CZ302070B6 - Jednoretezcový multifunkcní polypeptid, polynukleotid, vektor obsahující tento polynukleotid, bunka transfekovaná tímto polynukleotidem, prostredek obsahující tento polypeptid, polynukleotid nebo vektor a jejich použití a zpusob identifikace aktiváto - Google Patents

Abstract

Jednoretezcový multifunkcní polypeptid specifický pro antigeny CD19 a CD3. Tento polypeptid obsahuje (a) první doménu obsahující vazebné místo imunoglobulinového retezce nebo protilátky specificky rozpoznávající CD19 antigen; (b) druhou doménu obsahující vazebné místo imunoglobulinového retezce nebo protilátky specificky rozpoznávající CD3 antigen lidských T bunek; kde uvedené domény jsou usporádány v poradí V.sub.L.n.CD19-V.sub.H.n.CD19-V.sub.H.n.CD3-V.sub.L.n.CD3. Tento polypeptid muže obsahovat alespon jednu další doménu, výhodne s predem danou funkcí. Dále jsou popsány polynukleotidy kódující uvedený polypeptid, vektory obsahující uvedené polynukleotidy, hostitelské bunky jimi transformované a jejich použití pri výrobe uvedeného polypeptidu. Dále rešení zahrnuje prostredky, výhodne farmaceutické a diagnostické prostredky, obsahující uvedené polypeptidy, polynukleotidy nebo vektory; použití výše uvedených polypeptidu, polynukleotidu a vektoru pro prípravu farmaceutických prostredku pro imunoterapii, výhodne proti malignitám pocházejícím z B lymfocytu jako jsou napríklad nehodgkinské lymfomy. Krome toho se vynález týká zpusobu identifikace aktivátoru nebo inhibitoru aktivace nebo stimulace T lymfocytu.

Description

Oblast techniky

Předmětný vynález se týká nových jednořetězcových multifunkčních polypeptidů specifických 10 pro CD19XCD3, obsahujících alespoň dvě vazebná místa specifická pro antigeny CD19 a CD3, v uvedeném pořadí. Předkládaný vynález se dále týká polypeptidů, kde výše popsaný polypeptid obsahuje alespoň jednu další doménu, výhodně s předem danou funkcí. Kromě toho, předkládaný vynález se týká polynukleotidů kódujících uvedené polypeptidy, jakož i vektorů obsahujících uvedené polynukleotidy, a dále hostitelských buněk jimi transformovaných a jejich použití ve i s výrobě uvedených polypeptidů. Navíc, předkládaný vynález se týká prostředků, výhodně farmaceutických a diagnostických prostředků, obsahujících kterýkoliv z výše popsaných polypeptidů, polynukleotidů nebo vektorů. Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití výše uvedených polypeptidů, polynukleotidů a vektoru pro přípravu farmaceutických prostředků pro imunoterapii, výhodně proti malignitám pocházejícím z B Iymfocytů jako jsou například nehodgkinské lymfomy. Kromě toho se předmětný vynález týká způsobu identifikace aktivátorů nebo inhibitorů aktivace nebo stimulace T Iymfocytů.

Dosavadní stav techniky

V celém textu tohoto popisu je citováno několik dokumentů. Každý z těchto zde uvedených dokumentů (včetně všech popisů výrobce, instrukcí, atd.) je tedy zahrnut do odkazů, to ale neznamená, že citovaný dokument je opravdu dřívějším stavem techniky předkládaného vynálezu.

Navzdory zdravotní závažnosti, výzkum nemoci zprostředkovaných B lymfocyty, jako jsou například nehodgkinské lymfomy, přinesl pouze nevelký počet klinicky použitelných dat a obvyklé přístupy k léčbě podobných chorob zůstávají obtížné a nepříjemné a/nebo mají vysoké riziko relapsu. Například, ačkoli chemoterapie vysokými dávkami jako primární léčba nehodgkinských lymfomů vysokého stupně malignity může prodloužit celkové přežití, přibližně 50 % pacientů na tuto nemoc stále umírá (2-4). Kromě toho nehodgkinské lymfomy s nízkým stupněm malignity jako chronická lymfatická leukémie a lymfom buněk marginální zóny lymfatických uzlin jsou stále nevyléčitelné. To stimulovalo výzkum alternativních léčebných strategií, jako je například imunoterapie. Protilátky namířené proti molekulám buněčného povrchu definovaným CD antigeny představují jedinečnou možnost ve vývoji léčiv. Exprese určitých CD antigenů je vysoce omezena na specifickou linii lymfohematopoetických buněk a v uplynulých několika letech byly protilátky namířené proti antigenům specifickým pro lymfoidní tkáň používány pro vývoj léčby, která byla účinná buď in vitro, nebo ve zvířecích modelech (5-13). Z tohoto hlediska se ukázal být jako velmi užitečný cíl antigen CD 19. CD 19 je exprimován v celé linii B Iymfocytů od pre-B lymfocytu do stádia zralého B lymfocytu, jeho exprese se neztrácí, je jednotně exprimován na všech lymfomových buňkách, a na kmenových buňkách se nevyskytuje (8, 14). Zajímavý postup je použití bispecifické protilátky s jednou specifitou pro CD19 a druhou pro CD3 antigeny T lymfocytu. Ale bispecifické protilátky, které jsou zatím dostupné, mají nízkou cytotoxicitu pro T lymfocyty a potřebuji současně stimulující agens, aby projevily uspokojivou biologickou aktivitu.

Základním technickým problémem předkládaného vynálezu bylo tedy poskytnout přípravky a způsoby použitelné pro léčení nemocí zprostředkovaných B lymfocyty jako jsou například různé formy nehodgkinských lymfomů. Řešení uvedeného odborného problému je dosaženo provedením vynálezu, který je definován v dále uvedeném popisu a patentových nárocích.

- 1 CZ 302070 B6

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týkájednořetězcového multifunkčního polypeptidu který obsahuje:

(a) první doménu obsahující vazebné místo imunoglobu li nového řetězce nebo protilátky specificky rozpoznávající CD 19 antigen, a (b) druhou doménu obsahující vazebné místo imunoglobulinového řetězce nebo protilátky specificky rozpoznávající CD3 antigen lidských T buněk, io kde uvedené domény jsou uspořádány v pořadí V_LCD19-VnCD19-V₍|CD3-V|,CD3.

Ve výhodném provedení tohoto polypeptidu jsou dvě domény spojeny prostřednictvím polypeptidové spojky. Podle dalšího výhodného provedení první a/nebo druhá doména napodobuje nebo !5 odpovídá V_t| a V|, oblastí přirozené protilátky.

Podle dalšího výhodného provedení tohoto polypeptidu je protilátkou monoklonální protilátka, syntetická protilátka nebo humanizovaná protilátka.

2o Dále je podle předmětného vynálezu výhodný polypeptid, kde alespoň jedna z domén je jednořetězcový fragment variabilní oblasti protilátky.

Dále je podle předmětného vynálezu výhodný polypeptid, kde polypeptidová spojka obsahuje množství zbytků glycinu, alaninu a/nebo šeřinu. Výhodně tato polypeptidová spojka obsahuje množství po sobě následujících kopií aminokyselinové sekvence. Výhodně tato polypeptidová spojka obsahuje 1 až 5 aminokyselinových zbytků. Podle dalšího výhodného provedení tato polypeptidová spojka obsahuje aminokyselinovou sekvenci Gly Gly Gly Gly Ser.

Podle předmětného vynálezu je dále výhodný polypeptid, kde první doména obsahuje alespoň so jednu CDR z Vn a V_L oblasti zahrnující aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA sekvencí zobrazenou na obrázku 8 od nukleotidu 82 do 414 (VJ a nukleotidu 460 až 831 (V_H) a/nebo kde druhá doména obsahuje alespoň jednu CDR zV_H a V_L oblasti zahrnující aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA sekvencí zobrazenou na obrázku 8 od nukleotidu 847 do 1203 (V_H) a nukleotidu 1258 až 1575 (V_L).

Podle předmětného vynálezu je dále výhodný polypeptid, kde (a) vazebné místo první domény má afinitu přinejmenším 10’⁷ M, a/nebo to (b) vazebné místo druhé domény má afinitu menší než 10“⁷ M.

Podle dalšího výhodného provedení je tímto polypeptidem podle předmětného vynálezu bispecifickájednořetězcová protilátka.

Podle předmětného vynálezu je dále výhodný polypeptid, který obsahuje alespoň jednu další doménu. Výhodně je tato další doména připojená prostřednictvím kovalentní nebo nekovalentní vazby. Ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu tato alespoň jedna další doména obsahuje efektorovou molekulu mající konformaci vhodnou pro biologickou aktivitu, schopnou sekvestrace iontu nebo selektivní vazby na pevný podklad nebo k předem vybrané determinantě.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží póly nukleotid, který při expresi kóduje libovolný z výše definovaných polypeptidu podle předmětného vynálezu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží vektor obsahující tento výše definovaný poly55 nukleotid.

-2CZ 302070 B6

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží buňka transfekovaná výše definovaným polynukleotidem nebo výše definovaným vektorem.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy polypeptidu podle předmětného vynálezu, který obsahuje kultivaci výše definované buňky a izolaci polypeptidu z tkáňové kultury.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží prostředek, kterým je farmaceutický prostředek io nebo diagnostický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje libovolný výše definovaný polypeptid, polynukleotid nebo vektor.

Ve výhodném provedení je tímto prostředkem farmaceutický prostředek, který případně dále obsahující farmaceuticky přijatelnou nosičovou látku.

Podle dalšího výhodného provedení je tímto prostředkem diagnostický prostředek, který případně dále obsahuje činidla vhodná pro detekci.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití libovolného výše definovaného polypep2o tidu, póly nukleotidu nebo vektoru pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení malignit B lymfocytů, autoimunitních chorob se vztahem k B lymfocytům nebo deplece B lymfocytů.

Ve výhodném provedení tohoto použití je touto malignitou B lymfocytů nehodgkinský lymfom.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití libovolného výše definovaného polynukleotidu nebo vektoru pro výrobu přípravků pro genovou terapii.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob identifikace aktivátorů nebo inhibitorů aktivace nebo stimulace T lymfocytů, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje (a) pěstování T lymfocytů a CD 19 pozitivních buněk, výhodně B lymfocytů, v přítomnosti libovolného výše definovaného polypeptidu a případně v přítomnosti složky schopné poskytnout detekovatelný signál jako odpověď na aktivaci T lymfocytů testovanou sloučeninou v podmínkách umožňujících aktivaci T lymfocytů, a (b) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti signálu vzniklého interakcí sloučeniny s buňkami.

Termíny „první doména“ a „druhá doména“ podle předkládaného vynálezu znamenají, že jedno vazebné místo je namířeno proti obecnému markéru B lymfocytů CDI9, který je jednotně expri40 mován na převážné většině maligních B lymfocytů, a druhé vazebné místo je namířeno proti CD3 antigenu lidských T lymfocytů.

Termín „vazebné místo“, jak je používaný podle předkládaného vynálezu, je označením pro doménu obsahující trojrozměrnou strukturu schopnou specifické vazby k epitopu, jako nativní protilátky, volné scFv fragmenty nebo jeden z jejich odpovídajících i munog lobu li nových řetězců, výhodně řetězec Vh- Tedy, uvedená doména může zahrnovat Vh a/nebo V_L doménu protilátky nebo imunoglobulinového řetězce, výhodně alespoň doménu Vh- Na druhé straně, uvedená vazebná místa obsažená v polypeptidu podle vynálezu mohou zahrnovat alespoň jednu oblast určující komplementaritu (CDR) protilátky nebo imunoglobulinového řetězce rozpoznávající antigeny CD 19 a CD3. Domény vazebných míst přítomné v polypeptidu podle vynálezu mohou být odvozeny nejen z protilátek, ale také z jiných proteinů vázajících CD19 nebo CD3, jako jsou přirozeně se vyskytující povrchové receptory nebo ligandy. Podle vynálezu je uvedené vazebné místo obsažené v doméně.

-3 CZ 302070 B6

Termín „multifunkční polypeptid“, jak je používaný v tomto textu, je označením pro polypeptid obsahující alespoň dvě aminokyselinové sekvence pocházející z různých zdrojů, tj. ze dvou různých molekul, volitelně pocházejících z různých živočišných druhů, kde alespoň dva z uvedených zdrojů určují vazebná místa. Uvedená vazebná místa tedy určují funkce nebo alespoň někte5 ré funkce uvedeného multifunkčního peptidu. Takové póly peptidy zahrnují například bi specifické jednořetčzcové (bsc) protilátky.

Termín ,jednořetězcový“, jak je používaný podle předkládaného vynálezu, znamená, že uvedená první a druhá doména polypeptidu jsou kovalentně spojeny, výhodně ve formě souvislé lineární io aminokyselinové sekvence kódované molekulou nukleové kyseliny.

CD 19 označuje antigen, který je exprimován v řadě B, jako například v pre-B lymfocytech a zralých B lymfocytech, neztrácí expresi, je jednotně exprimován na všech lymfomových buňkách a chybí na kmenových buňkách (8, 14).

CD3 označuje antigen, který je exprimován na T lymfocytech jako část multimolekulárního komplexu receptoru T lymfocytů a který se skládá ze tří různých řetězců CD3c, CD3ó a CD3y. Shlukování CD3 na T lymfocytech, např. prostřednictvím i mobilizovaných anti-CD3-protilátek, vede k aktivaci T lymfocytů podobné zapojení receptoru T lymfocytů, ale nezávislé na spécifitě typické pro jeho klon. Ve skutečnosti většina anti-CD3-protilátek rozpoznává řetězec CD3e.

Protilátky, které specificky rozpoznávají CD 19 nebo CD3 antigen, jsou popsány ve stavu techniky, např. ve (24), (25) a (43), v daném pořadí, a mohou být tvořeny obvyklými způsoby v oboru známými.

Již bylo ukázáno, že bi specifické CD19XCD3 protilátky, které nemají jednořetězcovou strukturu, vykonávají T—buněčnou cytotoxicitu na lymfomových buňkách způsobem nezávislým na MHC, jsou účinné in vitro (5, 6, 9-11,13, 43), na zvířecích modelech (7, 28), jakož i v některých pilotních klinických zkouškách (12, 29, 30). Doposud tyto protilátky byly tvořeny pomocí metod hybrid-hybridom, kovalentní vazbou monoklonálních protilátek (31) nebo technikou vzniku tzv. „diabody“ (43). Rozsáhlejší klinické studie byly limitované skutečností, že tyto protilátky mají nízkou biologickou aktivitu, takže muselo být použito vysoké dávkování, a že používání těchto protilátek samotných neposkytovalo užitečný léčebný účinek. Kromě toho byla omezena dostupnost materiálu klinické úrovně.

Bez vazby na konkrétní teorii, má se za to, že při použití struktury bispecifické protilátky, jak je definována výše, takto vytvářené polypeptidy, jako například bispecifické protilátky CD19XCD3, jsou obvykle schopné ničit CD19-pozitivní cílové buňky prostřednictvím doplňování cytotoxických T lymfocytů bez potřeby předběžné stimulace a/nebo současné stimulace T to lymfocytů. To je v ostrém protikladu ke všem známým bispecifickým CD19XCD3 protilátkám vyráběných podle jiných molekulových struktur a obvykle nezávisí na specifitě konkrétních

CD19 neboCD3 protilátek použitých pro konstrukci, např. bispecifické jednořetězcové protilátky. Nezávislost na předběžné stimulace a/nebo současné stimulace T lymfocytů může značně přispět k výjimečně vysoké cytotoxicitě zprostředkované polypeptidem podle vynálezu, jak je doloženo příkladem konkrétní CD19XCD3 bispecifické protilátky popsané v příkladech.

Další výhodná vlastnost polypeptidu podle vynálezu je ta, že jeho malou, poměrně kompaktní strukturuje snadné produkovat a purifikovat, tím se obejdou problémy nízké výtěžnosti, výskyt nejasně vymezených vedlejších produktů, nebo těžkopádné purifikační postupy (15—19) publiko50 váné pro CD19XCD3 specifické protilátky doposud vyrobené z hybrid-hybridomů, pomoct chemické vazby nebo prostřednictvím renaturace z bakteriálních inkluzních tělísek. V následujícím textu budou výhodné a neočekávané vlastnosti polypeptidu podle vynálezu diskutovány bez omezení, doprovázené připojenými příklady včetně některých výhodných provedení vynálezu, na která se odkazuje níže, která objasní obsáhlé pojetí předkládaného vynálezu,

-4CZ 302070 B6

Podle předkládaného vynálezu byl použit eukaryotický expresní systém, který byl vyvinutý pro produkci rekombinantních bispecifických jednořetězcových protilátek (1), aby vytvářel rekombinantní bispecifickou CD19XCD3 jednořetězcovou protilátku prostřednictvím exprese v buňkách CHO. Plně funkční protilátka byla snadno purifikována ze supematantu tkáňové kultury pomocí své histidinové značky na C-konci na chromatografické koloně Ni-NTA. Specifická vazba na CD 19 a CD3 byla dokázána prostřednictvím FACS analýzy. Výsledná molekula bscCD19xCD3 (bispecifická jednořetězcová CD19XCD3) podle vynálezu prokázala některé neočekávané vlastnosti:

-navodila vysokou cytotoxicitu proti lymfomům namířenou na T lymfocyty in vitro a in vivo. Dokonce i při velmi nízkých koncentracích 10-100 pg/ml a nízkém poměru E (efektor) : T (cíl) 5:1 a 2,5:1 byla pozorována významná specifická lýze lymfomových buněčných linií. Kromě toho, 3 pg až 10 pg molekuly bscCD19xCD3 podle vynálezu pří soucitném podání ukázalo zřetelné a významné zlepšení zdravotního stavu. Ve srovnání s až doposud publikovanými CD19XCD3 protilátkami vyrobenými prostřednictvím metody hybridu-hybrtdomu nebo pomocí přístupu s „diabody“ (které také představují různou strukturu), které vykazovaly cytotoxickou aktivitu v rozmezí několika ng/ml nebo dokonce pg/ml, bscCD19xCD3 protilátka podle vynálezu se jeví mnohem účinnější (5—7, 27, 43) jak doloženo např. v připojených příkladech 4, 5 a 7.

-dokonce i nízké koncentrace bscCD19xCD3 podle vynálezu byly schopny navodit rychlou cytotoxicitu namířenou proti lymfomu (po 4 hodinách) pri nízkém poměru E:T bez potřeby jakékoliv předběžné stimulace T lymfocytů. Na rozdíl od toho obvyklá CD19XCD3 bispecifická protilátka (5-7, 27) nevykázala v těchto podmínkách (totiž žádná předběžná stimulace T lymfocytů, nízký poměr E:T) významnou cytotoxickou aktivitu dokonce i při vysokých koncentracích až 3000 ng/ml. Ačkoli indukce cytotoxické aktivity bez předběžné stimulace byla také publikovaná v případě jiné konvenční CD19XCD3 protilátky, byl tento účinek dosažen pouze při vysokých koncentracích a vysokém poměru E:T (100 ng/ml, 27:1) (9) ve srovnání s bscCDI9xCD3 podle vynálezu (100 pg/ml, 2,5:1). Kromě toho byl cytotoxický účinek této konvenční protilátky pozorovaný pouze po 1 dni předběžné stimulace s bispecifickou protilátkou samotnou, zatímco bscCD19xCD3 podle vynálezu indukovala cytotoxicitu namířenou proti lymfomu již po 4 hodinách. Co se týče znalosti původců vynálezu, taková rychlá a specifická cytotoxická aktivita nestimu lovaných T lymfocytů při takových nízkých koncentracích a poměru E:T nebyla popsána u jiných bispecifických protilátek doposud používaných. Ačkoli nedávno bylo ukázáno, že anti— p!85HER2/anti-CD3 bispecifická F(ab)2 protilátka indukovala cytotoxickou aktivitu v podobných koncentracích jako bscCD19xCD3 podle vynálezu, tato protilátka vyžadovala 24 hodinovou předběžnou stimulaci s IL-2 (32). Tudíž, bscCD19xCD3 protilátka podle vynálezu projevila jedinečné cytotoxické vlastnosti, které tuto molekulu odlišují od jiných bispecifických protilátek, které byly popsány.

BscCD19xCD3 podle vynálezu zprostředkovává cytotoxické účinky, které jsou specifické pro antigen, což je dokázáno fakty

- že tato protilátka selhala při lýze plasmacytomových buněčných linií NC1 a L363, což jsou buněčné linie B řady neexprimující CD 19 antigen, a

-že cytotoxicita proti lymfomovým buňkám může být blokována základní anti-CD19 protilátkou HD37. (HD37 protilátka je odvozená z HD37 hybridomu (22)).

Blokování metabolické dráhy perforinu prostřednictvím deprivace vápníku s EGTA zcela zastavilo bscCD19xCD3 zprostředkovanou cytotoxicitu, což svědčí pro to, že specifická lýze je spíše účinek zprostředkovaný T lymfocyty než přímý účinek protilátky samotné.

Souhrnem, bscCD19xCD3 protilátka konstruovaná podle nauky vynálezu vyniká nad až dosud popsané CD19XCD3 bispecifické protilátky vzhledem ke značně vyšší biologické aktivitě, jakož

-5 CZ 302070 B6 i možnosti rychlé a snadné produkce, čímž je poskytnuto dostačující množství klinického materiálu vysoké jakosti.

Proto se očekává, že bscCDI9xCD3 molekuly podle vynálezu jsou vhodným kandidátem pro průkaz terapeutického prospěchu bispeciťických protilátek v léčení nemocí zprostředkovaných B lymfocyty, jako například nehodgkinské lymfomy, v klinických zkouškách.

Ve výhodném provedení polypeptidu podle vynálezu jsou uvedené domény spojeny polypeptidovou spojkou. Uvedená spojka je umístěna mezi uvedenou první a uvedenou druhou doménu, io kde uvedená polypeptidová spojka výhodně zahrnuje několikeré, hydrofilní, peptidem vázané aminokyseliny a spojuje N-koncovou část uvedené první domény a C-koncovou část uvedené druhé domény.

V dalším výhodném provedení vynálezu uvedená první a/nebo druhá doména výše popsaného is polypeptidu napodobuje nebo odpovídá oblastem V_H a V_L přirozené protilátky. Protilátka poskytující vazebné místo pro polypeptid podle vynálezu může být např. monoklonální protilátka, polyklonální protilátka, chimérická protilátka, humanizovaná protilátka, bispecifická protilátka, syntetická protilátka, fragment protilátky, jako například Fab, Fv nebo scFv fragmenty atd., nebo chemický modifikovaný derivát kterékoliv z nich. Monoklonální protilátky mohou být připrave2o ny například metodami, jak byly původně popsány v Kóhler a Milstein (Nátuře, 256, 495, 1975) a Galfré (Meth, Enzymol., 73, 3, 1981), které zahrnují fúze myších myelomových buněk s buňkami sleziny pocházejících z imunizovaných savců s modifikacemi v oboru vyvinutými. Kromě toho, protilátky nebo jejich fragmenty proti dříve uvedeným anti genům mohou být získány použitím metod, které jsou popsány např. v Harlow a Lané („Antibodies, Laboratory Manual“,

CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988). Protilátky mohou pocházet z několika druhů, včetně člověka. Když jsou deriváty uvedených protilátek získány metodou vystavování na fágu (fagový displej), může být ke zvýšení účinnosti fágových protilátek, které se vážou k epitopu CD 19 nebo antigenu CD3 použita povrchová plasmonová rezonance, jak využívána systémem BIACORE (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7, 97-105, 1996, Malmborg, J. ImmunoL Methods 183, io 7-13, 1995). Produkce chimérických protilátek je popsána například v mezinárodní patentové přihlášce WO 89/09 622. Způsoby produkce humanizovaných protilátek jsou popsány v např. v přihláškách EP-A1 0 239 400 a WO 90/07 861. Další zdroj protilátek používaných podle předkládaného vynálezu jsou takzvané xenogenní protilátky. Obecný princip pro produkci xenogenních protilátek, jako například lidských protilátek v myších, je popsaný např. v přihláškách

WO 91/10 741, WO 94/02 602, WO 96/34 096 a WO 96/33 735.

Protilátky použité podle vynálezu nebo jejich odpovídající imunoglobulinový řetězec (řetězce) mohou být dále modifikovány s použitím obvyklých metod v oboru známých, například s použitím delece aminokyseliny (aminokyselin), inzerce (í), substituce (í), adice (í), a/nebo rekombina40 ce (í) a/nebo každé jiné modifikace (í) v oboru známé buď samotné, nebo v kombinaci. Metody pro zavedení takové modifikace do sekvence DNA určující aminokyselinovou sekvenci imunoglobulinového řetězce jsou odborníkovi známy (viz např. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y., 1989). Uvedené modifikace jsou výhodně prováděny na úrovni nukleové kyseliny.

V dalším výhodném provedení vynálezu je alespoň jedna z uvedených domén ve výše popsaném polypeptidu jednořetězcový fragment variabilní oblasti protilátky.

Jakje dobře známo, Fv, nejmenší protilátkový fragment, který obsahuje kompletní místo pro roz50 poznávání a vazbu antigenu, se skládá z dimeru variabilních domén jednoho těžkého a jednoho lehkého řetězce (V_H a V_L) ne koval entně spojených. V této konfiguraci, která odpovídá konfiguraci nalezené u nativních protilátek, vzájemně interagují tri oblasti určující komplementaritu (CDRs) každé variabilní domény, čímž definují místo vázající antigen na povrchu dimeru V_H-V_L. Souhrnně, šest CDRs propůjčí protilátce vazebnou specifitu pro antigen. Rámce (FRs) ohraniču55 jící CDRs mají terciární strukturu, která je v podstatě uchována v nativních imunoglobulinech

-6CZ 302070 B6 živočišných druhů tak různorodých jako člověk a myš. Tyto FRs slouží k tomu, aby udržovaly CDRs v jejich příslušné orientaci. Konstantní domény nejsou vyžadované pro vazebnou funkci, ale mohou napomáhat při stabilizaci interakce Vh-V_l. Dokonce i jediná variabilní doména (nebo polovina Fv obsahující pouze tři CDRs specifické pro antigen) má schopnost rozpoznat a vázat antigen, ačkoli obvykle pri nižší afinitě než celé vazebné místo (Painter, Biochem., 11, 1327— 1337, 1972). Proto uvedená doména vazebného místa polypeptidů podle vynálezu může být dvojice domén Vh-V_l, V_h-V_h nebo Vl~V_l buď stejných nebo odlišných imunoglobulinů. Uspořádání domén V_H a V_L v polypeptidovém řetězci není pro předkládaný vynález rozhodující, uspořádání domén dané výše může být obráceno obvykle bez ztráty funkce. Avšak je důležité, že domelu ny V_H a V_L jsou uspořádány tak, že místo vázající antigen se může správně prostorově uspořádat (folding).

Ve výhodném provedení polypeptidů podle vynálezu uvedené domény jsou uspořádány v pořadí V_lCD19-VhCD19-V_hCD3-VlCD3, kde „V_L“ a „V_H“ znamená lehký a těžký řetězec variabilní domény specifických anti-CD19 a anti-CD3 protilátek.

Jak bylo již pojednáno výše, uvedená vazebná místa jsou výhodně spojena flexibilní spojkou, výhodně polypeptidovou spojkou umístěnou mezi uvedenými doménami, přičemž uvedená polypeptidová spojka zahrnuje několikeré, hydrofilní, peptidem vázané aminokyseliny o délce posta20 čující k překlenutí vzdálenosti mezi C-koncovou částí jedné z uvedených domén obsahující uvedené vazebné místo a N-koncovou částí druhé z uvedených domén obsahující uvedené vazebné místo, když polypeptid podle vynálezu přijme strukturu vhodnou pro vazbu při umístění ve vodném roztoku. Výhodně se uvedená polypeptidová spojka skládá z velkého množství glycinových, alaninových a/nebo serinových zbytků. Je dále výhodné, že uvedená polypeptidová spojka se skládá z velkého množství konsekutivních kopií aminokyselinové sekvence. Obvykle se polypeptidová spojka skládá z 1 až 15 aminokyselin, ačkoli polypeptidová spojka o více než 15 aminokyselinách se může také osvědčit. Ve výhodném provedení vynálezu se uvedená polypeptidová spojka skládá z 1 až 5 aminokyselinových zbytků.

V obzvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu polypeptidová spojka v polypeptidů podle vynálezu obsahuje 5 aminokyselin. Jak je ukázáno v připojených příkladech, uvedená polypeptidová spojka se výhodně skládá z aminokyselinové sekvence Gly Gly Gly Gly Ser.

V dalším mimořádně výhodném provedení uvedená první doména polypeptidů podle vynálezu obsahuje alespoň jednu CDR V_H a V_L oblasti zahrnující aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA sekvencí ukázanou na obrázku 8 od nukleotidu 82 do nukleotidu 414 (V_L) a nukleotidu 460 až 831 (V_H) a/nebo uvedená druhá doména obsahuje alespoň jednu CDR, výhodněji dvě, nej výhodněj i tři CDRs V_H a V_L oblasti obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA sekvencí zobrazenou na obrázku 8 od nukleotidu 847 až nukleotidu 1203 (V_H) a nukleotidu 1258 až 1575 (V_L), volitelně v kombinaci s rámcem oblastí, které se vyskytují zároveň s uvedenými CDRs v základních protilátkách. CDRs obsažené ve variabilních oblastech zobrazených na obrázku 8 mohou být určeny například podle autora Kabat („Sequences of Proteins of Immunological Interest“, U. S. Department of Health and Human Services, třetí vydání, 1983, čtvrté vydání, 1987, páté vydání, 1990). Odborník hned ocení, že vazebné místo nebo alespoň jedna

CDR z něj vycházející mohou být použity pro konstrukci polypeptidů podle vynálezu. Výhodně uvedený polypeptid zahrnuje aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA sekvenci, jak je ukázána na obrázku 8, od nukleotidu 82 až 1575, Odborník hned ocení, že vazebné místo polypeptidu podle vynálezu může být konstruováno podle metod v oboru známých, např. jak byly popsány v Evropských patentech EP-A1 0 451 216 a EP-A1 0 549 581.

Domény vazebných míst polypeptidů podle vynálezu výhodně mají specifitu alespoň v podstatě identickou s vazebnou specifitou např. protilátky nebo imunoglobulinového řetězce, od kterého jsou odvozeny. Takové domény vazebného místa mohou mít vazebnou afinitu alespoň 10⁵M^_l, výhodně ne vyšší než 10⁷M ¹ pro antigen CD3 a výhodně až 10^IOM^_1 nebo vyšší pro antigen

CD19,

-7 CZ 302070 B6

Ve výhodném provedení polypeptídu podle vynálezu (a) uvedené vazebné místo první domény má afinitu alespoň přibližně 10 ⁷M, výhodně alespoň přibližně 10 a nejvýhodněji alespoň přibližné 10 ^llM, a/nebo (b) uvedené vazebné místo druhé domény má afinitu menší než přibližně 10 ⁷M, výhodně menší než přibližně 10 ^hM a nejvýhodněji řádově 10 ^?M.

io Ve shodě s výhodnými provedeními uvedenými výše je výhodné, jestliže vazebné místo rozpoznávající antigen CD19 má vysokou afinitu, aby byly s vysokou účinnosti zachyceny cílové buňky, které mají být zničeny. Na druhé straně, vazebná afinita vazebného místa rozpoznávajícího antigen CD3 by měla být řádově taková, jako je afinita přirozeného receptoru CD3 nebo receptoru obvykle nalézaného při interakci T-buněčného receptoru se svým ligandem, to jest peptido15 vým komplexem MHC na povrchu cílové buňky.

V jiném výhodném provedení vynálezu je polypeptid popsaný výše bispecifická jednořetězcová protilátka.

Předkládaný vynález se dále týká polypeptídu obsahujícího alespoň jednu další doménu, uvedené domény jsou spojené prostřednictvím kovalentních nebo nekovalentních vazeb.

Vazba může být založena na genetické fúzi podle metod v oboru známých a výše popsaných nebo může být provedena prostřednictvím, např. chemického zesítění (crosslinking), jak bylo popsáno například v patentové přihlášce WO 94/04 686. Další doména přítomná v polypeptídu podle vynálezu může být výhodně připojena flexibilní spojkou, výhodně polypeptidovou spojkou k jedné z domén vazebného místa, kde uvedená polypeptidová spojka zahrnuje několikeré, hydrofilní, peptidem vázané aminokyseliny o délce postačující k překlenutí vzdálenosti mezi C-koncovou částí jedné z uvedených domén a Nkoncovou částí druhé z uvedených domén, když uve50 děný polypeptid přijme strukturu vhodnou pro vazbu při umístění ve vodném roztoku. Výhodně uvedená polypeptidová spojka je polypeptidová spojka, jak popsáno v provedeních výše. Polypeptid podle vynálezu může dále obsahovat štěpitelnou spojku nebo štěpné místo pro proteinázy, jako například enterokinázy, viz také připojené příklady.

Kromě toho uvedená další doména může mít předem definovanou specifitu nebo funkci. Například literatura obsahuje velké množství odkazů na způsoby cílení bioaktivních látek, jako například léků, toxinů a enzymů, na specifická místa v organismu za účelem zničit nebo lokalizovat maligní buňky nebo indukovat lokalizovaný lék nebo enzymatické působení. Bylo navrženo, jak dosáhnout tohoto účinku pomocí konjugace bioaktivní látky k monoktonálním protilátkám (viz, např., N.Y. Oxford University Press, aGhose, J. Nati. Cancer Inst. 61,657-676, 1978).

V této souvislosti se také rozumí, že polypeptidy podle vynálezu mohou být dále modifikovány prostřednictvím obvyklých metod v oboru známých. To umožňuje konstrukce chimérických proteinů obsahujících polypeptid podle vynálezu a další funkční aminokyselinové sekvence, např.

jaderné lokalizační signály, transaktivační domény, DNA-vazebné domény, hormony vázající domény, proteinové značky (GST, GFP, peptid h-myc, FLAG, peptid HA), které mohou být odvozeny z heterologních proteinů. Jak je popsáno v připojených příkladech, polypeptid podle vynálezu výhodně obsahuje značku FLAG dlouhou přibližně 8 aminokyselin, viz obrázek 8.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být používány léčebně u pacientů trpících chorobami B lymfocytů, jako lymfom pocházející z lymfocytů B, chronická lymfatická leukémie typu Β (BCLL) a/nebo u pacientů majících autoimunitní choroby se vztahem k B lymfocytům, jako například myasthenia gravis, Basedowova nemoc, Hashimotova thyreoiditis nebo Goodpastureův syndrom. Taková léčba může být uskutečněna například pomocí podávání polypeptidů podle vyná55 lezu. Toto podávání může použít polypeptidy neoznačené i označené.

-8CZ 302070 B6

Například polypeptidy podle vynálezu mohou být podávány značené léčebným přípravkem. Tyto přípravky mohou být spojeny buď přímo, nebo nepřímo s protilátkami nebo antigeny podle vynálezu, Jeden příklad nepřímé vazby je použití distanční skupiny (spacer). Tyto distanční skupiny mohou být střídavě buď nerozpustné, nebo rozpustné (Diener, Science, 231, 148, 1986) a mohou být vybrány tak, aby umožnily uvolnění léku od antigenu v cílovém místě. Příklady terapeutických přípravků, které mohou být spojeny s polypeptidy podle vynálezu pro imunoterapii, jsou léky, radioizotopy, lektiny a toxiny. Léky, které mohou být konjugovány s polypeptidy podle vynálezu, zahrnují sloučeniny, které se klasicky přiřazují k lékům, jako například mitomycin C, daunorubicin a vinblastin.

Při použití polypeptidu podle vynálezu konjugovaných s radioizotopy pro např. imunoterapii jsou určité izotopy vhodnější než jiné, v závislosti na takových faktorech jako je distribuce leukocytů, stejně jako stabilita a emise. Co se týče autoimunitní reakce, některé zářiče mohou být vhodnější než jiné. Obecně vzato v imunoterapii jsou upřednostňovány radioizotopy emitující částice a a β.

Výhodné jsou a zářiče krátkého dosahu a vysoké energie, jako například ²¹²Bi. Příklady radioizotopů, které mohou být vázány na polypeptidy podle vynálezu pro léčebné účely, jsou ¹²⁵I, ¹³¹1,

Lektiny jsou proteiny obvykle izolované z rostlinného materiálu, které se vážou na specifické sacharidové skupiny. Mnoho lektinů je také schopno aglutinovat buňky a stimulovat lymfocyty. Ricin je toxický lektin, ktetý byl používaný imunoterapeuticky. To je prováděno vazbou a-peptidového řetězce ricinu, který je odpovědný za toxicitu, k polypeptidu, aby se umožnilo místně specifické toxické působení.

Toxiny jsou jedovaté látky produkované rostlinami, zvířaty nebo mikroorganismy, které jsou v přiměřené dávce často smrtelné. Difterický toxin je látka tvořena Corynebacterium diphtheria, která může být používána léčebně. Tento toxin se skládá z podjednotek a a β, které mohou být odděleny ve vhodných podmínkách. Toxická složka A může být navázána k polypeptidu podle vynálezu a může být použita pro místně specifické podání k interagujícím B a T lymfocytům, které byly přivedeny do její těsné blízkosti pomocí vazby k polypeptidu podle vynálezu.

Další léčebné přípravky, jako ty popsané výše, které mohou být připojovány k polypeptidu podle vynálezu, jakož i odpovídající ex vivo a in vivo léčebné protokoly, jsou známy nebo mohou být odborníkem snadno zjištěny. Kdekoliv je to vhodné, může odborník použít polynukleotid podle vynálezu níže popsaný, který kóduje kterýkoliv z výše popsaných polypeptidů nebo místo samotného proteinového materiálu mohou být použity odpovídající vektory.

Odborník tedy hned ocení, že polypeptid podle vynálezu může být použit pro konstrukci dalších polypeptidů požadované specifity a biologické funkce. Očekává se, že polypeptidy podle vynálezu budou mít důležitou léčebnou a vědeckou úlohu zvláště ve zdravotnictví, například při vývoji nových léčebných přístupů k chorobám se vztahem k B lymfocytům, jako například určité formy karcinomu a autoimunitních nemocí, nebo jako zajímavé nástroje pro analýzu a modulaci odpovídajícího buněčného signálu transdukčních metabolických drah.

V dalším výhodném provedení vynálezu obsahuje uvedená alespoň jedna další doména molekulu vybranou ze skupiny skládající se z efektorových molekul s konformací vhodnou pro biologickou aktivitu, aminokyselinových sekvencí schopných sekvestrovat iont a aminokyselinových sekvencí schopných selektivní vazby na pevný podklad nebo k předem vybranému antigenu.

Uvedená další doména obsahuje výhodně enzym, toxin, receptor, vazebné místo, vazebné místo pro biosyntetickou protilátku, růstový faktor, buněčný diferenciační faktor, lymfokin, cytokin, hormon, vzdáleně detekovatelnou skupinu, antimetabolit, radioaktivní atom nebo antigen. Uvedený antigen může být např. nádorový antigen, virový antigen, mikrobiální antigen, alergen, autoantigen, virus, mikroorganismus, polypeptid, peptid nebo velké množství nádorových buněk.

-9 CZ 302070 B6

Kromě toho uvedená sekvence schopná sekvestrovat iont je výhodně vybrána z kalmodulinu, metalothioneinu, jejich funkčního fragmentu nebo aminokyselinové sekvence bohaté na přinejmenším jednu z kyselin, a to kyseliny glutamové, kyseliny asparagové, lysinu a argininu.

Kromě toho uvedená polypeptidová sekvence schopná selektivní vazby k pevnému podkladu nuíže být pozitivně nebo negativně nabitá aminokyselinová sekvence, aminokyselinová sekvence obsahující cystein, avidin, streptavidin, funkční fragment proteinu Staphylococcus A, GST, značka His, značka FLAG nebo Lex A. Jak je popsáno v připojených příkladech, polypeptid podle vynálezu vysvětlený na příkladu jednořetězcové protilátky byl také exprimován s N-koneovou značkou FLAG a/nebo C-koncovou značkou His, které umožnily snadnou purifikaci a detekci. Značka FLAG používaná v příkladu obsahuje 8 aminokyselin (viz obrázek 8) a je tak výhodně použita podle předkládaného vynálezu. Ale jsou také vhodné značky FLAG skládající se ze zkrácených verzí FLAG používaných v připojených příkladech, jako například aminokyselinová sekvence Asp-Tyr-Lys-Asp.

Lfektorové molekuly a aminokyselinové sekvence popsané výše mohou být přítomné v polotovaru nebo prekurzorů (proforma), který samotný je buď aktivní, nebo neaktivní, a které mohou být odstraněny, když např. vstoupí do určitého buněčného prostředí.

V nejvýhodnějším provedení podle vynálezu je uvedený receptor současně stimulující povrchová molekula důležitá pro aktivaci T lymfocytů nebo obsahuje místo vázající epitop nebo místo vázající hormon.

V dalším nejvýhodnější provedení vynálezu, uvedená současně stimulující povrchová molekula je CD80 (B7-1) nebo CD86 (B7-2).

V ještě dalším provedení se předkládaný vynález týká polynukleotidů, které při expresi kódují výše popsané polypeptidy. Uvedené polynukleotidy mohou být fúzovány k vhodné expresní kontrolní sekvenci v oboru známé, aby zajistily vlastní transkripci a translaci póly peptidu.

Uvedený polynukleotid může být např. DNA, cDNA, RNA nebo synteticky vyrobená DNA či RNA nebo rekombinantně vyrobená chimérická molekula nukleové kyseliny zahrnující jakýkoliv z polynukleotidů buď samotný, nebo v kombinaci. Uvedený polynukleotid je výhodně část vektoru. Takové vektory mohou zahrnovat další geny, jako například markerové geny, které umožní selekci uvedeného vektoru ve vhodné hostitelské buňce a ve vhodných podmínkách. Výhodně je polynukleotid podle vynálezu operativně připojen k expresní kontrolní sekvenci umožňující expresi v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách. Exprese uvedeného polynukleotidu zahrnuje transkripci polynukleotidů do translatovatelné mRNA. Regulační prvky zajišťující expresi v eukaryotických buňkách, výhodně savčích buňkách, jsou dobře odborníkovi známy. Obvykle zahrnují regulační sekvence zajišťující začátek transkripce a volitelně poly-A signály zajišťující ukončení transkripce a stabilizaci transkriptu. Další regulační prvky mohou zahrnovat transkripční stejně jako translační zesilovače, a/nebo přirozeně přidružené nebo heterologní promotorové oblasti. Možné regulační prvky připouštějící expresi v prokaryotických hostitelských buňkách zahrnují např. promotor PL, lac, trp nebo tac v E. coli, a příklady regulačních prvků umožňujících expresi v eukaryotických hostitelských buňkách jsou promotory AOX1 nebo GAL1 ve kvasinkách nebo promotor CMV, SV40, RSV (Rous sarcoma virus), zesilovač CMV, zesilovač SV40 nebo globinový intron v buňkách savců a dalších zvířat. Kromě prvků, které jsou odpovědné za počátek transkripce, mohou tyto regulační prvky také zahrnovat transkripční terminační signály, jako například místo SV40-polyA nebo místo tk-poly-A, po směru transkripce od polynukleotidů. Kromě toho v závislosti na použitém expresním systému mohou být ke kódující sekvenci polynukleotidů podle vynálezu přidány vedoucí sekvence schopné směrování polypeptidu k buněčnému kompartmentů nebo sekrece polypeptidu do média a jsou v oboru dobře známy, viz také např. připojené příklady. Vedoucí sekvence je (jsou) sestaveny ve vhodné fázi s translační mi, iniciačními a terminačními sekvencemi a výhodně vedoucí sekvencí schopnou

- 10CZ 302070 B6 řízené sekrece translatovaného proteinu nebo jeho části do periplazmatického prostoru nebo extracelulámího média. Heterologní sekvence mohou volitelně kódovat fúzní protein včetně Nkoncového identifikačního peptidu propůjčujícího požadované vlastnosti, např. stabilizaci nebo zjednodušenou purifikaci exprimovaného rekombinantního produktu, viz výše. V této souvislosti, vhodné expresní vektory jsou v oboru známy, jako například cDNA expresní vektor pcDVl podle Okayamy-Berga (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-Vitrogene) nebo pSPORTl (GIBCO BRL).

Expresní kontrolní sekvence jsou výhodně eukaryotické promotorové systémy ve vektorech schopných transformovat nebo transfekovat eukaryotické hostitelské buňky, ale kontrolní sekvence pro prokaryotické hostitele mohou být také použity. Jakmile byl vektor zaveden do vhodného hostitele, je hostitel udržován v podmínkách vhodných pro vysokou expresi nukleotidové sekvence, a je-li žádoucí, může následovat sběr a purifikace polypeptidu podle vynálezu, viz např. připojené příklady.

Jak bylo popsáno výše, polynukleotid podle vynálezu může být použit samotný nebo jako část vektoru pro expresi polypeptidu podle vynálezu v buňkách pro např. genovou terapii nebo diagnostiku nemocí se vztahem k B lymfocytům. Polynukleotidy nebo vektory obsahující DNA sekvence kódující jakýkoliv z výše popsaných polypeptidů jsou zavedeny do buněk, které dále produkují požadovaný polypeptid. Genová terapie, která je založena na zavedení terapeutických genů do buněk prostřednictvím ex vivo nebo in vivo metod, je jednou z nej důležitějších aplikací genového přenosu. Vhodné vektory, metody nebo systémy pro podávání genů pro in vitro nebo in vivo genovou terapii jsou popsány v literatuře a jsou odborníkovi známy (viz např. Gtordano, Nátuře Medicine, 2, 534-539, 1996, Schaper, Circ. Res,, 79, 911-919, 1996, Anderson, Science, 256, 808-813, 1992, Verma, Nátuře, 389, 239, 1994, Isner, Lancet, 348, 370-374, 1996, Muhlhauser, Circ. Res., 77, 1077-1086, 1995, Onodera, Blood, 91, 30-36, 1998, Verma, Gene Ther., 5, 692-699, 1998, Nabel, Anna. N.Y. Acad. Sci., 811, 289-292, 1997, Verzeletti, Hum. Gene Ther., 9, 2243-51, 1998, Wang, Nátuře Medicine, 2, 714-716, 1996, WO 94/29 469, WO 97/00 957, US 5 580 859, US 5 589 466, nebo Schaper, Current Opinion in Biotechnology, 7, 635-640, 1996, a odkazy v nich citované). Polynukleotidy a vektory podle vynálezu mohou být navrženy pro přímé zavedení nebo pro zavedení prostřednictvím lipozomů nebo virových vektorů (např. adenovirových retro víro vých) do buňky.

Uvedená buňka je výhodně buňka zárodečné linie, embryonální buňka nebo vajíčko nebo buňka z nich pocházející, nejvýhodněji uvedená buňka je kmenová buňka. Příklad embryonální kmenové buňky může být, inter a/ia, kmenová buňka jak je popsaná v práci autora Nagy (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 8424-8428, 1993).

Podle výše uvedeného se předkládaný vynález týká vektorů, zejména plazmidů, kozmidů, virů a bakteriofágů obvykle používaných v genetickém inženýrství, které obsahují polynukleotid kódující polypeptid podle vynálezu. Uvedený vektor je výhodně expresní vektor a/nebo vektor pro genový přenos nebo cílící (targeting) vektor. Expresní vektory odvozené z virů, například retrovirů, viru vakcinie, adeno-asociovaných virů, herpetických virů nebo viru bovinního papilomu, mohou být použity pro dodání póly nukleotidů nebo vektoru podle vynálezu do populací cílových buněk. Metody, který jsou odborníkovi dobře známy, mohou být používány ke konstrukci rekombinantních vektorů, viz například metody popsané v práci Sambrooka a kol. (Molecular Clon ing: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y., 1989, a Ausubela a kol., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989). Nebo mohou být polynukleotidy a vektory podle vynálezu pro dodání k cílovým buňkám rekonstituovány do lipozomů. Vektory obsahující polynukleotidy podle vynálezu mohou být přeneseny do hostitelské buňky prostřednictvím známých metod, které se mění v závislosti na typu buněčného hostitele. Například transfekce chloridem vápenatým je obvykle použita pro prokaryotické buňky, zatímco ošetření fosfátem vápenatým nebo elektroporace mohou být použity pro jiné buněčné hostitele, viz Sambrook, výše. Jakmile jsou exprimovány, mohou být polypeptidy podle předkládaného vynálezu purifikovány podle v oboru standardního postupu, včetně

- ll CZ 302070 B6 precipitace sulfátem amonným, na afinitu ich kolonách, sloupcovou chromatografií, gelovou clektroforézou apod. (viz Scopes, „Protein Purification“, Spr i nger-Verlag, N.Y., 1982). Pro farmaceutické použití jsou výhodné v podstatě čisté polypeptidy s homogenitou alespoň 90 až 95 %, nejvýhodnější jsou s homogenitou 98 až 99 % nebo více. Jakmile jsou jednou purifikovány, čás5 tečně nebo na požadovanou homogenitu, mohou být polypeptidy pak používány léčebně (včetně tni motel ního přístupu) nebo při vývoji a provádění testů.

V ještě další provedení se předkládaný vynález týká buňky obsahující polynukleotid nebo vektor popsaný výše. Když se uvažuje o léčebných použitích polypeptidů, je uvedená buňka výhodně io eukaryotická, nejvýhodněji savčí buňka. Ovšem kvasinky a méně výhodné prokaryotické např. bakteriální buňky mohou také posloužit, zejména jestliže produkovaný polypeptid je používán jako diagnostický prostředek.

Polynukleotid nebo vektor podle vynálezu který je přítomný v hostitelské buňce, může být buď integrovaný do genomu hostitelské buňky, nebo může být udržován extrachromozomálne.

Termín „prokaryotický“ je chápán tak, že zahrnuje všechny baktérie, které mohou být transformovány nebo transťekovány molekulami DNA nebo RNA pro expresi polypeptidů podle vynálezu. Prokaryotičtí hostitelé zahrnují Gram-negativní jakož i Gram-pozitivní baktérie jako například E. coli, S. typhimuriurn, Serratia marcescens a Bacillus subtilis. Termín „eukaryotický“ je chápán tak, že zahrnuje kvasinky, vyšší rostliny, hmyz a výhodně savčí buňky. V závislosti na hostiteli použitém v postupu rekombinantní produkce mohou být polypeptidy podle předkládaného vynálezu glykosylovány nebo mohou být bez glykosylace. Polypeptidy podle vynálezu mohou také zahrnovat počáteční aminokyselinový zbytek methionin. Polynukleotid kódující polypeptid podle vynálezu může být použitý pro transformaci nebo transfekci hostitele s použitím jakékoliv z metod odborníkovi obecně známých. Obzvláště výhodné je použití plazmidu nebo viru obsahujícího kódující sekvenci polypeptidů podle vynálezu, ke které je navíc geneticky fúzovaná Nkoncová značka FLAG a/nebo C-koncová značka His. Délka uvedené značky FLAG je výhodně přibližně 4 až 8 aminokyselin, nejvýhodněji 8 aminokyselin. Metody pro přípravu fúzovaných, .to operativně spojených genů a exprímujících se v např. savčích buňkách a baktériích jsou v oboru známy (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Genetické konstrukty a metody popsané zde mohou být využity pro expresi polypeptidů podle vynálezu v eukaryotických nebo prokaryotických hostitelích. Obecné vzato, ve spojení s hostitelem jsou používány expresní vektory obsahující promotorové sekvence, které usnadní účinnou transkripci vloženého polynukleotidů. Expresní vektor typicky obsahuje počátek replikace, promotor a terminátor, jakož i specifické geny, které jsou schopné zajistit fenotypovou selekci transformovaných buněk. Kromě toho pro rozsáhlou produkci polypeptidu podle vynálezu mohou být používána transgenní zvířata, výhodně savci, obsahující buňky podle vynálezu.

4(1

V dalším provedení se předkládaný vynález tedy týká postupu pro přípravu polypeptidů popsaného výše zahrnující kultivaci buněk podle vynálezu v podmínkách vhodných pro expresi polypeptidu a izolaci polypeptidů z buňky nebo kultivačního média.

Transformovaní hostitelé mohou růst ve fermentoru a mohou být pěstováni podle metod v oboru známých tak, aby bylo dosaženo optimálního růstu buněk. Polypeptid podle vynálezu může pak být izolován z růstového média, buněčného lyzátu nebo frakci buněčných membrán. Izolace a purifikace např. mikrobiálně exprimovaných polypeptidů podle vynálezu se může provádět jakýmikoliv obvyklými prostředky jako například separace preparativní chromatografií a imuno50 logická separace zahrnující například použití monoklonálních nebo polyklonálních protilátek namířených např. proti značce na polypeptidů podle vynálezu nebo jak je popsáno v připojených příkladech.

Předkládaný vynález tudíž umožní rekombinantní produkci polypeptidů obsahujících vazebná místa s afinitou a specifitou pro epitopy antigenů CD 19 a CD3, podle pořadí, a volitelně další

- 12 CZ 302070 B6 funkční doménu. Jak vysvítá z již uvedeného, vynález poskytne velkou rodinu polypeptidů obsahujících tato vazebná místa pro jakékoliv použití v léčebných a diagnostických postupech. Odborníkovi je zřejmé, že polypeptidy podle vynálezu mohou být dále spojeny s dalšími skupinami, jak popsáno výše, pro např. cílení léku a použití pro zobrazovací metody. Tato vazba může být provedena po expresi polypeptidů chemickým způsobem k místu připojení nebo produkt obsahující vazbu může být konstruován v polypeptidů podle vynálezu již na úrovni DNA. DNA je pak exprimována ve vhodném hostitelském systému a exprimované proteiny jsou soustředěny a renaturovány, je-li to nezbytné. Jak popsáno výše, vazebná místa jsou výhodně odvozena z variabilní oblasti protilátek. Po této stránce, technologie hybridomu umožní produkci buněčných linií secemujících protilátky proti téměř každé požadované látce, která vyvolává imunitní reakci. Z cytoplazmy hybridomu pak může být získána RNA kódující imunoglobulinové lehké a těžké řetězce. 5' koncová část mRN A může být použita pro přípravu cDNA, která bude použita ve způsobu podle předkládaného vynálezu. DNA kódující polypeptidy podle vynálezu může být postupně exprimována v buňkách, výhodně savčích buňkách.

V závislosti na hostitelské buňce mohou být pro dosažení správné konformace požadovány renaturaění metody. Je-li to nutné, mohou být v DNA vytvořeny bodové substituce vyhledané pro optimalizaci vazby, s použitím obvyklé kazetové mutageneze nebo jiné metody proteinového inženýrství, například jak je popsána na tomto místě. Příprava polypeptidů podle vynálezu může také záviset na znalosti aminokyselinové sekvence (nebo odpovídající sekvence DNA či RNA) bioaktivních proteinů, jako například enzymů, toxinů, růstových faktorů, buněčných diferenciačních faktorů, receptorů, antimetabolitů, hormonů nebo různých cytokinů nebo lymfokinů. Takové sekvence jsou publikované v literatuře a dosažitelné prostřednictvím počítačových databank. Například polypeptid podle vynálezu může být konstruovaný tak, že se napr. skládá z jednořetězcového Fv fragmentu a extracelulámí části lidského současně stimulujícího proteinu CD80 (B71) připojeného prostřednictvím spojky (Gly4Serl) 1. CD80 současně stimulující protein patří do rodiny Ig. Je to silně glykosylovaný protein o 262 aminokyselinách. Podrobnější popis byl publikován v práci Freeman (J. Immunol., 143, 2714— 2722, 1989). Stabilní exprese může být provedena v např. DHFR deficitních CHO buňkách, jak popsáno v práci Kaufmann (Methods Enzymol. 185, 537-566, 1990). Protein může pak být purifikován díky své značce His připojené na C-koncové části s použitím kolony Ni-NTA (Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 92, 70217025, 1995).

Navíc předkládaný vynález poskytuje sloučeniny obsahující výše uvedený polypeptid, polynukleotid nebo vektor podle vynálezu.

Předkládaný vynález se výhodně týká přípravků, které jsou farmaceutické přípravky zahrnující výše uvedený polypeptid(y), polynukleotid(y) nebo vektoiýy) podle vynálezu.

Farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu může dále zahrnovat farmaceuticky přijatelný nosič. Příklady vhodných farmaceutických nosičů jsou v oboru dobře známy a zahrnují fyziologické roztoky pufrované fosfáty, vodu, emulze, jako například emulze olej/voda, různé druhy smácedel, sterilní roztoky, atd. Přípravky zahrnující tyto nosiče mohou být formulovány pomocí dobře známých obvyklých metod. Tyto farmaceutické přípravky mohou být podávány pacientovi ve vhodné dávce. Podávání vhodných přípravků se může provádět různými způsoby např. prostřednictvím intravenózního, intraperitoneálního, subkutánního, i ntramu skulám ího, lokálního nebo intradermálního podávání. Dávkovači režim bude určen ošetřující lékařem a klinickými faktory. Jak je v lékařských oborech dobře známo, dávkování pro každého pacienta závisí na mnoha faktorech, včetně velikosti pacienta, tělesného povrchu, věku, konkrétní sloučenině, která má být podávána, pohlaví, času a způsobu podávání, obecném zdravotním stavu a dalších lécích, které jsou podávány současně. Obecně dávkování při pravidelném podávání farmaceutického přípravku by mělo být v rozmezí 1 pg až 10 mg jednotek za den. Jestliže léčebný režim je ve formě souvislé infúze, mělo by být dávkování také v rozmezí 1 pg až 10 mg jednotek na kilogram tělesné hmotnosti za minutu. Ale výhodnější dávkování pro kontinuální infúzi by mohlo být v rozmezí 0,01 pg až 10 mg jednotek na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu.

- 13 CZ 302070 B6

Obzvláště výhodná dávkování jsou uvedena níže. Pokrok může být monitorován periodickým vyšetřováním. Dávka bude kolísat, ale výhodné dávkování pro intravenózní podávání DNA je přibližně IO^ft až IO¹² kopií molekuly DNA. Přípravky podle vynálezu mohou být podávány lokálně nebo systémově. Podávání je většinou parenterální např. intravenózní, DNA může být také podávána namířena na cílové místo např. biolistiekou metodou na vnitřní nebo vnější místo určení nebo prostřednictvím katétru na místo v tepně. Přípravky pro parenterální podávání zahrnují sterilní vodné nebo roztoky jiné než vodné, suspenze a emulze. Příklady rozpouštědel jiných než vodných jsou propylenglykol, polyetylenglykol, rostlinné oleje jako olivový olej a organické estery vhodné pro injekci jako například etyloleát. Vodné nosiče zahrnují vodu, alkoholové/vodio né roztoky, emulze nebo suspenze, včetně fyziologického roztoku a pufrovaných médií. Parenterální vehikula zahrnují roztok chloridu sodného, Ringerovu dextrózu, dextrózu a chlorid sodný, Ringerův roztok s laktátem nebo pevné oleje. Intravenózní vehikula zahrnují tekuté a výživné doplňky, elektrolytové doplňky (jako ty založené na Ringerově dextróze) apod. Mohou být také přítomny konzervační prostředky a další aditiva jako například antimikrobiální činidla, anti15 oxidační činidla, ehelatotvorná činidla a inertní plyny apod. Navíc, farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu může zahrnovat proteinové nosiče, jako např. sérový albumin nebo imunoglobulin, výhodně lidského původu. Kromě toho je doporučeno, aby farmaceutický přípravek podle vynálezu obsahoval další biologicky činný přípravek podle zamýšleného použití farmaceutického přípravku. Takové agens může být lék působící na gastrointestinální systém, lék působí jako cytostatikum, lék zabraňující hyperurikémii a/nebo molekuly současně stimulující T lymfocyty nebo v oboru známé cytokiny.

Předkládaný vynález předpokládá, že různé polynukleotidy a vektory podle vynálezu jsou podávány buď samotně, nebo v jakékoliv kombinaci s použitím standardních vektorů a/nebo systémů pro podávání genů, a volitelně spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem. Po podání mohou být uvedené polynukleotidy nebo vektory trvale integrovány do genomu pacienta.

Naproti tomu mohou být používány virové vektory, které jsou specifické pro určité buňky nebo tkáně a v uvedených buňkách perzistují. Vhodné farmaceutické nosiče a excipienty jsou v oboru dobře známy. Farmaceutické přípravky připravené podle vynálezu mohou být používány pro prevenci nebo léčbu nebo oddálení různých chorob týkajících se imunodefícitů a malignit se vztahem k B lymfocytům.

Kromě toho je možné použít farmaceutický přípravek podle vynálezu, který obsahuje polynukleotid nebo vektor podle vynálezu v genové terapii. Vhodné systémy pro podávání genů zahrnují li pozorný, systémy pro podávání zprostředkované receptory, nechráněnou DNA a virové vektory, jako jsou například herpes viry, retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry. Dodání nukleových kyselin na specifické místo v organismu při genové terapii může být také uskutečně40 no použitím biolistického systému pro přenos nukleové kyseliny, jako například systém popsaný autorem Williams (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 2726-2729, 1991). Další metody pro podávání nukleových kyselin zahrnují genový přenos zprostředkovaný částicemi, jak popsáno např. autorem Verma (Gene Ther., 15, 692-699. 1998). Rozumí se, že zavedené polynukleotidy a vektory exprimují genový produkt po zavedení do uvedené buňky a v tomto stavu výhodně zůstávají po dobu života uvedené buňky. Například, buněčné linie, které trvale exprimují polynukleotid při řízení vhodnou regulační sekvencí, mohou být konstruovány podle metod odborníkovi dobře známých. Spíše než použitím expresních vektorů obsahujících virové počátky replikace, jsou hostitelské buňky transformovány polynukleotidem podle vynálezu a markérem pro selekci, buď ve stejném, nebo samostatném plazmidu. Po zavedení cizorodé DNA jsou zkonst50 ruované buňky pěstovány po dobu 1 až 2 dny v obohacených médiích, a pak jsou přemístěny na selektivní média. Markér pro selekci v rekombinantním plazmidu propůjčí resistenci a umožní selekci buněk s trvale integrovaným plazmidem do svých chromozomů, které rostou a tvoří ložiska, která mohou být dále klonována a rozšířena do buněčných linií. Takto zkonstruované buněčné linie jsou také použitelné zejména pro sereening a detekci sloučenin zapojených do např.

interakcí B a T lymfocytů.

- 14 CZ 302070 B6

Může být použita celá řada selekčních systémů včetně např. thymidinkinázy viru herpes simplex (Wigler, Cell, 11, 223, 1977), hypoxantin-guanin fosforibosyltransferázy (Szybalska, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 48, 2026, 1962) a adeninfosforibosyltransferázy (Lowy, Cell, 22, 817, 1980) v tk-, hgprt- nebo aprt- buňkách, v daném pořadí, aniž by tento výčet byl omezující. Také může být používána rezistence k antimetabolitu, jako základ selekce s dhfř, který propůjčuje resistenci na metotrexát (Wigler, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77, 3567, 1980, 0'Hare, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78, 1527, 1981), gpt, který propůjčuje resistenci na kyselinu mykofenolovou (Mulligan, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78, 2072, 1981), neo, který propůjčuje resistenci na aminoglyio kosid G-418 (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol., 150, 1, 1981), hygro, který propůjčuje resistenci na hygromycin (Santerre, Gene, 30, 147, 1984), nebo puromycin (pat, puromycin N-acetyltransferáza). Byly popsány další geny pro selekci, například trpB, který umožňuje buňkám využívat indol místo tryptofanu, hisD, který umožňuje buňkám zužitkovat histinol místo histidinu (Hartman, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 8047, 1988), a ODC (omitindekarboxyláza), která propůj15 čuje resistenci na inhibitor omitindekarboxylázy, 2-(difluorometyl)-DL-omitin, DEMO (McCologue, v: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., 1987).

V dalším provedení se předkládaný vynález týká diagnostického přípravku obsahujícího kterýko2o liv z výše popsaných polypeptidů, polynukleotidů nebo vektorů podle vynálezu a volitelných vhodných prostředků pro detekci.

Polypeptidy podle vynálezu jsou také vhodné pro použití v imunotestech, ve kterých mohou být použity v tekuté fázi nebo navázány na pevný nosič. Příklady imunotestů, které mohou používat polypeptid podle vynálezu, jsou kompetitivní a nekompetitivní imunotesty buď přímé, nebo nepřímé. Příklady takových imunotestů jsou radioimunotest (R1A), sendvičový test (imunometrický test) a testování pomocí westernového přenosu (western blot).

Polypeptidy podle vynálezu mohu být vázány k mnoha různým nosičům a použity k izolaci buněk specificky navázaných na uvedené polypeptidy. Příklady známých nosičů zahrnují sklo, polystyren, póly viny lchlorid, polypropylen, polyetylén, polykarbonát, dextran, nylon, amylózy, přirozenou a modifikovanou celulózu, koloidní kovy, polyakrylamidy, agarózu a magnetit. Pro účely vynálezu může být nosič buď rozpustný, nebo nerozpustný.

Odborníkovi je známo mnoho různých značek a metod značení. Příklady značek, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, zahrnují enzymy, radioizotopy, koloidní kovy, fluorescenční sloučeniny, chemiluminiscenční sloučeniny a bioluminiscenční sloučeniny, viz také provedení projednaná výše.

Předkládaný vynález se také týká použití polypeptidu, polynukleotidu a vektoru podle vynálezu popsaných výše pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení malignit B lymfocytů, autoimunitních chorob se vztahem k B lymfocytům nebo deplece B lymfocytů.

Nedávné klinické studie s přesměrovanou cytotoxickou aktivitou lidských T lymfocytů pomocí bi specifických protilátek prokázaly slibné výsledky v léčení refraktemí Hodgkinovy nemoci (33), karcinomu prsu a vaječníků (34-37) a maligního gliomu (38). S danými fakty

- že bsc protilátky díky své nízké molekulové hmotnosti usnadňují penetraci do nádoru (jak bylo prokázáno pro fragmenty Fab nebo Fv) (39), a

- že se očekává, že bsc protilátky sníží toxicitu závisející na dávce a dávku omezující, tato toxicita je způsobena systémovým uvolněním cytokinů zprostředkovaným Fc částmi obvyklých bispecifických protilátek (40), a

- 15CZ 302070 B6

-že dokonce intaktní monoklonální protilátka (namířená proti CD20) vedla k regresi nádoru v pokročilých stadiích NHL (41,42), se očekávalo - a skutečně bylo ukázáno - že polypeptidy podle vynálezu jsou zajímavé mole5 kuly, které přispívají k dalšímu terapeutickému pokroku.

Ve výhodném provedení je tedy farmaceutický přípravek podle vynálezu používaný pro léčení nehodgkinských lymfomů.

io Rozmezí dávek při podávání polypeptidů, polynukleotidu a vektorů podle vynálezu je dost velké, aby vyvolalo žádoucí účinek, pri kterém jsou zmírněny symptomy nemocí se vztahem k B lymfocytům. Dávkování by nemělo být tak velké, aby způsobilo podstatné nepříznivé vedlejší účinky, jako nežádoucí křížové reakce, anafytaktické reakce apod. Obecně, dávkování se bude měnit podle věku, stavu, pohlaví a stadia nemoci pacienta a může být určeno odborníkem. Není-li t5 žádná kontraindikace, může být dávkování upraveno jednotlivým lékařem. Předpokládá se, že rozmezí uvedené dávky je stanoveno např. 0,01 pg až 10 mg polypeptidů podle vynálezu. Obzvláště výhodné dávkování je 0,1 pg až 1 mg, ještě výhodnější je 1 až 100 pg a nejvýhodnější je dávkování 3 až 10 pg jak je např. ukázáno v připojeném příkladu 7.

Kromě toho se vynález týká způsobu pro rozpoznání sloučenin aktivujících nebo současně stimulujících T lymfocyt nebo pro rozpoznání inhibitorů aktivace a stimulace T lymfocytů, způsob zahrnuje (a) pěstování CD 19 pozitivních buněk (výhodně B lymfocytů) a T lymfocytů v přítomnosti polypeptidů podle vynálezu a, volitelně, v přítomnosti složky schopné poskytnout detekovatelný signál jako odpověď na aktivaci T lymfocytů testovanou sloučeninou v podmínkách umožňujících interakci sloučeniny s buňkami, a (b) detekce přítomného nebo nepřítomného signálu vznikajícího interakci sloučeniny s buňkami.

Toto provedení je obzvláště užitečné pro testování kapacity sloučenin coby současně stimulujících molekul. V tomto způsobu CD 19 pozitivní buňka/B lymfocyt poskytne primární aktivační signál pro T lymfocyty, tudíž se vyhne klonotypovému receptoru T lymfocytů. Pak může být podle vynálezu určeno, která testovaná sloučenina je ještě potřebná pro skutečnou aktivaci T lymfocytů. Ve způsobu podle vynálezu CD 19 pozitivní buňka/B lymfocyt působí jako stimulační buňka, která spojuje bispecifické molekuly, které jsou vázány k CD3 komplexům na povrchu stejného T lymfocytů. Biologické způsoby pro pěstování, detekci a volitelně i testování jsou odborníkovi jasné.

Termín „sloučenina“ ve způsobu podle vynálezu zahrnuje jednu látku nebo velké množství látek, které mohou nebo nemusí být totožné.

Uvedená sloučenina(y) může být například obsažena ve vzorcích např. buněčných extraktů z např. rostlin, zvířat nebo mikroorganismů. Kromě toho uvedené sloučeniny mohou být v oboru známy, ale až dosud nebylo zřejmé, že jsou schopné inhibovat aktivaci T lymfocytů nebo že jsou použitelné jako současně stimulující faktor T lymfocytů. Mnoho sloučenin může být např. přidáno do kultivačního média nebo vstříknuto do buňky. Jestliže vzorek obsahující sloučeninu(y) je identifikován způsobem podle vynálezu, pak je buď možné izolovat sloučeninu z původního vzorku, když je určeno, že obsahuje příslušnou sloučeninu, nebo původní vzorek může být dále rozdělen, například jestliže se skládá z velkého množství různých sloučenin, aby se zredukoval počet různých látek ve vzorku a způsob se dále opakuje s částmi původního vzorku. Jestli uvedený vzorek nebo sloučenina projevují požadované vlastnosti pak může být určeno pomocí metod v oboru známých, jako například popsaných zde a v připojených příkladech. V závislosti na složitosti vzorků mohou být výše popsané kroky provedeny několikrát, výhodně až dokud vzorek určovaný způsobem podle vynálezu obsahuje pouze omezený počet látek nebo pouze jednu látku.

- 16CZ 302070 B6

Uvedený vzorek výhodně zahrnuje látky podobných chemických a/nebo fyzikálních vlastností a nejvýhodněji jsou uvedené látky totožné. Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být docela dobře prováděny a navrženy odborníkem například ve shodě s jinými testy založenými na buňkách, které jsou popsány ve stavu techniky nebo použitím a modifikací metod, jak je popsáno v připojených příkladech. Kromě toho odborník hned pozná, které další sloučeniny a/nebo buňky mohou být použity pro provádění způsobů podle vynálezu, například interleukiny nebo enzymy, bude-li to nezbytné, které konvertují určitou sloučeninu na prekurzor, který dále stimuluje nebo potlačuje aktivaci T lymfocytů. Takové adaptace způsobu podle vynálezu jsou ve schopnostech odborníka a mohou být prováděny bez nadbytečného experimentování.

Sloučeniny, které mohou být použity ve shodě se způsobem podle předkládaného vynálezu, zahrnují peptidy, proteiny, nukleové kyseliny, protilátky, malé organické molekuly, ligandy, peptidomimetika, PNA apod. Uvedené sloučeniny mohou také být funkčními deriváty nebo analogy známých aktivátorů nebo inhibitorů T lymfocytů. Způsoby přípravy chemických derivátů a analogů jsou odborníkovi dobře známy ajsou popsány například autorem Beilstein (Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York lne., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA). Kromě toho uvedené deriváty a analogy mohou být testovány na své působení podle způsobů v oboru známých nebo jak je popsáno například v připojených příkladech. Mimoto mohou být použita peptidomimetika a/nebo počítačem navržené vhodné aktivátory nebo inhibitory aktivace T lymfocytů například podle způsobů popsaných níže. Mohou být použity vhodné počítačové programy pro identifikaci interaktivních míst předpokládaného inhibitoru a antigenů podle vynálezu pri vyhledávání komplementárních strukturálních motivů prostřednictvím počítače (Fassina, Immunomethods, 5, 114-120, 1994). Další vhodné počítačové systémy pro návrhy proteinů a peptidů pomocí počítače jsou popsány ve stavu techniky například autory Berry (Biochem. Soc. Trans., 22, 1033-1036, 1994), Wodak (Ann. N.Y. Acad. Sci., 501, 1-13, 1987), Pabo (Biochemistry, 25, 5987-5991, 1986). Výsledky získané z výše popsaných počítačových analýz mohou být použity v kombinaci se způsobem podle vynálezu pro např. optimalizaci známých aktivátorů nebo inhibitorů T lymfocytů. Vhodná peptidomimetika mohou také být identifikována syntézou peptidomimetických kombinatorických knihoven prostřednictvím postupné chemické modifikace a testování výsledných sloučenin např. podle metody popsané na tomto místě a v připojených příkladech. Způsoby pro tvoření a použití peptidomimetických kombinatorických knihoven jsou popsány ve stavu techniky například autory Ostresh (Methods in Enzymology, 267, 220-234, 1996) a Domer (Bioorg. Med. Chem., 4, 709-715, 1996). Kromě toho trojrozměrné a/nebo krystalografické struktury inhibitorů nebo aktivátorů interakce B lymfocyt/T lymfocyt mohou být použity pro návrh peptidomimetických inhibitorů nebo aktivátorů aktivace T lymfocytů, které jsou testovány způsobem podle vynálezu (Rose, Biochemistry, 35, 12933-12944, 1996, Rutenber, Bioorg. Med. Chem., 4, 1545—1558, 1996).

Stručně řečeno, předkládaný vynález poskytuje způsoby identifikace sloučenin, které jsou schopné modulovat imunitní reakce zprostředkované B lymfocytem/T lymfocytem.

Sloučeniny, u kterých je zjištěno, že aktivují reakce zprostředkované B lymfocytem/T lymfocytem, mohou být použity pro léčení karcinomů a příbuzných nemocí. Navíc může být také možné specificky inhibovat virové choroby, a tím zabránit virové infekci nebo šíření viru. Sloučeniny identifikované jako supresory aktivace nebo stimulace T lymfocytů mohou být použity při orgánové transplantaci, aby zabránily rejekci Štěpu, viz také výše.

Je tudíž očekáváno, že sloučeniny identifikované nebo získané způsobem podle předkládaného vynálezu budou velice užitečné pro diagnostiku a především pro léčebné aplikace. Proto se v dalším provedení vynález týká způsobu produkce farmaceutického přípravku obsahujícího formulaci sloučenin identifikovaných v kroku (b) výše popsaného způsobu podle vynálezu ve farmaceuticky přijatelné formě. Kromě toho se předpokládá, že uvedená složka může být modifikovaná pomocí peptidomimetika. Způsoby tvoření a použití peptidomimetických kombinatorických knihoven jsou popsány ve stavu techniky například autoři Ostresh (Methods in Enzymology, 267,

- 17CZ 302070 B6

210-234, 1996). Dorner (Bioorg. Med. Chem., 4, 709-715, 1996), Beeley (Trends Biotechnok, 12, 213-216, 1994) nebo al—Obeitii (Mol. Biotech., 9, 205-223, 1998).

Léčebně použitelné sloučeniny identifikované způsobem podle vynálezu mohou být pacientovi podávány prostřednictvím jakéhokoliv vhodného způsobu pro konkrétní sloučeninu např. perorálně, intravenózně, parenterálně, transdermálně, přes sliznice nebo pomocí chirurgického zákroku nebo implantátu (např. sloučenina je ve formě pevné nebo polotuhé biologicky kompatibilní a resorbovatelné matrix) v místě, kde je žádoucí působení sloučeniny nebo blízko tohoto místa. Příslušné léčebné dávky jsou určeny odborníkem, viz výše.

Kromě toho předkládaný vynález poskytuje způsob pro léčení malignit B lymfocytů, autoimunitních chorob se vztahem k B lymfocytům nebo deplece B lymfocytů a/nebo způsob oddalující patologický stav, který je vyvolaný poruchami B lymfocytů, tento způsob zahrnuje zavedení polypeptidu, polynukleotidu nebo vektoru podle vynálezu do savce postiženého uvedenou malignitou, nemocí a/nebo patologickým stavem. Kromě toho je výhodný, že uvedený savec je člověk.

Toto a další provedení jsou popsána a obsažena v popisu a příkladech předkládaného vynálezu. Další literatura týkající se jakékoliv protilátky, způsobu, použití a sloučenin pro použití podle předkládaného vynálezu, může být vyhledána ve veřejných knihovnách a databázích, s použitím například elektronických zařízení. Například může být využita veřejná databáze „Medline“, která je dosažitelná na Internetu například pod adresou;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ PubMed/medl ine.html.

Další databáze a adresy, jako například;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fiirii.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, jsou odborníkovi známy a mohou také být získány použitím např.

http://www.lycos.com.

Přehled patentových informací v biotechnologii a přehled důležitých zdrojů patentových informací použitelných pro retrospektivní hledání a pro přehled o současných znalostech je podán v práci autora Berks (TIBTECH, 12, 352-364, 1994).

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: SDS-PAGE: barvení Coomassie modří purifikovaného bscCD19xCD3 fragmentu s různými množstvími proteinu. Molekulová hmotnost (kD) standardu je vyznačená nalevo.

Obrázek 2: FACS-analýza s bscCD19xCD3 (200 pg/ml) v různých CD19-pozitivních B buněčných liniích (BJAB, SKW6.4, Blin-1, Daudi, Ráji), v CD19-negativní B buněčné linii BL60 a s CD3-pozitivními buňkami Jurkat a primárními lidskými PBMC. Přerušované Čáry označují negativní kontroly.

Obrázek 3: Cytotoxicita bscCD19xCD3 v testu uvolňování ^5tCr s nestimulovanými lidskými PBMC a různými B buněčnými liniemi. Poměr efektor:cílová buňka (poměr E:T) byl 10:1, doba inkubace 4 hodiny. Směrodatná odchylka ve všech trojích opakováních byla pod 7 %.

-18CZ 302070 B6

Obrázek 4: Test cytotoxicity pomocí uvolňování chrómu s nestimulovanýmí primárními lidskými PBL proti plasmacytomovým buněčným liniím L363 a NCI a lymfomové buněčné linii Daudi, poměr E:T 20:1, doba inkubace 8 hodin.

Obrázek 5: Inhibice cytotoxicity bscCD19xCD3 základní anti-CD19 protilátkou v testu uvolňování chrómu, doba inkubace 8 hodin, poměr E:T20:l, koncentrace bscCD19xCD3 1 ng/ml.

Obrázek 6: Test cytotoxicity s nestimulovanýmí PBMC proti buňkám Daudi po přidávání stoupalo jícího množství EGTA, poměr E:T 10:1, doba inkubace 4 hodiny.

Obrázek 7: cytotoxicita bscCD19xCD3 v testu uvolňování ^5,Cr s nestimulovanýmí lidskými PBMC a buňkami Blin—1 jako cílovými buňkami při různých poměrech E:T, doba inkubace 4 hodiny, koncentrace konvenční bispecifické protilátky 3 pg/ml, koncentrace bsc 1Ίt5 1AxCD3 100 ng/ml, E:T poměr jak uvedeno.

Obrázek 8: DNA sekvence a proteinová sekvence bscCD19xCD3 protilátky (varianta obsahující značku FLAG). Čísla udávají pozice nukleotidů (nt), odpovídající aminokyselinová sekvence je zobrazena pod nukleotidovou sekvencí. DNA sekvence kódující bispecifickou protilátku začíná v pozici 1 a končí v pozici 1593. Prvních šest nt (pozice -10 až -5) a posledních šest nt (pozic 1596 až 1601) obsahuje štěpná místa restrikčních enzymů EcoRI a Sáli, v tomto pořadí. Nukleotidy 1 až 57 specifikují vedoucí sekvenci, nukleotidy 82 až 414 a 460 až 831 kódují V_LCD19 aV_HCD19, v tomto pořadí, nukleotidy 847 až 1203 a 1258 až 1575 kódují V_HCD3 a V_LCD3, v tomto pořadí, a nukleotidy 1576 až 1593 kódují značku His.

Obrázek 9: Deplece primárních (maligních) CD 19+ B lymfocytů odváděním autologních primárních T lymfocytů prostřednictvím bscCD19xCD3.

A) výchozí-bod (t = 0) : n = 3 x 10⁶ PBL/jamku bylo vyseto na 24-jamkovou tkáňovou kultivační misku v objemu 1 ml média RPMI 1640, doplněného 10% FCS. Je ukázáno počáteční procento CD19+ B lymfocytů, jakož i CD4⁺- a CD8⁺ T lymfocytů.

B—G) relativní počty B a CD4⁺- a CD8⁺ T lymfocytů po t = 5 dnech inkubace v 37 °C/5% CO₂ v nepřítomnosti (B-C) nebo přítomnosti (LM3) bscCD19xCD3 (koncentrace jsou ukázány) se

60 U/ml IL-2 nebo bez něj. Negativní kontroly obsahovaly buď bispecifickou jednořetězcovou protilátku (17-JAxCD3) s irelevantní specifítou pro cílovou buňku, nebo neobsahovaly žádnou bispecifickou protilátkou (C).

Obrázek 10: Purifikační kroky pro bscCD19xCD3.

Obrázek 11: SDS-PAGE analýza čistoty bscCD19xCD3. Je ukázán SDS-polyakrylamidový gel s4až 12% gradientem barvený koloidní Coomassie modří. Dráhy 1 a 6, standardy molekulové velikosti, dráha 2, supematant buněčné kultury, dráha 3, aktivní frakce z kationtové výměnné chromatografie, dráha 4, aktivní frakce z afinitní chromatografie s cheláty kobaltu, dráha 5, aktiv45 ní frakce z gelové filtrace. Bylo analyzováno stejné množství proteinu (2 pg) ze supematantu buněčné kultury a různé frakce z kolon. Velikost standardů molekulové hmotnost v kD je ukázána napravo. Šipka ukazuje pozici bscCD19xCD3.

Obrázek 12: Kationtové výměnná chromatografie bscCD19xCD3. Koncentrace proteinu byla měřena pomocí absorpce ve 280 nm (mAU, vlevo). Eluční profil proteinu je ukázán plnou čarou. Profil stupňovitého gradientu NaCl je vyznačen přímou plnou čarou (%B, vpravo) a sebrané frakce jsou označeny přerušovanými čarami, bscCD19xCD3 byla detekována ve frakci F6.

Obrázek 13: Afinitní chromatografie s cheláty kobaltu bscCD19xCD3. Koncentrace proteinu byla měřen pomocí absorpce ve 280 nm (mAU, vlevo). Eluční profil proteinu je ukázán plnou

- 19C7. 302070 B6 čarou. Imidazolový gradient je vyznačen přímou plnou čarou (%B, vpravo) a sebrané frakce jsou označeny přerušovanými čarami. bscCDI9xCD3 byla detekována ve frakci F7.

Obrázek 14: Gelová filtrace anti-CD19XAN11-CD3. Koncentrace proteinu byla měřen pomocí 5 absorpce ve 280 nm (mAU, vlevo). Eluční profil proteinu je ukázán plnou čarou. Přerušované čáry označují sebrané frakce. bscCDI9xCD3 byla nalezena ve frakci F7 odpovídající molekulové velikosti přibližně 60 kD.

Obrázek 15: Hladiny gamaglutamyltransferázy (GGT) v krvi jako reakce na ošetření io s bscCDI9xCD3. GGT hodnoty byly určeny standardní klinickou biochemickou metodou a jsou vyjádřeny v jednotkách/l. Časová osa ukazuje dny (d) od začátku prvního podání léku a hodiny (h) po jednotlivých dalších podáních léku, začínajíc nulou. Šipky označují časové body podávání léku.

Obrázek 16: Ultrazvukové měřeni sleziny pacienta A-B.

A: Určení velikosti sleziny datované 12. dubna, 1999, před léčbou bscCD19xCD3. Obrázek ukazuje zvětšenou slezinu (velikost 146 x 69,2 mm), cožje zaviněno infiltrací maligními B lymfocyty.

B: Určení velikosti sleziny datované 16. dubna, 1999, po léčbě 3 gg 14. dubna, následovanými 10 gg 15. dubna. Obrázek ukazuje zmenšování sleziny na velikost 132 x 58,9 mm způsobené systémovou léčbou s bscCD19xCD3. Nesrovnalosti jednotlivých měření velikosti ukázaných v tabulce 1 jsou vysvětlené určováním velikosti orgánu v různých prostorových rovinách na základě ultrazvukového vyšetření. Tyto dva rozměry jsou označeny (+) a (x).

Obrázek 17: Počty leukocytů v krvi jako odpověď na léčbu s bscCD19xCD3. Počet leukocytů je uveden v 1O⁹/litr. Časová osa ukazuje dny (d) od začátku prvního podání léku a hodiny (h) po jednotlivých dalších podáních léku, začínajíc nulou. Šipky označují časové body podávání léku.

Obrázek 18: Hladiny C-reaktivního proteinu (CRP) v krvi jako odpověď na léčbu s bscCDI9xCD3. CRP hodnoty byly určeny standardní klinickou biochemickou metodou a jsou vyjádřeny v mg/dl. Časová osa ukazuje dny (d) od začátku prvního podání léku a hodiny (h) po jednotlivých dalších podáních léku, začínajíc nulou. Šipky označují časové body podávání léku.

Obrázek 19: Hladiny nádorového nekrotického faktoru-alfa (TNF) v krvi jako odpověď na léčbu s bscCD19xCD3. TNF hodnoty byly určeny pomocí testu ELISA a jsou vyjádřeny v ng/ml. Časová osa ukazuje dny (d) od začátku prvního podání léku a hodiny (h) po jednotlivých dalších podáních léku, začínajíc nulou. Šipky označují časové body podávání léku.

Obrázek 20: Hladiny interleukinu-6 (1L-6) v krvi jako odpověď na léčbu s bscCDI9xCD3. IL-6 hodnoty byly určeny pomocí testu ELISA a jsou vyjádřeny v pg/ml. Časová osa ukazuje dny (d) od začátku prvního podání léku a hodiny (h) po jednotlivých dalších podáních léku, začínajíc nulou. Šipky označují časové body podávání léku.

Obrázek 21: Hladiny interleukinu-8 (1L- E) v krvi jako odpověď na léčbu s bscCD19xCD3. IL—8 hodnoty byly určeny pomocí testu ELISA a jsou vyjádřeny v pg/ml. Časová osa ukazuje dny (d) od začátku prvního podání léku a hodiny (h) po jednotlivých dalších podáních léku, začínajíc nulou. Šipky označují časové body podávání léku.

Obrázek 22: hladiny alfa řetězce rozpustného receptoru interleukinu-2 (IL-2R) v krvi jako odpověď na léčbu s bscCD19xCD3. IL-2R hodnoty byly určeny pomocí testu ELISA a jsou vyjádřeny v jednotkách/ml. Časová osa ukazuje dny (d) od začátku prvního podání léku a hodiny (h) po jednotlivých dalších podáních léku, začínajíc nulou. Šipky označují časové body podávání léku.

-20CZ 302070 B6

Vynález bude nyní podrobněji popsán a vysvětlen prostřednictvím následujících biologických příkladů, které jsou pouze ilustrující a rozsah předkládaného vynálezu nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování variabilních (V) imunoglobulinových domén

Domény V lehkého řetězce(VL) a V těžkého řetězce (VH) z hybridomu HD37 (22) byly klonovány podle standardní PCR (polymerázová řetězová reakce) metody (23). cDNA syntéza byla prováděna s oligo-dT primery a Taq polymerázou.

Seznam primerů

5' Ll:

GAAGCACGCGTAGATATCKTGMTSACCCAA [sekvence id. č. 1]

3' K:

GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGCATCAGC [sekvence id. č. 2]

5' Hl:

CAGCCGGCCATGGCGCAGGTSCAGCTGCAG [sekvence id. č. 3]

3' G:

ACCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGG [sekvence id. č. 4]

5' VLB5RRV;

AGGTGTACACTCCATATCCAGCTGACCCAG [sekvence id. č. 5]

3' VLGS15;

GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCTTT [sekvence id. č. 6]

5' VHGS15:

GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG [sekvence id. č. 7]

3' VHBspEl:

AATCCGGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCT [sekvence id. č. 8]

Pro amplifikací V domén prostřednictvím PCR byty použity primery 5' Ll a 3' K, ohraničující doménu V_L, a 5' Hl a 3' G pro těžký řetězec založený na příměrech popsaných Důbel et al. (24). CDNA anti-CD3 scFv fragmentu laskavě poskytl A. Traunecker (25).

-21 CZ 302070 B6

Příklad 2

Konstrukce bispecifickýeh jednořetčzeovýeh fragmentu a eukaryotieká exprese

Aby byl získán anti-CD19 scFv-fragment, odpovídající VL- a VH-oblastí klonované do samostatných plazmidových vektorů sloužily jako templáty pro VL- a VH-specifickou PCR používající páry olígonukleotidových primerů 5' VLB5RRV/3' VLGS15 a 5' VHGS15/3' VHBspEI, v tomto pořadí. Tím byly vloženy překrývající se komplementární sekvence do PCR produktů, které byly spojeny za vzniku kódující sekvence 15-aminokyselinové (Gly₄Seri)₃ spojky během následující fúzní PCR. Tento amplifikaění krok byl proveden s párem primerů 5' VLB5RRV/3' VHBspEI a výsledný fúzní produkt (nebo spíše anti- CD 19 scFv-fragment) byl štěpen restrikčními enzymy EeoRV a BspEI, a tak klonován do vektoru BluescriptKS- (Stratagene) obsahujícím buď (EcoRl/Sall-klonovanou) kódující sekvenci anti-17-1 A/anti-CD3 bispecifické jednořetězcové protilátky s N—koncovou značkou FLAG [1], nebo sekvenci modifikované verze bez epitopu FLAG (21), čímž byla nahrazena anti-17-ΙΑ-speei lita spéci fltou anti-CD19 a uchována 5 aminokyselinová (Gly₄Seri)i spojka spojující C-koncový anti—CD3 scFv fragment, v daném pořadí. Pak byly DNA fragmenty kódující obě verze anti-CD19/anti-CD3 bispecifickýeh jednořetčzeovýeh protilátek s uspořádáním domény VU^io-VHcimit-VHcd.i-VLcw subklonovány EcoRI/SalI do popsaného expresního vektoru pEF-DHRF [I ], podle pořadí- Výsledné plazmidové DNA byly transfekovány do DHFR-deficitních CHO lymfocytů pomocí elektroporace; selekce, genová amplifikace a produkce proteinu byla prováděna jako popsáno [1]. V následujících příkladech jsou vysvětlené výsledky získané s verzí bscCD19xCD3 obsahující FLAG.

Purifikace bscCDI9xCD3 ze supematantu transfekovaných CHO buněk poskytla 4 mg na litr tkáňového supematantu. Bsc-Ab byla purifikovaná prostřednictvím své C-koncové histídinové značky pomocí afinitní chromatografie na koloně Ni-NTA, jak je popsáno [1], Bsc-Ab byla eluována z kolony Ni-NTA jako zřetelný vrchol při imidazolu v 200mM koncentraci. SDSPAGE byla prováděna podle Laemmli (26) s 12% gelem, a pak následovalo barvení Coomassie briliantovou modří R250 pro analýzu purifikace bsc-Ab. Výsledky analýzy SDS-PAGE (obr. 1) ukazují předpokládanou velikost bsc-Ab (60 kD).

Příklad 3

Vazebné vlastnosti bsc-AbCD19xCD3

Vazebné specifity bsc-Ab pro CD3 a CD 19 byly prokázány pomocí analýzy průtokovou cytometrií na CD3-pozitÍvních buňkách Jurkat, lidských PBMC a několika různých CD 19pozitivních buněčných liniích lymfomů z B lymfocytů, včetně Blin I, SKW6.4, Daudi, BJAB a Ráji. CD 19—pozitivní B buněčné linie Daudi, Ráji, BJAB (Burkittův lymfom), SKW6.4 (lidské B lymfocyty transformované EBV) a Blin—1 (linie pre-B lymfocytů) byly použity pro analýzu průtokovou cytometrií a testy uvolňování chrómu. Jurkat je CD3-pozitivní buněčná linie T lymfocytů, BL60 a plasmocytomové buněčné linie NCI a L363 jsou negativní na obě povrchové molekuly, CD3 a CD 19. Buněčné linie byly pěstovány v kompletním RPMI 1640 (Biochrom) s 10%FCS (GIBCO).

I x IO⁶ buněk bylo promyto PBS, resuspendováno ve 200 μΙ PBS s 10 % Vemimmun (Centeon, Marburg, Německo) a 0,1 % NaN₃ a inkubováno 30 minut ve 4 °C. Po centrifugaci (100 x g, 5 minut) byly buňky inkubovány v 50 μΐ bscCD19xCD3 (200 pg/ml v PBS s 10 % Venimmun a OJ % NaN-J 30 minut ve 4 °C. Buňky byly dvakrát promyty PBS. Pro detekci bsc-Ab byla použita protilátka proti značce His (Dianova) konjugovaná s FITC. Jako negativní kontroly sloužily irelevantní bsc-Ab 17—1AxCD3, produkovaná pomocí stejného expresního systému jako bscCD19xCD3, nebo protilátka proti samotné značce His. Průtoková cytometríe byla prováděna

- 22 CZ 302070 Β6 na přístroji Becton Dickinson FACScan. U buněk BL60, které neexprimují ani CD19 ani CD3, nebyla zjištěna žádná vazba (obr. 2).

Příklad 4

Cytotoxická aktivita bsc-AbCD19xCD3 proti CD19-pozitivním lymfomovým buňkám

V testu uvolňování ^5,Cr se ukázalo, že protilátka bscCD19xCD3 je vysoce cytotoxická pro některé lymfomové buněčné linie (obrázek 3). Lidské mononukleámí buňky periferní krve (PBMC), jakožto efektorové buňky, byly izolovány z čerstvě sražených leukocytů („buffy coat“) náhodných dárců gradientovou centrifugací s použitím Lymphoprep™ (Nycomed) s následující centrifugací 100 x g pro odstranění trombocytů. CDl9-pozitivní B lymfocyty byly odčerpány použitím Dynabeads® M-450 CD 19 (Dynal). Ochuzené buněčné populace byly analyzovány pomocí průtokové cytometrie (Becton Dickinson), která ukázala 99% depleci CD19-pozitivních buněk. PBMC byly inkubovány přes noc ve 37 °C, 5 % CO₂, jako cílové buňky byly použity CD19-pozitivní B buněčné linie (Ráji, Blin I, Daudi, BJAB, SKW6.4).

Cytotoxicita byla měřena ve standardním testu uvolňováni chrómu na 96-jamkových destičkách s kulatým dnem (Nunc) s použitím kompletního média RPMI 1640 (Biochrom) s 10% FCS (GIBCO).

Nestimulované PBMC byly přidány v objemu 80 pl média do každé jamky obsahující 20 pl bscAb v různých koncentracích. Pak bylo přidáno 100 pl cílových buněk (1 x 10⁴) značených ^5lCr, destičky byly stočeny 3 minuty v 100 x g a inkubovány 4 hodiny ve 37 °C, 5 % CO₂. Po další centrifugací bylo odstraněno 50 pl supematantu a testováno na uvolněný ^5lCr v počítači gama impulzů (TopCount, Canberra Packard).

Spontánní uvolňování bylo měřeno pomocí inkubace cílových buněk bez efektorových buněk nebo protilátek a maximální uvolňování bylo určováno pomocí inkubace cílových buněk s 10% TritonX-100. Inkubace cílových buněk s bscAb bez efektorových buněk neměla za následek měřitelnou lýzi buněk. Procento specifické lýze bylo vypočítáno takto: nespecifické uvolňování (%) = [(cpm, experimentální uvolňování) - (cpm, spontánní uvolňování)] / [(cpm, maximální uvolňování) - (cpm, spontánní uvolňování)] x 100. Všechny pokusy byly prováděny ve trojím opakování (triplikátech). SD mezi triplikáty byla ve všech experimentech pod 6 %. Aby byly přiblíženy podmínky in vivo použili původci vynálezu jakožto efektorové buňky nestimulované PBMC od zdravých dárců. Rychlá indukce cytotoxicity během 4 hodin byla pozorována bez žádné předběžné stimulace T lymfocytů. Kontrolní bsc-protilátka s odlišnou nádorovou specifitou (bscl7-lAxCD3), ale vytvářena stejným systémem jako protilátka bscCD19xCD3, vykázala lyzační aktivitu nevýznamně vyšší než médium coby pozadí. Kromě toho nebyla pozorována žádná cytotoxická aktivita při použití plasmocytomových buněčných linií NCI a L363, které neexprimují CD 19, jako cílových buněk (obrázek 4). V kompetitivních testech používajících stoupající množství CD19-specifické základní monoklonální protilátky HD37 byla cytotoxická aktivita bscCD19xCD3 téměř úplně blokována (obrázek 5). Tyto kontroly ukazují, že cytotoxický účinek zprostředkovaný bscCD19xCD3 je antigen-specifícký. Pro získání více informací o molekulárním mechanismu, kterým bscCD19xCD3 protilátka ničí CD19-pozitivní cílové buňky, zkoušeli původci vynálezu blokovat cytotoxicitu zprostředkovanou bscCDl9xCD3 prostřednictvím EGTA. Jak ukázáno na obrázku 6, cytotoxická aktivita bscCD19xCD3 může být úplně zablokována prostřednictvím EGTA, což ukazuje, že specifická lýze je spíše účinek zprostředkovaný T lymfocyty (pravděpodobně přes metabolickou dráhu perforinu) než přímé působení protilátky samotné (např. indukce apoptózy).

Při použití nesti mu lovaných T lymfocytů byl pozorován významný cytotoxický účinek proti buňkám Blin I dokonce při koncentracích protilátky pod 1 ng/ml (obrázek 7). Dokonce při poměrně nízkém poměru E:T (5:1, 2,5:1) a při velmi nízké koncentraci protilátky 10 až 100 pg/ml, proti-23 CZ 302070 B6 látka bscCD19xCD3 rychle indukovala specifickou cytotoxickou aktivitu nestimulovaných T lymfocytů (obrázek 7). Na rozdíl od toho, konvenční bispeciílcká protilátka CD19XCD3 vytvořená pomocí techniky hybrídu-hybridomu (5-7, 27) nevykázala v těchto podmínkách významnou cytotoxickou aktivitu ani při koncentracích až 3000 ng/ml (obrázek 7). Tato konvenční bispecifieká protilátka vyžadovala další předběžnou stimulaci T lymfocytů a vysoké koncentrace protilátek přibližně 100 ng/ml, aby indukovala cytotoxicitu specifickou pro T lymfocyty (neukázáno), což je v souhlase s literaturou (5-7, 27).

Příklad 5

Deplece primárních (maligních) B lymfocytů prostřednictvím autologních T lymfocytů přes cytotoxickou aktivitu bscCD19xCD3

Aby se určila cytotoxická aktivita bscCD19xCD3 na primární maligní B lymfocyty, mononuklcámí buňky periferní krve (PBMC) pacienta nemocného B CLL (chronická lymfatická leukémie typu B) byly izolovány pomoci centrifugace na hustotním gradientu Ficollu. Tyto buňky byly nepřetržitě pěstovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti bscCD19xCD3 po dobu 5 dnů ve 37 °C/5 % CO₂ v médiu RPMI 1640 doplněném 10% FCS a, volitelně, 60 U/ml IL-2. Analýza průtokovou cytometrií odhalila, že lymfocyty periferní krve (PBL) tohoto konkrétního pacienta (který byl později systémově léčen s bscCD19xCD3, viz příklad 7) s NHL (nehodgkinský lymfom) obsahovaly 92,6 % CD19-pozitivních B lymfocytů (- cílové buňky) a 7,4 % CD3-požiti v nich T lymfocytů (= efektorové buňky) při poměru T lymfocytů CD4/CD8 2,6 : 4,8. Převážná většina těchto CD19-pozitivních B lymfocytů se skládala z maligních buněk. Na 24— jamkové tkáňové kultivační destičky byl vyseto 3x10⁶ PBL/ml najamku v objemu 1 ml. Jako negativní kontroly sloužily kultivační médium plus IL-2 a kultivační médium plus IL-2 s irelevantní bispecifickou jednořetězcovou protilátkou bscl7-lAxCD3 (1) v koncentraci 0,5 ng/ml. Jak je ukázáno na obrázku 9, po 5 dnech inkubace nebyla v těchto podmínkách zjištěna deplece CD19-pozitivních buněk. Ale když byla přidána bscCD19xCD3 v koncentracích 0,5 nebo 0,05 gg/ml (buď v přítomnosti, nebo nepřítomnosti IL-2), byly zničeny skoro všechny CD 19pozitivní B lymfocyty. Pěstované buňky se tehdy skládaly převážně z T lymfocytů s poměrem T lymfocytů CD4/CD8 asi 1:2 až 1:3. To ukázalo mimořádnou cytotoxicitu bscCD19xCD3 pro CD19-pozitivní B lymfocyty, protože úplná deplece primárních B lymfocytů autologními T lymfocyty byla indukována v koncentraci pouze 50 ng/ml pri velmi nepříznivém počátečním poměru efektorových a cílových buněk (méně než 1:10), dokonce bez další stimulace T lymfoeytů IL-2 nebo jiným druhem stimulace.

Příklad 6

Purifikace bscCD19xCD3 pro léčebné použití bscCD19xCD3 byla produkována v buňkách vaječníků čínského křečka (CHO) trvale transfekovaných expresním vektorem (pEF-DHFR, víz příklad 2) kódujícím bscCD19xCD3 a kromě toho hexahistidin a značku FLAG. Buňky byly pěstovány v médiu bez séra (Rencyte) v reaktoru s dutými vlákny (Unisyn). Pět set ml supernatantu buněčné kultury bylo odebráno a sterilováno filtrací přes 0,2 gm filtr (AcroCap, Pálí Gelman).

bscCD19xCD3 byla detekována a kvantifikována pomocí westernová přenosu s použitím myšího anti-FLAG IgG (Sigma) a kozího anti-myšího IgG konjugovaného s alkalickou fosfatázou (Sigma). Detekce byla prováděna pomocí chemiluminiscence s použitím systému BCIP/ NBT (Devitron). Koncentrace proteinu byly určeny pomocí Bradfordova testu (Biorad), s použitím bovinního IgG (Biorad) jako proteinového standardu. Čistota frakcí z kolon byla hodnocena redukující elektroforézou s dodecylsulfátem sodným (SDS) Bis/Tris polyakrylamidovým gelem s gradientem 4 až 12% (PAGE) používající systém s MOPS pufrem (Novex).

-24CZ 302070 Β6

Purifikace bscCD19xCD3 do homogenity vyžaduje kationtovou výměnnou chromatografii, afinitní chromatografií s cheláty kobaltu a, jako závěrečný stupeň, gelovou filtraci. Tyto purifikační kroky byly prováděny s použitím standardních protokolů (viz níže). Proudové schéma purifikačního postupuje ukázáno na obrázku 10.

Kat iontová výměnná chromatografie: Supematant buněčné kultury z CHO buněk byl smíchán se dvěma objemy pufru C (30 mM morfolinoetansulfonová kyselina [MES], 20 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0,3 mM benzamid inhydroch lorid, pH 5,5) a puštěn přes 70 ml kationtovou výměnnou kolonu SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) při průtokové rychlosti 20 ml/minutu. Kolona byla ekvilibrována pufrem A (20 mM MES, 20 mM NaCI, pH 5,8). Po promytí 5 objemy kolony pufrem A byla bscCD19xCD3 eluována s gradientem 45 % pufru B (20 mM MES, IM NaCI, pH 5,8) v pufru A. K eluátu bylo přidáno 0,045 objemu IM Tris/HCL, pH 8,5, obsahujícího 47mM imidazolů a byl pak sterilován filtrací (0,2 pm, AcroCap). Typický eluční profil kationtové výměnné chromatografie je ukázán na obrázku 12. bscCD19xCD3 byla obsažena ve frakci 6.

Afínitní chromatografie s cheláty kobaltu: Eluát z kationtové výměnné kolony byl puštěn při průtokové rychlosti 2,5 ml/minutu přes 10 ml kolonu Chelatíng Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrovanou pufrem AO (50 mM Na₂HPO₄, 400 mM NaCI, pH 8,0). Kolona byla předem ekvilibrována s roztokem 0,lM chloridu kobaltu. Po promytí s 33 objemy kolony pufrem AO, pufrem A (50mM NB₂HPO₄, 400mM NaCI, 2mM imidazol, pH 6,4) a gradientem od 0 do 12 % pufru B (50mM Na₂HPO₄, 400mM NaCI, 500mM imidazol, pH 6,4) v pufru A, byla bscCD19xCD3 eluována v jednom kroku 30 ml 100% pufru B. Eluát byl sterilován filtrací, po které následovala přibližně 10 násobná koncentrace v přístroji MacroSep (Pall Gelman, limit propustnosti 10 kD). Typický eluční profil afínitní chromatografie s cheláty kobaltu je ukázán na obrázku 13. bscCD19xCD3 byla detekována ve frakci číslo 7.

Gelová filtrace: Koncentrovaný eluát z kolony pro afínitní chromatografii s cheláty kobaltu byl nanesen při průtokové rychlosti 0,75 ml/minutu na 124 ml kolonu High Load Superdex 200 (Pharmacia, preparativní stupeň) ekvilibrovanou fyziologickým roztokem pufrovaným fosfáty (Gibco). bscCD19xCD3 byla eluována ve frakci s molekulovou velikostí odpovídající přibližně 55 kD (obrázek 14, frakce číslo 7), Frakce gelové filtrace obsahující bscCD19xCD3 byla doplněna 5% lidským sérovým albuminem (Behring) a pak následovala sterilizace filtrací přes 0,1 pm filtr (Millex, Millipore).

Velké množství bscCD19xCD3 v supematantu buněčné kultury a různých aktivních frakcích z kolon, jak bylo analyzováno pomocí SDS-PAGE, je ukázáno na obrázku 11. bscCD19xCD3 byl hlavní proteinový pás detekovaný v supematantech buněčných kultur (dráha 2). Vysoce purifikovaný anti_CD19xanti-CD3, který byl použit pro léčení lidí, nevykázal zjistitelné nečistoty (obr. 11, dráha 5).

Příklad 7

Klinické použití bscCD19xCD3 u pacienta s lymfomem pocházejícím z lymfocytů B

V soucitném použití byl pacient (A-B, žena, narozena 1937) trpící chronickou lymfatickou leukémií typu Β (B CLL) léčen bispecifickou jednořetězcovou protilátkou bscCD19xCD3.

Pacientova anamnéza a zdůvodnění:

U pacienta byla diagnostikována B CLL v r. 1992. V době počáteční diagnózy nemoc postihla různé oblasti lymfatických uzlin a slezinu, kromě toho byla pozorována hemolytická anémie auto imunitního původu a deficit imunoglobulinů. Pacient má struma nodosa, která je dobře kontrolována a pacient je v eutyreoidním stavu díky léčení karbimazolem v dávce 2,5 mg/den.

-25C7. 302070 B6

Pacient byl od r. 1992 do r. 1994 léčen mnohonásobnými chemoterapeutickými cykly chlorambucilem a prednizonem. Po progresi nemoci byla léčba změněna na cyklofosfamid, doxorubicin, vinkristin a prednizon (CHOP, 8 cyklů) a bylo dosaženo remise trvající déle než jeden rok. Po novém relapsu pacient obdržel dalších 6 cyklů CHOP, následovanými léčbou chlorambucilem a prednizonem a jednu kúru samotným chlorambucilem, která nezpůsobila ústup nemoci. V prosinci 1998 bylo provedeno ozáření sleziny, aby se potlačila postupující splenomegalie pacienta. Pacient prodělal vážné snížení aktivity kostní dřeně s četnými infekčními komplikacemi. Pacientova anémie a trombocytopenie vyžadovala časté transfúze červených krvinek a substituci destiček.

II)

IJ tohoto pacienta nebyla indikována útočnější chemoterapie nebo léčba vysokými dávkami pro pokročilý stupeň choroby a zhoršenou funkci kostní dřeně. Léčení s protilátkou anti- CD20 rituximabem nebylo vhodné, protože účinnost rituximabu u B CLL nebyla doposud jasně prokázána.

Analýza FACS odhalila, že 95 % buněk periferní krve pacienta byly CD19-pozitivní buňky, zatímco 77 % buněk exprimovalo antigen CD20. Inkubace buněk periferní krve pacienta s bscCDI9xCD3 ukázala výraznou depleci CD 19-, pozitivních B lymfocytů (viz příklad 5). Proto lékaři rozhodli léčit pacienta s novou bscCD19xCD3 (soucitné použití). Pacient byl podrobně informován o novosti sloučeniny a o možném riziku a užitku této léčby. Pacient plně rozu2o měl vysvětlení a vyjádřil písemně informovaný souhlas s tímto soucitným použitím.

Popis klinického podávání;

Před začátkem léčby pacient podstoupil klinické vyšetření a četné diagnostické proceduiy, aby byl ověřen stupeň nemoci a aby byly vyloučeny jakékoliv další rizikové faktory. Pacient byl v dobrém klinickém stavu, co se týče anémie, trombocytopenie a ztráty hmotnosti, ale bez jakékoliv kardiovaskulární poruchy nebo jiných komplikací zabraňujících použití bscCD19xCD3. Během nocí před prvními dny léčby měl pacient migrénu. Při podávání bscCD19xCD3 byl pacient hospitalizován na nemocničním oddělení v podmínkách intenzivní péče, aby bylo zajiš3o těno rychlé léčení jakékoliv náhlé příhody, která by mohla nastat. Pro prevenci akutní cytokinové reakce a komplikací z lýze nádorových buněk dostal pacient profylaktické i. v. dávky 2 mg klemastínu (Tavegii®) a 200 mg cimetidinu (Tagamet®), jakož i 300 mg alopurinolu a 20 mg omeprazolu (Antra®).

V průběhu léčení a období dalšího sledování byla prováděna alkalizace a heparinizace. Kromě toho pacient dostával veškerou potřebnou symptomatickou léčbu.

Před podáváním léku a v průběhu léčení byly odebírány vzorky krve pro sledování biochemických, hematologických a imunologických ukazatelů.

První podávání bscCD19xCD3 (14. dubna 1999):

Pacient dostal první dávku 3 pg bscCD19xCD3 jako 20 minutovou infúzi v izotonickém fosfátovém pufru obsahujícím 5% lidský sérový albumin (HSA). Během infúze pacient nepociťoval žádné nepříznivé účinky. Přibližně 1 hodinu po infúzi měl pacient přibližně 5 minut třesavku, po které následovalo pocení, mírný pokles krevního tlaku o přibližně 10 mmHg a mírný vzestup tělesné teploty (+ 0,5 °C) po dobu několika hodin. Kromě toho se nepatrně zhoršily bolesti hlavy. Pacient byl léčen dalšími 2 mg Tavegilu® a 200 mg Tagametu®, 250 mg prednizolonu (SoluDecortin®) a 50 mg pethidinu (Dolantin®). Všechny příznaky vymizely tentýž den bez následků.

Druhé podávání bscCD19xCD3 (15. dubna 1999):

Druhá dávka 10pg bscCD19xCD3 byla podána den později za stejných podmínek. Přibližně 1 hodinu po infúzi měl pacient nápadnou třesavku, horečku (39,2 °C), mírnou hyperventilaci a hypotenzní reakci. Pacient byl léčen 2 mg Tavegilu, 200 mg Tagametu a 300 mg Solu-Decor-26CZ 302070 B6 tinu a 15 mg piritramidu (Dipidolor®)· Pro stabilizaci kardiovaskulárních funkcí dostal pacient infúzi dopaminu a objemovou substituci. Po této léčbě se příznaky výrazně zmenšily. Nicméně přesto byl pacient přemístěn přes noc na kardiologické oddělení, aby bylo zajištěno řádné sledování životních funkcí a v případě nutnosti okamžitý zákrok. Druhý den ráno byl pacient přemís5 těn na normální nemocniční pokoj bez dalších komplikací.

Během dalších 3 dnů pacientovi přetrvávala subfebrilní teplota (přibližně 37,2 °C) a den později po druhé dávce se objevil menší pleurální výpotek (16. duben 1999) a mírný edém dolních končetin (duben 18. 1999). Kardiovaskulární činnost zůstala stabilní a laboratorní vyšetření neodhalí) lilo mimořádné změny vzhledem k bezpečnému podání léku kromě zvýšení γ-glutamyltransferázy po druhé dávce bscCD19xCD3 (obrázek 15).

Protože bscCD19xCD3 byla pacientem tolerovaná a nepříznivé účinky byly zvládnuty symptomatickou léčbou, bude u tohoto pacienta pokračovat podávání nové bscCD19xCD3.

Klinická a imunologická účinnost bscCD19xCD3:

Klinické výsledky:

2o Ultrazvukové vyšetření sleziny a pěti abdominálních a axilárních lymfatických uzlin bylo provedeno jeden a čtyři dny po podávání druhé dávky bscCD19xCD3. Již jeden den po dávce 10 pg (16. dubna 1999) vykázaly lymfatické uzliny, a také slezina, zmenšení přibližně o 20 % ve srovnání s výchozím hodnocením. Toto pozorování bylo potvrzeno při druhém ultrazvukovém vyšetření 19. dubna 1999. Hmotnost sleziny se zmenšila o 350 g (z 1630 g při výchozím hodnocení na

1 2 80 g 19. dubna 1999) (tabulka 1, obrázek 16).

Hematologické výsledky:

Počet bílých krvinek, který zahrnoval z největší části maligní B lymfocyty, během léčebné kúry a ve dnech dalšího sledování klesl (tabulka 2, obrázek 17). C-reaktivní protein (CRP) je protein akutní fáze, který odráží aktivaci T Iymfocytů a účinek prozánětlívých cytokinů. Po podání 10 pg bscCD19xCD3 se jeho hodnoty nápadně zvýšily, a pak během dalších 3 dnů pozorování následoval kontinuální pokles (tabulka 2, obrázek 18).

Imunologické výsledky:

Hladina sérových cytokinů, které odráží akutní imunologickou reakci na podávání sloučeniny, byla měřena před podáváním nové sloučeniny a v různých intervalech po podávání. Sérové hladiny cytokinů a rozpustného receptoru IL-2 byly měřeny kvantitativním testem EL1SA podle inst40 rukci výrobce.

Nádorový nekrotický faktor TNF-α významně vzrostl způsobem závislým na dávce během první hodiny po podávání bscCD19xCD3 (obrázek 19).

Interleukin 6 (IL—6) a interleukin 8 (IL—8) také vykázaly významné zvýšení závislé na dávce. Jejich maximální hladiny byly pozorovány 2 až 4 hodiny po podáváni bscCDI9xCD3 (obrázky 20, 21). Všechny cytokiny se vrátily na výchozí hladinu během několika hodin.

Rozpustný receptor IL-2 byl zvýšený již při výchozím vyšetření, což může být vysvětleno tím, že masa maligních B Iymfocytů exprimuje receptor IL-2. Po podávání nové bscCD19xCD3 bylo pozorováno zvýšení rozpustného receptoru IL-2, což ukazuje aktivaci efektorových buněk (obrázek 22).

-27CZ 302070 B6

Závěr:

Nová bscCD19 CD3 byla podávána bezpečně pacientovi trpícímu refraktemí B CLL. Snášen5 livost bscCDI9xCD3 v dávkách 3 pg a 10 pg byla přijatelná a může být dobře kontrolována pomocí profy I akt i c kých opatření a symptomatické léčby.

Nová bscCD19xCD3 způsobila zmenšení již předtím zvětšené sleziny a lymfatických uzlin pacienta, jak ukázáno při vyšetření ultrazvukem. Protože zvětšení sleziny a lymfatických uzlin je lo způsobeno infiltrací maligními B lymfocyty, zmenšení odráží zničení maligních B lymfocytů jako následek podávání bscCD19xCD3.

V ostrém protikladu ke každé jiné bispecifické protilátce CD19XCD3 v oboru známé, bispecifleká protilátka CD19XCD3 podle vynálezu (bscCD19xCD3) se projevila klinicky účinná u nehodgkinského lymfomu pocházejícího z B lymfocytů, jak měřeno zmenšením lymfoidních orgánů infiltrovaných maligními B lymfocyty. Ukázalo se, že bscCD19xCD3 je klinicky účinná výhodně v překvapivě nízkých dávkách, které jsou při systémovém podávání dobře tolerovány. Tudíž klinická účinnost bscCD19xCD3 potvrdila její výjimečnou cytotoxickou aktivitu, jak byla zjištěna in vitro.

Tabulka 1

IJěinek bscCDl9xCD3 na velikost lymfatických uzlin a sleziny pacienta s lymfomem pocházejí25 cím z lymfocytů B.

Ultrazvuková měření	12.4.1999	16.4.1999	19.4.1999
lymfatické	abdominální	1	54x29x14 mm	42x30x13 mm	42x30x14 mm
uzliny			2	56x33x18 mm	43x33x18 mm	43x30x16 mm
			3	46x32x27 mm	46x31x22 mm	47x32x23 mm
	axilární	vlevo	36x24x16 mm	34x22x15 mm	30x22x14 mm
		vpravo	37x24x13 mm	33x20x11 mm	32x23x14 mm
slezina				270x146x69 mm	265x132x64 mm	265x128x63 mm
				1630 g	1340 g	1280 g

Velikost tří abdominálních lymfatických uzlin, jedné levé a jedné pravé axilární lymfatické 3o uzliny a sleziny byla určena a měřena ultrazvukovým vyšetřením s použitím přístroje Toshiba

SSA100. Velikosti jsou uvedeny ve třech rozměrech a v mm. Hmotnost sleziny byla vypočítána z rozměrů a ultrazvukové hustoty.

-28CZ 302070 B6

Tabulka 2

Hladiny vybraných ukazatelů v krvi jako reakce na léčení s bscCD19xCD3.

		14.4. 1999	15.4. 1999	16.4. 1999	17.4. 1999	18.4. 1999	19.4. 1999
	jednotky
GGT	U/l	22	24 (ráno) - (večer)	124 (6,00) 107 ¢12,00)	96	89	87
LDH	U/l	618	536 (ráno) 773 (večer)	548	697	551	539
Leukocyty	Gpt/1	46, 8	43.3 (ráno) 22.3 (večer)	36,9	37,0	28,3	36, 6
Lymfocyty	%	85	58,8 (ráno) 82,0 (večer)	60, 9	64,4	65,5	88
CRP	mg/dl	< 0,4	1,0 (ráno) 0,7 (večer)	5,2	2,5	2,0	0,7

Hladiny gamaglutamyltransferázy (GGT), laktátdehydrogenázy (LDH) a C-reaktivního proteinu (CRP) v krvi byly určovány standardními metodami klinické biochemie a jsou vyjádřeny jako io jednotky/ml (U/ml) (GGT), jednotky/1 (U/ml) (LDH) a mg/dl (CRP). Počet leukocytů je vyjádřen v 10⁹/l a počet lymfocytů je uvedený jako procento ze všech leukocytů. Výchozí hladiny 14. dubna 1999 před léčbou jsou udány na prvním řádku. Reakce na 3 pg bscCD19xCD3 15. dubna (která byla podána 14. dubna) je ukázána na druhém řádku. Reakce na druhé podání 10 pg sloučeniny tentýž den je ukázána na třetím řádku. Hladiny vyvolených ukazatelů čtyři dny po ošetření lékem jsou uvedeny na posledních čtyřech řádcích.

SEZNAM LITERATURY

I. Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 7021-5, 1995.

2. Giannt, N Engl. J. Med. 336, 1290-7, 1997.

3. Urba, J. Nati. Cancer Inst. Monogr., 29-37, 1990.

4. Fisher, Cancer, 1994.

5. Bohlen, Blood, 82, 1803-121, 1993.

6. Bohlen, Cancer Res, 53, 18:4310-4, 1993.

7. Bohlen, Cancer Res, 57,1704-9, 1997.

8. Haagen, din Exp Immunol, 90, 368-75, 1992.

9. Haagen, Cancer Immunol Immunother., 39, 391-6, 1994.

10. Haagen, Blood, 84, 556-63, 1994.

II. Haagen, Blood, 85, 3208-12, 1995.

12. Weiner, Leuk Lymphoma, 16, 199-207, 1995.

13. Csoka, Leukemia, 10, 1765-72, 1996.

14. Uckun, Proč. Nati. Acad. Sci. USA., 85, 8603-7, 1988.

15. Staerz, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 1453-7, 1986.

16. Lanzavecchia, Eur J Immunol, 17, 105-11, 1987.

17. Mallender, J Biol Chem, 269, 199-206, 1994.

-29CZ 302070 B6

18. Gruber, J Immunol, 152,5368-74, 1994.

19. KosteIny, J Immunol, 148, 1547-53, 1992.

20. Mack, J Immunol, 158,3965-70, 1997.

21. Kufer, Cancer Immunol Immunother, 45, 193-7, 1997.

22. Pezzutto, J Immunol, 138, 2793-9. 1987.

23. Orlandi, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 3833-7, 1989.

24. Dubel, J Immunol Methods, 175, 89-95, 1994.

25. Traunecker, EmboJ, 10, 3655-9, 1991.

26. Laemmti, Nátuře, 227, 680-5, 1970.

io 27. Bohlen, J Immunol Methods, 173,55-62, 1994.

28. Demanet, Int J Cancer Suppl, 7, 67-8, 1992.

29. De, J Hematother, 4, 433-7, 1995.

30. Haagen, Leuk Lymphoma, 19,381-93, 1995.

31. Anderson, Blood, 80, 2826-34, 1992.

32. Zhu, Int J Cancer, 62, 319-24, 1995.

33. Hartmann, Blood, 89, 2042-7, 1997.

34. Valone, J Clin Oncol, 13,2281-92, 1995.

35. Valone, J Hematother, 4, 471-5, 1995.

36. Bolhuis, Int J Cancer Suppl, 7, 78-81, 1992.

2o 37. Canevari, J Nati Cancer Inst, 87, 1463-9, 1995.

38. Nitta, Lancet, 335, 368-71, 1990.

39. Yokota, Cancer Res, 52, 3402-8, 1992.

40. Weiner, J Immunol, 152,2385-92, 1994.

41. Maloney, Blood 84, 2457-66, 1994.

42. RetT, Blood 83, 435-45. 1994.

43. Kipriyanov, Int. J. Cancer, 77, 763-772, 1998.

SEZNAM SEKVENCÍ w (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů bází 55 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina 40 (A) POPIS: /decs = „oligonukleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

GAAGCACGCG TAGATATCKT GMTSACCCAA WCTCCA 36

- 30CZ 302070 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - „oligonukleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

GAAGATGGAT CCAGCGGCCG CAGCATCAGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineami (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „oligonukleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3: CAGCCGGCCA TGGCGCAGGT SCAGCTGCAG SAG

2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - „oligonukleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: ano

-31 CZ 302070 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

ACCAGGGGCC AGTGGATAGA CAAGCTTGGG TGTCGTTTT 39

2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

io (A) DÉLKA: 36 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: Zdesc = „oligonukleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

AGGTGTACAC TCCATATCCA GCTGACCCAG TCTCCA 3 6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 párů bází 30 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „oligonukleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

GGAGCCGCCG CCGCCAGAAC CACCACCTTT GATCTCGAGC TTGGTCCC 48 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-32CZ 302070 B6 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „oligonukleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGTTCT CAGGTACTGC AGAGTCGG 48 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „oligonukleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

AATCCGGAGG AGACGGTGAC CGTGGTCCCT TGGCCCCAG 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1611 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: double (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLECULE TYP: cDNA 40 (iii) HYPOTETICKÁ: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 11..1603 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

GAATTCCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA AGA 49

Met Gly Trp Ser Cys lle lle Leu Phe Leu Val Ala Thr

-33CZ 30207« B6

GCT ACA

GGT GTC CAC TCC

GAC TAC

AAA GAT GAT Lys Asp Asp

GAC GAT Asp Asp

AAG Lys GGG Gly

GAT Asp CAG Gin

ATC Ile AGG Arg 45

97 145

Ala CAG Gin 30

Thr 15 CTG Leu

Gly Val

His TCT Ser

Ser CCA Pro 35

Asp 20 GCT Ala

Tyr TCT Ser

ACC Thr

CAG Gin

TTG Leu

GCT Ala

GTG Val 40

25 TCT Ser

CTA Leu

GCC

ACC

ATC

TCC

TGC

AAG

GCC

AGC

CAA

AGT

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

193

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

50

55

60

AGT

TAT

TTG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

ATT

CCA

GGA

CAG

CCA

ccc

AAA

CTC

241

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Ile

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

65

70

75

CTC

ATC

TAT

GAT

GCA

TCC

AAT

CTA

GTT

TCT

GGG

ATC

CCA

ccc

AGG

TTT

289

Leu

Ile

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Leu

Val

Ser

Gly

Ile

Pro

Pro

Arg

Phe

80

85

90

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

CTC

AAC

ATC

CAT

CCT

GTG

337

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

Ile

His

Pro

Val

95

100

105

GAG

AAG

GTG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

CAC

TGT

CAG

CAA

AGT

ACT

GAG

GAT

385

Glu

Lys

Val

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

His

Cys

Gin

Gin

Ser

Thr

Glu

Asp

110

115

120

125

CCG

TGG

ACG

TTC

GGT

GGA

GGG

ACC

AAG

CTC

GAG

ATC

AAA

GGT

GGT

GGT

433

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Gly

Gly

Gly

130

135

140

GGT

TCT

GGC

GGC

GGC

GGC

TCC

GGT

GGT

GGT

GGT

TCT

CAG

GTG

CAG

CTG

481

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

145

150

155

CAG

CAG

TCT

GGG

GCT

GAG

CTG

GTG

AGG

CCT

GGG

TCC

TCA

GTG

AAG

ATT

529

Gin

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

Pro

Gly

Ser

Ser

Val

Lys

Ile

160

165

170

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGC

TAT

GCA

TTC

AGT

AGC

TAC

TGG

ATG

AAC

TGG

577

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Tyr

Trp

Met

Asn

Trp

175

180

185

34CZ 302070 B6

GTG

AAG

CAG

AGG

CCT

GGA

CAG

GGT

CTT

GAG

TGG

ATT

GGA

CAG

ATT

TGG

Val 190

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly 195

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp 200

Ile

Gly

Gin

Ile

Trp 205

CCT

GGA

GAT

GGT

GAT

ACT

AAC

TAC

AAT

GGA

AAG

TTC

AAG

GGT

AAA

GCC

Pro

Gly

Asp

Gly Asp 210

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly 215

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys 220

Ala

ACT

CTG

ACT

GCA

GAC

GAA

TCC

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

ATG

CAA

CTC

AGC

Thr

Leu

Thr

Ala 225

Asp

Glu

Ser

Ser

Ser 230

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin 235

Leu

Ser

AGC

CTA

GCA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TTC

TGT

GCA

AGA

CGG

GAG

Ser

Leu

Ala 240

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala 245

Val

Tyr

Phe

Cys

Ala 250

Arg

Arg

Glu

ACT

ACG

ACG

GTA

GGC

CGT

TAT

TAC

TAT

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

Thr

Thr 255

Thr

Val

Gly

Arg

Tyr 260

Tyr

Tyr

Ala

Met

Asp 265

Tyr

Trp

Gly

Gin

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCC

GGA

GGT

GGT

GGA

TCC

GAT

ATC

AAA

Gly 270

Thr

Thr

Val

Thr

Val 275

ser

Ser

Gly

Gly

Gly 280

Gly

Ser

Asp

Ile

Lys 285

CTG

CAG

CAG

TCA

GGG

GCT

GAA

CTG

GCA

AGA

CCT

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

Leu

Gin

Gin

Ser

Gly 290

Ala

GlU

Leu

Ala

Arg 295

Pro

Gly

Ala

Ser

Val 300

Lys

ATG

TCC

TGC

AAG

ACT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTT

ACT

AGG

TAC

ACG

ATG

CAC

Met

Ser

Cys

Lys 305

Thr

Ser

Gly

Tyr

Thr 310

Phe

Thr

Arg

Tyr

Thr 315

Met

His

TGG

GTA

AAA

CAG

AGG

CCT

GGA

CAG

GGT

CTG

GAA

TGG

ATT

GGA

TAC

ATT

Trp

Val

Lys 320

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin 325

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile 330

Gly

Tyr

Ile

62S

673

721

769

817

865

913

961

1009

AAT CCT Asn Pro 335

AGC Ser

CGT GGT TAT ACT AAT TAC AAT CAG AAG

TTC AAG GAC AAG

Arg

Gly Tyr

Thr 340

Asn Tyr

Asn

Gin

Lys 345

Phe

Lys

Asp

Lys

GCC

ACA

TTG

ACT

ACA

GAC

AAA

TCC

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

ATG

CAA

CTG

Ala

Thr

Leu

Thr

Thr

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

350

355

360

365

1057

1105

35CZ 302070 B6

AGC Ser

AGC CTG

ACA TCT

GAG GAC TCT

GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA TAT

1153

Ser

Leu

Thr

Ser 370

Glu

Asp

Ser

Ala

Val 375

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg 380

Tyr

TAT

GAT

GAT

CAT

TAC

TGC

CTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGC

ACC

ACT

CTC

1201

Tyr

Asp

Asp

His

Tyr

Cys

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

385

390

395

ACA

GTC

TCC

TCA

GTC

GAA

GGT

GGA

AGT

GGA

GGT

TCT

GGT

GGA

AGT

GGA

1249

Thr

Val

Ser

Ser

Val

Glu

Gly

Gly

Ser

Gly Gly

Ser

Gly

Gly

Ser

Gly

400

405

410

GGT

TCA

GGT

GGA

GTC

GAC

GAC

ATT

CAG

CTG

ACC

CAG

TCT

CCA

GCA

ATC

1297

Gly

Ser

Gly

Gly

Val

Asp

Asp

Ile

Gin

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ile

415

420

425

ATG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

TGC

AGA

GCC

AGT

1345

Met

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

430

435

440

445

TCA

AGT

GTA

AGT

TAC

ATG

AAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

TCA

GGC

ACC

TCC

1393

Ser

Ser

Val

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Ser

Gly

Thr

Ser

450

455

4 60

ccc

AAA

AGA

TGG

ATT

TAT

GAC

ACA

TCC

AAA

GTG

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

1441

Pro

Lys

Arg

Trp

Ile

Tyr

Asp

Thr

Ser

Lys

Val

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

465

470

475

TAT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCA

TAC

TCT

CTC

ACA

ATC

1489

Tyr

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

480

485

490

AGC

AGC

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAA

CAG

TGG

1537

Ser

Ser

Met

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

495

500

505

AGT

AGT

AAC

CCG

CTC

ACG

TTC

GGT

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

CTG

AAA

1585

Ser

Ser

Asn

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

510

515

520

525

CAT

CAT

CAC

CAT

CAT

CAT

TAGTCGAC

1611

His

His

His

His

His

His

530

36CZ 302070 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 531 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein o

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

1

5

10

15

Val

His

Ser

Asp

Tyr

Lys

Asp

Asp

Asp

Asp

Lys

Asp

Ile

Gin

Leu

Thr

20

25

30

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

Val

Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

Ile

35

40

45

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

50

55

60

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Ile

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

65

70

75

80

Asp

Ala

Ser

Asn

Leu

Val

Ser

Gly

Ile

Pro

Pro

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

85

90

95

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

Ile

His

Pro

Val

Glu

Lys

Val

100

105

110

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

His

Cys

Gin

Gin

Ser

Thr

Glu

Asp

Pro

Trp

Thr

115

120

125

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Gly

130

135

140

Gly

Gly

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Gin

Ser

145

150

155

160

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

Pro

Gly

Ser

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

165 170 175

-37CZ 302070 B6

Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val

Lys

180

185

190

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Gin

Ile

Trp

Pro

Gly

195

200

205

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

210

215

220

Ala

Asp

Glu

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

225

230

235

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Thr

245

250

255

Val

Gly

Arg

Tyr

Tyr

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

260

265

270

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Gly

Gly Gly

Gly

Ser

Asp

Ile

Lys

Leu

Gin

275

280

285

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Ala

Arg

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Met

Ser

290

295

300

Lys

Thr

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Arg

Tyr

Thr

Met

His

Trp

Val

305

310

315

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Asn

Pro

325

330

335

Arg

Gly

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Asp

Lys

Ala

Thr

340

345

350

Thr

Thr

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

355

360

365

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Tyr

Tyr

Asp

370

375

380

His

Tyr

Cys

Leu

Asp

Tyr Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

385 390 395

Gin

Asp

Thr

Ala

240

Thr

Thr

Gin

Cys

Lys

320

Ser

Leu

Leu

Asp

Ser

400

-38CZ 302070 B6

Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
	405	410	415
Gly Val Asp	Asp Xle	Gin Leu Thr Gin Ser Pro	Ala Ile Met Ser Ala
	420	425	430
Ser Pro Gly	Glu Lys	Val Thr Met Thr Cys Arg	Ala Ser Ser Ser Val
435		440	445
Ser Tyr Met	Asn Trp	Tyr Gin Gin Lys Ser Gly	Thr Ser Pro Lys Arg
450		455	460
Trp Ile Tyr	Asp Thr	Ser Lys Val Tkla Ser Gly	Val Pro Tyr Arg Phe
465		470 47S	480
Ser Gly Ser	Gly Ser	Gly Thr Ser Tyr Ser Leu	Thr Ile Ser Ser Met
	485	490	495
Glu Ala Glu	Asp Ala	Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin	Gin Trp Ser Ser Asn
	500	505	510
Pro Leu Thr	Phe Gly	Ala Gly Thr Lys Leu Glu	Leu Lys His His His
515		520	525
His His His
530
		PATENTOVÉ NÁROKY

ιο 1. Jednořetězcový multifunkční polypeptid, který obsahuje

Claims (26)

1. (a) první doménu obsahující vazebné místo imunoglobulinového řetězce nebo protilátky specificky rozpoznávající CD19 antigen, a

   15 (b) druhou doménu obsahující vazebné místo imunoglobulinového řetězce nebo protilátky specificky rozpoznávající CD3 antigen lidských T buněk, kde uvedené domény jsou uspořádány v pořadí V_LCD19-V_HCDI9-V_HCD3-V_LCD3.

   20
2. 2. Polypeptid podle nároku 1, kde dvě domény jsou spojeny prostřednictvím polypeptidové spojky.

   -39CZ 302070 B6
3. 3. Polypeptid podle nároku l nebo 2, kde první a/nebo druhá doména napodobuje nebo odpovídá V|| a V] oblasti přirozené protilátky.
4. 4. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků I až 3, kde protilátka je monoklonální protilátka,
5. 5 syntetická protilátka nebo humanizovaná protilátka.

   5. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků I až 4, kde alespoň jedna z domén je jed no řetězcový fragment variabilní oblasti protilátky.

   io
6. 6. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 2 až 5, kde polypeptidová spojka obsahuje množství zbytků glycinu, alaninu a/nebo šeřinu.
7. 7. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 2 až 6, kde polypeptidová spojka obsahuje množství po sobě následujících kopií aminokyselinové sekvence.
8. 8. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 2 až 7, kde polypeptidová spojka obsahuje 1 až 5 aminokyselinových zbytků.
9. 9. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 2 až 8, kde polypeptidová spojka obsahuje amino20 kyselinovou sekvenci Gly Gly Gly Gly Ser.
10. 10. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kde první doména obsahuje alespoň jednu CDR z Vjí a Vl oblasti zahrnující aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA sekvencí zobrazenou na obrázku 8 od nukleotidu 82 do 414 (V_L) a nukleotidu 460 až 831 (V_M) a/nebo kde druhá

    25 doména obsahuje alespoň jednu CDR z V₍₁ a Vl oblasti zahrnující aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA sekvencí zobrazenou na obrázku 8 od nukleotidu 847 do 1203 (V_H) a nukleotidu 1258 až 1575 (V,.).
11. 11. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků I až 10, kde (a) vazebné místo první domény má afinitu přinejmenším 10 ⁷ M, a/nebo

    55 (b) vazebné místo druhé domény má afinitu menší než 10 ⁷ M.
12. 12. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kterým je bispecifickájednořetězcová protilátka.

    •to
13. 13. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků I až 12, který obsahuje alespoň jednu další doménu.
14. 14. Polypeptid podle nároku 13, kde další doména je připojená prostřednictvím kovalentní nebo nekovalentní vazby.

    45
15. 15. Polypeptid podle nároku 13 nebo 14, kde alespoň jedna další doména obsahuje efektorovou molekulu mající konformaci vhodnou pro biologickou aktivitu, schopnou sekvestrace iontu nebo selektivní vazby na pevný podklad nebo k předem vybrané determinantě.
16. 16. Polynukleotid, který při expresi kóduje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
17. 17. Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 16.
18. 18. Buňka transfekovaná polynukleotídem podle nároku 16 nebo vektorem podle nároku 17.

    -40CZ 302070 B6
19. 19. Způsob přípravy polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků I až 15, vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci buňky podle nároku 18 a izolaci polypeptidů z tkáňové kultury.
20. 20. Prostředek, kterým je farmaceutický prostředek nebo diagnostický prostředek, vyzná5 Čující se tím, že obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, póly nukleotid podle nároku 16 nebo vektor podle nároku 17.
21. 21. Prostředek podle nároku20, vyznačující se tím, že tímto prostředkem je farmaceutický prostředek, který případně dále obsahuje farmaceuticky přijatelnou nosičovou i o látku.
22. 22. Prostředek podle nároku 20, vyznačující se tím, že tímto prostředkem je diagnostický prostředek, který případně dále obsahuje činidla vhodná pro detekci.

    [5
23. 23. Použití polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, polynukleotidu podle nároku 16 nebo vektoru podle nároku 17 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení malignit B lymfocytů, autoimunitních chorob se vztahem k B lymfocytům nebo deplece B lymfocytů.
24. 24. Použití podle nároku 23, kde malignita B lymfocytů je nehodgkinský lymfom.
25. 25. Použití polynukleotidu podle nároku 16 nebo vektoru podle nároku 17 pro výrobu přípravků pro genovou terapii.
26. 26. Způsob identifikace aktivátorů nebo inhibitorů aktivace nebo stimulace T lymfocytů,

    25 vyznačující se tím, že obsahuje (a) pěstování T lymfocytů a CD 19 pozitivních buněk, výhodně B lymfocytů, v přítomnosti polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 a případně v přítomnosti složky schopné poskytnout detekovatelný signál jako odpověď na aktivaci T lymfocytů testovanou sloučeninou v pod30 mínkách umožňuj ících aktivaci T lymfocytů, a (b) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti signálu vzniklého interakcí sloučeniny s buňkami.