ES2743809T3 - Constructos de anticuerpo monocatenarios biespecificos específicos de especies cruzadas optimizados - Google Patents

Abstract

Un constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico que se une a un antígeno de superficie de una célula diana a través de un primer dominio de unión y al antígeno de superficie de una célula T CD3 a través de un segundo dominio de unión, en el que: - el segundo dominio de unión se une a un epítope de la cadena CD3ε humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, comprendiendo el epítope al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 1), y - una albúmina sérica está fusionada al extremo C-terminal del constructor; el constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico no tiene una secuencia de aminoácidos tal como se representa en las SEQ ID NO: 2 y 3, y el constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico no tiene la secuencia de aminoácidos:

Description

DESCRIPCIÓN

Constructos de anticuerpo monocatenarios biespecificos específicos de especies cruzadas optimizados

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico que se une a un antígeno de superficie de una célula diana a través de un primer dominio de unión y al antígeno de superficie de una célula T CD3 a través de un segundo dominio de unión, en el que el segundo dominio de unión se une a un epítope de la cadena CD3e humana y de Callithrix jacchus, Saguinus Edipo o Saimirí sciureus, en la que el epítope comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 1), y está fusionada albúmina sérica al extremo C-terminal del constructor de anticuerpo tal como se define en las reivindicaciones. Además, la invención proporciona un polinucleótido que codifica el constructor de anticuerpo, un vector que comprende dicho polinucleótido y una célula huésped transformada o transfectada con dicho vector. Además, la invención proporciona un proceso para la producción del constructor de anticuerpo de la invención, un uso médico de dicho constructor de anticuerpo y un kit que comprende dicho constructor de anticuerpo.

Antecedentes de la invención

Las moléculas biespecíficas tales como los anticuerpos BiTE® (acoplador biespecífico de células T) son constructos de proteínas recombinantes producidos a partir de dos dominios de unión derivados de anticuerpos unidos de forma flexible. Un dominio de unión de los anticuerpos BiTE® es específico para un antígeno de superficie asociado a tumor seleccionado presente en células diana; el segundo dominio de unión es específico para CD3, una subunidad del complejo receptor de células T presente en células T. Por su diseño particular, los anticuerpos BiTE® son especialmente adecuados para conectar transitoriamente células T con células diana y, al mismo tiempo, activar de forma potente el potencial citolítico inherente de las células T contra las células diana. Un desarrollo adicional importante de la primera generación de moléculas BiTE® (véanse los documentos WO 99/54440 y WO 2005/040220) desarrolladas en la clínica como AMG 103 y AMG 110 fue la provisión de constructos de anticuerpo biespecíficos que se unen a un epítope independiente del contexto en el extremo N-terminal de la cadena CD3s (documento WO 2008/119567). Los anticuerpos BiTE® que se unen a este epítope elegido no solo mostraron especificidad de especies cruzadas para la cadena CD3s humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, sino también, debido al uso de este epítope en lugar de los epítopes descritos previamente para ligantes de CD3 en moléculas que se acoplan a células T biespecíficas, no activan las células T en el mismo grado que se observó para la generación anterior de anticuerpos que se acoplan a células T. Esta diferencia en la activación de las células T se ha relacionado con una redistribución de células T menor o reducida en pacientes, lo que se identificó como un riesgo de padecer efectos secundarios. El documento WO 2013/128027 describe moléculas acopladoras de células T (BiTE) con al menos tres dominios de unión, en las que un dominio de unión se une a albúmina sérica.

Definiciones

Debe indicarse que, tal como se usan en el presente documento, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o más de dichos reactivos diferentes y la referencia a "el procedimiento" incluye referencia a etapas y procedimientos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica que podrían modificarse o sustituirse por los procedimientos descritos en el presente documento.

A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que la expresión "al menos" que precede a una serie de elementos se refiere a cada elemento de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar utilizando únicamente experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las formas de realización específicas de la invención descritas en el presente documento. Se pretende que dichos equivalentes estén abarcados por la presente invención.

El término "y/o", cuando se utilice en el presente documento, incluye el significado de "y", "o" y "todos o cualquier otra combinación de los elementos enlazados por dicho término".

El término "aproximadamente" o la expresión "alrededor de", tal como se utilizan en el presente documento, significan dentro de ± 20%, preferentemente dentro de ± 15%, de forma más preferida dentro de ± 10%, y de la forma más preferida dentro de ± 5% de un valor o intervalo dado.

A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones posteriores, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender" y variaciones de la misma tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o etapa o de un grupo de números enteros o etapas establecido, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se utiliza en el presente documento, la expresión "que comprende" se puede sustituir por la expresión "que contiene" o "que incluye" o, a veces, cuando se utiliza en el presente documento por la expresión "que tiene".

Cuando se utiliza en el presente documento, "consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se utiliza en el presente documento, "consiste esencialmente en" no excluye materiales o etapas que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.

En cada caso en el presente documento, cualquiera de las expresiones "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede reemplazarse por cualquiera de las otras dos expresiones.

Descripción detallada de la invención

Para moléculas acopladoras de células T biespecíficas que comprenden como su entidad de unión a células T un dominio de unión específico para la cadena CD3e humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimirí sciureus, en el que el epítope es parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 8, 9 y 10 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 1), se observó que esas moléculas cuando se utilizaban en concentraciones extremadamente altas mostraban citotoxicidad de células T, independientemente de la especificidad diana del segundo dominio de unión e incluso en ausencia de células diana. Aunque esas altas concentraciones de moléculas acopladoras de células T biespecíficas no son relevantes para cada combinación de enfermedad y diana en un tratamiento que utiliza el modo de acción de moléculas acopladoras de células T en caso de una administración i.v. continua, dichos problemas de alta concentración pueden llegar a ser relevantes para vías de administración específicas o en combinación con configuraciones específicas de diana y concentraciones de compuesto requeridas.

Por lo tanto, el problema subyacente en la presente invención era proporcionar constructos de anticuerpo monocatenarios biespecíficos utilizando un dominio de unión a células T de la última generación, que evita la citotoxicidad de células T incluso en altas concentraciones de compuestos.

Este problema se resolvió proporcionando un constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico que se une a un antígeno de superficie de una célula diana a través de un primer dominio de unión y al antígeno de superficie de una célula T CD3 a través de un segundo dominio de unión, en el que

• el segundo dominio de unión se une a un epítope de cadena CD3e humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que el epítope comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 1), y

• una albúmina sérica está fusionada al extremo C-terminal del constructor de anticuerpo;

el constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico no tiene una secuencia de aminoácidos tal como se representa en las SEQ ID NO: 2 y 3,

y el constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico no tiene la secuencia de aminoácidos:

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Sin la intención de vincularse a ninguna teoría, la activación de células T en presencia de una alta concentración de constructos de anticuerpo biespecíficos acopladores de células T y en ausencia de células diana se explica por la dimerización o multimerización de los constructos de anticuerpo a través del dominio de unión CD3. Dicha di- o multimerización está deteriorada estéricamente por la fusión de una albúmina o variante de la misma al extremo C-terminal del constructor de anticuerpo, que mantiene simultáneamente las características del constructor de anticuerpo con respecto a su modo de acción en el acoplamiento de células T.

Esas altas concentraciones de constructos de anticuerpo biespecíficos acopladores de células T en un paciente son dichas concentraciones en un compartimiento específico tal como el suero. La fusión de la albúmina al extremo C-terminal del constructor de anticuerpo acoplador de células T evita la activación de las células T en ausencia de células diana hasta una concentración de 2 mg/ml, al menos hasta 1 mg/ml, de forma más preferida hasta a 500 ng/ml.

Callithrix jacchus y Saguinus oedipus son ambos primates del nuevo mundo que pertenecen a la familia Callitrichidae, mientras que Saimiri sciureus es un primate del nuevo mundo que pertenece a la familia Cebidae.

La albúmina sérica es una proteína producida fisiológicamente por el hígado; está presente en forma disuelta en el plasma sanguíneo y es la proteína sanguínea más abundante en los mamíferos. La albúmina es esencial para mantener la presión oncótica necesaria para la distribución apropiada de fluidos corporales entre vasos sanguíneos y tejidos corporales. También actúa como un vehículo plasmático mediante la unión no específica de varias hormonas esteroides hidrófobas y como una proteína transportadora de hemina y ácidos grasos. La expresión "albúmina sérica", respectivamente la variante humana de la misma ("albúmina humana"), define en el contexto de las proteínas de la invención o bien la proteína albúmina sérica humana parental (secuencia tal como se describe en la SEQ ID NO: 4) o bien cualquier variante (por ejemplo, tal como la proteína albúmina tal como se representa en las SEQ ID NO: 5-12 o 608 a 628) o un fragmento de la misma expresado preferentemente como proteínas de fusión genética y por reticulación química, etc., al menos con una proteína terapéutica. Las variantes que comprenden mutaciones únicas o múltiples o fragmentos de albúmina proporcionan propiedades mejoradas, tales como afinidades al receptor FcRn y una semivida en plasma prolongada en comparación con su molécula parental o de referencia. Un grupo preferido de secuencias de albúmina sérica relacionado con la presente invención se selecciona de un grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 608, 609, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 621,622, 623, 624, 625, 626, 627 y 628.

La expresión "constructor de anticuerpo" se refiere a una molécula en la que la estructura y/o la función se basa en la estructura y/o la función de un anticuerpo, por ejemplo de una molécula de inmunoglobulina completa o de longitud completa. Por lo tanto, un constructor de anticuerpo es capaz de unirse a su diana o antígeno específico. Además, un constructor de anticuerpo según la invención comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión a la diana. Estos requisitos mínimos pueden definirse, por ejemplo, por la presencia de al menos las tres CDR de cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o las tres CDR de cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). Los anticuerpos en los que se basan los constructos según la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos.

Dentro de la definición de "constructos de anticuerpo" según la invención, se encuentran anticuerpos completos o de longitud completa que incluyen anticuerpos de camélidos y otros anticuerpos de inmunoglobulina generados mediante procedimientos o procesos biotecnológicos o de ingeniería de proteínas. Estos anticuerpos de longitud completa pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos. También dentro de la definición de "constructos de anticuerpo" se encuentran fragmentos de anticuerpos de longitud completa, tales como VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 o "rIgG" ("medio anticuerpo"). Los constructos de anticuerpo según la invención también pueden ser fragmentos modificados de anticuerpos, también denominados variantes de anticuerpos, tales como scFv, di-scFv o bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFvcremallera, scFab, Fab2, Fab3, diacuerpos, diacuerpos monocatenarios, diacuerpos en tándem (Tandab), di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem, "minicuerpos" ejemplificados por una estructura que es la siguiente: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 o (scFv-CH3-scFv)2, multicuerpos tales como triacuerpos o tetracuerpos, y anticuerpos de dominio único tales como nanocuerpos o anticuerpos de dominio variable único que comprenden simplemente un dominio variable, que puede ser VHH, VH o VL, que se unen específicamente a un antígeno o un epítope independientemente de otras regiones o dominios V.

Además, la definición de la expresión "constructos de anticuerpo" incluye constructos monovalentes, bivalentes y polivalentes/multivalentes y, por lo tanto, constructos monoespecíficos, que se unen específicamente a una sola estructura antigénica, así como constructos biespecíficos y poliespecíficos/multiespecíficos, que se unen específicamente a más de una estructura antigénica, por ejemplo dos, tres o más, a través de distintos dominios de unión. Además, la definición de la expresión "constructos de anticuerpo" incluye moléculas que consisten en una única cadena polipeptídica, así como moléculas que consisten en más de una cadena polipeptídica, cuyas cadenas pueden ser idénticas (homodímeros, homotrímeros u homooligómeros) o diferentes (heterodímero, heterotrímero o heterooligómero). Se describen ejemplos de los anticuerpos identificados anteriormente y variantes o derivados de los mismos, entre otros, por Harlow y Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) and Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2a ed.

2010 y Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

Los constructos de anticuerpo de la presente invención son preferentemente "constructos de anticuerpo generados in vitro". Esta expresión se refiere a un constructor de anticuerpo según la definición anterior en el que la totalidad o parte de la región variable (por ejemplo, al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunitarias, es decir, una presentación en fagos in vitro, un chip de proteínas o cualquier otro procedimiento en el que se puedan analizar secuencias candidatas para determinar su capacidad para unirse a un antígeno. Por lo tanto, esta expresión preferentemente excluye las secuencias generadas únicamente por reordenamiento genómico en una célula inmunitaria en un animal. Un "anticuerpo recombinante" es un anticuerpo creado mediante el uso de tecnología de ADN recombinante o ingeniería genética.

La presente invención se refiere a "constructos de anticuerpo monocatenarios". En consecuencia, esos constructos de anticuerpo monocatenarios solo incluyen aquellas formas de realización de los constructos de anticuerpo descritos anteriormente que consisten en una única cadena peptídica.

La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb) o constructor de anticuerpo monoclonal, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales y modificaciones postraduccionales (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio o determinante antigénico en el antígeno, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (o epítopes). Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan mediante cultivo de hibridoma y, por lo tanto, no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que se requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento en particular.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares en continuo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a utilizar se pueden producir mediante el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden producirse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 4.816.567). Los ejemplos de técnicas adicionales para producir anticuerpos monoclonales humanos incluyen la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96.).

Los hibridomas se pueden cribar utilizando procedimientos estándar, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el análisis de resonancia de plasmón superficial (BIACORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno específico. Se puede utilizar cualquier forma del antígeno relevante como inmunógeno, por ejemplo, antígeno recombinante, formas de origen natural, cualquier variante o fragmento de las mismas, así como un péptido antigénico del mismo. La resonancia de plasmón superficial, tal como se emplea en el sistema BIAcore, se puede utilizar para aumentar la eficacia de los anticuerpos de fagos que se unen a un epítope de un antígeno diana, tal como el antígeno de superficie de una célula diana o el CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13.).

Otro procedimiento ejemplar para producir anticuerpos monoclonales incluye el cribado de bibliotecas de expresión de proteínas, por ejemplo, bibliotecas de presentación en fagos o de presentación en ribosomas. La presentación en fagos se describe, por ejemplo, por Ladner et al., N° 5.223.409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Además del uso de bibliotecas de presentación, el antígeno relevante puede utilizarse para inmunizar a un animal no humano, por ejemplo un roedor (tal como un ratón, un hámster, un conejo o una rata). En una forma de realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible obtener por ingeniería genética cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig (inmunoglobulina) humana. Utilizando tecnología de hibridoma se pueden producir y seleccionar anticuerpos monoclonales específicos de antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véase, por ejemplo, XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, documentos US 2003-0070185, WO 96/34096 y WO96/33735.

También se puede obtener un anticuerpo monoclonal a partir de un animal no humano, y luego modificarlo, es decir, humanizarlo, desinmunizarlo, volverlo quimérico, etc., utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Los ejemplos de constructos de anticuerpo modificados incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos "madurados por afinidad" (véase, por ejemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)) y mutantes de anticuerpos con funciones efectoras alteradas (véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.648.260, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. .y Little (2009), loc. cit.).

En inmunología, la maduración por afinidad es el proceso mediante el cual las células B producen anticuerpos con una afinidad aumentada por el antígeno durante el transcurso de una respuesta inmunitaria. Con exposiciones repetidas al mismo antígeno, un huésped producirá anticuerpos de afinidades cada vez mayores. Como el prototipo natural, la maduración por afinidad in vitro se basa en los principios de mutación y selección. La maduración por afinidad in vitro se ha utilizado con éxito para optimizar anticuerpos, constructos de anticuerpo y fragmentos de anticuerpos. Se introducen mutaciones aleatorias dentro de las CDR utilizando radiación, mutágenos químicos o PCR propensa a errores. Además, la diversidad genética puede aumentarse mediante el barajado de cadenas. Dos o tres rondas de mutación y selección utilizando procedimientos de presentación tales como la presentación en fagos generalmente dan como resultado fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo nanomolar bajo.

Un tipo preferido de una variación de sustitución de aminoácidos de los constructos de anticuerpo implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para el desarrollo adicional tendrá(n) propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo parental a partir del que se generan. Una forma conveniente de generar dichas variantes de sustitución implica la maduración por afinidad utilizando presentación en fagos. En resumen, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se presentan de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos se criban después para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se describe en el presente documento. Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede realizar una mutagénesis de barrido de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el dominio de unión y, por ejemplo, el antígeno de superficie de célula diana humana. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describe en el presente documento y se pueden cribar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para un desarrollo adicional.

Los anticuerpos monoclonales y los constructos de anticuerpo de la presente divulgación incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (patente de Estados Unidos N° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humana. Se han descrito una diversidad de enfoques para producir anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl Acad ScL U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314: 452, 1985, Cabilly et al., patente de Estados Unidos N° 4.816.567; Boss et al., patente de Estados Unidos N° 4.816.397; Tanaguchi et al., documentos EP 0171496; EP 0173494 y GB 2177096.

Un anticuerpo, constructor de anticuerpo o fragmento de anticuerpo también puede modificarse por eliminación específica de epítopes de células T humanas (un procedimiento denominado "desinmunización") mediante los procedimientos descritos en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. En resumen, los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo pueden analizarse para determinar los péptidos que se unen a MHC de clase II; estos péptidos representan epítopes de células T potenciales (tal como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de epítopes de células T potenciales, se puede aplicar un enfoque de modelado computarizado denominado "enhebrado de péptidos", y además se pueden buscar en una base de datos de péptidos de unión a MHC de clase II humanos motivos presentes en las secuencias VH y VL, tal como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 principales alotipos MHC de clase II DR y, por lo tanto, constituyen epítopes de células T potenciales. Los epítopes de células T potenciales detectados pueden eliminarse sustituyendo pequeñas cantidades de residuos de aminoácidos en los dominios variables, o preferentemente, mediante sustituciones simples de aminoácidos. Normalmente, se realizan sustituciones conservativas. A menudo, pero no exclusivamente, se puede utilizar un aminoácido común a una posición en las secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana. Se divulgan secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, por Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today vol. 16 (5): 237-242; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14: 4628-4638. El directorio V bAs E proporciona un directorio completo de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). Estas secuencias pueden utilizarse como fuente de secuencias humanas, por ejemplo para regiones estructurales y CDR. También se pueden utilizar regiones estructurales humanas de consenso, por ejemplo, tal como se describe en la patente de Estados Unidos N° 6.300.064.

Los anticuerpos, constructos de anticuerpo o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) "humanizados" son anticuerpos o inmunoglobulinas de secuencias en su mayor parte humanas, que contienen una o varias secuencia(s) mínima(s) derivada(s) de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable (también CDR) del receptor están reemplazados por residuos de una región hipervariable de un animal no humano (por ejemplo un roedor) (anticuerpo donante) tal como un ratón, una rata, un hámster o un conejo que tienen la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) Fv de la inmunoglobulina humana están reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Además, "anticuerpos humanizados", tal como se utiliza en el presente documento, también puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct Biol., 2: 593-596 (1992).

Pueden generarse anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos reemplazando secuencias del dominio variable Fv que no están directamente involucradas en la unión a antígeno por secuencias equivalentes de dominios variables Fv humanos. Los procedimientos ejemplares para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se proporcionan por Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; y por los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205 y US 6.407.213. Esos procedimientos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la totalidad o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o una cadena ligera. Dichos ácidos nucleicos pueden obtenerse a partir de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, tal como se ha descrito anteriormente, así como a partir de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizado puede clonarse después en un vector de expresión apropiado.

También pueden producirse anticuerpos humanizados utilizando animales transgénicos tales como ratones que expresan genes de cadena pesada y ligera humanos, pero que son incapaces de expresar los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de ratón endógenos. Winter describe un procedimiento de injerto de CDR de ejemplo que se puede utilizar para preparar los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento (patente de Estados Unidos N° 5.225.539). Todas las CDR de un anticuerpo humano particular pueden reemplazarse por al menos una porción de una CDR no humana, o solo algunas de las CDR pueden reemplazarse por CDR no humanas. Solo es necesario reemplazar el número de CDR requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.

Un anticuerpo humanizado puede optimizarse mediante la introducción de sustituciones conservativas, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de línea germinal y/o retromutaciones. Dichas moléculas de inmunoglobulina alteradas pueden producirse mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en la técnica, (por ejemplo, Teng et al., Proc. Natl Acad Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982 y el documento EP 239400.

Las expresiones "anticuerpo humano", "constructor de anticuerpo humano" y "dominio de unión humano" incluyen anticuerpos, constructos de anticuerpo y dominios de unión que tienen regiones de anticuerpo tales como regiones o dominios variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas en la técnica, incluidas, por ejemplo, las descritas por Kabat et al. (1991) (loc.cit.). Los anticuerpos, constructos de anticuerpo o dominios de unión humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR, y en particular, en CDR3. Los anticuerpos, constructos de anticuerpo o dominios de unión humanos pueden tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones reemplazadas por un residuo de aminoácido que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. La definición de anticuerpos, constructos de anticuerpo y dominios de unión humanos tal como se utiliza en el presente documento también contempla anticuerpos completamente humanos, que incluyen solo secuencias humanas de anticuerpos no alteradas artificialmente y/o genéticamente, tales como las que pueden derivarse utilizando tecnologías o sistemas tales como el Xenomouse.

En algunas formas de realización, los constructos de anticuerpo de la invención son constructos de anticuerpos "aislados" o "sustancialmente puros". "Aislado" o "sustancialmente puro", cuando se utilizan para describir el constructor de anticuerpo descrito en el presente documento significan un constructor de anticuerpo que se ha identificado, separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno de producción. Preferentemente, el constructor de anticuerpo carece o carece sustancialmente de asociación con todos los otros componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tales como los producidos por células transfectadas recombinantes, son materiales que normalmente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Los constructos de anticuerpo pueden constituir, por ejemplo, al menos aproximadamente el 5%, o al menos aproximadamente el 50% en peso de la proteína total en una muestra dada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir del 5% al 99,9% en peso del contenido total de proteína, dependiendo de las circunstancias. El polipéptido puede producirse a una concentración significativamente superior mediante el uso de un promotor inducible o un promotor de alta expresión, de forma que se produzca a niveles de concentración elevados. La definición incluye la producción de un constructor de anticuerpo en una amplia diversidad de organismos y/o células huésped que son conocidos en la técnica. En formas de realización preferidas, el constructor de anticuerpo se purificará (1) hasta un nivel suficiente como para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. Generalmente, sin embargo, un constructor de anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

La expresión "dominio de unión" caracteriza en relación con la presente invención un dominio que (específicamente) se une a/interactúa con/reconoce un epítope diana dado o un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos) y CD3, respectivamente. La estructura y la función del primer dominio de unión (que reconoce el antígeno de superficie de la célula diana), y preferentemente también la estructura y/o la función del segundo dominio de unión (CD3), se basa(n) en la estructura y/o la función de un anticuerpo, por ejemplo de una molécula de inmunoglobulina completa o de longitud completa. Según la invención, el primer dominio de unión se caracteriza por la presencia de tres CDR de cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y tres CDR de cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). El segundo dominio de unión también comprende preferentemente los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión a la diana. De forma más preferida, el segundo dominio de unión comprende al menos tres CDR de cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o tres CDR de cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). Se prevé que el primer y/o segundo dominio de unión se produzcan mediante o puedan obtenerse mediante procedimientos de cribado de bibliotecas o de presentación en fagos, en lugar de mediante injerto de secuencias de CDR de un anticuerpo (monoclonal) preexistente en un armazón.

Según la presente invención, los dominios de unión se encuentran preferentemente en forma de polipéptidos. Dichos polipéptidos pueden incluir partes proteicas y partes no proteicas (por ejemplo, enlazadores químicos o agentes reticulantes químicos tales como glutaraldehído). Las proteínas (incluidos fragmentos de las mismas, preferentemente fragmentos biológicamente activos, y los péptidos, que generalmente tienen menos de 30 aminoácidos) comprenden dos o más aminoácidos acoplados entre sí a través de un enlace peptídico covalente (que da como resultado una cadena de aminoácidos). El término "polipéptido", tal como se utiliza en el presente documento, describe un grupo de moléculas, que generalmente consiste en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar también multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, consisten en más de una molécula polipeptídica. Las moléculas de polipéptidos que forman dichos dímeros, trímeros, etc., pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes de dichos multímeros se denominan, en consecuencia, homo- o heterodímeros, homo- o heterotrímeros, etc. Un ejemplo de un hereteromultímero es una molécula de anticuerpo que, en su forma de origen natural, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" también se refieren a péptidos/polipéptidos/proteínas modificados de forma natural en los que la modificación se efectúa, por ejemplo, mediante modificaciones postraduccionales tales como glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Cuando se hace referencia a un "péptido", un "polipéptido" o una "proteína" en el presente documento, estos también pueden estar modificados químicamente, por ejemplo pegilados. Dichas modificaciones son bien conocidas en la técnica y se describen más adelante.

Tal como se ha mencionado anteriormente, un dominio de unión puede comprender normalmente una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo; sin embargo, no es necesario que comprenda ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo conservan alguna función de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno (modificados) incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad aislada (CDR) y (7) un Fv monocatenario (scFv), siendo el último preferido (por ejemplo, derivado de una biblioteca de scFv).

Los anticuerpos y los constructos de anticuerpo que comprenden al menos un dominio de unión humano evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos o los constructos de anticuerpo que poseen regiones variables y/o constantes no humanas, tales como de roedor (por ejemplo, murinas, de rata, de hámster o de conejo). La presencia de dichas proteínas derivadas de roedor puede conducir a la rápida eliminación de los anticuerpos o constructos de anticuerpo o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo o el constructor de anticuerpos por parte de un paciente. Con el fin de evitar el uso de anticuerpos o constructos de anticuerpo derivados de roedores, se pueden generar anticuerpos/constructos de anticuerpo humanos o completamente humanos a través de la introducción de la función de anticuerpos humanos en un roedor, de forma que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos.

La capacidad de clonar y reconstruir loci humanos del tamaño de megabases en YAC e introducirlos en la línea germinal de ratón proporciona un enfoque poderoso para elucidar los componentes funcionales de loci muy grandes o toscamente cartografiados, así como para generar modelos útiles de enfermedades humanas. Además, el uso de dicha tecnología para la sustitución de loci de ratón por sus equivalentes humanos podría proporcionar información única sobre la expresión y la regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas y su implicación en la inducción y la progresión de la enfermedad.

Una aplicación práctica importante de dicha estrategia es la "humanización" del sistema inmunitario humoral del ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones en los que los genes de Ig endógenos han sido inactivados ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y el ensamblaje de anticuerpos, así como su papel en el desarrollo de células B. Además, dicha estrategia podría proporcionar una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos, un hito importante hacia el cumplimiento del compromiso de un tratamiento con anticuerpos en enfermedades humanas. Se espera que los anticuerpos o los constructos de anticuerpo completamente humanos minimicen las respuestas inmunógenas y alérgicas intrínsecas a los mAb de ratón derivados de ratón y, por lo tanto, aumenten la eficacia y la seguridad de los anticuerpos/constructos de anticuerpo administrados. Se puede esperar que el uso de anticuerpos o constructos de anticuerpo completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, autoinmunidad y cáncer, que requieren administraciones repetidas de compuestos.

Un enfoque hacia este objetivo consistió en obtener por ingeniería genética cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humana, en previsión de que dichos ratones produjeran un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los fragmentos de Ig humana grandes conservarían la gran diversidad de genes variables, así como la regulación adecuada de la producción y expresión de anticuerpos. Mediante la explotación de la maquinaria de ratón para la diversificación y la selección de anticuerpos y la falta de tolerancia inmunológica a proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducido en estas cepas de ratón deberá producir anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluidos antígenos humanos. Utilizando la tecnología de hibridoma, se podrían producir y seleccionar fácilmente mAb humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada. Esta estrategia general se demostró con respecto a la generación de las primeras cepas de ratón XenoMouse (véase Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994)). Las cepas XenoMouse se obtuvieron por ingeniería genética con cromosomas artificiales de levadura (YAC) que contenían fragmentos de configuración de línea germinal del tamaño de 245 kb y 190 kb del locus de la cadena pesada humana y del locus de la cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían secuencias de la región central variable y constante. Los YAC que contienen Ig humana demostraron ser compatibles con el sistema de ratón tanto para la reorganización como para la expresión de anticuerpos y eran capaces de sustituir los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demostró por medio de su capacidad para inducir el desarrollo de células B, para producir un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y para generar mAb humanos específicos de antígeno. Estos resultados también sugieren que la introducción de porciones más grandes de los loci de Ig humana que contienen un mayor número de genes V, elementos reguladores adicionales y regiones constantes de Ig humana podría recapitular sustancialmente el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral humana a la infección y la inmunización. El trabajo de Green et al. se extendió recientemente a la introducción de más de aproximadamente el 80% del repertorio de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos de YAC de configuración de línea germinal de tamaño de megabase de los loci de la cadena pesada humana y los loci de la cadena ligera kappa, respectivamente. Véase Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997) y la solicitud de patente de Estados Unidos con el número de serie 08/759.620.

La producción de los ratones XenoMouse se discute adicionalmente y se describe en las solicitudes de patente de Estados Unidos con el número de serie 07/466.008, el número de serie 07/610.515, el número de serie 07/919.297, el número de serie 07/922.649, el número de serie 08/031.801, el número de serie 08/112.848, el número de serie 08/234.145, el número de serie 08/376.279, el número de serie 08/430.938, el número de serie 08/464.584, el número de serie 08/464.582, el número de serie 08/463.191, el número de serie 08/462.837, el número de serie 08/486.853, el número de serie 08/486.857, el número de serie 08/486.859, el número de serie 08/462.513, el número de serie 08/724.752 y el número de serie 08/759.620; y las patentes de Estados Unidos N° 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 y 5.939. 598 y las patentes japonesas N23068 180 B2, 3068506 B2 y 3068507 B2. Véase también Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483­ 495 (1998), el documento EP 0463151 B1, el documento WO 94/02602, el documento WO 96/34096, el documento WO 98/24893, el documento WO 00/76310 y el documento WO 03/47336.

En un enfoque alternativo, otros, incluido GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de "minilocus". En el enfoque de minilocus, un locus de Ig exógena se imita mediante la inclusión de trozos (genes individuales) del locus de Ig. Por lo tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y una segunda región constante (preferentemente una región constante gamma) se forman en un constructor para su inserción en un animal. Este enfoque se describe en la patente de Estados Unidos N° 5.545.807 de Surani et al. y las patentes de Estados Unidos N25.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 y 6.255.458 cada una de Lonberg y Kay, las patentes de Estados Unidos N° 5.591.669 y 6.023.010 de Krimpenfort y Berns, las patentes de Estados Unidos N° 5.612.205, 5.721.367 y 5.789.215 de Berns et al., y la patente de Estados Unidos N° 5.643.763 de Choi y Dunn, y lassolicitudes de patente de Estados Unidos de GenPharm Internacional con el número de serie 07/574.748, el número de serie 07/575.962, el número de serie 07/810.279, el número de serie 07/853.408, el número de serie 07/904.068, el número de serie 07/990.860, el número de serie 08/053.131, el número de serie 08/096.762, el número de serie 08/155.301, el número de serie 08/161.739, el número de serie 08/165.699, el número de serie 08/209.741. Véanse también los documentos EP 0 546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la patente de Estados Unidos N25.981.175. Véanse también Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994) y Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).

Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, a través de la fusión de microcélulas, se han introducido grandes trozos de cromosomas, o cromosomas completos. Véanse las solicitudes de patente europea N° 773288 y 843961. Xenerex Biosciences está desarrollando una tecnología para la generación potencial de anticuerpos humanos. En esta tecnología, se reconstituyen ratones SCID con células linfáticas humanas, por ejemplo, células B y/o T. Los ratones se inmunizan después con un antígeno y pueden generar una respuesta inmunitaria contra el antígeno. Véanse las patentes de Estados Unidos N° 5.476.996; 5.698.767 y 5.958.765.

Las respuestas de anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA) han conducido a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de otra forma. Sin embargo, se espera que se observen determinadas respuestas de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), particularmente en las aplicaciones crónicas o de dosis múltiples del anticuerpo. Por lo tanto, sería deseable proporcionar constructos de anticuerpo que comprendan un dominio de unión completamente humano contra el antígeno de superficie de una célula diana y un dominio de unión completamente humano contra CD3 con el fin de minar las preocupaciones y/o los efectos de la respuesta de HAMA o de HACA.

Les expresiones "se une (específicamente) a", "reconoce (específicamente)","se dirige (específicamente) a" y "reacciona (específicamente) con" significan según la presente invención que un dominio de unión interactúa o interactúa específicamente con uno o más, preferentemente al menos dos, de forma más preferida al menos tres y de la forma más preferida al menos cuatro aminoácidos de un epítope ubicado en la proteína o antígeno diana (el antígeno de superficie de una célula diana/CD3).

El término "epítope" se refiere a un sitio de un antígeno al que se une específicamente un dominio de unión, tal como

un anticuerpo o inmunoglobulina o derivado o fragmento de un anticuerpo o de una inmunoglobulina. Un "epítope" es antigénico y, por lo tanto, el término epítope a veces se denomina también en el presente documento "estructura antigénica" o "determinante antigénico". Por lo tanto, el dominio de unión es un "sitio de interacción con antígeno".

Se entiende que dicha unión/interacción también define un "reconocimiento específico".

Los "epítopes" pueden estar formados tanto por aminoácidos contiguos como por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante plegamiento terciario de una proteína. Un "epítope lineal" es un epítope en el que una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítope reconocido. Un epítope lineal incluye generalmente al menos 3 o al menos 4, y más generalmente, al menos 5 o al menos 6 o al menos 7, por ejemplo, aproximadamente

8 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única.

Un "epítope conformacional", a diferencia de un epítope lineal, es un epítope en el que la secuencia primaria de los aminoácidos que comprende el epítope no es el único componente que define el epítope reconocido (por ejemplo, un epítope en el que la secuencia primaria de aminoácidos no es necesariamente reconocida por el dominio de

unión). Normalmente, un epítope conformacional comprende un número superior de aminoácidos con respecto a un epítope lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopes conformacionales, el dominio de unión reconoce una estructura tridimensional del antígeno, preferentemente un péptido o proteína o fragmento del mismo (en el contexto

de la presente invención, el antígeno para uno de los dominios de unión está comprendido dentro de la proteína del antígeno de superficie de la célula diana). Por ejemplo, cuando una molécula de proteína se pliega formando una estructura tridimensional, determinados aminoácidos y/o el esqueleto polipeptídico que forman el epítope conformacional se yuxtaponen permitiendo al anticuerpo reconocer el epítope. Los procedimientos para determinar la conformación de los epítopes incluyen, entre otros, cristalografía de rayos X, espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional (2D-RMN) y marcado de espín dirigido al sitio y espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR).

La interacción entre el dominio de unión y el epítope o agrupación de epítopes implica que un dominio de unión muestra una afinidad apreciable por el epítope o agrupación de epítopes de una proteína o antígeno particular (en el presente documento: el antígeno de superficie de la célula diana y CD3, respectivamente) y, en general, no muestra

una reactividad significativa con proteínas o antígenos distintos del antígeno de superficie de la célula diana o CD3.

"Afinidad apreciable" incluye la unión con una afinidad de aproximadamente 10-6 M (KD) o más fuerte.

Preferentemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es de aproximadamente 10-12 a 10-8

M, 10-12 a 10-9 M, 10-12 a 10-10 M, 10-11 a 10-8 M, preferentemente de aproximadament dominio de unión reaccione específicamente con, o se una a, una diana se puede determinar fácilmente mediante, entre otros, la comparación de la reacción de dicho dominio de unión con una proteína o antígeno diana con la reacción de dicho dominio de unión con proteínas o antígenos distintos del antígeno de superficie de la célula diana

o CD3. Preferentemente, un dominio de unión de la invención no se une esencialmente o sustancialmente a proteínas o antígenos distintos del antígeno de superficie de la célula diana o CD3 (es decir, el primer dominio de

unión no es capaz de unirse a proteínas distintas del antígeno de superficie de la célula diana y el segundo dominio

de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de CD3).

Las expresiones "no se une esencialmente/sustancialmente" o "no es capaz de unirse" significan que un dominio de

unión de la presente invención no se une a una proteína o antígeno distinto del antígeno de superficie de la célula

diana o CD3, es decir, no muestra una reactividad superior al 30%, preferentemente superior al 20%, de forma más preferida superior al 10%, de forma particularmente preferida superior al 9%, 8%, 7%, 6% o 5% con proteínas o antígenos aparte del antígeno de superficie de la célula diana o CD3, estableciéndose la unión al antígeno de superficie de la célula diana o CD3, respectivamente, de forma que sea el 100%.

Se cree que la unión específica se efectúa mediante motivos específicos de la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno. Así, la unión se logra como resultado de su estructura primaria, secundaria y/o terciaria, así como resultado de modificaciones secundarias de dichas estructuras. La interacción específica del sitio

de interacción de antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado una unión simple de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del sitio de interacción de antígeno con su antígeno específico puede

dar como resultado alternativamente o adicionalmente el inicio de una señal, por ejemplo, debido a la inducción de

un cambio en la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc.

El término "variable" se refiere a las porciones de los dominios de anticuerpos o inmunoglobulinas que muestran variabilidad en su secuencia y que están involucradas en la determinación de la especificidad y la afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, el o los "dominio(s) variable(s)"). El emparejamiento de una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) forma conjuntamente un único sitio de unión a antígeno. El dominio CH más próximo a VH se designa CH1. Cada cadena ligera (L) está unida a una cadena pesada (H) por medio de un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están enlazadas entre sí por medio de uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H.

La variabilidad no está distribuida uniformemente a lo largo de los dominios variables de anticuerpos; se concentra en subdominios de cada una de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. Estos subdominios se denominan "regiones hipervariables" o "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR). Las porciones más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan regiones "estructurales" (FRM) y proporcionan un armazón para las seis CDR en el espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de origen natural comprenden cada uno cuatro regiones FRM (FR1, FR2, FR3 y FR4), que adoptan en gran parte una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan a, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante la FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (véase Kabat et al., loc. cit.). Los dominios constantes no están directamente involucrados en la unión al antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tales como, por ejemplo, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos y activación del complemento.

El término "CDR", y su plural "CDR", se refieren a la región determinante de la complementariedad de la que tres conforman el carácter de unión de una región variable de cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3) y tres conforman el carácter de unión de una región variable de cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3). Las CDR contienen la mayor parte de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno y, por lo tanto, contribuyen a la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: son los principales determinantes de la especificidad del antígeno.

Los límites exactos y las longitudes exactas de los CDR según su definición están sujetos a diferentes sistemas de clasificación y numeración. Por lo tanto, las CDR pueden referirse por Kabat, Chothia, contacto o cualquier otra definición de límites, incluido el sistema de numeración descrito en el presente documento. A pesar de los diferentes límites, cada uno de estos sistemas tiene un determinado grado de superposición en lo que constituye las denominadas "regiones hipervariables" dentro de las secuencias variables. Las definiciones de CDR según estos sistemas pueden diferir, por lo tanto, en los ámbitos de longitud y límites con respecto a la región estructural adyacente. Véase, por ejemplo, Kabat (un enfoque basado en la variabilidad de secuencia de especies cruzadas), Chothia (un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo) y/o MacCallum (Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917.; y MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Otro criterio más para caracterizar el sitio de unión al antígeno es la definición de AbM utilizada por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). En la medida en que dos técnicas de identificación de residuos definan regiones de superposición, pero no regiones idénticas, se pueden combinar para definir una CDR híbrida. No obstante, se prefiere la numeración según el denominado sistema Kabat.

Generalmente, las CDR forman una estructura de bucle que se puede clasificar como una estructura canónica. La expresión "estructura canónica" se refiere a la conformación de la cadena principal que se adopta por los bucles de unión a antígeno (CDR). A partir de estudios estructurales comparativos, se ha descubierto que cinco de los seis bucles de unión a antígeno tienen solo un repertorio limitado de conformaciones disponibles. Cada estructura canónica puede caracterizarse por los ángulos de torsión del esqueleto polipeptídico. Los bucles correspondientes entre los anticuerpos pueden tener, por lo tanto, estructuras tridimensionales muy similares, a pesar de la alta variabilidad de la secuencia de aminoácidos en la mayoría de las partes de los bucles (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin y Thornton, J. Mol. Biol., 1996, 263: 800). Además, existe una relación entre la estructura de bucle adoptada y las secuencias de aminoácidos que la rodean. La conformación de una clase canónica particular se determina mediante la longitud del bucle y los residuos de aminoácidos que residen en posiciones clave dentro del bucle, así como dentro de la estructura conservada (es decir, fuera del bucle). Por lo tanto, la asignación a una clase canónica particular se puede realizar en base a la presencia de estos residuos de aminoácidos clave.

La expresión "estructura canónica" también puede incluir consideraciones sobre la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo, según lo catalogado por Kabat (Kabat et al., loc. cit.). El esquema (sistema) de numeración de Kabat es un patrón ampliamente adoptado para numerar los residuos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo de una forma coherente y es el esquema preferido aplicado en la presente invención como también se menciona en otra parte en el presente documento. También se pueden utilizar consideraciones estructurales adicionales para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por ejemplo, las diferencias no reflejadas completamente por la numeración de Kabat pueden describirse mediante el sistema de numeración de Chothia et al. y/o revelarse por medio de otras técnicas, por ejemplo, cristalografía y modelado computacional bidimensional o tridimensional. Por consiguiente, una secuencia de anticuerpo dada puede disponerse en una clase canónica que permita, entre otras cosas, identificar secuencias de chasis apropiadas (por ejemplo, basadas en el deseo de incluir una diversidad de estructuras canónicas en una biblioteca). La numeración de Kabat de las secuencias de aminoácidos de anticuerpos y las consideraciones estructurales descritas por Chothia et al., loc. cit., y sus implicaciones para interpretar los aspectos canónicos de la estructura del anticuerpo, se describen en la literatura. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para una revisión de la estructura del anticuerpo, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al. 1988.

La CDR3 de la cadena ligera y, en particular, la CDR3 de la cadena pesada pueden constituir los determinantes más importantes en la unión a antígeno dentro de las regiones variables de la cadena ligera y pesada. En algunas constructos de anticuerpo, la CDR3 de cadena pesada parece constituir el área principal de contacto entre el antígeno y el anticuerpo. Los esquemas de selección in vitro en los que se varía solo CDR3 se pueden utilizar para variar las propiedades de unión de un anticuerpo o determinar qué residuos contribuyen a la unión de un antígeno. Por lo tanto, la CDR3 es normalmente la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión a anticuerpo. La H3, por ejemplo, puede ser de solo dos residuos de aminoácidos o de más de 26 aminoácidos.

La secuencia de los genes de anticuerpos después del ensamblaje y la mutación somática es muy variada, y se estima que estos genes variados codifican 1010 moléculas diferentes de anticuerpos (Inmunoglobulina Genes, 2a ed., Eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). En consecuencia, el sistema inmunitario proporciona un repertorio de inmunoglobulinas. El término "repertorio" se refiere a al menos una secuencia de nucleótidos derivada totalmente o parcialmente de al menos una secuencia que codifica al menos una inmunoglobulina. La(s) secuencia(s) puede(n) generarse mediante reorganización in vivo de los segmentos V, D y J de cadenas pesadas, y los segmentos V y J de cadenas ligeras. Alternativamente, la(s) secuencia(s) puede(n) generarse a partir de una célula en respuesta a lo cual se produce un reordenamiento, por ejemplo, estimulación in vitro. Alternativamente, se puede obtener parte o la totalidad de la(s) secuencia(s) mediante corte y empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis y otros procedimientos; véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.565.332. Un repertorio puede incluir solo una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluidas las de una colección genéticamente diversa.

El término "biespecífico" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un constructor de anticuerpo que es "al menos biespecífico", es decir, comprende al menos un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión, en el que el primer dominio de unión se une a un antígeno o diana, y el segundo dominio de unión se une a otro antígeno o diana (a este respecto: CD3). En consecuencia, los constructos de anticuerpo según la invención comprenden especificidades para al menos dos antígenos o dianas diferentes. La expresión "constructor de anticuerpo biespecífico" de la invención también abarca constructos de anticuerpo multiespecíficos, tales como constructos de anticuerpo triespecíficos; incluyendo estos últimos tres dominios de unión, o constructos que tienen más de tres especificidades (por ejemplo, cuatro, cinco,...).

Dado que los constructos de anticuerpo según la invención son biespecíficos, no se producen de forma natural y son marcadamente diferentes de los productos de origen natural. Un constructor de anticuerpo "biespecífico" o inmunoglobulina "biespecífica" es por lo tanto un anticuerpo o inmunoglobulina híbrido artificial que tiene al menos dos sitios de unión distintos con especificidades diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una diversidad de procedimientos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990).

Los, al menos dos, dominios de unión y los dominios variables del constructor de anticuerpo de la presente invención pueden comprender o no enlazadores peptídicos (péptidos espaciadores). La expresión "enlazador peptídico" define según la presente invención una secuencia de aminoácidos mediante la cual las secuencias de aminoácidos de un dominio (variable y/o de unión) y otro dominio (variable y/o de unión) del constructor de anticuerpo de la invención están enlazadas entre sí. Una característica técnica esencial de dicho enlazador peptídico es que dicho enlazador peptídico no comprende ninguna actividad de polimerización. Entre los enlazadores peptídicos adecuados se encuentran los descritos en las patentes de Estados Unidos N° 4.751.180 y 4.935.233 o el documento WO 88/09344.

En caso de que se use un enlazador, este enlazador es preferentemente de una longitud y una secuencia suficientes para asegurar que cada uno de los dominios primero y segundo pueda, independientemente uno de otro, conservar sus especificidades de unión diferencial. Para los enlazadores peptídicos que conectan los, al menos dos, dominios de unión en el constructor de anticuerpo de la invención (o dos dominios variables) se prefieren aquellos enlazadores peptídicos que comprenden solo un número reducido de residuos de aminoácidos, por ejemplo 12 residuos de aminoácidos o menos. Por lo tanto, se prefieren enlazadores peptídicos de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 residuos de aminoácidos. Un enlazador peptídico previsto con menos de 5 aminoácidos comprende 4, 3, 2 o un aminoácido(s), prefiriéndose los enlazadores ricos en Gly. Un aminoácido "único" particularmente preferido en el contexto de dicho "enlazador peptídico" es Gly. En consecuencia, dicho enlazador peptídico puede consistir en el único aminoácido Gly. Otra forma de realización preferida de un enlazador peptídico se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir, Gly⁴Ser, o polímeros de los mismos, es decir (Gly4Ser)x, en los que x es 1 o un número entero superior. Las características de dicho enlazador peptídico, que comprenden la ausencia de la promoción de estructuras secundarias, son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, por Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) y Raag y Whitlow (fAs EB (1995) 9 (1), 73-80). Se prefieren los enlazadores peptídicos que tampoco promueven ninguna estructura secundaria. El enlace de dichos dominios entre sí se puede proporcionar, por ejemplo, mediante ingeniería genética, tal como se describe en los ejemplos. Los procedimientos para preparar constructos monocatenarios biespecíficos fusionados y unidos operativamente y expresarlos en células o bacterias de mamíferos son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, el documento WO 99/54440 o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001).

Las moléculas monocatenarias biespecíficas son conocidas en la técnica y se describen en el documento WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970., Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197., Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420­ 2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véanse, entre otros, la patente de Estados Unidos 4.946.778, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.) para producir constructos de anticuerpo monocatenarios que reconozcan específicamente una o varias dianas elegidas.

Se pueden obtener por ingeniería genética fragmentos variables bivalentes (también denominados divalentes) o biespecíficos monocatenarios (bi-scFvs o di-scFvs que tienen el formato (scFv)²) uniendo dos moléculas de scFv. Si estas dos moléculas de scFv tienen la misma especificidad de unión, la molécula resultante (scFv)² se denominará preferentemente bivalente (es decir, tiene dos valencias para el mismo epítope diana). Si las dos moléculas scFv tienen diferentes especificidades de unión, la molécula resultante (scFv)² se denominará preferentemente biespecífica. El enlace se puede realizar produciendo una única cadena peptídica con dos regiones VH y dos regiones VL, proporcionando un scFv en tándem (véase, por ejemplo, Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22 (5): 238-244). Otra posibilidad es la creación de moléculas scFv con péptidos enlazadores que sean demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas (por ejemplo, aproximadamente cinco aminoácidos), lo que obliga a los scFv a dimerizarse. Este tipo es conocido como diacuerpos (véase, por ejemplo, Hollinger, Philipp et al., (Julio de 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444­ 8.).

Los anticuerpos de dominio único comprenden simplemente un dominio variable de anticuerpo (monomérico) que es capaz de unirse selectivamente a un antígeno específico, independientemente de otras regiones o dominios V. Los primeros anticuerpos de dominio único se obtuvieron por ingeniería genética a partir de anticuerpos de cadena pesada que se encuentran en camélidos, y estos se denominan fragmentos V^hH. Los peces cartilaginosos también tienen anticuerpos de cadena pesada (IgNAR) a partir de los que pueden obtenerse anticuerpos de dominio único denominados fragmentos V^nar. Un enfoque alternativo consiste en dividir los dominios variables diméricos de inmunoglobulinas comunes, por ejemplo de seres humanos o de roedores, en monómeros obteniendo, por lo tanto, VH o VL como un Ab (anticuerpo) de dominio único. Aunque la mayor parte de las investigaciones sobre anticuerpos de dominio único se basan actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha demostrado que los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopes diana. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único se denominan sdAb, nanocuerpos o anticuerpos de un solo dominio variable.

Un (mAb de dominio único)² , por lo tanto, es un constructor de anticuerpo monoclonal compuesto por (al menos) dos anticuerpos monoclonales de dominio único, que se seleccionan individualmente del grupo que comprende VH, VL, V^hH y V^nar. El enlazador se encuentra preferentemente en forma de un enlazador peptídico. De forma similar, un "scFv-mAb de dominio único" es un constructor de anticuerpo monoclonal compuesto por al menos un anticuerpo de dominio único tal como se ha descrito anteriormente y una molécula de scFv tal como se ha descrito anteriormente. De nuevo, el enlazador se encuentra preferentemente en forma de un enlazador peptídico.

Las moléculas monocatenarias biespecíficas son conocidas en la técnica y se describen en el documento WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véanse, entre otros, la patente de Estados Unidos 4.946.778, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit., y Little (2009), loc. cit.) para producir constructos de anticuerpo monocatenarios que reconozcan específicamente una o varias diana(s) elegida(s).

Pueden obtenerse por ingeniería genética fragmentos variables bivalentes (también denominados divalentes) o biespecíficos monocatenarios (bi-scFvs o di-scFvs que tienen el formato (scFv)²) uniendo dos moléculas scFv. Si estas dos moléculas scFv tienen la misma especificidad de unión, la molécula resultante (scFv)² se denominará preferentemente bivalente (es decir, tiene dos valencias para el mismo epítope diana). Si las dos moléculas scFv tienen diferentes especificidades de unión, la molécula resultante (scFv)² se denominará preferentemente biespecífica. El enlace se puede realizar produciendo una única cadena peptídica con dos regiones VH y dos regiones VL, proporcionando un scFv en tándem (véase, por ejemplo, Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22 (5): 238-244). Otra posibilidad es la creación de moléculas scFv con péptidos enlazadores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen (por ejemplo, aproximadamente cinco aminoácidos), lo que obliga a los scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos (véase, por ejemplo, Hollinger, Philipp et al., (julio de 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8.).

Los anticuerpos de dominio único comprenden simplemente un dominio variable de anticuerpo (monomérico) que puede unirse selectivamente a un antígeno específico, independientemente de otras regiones o dominios V. Los primeros anticuerpos de dominio único se obtuvieron por ingeniería genética a partir de anticuerpos de cadena pesada que se encuentran en camélidos, y estos se denominan fragmentos V^hH. Los peces cartilaginosos también tienen anticuerpos de cadena pesada (IgNAR) a partir de los que puden obtenerse anticuerpos de dominio único denominados fragmentos V^nar. Un enfoque alternativo consiste en dividir los dominios variables diméricos de inmunoglobulinas comunes, por ejemplo de seres humanos o de roedores, en monómeros obteniendo, por lo tanto, VH o VL como un Ab de dominio único. Aunque la mayor parte de las investigaciones sobre anticuerpos de dominio único se basan actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha demostrado que los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopes diana. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único se denomminan sdAb, nanocuerpos o anticuerpos de un solo dominio variable.

Un (mAb de dominio único)2, por lo tanto, es un constructor de anticuerpo monoclonal compuesto por (al menos) dos anticuerpos monoclonales de dominio único, que se seleccionan individualmente del grupo que comprende VH, VL, V^hH y V^nar. El enlazador se encuentra preferentemente en forma de un enlazador peptídico. De forma similar, un "scFv-mAb de dominio único" es un constructor de anticuerpo monoclonal compuesto por al menos un anticuerpo de dominio único tal como se ha descrito anteriormente y una molécula de scFv tal como se ha descrito anteriormente. De nuevo, el enlazador se encuentra preferentemente en forma de un enlazador peptídico.

También se prevé que el constructor de anticuerpo de la divulgación tenga, además de su función de unirse al antígeno diana y CD3, una función adicional. En este formato, el constructor de anticuerpo es un constructor de anticuerpo trifuncional o multifuncional que se dirige a las células diana mediante la unión al antígeno diana, que media la actividad de las células T citotóxicas a través de la unión a CD3 y que proporciona una función adicional tal como un marcador (fluorescente, etc.), un agente terapéutico tal como una toxina o radionúclido, etc.

Las modificaciones covalentes del anticuerpo, generalmente, pero no siempre, se realizan postraduccionalmente. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes del constructor de anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácidos específicos del constructor de anticuerpo con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos N o C-terminales.

Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con a-haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-piridil-disulfuro de metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos de histidilo se derivatizan por reacción con pirocarbonato de dietilo a pH de 5,5-7,0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0. Los residuos terminales lisinilo y amino se hacen reaccionar con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción catalizada con transaminasa con glioxilato.

Los residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre los mismos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido a la alta pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos lisina y con el grupo arginina-epsilon-amino.

Se puede realizar la modificación específica de residuos de tirosilo, con particular interés en la introducción de marcadores espectrales en residuos de tirosilo, mediante reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan utilizando 125I o 1311 para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayo, siendo adecuado el procedimiento de cloramina T descrito anteriormente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), en las que R y R' son grupos alquilo opcionalmente diferentes, tales como 1 -ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los constructos de anticuerpo de la presente invención con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en una diversidad de procedimientos. Los agentes de reticulación que se utilizan comúnmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluidos ésteres disuccinimidílicos tales como 3,3'-ditiobis(propionato de succinimidilo), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizados tales como el 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo producen intermedios fotoactivables que son capaces de formar enlaces cruzados en presencia de luz. Alternativamente, se emplean matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes de Estados Unidos N23.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537 y 4.330.440 para la inmovilización de proteínas.

Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente dando los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquiera de las formas de estos residuos se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, p. 79-86), la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente de los constructos de anticuerpo incluido dentro del alcance de la presente invención comprende alterar el patrón de glicosilación de la proteína. Tal como se sabe en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácidos de glicosilación particulares, tal como se aborda más adelante), o la célula u organismo huésped en el que se produce la proteína. Más adelante se abordan sistemas de expresión particulares.

La glicosilación de polipéptidos está normalmente o bien ligada a N o bien ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, de la forma más habitual serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al constructor de anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos para que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación ligada a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia de inicio (para los sitios de glicosilación ligada a O). Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos de un constructor de anticuerpo se altera preferentemente a través de cambios en el nivel de ADN, de forma particular mediante mutación del ADN que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas de forma que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio para aumentar el número de restos carbohidrato en el constructor de anticuerpo es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren la producción de la proteína en una célula huésped que tenga capacidades de glicosilación para la glicosilación ligada a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el o los azúcar(es) puede(n) unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en el documento WO 87/05330, y por Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., p. 259-306.

La eliminación de los restos carbohidratos presentes en el constructor de anticuerpo de partida se puede realizar químicamente o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o a un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayor parte o la totalidad de los azúcares, excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras se deja el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos carbohidrato en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una diversidad de endo- y exoglicosidasas tal como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. La glicosilación en los sitios de glicosilación potenciales se puede evitar mediante el uso del compuesto tunicamicina tal como se describe por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glucósido.

En el presente documento se contemplan otras modificaciones del constructor de anticuerpo. Por ejemplo, otro tipo de modificación covalente del constructor de anticuerpo comprende enlazar el constructor de anticuerpo a varios polímeros no proteínicos, que incluyen, pero sin limitación, varios polioles tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, en la forma expuesta en las patentes de Estados Unidos N24.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Además, tal como se sabe en la técnica, las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar en varias posiciones dentro del constructor de anticuerpo, por ejemplo con el fin de facilitar la adición de polímeros tales como PEG.

En algunas formas de realización, la modificación covalente de los constructos de anticuerpo de la invención comprende la adición de una o más marcas. El grupo de marcado puede acoplarse al constructor a través de brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el potencial impedimento estérico. Se conocen diversos procedimientos para el marcado de proteínas en la técnica y se pueden utilizar en la realización de la presente invención. El término "marca" o "grupo de marcado" se refiere a cualquier marca detectable. En general, las marcas se clasifican en una diversidad de clases, según el ensayo en el que se van a detectar. Los ejemplos siguientes incluyen, pero sin limitación:

a) marcas isotópicas, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, tales como radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)

b) marcas magnéticas (por ejemplo, partículas magnéticas)

c) restos con actividad rédox

d) tinte óptico (incluidos, pero sin limitación, cromóforos, fósforos y fluoróforos) tales como grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos quimioluminiscentes y fluoróforos que pueden ser fluorescentes de "molécula pequeña" o fluorescentes proteicos

e) grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) f) grupos biotinilados

g) epítopes de polipéptidos predeterminados reconocidos por un comunicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopes, etc.)

Por "marca fluorescente" se entiende cualquier molécula que pueda detectarse a través de sus propiedades fluorescentes inherentes. Las marcas fluorescentes adecuadas incluyen, pero sin limitación, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde de malaquita, estilbeno, Lucifer Yellow, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIpY FL, lC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon green, los colorantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633 Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina y Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5. 5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). En Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland se describen colorantes ópticos adecuados, incluidos fluoróforos.

Las marcas fluorescentes proteicas adecuadas también incluyen, pero sin limitación, proteína fluorescente verde, incluyendo una especie de Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263: 802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Número de acceso de Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8a planta, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24: 462-471.; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150: 5408-5417), pgalactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl Acad Sci. U.S.A. 85: 2603-2607) y Renilla (documentos W092/15673, W095/07463, W098/14605, W098/26277, W099/49019, patentes de Estados Unidos N25292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558).

Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originariamente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se han encontrado en una diversidad de diferentes proteínas. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran péptidos de origen natural y derivados de los mismos que se dimerizan o se trimerizan. En la solicitud PCT W 0 94/10308 se describen ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles, y la cremallera de leucina derivada de la proteína surfactante pulmonar D (SPD) se describe por Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite una trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe por Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-78. En un enfoque, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden el fragmento de anticuerpo de antígeno diana o derivado fusionado con un péptido de cremallera de leucina se expresan en células huésped adecuadas, y los fragmentos de anticuerpo de antígeno diana oligoméricos solubles o derivados que se forman se recuperan del sobrenadante de cultivo.

El constructor de anticuerpo de la invención también puede comprender dominios adicionales, que son, por ejemplo, útiles en el aislamiento de la molécula o están relacionados con un perfil farmacocinético adaptado de la molécula. Los dominios útiles para el aislamiento de un constructor de anticuerpo pueden seleccionarse de entre motivos peptídicos o restos introducidos de forma secundaria, que pueden capturarse en un procedimiento de aislamiento, por ejemplo una columna de aislamiento. Formas de realización no limitantes de dichos dominios adicionales comprenden motivos peptídicos conocidos tales como etiqueta Myc, etiqueta HAT, etiqueta HA, etiqueta TAP, etiqueta GST, dominio de unión a quitina (CBD-tag), proteína de unión a maltosa (MBP-tag), etiqueta Flag, etiqueta Strep y variantes de los mismos (por ejemplo, etiqueta Strepll) y etiqueta His. Se prefieren todos los constructos de anticuerpo divulgados en el presente documento caracterizados por las CDR identificadas que comprendan un dominio de etiqueta His, que generalmente se conoce como una repetición de residuos de His consecutivos en la secuencia de aminoácidos de una molécula, preferentemente de seis residuos de His.

Las células T o linfocitos T son un tipo de linfocito (en sí mismo, un tipo de glóbulo blanco) que desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Existen varios subconjuntos de células T, cada uno con una función distinta. Las células T se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como células B y células NK, por la presencia de un receptor de células T (TCR) en la superficie celular. El TCR es responsable de reconocer antígenos unidos a moléculas del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) y está compuesto por dos cadenas de proteínas diferentes. En el 95% de las células T, el TCR consiste en una cadena alfa (a) y una beta (p). Cuando el TCR se acopla con el péptido antigénico y el MHC (complejo péptido/MHC), el linfocito T se activa a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores, moléculas adaptadoras especializadas y factores de transcripción activados o liberados.

El complejo receptor CD3 es un complejo proteico y está compuesto por cuatro cadenas. En los mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3^y (gamma), una cadena CD35 (delta) y dos cadenas CD3s (épsilon). Estas cadenas se asocian con el receptor de células T (TCR) y la denominada cadena Z (zeta) para formar el complejo receptor de células T CD3 y para generar una señal de activación en los linfocitos T. Las cadenas CD3y (gamma), CD35 (delta) y CD3s (épsilon) son proteínas de la superficie celular muy relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un único dominio de inmunoglobulina extracelular. Las colas intracelulares de las moléculas CD3 contienen un único motivo conservado conocido como motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM de forma abreviada, que es esencial para la capacidad de señalización del TCR. La molécula CD3 épsilon es un polipéptido que en los humanos está codificado por el gen CD3E que reside en el cromosoma 11. La secuencia de un dominio extracelular de CD3 épsilon humano preferido se muestra en la SEQ ID NO: 605, y se representa el epítope de unión a CD3 más preferido correspondiente a los residuos de aminoácido 1-27 del dominio extracelular de CD3 épsilon humano en la SEQ ID NO: 604.

La lisis redirigida de células diana a través del reclutamiento de células T por un constructor de anticuerpo multiespecífico, al menos biespecífico, implica la formación de sinapsis citolítica y el suministro de perforina y granzimas. Las células T acopladas son capaces de realizar la lisis de células diana en serie y no se ven afectadas por los mecanismos de escape inmunitario que interfieren con el procesamiento y la presentación del antígeno peptídico, o la diferenciación de las células T clonales; véase, por ejemplo, el documento WO 2007/042261.

La citotoxicidad mediada por constructos de anticuerpo biespecíficos se puede medir de varias formas. Las células efectoras pueden ser, por ejemplo, células T CD8 positivas (humanas) enriquecidas estimuladas o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) no estimuladas (humanas). Si las células diana son originarias de macaco o se expresan o se transfectan con antígeno de célula diana de macaco, las células efectoras también deben ser originarias de macaco tal como una línea de células T de macaco, por ejemplo 4119LnPx. Las células diana deberán expresar (al menos el dominio extracelular de) un antígeno de células diana, por ejemplo un antígeno de células diana humano o de macaco. Las células diana pueden ser una línea celular (tal como CHO) que se transfecta de forma estable o transitoria con el antígeno de la célula diana, por ejemplo un antígeno de células diana humano o de macaco. Alternativamente, las células diana pueden ser una línea celular expresadora natural positiva al antígeno de la célula diana, tal como una línea celular de cáncer humano. Por lo general, se espera que los valores de CE50 sean más bajos con las líneas celulares diana que expresan niveles más altos de antígeno de la célula diana en la superficie celular. La relación de efector con respecto a la célula diana (E:T) es habitualmente de aproximadamente 10:1, pero también puede variar. La actividad citotóxica de constructos de anticuerpo biespecíficos se puede medir en un ensayo de liberación de 51cromo (tiempo de incubación de aproximadamente 18 horas) o en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (tiempo de incubación de aproximadamente 48 horas). También son posibles modificaciones del tiempo de incubación del ensayo (reacción citotóxica). Otros procedimientos para medir la citotoxicidad son bien conocidos por los expertos y comprenden ensayos MTT o MTS, ensayos basados en ATP, incluidos ensayos bioluminiscentes, el ensayo de sulforrodamina B (SRB), el ensayo WST, el ensayo clonogénico y la tecnología ECIS.

La actividad citotóxica mediada por constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención se mide preferentemente en un ensayo de citotoxicidad basado en células. Está representado por el valor de CE⁵⁰ , que corresponde a la concentración eficaz semimáxima (concentración del constructor de anticuerpo que induce una respuesta citotóxica a medio camino entre la línea base y el máximo). Preferentemente, el valor de CE50 de los constructos de anticuerpo biespecíficos es < 20.000 pg/ml, de forma más preferida < 5000 pg/ml, de forma incluso más preferida < 1000 pg/ml, de forma incluso más preferida < 500 pg/ml, de forma incluso más preferida < 350 pg/ml, de forma incluso más preferida < 250 pg/ml, de forma incluso más preferida < 100 pg/ml, de forma incluso más preferida < 50 pg/ml, de forma incluso más preferida < 10 pg/ml, y de la forma más preferida <5 pg/ml.

Cualquiera de los valores de CE⁵⁰ dados anteriormente puede combinarse con cualquiera de los escenarios indicados de un ensayo de citotoxicidad basado en células, por ejemplo, en línea con los procedimientos descritos en el ejemplo adjunto. Por ejemplo, cuando se utilizan células T positivas a CD8 (humanas) o una línea de células T de macaco como células efectoras, el valor de CE⁵⁰ del constructor de anticuerpo biespecífico de la invención (por ejemplo, un constructor biespecífico de antígeno de célula diana/CD3) es preferentemente < 1000 pg/ml, de forma más preferida < 500 pg/ml, de forma incluso más preferida < 250 pg/ml, de forma incluso más preferida < 100 pg/ml, de forma incluso más preferida < 50 pg/ml, de forma incluso más preferida < 10 pg/ml y de la forma más preferida < 5 pg/ml. Si en este ensayo, las células diana son células (humanas o de macaco) transfectadas con el antígeno diana (por ejemplo, antígeno de la célula diana), tales como células CHO, el valor de CE⁵⁰ del constructor de anticuerpo biespecífico es preferentemente < 150 pg/ml, de forma más preferida < 100 pg/ml, de forma incluso más preferida < 50 pg/ml, de forma incluso más preferida < 30 pg/ml, de forma incluso más preferida < 10 pg/ml y de la forma más preferida < 5 pg/ml. Si las células diana son una línea celular expresadora natural positiva (por ejemplo, del antígeno de la célula diana), entonces el valor de CE⁵⁰ es preferentemente < 350 pg/ml, de forma más preferida < 250 pg/ml, de forma incluso más preferida < 200 pg/ml, de forma incluso más preferida < 100 pg/ml, de forma incluso más preferida < 150 pg/ml, de forma incluso más preferida < 100 pg/ml y de la forma más preferida < 50 pg/ml, o inferior. Cuando se utilizan PBMC (humanas) como células efectoras, el valor de CE⁵⁰ del constructor de anticuerpo biespecífico es preferentemente < 1000 pg/ml, de forma más preferida < 750 pg/ml, de forma más preferida < 500 pg/ml, de forma incluso más preferida < 350 pg/ml, de forma incluso más preferida < 250 pg/ml, de forma incluso más preferida < 100 pg/ml y de la forma más preferida < 50 pg/ml, o inferior.

Preferentemente, los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención no inducen/median la lisis o no inducen/median esencialmente la lisis de células negativas al antígeno de la célula diana, tales como las células CHO. Las expresiones "no inducen la lisis", "no inducen esencialmente la lisis", "no median la lisis" o "no median esencialmente la lisis" significan que los constructos de un anticuerpo de la presente invención no inducen ni median una lisis de más de 30 %, preferentemente de no más del 20%, de forma más preferida de no más del 10%, de forma particularmente preferida de no más del 9%, 8%, 7%, 6% o 5% de células negativas al antígeno de células diana, estableciéndose la lisis de una línea celular positiva para el antígeno de la célula diana en el 100%. Esto generalmente se aplica a concentraciones del constructor de anticuerpos de hasta 500 nM. El experto sabe cómo medir la lisis celular sin más. Además, la presente memoria descriptiva enseña instrucciones específicas sobre cómo medir la lisis celular.

La diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y la dimérica de constructos de anticuerpo biespecíficos individuales se denomina "brecha de potencia". Esta brecha de potencia puede calcularse, por ejemplo, como cociente entre valores de CE⁵⁰ de la forma monomérica y dimérica de la molécula. Las brechas de potencia de los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención son preferentemente < 5, de forma más preferida < 4, de forma incluso más preferida < 3, de forma incluso más preferida < 2 y de la forma más preferida < 1.

Al igual que el segundo dominio de unión, el o los primeros (o cualesquiera otros) dominio(s) de unión del constructor de anticuerpo de la invención es o son preferentemente específicos de especies cruzadas para miembros del orden de primates de mamíferos. Los dominios de unión a CD3 específicos de especies cruzadas se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008/119567. Según una forma de realización, el primer y el segundo dominio de unión, además de la unión al antígeno de la célula diana humana y al CD3 humano, respectivamente, también se unirán al antígeno de la célula diana/CD3 de primates, incluidos (pero sin limitación) primates del nuevo mundo (tales como Callithrix jacchus, Saguinus Edipo o Saimirí sciureus), primates del viejo mundo (tales como babuinos y macacos), gibones y homininos no humanos.

En un aspecto de la invención, el primer dominio de unión se une a CDH19 humano (SEQ ID NO: 606) y además se une a CDH19 de macaco, tal como CDH19 de Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 607). La afinidad del primer dominio de unión por CDH19 de macaco es preferentemente < 15 nM, de forma más preferida < 10 nM, de forma incluso más preferida < 5 nM, de forma incluso más preferida < 1 nM, de forma incluso más preferida < 0,5 nM, de forma incluso más preferida < 0,1 nM y de la forma más preferida < 0,05 nM o incluso < 0,01 nM.

Preferentemente, la brecha de afinidad de los constructos de anticuerpo según la invención para unirse a su antígeno diana de macaco frente al humano, por ejemplo CDH19 de macaco frente a CDH19 humano [maCDH19:huCDH19] se encuentra entre 0,1 y 10, de forma más preferida entre 0,2 y 5, de forma incluso más preferida entre 0,3 y 2,5, de forma incluso más preferida entre 0,4 y 2, y de la forma más preferida entre 0,5 y 1.

En una forma de realización, la invención proporciona un constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico, en el que la albúmina sérica es una albúmina sérica humana o una variante de unión a FcRn optimizada. Se describen variantes de albúmina humana, por ejemplo, en el documento WO 2014/072481.

En una forma de realización del constructor de anticuerpo de la invención, la albúmina sérica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 a 12 y 608 a 628.

También en una forma de realización del constructor de anticuerpo de la invención, la albúmina sérica está unida al constructor de anticuerpo a través de un enlazador peptídico. Se prefiere que el enlazador peptídico tenga la secuencia de aminoácidos (GGGGS)n(SEQ ID NO: 13)n, (PGGGGS)n(SEQ ID NO: 2707)n o (PGGDGS)n(SEQ ID NO: 2708)n, en las que "n" es un número entero en el intervalo de 1 a 5. Más preferido es que "n" sea un número entero en el intervalo de 1 a 3, y de la forma más preferida "n" es 1 o 2.

En una forma de realización del constructor de anticuerpo de la invención, el segundo dominio de unión comprende una región VL que tiene CDR-L1-L3 y una región VH que tiene CDR-H1-H3 seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 14-16 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 17-19;

(b) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 26-28 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 29-31;

(c) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 38-40 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 41-43;

(d) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 50-52 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 53-55;

(e) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 62-64 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 65-67;

(f) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 74-76 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 77-79;

(g) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: ^{8 6 - 8 8} y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 89-91;

(h) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 98-100 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 101-103;

(i) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 110-112 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 113-115 y

(j) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 122-124 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 125-127.

En una forma de realización del constructor de anticuerpo de la invención, el segundo dominio de unión comprende pares de cadenas VH y VL seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 20 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 22;

(b) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 32 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 34;

(c) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 44 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 46;

(d) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 56 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 58;

(e) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: ^{6 8} y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 70;

(f) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 80 y una cadena VL tal como se representa en la

SEQ ID NO: 82;

(g) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 92 y una cadena VL tal como se representa en la

SEQ ID NO: 94;

(h) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 104 y una cadena VL tal como se representa en la

SEQ ID NO: 106;

(i) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 116 y una cadena VL tal como se representa en la

SEQ ID NO: 118 y

(j) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 128 y una cadena VL tal como se representa en la

SEQ ID NO: 130.

También en una forma de realización del constructor de anticuerpo de la invención, el segundo dominio de unión

comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, SEQ ID

NO: 48, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 120 o SEQ

ID NO: 132.

En una forma de realización adicional del constructor de anticuerpo de la invención, el primer dominio de unión se

une a un antígeno de superficie de la célula diana, que es un antígeno tumoral o un antígeno vírico de la superficie

de una célula huésped infectada. En una forma de realización preferida, el antígeno tumoral se selecciona del grupo

que consiste en CDH19, MSLN, DLL3, FLT3, EGFRvIII, CD33, ^c D19, CD20 y CD70. Los antígenos víricos

preferidos se seleccionan de un grupo que consiste en Influenza A, CMV y VIH.

La invención proporciona además un constructor de anticuerpo, comprendiendo el constructor de anticuerpo una

secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) SEQ ID NO: 134-180;

(b) SEQ ID NO: 181-227;

(c) SEQ ID NO: 228-274;

(d) SEQ ID NO: 275-321;

(e) SEQ ID NO: 322-368;

(f) SEQ ID NO: 369-415;

(g) SEQ ID NO: 416-462;

(h) SEQ ID NO: 463-509;

(i) SEQ ID NO: 510-556 y

(j) SEQ ID NO: 557-603.

La invención también proporciona un constructor de anticuerpo, comprendiendo el constructor de anticuerpo los

elementos siguientes partiendo del extremo N-terminal:

(a) un scFv que se une al antígeno de superficie de la célula diana que tiene una secuencia de aminoácidos

seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 629-675, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764,

774 , 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 894, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984,

994, 1004, 1014, 1024 , 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1104, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164,

1174, 1184, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274 , 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354,

1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534,

1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1674, 1684, 1694, 1704, 1714, 1724,

^{1 7 3 4} , ^{1 7 4 4} , ^{1 7 5 4} , 1764, 1774 , 1784, 1794, 1804, 1814, 1824, 1834, 1844, 1854, 1864, 1874, 1894, 1894, 1904,

1914, 1924, 1944, 1954, 1964, 1974, 2004, 2014, 2014, 2024, 2034, 2044 , 2054, 2064, 2074, 2084, 2094, 2104,

2114, 2124, 2134, 2144, 2154, 2164, 2174, 2184, 2194, 2204, 2214, 2224, 2234, 2244, 2254, 2264, 2274, 2284, 2304, 2314, 2324, 2334, 2354, 2364, 2374, 2384, 2394, 234, 2404, 2414, 2424, 2434, 2444, 2454, 2464, 2474,

2484, 2494, 2504, 2514, 2524, 2534, 2544, 2554, 2564, 2574, 2584, 254, 2604, 2614, 2624, 2634, 2644, 2654,

2664, 2674, 2674, 2684, 2694 y 2704;

(b) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13 y 2707-2709;

(c) un scFv que se une al antígeno de superficie de célula T CD3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132 y 2706;

(d) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13 y 2707-2709;

(e) una albúmina sérica que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4 a 12 y 608 a 628; y

(f) opcionalmente una etiqueta His.

Se prefiere particularmente que los elementos definidos en los puntos (a) a (f) anteriores estén dispuestos en esta secuencia desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal del constructor de anticuerpo.

También se contemplan modificaciones de la secuencia de aminoácidos de los constructos de anticuerpo descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del constructor de anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos de los constructos de anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico de los constructos de anticuerpo, o por síntesis de péptidos. Todas las modificaciones de la secuencia de aminoácidos descritas a continuación deberán dar como resultado un constructor de anticuerpo que aún conserva la actividad biológica deseada (unión al antígeno de la célula diana y al CD3) de la molécula parental no modificada.

El término "aminoácido" o la expresión "residuo de aminoácido" se refieren normalmente a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparagina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (He o I): leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V), aunque se pueden utilizar aminoácidos modificados, sintéticos o raros, según se desee. En general, los aminoácidos pueden agruparse como los que poseen una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, Asp, Glu); una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar sin carga (por ejemplo, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr).

Las modificaciones de aminoácidos incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los constructos de anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se realiza para llegar al constructor final, siempre que el constructor final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos postraduccionales de los constructos de anticuerpo, tales como un cambio en el número o la posición de los sitios de glicosilación.

Por ejemplo, pueden insertarse o eliminarse 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos en cada una de las CDR (por supuesto, dependiendo de su longitud), mientras que se pueden insertar o eliminar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos en cada una de las FR. Preferentemente, las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que varían en su longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intra-secuencia de residuos de aminoácidos sencillos o múltiples. Una variante de inserción del constructor de anticuerpo de la invención incluye la fusión al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del constructor de anticuerpo a una enzima o una fusión a un polipéptido que aumenta la semivida en suero del constructor de anticuerpo.

Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las CDR de la cadena pesada y/o ligera, en particular las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR en la cadena pesada y/o ligera. Las sustituciones son preferentemente sustituciones conservativas tal como se describen en el presente documento. Preferentemente, pueden sustituirse 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos en una CDR, mientras que pueden sustituirse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos en las regiones estructurales (FR), dependiendo de la longitud de la CDR o la FR. Por ejemplo, si una secuencia de CDR abarca 6 aminoácidos, se prevé que se sustituyan uno, dos o tres de estos aminoácidos. De forma similar, si una secuencia de CDR abarca 15 aminoácidos, se prevé que se sustituyan uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de estos aminoácidos.

Un procedimiento útil para la identificación de determinados residuos o regiones de los constructos de anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" tal como se describe por Cunningham y Wells en Science, 244: 1081-1085 (1989). A este respecto, se identifica un residuo o grupo de residuos diana dentro del constructor de anticuerpo (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplaza por un aminoácido neutro o cargado negativamente (de la forma más preferida alanina o polialanina) para que afecte a la interacción de los aminoácidos con el epítope.

Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan posteriormente mediante la introducción de variantes adicionales o de otras variantes en los sitios de sustitución. Así, aunque el sitio o la región para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no precisa estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar u optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar mutagénesis de barrido de alanina o aleatoria en un codón o una región diana, y las variantes de constructor de anticuerpo expresado se criban para determinar la combinación óptima de actividad deseada. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis por PCR. El cribado de los mutantes se realiza mediante ensayos de actividades de unión al antígeno diana.

En general, si los aminoácidos están sustituidos en una o más o todas las CDR de la cadena pesada y/o ligera, se prefiere que la secuencia "sustituida" obtenida posteriormente sea al menos el 60%, de forma más preferida el 65%, de forma incluso más preferida el 70%, de forma particularmente preferida el 75%, de forma más particularmente preferida el 80%, idéntica a la secuencia de CDR "original". Esto significa que depende de la longitud de la CDR en qué grado es idéntica a la secuencia "sustituida". Por ejemplo, una CDR que tiene 5 aminoácidos es preferentemente el 80% idéntica a su secuencia sustituida si tiene al menos un aminoácido sustituido. En consecuencia, las CDR del constructor de anticuerpo pueden tener diferentes grados de identidad con sus secuencias sustituidas, por ejemplo, CDRL1 puede tener el 80%, mientras que CDRL3 puede tener el 90%.

Las sustituciones (o reemplazos) preferidas son sustituciones conservativas. Sin embargo, se prevé cualquier sustitución (incluida una sustitución no conservativa o una o más de las "sustituciones ejemplares" enumeradas en la tabla ¹ , a continuación) siempre que el constructor de anticuerpo conserve su capacidad para unirse al antígeno de la célula diana a través del primer dominio de unión y a CD3 épsilon a través del segundo dominio de unión y/o sus CDR poseen una identidad con respecto a la secuencia sustituida posterior (siendo al menos el 60%, de forma más preferida el 65%, de forma incluso más preferida el 70%, de forma particularmente preferida el 75%, de forma más particularmente preferida el 80%, idéntica a la secuencia de CDR "original").

Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la tabla A, o como se describe más adelante con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos se criban con respecto a una característica deseada.

Tabla A: Sustituciones de aminoácidos

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del constructor de anticuerpo de la presente invención se realizan seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre la conservación de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en la zona de la sustitución tal como, por ejemplo, una lámina o una conformación helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (⁶ ) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un elemento de una de estas clases por otra clase. Cualquier resto de cisteína que no esté involucrado en el mantenimiento de la conformación adecuada del constructor de anticuerpo puede sustituirse, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir una reticulación aberrante. Por el contrario, se puede(n) añadir uno o varios enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Para las secuencias de aminoácidos, la identidad y/o la similitud de secuencia se determinan mediante el uso de técnicas estándar conocidas en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, el algoritmo de alineamiento de identidad de secuencia de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad Sci. U.S.A. 85:2444, implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de genética de Wisconsin (Wisconsin Genetics Software Package), Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12: 387-395, preferentemente utilizando las configuraciones predeterminadas, o por inspección. Preferentemente, el porcentaje de identidad se calcula mediante FastDB en base a los parámetros siguientes: penalización por falta de coincidencia de ¹ ; penalización por hueco de ¹ ; penalización por tamaño de hueco de 0,33; y penalización de unión de 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineamientos progresivos por pares. También puede trazar un árbol que muestre las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear el alineamiento. PILEUP utiliza una simplificación del procedimiento de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35: 351-360; el procedimiento es similar al descrito por Higgins y Sharp, 1989, CABIOS 5: 151-153. Los parámetros útiles de PILEUP incluyen un peso de hueco predeterminado de 3,00, un peso de longitud de hueco predeterminado de 0,10 y huecos terminales ponderados.

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito por: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; y Karin et al., 1993, Proc. Nati Acad Sci. USA 90: 5873­ 5787. Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 que se obtuvo por Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266: 460-480. WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayor parte de los cuales están configurados en los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se configuran con los siguientes valores: intervalo de superposición = 1, fracción de superposición = 0,125, umbral de palabra (T) = II. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por medio del programa mismo en función de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular en la que se busca la secuencia de interés; no obstante, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad.

Un algoritmo adicional útil es gapped BLAST tal como se comunica por Altschul et al., 1993, Nucl. Acidos Res. 25: 3389-3402. Gapped BLAST utiliza puntuaciones de sustitución BLOSUM-62; parámetro umbral T establecido en 9; el procedimiento de dos aciertos para desencadenar extensiones sin huecos, carga longitudes de huecos de k a un coste de 10 k; Xu establecido en 16 y Xg establecido en 40 para la etapa de búsqueda en la base de datos y en 67 para la etapa de salida de los algoritmos. Los alineamientos con huecos se desencadenan mediante una puntuación correspondiente a aproximadamente ^{2 2} bits.

En general, la homología, la similitud o la identidad de aminoácidos entre las CDR de variantes individuales son al menos el 60% con respecto a las secuencias representadas en el presente documento, y más típicamente presentan homologías o identidades preferentemente crecientes de al menos el 65% o el 70%, de forma más preferida de al menos el 75% o el 80%, de forma incluso más preferida de al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y casi el 100%. De forma similar, el "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a la secuencia de ácido nucleico de las proteínas de unión identificadas en el presente documento se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de nucleótidos en la secuencia codificante del constructor de anticuerpo. Un procedimiento específico utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 ajustado a los parámetros predeterminados, estando el intervalo de superposición y la fracción de superposición establecidos en 1 y 0,125, respectivamente.

En general, la homología, la similitud o la identidad de secuencia de ácido nucleico entre las secuencias de nucleótidos que codifican CDR variantes individuales y las secuencias de nucleótidos representadas en el presente documento son al menos el 60%, y más normalmente presentan homologías o identidades preferentemente crecientes de al menos el 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, ^{8 6} %, 87%, ^{8 8} %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, y casi el ^{1 0 0} %. Por lo tanto, una "CDR variante" es una con la homología, similitud o identidad especificada con respecto a la CDR parental de la invención, y comparte una función biológica, que incluye, pero sin limitación, al menos el 60%, 65%, 70%, 75%. %, 80%, 81%, ^{8 2} %, 83%, 84%, 85%, ^{8 6} %, 87%, ^{8 8} %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la especificidad y/o actividad de la CDR parental.

Además, se prevé que los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención muestren eficacia terapéutica o actividad antitumoral. Esto puede evaluarse, por ejemplo, en un estudio tal como se describe en el ejemplo siguiente de un modelo de xenoinjerto de tumor humano en etapa avanzada:

El día 1 del estudio, 5 x 10⁶ células de una línea celular de cáncer positiva al antígeno de célula diana humana se inyectan por vía subcutánea en el flanco dorsal derecho de ratones NOD/SCID hembra. Cuando el volumen medio del tumor alcanza aproximadamente 100 mm3, se transplantan células T positivas a CD3 humanas expandidas in vitro a los ratones mediante la inyección de aproximadamente ² x ^{1 0 7} células en la cavidad peritoneal de los animales. Los ratones del grupo de control de vehículo 1 no reciben células efectoras y se utilizan como control no trasplantado para su comparación con el grupo de control de vehículo ² (que recibe células efectoras) para realizar un seguimiento del efecto de las células T solas sobre el crecimiento del tumor. El tratamiento con anticuerpos comienza cuando el volumen medio del tumor alcanza aproximadamente 200 mm3. El tamaño medio del tumor de cada grupo de tratamiento el día del inicio del tratamiento no debe ser estadísticamente diferente de cualquier otro grupo (análisis de varianza). Los ratones se tratan con 0,5 mg/kg/día de un constructor de anticuerpo biespecífico para antígeno de célula diana/CD3 mediante inyección en embolada intravenosa durante aproximadamente 15 a 20 días. Los tumores se miden mediante un calibre durante el estudio y el progreso se evalúa mediante comparación intergrupal de volúmenes de tumores (TV). La inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] se determina calculando TV como T/C% = 100 x (mediana de TV del grupo analizado)/(mediana de TV del grupo de control 2).

El experto sabe cómo modificar o adaptar determinados parámetros de este estudio, tales como el número de células tumorales inyectadas, el sitio de inyección, el número de células T humanas trasplantadas, la cantidad de constructos de anticuerpo biespecíficos que debe administrarse y la agenda temporal, mientras se alcance aún un resultado significativo y reproducible. Preferentemente, la inhibición del crecimiento del tumor T/C [%] es < 70 o < 60, de forma más preferida < 50 o < 40, de forma incluso más preferida < 30 o < 20 y de la forma más preferida < 10 o < 5 o incluso < 2,5.

En una forma de realización, los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención muestran altos rendimientos monoméricos en condiciones de escala de investigación estándar, por ejemplo, en un proceso de purificación estándar de dos etapas. Preferentemente, el rendimiento monomérico de los constructos de anticuerpo según la invención es > 0,25 mg/l de sobrenadante, de forma más preferida > 0,5 mg/l, de forma incluso más preferida > 1 mg/l, y de la forma más preferida > 3 mg/l de sobrenadante.

Asimismo, puede determinarse el rendimiento de las isoformas de constructor de anticuerpo dimérico y el porcentaje de monómeros (es decir, monómero:(monómero dímero) de los constructos de anticuerpo. La productividad de los constructos de anticuerpo monoméricos y diméricos y el porcentaje de monómeros calculado pueden obtenerse, por ejemplo, en la etapa de purificación SEC del sobrenadante de cultivo a partir de la producción a escala de investigación estandarizada en botellas de rodillos. En una forma de realización, el porcentaje de monómero de los constructos de anticuerpo es > 80%, de forma más preferida > 85%, de forma incluso más preferida > 90%, y de la forma más preferida > 95%.

En una forma de realización adicional, el porcentaje de identidad con respecto a la línea germinal humana de los constructos de anticuerpo según la invención es > 70% o > 75%, de forma más preferida > 80% o > 85%, de forma incluso más preferida > 90%, y de la forma más preferida > 95%. Se cree que la identidad con respecto a los productos génicos de la línea germinal de anticuerpos humanos es una característica importante para reducir el riesgo de que las proteínas terapéuticas desencadenen una respuesta inmunitaria contra el fármaco en el paciente durante el tratamiento. Hwang & Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) demuestran que la reducción de porciones no humanas de constructos de anticuerpo farmacológicos conduce a una disminución del riesgo de inducir anticuerpos anti-fármaco en los pacientes durante el tratamiento. Mediante comparación de un número exhaustivo de fármacos de anticuerpo evaluados clínicamente y los datos de inmunogenicidad respectivos, se muestra la tendencia de que la humanización de las regiones V de los anticuerpos hace que la proteína sea menos inmunogénica (promedio 5,1% de los pacientes) que los anticuerpos que portan regiones V no humanas no alteradas (media 23,59% de los pacientes). Por lo tanto, es deseable un mayor grado de identidad con respecto a las secuencias humanas para productos terapéuticos de proteínas basados en la región V en forma de constructos de anticuerpo. Para este propósito de determinar la identidad de la línea germinal, las regiones V de VL pueden alinearse con las secuencias de aminoácidos de los segmentos V y los segmentos J de la línea germinal humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) utilizando el programa informático Vector NTI y la secuencia de aminoácidos calculada dividiendo los residuos de aminoácidos idénticos por el número total de residuos de aminoácidos de la VL en porcentaje. Lo mismo puede aplicarse a los segmentos VH (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) con la excepción de que la VH CDR3 puede excluirse debido a su alta diversidad y la falta de asociados de alineamiento de VH CDR3 de la línea germinal humana existente.

Se pueden utilizar técnicas recombinantes para aumentar la identidad de secuencia con respecto a genes de la línea germinal del anticuerpo humano.

En una forma de realización, los constructos de anticuerpo tienen una estabilidad en plasma preferida (relación de CE50 con plasma a CE50 sin plasma) de < 5, de forma más preferida < 4, de forma incluso más preferida < 3, y de la forma más preferida < 2. La estabilidad en plasma de un constructor de anticuerpo se puede evaluar mediante la incubación del constructor en plasma humano a 37 °C durante 24 horas, seguida de la determinación de CE50 en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51. Las células efectoras en el ensayo de citotoxicidad se pueden estimular con células T positivas a CD8 humanas enriquecidas. Las células diana pueden ser, por ejemplo, células CHO transfectadas con el antígeno diana, por ejemplo, CDH19. La relación de célula efectora con respecto a célula diana (E:T) se puede elegir como 10:1. El plasma humano reunido utilizado para este propósito se deriva de la sangre de donantes sanos recogida mediante jeringas recubiertas con EDTA. Los componentes celulares se eliminan por centrifugación y la fase de plasma superior se recoge y subsiguientemente se reúne. Como control, los constructos de anticuerpo se diluyen inmediatamente antes del ensayo de citotoxicidad en medio RPMI-1640. La estabilidad en plasma se calcula como la relación de CE50 (después de la incubación del plasma) con respecto a CE50 (control).

Se prefiere que la conversión de monómero a dímero de los constructos de anticuerpo de la invención sea reducida. La conversión puede medirse en diferentes condiciones y analizarse mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento. Por ejemplo, la incubación de las isoformas monoméricas de los constructos de anticuerpo se puede llevar a cabo durante 7 días a 37 °C y a concentraciones de, por ejemplo, 100 pg/ml o 250 pg/ml en una incubadora. En estas condiciones, se prefiere que los constructos de anticuerpo de la invención muestren un porcentaje dimérico que sea < 5%, de forma más preferida < 4%, de forma incluso más preferida < 3%, de forma incluso más preferida < 2,5%, de forma incluso más preferida < 2% , de forma incluso más preferida < 1,5% y de la forma más preferida < 1%.

También se prefiere que los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención se presenten con una conversión de dímero muy baja después de una serie de ciclos de congelación/descongelación. Por ejemplo, el monómero de constructor de anticuerpo se ajusta a una concentración de 250 pg/ml, por ejemplo, en un tampón de ejecución de SEC y se someten a tres ciclos de congelación/descongelación (congelación a -80 °C durante 30 min seguida de descongelación durante 30 min a temperatura ambiente), seguidos de SEC de alto rendimiento para determinar el porcentaje de constructor de anticuerpo inicialmente monomérico, que se había convertido en constructor de anticuerpo dimérico. Preferentemente, los porcentajes diméricos de los constructos de anticuerpo biespecíficos son < 5%, de forma más preferida < 4%, de forma incluso más preferida < 3%, de forma incluso más preferida < 2,5%, de forma incluso más preferida < 2%, de forma incluso más preferida < 1,5% y de la forma más preferida < 1%, por ejemplo, después de tres ciclos de congelación/descongelación.

Los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención muestran preferentemente una termoestabilidad favorable con temperaturas de fusión superiores a 60 °C. Este parámetro se puede determinar de la forma siguiente: se determinan curvas de temperatura de fusión por calorimetría de barrido diferencial (DSC) para determinar las estabilidades de proteínas biofísicas intrínsecas de los constructos de anticuerpo. Estos experimentos se realizan utilizando un dispositivo VP-DSC MicroCal LLC (Northampton, MA, Estados Unidos). La captación de energía de una muestra que contiene un constructor de anticuerpo se registra de 20 °C a 90 °C en comparación con una muestra que contiene solo el tampón de formulación. Los constructos de anticuerpo se ajustan a una concentración final de 250 pg/ml, por ejemplo en tampón de ejecución de SEC. Para registrar la curva de fusión respectiva, la temperatura general de la muestra se incrementa gradualmente. A cada temperatura T se registra la captación de energía de la muestra y la referencia del tampón de formulación. La diferencia en la captación de energía Cp (kcal/mol/°C) de la muestra menos la referencia se representa en función de la temperatura correspondiente. La temperatura de fusión se define como la temperatura en el primer máximo de captación de energía.

En una forma de realización adicional, el constructor de anticuerpo según la invención es estable a pH ácido. Cuanto más tolerante se comporte el constructor de anticuerpo a un pH no fisiológico tal como un pH de 5,5 (un pH que se requiere para ejecutar, por ejemplo, una cromatografía de intercambio catiónico), mayor será la recuperación del constructor de anticuerpo eluido desde una columna de intercambio iónico con respecto a la cantidad total de proteína cargada. La recuperación del constructor de anticuerpo de una columna de intercambio iónico (por ejemplo, catiónico) a pH 5,5 es preferentemente > 30%, de forma más preferida > 40%, de forma más preferida > 50%, de forma incluso más preferida > 60%, de forma incluso más preferida > 70%, de forma incluso más preferida > 80% y de la forma más preferida > 90%.

Además, se prevé que los constructos de anticuerpo biespecíficos de la presente invención muestren eficacia terapéutica o actividad antitumoral. Esto puede evaluarse, por ejemplo, en un estudio tal como se describe en el ejemplo siguiente de un modelo de xenoinjerto de tumor humano en un estado avanzada.

En una forma de realización alternativa, la invención proporciona un polinucleótido que codifica un constructor de anticuerpo de la invención.

Un polinucleótido es un biopolímero compuesto por 13 o más monómeros de nucleótido unidos covalentemente en una cadena. El ADN (tal como el ADNc) y el ARN (tal como el ARNm) son ejemplos de polinucleótidos con una función biológica distinta. Los nucleótidos son moléculas orgánicas que sirven como monómeros o subunidades de moléculas de ácido nucleico tales como el ADN o el ARN. La molécula de ácido nucleico o polinucleótido puede ser bicatenaria y monocatenaria, lineal y circular. Está comprendida preferentemente en un vector que está comprendido preferentemente en una célula huésped. Dicha célula huésped es capaz, por ejemplo, después de la transformación o transfección con el vector o el polinucleótido de la invención, de expresar el constructor de anticuerpo. Para ese propósito, la molécula de polinucleótido o ácido nucleico está unida operativamente con secuencias de control. El código genético es el conjunto de normas mediante las cuales la información codificada dentro del material genético (ácidos nucleicos) se traduce en proteínas. La decodificación biológica en células vivas se realiza por el ribosoma, que une los aminoácidos en un orden especificado por el ARNm, utilizando moléculas de ARNt para transportar aminoácidos y leer los tres nucleótidos del ARNm a la vez. El código define cómo las secuencias de estos tripletes de nucleótidos, denominados codones, especifican qué aminoácido se añadirá a continuación durante la síntesis de proteínas. Con algunas excepciones, un codón de tres nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico especifica un único aminoácido. Debido a que la gran mayoría de los genes están codificados con exactamente el mismo código, este código particular a menudo se denomina código genético canónico o estándar. Mientras que el código genético determina la secuencia de la proteína para una región codificadora dada, otras regiones genómicas pueden influir en cuándo y en dónde se producen estas proteínas.

En una forma de realización alternativa adicional, la invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido de la invención.

Un vector es una molécula de ácido nucleico que se utiliza como vehículo para transferir material genético (extraño) a una célula. El término "vector" abarca, pero no está restringido a, plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. En general, los vectores obtenidos por ingeniería genética comprenden un origen de replicación, un sitio de multiclonación y un marcador seleccionable. El vector en sí es generalmente una secuencia de nucleótidos, comúnmente una secuencia de ADN, que comprende un inserto (transgén) y una secuencia más grande que sirve como el "esqueleto" del vector. Los vectores modernos pueden abarcar características adicionales además del inserto transgénico y un esqueleto: promotor, marcador genético, resistencia a antibióticos, gen comunicador, secuencia de direccionamiento, etiqueta de purificación de proteínas. Los vectores denominados vectores de expresión (constructos de expresión) son específicamente para la expresión del transgén en la célula diana, y generalmente poseen secuencias de control.

La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificadora si está posicionado de forma que facilite la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. No obstante, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. La unión se realiza mediante ligadura en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se utilizan los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

"Transfección" es el proceso de introducción deliberada de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluidos vectores) en las células diana. El término se utiliza principalmente para procedimientos no víricos en células eucariotas. Transducción se utiliza a menudo para describir la transferencia mediada por virus de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos. La transfección de células animales normalmente implica abrir poros o "agujeros" transitorios en la membrana celular, para permitir la absorción de material. La transfección se puede llevar a cabo utilizando fosfato de calcio, por electroporación, por compresión celular o mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas, que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga en el interior.

El término "transformación" se utiliza para describir la transferencia no vírica de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluidos vectores) en bacterias, y también en células eucariotas no animales, incluidas células vegetales. Por lo tanto, la transformación es la alteración genética de una célula eucariota bacteriana o no animal que es resultado de la captación directa a través de la(s) membrana(s) celular(es) de su entorno y la posterior incorporación de material genético exógeno (moléculas de ácido nucleico). La transformación puede efectuarse por medios artificiales. Para que suceda la transformación, las células o las bacterias deben encontrarse en un estado de competencia, lo que podría ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a condiciones ambientales, tales como la inanición y la densidad celular.

Además, en una forma de realización alternativa adicional, la invención proporciona una célula huésped transformada o transfectada con el polinucleótido de la invención o con el vector de la invención.

Tal como se utilizan en el presente documento, se pretende que las expresiones "célula huésped" o "célula receptora" incluyan cualquier célula individual o cultivo celular que pueda(n) ser o que haya(n) sido receptores de vectores, moléculas de ácido nucleico exógeno y polinucleótidos que codifican el constructor de anticuerpo de la presente invención; y/o receptores del constructor de anticuerpo mismo. La introducción del material respectivo en la célula se lleva a cabo por medio de transformación, transfección y similares. Se pretende que la expresión "célula huésped" también incluya la progenie o la progenie potencial de una célula individual. Debido a que pueden ocurrir determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a una mutación natural, accidental o deliberada, o debido a influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN genómico o total) a la célula parental, pero aún se incluye dentro del alcance de la expresión tal como se utiliza en el presente documento. Las células huésped adecuadas incluyen células procarióticas o eucariotas, y también incluyen, pero sin limitación, bacterias, células de levadura, células fúngicas, células vegetales y células animales tales como células de insectos y células de mamíferos, por ejemplo, murinas, de rata, de macaco o humanas.

El constructor de anticuerpo de la invención se puede producir en bacterias. Después de la expresión, el constructor de anticuerpo de la invención se aísla de la pasta celular de E.coli en una fracción soluble y se puede purificar mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad y/o exclusión por tamaño. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al proceso para purificar el anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para el constructor de anticuerpo de la invención. Saccharomyces cerevisiae o levadura de panadería común, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. Sin embargo, muchos otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe, huéspedes de Kluyveromyces tales como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402226); Pichia pastoris (documento EP 183 070); Cándida; Trichoderma Recia (documento EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como huéspedes de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulanos y A. Níger.

Las células huésped adecuadas para la expresión del constructor de anticuerpo glicosilado de la invención se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células huésped de insectos permisivas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx morí. Una variedad de cepas víricas para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus se pueden utilizar como el virus del presente documento según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También pueden utilizarse como huéspedes cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco. Los vectores de clonación y expresión útiles en la producción de proteínas en cultivos celulares de plantas son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78., Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750 y Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

Sin embargo, se ha puesto más interés en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI A^t CC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón caninas (MDc K, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3a , ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2,1413 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL5 1); células TRI (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44­ ^{6 8} ); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

La invención también proporciona un proceso para la producción de un constructor de anticuerpo de la invención, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula huésped de la invención en condiciones que permitan la expresión del constructor de anticuerpo de la invención y recuperar el constructor de anticuerpo producido del cultivo.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cultivo" se refiere al mantenimiento, la diferenciación, el crecimiento, la proliferación y/o la propagación de células in vitro en condiciones adecuadas en un medio. El término "expresión" incluye cualquier etapa involucrada en la producción de un constructor de anticuerpo de la invención que incluye, pero sin limitación, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el constructor de anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si el constructor de anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los residuos particulados, ya sea células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E.coli. En resumen, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los residuos celulares se pueden eliminar por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión generalmente se concentran en primer lugar utilizando un filtro de concentración de proteína disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa, tal como el PMSF, en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis, y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

El constructor de anticuerpo de la invención preparado a partir de las células huésped se puede recuperar o purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio catiónico o aniónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), enfoque de cromato, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar. Cuando el constructor de anticuerpo de la invención comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación.

La cromatografía de afinidad es una técnica de purificación preferida. La matriz a la que se une el ligando de afinidad es con mayor frecuencia agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli(estiren-divinil)benceno, permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa.

Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un constructor de anticuerpo de la invención, o un constructor de anticuerpo producido según el procedimiento de la invención.

Según una forma de realización de la invención, el constructor de anticuerpo de la invención, o producido según el proceso de la invención, se utiliza en la prevención, el tratamiento o la mejora de una enfermedad seleccionada de entre una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad vírica o un trastorno inmunológico.

Las formulaciones descritas en el presente documento son útiles como composiciones farmacéuticas en el tratamiento, la mejora y/o la prevención de la afección médica patológica tal como se describe en el presente documento en un paciente con necesidad de ello. El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. El tratamiento incluye la aplicación o la administración de la formulación al cuerpo, un tejido aislado o una célula de un paciente que padece una enfermedad/un trastorno, un síntoma de una enfermedad/un trastorno, o una predisposición hacia una enfermedad/un trastorno, con el propósito de subsanar, curar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, paliar, mejorar o afectar a la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.

El término "mejora", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier mejora del estado de enfermedad de un paciente, mediante la administración de un constructor de anticuerpo según la invención a un sujeto con necesidad de ello. Dicha mejora también puede observarse como una desaceleración o detención de la enfermedad en progresión del paciente. El término "prevención", tal como se utiliza en el presente documento, significa evitar la aparición o la reaparición de una enfermedad en un paciente que la padece tal como se especifica en el presente documento, mediante la administración de un constructor de anticuerpo según la invención a un sujeto con necesidad de ello.

El término "enfermedad" se refiere a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el constructor de anticuerpo o la composición farmacéutica descrita en el presente documento. Este incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluidas aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero a la enfermedad en cuestión.

Las expresiones "sujeto con necesidad" o aquellos "con necesidad de tratamiento" incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se debe prevenir el trastorno. El sujeto con necesidad o "paciente" incluye seres humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento ya sea profiláctico o terapéutico.

El constructor de anticuerpo de la invención se diseñará generalmente para rutas y procedimientos específicos de administración, para dosis y frecuencias de administración específicas, para tratamientos específicos de enfermedades específicas, con intervalos de biodisponibilidad y persistencia, entre otras cosas. Los materiales de la composición se formulan preferentemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Las formulaciones y composiciones, por lo tanto, pueden diseñarse según la invención para su administración por cualquier vía de administración adecuada. En el contexto de la presente invención, las vías de administración incluyen, pero sin limitación

• vías tópicas (tales como epicutánea, inhalatoria, nasal, oftálmica, auricular/ótica, vaginal, mucosal);

• vías enterales (tales como oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, bucal, rectal) y

• vías parenterales (tales como intravenosa, intraarterial, intraósea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, epidural, intratecal, subcutánea, intraperitoneal, extraamniótica, intraarticular, intracardiaca, intradérmica, intralesional, intrauterina, intravesical, intravítrea, transdérmica, intranasal, transmucosal, intrasinovial, intraluminal).

Las composiciones farmacéuticas y el constructor de anticuerpos de la presente invención son particularmente útiles para administración parenteral, por ejemplo, administración subcutánea o intravenosa, por ejemplo mediante inyección tal como inyección en embolada, o mediante infusión tal como infusión continua. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse utilizando un dispositivo médico. Ejemplos de dispositivos médicos para administrar composiciones farmacéuticas se describen en las patentes de Estados Unidos N° 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447.233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851 y 5.399.163.

En particular, la presente invención proporciona una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como ejemplo no limitante, la administración ininterrumpida o sustancialmente ininterrumpida, es decir, continua, puede realizarse mediante un pequeño sistema de bombeo portado por el paciente para medir la afluencia de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. La composición farmacéutica que comprende el constructor de anticuerpo de la invención puede administrarse utilizando dichos sistemas de bombeo. Dichos sistemas de bombeo son generalmente conocidos en la técnica, y comúnmente se basan en el intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico que se va a infundir. Cuando se cambia el cartucho en un sistema de bombeo de este tipo, puede producirse una interrupción temporal del flujo ininterrumpido de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. En dicho caso, la fase de administración antes del reemplazo del cartucho y la fase de administración después del reemplazo del cartucho aún se considerarán dentro del significado de los medios farmacéuticos y los procedimientos de la invención que constituyen conjuntamente una "administración ininterrumpida" de dicho agente terapéutico.

La administración continua o ininterrumpida de los constructos de anticuerpo de la invención puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de administración de fluido o sistema de bombeo pequeño que incluye un mecanismo de impulsión de fluido para expulsar el fluido desde un depósito y un mecanismo de activación para accionar el mecanismo de accionamiento. Los sistemas de bombeo para administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para su introducción en la piel de un paciente y la administración de la composición adecuada en el cuerpo del paciente. Dichos sistemas de bombeo pueden fijarse o unirse directamente a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, permitiendo así un contacto directo entre el sistema de bombeo y la piel del paciente. El sistema de bombeo se puede unir a la piel del paciente durante 24 horas hasta varios días. El sistema de bombeo puede ser de tamaño pequeño con un depósito para volúmenes pequeños. Como ejemplo no limitante, el volumen del depósito para la composición farmacéutica adecuada que se va a administrar puede encontrarse entre 0,1 y 50 ml.

La administración continua también puede ser transdérmica por medio de un parche que se lleva sobre la piel y se reemplaza a intervalos. Un experto en la técnica es consciente de los sistemas de parches para la administración de fármacos adecuados para este propósito. Debe indicarse que la administración transdérmica es especialmente susceptible de una administración ininterrumpida, ya que el intercambio de un primer parche agotado puede realizarse ventajosamente simultáneamente con la colocación de un segundo parche nuevo, por ejemplo, en la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primer parche agotado e inmediatamente antes de retirar el primer parche agotado. No se presentan problemas de interrupción del flujo o fallos de la celda de potencia.

Si la composición farmacéutica se ha liofilizado, el material liofilizado se reconstituye primero en un líquido apropiado antes de la administración. El material liofilizado se puede reconstituir, por ejemplo, en agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la misma formulación en la que había estado la proteína antes de la liofilización.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada que puede determinarse, por ejemplo, mediante estudios de escalada de dosis por medio de la administración de dosis crecientes del constructor de anticuerpo de la invención que muestra especificidad de especie cruzada descrito en el presente documento a primates no chimpancés, por ejemplo, macacos. Tal como se expuso anteriormente, el constructor de anticuerpo de la invención que muestra especificidad de especies cruzadas descrito en el presente documento puede utilizarse ventajosamente de forma idéntica en ensayos preclínicos en primates no chimpancés y como fármaco en seres humanos. El régimen de dosificación se determinará por el médico tratante y los factores clínicos. Como es bien sabido en las técnicas médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluidos el tamaño del paciente, el área de la superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se administrará, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administran concurrentemente.

La expresión "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se define como una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente el efecto deseado. La expresión "dosis terapéuticamente eficaz" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Las cantidades o dosis eficaces para este uso dependerán de la afección que se va a tratar (la indicación), el constructor de anticuerpo administrado, el contexto y los objetivos terapéuticos, la gravedad de la enfermedad, el tratamiento previo, el historial clínico del paciente y la respuesta al agente terapéutico, la vía de administración, el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o la condición (la edad y la salud general) del paciente, y el estado general del propio sistema inmunitario del paciente. La dosis adecuada se puede ajustar según el criterio del médico competente, de forma que se pueda administrar al paciente una vez o durante una serie de administraciones, y para obtener el efecto terapéutico óptimo.

Una dosis típica puede variar desde aproximadamente 0,1 pg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En formas de realización específicas, la dosis puede variar desde 1,0 pg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, opcionalmente desde 10 pg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg o desde 100 pg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un constructor de anticuerpo de la invención produce preferentemente una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia o la duración de los períodos que no presentan síntomas de la enfermedad o una prevención del deterioro o la discapacidad debida a la aflicción de la enfermedad. Para tratar tumores que expresan antígeno de células diana, una cantidad terapéuticamente eficaz del constructor de anticuerpo de la invención, por ejemplo un constructor de anticuerpo antiantígeno de célula diana/anti-CD3, preferentemente inhibe el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 90% con respecto a pacientes no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un modelo animal predictivo de eficacia en tumores humanos.

La composición farmacéutica puede administrarse como un único agente terapéutico o en combinación con tratamientos adicionales, tales como tratamientos contra el cáncer, según sea necesario, por ejemplo, otros fármacos proteicos y no proteicos. Estos fármacos pueden administrarse simultáneamente con la composición que comprende el constructor de anticuerpo de la invención tal como se define en el presente documento o por separado antes o después de la administración de dicho constructor de anticuerpo en intervalos y dosis definidos oportunamente.

La expresión "dosis eficaz y no tóxica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una dosis tolerable de un constructor de anticuerpo de la invención que es lo suficientemente alta como para causar el agotamiento de las células patológicas, la eliminación del tumor, la contracción del tumor o la estabilización de la enfermedad sin, o esencialmente sin, efectos tóxicos importantes. Dichas dosis eficaces y no tóxicas se pueden determinar, por ejemplo, mediante estudios de escalada de dosis descritos en la técnica y deben encontrarse por debajo de la dosis que induce eventos secundarios adversos graves (toxicidad limitante de la dosis, DLT).

El término "toxicidad", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestado en eventos adversos o eventos adversos graves. Estos eventos secundarios pueden referirse a una falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o una falta de tolerancia local después de la administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos o carcinogénicos causados por el fármaco.

Los términos y las expresiones "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad", tal como se utilizan en el presente documento, definen la administración de un fármaco sin inducir eventos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un período más largo de aplicación del fármaco. La "seguridad", la "seguridad in vivo" o la "tolerabilidad" pueden evaluarse, por ejemplo, a intervalos regulares durante el tratamiento y el período de seguimiento. Las mediciones incluyen la evaluación clínica, por ejemplo, manifestaciones en los órganos y la detección de anomalías de laboratorio. Puede realizarse una evaluación clínica y registrar/codificar las desviaciones con respecto a los hallazgos normales según las normas NCI-CTC y/o MedDRA. Las manifestaciones de los órganos pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardíaca, coagulación y similares, tal como se establece, por ejemplo, en los Criterios de Terminología Común para eventos adversos v3.0 (CTCAE). Los parámetros de laboratorio que pueden analizarse incluyen, por ejemplo, hematología, química clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y análisis de otros fluidos corporales tales como suero, plasma, líquido linfoide o cefalorraquídeo, licor y similares. La seguridad puede evaluarse, por ejemplo, mediante examen físico, técnicas de imagen (es decir, ultrasonido, rayos X, tomografías computarizadas, imágenes de resonancia magnética (MRI), otras medidas con dispositivos de diagnóstico (es decir, electrocardiograma), signos vitales, mediante la medición de parámetros de laboratorio y el registro de eventos adversos. Por ejemplo, los eventos adversos en primates que no son chimpancés en los usos y procedimientos según la invención se pueden examinar mediante procedimientos histopatológicos y/o histoquímicos.

Los términos anteriores también se mencionan, por ejemplo, en la Evaluación de seguridad preclínica de productos farmacéuticos derivados de la biotecnología S6; Directriz tripartita armonizada de ICH; Reunión del Comité Directivo de ICH el 16 de julio de 1997 (Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997).

Finalmente, la invención proporciona un kit que comprende un constructor de anticuerpo de la invención o producido según el procedimiento de la invención, un vector de la invención y/o una célula huésped de la invención.

En el contexto de la presente invención, el término "kit" significa dos o más componentes, uno de los cuales corresponde al constructor de anticuerpo, la composición farmacéutica, el vector o la célula huésped de la invención, envasados juntos en un recipiente, depósito u otro contenedor cualquiera. Por lo tanto, un kit puede describirse como un conjunto de productos y/o utensilios que son suficientes para lograr un determinado objetivo, que puede comercializarse como una sola unidad.

El kit puede comprender uno o más recipientes (tales como viales, ampollas, recipientes, jeringas, botellas, bolsas) de cualquier forma, tamaño y material apropiados (preferentemente impermeables al agua, por ejemplo, de plástico o vidrio) que contiene el constructor de anticuerpo o la composición farmacéutica de la presente invención en una dosis apropiada para su administración (véase anteriormente). El kit también puede contener instrucciones de uso (por ejemplo, en forma de folleto o manual de instrucciones), medios para administrar el constructor de anticuerpo de la presente invención, tales como una jeringa, bomba, infusor o similares, medios para reconstituir el constructor de anticuerpo de la invención y/o medios para diluir el constructor de anticuerpo de la invención.

La invención también proporciona kits para una unidad de administración de dosis única. El kit de la invención también puede contener un primer recipiente que comprende un constructor de anticuerpo liofilizado y seco y un segundo recipiente que comprende una formulación acuosa. En determinadas formas de realización de la presente invención, se proporcionan kits que contienen jeringas precargadas de una sola cámara y de múltiples cámaras (por ejemplo jeringas liquidas y liojeringas).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1:

Activación T de constructos de anticuerpo BiTE® en ausencia de una fusión de albúmina en el extremo C-terminal de la molécula. La expresión de CD25 y CD69 en células T CD4+ (panel A y C) y CD8+ (panel B y D) se determinaron mediante citometría de flujo.

Figura 2:

Activación T de constructos de anticuerpo BiTE® en presencia (panel inferior) de una fusión de albúmina en el extremo C-terminal de la molécula. La expresión de CD25 y CD69 en células T CD4+ (panel A y C) y CD8+ (panel B y D) se determinaron mediante citometría de flujo.

Figura 3:

Análisis por FACS de anticuerpos biespecíficos CDH19/CD3 en las líneas celulares indicadas: 1) células CHO transfectadas de forma estable con CDH19 humano, 2) línea de células T humana humana positiva a CD3 humano HBP-ALL, 3) células CHO transfectadas de forma estable con CDH19 de cynomolgus, 4) línea de células T de macaco 4119 LnPx, 5) línea celular de melanoma humano CHL-1 que expresa CDH19 humano nativo, 6) células CHO no transfectadas. Controles negativos [1) a 6)]: anticuerpos de detección sin el anticuerpo biespecífico CDH19/CD3 anterior.

Figura 4:

Actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos CDH19/CD3 medida en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: línea de células T de macaco que expresan CD34119LnPx. Células diana: células CHO transfectadas con CDH19 de cynomolgus. Relación efector con respecto a célula diana (E:T): 10:1. La figura muestra los resultados para CDH192G6302xI2C HALB y para un control negativo.

Figura 5:

Farmacocinética de constructos de anticuerpo BiTE®.

Cuatro moléculas denominadas 1) 2G6-156; 2) 2G6-LFcBy; 3) 2G6-LFcBy-156; 4) 2G6-D3HSA se sometieron a ensayo en mono cynomolgus en el contexto de un estudio farmacocinético (PK). La figura muestra los resultados con respecto al ejemplo 4.

Figura 6:

Ausencia de activación de células T "no específica" por constructos de anticuerpo monocatenarios biespecíficos que comprenden un dominio de unión a CD3 específico de humano/chimpancé que utiliza AMG 110.

Figura 7:

La activación T en la unión de constructos de anticuerpo biespecíficos a diferentes estructuras diana de la superficie celular en ausencia y en presencia de una fusión de albúmina en el extremo C-terminal de la molécula. La expresión de CD25 y CD69 en células T se determinó mediante citometría de flujo.

7a: Ensayo de activación basado en FACS (48 h) con PBMC humanas (donantes # 669, # 729, # 736) y constructos de anticuerpo BITE® específicos para la influenza; concentración inicial de BiTE® = 1 pg/ml (dilución 1:10);

7b: Ensayo de activación basado en FACS (48 h) con PBMC humanas (donantes # 453, # 458, # 551) y constructos de anticuerpo BITE® específicos para DLL3; concentración inicial de BiTE® = 1 pg/ml (dilución 1:10); 7c Se cultivaron PBMC humanas en ausencia de células diana con Mesothelin BiTE® o la variante HSA del constructor de anticuerpo Mesothelin BiTE® durante 48 h. La expresión del marcador de activación CD69 en células T se determinó mediante inmunotinción y citometría de flujo;

Figura 8:

Activación T en la unión de constructos de anticuerpos biespecíficos a diferentes estructuras diana de la superficie celular en ausencia y en presencia de células diana. La expresión de CD25 y CD69 en células T se determinó mediante citometría de flujo.

8a: Células T aisladas de donantes humanos sanos se cocultivaron en presencia o en ausencia de células diana (Raji) (relación de células E:T 10:1) y HSA de longitud completa-CD19 BITE® durante 48 h. La expresión de los marcadores de activación CD69 o CD25 en células T se determinó mediante inmunotinción y citometría de flujo; 8b: Células T aisladas de donantes humanos sanos se cocultivaron en presencia o en ausencia de células diana (Raji) (relación de células E:T 10:1) y HSA de longitud completa-CD20 BITE® durante 48 h. La expresión de los marcadores de activación CD69 o CD25 en células T se determinó mediante inmunotinción y citometría de flujo; 8c: PBMC humanas se cocultivaron en presencia o en ausencia de células diana (U251vNI) (relación de células E:T 10:1) y EGFRvIII-BiTE® o la variante HSA de EGFRvIII-BITE® durante 48 h. La expresión de los marcadores de activación CD69 en células T se determinó mediante inmunotinción y citometría de flujo.

Figura 9:

Acumulación en el tumor de constructor de anticuerpo CDH19-HALB BiTE®.

F igu ra 10:

Perfiles de PK medios de seis proteínas de fusión BiTE®-HALB después de la administración de una dosis única en monos cynomolgus.

Figura 11:

Perfiles farmacocinéticos de constructos de CD33-1 x I2C-HALB y CD33-2 x I2C6-HALB administrados en programas de dosis repetidos en diferentes dosis y diferentes programas consecutivos. Por motivos de comparación, los perfiles de dosis repetidos descritos se normalizan en dosis a 120 pg/kg. El perfil PK del compuesto de referencia 8 administrado a 30 pg/kg/día, cIV durante 7 días, se muestra en naranja.

Figura 12:

Perfiles farmacocinéticos de modalidades HALB HLE modificadas basadas en el constructor de anticuerpo EGFRvIlI-BiTE. Se analizaron siete constructos de anticuerpo BiTE EGFRvIlI-HLE diferentes generados por mutaciones dentro de la secuencia de tipo silvestre de HALB en mono cynomolgus en el contexto de un estudio farmacocinético (PK). Las diferencias en las variantes de hALB se basan en afinidades de unión a FcRn diferentes aumentadas.

Debe entenderse que las invenciones en el presente documento no se limitan a una metodología, protocolos o reactivos particulares, ya que los mismos pueden variar. La discusión y los ejemplos proporcionados en el presente documento se presentan con el fin de describir solo formas de realización particulares y no pretenden limitar el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones.

Ejemplos:

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el propósito de ilustrar formas de realización específicas o características de la presente invención. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de esta invención. Los ejemplos se incluyen con fines ilustrativos, y la presente invención está limitada solo por las reivindicaciones.

Ejemplo 1:

Activación de células T de moléculas BiTE® en presencia y en ausencia de una fusión de albúmina en el extremo C-terminal de la molécula

• Constructos BiTE® (diluciones en serie: 0,1 pg/ml - 1 pg/ml):

1. CDH19 2G6 302 x I2C -H6; 258,7 pg/ml (SoW0416; Lote de partes alícuotas: 140514_APu01); BiTE® sin etiquetar

2. CDH19 2G6 302 x I2C -HALB -DY -H6; 260 pg/ml (SoW0445; Lote de partes alícuotas: 140514_APu03);

longitud completa de semivida prolongada

• Células efectoras de PBMC humanas (4 donantes; # 875, # 889, # 891, # 895)

• 48 h de tiempo de incubación

• Determinación de la expresión de CD25 y CD69 en células T CD4+ y CD8+ con citómetro de flujo y mAb conjugados específicos de antígeno

En un ajuste similar, se analizó la capacidad de diferentes constructos de anticuerpo BiTE® para activar células T. Esos constructos de anticuerpo BiTE® no comprenden el dominio de unión específico de CD3 de los constructos de anticuerpo monocatenarios biespecíficos de la invención, sino simplemente un dominio de unión a CD3 específico de humano/chimpancé. El constructor de anticuerpo BiTE® correspondiente es AMG 110, que es un constructor de anticuerpo BiTE® específico de EpCAM y CD3. Se incubaron PBMC con concentraciones crecientes de AMG 110 durante 24 o 48 horas, la activación de las células T se determinó mediante tinción para la expresión en superficie de CD25 o CD69 mediante citometría de flujo en un instrumento BD FACSCanto II. El resultado de este análisis se muestra en la figura 6. Además, se demostró la modalidad genérica de eliminar la activación de células T independientes de diana en las concentraciones de constructor de anticuerpo BiTE® extremadamente altas definidas para un mayor número de constructos de anticuerpo biespecíficos adicionales con especificidad para diferentes estructuras diana tal como se muestra en la figura 7 (7a: antígeno de influenza A; 7b: DLL3; 7c: mesotelina (MSLN)).

Ejemplo 2:

Unión biespecífica y reactividad cruzada entre especies:

Para la confirmación de la unión a CDH19 humano y de cynomolgus y a CD3 humano y de macaco, se analizaron anticuerpos biespecíficos por citometría de flujo utilizando las líneas celulares indicadas. Células CHO transfectadas con CDH19 humano, con CDH19 de cynomolgus, la línea celular de melanoma humano CHL-1 que expresa CDH19 humano nativo, la línea celular de leucemia de células T humana que expresa CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) y la línea de células T de macaco que expresa CD34119LnPx (Knappe A, et al., Blood, 2000, 95, 3256­ 3261) se utilizaron como líneas celulares positivas a antígeno. Además, se utilizaron células CHO no transfectadas como control negativo.

Para la citometría de flujo, se incubaron 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 minutos en hielo con 50 pl de anticuerpo biespecífico purificado a una concentración de 5 pg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS/FCS al 10% y la unión de los constructos se detectó con un anticuerpo anti-His murino (Serotec AbD; diluido 1:1000 en 50 pl de PBS/FCS al 10%). Después del lavado, los anticuerpos anti-His unidos se detectaron con un anticuerpo específico para Fc gamma (Dianova) conjugado a ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS/10% de FCS. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron con el programa informático FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).

Los anticuerpos biespecíficos CDH19/CD3 tiñeron células CHO transfectadas con CDH19 humano, CDH19 de cynomolgus, las líneas celulares de melanoma que expresan CDH19 humano CHL-1, así como células T humanas y de macaco. Además, no hubo tinción de células CHO no transfectadas (véase la figura 3).

Ejemplo 3:

Actividad citotóxica

Marcado de células diana

Para el análisis de la lisis celular en ensayos de citometría de flujo, se utilizó el tinte de membrana fluorescente DiOC18 (DiO) (Molecular Probes, # V22886) para marcar células CHO positivas a CDH19 de cynomolgus (como células diana y distinguirlas de las células efectoras). En resumen, las células se recogieron, se lavaron una vez con PBS y se ajustaron a 106 células/ml en PBS que contenía el 2% (v/v) de FBS y el tinte de membrana DiO (5 pl/106 células). Después de una incubación durante 3 minutos a 37 °C, las células se lavaron dos veces en medio RPMI completo y el número de células se ajustó a 1,25 x 105 células/ml. La vitalidad de las células se determinó utilizando una solución de EosinaG isotónica al 0,5% (v/v) (Roth, # 45380).

Análisis basados en citometría de flujo

Este ensayo se diseñó para cuantificar la lisis de células CHO transfectadas con CDH19 de cynomolgus en presencia de diluciones seriadas de anticuerpos biespecíficos CDH19.

Se mezclaron volúmenes iguales de células diana marcadas con DiO y células efectoras (es decir, línea de células T de macaco que expresan CD3 4119LnPx), dando como resultado una relación de células E:T de 10:1. Se transfirieron 160 pl de esta suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 40 pl de diluciones seriadas de los anticuerpos biespecíficos CDH19 y un anticuerpo biespecífico de control negativo (un anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno diana irrelevante) o medio RPMI completo como control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por anticuerpos biespecíficos se desarrolló durante 48 horas en una incubadora humidificada con el 7% de CO2. Después, las células se transfirieron a una placa de 96 pocillos nueva y se controló la pérdida de integridad de membrana de la célula diana añadiendo yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 pg/ml. El PI es un tinte impermeable a la membrana que normalmente es excluido de las células viables, mientras que las células muertas lo absorben y se vuelven identificables por emisión fluorescente.

Las muestras se midieron mediante citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron con el programa informático FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).

Las células diana se identificaron como células positivas a DIO. Las células diana negativas a PI se clasificaron como células dianas vivas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó según la fórmula siguiente:

Citotoxicidad [%] = ncélulasdian°muerlas x 100

^ células diana

n = número de eventos

Utilizando el programa informático GraphPad Prism 6 (Graph Pad Software, San Diego), se representó el porcentaje de citotoxicidad frente a las concentraciones de anticuerpos biespecíficos correspondientes. Las curvas de dosisrespuesta se analizaron con los cuatro modelos de regresión logística paramétrica para la evaluación de curvas de dosis-respuesta sigmoides con pendiente de la loma fija y se calcularon los valores de CE50.

Los resultados de citotox que utilizan el sistema descrito anteriormente para CDH192G6302xI2C HALB y para un control negativo se muestran en la figura 4

Ejemplo 4

Farmacocinética de constructos de anticuerpo BiTE®

Cuatro moléculas denominadas 1) 2G6-156; 2) 2G6-LFcBy; 3) 2G6-LFcBy-156; 4) 2G6-D3HSA se analizaron en mono cynomolgus en el contexto de un estudio farmacocinético (PK). En este estudio PK, se administró una dosis de 6 pg/kg en forma de una inyección en embolada intravenosa única. Para cada uno de los compuestos anteriores, se utilizó un grupo de 2 animales. Se recogieron muestras de sangre y se preparó suero para la determinación de la concentración en suero para cada fármaco en los dos animales. Los niveles de fármacos en suero se midieron utilizando un inmunoensayo. Los datos de concentración en suero-tiempo se utilizaron para determinar los parámetros PK. La muestra de sangre se recogió en los siguientes puntos temporales: antes de la dosis, 0,05, 0,25, 0,5, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 168, 240 y 336 horas después de la dosis. Los parámetros PK se determinaron utilizando procedimientos estándar de análisis no compartimental (NCA).

Para todos los fármacos sometidos a ensayo, los niveles en suero fueron cuantificables para la gran mayoría de los puntos temporales en todos los animales después de la administración del fármaco. Los perfiles PK mostraron una disminución exponencial bifásica para todos los fármacos sometidos a ensayo. Utilizando procedimientos NCA, se estimaron los siguientes parámetros: AUCinf (área bajo la curva de concentración en suero-tiempo), Vss (volumen de distribución en estado estacionario), CL (aclaramiento sistémico), MRT (tiempo medio de residencia) y t^1/2 terminal (semivida estimada a partir de la fase terminal). A continuación se resumen los parámetros PK (media de n = 2) de cada compuesto sometido a ensayo:

El AUCinf fue de 568 h * ng/ml, 366 h * ng/ml, 1796 h * ng/ml y 1383 h * ng/ml respectivamente para los compuestos 1,2, 3 y 4. El Vss fue de 446 ml/kg, 594 ml/kg, 193 ml/kg y 80,7 ml/kg respectivamente para los compuestos 1, 2, 3 y 4. El aclaramiento sistémico fue de 11,3 ml/h/kg, 16,1 ml/h/kg, 4,3 ml/h/kg y 4,9 ml/h/kg respectivamente para los compuestos 1, 2, 3 y 4. El valor de M^rT para los compuestos 1, 2, 3 y 4 fue 42,3 h, 39,8 h, 48,7 h y 18,1 h respectivamente y el de la semivida terminal fue de 44,3 h, 31,2 h, 40,3 h y 13,5 h respectivamente para los compuestos 1, 2, 3 y 4.

La semivida terminal y el MRT de cada uno de los compuestos 1, 2 y 3 fueron mucho más altos (> 2 veces) que los de los compuestos 4. Los compuestos 1, 2 y 3 presentan una versión de semivida más larga de los constructos de anticuerpo BiTE®.

Los resultados se muestran en la figura 5.

Ejemplo 5

Expresión de CD69 o CD25 inducida por BiTE® en células T en presencia y en ausencia de células diana

Se cocultivaron células T aisladas de donantes humanos sanos en presencia o en ausencia de células diana.

Para los constructos de anticuerpo biespecíficos CD19/CD3 y CD20/CD3, se utilizaron células Raji como células diana. Se utilizó una relación de células E:T de 10:1 y se incubaron CD19-HALB-BITE (figura 8a) y CD20-HALB-BiTE (figura 8b) durante 48 h. La expresión de los marcadores de activación CD69 o CD25 en células T se determinó mediante inmunotinción y citometría de flujo y conjugados específicos de antígeno mAb.

Para los constructos de anticuerpo biespecíficos EGFRvIII/CD3 se utilizaron células U251vIII como células diana. A una E:T de 10:1 EGFRvIII-BiTE o la variante HSA de EGFRvIII-BITE se incubaron durante 48 h. La expresión de los marcadores de activación CD69 en células T se determinó mediante inmunotinción y citometría de flujo (figura 8c).

Ejemplo 6

Acumulación en tumor de CDH19-HALB BiTE

Análisis in vivo de CDH19-HALB BiTE, marcado con CW800 (tinte de infrarrojo cercano), inyectado i.v. en la vena lateral de la cola de ratones portadores de tumores (tumor positivo a CDH19), utilizando "In Vivo Xtreme Imager" (Bruker) en el momento indicado después de la inyección (figura 9).

Ejemplo 7

Farmacocinética de constructos de anticuerpo BiTE® después de una administración única

Se fusionaron diferentes anticuerpos BiTE® de unión a diana a un único resto de albúmina humana (HALB) de tipo silvestre y se sometieron a ensayo en mono cynomolgus en el contexto de estudios farmacocinéticos (PK). La farmacocinética de seis anticuerpos BiTE®-HALB se muestra de forma ejemplar. La nomenclatura correspondiente de estas moléculas se resume brevemente en la tabla 2, a continuación.

Tabla 2: Nomenclatura de compuestos de cinco anticuerpos BiTE®-HALB de dosis única

Los anticuerpos BiTE®-HALB se administraron como infusiones cortas intravenosas (30 min) a 12 pg/kg (compuestos 1-3 y 5) y 15 pg/kg (compuestos 4 y 6), respectivamente. Para cada uno de los compuestos mencionados anteriormente se usó un grupo de tres animales. Se recogieron muestras de sangre y se preparó suero para la determinación de las concentraciones en suero. Se midieron los niveles de constructor de anticuerpo BiTE® en suero utilizando un inmunoensayo. El ensayo se realiza capturando el BiTE® a través de su resto diana, mientras que se utilizó para la detección un anticuerpo dirigido contra la parte de unión a CD3 del constructor. Los perfiles de concentración en suero-tiempo se utilizaron para determinar los parámetros PK. Los puntos temporales de las tomas de muestras de sangre se enumeran en la tabla 3, a continuación.

Tabla 3 Puntos temporales de las tomas de muestras de sangre durante el estudio PK

Los parámetros farmacocinéticos se determinaron utilizando procedimientos estándar de análisis no compartimental (NCA).

Para todas las proteínas analizadas, los niveles en suero fueron cuantificables para todos los puntos temporales en todos los animales después de la administración del constructor de anticuerpo BiTE®. Los perfiles PK describen una disminución bifásica y exponencial después de cada una de las administraciones de elementos de ensayo individuales (figura 10).

Utilizando análisis no compartimentales, se estimaron los siguientes parámetros PK: AUCinf (área bajo la curva de concentración en suero-tiempo), Vss (volumen de distribución en estado estacionario), CL (aclaramiento sistémico) y t1/2 terminal (semivida terminal).

El parámetro PK como media de n = 3 para cada compuesto sometido a ensayo se resume en la tabla 4, a continuación.

Tabla 4: Parámetros farmacocinéticos después de la administración de una dosis única de seis diversas proteínas BiTE®-HALB en monos cynomolgus.

El AUCinf para las diferentes variantes de BiTE®-HALB osciló entre 2226 h * ng/ml y 11593 h * ng/ml, dependiendo del contexto diana de BiTE®. Todas las fusiones HALB analizadas alcanzaron semividas terminales de al menos 48 horas después de la administración de una dosis única baja de 12 y 15 pg/kg. Los valores de aclaramiento sistémico fueron 1,1 ml/h/kg, 1,0 ml/h/kg, 1,2 ml/h/kg, 3,3 ml/h/kg, 6,7 ml/h/kg y 3,8 ml/h/kg respectivamente para los compuestos 1-6. El volumen de distribución correspondiente fue de 66 ml/kg, 65 ml/kg, 64 ml/kg, 161 ml/kg, 303 ml/kg y 349 ml/kg, respectivamente.

Las diferencias en el comportamiento farmacocinético de los diversos anticuerpos BiTE®-HALB se relacionaron claramente con los diferentes restos BiTE® y sus dianas, respectivamente. El resto HALB de cada uno de los analizados se representó por la albúmina humana de tipo silvestre y no se cambió entre los constructos.

Ejemplo 8

Farmacocinética de constructos de anticuerpo BiTE® después de administración repetida

Tres moléculas, CD33-1 x I2C6-HALB (compuesto 4) y CD33-2 x I2C6-HALB (compuesto 7) se sometieron a ensayo en mono cynomolgus en el contexto de estudios farmacocinéticos (PK) de dosis repetidas. Cada molécula representa un resto BiTE® dirigido contra una proteína diana común fusionada a una copia del resto de albúmina de suero humano de tipo silvestre (HALB). El compuesto 8 representa una versión desnuda, no fusionada con HALB del compuesto 7 y se denomina CD33-2 x I2C6

Los compuestos se administraron a diferentes concentraciones y en diferentes esquemas de dosis tal como se describe en la tabla 5, a continuación.

Tabla 5: Dosis administradas con las agendas de dosis correspondientes analizadas en la configuración de dosis repetidas de las variantes de CD33-1 x I2C6 BiTE®

En estos estudios, se administraron dos o cuatro dosis consecutivas de 60 gg/kg, 80 gg/kg, 180 gg/kg y 120 gg/kg como infusiones cortas intravenosas (30 min) para los compuestos 4 y 7. El compuesto 8 se administró como infusión continua (cIV) a 30 gg/kg/día durante 7 días. Para cada uno de los compuestos anteriores se utilizó un grupo de tres animales. Se recogieron muestras de sangre y se preparó suero para la determinación de las concentraciones en suero. Se midieron los niveles de constructor de anticuerpo BiTE® en suero utilizando un inmunoensayo. El ensayo se realiza capturando el BiTE® a través de su resto diana, mientras que se utilizó para la detección un anticuerpo dirigido contra la parte de unión a CD3 del constructor. Los perfiles de concentración en suero-tiempo se describen en la figura 11.

La administración repetida de anticuerpos BiTE®-HALB conduce a la acumulación de niveles mínimos en suero durante la administración, mientras que las concentraciones en suero máximas alcanzadas (cmax) se mantienen casi estables con la administración repetida (tabla 6 Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.). Para todas las dosis administradas y las agendas de dosificación descritas, las exposiciones a lo largo de 7 días de los compuestos CD33-1 x I2C6-HALB aumentaron claramente en comparación con la exposición de un compuesto de anticuerpo BiTE® desnudo CD33-1 x I2C6 administrado solo cIV dentro del mismo marco temporal (figura 11).

Tabla 6: Concentraciones máximas y mínimas en suero de variaciones del constructor de anticuerpo CD33 x I2C6 BiTE® administradas a diferentes agendas de dosificación y varias dosis

Cada dos días, la administración del compuesto 4 a diferentes niveles de dosis muestra un comportamiento lineal de dosis con valores de AUC/dosis estables (tabla 7) del constructor de anticuerpo BiTE®-HALB en un intervalo de dosis de 60 pg/kg a 180 pg/kg.

Tabla 7: Exposición a lo largo de la dosificación de los anticuerpos CD33-1 x I2C6-HALB BiTE® administrados a 60, 80 y 180 pg/kg en comparación con CD33-2 x I2C6 BiTE® canónico

La AUC/dosis media del constructor de anticuerpo CD33-1 x I2C6-HALB BiTE® se incrementa en 10 veces, en comparación con la AUC/dosis del correspondiente constructor canónico de anticuerpo BiTE®.

Ejemplo 9

Farmacocinética de constructos de anticuerpos BiTE® con diferentes prolongaciones de semivida basadas en albúmina

Se sometieron a ensayo ocho moléculas en mono cynomolgus en el contexto de un estudio farmacocinético (PK). Cada molécula representa una fusión de la misma proteína BiTE® con albúmina de suero humano de tipo silvestre o modificada de afinidad a FcRn (HALB). Las denominaciones de los compuestos de ensayo se resumen brevemente en la tabla 8, a continuación.

Tabla 8 Nomenclatura de compuesto

En este estudio se administraron dos dosis consecutivas de 80 pg/kg como infusiones cortas intravenosas (30 min). Para cada uno de los compuestos anteriores se utilizó un grupo de tres animales. Se recogieron muestras de sangre y se preparó suero para la determinación de las concentraciones en suero. Los niveles en suero de anticuerpos BiTE® se midieron utilizando un inmunoensayo. El ensayo se realiza capturando el BiTE® a través de su resto diana, mientras que se utilizó para la detección un anticuerpo dirigido contra la parte de unión a CD3 del constructor. Los perfiles de concentración en suero-tiempo se utilizaron para determinar los parámetros PK. Los puntos temporales de tomas de muestras de sangre se enumeran en la tabla 9, a continuación.

Tabla 9: Puntos temporales de tomas de muestras de sangre durante el estudio PK

Los parámetros farmacocinéticos se determinaron utilizando procedimientos estándar de análisis no compartimental (NCA). La fase terminal farmacocinética de los fármacos individuales se describió utilizando el período de decaimiento de la administración del segundo elemento de ensayo.

Para todas las proteínas sometidas a ensayo, los niveles en suero fueron cuantificables para todos los puntos temporales en todos los animales después de la administración del anticuerpo BiTE®. Los perfiles PK describen una disminución bifásica y exponencial después de cada una de las administraciones de elementos de ensayo individuales (figura 12).

Utilizando análisis no compartimentales, se estimaron los siguientes parámetros PK: AUCinf (área bajo la curva de concentración en suero-tiempo), Vss (volumen de distribución en estado estacionario), CL (aclaramiento sistémico) y t1/2 terminal (semivida terminal) .

El parámetro PK como media de n = 3 para cada compuesto sometido a ensayo se resume en la tabla siguiente.

Con respecto a la semivida terminal, todas las variantes de EGFRvIII-HALB con afinidad aumentada sometidas a ensayo alcanzan un factor de hasta 1,56 veces (compuesto 11) superior a la semivida de la proteína de fusión HALB de tipo silvestre en el ajuste de dosis repetidas en cynomolgus. Por lo tanto, todas representan una versión de semivida prolongada (HLE) de la correspondiente albúmina de tipo silvestre.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico que se une a un antígeno de superficie de una célula diana a través de un primer dominio de unión y al antígeno de superficie de una célula T CD3 a través de un segundo dominio de unión, en el que:

   • el segundo dominio de unión se une a un epítope de la cadena CD3s humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, comprendiendo el epítope al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 1), y

   • una albúmina sérica está fusionada al extremo C-terminal del constructor; el constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico no tiene una secuencia de aminoácidos tal como se representa en las SEQ ID NO: 2 y 3, y el constructor de anticuerpo monocatenario biespecífico no tiene la secuencia de aminoácidos:

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   2. El constructor de anticuerpo según la reivindicación 1, en el que la albúmina sérica es una albúmina sérica humana o una variante optimizada de unión a FcRn de la misma.

   3. El constructor de anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, en el que la albúmina sérica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4 a 12 y 608 a 628.

   4. El constructor de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la albúmina sérica se une al constructor de anticuerpo a través de un enlazador peptídico.

   5. El constructor de anticuerpo según la reivindicación 4, en el que el enlazador peptídico tiene la secuencia de aminoácidos (GGGGS)n(SEQ ID NO: 13)n en la que n es un número entero presente en el intervalo de 1 a 5.

   6. El constructor de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo dominio de unión comprende una región VL que tiene CDR-L1-L3 y una región VH que tiene CDR-H1-H3 seleccionadas del grupo que consiste en:

   (a) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 14-16 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 17-19;

   (b) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 26-28 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 29-31;

   (c) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 38-40 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 41-43;

   (d) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 50-52 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 53-55;

   (e) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 62-64 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 65-67;

   (f) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 74-76 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 77-79;

   (g) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 86-88 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 89-91;

   (h) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 98-100 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 101-103;

   (i) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 110-112 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 113-115; y

   (j) CDR-L1-L3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 122-124 y CDR-H1-H3 tal como se representan en las SEQ ID NO: 125-127.

   7. El constructor de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo dominio de unión comprende pares de cadenas VH y VL seleccionadas del grupo que consiste en:

   (a) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 20 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 22;

   (b) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 32 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 34;

   (c) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 44 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 46;

   (d) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 56 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 58;

   (e) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: ^{6 8} y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 70;

   (f) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 80 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 82;

   (g) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 92 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 94;

   (h) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 104 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 106;

   (i) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 116 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 118; y

   (j) una cadena VH tal como se representa en la SEQ ID NO: 128 y una cadena VL tal como se representa en la SEQ ID NO: 130.

   ⁸. El constructor de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 72, la SEQ ID NO: 84, la SEQ ID NO: 96, la SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 120 o la SEQ ID NO: 132.

   9. El constructor de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antígeno de superficie de una célula diana es un antígeno tumoral o un antígeno vírico presente en la superficie de una célula huésped infectada.

   10. El constructor de anticuerpo según la reivindicación 9, en el que el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en CDH19, MSLN, DLL3, FLT3, EGFRvIII, CD33, CD19, CD20 y CD70.

   11. El constructor de anticuerpo según las reivindicaciones 1 a ⁸ , comprendiendo el constructor de anticuerpo los elementos siguientes comenzando por el extremo N-terminal:

   (a) un scFv que se une al antígeno de superficie de una célula diana que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 629-675, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774 , 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 894, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024 , 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1104, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274 , 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1494, 1504, 1514, 1524 , 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1674, 1684, 1694, 1704, 1714, 1724, ^{1 7 3 4} , ^{1 7 4 4} , ^{1 7 5 4} , 1764, 1774 , 1784, 1794, 1804, 1814, 1824, 1834, 1844, 1854, 1864, 1874, 1894, 1894, 1904, 1914, 1924, 1944, 1954, 1964, 1974, 2004, 2014, 2014, 2024, 2034, 2044 , 2054, 2064, 2074, 2084, 2094, 2104, 2114, 2124, 2134, 2144, 2154, 2164, 2174, 2184, 2194, 2204, 2214, 2224, 2234, 2244, 2254, 2264, 2274, 2284, 2304, 2314, 2324, 2334, 2354, 2364, 2374, 2384, 2394, 234, 2404, 2414, 2424, 2434, 2444, 2454, 2464, 2474, 2484, 2494, 2504, 2514, 2524, 2534, 2544, 2554, 2564, 2574, 2584, 254, 2604, 2614, 2624, 2634, 2644, 2654, 2664, 2674, 2674, 2684, 2694 y 2704;

   (b) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13 y 2707-2709;

   (c) un scFv que se une al antígeno de superficie de célula T CD3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132 y 2706; (d) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13 y 2707-2709;

   (e) una albúmina sérica que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4 a 12 y 608 a 628; y

   (f) opcionalmente una etiqueta His.

   12. Un polinucleótido que codifica un constructor de anticuerpo tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

   13. Un vector que comprende un polinucleótido tal como se define en la reivindicación 12.

   14. Una célula huésped transformada o transfectada con el polinucleótido tal como se define en la reivindicación 12 o con el vector tal como se define en la reivindicación 13.

   15. Un proceso para la producción de un constructor de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula huésped tal como se define en la reivindicación 14 en condiciones que permiten la expresión del constructor de anticuerpo tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y recuperar del cultivo el constructor de anticuerpo producido.

   16. Una composición farmacéutica que comprende un constructor de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o producido según el proceso de la reivindicación 15.

   17. El constructor de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o producido según el proceso de la reivindicación 15 para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora de una enfermedad seleccionada de entre una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad vírica o un trastorno inmunológico. 18. Un kit que comprende un constructor de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o producido según el proceso de la reivindicación 15, un vector tal como se define en la reivindicación 13 y/o una célula huésped tal como se define en la reivindicación 14.