

9 · · · 9 9 9 9

999 999 999 99 99

116 dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Destička byla promyta PBTS a byl přidán monomer nebo dimer (100 μΐ) v PBTS-milk v různých koncentracích po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Pak byla plotna promyta a byla přidána anti-V_L polyklonální protilátka (získaná z králíků imunizovaných V_L odvozeným z Yl) (ředěno 1:100 v PBTS-milk) po dobu jedné hodiny. Plotna byla promyta a anti-králičí HPR byl přidán po další jednu hodinu. Plotna byla promyta 5krát a 100 μΐ substrátu TMB bylo přidáno přibližně na dobu 15 minut, pak bylo přidáno 100 μΐ 0,5 H^.SO4 pro zastavení reakce. Optická hustota byla měřena při 450 nm na ELISA readeru.

[385.] 9.8 Příprava tetramerů z Yl [386.] Byl navržen konstrukt, ve kterém následující sekvence LNDIFEAQKIEWHE byla přidána k C-konci Yl pomocí PCR a klonování do expresní kazety indukovatelné IPG$f. Klon byl pojmenován Yl-biotag. Tato sekvence je substrátem pro enzym BirA, enzym, který v přítomnosti volného biotinu je schopen kovalentně připojit biotin ke zbytku lysinu (K)(Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 1996 Oct 4; 274 (5284):94-6, Altman JD et al). Konstrukt byl produkován jako inkluzní tělíska v bakteriálních buňkách BL21. Refolding byl proveden tak, jak bylo popsáno výše. Inkluzní tělíska byla solubilizována guanidin-DTT. Refolding byl proveden ředěním v pufru obsahujícím arginin-Tris-EDTA. Byla provedena dialýza a zakoncentrování s následnou HiTrapQ iontovýměnnou purifikaci.

[387.] Purifikovaný Yl-biotag scFv byl inkubován s enzymem BirA (poskytnutým Avidity) a biotinem podle doporučení výrobce. Biotinylovaný Yl-biotag byl analyzován ·♦ ··♦« • · · ·· ·· * · » « · · · · · « · · >

• · ♦ · « · · · · · « · · · « « · · · ·· #·· ··« ··· ··

117 testem HABA (který stanovuje množství biotinu na molekulu) a bylo prokázáno, že obsahoval přibližně >0,8 zbytků biotinu/molekula.

[388.] Biotinylovaný Yl-biotag byl inkubován se Streptavidin-PE (Phycoerytrin) za vzniku komplexů a byl použit v FACfí pokusech s použitím buněk KG-1 (pozitivních pro Yl). Streptavidin může vázat až 4 biotinylované Ylbiotag molekuly. Citlivost vazby byla zvýšena alespoň lOOkrát díky zvýšení avidity.

[389.] Sekvence Yl-biotag je následující:

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ

APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL

YLQMNSLRAE DTAVYYCARM RAPVIWGQGT LVTVSRGGGG 121 SGGGGSGGGG SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY

161 YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA

201 SLTITGAQAE DEADYYCNSR DSSGNNWFG GGTKLTVLGG

241 GGLNDIFEAQ KIEWHE

Příklad 10:

[390.] Konstrukce Yl-IgGl o úplné délce [391.] Úplná molekula IgG má několik předností před formami Fv, včetně delšího biologického poločasu in vivo a schopnosti indukovat in vivo buněčnou odpověď, jako je odpověď zprostředkovaná.ADCC nebo CDC (complement dependent cytotoxicity; Tomlinson, Current Opinions of Immunology, 5, 83-89 (1993)). S použitím přístupu molekulárního klonování, který je popsán níže, byly oblasti Yl Fv převedeny do

118

·· • «	• •	···· • • ··	• •	• « · •	♦ •	·· ♦ «	·♦·· • •
•	•	•	•	•	•	•	• ·
• ·		·· ·	···	• ··		• ·	« ·

molekul IgGI o plné délce. Konstrukce Yl-IgGl byla uskutečňována vzájemným pospojováním fragmentů cDNA v následujícím pořadí.

[392.] 10.1 Vedoucí (leader) sekvence kompatibilní se savčím expresním systémem: Byl navržen Výměnný systém, který by umožňoval vhodnou inzerci prvků, požadovaných pro úplnou molekulu IgG. Byly syntetizovány následující komplementární dvouřetězcové oligonukleotidy kódující domnělou vedoucí sekvenci, které byly anelovány a ligovány do místa Xhol savčího expresního vektoru (pod promotor SRa5).

5'-TCGACCTCATCACCATGGCCTGGGCTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCAG GACACAGGGTCCTGGGCCGAT a

5'-GATCGATTGCACCAGCTGGATATCGGCCCAGGACCCTGTGTCCTGAG

TGAGGAGGGTGAGGAGCAGCAGCCCAGGCCATGGTGATGAGG. Proti směru od iniciačního kodonu ATG byly včleněny dva elementy Kozákové. Kromě toho bylo zavedeno vnitřní místo EcoRV mezi domnělé místo štěpení vedoucí sekvence a místo Xhol, které umožňuje subklonování variabilních oblastí. Tento modifikovaný vektor byl označen pBJ-3.

[393.] 10.2 Sekvence kódující V_L odvozená ze sekvence cDNA pro Yl scFv byla inzerována mezi vedoucí sekvenci a sekvenci kódující konstantní oblast lehkého řetězce.

Podobně, sekvence kódující V_H odvozená ze sekvence cDNA pro Yl scFv byla inzerována mezi vedoucí sekvenci a sekvenci kódující konstantní oblast těžkého řetězce. Následovala PCR amplifikace vektoru pHEN-Yl, kódujícího původní Yl, tak, aby byly získány samostatně oblasti V_L a V_H.

119 ·· ···· • · · « · ··· • · · · [394.] Oligonukleotidy

5'-TTTGATATCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA (sense) a

5'-GCTGACCTAGGACGGTCAGCTTGGT (antisense) byly použity pro PCR reakce V_L. Produkt cDNA o očekávané velikosti ~ 350bp byl purifikován, sekvenován a štěpen s restrikčními enzymy EcoRV a AvrlI. Stejný postup byl proveden pro amplifikaci a purifikaci cDNA pro V_H oblast s použitím sense a antisense oligonukleotidů

5'-GGGATATCCAGCTG(C/G)(A/T)GGAGTCGGGC

5'-GGACTCGAGACGGTGACCAGGGTACCTTG, v uvedeném pořadí.

[395.] 10.4 Konstantní oblasti: Konstatní λ3 (CL-X3) oblast a konstatní oblasti těžkého řetězce CH1-CH3 odvozené z cDNA pro IgGl byly jednotlivě syntetizovány následujícím způsobem:

[396.] 10.4.1 Pro konstatní oblast CL-X3 byla provedena RT-PCR na mRNA extrahované ze společného vzorku (pool) normálních periferních B-buněk (buněk CD 19+) v kombinaci s oligonukleotidy sense

5'-CCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGC a antisense

5'-TTTGCGGCCGCTCATGAACATTCTGTAGGGGCCACTGT. Produkt PCR o očekávané velikosti (~ 400 bp) byl purifikován, sekvenován a štěpen s restrikčními enzymy AvrlI a Notl.

[397.] 10.4.2 Pro konstatní oblast IgGI (γ řetězce) byl vybrán pro PCR amplifikaci lidský klon B buněk (CVM - klon #40), imortalizovaný na BTG. Bylo prokázáno, že tento klon sekretuje IgGi proti lidskému CMV a rovněž bylo prokázáno, že indukuje ACDD odpověď v in vitro zkouškách. Pro cDNA oblasti CH1-CH3 byly syntetizovány oligonukleotidy

120 « · ·· · · • · · ♦ « · ··· • · · · ·· ··· *··

5'-CCGCTCGAGTGC(T/C)TCCACCAAGGGCCCATC(G/C)GTCTTC (sense) a 5'_TTTGCGGCCGCTCATTTACCC(A/G)GAGACAGGGAGAGGCT (antisense) a použity pro PCR amplifikaci. Tak, jak bylo popsáno pro cDNA sekvenci kódující CL, byl produkt PCR o očekávané velikosti (~ 1500 bp) purifikován, sekvenován a štěpen restrikčními enzymy AvrlI a Notl.

[398.] 10.5 Pro získání konečných expresních vektorů byl proveden trojnásobný ligační postup s použitím předem štěpeného EcoRV-Notl vektoru, a variabilní cDNA pro EcoRVAvrlI a AvrlI-Notl konstantní oblasti. Konečné vektory pro expresi těžkého a lehkého řetězce byly označeny Y-I-HC a Yl-LC v uvedeném pořadí.

[399.] 10.6 Další vektor, pBJ-Yl-LP, byl zkonstruován na základě Yl-LC pro umožnění dvojí selekce na základě genu pro rezistenci k puromycinu (PAC). V tomto vektoru byl gen pro neomycinovou rezistenci v plasmidu Yl-LC zaměněn fragmentem o ~ 1600 bp, kódujícím gen PAC (z vektoru pMCC.ZP).

[400.] Čtecí rámec otevřený (open reading frame, ORF) obou Y-l-IgG-HC a Yl-IgG-LC a jejich kódované aminokyselinové sekvence jsou uvedeny níže:

121 [401.] 10.7.1 Čtecí rámec otevřený pro Yl-IgG-HC (V_H C„1 C_h2 C_h3)

ATGGCCTGGGCTCTGCTGCTCCTOACCCTCCTCACTCAGGACACAGGGTCCTGGGCCGAT

MAWALLLLTLLTQDTGSWAD

ATCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC

IQLVESGGGVVRPGGSLRLS

121 TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCTCCA

CAASGFTFDDYGMS WVRQAP

181 GGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAATTGGAATGGTGGTAGCACAGGTTATGCA

GKGLEWVSGINWNGGSTGYA

241 GACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTG

DSVKGRFTISRDNAKN SLYL

301 CAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAATGAGGGCT

101 QMNSLRAEDTAVYYCARMRA

361 CCTGTGATTTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTTCCACCAAGGGCCCA

121 PVIWGQGTLVTVSSASTKGP

421 TCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGC

141 SVFPLAPSSK STSGGTAALG

481 TGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTG

161 CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL

541 ACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC

181 TSGVHTFP AVLQSSGLYSLS

601 AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT

201 SVVTVPSSSLGTQTYICNVN

661 CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT

221 HKPSNTKVDKRVEPKSCDKT

721 CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACTGTCAGTCTTCOTCTTC

241 HTCPPCPAPELLGGPSVFLF

781 CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTG

261 PPKPKDTLMISRTPEVTCV V

841 GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG

281 VDVSHEDPEVKFNWYVDGVE

901 GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC

301 VHNAKTKPREEQYNSTYRVV

961 AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC

321 SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV

1021 TCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC

341 SNKALPAPIEKTISKAKGQP

1081 OGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC

361 REPQVYTLPPSREEMTKNQV

1141 AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC

381 SLTCLVKGFYPSDIAVEWES

1201 AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGTCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC

401 NGQPENNYKTTSPVLDSDGS

1261 TTCTTCCTCTATAGCAAGCTČACCGTGCACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC

421 FFLYSKLTVDKSRWQQGNVF

1321 TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG

441 SCSVMHEALHNHYTQKSLSL

1381 TCTCTGGGTAAATGA

461 S L G K * • * ·«·« v « V» w » * w ··· ·· · · · · 4» • · ··· · · ··· • · · · · · · · · · • « · · · ···· *· ··· ··· ·«· ·· *·

122 [402.] 10.7.2 Čtecí rámec otevřený pro Yl-IgG-LC (V_L C_L)

ATGG CCTGGGCTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCAGGACACAGGGTCCTGGGCCGAT ¹ MAWALLLLTLLTQDTGSWAD

GCAGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACA

AELTQDPAVSVALGQTVRIT

1212 TGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAG

CQGDSLRSYYASWYQQKPGQ

181 GCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTC

161 APVLVIYGKNNRPSGXPDRP

241 TCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGAT

SGSSSGNTASlTITGAQAED

301 GAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGA

101 EADYYCNSRDSSGNHVVFGG

361 GGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCG

121 GTKLTVLGQPKAAPSVTLFP

421 CCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTC

141 PSSEELQANKATLVCLISDF

481 TACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTG

161 YPGAVTVAWKADSSPVKAGV

541 GAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGC

181 ETTTPSKQSNNKYAASSYLS

601 CTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAAAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGG

201 LTPEQWKSHKSYSCQVTHEG

661 AGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATGA

221 STVEKTVAPTECS * [403.] Vedoucí sekvence je podtržena. Oblast V_H a V_L jsou každá zakódována aminokyselinovými sekvencemi, které jsou uvedeny tučnými písmeny, následovanými buďto IgGl (pro těžký řetězec) nebo λ3 (pro lehký řetězec) sekvencemi konstantních oblastí.

[404.] 10.8 Exprese těžkého a lehkého řetězce Yl v buňkách CHO. Vektory Yl-HC a Yl-LC byly jednotlivě použity pro transfekci a selekci stabilních buněk exprimujících těžké a lehké řetězce. Po selekci na G418 a růstu buněk, byl sekretovaný protein v supernatantu analyzován na expresi proteinu IgGl s použitím sendvičové (capture) EIA zkoušky a Western blot analýzy, jak je popsáno níže.

123

·· • •	• •	···« • 999	• ·· •	9 • · •	99	9999 9 9
9 9	9 9
•	•		•	•	9	9	9 9
··		·· ·	···	999		99	99

[405.] Sendvičová EIA zkouška: Na jamky 96-jamkové destičky byl předem navázán myší protilidský IgGI Fc (Sigma). Supernatant z výše uvedeného postupu byl přidán do jamek a přítomnost těžkého řetězce IgGI byla detekována biotinylovanou kozí anti-γ řetězec specifickou protilátkou (Sigma), streptavidin-HRP a substrátem ELISA plate reader zaznanamenal vznik zabarvení při A4₀₅.

[406.] 10.8.2 Western blot analýza: Supernatant z výše uvedených buněk byl nanesen na 12,5% SDS-PAGE. Exprese každého z řetězců byla detekována s (a) kozím protilidským IgG-HPR (H+L; Sigma Cat #A8667) pro detekci těžkého řetězce a (b) biotinylovaným kozím protilidským λ3 řetězcem (Southern Biotechnology Association, Cat #2070-08) pro detekci lehkého řetězce.

[407.] Exprese a purifikace Yl-IgG [408.] Buněčná kultura a transfekce: Buňky CHO byly kultivovány v médiu F-12 s 10% fetálním telecím sérem a 40 gg/ml gentamicinu při 37 °C v 5% atmosféře CO₂. Jeden den před transfekcí bylo 0,8 x 10⁶ buněk vyseto na 90 mm plotny. Kultury byly kotransfekovány s 10 μρ DNA lehkých a těžkých řetězců transfekční reagenční technikou FUGene (Roche). Po dvou dnech růstu v neselektivním médiu byly buňky kultivovány po dobu 10-12 dnů v médiu F-12 obsahujícím 5 50 μ9/πι1 neomycinu a 3 μς/πιΐ puromycinu. Buňky byly trypsinizovány a klonovány limitujícím ředěním 0,5 buněk/jamka v jamkových destičkách Costar. Jednotlivé kolonie byly sklizeny, pěstovány v miskách o šesti jamkách a přeneseny do lahví.

• ··· • · ·« · · « α · · • · · · · ···· ·· ··· ··· ··· ·· ··

124 [409.] Stanovení sekrece těžkých a lehkých řetězců:

Bylo použito sandvičové zkoušky ELISA ke stanovení protilátky sekretované do supernatantu transfektovaných buněk CHO. Ke stanovení koncentrace protilátky byly použity následující reagencie: monoklonální protilidský IgGl (Fc)(Sigma) jako navázaná protilátka, kozí protilidský IgG (specifický pro γ-řetězec), biotinový konjugát jako detektor (Sigma) a čistý lidský IgGl, lambda (Sigma) jako standard. Ve zkouškce ELISA se rychlost produkce pohybovala v rozmezí 3-4 gg/ml.

[410.] 10.9.3 Produkce a purifikace Mab z buněk: Buňky byly pěstovány v rotujících láhvích ke konečné koncentraci l-2xl0⁸ buněk na láhev v médiu F-12 s 10% fetálním telecím sérem, doplněným neomycinem a puromycinem. Pro produkci byly buňky kultivovány ve stejném médiu, avšak s 2% fetálním telecím sérem po další po dva dny. Sekretovaná protilátka byla purifikována na sloupci G-Sepharose (Pharmacia). Vazba probíhala v 20 mM sodium fosfátovém pufru, pH 7,0; eluce byla prováděna v 0,lM glycinovém pufru, pH 2,5-3,0. Množství purifikované protilátky bylo stanoveno UV absorbancí, čistota byla analyzována pomocí SDS-PAGE. Za nedenaturujících podmínek měla úplná protilátka IgG očekávanou molekulární hmotnost 160 kD.

V denaturovaných gelech měly jak těžký, tak lehký řetězce očekávanou molekulovou hmotnost 55 a 28 kD, v uvedeném pořadí.

[411.] 10.9.4 Vazba úplné molekuly Yl-IgG: Byly prováděny vazebné pokusy za účelem stanovení úrovně vázání molekuly Y-IgG ve srovnání s molekulou scFv-ΥΙ. Bylo použito metody dvojího barvení, ve které 5 ng Yl-IgG reagovalo jak s buňkami RÁJI (negativní kontrola, Obrázek 7a) , tak s buňkami Jurkat (Yl pozitivní buňky, Obrázek 7b) .

• · · ·

• · · • · · · · • · · · • · · ·· ·· ·

125

K detekci byl použit kozí PE-značený anti-lidský IgG. Podobně 1 Hg scFV-Yl reagoval s buňkami Jurkat (Obrázek 7c) a králičí PE-značený anti-scFv byl použit pro dektci. Výsledky naznačují, že jak ΥΙ-IgG, tak scFv-ΥΙ vážou buňky Jurkat s tím, že pro detekci podobné úrovně je třeba přibližně 10³krát více molekul scFv-ΥΙ, než molekul Yl-IgG.

Stručný popis Tabulek [412.] Tabulka 1: Výsledky panningu získané podle protokolu AM. Jsou shrnuty odhad počtu fágemidů použitých pro panning (vstup) a odhad počtu eluovaných vázaných fágemidů (výstup) pro čtyři následující stupně AM biopanningového protokolu. Je uveden zdroj buněk a eluční médium pro každý výstupový výsledek·, stejně jako pojmenování použité k odlišení každého jednotlivého kmene.

[413.] Tabulka 2: Klony selektované podle AM biopanningovém protokolu. Jsou shrnuty počty aminokyselinových zbytků v oblasti CDR3 (velikost V_H-CDR3) a aminokyselinové sekvence pro odlišné izolované typy klonů. Kromě toho je uvedena frekvence každého z typů klonů ve dvou AM biopanningových výstupech, tj. výstupu T16M3 a T16M3.1.

[414.] Tabulka 3: Výsledky panningu podle protokolu YPR. Jsou shrnuty odhad počtu fágemidů použitých pro panning (vstup) a odhad počtu eluovaných vázaných fágemidů (výstup). Je uvedeno eluční médium pro každý výstup, stejně jako pojmenování použité pro odlišení každého jednotlivého kmene.

126 * · · · · · • · · · · • · · · ·· ··· ···

[415.] Tabulka 4; Výsledky panningu získané podle YPNR protikolu. Jsou shrnuty odhad počtu fágemidů použitých pro panning (vstup) a odhad počtu eluovaných vázaných fágemidů (výstup) pro tři následující stupně YPNR biopanningového protokolu. Je uvedeno eluční médium pro každý výstup, stejně jako pojmenování použité pro odlišení každého jednotlivého kmene.

[416.] Tabulka 5: Selektované Y-řady klonů podle YPR biopanningovém protokolu s výstupem R3. Byla identifikována řada odlišných klonů ve výstupním kmenu R3. Jsou uvedeny počet aminokyselinových zbytků a aminokyselinové sekvence oblastí V_h-CDR3 identifikovaných klonů, stejně jako označení základní linií.

[417.] Tabulka 6: Vazebná specifita Yl k leukemickým buňkám. Jsou uvedeny výsledky vazebných pokusů pro tři odlišné scFv klony, každý po reakci se směsí buněk, obsahující primárně každý ze sedmi odlišných typů leukemických buněk, jak byly stanoveny analýzou FACS. Výsledky reprezentují frakci pacientů, jejichž buňky byly s použitím analýzy FACS identifikovány jako pozitivně reagující s každou testovanou protilátkou. Čitatel uvádí počet pozitivních pacientů, jmenovatel uvádí celkový počet pacientů testovaných pro danou kombinaci scFv/typ leukemické buňky.

[418.] Tabulka 7: Analýza FACS vazby scFv k Ficollem purifikovaným normálním krevním buňkám. Každý ze tří klonů scFv byl analyzován na vazbu k pěti odlišným Ficollem purifikovaným typům krevních buněk. Vazebné výsledky reprezentují frakci vzorků normální krve, které byly

9 · · · ····

Φ· «·· ··· ··· ·· · ·

127 identifikovány pomocí FACS analýzy jako pozitivně reagující s každou testovanou protilátkou.

[419-1 Tabulka 8: Porovnání vazby Y- scFv a protilátek k různým buněčným markérům. Jsou uvedeny výsledky analýzy FACS barvení Yl a souboru jiných protilátek. Byly připraveny Ficollem purifikované periferní buňky a buňky kostní dřeně od ANE pacientů a byla studována vazebná specifita Yl scFv ve srovnání s vazebnou specifitou různých buněčných markérů buněk AML. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento buněk ve Ficollem purifikovaných vzorcích od daného pacienta, které bylo identifikováno FACS analýzou jako pozitivně reagující s každým Fv. Pro srovnání jsou uvedeny čtyři jiné protilátky: (1) CD13 - markér granulocytů a monocytů; (2) CD14 - markér monocytů a neutrofilů; (3) CD33 - markér normálních myeloidních buněk a leukemických myeloidních buněk; a (4) CD34 - markér kmenových buněk.

[420.1 Tabulka 9: Vazba Yl k liniím hematopoetických buněk. Analýza FACS bylo provedena z účelem stanovení vazby Yl scFv klonů ke třem odlišným kategoriím lidských leukemických buněčných linií a k jedné myší buněčné linii. Jsou uvedeny buněčné linie, ke kterým byl Yl pozitivně vázán (reaktivní) nebo nikoliv (nereaktivní).

[421.] Tabulka 10: Sekvence CDR3 izolovaných klonů V_H3DP32. Podle odlišných postupů biopanningu a selekce bylo izolováno několik klonů odvozených ze základní linie DP32. Během biopanningové selekce na destičkách byly identifikovány klony Yl, Y17, Y-27 a Y-44 (YPR a YPNR protokoly). Je uvedena sekvence oblasti V_H-CDR3 pro každý z těchto klonů.

• ·

128 [422.] Tabulka 11: Vazebný profil izolovaných klonů V_h3-DP32. Byla testována vazebná specifičnost klonů odvozených z DP32 k několika hematopoetickým buňkám pomoc FACS analýzy.

[423.] Vynález byl popsán s odkazem na specifické příklady provedení, materiály a údaje. Pro odborníka v oboru jsou dostupné obměny způsobu pro použití nebo přípravu různých aspektů podle vynálezu. Takovéto obměny jsou zamýšleny jako spadající do rozsahu a ducha předkládaného vynálezu tak, jak je definován v následujících patentových nárocích.

Claims (259)

1. Patentové nároky

   1. Peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt fragmentu mající zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se váže selektivně a/nebo specificky k cílové buňce ve prospěch jiných buněk, přičemž vazebná selektivita nebo specifičnost je primárně determinována první hypervariabilní oblastí a přičemž Fv je scFv nebo dsFv, případně mající jednu nebo více identifikátorových sekvencí (tags).
2. 2. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1, ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.
3. 3. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1, ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24, a jehož vazebná selektivita nebo specifičnost je druhotně ovlivňována druhou hypervariabilní oblastí, třetí hypervariabilní oblastí a/nebo jednou nebo více oblastmi lemujícími proti směru nebo po směru první, druhé a/nebo třetí hypervariabilní oblasti.
4. 4. Peptid nebo polypeptid podle nároku 2, kde peptidem nebo polypeptidem je scFV mající SEQ ID NO: 25, ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3, která je shodná se SEQ ID NO: 8.
5. 5. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1, kde molekula scFv obsahuje přímý nebo rozvětveny řetězcový spacer z 20 nebo méně aminokyseliných zbytků.

   • · ·· ····· · · · * · • · ·· · · · · * · • · · · · · · · « ·· ·«· ··· **· ·· ··

   130
6. 6. Peptid nebo polypeptid podle nároku 5, ve kterém spacer obsahuje SEQ ID NO: 123 nebo SEQ ID NO: 124.
7. 7. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1, kde cílová buňka je aktivovaná, excitovaná, modifikovaná, pozměněná, poškozená, abnormální nebo nemocná buňka.
8. 8. Peptid nebo polypeptid podle nároku 7, kde nemocnou buňkou je rakovinná buňka.
9. 9. Peptid nebo polypeptid podle nároku 7, kde buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.
10. 10. Peptid nebo polypeptid podle nároku 9, kde buňkou je leukemická nebo myelomová buňka.
11. 11. Peptid nebo polypeptid podle nároku 9, kde leukemickou nebo myelomovou buňkou je maligní B-buňka.
12. 12. Peptid nebo polypeptid podle nároku 10, kde leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie nebo maligní B-buňka.
13. 13. Peptid nebo polypeptid podle nároku 2, který dále obsahuje kazetu z po sobě následujících aminokyselin, která má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-113, nebo má s ní alespoň 90% podobnost, nebo její fragment, přičemž kazeta nebo fragment poskytuje čtecí rámec, do kterého je vestavěna, inzerována, připojena, vázána, kombinována nebo fúzována oblast CDR3,

    131 • · · · · ···· · ·· · · * · · ♦ ·

    99 999 999 999 99 99 jež má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.
14. 14. Peptid nebo polypeptid podle nároku 13, kde kazeta má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-32, 33, 37-39, 41, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 57, 59-68, 70, 71, 76-85, 87, 89-92, 94, 97,

    99, 103, 106, 112 a 113, nebo má s ní alespoň 90% aminokyselinovou podobnost.
15. 15. Peptid nebo polypeptid podle nároku 13, kde kazeta má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 61, nebo má s ní alespoň 90% aminokyselinovou podobnost.
16. 16. Peptid nebo polypeptid podle nároku 15, kde kazeta má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 61, nebo má s ní alespoň 90% aminokyselinovou podobnost.
17. 17. Peptid nebo polypeptid podle nároku 15, ve kterém sedm aminokyselinových zbytků karboxykonce ze SEQ ID NO:61 je zaměněno sedmi aminokyselinovými zbytky SEQ ID NO: 122.
18. 18. Peptid nebo polypeptid podle nároku 3, ve kterém druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou CDR2 a CDR1 hypervariabilní oblast, v uvedeném pořadí.
19. 19. Peptid nebo polypeptid podle nároku 2, ve kterém oblast CDR3 má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8.
20. 20. Peptid nebo polypeptid podle nároku 18, ve kterém oblastí CDR2 a CDR1 mají aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 115 a SEQ ID NO: 114, v uvedeném pořadí.

    • · · · • · * · · · • « · · * ·· ··* ··« ···

    132
21. 21. Peptid nebo polypeptid podle nároku 3, ve kterém druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou hypervariabilní oblast CDR2 a CDRl v uvedeném pořadí, a ve kterém oblasti CDR3, CDR2 a CDRl mají aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 8, 115 a 114, v uvedeném pořadí.
22. 22. Peptid nebo polypeptid podle nároku 3, ve kterém oblast lemující oblast CDR3 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 117, a ve kterém oblast lemující oblast CDR3 po směru má aminokyselinovu sekvenci SEQ ID NO: 116.
23. 23. Peptid nebo polypeptid podle nároku 3, ve kterém druhou hypervariabilní oblastí je hypervariabilní oblast CDR2, a ve kterém oblast lemující oblast CDR2 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 119, a kde oblast lemující oblast CDR2 po směru má aminokyselinovu sekvenci SEQ ID NO: 118.
24. 24. Peptid nebo polypeptid podle nároku 3, ve kterém druhou hypervariabilní oblastí je hypervariabilní oblast CDRl, a ve kterém oblast lemující oblast CDRl proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 121, a kde oblast lemující oblast CDRl po směru má aminokyselinovu sekvenci SEQ ID NO: 120.
25. 25. Peptid nebo polypeptid podle nároku 18, kde oblasti CDR2 a CDRl kazety z po sobě následujících aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-113 nebo jejího fragmentu jsou zaměněny sekvencí SEQ ID NO: 115 a 114, v uvedeném pořadí.
26. 26. Peptid nebo polypeptid podle nároku 18, kde oblasti CDR2 a CDRl kazety z po sobě následujících « ·

    133 aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-32, 35, 37-39, 41, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 57, 59-68,

    70, 71, 76-85, 87, 89-92, 94, 97, 99, 103, 106, 112 a 113 nebo jejího fragmentu jsou zaměněny sekvencí SEQ ID NO: 115 a 114, v uvedeném pořadí.
27. 27. Peptid nebo polypeptid podle nároku 3, ve kterém (a) druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou hypervariabilní oblasti CDR2 a CDRl v uvedeném pořadí,

    (b) aminokyselinová sekvence CDR3 je SEQ ID NO:8, (o) aminokyselinová sekvence CDR2 je SEQ ID NO:115, (d) aminokyselinová sekvence CDRl je SEQ ID

    NO:114, (e) oblast lemující oblast CDR3 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 117, (f) oblast lemující oblast CDR3 po směru má aminokyselinovu sekvenci SEQ ID NO: 116, (g) oblast lemující oblast CDR2 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 119, (h) oblast lemující oblast CDR2 po směru má aminokyselinovu sekvenci SEQ ID NO: 118, (i) oblast lemující oblast CDRl proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 121, (j) oblast lemující oblast CDRl po směru má aminokyselinovu sekvenci SEQ ID NO: 120.
28. 28. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1, kde Fv je scFv získatelný z fágové expresní knihovny.
29. 29. Peptid nebo polypeptid podle nároku 28, kde fágová expresní knihovna byla zkonstruována z lymfocytů periferní • · ·· • « · * · ♦ · · · «· ·«· ··· ··· ·· ·*

    134 krve neimunizovaného člověka, a kde peptid scFv je selektován proti dosud necharakterizovaným a nepurifikovaným antigenům na povrchu cílových buněk.
30. 30. Způsob selekce nebo identifikace peptidu nebo polypeptidu podle nároku 28, vyznačující se tím, že zahrnuje biopanning, kde biopanning zahrnuje vazbu fága k cíli, odstranění nenavázaného fága, eluci vázaného fága a propagaci a amplifikaci eluovaného fága.
31. 31. Peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt z fragmentu, který má zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se selektivně a/nebo specificky váže k podstatně exponovanému a/nebo zvýšeně exprimovanému vazebnému místu na nebo v cílové buňce, kde vazba k cílové buňce se vyskytuje ve prospěch jiných buněk, na nebo ve kterých není vazebné místo podstatně dostupné a/nebo exprimované, přičemž vazebná selektivita nebo specifičnost je primárně determinována první hypervariabilní oblastí, Fv je scFv nebo dsFv, a kde Fv má případně jednu nebo více identifikátorových sekvencí.
32. 32. Peptid nebo polypeptid podle nároku 31, ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.
33. 33. Peptid nebo polypeptid podle nároku 31, ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24, a jehož vazebná selektivita nebo specifičnost je druhotně ovlivňována druhou hypervariabilní

    4 4 4·

    135 oblastí, třetí hypervariabilní oblastí a/nebo jednou nebo více oblastmi lemujícími proti směru nebo po směru první, druhé a/nebo třetí hypervariabilní oblasti, a ve kterém druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou oblasti CDR2 a CDRl v uvedeném pořadí.
34. 34. Peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt z fragmentu , který má zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se selektivně a/nebo specificky váže k cílové buňce ve prospěch jiných buněk, kde molekula Fv obsahuje první řetězec, mající první, druhou a třetí hypervariabilní oblast, a druhý řetězec, mající první, druhou a třetí hypervariabilní oblast, ve kterém jedna z hypervariabilních oblastí prvního řetězce má sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24, a kde jedna z hypervariabilních oblastí druhého řetězce má sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125202, a kde prvními, druhými a třetími hypervariabilními oblastmi jsou oblast CDR3, CDR2 a CDRl, v uvedeném pořadí, a kde Fv je scFv nebo dsFv a Fv má případně jednu nebo více idnetifikátorových sekvencí.
35. 35. Peptid nebo polypeptid podle nároku 34, ve kterém (a) každý z prvního a druhého řetězce obsahuje první hypervariabilní oblast vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24; nebo (b) první hypervariabilní oblast prvního řetězce a první hypervariabilní oblast druhého řetězce jsou identické a jsou vybrány ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24; nebo (c) první hypervariabilní oblast prvního řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID ······ « · • · · ·· *· » · ··· · ·

    4 · ♦ <· · · • « v · · • · ··· ♦ ·· ···

    136

    NO: 8-24 a první hypervariabilní oblast druhého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202; nebo (d) první hypervariabilní oblast prvního řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202 a první hypervariabilní oblast druhého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.
36. 36. Peptid nebo polypeptid podle nároku 34, ve kterém druhými a třetími hypervariabilními oblastmi prvního řetězce jsou SEQ ID NO: 114 a 115, v uvedeném pořadí.
37. 37. Peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou nebo konstrukt z fragmentu, který (a) se váže k neznámému ligandu na první buňce mající první a druhé stadium, přičemž vazba je účinná ve druhém stadiu, avšak není podstatně účinná v prvním stadiu buňky, a (b) na základě imunologické křížové reaktivity se specificky nebo selektivně váže k ligandu na druhé buňce, přičemž Fv je scFv nebo dsFv a Fv případně má jednu nebo více identifikátorových sekvencí.
38. 38. Peptid nebo polypeptid podle nároku 37, kde první buňkou je normální buňka.
39. 39. Peptid nebo polypeptid podle nároku 37, kde první stadium je neaktivovaný stav a druhé stadium je stav aktivovaný, excitovaný, modifikovaný, pozměněný nebo poškozený.

    137 ·· ···· • · · * · · ·· • * * • « · ·· ·♦·
40. 40. Peptid nebo polypeptid podle nároku buňkou je nemocná buňka.

    37, kde druhou
41. 41.

    nemocnou

    Peptid nebo polypeptid podle buňkou je rakovinná buňka.

    nároku

    40, kde
42. 42. Peptid nebo polypeptid podle nároku 40, kde nemocná buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.
43. 43. Peptid nebo polypeptid podle nároku 42, kde nemocnou buňkou je leukemická buňka.
44. 44. Peptid nebo polypeptid podle nároku leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní

    43, kde leukemie.
45. 45. Peptid nebo polypeptid podle nároku 37, kde selektivní a/nebo specifická vazba peptidu nebo polypeptidů k ligandů druhé buňky je determinována první hypervariabilní oblastí.
46. 46. Peptid nebo polypeptid podle nároku 45, ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 mající aminokyselinou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.
47. 47, Peptid nebo polypeptid podle nároku 46, ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 mající aminokyselinou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24 , a jehož vazebná selektivita nebo specifita je sekundárně ovlivňována druhou hypervariabilní

    138 ·«···* 9 •99 99 9

    9 9999 9

    9 9 ♦ · · • 9 · · • 9 999 999 9 • ·· · oblastí, třetí hypervariabilní oblastí, a/nebo jednou nebo více oblastmi lemujícími proti směru nebo po směru, první, druhé a třetí hypervariabilní oblasti v uvedeném pořadí.
48. 48. Ligand, který je exprimován druhou buňkou a který je schopen být vázán k peptidu nebo polypeptidů podle nároku 37.
49. 49. Molekula, která rozpoznává a váže se na ligand podle nároku 48.
50. 50. Molekula nukleové kyseliny kódující peptid nebo polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1, 31, 34 nebo 37.
51. 51. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 50, kde nukleovou kyselinou je DNA.
52. 52. Peptid nebo polypeptid podle nároku 37, kde první a druhé stadium první buňky jsou stejné a kde první buňka je odvozena z buněčné linie.
53. 53. Peptid nebo polypeptid podle nároku 52, kde buněčná linie je vybrána ze skupiny sestávající z buněk Jurkat, MOLT-4, HS-602, U937, TF-1, THP-1, KG-1, ML-2 a HUT-78.
54. 54. Způsob identifikace cílící molekuly, která se váže k neznámým imunologicky křížově reaktivním vazebným místům na první a druhé buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) provedení jednoho nebo více biopanningů na první cílové buňce, která ve druhém stadiu avšak nikoliv v prvním stadiu, podstatně exponuje nebo exprimuje vazebné místo

    139 obsahující alespoň jeden neznámý ligand tak, že je produkována první populace rozpoznávacích molekul;

    (b) provedení následujících biopanningových a/nebo selekčních kroků, začínajících s první populací rozpoznávacích molekul z kroku (a), které jsou prováděny na druhé buňce, jež exprimuje vazebné místo obsahující alespoň jeden neznámý ligand mající imunologickou křížovou reaktivitu k neznámému ligandu první buňky tak, že je produkována druhá populace rozpoznávacích molekul;

    (c) amplifikaci a purifikaci druhé populace rozpoznávacích molekul z kroku (b); a (d) konstrukci z rozpoznávacích míst purifikovaných rozpoznávacích molekul, f

    peptidů nebo polypeptidů, které obsahují cílící molekuly, jež jsou selektivní a /nebo specifické pro neznámé ligandy na druhé buňce.
55. 55. Způsob podle nároku 54, vyznačující se tím, že první buňkou je normální buňka a kde první stadium je neaktivovaný stav a druhé stadium je aktivovaný, excitovaný, modifikovaný, pozměněný nebo poškozený stav.
56. 56. Způsob podle nároku 54, vyznačující se tím, že druhou buňkou je nemocná buňka.
57. 57. Způsob podle nároku 56, vyznačující se tím, že nemocnou buňkou je rakovinná buňka.

    ·* ··· ·

    140
58. 58. Způsob podle nároku 56, vyznačující se tím, že buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.
59. 59. Způsob podle nároku 58, vyznačující se tím, že buňkou je leukemická buňka.
60. 60. Způsob podle nároku 59, vyznačující se tím, že leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie.
61. 61. Použití peptidů nebo polypeptidu podle nároku 1 nebo nároku 37, případně v asociaci, nebo připojeného, vázaného, kombinovaného, ve vazbě nebo fúzovaného s farmaceutickým agens, pro přípravu léčiva.
62. 62. Použití podle nároku 61, kde léčivo má aktivitu proti nemocné buňce.
63. 63. Použití podle nároku 62, kde nemocnou buňkou je rakovinná buňka.
64. 64. Použití podle nároku 62, kde buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu. blastomu, seminomu a melanomu.
65. 65. Použití podle nároku 64, kde buňkou je leukemická buňka,
66. 66. Použití podle nároku 65, kde leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie.

    141 ·· ···· • · · • · ··· • 4 · • · · · ·
67. 67. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1 nebo 37, případně v asociaci, nebo připojený, vázaný, kombinovaný, ve vazbě nebo fúzovaný s farmaceutickým agens, pro použití jako léčivo.
68. 68. Peptid nebo polypeptid podle nároku má aktivitu proti nemocné buňce.
69. 69. Peptid nebo polypeptid podle nároku nemocnou buňkou je rakovinná buňka.

    67, kde léčivo

    68, kde
70. 70. Peptid nebo polypeptid podle nároku 68, kde buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.
71. 71. Peptid nebo polypeptid podle nároku 70, kde buňkou je leukemická buňka.
72. 72. Peptid nebo polypeptid podle nároku 71, kde leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie.
73. 73. Použití peptidu nebo polypeptidů podle nároku 1 nebo 37 pro přípravu kompozice pro použití k inhibici růstu nemocné nebo rakovinné buňky.
74. 74. Použití peptidu nebo polypeptidů podle nároku 73, kde buňkou je leukemická buňka.
75. 75. Použití peptidu nebo polypeptidů podle nároku 74, kde leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie.

    ·· ····

    142 • · » ·· «
76. 76. Použití peptidů nebo polypeptidu podle nároku 1 nebo 37 pro přípravu kompozice pro použití k inhibici růstu rakovinných buněk, kde uvedená kompozice obsahuje alespoň jednu sloučeninu mající farmaceutický ligand selektivní a/nebo specifický pro rakovinnou buňku.
77. 77. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden peptid podle nároku 1 nebo nároku 37 v asociaci, nebo připojeného, vázaného, kombinovaného, ve vazbě nebo fúzovaného s farmaceutickým agens ve farmaceuticky účinném množství a případně farmaceuticky účinný nosič.
78. 78. Kompozice podle nároku 77, vyznačující se tím, že peptid nebo polypeptid a farmaceutické agens jsou spojeny pomocí spojující sloučeniny (linkeru).
79. 79. Kompozice podle nároku 78, vyznačující se tím, že spojující sloučenina je vybrána je skupiny sestávající z dikarboxylové kyseliny, maleimido hydrazidu, PDPH, hydrazidu karboxylové kyseliny a malého peptidů.
80. 80. Kompozice podle nároku 79, vyznačující se tím, že malý peptid je vybrán ze skupiny sestávající z AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, Proteinu C, S-TAG®, T7, V5, VSV-G a KAK-Tag.
81. 81. Peptid nebo polypeptid podle některého z nároků 1, 31, 34 a 37, ve kterém je identifikátorová sekvence vybrána ze skupiny sestávající z: AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, GluGlu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, Proteinu C, S-TAG®, T7_Z V5, VSV-G a KAK-Tag.

    143 · + ···· » · · » * ···
82. 82. Kompozice podle nároku 77, vyznačující se tím, že farmaceutické agens je vybráno ze skupiny sestávající z radioizotopu, toxinu, oligonukleotidu, rekombinantního proteinu, fragmentu protilátky a protirakovinné látky.
83. 83. Kompozice podle nároku 82, vyznačující se tím, že radioizotop je vybrán ze skupiny sestávající z izotopu, kterým je ¹¹¹indium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechneciurn, ^121ratellur, ^122mtellur, ^125mtellur ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium.
84. 84. Kompozice podle nároku 82, vyznačující se tím, že toxin je vybrán ze skupiny sestávající z geloninu, Pseudomonas exotoxinu (PE) , PE40, PE38, diftérického toxinu, ricinu a jejich modifikací a derivátů.
85. 85. Kompozice podle nároku 82, vyznačující se tím, že protirakovinná látka je vybrána ze skupiny sestávající z doxorubicinu (adriamycinu), morfolinodoxorubicinu, methoxymorfolinyldoxorubicinu, cis-platiny, taxolu, calicheamicinu, vincristinu, cytarabinu (Ara-C), cyklofosfamidu, prednísonu, daunorubicinu, morfolinodaunorubicinu, methoxymorfolinyldaunorubicinu, idarubicinu, fludarabinu, chlorambucilu, interferonu alfa, hydroxymočoviny, temozolomidu, thalidomidu, bleomycinu a jejich derivátů.
86. 86. Způsob inhibice růstu buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování buňky s množství peptidu nebo polypeptidu podle nároku 1 nebo nároku 37.

    144 ·· ·· • · • ··· • · * » ··
87. 87. Způsob podle nároku 86, vyznačující se tím, že buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu. blastomu, seminomu a melanomu.
88. 88. Způsob podle nároku 87, vyznačující se tím, že buňkou je leukemická buňka.
89. 89. Způsob podle nároku 88, vyznačující se tím, že leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie.
90. 90. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden peptid podle nároku 1 nebo nároku 37 připojený, vázaný, kombinovaný, ve vazbě nebo fúzovaný se zobrazovacím agens pro použití k diagnostické lokalizaci a zobrazení nádoru.
91. 91. Způsob léčby pacienta trpícího nemocí nebo rakovinou, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi peptidu nebo polypeptidů podle nároku 1 nebo nároku 37 v množství účinném pro léčbu nemoci nebo rakoviny.
92. 92. Způsob podle nároku 91, vyznačující se tím, že nemoc nebo rakovina je vybrána ze skupiny sestávající z karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu. blastomu, seminomu a melanomu.
93. 93. Způsob podle nároku 92, vyznačující se tím, že nemocí je leukémie.

    ·· ···· • ···· · · · · · ·· · * · · · « · · ·· · 9 9 9 9 9 9

    99 999 999 999 99 99

    145
94. 94. Způsob podle nároku 93, vyznačující se tím, že leukéemií je akutní myeloidní leukémie.
95. 95. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1 nebo 37, kde Fv se specificky nebo selektivně váže k buňkám akutní myeloidní leukémie (AML).
96. 96. Ligand přítomný na buňkách AML vázaný s peptidem nebo polypeptidem podle nároku 95.
97. 97. Peptid nebo polypeptid, který se váže s ligandem podle nároku 96.
98. 98. Diagnostický kit pro in vitro analýzu účinnosti léčby před, během a po ošetření, vyznačující se tím, že obsahuje peptid nebo polypeptid podle nároku 1 nebo nároku 37 připojený, vázaný, kombinovaný, ve vazbě nebo fúzovaný s molekulou indikativního markéru.
99. 99. Kit podle nároku 98, vyznačující se tím, že molekula indikativního markéru je fluorescenční markér.
100. 100. Kit podle nároku 99, vyznačující se tím, že fluorescenční markér je vybrán ze skupiny sestávající z fluoresceinu, rhodamidu, phycoerythrinu a jejich modifikací a konjugátů.
101. 101. Kit podle nároku 98, vyznačující se tím, že je použit pro diagnostiku nemoci nebo rakoviny.
102. 102. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1 nebo nároku 37, kde konstruktem je Ig polypeptid.

     ·· ···· • » · ·· ·· · · · • · «·· · · · · · ·· · · · · · · · · • · · · · · · · · ·· ··· ··· ··· ·· ·*

     146
103. 103. Způsob výroby peptidu nebo polypeptidu podle nároku 102, vyznačující se tím, že Ig polypeptid je exprimován jako rekombinantní polypeptid a je produkován v eukaryontním buněčném systému.
104. 104. Způsob podle nároku 103, vyznačující se tím, že eukaryontním systémem je savčí buněčný systém.
105. 105. Peptid nebo polypeptid podle nároku 102, kde Ig polypeptid je IgG polypeptid.
106. 106. Peptid nebo polypeptid podle nároku 105, kde IgG polypeptid obsahuje oblast CDR3, CDR2 a CDRl mající SEQ ID NO: 8, 115 a 114 v uvedeném pořadí.
107. 107. IgG polypeptid podle nároku 106, ve kterém oblasti CDR3, CDR2 a CDRl jsou oblastmi těžkého řetězce.
108. 108. IgG polypeptid podle nároku 106, ve kterém oblasti CDR3, CDR2 a CDRl jsou oblastmi lehkého řetězce.
109. 109. IgG polypeptid podle nároku 102, který má těžký řetězec obsahující SEQ ID NO: 26 a lehký řetězec obsahující SEQ ID NO: 27, nebo má řetězce mající s nimi alespoň 90% aminokyselinovou podobnost.
110. 110. Způsob výroby peptidu nebo polypeptidu podle nároku 1 nebo nároku 37, vyznačující se tím, že peptid nebo polypeptid je produkován v prokaryontním buněčném systému nebo v eukaryontním buněčném systému.
111. 111. Způsob podle nároku 110, vyznačující se tím, že prokaryontní systém zahrnuje E.coli, přičemž E. coli • · ··· ·

     147 obsahuje expresní vektor, a eukaryontním systémem je savčí buněčný systém.
112. 112. Způsob podle nároku 111, vyznačující se tím, že expresní vektor prokaryontního systému obsahuje promotor vybraný ze skupiny sestávající z osmB, deo, P~lac-U5, XP_L, SRcc5 a CVM.
113. 113. Peptid nebo polypeptid, který obsahuje vazebný motiv, který obsahuje aminokyselinovu sekvencí R_x-X Phe Pro-R2, ve které každý z R1 a R2 zahrnuje sekvenci o 0-15 aminokyselinových zbytcích a X je buď Arg, Gly nebo Lys.
114. 114. Peptid nebo polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 2, 34 nebo 46, ve kterém CDR3 obsahuje aminokyselinovou sekvenci Ri-X Phe Pro-R2, ve které každý z Rl a R2 zahrnuje sekvenci o 0-15 aminokyselinových zbytcích a X je buď Arg, Gly nebo Lys.
115. 115. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1 nebo nároku 37, kde uvedený peptid nebo polypeptid zahrnuje alespoň jednu nepřirozeně se vyskytují modifikaci.
116. 116. Peptid nebo polypeptid podle nároku 115, kde uvedená nepřirozeně se vyskytující modifikace činí peptid nebo polypeptid více imunogenním nebo více stabilním.
117. 117. Peptid nebo polypeptid podle nároku 116, kde uvedená alespoň jedna modifikace je vybrána ze skupiny sestávající z peptoidní modifikace, semipeptoidní modifikace, modifikace cyklického peptidu, modifikace Nkonce, modifikace C-konce, modifikace peptidové vazby, modifikace páteře a modifikace reziduí.

     • ·

     148
118. 118. Peptid nebo polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1, 31, 34, 37 nebo 67 pro ex vivo čištění (purging) autologní kostní dřeně k odstranění abnormálních buněk.
119. 119. Způsob výroby cíleného agens, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

     a) izolaci a selekci jedné nebo více cílících molekul obsahujících primární rozpoznávací místo metodou biopanningu přímo na cílové buňce, nebo biopanningovým postupem nepřímo na první cílové buňce ve druhém stadiu, avšak nikoliv prvním stadiu, a následně biopanningovým postupem přímo na druhé cílové buňce k získání jedné nebo více cílících molekul;

     b) amplifikaci, purifikaci a identifikaci jedné nebo více cílících molekul; a

     c) konstrukci cílícího agens z jedné nebo více cílících molekul, kde cílícím agens může být peptid, polypeptid, a protilátka nebo fragment protilátky, nebo jejich multimer.
120. 120. Způsob podle nároku 119, vyznačující se tím, že cílící agens je připojené, vázané, kombinované, ve vazbě nebo fúzované, nebo v asociaci s farmaceutickým agens.
121. 121. Způsob podle nároků 119 nebo 120, vyznačující se tím, že cílícím agens je látka proti nemoci nebo proti rakovině.

     • · · · • ·

     149
122. 122. Způsob podle nároku 120, vyznačující se tím, že farmaceutické agens je vybráno ze skupiny sestávající z radioizotopu, toxinu, oligonukleotidu, rekombinantního proteinu, fragmentu protilátky a protirakovinné látky.
123. 123. Způsob podle nároku 122, vyznačující se tím, že radioizotop je vybrán ze skupiny sestávající z izotopu, kterým je ^U1indíum, ¹¹³indium, ^99mrhenium, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechneciurn, ¹²¹ⁱⁿtellur, ^122mtellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ^{126 * * *}jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium.
124. 124. Způsob podle nároku 122, vyznačující se tím, že toxin je vybrán ze skupiny sestávající z geloninu, Pseudomonas exotoxinu (PE), PE40, PE38, Diptheria, ricinu a jejich modifikací a derivátů.
125. 125. Způsob podle nároku 122, vyznačující se tím, že protirakovinná látka je vybrána ze skupiny zahrnující doxorubicin (adriamycin), morfolinodoxorubicin, methoxymorfolinyldoxorubicin, vincristin, cytarabin (AraC), cyklofosfamid, prednison, daunorubicin, morfolinodaunorubicin, methoxymorfdinyldaunorubicin, idarubicin, fludarabin, chlorambucil, interferon alfa, hydroxymočovina, temozolomid, thalidomid, bleomycin a jejich derivátů.
126. 126. Peptid nebo polypeptid mající vzorec o struktuře:

     A-X-B, ve kterém X je hypervariabilní oblast CDR3 ze 3 až 30 aminokyselin; každý z A a B mohou být aminokyselinové • · · · · · · ♦ · · ·· · • · · · · · • · 9 9 9 • · · « ·· ··· · 9 · ·

     150 řetězce o délce od 1 do 1000 aminokyselin, kde A je aminokonec a B je karboxykonec.
127. 127. Peptid podle nároku 126, kde A je 150-250 aminokyselinových zbytků a kde B je 350-500 aminokyselinových zbytků.
128. 128. Peptid podle nároku 126, kde oblastí CDR3 je 5-13 aminokyselinových zbytků.
129. 129. Peptid podle nároku 126, kde X je aminokyselinová sekvence vybraná ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.
130. 130. Peptid nebo polypeptid podle nároku 127, který je částí rozsáhlejší nebo úplné protilátky nebo multimeru.
131. 131. Dimerní molekula obsahující dva peptidy nebo polypeptidy, z nichž jeden je peptid nebo polypeptid podle nároku 126.
132. 132. Dimerní molekula obsahující dva peptidy nebo polypeptidy podle nároku 126, které jsou identické.
133. 133. Dimerní molekula podle nároku 131 nebo nároku 132, kde X je aminokyselinová sekvence vybraná ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.
134. 134. Molekula nukleové kyseliny kódující peptid nebo polypeptid podle nároku 126 nebo dimerní molekulu podle nároku 130.
135. 135. Způsob podle nároku 104, vyznačující se tím, že savčí buněčný systém obsahuje promotor SRa5.

     151
136. 136. Způsob podle nároku 104, vyznačující se tím, že savčí buněčný systém obsahuje promotor CVM.

     .
137. 137. Peptid nebo polypeptid v podstatě takový, jak je zde popsán.
138. 138. Peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt fragmentu mající zvýšené vazebné charkateristiky tak, že se selektivně a/nebo specifikcy váže k cílové buňce ve prospěch jiných buněk, kde vazebná selektivita nebo specifičnost je primárně determinována první hypervariabilní oblastí, a ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 obsahující aminokyselinovu sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8 nebo 20, a kde Fv je scFv nebo dsFv, případně mající jednu nebo dvě identifikátorové sekvence.
139. 139. Peptid nebo polypetid podle nároku 138, jehož vazebná selektivita nebo specifičnost je sekundárně ovlivňována druhou hypervariabilní oblastí, třetí hypervariabilní oblastí a/nebo jednou nebo více oblastí lemující první, druhou a/nebo třetí hypervariabilní oblast proti směru.
140. 140. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138, kde peptidem nebo polypeptidem je scFv mající SEQ ID NO: 25, a ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3, která je identická se SEQ ID NO:8.
141. 141. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138, kde peptidem nebo polypeptidem je scFv mající SEQ ID NO: 203, a • ·

     152 ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3, která je identická se SEQ ID NO:20.
142. 142. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138, kde molekula scFv obsahuje přímý nebo rozvětvený spacer ze 20 nebo méně aminokyselinových zbytků.
143. 143. Peptid nebo polypeptid podle nároku 142, kde spacer obsahuje SEQ ID NO: 123 nebo SEQ ID NO: 124.
144. 144. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138, kde cílovou buňkou je aktivovaná, excitovaná, modifikovaná, pozměněná, poškozená, abnormální nebo nemocná buňka.
145. 145. Peptid nebo polypeptid podle nároku 144, kde nemocnou buňkou je rakovinná buňka.
146. 146. Peptid nebo polypeptid podle nároku 144, kde buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.
147. 147. Peptid nebo polypeptid podle nároku 146, kde buňkou je leukemická nebo myelomová buňka.
148. 148. Peptid nebo polypeptid podle nároku 146, kde leukemická nebo myelomová buňka je maligní B-buňka.
149. 149. Peptid nebo polypeptid podle nároku 147, kde leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie nebo maligní B-buňka.

     • ·

     153
150. 150. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138 dále obsahující kazetu z po sobě následujících aminokyselin, která má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-113, nebo má s ní alespoň 90% podobnost, nebo její fragment, přičemž kazeta nebo fragment poskytuje čtecí rámec, do kterého je vestavěna, inzerována, připojena, vázána, kombinována nebo fúzována oblast CDR3, jež má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny se stávající ze SEQ ID NO: 8-20.
151. 151. Peptid nebo polypeptid podle nároku 150, kde kazeta má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-32, 33, 37-39, 41, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 57, 59-68, 70, 71, 76-85, 87, 89-92, 94, 97,

     99, 103, 106, 112 a 113, nebo má s ní alespoň 90% aminokyselinovou podobnost.
152. 152. Peptid nebo polypeptid podle nároku 150, kde kazeta má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 61, nebo má s ní alespoň 90% aminokyselinovou podobnost
153. 153. Peptid nebo polypeptid podle nároku 152, kde kazeta má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 61, nebo má s ní alespoň 90% aminokyselinovou podobnost
154. 154. Peptid nebo polypeptid podle nároku 152, ve kterém sedm aminokyselinových zbytků karboxykonce ze SEQ ID NO:61 je zaměněno sedmi aminokyselinovými zbytky SEQ ID NO: 122.
155. 155. Peptid nebo polypeptid podle nároku 139, ve kterém druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou CDR2 a CDRl hypervariabilní oblast, v uvedeném pořadí.

     • · · ·

     154
156. 156. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138, ve kterém oblast CDR3 má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:

     8 .
157. 157. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138, ve kterém oblast CDR3 má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20.
158. 158. Peptid nebo polypeptid podle nároku 155, ve kterém oblasti CDR2 a CDRl mají aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 115 a SE ID NO: 114, v uvedeném pořadí.
159. 159. Peptid nebo polypeptid podle nároku 140, ve kterém druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou hypervariabilní oblast CDR2 a CDRl v uvedeném pořadí, a ve kterém oblasti lemující oblasti CDR3, CDR2 a CDRl mají aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 8, 115 a 114, v uvedeném pořadí.
160. 160. Peptid nebo polypeptid podle nároku 140, ve kterém druhými a třetími variabilními oblastmi jsou hypervariabilní oblast CDR2 a CDRl v uvedeném pořadí, a ve kterém oblasti CDR3, CDR2 a CDRl mají aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 20, 115 a 114 v uvedeném pořadí.
161. 161. Peptid nebo polypeptid podle nároku 139, ve kterém oblast lemující oblast CDR3 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 117, a ve kterém oblast lemující oblast CDR3 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 116.

     ·· ···· • ···

     155
162. 162. Peptid nebo polypeptid podle nároku 139, ve kterém druhou hypervariabilní oblastí je hypervariabilní oblast CDR2, a ve kterém oblast lemující oblast CDR2 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 119, a ve kterém oblast lemující oblast CDR2 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 118.
163. 163. Peptid nebo polypeptid podle nároku 139, ve kterém třetí hypervariabilní oblastí je hypervariabilní oblast CDR1, a ve kterém oblast lemující oblast CDR1 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 121, a ve kterém oblast lemující oblast CDR1 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 120.
164. 164. Peptid nebo polypeptid podle nároku 155, kde oblasti kazety CDR2 a CDR1 o sekvenci z po sobě následujících aminokyselin vybrané ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-113, nebo jejího fragmentu, jsou zaměněny sekvencí SEQ ID NO: 115 a 114, v uvedeném pořadí.
165. 165. Peptid nebo polypeptid podle nároku 155, kde oblasti kazety CDR2 a CDR1 o sekvenci z po sobě následujících aminokyselin vybrané ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-32, 35, 37-39, 41, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 57, 59-68, 70, 71, 76-85, 87, 89-92, 94, 97, 99, 103, 106, 112 a 113, nebo jejího fragmentu, jsou zaměněny sekvencí SEQ ID NO: 115 a 114, v uvedeném pořadí.
166. 166. Peptid nebo polypeptid podle nároku 139, ve kterém (a) druhými a třetími hypervariabilními oblastmi jsou hypervariabilní oblast CDR2 a CDR1, v uvedeném pořadí, • · · · · ·

     156 (b) aminokyselinovou sekvencí CDR3 je SEQ ID NO: 8, (c) aminokyselinovou sekvencí CDR2 je SEQ ID NO: 115, (d) aminokyselinovou sekvencí CDR1 je SEQ ID NO:114,

     (e) oblast lemující oblast CDR3 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:117, (f) oblast lemující oblast CDR3 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 116, (g) oblast lemující oblast CDR2 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:119, (h) oblast lemující oblast CDR2 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 118, (i) oblast lemující oblast CDR1 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:121, (j) oblast lemující oblast CDR1 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 120.
167. 167. Peptid nebo polypeptid podle nároku 139, ve kterém (a) druhými a třetími hypervariabilními oblastmi jsou hypervariabilní oblast CDR2 a CDR1, v uvedeném pořadí,

     (b) aminokyselinovou 20, sekvencí CDR3 je SEQ ID NO: (c) aminokyselinovou 115, sekvencí CDR2 je SEQ ID NO: (d) aminokyselinovou NO:114, sekvencí CDR1 je SEQ ID (e) oblast lemující oblast CDR3 proti směru má

     aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:117, • · ····

     157 ·· » (f) (g) (h) (i) oblast lemující oblast CDR3 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 116, oblast lemující oblast CDR2 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:119, oblast lemující oblast CDR2 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 118, oblast lemující oblast CDRl proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:121, (j) ' oblast lemující oblast CDRl po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:120.
168. 168. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138, kde Fv je scFv získatelný z fágové expresní knihovny.
169. 169. Peptid nebo polypeptid podle nároku 165, kde fágová expresní knihovna byla zkonstruována z lymfocytů periferní krve neimunizovaného člověka, a kde peptid scFv je selektován proti dosud necharakterizovaným a nepurifikovaným antigenům na povrchu cílových buněk.
170. 170. Způsob selekce nebo identifikace peptidu nebo polypeptidů podle nároku 165, vyznačující se tím, že zahrnuje biopanning, kde biopanning zahrnuje vazbu fága k cíli, odstranění nenavázaného fága, eluci vázaného fága a propagaci a amplifikaci eluovaného fága.
171. 171. Peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt z fragmentu, který má zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se selektivně a/nebo specificky váže k podstatně exponovanému a/nebo zvýšeně exprimovanému vazebnému místu na nebo v cílové buňce, kde vazba k cílové buňce se vyskytuje ve prospěch jiných buněk, na nebo ve kterých není vazebné

     99 ···· • · 9

     158 • 9 999 • · · ·· 999 místo podstatně dostupné a/nebo exprimované, přičemž vazebná selektivita nebo specifičnost je primárně determinována první hypervariabilní oblastí, a ve kterém první hypervariabilní oblastí je oblast CDR3 sestávající ze SEQ ID NO: 8 nebo 20, a kde Fv je scFv nebo dsFv, a kde Fv má případně jednu nebo více identifikátorových sekvencí.
172. 172. Peptid nebo polypeptid podle nároku 171, kde vazebná selektivita nebo specifičnost je druhotně ovlivňována druhou hypervariabilní oblastí, třetí hypervariabilní oblastí a/nebo jednou nebo více oblastmi lemujícími proti směru nebo po směru první, druhé a/nebo třetí hypervariabilní oblasti, a ve kterém druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou oblasti CDR2 a CDRl, v uvedeném pořadí.
173. 173. Peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou, nebo konstrukt z fragmentu , který má zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se selektivně a/nebo specificky váže k cílové buňce ve prospěch jiných buněk, kde molekula Fv obsahuje první řetězec, mající první, druhou a třetí hypervariabilní oblast, a druhý řetězec, mající první, druhou a třetí hypervariabilní oblast, kde jedna z hypervariabilních oblastí prvního řetězce obsahuje sekvenci SEQ ID NO: 8 nebo 20, a kde jedna z hypervariabilních oblastí druhého řetězce má sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202, ve kterém prvními, druhými a třetími hypervariabilními oblastmi jsou oblast CDR3, CDR2 a CDRl, v uvedeném pořadí, a kde Fv je scFv nebo dsFv a Fv má případně jednu nebo více identifikátorových sekvencí.

     • ·

     159
174. 174. Peptid nebo polypeptid podle nároku 172, ve kterém (a) ' první hypervariabilní oblast prvního řetězce a první hypervariabilní oblast druhého řetězce jsou identické a jsou vybrány ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8 nebo 20; nebo (b) první hypervariabilní oblast prvního řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8 nebo 20 a první hypervariabilní oblast druhého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202; nebo (e) první hypervariabilní oblast prvního řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202 a první hypervariabilní oblast druhého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8 nebo 20.
175. 175. Peptid nebo polypeptid podle nároku 173, ve kterém druhými a třetími hypervariabilními oblastmi prvního řetězce jsou SEQ ID NO: 114 a 115, v uvedeném pořadí.
176. 176. Peptid nebo polypeptid obsahující molekulu Fv, její konstrukt, fragment obou nebo konstrukt z fragmentu, který (a) se váže k neznámému ligandu na první buňce mající první a druhé stadium, přičemž vazba je účinná ve druhém stadiu, avšak není podstatně účinná v prvním stadiu buňky, a (b) na základě imunologické křížové reaktivity se specificky nebo selektivně váže k ligandu na druhé buňce, přičemž Fv je scFv nebo dsFv a Fv případně má jednu nebo více identifikátorových sekvencí.

     • · · · • ·

     160
177. 177. Peptid nebo polypeptid podle nároku 176, kde první buňkou je normální buňka.
178. 178. Peptid nebo polypeptid podle nároku 176, kde první stadium je neaktivovaný stav a druhé stadium je stav aktivovaný, excitovaný, modifikovaný, pozměněný nebo poškozený.
179. 179. Peptid nebo polypeptid podle nároku 176, kde druhou buňkou je nemocná buňka.
180. 180. Peptid nebo polypeptid podle nároku 179, kde nemocnou buňkou je rakovinná buňka.
181. 181. Peptid nebo polypeptid podle nároku 179, kde nemocná buňka je vybrána ze skupiny sestávající z z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu. blastomu, seminomu a melanomu.
182. 182. Peptid nebo polypeptid podle nároku 181, kde nemocnou buňkou je leukemická buňka.
183. 183. Peptid nebo polypeptid podle nároku 182, kde leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie.
184. 184. Peptid nebo polypeptid podle nároku 176, kde selektivní a/nebo specifická vazba peptidu nebo polypeptidu k ligandu druhé buňky je determinována první hypervariabilní oblastí.
185. 185. Peptid nebo polypeptid podle nároku 175, kde vazebná selektivita nebo specifičnost je sekundárně • ·

     161 ovlivňována druhou hypervariabilní oblastí, třetí hypervariabilní oblastí a/nebo jednou nebo více oblastmi lemujícími proti směru nebo po směru první, druhé a třetí hypervariabilní oblasti, v uvedeném pořadí.
186. 186. Ligand, který je exprimován druhou buňkou a který je schopen být vázán k peptidů nebo polypeptidů podle nároku 176.
187. 187. Molekula, která rozpoznává a váže se na ligand podle nároku 186.
188. 188. Molekula nukleové kyseliny kódující peptid nebo polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 138, 171, 173 nebo 176.
189. 189. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 188, kde nukleovou kyselinou je DNA.
190. 190. Peptid nebo polypeptid podle nároku 176, kde první a.druhé stadium první buňky jsou stejné a kde první buňka je odvozena z buněčné linie.
191. 191. Peptid nebo polypeptid podle nároku 190, kde buněčná linie je vybrána ze skupiny sestávající z buněk Jurkat, MOLT-4, HS-602, U937, TF-1, THP-1, KG-1 a HUT-78.
192. 192. Použití peptidů nebo polypeptidů podle nároku 138 nebo nároku 176, případně v asociaci, nebo připojeného, vázaného, kombinovaného, ve vazbě nebo fúzovaného s farmaceutickým agens, pro přípravu léčiva.

     • · · ·

     162 • · · · · · • · · • · · • · · · • . · · · ·· ··
193. 193. Použití podle nároku 192, kde léčivo má aktivitu proti nemocné buňce.
194. 194. Použití podle nároku 193, kde nemocnou buňkou je rakovinná buňka.
195. 195. Použití podle nároku 193, kde buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.
196. 196. Použití podle nároku 195, kde buňkou je leukemická buňka.
197. 197. Použití podle nároku 196, kde leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie.
198. 198. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138 nebo nároku 176, případně v asociaci, nebo připojený, vázaný, kombinovaný, ve vazbě nebo fúzovaný s farmaceutickým agens, pro použití jako léčivo.
199. 199. Peptid nebo polypeptid podle nároku 198, kde léčivo má aktivitu proti nemocné buňce.
200. 200. Peptid nebo polypeptid podle nároku 199, kde nemocnou buňkou je rakovinná buňka.
201. 201. Peptid nebo polypeptid podle nároku 199, kde buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.

     ····

     163
202. 202. Peptid nebo polypeptid podle nároku 201, kde buňkou je leukemická buňka.
203. 203. Peptid nebo polypeptid podle nároku 202, kde leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie.
204. 204. Použití peptidu nebo polypeptidu podle nároku 138 nebo nároku 176 pro přípravu kompozice pro použití k inhibici růstu nemocné buňky.
205. 205. Použití peptidu nebo polypeptidu podle nároku

     204, kde buňkou je leukemická buňka.
206. 206. Použití peptidu nebo polypeptidu podle nároku

     205, kde leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie.
207. 207. Použití peptidu nebo polypeptidu podle nároku 138 nebo 176 pro přípravu kompozice pro použití k inhibici růstu rakovinných buněk, kde uvedená kompozice obsahuje alespoň jednu sloučeninu mající farmaceutický ligand selektivní a/nebo specifický pro rakovinnou buňku.
208. 208. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden peptid podle nároku 138 nebo nároku 176 v asociaci, nebo připojeného, vázaného, kombinovaného, ve vazbě nebo fúzovaného s farmaceutickým agens ve farmaceuticky účinném množství a případně farmaceuticky účinný nosič.
209. 209. Kompozice podle nároku 208, vyznačující se tím, že peptid nebo polypeptid a farmaceutické agens jsou spojeny pomocí spojující sloučeniny.

     • · · · • · · · · ·

     164
210. 210. Kompozice podle nároku 209, vyznačující se tím, že spojující sloučenina je vybrána je skupiny sestávající z dikarboxylové kyseliny, maleimido hydrazidu, PDPH, hydrazidu karboxylové kyseliny a malého peptidů.
211. 211. Kompozice podle nároku 209, vyznačující se tím, že malý peptid je vybrán ze skupiny sestávající z AU1, AU5, Btag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS,

     KT3, Proteinu C, S-TAG®, T7, V5, VSV-G.
212. 212. Peptid nebo polypeptid podle některého z nároků 137, 170, 172 a 175, kde identifikátorová sekvence je vybrána ze skupiny sestávající z: AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, Proteinu C, S-TAG®, T7, V5, VSV-G.
213. 213. Kompozice podle nároku 208, vyznačující se tím, že farmaceutické agens je vybráno ze skupiny sestávající z radioizotopu, toxinu, oligonukleotidu, rekombinantního proteinu, fragmentu protilátky a protirakovinné látky.
214. 214. Kompozice podle nároku 82, vyznačující se tím, že radioizotop je vybrán ze skupiny sestávající z izotopu, kterým je ⁿⁱindium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechneciurn, ^121mtellur, ^122mtellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³ jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸galiium.
215. 215. Kompozice podle nároku 213, vyznačující se tím, že toxin je vybrán ze skupiny sestávající z geloninu,

     165

     Pseudomonas exotoxinu (PE), PE40, PE38, toxinu, ricinu a jejich modifikací a derivátů.
216. 216. Kompozice podle nároku 212., vyznačující se tím, že protirakovinná látka je vybrána ze skupiny sestávající z doxorubicinu (adriamycinu), morfolinodoxorubicinu, methoxymorfolinyldoxorubicinu, cis-platiny, taxolu, calicheamicinu, vincristinu, cytarabinu (Ara-C), cyklofosfamidu, prednisonu, daunorubicinu, morfolinodaunorubicinu, methoxymorfolinyldaunorubicinu, idarubicinu, fludarabinu, chlorambucilu, interferonu alfa, hydroxymočoviny, temozolomidu, thalidomidu, bleomycinu a jejich derivátů.
217. 217. Způsob inhibice růstu buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování buňky s množství peptidů nebo polypeptidů podle nároku 138 nebo nároku 176.
218. 218. Způsob podle nároku 217, vyznačující se tím, že buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.
219. 219. Způsob podle nároku 218, vyznačující se tím, že buňkou je leukemická buňka.
220. 220. Způsob podle nároku 219, vyznačující se tím, že leukemickou buňkou je buňka akutní myeloidní leukémie.
221. 221. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden peptid podle nároku 138 nebo nároku 176 připojený, vázaný, kombinovaný, ve vazbě nebo fúzovaný • · · · · · ·· ·· · • · · • · · · • · · •·· ···

     166 se zobrazovacím agens pro použití k diagnostické lokalizaci a zobrazení nádoru.
222. 222. Způsob léčby pacienta trpícího nemocí nebo rakovinou, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi peptidu nebo polypeptidů podle nároku 138 nebo nároku 176 v množství účinném pro léčbu nemoci nebo rakoviny.
223. 223. Způsob podle nároku 222, vyznačující se tím, že nemoc nebo rakovina je vybrána ze skupiny sestávající z karcinomu, sarkomu, leukémie, adenomu, lymfomu, myelomu, blastomu, seminomu a melanomu.
224. 224. Způsob podle nároku 223, vyznačující se tím, že nemocí je leukémie.
225. 225. Způsob podle nároku 224, vyznačující se tím, že leukémií je akutní myeloidní leukémie.
226. 226. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138 nebo 176, kde Fv se specificky nebo selektivně váže k buňkám akutní myeloidní leukémie (AML).
227. 227. Ligand přítomný na buňkách AML vázaný s peptidem nebo polypeptidem podle nároku 226,
228. 228. Peptid nebo polypeptid, který se váže.s ligandem podle nároku 227.
229. 229. Diagnostický kit pro in vitro analýzu účinnosti léčby před, během a po ošetření, vyznačující se tím, že obsahuje peptid nebo polypeptid podle nároku 138 nebo • · · ·

     167 nároku 176 připojený, vázaný, kombinovaný, ve vazbě nebo fúzovaný s molekulou indikativního markéru.
230. 230. Kit podle nároku 229, vyznačující se tím, že molekula indikativního markéru je fluorescenční markér.
231. 231. Kit podle nároku 230, vyznačující se tím, že fluorescenční markér je vybrán ze skupiny sestávající z fluoresceinu, rhodamidu, phycoerythrinu a jejich modifikací a konjugátů.
232. 232. Kit podle nároku 229, vyznačující se tím, že je použit pro diagnostiku nemoci nebo rakoviny.
233. 233. Peptid nebo polypeptid podle nároku 139 nebo nároku 176, kde konstruktem je Ig polypeptid.
234. 234. Způsob výroby peptidu nebo polypeptidu podle nároku 233, vyznačující se tím, že Ig polypeptid je exprimován jako rekombinantní polypeptid a je produkován v eukaryontním buněčném systému.
235. 235. Způsob podle nároku 234, vyznačující se tím, že eukaryontním systémem je savčí buněčný systém.
236. 236. Peptid nebo polypeptid podle nároku 233, kde Ig polypeptidem je IgG polypeptid.
237. 237. Peptid nebo polypeptid podle nároku 236, kde IgG polypeptid obsahuje oblast CDR3, CDR2 a CDRl mající SEQ ID NO: 8, 115 a 114, v uvedeném pořadí.

     168
238. 238. Peptid nebo polypeptid podle nároku 236, kde IgG polypeptid obsahuje oblast CDR3, CDR2 a CDRl mající SEQ ID NO: 20, 115 a 114, v uvedeném pořadí.
239. 239. IgG polypeptid podle nároku 237, ve kterém oblasti CDR3, CDR2 a CDRl jsou oblastmi těžkého řetězce.
240. 240. IgG polypeptid podle nároku 238, ve kterém oblasti CDR3, CDR2 a CDRl jsou oblastmi těžkého řetězce.
241. 241. IgG polypeptid podle nároku 237, ve kterém oblasti CDR3, CDR2 a CDRl jsou oblastmi lehkého řetězce.
242. 242. IgG polypeptid podle nároku 238, ve kterém oblasti CDR3, CDR2 a CDRl jsou oblastmi lehkého řetězce.
243. 243. IgG polypeptid podle nároku 233, kde IgG má těžký řetězec obsahující SEQ ID NO: 26 a lehký řetězec obsahující SEQ ID NO: 27, nebo má řetězce mající s nimi alespoň 90% aminokyselinovou podobnost.
244. 244. Způsob výroby peptidů nebo polypeptidů podle nároku 139 nebo nároku 176, vyznačující se tím, že peptid nebo polypeptid je produkován v prokaryontním buněčném systému nebo v eukaryontním buněčném systému.
245. 245. Způsob podle nároku 244, vyznačující se tím, že prokaryontní systém zahrnuje E.coli, přičemž E. coli obsahuje expresní vektor, a eukaryontním systémem je savčí buněčný systém.
246. 246. Způsob podle nároku 245, vyznačující se tím, že expresní vektor prokaryontního systému obsahuje promotor ·· ···· • · · • · · ♦ · · · • · · · • ·· ··

     169 vybraný ze skupiny sestávající z osmB, deo, p-lac-U5, XP_L, SRct5 a CVM.
247. 247. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138 nebo 176, který obsahuje aminokyselinovu sekvenci Rj-X Phe Pro-R₂, ve které každý z R1 a R2 zahrnuje sekvenci o 0-15 aminokyselinových zbytcích a X je buď Arg, Gly nebo Lys.
248. 248. Peptid nebo polypeptid podle nároku 138 nebo nároku 176, kde uvedený peptid nebo polypeptid zahrnuje alespoň jednu nepřirozeně se vyskytují modifikaci.
249. 249. Peptid nebo polypeptid podle nároku 248, kde uvedená nepřirozeně se vyskytující modifikace činí peptid nebo polypeptid více imunogenním nebo více stabilním.
250. 250. Peptid nebo polypeptid podle nároku 249, kde uvedená alespoň jedna modifikace je vybrána ze skupiny sestávající z peptoidní modifikace, semipeptoidní modifikace, modifikace cyklického peptidů, modifikace Nkonce, modifikace C-konce, modifikace peptidové vazby, modifikace páteře a modifikace reziduí.
251. 251. Peptid nebo polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 138, 171, 173, 176 nebo 198 pro ex vivo čištění (purging) autologní kostní dřeně k odstranění abnormálních buněk.
252. 252. Peptid nebo polypeptid mající vzorec o struktuře:

     A-X-B, ve kterém X je hypervariabilní oblast CDR3 obsahující SEQ ID NO: 8 nebo 20; každý z A a B mohou být aminokyselinové

     170 ·« ···· • · · • · * * · • · · · • · · řetězce o délce od 1 do 1000 aminokyselin, kde A je aminokonec a B je karboxy-konec.
253. 253. Peptid podle nároku 252, kde A je 150-250 aminokyselinových zbytků a kde B je 350-500 aminokyselinových zbytků.
254. 254. Peptid nebo polypeptid podle nároku 253, který je částí rozsáhlejší nebo úplné protilátky nebo multimeru.
255. 255. Dimerní molekula obsahující dva peptidy nebo polypeptidy, z nichž jeden je peptid nebo polypeptid podle nároku 252.
256. 256. Dimerní molekula obsahující dva peptidy nebo polypeptidy podle nároku 252, které jsou identické.
257. 257. Molekula nukleové kyseliny kódující peptid nebo polypeptid podle nároku 252 nebo dimerní molekulu podle nároku 254.
258. 258. Způsob podle nároku 235, vyznačující se tím, že savčí buněčný systém obsahuje promotor SRa5.
259. 259. Způsob podle nároku 235, vyznačující se tím, že savčí buněčný systém obsahuje promotor CVM.