ES2980787T3

ES2980787T3 - Constructo de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico con distribución tisular potenciada

Info

Publication number: ES2980787T3
Application number: ES15753907T
Authority: ES
Inventors: Peter Kufer; Patrick Hoffmann; Markus Munz; Matthias Klinger; Elaine-Pashupati Dopfer; Elisabeth Nahrwold
Original assignee: Amgen Research Munich GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2024-10-03
Anticipated expiration: 2035-07-31
Also published as: MX384418B; WO2016016415A1; EP3174903B1; AU2015295242B2; JP6698065B2; JP2017522891A; AR101400A1; AU2015295242A1; CA2952540A1; TW201609811A; US20250333535A1; EP3174903C0; EP3174903A1; CA2952540C; MX2017001403A; US20170275373A1

Abstract

La presente invención proporciona un constructo de anticuerpo monocatenario biespecífico que se une a un antígeno de superficie de célula diana a través de un primer dominio de unión y al antígeno de superficie de célula T CD3 a través de un segundo dominio de unión, comprendiendo el constructo dos péptidos de unión a FcRn. Además, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el constructo de anticuerpo, un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico y una célula huésped transformada o transfectada con dicho vector. Además, la invención proporciona un proceso para la producción del constructo de anticuerpo de la invención, un uso médico de dicho constructo de anticuerpo y un kit que comprende dicho constructo de anticuerpo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Constructo de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico con distribución tisular potenciada

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un constructo de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico que se une a un antígeno de superficie celular diana por medio de un primer dominio de unión y al antígeno de superficie de células T CD3 por medio de un segundo dominio de unión, comprendiendo el constructo dos péptidos de unión a FcRn tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Además, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el constructo de anticuerpo, un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico y una célula huésped transformada o transfectada con dicho vector tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Además, la invención proporciona un proceso para la producción del constructo de anticuerpo de la invención, un uso médico de dicho constructo de anticuerpo y un kit que comprende dicho constructo de anticuerpo tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Antecedentes de la invención

Una cuestión decisiva durante el desarrollo de una composición farmacéutica es si el compuesto activo alcanza de manera cuantitativa su diana para mostrar eficacia. Para enfoques terapéuticos que hacen uso de compuestos derivados de anticuerpo captador de células T biespecífico, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer, enfermedades víricas o inflamatorias, la cuestión correspondiente es si el compuesto derivado de anticuerpo alcanza una concentración suficiente en el compartimiento de las células diana. Las moléculas biespecíficas tales como los anticuerpos BiTE® (captadores de células T biespecíficos) son constructos de proteínas recombinantes hechos de dos dominios de unión derivados de anticuerpo ligados de manera flexible. Un dominio de unión de los anticuerpos BiTE® es específico para un antígeno de superficie asociado a tumor seleccionado en células diana; el segundo dominio de unión es específico para CD3, una subunidad del complejo receptor de células T en células T. Por su diseño particular, los anticuerpos BiTE® son adecuados de manera única para conectar de manera transitoria células T con células diana y, al mismo tiempo, activar potentemente el potencial citolítico inherente de las células T frente a las células diana. Los anticuerpos BiTE® son proteínas pequeñas con un peso molecular que permite a esos tipos de compuestos infiltrarse en compartimentos detrás de la barrera endotelial por medio de difusión paracelular. Sin embargo, el inconveniente de las proteínas pequeñas tales como los anticuerpos BiTE® es un peso molecular por debajo del límite renal que podría dar probablemente como resultado una semivida más corta, una característica que los anticuerpos BiTE® comparten con muchos otros formatos de anticuerpo.

Una semivida aumentada es generalmente útil en aplicacionesin vivode inmunoglobulinas, especialmente anticuerpos y lo más especialmente fragmentos de anticuerpo de tamaño pequeño. Aunque tales constructos de anticuerpo a base de fragmentos de anticuerpo (Fv, Fv unidos por disulfuro, Fab, scFv, dAc) son capaces de alcanzar rápidamente la mayoría de las partes del cuerpo, es probable que esos constructos de anticuerpo sufran un rápido aclaramiento del cuerpo. Las estrategias descritas en la técnica para prolongar la semivida de constructos de anticuerpo tales como diacuerpos de cadena sencilla incluyen la conjugación de cadenas de polietilenglicol (PEGilación), la fusión a la región Fc de IgG o a una proteína estreptocócica G de forma de dominio de unión a albúmina (véase Stork 2009, JBC 284(38), págs. 25612). Todos esos enfoques tienen diferentes problemas, que tienen que abordarse por separado. La PEGilación puede o bien ser irreversible o bien el proceso puede alterar la actividad biológica y/o la distribución tisular del constructo de anticuerpo. La fusión de un constructo de anticuerpo biespecífico a una región Fc de IgG puede dar como resultado una molécula trifuncional tal como se describe para catumaxomab, que es capaz de reclutar un tipo de célula adicional por medio de la función Fc-FcR. Además, la fusión de un dominio de unión a albúmina de una fuente bacteriana puede aumentar la inmunogenicidad del constructo de anticuerpo, y generalmente se está de acuerdo en la técnica que la inmunogenicidad tiene que minimizarse con el fin de permitir una eficacia de larga duración de un compuesto a base de proteína en un paciente.

El documento WO 2006/071441 A2 da a conocer anticuerpos monoclonales completamente humanos que se unen específicamente a GPNMB, y usos de los mismos, así como inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-GPNMB y anticuerpos biespecíficos que comprenden un componente de anticuerpo anti-GPNMB y un componente anti-CD3, y métodos de uso de tales anticuerpos biespecíficos. Bertucciet al.,Anticancer Research 27:3441-3450 (2007) dan a conocer que el perfilado de expresión génica de líneas celulares de melanoma humano con distinto potencial metastásico identifica nuevos marcadores de progresión. Sockoloskyet al.,PNAS 109(40):16095-16100 (2012) dan a conocer la modificación mediante ingeniería de reciclaje y transcitosis mediados por receptor neonatal para Fc en proteínas recombinantes mediante extensiones de péptido terminales cortas.

Por tanto, aunque por un lado es deseable tener una molécula de unión pequeña, dado que puede, por ejemplo, alcanzar rápidamente su ubicación designada en el cuerpo y puede alcanzar también la mayoría de las partes del cuerpo, el pequeño “tamaño” de una molécula de unión de este tipo es por otro lado desfavorable en lo que respecta, en particular, al aclaramiento renal. El precio de la estrategia de aumentar el peso molecular de un constructo de anticuerpo por encima del umbral para el aclaramiento renal puede ser la pérdida de la distribución tisular apreciada o la alteración estérica de la función del anticuerpo. Por tanto, es un acto de equilibrio entre el tamaño pequeño, el aclaramiento renal, la estabilidad/funcionalidad y la distribución tisular.

Definiciones

Tiene que indicarse que tal como se usan en el presente documento, las formas en singular “un”, “una” y “el/la”, incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un reactivo” incluye uno o más de tales reactivos diferentes y la referencia a “el método” incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos habituales en la técnica que podrían modificarse o sustituirse para los métodos descritos en el presente documento.

A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término “al menos” precediendo una serie de elementos hace referencia a cada elemento en la serie.

El término “y/o” siempre que se use en el presente documento incluye el significado de “y”, “o” y “todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados mediante dicho término”.

El término “alrededor de” o “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento significa dentro de ±20%, preferiblemente dentro de ±15%, más preferiblemente dentro de ±10% y lo más preferiblemente dentro de ±5% de un valor o intervalo dado.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, implica la inclusión de un número entero o una etapa o un grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se use en el presente documento, el término “que comprende” puede sustituirse por el término “que contiene” o “que incluye” o en ocasiones cuando se use en el presente documento por el término “que tiene”.

Cuando se use en el presente documento, “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa o componente no especificado en el elemento reivindicado. Cuando se use en el presente documento, “que consiste esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afecten de manera material a las características básicas y novedosas de la reivindicación.

En cada caso en el presente documento, cualquiera de los términos “que comprende”, “que consiste esencialmente en” y “que consiste en” puede reemplazarse por cualquiera de los otros dos términos.

Descripción detallada de la invención

Tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento, una estrategia preferida para aumentar el volumen de distribución de un constructo de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico es el acoplamiento de dominios peptídicos pequeños, que permiten las características de distribución tisular preferidas, pero que evitan la alteración de la función de captación de células T de la molécula debido a efectos estéricos. Un posible enfoque en este contexto se describió para proteína recombinante fluorescente esférica por Sockolosky (PNAS 2012, 109 (40, pág. 16095). Este enfoque describe la fusión de extensiones peptídicas terminales cortas que se unen al receptor neonatal para Fc (FcRn). La proteína recombinante (mKate) usada por Sockolosky se modificó con el fin de prolongar la semivida de esas proteínas haciendo uso del sistema de reciclaje y transcitosis mediado por FcRn. Sin embargo, el uso de mKate, una proteína fluorescente roja lejana de la anémonaEntacmaea quadricolor,en combinación con péptidos de unión a FcRn es un sistema de modelo muy simplificado. A diferencia de la proteína mKate, un constructo de anticuerpo biespecífico captador de células T es una estructura mucho más compleja, que requiere para su funcionalidad la correcta formación del dominio de unión para permitir la unión a su epítopo específico. Esta unión es un requisito previo para conectar las propias células T de los pacientes con aquellas células que portan el epítopo diana (que es el epítopo del dominio de unión diana), lo que da como resultado la eliminación citotóxica de la célula diana. Naturalmente, un factor decisivo adicional para la funcionalidad de un constructo de anticuerpo captador de células T biespecífico es la cuestión de si el constructo todavía puede producirse en línea con estándares industriales para su utilidad farmacéutica. En vista del campo técnico descrito anteriormente, el problema subyacente a la presente invención es proporcionar constructos de anticuerpo de cadena sencilla biespecíficos funcionales que muestren una distribución tisular potenciada en comparación con los constructos de anticuerpo captador de células T biespecíficos conocidos en la técnica.

La presente invención proporciona un constructo de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico que se une a un antígeno de superficie celular diana por medio de un primer dominio de unión y al antígeno de superficie de células T CD3 por medio de un segundo dominio de unión, comprendiendo el constructo dos péptidos de unión a FcRn, en los que:

(a) un primer péptido de unión a FcRn consiste en la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLXiPANG(SEQ ID NO: 1) en la que X<1>es Y o H; y

(b) un segundo péptido de unión a FcRn consiste en la secuencia de aminoácidosTGHFGGLHP(SEQ ID NO: 4); no teniendo el constructo de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico una secuencia de aminoácidos tal como se representa en las SEQ ID NO:132-135.

En una realización del constructo de anticuerpo de la invención, el segundo péptido de unión a FcRn consiste en la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3) oQRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO: 5).

El término “constructo de anticuerpo” se refiere a una molécula en la que la estructura y/o la función se basa(n) en la estructura y/o la función de un anticuerpo, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o completa. Por tanto, un constructo de anticuerpo es capaz de unirse a su diana o antígeno específico. Además, un constructo de anticuerpo según la invención comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión a la diana. Este requisito mínimo puede, por ejemplo, definirse mediante la presencia de al menos las tres CDR de cadena ligera (es decir CDR1, CDR2 y c DR3 de la región VL) y/o las tres CDR de cadena pesada (es decir CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). Los anticuerpos en los que se basan los constructos según la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos.

Dentro de la definición de “constructos de anticuerpo” según la invención están anticuerpos de longitud completa o completos incluyendo anticuerpos de camélido y otros anticuerpos de inmunoglobulina generados mediante métodos o procesos biotecnológicos o de modificación mediante ingeniería de proteínas. Estos anticuerpos de longitud completa pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos. También están dentro de la definición de “constructos de anticuerpo” los fragmentos de anticuerpos de longitud completa, tales como VH, VHH, VL, (s)dAc, Fv, Fd, Fab, Fab’, F(ab’)2 o “r IgG” (“medio anticuerpo”). Los constructos de anticuerpo según la invención pueden ser también fragmentos modificados de anticuerpos, también denominados variantes de anticuerpos, tales como scFv, di-scFv o bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFvcremallera, scFab, Fab2, Fab3, diacuerpos, diacuerpos de cadena sencilla, diacuerpos en tándem (Tandab), di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem, “minicuerpos” ejemplificados mediante una estructura que es tal como sigue: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 o (scFv-CH3-scFv)2, multicuerpos tales como triacuerpos o tetracuerpos, y anticuerpos de un solo dominio tales como nanocuerpos o anticuerpos de un solo dominio variable que comprenden meramente un dominio variable, que puede ser VHH, VH o VL, que se unen específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V.

Además, la definición del término “constructos de anticuerpo” incluye constructos monovalentes, bivalentes y polivalentes/multivalentes y, por tanto, constructos monoespecíficos, que se unen específicamente a solo una estructura antigénica, así como constructos biespecíficos y poliespecíficos/multiespecíficos, que se unen específicamente a más de una estructura antigénica, por ejemplo, dos, tres o más, a través de distintos dominios de unión. Además, la definición del término “constructos de anticuerpo” incluye moléculas que consisten en solo una cadena polipeptídica así como moléculas que consisten en más de una cadena polipeptídica, cadenas que pueden ser o bien idénticas (homodímeros, homotrímeros u homooligómeros) o bien diferentes (heterodímero, heterotrímero o heterooligómero). Ejemplos de los anticuerpos identificados anteriormente y variantes o derivados de los mismos se describen entre otros en Harlow y Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) y Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2a ed. 2010 y Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

Los constructos de anticuerpo de la presente invención son preferiblemente “constructos de anticuerpo generadosin vitro".Este término se refiere a un constructo de anticuerpo según la definición anterior en el que toda o parte de la región variable (por ejemplo, al menos una CDR) se genera en una selección de célula no inmune, por ejemplo, una presentación en fagoin vitro,un chip proteico o cualquier otro método en el que secuencias candidatas puedan someterse a prueba para su capacidad para unirse a un antígeno. Por tanto, este término excluye preferiblemente secuencias generadas únicamente mediante reorganización genómica en una célula inmune en un animal. Un “anticuerpo recombinante” es un anticuerpo hecho a través del uso de tecnología de ADN recombinante o modificación mediante ingeniería genética.

La presente invención se refiere a “constructos de anticuerpo de cadena sencilla”. Por consiguiente, esos constructos de anticuerpo de cadena sencilla solo incluyen aquellas realizaciones de los constructos de anticuerpo descritos anteriormente que consisten en una única cadena polipeptídica.

El término “anticuerpo monoclonal” (Acm) o constructo de anticuerpo monoclonal tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se produzcan de manera natural y/o modificaciones postraduccionales (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio o determinante antigénico en el antígeno, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (o epítopos). Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan mediante el cultivo de hibridomas, por tanto sin estar contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben usarse pueden prepararse mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Koehleret al.,Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n ° 4.816.567). Los ejemplos de técnicas adicionales para producir anticuerpos monoclonales humanos incluyen la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica del hibridoma de EBV (Coleet al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

Los hibridomas pueden examinarse usando métodos estándar, tales como ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas(ELISA) y análisis de resonancia de plasmones superficiales (BIACORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno especificado. Cualquier forma del antígeno relevante puede usarse como inmunógeno, por ejemplo, antígeno recombinante, formas que se producen de manera natural, cualquier variante o fragmento de los mismos, así como un péptido antigénico de los mismos. La resonancia de plasmones superficiales tal como se emplea en el sistema BIAcore puede usarse para aumentar la eficiencia de los anticuerpos de fago que se unen a un epítopo de un antígeno diana, tal como el antígeno de superficie celular diana o CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

Otro método a modo de ejemplo de preparación de anticuerpos monoclonales incluye examinar bibliotecas de expresión de proteínas, por ejemplo, bibliotecas de presentación en fago o de presentación en ribosoma. La presentación en fago se describe, por ejemplo, en Ladneret al.,patente estadounidense n ° 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clacksonet al.,Nature, 352: 624-628 (1991) y Markset al.,J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Además del uso de bibliotecas de presentación, el antígeno relevante puede usarse para inmunizar un animal no humano, por ejemplo, un roedor (tal como un ratón, hámster, conejo o rata). Por ejemplo, es posible modificar mediante ingeniería razas de ratón deficientes en producción de anticuerpos de ratón con fragmentos grandes de los loci de Ig (inmunoglobulina) humana. Usando la tecnología del hibridoma, pueden producirse y seleccionarse anticuerpos monoclonales específicos de antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véanse, por ejemplo, XENOMOUSE™, Greenet al.(1994) Nature Genetics 7:13-21, el documento US 2003-0070185, el documento WO 96/34096, y el documento WO96/33735.

Un anticuerpo monoclonal puede obtenerse también de un animal no humano, y entonces modificarse, por ejemplo, humanizarse, desinmunizarse, convertirse en quimérico, etc., usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Los ejemplos de constructos de anticuerpo modificados incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos “madurados en cuanto a la afinidad” (véanse, por ejemplo, Hawkinset al.J. Mol. Biol. 254, 889 896 (1992) y Lowmanet al.,Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) y mutantes de anticuerpo con función/funciones efectora(s) alterada(s) (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense 5.648,260, Kontermann y Dübel (2010), en el lugar citado y Little (2009), en el lugar citado).

En inmunología, la maduración de la afinidad es el proceso mediante el cual las células B producen anticuerpos con afinidad aumentada para el antígeno durante el transcurso de una respuesta inmunitaria. Con exposiciones repetidas al mismo antígeno, un huésped producirá anticuerpos de afinidades sucesivamente mayores. Como el prototipo natural, la maduración de la afinidadin vitrose basa en los principios de mutación y selección. La maduración de la afinidadin vitrose ha usado satisfactoriamente para optimizar anticuerpos, constructos de anticuerpo y fragmentos de anticuerpo. Se introducen mutaciones aleatorias dentro de las CDR usando radiación, mutágenos químicos o PCR propensa a error. Además, la diversidad genética puede aumentarse mediante intercambio de cadenas. Dos o tres rondas de mutación y selección usando métodos de presentación como la presentación en fago dan como resultado habitualmente fragmentos de anticuerpo con afinidades en el intervalo nanomolar bajo.

Un tipo preferido de una varianación por sustitución de aminoácidos de los constructos de anticuerpo implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo parental a partir del que se generan. Un modo conveniente para generar tales variantes por sustitución implica la maduración de la afinidad usando presentación en fago. Resumiendo, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se presentan de una manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fago se examen entonces para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se da a conocer en el presente documento. Con el fin de identificar sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, puede realizarse mutagénesis de barrido de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígenoanticuerpo para identificar puntos de contacto entre el dominio de unión y, por ejemplo, humano el antígeno de superficie celular diana. Tales residuos de contacto y residuos adyacentes son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez que se generan tales variantes, el panel de variantes se somete a examen tal como se describe en el presente documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para su desarrollo adicional.

Los anticuerpos monoclonales y los constructos de anticuerpo de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es/son idénticos u homólogo(s) a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente estadounidense n.° 4.816.567; Morrisonet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos “primitizados” que comprenden variable secuencias de unión a antígeno de dominio derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del Viejo Mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humana. Se han descrito una variedad de enfoques para preparar anticuerpos quiméricos. Véanse, por ejemplo, Morrisonet al.,Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81:6851, 1985; Takedaet al.,Nature 314:452, 1985, Cabillyet al.,patente estadounidense n° 4.816.567; Bosset al.,patente estadounidense mo 4.816.397; Tanaguchiet al.,el documento EP 0171496; el documento EP 0173494; y el documento GB 2177096.

Un anticuerpo, constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede modificarse también mediante la deleción específica de epítopos de células T humanas (un método denominado “desinmunización”) mediante los métodos dados a conocer en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Resumiendo, los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo pueden analizarse para péptidos que se unen a MHC de clase II; estos péptidos representan epítopos de células T potenciales (tal como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de epítopos de células T potenciales, puede aplicarse un enfoque de modelado informático denominado “reconocimiento de plegamiento de péptidos”, y además puede buscarse en una base de datos de péptidos de unión a MHC de clase II humanos por motivos presentes en las secuencias VH y VL, tal como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos DR de MHC de clase II principales, y por tanto constituyen epítopos de células T potenciales. Los epítopos de células T potenciales detectados puede eliminarse sustituyendo pequeños números de residuos de aminoácido en los dominios variables o, preferiblemente, mediante sustituciones de aminoácidos individuales. Normalmente, se hacen sustituciones conservativas. A menudo, pero no exclusivamente, puede usarse un aminoácido común a una posición en secuencias de anticuerpo de línea germinal humana. Las secuencias de línea germinal humana se dan a conocer, por ejemplo, en Tomlinson,et al.(1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P.et al.(1995) Immunol. Today vol. 16 (5): 237-242; y Tomlinsonet al.(1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638. El directorio V BASE proporciona un directorio exhaustivo de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, LA.et al.MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, R. U.). Estas secuencias pueden usarse como fuente de secuencia humana, por ejemplo, para regiones de entramado y CDR. También pueden usarse regiones de entramado humanas consenso, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n ° 6.300.064.

Los anticuerpos, constructos de anticuerpo “humanizados” o fragmentos de los mismos (tal como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) son anticuerpos o inmunoglobulinas de secuencias en su mayor parte humanas, que contienen (a) secuencia(s) mínima(s) derivada(s) de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una región hipervariable (también CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (por ejemplo, roedor) (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, hámster o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, residuos de la región de entramado (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, “anticuerpos humanizados” tal como se usa en el presente documento puede comprender también residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. El anticuerpo humanizado puede comprender también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véanse Joneset al.,Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmannet al.,Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

Los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos pueden generarse reemplazando secuencias del dominio variable de Fv que no están implicadas directamente en la unión a antígeno por secuencias equivalentes de dominios variables de Fv humanos. Métodos a modo de ejemplo para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se proporcionan por Morrison (1985) Science 229:1202-1207; por Oiet al.(1986) BioTechniques 4:214; y por los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; y US 6.407.213. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las moléculas de ácido nucleico que codifican todos o parte de los dominios variables de Fv de inmunoglobulina a partir de al menos una de una cadena pesada o ligera. Tales ácidos nucleicos pueden obtenerse a partir de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, tal como se describió anteriormente, así como a partir de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizado puede clonarse entonces en un vector de expresión apropiado.

Los anticuerpos humanizados pueden producirse también usando animales transgénicos tales como ratones que expresan genes de cadena pesada y ligera humana, pero que son incapaces de expresar los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de ratón endógenos. Winter describe un método de injerto de CDR a modo de ejemplo que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento (patente estadounidense n.° 5.225.539). Todas las CDR de un anticuerpo humano particular pueden reemplazarse por al menos una porción de una CDR no humana, o solo algunas de las CDR pueden reemplazarse por CDR no humanas. Solo es necesario reemplazar el número de CDR requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.

Un anticuerpo humanizado puede optimizarse mediante la introducción de sustituciones conservativas, sustituciones de secuencias consenso, sustituciones de líneas germinales y/o retromutaciones. Tales moléculas de inmunoglobulina alteradas pueden prepararse mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en la técnica, (por ejemplo, Tenget al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozboret al.,Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olssonet al.,Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, y el documento EP 239400.

El término “anticuerpo humano”, “constructo de anticuerpo humano” y “dominio de unión humano” incluye anticuerpos, constructos de anticuerpo y dominios de unión que tienen regiones de anticuerpo tales como regiones o dominios variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, las descritas por Kabatet al.(1991) (en el lugar citado). Los anticuerpos, constructos de anticuerpo o dominios de unión humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitioin vitroo mediante mutación somáticain vivo),por ejemplo, en las CDR, y en particular, en CDR3. Los anticuerpos, constructos de anticuerpo o dominios de unión humanos pueden tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones reemplazadas por un residuo de aminoácido que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana. La definición de anticuerpos, constructos de anticuerpo y dominios de unión humanos tal como se usa en el presente documento contempla también anticuerpos completamente humanos, que incluyen solo secuencias de anticuerpos humana no alteradas artificial y/o genéticamente ya que estas pueden derivarse usando tecnologías o sistemas tales como Xenomouse.

En algunas realizaciones, los constructos de anticuerpo de la invención son constructos de anticuerpo “aislados” o “sustancialmente puros”. “Aislado” o “sustancialmente puro” cuando se usa para describir el constructo de anticuerpo dado a conocer en el presente documento significa un constructo de anticuerpo que se ha identificado, separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno de producción. Preferiblemente, el constructo de anticuerpo está libre o sustancialmente libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tal como los que resultan de células transfectadas recombinantes, son materiales que interferirían normalmente con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Los constructos de anticuerpo pueden, por ejemplo, constituir al menos alrededor del 5%, o al menos alrededor del 50% en peso de la proteína total en una muestra dada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir desde el 5% hasta el 99,9% en peso del contenido de proteína total, dependiendo de las circunstancias. El polipéptido puede prepararse a una concentración significativamente mayor a través del uso de un promotor inducible o promotor de alta expresión, de modo que se prepara a niveles de concentración aumentados. La definición incluye la producción de un constructo de anticuerpo en una amplia variedad de organismos y/o células huésped que se conocen en la técnica. En realizaciones preferidas, el constructo de anticuerpo se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Sin embargo, de manera ordinaria un constructo de anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

El término “dominio de unión” caracteriza en relación con la presente invención un dominio que (específicamente) se une a/interacciona con/reconoce un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos) y CD3, respectivamente. La estructura y la función del primer dominio de unión (que reconoce el antígeno de superficie celular diana), y preferiblemente también la estructura y/o la función del segundo dominio de unión (CD3), se basa(n) en la estructura y/o la función de un anticuerpo, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o completa. Según la invención, el primer dominio de unión está caracterizado por la presencia de tres CDR de cadena ligera (es decir CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y tres CDR de cadena pesada (es decir CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). El segundo dominio de unión comprende preferiblemente también los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión a la diana. Más preferiblemente, el segundo dominio de unión comprende al menos tres CDR de cadena ligera (es decir CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o tres CDR de cadena pesada (es decir CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). Se concibe que el primer y/o segundo dominio de unión se produzca mediante o pueda obtenerse mediante métodos de presentación en fago o de examen de bibliotecas en vez de injertando secuencias de CDR de un anticuerpo (monoclonal) preexistente en un armazón.

Según la presente invención, los dominios de unión están preferiblemente en forma de polipéptidos. Tales polipéptidos pueden incluir partes proteicas y partes no proteicas (por ejemplo, ligadores químicos o agentes de reticulación químicos tales como glutaraldehído). Las proteínas (incluyendo los fragmentos de las mismas, preferiblemente fragmentos biológicamente activos, y péptidos, que tienen habitualmente menos de 30 aminoácidos) comprenden dos o más aminoácidos acoplados entre sí por medio de un enlace peptídico covalente (dando como resultado una cadena de aminoácidos). El término “polipéptido” tal como se usa en el presente documento describe un grupo de moléculas, que consisten habitualmente en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar adicionalmente multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir que consisten en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptido que forman tales dímeros, trímeros, etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes de tales multímeros se denominan, en consecuencia, homo- o heterodímeros, homo- o heterotrímeros, etc. Un ejemplo de un hereteromultímero es una molécula de anticuerpo, que, en su forma que se produce de manera natural, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” se refieren también a péptidos/polipéptidos/proteínas modificados de manera natural, en los que la modificación se efectúa, por ejemplo, mediante modificaciones postraduccionales como glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Un “péptido”, un “polipéptido” o una “proteína”, cuando se hace referencia a los mismos en el presente documento, pueden estar también modificados químicamente tal como pegilados. Tales modificaciones se conocen ampliamente en la técnica y se describen a continuación en el presente documento.

Como se ha mencionado anteriormente, un dominio de unión puede comprender normalmente una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH); sin embargo, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo conservan algo de función de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno (modificados) incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab ligados mediante un puente disulfuro en la región bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAc (Wardet al.,(1989) Nature 341 :544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, y (7) un Fv de cadena sencilla (scFv), prefiriéndose el último (por ejemplo, derivado de una biblioteca de scFV).

Los anticuerpos y constructos de anticuerpo que comprenden al menos un dominio de unión humano evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos o constructos de anticuerpo que presentan regiones variables y/o constantes no humanas tal como de roedor (por ejemplo, murinas, de rata, hámster o conejo). La presencia de tales proteínas derivadas de roedor pueden conducir al aclaramiento rápido de los anticuerpos o constructos de anticuerpo o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo o constructo de anticuerpo por parte de un paciente. Con el fin de evitar el uso de anticuerpos o constructos de anticuerpo derivados de roedor, pueden generarse anticuerpos/constructos de anticuerpo humanos o completamente humanos a través de la introducción de la función de anticuerpo humano en un roedor, de modo que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos.

La capacidad de clonar y reconstruir loci humanos de tamaño de megabase en YAC y de introducirlos en la línea germinal de ratón proporciona un enfoque potente para dilucidar los componentes funcionales de loci muy grandes o mapeados de manera burda así como generar modelos útiles de enfermedad humana. Además, el uso de tal tecnología para la sustitución de loci de ratón por sus equivalentes humanos podría proporcionar conocimientos únicos sobre la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas y su implicación en la inducción y progresión de enfermedades.

Una aplicación práctica importante de una estrategia de este tipo es la “humanización” del sistema inmune humoral de ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones, en los que se han inactivado los genes de Ig endógenos, ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y al ensamblaje de anticuerpos así como su papel en el desarrollo de células B. Además, una estrategia de este tipo podría proporcionar una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales (Acm) completamente humanos - un hito importante hacia el cumplimiento de la promesa de terapia con anticuerpos en enfermedad humana. Se espera que los anticuerpos o constructos de anticuerpo completamente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los Acm de ratón o derivatizados de ratón y por tanto aumenten la eficacia y seguridad de los anticuerpos/constructos de anticuerpo administrados. Puede esperarse que el uso de anticuerpos o constructos de anticuerpo completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, autoinmunidad y cáncer, que requieren administraciones de compuestos repetidas.

Un enfoque hacia este objetivo era modificar mediante ingeniería razas de ratón deficientes en producción de anticuerpos de ratón con fragmentos grandes de los loci de Ig humana en anticipación a que tales ratones produzcan un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los fragmentos de Ig humana grande conservarían la gran diversidad génica variable así como la regulación apropiada de la producción y expresión de anticuerpos. Al explotar la maquinaria de ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la falta de tolerancia inmunológica a proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducidos en estas razas de ratón debería producir anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Usando la tecnología del hibridoma, podrían producirse y seleccionarse fácilmente Acm humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada. Esta estrategia general se demostró en relación con la generación de las primeras razas de ratón XenoMouse (véase Greenet al.Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Las razas XenoMouse se modificaron mediante ingeniería con cromosomas artificiales de levadura (YAC) que contienen fragmentos de configuración de línea germinal de 245 kb y 190 kb de tamaño del locus de cadena pesada humana y del locus de cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían secuencias de región variable y constante de núcleo. Los YAC que contienen Ig humana demostraron ser compatibles con el sistema de ratón tanto para la reorganización como para la expresión de anticuerpos y eran capaces de sustituir los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demostró mediante su capacidad para inducir desarrollo de células B, para producir un repertorio humano similar a adulto de anticuerpos completamente humanos, y para generar Acm humanos específicos de antígeno. Estos resultados también sugerían que la introducción de porciones más grandes de los loci de Ig humana que contienen números mayores de genes V, elementos reguladores adicionales y regiones constantes de Ig humana podrían recapitular sustancialmente el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral humana a la infección y la inmunización. El trabajo de Greenet al.se extendió recientemente a la introducción de más de aproximadamente el 80% del repertorio de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos de YAC de configuración de línea general, de tamaño de megabase, de los loci de cadena pesada humana y los loci de cadena ligera kappa, respectivamente. Véanse Mendezet al.Nature Genetics 15:146-156 (1997) y la solicitud de patente estadounidense con n.° de ser. 08/759.620.

La producción de los ratones XenoMouse se da a conocer y se esboza adicionalmente en las solicitudes de patente estadounidense con n ° de ser. 07/466.008, n ° de ser. 07/610.515, mo de ser. 07/919.297, n ° de ser.07/922.649, n° de ser. 08/031.801, mo de ser. 08/112.848, mo de ser. 08/234.145, mo de ser. 08/376.279, mo de ser.08/430.938, n o de ser. 08/464.584, mo de ser. 08/464.582, mo de ser. 08/463.191, mo de ser. 08/462.837, mo de ser.08/486.853, n o de ser. 08/486.857, mo de ser. 08/486.859, mo de ser. 08/462.513, n o de ser. 08/724.752 y n o de ser. 08/759.620; y las patentes estadounidenses n ° 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 y 5.939.598, y las patentes japonesas mo 3068 180 B2, 3068506 B2 y 3068507 B2. Véanse también Mendezet al.Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), el documento EP 0463 151 B1, el documento WO 94/02602, el documento WO 96/34096, el documento WO 98/24893, el documento WO 00/76310 y el documento WO 03/47336.

En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de “minilocus”. En el enfoque de minilocus, un locus de Ig exógeno se emita a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus de Ig. Por tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se forman para dar un constructo para su inserción en un animal. Este enfoque se describe en la patente estadounidense n° 5.545.807 concedida a Suraniet al.y las patentes estadounidenses mo 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 y 6.255.458 concedidas cada una a Lonberg y Kay, las patentes estadounidenses mo 5.591.669 y 6.023.010 concedidas a Krimpenfort y Berns, las patentes estadounidenses n° 5.612.205, 5.721.367 y 5.789.215 concedidas a Bernset al.,y la patente estadounidense n ° 5.643.763 concedida a Choi y Dunn, y solicitud de patente estadounidense de GenPharm International con n° de ser.07/574.748, mo de ser.

07/575.962, n o de ser. 07/810.279, n o de ser. 07/853.408, mo de ser. 07/904.068, mo de ser.07/990.860, mo de ser.

08/053.131, n ° de ser. 08/096.762, n ° de ser. 08/155.301, mo de ser. 08/161.739, mo de ser.08/165.699, mo de ser.

08/209.741. Véanse también los documentos EP 0 546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la patente estadounidense mo 5.981.175. Véanse además Tayloret al.(1992), Chenet al.(1993), Tuaillonet al.(1993), Choiet al.(1993), Lonberget al.(1994), Tayloret al.(1994), y Tuaillonet al.(1995), Fishwildet al.(1996).

Kirin ha demostrado también la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, a través de fusión microcelular, se han introducido grandes piezas de cromosomas, o cromosomas enteros. Véanse las solicitudes de patente europea mo 773 288 y 843 961. Xenerex Biosciences está desarrollando una tecnología para la generación potencial de anticuerpos humanos. En esta tecnología, ratones SCID se reconstituyen con células linfáticas humanas, por ejemplo, células B y/o T. Los ratones se inmunizan entonces con un antígeno y pueden generar una respuesta inmunitaria contra el antígeno. Véanse las patentes estadounidenses n ° 5.476.996; 5.698.767; y 5.958.765.

Las respuestas de anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA) han conducido a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de otro modo. Sin embargo, se espera que se observen ciertas respuestas de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), particularmente en utilizaciones crónicas o de múltiples dosis del anticuerpo. Por tanto, sería deseable proporcionar constructos de anticuerpo que comprendan un dominio de unión completamente humano contra el antígeno de superficie celular diana y un dominio de unión completamente humano contra CD3 con el fin de eliminar las preocupaciones y/o los efectos de la respuesta HAMA o HACA.

Los términos “se une (específicamente) a”, “reconoce (específicamente)”, “se dirige (específicamente) a” y “reacciona (específicamente) con” significan según esta invención que un dominio de unión interacciona o interacciona específicamente con uno o más, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres y lo más preferiblemente al menos cuatro aminoácidos de un epítopo ubicado en la proteína o antígeno diana (el antígeno de superficie celular diana/CD3).

El término “epítopo” se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente un dominio de unión, tal como un anticuerpo o una inmunoglobulina o derivado o fragmento de un anticuerpo o de una inmunoglobulina. Un “epítopo” es antigénico y por tanto al término epítopo se hace referencia en ocasiones también en el presente documento como “estructura antigénica” o “determinante antigénico”. Por tanto, el dominio de unión es un “sitio de interacción con antígeno”. Se entiende también que dicha unión/interacción define un “reconocimiento específico”.

Los “epítopos” pueden estar formados tanto por aminoácidos contiguos como por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Un “epítopo lineal” es un epítopo en el que una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal incluye normalmente al menos 3 o al menos 4 y, más habitualmente, al menos 5 o al menos 6 o al menos 7, por ejemplo, de alrededor de 8 a alrededor de 10 aminoácidos en una secuencia única.

Un “epítopo conformacional”, a diferencia de un epítopo lineal, es un epítopo en el que la secuencia primaria de los aminoácidos que comprende el epítopo no es el único componente definitorio del epítopo reconocido (por ejemplo, un epítopo en el que la secuencia primaria de aminoácidos no se reconoce necesariamente por el dominio de unión). Normalmente, un epítopo conformacional comprende un número aumentado de aminoácidos en relación con un epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopos conformacionales, el dominio de unión reconoce una estructura tridimensional del antígeno, preferiblemente un péptido o una proteína o un fragmento de los mismos (en el contexto de la presente invención, el antígeno para uno de los dominios de unión está comprendido dentro de la proteína de antígeno de superficie celular diana). Por ejemplo, cuando una molécula de proteína se pliega para formar una estructura tridimensional, ciertos aminoácidos y/o la estructura principal polipeptídica que forman el epítopo conformacional se yuxtaponen, posibilitando que el anticuerpo reconozca el epítopo. Los métodos de determinación de la conformación de epítopos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos x, espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional (2D-NMR) y espectroscopía de marcado de espín dirigido al sitio y de resonancia paramagnética electrónica (EPR).

La interacción entre el dominio de unión y el epítopo o agrupamiento de epítopos implica que un dominio de unión presente una afinidad apreciable por el epítopo o agrupamiento de epítopo en una proteína o antígeno particular (en este caso: el antígeno de superficie celular diana y CD3, respectivamente) y, generalmente, no presente reactividad significativa con proteínas o antígenos distintos del antígeno de superficie celular diana o CD3. La “afinidad apreciable” incluye la unión con una afinidad de alrededor de 10-6 M (KD) o más fuerte. Preferiblemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es de alrededor de 10-12 a 10-8 M, de 10-12 a 10-9 M, de 10-12 a 10-11 M, de 10-11 a 10-8 M, preferiblemente de alrededor de 10-11 a 10-9 M. Que un dominio de unión reacciona específicamente con o se une a una diana puede someterse a prueba fácilmente, entre otros, comparando la reacción de dicho dominio de unión con una proteína o antígeno diana con la reacción de dicho dominio de unión con proteínas o antígenos distintos del antígeno de superficie celular diana o CD3. Preferiblemente, un dominio de unión de la invención no se une esencial o sustancialmente a proteínas o antígenos distintos del antígeno de superficie celular diana o CD3 (es decir, el primer dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas del antígeno de superficie celular diana y el segundo dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de CD3).

El término “no se une esencial/sustancialmente” o “no es capaz de unirse” significa que un dominio de unión de la presente invención no se une a una proteína o antígeno distinto del antígeno de superficie celular diana o CD3, es decir, no muestra una reactividad de más del 30%, preferiblemente no más del 20%, más preferiblemente no más del 10%, de manera particularmente preferible no más del 9%, del 8%, del 7%, del 6% o del 5% con proteínas o antígenos distintos del antígeno de superficie celular diana o CD3, según lo cual la unión al antígeno de superficie celular diana o CD3, respectivamente, se establece que es del 100%.

Se cree que la unión específica se efectúa mediante motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y del antígeno. Por tanto, la unión se consigue como resultado de su estructura primaria, secundaria y/o terciaria, así como resultado de modificaciones secundarias de dichas estructuras. La interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico pueda dar como resultado una unión simple de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado alternativa o adicionalmente el inicio de una señal, por ejemplo, debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc.

El término “variable” se refiere a las porciones de los dominios de anticuerpo o de inmunoglobulina que presentan variabilidad en su secuencia y que están implicadas en la determinación de la especificidad y la afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, el/los “dominio(s) variable(s)”). El apareamiento de una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) entre sí forma un único sitio de unión a antígeno. El dominio CH más proximal a VH se denomina CH1. Cada cadena ligera (L) está ligada a una cadena pesada (H) mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están ligadas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H.

La variabilidad no está distribuida uniformemente por todos los dominios variables de anticuerpos; se concentra en subdominios de cada una de las regiones variables de cadena pesada y ligera. Estos subdominios se denominan “regiones hipervariables” o “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR). Las porciones más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan regiones “de entramado” (FRM) y proporcionan un armazón para las seis CDR en el espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera que se producen de manera natural comprenden cada uno cuatro regiones FRM (FR1, FR2, FR3 y FR4), que adoptan en su mayor parte una configuración de lámina p, conectadas mediante tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos que forman parte de, la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad estrecha mediante la FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno (véase Kabatetal.,en el lugar citado). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión a antígeno, sino que presentan diversas funciones efectoras, tales como, por ejemplo, citotoxicidad mediada por células, dependiente de anticuerpo, y activación de complementos.

Los términos “CDR”, y su plural “CDR”, se refieren a la región determinante de la complementariedad de las que tres componen el carácter de unión de una región variable de cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3) y tres componen el carácter de unión de una región variable de cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3). Las CDR contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno y por tanto contribuyen a la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: son los principales determinantes de especificidad de antígeno.

Los límites y las longitudes de CDR definitorios exactos están sujetos a diferentes sistemas de clasificación y de numeración. Por tanto, las CDR pueden denominarse según Kabat, Chothia, contacto o cualquier otra definición de límites, incluyendo el sistema de numeración descrito en el presente documento. A pesar de límites diferentes, cada uno de estos sistemas tiene algún grado de solapamiento en lo que constituye la denominadas “regiones hipervariables” dentro de las secuencias variables. Por tanto, las CDR de CDR definiciones según estos sistemas pueden diferir en longitud y áreas de límite con respecto a la región de entramado adyacente. Véanse, por ejemplo, Kabat (un enfoque basado en la variabilidad de secuencia entre especies), Chothia (un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo) y/o MacCallum (Kabatet al.,en el lugar citado, Chothiaet al.,J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; y MacCallumet al.,J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Todavía otro estándar para caracterizar el sitio de unión a antígeno es la definición de AbM usada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). En la medida en que dos técnicas de identificación de residuo definan regiones de solapamiento, pero no regiones idénticas, pueden combinarse para definir una CDR híbrida. Sin embargo, se prefiere la numeración según el denominado sistema de Kabat.

Normalmente, las CDR forman una estructura de bucle que puede clasificarse como estructura canónica. El término “estructura canónica” se refiere a la conformación de cadena principal que se adopta por los bucles de unión a antígeno (CDR). A partir de estudios estructurales comparativos, se ha encontrado que cinco de los seis bucles de unión a antígeno tienen solo un repertorio limitado de conformaciones disponibles. Cada estructura canónica puede caracterizarse mediante los ángulos de torsión de la estructura principal polipeptídica. Por tanto, bucles correspondientes entre anticuerpos pueden tener estructuras tridimensionales muy similares, a pesar de la alta variabilidad de la secuencia de aminoácidos en la mayoría de las partes de los bucles (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothiaet al.,Nature, 1989, 342: 877; Martin y Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Además, hay una relación entre la estructura de bucle adoptada y las secuencias de aminoácidos que la rodean. La conformación de una clase canónica particular está determinada por la longitud del bucle y los residuos de aminoácido que residen en posiciones clave dentro del bucle, así como dentro del entramado conservado (es decir, fuera del bucle). Por tanto, la asignación a una clase canónica particular puede hacerse basándose en la presencia de estos residuos de aminoácido clave.

El término “estructura canónica” puede incluir también consideraciones en cuanto a la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo, tal como se cataloga por Kabat (Kabatet al.,en el lugar citado). El esquema (sistema) de numeración de Kabat es un estándar adoptado ampliamente para numerar los residuos de aminoácido de un dominio variable de anticuerpo de una manera consistente y es el esquema preferido aplicado en la presente invención tal como se menciona también en otro punto en el presente documento. Consideraciones estructurales adicionales pueden usarse también para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por ejemplo, aquellas diferencias no reflejadas completamente mediante la numeración de Kabat pueden describirse mediante el sistema de numeración de Chothiaet al.y/o revelarse mediante otras técnicas, por ejemplo, cristalografía y modelado computacional bi- o tridimensional. Por consiguiente, una secuencia de anticuerpo dada puede situarse en una clase canónica que permita, entre otras cosas, identificar secuencias de chasis apropiadas (por ejemplo, basándose en un deseo por incluir una variedad de estructuras canónicas en una biblioteca). La numeración de Kabat de secuencias de aminoácidos de anticuerpo y consideraciones estructurales tales como se describen por Chothiaet al.,en el lugar citado y sus implicaciones para interpretar aspectos canónicos de la estructura de anticuerpo, se describen en la bibliografía. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen ampliamente en la técnica. Para una revisión de la estructura de anticuerpo, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlowet al.,1988.

La CDR3 de la cadena ligera y, particularmente, la CDR3 de la cadena pesada pueden constituir los determinantes más importantes en la unión a antígeno dentro de las regiones variables de cadena ligera y pesada. En algunos constructos de anticuerpo, la CDR3 de cadena pesada parece constituir la principal área de contacto entre el antígeno y el anticuerpo. Pueden usarse esquemas de selecciónin vitroen los que la CDR3 sola se varía, para variar las propiedades de unión de un anticuerpo o determinar qué residuos contribuyen a la unión de un antígeno. Por tanto, la CDR3 es normalmente la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión a anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser de tan solo dos residuos de aminoácido o de más de 26 aminoácidos.

La secuencia de genes de anticuerpo tras el ensamblaje y la mutación somática es muy variada y se estima que estos genes variados codifican 1010 moléculas de anticuerpo diferentes (Immunoglobulin Genes, 2a ed., eds. Jonioet al.,Academic Press, San Diego, CA, 1995). Por consiguiente, el sistema inmune proporciona un repertorio de inmunoglobulinas. El término “repertorio” se refiere a al menos una secuencia de nucleótidos deriva completa o parcialmente de al menos una secuencia que codifica al menos una inmunoglobulina. La(s) secuencia(s) puede(n) generarse mediante la reorganizaciónin vivode los segmentos V, D y J de cadenas pesadas, y los segmentos V y J de cadenas ligeras. Alternativamente, la(s) secuencia(s) pueden generarse a partir de una célula en respuesta a qué reorganización se produce, por ejemplo, estimulaciónin vitro.Alternativamente, parte de o toda(s) la(s) secuencia(s) puede(n) obtenerse mediante corte y empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis y otros métodos, véase, por ejemplo, la patente estadounidense 5.565.332. Un repertorio puede incluir solo una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluyendo aquellas en una colección genéticamente diversa.

El término “biespecífico” tal como se usa en el presente documento se refiere a un constructo de anticuerpo que es “al menos biespecífico”, es decir, comprende al menos un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión, uniéndose el primer dominio de unión a un antígeno o diana, y uniéndose el segundo dominio de unión a otro antígeno o diana (en este caso: CD3). Por consiguiente, los constructos de anticuerpo según la invención comprenden especificidades para al menos dos antígenos o dianas diferentes. El término “constructo de anticuerpo biespecífico” de la invención abarca también constructos de anticuerpo multiespecíficos, tales como constructos de anticuerpo triespecíficos, incluyendo los últimos tres dominios de unión, o constructos que tienen más de tres (por ejemplo, cuatro, cinco...) especificidades.

Dado que los constructos de anticuerpo según la invención son (al menos) biespecíficos, no se producen de manera natural y son notablemente diferentes de los productos que se producen de manera natural. Por tanto, un constructo de anticuerpo o una inmunoglobulina “biespecífico” es un anticuerpo o inmunoglobulina híbrido artificial que tiene al menos dos sitios de unión distintos con diferentes especificidades. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o ligado de fragmentos Fab’. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).

Los al menos dos dominios de unión y los dominios variables del constructo de anticuerpo de la presente invención pueden comprender o no ligadores peptídicos (péptidos espaciadores). El término “ligador peptídico” define según la presente invención una secuencia de aminoácidos mediante la que las secuencias de aminoácidos de un dominio (variable y/o de unión) y otro dominio (variable y/o de unión) del constructo de anticuerpo de la invención están ligados entre sí. Una característica técnica esencial de tal ligador peptídico es que dicho ligador peptídico no comprende ninguna actividad de polimerización. Entre los ligadores peptídicos adecuados están aquellos descritos en las patentes estadounidenses 4.751.180 y 4.935.233 o el documento WO 88/09344.

En el caso de que se use un ligador, este ligador es preferiblemente de una longitud y una secuencia suficientes para garantizar que cada uno de los dominios primero y segundo pueda, independientemente entre sí, conservar sus especificidades de unión diferenciales. Para los ligadores peptídicos que conectan los al menos dos dominios de unión en el constructo de anticuerpo de la invención (o dos dominios variables), se prefieren aquellos ligadores peptídicos que comprenden solo un número escaso de residuos de aminoácido, por ejemplo, 12 residuos de aminoácido o menos. Por tanto, se prefieren ligadores peptídicos de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 residuos de aminoácido. Un ligador peptídico concebido con menos de 5 aminoácidos comprende 4, 3, 2 o un aminoácido(s), prefiriéndose los ligadores ricos en Gly. Un “único” aminoácido particularmente preferido en el contexto de dicho “ligador peptídico” es Gly. Por consiguiente, dicho ligador peptídico puede consistir en el único aminoácido Gly. Otra realización preferida de un ligador peptídico está caracterizada por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir Gly4Ser, o polímeros de la misma, es decir (Gly4Ser)x, donde x es un número entero de 1 o mayor. Las características de dicho ligador peptídico, que comprenden la ausencia de la promoción de estructuras secundarias se conocen en la técnica y se describen por ejemplo, en Dall’Acquaet al.(Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadleet al.(Mol Immunol (1992) 29, 21-30) y Raag y Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Se prefieren los ligadores peptídicos que tampoco promueven ninguna estructura secundaria. El ligado de dichos dominios entre sí puede proporcionarse mediante, por ejemplo, modificación mediante ingeniería genética, tal como se describe en los ejemplos. Métodos para preparar constructos de cadena sencilla biespecíficos fusionados y ligados operativamente y expresarlos en células de mamífero o bacterias se conocen ampliamente en la técnica (por ejemplo, el documento WO 99/54440 o Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001).

Moléculas de cadena sencilla biespecíficas se conocen en la técnica y se describen en el documento WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021 -7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véanse, entre otros, la patente estadounidense 4.946.778, Kontermann y Dübel (2010), en el lugar citado y Little (2009), en el lugar citado) pueden adaptarse para producir constructos de anticuerpo de cadena sencilla que reconocen específicamente una(s) diana(s) elegida(s).

Fragmentos variables de cadena sencilla bivalentes (también denominados divalentes) o biespecíficos (bi-scFv o discFv que tienen el formato (scFv)<2>) pueden modificarse mediante ingeniería ligando dos moléculas de scFv. Si estas dos moléculas de scFv tienen la misma especificidad de unión, la molécula (de scFv) resultante se denominará preferiblemente bivalente (es decir, tiene dos valencias para el mismo epítopo diana). Si las dos moléculas de scFv tienen diferentes especificidades de unión, la molécula (de scFv) resultante se denominará preferiblemente biespecífica. El ligado puede realizarse produciendo una única cadena peptídica con dos regiones VH y dos regiones VL, produciendo scFv en tándem (véase, por ejemplo, Kufer P.et al.,(2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). Otra posibilidad es la creación de moléculas de scFv con péptidos ligadores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen conjuntamente (por ejemplo, alrededor de cinco aminoácidos), forzando a los scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos (véase por ejemplo, Hollinger, Philippet al.,(julio de 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8).

Los anticuerpos de dominio único comprenden meramente un dominio variable de anticuerpo (monomérico) que es capaz de unirse de manera selectiva a un antígeno específico, independientemente de otras regiones o dominios V. Los primeros anticuerpos de dominio único se modificaron mediante ingeniería a partir de anticuerpos de cadena pesada encontrados en camélidos, y estos se denominan fragmentos V<h>H. Los peces cartilaginosos tienen también anticuerpos de cadena pesada (IgNAR) a partir de los que pueden obtenerse anticuerpos de dominio único denominados fragmentos V<nar>. Un enfoque alternativo es dividir los dominios variables diméricos de inmunoglobulinas comunes, por ejemplo, de humanos o roedores in monómeros, obteniendo por tanto VH o VL como Ac de dominio único. Aunque la mayoría de la investigación sobre anticuerpos de dominio único se basa actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha mostrado que los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopos diana. Ejemplos de anticuerpos de dominio único se denominan sdAc, nanocuerpos o anticuerpos de dominio variable único.

Por tanto, un (Acm de dominio único<)2>es un constructo de anticuerpo monoclonal compuesto por (al menos) dos anticuerpos de dominio único monoclonales, que se seleccionan individualmente del grupo que comprende VH, VL, V<h>H y V<nar>. El ligador está preferiblemente en forma de un ligador peptídico. De manera similar, un “Acm de dominio único de scFv” es un constructo de anticuerpo monoclonal compuesto por al menos un anticuerpo de dominio único tal como se describió anteriormente y una molécula de scFv tal como se describió anteriormente. De nuevo, el ligador está preferiblemente en forma de un ligador peptídico.

También se concibe que el constructo de anticuerpo de la invención tenga, además de su función de unirse a un antígeno diana y CD3, una función adicional. En este formato, el constructo de anticuerpo es un constructo de anticuerpo trifuncional o multifuncional seleccionando como diana células diana a través de la unión al antígeno diana, mediando en la actividad de células T citotóxicas a través de la unión a CD3 y proporcionando una función adicional tal como un marcador (fluorescente, etc.), un agente terapéutico tal como una toxina o un radionúclido, etc.

Las modificaciones covalentes de los constructos de anticuerpo están incluidas también dentro del alcance de esta invención y se realizan generalmente, pero no siempre, de manera posttraduccional. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes del constructo de anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácido específicos del constructo de anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales.

Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar lo más comúnmente con a-haloacetatos (y aminas correspondientes), tal como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también se derivatizan mediante la reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos de histidilo se derivatizan mediante la reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0, porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0. Los residuos terminales de lisinilo y de amino se hacen reaccionar con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanediona; y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.

Los residuos de arginilo se modifican mediante la reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo épsilon-amino de arginina.

Puede hacerse la modificación específica de residuos de tirosilo, con interés particular en la introducción de marcadores espectrales en residuos de tirosilo mediante la reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Lo más comúnmente se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan usando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayo, siendo adecuado el método de cloramina T descrito anteriormente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican de manera selectiva mediante la reacción con carbodiimidas (R’-N=C=N--R’), donde R y R’ son grupos alquilo opcionalmente diferentes, tales como 1 -ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1 -etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los constructos de anticuerpo de la presente invención a una superficie o matriz de soporte insoluble en agua para su uso en una variedad de métodos. Los agentes de reticulación usados comúnmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidílicos tales como 3,3’-ditiobis(propionato de succinimidilo), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes de derivatización tales como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo dan productos intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, matrices insolubles en agua reactivas tales como carbohidratos activados por bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes estadounidenses n.° 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 se emplean para la inmovilización de proteínas.

Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente para dar los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de estos residuos se encuentra dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, págs. 79-86), acetilación de la amina N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente de los constructos de anticuerpo incluidos dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación de la proteína. Como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácido de glicosilación particulares, discutido más adelante) como de la célula u organismo huésped en el que se produce la proteína. Sistemas de expresión particulares se discuten más adelante.

La glicosilación de polipéptidos está normalmente ligada o bien a N o bien a O. Ligado a N se refiere al acoplamiento del radical carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del radical carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere al acoplamiento de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al constructo de anticuerpo se lleva a cabo convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación ligados a N). La alteración puede hacerse también mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de partida (para sitios de glicosilación ligados a O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos de un constructo de anticuerpo se altera preferiblemente a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido en bases seleccionadas previamente, de modo que se generen codones que se traducirán a los aminoácidos deseados.

Otro medio de aumentar el número de radicales carbohidrato en el constructo de anticuerpo es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de la proteína en una célula huésped que tenga capacidades de glicosilación para glicosilación ligada a N y a O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el/los azúcar(es) puede(n) unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330, y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306.

La eliminación de radicales carbohidrato presentes en el constructo de anticuerpo de partida puede llevarse a cabo química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o de todos los azúcares excepto el azúcar de ligado (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), al tiempo que deja el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe por Hakimuddinet al.,1987,Arch. Biochem. Biophys.

259:52 y por Edgeet al.,1981,Anal. Biochem.118:131. La escisión enzimática de radicales carbohidrato en polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una variedad de endo- y exoglicosidasas tal como se describe por Thotakuraet al.,1987, Meth. Enzymol. 138:350. La glicosilación en sitios de glicosilación potenciales pueden impedirse mediante el uso del compuesto tunicamicina tal como se describe por Duskinet al.,1982, J. Biol. Chem. 257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glicósido.

Se contemplan otras modificaciones del constructo de anticuerpo en el presente documento. Por ejemplo, otro tipo de modificación covalente del constructo de anticuerpo comprende ligar el constructo de anticuerpo a diversos polímeros no proteicos, incluyendo, pero sin limitarse a, diversos polioles tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, de la manera expuesta en las patentes estadounidenses n.° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Además, como se conoce en la técnica, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos en diversas posiciones dentro del constructo de anticuerpo, por ejemplo, con el fin de facilitar la adición de polímeros tales como PEG.

En algunas realizaciones, la modificación covalente de los constructos de anticuerpo de la invención comprende la adición de uno o más marcadores. El grupo marcador puede acoplarse al constructo de anticuerpo por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. Diversos métodos para marcar proteínas se conocen en la técnica y pueden usarse en la realización de la presente invención. El término “marcador” o “grupo marcador” se refiere a cualquier marcador detectable. En general, los marcadores se encuentran en una variedad de clases, dependiendo del ensayo en el que deban detectarse - los siguientes ejemplos incluyen, pero no se limitan a:

a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, tales como radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)

b) marcadores magnéticos (por ejemplo, partículas magnéticas)

c) radicales activos redox

d) colorante óptico (incluyendo, pero sin limitarse a, cromóforos, fósforos y fluoróforos) tal como grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos quimioluminiscentes, y fluoróforos que pueden ser o bien fluoros “de molécula pequeña” o bien fluoros proteicos

e) grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa del rábano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) f) grupos biotinilados

g) epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas epitópicas, etc.)

Con “marcador fluorescente” quiere decirse cualquier molécula que pueda detectarse por medio de sus propiedades fluorescentes inherentes. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde de malaquita, estilbeno, amarillo Lucifer, Cascade BlueJ, rojo Texas, IAEDANS, EdAn S, BODIPY FL, rojo LC 640, Cy 5, Cy 5.5, rojo LC 705, verde Oregón, los colorantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina y rojo Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Colorantes ópticos adecuados, incluyendo fluoróforos, se describen en Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland.

Los marcadores fluorescentes proteicos adecuados incluyen también, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, incluyendo una especie Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfieet al.,1994,Science263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., número de registro Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8a planta, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998,Biotechniques24:462-471; Heimet al.,1996,Curr. Biol.6:178-182), proteína fluorescente amarilla potenciada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichikiet al.,1993, J.Immunol.150:5408-5417), p-galactosidasa (Nolanet al.,1988,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85:2603-2607) y Renilla (documentos WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, patentes estadounidenses mo 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558).

Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originariamente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulzet al.,1988,Science240:1759) y se han encontrado desde entonces en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas están péptidos que se producen de manera natural y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud PCT WO 94/10308 y la cremallera de leucina derivada de la proteína D de tensioactivo (SPD) de pulmón descrita en Hoppeet al.,1994,FEBS Letters344:191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe en Fanslowet al.,1994,Semin. Immunol.6:267-78. En un enfoque, proteínas de fusión recombinantes que comprenden el fragmento de anticuerpo de antígeno diana o derivado fusionado a un péptido de cremallera de leucina se expresan en células huésped adecuadas, y los fragmentos de anticuerpo de antígeno diana oligoméricos solubles o derivados que se forman se recuperan del sobrenadante de cultivo.

El constructo de anticuerpo de la invención puede comprender también dominios adicionales que son, por ejemplo, útiles en el aislamiento de la molécula o se refieren a un perfil farmacocinético adaptado de la molécula. Dominios útiles para el aislamiento de un constructo de anticuerpo pueden seleccionarse de motivos peptídicos o radicales introducidos de manera secundaria, que pueden capturarse en un método de aislamiento, por ejemplo, una columna de aislamiento. Las realizaciones no limitativas de tales dominios adicionales comprenden motivos peptídicos conocidos como etiqueta Myc, etiqueta HAT, etiqueta HA, etiqueta TAP, etiqueta GST, dominio de unión a quitina (etiqueta CBD), proteína de unión a maltosa (etiqueta MBP), etiqueta Flag, etiqueta Strep y variantes de las mismas (por ejemplo, etiqueta StrepII) y etiqueta His. Se prefiere que todos los constructos de anticuerpo dados a conocer en el presente documento caracterizados mediante las CDR identificadas comprendan un dominio de etiqueta His, que se conoce generalmente como repetición de residuos His consecutivos en la secuencia de aminoácidos de una molécula, preferiblemente de seis residuos His.

Las células T o los linfocitos T son un tipo de linfocito (en sí mismo un tipo de glóbulo blanco) que desempeñan un papel central en la inmunidad medida por células. Hay varios subconjuntos de células T, cada uno con una función distinta. Las células T pueden distinguirse de otros linfocitos, tales como células B y células NK, por la presencia de un receptor de células T (TCR) en la superficie celular. El TCR es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y se compone de dos cadenas proteicas diferentes. En el 95% de las células T, el TCR consiste en una cadena alfa (a) y una beta (p). Cuando el TCR interacciona con péptido antigénico y MHC (complejo péptido/MHC), el linfocito T se activa a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores, moléculas adaptadoras especializadas y factores de transcripción activados o liberados

El complejo del receptor CD3 es un complejo proteico y se compone de cuatro cadenas. En mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y (gamma), una cadena CD35 (delta) y dos cadenas CD3s (épsilon). Estas cadenas se asocian con el receptor de células T (TCR) y la denominada cadena Z (zeta) para formar el complejo de receptor de células T-CD3 y para generar una señal de activación en linfocitos T. Las cadenas CD3y (gamma), CD35 (delta) y CD3s (épsilon) son proteínas de la superficie celular altamente relacionadas de la superfamilia de las inmunoglobulinas que contienen un dominio de inmunoglobulina extracelular único. Las colas intracelulares de las moléculas de CD3 contiene un motivo conservado único conocido como motivo de activación a base de tirosina inmunorreceptor o ITAM en forma abreviada, que es esencial para la capacidad de señalización del TCR. La molécula de CD3 épsilon es un polipéptido que en humanos se codifica por el genCD3Eque reside en el cromosoma 11. La secuencia de un dominio extracelular CD3 épsilon humano preferido se muestra en SEQ ID NO:610, y el epítopo de unión a CD3 más preferido correspondiente a los residuos de aminoácido 1 -27 del dominio extracelular de CD3 épsilon humano se representa en SEQ ID NO:7.

La lisis redirigida de células diana por medio del reclutamiento de células T mediante un constructo de anticuerpo multiespecífico, al menos biespecífico, implica la formación de sinapsis citolítica y el suministro de perforina y granzimas. Las células T acopladas son capaces de lisis de células diana en serie y no se ven afectadas por mecanismos de escape inmunes que interfieren con el procesamiento y la presentación de antígeno peptídico, o la diferenciación de células T clonales; véase, por ejemplo, el documento WO 2007/042261.

La citotoxicidad mediada por constructos de anticuerpo biespecíficos puede medirse de diversas maneras. Las células efectoras pueden ser, por ejemplo, células T CD8 positivas (humanas) enriquecidas estimuladas o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (humanas) no estimuladas. Si las células diana son de origen de macaco o expresan o se transfectan con antígeno de células diana de macaco, las células efectoras deberían ser también de origen de macaco, tal como una línea de células T de macaco, por ejemplo, 4119LnPx. Las células diana deben expresar (al menos el dominio extracelular de) antígeno de células diana, por ejemplo, antígeno de células diana humano o de macaco. Las células diana pueden ser una línea celular (tal como CHO) que se transfecta de manera estable o de manera transitoria con antígeno de células diana, por ejemplo, antígeno de células diana humano o de macaco. Alternativamente, las células diana pueden ser una línea celular expresora natura positiva para antígeno de células diana, tal como una línea celular de cáncer humano. Habitualmente, se espera que los valores de EC50 sean menores con líneas celulares diana que expresan niveles más altos de antígeno de células diana en la superficie celular. La relación de células efectoras con respecto a diana (E:T) es habitualmente de alrededor de 10:1, pero también puede variar. La actividad citotóxica de constructos de anticuerpo biespecíficos puede medirse en un ensayo de liberación 51cromo (tiempo de incubación de alrededor de 18 horas) o en un en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (tiempo de incubación de alrededor de 48 horas). También son posibles modificaciones del tiempo de incubación del ensayo (reacción citotóxica). Otros métodos de medición de la citotoxicidad se conocen ampliamente por el experto en la técnica y comprenden ensayos MTT o MTS, ensayos basados en ATP incluyendo ensayos bioluminiscentes, el ensayo de sulforrodamina B (SRB), el ensayo WST, el ensayo clonogénico y la tecnología ECIS.

La actividad citotóxica mediada por constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención se mide preferiblemente en un ensayo de citotoxicidad basado en células. Se representa mediante el valor de EC<50>, que corresponde a la mitad de la concentración efectiva máxima (concentración del constructo de anticuerpo que induce una respuesta citotóxica a medio camino entre la referencia y el máximo). Preferiblemente, el valor de EC<50>de los constructos de anticuerpo biespecíficos es de <20.000 pg/ml, más preferiblemente <5000 pg/ml, incluso más preferiblemente <1000 pg/ml, incluso más preferiblemente <500 pg/ml, incluso más preferiblemente <350 pg/ml, incluso más preferiblemente <250 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml, incluso más preferiblemente <50 pg/ml, incluso más preferiblemente <10 pg/ml y lo más preferiblemente <5 pg/ml.

Cualquiera de los valores de EC<50>facilitados anteriormente puede combinarse con uno cualquiera de los escenarios indicados de un ensayo de citotoxicidad basado en células, por ejemplo, en línea con el método descrito en el ejemplo adjunto. Por ejemplo, cuando se usan células T CD8 positivas (humanas) o una línea de células T de macaco como células efectoras, el valor de EC<50>del constructo de anticuerpo biespecífico de antígeno de células diana/CD3 es de preferiblemente <1000 pg/ml, más preferiblemente <500 pg/ml, incluso más preferiblemente <250 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml, incluso más preferiblemente <50 pg/ml, incluso más preferiblemente <10 pg/ml y lo más preferiblemente <5 pg/ml. Si en este ensayo las células diana son células transfectadas con antígeno de células diana (humanas o de macado) tales como células CHO, el valor de EC<50>del constructo de anticuerpo biespecífico de antígeno de células diana/CD3 es de preferiblemente <150 pg/ml, más preferiblemente <100 pg/ml, incluso más preferiblemente <50 pg/ml, incluso más preferiblemente <30 pg/ml, incluso más preferiblemente <10 pg/ml y lo más preferiblemente <5 pg/ml. Si las células diana son una línea celular expresora natural positiva para antígeno de células diana, entonces el valor de EC<50>es de preferiblemente <350 pg/ml, más preferiblemente <250 pg/ml, incluso más preferiblemente <200 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml, incluso más preferiblemente <150 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml y lo más preferiblemente <50 pg/ml, o menor. Cuando se usan PBMC (humanas) como células efectoras, el valor de EC<50>del constructo de anticuerpo biespecífico de antígeno de células diana/CD3 es de preferiblemente <1000 pg/ml, más preferiblemente <750 pg/ml, más preferiblemente <500 pg/ml, incluso más preferiblemente <350 pg/ml, incluso más preferiblemente <250 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml y lo más preferiblemente <50 pg/ml, o menor.

Preferiblemente, los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención no inducen/median en la lisis o esencialmente no inducen/median en la lisis de células negativas para antígeno de células diana tales como células CHO. El término “no inducen lisis”, “esencialmente no inducen lisis”, “no median en la lisis” o “esencialmente no median en la lisis” significa que un constructos de anticuerpo de la presente invención no induce o no media en la lisis de más del 30%, preferiblemente no más del 20%, más preferiblemente no más del 10%, de manera particularmente preferible no más del 9%, del 8%, del 7%, del 6% o del 5% de célula negativas para antígeno de células diana, según lo cual la lisis de una línea celular positiva para antígeno de células diana se establece como el 100%. Esto es aplicable habitualmente para concentraciones del constructo de anticuerpo de hasta 500 nM. El experto en la técnica conoce cómo medir la lisis celular sin más preámbulo. Además, la presente memoria descriptiva enseña instrucciones específicas de cómo medir la lisis celular.

La diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y la dimérica de constructos de anticuerpo biespecíficos individuales se denomina “hueco de potencia”. Este hueco de potencia puede, por ejemplo, calcularse como relación entre los valores de EC<50>de la forma monomérica y dimérica de la molécula. Los huecos de potencia de los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención son de preferiblemente <5, más preferiblemente <4, incluso más preferiblemente <3, incluso más preferiblemente <2 y lo más preferiblemente <1.

El primer y/o el segundo dominio(s) de unión (o cualquiera adicional) del constructo de anticuerpo de la invención es/son preferiblemente especies cruzadas específicas para miembros del orden de mamíferos de los primates. Los dominios de unión a CD3 específicos de especies cruzadas se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008/119567. Según una realización, el primer y/o el segundo dominio de unión, además de unirse a un antígeno de células diana y CD3 humano, respectivamente, se unirán también al antígeno de células diana/CD3 de primates incluyendo (pero sin limitarse a) primates del Nuevo Mundo (tal comoCallithrix jacchus, Saguinus OedipusoSaimirí sciureus),primates del Viejo mundo (tales como babuinos y macacos), gibones y homínidos no humanos.

En un aspecto de la invención, el primer dominio de unión se une a CDH19 humana (SEQ ID NO: 611) y se une además a CDH19 de macaco, tal como CDH19 deMacaca fascicularis(SEQ ID NO: 612). La afinidad del primer dominio de unión por CDH19 de macaco es de preferiblemente <15 nM, más preferiblemente <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, incluso más preferiblemente <1 nM, incluso más preferiblemente <0,5 nM, incluso más preferiblemente <0,1 nM y lo más preferiblemente <0,05 nM o incluso <0,01 nM.

Preferiblemente, el hueco de afinidad de los constructos de anticuerpo según la invención para unirse a su antígeno diana de macaco frente a humano específico, por ejemplo, CDH19 de macaco frente a CDH19 humana [maCDH19:huCDH19], es de entre 0,1 y 10, más preferiblemente entre 0,2 y 5, incluso más preferiblemente entre 0,3 y 2,5, incluso más preferiblemente entre 0,4 y 2, y lo más preferiblemente entre 0,5 y 1.

En una realización adicional del constructo de anticuerpo de la invención, el constructo de anticuerpo comprende un péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal y un péptido de unión a FcRn en el extremo C-terminal seleccionados del grupo que consiste en:

(a) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLYPANG(SEQ ID NO: 2) y aquel en el extremo C-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO: 5);

(b) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLYPANG(SEQ ID NO: 2) y aquel en el extremo C-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3);

(c) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3) y aquel en el extremo C-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO: 5);

(d) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3) y aquel en el extremo C-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3);

(e) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO: 5) y aquel en el extremo C-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLYPANG(SEQ ID NO: 2); y

(f) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO: 5) y aquel en el extremo C-terminal comprende la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3).

Como resulta evidente a partir de los datos presentados en el ejemplo 1, se ha encontrado sorprendentemente que los péptidos cíclicos, es decir péptidos que comprenden un bucle cys, son por un lado críticos para la producción, por ejemplo, en el cultivo celular (criterios de producción aguas arriba) y el aislamiento de constructos de cadena sencilla biespecíficos (criterios de producción aguas abajo). Por otro lado, el ejemplo muestra que la posición de tal péptido cíclico dentro de la cadena proteica es decisiva para la producción y el aislamiento de constructos de cadena sencilla biespecíficos. Los constructos de anticuerpo de cadena sencilla biespecíficos de la invención que comprenden las combinaciones identificadas de péptidos de unión a FcRn en el extremo N-terminal y en el extremo C-terminal del constructo permiten la provisión de un constructo de anticuerpo con características de distribución tisular preferidas al tiempo que conservan sus criterios de producción aguas arriba y aguas abajo industrialmente aceptables.

En una realización adicional del constructo de anticuerpo de la invención, los péptidos de unión a FcRn están ligados al constructo de anticuerpo por medio de un ligador peptídico. Se prefiere que el ligador peptídico tenga una secuencia de aminoácidos de (GGGGS)n (SEQ ID NO: 6)n donde “n” es un número entero en el intervalo de 1 a 5. Más preferiblemente, un número entero “n” está en el intervalo de 1 a 3 y lo más preferiblemente “n” es 1 o 2.

En una realización de la invención, el constructo comprende un dominio adicional que se une a albúmina sérica. Un dominio de unión a albúmina particularmente preferido es, por ejemplo, el péptido que tiene la secuencia RDWDFDVFGGGTPVGG (SEQ ID NO: 609). Sin embargo, se prefieren dominios que se unen a albúmina que son de estructura lineal y no comprenden estructuras tales como bucles cys, dado que se asume que tal estructura de bucle cys adicional en un constructo de anticuerpo de la invención está relacionada con problemas de producción.

También en una realización del constructo de anticuerpo de la invención, el antígeno de superficie celular diana es un antígeno tumoral. Se prefiere que este antígeno tumoral se seleccione del grupo que consiste en CDH19 (cadherina 19), MSLN (mesotelina, también descrita como factor potenciador de megacariocitos [MPF]), DLL3, FLT3 (tirosina cinasa 3 relacionada con FMS, también descrita como tirosina cinasa 1 de células madre [STK1]) o FLK2), CD33 (también conocida como lectina 3 similar a inmunoglobulina de unión a ácido siálico [SIGLEC3]), CD20 (también conocida como antígeno superficial B1 de linfocitos B [B1] o MS4A1) y EGFRvIII.

En una realización del constructo de anticuerpo de la invención, el segundo dominio de unión se une a un epítopo de cadena CD3s humana y deCallithrix jacchus, Saguinus oedipusoSaimirí sciureus,formando el epítopo parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (humana), SEQ ID NO: 8(Callithrix jacchus),SEQ ID NO: 9(Saguinus oedipus)y SEQ ID NO: 10(Saimiri sciureus)y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 11).Callithrix jacchusySaguinus oedipusson ambos primates del Nuevo Mundo que pertenecen a la familia deCallitrichidae,mientras queSaimiri sciureuses un primate del Nuevo Mundo que pertenece a la familia deCebidae.

En una realización el segundo dominio de unión comprende una región VL que tiene CDR-L1-L3 y una región VH que tiene CDR-H1-H3 seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:12-14 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:15-17;

(b) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:24-26 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:27-29;

(c) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:36-38 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:39-41;

(d) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:48-50 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:51-53;

(e) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:60-62 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:63-65;

(f) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:72-74 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:75-77;

(g) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:84-86 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:87-89;

(h) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:96-98 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:99-101;

(i) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:108-110 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:111-113;

(j) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:120-122 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:123-125;

(k) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:616-618 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:613-615;

(l) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:626-628 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:623-625;

(m) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:636-638 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:633-635;

(n) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:646-648 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:643-645;

(o) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:656-658 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:653-655;

(p) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:666-668 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:663-665;

(q) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:676-678 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:673-675; y

(r) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:686-688 y CDR-H1-H3 tal como se representa en las SEQ ID NO:683-685.

(a) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 18 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 20;

(b) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 30 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 32;

(c) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 42 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 44;

(d) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 54 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 56;

(e) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 66 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 68;

(f) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 78 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 80;

(g) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 90 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 92;

(h) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 102 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 104;

(i) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 114 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 116;

(j) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 126 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 12;8

(k) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 619 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 620;

(l) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 629 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 630;

(m) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 639 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 640;

(n) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 649 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 650;

(o) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 659 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 660;

(p) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 669 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 670;

(q) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 679 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 680; y

(r) una cadena VH tal como se representa en SEQ ID NO: 689 y una cadena VL tal como se representa en SEQ ID NO: 690.

También en una realización del constructo de anticuerpo de la invención, el segundo dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 681 o SEQ ID NO: 691.

En una realización preferida del constructo de anticuerpo de la invención, los dominios están dispuestos desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal tal como sigue:

(péptido de unión a FcRn que comprende SEQ ID NO: 1, en la que X<1>es Y o H) - (cadena VH del primer dominio de unión) - (cadena VL del primer dominio de unión) - (cadena VH del segundo dominio de unión) - (cadena VL del segundo dominio de unión) - (péptido de unión a FcRn que comprende SEQ ID NO: 4)

o

(péptido de unión a FcRn que comprende SEQ ID NO: 4) - (cadena VH del primer dominio de unión) - (cadena VL del primer dominio de unión) - (cadena VH del segundo dominio de unión) - (cadena VL del segundo dominio de unión) -(péptido de unión a FcRn que comprende SEQ ID NO: 1, en la que X<1>es Y o H)

También se contemplan modificaciones de las secuencias de aminoácidos de los constructos de anticuerpo descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del constructo de anticuerpo. Las variantes de las secuencias de aminoácidos de los constructos de anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico de los constructos de anticuerpo, o mediante la síntesis de péptidos. Todas las modificaciones de las secuencias de aminoácidos descritas más adelantes deben dar como resultado un constructo de anticuerpo que conserve todavía la actividad biológica deseada (unión a antígeno de células diana y a CD3) de la molécula parental no modificada.

El término “aminoácido” o “residuo de aminoácido” se refiere normalmente a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparagina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (He o I): leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V), aunque pueden usarse aminoácidos modificados, sintéticos o raros según se desee. Generalmente, los aminoácidos pueden agruparse por tener una cadena lateral apolar (por ejemplo, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, Asp, Glu); una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar no cargada (por ejemplo, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr).

Las modificaciones de aminoácidos incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los constructos de anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se hace para llegar al constructo final, siempre que el constructo final presente las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos posttraduccionales de los constructos de anticuerpo, tal como cambiar el número o la posición de sitios de glicosilación.

Por ejemplo, pueden insertarse o delecionarse 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos en cada una de las CDR (naturalmente, dependiendo de su longitud), mientras que pueden insertarse o delecionarse 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos en cada una de las FR. Preferiblemente, las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que oscila en longitud desde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones dentro de la secuencia de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Una variante de inserción del constructo de anticuerpo de la invención incluye la fusión al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del constructo de anticuerpo a una enzima o una fusión a un polipéptido que aumenta la semivida sérica del constructo de anticuerpo.

Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las CDR de la cadena pesada y/o ligera, en particular las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR en la cadena pesada y/o ligera. Las sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas tal como se describe en el presente documento. Preferiblemente, pueden sustituirse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos en una CDR, mientras que pueden sustituirse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos en las regiones de entramado (FR), dependiendo de la longitud de la CDR o FR. Por ejemplo, si una secuencia de CDR abarca 6 aminoácidos, se concibe que uno, dos o tres de estos aminoácidos estén sustituidos. De manera similar, si una secuencia de CDR abarca 15 aminoácidos se concibe que uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de estos aminoácidos estén sustituidos.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones de los constructos de anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina “mutagénesis por barrido de alanina” tal como se describe por Cunningham y Wells en Science, 244: 1081-1085 (1989). En este caso, un residuo o grupo de residuos diana dentro del constructo de anticuerpo se identifica(n) (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplaza(n) por un aminoácido neutro o cargado negativamente (lo más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el epítopo.

Esas ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo más u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio o la región para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado/a, no es necesario predeterminar la naturaleza de la mutación en sí. Por ejemplo, para analizar u optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, puede realizarse mutagénesis por barrido de alanina o aleatoria en un codón o región diana, y las variantes de constructo de anticuerpo expresadas se examinan para la combinación óptima de actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida se conocen ampliamente, por ejemplo, mutagénesis de cebador M13 y mutagénesis por PCR. El examen de los mutantes se hace usando ensayos de actividades de unión a antígeno, tal como por ejemplo, unión a CDH19.

Generalmente, si los aminoácidos se sustituyen en una o más de o todas las CDR de la cadena pesada y/o ligera, se prefiere que la secuencia “sustituida” obtenida entonces sea al menos el 60%, más preferiblemente el 65%, incluso más preferiblemente el 70%, de manera particularmente preferible el 75%, de manera más particularmente preferible el 80% idéntica a la secuencia de CDR “original”. Esto significa que depende de la longitud de la CDR en qué grado es idéntica a la secuencia “sustituida”. Por ejemplo, una CDR que tiene 5 aminoácidos es preferiblemente el 80% idéntica a su secuencia sustituida con el fin de tener al menos un aminoácido sustituido. Por consiguiente, las CDR del constructo de anticuerpo pueden tener diferentes grados de identidad con sus secuencias sustituidas, por ejemplo, CDRL1 puede tener el 80%, mientras que CDRL3 puede tener el 90%.

Las sustituciones (o reemplazos) preferidas son sustituciones conservativas. Sin embargo, se concibe cualquier sustitución (incluyendo una sustitución no conservativa o una o más de las “sustituciones a modo de ejemplo” listadas en la tabla 1, más adelante) siempre que el constructo de anticuerpo conserve su capacidad para unirse a antígeno de células diana por medio del primer dominio de unión y a CD3 épsilon por medio del segundo dominio de unión y/o sus CDR tengan una identidad con la secuencia entonces sustituida (al menos el 60%, más preferiblemente el 65%, incluso más preferiblemente el 70%, de manera particularmente preferible el 75%, de manera más particularmente preferible el 80% idéntica a la secuencia de CDR “original”).

Sustituciones conservativas se muestran en la tabla 1 bajo el encabezado de “sustituciones preferidas”. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados “sustituciones a modo de ejemplo” en la tabla A, o tal como se describe adicionalmente más adelante en referencia a clases de aminoácidos, y examinarse los productos para una característica deseada.

Tabla A: Sustituciones de aminoácidos

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del constructo de anticuerpo de la presente invención se llevan a cabo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura de la estructura principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el grueso de la cadena lateral. Los residuos que aparecen de manera natural se dividen en grupos basándose en los propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína no implicado en mantener la conformación apropiada del constructo de anticuerpo puede sustituirse, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula e impedir una reticulación aberrante. A la inversa, puede(n) añadirse enlace(s) cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Para las secuencias de aminoácidos, la identidad y/o similitud de secuencia se determina usando técnicas estándar conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith y Waterman, 1981,Adv. Appl. Math.2:482, el algoritmo de alineación de identidad de secuencia de Needleman y Wunsch, 1970,J. Mol. Biol.48:443, el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.85:2444, implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereuxet al.,1984,Nucl. Acid Res.12:387-395, usando preferiblemente los ajustes por defecto, o mediante inspección. Preferiblemente, el porcentaje de identidad se calcula mediante FastDB basándose en los siguientes parámetros: penalización por emparejamiento erróneo de 1; penalización por hueco de 1; penalización por tamaño de hueco de 0,33; y penalización por unión de 30, “Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods y Applications, págs. 127 149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones por pares, progresivas. También puede representar gráficamente un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas la crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, 1987,J. Mol. Evol.35:351-360; el método es similar al descrito por Higgins y Sharp, 1989,CABIOS5:151-153. Los parámetros de PILEUP útiles incluyen un peso de hueco por defecto de 3,00, un peso de longitud de hueco por defecto de 0,10 y huecos de extremo ponderados.

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito en: Altschulet al.,1990,J. Mol. Biol.215:403-410; Altschulet al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402; y Karinet al.,1993,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:5873-5787. Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 que se obtuvo de Altschulet al.,1996,Methods in Enzymology266:460-480. WU-BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se fijan a los valores por defecto. Los parámetros ajustables se fijan con los siguientes valores: intervalo de superposición=1, fracción de superposición=0,125, umbral de palabra (T)=II. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular frente a la que está buscándose la secuencia de interés; sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar sensibilidad.

Un algoritmo útil adicional es BLAST con huecos tal como notifica Altschulet al.,1993,Nucl. Acids Res.25:3389-3402. BLAST con huecos usa puntuaciones de sustitución BLOSUM-62; el parámetro T umbral se fija a 9; el método de dos coincidencias para activar extensiones sin huecos, carga longitudes de hueco de k un coste de 10+k; Xu se fija 16, y Xg se fija 40 para la fase de búsqueda en la base de datos y a 67 para la fase de salida de los algoritmos. Las alineaciones con huecos se activan mediante una puntuación que corresponde a aproximadamente 22 bits.

Generalmente, la homología, similitud o identidad de aminoácidos entre CDR variantes individuales son de al menos el 60% con respecto a las secuencias representadas en el presente documento, y más normalmente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos el 65% o el 70%, más preferiblemente al menos el 75% o el 80%, incluso más preferiblemente al menos el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% y casi el 100%. De una manera similar, “el porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico” con respecto a la secuencia de ácido nucleico de las proteínas de unión identificadas en el presente documento se define como el porcentaje de residuos de nucleótido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de nucleótido en la secuencia codificante del constructo de anticuerpo. Un método específico utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 fijado a los parámetros por defecto, con intervalo de solapamiento y fracción de solapamiento fijados a 1 y 0,125, respectivamente.

Generalmente, la homología, similitud o identidad de secuencia de ácido nucleico entre las secuencias de nucleótidos que codifican CDR variantes individuales y las secuencias de nucleótidos representadas en el presente documento son de al menos el 60%, y más normalmente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99%, y casi el 100%. Por tanto, una “CDR variante” es una con la homología, similitud o identidad especificada con respecto a la CDR parental de la invención, y comparte la función biológica, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de la especificidad y/o actividad de la CDR parental.

Se concibe además que los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención presenten eficacia terapéutica o actividad antitumoral. Esto puede evaluarse, por ejemplo, en un estudio tal como se da a conocer en el siguiente ejemplo de un modelo de xenoinjerto de tumor humano en fase avanzada:

El día 1 del estudio se inyectan por vía subcutánea 5x106 células de una línea celular de cáncer positiva para antígeno de células diana humana en el flanco dorsal derecho de ratones NOD/SCID hembra. Cuando el volumen tumoral medio alcanza aproximadamente 100 mm3, se trasplantan células T CD3 positivas humanas expandidasin vitroen los ratones mediante la inyección de aproximadamente 2x107 células en la cavidad peritoneal de los animales. Los ratones del grupo de control de vehículo 1 no reciben células efectoras y se usan como control no trasplantado para la comparación con el grupo de control de vehículo 2 (que recibe células efectoras) para monitorizar el impacto de células T solas sobre el crecimiento tumoral. El tratamiento con anticuerpo empieza cuando el volumen tumoral medio alcanza alrededor de 200 mm3. El tamaño tumoral medio de cada grupo de tratamiento el día de inicio del tratamiento no debería ser estadísticamente diferente de cualquier otro grupo (análisis de varianza). Los ratones se tratan con 0,5 mg/kg/día de un constructo de anticuerpo biespecífico de antígeno de células diana/CD3 mediante inyección de bolo intravenoso durante alrededor de 15 a 20 días. Los tumores se miden mediante un calibre durante el estudio y se evalúa el progreso mediante la comparación entre grupos de los volúmenes tumorales (TV). La inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] se determina calculando TV como T/C% = 100 x (mediana de TV del grupo analizado) / (mediana de TV del grupo control 2).

El experto en la técnica conoce cómo modificar o adaptar ciertos parámetros de este estudio, tal como el número de células tumorales inyectadas, el sitio de inyección, el número de células T humanas trasplantadas, la cantidad de constructos de anticuerpo biespecíficos que deben administrarse y los plazos, al tiempo que se llega todavía a un resultado significativo y reproducible. Preferiblemente, la inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] es < 70 o < 60, más preferiblemente < 50 o < 40, incluso más preferiblemente < 30 o < 20 y lo más preferiblemente < 10 o < 5 o incluso < 2,5.

En una realización, los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención presentan altos rendimientos de monómeros en condiciones a escala de investigación estándar, por ejemplo, en un proceso de purificación de dos etapas estándar. Preferiblemente, el rendimiento de monómeros de los constructos de anticuerpo según la invención es > 0,25 mg/l de sobrenadante, más preferiblemente > 0,5 mg/l, incluso más preferiblemente > 1 mg/l y lo más preferiblemente > 3 mg/l de sobrenadante.

Igualmente, puede determinarse el rendimiento de las isoformas de constructo de anticuerpo diméricas y el porcentaje de monómero (es decir, monómero: (monómero+dímero)) de los constructos de anticuerpo. La productividad de constructos de anticuerpo monoméricos y diméricos y el porcentaje de monómero calculado pueden obtenerse, por ejemplo, en la etapa de purificación de SEC de sobrenadante de cultivo de producción a escala de investigación estandarizada en frascos rotativos. En una realización, el porcentaje de monómero de los constructos de anticuerpo es > 80%, más preferiblemente > 85%, incluso más preferiblemente > 90% y lo más preferiblemente > 95%.

En una realización adicional, el porcentaje de identidad con la línea germinal humana de los constructos de anticuerpo según la invención es > 70% o > 75%, más preferiblemente > 80% o > 85%, incluso más preferiblemente > 90% y lo más preferiblemente > 95%. Se cree que la identidad con los productos génicos de línea germinal de anticuerpo humano es una característica importante para reducir el riesgo de que las proteínas terapéuticas provoquen una respuesta inmunitaria contra el fármaco en el paciente durante tratamiento. Hwang y Foote (“Immunogenicity of engineered antibodies” ; Methods 36 (2005) 3-10) demuestran que la reducción de porciones no humanas de constructos de anticuerpo farmacológicos conduce a una disminución del riesgo de inducir anticuerpos anti-fármaco en los pacientes durante el tratamiento. Comparando un número exhaustivo de fármacos de anticuerpo evaluados clínicamente y los respectivos datos de inmunogenicidad, se muestra la tendencia de que la humanización de las regiones V de anticuerpos hace que la proteína sea menos inmunogénica (promedio 5,1% de los pacientes) que los anticuerpos que portan regiones V no humanas inalteradas (promedio 23,59% de los pacientes). Un mayor grado de identidad con respecto a secuencias humanas es por tanto deseable para agentes terapéuticos proteicos basados en la región V en forma de constructos de anticuerpo. Para este propósito de determinar la identidad de la línea germinal, las regiones V de VL pueden alinearse con las secuencias de aminoácidos de segmentos V y segmentos J de línea germinal humana (http://vbase.marc-cpe-cam-ac-uk/) usando el software Vector NTI y calcularse la secuencia de aminoácidos dividiendo los residuos de aminoácido idénticos entre el número total de residuos de aminoácido de la VL en porcentaje. Lo mismo puede suceder para los segmentos de VH (http://vbase.marc-cpe-cam-ac-uk/) con la excepción de que puede excluirse VH CDR3 debido a su alta diversidad y una falta de parejas de alineación de VH CDR3 de línea germinal humana existentes. Entonces pueden usarse técnicas recombinantes para aumentar la identidad de secuencia con respecto a genes de línea germinal de anticuerpos humanos.

En una realización, los constructos de anticuerpo tienen una estabilidad en plasma preferida (relación de EC50 con plasma con respecto a EC50 sin plasma) de < 5, más preferiblemente < 4, incluso más preferiblemente < 3 y lo más preferiblemente < 2. La estabilidad en plasma de un constructo de anticuerpo puede someterse a prueba mediante la incubación del constructo en plasma humano a 37°C durante 24 horas seguido de la determinación de EC50 en un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51cromo. Las células efectoras en el ensayo de citotoxicidad pueden ser células T CD8 positivas humanas enriquecidas estimuladas. Las células diana pueden ser, por ejemplo, células CHO transfectadas con antígeno de células diana humano. La relación de células efectoras con respecto a diana (E:T) puede elegirse como 10:1. El conjunto de plasma humano usado para este propósito se deriva de la sangre de donantes sanos recogida mediante jeringuillas recubiertas con EDTA. Los componentes celulares se eliminan mediante centrifugación y se recoge la fase de plasma superior y posteriormente se agrupa. Como control, se diluyen constructos de anticuerpo inmediatamente antes del ensayo de citotoxicidad en medio RPM1-1640. La estabilidad en plasma se calcula como la relación de EC50 (tras la incubación en plasma) con respecto a EC50 (control).

Se prefiere que la conversión de monómero a dímero de constructos de anticuerpo de la invención sea baja. La conversión puede medirse en diferentes condiciones y analizarse mediante cromatografía por exclusión de tamaño de alto rendimiento. Por ejemplo, la incubación de las isoformas monoméricas de los constructos de anticuerpo puede llevarse a cabo durante 7 días a 37°C y concentraciones de, por ejemplo, 100 pg/ml o 250 pg/ml en un incubador. En estas condiciones, se prefiere que los constructos de anticuerpo de la invención muestran un porcentaje de dímero que sea <5%, más preferiblemente <4%, incluso más preferiblemente <3%, incluso más preferiblemente <2,5%, incluso más preferiblemente <2%, incluso más preferiblemente <1,5% y lo más preferiblemente <1%.

También se prefiere que los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención presenten una conversión de dímero muy baja tras un número de ciclos de congelación/descongelación. Por ejemplo, el constructo de anticuerpo monómero se ajusta a una concentración de 250 pg/ml, por ejemplo, en tampón de ejecución de SEC y se somete a tres ciclos de congelación/descongelación (congelación a -80°C durante 30 min seguido de descongelación durante 30 min a temperatura ambiente), seguido de SEC de alto rendimiento para determinar el porcentaje de constructo de anticuerpo inicialmente monomérico que se había convertido a constructo de anticuerpo dimérico. Preferiblemente, los porcentajes de dímero de los constructos de anticuerpo biespecíficos son <5%, más preferiblemente <4%, incluso más preferiblemente <3%, incluso más preferiblemente <2,5%, incluso más preferiblemente <2%, incluso más preferiblemente <1,5% y lo más preferiblemente <1%, por ejemplo, after tres ciclos de congelación/descongelación.

Los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención muestran preferiblemente una termoestabilidad favorable con temperaturas de fusión por encima de 60°C. Este parámetro puede determinarse tal como sigue: se determinan curvas de fusión por temperatura mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar las estabilidades de proteínas biofísicas intrínsecas de los constructos de anticuerpo. Estos experimentos se realizan usando un dispositivo VP-DSC de MicroCal LLC (Northampton, MA, EE. UU.). La absorción de energía de una muestra que contiene un constructo de anticuerpo se registra desde 20°C hasta 90°C en comparación con una muestra que contiene solo el tampón de formulación. Los constructos de anticuerpo se ajustan a una concentración final de 250 pg/ml, por ejemplo, en tampón de ejecución de SEC. Para registrar la respectiva curva de fusión, la temperatura de muestra global se aumenta gradualmente. A cada temperatura T se registra la absorción de energía de la muestra y la referencia de tampón de formulación. La diferencia en la absorción de energía Cp (kcal/mol/2C) de la muestra menos la referencia se representa gráficamente frente a la respectiva temperatura. La temperatura de fusión se define como la temperatura en el primer máximo de absorción de energía.

En una realización adicional, el constructo de anticuerpo según la invención es estable a pH ácido. Cuanto más tolerante se comporte el constructo de anticuerpo a pH no fisiológico, tal como pH 5,5 (un pH que se requiere para ejecutar, por ejemplo, una cromatografía de intercambio catiónico), mayor será la recuperación del constructo de anticuerpo eluido desde una columna de intercambio iónico en relación con la cantidad total de proteína cargada. La recuperación del constructo de anticuerpo a partir de una columna de intercambio iónico (por ejemplo, catiónico) a pH 5,5 es preferiblemente > 30%, más preferiblemente > 40%, más preferiblemente > 50%, incluso más preferiblemente > 60%, incluso más preferiblemente > 70%, incluso más preferiblemente > 80% y lo más preferiblemente > 90%.

En una realización alternativa, la invención proporciona un polinucleótido que codifica un constructo de anticuerpo de la invención.

Un polinucleótido es un biopolímero compuesto por 13 o más monómeros nucleotídicos unidos covalentemente en una cadena. ADN (tal como ADNc) y ARN (tal como ARNm) son ejemplos de polinucleótidos con distinta función biológica. Los nucleótidos son moléculas orgánicas que sirven como monómeros o subunidades de moléculas de ácido nucleico como ADN o ARN. La molécula de ácido nucleico o el polinucleótido puede ser bicatenario y monocatenario, lineal y circular. Está comprendido preferiblemente en un vector que está comprendido preferiblemente en una célula huésped. Dicha célula huésped es, por ejemplo, tras la transformación o transfección con el vector o el polinucleótido de la invención, capaz de expresar el constructo de anticuerpo. Para ese propósito, el polinucleótido o la molécula de ácido nucleico está ligado operativamente con secuencias control.

El código genético es el conjunto de reglas mediante el que la información codificada dentro de material genético (ácidos nucleicos) se traduzca a proteínas. La decodificación biológica en células vivas se lleva a cabo mediante el ribosoma que liga aminoácidos en un orden especificado por ARNm, usando moléculas de ARNt para portar aminoácidos y leer el ARNm de tres nucleótidos a la vez. El código define cómo secuencias de estos tripletes nucleotídicos, denominados codones, especifican qué aminoácido se añadirá a continuación durante la síntesis de proteínas. Con algunas excepciones, un codón de tres nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico especifica un único aminoácido. Dado que la amplia mayoría de los genes están codificados con exactamente el mismo código, este código particular se denomina a menudo código genético canónico o estándar. Aunque el código genético determina la secuencia de proteína para una región codificante dada, otras regiones genómicas pueden influir en cuándo y dónde se producen estas proteínas.

Además, la invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido/una molécula de ácido nucleico de la invención.

Un vector es una molécula de ácido nucleico usada como vehículo para transferir material genético (extraño) al interior de una célula. El término “vector” abarca - pero no está restringido a - plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. En general, los vectores modificados mediante ingeniería comprenden un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable. El propio vector es generalmente una secuencia de nucleótidos, comúnmente una secuencia de ADN, que comprende un inserto (transgén) y una secuencia más grande que sirve como la “estructura principal” del vector. Los vectores modernos pueden abarcar características adicionales más allá del inserto transgénico y una estructura principal: promotor, marcador genético, resistencia a antibióticos, gen indicador, secuencia de selección como diana, etiqueta de purificación de proteínas. Los vectores denominados vectores de expresión (constructos de expresión) son específicamente para la expresión del transgén en la célula diana y generalmente tienen secuencias control.

El término “secuencias control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante ligada operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma. Se conoce que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está “ligado operativamente” cuando está en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o líder secretor está ligado operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está ligado operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está ligado operativamente a una secuencia codificante si está situado para facilitar la traducción. Generalmente, “ligado operativamente” significa que las secuencias de ADN que están ligadas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El ligado se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se usan los adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

La “transfección” es el proceso de introducir deliberadamente moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo vectores) en células diana. El término se usa en la mayoría de los casos para métodos no virales en células eucariotas. La transducción se usa a menudo para describir la transferencia mediada por virus de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos. La transfección de células de animales implica normalmente abrir poros o “agujeros” transitorios en la membrana celular, para permitir la captación de material. La transfección puede llevarse a cabo usando fosfato de calcio, mediante electroporación, mediante exprimido celular o mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas, que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga dentro.

El término “transformación” se usa para describir la transfer no viral de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo vectores) al interior de bacterias y también al interior de células eucariotas no de animales, incluyendo células vegetales. Por tanto, la transformación es la alteración genética de una célula eucariota bacteriana o no animal que resulta de la captación directa a través de la(s) membrana(s) celular(es) desde sus alrededores y la incorporación posterior de material genético exógeno (moléculas de ácido nucleico). La transformación puede efectuarse mediante medios artificiales. Para que se produzca la transformación, las células o bacterias tienen que estar en un estado de competencia, que puede producirse como respuesta de tiempo limitado a condiciones medioambientales tales como agotamiento y densidad celular.

Además, la invención proporciona una célula huésped transformada o transfectada con el polinucleótido/la molécula de ácido nucleico o con el vector de la invención.

Tal como se usan en el presente documento, se pretende que los términos “célula huésped” o “célula receptora” incluyan cualquier célula individual o cultivo celular que pueda ser o haya sido receptor de vectores, moléculas de ácido nucleico exógenas y polinucleótidos que codifican el constructo de anticuerpo de la presente invención; y/o receptor del propio constructo de anticuerpo. La introducción del respectivo material en la célula se lleva a cabo a modo de transformación, transfección y similar. Se pretende también que el término “célula huésped” incluya la progenie o la progenie potencial de una única célula. Dado que ciertas modificaciones pueden producirse en generaciones sucesivas debido a una mutación ya sea natural, accidental o deliberada, o debido a influencias medioambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, completamente idéntica (en morfología o en complemente de ADN genómico o total) a la célula parental, pero está incluida todavía dentro del alcance del término tal como se usa en el presente documento. Las células huésped adecuadas incluyen células procariotas o eucariotas, e incluyen también, pero no se limitan, a bacterias, células de levadura, células fúngicas, células vegetales y células de animales, tales como células de insecto y células de mamífero, por ejemplo, murinas, de rata, de macaco o humanas.

El constructo de anticuerpo de la invención puede producirse en bacterias. Tras la expresión, el constructo de anticuerpo de la invención se aísla de la pasta celular deE. colien una fracción soluble y puede purificarse a través de, por ejemplo, cromatografía de afinidad y/o exclusión por tamaño. La purificación final puede llevarse a cabo de manera similar al proceso para purificar anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO.

Además de procariotas, microbios eucariotas tales como levaduras u hongos filamentosos son huéspedes de clonación o de expresión adecuados para el constructo de anticuerpo de la invención.Saccharomyces cerevisiae,o una levadura de panadería común, es la usada más comúnmente entre microorganismos huésped eucariotas inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies y cepas están disponibles comúnmente y son útiles en el presente documento, tal comoSchizosaccharomyces pombe,huéspedes de Kluyveromyces tales comoK. lactis, K. fragilis(ATCC 12424),K. bulgaricus(ATCC 16045),K. wickeramii(ATCC 24178),K. waltii(ATCC 56500),K. drosophilarum(ATCC 36906),K. thermotoleransyK. marxianus,yarrowia (documento EP 402 226);Pichia pastoris(documento EP 183 070); Candida;Trichoderma reesia(documento EP 244 234);Neurospora crassa,Schwanniomyces tales comoSchwanniomyces occidentalis,y hongos filamentosos tales como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes de Aspergillus tales comoA. nidulansyA. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión de constructo de anticuerpo glicosilado de la invención se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales comoSpodoptera frugiperda(oruga),Aedes aegypti(mosquito),Aedes albopictus(mosquito),Drosophila melanogaster(mosca de la fruta) yBombyx morí.Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 deAutographa californicaNPV y la cepa Bm-5 deBombyxmoriNPV, y tales virus pueden usarse como virus en el presente documento según la presente invención, particularmente para la transfección de células deSpodoptera frugiperda.

También pueden usarse cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco como huéspedes. Vectores de clonación y de expresión útiles en la producción de proteínas en cultivo de células vegetales se conocen por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Hiattet al.,Nature (1989) 342: 76 78, Owenet al.(1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenkoet al.(1995) The Plant J 8: 745-750, y Feckeret al.(1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

Sin embargo, el mayor interés ha sido en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) ha pasado a ser un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Grahamet al.,J.

Gen Virol. 36 : 59 (1977)); células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaubetal.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI ATCC Cc L 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK,<a>T<c>C CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, A<t>CC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humanas (Hep G2,1413 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL5 1); células TRI (Matheret al.,Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

La invención proporciona también un proceso para la producción de un constructo de anticuerpo de la invención, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula huésped de la invención en condiciones que permiten la expresión del constructo de anticuerpo de la invención y recuperar el constructo de anticuerpo producido del cultivo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivar” se refiere al mantenimiento, la diferenciación, el crecimiento, la proliferación y/o la propagación de célulasin vitroen condiciones adecuadas en un medio. El término “expresión” incluye cualquier etapa implicada en la producción de un constructo de anticuerpo de la invención incluyendo, pero sin limitarse a, transcripción, modificación posttranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

Cuando se usan técnicas recombinantes, el constructo de anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio. Si el constructo de anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los desechos particulados, ya sean células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carteret al.,Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico deE. coli.Resumiendo, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a lo largo de alrededor de 30 min. Los desechos celulares pueden eliminarse mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, un filtro de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir proteólisis y pueden añadirse antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes adventicios.

El constructo de anticuerpo de la invención preparado a partir de las células huésped puede recuperarse o purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. También están disponibles otras técnicas para la purificación de proteína tal como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC en fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSE™, cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna ácido poliaspártico), cromato-enfoque, SDS-PAGE y precipitación en sulfato de amonio dependiendo del anticuerpo que deba recuperarse. Cuando el constructo de anticuerpo de la invención comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación.

La cromatografía de afinidad es una técnica de purificación preferida. La matriz a la que se une el ligando de afinidad es lo más a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poros controlados o poli(estirenodivinil)benceno permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden conseguirse con agarosa.

En una realización alternativa, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un constructo de anticuerpo de la invención o un constructo de anticuerpo producido según el proceso de la invención.

Una realización se refiere a un constructo de anticuerpo de la invención o un constructo de anticuerpo producido según el proceso de la invención para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora de una enfermedad seleccionada de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad vírica o un trastorno inmunológico.

Las formulaciones descritas en el presente documento son útiles como composiciones farmacéuticas en el tratamiento, la mejora y/o la prevención del estado médico patológico descrito en el presente documento en un paciente que lo necesite. El término “tratamiento” se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Tratamiento incluye la aplicación o administración de la formulación al cuerpo, un tejido aislado o una célula de un paciente que tiene una enfermedad/trastorno, un síntoma de una enfermedad/trastorno o una predisposición hacia una enfermedad/trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, reducir o afectar a la enfermedad, el síntoma de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.

El término “mejora” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier mejora del estado patológico de un paciente, mediante la administración de un constructo de anticuerpo según la invención a un sujeto que lo necesite. Una mejora de este tipo puede considerarse también como una ralentización o una detención de la progresión de la enfermedad del paciente. El término “prevención” tal como se usa en el presente documento significa evitar la aparición o reaparición de que un paciente tenga una enfermedad tal como se especifica en el presente documento, mediante la administración de un constructo de anticuerpo según la invención a un sujeto que lo necesite.

El término “enfermedad” se refiere a cualquier estado que pueda beneficiarse del tratamiento con el constructo de anticuerpo o la composición farmacéutica descrita en el presente documento. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellos estados patológicos que predispongan al mamífero a la enfermedad en cuestión.

Los términos “sujeto que lo necesite” o aquellos “que necesiten tratamiento” incluyen aquellos ya con el trastorno, así como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. El sujeto que lo necesite o “paciente” incluye sujetos humanos y de otros mamíferos que reciben tratamiento ya sea profiláctico o terapéutico.

El constructo de anticuerpo de la invención estará diseñado generalmente para rutas y métodos de administración específicos, para dosificaciones y frecuencias de administración específicas, para tratamientos específicos de enfermedades específicas, con intervalos de biodisponibilidad y persistencia, entre otras cosas. Los materiales de la composición se formulan preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración.

Por tanto, las formulaciones y composiciones pueden diseñarse según la invención para el suministro mediante cualquier vía de administración adecuada. En el contexto de la presente invención, las vías de administración incluyen, pero no se limitan a

• vías tópicas (tal como epicutánea, por inhalación, nasal, oftálmica, auricular/aural, vaginal, mucosa);

• vías enterales (tal como oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, bucal, rectal); y

• vías parenterales (tal como intravenosa, intraarterial, intraósea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, epidural, intratecal, subcutánea, intraperitoneal, extraamniótica, intraarticular, intracardiaca, intradérmica, intralesional, intrauterina, intravesical, intravítrea, transdérmica, intranasal, transmucosa, intrasinovial, intraluminal).

Las composiciones farmacéuticas y el constructo de anticuerpo de esta invención son particularmente útiles para administración parenteral, por ejemplo, suministro subcutáneo o intravenoso, por ejemplo, mediante inyección tal como inyección de bolo, o mediante infusión tal como infusión continua. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse usando un dispositivo médico. Ejemplos de dispositivos médicos para administrar composiciones farmacéuticas se describen en las patentes estadounidenses n ° 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447.233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851; y 5.399.163.

En particular, la presente invención proporciona una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como ejemplo no limitativo, la administración ininterrumpida o sustancialmente ininterrumpida, es decir continua, puede realizarse mediante un sistema de bomba pequeño portado por el paciente para medir el influjo de agente terapéutico al cuerpo del paciente. La composición farmacéutica que comprende el constructo de anticuerpo de la invención puede administrarse usando dichos sistemas de bomba. Tales sistemas de bomba se conocen generalmente en la técnica y se basan comúnmente en el intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico que debe infundirse. Cuando se intercambia el cartucho en un sistema de bomba de este tipo, puede suceder una interrupción temporal del flujo de lo contrario ininterrumpido de agente terapéutico al cuerpo del paciente. En un caso de este tipo, la fase de administración antes del reemplazo del cartucho y la fase de administración tras el reemplazo del cartucho se consideraría todavía dentro del significado de que los medios farmacéuticos y los métodos de la invención constituyen conjuntamente una “administración ininterrumpida” de tal agente terapéutico.

La administración continua o ininterrumpida de los constructos de anticuerpo de la invención puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de suministro de fluido o sistema de bomba pequeño que incluye un mecanismo de impulso de fluido para impulsar fluido fuera de un reservorio y un mecanismo de accionamiento para accionar el mecanismo de impulso. Los sistemas de bomba para administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para penetrar en la piel de un paciente y suministrar la composición adecuada al cuerpo del paciente. Dichos sistemas de bomba pueden estar fijados o unidos directamente a la piel del paciente independientemente de una vena, una arteria o un vaso sanguíneo, permitiendo de ese modo un contacto directo entre el sistema de bomba y la piel del paciente. El sistema de bomba puede estar unido a la piel del paciente durante de 24 horas a varios días. El sistema de bomba puede ser de tamaño pequeño con un reservorio para volúmenes pequeños. Como ejemplo no limitativo, el volumen del reservorio para la composición farmacéutica adecuada que puede administrarse puede ser de entre 0,1 y 50 ml.

La administración continua puede ser también transdérmica por medio de un parche portado sobre la piel y reemplazado a intervalos. Un experto en la técnica es consciente de sistemas de parche para un suministro de fármacos adecuado para este propósito. Debe observarse que la administración transdérmica es especialmente susceptible a la administración ininterrumpida, ya que el intercambio de un primer parche agotado puede ventajosamente llevarse a cabo simultáneamente con la colocación de un segundo parche nuevo, por ejemplo, en la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primer parche agotado e inmediatamente antes de la eliminación del primer parche agotado. No surgen problemas de interrupción del flujo o de fallo de la célula de potencia.

Si la composición farmacéutica se ha liofilizado, el material liofilizado se reconstituye en primer lugar en un líquido apropiado antes de la administración. El material liofilizado puede reconstituirse en, por ejemplo, agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la misma formulación en la que la proteína estaba antes de la liofilización.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada que puede determinarse, por ejemplo, mediante de estudios de escalado de dosis mediante la administración de dosis crecientes del constructo de anticuerpo de la invención que presenta la especificidad entre especies descrita en el presente documento a primates distintos de chimpancés, por ejemplo, macacos. Como se ha expuesto anteriormente, el constructo de anticuerpo de la invención que presenta la especificidad entre especies descrita en el presente documento puede usarse ventajosamente en forma idéntica en pruebas preclínicas en primates distintos de chimpancés y como fármaco en humanos. El régimen de dosificación se determinará por el médico tratante y factores clínicos. Como se conoce ampliamente la técnica médica, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que deba administrarse, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que estén administrándose de manera concurrente.

El término “dosis efectiva” o “dosificación efectiva” se define como una cantidad suficiente para conseguir o conseguir al menos parcialmente el efecto deseado. El término “dosis terapéuticamente efectiva” se define como una cantidad suficiente para curar o detener al menos parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya sufre la enfermedad. Las cantidades o dosis efectivas para este uso dependerán del estado que deba tratarse (la indicación), el constructo de anticuerpo suministrado, el contexto y los objetivos terapéuticos, la gravedad de la enfermedad, la terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al agente terapéutico, la vía de administración, el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o la condición (la edad y salud general) del paciente, y el estado general del propio sistema inmune del paciente. La dosis apropiada puede ajustarse según la opinión del médico tratante de modo que puede administrarse al paciente una vez o a lo largo de una serie de administraciones, y con el fin de obtener el efecto terapéutico óptimo.

Una dosificación típica puede oscilar entre alrededor de 0,1 pg/kg y alrededor de 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En realizaciones específicas, la dosificación puede oscilar entre 1,0 pg/kg y alrededor de 20 mg/kg, opcionalmente entre 10 pg/kg y alrededor de 10 mg/kg o entre 100 pg/kg y alrededor de 5 mg/kg.

Una cantidad terapéutica efectiva de un constructo de anticuerpo de la invención da como resultado preferiblemente una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia o duración de periodos libres de síntomas de enfermedad o una prevención de disfunción o discapacidad debida al sufrimiento de la enfermedad. Para tratar tumores que expresan antígeno de células diana, una cantidad terapéuticamente efectiva del constructo de anticuerpo de la invención, por ejemplo, un constructo de anticuerpo anti-antígeno de células diana/anti-CD3, inhibe preferiblemente el crecimiento celular o crecimiento tumoral en al menos alrededor del 20%, al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80% o al menos alrededor del 90% en relación con pacientes no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral puede evaluares un modelo de animal predictivo de la eficacia en tumores humanos.

La composición farmacéutica puede administrarse como único agente terapéutico o en combinación con terapias adicionales tales como terapias anticancerígenas según sea necesario, por ejemplo, otros fármacos proteicos y no proteicos. Estos fármacos pueden administrarse simultáneamente con la composición que comprende el constructo de anticuerpo de la invención tal como se define en el presente documento o por separado antes o después de la administración de dicho constructo de anticuerpo en intervalos y dosis definidos oportunamente.

El término “dosis efectiva y no tóxica” tal como se usa en el presente documento se refiere a una dosis tolerable de un constructo de anticuerpo inventivo que es suficientemente alta para provocar el agotamiento de células patológicas, la eliminación de tumor, la contracción de tumor o la estabilización de la enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos mayores. Tales dosis efectivas y no tóxicas pueden determinarse, por ejemplo, mediante estudios de escalado de dosis descritos en la técnica y deberían estar por debajo de la dosis que induce eventos secundarios adversos graves (toxicidad limitante de dosis, DLT).

El término “toxicidad” tal como se usa en el presente documento se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestados en eventos adversos o eventos adversos graves. Estos eventos secundarios pueden hacer referencia a una falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o una falta de tolerancia local tras la administración. La toxicidad podría incluir también los efectos teratogénicos o carcinogénicos provocados por el fármaco.

El término “seguridad”, “seguridadin vivo’’o “tolerabilidad” tal como se usa en el presente documento define la administración de un fármaco sin inducir eventos adversos graves directamente tras la administración (tolerancia local) y durante un periodo de aplicación más largo del fármaco. La “seguridad”, “seguridadin vivo”o “tolerabilidad” puede evaluarse, por ejemplo, a intervalos regulares durante el tratamiento y el periodo de seguimiento. Las mediciones incluyen la evaluación clínica, por ejemplo, manifestaciones en órganos, y el examen de anomalías de laboratorio. La evaluación clínica puede llevarse a cabo y las deviaciones con respecto a los hallazgos normales registrarse/codificarse según las normas NCI-CTC y/o MedDRA. Las manifestaciones en órganos pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardiaca, coagulación y similares, tal como se expone, por ejemplo, en the Common Terminology Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE). Los parámetros de laboratorio que pueden someterse a prueba incluyen, por ejemplo, hematología, química clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y el examen de otros fluidos corporales tales como suero, plasma, fluido linfoide o líquido cefalorraquídeo, licor y similares. Por tanto, la seguridad puede evaluarse, por ejemplo, mediante examen físico, técnicas de formación de imágenes (es decir ultrasonidos, rayos x, barridos de CT, formación de imágenes mediante resonancia magnética (MRI), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir electrocardiograma), signos vitales, midiendo parámetros de laboratorio y registrando eventos adversos. Por ejemplo, los eventos adversos en primates distintos de chimpancés en los usos y métodos según la invención pueden examinarse mediante métodos histopatológicos y/o histoquímicos.

Se hace referencia a los términos anteriores también, por ejemplo, en the Preclinical safety evaluation of biotechnologyderived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; reunión del ICH Steering Committee el 16 de julio de 1997.

Finalmente, la invención proporciona un kit que comprende un constructo de anticuerpo de la invención o producido según el proceso de la invención, un vector de la invención y/o una célula huésped de la invención.

En el contexto de la presente invención, el término “kit” significa dos o más componentes - uno de los cuales corresponde al constructo de anticuerpo, la composición farmacéutica, el vector o la célula huésped de la invención -envasados conjuntamente en un contenedor, recipiente o de otro modo. Por tanto, un kit puede describirse como un conjunto de productos y/o utensilios que son suficientes para conseguir un cierto objetivo, que pueden comercializarse como una sola unidad.

El kit puede comprender uno o más recipientes (tal como viales, ampollas, contenedores, jeringuillas, frascos, bolsas) de cualquier forma, tamaño y material apropiado (preferiblemente impermeable, por ejemplo, de plástico o vidrio) que contenga el constructo de anticuerpo o la composición farmacéutica de la presente invención en una dosificación apropiada para la administración (véase anteriormente). El kit puede contener adicionalmente instrucciones de uso (por ejemplo, en forma de un folleto o manual de instrucciones), medios para administrar el constructo de anticuerpo de la presente invención tal como una jeringuilla, bomba, infusor o similares, medios para reconstituir el constructo de anticuerpo de la invención y/o medios para diluir el constructo de anticuerpo de la invención.

La invención proporciona también kits para una unidad de administración de una sola dosis. El kit de la invención puede contener también un primer recipiente que comprende un constructo de anticuerpo secado/liofilizado y un segundo recipiente que comprende una formulación acuosa. En determinadas realizaciones de esta invención se proporcionan kits que contienen jeringuillas precargadas de una sola cámara y de múltiples cámaras (por ejemplo, jeringuillas de líquido y liojeringuillas).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1:

Perfiles de eluación para la purificación/el aislamiento con columna de intercambio catiónico de constructo de anticuerpo BiTE equipado con FcRnBP cíclico en ambos sitios de la proteína (panel A) en comparación con constructo de anticuerpo BiTE con FcRnBP lineal en el extremo n-terminal y FcRnBP cíclico en el extremo c-terminal.

Figura 2:

Análisis FACS de anticuerpos biespecíficos CDH19/CD3 en líneas celulares indicadas: 1) células CHO transfectadas de manera estable con CDH19 humana, 2) línea de células T humanas CD3 positivas humana HBP-ALL, 3) células CHO transfectadas de manera estable con CDH19 de cynomolgus, 4) línea de células T de macaco 4119 LnPx, 5) línea de células de melanoma humano CHL-1 que expresa CDH19 humana nativa, 6) células CHO no transfectadas. Controles negativos [1) a 6)]: anticuerpos de detección sin anticuerpo biespecífico CDH19/CD3 previo.

Figura 3:

Actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos CDH19/CD3 medida en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: línea de células T de macaco que expresan CD3 4119LnPx. Células diana: células CHO transfectadas con CDH19 de cynomolgus. Relación de células efectoras con respecto a diana (E:T): 10:1. La figura muestra los resultados para CDH19 2G6 302xI2C HALB, CDH19 2G6 302xI2C 156, CDH19 2G6 302xI2C LFcBY, CDH192G6302xI2C LFcBY 156, CDH192G6302xI2C D3 HALB y para un control negativo.

Figura 4:

El receptor neonatal para Fc (FcRn) se expresa mediante células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMEC).

Los lisados celulares totales de HPMEC y las células Jurkat E6.1 se separaron mediante electroforesis en gel. La inmunotransferencia de tipo Western anti-FcRn mostró una banda a alrededor de 40 kDa en el lisado de HPMEC (carril 1) que era menos pronunciada en el lisado de Jurkat E6.1 (carril 2). Como control, la inmunotransferencia de tipo Western anti-actina mostró una banda a alrededor de 42 kDa en lisados celulares totales tanto de HPMEC como de Jurkat E6.1 (carril 1 y 2) verificando que se sometían a inmunotransferencia cantidades iguales de proteína.

Figura 5:

Dibujo esquemático del sistema de dos cámaras in vitro.

Se sembraron en placa células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMEC) sobre una membrana de inserto Transwell y se hicieron crecer hasta confluencia. Antes del experimento, se confirmó la integridad de la monocapa de células endoteliales mediante medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER). A t = 0 h, se vertió (constructo de anticuerpo BiTE o dextrano) sobre la monocapa de células endoteliales dentro del inserto Transwell. El sistema de dos cámaras se incubó entonces durante 4 h a 37°C. Se cuantificó la cantidad de analito que había pasado a través de la monocapa de células endoteliales a la cámara inferior. Tras el experimento, se tiñó la monocapa de células endoteliales y se comprobó microscópicamente su integridad.

Figura 6:

Las monocapas de células endoteliales confluentes presentan una resistencia eléctrica transendotelial (TEER) aumentada y proporcionan un efecto de barrera para dextranos.

Insertos Transwell o bien se llenaron con medio de ensayo solo (blanco) o se sembraron en placa HPMEC por triplicado (n = 3).A. Tras 24-30 h de crecimiento celular, la resistencia (media ± DE) de los blancos y las monocapas de HPMEC era de 199 ± 2 Q y 249 ± 5 Q, respectivamente, dando como resultado un valor de TEER de HPMEC (media ± DE) de 16,67 ± 2,08 Q*cm2.B. Tras 48 h de crecimiento celular, se vertió FITC-dextrano 40 (2 mg/ml en medio de ensayo que contenía HSA 597 pM) a los insertos Transwell. Tras la incubación durante 4 h a 37°C, la intensidad de fluorescencia media (FI) ± DE de FITC-dextrano 40 que había pasado a través de la membrana sola (blanco) o la monocapa de HPMEC a la cámara inferior era de 4256 ± 361 y 93 ± 15, respectivamente.C. Tras el experimento, las monocapas de HPMEC se tiñeron y se comprobaron microscópicamente (aumento de 10x) para confluencia (carril inferior). Los datos se analizaron mediante software GraphPad Prism 6 para la significancia estadística usando una prueba de latno pareada (****:P<0,0001).

Figura 7:

El constructo de anticuerpo BiTE de semivida extendida CDH19-LfcBY experimenta transcitosis de manera eficiente a través de monocapas de HPMEC a concentraciones de HSA fisiológicas.

Se sembraron en placa HPMEC sobre membranas de inserto Transwell por triplicado (n = 3) para cada condición sometida a prueba. Tras 24-30 h de crecimiento celular, los valores de TEER de HPMEC oscilaban entre 12 y 17 Q*cm2 (datos no mostrados). Tras 48 h de crecimiento celular, se vertieron 100 gl del respectivo constructo de anticuerpo BiTE de semivida extendida (1 nM en medio de ensayo que contenía HSA 597 gM) sobre la monocapa de células endoteliales dentro del inserto Transwell, mientras que simultáneamente se llenaban 600 gl de medio de ensayo con HSA, pero sin constructo de anticuerpo BiTE, en la cámara inferior. Tras la incubación durante 4 h a 37°C, la cantidad de constructo de anticuerpo BiTE que había pasado a través de la monocapa de células endoteliales se cuantificó mediante ensayo de unión a ligado basado en electroquimioluminiscencia (ECL). Las concentraciones medias ± DE de anticuerpos BiTE CDH19-156 recuperados (CDH19 2G6 302 x I2C-156-H6), CDH19-HALB (CDH19 2G6 302 x I2C-HALB-DY-H6) y CDH19-LfcBY (CDH19 2G6302 x I2C-LfcBY-H6) eran de 0,424 ± 0,051 pM, 0,248 ± 0,026 pM y 0,781 ± 0,069 pM, respectivamente. Tras el experimento, las monocapas de HPMEC se tiñeron y se comprobaron microscópicamente (aumento de 10x) para confluencia (datos no mostrados). Los datos se analizaron mediante Microsoft Excel 2010 y software GraphPad Prism 6 para la significancia estadística usando ANOVA de una vía combinada con prueba posterior de Tukey (****:P<0,0001; ***:P<0,001; *:P<0,05).

Figura 8:

El constructo de anticuerpo BiTE de semivida extendida CDH19-LfcBY experimenta transcitosis de manera eficiente a través de monocapas de HPMEC en presencia de suero humano al 2%.

Se sembraron en placa HPMEC sobre membranas de inserto Transwell por triplicado (n = 3) para cada condición sometida a prueba. Tras 24-30 h de crecimiento celular, los valores de TEER de HPMEC oscilaban entre 19 y 31 Q*cm2 (datos no mostrados). Tras 48 h de crecimiento celular, se vertieron 100 gl del respectivo constructo de anticuerpo BiTE de semivida extendida (1 nM en medio de ensayo que contenía suero humano agrupado al 2%) sobre la monocapa de células endoteliales dentro del inserto Transwell, mientras que simultáneamente se llenaban 600 gl de medio de ensayo con suero humano agrupado al 2%, pero sin constructo de anticuerpo BiTE, en la cámara inferior. Tras la incubación durante 4 h a 37°C, la cantidad de constructo de anticuerpo BiTE que había pasado a través de la monocapa de células endoteliales se cuantificó mediante ensayo de unión a ligando basado en electroquimioluminiscencia (ECL). Las concentraciones medias ± DE de anticuerpos BiTE CDH19-156 recuperados (CDH192G6302 x I2C-156-H6), CDH19-HALB (CDH19 2G6 302 x I2C-HALB-DY-H6) y CDH19-LfcBY (CDH19 2G6 302 x I2C-LfcBY-H6) era de 0,849 ± 0,130 pM, 0,658 ± 0,047 pM y 1,751 ± 0,212 pM, respectivamente. Tras el experimento, las monocapas de HPMEC se tiñeron y se comprobaron microscópicamente (aumento de 10x) para confluencia (datos no mostrados). Los datos se analizaron mediante Microsoft Excel 2010 y software GraphPad Prism 6 para la significancia estadística usando ANOVA de una vía combinada con prueba posterior de Tukey (***:P<0,001; ns:P> 0,05).

Figura 9:

El constructo de anticuerpo BiTE de semivida extendida CDH19-LfcBY experimenta transcitosis de manera eficiente a través de monocapas de HPMEC en presencia de suero humano al 20%.

Se sembraron en placa HPMEC sobre membranas de inserto Transwell por triplicado (n = 3) para cada condición sometida a prueba. Tras 24-30 h de crecimiento celular, los valores de TEER de HPMEC oscilaban entre 19 y 31 D*cm2 (datos no mostrados). Tras 48 h de crecimiento celular, se vertieron 100 gl del respectivo constructo de anticuerpo BiTE de semivida extendida (1 nM en medio de ensayo que contenía suero humano agrupado al 20%) sobre la monocapa de células endoteliales dentro del inserto Transwell, mientras que simultáneamente se llenaban 600 gl de medio de ensayo con suero humano agrupado al 20%, pero sin constructo de anticuerpo BiTE, en la cámara inferior. T ras la incubación durante 4 h a 37°C, la cantidad de constructo de anticuerpo BiTE que había pasado a través de la monocapa de células endoteliales se cuantificó mediante ensayo de unión a ligando basado en electroquimioluminiscencia (ECL). Las concentraciones medias ± DE de anticuerpos BiTE CDH19-156 recuperados (CDH192G6302 x I2C-156-H6), CDH19-HALB (CDH19 2G6 302 x I2C-HALB-DY-H6) y CDH19-LfcBY (CDH19 2G6 302 x I2C-LfcBY-H6) eran de 0,758 ± 0,027 pM, 0,761 ± 0,027 pM y 1,976 ± 0,355 pM, respectivamente. Tras el experimento, las monocapas de HPMEC se tiñeron y se comprobaron microscópicamente (aumento de 10x) para confluencia (datos no mostrados). Los datos se analizaron mediante Microsoft Excel 2010 y software GraphPad Prism 6 para la significancia estadística usando ANOVA de una vía combinada con prueba posterior de Tukey (***:P<0,001; ns:P> 0,05).

Figura 10:

Farmacocinética de constructos de anticuerpo BiTE

Cuatro moléculas denominadas 1) 2G6-156; 2) 2G6-LFcBy; 3) 2G6-LFcBy-156; 4) 2G6-D3HSA se sometieron a prueba en el mono cynomolgus en el contexto de un estudio farmacocinético (PK). La figura muestra los resultados en relación con el ejemplo 5.

Figura 11:

La transcitosis eficiente de BiTE-LfcBY de semivida extendida es independiente de la diana

A)Se sembraron en placa HPMEC sobre membranas de inserto Transwell. Tras 24 h de crecimiento celular, los valores de TEER de HPMEC oscilaban entre 13 y 23 D*cm2. Tras 48 h de crecimiento celular, se sembraron en placa 100 gl del respectivo constructo de anticuerpo BiTE de semivida extendida (1 nM en medio de ensayo que contenía suero humano agrupado al 20%) sobre la monocapa de células endoteliales dentro del inserto Transwell (n = 4 hasta n=10). Se pusieron 600 gl de medio de ensayo con suero humano agrupado al 20% sin constructo de anticuerpo BiTE en la cámara inferior. Tras la incubación durante 4 h a 37°C, la cantidad de constructo de anticuerpo BiTE que había pasado a través de la monocapa de células endoteliales se cuantificó mediante ensayo de unión a ligando basado en electroquimioluminiscencia (ECL). Los constructos de anticuerpo BiTE que contenían etiqueta -LfcBY se normalizaron con respecto a su respectivo homólogo BiTE-156 y los diagramas de barras representan el cambio en veces ± DE de anticuerpos BiTE-LfcBY recuperados. CD33-LfcBY experimentó transcitosis 2,9±0,7 veces más eficientemente que CD33-156. CHD19-LfcBY experimentó transcitosis 3,1±0,4 veces más eficientemente que CDH19-156. Un constructo BiTE de cadherina-LfcBY experimentó transcitosis 2,4±0,5 veces más eficientemente que un BiTE de cadherina-156. Los datos se analizaron mediante Microsoft Excel 2010 y software GraphPad Prism 6 para la significancia estadística mediante la prueba de la t no pareada (****: P < 0,0001). B) El diagrama de barras representa valores medios de transcitosis de BiTE-LfcBY a través de tres dianas independientes normalizados con respecto a su homólogo de BiTE-156. Los constructos de BiTE-LfcBY experimentaron transcitosis 2,8±0,3 veces más eficientemente que los constructos de BiTE-156 (***: P < 0,001).

Figura 12:

Diferentes permutaciones de BiTE-LfcBY de semivida extendida experimentan transcitosis eficientementeSe sembraron en placa HPMEC sobre membranas de inserto Transwell. Tras 24 h de crecimiento celular, los valores de TEER de HPMEC oscilaban entre 13 y 23 D*cm2. Tras 48 h de crecimiento celular, se sembraron en placa 100 pl del respectivo constructo de anticuerpo BiTE de semivida extendida (1 nM en medio de ensayo que contenía suero humano agrupado al 20%) sobre la monocapa de células endoteliales dentro del inserto Transwell (n = 4 hasta n=10). Se pusieron 600 pl de medio de ensayo con suero humano agrupado al 20% sin constructo de anticuerpo BiTE en la cámara inferior. Tras la incubación durante 4 h a 37°C, la cantidad de constructo de anticuerpo BiTE que había pasado a través de la monocapa de células endoteliales se cuantificó mediante ensayo de unión a ligando basado en electroquimioluminiscencia (ECL). Los constructos de anticuerpo BiTE que contenían permutaciones -LfcBY se normalizaron con respecto a su respectivo homólogo de BiTE-156 y los diagramas de barras representan el cambio en veces DE de anticuerpos con permutación BiTE-LfcBY recuperados. En comparación con CH19-156, CH19-LH-FcB-CH experimentó transcitosis 1,8+0,4, CH19-LH-FcB-LH 2,0+0,1, CH19-CH-FcB-LH 2,8+0,4, CH19-LY-FcB-LH 2,9+0,6, CH19-CH-FcB-LY 2,6+0,4 y CH19-LY-FcB-CH 3,1+0,4 veces más eficientemente. Los datos se analizaron mediante Microsoft Excel 2010 y software GraphPad Prism 6 usando ANOVA DE UNA VÍA y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (****: P < 0,0001; ***: P < 0,001; **: P < 0,01).

Figura 13:

Diferentes permutaciones de BiTE-LfcBY de semivida extendida experimentan transcitosis eficientemente

Se sembraron en placa HPMEC sobre membranas de inserto Transwell. Tras 24 h de crecimiento celular, los valores de TEER de HPMEC oscilaban entre 13 y 23 D*cm2. Tras 48 h de crecimiento celular, se sembraron en placa 100 pl del respectivo constructo de anticuerpo BiTE de anticuerpo BiTE de semivida extendida (1 nM en medio de ensayo que contenía suero humano agrupado al 20%) sobre la monocapa de células endoteliales dentro del inserto Transwell (n = 4 hasta n=10). Se pusieron 600 pl de medio de ensayo con suero humano agrupado al 20% sin constructo de anticuerpo BiTE de anticuerpo BiTE en la cámara inferior. Tras la incubación durante 4 h a 37°C, la cantidad de constructo de anticuerpo BiTE de anticuerpo BiTE que había pasado a través de la monocapa de células endoteliales se cuantificó mediante ensayo de unión a ligando basado en electroquimioluminiscencia (ECL). Los constructos de anticuerpo BiTE que contenían permutaciones -LfcBY se normalizaron con respecto a su respectivo homólogo de BiTE-156 y los diagramas de barras representan el cambio en veces DE de anticuerpos con permutación BiTE-LfcBY recuperados. En comparación con Cad-156, Cad-LH-FcB-CH experimentó transcitosis 3,1+0,4, Cad-LH-FcB-LH 3,2+1 Cad-CH-FcB-LH 2,9+0,4, Cad-LY-FcB-LH 1,8+0,1, Cad-CH-FcB-LY 2,4+0,2 y Cad-LY-FcB-CH 2,4+0,5 veces más eficientemente. Los datos se analizaron mediante Microsoft Excel 2010 y software GraphPad Prism 6 usando ANOVA DE UNA VÍA y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (****: P < 0,0001; *: P < 0,05).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el propósito de ilustrar realizaciones o características específicas de la presente invención. Estos ejemplos no deben interpretarse como que limitan el alcance de esta invención. Los ejemplos se incluyen con fines de ilustración y la presente invención está limitada solo por las reivindicaciones.

Ejemplo 1:

1 Producción y purificación de constructos de anticuerpo de cadena sencilla biespecíficos

Se realizó la producción a escala de investigación estandarizada de constructos de anticuerpo CDH19 BiTE en frascos rotativos. El sobrenadante de cultivo recogido se sometió tras la filtración a una purificación de constructo de anticuerpo BiTE de dos etapas basada en captura por cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) y posterior cromatografía por exclusión de tamaño (SEC).

1.1 Etapa de captura por IMAC de constructos de anticuerpo BiTE

Se usaron sistemas exploradores Ákta® (GE Healthcare) controlados mediante software Unicorn® para la cromatografía. La cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) se realizó usando Fractogel EMD chelate® (Merck, Darmstadt) que se cargó con ZnCl2 según el protocolo proporcionado por el fabricante. La columna se equilibró con tampón A (tampón fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, imidazol 10 mM, pH 7,2) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (1000 ml) a la columna (10 ml de volumen de empaquetamiento) a una tasa de flujo de 4 ml/min. La columna se lavó con tampón A para eliminar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente de dos etapas de tampón B (tampón fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M, 0,5 M imidazol, pH 7,2) según el siguiente procedimiento:

Etapa 1: tampón B al 10% en 5 volúmenes de columna

Etapa 2: tampón B al 100% en 5 volúmenes de columna

Las fracciones de proteína eluidas de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional y se concentraron hasta 3 ml de volumen final usando unidades de centrifugación Vivaspin (Sartorius-Stedim, Gottingen-Alemania) con membrana de polietersulfona PES y un límite de peso molecular de 10 kDa. Todos los productos químicos eran de calidad para investigación y se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania).

1.2 Cromatografía por exclusión de tamaño SEC

Se realizó cromatografía por exclusión de tamaño en una columna de calidad preparativa HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con tampón SEC (NaCl 20 mM, NaH2PO430 mM, L-arginina 100 mM, pH 7,0) a una tasa de flujo de 1 ml/min. Se agruparon las fracciones de monómero y dímero de constructo de anticuerpo BiTE y se añadió una disolución de reserva de trehalosa al 24% hasta alcanzar una concentración de trehalosa final del 4%.

Las agrupaciones de proteína se midieron a 280 nm en cubetas de policarbonato con una trayectoria de luz de 1 cm (Eppendorf, Hamburgo-Alemania) y la concentración de proteína se calculó en base al factor calculada mediante software de análisis de secuencias Vector NTI para cada proteína.

Las agrupaciones de monómero BiTE se ajustaron a 250 pg/ml con tampón de formulación BiTE adicional (NaCl 20 mM, NaH2PO430 mM, L-arginina 100 mM, trehalosa al 4%, pH 7,0).

1.3 Comparación del rendimiento de monómero FcRn BiTE a partir de la producción a escala de investigaciónComo resulta evidente a partir de la tabla 1, el rendimiento de monómero BiTE para el péptido de unión a FcRn cíclico FcRnBP en ambos lados (n- y c-terminal, véase SEQ ID NO:145) del constructo de anticuerpo BiTE mostró una tasa de producción más de tres veces menor en comparación con el BiTE equipado con el FcRnBP lineal en el extremo nterminal y FcRnBP cíclico en el extremo c-terminal de la proteína BiTE (s Eq ID NO: 132).

Tabla 1: Rendimiento de monómero BiTE

CH19 2G6302 x Cíclico Cíclico 1963

I2C x FcBY

CH19 2G6302 x Lineal Cíclico 6386

I2C -LFcBY

Mucho menos rendimiento de monómero de BiTE de la versión BiTE equipada con FcRnBP cíclico en ambos lados en comparación con la versión BiTE con FcRnBP lineal en el extremo n-terminal y FcRnBP cíclico en el extremo cterminal

1.4 Recuperación de monómero FcRn BiTE de columna de intercambio catiónico

Se conectó una columna BioPro SP de 1 ml fabricada por YMC (YMC Europe GmbH, Dinslaken-Alemania) con grupos sulfopropilo acoplados a perlas sólidas a un dispositivo Ákta Micro FPLC (GE Healthcare).

Para el equilibrado de la columna, la dilución de muestras y el lavado se usó un tampón que consistía en dihidrogenofosfato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 30 mM ajustado con hidróxido de sodio a pH de 5,5.

Para la elución se usó un tampón que consistía en NaH2PO420 mM y NaCl 1000 mM ajustado con hidróxido de sodio a un pH de 5,5.

Se diluyeron 50 pg de monómero de constructo de anticuerpo BiTE con tampón de dilución hasta un volumen final de 50 ml.

Tras el equilibrado de la columna, se aplicaron 40 ml de la disolución de proteína diluida a la columna seguido de una etapa de lavado usando tampón de equilibrado de columna.

La elución se llevó a cabo mediante un gradiente creciente de manera constante con tampón de elución de cero al 100% sobre un volumen total que correspondía a 200 volúmenes de columna. Toda la ejecución se monitorizó a 280 nm de absorción óptica.

A diferencia del constructo de anticuerpo BiTE equipado con FcRnBP cíclico en ambos lados de la proteína BiTE, el constructo de anticuerpo BiTE equipado con un FcRnBP lineal en el lado n-terminal y FcRnBP cíclico en el lado cterminal del BiTE mostró elución de la columna de intercambio catiónico. Este comportamiento indica un comportamiento de purificación y un rendimiento de producto muy preferibles en una producción a escala aumentada de un constructo de anticuerpo BiTE Figura 1

Ejemplo 2:

Unión biespecífica y reactividad cruzada entre especies:

Para la confirmación de la unión a CDH19 humana y de cyno y a CD3 humano y de macaco, anticuerpos biespecíficos se sometieron a prueba mediante citometría de flujo usando las líneas celulares indicadas. Células CHO transfectadas con CDH19 humana, con CDH19 de cyno, la línea celular de melanoma humano CHL-1 que expresa CDH19 humana nativa, la línea celular de leucemia de células T humanas que expresan CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) y la línea de células T de macaco que expresan C<d>34119LnPx (Knappe A,et al.,Blood, 2000, 95, 3256 3261) se usaron como líneas celulares positivas para antígeno. Además, se usaron células CHO no transfectadas como control negativo.

Para la citometría de flujo se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 pl de anticuerpo biespecífico purificado a una concentración de 5 pg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS/FCS al 10% y la unión de los constructos se detectó con un anticuerpo anti-His murina (AbD Serotec; diluido 1: 1000 en 50 pl de PBS/FCS al 10%). Tras el lavado, los anticuerpos anti-His unidos se detectaron con un anticuerpo específico para gamma de Fc (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS/FCS al10%. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).

Los anticuerpos biespecíficos CDH19/CD3 tiñeron las células CHO transfectadas con CDH19 humana, CDH19 de cyno, las líneas celulares de melanoma que expresan CDH19 humana CHL-1 así como células T humanas y de macaco. Además, no había tinción de células CHO no transfectadas (véase la Figura 2).

Ejemplo 3:

Actividad citotóxica

Marcado de células diana

Para el análisis de lisis celular en ensayos de citometría de flujo, se usó el colorante de membrana fluorescente DiOC<18>(DiO) (Molecular Probes, n ° V22886) para marcar células CHO CDH19 positivas de cynomolgus como células diana y distinguirlas de las células efectoras. Resumiendo, las células se recogieron, se lavaron una vez con PBS y se ajustaron a 106 células/ml en PBS que contenía FBS al 2% (v/v) y el colorante de membrana DiO (5 pl/106 células). Tras la incubación durante 3 min a 37°C, las células se lavaron dos veces en medio RPMI completo y el número de células se ajustó a 1,25 x 105 células/ml. La vitalidad de las células se determinó usando disolución EosinG isotónica al 0,5% (v/v) (Roth, n.° 45380).

Análisis basado en citometría de flujo

Este ensayo se diseñó para cuantificar la lisis de células CHO transfectadas con CDH19 de cynomolgus en presencia de diluciones en serie de anticuerpos biespecíficos CDH19.

Se mezclaron volúmenes iguales de células diana y células efectoras marcadas con DiO (es decir línea de células T de macaco que expresan CD34119LnPx), dando como resultado una relación de células E:T de 10:1. Se transfirieron 160 pl de esta suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 40 pl de diluciones en serie de los anticuerpos biespecíficos CDH19 y un control negativo biespecífico (un anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno diana irrelevante) o medio RPMI completo como control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por anticuerpo biespecífico avanzó durante 48 horas en un incubador humidificado con CO<2>al 7%. Entonces se transfirieron las células a una nueva placa de 96 pocillos y se monitorizó la pérdida de integridad de la membrana celular diana añadiendo yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 pg/ml. PI es un colorante impermeable a la membrana que normalmente se excluye de células viables, mientras que las células muertas lo absorben y se vuelven identificables mediante emisión fluorescente.

Las muestras se midieron mediante citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).

Las células diana se identificaron como células DiO-positivas. Las células diana PI-negativas se clasificaron como células diana vivas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó según la siguiente fórmula:

n = número de eventos

Usando software GraphPad Prism 6 (Graph Pad Software, San Diego), el porcentaje de citotoxicidad se representó gráficamente frente a las concentraciones de anticuerpo biespecífico correspondientes. Las curvas de dosis-respuesta se analizaron con los cuatro modelos de regresión logística paramétrica para la evaluación de curvas de dosisrespuesta sigmoideas con inclinación de pendiente fija y se calcularon los valores de EC<50>.

Los resultados de citotoxicidad usando el sistema descrito anteriormente para CDH19 2G6 302xI2C HALB, CDH19 2G6 302xI2C 156, CDH19 2G6302xI2C LFcBY, CDH192G6 302xI2C LFcBY 156, CDH19 2G6302xI2C D3 HALB y para un control negativo se muestran en la figura 3

Ejemplo 4:

Sistema de dos cámaras in vitro para imitar la transcitosis de anticuerpos BiTE de semivida extendida a través de una capa de células endoteliales humanas

Cultivo y recogida de células endoteliales

Se usaron células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMEC) (PromoCell, n ° C-12281) como modelo de células endoteliales. HPMEC criopreservadas en el pase 2 (> 5x105 células/vial) se cultivaron en medio basal MV2 (PromoCell, n ° C-22221) suplementado con suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS, 1:100) (ScienCell, n ° 1052), suero humano agrupado al 5-7,5% (AMGEN, lote interno: 140625DrM01) y albúmina humana 5-10 mg/ml (HSA) (Behring, n ° C66444411 B) (denominado adicionalmente medio de crecimiento) en matraces de cultivo celular (Sarstedt, n.° 831,810,302) a 37°C y CO<2>al 5% en un Heraeus Cytoperm 2 (Thermo Scientific). El subcultivo de HPMEC se realizó con el kit Detach (PromoCell, n ° C-41200) que consistía en solución salina equilibrada tamponada con HEPES (PromoCell, nT C-40000), disolución de tripsina-EDTA (0,04%/0,03%) (PromoCell, n ° C-41000) y disolución de neutralización de tripsina (TNS) (PromoCell, n ° C-41100). Resumiendo, el medio se aspiró de la capa de HPMEC y las células se lavaron con 3 ml de solución salina equilibrada tamponada con HEPES. La adición de 3 ml de disolución de tripsina-EDTA diluida 1:1 con PBS durante 1-3 min a temperatura ambiente condujo al desacoplamiento de HPMEC del fondo del matraz. La inactivación de la disolución de tripsina-EDTA se realizó mediante la adición de 3 ml de TNS a la suspensión celular. Las células se centrifugaron a 300 g durante 3 min en un Heraeus Megafuge 40 (Thermo Scientific) y se sembraron a una densidad celular de ~10.000 células/cm2 en matraces de cultivo celular (Sarstedt, n ° 831.810.302, n ° 833.911.302).

Detección de receptor neonatal para Fc (FcRn) en HPMEC mediante inmunotransferencia de tipo Western

Se desacoplaron HPMEC (PromoCell, nT C-12282, lote: 1071302.1, P7) con EDTA (Biochrom, n ° L2113) y se lavaron con PBS (Biochrom, n ° L1820). Se recogieron las células Jurkat E6.1 (ECCC, n ° 88042803) y se lavaron con PBS. Se lisaron 3x106 células en cada caso en 100 pl de tampón de lisis (base Trizma 20 mM (Sigma Aldrich, n ° T1503) pH = 8, NaCl 137 mM (Sigma-Aldrich, nT S6546-1L), glicerol al 10% (Sigma-Aldrich, nT G5516), EDTA 2 mM (Sigma-Aldrich, nT 03620), Triton X100 al 1% (Sigma-Aldrich, nT X100), 1x cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich, nT 13911-1BO), NaF 100 mM (Sigma-Aldrich, nT 919), Na3VO4500 pM (Sigma-Aldrich, nT S6508)) durante 15 min en hielo. Las partes no solubles de los lisados celulares totales se sedimentaron mediante centrifugación a 13.200 g durante 15 min a 4°C (Sigma Laborzentrifugen, nT 1K15) y los sobrenadantes se transfirieron a tubos de reacción Eppendorf de 1,5 ml nuevos. Se diluyeron 7,5 pl de lisados con 2 pl de tampón de muestra NuPAGE LDS (life technologies, n° NP0007) y se desnaturalizaron durante 10 min a 70°C. Se cargaron 9,5 pl de los lisados y 10 pl de estándar de proteína teñido previamente (life technologies, n ° LC5800) en un gel de BisTris al 4-12% (life technologies, nT NP0336BOX) y se realizó la separación de proteínas en tampón de ejecución 1x NuPAGE MES (life technologies, nT NP0002-02) aplicando 200 V durante 35 min. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (PALL BioTrace NT, n ° 66485) según las instrucciones del módulo XCell II (life technologies). La membrana se bloqueó usando disolución de bloqueo (Thermo Scientific, nT 37542) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. La membrana se incubó durante la noche a 4°C en una disolución de anticuerpo anti-FcRn (Novus Biologicals, n ° NBP1 -89128, diluida 1:100 en tampón de bloqueo, suplementada con Tween-20 al 0,05% (Sigma-Aldrich, n ° P1379)) con agitación. La membrana se lavó 3 veces durante 5 min a temperatura ambiente con PBS-Tween (Biochrom, n ° L1820 con Tween-20 al 0,05% (Sigma-Aldrich, nT P1379)). La membrana se incubó durante 1 h a temperatura ambiente en disolución de anticuerpo secundario marcado con HRP (anticuerpo HRP anti-IgG de conejo (Thermo Scientific, nT 31460), diluida 1:5000 en PBS-Tween y leche al 3-5% (Fluka, n ° 70166)) con agitación. La membrana se lavó 2 veces durante 5 min a temperatura ambiente con PBS-Tween y 1 vez durante 5 min con PBS. La membrana se incubó en sustrato SuperSignalWest Pico (Thermo Scientific, n ° 1856135) según las instrucciones del fabricante. Se expuso una película sensible a la luz (película CL-XPosureTM, Thermo Scientific, n ° 34088) a la membrana y se reveló en el revelador (VELPEX, EXTRA-X). Posteriormente, la membrana se incubó durante la noche a 4°C en anticuerpo antibeta-actina (Thermo Scientific, nT MA1-91399, diluido 1:1000 en tampón de bloqueo, suplementado con Tween-20 al 0,05% (Sigma-Aldrich, n ° P1379)). La membrana se lavó 3 veces durante 5 min a temperatura ambiente con PBS-Tween. La membrana se incubó durante 1 h a temperatura ambiente en anticuerpo anti-IgG de ratón secundario marcado con HRP (Jackson ImmunoResearch, nT 415-035-100, diluido 1:5000 en PBS-Tween y leche al 3-5%) con agitación. La membrana se reveló tal como se describe en detalle anteriormente.

Sistema de dos cámaras in vitro

Sembrado en placa de HPMEC

Insertos Transwell-Clear de membrana de poliéster (PET) (Corning, n.° 3470) con un tamaño de poro de 0,4 gm y un área superficial de crecimiento efectiva de 0,33 cm2 se recubrieron con 10 gg/cm2 de fibronectina (Sigma, mo F2006) en PBS durante 6 h a temperatura ambiente. La disolución de fibronectina restante se aspiró y los insertos se lavaron una vez con PBS. Se añadieron 600 gl de medio de crecimiento a la cámara externa del sistema Transwell de 24 pocillos (Corning, n ° 3470) y las placas se equilibraron a 37°C durante 30 min. Las HPMEC se recogieron usando el kit Detach (PromoCell, mo C-41200) tal como se describió anteriormente. Las células se sembraron en placa en 200 gl de medio de crecimiento precalentado a una densidad de 8x104/cm2 sobre insertos Transwell recubiertos con fibronectina equilibrados. Se llenaron 4 pocillos con medio de crecimiento solo y se usaron como valores de blanco. Tras 24 h, se añadieron 100 gl medio de crecimiento tanto al pocillo interno como a la cámara externa del sistema Transwell. La confluencia de capa celulares se determinó mediante medición de resistencia eléctrica transendotelial (TEER).

Medición de resistencia eléctrica transendotelial (TEER) de una monocapa de células endoteliales

Se midió la resistencia eléctrica de cada monocapa de células endoteliales usando el sistema Millicell ERS-2 (Millipore, mo MERS00002) con un electrodo ajustable STX03 (Millipore, mo MERSSTX03) según las instrucciones del fabricante. Resumiendo, la funcionalidad del Millicell ERS-2 se sometió a prueba conectado el electro de prueba STX04 al orificio de entrada y encendiendo la corriente; el conmutador de MODO se fijó a Ohm y, si es necesario, se ajustó la presentación visual a 1000 Q con un destornillador en el tornillo “R Adj”. El electrodo ajustable STX03 se esterilizó sumergiendo el electrodo en etanol al 80% durante 5 min. Para la medición de resistencia eléctrica, el electrodo STX03 se conectó al ERS-2 por medio del orificio de entrada, el conmutador de MODO se fijó a Ohm y se encendió el conmutador de corriente. Las puntas del electrodo se sumergieron en el inserto Transwell en un ángulo de 90 grados; la punta más corta dentro del inserto Transwell sin tocar la monocapa de células endoteliales; la punta más larga fuera del inserto Transwell y justo tocando el fondo bottom del pocillo externo (Corning, n ° 3470). Se midieron insertos Transwell de blanco sin células pero que contenían el mismo medio para determinar la resistencia ide fondo. Antes de la medición de resistencia eléctrica, se permitió que las placas se enfriasen hasta temperatura ambiente; cuando todos los pocillos se habían medido una vez, se inició la medición de nuevo desde el principio y se promediaron los valores ((Qmedición<1>+ Qmedición2)/2 = Qmuestra). La resistencia real de una monocapa de células individual se calculó posteriormente restando la resistencia media de los insertos Transwell de blanco (Resistencia Q = Qmuestra - Qblanco). Para la determinación de la resistencia de área unitaria (TEER), se tuvo en cuenta el área de membrana efectiva (0,33 cm2) del sistema Transwell de 24 pocillos (Corning, mo 3470) (TEER = Resistencia Q * Área de membrana efectiva). Las monocapas de células HPMEC caracterizadas mediante un valor de TEER mayor de 10 Q*cm2 se consideraron confluentes.

Permeabilidad a FITC-dextrano de una monocapa de células endoteliales

Tras 48 h de crecimiento celular, los insertos Transwell que contenían una monocapa de HPMEC confluente se transfirieron a una placa de lavado de 24 pocillos (FALCON, mo 353047), con cada pocillo precargado con 700 gl de medio basal MV precalentado (PromoCell, mo C-22220) con el fin de lavar el exterior de los insertos Transwell. Se llenaron 600 gl de medio de ensayo (medio libre de rojo de fenol MV2 (PromoCell, n ° C-22226), ECGS (1:100) (ScienCell, n ° 1052) y HSA 597 gM (Behring, n ° C66444411 B)) en placas receptoras bloqueadas (700 gl/pocillo de una dilución 1:1 de tampón de bloqueo de partida (TBS) (Thermo Scientific, mo 37542) en PBS/FBS al 10%durante la noche a 37°C) (placas de 24 pocillos con superficie de acoplamiento ultrabaja (Corning, mo 3473)). Los insertos Transwell que contenían una monocapa de HPMEC confluente se transfirieron de la placa de lavado a una placa receptora precalentada. Al mismo tiempo, el medio de crecimiento se retiró del pocillo interno y la monocapa de células se lavó una vez con 100 gl de FITC-dextrano 40 (2 mg/ml en medio de ensayo) (Sigma, n ° FD40). Entonces, se pusieron 100 gl de FITC-dextrano 40 (2 mg/ml en medio de ensayo) sobre la monocapa de HPMEC y el ensayo de dos cámaras se incubó durante 4 h a 37°C y CO<2>al 5%. La fluorescencia de FITC-dextrano 40 recuperada del pocillo externo del sistema de dos cámaras se cuantificó mediante medición a la longitud de onda de excitación de 485 nm y la longitud de onda de emisión de 535 nm usando un SPECTRAFluor Plus (número de serie: 94493; Firmware: V 6.00 06_07_2003 Spectra; versión de XFLUOR4: V 4.40). Para el ensayo de dos cámaras, todas las placas se manejaron sobre una placa de calentamiento (minitube, mo 12055/0010) a 37°C.

Tinción de una monocapa de células endoteliales

T ras el ensayo de dos cámaras, las monocapas de células se lavaron una vez con medio de ensayo sin FITC-dextrano 40. Entonces, se pusieron 100 gl medio de ensayo sobre las monocapas de células y se añadieron 100 gl de paraformaldehído (PFA) (al 4% en PBS). Las monocapas de células se fijaron durante 1 h a 37°C o durante la noche a temperatura ambiente a una concentración de PFA final del 2%. La disolución de PFA se retiró y las monocapas de células se tiñeron con 100 gl de disolución de tinción celular (disolución Crystal Violet (Sigma-Aldrich, mo HT90132-1L), 1:20 en PFA al 4% en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las monocapas de células se lavaron dos veces con 200 gl de ddH<2>O. Se tomaron imágenes de las monocapas de HPMEC usando un microscopio Nikon Eclipse E800 equipado con un objetivo 10x.

Transcitosis de anticuerpos BiTE de semivida extendida a través de una monocapa de células endotelialesEl ensayo de dos cámaras se realizó con diversos anticuerpos BiTE de semivida extendida tal como se describió en detalle anteriormente para la permeabilidad a FITC-dextrano 40. El medio de ensayo consistía en medio libre de rojo fenol MV2 (PromoCell, n.° C-22226), ECGS (1:100) (ScienCell, n o 1052) y HSA (Behring, n.° C66444411B) o suero humano agrupado (inactivado durante 30 min a 56°C, AMGEN) tal como se indica. Se realizaron diluciones de anticuerpos BiTE en el medio de ensayo descrito anteriormente en tubos de baja unión de proteína (Sarstedt, n° 72.706.600). Se usó un medio de ensayo idéntico para diluciones de BiTE (es decir, en el inserto Transwell superior) y en la cámara inferior del sistema de dos cámaras. Las placas se manejaron sobre una placa de calentamiento (minitube, n ° 12055/0010) a 37°C. Se sometieron a ensayo diferentes anticuerpos BiTE de semivida extendida en desplazamientos de tiempo de 45 min para minimizar la adherencia no específica dependiente del tiempo a las superficies de las placas. Los anticuerpos BiTE recuperados del pocillo inferior del sistema de dos cámaras se cuantificaron tal como se describe en detalle más adelante.

Cuantificación de anticuerpos BiTE de semivida extendida

La cuantificación de anticuerpos BiTE de experimentos de transcitosis se realizó usando un ensayo de unión a ligando basado en electroquimioluminiscencia (ECL) altamente sensible.

Se prepararon muestras de calibrador para construir la curva de referencia estándar añadiendo de manera conocida concentraciones conocidas de los diferentes anticuerpos BiTE a la respectiva matriz de prueba (medio de ensayo) seguido de 10 etapas de dilución (diluciones 1:2, dando como resultado un total de 11 muestras de calibrador que abarcan un intervalo de concentración de 0,0048 a 5,0 ng/ml). La formulación de las muestras de calibrador se hizo coincidir con la respectiva formulación de las muestras desconocidas. Para cada constructo de anticuerpo BiTE, se usó el mismo material (constructo y lote) tanto para preparar muestras de calibrador como para ensayos de transcitosis. La respectiva matriz de prueba de las muestras desconocidas se ajustó a cantidades iguales de HSA (597 pM (Behring, mo C66444411 B)/Tween-80 (0,05% (J.T. Baker, mo 4117-04) o suero humano agrupado (20%, inactivado durante 30 min a 56°C, AMGEN) antes de la cuantificación.

En una primera etapa, se inmovilizó anticuerpo de captura 3E5A5 (específico para la parte de unión anti-CD3 de anticuerpos BiTE, AMGEN) en una placa de microtitulación de carbono equipada con dos electrodos (placa estándar, MSD, mo L15XA). Con este fin, las placas se recubrieron con 25 pl/pocillo de una disolución de anticuerpo 1 kg/ml durante la noche a 5 ± 3°C y entonces se bloquearon con 150 pl/pocillo de una disolución de BSA al 5% durante al menos 1 h.

Las muestras se prepararon tal como se describió anteriormente. Se añadieron 25 pl de cada muestra de calibrador o desconocida a pocillos individuales y se incubaron durante 1 h a 25 ± 2°C en un agitador. Las placas se lavaron entonces 3 veces con PBS-Tween (Tween-80 al 0,05%) usando un lavador de placas automatizado. El constructo de anticuerpo BiTE unido al anticuerpo de captura se detectó por medio de anticuerpo anti-Penta-His biotinilada (Qiagen, n o<3 4440>; 1 pg/ml, 25 pl/pocillo, 30 min a 25 ± 2°C en un agitador) seguido de estreptavidina-SulfoTag (MSD, n.o R32AD-1; 1 pg/ml, 25 pl/pocillo, 30 min a 25 ± 2°C en un agitador) sin lavar entre incubaciones. Las placas se lavaron 3 veces con PBS-Tween (Tween-80 al 0,05%) tras la segunda incubación usando un lavador de placas automatizado. Posteriormente, se añadieron 150 pl/pocillo de tampón de lectura 1x MSD (MSD, n ° R92TC-1) y las placas se midieron usando un dispositivo Sektor Imager 2400 (MSD).

Las señales de ECL de muestras de calibrador de curva de referencia estándar se representaron gráficamente frente a las concentraciones de constructo de anticuerpo BiTE conocidas y se ajustaron mediante un ajuste 5-PL (ponderación 1/y2; software: SoftMaxPro GxP 5.4). Las concentraciones de muestras desconocidas se retrocalcularon a partir de esta curva de regresión. Todas las muestras desconocidas se analizaron por triplicado notificándose las respectivas medias. Se calcularon las concentraciones molares a partir de estos resultados.

Tras el ensayo de dos cámaras, las monocapas de células endoteliales se tiñeron tal como se describió en detalle anteriormente y se comprobó su integridad mediante microscopía óptica.

La detección de constructos de anticuerpo CDH19- y CD33-BiTE se realizó tal como se describió anteriormente. La detección de cadherina-BiTE se realizó tal como sigue. En una primera etapa, se inmovilizó una forma soluble recombinante del antígeno diana BiTE (AMGEN) en una placa de microtitulación de carbono equipada con dos electrodos (placa estándar, MSD, n ° L15XA). Con este fin, las placas se recubrieron con 25 pl/pocillo de una disolución de anticuerpo 1 pg/ml durante la noche a 5 ± 3°C y entonces se bloquearon con 150 pl/pocillo de una disolución de BSA al 5% durante al menos 1 h.

Las muestras se prepararon tal como se describió anteriormente. Se añadieron 25 pl de cada muestra de calibrador o desconocida a pocillos individuales y se incubaron durante 1 h a 25 ± 2°C en un agitador. Las placas se lavaron entonces 3 veces con PBS-Tween (Tween-80 al 0,05%) usando un lavador de placas automatizado. El constructo de anticuerpo BiTE unido al antígeno diana se detectó por medio de anticuerpo conjugado con SulfoTag, específico para la parte de unión anti-CD3 de anticuerpos BiTE (3E5.E1-Rut, AMGEN). El anticuerpo se diluyó hasta una concentración final de 1 pg/ml. Se añadieron 25 pL per pocilio y se incubaron durante 30 min a 25 ± 2°C en un agitador.

Ejemplo 5

Farmacocinética de constructos de anticuerpo BiTE

Cuatro moléculas denominadas 1) 2G6-156; 2) 2G6-LFcBy; 3) 2G6-LFcBy-156; 4) 2G6-D3HSA se sometieron a prueba en el mono cynomolgus en el contexto de un estudio farmacocinético (PK). En este estudio PK se administró una dosis de 6 pg/kg como inyección de bolo intravenoso única. Para cada uno de los compuestos anteriores se usó un grupo de 2 animales. Se recogieron muestras de sangre y se preparó suero para la determinación de la concentración en suero para cada fármaco en ambos animales. Los niveles de fármaco en suero se midieron usando un inmunoensayo. Los datos de concentración en suero-tiempo se usaron para determinar los parámetros PK. La muestra de sangre se recogió en los siguientes puntos de tiempo: predosis, 0,05, 0,25, 0,5, 1,4, 8, 24, 48, 72, 168, 240 y 336 horas tras la dosis. Los parámetros PK se determinaron usando métodos de análisis no compartimental (NCA) estándar.

Para todos los fármacos sometidos a prueba, los niveles en suero eran cuantificables para la amplia mayoría de puntos de tiempo en todos los animales tras la administración del fármaco. Los perfiles PK mostraron una disminución exponencial bifásica para todos os fármacos sometidos a prueba. Usando métodos de NCA, se estimaron los siguientes parámetros: AUCinf (área bajo la curva de concentración en suero-tiempo), Vss (volumen de distribución en estado estacionario), CL (aclaramiento sistémico), MRT (tiempo de residencia medio) y t<1/2>terminal (semivida estimada de la fase terminal). Los parámetros PK (media de n=2) de cada compuesto sometido a prueba se resumen a continuación:

El AUCinf era de 568 h*ng/ml, 366 h*ng/ml, 1796 h*ng/ml y 1383 h*ng/ml respectivamente para los compuestos 1,2, 3 y 4. El Vss era de 446 ml/kg, 594 ml/kg, 193 ml/kg y 80,7 ml/kg respectivamente para los compuestos 1, 2, 3 y 4. El aclaramiento sistémico era de 11,3 ml/h/kg, 16,1 ml/h/kg, 4,3 ml/h/kg y 4,9 ml/h/kg respectivamente para los compuestos 1, 2, 3 y 4. El valor de MRT para los compuestos 1, 2, 3 y 4 era de 42,3 h, 39,8 h, 48,7 h y 18,1 h respectivamente y el de la semivida terminal era de 44,3 h, 31,2 h, 40,3 h y 13,5 h respectivamente para los compuestos 1,2, 3 y 4.

La semivida terminal y el MRT de cada uno de los compuestos 1,2 y 3 eran mucho mayores (> 2 veces) que aquellos para el compuesto 4. Los compuestos 1, 2 y 3 presentan una versión de semivida más larga de constructos de anticuerpo BiTE.

Resultados, véase la figura 10.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un constructo de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico que se une a un antígeno de superficie celular diana por medio de un primer dominio de unión y al antígeno de superficie de células T CD3 por medio de un segundo dominio de unión, comprendiendo el constructo dos péptidos de unión a FcRn, en el que:

(b) un segundo péptido de unión a FcRn consiste en la secuencia de aminoácidosTGHFGGLHP(SEQ ID NO: 4);

no teniendo el constructo de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico una secuencia de aminoácidos tal como se representa en las SEQ ID NO:132-135.

2. Un constructo de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico que se une a un antígeno de superficie celular diana por medio de un primer dominio de unión y al antígeno de superficie de células T CD3 por medio de un segundo dominio de unión, comprendiendo el constructo dos péptidos de unión a FcRn, en el que:

(a) un primer péptido de unión a FcRn consiste en la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLX<1>PANG(SEQ ID NO: 1) en la que X<1>es Y o H; y

(b) un segundo péptido de unión a FcRn consiste en la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3) oQRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO: 5).

3. Un constructo de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico que se une a un antígeno de superficie celular diana por medio de un primer dominio de unión y al antígeno de superficie de células T CD3 por medio de un segundo dominio de unión, comprendiendo el constructo un péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal y un péptido de unión a FcRn en el extremo C-terminal, en el que:

(a) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosq RfVTGHFGGLYPANG(SEQ ID NO: 2) y en el extremo C-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosQRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO: 5);

(b) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosq RfVTGHFGGLYPANG(SEQ ID NO: 2) y en el extremo C-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3);

(c) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3) y en el extremo C-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosQRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO: 5);

(d) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3) y en el extremo C-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3);

(e) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosQRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO: 5) y en el extremo C-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLYPANG(SEQ ID NO: 2); y

(f) el péptido de unión a FcRn en el extremo N-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosQRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO: 5) y en el extremo C-terminal consiste en la secuencia de aminoácidosQRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO: 3).

4. El constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los péptidos de unión a FcRn están ligados al constructo de anticuerpo por medio de uno o más ligadores peptídicos.

5. El constructo de anticuerpo según la reivindicación 4, en el que el ligador peptídico tiene la secuencia de aminoácidos (GGGGS)n (SEQ ID NO: 6)n en la que n es un número entero en el intervalo de 1 a 5.

6. El constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el constructo un dominio adicional que se une a albúmina sérica.

7. El constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antígeno de superficie celular diana es un antígeno tumoral.

8. El constructo de anticuerpo según la reivindicación 7, en el que el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en CDH19, mesotelina (MSLN), DLL3, FLT3, CD33, CD20 y EGFRvIII.

9. El constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo dominio de unión se une a un epítopo de cadena CD3s humana y deCallithrix jacchus, Saguinus oedipusoSaimirí sciureus,en el que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 8, 9 y 10 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 11).

10. El constructo de anticuerpo según la reivindicación 9, en el que el segundo dominio de unión comprende una región VL que tiene CDR-L1-L3 y una región VH que tiene CDR-H1-H3 seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:108-110 y CDR-H1-H3 ta como se representa en las SEQ ID NO:111-113;

(j) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:120-122 y CDR-H1-H3 ta como se representa en las SEQ ID NO:123-125;

(k) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:616-618 y CDR-H1-H3 ta como se representa en las SEQ ID NO:613-615;

(l) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:626-628 y CDR-H1-H3 ta como se representa en las SEQ ID NO:623-625;

(m) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:636-638 y CDR-H1-H3 ta como se representa en las SEQ ID NO:633-635;

(n) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:646-648 y CDR-H1-H3 ta como se representa en las SEQ ID NO:643-645;

(o) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:656-658 y CDR-H1-H3 ta como se representa en las SEQ ID NO:653-655;

(p) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:666-668 y CDR-H1-H3 ta como se representa en las SEQ ID NO:663-665;

(q) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:676-678 y CDR-H1-H3 ta como se representa en las SEQ ID NO:673-675; y

(r) CDR-L1-L3 tal como se representa en las SEQ ID NO:686-688 y CDR-H1-H3 ta como se representa en las SEQ ID NO:683-685.

11. El constructo de anticuerpo según la reivindicación 9 o 10, en el que el segundo dominio de unión comprende pares de cadenas VH y VL seleccionadas del grupo que consiste en:

12. El constructo de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el segundo dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 681 o SEQ ID NO: 691.

13. El constructo de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-12, en el que los dominios están dispuestos desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal tal como sigue:

(péptido de unión a FcRn que consiste en la SEQ ID NO:1, en la que X<1>es Y o H) - (cadena VH del primer dominio de unión) - (cadena VL del primer dominio de unión) - (cadena VH del segundo dominio de unión) - (cadena VL del segundo dominio de unión) - (péptido de unión a FcRn que consiste en la SEQ ID NO: 4)

o

(péptido de unión a FcRn que consiste en la SEQ ID NO:4) - (cadena VH del primer dominio de unión) - (cadena VL del primer dominio de unión) - (cadena VH del segundo dominio de unión) - (cadena VL del segundo dominio de unión) - (péptido de unión a FcRn que consiste en la SEQ ID NO: 1, en la que X<1>es Y o H)

14. Un polinucleótido que codifica un constructo de anticuerpo tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Un vector que comprende un polinucleótido tal como se define en la reivindicación 14.

16. Una célula huésped transformada o transfectada con el polinucleótido tal como se define en la reivindicación 14 o con el vector tal como se define en la reivindicación 15.

17. Un proceso para la producción de un constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula huésped tal como se define en la reivindicación 16 en condiciones que permiten la expresión del constructo de anticuerpo tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y recuperar el constructo de anticuerpo producido del cultivo.

18. Una composición farmacéutica que comprende un constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o producido según el proceso según la reivindicación 17.

19. El constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o producido según el proceso según la reivindicación 17, para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora de una enfermedad seleccionada de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad vírica o un trastorno inmunológico.

20. Un kit que comprende un constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o producido según el proceso según la reivindicación 17, un vector tal como se define en la reivindicación 15, y/o una célula huésped tal como se define en la reivindicación 16.