ES2964897T3

ES2964897T3 - Construcciones de anticuerpos biespecíficas que se unen a mesotelina y cd3

Info

Publication number: ES2964897T3
Application number: ES16757163T
Authority: ES
Inventors: Tobias Raum; Peter Kufer; Doris Rau; Jonas Anlahr; Claudia Bluemel; Patrick Hoffmann; Elisabeth Nahrwold; Julie Bailis; Markus Muenz; Johannes Brozy; Matthias Friedrich; Benno Rattel; Pamela Bogner; Andreas Wolf; Cornelius Pompe
Original assignee: Amgen Research Munich GmbH; Amgen Inc
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH; Amgen Inc
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2024-04-10
Anticipated expiration: 2036-08-01
Also published as: EP3328893B1; HRP20231410T1; NZ737458A; JO3747B1; CA2991672A1; US20240400673A1; IL256873B2; LT3328893T; IL256873A; US11884720B2; TN2017000552A1; PH12018500107A1; UA125580C2; KR102914586B1; PE20180798A1; EA201890383A8; EP4327885A3; EP3328893A1; RS64938B1; MY198199A

Abstract

La presente invención se refiere a una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a MSLN humano en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T. Además, la invención proporciona un polinucleótido que codifica la construcción de anticuerpo, un vector que comprende dicho polinucleótido y una célula huésped transformada o transfectada con dicho polinucleótido o vector. Además, la invención proporciona un proceso para la producción de la construcción de anticuerpos de la invención, un uso médico de dicha construcción de anticuerpos y un kit que comprende dicha construcción de anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Construcciones de anticuerpos biespecíficas que se unen a mesotelina y cd3

La presente invención se refiere a una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana, y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T como se define en las reivindicaciones. Además, la invención proporciona un polinucleótido que codifica la construcción de anticuerpo, y una célula hospedante transformada o transfectada con dicho polinucleótido como se define en las reivindicaciones. Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la construcción de anticuerpo de la invención, un uso médico de dicha construcción de anticuerpo, y un kit que comprende dicha construcción de anticuerpo como se define en las reivindicaciones.

INTRODUCCIÓN:

La mesotelina es una proteína de la superficie celular que se descubrió inicialmente como un antígeno reconocido por K1, un anticuerpo monoclonal derivado por inmunización de ratones con la línea celular de cáncer de ovario humano OVCAR-3 (Chang et al., Int. J. Cancer 1992). Se usó clonación de expresión para identificar el ADNc de mesotelina a partir de una biblioteca de HeLa (Chang et al., PNAS 1996). El análisis molecular demostró que el gen de la mesotelina está codificado dentro de una proteína precursora de 69 kD, que es escindida por furina para dar dos proteínas distintas: el factor potenciador de megacariocitos (MPF), una proteína de 31 kD que se pierde, y la mesotelina, una proteína de 40 kD que se asocia con la membrana celular a través de un enlace de glicofosfatidilinositol (anclaje de GPI) (Chang et al., PNAS 1996). La proteína mesotelina está organizada en dominios superhelicoidales, con repeticiones de tipo ARM.

La mesotelina se expresa altamente en el cáncer de ovario, así como en otros tipos de tumores, incluido el cáncer de páncreas, el mesotelioma, el cáncer de pulmón, el cáncer gástrico y el cáncer de mama triple negativo. En los tejidos normales, la mesotelina se expresa principalmente en la capa de células mesoteliales de las cavidades pleural, pericárdica y peritoneal. La mesotelina también se expresa en los epitelios superficiales del ovario normal, las trompas de Falopio y las amígdalas.

Además de su expresión en la superficie celular, la mesotelina también se elimina al suero mediante la acción de ADAM17/TACE. Los niveles séricos de mesotelina eliminada están elevados en pacientes con cáncer de ovario y otros cánceres. MESOMARK®, un ensayo de ELISA para mesotelina sérica eliminada, está aprobado por la FDA para uso humanitario, y puede ayudar en el diagnóstico o seguimiento del mesotelioma. La mesotelina eliminada también se ha usado, sola o junto con otros marcadores, para ayudar en el diagnóstico o pronóstico de otros tipos de cáncer.

La correlación de los niveles séricos de mesotelina eliminada con la enfermedad sugirió un papel potencial de la proteína mesotelina en la progresión del cáncer. Si bien la función biológica de la mesotelina no se comprende bien -los ratones carentes del gen parecen normales-, se ha demostrado que la mesotelina se une a la mucina MUC16/CA-125. Se ha propuesto que la interacción mesotelina-CA-125 funciona en la adhesión, invasión y metástasis celular.

Los primeros anticuerpos generados contra la mesotelina para intervención terapéutica se diseñaron para interferir con la interacción entre mesotelina y CA-125. La presentación en fagos identificó el Fv SS, que se optimizó por afinidad y se usó para generar una inmunotoxina recombinante dirigida contra la mesotelina, SS1P. El anticuerpo MORAb-009 amatuximab, que también usa SS1, reconoce un epítopo no lineal en los 64 aminoácidos amino terminales de la mesotelina. El SS1 Fv también se usó para generar células T manipuladas con receptores de antígenos quiméricos. Los anticuerpos antimesotelina también se han usado para generar conjugados de fármacos, tal como Anetumab ravtansina, que contiene el anticuerpo MF-T acoplado a DM4, y el anticuerpo 7D9 conjugado con monometil auristatina E. Estos anticuerpos antimesotelina también reconocen la región amino terminal de la proteína (aminoácidos 296-390), aunque no compiten con ella. Estas sustancias terapéuticas dirigidas contra la mesotelina que se encuentran actualmente en ensayos clínicos han demostrado una eficacia limitada como agentes únicos.

El documento WO2014/004549 describe construcciones biespecíficas que se unen a mesotelina y CD3. El documento WO2010/124797 describe inmunoconjugados anti-mesotelina basados en un anticuerpo anti-mesotelina para el tratamiento del cáncer de páncreas que expresa mesotelina.

Muy recientemente, se han descrito nuevos anticuerpos antimesotelina que reconocen otras regiones de la proteína mesotelina. Todavía sigue siendo necesario comprender si los anticuerpos contra diferentes epítopos de mesotelina distintos de SS1/MORAb-009 (por ejemplo, anticuerpos que no compiten con la mesotelina eliminada o CA-125 eliminada) habrían mejorado la eficacia en los pacientes.

Como todavía existe la necesidad de tener disponibles opciones adicionales para el tratamiento de enfermedades de tumores sólidos relacionadas con la sobreexpresión de MSLN, tales como cáncer de ovario, cáncer de páncreas, mesotelioma, cáncer de pulmón, cáncer gástrico y cáncer de mama triple negativo, se proporcionan aquí medios y métodos para la solución de este problema en forma de una construcción de anticuerpo biespecífica que tiene un dominio de unión dirigido contra MSLN en la superficie de células diana tumorales y un segundo dominio de unión dirigido contra CD3 en la superficie de células T.

Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión se une a un epítopo de MSLN que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 245;

en la que el primer dominio de unión que se une a MSLN humana comprende una región VH que comprende CDR-H1, c Dr -H2 y CDR-H3 y una región Vl que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 161, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 162, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 163, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 164, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 165 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 166;

b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 171, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 172, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 173, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 174, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 175 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 176;

c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 181, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 182, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 183, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 184, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 185 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 186;

d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 191, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 192, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 193, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 194, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 195 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 196; y

e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 201, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 202, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 203, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 204, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 205 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 206.

También se describe una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión se une a un epítopo de MSLN que está comprendido dentro de las variantes de MSLN como se representa en las SEQ ID NO: 231, 232 y 233, y además se une a MSLN deMacaca fasciculariscomo se representa en las SEQ ID NO: 234.

Debe tenerse en cuenta que, como se utiliza en esta memoria, las formas en singulares "un", "una" y "el", “la” incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o más de dichos reactivos diferentes y la referencia al "método" incluye una referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica que podrían modificarse o sustituirse por los métodos descritos en esta memoria.

A menos que se indique lo contrario, la expresión "al menos" que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada uno de los elementos de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar, utilizando únicamente una experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las formas de realización específicas de la invención descrita en el presente documento. Se pretende que equivalentes de este tipo estén incluidos en la presente invención.

El término "y/o", donde quiera que se utilice en el presente documento, incluye el significado de "y", "o" y "todas las combinaciones o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término".

El término "aproximadamente" o "alrededor", tal como se utiliza en esta memoria significa dentro de ± 20%, preferiblemente dentro de ± 15%, más preferiblemente dentro de ± 10% y lo más preferiblemente dentro de ± 5% de un valor o intervalo dado.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapa. Cuando se utiliza en esta memoria, la expresión "que comprende" puede sustituirse con la expresión "que contiene" o "que incluye" o, a veces, cuando se utiliza en esta memoria, con la expresión "que tiene".

Cuando se utiliza en esta memoria, "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se utiliza en esta memoria, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.

En cada caso en esta memoria, cualquiera de las expresiones "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede reemplazarse por cualquiera de las otras dos expresiones.

La expresión "construcción de anticuerpo" se refiere a una molécula en la que la estructura y/o función se basa(n) en la estructura y/o función de un anticuerpo, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o entera. Por lo tanto, una construcción de anticuerpo es capaz de unirse a su diana o antígeno específico. Además, una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión de la diana. Este requisito mínimo se define por la presencia de al menos tres CDRs de la cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y las tres CDRs de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH), es decir, de todas las seis CDRs. Los anticuerpos en los que se basan las construcciones de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos.

Dentro de la definición de "construcciones de anticuerpos" de acuerdo con la invención se encuentran los anticuerpos de longitud completa o enteros que también incluyen anticuerpos de camélidos y otros anticuerpos de inmunoglobulina generados por métodos o procedimientos biotecnológicos o de modificación de proteínas. Estos anticuerpos de longitud completa pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos. También dentro de la definición de "construcciones de anticuerpos" están los fragmentos de anticuerpos de longitud completa, tales como VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 o "r IgG" ("medio anticuerpo"). Las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención también pueden ser fragmentos modificados de anticuerpos, también denominados variantes de anticuerpos, tales como scFv, di-scFv o bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-cremallera, scFab, Fab2, Fab3, diacuerpos, diacuerpos de cadena sencilla, diacuerpos en tándem (Tandab), di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem, "minicuerpos" ejemplificados por una estructura que es la siguiente: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 CH3), ((scFv)2-CH3) o (scFv-CH3-scFv)2, multicuerpos tales como triacuerpos o tetracuerpos, y anticuerpos de dominio único tales como nanocuerpos o anticuerpos de dominio variable único que comprenden simplemente un dominio variable, que podría ser VHH, VH o VL, que se unen específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V.

Un dominio de unión puede comprender típicamente una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo; sin embargo, no tiene por qué comprender ambos. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo conservan alguna función de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno intacto. Ejemplos adicionales para el formato de fragmentos de anticuerpo, variantes de anticuerpo o dominios de unión incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, y (7) un Fv monocatenario (scFv), prefiriéndose este último (por ejemplo, derivado de una biblioteca de scFV). Los ejemplos de realizaciones de construcciones de anticuerpos según la invención se describen, por ejemplo, en los documentos WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, W O2014/144722, WO 2014/151910, y WO 2015/048272.

Además, la definición de la expresión "construcción de anticuerpo" incluye construcciones monovalentes, bivalentes y polivalentes / multivalentes y, por lo tanto, construcciones monoespecíficas, que se unen específicamente a una sola estructura antigénica, así como construcciones biespecíficas y poliespecíficas / multiespecíficas, que se unen específicamente a más de una estructura antigénica, p. ej., dos, tres o más, a través de distintos dominios de unión. Además, la definición de la expresión "construcción de anticuerpo" incluye moléculas que consisten en una sola cadena polipeptídica, así como moléculas que consisten en más de una cadena polipeptídica, cuyas cadenas pueden ser idénticas (homodímeros, homotrímeros u homo-oligómeros) o diferentes (heterodímero, heterotrímero o heterooligómero). Los ejemplos de los anticuerpos identificados anteriormente y sus variantes o derivados se describen, entre otros, en Harlow y Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) y Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2a ed. 2010 y Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

Las construcciones de anticuerpos de la presente invención son preferiblemente "construcciones de anticuerpos generadas in vitro". Este término se refiere a una construcción de anticuerpo según la definición anterior en la que toda o parte de la región variable (por ejemplo, al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunes, por ejemplo una presentación en fagos in vitro, un chip de proteína, o cualquier otro método en el que se pueden ensayar secuencias candidatas para determinar su capacidad para unirse a un antígeno. Por lo tanto, esta expresión excluye preferiblemente las secuencias generadas únicamente por transposición genómica en una célula inmune en un animal. Un "anticuerpo recombinante" es un anticuerpo elaborado mediante el uso de tecnología de ADN recombinante o ingeniería genética.

La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb) o construcción de anticuerpo monoclonal, como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente y/o modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico o determinante en el antígeno, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (o epítopos). Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque son sintetizados por el cultivo de hibridoma y, por tanto, no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por método particular alguno.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede utilizarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar pueden prepararse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 4.816.567). Los ejemplos de técnicas adicionales para producir anticuerpos monoclonales humanos incluyen la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica del hibridoma del EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

Luego, los hibridomas pueden rastrearse utilizando métodos estándar, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el análisis de resonancia de plasmón de superficie (BIACORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno específico. Puede utilizarse cualquier forma del antígeno relevante como inmunógeno, p. ej., antígeno recombinante, formas que se producen de forma natural, cualquier variante o fragmento del mismo, así como un péptido antigénico del mismo. La resonancia de plasmones superficiales empleada en el sistema BIAcore se puede usar para aumentar la eficacia de los anticuerpos de fagos que se unen a un epítopo de un antígeno diana, tal como MSLN o CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

Otro método ejemplar para preparar anticuerpos monoclonales incluye el rastreo de colecciones de expresión de proteínas, p. ej., colecciones de presentación de fagos o presentación de ribosomas. La presentación en fagos se describe, por ejemplo, en Ladner et al., patente de EE.UU. n.° 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 -597 (1991).

Además del uso de colecciones de presentación, el antígeno relevante puede utilizarse para inmunizar un animal no humano, p. ej., un roedor (tal como un ratón, hámster, conejo o rata). En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible modificar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humana (inmunoglobulina). Utilizando la tecnología de hibridomas, pueden producirse y seleccionarse anticuerpos monoclonales específicos para antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véanse, por ejemplo, XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, y WO 96/33735.

También puede obtenerse un anticuerpo monoclonal de un animal no humano y luego modificarse, p. ej., humanizarse, desinmunizarse, volverse quimérico, etc., utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Los ejemplos de construcciones de anticuerpos modificados incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos "madurados por afinidad" (véanse, por ejemplo, Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)) y mutantes de anticuerpos con función o funciones efectoras alteradas (véanse,por ejemplo,la patente de EE.UU. 5.648.260, Kontermann y Dübel (2010),loc. cit.Y Little (2009),loc. cit.).

En inmunología, la maduración por afinidad es el proceso mediante el cual las células B producen anticuerpos con mayor afinidad por el antígeno durante el curso de una respuesta inmune. Con exposiciones repetidas al mismo antígeno, un huésped producirá anticuerpos de afinidades sucesivamente mayores. Al igual que el prototipo natural, la maduración por afinidadin vitrose basa en los principios de mutación y selección. La maduración por afinidadin vitrose ha usado con éxito para optimizar anticuerpos, construcciones de anticuerpos, y fragmentos de anticuerpos. Las mutaciones aleatorias dentro de las CDRs se introducen utilizando radiación, mutágenos químicos o PCR propensa a errores. Además, la diversidad genética se puede incrementar mediante la transposición de la cadena. Dos o tres rondas de mutación y selección utilizando métodos de presentación tales como la presentación de fagos generalmente dan como resultado fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo nanomolar bajo.

Un tipo preferido de variación por sustitución de aminoácidos de las construcciones de anticuerpos implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (p. ej., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la o las variantes resultantes seleccionadas para un desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo parental a partir del cual se generan. Una forma conveniente de generar variantes de sustitución de este tipo implica la maduración por afinidad utilizando presentación de fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (p. ej., 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se presentan de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos en forma de fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada una de las partículas. Las variantes presentadas en fagos se rastrean luego para determinar su actividad biológica (p. ej., afinidad de unión) tal como se describe en esta memoria. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede realizar una mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. De forma alternativa, o adicionalmente, puede resultar beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el dominio de unión y, por ejemplo, MSLN humana. Residuos de contacto de este tipo y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en esta memoria. Una vez que se generan variantes de este tipo, el panel de variantes se somete a rastreo tal como se describe en esta memoria y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para su posterior desarrollo.

Los anticuerpos monoclonales y las construcciones de anticuerpos de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la o las cadenas son idénticas u homólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. n.° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en esta memoria incluyen anticuerpos "primitizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (p. ej., mono del Viejo Mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humana. Se ha descrito una diversidad de enfoques para preparar anticuerpos quiméricos. Véansepor ejemplo,Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81:6851 , 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., patente de EE.UU. n.° 4.816.567; Boss et al., patente de<E E . U u .>n.° 4.816.397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494; y GB 2177096.

Un anticuerpo, construcción de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o variante de anticuerpo también puede modificarse mediante la eliminación específica de epítopos de células T humanas (un método denominado "desinmunización") mediante los métodos descritos, por ejemplo, en los documentos WO 98/52976 o WO 00/34317. Brevemente, los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo se pueden analizar para detectar péptidos que se unen al MHC de clase II; estos péptidos representan epítopos potenciales de células T (como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de epítopos potenciales de células T, se puede aplicar un enfoque de modelado por computadora denominado "enhebrado de péptidos", y además, se pueden buscar motivos presentes en las secuencias VH y VL en una base de datos de péptidos de unión al MHC de clase II humano, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales de DR del MHC de clase II y, por tanto, constituyen epítopos potenciales de células T. Los epítopos de células T potenciales detectados pueden eliminarse sustituyendo pequeños números de residuos de aminoácidos en los dominios variables, o preferiblemente, mediante sustituciones de un solo aminoácido. Típicamente, se realizan sustituciones conservadoras. A menudo, pero no exclusivamente, se puede utilizar un aminoácido común a una posición en las secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana se describenpor ejemploen Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638. El directorio V BASE proporciona un directorio completo de secuencias de regiones variables de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, LA.et al.MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). Estas secuencias se pueden utilizar como una fuente de secuencia humana, p. ej., para regiones marco y CDRs. También se pueden usar regiones estructurales humanas de consenso, por ejemplo como se describe en la patente de EE.UU. n.° 6.300.064.

Los anticuerpos, construcciones de anticuerpos, variantes o fragmentos de los mismos "humanizados" (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) son anticuerpos o inmunoglobulinas de secuencias principalmente humanas, que contienen (a) secuencia(s) mínima(s) derivada(s) de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable (también CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (p. ej., roedor) (anticuerpo donante), tales como ratón, rata, hámster o conejo que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, residuos de la región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, "anticuerpos humanizados", tal como se utiliza en esta memoria, también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véanse Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

Pueden generarse anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos reemplazando secuencias del dominio variable Fv que no están directamente implicadas en la unión de antígenos con secuencias equivalentes de dominios variables Fv humanos. Los métodos ejemplares para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se proporcionan en Morrison (1985) Science 229:1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; y mediante los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; y<u>S 6.407.213. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina de al menos uno de una cadena pesada o ligera. Dichos ácidos nucleicos pueden obtenerse de un hibridoma que produzca un anticuerpo contra una diana predeterminada, tal como se describió arriba, así como de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizado puede luego clonarse en un vector de expresión apropiado.

Anticuerpos humanizados también se pueden producir utilizando animales transgénicos, tales como ratones, que expresan genes de cadena pesada y ligera humana, pero que son incapaces de expresar los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena de ratón. Winter describe un método de injerto de CDR ejemplar que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados descritos aquí (patent de EE.UU. n.° 5.225.539). Todas las CDRs de un anticuerpo humano particular pueden reemplazarse por al menos una parte de una CDR no humana, o solo algunas de las CDRs pueden reemplazarse por CDRs no humanas. Solo es necesario reemplazar el número de CDRs requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.

Un anticuerpo humanizado puede optimizarse mediante la introducción de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia consenso, sustituciones de la línea germinal y/o mutaciones inversas. Tales moléculas de inmunoglobulina alteradas se pueden preparar mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, y documento EP 239400).

La expresión "anticuerpo humano", "construcción de anticuerpo humano" y "dominio de unión humano" incluye anticuerpos, construcciones de anticuerpos y dominios de unión que tienen regiones de anticuerpo tales como regiones o dominios variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas en la técnica. incluyendo, por ejemplo, los descritos por Kabatet al.(1991)(loc. cit.).Los anticuerpos humanos, construcciones de anticuerpos o dominios de unión de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitioin vitro,o por mutación somáticain vivo),por ejemplo en las CDR, y en particular, en CDR3. Los anticuerpos, las construcciones de anticuerpos o los dominios de unión humanos pueden tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones reemplazadas por un residuo de aminoácido que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. La definición de anticuerpos humanos, construcciones de anticuerpos y dominios de unión, tal como se utiliza en esta memoria también contempla anticuerpos completamente humanos, que incluyen solo secuencias humanas de anticuerpos alteradas no artificialmente y/o genéticamente, ya que se pueden derivar utilizando tecnologías o sistemas tales como el Xenomouse.

En algunas realizaciones, las construcciones de anticuerpos de la invención son construcciones de anticuerpos "aisladas" o "sustancialmente puras". "aislado" o "sustancialmente puro", cuando se usa para describir las construcciones de anticuerpos descritas aquí, significa una construcción de anticuerpo que se ha identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de producción. Preferiblemente, la construcción de anticuerpo está libre o sustancialmente libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tales como el resultante de células transfectadas recombinantes, son materiales que típicamente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Las construcciones de anticuerpos pueden, p. ej., constituir al menos aproximadamente el 5%, o al menos aproximadamente el 50% en peso de la proteína total en una muestra dada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir del 5% al 99,9% en peso del contenido total de proteína, dependiendo de las circunstancias. El polipéptido se puede preparar a una concentración significativamente mayor mediante el uso de un promotor inducible o un promotor de alta expresión, de modo que se produzca a niveles de concentración incrementados. La definición incluye la producción de una construcción de anticuerpo en una amplia diversidad de organismos y/o células huésped que se conocen en la técnica. En realizaciones preferidas, la construcción de anticuerpo se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Sin embargo, normalmente se preparará una construcción de anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.

La expresión "dominio de unión" caracteriza en relación con la presente invención un dominio que (específicamente) se une a / interactúa con / reconoce un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos), aquí: MSLN y CD3, respectivamente. La estructura y función del primer dominio de unión (que reconoce MSLN), y preferiblemente también la estructura y/o función del segundo dominio de unión (que reconoce CD3), se basan en la estructura y/o función de un anticuerpo, por ejemplo de una molécula de inmunoglobulina completa o de longitud completa. Según la invención, el primer dominio de unión se caracteriza por la presencia de tres CDR de cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o tres CDR de cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). El segundo dominio de unión preferiblemente también comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión de la diana. Más preferiblemente, el segundo dominio de unión comprende al menos tres CDR de cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y tres CDR de cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). Se prevé que el primer y/o segundo dominio de unión se produzca o se pueda obtener mediante métodos de rastreo de fagotecas o presentación de fagos en lugar de injertar secuencias de CDR de un anticuerpo (monoclonal) preexistente en un armazón.

De acuerdo con la presente invención, los dominios de unión están en forma de uno o más polipéptidos. Dichos polipéptidos pueden incluir partes proteicas y partes no proteicas (p. ej., enlazadores químicos o agentes reticulantes químicos tales como glutaraldehído). Las proteínas (incluidos fragmentos de las mismas, preferiblemente fragmentos biológicamente activos, y péptidos, que habitualmente tienen menos de 30 aminoácidos) comprenden dos o más aminoácidos acoplados entre sí mediante un enlace peptídico covalente (dando como resultado una cadena de aminoácidos). El término "polipéptido", tal como se utiliza en esta memoria, describe un grupo de moléculas, que habitualmente consiste en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar además multímeros, tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores,es decir,que consisten en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptido que forman este tipo de dímeros, trímeros, etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las correspondientes estructuras de orden superior de multímeros de este tipo se denominan, en consecuencia, homodímeros o heterodímeros, homotrímeros o heterotrímeros, etc. Un ejemplo de un heteromultímero es una molécula de anticuerpo que, en su forma que aparece en la naturaleza, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" también se refieren a péptidos / polipéptidos / proteínas modificados de forma natural, en donde la modificación se efectúa, p. ej., mediante modificaciones postraduccionales, tales como glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Un "péptido", "polipéptido" o "proteína" cuando se le alude en esta memoria también puede modificarse químicamente, tal como pegilarse. Modificaciones de este tipo son bien conocidas en la técnica y se describen más adelante en esta memoria.

Preferiblemente, el dominio de unión que se une a MSLN y/o el dominio de unión que se une a CD3 son dominios de unión humanos. Los anticuerpos y las construcciones de anticuerpos que comprenden al menos un dominio de unión humano evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos o las construcciones de anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes no humanas tales como de roedores (p. ej., murino, rata, hámster o conejo). La presencia de proteínas de este tipo derivadas de roedores puede conducir al rápido aclaramiento de los anticuerpos o construcciones de anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo o la construcción de anticuerpos por parte de un paciente. Para evitar el uso de anticuerpos o construcciones de anticuerpos derivados de roedores, se pueden generar anticuerpos / construcciones de anticuerpos humanos o completamente humanos mediante la introducción de la función de anticuerpos humanos en un roedor, de modo que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos.

La capacidad de clonar y reconstruir loci humanos del tamaño de una megabase en YACs e introducirlos en la línea germinal del ratón proporciona un enfoque poderoso para dilucidar los componentes funcionales de loci muy grandes o mapeados de forma burda, así como para generar modelos útiles de enfermedades humanas. Además, el uso de una tecnología de este tipo para la sustitución de loci de ratón con sus equivalentes humanos podría proporcionar conocimientos únicos sobre la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas y su participación en la inducción y progresión de enfermedades.

Una aplicación práctica importante de una estrategia de este tipo es la "humanización" del sistema inmune humoral del ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los que los genes de Ig endógenos han sido inactivados ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y al ensamblaje de anticuerpos, así como su papel en el desarrollo de las células B. Además, dicha estrategia podría proporcionar una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales (mAbs) completamente humanos - un hito importante para cumplir la promesa de la terapia con anticuerpos en enfermedades humanas. Se espera que los anticuerpos o las construcciones de anticuerpos completamente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los mAbs de ratón o derivatizados de ratón y, por lo tanto, aumenten la eficacia y seguridad de las construcciones de anticuerpos/anticuerpos administradas. Se puede esperar que el uso de anticuerpos o construcciones de anticuerpos completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, autoinmunidad y cáncer, que requieren administraciones repetidas de compuestos.

Un enfoque hacia este objetivo fue diseñar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humana en previsión de que este tipo de ratones producirían un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los grandes fragmentos de Ig humana preservarían la gran diversidad genética variable, así como la regulación adecuada de la producción y expresión de anticuerpos. Al explotar la maquinaria del ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la falta de tolerancia inmunológica a las proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducidos en estas cepas de ratón debería producir anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluidos los antígenos humanos. Utilizando la tecnología de hibridomas, se podrían producir y seleccionar fácilmente mAbs humanos específicos para antígenos con la especificidad deseada. Esta estrategia general se demostró con respecto a la generación de las primeras cepas de ratón XenoMouse (véase Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Las cepas de XenoMouse se modificaron con cromosomas artificiales de levadura (YACs) que contenían fragmentos de configuración de la línea germinal de un tamaño de 245 kb y 190 kb del locus de la cadena pesada humana y del locus de la cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían secuencias de la región central variable y constante. Los YACs que contienen Ig humana demostraron ser compatibles con el sistema de ratón tanto para el reordenamiento como para la expresión de anticuerpos y eran capaces de sustituir los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demostró por su capacidad para inducir el desarrollo de células B, para producir un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos y para generar mAbs humanos específicos para antígenos. Estos resultados también sugirieron que la introducción de porciones más grandes de los loci de Ig humana que contienen un mayor número de genes V, elementos reguladores adicionales y regiones constantes de Ig humana podría recapitular sustancialmente el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral humana a la infección y la inmunización. El trabajo de Green et al. se amplió recientemente a la introducción de más de aproximadamente el 80% del repertorio de anticuerpos humanos mediante la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal de tamaño megabase de los loci de cadena pesada humana y loci de cadena ligera kappa, respectivamente. Véase Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

La producción de los ratones XenoMouse se analiza y delinea adicionalmente en la patente de EE.UU. n.° 6.673.986, patentes de EE.UU. núms. 6.162.963; 6.150.584; 6.114.598; 6.075.181, y 5.939.598, así como el solicitudes de patente de EE.UU. subyacentes y las patentes japonesas núms. 3068 180 B2, 3068 506 B2, y 3068 507 B2. Véanse también Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green and Jakobovits J. Exp. Med.

188:483-495 (1998), EP 0463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310, y WO 03/47336.

En un enfoque alternativo, otros, incluido GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de "minilocus". En el enfoque de minilocus, se imita un locus de Ig exógeno mediante la inclusión de trozos (genes individuales) del locus de Ig. Por lo tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se transforman en una construcción para la inserción en un animal. Este enfoque se describe en la patente de EE.UU. n.° 5.545.807 de Surani et al. y las patentes de EE.UU. núms 5.545.806; 5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; 5.770.429; 5.789.650; 5.814.318; 5.877.397; 5.874.299; y 6.255.458, cada una de Lonberg y Kay, las patentes de EE.UU. núms. 5.591.669 y 6.023.010 de Krimpenfort y Berns, las patentes de EE.UU. núms. 5.612.205; 5.721.367; y 5.789.215 to Berns et al., y la patente de<e E . U U .>n.° 5.643.763 de Choi y Dunn. Este enfoque se describe además en las patentes de EE.UU. de GenPharm International núms. 5.569.825,5.789.650, 5.545.806, 5.661.016, 5.814.318, y 5.364.079, así como las solicitudes de patente subyacentes. Véanse también los documentos EP 0546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y la patente de EE.UU n.° 5.981.175. Véanse además Tayloret al.(1992), Chenet al.(1993), Tuaillonet al.(1993), Choiet al.(1993), Lonberget al.(1994), Tayloret al.(1994), y Tuaillonet al.(1995), Fishwildet al.(1996).

Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, a través de la fusión de microcélulas, se han introducido grandes trozos de cromosomas o cromosomas completos. Véanse las solicitudes de patente europea núms. 773288 y 843961. Xenerex Biosciences está desarrollando una tecnología para la generación potencial de anticuerpos humanos. En esta tecnología, los ratones SCID se reconstituyen con células linfáticas humanas, p. ej., células B y/o T. Luego, los ratones son inmunizados con un antígeno y pueden generar una respuesta inmune contra el antígeno. Véanse las patentes de EE.UU. núms. 5.476.996; 5.698.767; y 5.958.765.

Las respuestas de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) han conducido a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de otro modo. Sin embargo, se espera que se observen determinadas respuestas de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), particularmente en las utilizaciones crónicas o multidosis del anticuerpo. Por lo tanto, sería deseable proporcionar construcciones de anticuerpos que comprendan un dominio de unión humano contra MSLN y un dominio de unión humano contra CD3 para anular las preocupaciones y/o efectos de la respuesta HAMA o HACA.

Las expresiones "(específicamente) se une a", “(específicamente) reconoce", "se dirige (específicamente) a" y "(específicamente) reacciona con” significan de acuerdo con esta invención que un dominio de unión interactúa o interactúa específicamente con un epítopo dado un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos), aquí: MSLN y CD3, respectivamente.

El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente un dominio de unión, tal como un anticuerpo o inmunoglobulina, o un derivado, fragmento o variante de un anticuerpo o una inmunoglobulina. Un "epítopo" es antigénico y, por lo tanto, al término epítopo se le alude a veces también en esta memoria como "estructura antigénica" o "determinante antigénico". Por lo tanto, el dominio de unión es un "sitio de interacción con el antígeno". También se entiende que dicha unión/interacción define un "reconocimiento específico".

"Epítopos" pueden formarse tanto por aminoácidos contiguos como por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Un "epítopo lineal" es un epítopo en el que una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal incluye típicamente al menos 3 o al menos 4, y más habitualmente, al menos 5 o al menos 6 o al menos 7, por ejemplo, aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única.

Un "epítopo conformacional", a diferencia de un epítopo lineal, es un epítopo en el que la secuencia primaria de los aminoácidos que comprenden el epítopo no es el único componente definitorio del epítopo reconocido (por ejemplo, un epítopo en el que la secuencia primaria de aminoácidos no es necesariamente reconocida por el dominio de unión). Típicamente, un epítopo conformacional comprende un mayor número de aminoácidos con relación a un epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopos conformacionales, el dominio de unión reconoce una estructura tridimensional del antígeno, preferiblemente un péptido o proteína o fragmento del mismo (en el contexto de la presente invención, la estructura antigénica para uno de los dominios de unión está comprendida dentro la proteína MSLN). Por ejemplo, cuando una molécula de proteína se pliega para formar una estructura tridimensional, determinados aminoácidos y/o la cadena principal polipeptídica que forma el epítopo conformacional se yuxtaponen, permitiendo que el anticuerpo reconozca el epítopo. Métodos para determinar la conformación de epítopos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos X, espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional (2D-RMN) y espectroscopía de marcación de espín dirigida al sitio y resonancia paramagnética electrónica (EPR).

En lo que sigue se describe un método para el mapeo de epítopos: Cuando una región (un tramo de aminoácidos contiguos) en la proteína MSLN humana se intercambia/reemplaza por su región correspondiente de un antígeno MSLN no humano y no primate (por ejemplo, MSLN de ratón, pero también pueden ser concebibles otros como pollo, rata, hámster, conejo etc.), se espera que se produzca una disminución en la unión del dominio de unión, a menos que el dominio de unión tenga reactividad cruzada para el MSLN no humano ni de primate usado. Dicha disminución es preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%; más preferiblemente al menos 60%, 70% u 80%, y lo más preferible 90%, 95% o incluso 100%, en comparación con la unión a la región respectiva en la proteína MSLN humana, con lo que la unión a la región respectiva en la proteína MSLN humana se establece en 100%. Se prevé que las quimeras MSLN humana/MSLN no humana antes mencionadas se expresen en células CHO. Las quimeras MSLN humana/MSLN no humana también pueden fusionarse con un dominio transmembrana y/o dominio citoplasmático de una proteína unida a membrana diferente, tal como EpCAM, aunque tal técnica no fue necesaria para el método descrito en los Ejemplos 1 y 2.

En un método alternativo o adicional para el mapeo de epítopos, se pueden generar varias versiones truncadas del dominio extracelular de MSLN humana, para determinar una región específica que es reconocida por un dominio de unión. En estas versiones truncadas, los diferentes dominios/subdominios o regiones extracelulares de MSLN se eliminan paso a paso, comenzando desde el extremo N. Las versiones truncadas de MSLN pueden expresarse en células CHO. También se prevé que las versiones truncadas de MSLN puedan fusionarse con un dominio transmembrana y/o un dominio citoplasmático de una proteína unida a membrana diferente, tal como EpCAM. También se prevé que las versiones truncadas de MSLN puedan abarcar un dominio de péptido señal en su extremo N, por ejemplo un péptido señal derivado de un péptido señal de cadena pesada de IgG de ratón. Además, se prevé que las versiones truncadas de MSLN puedan abarcar un dominio v5 en su extremo N (tras el péptido señal) que permite verificar su correcta expresión en la superficie celular. Se espera que se produzca una disminución o pérdida de unión con aquellas versiones de MSLN truncadas que ya no abarcan la región de MSLN reconocida por el dominio de unión. La disminución de la unión es preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; más preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, y lo más preferible 90%, 95% o incluso 100%, por lo que la unión a toda la proteína MSLN humana (o su región o dominio extracelular) se establece en 100%.

Otro método para determinar la contribución de un resto específico de un antígeno diana al reconocimiento por una construcción de anticuerpo o dominio de unión es el barrido de alanina (véase, por ejemplo, Morrison KL y Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 Jun;5(3):302-7), en el que cada resto a analizar se reemplaza por alanina, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida al sitio. La alanina se utiliza debido a su grupo funcional metilo no voluminoso y químicamente inerte que, no obstante, imita las referencias de estructura secundaria que poseen muchos de los otros aminoácidos. A veces, se pueden utilizar aminoácidos voluminosos, tales como valina o leucina, en los casos en los que se desee la conservación del tamaño de los residuos mutados. El escaneo de alanina es una tecnología madura que ha sido utilizada durante un largo período de tiempo.

La interacción entre el dominio de unión y el epítopo o la región que comprende el epítopo implica que un dominio de unión exhiba una afinidad apreciable por el epítopo / la región que comprende el epítopo en una proteína o antígeno particular (aquí: MSLN y CD3, respectivamente), y, generalmente, no presenta reactividad significativa con proteínas o antígenos distintos de MSLN o CD3. "Afinidad apreciable" incluye unión con una afinidad de alrededor de 10-6 M (KD) o más fuerte. Preferiblemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es alrededor de 10 12 a 10-8 M, 10-12 a 10-9 M, 10-12 a 10-10 M, 10-11 a 10-8 M, preferiblemente de alrededor de 10-11 a 10-9 M. Si un dominio de unión reacciona específicamente con o se une a una diana se puede probar fácilmente mediante, entre otros, la comparación de la reacción de dicho dominio de unión con una proteína o antígeno diana con la reacción de dicho dominio de unión con proteínas o antígenos distintos de MSLN o CD3. Preferiblemente, un dominio de unión de la invención no se une esencial o sustancialmente a proteínas o antígenos distintos de MSLN o CD3 (es decir, el primer dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de MSLN, y el segundo dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de CD3).

La expresión "no se une esencial/sustancialmente" o "no es capaz de unirse" significa que un dominio de unión de la presente invención no se une a una proteína o antígeno distinto de MSLN o CD3, es decir, no muestra reactividad de más de 30%, preferiblemente no más de 20%, más preferiblemente no más de 10%, particularmente de forma preferible no más de 9%, 8%, 7%, 6% o 5% con proteínas o antígenos distintos de MSLN o CD3, con lo que la unión a MSLN o CD3, respectivamente, se establece en 100%.

Se cree que la unión específica se efectúa mediante motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno. Por lo tanto, la unión se consigue como resultado de su estructura primaria, secundaria y/o terciaria, así como como resultado de modificaciones secundarias de dichas estructuras. La interacción específica del sitio de interacción del antígeno con su antígeno específico puede resultar en una simple unión de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del sitio de interacción del antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado, alternativa o adicionalmente, el inicio de una señal, p. ej., debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc.

También se prefiere, en una realización de la invención, que el segundo dominio de unión se una a CD3 épsilon humano y a CD3 épsilon deCallithrix jacchus, Saguinus OedipusoSaimirí sciureus.

La presente descripción proporciona una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión se une a un epítopo de MSLN que está comprendido dentro de la región de la MSLN humana que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO seleccionada de SEQ ID NO: 244 (grupo 1+2) y SEQ ID NO: 241 (grupo 4).

La presente invención proporciona una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión se une a un epítopo de MSLN que está comprendido dentro de la región de la MSLN humana que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO: 245 (grupo 2+3), en la que

el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo biespecífica de la invención comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región V<l>que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

Además, entre la presente descripción, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo biespecífica descrita aquí comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 151, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 152, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 153, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 154, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 155 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 156;

b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 211, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 212, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 213, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 214, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 215 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 216; y

c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 221, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 222, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 223, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 224, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 225 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 226.

El término "variable" se refiere a las porciones de los dominios de anticuerpo o de inmunoglobulina que exhiben variabilidad en su secuencia y que están implicadas en la determinación de la especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, el "dominio o dominios variables"). El emparejamiento de una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) juntas forma un único sitio de unión al antígeno.

La variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos; se concentra en sub-dominios de cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera. Estos sub-dominios se denominan "regiones hipervariables" o "regiones determinantes de la complementariedad" (CDRs). Las porciones más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan regiones "marco" (FRM o FR) y proporcionan un armazón para las seis CDRs en el espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas que se producen de forma natural comprenden cada uno cuatro regiones FRM (FR1, FR2, FR3 y FR4), que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de la lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante el FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (véase Kabatet al., loc. cit.).

Los términos "CDR", y su plural "CDRs", se refieren a la región determinante de la complementariedad, de las cuales tres constituyen el carácter de unión de una región variable de la cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3) y tres componen el carácter de unión de una región variable de la cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3). Las CDRs contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno y, por lo tanto, contribuyen en la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: son los principales determinantes de la especificidad del antígeno.

Los límites y las longitudes de la definición exacta de CDR están sujetos a diferentes sistemas de clasificación y numeración. Por lo tanto, Kabat, Chothia, contacto o cualquier otra definición de límites pueden hacer referencia a las CDRs, incluyendo el sistema de numeración descrito en esta memoria. A pesar de los diferentes límites, cada uno de estos sistemas tiene cierto grado de solapamiento en lo que constituye las denominadas "regiones hipervariables" dentro de las secuencias variables. Por tanto, las definiciones de CDR de acuerdo con estos sistemas pueden diferir en longitud y áreas límites con respecto a la región de marco adyacente. Véanse, por ejemplo, Kabat (un enfoque basado en la variabilidad de secuencia entre especies), Chothia (un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo), y/o MacCallum (Kabatet al., loc. cit.;Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; y MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Aún otro patrón más para caracterizar el sitio de unión al antígeno es la definición de AbM utilizada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). En la medida en que dos técnicas de identificación de residuos definan regiones de solapamiento, pero no regiones idénticas, se pueden combinar para definir una CDR híbrida. Sin embargo, se prefiere la numeración de acuerdo con el denominado sistema Kabat.

Típicamente, las CDRs forman una estructura de bucle que se puede clasificar como estructura canónica. La expresión "estructura canónica" se refiere a la conformación de la cadena principal que es adoptada por los bucles de unión a antígeno (CDR). A partir de estudios estructurales comparativos, se ha descubierto que cinco de los seis bucles de unión a antígeno tienen solo un repertorio limitado de conformaciones disponibles. Cada una de las estructuras canónicas puede caracterizarse por los ángulos de torsión de la cadena principal polipeptídica. Los bucles correspondientes entre anticuerpos pueden, por lo tanto, tener estructuras tridimensionales muy similares, a pesar de la alta variabilidad de la secuencia de aminoácidos en la mayoría de las partes de los bucles (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin y Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Además, existe una relación entre la estructura de bucle adoptada y las secuencias de aminoácidos que la rodean. La conformación de una clase canónica particular está determinada por la longitud del bucle y los restos de aminoácidos que residen en posiciones clave dentro del bucle, así como dentro del marco conservado (es decir, fuera del bucle). Por lo tanto, la asignación a una clase canónica particular se puede realizar en función de la presencia de estos residuos de aminoácidos clave.

La expresión "estructura canónica" también puede incluir consideraciones en cuanto a la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo como lo cataloga Kabat (Kabatet al.,loc. cit.). El esquema (sistema) de numeración de Kabat es un patrón ampliamente adoptado para numerar los residuos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo de una manera consistente y es el esquema preferido aplicado en la presente invención como también se menciona en otra parte de esta memoria. También se pueden utilizar consideraciones estructurales adicionales para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por ejemplo, aquellas diferencias que no se reflejan completamente en la numeración de Kabat pueden describirse mediante el sistema de numeración de Chothiaet al.y/o revelarse mediante otras técnicas, por ejemplo cristalografía y modelado computacional bi- o tridimensional. En consecuencia, una secuencia de anticuerpo determinada se puede colocar en una clase canónica que permita, entre otras cosas, identificar secuencias de chasis apropiadas (por ejemplo, basándose en el deseo de incluir una variedad de estructuras canónicas en una biblioteca). En la bibliografía se describe la numeración de Kabat de secuencias de aminoácidos de anticuerpos y consideraciones estructurales como se describe por Chothiaet al., loc. cit.y sus implicaciones para la construcción de aspectos canónicos de la estructura del anticuerpo. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para una revisión de la estructura de anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.

La CDR3 de la cadena ligera y, en particular, la CDR3 de la cadena pesada pueden constituir los determinantes más importantes en la unión del antígeno dentro de las regiones variables de la cadena ligera y pesada. En algunas construcciones de anticuerpos, la CDR3 de la cadena pesada parece constituir el área principal de contacto entre el antígeno y el anticuerpo. Se pueden usar esquemas de selecciónin vitroen los que se varía CDR3 sola para variar las propiedades de unión de un anticuerpo o determinar qué restos contribuyen a la unión de un antígeno. Por lo tanto, la CDR3 es típicamente la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión del anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos residuos de aminoácidos o más de 26 aminoácidos.

En un anticuerpo o una inmunoglobulina de longitud completa clásico, cada una de las cadenas ligeras (L) está enlazada a una cadena pesada (H) por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están enlazadas entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del Isotipo de la cadena H. El dominio CH más próximo a VH se designa habitualmente como CH1. Los dominios constantes ("C") no están directamente implicados en la unión del antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos y la activación del complemento. La región Fc de un anticuerpo está comprendida dentro de los dominios constantes de la cadena pesada y es, por ejemplo, capaz de interactuar con receptores Fc localizados en la superficie de la célula.

La secuencia de genes de anticuerpos después del ensamblaje y la mutación somática es muy variada, y se estima que estos genes variados codifican 1010 moléculas de anticuerpos diferentes (Immunoglobulin Genes, 2a ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Por consiguiente, el sistema inmune proporciona un repertorio de inmunoglobulinas. El término "repertorio" se refiere a al menos una secuencia de nucleótidos derivada total o parcialmente de al menos una secuencia que codifica al menos una inmunoglobulina. La o las secuencias pueden generarse mediante reordenamientoin vivode los segmentos V, D y J de cadenas pesadas, y los segmentos V y J de cadenas ligeras. Alternativamente, la o las secuencias se pueden generar a partir de una célula en respuesta a la cual se produce el reordenamiento, por ejemplo estimulaciónin vitro.Alternativamente, parte o la totalidad de la o las secuencias pueden obtenerse mediante corte y empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis, y otros métodos, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.565.332. Un repertorio puede incluir solo una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluidas las de una colección genéticamente diversa.

Una construcción de anticuerpo según la presente descripción también se puede definir como una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión (preferiblemente humano) que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión se une al mismo epítopo de MSLN que un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en MS_1 a MS_8, es decir, un anticuerpo que comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CD R-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L<2>y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 161, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 162, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 163, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 164, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 165 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 166;

c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 171, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 172, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 173, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 174, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 175 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 176;

d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 181, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 182, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 183, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 184, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 185 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 186;

e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 191, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 192, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 193, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 194, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 195 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 196;

f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 201, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 202, CDR-H<3>como se representa en SEQ ID NO: 203, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 204, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 205 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 206;

g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 211, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 212, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 213, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 214, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 215 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 216; y

h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 221, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 222, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 223, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 224, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 225 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 226.

Si una construcción de anticuerpo se une o no al mismo epítopo de MSLN que otra construcción de anticuerpo determinada se puede medir, por ejemplo, mediante mapeo de epítopos con moléculas diana quiméricas o truncadas, por ejemplo como se describe aquí y en los Ejemplos 1 y 2 adjuntos.

Una construcción de anticuerpo según la presente descripción también se puede definir como una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión (preferiblemente humano) que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión compite por la unión con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en MS_1 a MS_8, es decir, un anticuerpo que comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CD R-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en las descritas anteriormente.

El que una construcción de anticuerpo compita o no por la unión con otra construcción de anticuerpo dada, se puede medir en un ensayo de competencia tal como un ELISA competitivo o un ensayo de competencia basado en células. También se pueden utilizar micropartículas (perlas) acopladas a avidina. De manera similar a una placa ELISA recubierta de avidina, cuando se hace reaccionar con una proteína biotinilada, cada una de estas perlas se puede utilizar como un sustrato sobre el cual se puede realizar un ensayo. El antígeno se recubre sobre una perla y luego se recubre con el primer anticuerpo. Se añade el segundo anticuerpo y se determina cualquier unión adicional. Los posibles medios para la lectura incluyen citometría de flujo.

En una realización, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, y SEQ ID NO: 207. Está entre la presente descripción que el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí comprenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 217, y SEQ ID NO: 227.

En una realización adicional, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, y SEQ<i D>NO: 208. Está entre la presente descripción que el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí comprenda una región VL seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 218, y SEQ ID NO: 228.

En otra realización, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VH y una región VL seleccionadas del grupo que consiste en pares de una región VH y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 167+168, SEQ ID NO: 177+178, SEQ ID NO: 187+188, SEQ ID NO: 197+198 y SEQ ID NO: 207+208. Está entre la presente descripción que el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí comprenda una región VH y una región VL seleccionadas del grupo que consiste en pares de una región VH y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 157+158, SEQ ID NO: 217+218 y SEQ ID NO: 227+228.

En aún una realización adicional, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209. Está entre la presente descripción que el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí comprenda un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 219, y SEQ ID<n O :>229.

Los primeros dominios de unión anteriores (que se especifican por sus CDR, región VH y región VL, y combinaciones de las mismas) se caracterizan como dominios de unión que se unen a un epítopo de MSLN como se representa en las SEQ ID NO: 231,232 y 233.

El término "biespecífica", como se usa aquí, se refiere a una construcción de anticuerpo que es "al menos biespecífica", es decir, comprende al menos un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión, en la que el primer dominio de unión se une a un antígeno o diana (aquí: MSLN), y el segundo dominio de unión se une a otro antígeno o diana (aquí: CD3). Por consiguiente, las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención comprenden especificidades para al menos dos antígenos o dianas diferentes. La expresión "construcción de anticuerpos biespecíficas" de la invención también abarca construcciones de anticuerpos multiespecíficos, tales como construcciones de anticuerpos triespecíficos, las últimas incluyen tres dominios de unión, o construcciones que tienen más de tres (por ejemplo, cuatro, cinco...) especificidades.

Dado que las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención son (al menos) biespecíficas, no se producen de forma natural y son marcadamente diferentes de los productos que se producen de forma natural. Una construcción de anticuerpo o inmunoglobulina "biespecífica" es, por lo tanto, un anticuerpo híbrido artificial o inmunoglobulina que tiene al menos dos sitios de unión distintos con diferentes especificidades. Construcciones de anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una diversidad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o el enlace de fragmentos Fab’. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).

Los al menos dos dominios de unión y los dominios variables de la construcción de anticuerpo de la presente invención pueden comprender o no enlazadores peptídicos (péptidos espaciadores). La expresión "enlazador peptídico" comprende, de acuerdo con la presente invención, una secuencia de aminoácidos mediante la cual las secuencias de aminoácidos de un dominio (variable y/o de unión) y otro dominio (variable y/o de unión) de la construcción de anticuerpos de la invención están enlazados entre sí. Una característica técnica esencial de un enlazador peptídico de este tipo es que no comprende actividad de polimerización alguna. Entre los enlazadores peptídicos adecuados se encuentran los descritos en las patentes de EE.UU. 4.751.180 y 4.935.233 o WO 88/09344. Los enlazadores peptídicos también se pueden utilizar para fijar otros dominios o módulos o regiones (tales como dominios que extienden la semivida) a la construcción de anticuerpo de la invención.

En el caso de que se utilice un enlazador, este enlazador es preferiblemente de una longitud y secuencia suficientes para asegurar que cada uno de los dominios primero y segundo puedan, independientemente uno de otro, conservar sus especificidades de unión diferenciales. Para los enlazadores peptídicos que conectan los al menos dos dominios de unión (o dos dominios variables) en la construcción de anticuerpo de la invención, se prefieren aquellos enlazadores peptídicos que comprenden sólo un pequeño número de restos de aminoácidos, por ejemplo 12 restos de aminoácidos o menos. Por lo tanto, se prefieren enlazadores peptídicos de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 residuos de aminoácidos. Un enlazador peptídico contemplado con menos de 5 aminoácidos comprende 4, 3, 2 o uno o más aminoácidos, en donde se prefieren enlazadores ricos en Gly. Un aminoácido "único" particularmente preferido en el contexto de dicho "enlazador peptídico" es Gly. Por consiguiente, dicho enlazador peptídico puede consistir en un solo aminoácido Gly. Otra realización preferida de un enlazador peptídico se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir, Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), o polímeros de la misma, es decir (Gly4Ser)x, en que x es un número entero de 1 o mayor (p. ej., 2 o 3). Enlazadores preferidos se representan en SEQ ID NOs: 1-9. Las características de dicho enlazador peptídico, que comprende la ausencia de promoción de estructuras secundarias, se conocen en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) y Raag y Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Se prefieren enlazadores peptídicos que, además, no fomenten estructuras secundarias. La unión de dichos dominios entre sí se puede proporcionar, por ejemplo, mediante ingeniería genética, como se describe en los ejemplos. Los métodos para preparar construcciones monocatenarias biespecíficas fusionadas y unidas operativamente, y para expresarlas en células de mamíferos o bacterias, son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, WO 99/54440 o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001).

Como se describió anteriormente aquí, la invención proporciona una realización preferida en la que la construcción de anticuerpo está en un formato seleccionado del grupo que consiste en (scFv)<2>, mAb de dominio único de scFv, diacuerpos y oligómeros de cualquiera de esos formatos.

De acuerdo con una realización particularmente preferida, y como se documenta en los ejemplos adjuntos, la construcción de anticuerpo de la invención es una "construcción de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico", más preferiblemente un "Fv de cadena sencilla" biespecífico (scFv). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes distintos, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético -como se describe anteriormente aquí-, que permite crearlos como un solo cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar una molécula monovalente; véase, por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y la función de los fragmentos se evalúa de la misma manera que los anticuerpos completos o de longitud completa. Un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) es, por lo tanto, una proteína de fusión de la región variable de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) de inmunoglobulinas, habitualmente conectada con un péptido enlazador corto de aproximadamente diez a aproximadamente 25 aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 15 a 20 aminoácidos. El enlazador suele ser rico en glicina para la flexibilidad, así como en serina o treonina para la solubilidad, y puede conectar el extremo N del VH con el extremo C del VL, oviceversa.Esta proteína conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción del enlazador.

Las moléculas biespecíficas monocatenarias se conocen en la técnica, y se describen en WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véanse,entre otros,patente de EE.UU 4.946.778, Kontermann y Dübel (2010),loc. cit.y Little (2009),loc. cit.)se pueden adaptar para producir construcciones de anticuerpos monocatenarias que reconozcan específicamente una(s) diana(s) elegida(s).

Los fragmentos variables monocatenarios bivalentes (también llamados divalentes) o biespecíficos (bi-scFv o di-scFv, que tienen el formato (scFv)<2>, se pueden diseñar uniendo dos moléculas scFv (por ejemplo con enlazadores como se describe aquí anteriormente). Si estas dos moléculas de scFv tienen la misma especificidad de unión, la molécula de (scFv<)2>resultante se denominará preferiblemente bivalente (es decir, tiene dos valencias para el mismo epítopo diana). Si las dos moléculas de scFv tienen diferentes especificidades de unión, la molécula de (scFv<)2>resultante se denominará preferiblemente biespecífica. El enlazamiento se puede realizar produciendo una única cadena peptídica con dos regiones VH y dos regiones VL, produciendo scFv en tándem (véase,por ejemploKufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). Otra posibilidad es la creación de moléculas de scFv con péptidos enlazadores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas (por ejemplo, alrededor de cinco aminoácidos), lo que obliga a los scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos (véase,por ejemploHollinger, Philipp et al., (July 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8.).

Según una realización también preferida de la construcción de anticuerpos de la invención, la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (VL) de un dominio de unión que se une al antígeno diana MSLN o CD3 no están conectadas directamente a través de un enlazador peptídico descrito anteriormente, sino que el dominio de unión se forma debido a la formación de una molécula biespecífica como se describe para el diacuerpo. Por tanto, la cadena VH del dominio de unión a CD3 se puede fusionar con la VL del dominio de unión a MSLN mediante tal enlazador peptídico, mientras que la cadena VH del dominio de unión a MSLN se fusiona con la VL del dominio de unión a CD3 mediante tal enlazador peptídico.

Los anticuerpos de dominio único comprenden simplemente un dominio variable de anticuerpo (monomérico) que es capaz de unirse selectivamente a un antígeno específico, independientemente de otras regiones o dominios V. Los primeros anticuerpos de dominio único se modificaron a partir de anticuerpos de cadena pesada que se encuentran en los camélidos, y a estos se les denomina fragmentos V<h>H. Los peces cartilaginosos también tienen anticuerpos de cadena pesada (IgNAR) a partir de los cuales se pueden obtener anticuerpos de dominio único denominados fragmentos V<nar>. Un enfoque alternativo es dividir los dominios variables diméricos de inmunoglobulinas comunes, por ejemplo de humanos o roedores, en monómeros, obteniendo así VH o VL como un Ab de dominio único. Aunque la mayoría de las investigaciones sobre anticuerpos de dominio único se basan actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha demostrado que los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopos diana. Ejemplos de anticuerpos de dominio único se denominan sdAb, nanocuerpos o anticuerpos de dominio variable único.

Un (mAb de dominio único<)2>es, por lo tanto, una construcción de anticuerpo monoclonal compuesta de (al menos) dos anticuerpos monoclonales de dominio único, que se seleccionan individualmente del grupo que comprende VH, VL, V<h>H y V<nar>. El enlazador está preferiblemente en forma de un enlazador peptídico. De forma similar, un "mAb de dominio único scFv" es una construcción de anticuerpo monoclonal compuesto por al menos un anticuerpo de dominio único como se describe arriba y una molécula de scFv como se describe arriba. De nuevo, el enlazador está preferiblemente en forma de un enlazador peptídico.

La presente invención proporciona una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión se une a un epítopo de MSLN que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 245 (grupo 2+3), en la que el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo biespecífica comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 191, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 192, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 193, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 194, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 195 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 196;

En una realización, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, y SEQ ID NO: 207.

En una realización adicional, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, y SEQ ID NO: 208.

En otra realización, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VH y una región VL seleccionadas del grupo que consiste en pares de una región VH y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 167+168, SEQ ID NO: 177+178, SEQ ID NO: 187+188, SEQ ID NO: 197+198 y SEQ ID NO: 207+208.

En una realización adicional, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209.

La presente descripción también proporciona una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión se une a un epítopo de MSLN que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 244 (grupo 1+2).

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo biespecífica descrita aquí puede comprender una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como sigue:

(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 151, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 152, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 153, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 154, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 155 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 156; o

(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 221, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 222, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 223, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 224, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 225 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 226.

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí puede comprender una región VH representada en SEQ ID NO: 157 o SEQ ID NO: 227.

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí puede comprender una región VL representada en SEQ ID NO: 158, y SEQ ID NO: 228.

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí puede comprender una región VH y una región VL seleccionadas del grupo que consiste en pares de una región VH y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 157+158 y SEQ ID NO: 227+228.

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí puede comprender un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 159, y SEQ ID NO: 229.

La presente descripción también proporciona una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión se une a un epítopo de MSLN que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 241 (grupo 4).

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo biespecífica descrita aquí puede comprender una región VH que comprende CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 211, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 212, CDR-H3 como se representa en<s>E<q>ID NO: 213, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 214, CDR-L2 como se representa en s Eq ID NO: 215 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 216.

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí puede comprender una región VH representada en SEQ ID NO: 217.

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí puede comprender una región VL representada en SEQ ID NO: 218.

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí puede comprender una región VH y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 217+218.

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo descrita aquí puede comprender un polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 219.

Otra construcción de anticuerpo descrita aquí también se puede definir como una construcción de anticuerpo biespecífica que comprende un primer dominio de unión (preferiblemente humano) que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión compite por la unión con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en MS-3, MS-4 y MS-5, es decir, un anticuerpo que comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en las descritas anteriormente.

Las células T o linfocitos T son un tipo de linfocito (en sí mismo un tipo de glóbulo blanco) que juegan un papel central en la inmunidad mediada por células. Existen subconjuntos de células T, cada uno con una función distinta. Las células T se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como células B y células NK, por la presencia de un receptor de células T (TCR, por sus siglas en inglés) en la superficie celular. El TCR es el responsable de reconocer antígenos unidos a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y está compuesto por dos cadenas de proteínas diferentes. En el 95 % de las células T, el TCR consiste en una cadena alfa (a) y una cadena beta (p). Cuando el TCR interactúa con el péptido antigénico y el MHC (complejo péptido / MHC), el linfocito T se activa a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, co-receptores, moléculas adaptadoras especializadas y factores de transcripción activados o liberados.

El complejo del receptor CD3 es un complejo proteico y está compuesto por cuatro cadenas. En los mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3<y>(gamma), una cadena CD35 (delta) y dos cadenas CD3s (épsilon). Estas cadenas se asocian con el receptor de linfocitos T (TCR) y la denominada cadena Z (zeta) para formar el complejo receptor de linfocitos T CD3 y generar una señal de activación en los linfocitos T. Las cadenas CD3y (gamma), CD35 (delta) y CD3s (épsilon) son proteínas de la superficie celular muy relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un único dominio de inmunoglobulina extracelular. Las colas intracelulares de las moléculas de CD3 contienen un único motivo conservado, conocido como un motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM para abreviar, que es esencial para la capacidad de señalización del TCR. La molécula de CD3 épsilon es un polipéptido que en seres humanos está codificado por el genCD3Eque reside en el cromosoma 11. El epítopo más preferido de CD3 épsilon está comprendido dentro de los restos de aminoácidos 1 -27 del dominio extracelular de CD3 épsilon humano.

La lisis redirigida de células diana mediante el reclutamiento de células T por una construcción de anticuerpo multiespecífica, al menos biespecífica, implica la formación de sinapsis citolíticas y el suministro de perforina y granzimas. Las células T comprometidas son capaces de realizar lisis de células diana en serie, y no se ven afectadas por mecanismos de escape inmunológico que interfieren con el procesamiento y la presentación del antígeno peptídico, o la diferenciación de células T clonales; véase, por ejemplo, el documento WO 2007/042261.

La citotoxicidad mediada por construcciones de anticuerpos biespecíficos MSLNxCD3 se puede medir de diversas formas. Véase Ejemplos 5. Las células efectoras pueden ser, p. ej., células T CD8 positivas (humanas) enriquecidas estimuladas o células mononucleares de la sangre periférica (humanas) no estimuladas (PBMC). Si las células diana son de origen de macaco o expresan o se transfectan con MSLN de macaco, las células efectoras también deberían ser de origen de macaco, tal como una línea de células T de macaco, por ejemplo 4119LnPx. Las células diana deberían expresar (al menos el dominio extracelular de) MSLN, por ejemplo MSLn humana o de macaco. Las células diana pueden ser una línea celular (tal como CHO) que se transfecta de forma estable o transitoria con MSLN, por ejemplo MSLN humana o de macaco. Alternativamente, las células diana pueden ser una línea celular expresadora natural positiva para MSLN, tal como la línea celular humana OVCAR-8. Por lo general, se espera que los valores de CE50 sean más bajos con líneas celulares diana que expresan niveles más altos de MSLN en la superficie celular. La relación entre la célula efectora a diana (E:T) es habitualmente de aproximadamente 10:1, pero también puede variar. La actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficos MSLNxCD3 se puede medir en un ensayo de liberación de cromo 51 (tiempo de incubación de aproximadamente 18 horas) o en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (tiempo de incubación de aproximadamente 48 horas). También son posibles modificaciones del tiempo de incubación del ensayo (reacción citotóxica). Otros métodos para medir la citotoxicidad son bien conocidos por la persona experta y comprenden ensayos MTT o MTS, ensayos basados en ATP, incluyendo ensayos bioluminiscentes, el ensayo de sulforrodamina B (SRB), el ensayo WST, ensayo clonogénico y la tecnología ECIS.

La actividad citotóxica mediada por las construcciones de anticuerpos biespecíficos MSLNxCD3 de la presente invención se mide preferiblemente en un ensayo de citotoxicidad basado en células. También se puede medir en un ensayo de liberación de cromo 51. Se representa por el valor de CE<50>, que corresponde a la mitad de la concentración efectiva máxima (concentración de la construcción de anticuerpo que induce una respuesta citotóxica a medio camino entre el valor inicial y el máximo). Preferiblemente, el valor de CE<50>de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 es <5000 pM o <4000 pM, más preferiblemente <3000 pM o <2000 pM, incluso más preferiblemente <1000 pM o <500 pM, incluso más preferiblemente <400 pM o <300 pM, incluso más preferiblemente <200 pM, incluso más preferiblemente <100 pM, incluso más preferiblemente <50 pM, incluso más preferiblemente <20 pM o <10 pM, y lo más preferible <5 pM.

Los valores de CE<50>indicados anteriormente se pueden medir en diferentes ensayos. El experto es consciente de que se puede esperar que un valor de CE<50>sea menor cuando se usan células T CD8+ estimuladas/enriquecidas como células efectoras, en comparación con PBMC no estimuladas. Además, se puede esperar que los valores de CE<50>sean más bajos cuando las células diana expresan un número elevado del antígeno diana en comparación con una tasa baja de expresión diana. Por ejemplo, cuando se usan células T CD8+ humanas estimuladas/enriquecidas como células efectoras (y se usan células transfectadas con MSLN tales como células CHO o una línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8 como células diana), el valor de CE<50>de la construcción de anticuerpo biespecífica MSLN xCD3 es preferiblemente <1000 pM, más preferiblemente <500 pM, incluso más preferiblemente <250 pM, incluso más preferiblemente <100 pM, incluso más preferiblemente <50 pM, incluso más preferiblemente <10 pM, y lo más preferible <5 pM. Cuando se usan PBMC humanas como células efectoras, el valor de CE<50>de la construcción de anticuerpo biespecífica MSLNxCD3 es preferiblemente <5000 pM o <4000 pM (en particular cuando las células diana son una línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8), más preferiblemente <2000 pM (en particular cuando las células diana son células transfectadas con MSLN, tales como células CHO), más preferiblemente <1000 pM o <500 pM, incluso más preferiblemente <200 pM, incluso más preferiblemente <150 pM, incluso más preferiblemente <100 pM, y lo más preferible <50 pM, o menor. Cuando se usa como células efectoras una línea celular T de macaco tal como LnPx4119, y se usa como línea celular diana una línea celular transfectada con MSLN de macaco tal como células CHO, el valor de CE<50>de la construcción de anticuerpo biespecífica MSLN xCD3 es preferiblemente <2000 pM o <1500 pM, más preferiblemente <1000 pM o <500 pM, incluso más preferiblemente <300 pM o <250 pM, incluso más preferiblemente <100 pM, y lo más preferible <50 pM.

Preferiblemente, las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 de la presente invención no inducen/median la lisis o no inducen/median esencialmente la lisis de células negativas para MSLN, tales como células CHO. La expresión "no induce la lisis", "no induce esencialmente la lisis", "no media la lisis" o "no media esencialmente la lisis" significa que una construcción de anticuerpo de la presente invención no induce ni media la lisis más de 30%, preferiblemente no más de 20%, más preferiblemente no más de 10%, particularmente de forma preferible no más de 9%, 8%, 7%, 6% o 5% de células negativas para MSLN, con lo cual la lisis de una línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8 (véase anteriormente) se establece en 100%. Esto se aplica habitualmente a concentraciones de la construcción de anticuerpo de hasta 500 nM. La persona experta sabe cómo medir la lisis celular sin más preámbulos. Además, la presente memoria descriptiva enseña instrucciones específicas sobre cómo medir la lisis celular.

La diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y dimérica de construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLN xCD3 individuales se denomina "brecha de potencia". Esta brecha de potencia se puede calcular, por ejemplo, como relación entre los valores de CE<50>de la forma monomérica y dimérica de la molécula; véase el Ejemplo 5.8. Las brechas de potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 de la presente invención son preferiblemente < 5, más preferiblemente < 4, incluso más preferiblemente < 3, incluso más preferiblemente < 2, además preferiblemente < 1, y lo más preferible < 0,3.

El primero y/o el segundo (o cualquier otro) dominio(s) de unión de la construcción de anticuerpo de la invención es/son preferiblemente específico de especies cruzadas para miembros del orden de primates de mamíferos. Los dominios de unión a CD3 específicos entre especies se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008/119567. Según una realización, el primer y/o segundo dominio de unión, además de unirse aMSLNhumana y CD3 humano, respectivamente, también se unirá aMSLN/CD3 de primates, incluyendo (pero sin limitarse a) primates del nuevo mundo (tales comoCallithrix jacchus, Saguinus OedipusoSaimirí sciureus),primates del viejo mundo (tales como babuinos y macacos), gibones, orangutanes, y homínidos no humanos. Se prevé que el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana también se una al menos a MSLN de macaco, y/o el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T también se una al menos al CD3 de macaco. Un macaco preferido esMacaca fascicularis.También se prevéMacaca mulatta(Rhesus).

En un aspecto de la invención, el primer dominio de unión se une a MSLN humana y además se une a MSLN de macaco, tal como MSLN deMacaca fascicularis,y más preferiblemente, a MSLN de macaco expresada en las células de macaco de superficie. Una MSLN deMacaca fascicularispreferida se representa en SEQ ID NO: 234. La afinidad del primer dominio de unión para MSLN de macaco es preferiblemente <15 nM, más preferiblemente <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, incluso más preferiblemente <1 nM, incluso más preferiblemente <05 nM, incluso más preferiblemente <0,1 nM. y lo más preferible <0,05 nM, o incluso <0,01 nM.

Preferiblemente, la brecha de afinidad de las construcciones de anticuerpos según la invención para la unión a MSLN de macaco frente a MSLN humana [ma MSLN:hu MSLN] (según lo determinado, por ejemplo, mediante análisis BiaCore o Scatchard) es <100, preferiblemente <20, más preferiblemente <15, aún más preferiblemente <10, incluso más preferiblemente <8, más preferiblemente <6, y lo más preferible <2. Los intervalos preferidos para la brecha de afinidad de las construcciones de anticuerpos según la invención para la unión a MSLN de macaco frente a MSLN humana están entre 0,1 y 20, más preferiblemente entre 0,2 y 10, incluso más preferiblemente entre 0,3 y 6, incluso más preferiblemente entre 0,5 y 3, o entre 0,5 y 2,5, y lo más preferible entre 0,5 y 2 o entre 0,6 y 2. Véase Ejemplos 3.

Por consiguiente, de acuerdo con esta invención, se prefieren construcciones de anticuerpos que comprenden un aglutinante de MSLN para el grupo de epítopos 2+3, y se ha demostrado que todas tienen una brecha de afinidad <15. También se prefieren construcciones de anticuerpos que comprenden un aglutinante de MSLN para el grupo de epítopos 2+3 que tienen una brecha de afinidad <6, tales como construcciones de anticuerpos biespecíficas basadas en MS-3, MS-4 o MS-5.

En una realización de la construcción de anticuerpos de la invención, el segundo dominio de unión se une a CD3 épsilon humano y a CD3 épsilon deCallithrix jacchus, Saguinus OedipusoSaimirí sciureus.Preferiblemente, el segundo dominio de unión se une a un epítopo extracelular de estas cadenas de CD3 épsilon. También se prevé que el segundo dominio de unión se una a un epítopo extracelular de la cadena de CD3 épsilon humano y deMacaca.El epítopo más preferido de CD3 épsilon está comprendido dentro de los restos de aminoácidos 1-27 del dominio extracelular de CD3 épsilon humano. Incluso más específicamente, el epítopo comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu.Callithrix jacchus y Saguinus oedipusson primates del nuevo mundo que pertenecen a la familia deCallitrichidae,mientras queSaimiri sciureuses un primate del nuevo mundo que pertenece a la familia deCebidae.

Se prefiere particularmente para la construcción de anticuerpos de la presente invención que el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T comprenda una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:

(a) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 27 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 28 del documento WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 29 del documento WO 2008/119567;

(b) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 117 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 118 del documento WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 119 del documento WO 2008/119567; y

(c) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 153 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 154 del documento WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 155 del documento WO 2008/119567.

En una realización alternativamente preferida de la construcción de anticuerpos de la presente invención, el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 12 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 13 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 14 del documento WO 2008/119567;

(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 30 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 31 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 32 del documento WO 2008/119567;

(c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 48 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 49 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 50 del documento WO 2008/119567;

(d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 66 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 67 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 68 del documento WO 2008/119567;

(e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 84 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 85 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 86 del documento WO 2008/119567;

(f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 102 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 103 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 104 del documento WO 2008/119567;

(g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 120 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 121 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 122 del documento WO 2008/119567;

(h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 138 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 139 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 140 del documento WO 2008/119567;

(i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 156 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 157 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 158 del documento WO 2008/119567; y

(j) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 174 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID<N o :>175 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 176 del documento WO 2008/119567.

Se prefiere además para la construcción de anticuerpos de la presente invención que el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T comprenda una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99, y SEQ ID NO: 102 (véase también SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 o 165 del documento WO 2008/119567).

Alternativamente, se prefiere que el segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T comprenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, y SEQ ID NO: 101 (véase también SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181 del documento WO 2008/119567).

Más preferiblemente, la construcción de anticuerpos de la presente invención se caracteriza por el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T que comprende una región VL y una región VH seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 17 o 21 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 15 o 19 del documento WO 2008/119567;

(b) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 35 o 39 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 33 o 37 del documento WO 2008/119567;

(c) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 53 o 57 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 51 o 55 del documento WO 2008/119567;

(d) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 71 o 75 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 69 o 73 del documento WO 2008/119567;

(e) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 89 o 93 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 87 o 91 del documento WO 2008/119567;

(f) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 107 o 111 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 105 o 109 del documento WO 2008/119567;

(g) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 125 o 129 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 123 o 127 del documento WO 2008/119567;

(h) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 143 o 147 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 141 o 145 del documento WO 2008/119567;

(i) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 161 o 165 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 159 o 163 del documento WO 2008/119567; y

(j) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 179 o 183 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 177 o 181 del documento WO 2008/119567.

También se prefiere, en relación con la construcción de anticuerpos de la presente invención, un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T que comprende una región VL como se representa en<S e Q>ID NO: 102 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 101.

De acuerdo con una realización preferida de la construcción de anticuerpo de la presente invención, los dominios de unión y, en particular, el segundo dominio de unión (que se une a CD3 humana sobre la superficie de una célula T) tienen el siguiente formato: Los pares de regiones VH y VL están en el formato de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv). Las regiones VH y VL están dispuestas en el orden VH-VL o VL-VH. Se prefiere que la región VH esté posicionada en el extremo N de una secuencia de enlazador, y que la región VL esté posicionada en el extremo C de la secuencia de enlazador.

Una realización preferida de la construcción de anticuerpos de la presente invención descrita anteriormente se caracteriza por el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103 (véase también SEQ ID NO: 23, 25, 41,43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187 del documento WO 2008/119567).

También se prevé que la construcción de anticuerpos de la invención tenga, además de su función de unirse a las moléculas diana MSLN y CD3, una función adicional. En este formato, la construcción de anticuerpo es una construcción de anticuerpo trifuncional o multifuncional que se dirige contra células diana mediante la unión a MSLN, mediando la actividad de las células T citotóxicas a través de la unión a CD3 y proporcionando una función adicional tal como un dominio constante Fc completamente funcional que media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mediante el reclutamiento de células efectoras como células NK, un marcador (fluorescente, etc.), un agente terapéutico tal como una toxina o radionúclido, y/o medios para mejorar la vida media en suero, etc.

Ejemplos de medios para prolongar la semivida en suero de las construcciones de anticuerpos de la invención incluyen péptidos, proteínas o dominios de proteínas, que están fusionados o fijados de otra manera a las construcciones de anticuerpos. El grupo de péptidos, proteínas o dominios proteicos incluye péptidos que se unen a otras proteínas con perfil farmacocinético preferido en el cuerpo humano, tal como albúmina sérica (véase el documento WO 2009/127691). Un concepto alternativo de dichos péptidos que prolongan la vida media incluye péptidos que se unen al receptor Fc neonatal (FcRn, véase el documento WO 2007/098420), que también se puede usar en las construcciones de la presente invención. El concepto de unir dominios más grandes de proteínas o proteínas completas incluye, por ejemplo, la fusión de seroalbúmina humana, variantes o mutantes de seroalbúmina humana (véanse los documentos WO 2011/051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) o sus dominios, así como la fusión de la región constante de inmunoglobulinas (dominios Fc) y sus variantes. Tales variantes de dominios Fc pueden optimizarse/modificarse para permitir el emparejamiento deseado de dímeros o mulímeros, para suprimir la unión al receptor Fc (por ejemplo, el receptor Fcy), o por otras razones. Un concepto adicional conocido en la técnica para prolongar la semivida de pequeños compuestos proteicos en el cuerpo humano es la pegilación de esos compuestos, tales como la construcción de anticuerpos de la presente invención.

En una realización preferida, la construcción de anticuerpos de la invención se describe como sigue:

(a) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209,;

<o>un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-9; y

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103; y

<o>opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

(b) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209;

<o>un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103;

<o>opcionalmente un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104-134; y

o opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

(c) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLX<1>PANG (SEQ ID NO: 135) mientras que X<1>es Y o H; y

o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209; o un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103;

o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) o QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); y

o opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

(d) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N

o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, y SEQ ID NO: 101;

o un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, y SEQ ID NO: 208, y un resto de serina en el extremo C;

<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 140; y<o>un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

■ un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, y SEQ ID NO: 207;

■ un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

■ un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99, y SEQ ID NO: 102, y un resto de serina en el extremo C;

■ un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 141; (e) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, y SEQ ID NO: 101;

<o>un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8; o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, y SEQ ID NO: 208;<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 142; y<o>un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

■ un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

■ un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 143; (f) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

<o>un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103; y<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 144; y<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 145;

(g) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209; y

<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 146; y<o>un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

■ un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103; y

■ un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 147; (h) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 148; y<o>un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

■ un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 149; o (i) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209; o un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103; y o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 150.

También se describen aquí construcciones de anticuerpos descritas como sigue:

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 219, y SEQ ID NO: 229;

o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103; y o opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

o un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

o opcionalmente un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104-134; y

<o>opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLX<1>PANG (SEQ ID NO: 135) mientras que X<1>es Y o H; y

<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) o QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); y

<o>opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

<o>un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en<S e Q i D>NO: 158, SEQ ID NO: 218, y SEQ ID NO: 228, y un resto de serina en el extremo C;

<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 140; y

<o>un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

■ un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 217, y SEQ ID NO: 227;

<o>un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 218, y SEQ ID NO: 228;

<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 142; y

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 219, y SEQ ID NO: 229; y

<o>un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103; y<o>un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 150.

Como se describió arriba, varias construcciones de anticuerpos preferidas de la invención se modifican mediante fusión con otro resto, tal como albúmina o variantes de albúmina. Si estas construcciones de fusión se caracterizan por sus propiedades, en particular afinidad por la diana o actividad citotóxica, el experto sabrá que se puede esperar que construcciones de fusión similares o construcciones de anticuerpos biespecíficas no modificadas tengan propiedades similares (o incluso mejores). Por ejemplo, si una construcción de anticuerpo biespecífica fusionada con albúmina tiene una actividad citotóxica o afinidad por la diana apreciable o deseable, se puede esperar que se observe la misma/similar o incluso mayor actividad citotóxica/afinidad por la diana para la construcción sin albúmina.

De acuerdo con otra realización preferida, la construcción de anticuerpo biespecífico de la invención comprende (además de los dos dominios de unión) un tercer dominio que comprende dos monómeros polipeptídicos, cada uno de los cuales comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, en donde dichos dos polipéptidos (o monómeros polipeptídicos) están fusionados entre sí mediante un enlazador peptídico. Preferiblemente, dicho tercer dominio comprende en un orden N- a C-terminal: bisagra-CH2-CH3-enlazador-bisagra-CH2-CH3. Las secuencias de aminoácidos preferidas para dicho tercer dominio se representan en las SEQ ID NOs: 260-267. Cada uno de dichos dos monómeros polipeptídicos tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 252-259, o que es al menos un 90% idéntica a esas secuencias. En otra realización preferida, el primer y segundo dominios de unión de la construcción de anticuerpo biespecífico de la invención se fusionan al tercer dominio mediante un enlazador peptídico que se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

En línea con la presente invención, una "bisagra" es una región bisagra de IgG. Esta región se puede identificar por analogía utilizando la numeración de Kabat, véanse las posiciones 223-243 de Kabat. De acuerdo con lo anterior, el requisito mínimo para una "bisagra" son los restos de aminoácidos correspondientes al tramo de secuencia de IgGi de D231 a P243 según la numeración de Kabat. Los términos CH2 y CH3 se refieren a las regiones constantes 2 y 3 de la cadena pesada de inmunoglobulina. Estas regiones también pueden identificarse por analogía utilizando la numeración de Kabat, véanse las posiciones de Kabat 244-360 para CH2 y las posiciones de Kabat 361-478 para CH3. Se entiende que existe cierta variación entre las inmunoglobulinas en términos de su región Fc de IgG<1>, región Fc de IgG<2>, región Fc de IgG3, región Fc de IgG4, región Fc de IgM, región Fc de IgA, región Fc de IgD, y región Fc de IgE (véase, por ejemplo, Padlan, Molecular Immunology, 31 (3), 169-217 (1993)). La expresión monómero Fc se refiere a las dos últimas regiones constantes de la cadena pesada de IgA, IgD e IgG, y a las últimas tres regiones constantes de la cadena pesada de IgE e IgM. El monómero Fc también puede incluir la bisagra N-terminal flexible con respecto a estos dominios. Para IgA e IgM, el monómero Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, la porción Fc comprende los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 y la bisagra entre los dos primeros dominios y CH2. Aunque los límites de la porción Fc de una inmunoglobulina pueden variar, un ejemplo de una porción Fc de cadena pesada de IgG humana que comprende una bisagra funcional, dominio CH2 y CH3 puede definirse, p. ej., para comprender los residuos D231 (del dominio bisagra) a P476 (del extremo C del dominio CH3), o D231 a L476, respectivamente, para IgG4, en donde la numeración es de acuerdo con Kabat.

Por lo tanto, la construcción de anticuerpos de la invención puede comprender en un orden N- a C-terminal:

(a) el primer dominio de unión;

(b) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 8 y 9;

(c) el segundo dominio de unión;

(d) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1,2, 4, 5, 6, 8 y 9;

(e) el primer monómero polipeptídico del tercer dominio (que comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3);

(f) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 301,302, 303 y 304; y

(g) el primer monómero polipeptídico del tercer dominio (que comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3).

También se prefiere que la construcción de anticuerpo de la invención comprenda en un orden N- a C-terminal:

• teniendo el primer dominio de unión una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 8 y 9;

• teniendo el segundo dominio de unión una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103 (véase también SEQ ID NO: 23, 25, 41,43, 59, 61,77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187 del documento WO 2008/119567);

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1,2, 4, 5, 6, 8 y 9; y

• teniendo el tercer dominio una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 260-267.

También se describen aquí construcciones de anticuerpos que comprenden, en orden N a C-terminal:

• teniendo el primer dominio de unión una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 219, y SEQ ID NO: 229;

La construcción de anticuerpo descrita aquí comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en las SEQ ID NO: 268 a 299.

También es preferible, en una realización de la invención, que la construcción de anticuerpos de la presente invención comprenda o consista en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en las SEQ ID NO: 276 a 287.

También en una realización preferida de la invención, la construcción de anticuerpos de la presente invención comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en las SEQ ID NO: 276, 280 y 284, más preferiblemente comprende o consiste en un polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 280.

Modificaciones covalentes de las construcciones de anticuerpos también se incluyen dentro del alcance de esta invención y, en general, pero no siempre, se realizan de forma postraduccional. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes de la construcción de anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácidos específicos de la construcción de anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales.

Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con a-haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Residuos de cisteinilo también se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-piridil disulfuro de metilo, pcloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Residuos de histidilo se derivatizan por reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0, ya que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil bromuro de parabromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0. Residuos lisinilo y amino terminales se hacen reaccionar con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción catalizada por transaminasas con glioxilato.

Residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de residuos de tirosilo se puede realizar, con particular interés, en la introducción de marcadores espectrales en residuos de tirosilo mediante reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los restos de tirosilo se yodan usando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para uso en radioinmunoensayo, siendo adecuado el método de cloramina T descrito anteriormente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R’-N=C=N- R’), en que R y R’ son grupos alquilo opcionalmente diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular las construcciones de anticuerpos de la presente invención con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para uso en una diversidad de métodos. Los agentes reticulantes comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(propionato de succinimidilo), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes derivatizantes tales como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo producen compuestos intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, para la inmovilización de proteínas se emplean matrices reactivas insolubles en agua, tales como hidratos de carbono activados con bromuro de cianógeno, y sustratos reactivos como se describe en las patentes de EE.UU. núms. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440.

Residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan con frecuencia a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de restos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de lisina, arginina, y cadenas laterales de histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, págs. 79-86), acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente de las construcciones de anticuerpos incluidas dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación de la proteína. Como se sabe en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de restos de aminoácidos de glicosilación particulares, discutidos más adelante), como de la célula u organismo hospedante en el que se produce la proteína. Sistemas de expresión particulares se comentan más adelante.

La glicosilación de polipéptidos está típicamente enlazada a N o a O. Enlazada a N se refiere a la fijación del resto hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación enlazada a O se refiere a la fijación de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación a la construcción de anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos arriba descritas (para los sitios de glicosilación enlazados a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de partida (para los sitios de glicosilación enlazados a O). Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos de una construcción de anticuerpo se altera preferiblemente mediante cambios al nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio de aumentar el número de restos de hidratos de carbono en la construcción del anticuerpo es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de la proteína en una célula huésped que tiene capacidades de glicosilación para la glicosilación enlazada a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el o los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330, y en Aplin and Wriston, 1981,<c>R<c>Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306.

La eliminación de restos de hidratos de carbono presentes en la construcción del anticuerpo de partida se puede realizar de forma química o enzimática. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o de todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja intacto el polipéptido. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem.

Biophys. 259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo- y exoglicosidasas, como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. La glicosilación en sitios potenciales de glicosilación se puede prevenir mediante el uso del compuesto tunicamicina, como se describe por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem.

257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glicósido.

También se contemplan en esta memoria otras modificaciones de la construcción de anticuerpo. Por ejemplo, otro tipo de modificación covalente de la construcción de anticuerpo comprende unir la construcción de anticuerpo a diversos polímeros no proteicos, incluyendo, pero sin limitarse a, diversos polioles tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, de la manera expuesta en las patentes de EE.UU. núms. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Además, como se conoce en la técnica, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en diversas posiciones dentro de la construcción del anticuerpo, p. ej., con el fin de facilitar la adición de polímeros tales como PEG.

En algunas realizaciones, la modificación covalente de las construcciones de anticuerpos de la invención comprende la adición de uno o más marcadores. El grupo marcador puede acoplarse a la construcción de anticuerpo mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. Se conocen en la técnica diversos métodos para marcar proteínas y se pueden utilizar para realizar la presente invención. El término "marcador" o "grupo de marcaje" se refiere a cualquier marcador detectable. En general, los marcadores se clasifican en una diversidad de clases, dependiendo del ensayo en el que se han de detectar - los siguientes ejemplos incluyen, pero no se limitan a:

a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, tales como radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)

b) marcadores magnéticos(p. ej.,partículas magnéticas)

c) restos activos redox

d) colorantes ópticos (incluyendo, pero no limitados a cromóforos, fósforos y fluoróforos), tales como grupos fluorescentes(p. ej.,FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos quimioluminiscentes y fluoróforos que pueden ser de "molécula pequeña" fluorescentes o proteicos fluorescentes

e) grupos enzimáticos(p. ej.,peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina)

f) grupos biotinilados

g) epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un informador secundario(p. ej.,secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo, etc.)

Por "marcador fluorescente" se quiere decir cualquier molécula que se puede detectar mediante sus propiedades fluorescentes inherentes. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malacita, estilbeno, amarillo Lucifer, Cascade BlueJ, Rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Rojo 640, Cy 5, Cy 5.5, L<c>Rojo 705, Verde Oregón, los tintes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rodamina, y Rojo Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5 .5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Colorantes ópticos adecuados, incluyendo los fluoróforos, se describen en Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland.

Los marcadores fluorescentes proteicos adecuados también incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, incluida una especie Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., número de acceso a Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), p galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) y Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, patentes de EE.UU. núms.

5.292.658; 5.418.155; 5.683.888; 5.741.668; 5.777.079; 5.804.387; 5.874.304; 5.876.995; 5.925.558).

Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que fomentan la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión al ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se ha encontrado en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran péptidos que se producen de forma natural y derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la Solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína D tensioactiva pulmonar (SPD) descrita en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. En un enfoque, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento o derivado de anticuerpo antiMSLN fusionado a un péptido de cremallera de leucina se expresan en células hospedantes adecuadas, y los fragmentos o derivados de anticuerpo antiMSLN oligoméricos solubles que se forman se recuperan del sobrenadante del cultivo.

La construcción de anticuerpo de la invención también puede comprender dominios adicionales, que son, por ejemplo, útiles en el aislamiento de la molécula o se relacionan con un perfil farmacocinético adaptado de la molécula. Dominios de ayuda para el aislamiento de una construcción de anticuerpo pueden seleccionarse de motivos peptídicos o restos introducidos de forma secundaria, que pueden capturarse en un método de aislamiento, p. ej., una columna de aislamiento. Realizaciones no limitantes de dominios adicionales de este tipo comprenden motivos peptídicos conocidos como etiqueta Myc, etiqueta HAT, etiqueta HA, etiqueta TAP, etiqueta GST, dominio de unión a quitina (etiqueta CBD), proteína de unión a maltosa (etiqueta MBP), etiqueta Flag, etiqueta Strep y variantes de las mismas (p. ej., etiqueta Strepll) y etiqueta His. Se prefiere que todas las construcciones de anticuerpos descritas en esta memoria caracterizadas por las CDRs identificadas comprendan un dominio de etiqueta His, que generalmente se conoce como una repetición de residuos de His consecutivos en la secuencia de aminoácidos de una molécula, preferiblemente de cinco y más preferiblemente de seis residuos His (hexa-histidina). La etiqueta His puede ubicarse, p. ej., en el extremo N o C de la construcción de anticuerpo, preferiblemente está ubicada en el extremo C. Lo más preferible, una etiqueta de hexahistidina (HHHHHH) (SEQ ID NO:10) está unida mediante un enlace peptídico al extremo C de la construcción de anticuerpo según la invención.

El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la presente invención se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana. La secuencia de aminoácidos preferida de MSLN humana está representada por las NO: 231, 232 y 233. Por lo tanto, el primer dominio de unión según la invención se une preferiblemente a MSLN cuando se expresa por células o líneas celulares que se expresan de forma natural, y/o mediante células o líneas celulares transformadas o transfectadas (de forma estable/transitoria) con MSLN. En una realización preferida, el primer dominio de unión también se une a MSLN cuando MSLN se usa como molécula "diana" o "ligando" en un ensayo de uniónin vitrotal como BIAcore o Scatchard. La "célula diana" puede ser cualquier célula procariótica o eucariota que exprese MSLN en su superficie; preferiblemente la célula diana es una célula que forma parte del cuerpo humano o animal, tal como una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de páncreas, una célula de mesotelioma, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer gástrico, y una célula de cáncer de mama triple negativo.

La afinidad del primer dominio de unión por MSLN humana es preferiblemente <20 nM, más preferiblemente <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, incluso más preferiblemente <2 nM, incluso más preferiblemente <1 nM, incluso más preferiblemente <0,6 nM, incluso más preferiblemente <0,5 nM, y lo más preferible <0,4 nM. La afinidad se puede medir, por ejemplo, en un ensayo BIAcore o en un ensayo Scatchard, por ejemplo como se describe en los Ejemplos. El experto también conoce bien otros métodos para determinar la afinidad; véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 adjunto.

También se contemplan modificaciones en la secuencia de aminoácidos de las construcciones de anticuerpos descritas en esta memoria. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de la construcción de anticuerpo. Variantes de la secuencia de aminoácidos de las construcciones de anticuerpos se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico de las construcciones de anticuerpos o mediante síntesis de péptidos. Todas las modificaciones de la secuencia de aminoácidos descritas a continuación deberían dar como resultado una construcción de anticuerpo que aún conserva la actividad biológica deseada (unión a MSLN y a CD3) de la molécula parental no modificada.

El término "aminoácido" o la expresión "residuo de aminoácido" se refiere típicamente a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparagina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (He o I): leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V), aunque se pueden utilizar aminoácidos modificados, sintéticos o raros según se desee. Generalmente, los aminoácidos se pueden agrupar por tener una cadena lateral apolar (p. ej., Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral cargada negativamente (p. ej., Asp, Glu); una cadena lateral cargada positivamente (p. ej., Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar no cargada (p. ej., Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr).

Modificaciones de aminoácidos incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de las construcciones de anticuerpos. Se realiza cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos postraduccionales de las construcciones de anticuerpos, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación.

Por ejemplo, se pueden insertar o eliminar 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos en cada una de las CDRs (por supuesto, dependiendo de su longitud), mientras que 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,<1>8 , 19, 20 o 25 aminoácidos se pueden insertar o eliminar en cada una de las FRs. Preferiblemente, las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o<10>residuos a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intra-secuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Una variante de inserción de la construcción de anticuerpo de la invención incluye la fusión al extremo N o al extremo C de la construcción de anticuerpo de una enzima o la fusión a un polipéptido que aumenta la semivida en suero de la construcción de anticuerpo.

Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las CDRs de la cadena pesada y/o ligera, en particular las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de la FR en la cadena pesada y/o ligera. Las sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas tal como se describe en esta memoria. Preferiblemente, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 aminoácidos pueden estar sustituidos en una CDR, mientras que 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos pueden estar sustituidos en las regiones marco (FRs), dependiendo de la longitud de la CDR o FR. Por ejemplo, si una secuencia de CDR comprende 6 aminoácidos, se prevé que uno, dos o tres de estos aminoácidos estén sustituidos. De manera similar, si una secuencia de CDR comprende 15 aminoácidos, se prevé que uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de estos aminoácidos estén sustituidos.

Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones de las construcciones de anticuerpos que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina", como lo describen Cunningham y Wells en Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, un resto o grupo de restos diana dentro de la construcción de anticuerpo (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) se identifican y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el epítopo.

Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan luego introduciendo variantes adicionales u otras en, o para los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio o región para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario predeterminar la naturaleza de la mutaciónper se.Por ejemplo, para analizar u optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar un barrido de alanina o una mutagénesis aleatoria en un codón o región diana, y las variantes de construcción de anticuerpos expresadas se rastrean en cuanto a la combinación óptima de actividad deseada. Técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados del ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis por PCR. La detección de los mutantes se realiza mediante ensayos de actividades de unión al antígeno, tales como la unión a MSLN o CD3.

Generalmente, si los aminoácidos están sustituidos en una o más o en todas las CDRs de la cadena pesada y/o ligera, se prefiere que la secuencia "sustituida" obtenida sea entonces al menos 60% o 65%, más preferiblemente 70% o 75%, incluso más preferiblemente 80% u 85%, y de manera particularmente preferida 90% o 95% idéntica a la secuencia de CDR "original". Esto significa que depende de la longitud de la CDR hasta qué punto es idéntica a la secuencia "sustituida". Por ejemplo, una CDR que tiene 5 aminoácidos es preferiblemente un 80 % idéntica a su secuencia sustituida con el fin de tener al menos un aminoácido sustituido. Por consiguiente, las CDRs de la construcción de anticuerpo pueden tener diferentes grados de identidad con sus secuencias sustituidas, p. ej., CDRL1 puede tener un 80 %, mientras que CDRL3 puede tener un 90 %.

Sustituciones (o reemplazos) preferidas son sustituciones conservadoras. Sin embargo, se prevé cualquier sustitución (incluida la sustitución no conservativa o una o más de las "sustituciones ejemplares" enumeradas en la Tabla 1, a continuación) siempre que la construcción de anticuerpo conserve su capacidad para unirse a MSLN a través del primer dominio de unión y a CD3 o a CD3 épsilon a través del segundo dominio de unión, y/o sus CDR tengan una identidad con la secuencia entonces sustituida (al menos 60% o 65%, más preferiblemente 70% o 75%, incluso más preferiblemente 80% u 85%, y particularmente de forma preferible 90% o 95% idéntica a la secuencia de CDR "original").

Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si sustituciones de este tipo dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe más adelante en referencia a clases de aminoácidos, y los productos pueden seleccionarse para una característica deseada.

Tabla 1: Sustituciones de aminoácidos

Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de la construcción de anticuerpos de la presente invención se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los residuos que se producen de forma natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) de carácter ácido: asp, glu; (4) de carácter básico: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6 ) aromáticos: trp, tyr, phe.

Sustituciones no conservadoras supondrán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína que no esté implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada de la construcción de anticuerpo puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. A la inversa, se pueden añadir enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en los casos en los que el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Para secuencias de aminoácidos, la identidad y/o similitud de secuencia se determina usando técnicas estándar conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, el algoritmo de alineación de identidad de secuencia de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BeSt FIT, FAs Ta , y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, preferiblemente usando los ajustes predeterminados, o mediante inspección. Preferiblemente, FastDB calcula el porcentaje de identidad basándose en los siguientes parámetros: penalización de<1>por falta de coincidencia; penalización de<1>por salto; penalización de 0,33 por tamaño de salto; y penalización de 30 de unión, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, págs. 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Un ejemplo de algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineamientos progresivos por pares. También puede trazar un árbol que muestre las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351 -360; el método es similar al descrito por Higgins y Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Parámetros útiles de PILEUP que incluyen un peso de hueco predeterminado de 3,00, un peso de longitud de hueco predeterminado de 0,10 y huecos finales ponderados.

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito en: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; y Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2, que se obtuvo de Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se establecen en los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se configuran con los siguientes valores: intervalo de solapamiento = 1, fracción de solapamiento = 0,125, umbral de palabra (T) = ll. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y los establece el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular contra la cual se busca la secuencia de interés; sin embargo, los valores se pueden ajustar para aumentar la sensibilidad.

Un algoritmo útil adicional es el BLAST con saltos, como dan a conocer Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. BLAST con huecos utiliza puntuaciones de sustitución BLOSUM-62; parámetro de umbral T establecido en 9; el método de dos aciertos para activar extensiones sin huecos, cobra longitudes de hueco de k a un coste de 10+k; Xu se establece en 16 y Xg se establece en 40 para la fase de búsqueda de la base de datos y en 67 para la fase de salida de los algoritmos. Los alineamientos con huecos se activan mediante una puntuación correspondiente a aproximadamente 22 bits.

Generalmente, la homología, similitud o identidad de aminoácidos entre las CDRs variantes individuales son al menos el 60% de las secuencias representadas en esta memoria, y más típicamente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos 65% o 70%, más preferiblemente al menos 75% u 80%, incluso más preferiblemente al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y casi 100%. De manera similar, el "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a la secuencia de ácido nucleico de las proteínas de unión identificadas en esta memoria se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de nucleótidos en la secuencia codificante de la construcción del anticuerpo. Un método específico utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 configurado con los parámetros predeterminados, con el intervalo de solapamiento y la fracción de solapamiento configurados en 1 y 0,125, respectivamente.

En general, la homología, similitud o identidad de aminoácidos entre las CDRs variantes individuales que codifican las secuencias de nucleótidos y las secuencias de nucleótidos representadas en esta memoria es de al menos un 60 %, y más típicamente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, y casi 100 %. Por lo tanto, una "variante de CDR" es aquella con la homología, similitud o identidad especificadas con la CDR parental de la invención y comparte la función biológica, que incluye, pero no se limita a al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la especificidad y/o actividad de la CDR parental.

En una realización, el porcentaje de identidad con la línea germinal humana de las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención es > 70% o > 75%, más preferiblemente > 80% o > 85%, incluso más preferiblemente > 90% y lo más preferiblemente > 91 %, > 92%, > 93%, > 94%, > 95% o incluso > 96%. Se cree que la identidad con los productos génicos de la línea germinal de anticuerpos humanos es una característica importante para reducir el riesgo de que las proteínas terapéuticas provoquen una respuesta inmunitaria contra el fármaco en el paciente durante el tratamiento. Hwang & Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) demuestran que la reducción de porciones no humanas de construcciones de anticuerpos farmacéuticas conduce a una disminución del riesgo de inducir anticuerpos antifármacos en los pacientes durante el tratamiento. Al comparar un número exhaustivo de fármacos de anticuerpos evaluados clínicamente y los datos de inmunogenicidad respectivos, se muestra la tendencia de que la humanización de las regiones V de los anticuerpos haga que la proteína sea menos inmunogénica (promedio del 5,1% de los pacientes) que los anticuerpos que llevan regiones V no humanas no alteradas. (promedio 23,59% de los pacientes). Por lo tanto, es deseable un mayor grado de identidad con las secuencias humanas para las terapias con proteínas basadas en la región V en forma de construcciones de anticuerpos. Para este propósito de determinar la identidad de la línea germinal, las regiones V de VL pueden alinearse con las secuencias de aminoácidos de los segmentos V y J de la línea germinal humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) utilizando el software Vector NTI y la secuencia de aminoácidos calculada dividiendo los residuos de aminoácidos idénticos por el número total de residuos de aminoácidos de la VL en porcentaje. Lo mismo puede ser para los segmentos VH (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) con la excepción de que la CDR3 de VH puede ser excluida debido a su alta diversidad y a la falta de participantes en el alineamiento de CDR3 de VH de la línea germinal humana existente. A continuación, pueden utilizarse técnicas recombinantes para aumentar la identidad de secuencia con genes de la línea germinal de anticuerpos humanos.

En una realización adicional, las construcciones de anticuerpos biespecíficas de la presente invención exhiben altos rendimientos de monómero en condiciones de escala de investigación estándar, por ejemplo en un procedimiento de purificación estándar de dos etapas. Preferiblemente, el rendimiento de monómero de las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención es > 0,25 mg/L de sobrenadante, más preferiblemente > 0,5 mg/L, incluso más preferiblemente > 1 mg/L y lo más preferiblemente > 3 mg/L de sobrenadante.

Asimismo, se puede determinar el rendimiento de las isoformas de la construcción de anticuerpo dimérica, y por tanto el porcentaje de monómero (es decir, monómero: (monómero dímero)) de las construcciones de anticuerpos. La productividad de las construcciones de anticuerpos monoméricas y diméricas, y el porcentaje de monómero calculado, se pueden obtener, por ejemplo, en la etapa de purificación mediante SEC del sobrenadante de cultivo a partir de la producción estandarizada a escala de investigación en botellas giratorias. En una realización, el porcentaje de monómero de las construcciones de anticuerpos es > 80 %, más preferiblemente > 85 %, incluso más preferiblemente > 90 % y lo más preferiblemente > 95 %.

En una realización, las construcciones de anticuerpos tienen una estabilidad en plasma preferida (relación de CE50 con plasma a CE50 sin plasma) de < 5 o < 4, más preferiblemente < 3,5 o < 3, incluso más preferiblemente < 2,5 o < 2, y lo más preferiblemente < 1,5 o < 1. La estabilidad en plasma de una construcción de anticuerpo se puede testar mediante la incubación de la construcción en plasma humano a 37°C durante 24 horas, seguido de la determinación de CE50 en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51. Las células efectoras en el ensayo de citotoxicidad se pueden estimular en células T CD8 positivas humanas enriquecidas. Las células diana pueden ser, por ejemplo, células CHO transfectadas conMSLNhumana. La relación entre la célula efectora a diana (E:T) se puede elegir como 10:1. El conjunto de plasma humano utilizado para este propósito se deriva de la sangre de donantes sanos recogida con jeringas recubiertas con EDTA. Los componentes celulares se eliminan por centrifugación y la fase plasmática superior se recoge y posteriormente se agrupa. Como control, las construcciones de anticuerpos se diluyen inmediatamente antes del ensayo de citotoxicidad en medio RPMI-1640. La estabilidad en plasma se calcula como la relación de CE50 (después de la incubación en plasma) a CE50 (control). Véase el Ejemplo 6.

Además, se prefiere que la conversión de monómero a dímero de las construcciones de anticuerpos de la invención sea baja. La conversión se puede medir en diferentes condiciones y analizar mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento. Véase el Ejemplo 9. Por ejemplo, la incubación de las isoformas monoméricas de las construcciones de anticuerpos se puede llevar a cabo durante 7 días a 37°C y concentraciones de, por ejemplo, 100 μg/ml o 250 μg/ml en una incubadora. Bajo estas condiciones, se prefiere que las construcciones de anticuerpos de la invención muestren un porcentaje de dímeros que sea < 5%, más preferiblemente < 4%, incluso más preferiblemente < 3%, incluso más preferiblemente < 2,5%, incluso más preferiblemente < 2%, incluso más preferiblemente < 1,5%, y lo más preferiblemente < 1% o < 0,5% o incluso 0%.

También se prefiere que las construcciones de anticuerpos biespecíficos de la presente invención presenten una conversión de dímeros muy baja después de un cierto número de ciclos de congelación/descongelación. Por ejemplo, el monómero de la construcción de anticuerpo se ajusta a una concentración de 250 μg/ml, por ejemplo en amortiguador de formulación genérica, y se somete a tres ciclos de congelación/descongelación (congelación a -80°C durante 30 min, seguido de descongelación durante 30 min a temperatura ambiente), seguido de SEC de alto rendimiento para determinar el porcentaje de construcción de anticuerpo inicialmente monomérica, que se ha convertido en una construcción de anticuerpo dimérica. Preferiblemente, los porcentajes de dímeros de las construcciones de anticuerpos biespecíficos son < 5%, más preferiblemente < 4%, incluso más preferiblemente < 3%, incluso más preferiblemente < 2,5%, incluso más preferiblemente < 2%, incluso más preferiblemente < 1,5%, y lo más preferiblemente < 1% o incluso < 0,5%, por ejemplo después de tres ciclos de congelación/descongelación.

Las construcciones de anticuerpos biespecíficas de la presente invención muestran preferiblemente una termoestabilidad favorable, con temperaturas de agregación >45°C o >50°C, más preferiblemente >51°C, >52°C, >53°C o >54°C, incluso más preferiblemente >56°C o >57°C, y lo más preferiblemente >58°C o >59°C. El parámetro de termoestabilidad se puede determinar en términos de temperatura de agregación del anticuerpo como sigue: La solución de anticuerpo a una concentración de 250 μg/ml se transfiere a una cubeta de un solo uso y se coloca en un dispositivo de Dispersión Dinámica de la Luz (DLS). La muestra se calienta de 40 °C a 70 °C a una tasa de calentamiento de 0,5 °C/min con adquisición constante del radio medido.

El aumento del radio que indica la fusión de la proteína y la agregación se utiliza para calcular la temperatura de agregación del anticuerpo. Véase el Ejemplo 10.

Alternativamente, las curvas de temperatura de fusión se pueden determinar mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar las estabilidades biofísicas intrínsecas de las proteínas de las construcciones de anticuerpos. Estos experimentos se realizan utilizando un dispositivo VP-DSC de MicroCal LLC (Northampton, MA, EE.UU.). La absorción de energía de una muestra que contiene una construcción de anticuerpo se registra de 20°C a 90°C en comparación con una muestra que contiene solo el tampón de formulación. Las construcciones de anticuerpos se ajustan a una concentración final de 250 μg/ml, por ejemplo en el amortiguador de ejecución de la SEC. Para el registro de la curva de fusión respectiva, la temperatura total de la muestra se aumenta escalonadamente. A cada temperatura T se registra la absorción de energía de la muestra y la referencia del tampón de formulación. Se representa la diferencia en la absorción de energía Cp (kcal/mol/°C) de la muestra menos la referencia frente a la temperatura respectiva. La temperatura de fusión se define como la temperatura en el primer máximo de absorción de energía.

También se prevé que las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLN xCD3 de la invención tengan una turbidez (medida por OD340 después de concentrar la construcción de anticuerpo monomérica purificada hasta 2,5 mg/ml e incubar durante la noche) de < 0,2, preferiblemente de < 0,15, más preferiblemente de < 0,12, incluso más preferiblemente de < 0,1 o incluso >0,09, y lo más preferible de < 0,08 o >0,07. Véase el Ejemplo 11.

En una realización adicional, la construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención es estable a pH ácido. Cuanto más tolerante se comporte la construcción de anticuerpos a un pH no fisiológico, tal como pH 5,5 (un pH que se requiere para ejecutar, p. ej., una cromatografía de intercambio catiónico), mayor será la recuperación de la construcción de anticuerpos eluida de una columna de intercambio iónico en relación con la cantidad total de proteína cargada. La recuperación de la construcción de anticuerpo de una columna de intercambio iónico(p. ej.,,catiónico) a pH 5,5 es preferiblemente > 30%, más preferiblemente > 40%, más preferiblemente > 50%, incluso más preferiblemente > 60%, incluso más preferiblemente > 70%, incluso más preferiblemente > 80%, incluso más preferiblemente > 90%, incluso más preferiblemente > 95% y lo más preferiblemente > 99%. Véase el Ejemplo 7.

Además, se prevé que las construcciones de anticuerpos biespecíficos de la presente invención exhiban eficacia terapéutica o actividad antitumoral. Esto puede evaluarse, por ejemplo, en un estudio como se describe en el siguiente ejemplo de un modelo de xenoinjerto de tumor humano en etapa avanzada:

El día 1 del estudio, se inyectan por vía subcutánea 5 x 106 células de una línea celular cancerosa positiva para MSLN humana (por ejemplo, OVCAR-8) en el flanco dorsal derecho de ratones hembra NOD/SCID. Cuando el volumen medio del tumor alcanza alrededor de 100 mm3, se trasplantan células T positivas para CD3 humanas expandidas in vitro a los ratones mediante inyección de alrededor de 2 x 107 células en la cavidad peritoneal de los animales. Los ratones del grupo de control de vehículo 1 no reciben células efectoras y se utilizan como un control no trasplantado para comparar con el grupo de control de vehículo 2 (que reciben células efectoras) para vigilar el impacto de las células T solas sobre el crecimiento del tumor. El tratamiento con anticuerpos comienza cuando el volumen medio del tumor alcanza aproximadamente 200 mm3. El tamaño medio del tumor de cada uno de los grupo de tratamiento el día de inicio del tratamiento no debería ser estadísticamente diferente de cualquier otro grupo (análisis de varianza). Los ratones se tratan con 0,5 mg/kg/día de una construcción de anticuerpo biespecífica MSLN xCD3 mediante inyección intravenosa en bolo durante alrededor de 15 a 20 días. Los tumores se miden con un calibre durante el estudio y se evalúa el progreso mediante la comparación entre grupos de los volúmenes de los tumores (TV). La inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] se determina calculando TV como T/C% = 100 x (TV mediana del grupo analizado)/(TV mediana del grupo 2 de control).

La persona experta sabe cómo modificar o adaptar determinados parámetros de este estudio, tal como el número de células tumorales inyectadas, el sitio de inyección, el número de células T humanas trasplantadas, la cantidad de construcciones de anticuerpos biespecíficos que se administrarán y los plazos, sin dejar de llegar a un resultado significativo y reproducible. Preferiblemente, la inhibición del crecimiento del tumor T/C [%] es < 70 o < 60, más preferiblemente < 50 o < 40, incluso más preferiblemente < 30 o < 20 y lo más preferiblemente < 10 o < 5 o incluso < 2,5.

La invención proporciona además una molécula de polinucleótido/ácido nucleico que codifica una construcción de anticuerpo de la invención.

Un polinucleótido es un biopolímero compuesto por 13 o más monómeros de nucleótidos unidos covalentemente en una cadena. El ADN (tal como ADNc) y el ARN (tal como ARNm) son ejemplos de polinucleótidos con una función biológica distinta. Los nucleótidos son moléculas orgánicas que sirven como monómeros o subunidades de moléculas de ácido nucleico, tales como ADN o ARN. La molécula de ácido nucleico o polinucleótido puede ser de doble cadena y de cadena sencilla, lineal y circular. Preferiblemente está comprendida en un vector que preferiblemente está comprendido en una célula huésped. Dicha célula huésped es, p. ej., después de la transformación o transfección con el vector o el polinucleótido de la invención, capaz de expresar la construcción del anticuerpo. Para ese propósito, el polinucleótido o la molécula de ácido nucleico se enlaza operativamente con secuencias de control.

El código genético es el conjunto de reglas mediante las cuales la información codificada dentro del material genético (ácidos nucleicos) se traduce en proteínas. La descodificación biológica en las células vivas se logra mediante el ribosoma que enlaza los aminoácidos en un orden especificado por el ARNm, utilizando moléculas de ARNt para llevar aminoácidos y leer los tres nucleótidos del ARNm a la vez. El código define cómo las secuencias de estos tripletes de nucleótidos, denominados codones, especifican qué aminoácido se añadirán a continuación durante la síntesis de proteínas. Con algunas excepciones, un codón de tres nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico especifica un solo aminoácido. Debido a que la gran mayoría de genes son codificados con exactamente el mismo código, a este código particular se le alude a menudo como código genético canónico o estándar. Si bien el código genético determina la secuencia de proteínas para una región codificante dada, otras regiones genómicas pueden influir en cuándo y dónde se producen estas proteínas.

Además, la presente descripción proporciona un vector que comprende una molécula de polinucleótido/ácido nucleico de la invención.

Un vector es una molécula de ácido nucleico que se utiliza como un vehículo para transferir material genético (extraño) a una célula. El término "vector" abarca, pero no se limita a - plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. En general, los vectores modificados comprenden un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable. El vector en sí mismo es generalmente una secuencia de nucleótidos, habitualmente una secuencia de ADN, que comprende una inserción (transgén) y una secuencia más grande que sirve como la "columna vertebral" del vector. Los vectores modernos pueden abarcar características adicionales además de la inserción del transgén y una columna vertebral: promotor, marcador genético, resistencia a antibióticos, gen informador, secuencia de fijación de objetivo, etiqueta de purificación de proteínas. Los vectores denominados vectores de expresión (construcciones de expresión) son específicamente para la expresión del transgén en la célula diana y generalmente tienen secuencias de control.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante enlazada operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o conductor secretor está operativamente enlazado al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente enlazado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente enlazado a una secuencia codificante si está situado para facilitar la traducción. Generalmente, "operativamente enlazado" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un conductor secretor, son contiguas y están en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La vinculación se logra mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si no existe este tipo de sitios, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.

La "transfección" es el proceso de introducir deliberadamente moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo los vectores) en células diana. El término se utiliza principalmente para métodos no virales en células eucariotas. La transducción se utiliza a menudo para describir la transferencia mediada por virus de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos. La transfección de células animales implica típicamente la apertura de poros transitorios o "agujeros" en la membrana celular, para permitir la absorción de material. La transfección se puede llevar a cabo utilizando fosfato de calcio, por electroporación, por exprimido celular o mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas, que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga en el interior.

El término "transformación" se utiliza para describir la transferencia no viral de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo vectores) a bacterias, y también a células eucariotas no animales, incluyendo células vegetales. La transformación es, por lo tanto, la alteración genética de una célula eucariota bacteriana o no animal resultante de la captación directa a través de la o las membranas celulares de su entorno y la incorporación posterior de material genético exógeno (moléculas de ácido nucleico). La transformación se puede efectuar por medios artificiales. Para que ocurra la transformación, las células o bacterias deben estar en un estado de competencia, lo que podría ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a condiciones del entorno tales como la inanición y la densidad celular.

Además, la invención proporciona una célula hospedante transformada o transfectada con la molécula de polinucleótido/ácido nucleico de la invención. También se describen células hospedantes transformadas o transfectadas con el vector descrito aquí.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "célula huésped" o "célula receptora" pretende incluir cualquier célula individual o cultivo celular que pueda o puedan ser o haya o hayan sido receptoras de vectores, moléculas de ácido nucleico exógenas y polinucleótidos que codifican la construcción de anticuerpos de la presente invención; y/o receptores de la propia construcción de anticuerpo. La introducción del material respectivo en la célula se lleva a cabo mediante transformación, transfección y similares. La expresión "célula huésped" también pretende incluir la progenie o la progenie potencial de una sola célula. Debido a que determinadas modificaciones pueden producirse en las generaciones sucesivas debido a una mutación natural, accidental o deliberada o debido a influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico o total) a la célula parental, pero todavía está incluido dentro del alcance del término como se utiliza en esta memoria. Células huésped adecuadas incluyen células procariotas o eucariotas y también incluyen, pero no se limitan a bacterias, células de levaduras, células de hongos, células vegetales y células animales, tales como células de insectos y células de mamíferos, p. ej., ratones, ratas, macacos o seres humanos.

La construcción de anticuerpos de la invención se puede producir en bacterias. Después de la expresión, la construcción de anticuerpos de la invención se aísla de la pasta de células deE. colien una fracción soluble, y se puede purificar, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad y/o exclusión por tamaño. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al procedimiento de purificación de anticuerpos expresados, p. ej., en células CHO.

Además de los procariotas, microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para la construcción de anticuerpos de la invención.Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es la más comúnmente usada entre los microorganismos hospedantes eucariotas inferiores. Sin embargo, una serie de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles aquí, tales comoSchizosaccharomyces pombe,hospedantes de Kluyveromyces tales comoK. lactis, K. fragilis(ATC<c>12424),K. bulgaricus(ATCC 16045),K. wickeramii(ATCC 24178),K. waltii(ATCC 56500),K. drosophilarum(ATCC 36906),K. thermotolerans,yK. marxianus; yarrowia (documento EP 402 226);Pichia pastoris(documento EP 183 070); Candida;Trichoderma reesia(documento EP 244 234);Neurospora crassa; Schwanniomyces tal comoSchwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospedantes de Aspergillus tales comoA. nidulansyA. niger.

Células huéspedes adecuadas para la expresión de la construcción de anticuerpos glicosilados de la invención se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células hospedantes de insectos permisivas a partir de hospedantes tales comoSpodoptera frugiperda(oruga),Aedes aegypti(mosquito),Aedes albopictus(mosquito),Drosophila melanogaster(mosca de la fruta), yBombyx morí.Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo la variante L-1 deAutographa californicaNPV y la cepa Bm-5 deBombyx moriNPV, y tales virus puede usarse como el virus aquí según la presente invención, particularmente para la transfección de célulasSpodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar como huéspedes cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco. Los expertos en la técnica conocen vectores de clonación y expresión útiles en la producción de proteínas en cultivos de células vegetales. Véansepor ejemploHiatt et al., Nature (1989) 342: 76 78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8 : 745-750, y Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un proceso de rutina. Ejemplos de líneas celulares hospedantes de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al. , J. Gen Virol. 36 : 59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.

23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI ATC<c>CCL 70); células de riñón de mono verde africano (<v>E<r>O-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MOCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2,1413 8065); tumor mamario de ratón (Mm T 060562, ATCC CCL5 1); células TRI (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

La presente descripción también proporciona un procedimiento para la producción de una construcción de anticuerpo de la invención, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula hospedante de la invención en condiciones que permitan la expresión de la construcción de anticuerpo de la invención, y recuperar la construcción de anticuerpo producida a partir del cultivo.

Como se usa aquí, el término "cultivar" se refiere al mantenimiento, diferenciación, crecimiento, proliferación y/o propagaciónin vitrode células en condiciones adecuadas en un medio. El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de una construcción de anticuerpo de la invención que incluye, pero no se limita a transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, la construcción de anticuerpos se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico o se puede secretar directamente al medio. Si la construcción de anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los desechos en partículas, ya sean células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se segregan en el espacio periplásmico deE. coli.Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los desechos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de sistemas de expresión de este tipo se concentran generalmente primero utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La construcción de anticuerpo de la invención, preparada a partir de las células huéspedes se puede recuperar o purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatito, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatografía-focalización, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar. En los casos en los que la construcción de anticuerpo de la invención comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación.

La cromatografía de afinidad es una técnica de purificación preferida. La matriz a la que está fijado el ligando de afinidad suele ser agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Matrices mecánicamente estables, tales como el vidrio de poros controlado o el poli (estirendivinil) benceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa.

Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una construcción de anticuerpo de la invención. Se prefiere para la composición farmacéutica de la invención que la homogeneidad de la construcción de anticuerpo sea > 80%, más preferiblemente > 81%, > 82%, > 83%, > 84% o > 85%, aún más preferiblemente > 86%,> 87%, > 88%, > 89%, o > 90%, aún más preferiblemente, > 91%, > 92%, > 93%, > 94%, o > 95%, y lo más preferible > 96%, > 97%, > 98% o > 99%.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una composición que es adecuada para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. La composición farmacéutica particularmente preferida de esta invención comprende una o una pluralidad de la o las construcciones de anticuerpos de la invención, preferiblemente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende, además, formulaciones adecuadas de uno o más soportes, estabilizadores, excipientes, diluyentes, solubilizantes, tensioactivos, emulsionantes, conservantes y/o adyuvantes (farmacéuticamente eficaces). Constituyentes aceptables de la composición son preferiblemente no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero no se limitan a composiciones líquidas, congeladas y liofilizadas.

Las composiciones de la invención pueden comprender un soporte farmacéuticamente aceptable. En general, tal como se utiliza en esta memoria, "soporte farmacéuticamente aceptable" significa todas y cada una de las soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles, disolventes, tampones, p. ej., solución salina tamponada con fosfato (PBS), agua, suspensiones, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, liposomas, medios de dispersión y recubrimientos, que son compatibles con la administración farmacéutica, en particular con la administración parenteral. El uso de medios y agentes de este tipo en composiciones farmacéuticas es bien conocido en la técnica, y las composiciones que comprenden soportes de este tipo se pueden formular mediante métodos convencionales bien conocidos.

Determinadas realizaciones proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden la construcción de anticuerpo de la invención y, además, uno o más excipientes, tales como los descritos ilustrativamente en esta sección y en otras partes de esta memoria. Los excipientes se pueden utilizar en la invención a este respecto para una amplia diversidad de propósitos, tales como ajustar las propiedades físicas, químicas o biológicas de las formulaciones, tales como el ajuste de la viscosidad, y/o los procedimientos de la invención para mejorar la efectividad y/o estabilizar formulaciones de este tipo y procedimientos contra la degradación y el deterioro debido, por ejemplo, a las tensiones que se producen durante la fabricación, el transporte, el almacenamiento, la preparación previa al uso, la administración y posteriormente.

En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación con el fin de modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, viscosidad, transparencia, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición (véase, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edición, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company). En realizaciones de este tipo, materiales de formulación adecuados pueden incluir, pero no se limitan a:

• aminoácidos tales como glicina, alanina, glutamina, asparagina, treonina, prolina, 2-fenilalanina, incluyendo aminoácidos cargados, preferiblemente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato y/o histidina.

• antimicrobianos tales como agentes antibacterianos y antifúngicos

• antioxidantes tales como ácido ascórbico, metionina, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio;

• amortiguadores, sistemas amortiguadores y agentes amortiguadores, que se usan para mantener la composición a un pH fisiológico o a un pH ligeramente inferior, normalmente dentro de un intervalo de pH de alrededor de 5 a alrededor de 8 o 9; ejemplos de amortiguadores son borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos, succinato, fosfato, histidina y acetato; por ejemplo, amortiguador de Tris de alrededor de pH 7,0-8,5, o amortiguador de acetato de alrededor de pH 4,0-5,5;

• disolventes no acuosos tales como propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo;

vehículos acuosos que incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluidos medios salinos y amortiguados;

polímeros biodegradables tales como poliésteres;

agentes para dar volumen, tales como manitol o glicina;

agentes quelantes tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA);

agentes isotónicos y retardadores de la absorción;

agentes complejantes tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-betaciclodextrina)

cargas;

monosacáridos; disacáridos; y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa o dextrinas); los hidratos de carbono pueden ser azúcares no reductores, preferiblemente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol;

proteínas (de bajo peso molecular), polipéptidos o vehículos proteicos tales como seroalbúmina humana o bovina, gelatina o inmunoglobulinas, preferiblemente de origen humano;

agentes colorantes y aromatizantes;

agentes reductores que contienen azufre, tales como glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol, y tiosulfato de sodio

agentes diluyentes;

agentes emulsionantes;

polímeros hidrófilos tal como polivinilpirrolidona)

contraiones formadores de sales, tal como sodio;

conservantes tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares; ejemplos son: cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno);

complejos metálicos tales como complejos de Zn-proteína;

disolventes y codisolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol);

azúcares y alcoholes de azúcar, tales como trehalosa, sacarosa, octasulfato, manitol, sorbitol o xilitol, estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, mioinisitosa, galactosa, lactitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol, ciclitoles (por ejemplo, inositol), polietilenglicol; y alcoholes de azúcares polihidroxilados; agentes de suspensión;

tensioactivos o agentes humectantes tales como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato<2 0>, polisorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal; los tensioactivos pueden ser detergentes, preferiblemente con un peso molecular > 1,2 KD, y/o un poliéter, preferiblemente con un peso molecular > 3 KD; ejemplos no limitativos de detergentes preferidos son Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 y Tween 85; ejemplos no limitativos de poliéteres preferidos son PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 y PEG 5000;

agentes mejoradores de la estabilidad, tales como sacarosa o sorbitol;

agentes potenciadores de la tonicidad, tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol;

• vehículos para administración parenteral, incluyendo disolución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado, o aceites fijos;

• vehículos para administración intravenosa, incluyendo reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer).

Es evidente para los expertos en la técnica que los diferentes constituyentes de la composición farmacéutica (p. ej., los arriba enumerados) pueden tener diferentes efectos, por ejemplo, un aminoácido puede actuar como tampón, estabilizador y/o antioxidante; el manitol puede actuar como un agente espesante y/o un agente potenciador de la tonicidad; cloruro de sodio puede actuar como vehículo de administración y/o agente potenciador de la tonicidad; etc.

Se prevé que la composición de la invención podría comprender, además del polipéptido de la invención definido en esta memoria, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición. Agentes de este tipo pueden ser fármacos que actúan sobre el sistema gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que previenen la hiperuriquemia, fármacos que inhiben las inmunorreacciones (p. ej., corticosteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o fármacos, tales como citoquinas conocidas. en la técnica. También se prevé que la construcción de anticuerpos de la presente invención se aplique en una coterapia, es decir, en combinación con otro medicamento contra el cáncer.

En determinadas realizaciones, un experto en la técnica determinará la composición farmacéutica óptima dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración pretendida, el formato de suministro y la dosis deseada. Véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, más arriba. En ciertas realizaciones, tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberaciónin vivo,y la tasa de eliminaciónin vivode la construcción de anticuerpo de la invención. En determinadas realizaciones, el vehículo o soporte principal en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o soporte adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. En ciertas realizaciones, la construcción de anticuerpos de las composiciones de la invención se puede preparar para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, más arriba) en forma de un torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, en determinadas realizaciones, la construcción de anticuerpo de la invención se puede formular como un liofilizado utilizando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención pueden proporcionarse en forma de una solución acuosa apirógena, parenteralmente aceptable, que comprende la construcción de anticuerpo deseada de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que la construcción de anticuerpo de la invención se formula como una solución isotónica estéril, debidamente conservada. En determinadas realizaciones, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto que puede suministrarse mediante inyección de depósito. En determinadas realizaciones, también se puede utilizar ácido hialurónico, que tiene el efecto de fomentar una duración sostenida en la circulación. En determinadas realizaciones, se pueden utilizar dispositivos de suministro de fármacos implantables para introducir la construcción de anticuerpo deseada.

Composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que implican la construcción de anticuerpos de la invención en formulaciones de administración / liberación sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen técnicas para formular una diversidad de otros medios de suministro sostenido o controlado, tales como soportes de liposomas, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional n° WO93/15722, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos moldeados, p. ej., películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (como se describe en la patente de EE.UU. No. 3.773.919 y Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.

15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etileno-acetato de vinilo (Langer et al., 1981, más arriba), o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (publicación de solicitud de patente europea n° EP 133.988). Composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; publicaciones de solicitudes de patente europea núms. EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.

La construcción de anticuerpo también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente), en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, l 6 a edición, Oslo, A., Ed., (1980).

Las composiciones farmacéuticas usadas para la administraciónin vivonormalmente se proporcionan como preparaciones estériles. La esterilización se puede lograr mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización utilizando este método puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución. Composiciones para administración parenteral se pueden almacenar en forma liofilizada o en solución. Composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene una lumbrera de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Otro aspecto de la invención incluye la construcción de anticuerpos autoamortiguadoras de las formulaciones de la invención, que pueden usarse como composiciones farmacéuticas, como se describe en la solicitud de patente internacional WO 06138181A2. Hay disponible una variedad de exposiciones sobre materiales y métodos de estabilización y formulación de proteínas útiles a este respecto, tales como Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution" en: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter y Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), y Randolph et al., "Surfactant-protein interactions", Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), véanse particularmente las partes pertinentes a excipientes y procedimientos de los mismos para formulaciones de proteínas autoamortiguantes de acuerdo con la presente invención, especialmente en cuanto a productos y procedimientos farmacéuticos proteicos para usos veterinarios y/o médicos humanos.

Sales se pueden utilizar de acuerdo con determinadas realizaciones de la invención para, por ejemplo, ajustar la fuerza iónica y/o la isotonicidad de una formulación y/o para mejorar la solubilidad y/o estabilidad física de una proteína u otro ingrediente de una composición de acuerdo con la invención. Como es bien sabido, los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas uniéndose a residuos cargados en la superficie de la proteína y protegiendo a los grupos cargados y polares en la proteína y reduciendo la fuerza de sus interacciones electrostáticas, atractivas y repelentes. Los iones también pueden estabilizar el estado desnaturalizado de una proteína uniéndose, en particular, a los enlaces peptídicos desnaturalizados (--CONH) de la proteína. Además, la interacción iónica con grupos cargados y polares en una proteína también puede reducir las interacciones electrostáticas intermoleculares y, con ello, prevenir o reducir la agregación e insolubilidad de las proteínas.

Las especies iónicas difieren significativamente en sus efectos sobre las proteínas. Se ha desarrollado un cierto número de clasificaciones categóricas de iones y sus efectos sobre las proteínas que pueden utilizarse en la formulación de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención. Un ejemplo es la serie Hofmeister, que clasifica los solutos iónicos y no iónicos polares por su efecto sobre la estabilidad conformacional de las proteínas en solución. Los solutos estabilizadores se denominan "cosmotrópicos". Los solutos desestabilizadores se denominan "caotrópicos". Los cosmótropos se utilizan comúnmente en concentraciones elevadas (p. ej., sulfato de amonio > 1 molar) para precipitar proteínas de la solución ("precipitación salina"). Los caótropos se utilizan comúnmente para dentaduras postizas y/o para solubilizar proteínas ("salazón"). La efectividad relativa de los iones para "salar" y “precipitar” define su posición en la serie de Hofmeister.

Los aminoácidos libres se pueden utilizar en la construcción de anticuerpos de las formulaciones de la invención de acuerdo con diversas realizaciones de la invención como agentes conferidores de consistencia, estabilizadores y antioxidantes, así como otros usos estándares. Se pueden utilizar lisina, prolina, serina y alanina para estabilizar proteínas en una formulación. La glicina es útil en la liofilización para asegurar la estructura y propiedades correctas de la torta. La arginina puede ser útil para inhibir la agregación de proteínas, tanto en formulaciones líquidas como liofilizadas. La metionina es útil como un antioxidante.

Polioles incluyen azúcares, p. ej., manitol, sacarosa y sorbitol y alcoholes polihíd ricos, tales como, por ejemplo, glicerol y propilenglicol y, para los propósitos de la discusión en esta memoria, polietilenglicol (PEG) y sustancias relacionadas. Los polioles son cosmotrópicos. Son agentes estabilizantes útiles en formulaciones tanto líquidas como liofilizadas para proteger proteínas de los procesos de degradación física y química. Polioles también son útiles para ajustar la tonicidad de las formulaciones. Entre los polioles útiles en realizaciones seleccionadas de la invención se encuentra el manitol, comúnmente utilizado para asegurar la estabilidad estructural de la torta en formulaciones liofilizadas. Asegura estabilidad estructural a la torta. Generalmente se utiliza con un lioprotector, p. ej., sacarosa. El sorbitol y la sacarosa se encuentran entre los agentes preferidos para ajustar la tonicidad y como estabilizadores para proteger frente a las tensiones de congelación-descongelación durante el transporte o la preparación de cargas durante el procedimiento de fabricación. Los azúcares reductores (que contienen grupos aldehído o cetona libres), tales como glucosa y lactosa, pueden glicar los residuos de lisina y arginina de la superficie. Por lo tanto, generalmente no se encuentran entre los polioles preferidos para uso de acuerdo con la invención. Además, los azúcares que forman especies reactivas de este tipo, tales como sacarosa, que se hidroliza a fructosa y glucosa en condiciones ácidas y, en consecuencia, engendra glicación, tampoco se encuentran entre los polioles preferidos de la invención a este respecto. El PEG es útil para estabilizar proteínas y como un crioprotector y puede utilizarse en la invención a este respecto.

Realizaciones de la construcción de anticuerpos de las formulaciones de la invención comprenden, además, tensioactivos. Las moléculas de proteína pueden ser susceptibles a la adsorción sobre superficies y a la desnaturalización y la consiguiente agregación en las interfaces aire-líquido, sólido-líquido y líquido-líquido. Estos efectos se incrementan generalmente a la inversa con la concentración de las proteínas. Estas interacciones deletéreas se incrementan generalmente a la inversa con la concentración de proteína y típicamente son exacerbadas por la agitación física, tales como la generada durante el transporte y la manipulación de un producto. Los tensioactivos se utilizan de forma rutinaria para prevenir, minimizar o reducir la adsorción superficial. Tensioactivos útiles en la invención a este respecto incluyen polisorbato<20>, polisorbato 80, otros ésteres de ácidos grasos de polietoxilatos de sorbitán y poloxámero 188. Los tensioactivos también se utilizan comúnmente para controlar la estabilidad conformacional de las proteínas. El uso de tensioactivos a este respecto es específico para proteínas, ya que cualquier tensioactivo dado estabilizará típicamente algunas proteínas y desestabilizará otras.

Los polisorbatos son susceptibles a la degradación oxidativa y, a menudo, tal como se suministran, contienen cantidades suficientes de peróxidos para provocar la oxidación de las cadenas laterales de residuos de proteínas, especialmente metionina. En consecuencia, los polisorbatos deberían utilizarse con cuidado y, cuando se utilizan, deben emplearse en su concentración efectiva más baja. A este respecto, los polisorbatos ejemplifican la regla general de que los excipientes deben utilizarse en sus concentraciones efectivas más bajas.

Realizaciones de la construcción de anticuerpos de las formulaciones de la invención comprenden, además, uno o más antioxidantes. Hasta cierto punto, la oxidación perjudicial de proteínas se puede prevenir en las formulaciones farmacéuticas manteniendo niveles adecuados de oxígeno y temperatura ambientales y evitando la exposición a la luz. También se pueden utilizar excipientes antioxidantes para prevenir la degradación oxidativa de proteínas. Entre los antioxidantes útiles a este respecto se encuentran los agentes reductores, los captadores de oxígeno/radicales libres y los agentes quelantes. Antioxidantes para uso en formulaciones de proteínas terapéuticas de acuerdo con la invención son preferiblemente hidrosolubles y mantienen su actividad durante la vida útil de un producto. EDTA es un antioxidante preferido de acuerdo con la invención a este respecto. Los antioxidantes pueden dañar las proteínas. Por ejemplo, agentes reductores, tales como glutatión en particular, pueden alterar los enlaces disulfuro intramoleculares. Por lo tanto, los antioxidantes para uso en la invención se seleccionan para, entre otras cosas, eliminar o reducir suficientemente la posibilidad de que ellos mismos dañen las proteínas en la formulación.

Formulaciones de acuerdo con la invención pueden incluir iones metálicos que son co-factores de proteínas y que son necesarios para formar complejos de coordinación de proteínas, tales como el zinc, necesario para formar determinadas suspensiones de insulina. Los iones metálicos también pueden inhibir algunos procesos que degradan proteínas. Sin embargo, los iones metálicos también catalizan procesos físicos y químicos que degradan proteínas. Se pueden utilizar iones magnesio (10-120 mM) para inhibir la isomerización del ácido aspártico a ácido isoaspártico. Los iones de Ca<+2>(hasta 100 mM) pueden aumentar la estabilidad de la desoxirribonucleasa humana. Sin embargo, Mg+2, Mn<+2>y Zn<+2>pueden desestabilizar la rhDNasa. De manera similar, Ca<+2>y Sr<+2>pueden estabilizar el Factor VIII, se puede desestabilizar mediante Mg+2, Mn<+2>y Zn+2, Cu<+2>y Fe+2, y su agregación puede incrementarse mediante iones de Al+3.

Realizaciones de la construcción de anticuerpo de las formulaciones de la invención comprenden, además, uno o más conservantes. Los conservantes son necesarios cuando se desarrollan formulaciones parenterales multidosis que implican más de una extracción del mismo recipiente. Su función principal es inhibir el crecimiento microbiano y asegurar la esterilidad del producto durante la vida útil o el período de uso del producto farmacológico. Los conservantes de uso común incluyen alcohol bencílico, fenol y m-cresol. Aunque los conservantes tienen una larga historia de uso con parenterales de moléculas pequeñas, el desarrollo de formulaciones de proteínas que incluyan conservantes puede ser un desafío. Los conservantes tienen casi siempre un efecto desestabilizador (agregación) sobre las proteínas, y esto se ha convertido en un factor importante para limitar su uso en formulaciones de proteínas multidosis. Hasta la fecha, la mayoría de los fármacos proteicos se han formulado para un solo uso. Sin embargo, cuando son posibles formulaciones de dosis múltiples, tienen la ventaja adicional de permitir la conveniencia del paciente y una comerciabilidad incrementada. Un buen ejemplo es el de la hormona del crecimiento humana (hGH), en donde el desarrollo de formulaciones conservadas ha conducido a la comercialización de presentaciones de pluma inyectable multiusos más convenientes. Actualmente, se encuentran disponibles en el mercado al menos cuatro de estos dispositivos de pluma que contienen formulaciones conservadas de hGH. Norditropin (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ (líquido, Genentech) y Genotropin (liofilizado - cartucho de doble cámara, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol, mientras que Somatrope (Eli Lilly) está formulado con m-cresol. Es necesario considerar varios aspectos durante la formulación y el desarrollo de formas de dosificación conservadas. Debe optimizarse la concentración eficaz de conservante en el producto farmacológico. Esto requiere testar un conservante dado en la forma de dosificación con intervalos de concentraciones que confieren eficacia antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la proteína.

Como era de esperar, el desarrollo de formulaciones líquidas que contienen conservantes es más desafiante que las formulaciones liofilizadas. Productos liofilizados pueden liofilizarse sin el conservante y pueden reconstituirse con un diluyente que contenga conservante en el momento de su uso. Esto acorta el tiempo durante el cual un conservante está en contacto con la proteína, minimizando significativamente los riesgos de estabilidad asociados. Con las formulaciones líquidas, la eficacia y la estabilidad de los conservantes deben mantenerse durante toda la vida útil del producto (aproximadamente de 18 a 24 meses). Un punto importante a tener en cuenta es que la eficacia del conservante debe demostrarse en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes del excipiente.

Las construcciones de anticuerpos descritas en esta memoria también se pueden formular como inmuno-liposomas. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es útil para el suministro de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen la construcción de anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa , 82: 3688 (1985); Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); US Pat. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y WO 97/38731. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la patente de EE.UU. 5.013.556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de la construcción de anticuerpos de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico. Véase Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

Una vez formulada la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles en forma de una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal o en forma de un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones se pueden almacenar en una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de la administración.

La actividad biológica de la composición farmacéutica definida aquí se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos de citotoxicidad, como se describe en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). "Eficacia" o "eficaciain vivo",como se usa aquí, se refiere a la respuesta a la terapia mediante la composición farmacéutica de la invención, usando, por ejemplo, criterios de respuesta estandarizados del NCI. El éxito o eficaciain vivode la terapia que usa una composición farmacéutica de la invención se refiere a la eficacia de la composición para el fin previsto, es decir, la capacidad de la composición para provocar su efecto deseado, es decir, el agotamiento de las células patológicas, por ejemplo células tumorales. La eficaciain vivopuede monitorizarse mediante métodos estándar establecidos para las respectivas entidades patológicas, incluidos, pero sin limitarse a, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación de células activadas por fluorescencia, y aspiración de médula ósea. Además, se pueden utilizar diversos parámetros químicos clínicos específicos de la enfermedad y otros métodos estándares establecidos. Además, se pueden usar tomografía asistida por computadora, rayos X, tomografía por resonancia magnética nuclear (por ejemplo, para la evaluación de respuesta basada en criterios del Instituto Nacional del Cáncer [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Informe de un taller internacional para estandarizar los criterios de respuesta para los linfomas no Hodgkin. Grupo de trabajo internacional patrocinado por NCI. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244]), barrido por tomografía por emisión de positrones, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de médula ósea, biopsias/histologías de ganglios linfáticos, y diversos parámetros químicos clínicos específicos del linfoma (por ejemplo., lactato deshidrogenasa), y otros métodos estándar establecidos.

Otro desafío importante en el desarrollo de fármacos tales como la composición farmacéutica de la invención es la modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. Para este fin, se puede establecer un perfil farmacocinético del fármaco candidato, es decir, un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan la capacidad de un fármaco particular para tratar una afección determinada. Parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen en la capacidad de un fármaco de tratar una determinada enfermedad incluyen, pero no se limitan a: semivida, volumen de distribución, metabolismo hepático de primer paso y grado de unión al suero sanguíneo. La eficacia de un agente farmacológico dado puede verse influida por cada uno de los parámetros arriba mencionados.

"Semivida" significa el tiempo en el que el 50% de un fármaco administrado se elimina a través de procesos biológicos, p. ej., metabolismo, excreción, etc. Por "metabolismo hepático de primer paso" se entiende la propensión de un fármaco a metabolizarse en el primer contacto con el hígado, es decir, durante su primer paso a través del hígado. "Volumen de distribución" significa el grado de retención de un fármaco en los diversos compartimientos del cuerpo, tales como, p. ej., espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc. y la distribución del fármaco dentro de estos compartimientos. "Grado de unión al suero sanguíneo" significa la propensión de un fármaco a interactuar y unirse a proteínas del suero sanguíneo, tales como albúmina, lo que conduce a una reducción o pérdida de la actividad biológica del fármaco.

Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de retardo (Tlag), Tmáx, tasas de absorción, mayor inicio y/o Cmáx para una cantidad dada de fármaco administrado. "Biodisponibilidad" significa la cantidad de un fármaco en el compartimiento sanguíneo. "Tiempo de espera" significa el tiempo de demora entre la administración del fármaco y su detección y mensurabilidad en sangre o plasma. "Tmáx" es el tiempo después del cual se alcanza la concentración sanguínea máxima del fármaco, y "Cmáx" es la concentración sanguínea máxima obtenida con un fármaco dado. El tiempo necesario para alcanzar la concentración sanguínea o tisular del fármaco que se requiere para su efecto biológico está influenciado por todos los parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de construcciones de anticuerpos biespecíficas que exhiben especificidad entre especies, que pueden determinarse en ensayos preclínicos con animales en primates no chimpancés como se describió anteriormente, también se exponen, por ejemplo, en la publicación de Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

Una realización proporciona la construcción de anticuerpos de la invención para uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad de tumor sólido o de una enfermedad de cáncer metastásico.

Las formulaciones descritas en esta memoria son útiles como composiciones farmacéuticas en el tratamiento, la mejoría y/o prevención de la afección médica patológica tal como se describe en esta memoria en un paciente que lo necesite. El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Tratamiento incluye la aplicación o administración de la formulación al cuerpo, un tejido aislado o una célula de un paciente que tiene una enfermedad/trastorno, un síntoma de una enfermedad/trastorno o una predisposición a una enfermedad/trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, paliar, mejorar o afectar la enfermedad, el síntoma de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad.

El término "mejora", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier mejora del estado patológico de un paciente que tiene un tumor o cáncer o un cáncer metastásico tal como se especifica más adelante en esta memoria, mediante la administración de una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención a un sujeto que lo necesite. Una mejora de este tipo también puede verse como una ralentización o detención de la progresión del tumor o cáncer o cáncer metastásico del paciente. El término "prevención", tal como se utiliza en esta memoria, significa evitar la aparición o reaparición de un paciente que tiene un tumor o cáncer o un cáncer metastásico como se especifica más adelante en esta memoria, mediante la administración de una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención a un sujeto en necesidad de la misma.

El término "enfermedad" se refiere a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con la construcción de anticuerpo o la composición farmacéutica descrita en esta memoria. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos, incluyendo aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero a la enfermedad en cuestión.

Una "neoplasia" es un crecimiento anormal de tejido que, por lo general, pero no siempre, forma una masa. Cuando también forma una masa, se la alude comúnmente como un "tumor". Las neoplasias o tumores pueden ser benignos, potencialmente malignos (precancerosos), o malignos. Las neoplasias malignas se denominan comúnmente cáncer. Por lo general, invaden y destruyen el tejido circundante y pueden formar metástasis, es decir, se diseminan a otras partes, tejidos u órganos del cuerpo. Por lo tanto, la expresión "cáncer metastásico" abarca metástasis a otros tejidos u órganos distintos del tumor original. Los linfomas y las leucemias son neoplasias linfoides. Para los fines de la presente invención, también están abarcados por los términos "tumor" o "cáncer".

En una realización preferida de la invención, la enfermedad de tumor sólido y la enfermedad de cáncer metastásico pueden derivar de cualquiera de las anteriores.

Las enfermedades tumorales preferidas en relación con esta invención se seleccionan de un grupo que consiste en cáncer de mama, carcinoide, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, mesotelioma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer renal, y cáncer de estómago. Más preferiblemente, el tumor o enfermedad cancerosa, que es preferiblemente una enfermedad de tumor sólido, se puede seleccionar del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer de páncreas, mesotelioma, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, y cáncer de mama triple negativo. La enfermedad del cáncer metastásico se puede derivar de cualquiera de los anteriores.

También se describe un método para el tratamiento o mejora de un tumor o una enfermedad cancerosa o una enfermedad cancerosa metastásica, que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita la construcción de anticuerpo de la invención o la construcción de anticuerpo producida según el procedimiento de la invención.

Las expresiones "sujeto que lo necesita" o "que necesita tratamiento" incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se debe prevenir el trastorno. El sujeto necesitado o "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

La construcción de anticuerpos de la invención se diseñará generalmente para vías y métodos de administración específicos, para dosificaciones y frecuencias de administración específicas, para tratamientos específicos de enfermedades específicas, con intervalos de biodisponibilidad y persistencia, entre otras cosas. Los materiales de la composición se formulan preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el lugar de administración.

Por lo tanto, las formulaciones y composiciones pueden diseñarse de acuerdo con la invención para suministro mediante cualquier vía de administración adecuada. En el contexto de la presente invención, las vías de administración incluyen, pero no se limitan a

• vías tópicas (tales como epicutánea, inhalatoria, nasal, oftálmica, auricular/aural, vaginal, mucosal);

• vías enterales (tales como oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, bucal, rectal); y

• vías parenterales (tales como intravenosa, intraarterial, intraósea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, epidural, intratecal, subcutánea, intraperitoneal, extraamniótica, intraarticular, intracardíaca, intradérmica, intralesional, intrauterina, intravesical, intravítrea, transdérmica, intranasal, transmucosal, intrasinovial, intraluminal).

Las composiciones farmacéuticas y la construcción de anticuerpo de esta invención son particularmente útiles para la administración parenteral, p. ej., suministro subcutáneo o intravenoso, por ejemplo, mediante inyección, tal como inyección en bolo, o mediante infusión, tal como infusión continua. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar utilizando un dispositivo médico. Ejemplos de dispositivos médicos para administrar composiciones farmacéuticas se describen en las patentes de EE.UU. núms. 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447.

233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851;

y 5.399.163.

En particular, la presente invención proporciona una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como ejemplo no limitativo, la administración ininterrumpida o sustancialmente ininterrumpida, es decir, continua, puede realizarse mediante un pequeño sistema de bomba usado por el paciente para medir el flujo de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. La composición farmacéutica que comprende la construcción de anticuerpo de la invención se puede administrar utilizando dichos sistemas de bomba. Sistemas de bomba de este tipo son generalmente conocidos en la técnica y comúnmente se basan en el intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico que se ha de infundir. Cuando se cambia el cartucho en un sistema de bomba de este tipo, puede producirse una interrupción temporal del flujo ininterrumpido de otro modo de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. En tal caso, la fase de administración antes del reemplazo del cartucho y la fase de administración después del reemplazo del cartucho aún se considerarían dentro del significado de los medios farmacéuticos y los métodos de la invención juntos constituyen una "administración ininterrumpida" de un agente terapéutico de este tipo.

La administración continua o ininterrumpida de las construcciones de anticuerpos de la invención puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de suministro de fluido o un pequeño sistema de bomba que incluye un mecanismo de impulsión de fluido para sacar fluido de un depósito y un mecanismo de actuación para activar el mecanismo de impulsión. Sistemas de bomba para administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para penetrar la piel de un paciente y administrar la composición adecuada al cuerpo del paciente. Dichos sistemas de bomba pueden fijarse o adherirse directamente a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, permitiendo con ello un contacto directo entre el sistema de bomba y la piel del paciente. El sistema de bomba se puede colocar en la piel del paciente durante 24 horas hasta varios días. El sistema de bomba puede ser de pequeño tamaño con un depósito para pequeños volúmenes. Como un ejemplo no limitativo, el volumen del depósito para la composición farmacéutica adecuada a administrar puede estar entre 0,1 y 50 ml.

La administración continua también puede ser transdérmica mediante un parche que se coloca sobre la piel y se reemplaza a intervalos. Un experto en la técnica conoce los sistemas de parches para el suministro de fármacos adecuados para este propósito. Cabe señalar que la administración transdérmica es especialmente adecuada para la administración ininterrumpida, ya que el intercambio de un primer parche agotado se puede realizar ventajosamente simultáneamente con la colocación de un segundo parche nuevo, por ejemplo, en la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primer parche agotado e inmediatamente antes de retirar el primer parche agotado. No surgen problemas de interrupción del flujo o fallo de la celda de energía.

Si la composición farmacéutica se ha liofilizado, el material liofilizado se reconstituye primero en un líquido apropiado antes de la administración. El material liofilizado se puede reconstituir en, p. ej., agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la misma formulación en la que había estado la proteína antes de la liofilización.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada que se puede determinar, p. ej., mediante estudios de aumento de la dosis mediante la administración de dosis crecientes de la construcción de anticuerpo de la invención que exhibe la especificidad entre especies descrita en esta memoria para primates que no son chimpancés. por ejemplo macacos. Como se expuso arriba, la construcción de anticuerpo de la invención que exhibe especificidad entre especies descrita en esta memoria puede utilizarse ventajosamente en forma idéntica en pruebas preclínicas en primates que no son chimpancés y como fármaco en seres humanos. El régimen de dosificación lo determinará el médico tratante y los factores clínicos. Como es bien conocido en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, la superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se ha de administrar, el sexo, la hora y la vía de administración, la salud general y otros. fármacos que se administran al mismo tiempo.

La expresión "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se define como una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente el efecto deseado. La expresión "dosis terapéuticamente eficaz" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Cantidades o dosis eficaces para este uso dependerán de la afección a tratar (la indicación), la construcción del anticuerpo administrado, el contexto y los objetivos terapéuticos, la gravedad de la enfermedad, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al agente terapéutico, la vía de administración, el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o el estado (la edad y salud general) del paciente, y el estado general del sistema inmune del propio paciente. La dosis adecuada se puede ajustar de acuerdo con el criterio del médico tratante, de modo que se pueda administrar al paciente una vez o durante una serie de administraciones, y con el fin de obtener el efecto terapéutico óptimo.

Una dosificación típica puede variar desde aproximadamente 0,1 μg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores arriba mencionados. En realizaciones específicas, la dosificación puede variar desde 1,0 μg/kg hasta aproximadamente<20>mg/kg, opcionalmente desde<10>μg/kg hasta aproximadamente<10>mg/kg o desde 100 μg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de una construcción de anticuerpo de la invención preferiblemente da como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad o una prevención del deterioro o discapacidad debidos a la aflicción de la enfermedad. Para tratar tumores que expresan MSLN, una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de anticuerpos de la invención, por ejemplo una construcción de anticuerpo anti-MSLN/anti-CD3, inhibe preferiblemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos alrededor de<20>%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, o al menos alrededor de 90% con respecto a pacientes no tratados. La capacidad de un compuesto de inhibir el crecimiento del tumor puede evaluarse en un modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos.

La composición farmacéutica se puede administrar como un único agente terapéutico o en combinación con terapias adicionales tales como terapias contra el cáncer según sea necesario, p. ej., otros fármacos proteicos y no proteicos. Estos fármacos pueden administrarse simultáneamente con la composición que comprende la construcción de anticuerpo de la invención como se define en esta memoria o por separado antes o después de la administración de dicha construcción de anticuerpo en intervalos y dosis definidos oportunamente.

La expresión "dosis eficaz y no tóxica", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una dosis tolerable de una construcción de anticuerpo de la invención que es lo suficientemente alta como para provocar el agotamiento de las células patológicas, la eliminación del tumor, la reducción del tumor o la estabilización de la enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos importantes. Dosis eficaces y no tóxicas de este tipo pueden determinarse, p. ej., mediante estudios de aumento de la dosis descritos en la técnica y deben estar por debajo de la dosis que induce efectos secundarios adversos graves (toxicidad limitante de la dosis, DLT).

El término "toxicidad", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco que se manifiestan en eventos adversos o eventos adversos graves. Estos eventos secundarios pueden referirse a una falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o una ausencia de tolerancia local después de la administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos o cancerígenos provocados por el fármaco.

El término "seguridad", "seguridadin vivo"o "tolerabilidad", como se usa aquí, define la administración de un fármaco sin inducir eventos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un período de aplicación más largo del fármaco. La "seguridad", "seguridadin vivo"o "tolerabilidad" pueden evaluarse, por ejemplo, a intervalos regulares durante el tratamiento y el período de seguimiento. Las mediciones incluyen evaluación clínica, p. ej., manifestaciones orgánicas y rastreo de anomalías de laboratorio. Se puede llevar a cabo una evaluación clínica y desviaciones de los hallazgos normales se pueden registrar/codificar de acuerdo con los estándares NCI-CTC y/o MedDRA. Las manifestaciones de órganos pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardíaca, coagulación y similares, como se recoge, p. ej., en los Criterios de Terminología Común para eventos adversos v3.0 (CTCAE). Parámetros de laboratorio que pueden testarse incluyen, por ejemplo, hematología, química clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y examen de otros fluidos corporales, tales como suero, plasma, líquido linfoide o cefalorraquídeo, líquido y similares. Por lo tanto, la seguridad puede evaluarse, p. ej., mediante examen físico, técnicas de formación de imágenes (es decir, ultrasonidos, rayos X, tomografías computarizadas, formación de Imágenes por Resonancia Magnética (MRI), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma), signos vitales, midiendo parámetros de laboratorio y registrando efectos adversos. Por ejemplo, eventos adversos en primates no chimpancés en los usos y métodos de acuerdo con la invención pueden examinarse mediante métodos histopatológicos y/o histoquímicos.

Los términos anteriores también se citan, por ejemplo, en la Evaluación de seguridad preclínica de productos farmacéuticos derivados de la biotecnología S6 ; Directriz Tripartita Armonizada de la ICH; Reunión del Comité Directivo de la ICH el 16 de julio de 1997.

En una realización adicional, la invención proporciona un kit que comprende una construcción de anticuerpo de la invención y/o una célula hospedante de la invención.

En el contexto de la presente invención, el término "kit" significa dos o más componentes - uno de los cuales corresponde a la construcción del anticuerpo, la composición farmacéutica, el vector o la célula huésped de la invención - empaquetados juntos en un envase, recipiente o de otro modo. Por lo tanto, un kit puede describirse como un conjunto de productos y/o utensilios que son suficientes para lograr un determinado objetivo, que pueden comercializarse como una sola unidad.

El kit puede comprender uno o más recipientes (tales como viales, ampollas, recipientes, jeringas, frascos, bolsas) de cualquier forma, tamaño y material apropiado (preferiblemente impermeable, por ejemplo plástico o vidrio) que contenga la construcción de anticuerpo o la composición farmacéutica de la presente invención en una dosis apropiada para la administración (véase anteriormente). El kit puede contener adicionalmente instrucciones de uso (por ejemplo, en forma de folleto o manual de instrucciones), medios para administrar la construcción de anticuerpos de la presente invención, tales como una jeringa, bomba, infusor o similares, medios para reconstituir la construcción de anticuerpo de la invención, y/o medios para diluir la construcción de anticuerpo de la invención.

La invención también proporciona kits para una unidad de administración de dosis única. El kit de la invención también puede contener un primer receptor que comprende una construcción de anticuerpo seca/liofilizada y un segundo receptor que comprende una formulación acuosa. En ciertas realizaciones de este invención, se proporcionan kits que contienen jeringas precargadas de una y varias cámaras (por ejemplo, jeringas para líquidos y liojeringas).

Las Figuras muestran:

Figura 1:

Representación esquemática de la quimera MSLN humana-ratón. Las quimeras de MSLN se generaron con 6 intercambios de tramos de secuencia distintos de MSLN humana a ratón. Las variantes respectivas se expresaron en la superficie de clones de células CHO (E1-E6 ). Véase el Ejemplo 1.

Figura 2

Reactividad cruzada de construcciones de anticuerpos anti-MSLN detectadas por citometría de flujo: unión a MSLN y CD3 humanos y macacos. Véase el Ejemplo 4.

Figura 3

Análisis de construcciones de anticuerpos anti-MSLN mediante citometría de flujo: unión a las variantes humanas v2 y v6. Véase el Ejemplo 4.

Figura 4

La potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 para redirigir células T efectoras CD8 humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con MSLN humana se midió en un ensayo de liberación de 51Cr de 18 horas (relación efectoras:diana 10:1).

Figura 5

La potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 para redirigir células T efectoras CD8 humanas estimuladas contra OVCAR-8 positivas para MSLN se midió en un ensayo de liberación de 51Cr de 18 horas (relación efectoras:diana 10:1).

Figura 6

La potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 para redirigir las células T en PBMC humanas no estimuladas (CD14-/CD56-) contra células CHO transfectadas con MSLN humana, en ausencia y presencia de MSLN soluble, se midió en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas (relación efectoras:diana<1 0>:<1>).

Figura 7

La potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 para redirigir las células T en PBMC humanas no estimuladas (CD14-/CD56-) contra la línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8 se midió en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas.

Figura 8

Para confirmar que las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 con reactividad cruzada son capaces de redirigir células T de macaco contra células CHO transfectadas con MSLN de macaco, se llevó a cabo en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con una línea de células T de macaco LnPx4119 como células T efectoras (relación efectoras:diana 10:1).

Figura 9

La brecha de potencia entre las isoformas monoméricas y diméricas de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 en la redirección de las células T en células T efectoras CD8 humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con MSLN humana se midió en un ensayo de liberación de 51Cr de 18 horas (relación efectoras:diana 10:1).

Figura 10

Estabilidad de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 después de una incubación durante 96 horas en plasma humano. Ensayo basado en 51Cr de 18 horas. Células efectoras: células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas. Células diana: células CHO transfectadas con hu MSLN. Relación de células efectoras a dianas (E:T): 10:1. Proteína BiTE como se indica.

Figura 11

La homogeneidad proteica de las construcciones de anticuerpos de la invención analizada mediante cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución CIEX

Figura 12

La hidrofobia superficial de construcciones de anticuerpos biespecíficas de la invención ensayada en cromatografía de interacción hidrófoba HIC en modo de flujo continuo.

Figura 13

Conversión de monómero a dímero después de tres ciclos de congelación/descongelación.

Figura 14

Conversión de monómero a dímero después de 7 días de incubación a 250 μg/ml

Figura 15:Evaluación de la activación de células T independiente de la diana por construcciones de anticuerpos HLE BiTE® de mesotelina (MS). 2(a) construcción de anticuerpo de la invención en ensayo de activación de 48 h con PBMC humanas (3x); diluciones en serie de HLE BiTE® (inicio 20 nM; 1:5, 7x+blanco); sin o con bloqueo de FcR [10 mg/ml de hulgG (Kiovog, Baxter)]; medida por FACS de la expresión de CD69 y CD25 [no mostrada] en células T CD4+, CD8 . 2(b) construcción de anticuerpo hetero-Fc en ensayo de activación de 48 h con PBMC humanas y PBMC empobrecidas en células CD14+/CD33+ (3x); diluciones en serie de HLE BiTE® (inicio 20 nM; 1:5, 7x+blanco); medida por FACS de la expresión de CD69 y CD25 [no mostrada] en células T CD4+, CD8 .

Figura 16:Evaluación de la activación de células T independiente de la diana por construcciones de anticuerpos HLE BiTE® de CDH19. 3(a) construcción de anticuerpo de la invención en ensayo de activación de 48 h con PBMC humanas (3x); diluciones en serie de HLE BiTE® (inicio 20 nM; 1:5, 7x+blanco); sin o con bloqueo de FcR [10 mg/ml de hulgG (Kiovog, Baxter)]; medida por FACS de la expresión de CD69 y CD25 [no mostrada] en células T CD4+, CD8 . 3(b) construcción de anticuerpo hetero-Fc en ensayo de activación de 48 h con PBMC humanas y PBMC empobrecidas en células CD14+/CD33+ (3x); diluciones en serie de HLE BiTE® (inicio 20 nM; 1:5, 7x+blanco); medida por FACS de la expresión de C<d>69 y CD25 [no mostrada] en células T CD4+, CD8 .3(c) construcción de Xcuerpo en ensayo de activación de 48 h con PBMC humanas y PBMC empobrecidas en células CD14+/CD33+ (3x); diluciones en serie de HLE BiTE® (inicio 20 nM; 1:5, 7x+blanco); medida por FACS de la expresión de CD69 y CD25 [no mostrada] en células T CD4+, CD8 .

Figura 17:Unión del complemento C1q de construcciones de anticuerpos BiTE® de fusión de Fc. Construcciones de anticuerpos BiTE® de fusión de Fc (Fc monocatenario BiTE® (triángulo), hetero Fc BiTE® (cuadrados), BiTE® canónico (círculo)) se revistieron sobre una placa Maxisorp (en series de dilución), antes de la incubación con suero humano combinado e incubación con anticuerpo murino policlonal anti CC1q humano, visualizadas mediante conjugado anti-Fc de ratón de cabra-AP.

Figura 18:Perfiles farmacocinéticos medios de cuatro pares de proteínas de fusión BiTE®-HLE después de la administración de una dosis única en monos cinomolgos. Por razones de comparabilidad, las concentraciones séricas se normalizaron en dosis a 15 μg/kg y se indicaron en nmol.

Figura 19: Perfiles farmacocinéticos medios de cinco construcciones de anticuerpos BiTE®diferentes, cada una fusionada a un resto que extiende la vida media de scFc. Por razones de comparabilidad, las concentraciones séricas se normalizaron en dosis a 15 μg/kg y se indicaron en nmol.

Ejemplos:

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención. Estos Ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de esta invención. La presente invención está limitada únicamente por las reivindicaciones.

Ejemplo 1

Generación de células CHO que expresan MSLN quimérica y de tipo salvaje

El antígeno MSLN se puede subdividir en seis subdominios o regiones diferentes que se definen, a los efectos de los Ejemplos 1 y 2. La secuencia de aa de esos seis subdominios se representa en las SEQ ID NO: 238-243.

Se eneraron las si uientes moléculas; véase también la Fi ura 1:

Para la generación de células CHO que expresan MSLN humana, de macaco cinomolgo ("cino"), y humana truncada N-terminal marcada con V5, las secuencias codificantes respectivas para MSLN humana (SEQ ID NO: 231; véase también el número de acceso de GeneBank NM_005823), MSLN cino (SEQ ID NO: 234, véase LMR C52457) y las seis versiones quiméricas de MSLN humana/murina (véase anteriormente) se clonaron en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Para la expresión en la superficie celular de MSLN humana y cino, se usó el péptido señal original. Todos los procedimientos de clonación se llevaron a cabo según protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Para cada construcción, se transfectó un plásmido correspondiente en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota, como lo describe Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La expresión de MSLN humana, quimérica y cino en células CHO se verificó en un ensayo de FACS usando un anticuerpo monoclonal de ratón IgG2b anti-MSLN humana. Como control negativo, las células se incubaron con el anticuerpo de control de isotipo en lugar del primer anticuerpo. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo.

Ejemplo 2

Mapeo de epítopos de construcciones de anticuerpos anti-MSLN

Las células transfectadas con MSLN humana y con las moléculas quiméricas de MSLN humana (véase el Ejemplo 1) se tiñeron con extracto periplásmico bruto, sin diluir, que contenía construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 (denominándose el dominio de unión a CD3 I2C) fusionadas a una albúmina humana (variante 1), en PBS/1,5%FCS. Las moléculas unidas se detectaron con un anticuerpo de dominio de unión anti-CD3 monoclonal de ratón interno (50 pl) seguido de una IgG anti-ratón Fc-gamma-PE (1:100, 50 pl; Jackson Immunoresearch n° 115-116 071) Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS/FCS al 1,5%. Como control negativo, las células se incubaron con PBS/FCS al 2% en lugar del extracto periplásmico. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo.

Las regiones que se reconocieron por los respectivos dominios de unión a MSLN se indican en la tabla de secuencias (Tabla 2). La pérdida de la señal de FACS en las respectivas construcciones quiméricas de MSLN que comprenden el grupo de epítopos murinos se leyó para determinar la relevancia del grupo respectivo para la unión. En caso de que la señal de FACS se viera afectada negativamente por más de uno, respectivamente dos, clones quiméricos de MSLN, se concluyó que ambos grupos son relevantes.

T l 2: M l r í M -1 M -8

Ejemplo 3

Análisis basado en Scatchard de la afinidad de la construcción del anticuerpo biespecífica MSLNxCD3 por MSLN humana y de macaco en células positivas para el antígeno diana, y determinación de la brecha de afinidad entre especies

Las afinidades de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 por células CHO transfectadas con MSLN humana o de macaco también se determinaron mediante análisis de Scatchard como el método más fiable para medir posibles brechas de afinidad entre MSLN humana y de macaco. Para el análisis de Scatchard, se realizan experimentos de unión por saturación utilizando un sistema de detección monovalente para determinar con precisión la unión monovalente de las construcciones de anticuerpos biespecíficos MSLNxCD3 a la línea celular respectiva.

2 x 10<4>células de la línea celular respectiva (línea celular CHO que expresa recombinantemente MSLN humana, línea celular CHO que expresa recombinantemente MSLN de macaco) se incubaron cada una con 50 gl de una serie de diluciones triples (doce diluciones a 1:2) de la construcción de anticuerpo biespecífica MSLNxCD3 respectiva (hasta que se alcance la saturación), comenzando a 10-20 nM, seguido de 16 h de incubación a 4°C con agitación y una etapa de lavado residual. Luego, las células se incubaron durante otra hora con 30 gl de una solución de conjugado CD3xALEXA488. Después de una etapa de lavado, las células se resuspendieron en 150 gl de tampón FACS que contenía formaldehído al 3,5 %, se incubaron durante 15 min adicionales, se centrifugaron, se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron utilizando una máquina FACS Cantoll y el software FACS Diva. Los datos se generaron a partir de dos conjuntos independientes de experimentos, cada uno de los cuales utilizó triplicados. Se calculó el análisis de Scatchard respectivo para extrapolar la unión máxima (Bmáx). Se determinaron las concentraciones de construcciones de anticuerpos biespecíficos MSLNxCD3 a la unión semi-máxima reflejando las respectivas Kds. Los valores de las mediciones por triplicado se representaron como curvas hiperbólicas y como curvas en forma de S para demostrar los intervalos de concentraciones adecuados desde la unión mínima hasta la óptima.

Los valores representados en la Tabla 3 se derivaron de dos experimentos independientes por construcción de anticuerpo biespecífico MSLNxCD3. El análisis de Scatchard basado en células confirmó que las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 de la invención tienen afinidad subnanomolar por MSLN humana y MSLN mac, y se presentan con una pequeña brecha de afinidad entre especies cino/humana de alrededor de 1.

Tabla 3:Afinidades (KD) de construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 según se determina en análisis de Scatchard basado en células con la brecha de afinidad calculada KD MSLN de macaco/KD MSLN humana. Las construcciones de anticuerpos se midieron en dos experimentos independientes, cada uno utilizando triplicados.

Ejemplo 4

Unión biespecífica y reactividad cruzada entre especies

Para la confirmación de la unión a MSLN humana y CD3 y a MSLN de cino y CD3, se ensayaron construcciones de anticuerpos biespecíficas de la invención mediante citometría de flujo usando

• células CHO transfectadas con MSLN humana, con isoforma de MSLN humana (NM_013404=SEQ ID NO:232 y AY743922=SEQ ID NO:233), y con MSLN de macaco, respectivamente,

• la línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8 ,

• la línea celular de leucemia de células T humanas que expresa CD3 HPB-all (DSMZ, Braunschweig, ACC483), y

• la línea de células T LnPx 4119 que expresa CD3 de cinomolgo

Para la citometría de flujo, se incubaron 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 60 min a 4°C con 50 μl de construcción de anticuerpo biespecífico purificado a una concentración de 5 μg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS/FCS al 2% y luego se incubaron con un anticuerpo de ratón interno (2 μg/ml) específico para la parte de unión a CD3 de las construcciones de anticuerpos biespecíficos durante 30 min a 4°C. Después del lavado, se detectaron anticuerpos de ratón unidos con un Fcy-PE anti-ratón de cabra (1:100) durante 30 min a 4°C. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo. Se utilizaron células CHO no transfectadas como control negativo.

Los resultados se muestran en las Figuras 2 y 3. Las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 de la invención tiñeron células CHO transfectadas con MSLN humana, la isoforma de MSLN artificial y con MSLN cino, y también tiñeron la línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8 (expresador natural). Las líneas de células T humanas y de cyno que expresan CD3 también fueron reconocidas por las construcciones de anticuerpos biespecíficos. Además, no hubo tinción de las células de control negativo (CHO no transfectadas).

Ejemplo 5

Actividad citotóxica

La potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 de la invención para redirigir células T efectoras contra células diana que expresan MSLN se analizó en cinco ensayos de citotoxicidadin vitro:

• La potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 para redirigir células T efectoras CD8 humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con MSLN humana se midió en un ensayo de liberación de 51Cr de 18 horas (relación efectoras:diana 10:1). Figura 4 y Tabla 4

• La potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 para redirigir células T efectoras CD8 humanas estimuladas contra la línea celular positiva para MSLN OVCAR-8 se midió en un ensayo de liberación de 51Cr de 18 horas (relación efectoras:diana 10:1). Figura 5 Tabla 5

• La potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 para redirigir las células T en PBMC humanas no estimuladas (CD14-/CD56-) contra células CHO transfectadas con MSLN humana, en ausencia y presencia de MSLN soluble, se midió en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas (relación efectoras:diana 10:1). Figura 6 y Tabla 6

• La potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 para redirigir las células T en PBMC humanas no estimuladas (CD14-/CD56-) contra la línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8 se midió en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Figura 7

• Para confirmar que las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 con reactividad cruzada son capaces de redirigir células T de macaco contra células CHO transfectadas con MSLN de macaco, se llevó a cabo en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con una línea de células T de macaco LnPx4119 como células T efectoras (relación efectoras:diana 10:1). Figura 8

• La brecha de potencia entre las isoformas monoméricas y diméricas de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 en la redirección de las células T en células T efectoras CD8+ humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con MSLN humana se midió en un ensayo de liberación de 51Cr de 18 horas (relación efectoras:diana 10:1). Figura 9

Ejemplo 5.1

Ensayo de liberación de cromo con células T humanas estimuladas

Se obtuvieron células T estimuladas enriquecidas en células T CD8+ como se describe a continuación. Se revistió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 disponible comercialmente (OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 μg/ml durante 1 hora a 37°C. La proteína no unida se eliminó mediante una etapa de lavado con PBS. Se añadieron 3-5 x107 PBMC humanas a la placa de Petri prerevestida en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada/FCS al 10%/IL-220 U/ml (Proleukin®, Chiron), y se estimularon durante 2 días. Al tercer día, las células se recogieron y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y las células se cultivaron de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que antes. Linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ se enriquecieron mediante el agotamiento de células T CD4+ y células NK CD56+ usando Dynal-Beads de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células diana CHO transfectadas con MSLN humana o MSLN cino se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI, y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 200 pl de RPMI complementado con una relación E:T de 10:1. Se utilizó una concentración inicial de 0,01 - 1 μg/ml de construcción de anticuerpo biespecífico purificado y diluciones triples de la misma. El tiempo de incubación del ensayo fue de 18 horas. La citotoxicidad se determinó como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante con relación a la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las mediciones se realizaron por cuadriplicado. La medición de la actividad de cromo en los sobrenadantes se realizó en un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los resultados se llevó a cabo con Prism 5 para Windows (versión 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.) Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis a partir de las curvas de respuesta a la dosis sigmoidea se utilizaron para comparar la actividad citotóxica.

Ejemplo 5.2

Potencia para redirigir células T efectoras humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con MSLN humana

La actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 según la invención se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr), usando células CHO transfectadas con MSLN humana como células diana y células T CD8+ humanas estimuladas como células efectoras. El experimento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 8.1.

Los resultados se muestran en la Tabla 4. Las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 mostraron una actividad citotóxica muy potente contra células CHO transfectadas con MSLN humana, en el intervalo picomolar de 1 dígito.

Tabla 4:Los valores de CE50 [pM] de construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 se analizaron en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr), usando células CHO transfectadas con MSLN humana como células diana células T CD8 humanas estimuladas como células efectoras.

Ejemplo 5.3

Potencia para redirigir células T efectoras humanas estimuladas contra la línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8

La actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr), usando la línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8 como fuente de células diana, y células T CD8+ humanas estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 8.1.

De acuerdo con los resultados de los ensayos de liberación de cromo 51 con linfocitos T CD8+ humanos enriquecidos estimulados como células efectoras y células CHO transfectadas con MSLN humana como células diana, las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 de la presente invención también son potentes en actividad citotóxica contra células diana expresoras naturales (véase la Tabla 5).

Tabla 5:Los valores de CE50 [pM] de construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 se analizaron en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) de 18 horas, con la línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8 como fuente de células diana, células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas como células efectoras.

Ejemplo 5.4

Ensayo de citotoxicidad basado en FACS con PBMC humanas no estimuladas

Aislamiento de células efectoras

Se prepararon células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) humana mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidos (capas leucocitarias), un producto secundario de los bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Las capas leucocitarias fueron suministradas por un banco de sangre local y las PBMC se prepararon el mismo día de la extracción de sangre. Después de la centrifugación de densidad Ficoll y extensos lavados con PBS de Dulbecco (Gibco), los eritrocitos restantes se eliminaron de las PBMC por medio de incubación con tampón de lisis de eritrocitos (NH4Cl 155 pM, KHCO<3>10 mM, EDTA 100 pM). Las plaquetas se eliminaron a través del sobrenadante tras la centrifugación de PBMC a 100 x g. Los linfocitos restantes comprenden principalmente linfocitos B y T, células NK y monocitos. Las PBMC se mantuvieron en cultivo a 37°C/5% de CO<2>en medio R<p>MI (Gibco) con 10% de FCS (Gibco).

Agotamiento de células CD14+ y CD56+

Para el agotamiento de las células CD14+, se usaron MicroBeads de CD14 humano (Milteny Biotec, MACS, #130-050-201), para el agotamiento de las células NK, MicroBeads de CD56 humano (MACS, #130-050-401). Las PBMC se contaron y se centrifugaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con 300 x g. El sobrenadante se descartó, y el pelete celular se resuspendió en amortiguador de aislamiento MACS [80 pl/107 células; PBS (Invitrogen, #20012-043), FBS al 0,5% (v/v) (Gibco, #10270-106), EDTA 2 mM (Sigma-Aldrich, #E-6511)]. Se añadieron MicroBeads de CD14 y MicroBeads de CD56 (20 pl/107 células), y se incubaron durante 15 minutos a 4 - 8°C. Las células se lavaron con amortiguador de aislamiento MACS (1 - 2 ml/107 células). Después de la centrifugación (véase anteriormente), el sobrenadante se descartó, y las células se resuspendieron en amortiguador de aislamiento MACS (500 gl/108 células). A continuación, se aislaron células negativas para CD14/CD56 utilizando Columnas LS (Miltenyi Biotec, n° 130-042 401). Se cultivaron células PBMC sin CD14+/CD56+ en medio completo RPMI, es decir, RPMI1640 (Biochrom AG, n° FG1215) complementado con FBS al 10% (Biochrom AG, n° S0115), 1x aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, n° K0293), tampón Hepes 10 mM (Biochrom AG, n° L1613), piruvato de sodio 1 mM (Biochrom AG, n° L0473) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Biochrom AG, n° A2213) a 37°C en una incubadora hasta que se necesite.

Mareaje de células diana

Para el análisis de la lisis celular en ensayoys de citometría de flujo, se usó el colorante de membrana fluorescente DiOC<1>8 (DiO) (Molecular Probes, #V22886) para marcar células CHO transfectadas con MSLN humana o MSLN de macaco como células diana y distinguirlas de las células efectoras. Brevemente, las células se recogieron, se lavaron una vez con PBS, y se ajustaron hasta 106 células/ml en PBS que contenía 2% (v/v) de FBS y el colorante de membrana DiO (5 gl/106 celdas). Después de la incubación durante 3 minutos a 37°C, las células se lavaron dos veces en medio RPMI completo, y el número de células se ajustó a 1,25 x 105 células/ml. La vitalidad de las células se determinó utilizando una solución de EosinaG isotónica al 0,5% (v/v) (Roth, n° 45380).

Análisis basado en citometría de flujo

Este ensayo se diseñó para cuantificar la lisis de células CHO transfectadas con MSLN humana o de cino en presencia de diluciones en serie de construcciones de anticuerpos biespecíficas de MSLN. Se mezclaron volúmenes iguales de células diana marcadas con DiO y células efectoras (es decir, PBMC sin células CD14+), lo que dio como resultado una relación de células E:T de 10:1. Se transfirieron 160 gl de esta suspensión a cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 40 gL de diluciones en serie de las construcciones de anticuerpos biespecíficos MSLNxCD3 y un control negativo biespecífico (una construcción de anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno diana irrelevante) o medio completo RPMI como un control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por el anticuerpo biespecífico transcurrió durante 48 horas en una incubadora humidificada con CO<2>al 7%. Luego, las células se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos y se vigiló la pérdida de integridad de la membrana de la célula diana añadiendo yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 gg/mL. El PI es un colorante impermeable a la membrana que normalmente se excluye de las células viables, mientras que las células muertas lo absorben y se vuelven identificables por emisión fluorescente.

Las muestras se midieron mediante citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron con el software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson). Las células diana se identificaron como células positivas para DiO. Las células diana PI negativas se clasificaron como células diana vivas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

^ c é lu la s diana muertas ,

Citotoxicidad [%] = --------------------x lOO

I tcé lu la s diana

n = número de eventos

Utilizando el software GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), se representó gráficamente el porcentaje de citotoxicidad frente a las concentraciones de construcciones de anticuerpos biespecíficos correspondientes. Las curvas de respuesta a la dosis se analizaron con los cuatro modelos de regresión logística paramétrica para la evaluación de las curvas de respuesta a la dosis sigmoidea con pendiente de colina fija y se calcularon los valores de CE50.

Ejemplo 5.5

Potencia para redirigir PBMC humanas no estimuladas contra células CHO transfectadas con MSLN humana en ausencia y presencia de MSLN soluble

La actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando células CHO transfectadas con MSLN humana como células diana y PBMC humanas no estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 8.4 anterior.

Los resultados de los ensayos de citotoxicidad basados en FACS con PBMC humanas no estimuladas como células efectoras y células CHO transfectadas con MSLN humana como dianas se muestran en la Tabla 7.

Tabla 6: Actividad citotóxica de PBMC humanas no estimuladas contra células CHO transfectadas con MSLN humana en ausencia y presencia de MSLN soluble

Como era de esperar, los valores de CE50 fueron generalmente más altos en los ensayos de citotoxicidad con PBMC no estimuladas como células efectoras en comparación con los ensayos de citotoxicidad utilizando células T CD8+ humanas estimuladas (véase el Ejemplo 8.2).

Ejemplo 5.6

Potencia para redirigir PBMC humanas no estimuladas contra células OVCAR-8 de la línea celular positiva para MSLN

La actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 se analizó además en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando la línea celular humana positiva para MSLN OVCAR-8 como fuente de células diana y PBMC humanas no estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 8.4 anterior. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7:Valores de CE50 [pM] de construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 medidos en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con PBMC humanas no estimuladas como células efectoras y la línea celular humana OVCAR-8 como fuente de células diana.

Ejemplo 5.7

Potencia para redirigir células T de macaco contra células CHO que expresan MSLN de macaco

La actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando células CHO transfectadas con MSLN de macaco (cino) como células diana y la línea de células T de macaco 4119LnPx (Knappe et al. Blood 95:3256-61 (2000)) como fuente de células efectoras. El marcaje de células diana de células CHO transfectadas con MSLN de macaco, y el análisis de la actividad citotóxica basado en citometría de flujo, se realizaron como se describió anteriormente.

Los resultados se muestran en la Tabla 8. Se indujeron células T de macaco de la línea celular 4119LnPx para que mataran eficazmente células CHO transfectadas con MSLN de macaco mediante construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 de la invención.

Tabla 8:Valores de CE50 [pM] de MSLNxCD3 biespecífico medidos en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas, con la línea de células T de macaco 4119LnPx como células efectoras y células CHO transfectadas con MSLN de macaco como células diana.

Ejemplo 5.8

Hueco de potencia entre la isoforma monomérica y la dimérica de las construcciones de anticuerpos biespecíficas

Con el fin de determinar la diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y la dimérica de las construcciones de anticuerpos biespecíficos MSLNxCD3 individuales (a la que se alude como hueco de potencia), se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 de 18 horas como se describe arriba en esta memoria (Ejemplo 8.1) con monómero y dímero de construcción de anticuerpo biespecífico purificado. Las células efectoras se estimularon con células T CD8+ humanas enriquecidas. Las células diana fueron células CHO transfectadas con hu MSLN. La relación célula efectora a diana (E:T) fue 10:1. El hueco de potencia se calculó como la relación entre los valores de CE50.

Los resultados de los ensayos con células T CD+ humanas enriquecidas estimuladas como células efectoras y células CHO transfectadas con MSLN humana como dianas se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9: Actividad citotóxica de PBMC humanas no estimuladas contra células CHO transfectadas con MSLN humana usando construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 monoméricas diméricas

Ejemplo 6

Estabilidad después de la incubación durante 24 horas en plasma humano

Construcciones de anticuerpos biespecíficos purificados se incubaron en una relación de 1:5 en una agrupación de plasma humano a 37°C durante 96 horas a una concentración final de 2-20 μg/ml. Después de la incubación con plasma, las construcciones de anticuerpos se compararon en un ensayo de liberación de cromo 51 con células T CD8+ humanas enriquecidas estimuladas y células CHO transfectadas con MSLN humana a una concentración inicial de 0,01-0,1 μg/ml y con una relación de célula efectora a diana (E:T) de 10:1 (ensayo como se describe en el Ejemplo 8.1). Se incluyeron como controles construcciones de anticuerpos biespecíficos recién descongelados, no incubados.

Los resultados se muestran en la Tabla 10 a continuación; Todas las construcciones de anticuerpos ensayadas presentaban una estabilidad plasmática muy favorable (CE<50>plasma/CE<50>control) de < 4,.

Tabla 10: Valores de CE50 de las construcciones de anticuerpos con y sin incubación de plasma y valor de plasma / control calculado

Ejemplo 7

Homogeneidad de proteínas mediante cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución

La homogeneidad de las proteínas de las construcciones de anticuerpos de la invención se analizó mediante cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución CIEX.

50 μg de monómero de construcción de anticuerpo se diluyeron con 50 ml de tampón de unión A (dihidrógeno-fosfato de sodio 20 mM, NaCl 30 mM, octanato de sodio al 0,01%, pH 5,5) y se aplicaron 40 ml de esta solución a una columna de 1 ml de BioPro SP-F (YMC, Alemania) conectada a un dispositivo Ákta Micro FPLC (GE Healthcare, Alemania). Después de la unión de la muestra, se llevó a cabo una etapa de lavado con tampón de unión adicional. Para la elución de proteínas se aplicó un gradiente de sal creciente lineal utilizando tampón B (dihidrógeno-fosfato de sodio 20 mM, NaCl 1000 mM, octanato de sodio al 0,01%, pH 5,5) hasta un 50% de tampón B sobre 10 volúmenes de columna. Todo el ciclo se vigiló a una absorbancia óptica de 280, 254 y 210 nm. El análisis se realizó mediante la integración de picos de la señal de 280 nm registrada en la hoja de evaluación de ejecución del software Ákta Unicorn.

Los resultados se muestran en la Tabla 11 que figura más adelante. Casi todas las construcciones de anticuerpos ensayadas tienen una homogeneidad muy favorable de > 80% (área bajo la curva (= AUC) del pico principal). La única excepción es la construcción biespecífica MS-2xCD3-HALB, con apenas un 67% de homogeneidad.

T l 11: H m n i r ín l n r i n ni r A l i rin i l

Hidrofobicidad de la superficie medida por HIC Butilo

La hidrofobicidad de la superficie de las construcciones de anticuerpos biespecíficos de la invención se testó en cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en modo de flujo continuo.

Se diluyeron 50 gg de monómero de construcción de anticuerpo con amortiguador de formulación genérico hasta un volumen final de 500 gl (ácido cítrico 10 mM, lisina HCl 75 mM, trehalosa al 4%, pH 7,0), y se aplicaron a una columna de Butil Sefarosa FF de 1 ml (GE Healthcare, Alemania) conectada a un sistema FPLC Purifier Ákta (GE Healthcare, Alemania). Todo el ciclo se vigiló a una absorbancia óptica de 280, 254 y 210 nm. El análisis se realizó mediante la integración de picos de la señal de 280 nm registrada en la hoja de evaluación de ejecución del software Ákta Unicorn. El comportamiento de elución se evaluó comparando el área y la velocidad de aumento y disminución de la señal de la proteína, lo que indica la fuerza de interacción de la fusión de albúmina BiTE con la matriz.

Las construcciones de anticuerpos tuvieron un buen comportamiento de elución, que fue en su mayor parte rápido y completo; véase la Tabla 12.

Tabla 12:La hidrofobia superficial de construcciones de anticuerpos biespecíficas

Ejemplo 9

Conversión de monómero a dímero después de (i) tres ciclos de congelación/descongelación y (ii) 7 días de incubación a 250 gg/ml

La construcción monomérica de anticuerpo MSLNxCD3 biespecífico se sometió a diferentes condiciones de estrés seguidas de SEC de alto rendimiento para determinar el porcentaje de construcción de anticuerpo inicialmente monomérico, que se había convertido en una construcción de anticuerpo dimérico.

(i) Se ajustaron 25 gg de la construcción de anticuerpo monomérico a una concentración de 250 gg/ml con tampón de formulación genérico y luego se congelaron a -80°C durante 30 min seguido de descongelación durante 30 min a temperatura ambiente. Después de tres ciclos de congelación/descongelación, se determinó el contenido de dímero mediante HP-SEC.

(ii) Se ajustaron 25 gg de construcción de anticuerpo monomérico a una concentración de 250 gg/ml con tampón de formulación genérico seguido de incubación a 37°C durante 7 días. El contenido de dímero se determinó mediante HP-SEC.

Se conectó una columna SEC TSK Gel G3000 SWXL de alta resolución (Tosoh, Tokio-Japón) a un Purificador Ákta 10 FPLC (GE Lifesciences) equipado con un muestreador automático A905. El equilibrio de la columna y el tampón de desarrollo consistieron en KH2PO4 100 mM - Na2SO4 200 mM ajustado a pH 6,6. Se aplicó la solución de anticuerpo (25 gg de proteína) a la columna equilibrada y se llevó a cabo la elución a un caudal de 0,75 ml/min a una presión máxima de 7 Mpa. Todo el ciclo se vigiló a una absorbancia óptica de 280, 254 y 210 nm. El análisis se realizó mediante la integración de picos de la señal de 210 nm registrada en la hoja de evaluación de ejecución del software Ákta Unicorn. El contenido de dímero se calculó dividiendo el área del pico de dímero por el área total del pico de monómero más pico de dímero.

Los resultados se muestran en la Tabla 13 que figura más adelante. Las construcciones de anticuerpos biespecíficos MSLNxCD3 de la invención se presentaron con porcentajes de dímero del 0,0% después de tres ciclos de congelación/descongelación, y con porcentajes de dímero de < 2,2% después de 7 días de incubación a 37°C.

Tabla 13:Porcentaje de construcciones de anticuerpos biespecíficos MSLNxCD3 monoméricos frente a diméricos se ún se determina mediante cromato rafía de exclusión por tamaño de alto rendimiento HP-SEC .

Ejemplo 10

Termoestabilidad

La temperatura de agregación de anticuerpos se determinó como sigue: 40 pl de solución de construcción de anticuerpos a 250 μg/ml se transfirieron a una cubeta de un solo uso y se colocaron en un dispositivo Wyatt Dynamic Light Scattering DynaPro Nanostar (Wyatt). La muestra se calentó de 40 °C a 70 °C a una tasa de calentamiento de 0,5 °C/min con adquisición constante del radio medido. El aumento del radio que indica la fusión de la proteína y la agregación se utilizó por el paquete de software suministrado con el dispositivo DLS para calcular la temperatura de agregación de la construcción de anticuerpos.

Todas las construcciones de anticuerpos biespecíficas MSLNxCD3 analizadas de la invención mostraron estabilidad térmica, con temperaturas de agregación >49°C, como se muestra en la Tabla 14 a continuación. El grupo de construcciones de anticuerpos que se unen al grupo de epítopos 2+3 tuvo incluso una estabilidad térmica de >51° y hasta más de 56°C.

Tabla 14:Termoestabilidad de las construcciones de anticuerpos biespecíficos según se determina por DLS dispersión dinámica de la luz

Ejemplo 11

Turbidez a una concentración de anticuerpo de 2500 μg/ml

1 ml de solución de construcción de anticuerpo purificada de una concentración de 250 μg/ml se concentró mediante unidades de concentración por centrifugación a 2500 μg/ml. Después de 16 h de almacenamiento a 5°C, se determinó la turbidez de la solución de anticuerpo mediante medición de la absorción óptica a DO340 nm frente al tampón de formulación genérico.

Los resultados se muestran en la Tabla 15 que figura más adelante. Todas las construcciones de anticuerpos ensayadas tienen una turbidez muy favorable de < 0,09.

Tabla 15:Turbidez de las construcciones de anticuerpos después de la concentración a 2,5 m /ml durante la noche

Ejemplo 12: BiTE® indujo la expresión de CD69 en células T en ausencia de células diana

Se cultivaron PBMC aisladas de donantes humanos sanos con construcciones de anticuerpos biespecíficas CDH19/CD3 o MSLN/CD3 HLE crecientes durante 48 h. La expresión del marcador de activación CD69 en células T se determinó mediante inmunotinción y citometría de flujo y mAb conjugado específico del antígeno.

La activación de las células T independiente de la diana en términos de aumento de CD69 se observó para todas las construcciones anti-CDH 19, pero fue más pronunciada para las moléculas heteroFc y de cuerpo cruzado. El aumento de CD69 por antiCDH19-scFc se produjo a concentraciones más altas, y la amplitud fue en parte menor en comparación con las otras dos construcciones basadas en Fc.

Para el anti-MSLN, casi no se observó activación de células T independiente de la diana para la molécula que contiene scFc, mientras que la construcción de heteroFc indujo un fuerte aumento de CD69 en las células T de la superficie celular en ausencia de células diana.

La activación de células T independiente de la diana inducida por construcciones BiTE® que contienen una fusión de Fc monocatenario o hetero-Fc en el extremo C se evaluó para las siguientes construcciones:

Construcciones BiTE® (diluciones en serie: 0,1 pM - 2 pM)

a. scFc MSLN; 1,14 mg/ml;

b. HeteroFc MSLN; 1,02 mg/

Células efectoras PBMC humanas (3 donantes; #065, #823, #836 (scFc) #401, #415, #433 (heteroFc); #590, #595, 598, #605 (Xcuerpo)).

Tiempo de incubación de 48 h.

Determinación de la expresión de CD69 en células T CD4+ y CD8+ con citómetro de flujo y mAb conjugados específicos del antígeno. Resultados, véase la Figura 15.

La activación de células T independiente de la diana inducida por construcciones de anticuerpos BiTE® que contienen una fusión de Fc monocatenario, de hetero-Fc, o de cuerpo cruzado en el extremo C se evaluó para las siguientes construcciones:

Construcciones BiTE® (diluciones en serie: 0,1 pM - 2 pM)

C. scFc CDH19; 245,3 μg/ml (

d. HeteroFc CDH-19; 1 mg/ml

e. Xcuerpo CDH19; 6,3 mg/ml

Células efectoras PBMC humanas (3 a 4 donantes; #386, #392, #401 (scFc) #282, #284, #287 (heteroFc)).

Tiempo de incubación de 48 h.

Determinación de la expresión de CD69 en células T CD4+ y CD8+ con citómetro de flujo y mAb conjugados específicos del antígeno. Resultados, véase la Figura 16.

Ejemplo 13:

Las construcciones de anticuerpo BiTE® purificadas se revistieron sobre una placa Maxisorb en concentración decreciente (100 nM, diluciones 1:4). Después de lavar 3 veces con PBS-T y bloquear con PBS/BSA al 3% (p/v) (60 min, 37°C), plasma humano combinado se incubó durante 60 min, 80 rpm a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces, se añadió un anticuerpo monoclonal de ratón específico para la subunidad A de C1q humana (CC1q) (Thermo MA1-83963, 1:500) durante 60 min, 80 rpm, temperatura ambiente; después de las etapas de lavado descritas, se incubó un mAb de cabra anti Fc de ratón-POX (1:5.000) durante 60 min, 80 rpm, temperatura ambiente. Después de un lavado adicional, el sustrato de TMB se incubó y se detuvo tras la reacción colorimétrica mediante la adición de H<2>SO<4>. La absorción se determinó a 450 nm.

Resultado: Como se muestra en la figura 17 a altas concentraciones, la construcción BiTE® de hetero Fc (cuadrados) mostró mayores señales de unión para CC1q humano en comparación con una construcción BiTE® de Fc monocatenario (triángulo). Como control negativo, se usó un BiTE® canónico (círculo), que no mostró unión significativa a CC1q.

Ejemplo 14: Farmacocinética de construcciones de anticuerpos BiTE ® fusionadas a proteínas Fc monocatenario (scFc) y hetero-Fc (hetFc)

Se fusionaron diversos anticuerpos BiTE® de unión a la diana con dos restos diferentes que prolongan la vida media. Las dos variantes HLE diferentes por anticuerpo BiTE®, denominadas posteriormente BiTE®-scFc y BiTE®-hetFc, se ensayaron en el mono cinomolgo en el contexto de estudios farmacocinéticos (PK). La nomenclatura correspondiente de estas moléculas se resume brevemente en la Tabla 16 a continuación.

Tabla 16 Nomenclatura de compuestos de nueve construcciones de anticuerpos BiTE® HLE de dosis única

La construcción de anticuerpo BiTE® HLE se administró como bolo intravenoso (compuestos 1b-5b) e infusión intravenosa (compuesto 1a, 30 min) a 6 μg/kg (compuesto 2b), 12 μg/kg (compuestos 2a y 3a-5b) y 15 μg/kg (compuestos 1a y 1b), respectivamente. Para cada uno de los compuestos mencionados anteriormente, se usó un grupo de al menos dos a tres animales. Se recogieron muestras de sangre, y se preparó suero para determinar las concentraciones séricas. Los niveles de las construcciones de anticuerpos BiTE® en suero se midieron usando un inmunoensayo. El ensayo se realiza capturando la BiTE® a través de su resto diana, mientras que para la detección se usó un anticuerpo dirigido contra la parte de la construcción que se une a CD3. Los perfiles de concentración séricatiempo se utilizaron para determinar los parámetros PK. Los puntos de tiempo de muestreo de sangre se enumeran en la Tabla 17 a continuación.

Tabla 17 Puntos de tiempo de muestreo de san re durante el estudio farmacocinético

La farmacocinética de cuatro pares de construcciones de anticuerpos BiTE®-HLE se muestran a modo de ejemplo en la Figura 18. Cada par representa la misma proteína BiTE® fusionada a una extensión scFc- o hetFc. Para todas las proteínas, los niveles séricos fueron cuantificables para todos los puntos temporales en todos los animales después de la administración de BiTE®-HLE. Los perfiles farmacocinéticos describen una disminución exponencial bifásica después de cada una de las administraciones de un solo elemento de ensayo.

Los parámetros farmacocinéticos se determinaron utilizando métodos estándares de análisis no compartimental (NCA). Mediante análisis no compartimental, se estimaron los siguientes parámetros farmacocinéticos: AUCinf (Área bajo la curva de concentración sérica-tiempo), Vss (volumen de distribución en estado estacionario), CL (aclaramiento sistémico), y t1/2 terminal (vida media terminal).

El parámetro farmacocinético para cada compuesto ensayado se resume como media de n=2 y n=3, respectivamente, en la Tabla 18 a continuación.

Tabla 18 Parámetro farmacocinético de variantes de scFc y heteroFc de diferentes aglutinantes diana de BiTE® en monos cinomol os.

En general, el AUCinf para los diferentes pares de aglutinantes diana de BiTE®-HLE fusionados con los restos -scFc y -hetFc, respectivamente, osciló entre 3293 h*ng/ml y 24769 h*ng/ml, dependiendo del contexto diana de BiTE®. Todas las fusiones HLE analizadas alcanzaron valores de aclaramiento sistémico de 0,48 a 3,6 ml/h/kg. Los volúmenes de distribución correspondientes oscilaron entre 78 y 261 ml/kg.

Ejemplo 15:

Las sustancias farmacéuticas preformuladas que contenían MSLN-HALB, MSLN-hFc y MSLN-scFc purificadas, respectivamente, se intercambiaron con amortiguador mediante ultrafiltración/diafiltración usando membranas con un corte de peso molecular (MWCO) de 10 kDa. La formulación final se logró añadiendo disoluciones madre concentradas. Las formulaciones resultantes para cada construcción se enumeran en la Tabla 19, y comprenden K60RTrT compuesto de fosfato potásico 20 mM, hidrocloruro de L-arginina 150 mM, dihidrato de trehalosa al 6% (p/V), polisorbato 80 al 0,01% (p/V) a pH 6,0, y G40MSuT compuesto por glutamato 10 mM, manitol al 4% (p/V), sacarosa al 2% (p/V), polisorbato 80 al 0,01% (p/V) a pH 4,0. La concentración de proteína diana fue 1,0 mg/ml. Las construcciones de MSLN formuladas se llenaron hasta 1 ml en viales de vidrio tipo I que se taparon con tapones de caucho de butilo y se engastaron con sellos de aluminio. Los viales llenos se incubaron a -20, 5, 25 y 37°C. Un vial de cada versión se sometió a cinco ciclos de congelación y descongelación (F/T). La temperatura de congelación diana fue -29°C. La temperatura de descongelación diana fue 2°C. La velocidad de rampa fue aproximadamente 0,3 K/min.

Las partículas visuales se evaluaron de acuerdo con el método descrito en Ph Eur 2.9.20 por operadores capacitados. Los recuentos visuales de partículas por vial se muestran en la Tabla 7. El número de partículas proteicas visuales (mayores de 125 pm) fue mayor para MSLN-hFc en comparación tanto con MSLN-hALB como con MSLN-scFc.

Tabla 19: Número de partículas proteicas visuales por vial para muestras estresadas y no estresadas (T0) que contienen diferentes construcciones BiTE® anti-mesotelina (MSLN) de vida media prolongada. K60RTrT indica una formulación que contiene fosfato potásico 20 mM, hidrocloruro de L-arginina 150 mM, dihidrato de trehalosa al 6% (p/V), polisorbato 80 al 0,01% (p/V), pH 6,0. G40MSuT indica una formulación que contiene lutamato 10 mM, manitol al 4% p/V , sacarosa al 2% p/V , polisorbato 80 al 0,01% p/V , pH 4,0.

Las muestras descritas anteriormente también se analizaron mediante cromatografía de ultra alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-UPLC) para cuantificar el contenido porcentual de especies de alto peso molecular (HMWS). SE-UPLC se realizó en un sistema UPLC AcquityH-Class (Waters) usando una columna Acquity UPLC BEH200 SeC de 150 mm (Waters). La temperatura de la columna se estableció a 25 °C. La separación de variantes de tamaño se logró aplicando un método isocrático con un caudal de 0,4 ml/min. La fase móvil estaba compuesta de fosfato de sodio 100 mM, NaCl 250 mM a pH 6,8. El tiempo de ejecución asciende a 6,0 minutos. Las muestras se mantuvieron a 8 °C dentro del inyector automático hasta el análisis. Se inyectó una cantidad total de 3 μg de proteína. Para evitar el arrastre, se llevó a cabo una inyección intermedia con acetonitrilo al 40% después de cada muestra. La detección se basó en la emisión de fluorescencia (excitación a 280 nm, emisión a 325 nm). La integración del pico se realizó usando el software Empower®. Se informó el área relativa bajo la curva de HMWS (Tabla 20).

Las construcciones basadas en Fc exhibieron contenidos de HMWS más bajos en la variante de formulación G40MSuT que en K60RTrT, independientemente de la condición de estrés. Se hizo evidente que MSLN-scFc contenía menos HMWS que MSLN-hFc tanto en las preparaciones G40MSuT como en las preparaciones K60RTrT. MSLN-scFc, en su formulación preferida (G40MSuT), fue menos propensa a la formación de HMWS que MSLN-hALB formulada en K60RTrT. En experimentos anteriores, este amortiguador mostró un potencial estabilizador mejorado para construcciones basadas en hALB en comparación con formulaciones con valores de pH más ácidos.

Tabla 20: Resumen del contenido de HMWS en preparaciones MSLN-HALB, -hFc y -scFc estresadas y no estresadas T0 determinadas mediante SE-UPLC

La abundancia de modificaciones químicas tras el estrés por calor (incubación a 37°C) se monitorizó mediante mapeo de péptidos. Las muestras de proteínas se digirieron enzimáticamente, y los péptidos resultantes se separaron mediante cromatografía de fase reversa. El eluato de la columna se inyectó directamente en la fuente de iones de un espectrómetro de masas, para la identificación y cuantificación de los péptidos.

Para lograr la máxima cobertura, se realizaron dos digestiones enzimáticas distintas: una con tripsina y otra con quimotripsina. En cada caso, las proteínas se desnaturalizaron con cloruro de guanidino, y después se redujeron con ditiotreitol (DTT). Después de la incubación en DTT, los restos de cisteína libres se alquilaron mediante adición de ácido yodoacético. Después, las muestras se intercambiaron de amortiguador en Tris 50 mM, pH 7,8, para la digestión. Se añadieron tripsina y quimotripsina a tubos de reacción distintos, en una relación de 1:10 (muestra:enzima) cada uno. Las muestras se digirieron durante 30 min a 37°C, y la reacción se detuvo añadiendo ácido trifluoroacético.

Se inyectó por separado una carga de 5 μg de cada digestión en una columna de fase reversa Zorbax SB-C18 (Agilent n° 859700-902) equilibrada en ácido fórmico (FA) al 0,1% (V/V). Se usó un gradiente de 156 minutos de hasta un 90% de acetonitrilo que contenía un 0,1% de FA, para eluir los péptidos directamente en la fuente de iones de electropulverización de un espectrómetro de masas Q-Exactive Plus (Thermo Scientific). Los datos se recopilaron en modo dependiente de los datos usando un método de los 12 mejores en el que un barrido completo (resolución 70 000; rango de barrido 200-2000 m/z) fue seguido de una disociación por colisión de alta energía (HCD) de los 12 iones más abundantes (resolución 17500).

Los péptidos se identificaron basándose en masas precisas y espectros de masas en tándem usando un software propio. Las identificaciones se verificaron manualmente. Las cantidades relativas de péptidos modificados y no modificados se calcularon en función de la abundancia de iones usando el software Pinpoint (Thermo Scientific).

Los porcentajes de modificaciones químicas de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y de la porción que prolonga la vida media (ya sea hALB o Fc) detectados en preparaciones de MSLN-HALB, -hFc y -scFc se dan en la Tabla 21. Al comparar condiciones de formulación similares, resultó obvio que, en general, las modificaciones químicas fueron menos abundantes en las construcciones de scFc.

Tabla 21: Resumen de las modificaciones químicas en preparaciones de MSLN-hALB, -hFc y -scFc estresadas n r T rmin m i n m i

Ejemplo 16:

MSLN-HALB, -hFc, -scFc, formuladas como se describe en el Ejemplo 15, se sometieron a un experimento de salto de pH. La concentración de los materiales de partida fue 1,0 mg/ml. Se llenó un vial de vidrio con un volumen de 0,38 ml de cada material de partida. Después de un preacondicionamiento a 37°C, las disoluciones se enriqueceron con disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) 20 veces, que estaba compuesta por fosfato de potasio 0,090 M, fosfato de sodio 0,480 M (ambos dibásicos), cloruro de potasio 0,052 M y NaCl 2,76 M. Las muestras enriquecidas se incubaron a 37°C durante dos semanas. Después de la incubación, se analizaron mediante SE-UPLC usando el método descrito en el Ejemplo 15, y se dio a conocer el contenido porcentual de HMWS (Tabla 22). Al comparar todas las construcciones formuladas en K60RTrT, el contenido de HMWS aumentó en el siguiente orden: hALB < scFc < hFc. MSLN-scFc también mostró un contenido de HMWS más bajo que MSLN-hFc cuando se formuló en G40MSuT.

Tabla 22: Resumen del contenido de HMWS en preparaciones de MSLN-HALB, -hFc y -scFc estresadas (salto de pH 2 semanas a 37°C determinado mediante Se -UPLC

%HMWS

2 semanas 37°C 1,5 8,3 7,1 5,4 5,1

Ejemplo 17:

MSLN-HALB, -hFc y -scFc, formuladas como se describe en el Ejemplo 15, se sometieron a estrés de agitación. La concentración de los materiales de partida fue 1,0 mg/ml. Se filtró un volumen de 0,5 ml de cada disolución a través de un filtro apropiado de 0,22 pm, y se introdujo en viales de vidrio de 3 cc. Los viales se colocaron en una caja de plástico, asegurándose de que no se desplazaran dentro de la caja durante la agitación. La caja se colocó en un agitador orbital. Las muestras se agitaron a 500 rpm durante 65 horas. Las partículas visuales se evaluaron de acuerdo con el método descrito en Ph Eur 2.9.20. El método se llevó a cabo por operadores capacitados. Los recuentos visuales de partículas por vial se muestran en la Tabla 23. Sólo se observaron partículas proteicas visibles en las preparaciones de MSLN-hFc.

T l 2 : N m r r í l r i vi l r vi l n m r i

Número de partículas proteicas visibles (>125 pm) por vial

Las muestras anteriores también se analizaron mediante cromatografía de ultra alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-UPLC) para cuantificar el contenido porcentual de especies de alto peso molecular (HMWS). Se aplicó el mismo método como se describe en el Ejemplo 15. Los contenidos de HMWS de las muestras agitadas se describen en la Tabla 24. La formación de HMWS fue más pronunciada en MSLN-hFc al comparar las preparaciones de K60RTrT. Para construcciones basadas en Fc, los contenidos de HMWS podrían reducirse disminuyendo el pH de la formulación (G40MSuT). Pero nuevamente, los HMWS fueron más abundantes en MSLN-hFc que en MLSN-scFc.

Tabla 24: Resumen del contenido de HMWS en preparaciones de MSLN-HALB, -hFc y -scFc estresadas (salto de pH 2 semanas a 37°C determinado mediante Se -UPLC

%HMWS

65h, 500rpm 1,8 5,8 2,4 1,8 0,3

Ejemplo 17:

MSLN-HALB, -hFc y -scFc, formuladas como se describe en el Ejemplo 15, se expusieron a luz visible y UVA (fotoestrés). La concentración de proteínas ascendió a 1 mg/ml en todas las preparaciones. Las disoluciones de proteínas se filtraron a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 pm, y se introdujeron hasta 0,5 ml en viales de vidrio tipo I. MSLN-hALB y -scFc se sometieron a dos ensayos diferentes que incluían 0,2 MLux de luz visible/25 W*h/m2 de luz UVA y 1,2 MLux de luz visible/173 W*h/m2, respectivamente. MSLN-hFc se sometió a dos ensayos diferentes que incluían 0,2 MLux de luz visible sin luz UVA y 1,2 MLux de luz visible/30 W*h/m2 de luz u Va , respectivamente. Las temperaturas de la cámara se ajustaron a 25°C. Después de la exposición a la luz, las muestras se analizaron mediante inspección visible (Tabla 25), SE-UPLC (Tabla 26), y mapa de péptidos (Tabla 27). Los métodos mencionados anteriormente se realizaron según los procedimientos descritos en el Ejemplo 15. Aunque MSLN-HALB y -scFc se expusieron a dosis más altas de luz UVA, no se observaron partículas proteicas visibles, mientras que las muestras de MSLN-hFc exhibieron una partícula proteica visible por vial para ambos ensayos, independientemente de la formulación.

Tabla 25: Resumen del número de partículas proteicas visibles por vial en preparaciones de MSLN-hALB, -hFc -scFc determinadas des ués de la ex osición a la luz

HMWS aumentó en el siguiente orden MSLN-hALB < -scFc < -hFc cuando la proteína se formuló en K60RTrT. La HMWS podría reducirse para construcciones basadas en Fc cuando se formula en G40MSuT. Sin embargo, las HMWS volvieron a ser menos pronunciadas para MSLN-scFc. MSLN-hFc reveló ser especialmente sensible a la exposición a la luz UVA.

Tabla 26: Resumen del contenido de HMWS en preparaciones de MSLN-HALB, -hFc y -scFc determinado después de la exposición a la luz mediante SE-UPLC

Los porcentajes de modificaciones químicas de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y de la porción que prolonga la vida media (ya sea hALB o Fc) detectados en preparaciones de MSLN-HALB, -hFc y -scFc se dan en la Tabla 27. Al comparar condiciones de formulación similares, resultó obvio que, en general, las modificaciones químicas fueron menos abundantes en las construcciones de scFc.

Tabla 27: Resumen de las modificaciones químicas en preparaciones de MSLN-HALB, -hFc y -scFc rmin l x i i n l l z m i n m i

na = no aplicable; n.t. = no ensayado

Ejemplo 18:

Se formuló MSLN-hALB en K60RTrT y se formuló MSLN-scFc en G40MSuT según el procedimiento descrito en el Ejemplo 15. Las concentraciones de proteínas ascendieron a 0,05 mg/ml. Recipientes de ensayo de vidrio (vial de borosilicato, tipo I, 13 mm, 3 cc, de West, Art. No. 68000375) y polipropileno (2 ml con junta tórica, por ejemplo de Sarstedt, Art. No. 72.694.005) se llenan con 500 pl del disolución de ensayo. La disolución de ensayo se dejó durante cinco minutos en el primer recipiente de ensayo. Después se tomó una muestra de una alícuota de 150 pl para análisis. La disolución de ensayo restante (350 pl) se transfirió secuencialmente desde un recipiente de ensayo al siguiente (cinco recipientes en total). En cada vial, la disolución se dejó durante cinco minutos antes de la siguiente transferencia. Se usó la misma punta de pipeta para cada etapa de transferencia. Se realizó el mismo ensayo usando frascos de policarbonato de 30 ml (Nalgene, PCS-000295 con cierre, PP/20-415/ZTPE). Para este tipo de recipiente, el primer recipiente se llenó con 5 ml. Después de tomar una muestra de una alícuota de 150 pl, el volumen residual se transfirió desde un recipiente de ensayo al siguiente (de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente). Las muestras extraídas de los recipientes n° 1 y n° 5 se analizaron mediante SE-UPLC (método como se describe en el Ejemplo 15). Además, la detección de proteínas se llevó a cabo con un detector PDA (280 nm), para determinar las concentraciones de proteínas. La recuperación porcentual de proteínas de cada recipiente de ensayo se proporciona en la Tabla 28. Se demostró que la recuperación de proteínas fue más pronunciada para MSLN-scFc que para MSLN-hALB, independientemente del tipo de recipiente.

Tabla 28: Recuperación de proteína a partir de diferentes tipos de recipientes para MSLN-HALB y -scFc, determinada mediante SE-UPLC

Ejemplo 19:

Se formuló MSLN-hALB en K60RTrT, y se formuló MSLN-scFc en K60RTrT y G40MSuT según el procedimiento descrito en el Ejemplo 15. La concentración de proteína ascendió a 1,0 mg/ml. Se añadieron 1950 pl de cada disolución de ensayo con 50 pl de una disolución patrón de silicio de 1000 ppm (Specpure de AlfaAesar, Art. No. 38717), dando como resultado un pico de 25 ppm. Una disolución de ensayo sin adición sirvió como muestra de control. La disolución de ensayo enriquecida, así como la muestra de control, se introdujeron en viales de vidrio tipo I de 3 cc, y se incubaron a 37°C durante 24 horas. Todas las muestras se analizaron mediante SE-UPLC según el método descrito en el Ejemplo 15, para cuantificar la cantidad de HMWS (Tabla 29). Cuando se formularon en K60RTrT, MSLN-hALB y -scFc mostraron aumentos similares en HMWS tras la adición de silicio. Para la construcción scFc, se pudo demostrar que este aumento podría reducirse disminuyendo el pH de la formulación a 4,0. Según experimentos preliminares, este enfoque no era factible para MLSN-hALB ya que reveló sufrir fragmentación a valores de pH de formulación de 5,0 e inferiores.

Tabla 29: Descripción general de los contenidos de HMWS en preparaciones de MSLN-HALB y -scFc rmin m i n E- PL ñ ir 2 m ili i

A%HMWS (en comparación con el control sin adición)

adición de 25 ppm 1,0 1,0 0,2

cvi00tí-ib <bh*-'00 CT><d>

��

ı22

��

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a MSLN humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en la que el primer dominio de unión se une a un epítopo de MSLN que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 245;

en la que el primer dominio de unión que se une a MSLN humana comprende una región VH que comprende CDR-H1,<c>D<r>-H2 y CDR-H3 y una región V<l>que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

b) CDR-H1 como se representa en SeQ ID NO: 171, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 172, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 173, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 174, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 175 y CDR-L3 como se representa en S<e>Q ID NO: 176;

c) CDR-H1 como se representa en SeQ ID NO: 181, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 182, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 183, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 184, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 185 y CDR-L3 como se representa en S<e>Q ID NO: 186;

d) CDR-H1 como se representa en S<e>Q ID NO: 191, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 192, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 193, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 194, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 195 y CDR-L3 como se representa en S<e>Q ID NO: 196; y

e) CDR-H1 como se representa en S<e>Q ID NO: 201, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 202, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 203, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 204, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 205 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 206.

2. La construcción de anticuerpo según la reivindicación 1, en la que el segundo dominio de unión se une a CD3 épsilon humano y a CD3 épsilon deCallithrix jacchus, Saguinus OedipusoSaimirí sciureus.

3. La construcción de anticuerpos según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la construcción de anticuerpos está en un formato seleccionado del grupo que consiste en (scFv)<2>, mAb de scFv de dominio único, diacuerpos y oligómeros de esos formatos.

4. La construcción de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, y SEQ ID NO: 207, y/o en la que el primer dominio de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, y SEQ ID NO: 208.

5. La construcción de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH y una región V<l>seleccionadas del grupo que consiste en pares de una región VH y una región Vl como se representa en SEQ ID NO: 167+168, SEQ ID n O: 177+178, SEQ iD NO: 187+188, SEQ ID NO: 197+198 y SEQ ID NO: 207+208.

6. La construcción de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209.

7. Las construcción de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103; y

• opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103;

• opcionalmente un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-9;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104 134; y

• opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLX<1>PANG (SEQ ID NO: 135) mientras que X<1>es Y o H; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) o QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); y

• opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, y SEQ ID NO: 101;

• un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 168, SEQ ID n O: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, y SEQ ID NO: 208, y un resto de serina en el extremo C; • un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 140; y un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, y SEQ ID NO: 207;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99, y SEQ ID NO: 102, y un resto de serina en el extremo C;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 141;

(e) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, y SEQ ID NO: 208;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 142; y

un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 143;

(f) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 144; y

un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 145;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 146; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 147;

(h) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 148; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 149; o

(i) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 150.

8. La construcción de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, en orden N a C-terminal:

• el primer dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, y SEQ ID NO: 209;

• el segundo dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100, y SEQ ID NO: 103 (véase también SEQ ID NO: 23, 25, 41,43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187 del documento WO 2008/119567);

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 6, 8 y 9; y

• el tercer dominio tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 260-267.

9. La construcción de anticuerpo según la reivindicación 8, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 276 a 287

10. Un polinucleótido que codifica una construcción de anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

11. Una célula hospedante transformada o transfectada con el polinucleótido como se define en la reivindicación 10.

12. Una composición farmacéutica que comprende una construcción de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Una construcción de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad de tumor sólido o una enfermedad de cáncer metastásico.

14. Un kit que comprende una construcción de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un polinucleótido como se define en la reivindicación 10, y/o una célula hospedante como se define en la reivindicación 11.