MD3328893T2 - Construcții de anticorpi bispecifici care leagă mezotelina şi CD3 - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă la MSLN uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T. Mai mult, invenţia furnizează o polinucleotidă care codifică constructul de anticorp, un vector care cuprinde respectiva polinucleotidă şi o celulă gazdă transformată sau transfectată cu respectiva polinucleotidă sau vector. De asemenea, invenţia furnizează un procedeu pentru producerea constructului de anticorp conform invenţiei, o utilizare medicală a constructului de anticorp menţionat şi un kit care cuprinde constructul de anticorp menţionat.

Description

Prezenta invenţie se referă la un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, aşa cum este definit în revendicări. Mai mult, invenţia furnizează o polinucleotidă care codifică constructul de anticorp şi o celulă gazdă transformată sau transfectată cu respectiva polinucleotidă, aşa cum este definită în revendicări. Mai mult, invenţia furnizează o compoziţie farmaceutică care cuprinde constructul de anticorp conform invenţiei, o utilizare medicală a constructului de anticorp menţionat şi un kit care cuprinde constructul de anticorp menţionat, aşa cum este definit în revendicări.

INTRODUCERE:

Mezotelina este o proteină de suprafaţă celulară care a fost descoperită iniţial ca un antigen recunoscut de K1, un anticorp monoclonal derivat prin imunizarea şoarecilor cu linia celulară de cancer ovarian uman OVCAR-3 (Chang şi colab., Int. J. Cancer 1992). Clonarea exprimării a fost utilizată pentru a identifica ADNc-ul mezotelinei dintr-o bibliotecă HeLa (Chang şi colab., PNAS 1996). Analiza moleculară a demonstrat că gena mezotelinei este codificată într-o proteină precursoare de 69 kD, care este scindată de furină pentru a furniza două proteine distincte: factorul de potenţare a megacariocitelor (MPF), o proteină de 31 kD care este eliminată şi mezotelina, o proteină de 40 kD care se asociază cu membrana celulară printr-o legătură glicofosfatidilinozitol (ancoră GPI) (Chang şi colab., PNAS 1996). Proteina mezotelină este organizată în domenii superelicoidale, cu repetări de tip ARM.

Mezotelina este foarte exprimată în cancerul ovarian, precum şi în alte tipuri de tumori, inclusiv cancerul pancreatic, mezoteliomul, cancerul pulmonar, cancerul gastric şi cancerul de sân triplu negativ. În ţesuturile normale, mezotelina este exprimată în principal în stratul de celule mezoteliale din cavităţile pleurale, pericardice şi peritoneale. Mezotelina este exprimată şi pe epiteliul de suprafaţă al ovarului normal, trompei uterine şi amigdalei.

Pe lângă exprimarea sa pe suprafaţa celulară, mezotelina este, de asemenea, eliminată în ser prin acţiunea ADAM17/TACE. Nivelurile serice de mezotelină eliminată sunt crescute la pacienţii cu cancer ovarian şi alte tipuri de cancer. MESOMARK®, un test ELISA pentru mezotelina serică eliminată, este aprobat de FDA pentru uz uman şi poate ajuta la diagnosticarea sau monitorizarea mezoteliomului. Mezotelina eliminată a fost, de asemenea, utilizată, singură, sau împreună cu alţi markeri, pentru a ajuta la diagnosticarea sau prognosticul altor tipuri de cancer.

Corelaţia nivelurilor serice de mezotelină eliminată cu boala a sugerat un rol potenţial al proteinei mezotelină în progresia cancerului. În timp ce funcţia biologică a mezotelinei nu este bine înţeleasă - şoarecii knockout par normali - s-a demonstrat că mezotelina leagă mucina MUC16/CA-125. S-a sugerat că interacţiunea mezotelină-CA-125 funcţionează în adeziunea, invazia şi metastaza celulară.

Primii anticorpi generaţi împotriva mezotelinei pentru intervenţie terapeutică au fost proiectaţi să interfereze cu interacţiunea dintre mezotelină şi CA-125. Expunerea pe fagi a identificat Fv SS, care a fost optimizat cu privire la afinitate şi utilizat pentru a genera o imunotoxină recombinantă care vizează mezotelina, SS1P. Anticorpul MORAb-009 amatuximab, care foloseşte şi SS1, recunoaşte un epitop neliniar în cei 64 de aminoacizi amino terminali ai mezotelinei. SS1 Fv a fost, de asemenea, utilizat pentru a genera celule T create de receptorul antigen himeric. Anticorpii anti-mezotelină au fost, de asemenea, utilizaţi pentru a genera conjugate de medicamente, cum ar fi Anetumab ravtansine, care conţine anticorpul MF-T cuplat la DM4 şi anticorpul 7D9 conjugat la monometil auristatina E. Aceşti anticorpi anti-mezotelină recunosc, de asemenea, regiunea amino terminală a proteinei (aminoacizi 296-390) deşi nu concurează cu. Aceste terapii ţintite anti-mezotelină care se află în prezent în studii clinice au demonstrat o eficacitate limitată ca agenţi unici.

WO2014/004549 dezvăluie constructe bispecifice care leagă mezotelina şi CD3. WO2010/124797 dezvăluie imunoconjugate anti-mezotelină bazate pe un anticorp anti-mezotelină pentru tratamentul cancerului pancreatic care exprimă mezotelină.

Foarte recent, au fost raportaţi noi anticorpi anti-mezotelină care recunosc alte regiuni ale proteinei mezotelină. Rămâne încă o nevoie de a înţelege dacă anticorpii împotriva diferiţilor epitopi ai mezotelinei decât SS1/MORAb-009 (de exemplu, anticorpii care nu sunt concuraţi de mezotelină eliminată sau CA-125 eliminat) ar fi îmbunătăţit eficacitatea la pacienţi.

Deoarece există încă o nevoie de a avea la dispoziţie opţiuni suplimentare pentru tratamentul bolilor cu tumori solide legate de supraexprimarea MSLN, cum ar fi cancerul ovarian, cancerul pancreatic, mezoteliomul, cancerul pulmonar, cancerul gastric şi cancerul de sân triplu negativ, prin prezenta sunt oferite mijloace şi metode pentru rezolvarea acestei probleme sub forma unui construct de anticorp bispecific având un domeniu de legare direcţionat către MSLN pe suprafaţa celulelor ţintă tumorale şi un al doilea domeniu de legare direcţionat către CD3 pe suprafaţa celulelor T.

Astfel, într-un prim aspect, prezenta invenţie furnizează un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă la un epitop al MSLN care este cuprins în regiunea descrisă în SECV ID NR: 245;

în care primul domeniu de legare care leagă MSLN umană cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din:

a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 161, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 162, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 163, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 164, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 165 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 166;

b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 171, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 172, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 173, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 174, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 175 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 176;

c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 181, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 182, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 183, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 184, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 185 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 186;

d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 191, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 192, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 193, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 194, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 195 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 196; şi

e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 201, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 202, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 203, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 204, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 205 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 206.

De asemenea, este dezvăluit un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă la un epitop al MSLN care este cuprins în variantele MSLN descrise în SECV ID NR: 231, 232 şi 233 şi se leagă în plus la MSLN Macaca fascicularis aşa cum este descris în SECV ID NR: 234.

Trebuie remarcat faptul că, aşa cum sunt utilizate aici, formele de singular "un", "unul" şi "acela" includ referinţe la plural, cu excepţia cazului în care contextul indică în mod clar altfel. Astfel, de exemplu, referinţa la "un reactiv» include unul sau mai mulţi dintre aceşti reactivi diferiţi, şi referinţa la "metodă" include referinţa la etape echivalente şi metode cunoscute celor cu calificare obişnuită în domeniu care ar putea fi modificate sau substituite pentru metodele descrise aici.

Dacă nu se indică altfel, termenul "cel puţin" care precede o serie de elemente trebuie înţeles a se referi la fiecare element din serie. Persoanele cu calificare în domeniu vor recunoaşte sau vor putea constata folosind nu mai mult decât experimentarea de rutină, multe echivalenţe la exemplele de realizare specifice ale invenţiei descrise aici. Astfel de echivalenţe sunt intenţionate să fie cuprinse de prezenta invenţie.

Termenul "şi/sau» oriunde este utilizat aici include semnificaţia "şi", "sau" şi "toate sau orice altă combinaţie a elementelor legate de termenul menţionat".

Termenul "aproximativ" sau "circa» aşa cum este utilizat aici înseamnă în intervalul ±20%, preferabil în intervalul ±15%, mai preferabil în intervalul ±10%, şi cel mai preferabil în intervalul ±5% dintr-o valoare sau interval dat.

Pe parcursul acestei specificaţii şi al revendicărilor care urmează, cu excepţia cazului în care contextul cere altfel, cuvântul "a cuprinde", şi variaţii, cum ar fi "cuprinde" şi "cuprinzând", vor fi înţelese ca implicând includerea unui număr întreg declarat sau a unei trepte sau a unui grup de numere întregi sau trepte, dar nu excluderea oricărui alt număr întreg sau treaptă sau grup de numere întregi sau treaptă. Când este utilizat aici, termenul "cuprinzând" poate fi substituit cu termenul "conţinând" sau "incluzând" sau uneori când este utilizat aici cu termenul "având".

Când este utilizat aici, "constând din" exclude orice element, etapă sau ingredient nespecificat în elementul revendicării. Atunci când este utilizat aici, "constând în esenţă din» nu exclude materialele sau etapele care nu afectează material caracteristicile de bază şi noi ale revendicării.

În fiecare caz de aici, oricare dintre termenii "cuprinzând", "constând în esenţă din" şi "constând din" poate fi înlocuit cu oricare dintre ceilalţi doi termeni.

Termenul "construct de anticorp" se referă la o moleculă în care structura şi/sau funcţia se bazează pe structura şi/sau funcţia unui anticorp, de ex., a unei molecule de imunoglobulină cu lungime completă sau întreagă. Un construct de anticorp este, prin urmare, capabil să se lege de ţinta sau antigenul său specific. Mai mult, un construct de anticorp conform invenţiei cuprinde cerinţele structurale minime ale unui anticorp care permit legarea ţintei. Această cerinţă minimă este definită de prezenţa a cel puţin celor trei CDR-uri de lanţ uşor (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 din regiunea VL) şi a celor trei CDR-uri de lanţ greu (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 din regiunea VH), adică a tuturor şase CDR-uri. Anticorpii pe care se bazează constructele conform invenţiei includ, de exemplu, anticorpi monoclonali, recombinanţi, himerici, dezimunizaţi, umanizaţi şi umani.

În definiţia "constructelor de anticorpi" conform invenţiei sunt cuprinşi anticorpi de lungime completă sau întregi incluzând, de asemenea, anticorpi de camelide şi alţi anticorpi de imunoglobuline generaţi prin metode sau procese biotehnologice sau de inginerie proteică. Aceşti anticorpi de lungime completă pot fi, de exemplu, anticorpi monoclonali, recombinanţi, himerici, dezimunizaţi, umanizaţi şi umani. De asemenea, în definiţia "constructelor de anticorpi» sunt incluse fragmente de anticorpi de lungime completă, cum ar fi VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 sau "r IgG" ("jumătate de anticorp"). Constructele de anticorpi conform invenţiei pot fi, de asemenea, fragmente modificate de anticorpi, numite şi variante de anticorpi, cum ar fi scFv, di-scFv sau bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-fermoar, scFab, Fab2, Fab3, diacorpi, diacorpi cu lanţ unic, diacorpi tandem (Tandab), di-scFv tandem, tri-scFv tandem, "minicorpi» exemplificaţi printr-o structură care este după cum urmează: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 + CH3), ((scFv)2-CH3) sau (scFv-CH3-scFv)2, multicorpi cum ar fi triacorpi sau tetracorpi şi anticorpi cu un singur domeniu, cum ar fi nanocorpi sau anticorpi cu un singur domeniu variabil care cuprind doar un domeniu variabil, care ar putea fi VHH, VH sau VL, care leagă în mod specific un antigen sau epitop independent de alte regiuni sau domenii V.

Un domeniu de legare poate cuprinde în mod tipic o regiune variabilă a lanţului uşor de anticorp (VL) şi o regiune variabilă a lanţului greu de anticorp (VH); cu toate acestea, nu trebuie să le cuprindă pe amândouă. Fragmentele Fd, de exemplu, au două regiuni VH şi adesea păstrează o anumită funcţie de legare la antigen a domeniului intact de legare la antigen. Exemple suplimentare pentru formatul fragmentelor de anticorpi, variantelor de anticorpi sau domeniilor de legare includ (1) un fragment Fab, un fragment monovalent având domeniile VL, VH, CL şi CH1; (2) un fragment F(ab')2, un fragment bivalent având două fragmente Fab legate printr-o punte disulfurică în regiunea balama; (3) un fragment Fd având cele două domenii VH şi CH1; (4) un fragment Fv având domeniile VL şi VH ale unui singur braţ al unui anticorp, (5) un fragment dAb (Ward şi colab., (1989) Nature 341:544-546), care are un domeniu VH; (6) o regiune de determinare a complementarităţii (CDR) izolată şi (7) un singur lanţ Fv (scFv), acesta din urmă fiind preferat (de exemplu, derivat dintr-o bibliotecă scFV). Exemple de exemple de realizare a constructelor de anticorpi conform invenţiei sunt descrise, de ex., în WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, W O2014/144722, WO 2014/151910, şi WO 2015/048272.

Mai mult, definiţia termenului "construct de anticorp» include constructe monovalente, bivalente şi polivalente/multivalente şi, prin urmare, constructe monospecifice, care se leagă în mod specific la o singură structură antigenică, precum şi constructe bispecifice şi polispecifice/multispecifice, care se leagă în mod specific la mai mult de o structură antigenică, de ex. două, trei sau mai multe, prin domenii de legare distincte. Mai mult, definiţia termenului "construct de anticorp» include molecule care constau dintr-un singur lanţ polipeptidic, precum şi molecule constând din mai multe lanţuri polipeptidice, care lanţuri pot fi identice (homodimeri, homotrimeri sau homo oligomeri) sau diferite (heterodimeri, heterotrimeri sau heterooligomeri). Exemple pentru anticorpii identificaţi mai sus şi variantele sau derivaţii acestora sunt descrise, printre altele, în Harlow şi Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) şi Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann şi Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010 şi Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

Constructele de anticorpi conform prezentei invenţii sunt, de preferinţă, "constructe de anticorpi generaţi in vitro". Acest termen se referă la un construct de anticorp conform definiţiei de mai sus, în care întreaga regiune variabilă sau o parte a acesteia (de ex., cel puţin o CDR) este generată într-o selecţie de celule non-imune, de ex., o expunere pe fagi in vitro, un cip de proteine sau orice altă metodă în care secvenţele candidate pot fi testate cu privire la capacitatea lor de a se lega la un antigen. Astfel, acest termen exclude, de preferinţă, secvenţele generate exclusiv de rearanjarea genomică într-o celulă imună la un animal. Un "anticorp recombinant" este un anticorp produs prin utilizarea tehnologiei de ADN recombinant sau a ingineriei genetice.

Termenul "anticorp monoclonal" (mAb) sau construct de anticorp monoclonal, aşa cum este utilizat aici, se referă la un anticorp obţinut dintr-o populaţie de anticorpi substanţial omogeni, adică anticorpii individuali care cuprind populaţia sunt identici, cu excepţia posibilelor mutaţii care apar în mod natural şi/sau modificărilor post-translaţie (de ex., izomerizări, amidări) care pot fi prezente în cantităţi minore. Anticorpii monoclonali sunt foarte specifici, fiind direcţionaţi împotriva unui singur situs antigenic sau determinant asupra antigenului, spre deosebire de preparatele de anticorpi (policlonali) convenţionali care includ de obicei diferiţi anticorpi direcţionaţi împotriva diferiţilor determinanţi (sau epitopi). În plus faţă de specificul lor, anticorpii monoclonali sunt avantajoşi prin faptul că sunt sintetizaţi prin cultura hibridomului, deci necontaminat de alte imunoglobuline. Modificatorul "monoclonal" indică caracterul anticorpului ca fiind obţinut dintr-o populaţie substanţial omogenă de anticorpi şi nu trebuie interpretat ca necesitând producerea anticorpului prin nici o metodă particulară.

Pentru prepararea anticorpilor monoclonali poate fi utilizată orice tehnică care furnizează anticorpi produşi prin culturi de linii celulare continue. De exemplu, anticorpii monoclonali care trebuie utilizaţi pot fi produşi prin metoda hibridomului descrisă mai întâi de Koehler şi colab., Nature, 256: 495 (1975), sau pot fi produşi prin metode de ADN recombinant (a se vedea, de ex., Brevetul SUA Nr. 4.816.567). Exemple de tehnici suplimentare pentru producerea de anticorpi monoclonali umani includ tehnica triomului, tehnica hibridomului cu celule B umane (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) şi tehnica hibrodomului EBV (Cole şi colab., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

Hibridomii pot fi apoi testaţi folosind metode standard, cum ar fi testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) şi rezonanţa plasmonilor de suprafaţă (BIACORE™), pentru a identifica unul sau mai mulţi hibridomi care produc un anticorp care se leagă în mod specific cu un antigen specificat. Orice formă a antigenului relevant poate fi utilizată ca imunogen, de ex., antigen recombinant, forme naturale, orice variante sau fragmente ale acestuia, precum şi o peptidă antigenică a acestuia. Rezonanţa plasmonilor de suprafaţă, aşa cum este folosită în sistemul BIAcore, poate fi utilizată pentru a creşte eficienţa anticorpilor fagi care se leagă la un epitop al unui antigen ţintă, cum ar fi MSLN sau CD3 epsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

O altă metodă, cu titlu de exemplu, de producere a anticorpilor monoclonali include screeningul bibliotecilor de exprimare a proteinelor, de ex., al bibliotecilor de expunere pe fagi sau bibliotecilor de expunere pe ribozomi. Expunerea pe fagi este descrisă, de exemplu, în Ladner şi colab., Brevetul SUA Nr. 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson şi colab., Nature, 352: 624-628 (1991) şi Marks şi colab., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

În plus faţă de utilizarea bibliotecilor de expunere, antigenul relevant poate fi utilizat pentru a imuniza un animal non-uman, de ex., o rozătoare (cum ar fi un şoarece, hamster, iepure sau şobolan). Într-un exemplu de realizare, animalul non-uman include cel puţin o parte a unei gene a imunoglobulinei umane. De exemplu, este posibil să se proiecteze tulpini de şoarece deficiente în producţia de anticorpi de şoarece cu fragmente mari de locusuri de Ig (imunoglobulină) umană. Folosind tehnologia hibridomului, pot fi produşi şi selectaţi anticorpi monoclonali specifici antigenului derivaţi din gene cu specificitatea dorită. A se vedea, de ex., XENOMOUSE™, Green şi colab. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, şi WO 96/33735.

Un anticorp monoclonal poate fi, de asemenea, obţinut de la un animal non-uman, şi apoi modificat, de ex., umanizat, dezimunizat, himerizat, etc., utilizând tehnici de ADN recombinant cunoscute în domeniu. Exemple de constructe de anticorpi modificate includ variante umanizate de anticorpi non-umani, anticorpi cu "afinitate maturată» (a se vedea, de ex. Hawkins şi colab. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) şi Lowman şi colab., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)) şi mutanţi de anticorp cu funcţie (funcţii) efectoare modificată (a se vedea, de ex., Brevetul SUA 5.648.260, Kontermann şi Dübel (2010), loc. cit. şi Little (2009), loc. cit.).

În imunologie, maturarea afinităţii este procesul prin care celulele B produc anticorpi cu afinitate crescută pentru antigen în cursul unui răspuns imun. Cu expuneri repetate la acelaşi antigen, o gazdă va produce anticorpi cu afinităţi succesiv mai mari. La fel ca prototipul natural, maturarea afinităţii in vitro se bazează pe principiile mutaţiei şi selecţiei. Maturarea afinităţii in vitro a fost folosită cu succes pentru a optimiza anticorpii, constructele de anticorpi şi fragmentele de anticorpi. Mutaţiile aleatorii din interiorul CDR-urilor sunt introduse folosind radiaţii, mutageni chimici sau PCR predispuse la erori. În plus, diversitatea genetică poate fi mărită prin amestecarea lanţului. Două sau trei runde de mutaţie şi selecţie folosind metode de expunere, cum ar fi expunerea pe fagi, duc de obicei la fragmente de anticorpi cu afinităţi în domeniul nanomolar scăzut.

Un tip preferat de variaţie de substituţie de aminoacizi a constructelor de anticorpi implică substituirea unuia sau mai multor resturi de regiune hipervariabilă ale unui anticorp părinte (de ex., un anticorp umanizat sau uman). În general, variantele rezultate selectate pentru dezvoltarea ulterioară vor avea proprietăţi biologice îmbunătăţite în raport cu anticorpul părinte din care sunt generate. O modalitate convenabilă de a genera astfel de variante de substituţie implică maturarea afinităţii folosind expunerea pe fagi. Pe scurt, mai multe situsuri ale regiunii hipervariabile (de ex., 6-7 situsuri) sunt mutate pentru a genera toate substituţiile posibile de aminoacizi la fiecare situs. Variantele de anticorpi astfel generate sunt expuse într-un mod monovalent din particule de fagi filamentoase ca fuziuni cu produsul genei III din M13 ambalat în fiecare particulă. Variantele expuse pe fagi sunt apoi selectate pentru activitatea lor biologică (de ex., afinitate de legare) aşa cum este dezvăluit aici. Pentru a identifica situsurile regiunii hipervariabile candidate pentru modificare, se poate efectua mutageneză de scanare cu alanină pentru a identifica reziduurile regiunii hipervariabile contribuind semnificativ la legarea antigenului. Alternativ sau suplimentar, poate fi benefic să se analizeze o structură cristalină a complexului antigen-anticorp pentru a identifica punctele de contact între domeniul de legare şi, de ex., MSLN umană. Astfel de reziduuri de contact şi reziduuri învecinate sunt candidaţi la substituţie în conformitate cu tehnicile elaborate aici. Odată ce astfel de variante sunt generate, panoul de variante este supus screeningului aşa cum este descris aici şi anticorpii cu proprietăţi superioare într-una sau mai multe teste relevante pot fi selectaţi pentru dezvoltare ulterioară.

Anticorpii monoclonali şi constructele de anticorpi din prezenta invenţie includ în mod specific anticorpi "himerici" (imunoglobuline) în care o porţiune a lanţului greu şi/sau uşor este identică sau omoloagă cu secvenţele corespunzătoare în anticorpi derivaţi de la o anumită specie sau aparţinând unei anumite clase sau subclase de anticorpi, în timp ce restul lanţului (lanţurilor) este identic sau omolog cu secvenţele corespunzătoare în anticorpi derivaţi de la o altă specie sau aparţinând unei alte clase sau subclase de anticorpi, precum şi fragmente ale unor astfel de anticorpi, atâta timp cât prezintă activitatea biologică dorită (Brevetul SUA Nr. 4.816.567; Morrison şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 81: 6851-6855 (1984)). Anticorpii himerici de interes din prezenta includ anticorpi "primitivi" care cuprind secvenţe de legare a antigenului domeniului variabil derivat de la un primat neuman (de ex., Cercopitecide, Hominoide etc.) şi secvenţe de regiune constantă umană. Au fost descrise o varietate de abordări pentru producerea anticorpilor himerici. A se vedea de ex, Morrison şi colab., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81:6851 , 1985; Takeda şi colab., Nature 314:452, 1985, Cabilly şi colab., Brevetul SUA Nr. 4.816.567; Boss şi colab., Brevetul SUA Nr. 4.816.397; Tanaguchi şi colab., EP 0171496; EP 0173494; şi GB 2177096.

Un anticorp, un construct de anticorp, un fragment de anticorp sau o variantă de anticorp poate fi, de asemenea, modificat(ă) prin deleţia specifică a epitopilor celulelor T umane (o metodă numită "dezimunizare") prin metodele descrise, de exemplu, în WO 98/52976 sau WO 00/34317. Pe scurt, domeniile variabile ale lanţului greu şi uşor ale unui anticorp pot fi analizate pentru peptide care se leagă la MHC clasa II; aceste peptide reprezintă epitopi potenţiali ai celulelor T (aşa cum sunt definiţi în WO 98/52976 şi WO 00/34317). Pentru detectarea potenţialilor epitopi ai celulelor T, poate fi aplicată o abordare de modelare computerizată numită "filetarea peptidei" şi, în plus, poate fi căutată o bază de date cu peptide de legare a MHC umane clasa II pentru motivele prezente în secvenţele VH şi VL, aşa cum este descris în WO 98/52976 şi WO 00/34317. Aceste motive se leagă de oricare dintre cele 18 alotipuri majore MHC clasa II DR şi astfel constituie epitopi potenţiali ai celulelor T. Epitopii potenţiali ai celulelor T detectaţi pot fi eliminaţi prin substituirea unui număr mic de reziduuri de aminoacizi în domeniile variabile sau, de preferinţă, prin substituţii de aminoacizi unici. De obicei, se fac substituţii conservatoare. Adesea, dar nu exclusiv, poate fi utilizat un aminoacid comun unei poziţii în secvenţele de anticorpi ai liniei germinale umane. Secvenţele liniei germinale umane sunt dezvăluite, de ex. în Tomlinson, şi colab. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. şi colab. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; şi Tomlinson şi colab. (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638. Directorul V BASE oferă un director cuprinzător de secvenţe de regiune variabilă a imunoglobulinei umane (compilat de Tomlinson, LA. şi colab. Centrul MRC pentru Ingineria Proteinelor, Cambridge, Marea Britanie). Aceste secvenţe pot fi utilizate ca sursă de secvenţă umană, de ex., pentru regiunile cadru şi CDR-uri. Regiunile cadru umane consens pot fi, de asemenea, utilizate, de exemplu, aşa cum este descris în Brevetul SUA Nr. 6.300.064.

Anticorpii "umanizaţi", constructe de anticorpi, variante sau fragmente ale acestora (cum ar fi Fv, Fab, Fab', F(ab')2 sau alte subsecvenţe ale anticorpilor care leagă antigenul) sunt anticorpi sau imunoglobuline cu secvenţe preponderent umane, care conţin (a) secvenţe minime derivate din imunoglobulină non-umană. În cea mai mare parte, anticorpii umanizaţi sunt imunoglobuline umane (anticorp receptor) în care reziduurile dintr-o regiune hipervariabilă (de asemenea, CDR) a receptorului sunt înlocuite cu reziduuri dintr-o regiune hipervariabilă a unei specii neumane (de ex., rozătoare) (anticorp donator) cum ar fi şoarecele, şobolanul, hamsterul sau iepurele având specificitatea, afinitatea şi capacitatea dorite. În unele cazuri, reziduurile regiunii cadru Fv (FR) ale imunoglobulinei umane sunt înlocuite cu reziduuri neumane corespunzătoare. Mai mult, "anticorpii umanizaţi", aşa cum se utilizează aici, pot cuprinde, de asemenea, reziduuri care nu se găsesc nici în anticorpul receptor, nici în anticorpul donator. Aceste modificări sunt făcute pentru a rafina şi optimiza în continuare performanţa anticorpilor. Anticorpul umanizat poate cuprinde, de asemenea, cel puţin o porţiune dintr-o regiune constantă a imunoglobulinei (Fc), în mod tipic aceea a unei imunoglobuline umane. Pentru detalii suplimentare, a se vedea Jones şi colab., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann şi colab., Nature, 332: 323-329 (1988); şi Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

Anticorpii umanizaţi sau fragmente ale acestora pot fi generaţi prin înlocuirea secvenţelor domeniului variabil Fv care nu sunt direct implicate în legarea antigenului cu secvenţe echivalente din domeniile variabile Fv umane. Metode, cu titlu de exemplu, pentru generarea de anticorpi umanizaţi sau fragmente ale acestora sunt furnizate de Morrison (1985) Science 229:1202-1207; de Oi şi colab. (1986) BioTechniques 4:214; şi de US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; şi US 6.407.213. Aceste metode includ izolarea, manipularea şi exprimarea secvenţelor de acid nucleic care codifică toate sau o parte din domeniile variabile ale imunoglobulinei Fv din cel puţin unul dintr-un lanţ greu sau uşor. Astfel de acizi nucleici pot fi obţinuţi dintr-un hibridom care produce un anticorp împotriva unei ţinte predeterminate, aşa cum este descris mai sus, precum şi din alte surse. ADN-ul recombinant care codifică molecula de anticorp umanizat poate fi apoi clonat într-un vector de exprimare adecvat.

Anticorpii umanizaţi pot fi produşi, de asemenea, utilizând animale transgenice, cum ar fi şoarecii care exprimă gene ale lanţului greu şi uşor uman, dar sunt incapabili să exprime genele endogene ale imunoglobulinei de şoarece. Winter descrie un exemplu de metodă de grefare CDR care poate fi utilizată pentru a prepara anticorpii umanizaţi descrişi aici (Brevetul SUA Nr. 5.225.539). Toate CDR-urile unui anumit anticorp uman pot fi înlocuite cu cel puţin o porţiune dintr-o CDR non-umană sau doar unele dintre CDR-uri pot fi înlocuite cu CDR-uri non-umane. Este necesar doar să se înlocuiască numărul de CDR-uri necesare pentru legarea anticorpului umanizat la un antigen predeterminat.

Un anticorp umanizat poate fi optimizat prin introducerea de substituţii conservatoare, substituţii de secvenţă consens, substituţii de linie germinală şi/sau mutaţii inverse. Astfel de molecule de imunoglobulină modificate pot fi produse prin oricare dintre mai multe tehnici cunoscute în domeniu (de ex., Teng şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. S.U.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor şi colab., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson şi colab., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, şi EP 239 400).

Termenul "anticorp uman", "construct de anticorp uman" şi "domeniu de legare uman" include anticorpi, constructe de anticorpi şi domenii de legare având regiuni de anticorpi, cum ar fi regiuni variabile şi constante sau domenii care corespund în mod substanţial secvenţelor de imunoglobuline ale liniei germinale umane cunoscute în domeniu, incluzându-le, de exemplu, pe cele descrise de Kabat et al. (1991) (loc. cit.). Anticorpii umani, constructele de anticorpi sau domeniile de legare ale invenţiei pot include resturi de aminoacizi necodificate de secvenţele de imunoglobuline ale liniei germinale umane (de ex., mutaţii introduse prin mutageneză aleatorie sau specifică situsului in vitro sau prin mutaţie somatică in vivo), de exemplu, în CDR-uri şi, în special, în CDR3. Anticorpii umani, constructele de anticorpi sau domeniile de legare pot avea cel puţin una, două, trei, patru, cinci sau mai multe poziţii înlocuite cu un reziduu de aminoacizi care nu este codificat de secvenţa de imunoglobulină a liniei germinale umane. Definiţia anticorpilor umani, a constructelor de anticorpi şi a domeniilor de legare, aşa cum este utilizată aici, are în vedere şi anticorpii complet umani, care includ doar secvenţe umane de anticorpi modificate non-artificial şi/sau genetic, deoarece aceştia pot fi derivaţi folosind tehnologii sau sisteme, cum ar fi Xenomouse.

În unele exemple de realizare, constructele de anticorpi ale invenţiei sunt constructe de anticorpi "izolate" sau "substanţial pure". "Izolat" sau "substanţial pur", atunci când este utilizat pentru a descrie constructele de anticorpi dezvăluite aici, înseamnă un construct de anticorp care a fost identificat, separat şi/sau recuperat dintr-o componentă a mediului său de producţie. De preferinţă, constructul de anticorp este liber sau substanţial lipsit de asociere cu toate celelalte componente din mediul său de producţie. Componentele contaminante ale mediului său de producţie, cum ar fi cel care rezultă din celulele transfectate recombinante, sunt materiale care ar interfera în mod obişnuit cu utilizările diagnostice sau terapeutice pentru polipeptidă şi pot include enzime, hormoni şi alte substanţe dizolvate proteice sau neproteice. Constructele de anticorpi pot constitui, de ex., cel puţin aproximativ 5% sau cel puţin aproximativ 50% în greutate din proteina totală dintr-o probă dată. Se înţelege că proteina izolată poate constitui de la 5% la 99,9% în greutate din conţinutul total de proteine, în funcţie de circumstanţe. Polipeptida poate fi realizată la o concentraţie semnificativ mai mare prin utilizarea unui promotor inductibil sau promotor cu exprimare ridicată, astfel încât să fie produs la niveluri crescute de concentraţie. Definiţia include producerea unui construct de anticorp într-o mare varietate de organisme şi/sau celule gazdă care sunt cunoscute în domeniu. În exemple de realizare preferate, constructul de anticorp va fi purificat (1) într-un grad suficient pentru a obţine cel puţin 15 reziduuri de secvenţă de aminoacizi cu N-terminal sau intern prin utilizarea unei cupe de secvenţiere de filare sau (2) la omogenitate prin SDS-PAGE în condiţii nereducătoare sau reducătoare utilizând colorare cu albastru Coomassie sau, de preferinţă, de argint. În mod obişnuit, totuşi, un construct de anticorp izolat va fi preparat prin cel puţin o etapă de purificare.

Termenul "domeniu de legare" caracterizează în legătură cu prezenta invenţie un domeniu care (în mod specific) se leagă la/interacţionează cu/recunoaşte un anumit epitop ţintă sau un anumit situs ţintă pe moleculele ţintă (antigene), aici: MSLN şi respectiv CD3. Structura şi funcţia primului domeniu de legare (recunoaşterea MSLN), şi, de preferinţă, de asemenea, structura şi/sau funcţia celui de al doilea domeniu de legare (recunoaşterea CD3), se bazează pe structura şi/sau funcţia unui anticorp, de ex. a unei molecule de imunoglobulină de lungime completă sau întreagă. Conform invenţiei, primul domeniu de legare este caracterizat prin prezenţa a trei CDR-uri ale lanţului uşor (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 ale regiunii VL) şi/sau trei CDR-uri ale lanţului greu (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 ale regiunii VH). Al doilea domeniu de legare cuprinde, de asemenea, de preferinţă, cerinţele structurale minime ale unui anticorp care permit legarea ţintei. Mai preferabil, al doilea domeniu de legare cuprinde cel puţin trei CDR-uri ale lanţului uşor (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 ale regiunii VL) şi trei CDR-uri ale lanţului greu (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 ale regiunii VH). Se preconizează că primul şi/sau al doilea domeniu de legare este produs prin sau poate fi obţinut prin expunerea pe fagi sau prin metode de screening de bibliotecă, mai degrabă decât prin grefarea secvenţelor CDR dintr-un anticorp (monoclonal) preexistent într-un eşafod cadru.

Conform prezentei invenţii, domeniile de legare sunt sub forma uneia sau mai multor polipeptide. Astfel de polipeptide pot include părţi proteice şi părţi neproteice (de ex., linkeri chimici sau agenţi chimici de reticulare, cum ar fi glutaraldehida). Proteinele (inclusiv fragmente ale acestora, de preferinţă fragmente biologic active şi peptide, având de obicei mai puţin de 30 de aminoacizi) cuprind doi sau mai mulţi aminoacizi cuplaţi între ei printr-o legătură peptidică covalentă (rezultând un lanţ de aminoacizi). Termenul "polipeptidă" aşa cum este utilizat aici descrie un grup de molecule, care constau de obicei din mai mult de 30 de aminoacizi. Polipeptidele pot forma în continuare multimeri, cum ar fi dimeri, trimeri şi oligomeri superiori, adică, constând din mai mult de o moleculă de polipeptidă. Moleculele polipeptidice care formează astfel de dimeri, trimeri etc. pot fi identice sau neidentice. Structurile corespunzătoare de ordin superior ale acestor multimeri sunt, în consecinţă, denumite homo- sau heterodimeri, homo- sau heterotrimeri etc. Un exemplu pentru un hereteromultimer este o moleculă de anticorp, care, în forma sa naturală, constă din două lanţuri polipeptidice uşoare identice şi două lanţuri polipeptidice grele identice. Termenii "peptidă", "polipeptidă" şi "proteină" se referă, de asemenea, la peptide/polipeptide/proteine modificate în mod natural în care modificarea este efectuată de ex. prin modificări post-translaţionale, cum ar fi glicozilarea, acetilarea, fosforilarea şi altele asemenea. O "peptidă", "polipeptidă" sau "proteină", la care se face referire aici, poate fi, de asemenea, modificată chimic, cum ar fi pegilată. Astfel de modificări sunt bine cunoscute în domeniu şi descrise aici mai jos.

De preferinţă, domeniul de legare care se leagă la MSLN şi/sau domeniul de legare care se leagă la CD3 este/sunt domenii de legare umane. Anticorpii şi constructele de anticorpi cuprinzând cel puţin un domeniu de legare uman evită unele dintre problemele asociate cu anticorpii sau constructele de anticorpi care posedă regiuni non-umane, cum ar fi de rozătoare (de ex. murin, şobolan, hamster sau iepure) regiuni variabile şi/sau constante. Prezenţa unor astfel de proteine derivate din rozătoare poate duce la eliminarea rapidă a anticorpilor sau a constructelor de anticorpi sau poate duce la generarea unui răspuns imun împotriva anticorpului sau a constructului de anticorp de către un pacient. Pentru a evita utilizarea anticorpilor derivaţi de la rozătoare sau a constructelor de anticorpi, anticorpii/constructele de anticorpi umani sau complet umani pot fi generate prin introducerea funcţiei anticorpului uman într-un rozător, astfel încât rozătoarele să producă anticorpi complet umani.

Capacitatea de a clona şi de a reconstrui locusuri umane de mărime megabază în YAC şi de a le introduce în linia germinală de şoarece oferă o abordare puternică pentru elucidarea componentelor funcţionale ale locusurilor foarte mari sau cartografiate brut, precum şi generarea de modele utile de boli umane. În plus, utilizarea unei astfel de tehnologii pentru înlocuirea locusurilor de şoarece cu echivalenţii lor umani ar putea oferi informaţii unice asupra exprimării şi reglării produselor genetice umane în timpul dezvoltării, comunicării lor cu alte sisteme şi implicării lor în inducerea şi progresia bolii.

O aplicaţie practică importantă a unei astfel de strategii este "umanizarea» sistemului imunitar umoral al şoarecelui. Introducerea locusurilor imunoglobulinei umane (Ig) în şoareci în care genele Ig endogene au fost inactivate oferă posibilitatea de a studia mecanismele care stau la baza exprimării şi asamblării programate a anticorpilor, precum şi rolul lor în dezvoltarea celulelor B. Mai mult, o astfel de strategie ar putea oferi o sursă ideală pentru producerea de anticorpi monoclonali complet umani (mAb) - o etapă importantă pentru îndeplinirea promisiunii terapiei cu anticorpi în bolile umane. Se aşteaptă ca anticorpii sau constructele de anticorpi complet umani să minimizeze răspunsurile imunogene şi alergice intrinseci la mAb de şoareci sau derivaţi de la şoareci şi astfel să crească eficacitatea şi siguranţa anticorpilor/constructelor de anticorpi administraţi. Se poate aştepta ca utilizarea anticorpilor sau a constructelor de anticorpi complet umani să ofere un avantaj substanţial în tratamentul bolilor umane cronice şi recurente, cum ar fi inflamaţia, autoimunitatea şi cancerul, care necesită administrări repetate de compuşi.

O abordare către acest obiectiv a fost să se proiecteze tulpini de şoarece cu deficit de producţie de anticorpi de şoarece cu fragmente mari de locusuri Ig umane în aşteptarea că astfel de şoareci ar produce un repertoriu mare de anticorpi umani în absenţa anticorpilor de şoarece. Fragmente mari de Ig umană ar păstra marea diversitate de gene variabile, precum şi reglarea adecvată a producţiei şi exprimării anticorpilor. Prin exploatarea maşinăriilor şoarecelui pentru diversificarea şi selecţia anticorpilor şi lipsa toleranţei imunologice la proteinele umane, repertoriul de anticorpi umani reprodus în aceste tulpini de şoarece ar trebui să producă anticorpi cu afinitate ridicată împotriva oricărui antigen de interes, inclusiv antigeni umani. Folosind tehnologia hibridomului, mAb umani specifici antigenului cu specificitatea dorită ar putea fi produşi şi selectaţi cu uşurinţă. Această strategie generală a fost demonstrată în legătură cu generarea primelor tulpini de şoarece XenoMouse (a se vedea Green şi colab. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Tulpinile XenoMouse au fost proiectate cu cromozomi artificiali de drojdie (YAC) care conţin fragmente de configuraţie a liniei germinale cu dimensiunea de 245 kb şi 190 kb ale locusului lanţului greu uman şi, respectiv, ale locusului lanţului uşor kappa, conţinând secvenţe de regiuni variabile şi regiuni constante de bază. YAC care conţin Ig umană s-au dovedit a fi compatibili cu sistemul şoarecelui atât pentru rearanjare, cât şi pentru exprimarea anticorpilor şi au fost capabili să înlocuiască genele Ig de şoarece inactivate. Acest lucru a fost demonstrat de capacitatea lor de a induce dezvoltarea celulelor B, de a produce un repertoriu uman de tip adult cu anticorpi complet umani şi de a genera mAb umani specifici antigenului. Aceste rezultate au sugerat, de asemenea, că introducerea unor porţiuni mai mari ale locusurilor Ig umane care conţin un număr mai mare de gene V, elemente de reglare suplimentare şi regiuni constante de Ig umane ar putea recapitula substanţial repertoriul complet care este caracteristic răspunsului umoral uman la infecţie şi imunizare. Lucrarea lui Green şi colab. a fost extinsă recent la introducerea a mai mult de aproximativ 80% din repertoriul de anticorpi umani prin introducerea fragmentelor YAC de configuraţie a liniei germinale de dimensiunea megabazei ale locusurilor lanţului greu uman şi, respectiv, ale locusurilor lanţului uşor kappa. A se vedea Mendez şi colab. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

Producerea şoarecilor XenoMouse este discutată şi delimitată în continuare în Brevetul SUA Nr. 6.673.986, Brevetele SUA Nr. 6.162.963; 6.150.584; 6.114.598; 6.075.181, şi 5.939.598 precum şi cererile de brevet americane subiacente şi Brevetele Japoneze Nr. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, şi 3 068 507 B2. A se vedea, de asemenea, Mendez şi colab. Nature Genetics 15:146-156 (1997) şi Green şi Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), EP 0 463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310, şi WO 03/47336.

Într-o abordare alternativă, alţii, inclusiv GenPharm International, Inc., au utilizat o abordare "minilocus". În abordarea minilocus, un locus de Ig exogenă este mimat prin includerea de piese (gene individuale) din locusul Ig. Astfel, una sau mai multe gene VH, una sau mai multe gene DH, una sau mai multe gene JH, o regiune constantă mu şi o a doua regiune constantă (de preferinţă o regiune constantă gamma) sunt formate într-un construct pentru inserare într-un animal. Această abordare este descrisă în Brevetul SUA Nr. 5.545.807 acordat lui Surani şi colab. şi Brevetele SUA Nr. 5.545.806; 5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; 5.770.429; 5.789.650; 5.814.318; 5.877.397; 5.874.299; şi 6.255.458 acordat fiecare lui Lonberg şi Kay, Brevetele SUA Nr. 5.591.669 şi 6.023.010 acordate lui Krimpenfort şi Berns, Brevetele SUA Nr. 5.612.205; 5.721.367; şi 5.789.215 acordate lui Berns şi colab., şi Brevetul SUA Nr. 5.643.763 acordat lui Choi şi Dunn. Această abordare este descrisă în plus în GenPharm International Brevetele SUA Nr 5.569.825,5.789.650, 5.545.806, 5.661.016, 5.814.318, şi 5.364.079, precum şi cererile de brevet subiacente. A se vedea, de asemenea, EP 0 546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, şi WO 98/24884 şi Brevetul SUA Nr. 5.981.175. A se vedea în plus Taylor şi colab. (1992), Chen şi colab. (1993), Tuaillon şi colab. (1993), Choi şi colab. (1993), Lonberg şi colab. (1994), Taylor şi colab. (1994), şi Tuaillon şi colab. (1995), Fishwild şi colab. (1996).

Kirin a demonstrat, de asemenea, generarea de anticorpi umani de la şoareci în care, prin fuziunea microcelulelor, au fost introduse bucăţi mari de cromozomi sau cromozomi întregi. A se vedea cererile de brevet european nr. 773 288 şi 843 961. Xenerex Biosciences dezvoltă o tehnologie pentru generarea potenţială de anticorpi umani. În această tehnologie, şoarecii SCID sunt reconstituiţi cu celule limfatice umane, de ex., celule B şi/sau T. Şoarecii sunt apoi imunizaţi cu un antigen şi pot genera un răspuns imun împotriva antigenului. A se vedea Brevetele SUA Nr. 5.476.996; 5.698.767; şi 5.958.765.

Răspunsurile la anticorpi umani anti-şoarece (HAMA) au determinat industria să prepare anticorpi umanizaţi himeric sau în alt fel. Cu toate acestea, este de aşteptat ca anumite răspunsuri la anticorpi anti-himerici umani (HACA) să fie observate, în special în utilizările cronice sau cu doze multiple ale anticorpului. Astfel, ar fi de dorit să se furnizeze constructe de anticorpi care cuprind un domeniu de legare uman împotriva MSLN şi un domeniu de legare uman împotriva CD3 pentru a anula preocupările şi/sau efectele răspunsului HAMA sau HACA.

Termenii "se leagă (specific) la", "recunoaşte (în mod specific)", "este (în mod specific) direcţionat către" şi "reacţionează (specific) cu" înseamnă, în conformitate cu această invenţie, că un domeniu de legare interacţionează sau interacţionează în mod specific cu un anumit epitop sau un anumit situs ţintă pe moleculele ţintă (antigene), aici: MSLN şi respectiv CD3.

Termenul "epitop" se referă la un situs pe un antigen la care se leagă în mod specific un domeniu de legare, cum ar fi un anticorp sau o imunoglobulină, sau un derivat, fragment sau variantă a unui anticorp sau a unei imunoglobuline. Un "epitop" este antigenic şi, prin urmare, termenul de epitop este uneori denumit aici şi "structură antigenică" sau "determinant antigenic". Astfel, domeniul de legare este un „situs de interacţiune cu antigenul». Această legare/interacţiune este, de asemenea, înţeleasă ca definind o "recunoaştere specifică".

"Epitopii" pot fi formaţi atât din aminoacizi alăturaţi, cât şi din aminoacizi nealăturaţi, juxtapuşi prin plierea terţiară a unei proteine. Un "epitop liniar" este un epitop în care o secvenţă primară de aminoacizi cuprinde epitopul recunoscut. Un epitop liniar include în mod tipic cel puţin 3 sau cel puţin 4 şi, de obicei, cel puţin 5 sau cel puţin 6 sau cel puţin 7, de exemplu, aproximativ 8 până la aproximativ 10 aminoacizi într-o secvenţă unică.

Un "epitop conformaţional", spre deosebire de un epitop liniar, este un epitop în care secvenţa primară de aminoacizi care cuprind epitopul nu este singura componentă definitorie a epitopului recunoscut (de ex., un epitop în care secvenţa primară de aminoacizi nu este neapărat recunoscută de domeniul de legare). De obicei, un epitop conformaţional cuprinde un număr crescut de aminoacizi faţă de un epitop liniar. În ceea ce priveşte recunoaşterea epitopilor conformaţionali, domeniul de legare recunoaşte o structură tridimensională a antigenului, de preferinţă o peptidă sau o proteină sau un fragment al acesteia (în contextul prezentei invenţii, structura antigenică pentru unul dintre domeniile de legare este cuprinsă în proteina MSLN). De exemplu, atunci când o moleculă de proteină se pliază pentru a forma o structură tridimensională, anumiţi aminoacizi şi/sau scheletul polipeptidic care formează epitopul conformaţional devin juxtapuse permiţând anticorpului să recunoască epitopul. Metodele de determinare a conformaţiei epitopilor includ, dar nu sunt limitate la, cristalografie cu raze X, spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară bidimensională (2D-RMN) şi etichetare spin direcţionată către situs şi spectroscopie de rezonanţă electronică paramagnetică (EPR).

O metodă de cartografiere a epitopilor este descrisă în cele ce urmează: Când o regiune (o întindere de aminoacizi contiguă) din proteina MSLN umană este schimbată/înlocuită cu regiunea corespunzătoare a unui antigen MSLN non-umană şi non-primată (de exemplu, MSLN de şoarece, dar şi altele, cum ar fi pui, şobolan, hamster, iepure etc. ar putea fi, de asemenea, imaginabile), este de aşteptat să apară o scădere a legării domeniului de legare, cu excepţia cazului în care domeniul de legare este reactiv încrucişat pentru MSLN non-umană, non-primată utilizată. Respectiva scădere este, de preferinţă, de cel puţin 10%, 20%, 30%, 40% sau 50%; mai preferabil de cel puţin 60%, 70% sau 80% şi cel mai preferabil de 90%, 95% sau chiar 100% în comparaţie cu legarea la regiunea respectivă din proteina MSLN umană, în care legarea la regiunea respectivă din proteina MSLN umană este setată să fie de 100%. Este avut în vedere ca himerele MSLN umană/MSLN non-umană menţionate mai sus să fie exprimate în celule CHO. Himerele MSLN umană/MSLN non-umană pot fi, de asemenea, fuzionate cu un domeniu transmembranar şi/sau un domeniu citoplasmatic al unei proteine diferite legate de membrană, cum ar fi EpCAM, deşi o astfel de tehnică nu a fost necesară pentru metoda descrisă în Exemplele 1 şi 2.

Într-o metodă alternativă sau suplimentară pentru cartografierea epitopilor, pot fi generate mai multe versiuni trunchiate ale domeniului extracelular MSLN umană pentru a determina o regiune specifică care este recunoscută de un domeniu de legare. În aceste versiuni trunchiate, diferitele domenii/subdomenii sau regiuni MSLN extracelulare sunt şterse treptat, începând de la capătul N-terminal. Versiunile MSLN trunchiate care pot fi exprimate în celule CHO. Este avut în vedere, de asemenea, că versiunile MSLN trunchiate pot fi fuzionate cu un domeniu transmembranar şi/sau domeniu citoplasmatic al unei proteine diferite legate de membrană, cum ar fi EpCAM. Este avut în vedere, de asemenea, că versiunile MSLN trunchiate pot cuprinde un domeniu de peptidă semnal la capătul lor N-terminal, de exemplu o peptidă semnal derivată din peptida semnal a lanţului greu IgG de şoarece. În plus, este avut în vedere că versiunile MSLN trunchiate pot cuprinde un domeniu v5 la capătul lor N-terminal (în urma peptidei semnal) care permite verificarea exprimării lor corecte pe suprafaţa celulei. Este de aşteptat să apară o scădere sau o pierdere a legării cu acele versiuni MSLN trunchiate care nu mai cuprind regiunea MSLN care este recunoscută de domeniul de legare. Scăderea legării este, de preferinţă, de cel puţin 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; mai preferabil de cel puţin 60%, 70%, 80% şi cel mai preferabil de 90%, 95% sau chiar 100%, prin care legarea la întreaga proteină MSLN umană (sau regiunea sau domeniul său extracelular) este setată la 100%.

O altă metodă pentru a determina contribuţia unui reziduu specific al unui antigen ţintă la recunoaşterea de către un construct de anticorp sau un domeniu de legare este scanarea cu alanină (a se vedea de ex. Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 iun;5(3):302-7), unde fiecare reziduu de analizat este înlocuit cu alanină, de ex. prin mutageneză direcţionată către situs. Alanina este utilizată datorită grupării sale funcţionale metil nevoluminoase, inerte chimic, care totuşi imită referinţele structurii secundare pe care o posedă mulţi dintre ceilalţi aminoacizi. Uneori, aminoacizii voluminoşi, cum ar fi valina sau leucina, pot fi utilizaţi în cazurile în care se doreşte conservarea dimensiunii reziduurilor mutante. Scanarea cu alanină este o tehnologie matură care a fost utilizată pentru o perioadă lungă de timp.

Interacţiunea dintre domeniul de legare şi epitop sau regiunea care cuprinde epitopul implică faptul că un domeniu de legare prezintă o afinitate apreciabilă pentru epitop/regiunea care cuprinde epitopul pe o anumită proteină sau antigen (aici: MSLN şi, respectiv, CD3) şi, în general, nu prezintă reactivitate semnificativă cu proteine sau antigeni, altele decât MSLN sau CD3. "Afinitate apreciabilă" include legarea cu o afinitate de aproximativ 10-6 M (KD) sau mai puternică. De preferinţă, legarea este considerată specifică atunci când afinitatea de legare este de aproximativ 10-12 la 10-8 M, 10-12 la 10-9 M, 10-12 la 10-10 M, 10-11 la 10-8 M, de preferinţă de aproximativ 10-11 la 10-9 M. Dacă un domeniu de legare reacţionează în mod specific cu sau se leagă de o ţintă poate fi testat cu uşurinţă prin, printre altele, compararea reacţiei domeniului de legare menţionat cu o proteină sau un antigen ţintă cu reacţia domeniului de legare menţionat cu alte proteine sau antigeni decât MSLN sau CD3. De preferinţă, un domeniu de legare al invenţiei nu se leagă în mod esenţial sau substanţial la proteine sau antigeni, altele decât MSLN sau CD3 (adică primul domeniu de legare nu este capabil să se lege la alte proteine decât MSLN şi al doilea domeniu de legare nu este capabil să se lege la alte proteine decât CD3).

Termenul "nu se leagă în mod esenţial/substanţial" sau "nu este capabil să se lege" înseamnă că un domeniu de legare al prezentei invenţii nu se leagă la o proteină sau un antigen altul decât MSLN sau CD3, adică nu prezintă o reactivitate mai mare de 30%, preferabil nu mai mare de 20%, mai preferabil nu mai mare de 10%, în mod deosebit de preferabil nu mai mare de 9%, 8%, 7%, 6% sau 5% cu proteine sau antigeni, altele decât MSLN sau CD3, prin care se leagă la MSLN sau, respectiv, CD3 este setat să fie 100%.

Se crede că legarea specifică este efectuată de motive specifice din secvenţa de aminoacizi a domeniului de legare şi a antigenului. Astfel, legarea se realizează ca urmare a structurii lor primare, secundare şi/sau terţiare, precum şi a rezultatului modificărilor secundare ale structurilor menţionate. Interacţiunea specifică a situsului de interacţiune antigen cu antigenul său specific poate duce la o legare simplă a situsului menţionat la antigen. Mai mult, interacţiunea specifică a situsului de interacţiune antigen cu antigenul său specific poate duce alternativ sau suplimentar la iniţierea unui semnal, de ex. datorită inducerii unei modificări a conformaţiei antigenului, a unei oligomerizări a antigenului etc.

De asemenea, este de preferat într-un exemplu de realizare a invenţiei ca cel de al doilea domeniu de legare să se lege la CD3 uman epsilon şi la CD3 Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus sau Saimiri sciureus epsilon.

Prezenta dezvăluire furnizează un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă la un epitop al MSLN care este cuprins în regiunea MSLN umană având o secvenţă aşa cum este descrisă în SECV ID NR selectată dintre SECV ID NR: 244 (cluster 1+2) şi SECV ID NR: 241 (cluster 4).

Prezenta invenţie furnizează un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă de MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă la un epitop al MSLN care este cuprins în regiunea MSLN umană având o secvenţă aşa cum este descrisă în SECV ID NR: 245 (cluster 2+3), în care

primul domeniu de legare al constructului de anticorp bispecific al invenţiei cuprinde o regiune VH care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din:

a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 161, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 162, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 163, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 164, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 165 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 166;

b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 171, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 172, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 173, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 174, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 175 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 176;

c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 181, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 182, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 183, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 184, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 185 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 186;

d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 191, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 192, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 193, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 194, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 195 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 196; şi

e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 201, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 202, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 203, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 204, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 205 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 206.

În plus, este cuprins în prezenta dezvăluire faptul că primul domeniu de legare al constructului de anticorp bispecific descris aici cuprinde o regiune VH care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR- L3 selectate din grupul format din:

a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 151, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 152, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 153, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 154, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 155 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 156;

b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 211, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 212, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 213, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 214, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 215 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 216; şi

c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 221, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 222, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 223, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 224, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 225 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 226.

Termenul "variabil" se referă la porţiunile de anticorp sau domenii de imunoglobulină care prezintă variabilitate în secvenţa lor şi care sunt implicate în determinarea specificităţii şi afinităţii de legare a unui anticorp particular (adică, "domeniu(ii) variabil(e)"). Împerecherea unui lanţ greu variabil (VH) şi a unui lanţ uşor variabil (VL) formează împreună un singur situs de legare a antigenului.

Variabilitatea nu este distribuită uniform în domeniile variabile ale anticorpilor; este concentrată în subdomeniile fiecăreia dintre regiunile variabile ale lanţului greu şi uşor. Aceste subdomenii sunt numite "regiuni hipervariabile" sau "regiuni care determină complementaritatea" (CDR). Porţiunile mai conservate (adică, nehipervariabile) ale domeniilor variabile sunt numite regiuni "cadru" (FRM sau FR) şi oferă un eşafod pentru cele şase CDR-uri în spaţiu tridimensional pentru a forma o suprafaţă care leagă antigenul. Domeniile variabile ale lanţurilor grele şi uşoare care apar în mod natural cuprind fiecare patru regiuni FRM (FR1, FR2, FR3 şi FR4), adoptând în mare măsură o configuraţie de foaie β, conectată prin trei regiuni hipervariabile, care formează bucle de conectare şi, în unele cazuri, formează parte a structurii foii β. Regiunile hipervariabile din fiecare lanţ sunt ţinute împreună în imediata apropiere de către FRM şi, împreună cu regiunile hipervariabile din celălalt lanţ, contribuie la formarea situsului de legare a antigenului (a se vedea Kabat şi colab., loc. cit.).

Termenul "CDR" şi pluralul său "CDR-uri" se referă la regiunea care determină complementaritatea dintre care trei alcătuiesc caracterul de legare al unei regiuni variabile a lanţului uşor (CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3) şi trei alcătuiesc caracterul de legare al unei regiuni variabile a lanţului greu (CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3). CDR-urile conţin majoritatea reziduurilor responsabile de interacţiunile specifice ale anticorpului cu antigenul şi, prin urmare, contribuie la activitatea funcţională a unei molecule de anticorp: sunt principalii factori determinanţi ai specificităţii antigenului.

Limitele şi lungimile definitorii exacte ale CDR sunt supuse unor sisteme diferite de clasificare şi numerotare. Prin urmare, CDR-urile pot fi denumite de Kabat, Chothia, contact sau orice altă definiţie a limitelor, inclusiv sistemul de numerotare descris aici. În ciuda limitelor diferite, fiecare dintre aceste sisteme are un anumit grad de suprapunere în ceea ce constituie aşa-numitele "regiuni hipervariabile" în cadrul secvenţelor variabile. Definiţiile CDR conform acestor sisteme pot, prin urmare, să difere în lungime şi zone de graniţă în raport cu regiunea cadru adiacentă. A se vedea, de exemplu, Kabat (o abordare bazată pe variabilitatea secvenţei între specii), Chothia (o abordare bazată pe studii cristalografice ale complexelor antigen-anticorp), şi/sau MacCallum (Kabat şi colab., loc. cit.; Chothia şi colab., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; şi MacCallum şi colab., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Un alt standard pentru caracterizarea situsului de legare a antigenului este definiţia AbM utilizată de software-ul de modelare a anticorpilor AbM de la Oxford Molecular. A se vedea, de ex., Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. În: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. şi Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). În măsura în care două tehnici de identificare a reziduurilor definesc regiuni care se suprapun, dar nu regiuni identice, ele pot fi combinate pentru a defini o CDR hibridă. Totuşi, este preferată numerotarea în conformitate cu aşa-numitul sistem Kabat.

De obicei, CDR-urile formează o structură de buclă care poate fi clasificată ca o structură canonică. Termenul "structură canonică" se referă la conformaţia lanţului principal care este adoptată de buclele de legare a antigenului (CDR). Din studii structurale comparative, s-a constatat că cinci dintre cele şase bucle de legare a antigenului au doar un repertoriu limitat de conformaţii disponibile. Fiecare structură canonică poate fi caracterizată prin unghiurile de torsiune ale scheletului polipeptidic. Prin urmare, buclele corespondente dintre anticorpi pot avea structuri tridimensionale foarte asemănătoare, în ciuda variabilităţii mari a secvenţei de aminoacizi în majoritatea părţilor buclelor (Chothia şi Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia şi colab., Nature, 1989, 342: 877; Martin şi Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Mai mult, există o relaţie între structura de buclă adoptată şi secvenţele de aminoacizi care o înconjoară. Conformaţia unei anumite clase canonice este determinată de lungimea buclei şi a resturilor de aminoacizi care se află în poziţiile cheie din buclă, precum şi în cadrul conservat (adică, în afara buclei). Atribuirea la o anumită clasă canonică se poate face, prin urmare, pe baza prezenţei acestor resturi cheie de aminoacizi.

Termenul "structură canonică" poate include, de asemenea, consideraţii cu privire la secvenţa liniară a anticorpului, de exemplu, aşa cum este catalogat de Kabat (Kabat şi colab., loc. cit.). Schema (sistemul) de numerotare Kabat este un standard adoptat pe scară largă pentru numerotarea reziduurilor de aminoacizi dintr-un domeniu variabil de anticorp într-o manieră consistentă şi este schema preferată aplicată în prezenta invenţie, aşa cum este menţionat şi în altă parte aici. Consideraţii structurale suplimentare pot fi, de asemenea, utilizate pentru a determina structura canonică a unui anticorp. De exemplu, acele diferenţe, care nu sunt pe deplin reflectate de numerotarea Kabat, pot fi descrise de sistemul de numerotare al lui Chothia şi colab. şi/sau dezvăluite prin alte tehnici, de exemplu, cristalografia şi modelarea computaţională bidimensională sau tridimensională. În consecinţă, o anumită secvenţă de anticorpi poate fi amplasată într-o clasă canonică care permite, printre altele, identificarea secvenţelor cadru adecvate (de ex., bazată pe dorinţa de a include o varietate de structuri canonice într-o bibliotecă). Numerotarea Kabat a secvenţelor de aminoacizi a anticorpilor şi consideraţii structurale aşa cum este descris de Chothia şi colab., loc. cit. şi implicaţiile lor pentru construirea aspectelor canonice ale structurii anticorpilor, sunt descrise în literatură. Structurile subunităţii şi configuraţiile tridimensionale ale diferitelor clase de imunoglobuline sunt bine-cunoscute în domeniu. Pentru o revizuire a structurii anticorpilor, a se vedea Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. Harlow şi colab., 1988.

CDR3 a lanţului uşor şi, în special, CDR3 a lanţului greu pot constitui cei mai importanţi determinanţi în legarea antigenului în regiunile variabile ale lanţului uşor şi greu. În unele constructe de anticorpi, CDR3 a lanţului greu pare să constituie zona principală de contact dintre antigen şi anticorp. Schemele de selecţie in vitro în care se variază numai CDR3 pot fi utilizate pentru a varia proprietăţile de legare ale unui anticorp sau pentru a determina ce reziduuri contribuie la legarea unui antigen. Prin urmare, CDR3 este de obicei cea mai mare sursă de diversitate moleculară în cadrul situsului de legare a anticorpului. H3, de exemplu, poate fi la fel de scurt ca două resturi de aminoacizi sau mai mare de 26 de aminoacizi.

Într-un anticorp sau o imunoglobulină clasică de lungime completă, fiecare lanţ uşor (L) este legat de un lanţ greu (H) printr-o legătură disulfurică covalentă, în timp ce cele două lanţuri H sunt legate între ele printr-una sau mai multe legături disulfurice, în funcţie de izotipul lanţului H. Domeniul CH cel mai apropiat de VH este de obicei desemnat ca CH1. Domeniile constante ("C") nu sunt direct implicate în legarea antigenului, dar prezintă diferite funcţii efectoare, cum ar fi citotoxicitatea dependentă de anticorp, mediată de celule şi activarea complementului. Regiunea Fc a unui anticorp este cuprinsă în domeniile constante ale lanţului greu şi este, de exemplu, capabilă să interacţioneze cu receptorii Fc situaţi la suprafaţa celulei.

Secvenţa genelor de anticorp după asamblare şi mutaţie somatică este foarte variată şi se estimează că aceste gene variate codifică 1010 molecule de anticorpi diferite (Immunoglobulin Genes, ed. a 2-a, ed. Jonio şi colab., Academic Press, San Diego, CA, 1995). În consecinţă, sistemul imunitar oferă un repertoriu de imunoglobuline. Termenul "repertoriu" se referă la cel puţin o secvenţă de nucleotide derivată în totalitate sau parţial din cel puţin o secvenţă care codifică cel puţin o imunoglobulină. Secvenţa(ele) pot fi generate prin rearanjare in vivo a segmentelor V, D şi J ale lanţurilor grele şi a segmentelor V şi J ale lanţurilor uşoare. Alternativ, secvenţa(ele) pot fi generate dintr-o celulă ca răspuns la care are loc rearanjarea, de exemplu, stimulare in vitro. Alternativ, o parte sau toate secvenţa(ele) pot fi obţinute prin matisare ADN, sinteza nucleotidelor, mutageneză şi alte metode, a se vedea, de ex., Brevetul SUA 5.565.332. Un repertoriu poate include o singură secvenţă sau poate include o multitudine de secvenţe, inclusiv cele dintr-o colecţie genetică diversă.

Un construct de anticorp conform prezentei dezvăluiri poate fi, de asemenea, definit ca un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare (de preferinţă uman) care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă la acelaşi epitop al MSLN ca un anticorp selectat din grupul constând din MS_1 până la MS_8, adică un anticorp care cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR- H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din:

a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 151, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 152, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 153, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 154, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 155 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 156;

b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 161, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 162, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 163, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 164, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 165 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 166;

c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 171, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 172, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 173, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 174, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 175 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 176;

d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 181, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 182, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 183, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 184, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 185 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 186;

e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 191, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 192, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 193, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 194, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 195 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 196;

f) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 201, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 202, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 203, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 204, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 205 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 206;

g) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 211, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 212, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 213, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 214, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 215 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 216; şi

h) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 221, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 222, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 223, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 224, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 225 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 226.

Poate fi măsurat dacă un construct de anticorp se leagă sau nu de acelaşi epitop al MSLN ca un alt construct de anticorp dat, de ex. prin cartografierea epitopului cu molecule ţintă himerice sau trunchiate, de ex. aşa cum este descris aici mai sus şi în Exemplele anexate 1 şi 2.

Un construct de anticorp conform prezentei dezvăluiri poate fi, de asemenea, definit ca un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare (de preferinţă uman) care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare concurează pentru legarea cu un anticorp selectat din grupul constând din MS_1 la MS_8, adică, un anticorp care cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din cele descrise mai sus.

Dacă un construct de anticorp concurează sau nu pentru legarea cu un alt construct de anticorp dat, se poate măsura într-un test competitiv, cum ar fi un ELISA competitiv sau un test competitiv pe bază de celule. Pot fi utilizate şi microparticule cuplate cu avidină (mărgele). Similar unei plăci ELISA acoperite cu avidină, atunci când reacţionează cu o proteină biotinilată, fiecare dintre aceste mărgele poate fi utilizată ca substrat pe care se poate efectua un test. Antigenul este acoperit pe o mărgea şi apoi pre-acoperit cu primul anticorp. Se adaugă al doilea anticorp şi se determină orice legare suplimentară. Mijloacele posibile pentru citire includ citometria în flux.

Într-un exemplu de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei cuprinde o regiune VH selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 177, SECV ID NR: 187, SECV ID NR: 197, şi SECV ID NR: 207. Este cuprins în prezenta dezvăluire faptul că primul domeniu de legare al constructului de anticorp descris aici cuprinde o regiune VH selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 157, SECV ID NR: 217, şi SECV ID NR: 227.

Într-un alt exemplu de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei cuprinde o regiune VL selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 178, SECV ID NR: 188, SECV ID NR: 198, şi SECV ID NR: 208. Este cuprins în prezenta dezvăluire faptul că primul domeniu de legare al constructului de anticorp descris aici cuprinde o regiune VL selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 158, SECV ID NR: 218, şi SECV ID NR: 228.

Într-un alt exemplu de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei cuprinde o regiune VH şi o regiune VL selectate din grupul constând din perechi formate dintr-o regiune VH şi o regiune VL aşa cum este descris în SECV ID NR: 167+168, SECV ID NR: 177+178, SECV ID NR: 187+188, SECV ID NR: 197+198, şi SECV ID NR: 207+208. Este cuprins în prezenta dezvăluire faptul că primul domeniu de legare al constructului de anticorp descris aici cuprinde o regiune VH şi o regiune VL selectate din grupul constând din perechi formate dintr-o regiune VH şi o regiune VL aşa cum este descris în SECV ID NR: 157+158, SECV ID NR: 217+218, şi SECV ID NR: 227+228.

Într-un alt exemplu de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei cuprinde o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209. Este cuprins în prezenta dezvăluire faptul că primul domeniu de legare al constructului de anticorp descris aici cuprinde o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 219, şi SECV ID NR: 229.

Primele domenii de legare de mai sus (care sunt specificate prin CDR-urile lor, regiunea VH şi regiunea VL şi combinaţiile acestora) se caracterizează ca domenii de legare care se leagă la un epitop al MSLN aşa cum este descris în SECV ID NR: 231, 232 şi 233.

Termenul "bispecific", aşa cum este utilizat aici, se referă la un construct de anticorp care este "cel puţin bispecific", adică, acesta cuprinde cel puţin un prim domeniu de legare şi un al doilea domeniu de legare, în care primul domeniu de legare se leagă la un antigen sau ţintă (aici: MSLN), iar al doilea domeniu de legare se leagă la un alt antigen sau ţintă (aici: CD3). În consecinţă, constructele de anticorpi conform invenţiei cuprind specificităţi pentru cel puţin doi antigeni sau ţinte diferite. Termenul "construct de anticorp bispecific" al invenţiei cuprinde, de asemenea, constructe de anticorpi multispecifici, cum ar fi constructe de anticorpi trispecifici, acestea din urmă incluzând trei domenii de legare, sau constructe având mai mult de trei (de ex., patru, cinci ...) specificităţi.

Având în vedere că constructele de anticorpi conform invenţiei sunt (cel puţin) bispecifice, ele nu apar în mod natural şi sunt semnificativ diferite de produsele naturale. Un construct de anticorp "bispecific" sau o imunoglobulină este, prin urmare, un anticorp hibrid artificial sau imunoglobulină având cel puţin două situsuri de legare distincte cu specificităţi diferite. Constructele de anticorpi bispecifici pot fi produse printr-o varietate de metode, inclusiv fuziunea hibridomilor sau legarea fragmentelor Fab'. A se vedea, de ex., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).

Cele cel puţin două domenii de legare şi domeniile variabile ale constructului de anticorp conform prezentei invenţii pot cuprinde sau nu linkeri peptidici (peptide distanţiere). Termenul "linker peptidic" cuprinde în conformitate cu prezenta invenţie o secvenţă de aminoacizi prin care secvenţele de aminoacizi ale unui domeniu (variabil şi/sau de legare) şi unui alt domeniu (variabil şi/sau de legare) al constructului de anticorp conform invenţiei sunt legate între ele. O caracteristică tehnică esenţială a unui astfel de linker peptidic este că acesta nu cuprinde nici o activitate de polimerizare. Printre linkerii peptidici adecvaţi sunt cei descrişi în Brevetele SUA 4.751.180 şi 4.935.233 sau WO 88/09344. Linkerii peptidici pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a ataşa alte domenii sau module sau regiuni (cum ar fi domeniile care se extind cu timpul de înjumătăţire) la constructul de anticorp conform invenţiei.

În cazul în care se utilizează un linker, acest linker are, de preferinţă, o lungime şi o secvenţă suficiente pentru a se asigura că fiecare dintre primul şi al doilea domeniu poate, independent unul de celălalt, să-şi păstreze specificităţile de legare diferenţiate. Pentru linkerii peptidici care conectează cel puţin două domenii de legare (sau două domenii variabile) în constructul de anticorp conform invenţiei, sunt preferaţi acei linkeri peptidici care cuprind doar un număr mic de resturi de aminoacizi, de ex. 12 reziduuri de aminoacizi sau mai puţin. Astfel, sunt preferaţi linkeri peptidici de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 sau 5 resturi de aminoacizi. Un linker peptidic prevăzut cu mai puţin de 5 aminoacizi cuprinde 4, 3, 2 sau un aminoacid(i), în care sunt preferaţi linkeri bogaţi în Gly. Un aminoacid "unic" preferat în special în contextul "linkerului peptidic" este Gly. În consecinţă, linkerul peptidic menţionat poate consta din aminoacidul unic Gly. Un alt exemplu realizare preferat al unui linker peptidic este caracterizat prin secvenţa de aminoacizi Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, adică Gly4Ser (SECV ID NR.: 1), sau polimeri ai acestuia, adică (Gly4Ser)x, în care x este un număr întreg de 1 sau mai mare (de ex. 2 sau 3). Linkeri preferaţi sunt descrişi în SECV ID NR: 1-9. Caracteristicile linkerului peptidic menţionat, care cuprind absenţa promovării structurilor secundare, sunt cunoscute în domeniu şi sunt descrise de ex. în Dall'Acqua şi colab. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle şi colab. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) şi Raag şi Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Sunt de preferat linkeri peptidici care, în plus, nu promovează nici o structură secundară. Legarea domeniilor menţionate unul la altul poate fi furnizată, de ex., prin inginerie genetică, aşa cum este descris în exemple. Metodele de preparare a constructelor bispecifice cu un singur lanţ fuzionate şi legate operativ şi de exprimare a acestora în celule sau bacterii de mamifere sunt bine-cunoscute în domeniu (de ex. WO 99/54440 sau Sambrook şi colab., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).

Aşa cum este descris aici mai sus, invenţia furnizează un exemplu de realizare preferat în care constructul de anticorp este într-un format selectat din grupul constând din (scFv)2, mAb cu domeniu unic scFv, diacorpi şi oligomeri ai oricăruia dintre aceste formate.

Conform unui exemplu de realizare deosebit de preferat, şi aşa cum este documentat în exemplele anexate, constructul de anticorp conform invenţiei este un "construct de anticorp bispecific cu lanţ unic", mai preferabil un "Fv cu lanţ unic" bispecific (scFv). Deşi cele două domenii ale fragmentului Fv, VL şi VH, sunt codificate de gene separate, ele pot fi unite, folosind metode recombinante, printr-un linker sintetic - aşa cum este descris mai sus - care le permite să fie făcute ca un singur lanţ proteic în care regiunile VL şi VH se împerechează pentru a forma o moleculă monovalentă; a se vedea, de ex., Huston şi colab. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Aceste fragmente de anticorpi sunt obţinute folosind tehnici convenţionale cunoscute de specialiştii în domeniu, iar fragmentele sunt evaluate cu privire la funcţionare în acelaşi mod ca şi anticorpii întregi sau de lungime completă. Un fragment variabil cu un singur lanţ (scFv) este, prin urmare, o proteină de fuziune a regiunii variabile a lanţului greu (VH) şi a lanţului uşor (VL) de imunoglobuline, de obicei conectată cu o peptidă scurtă de legătură de aproximativ zece până la aproximativ 25 aminoacizi, preferabil aproximativ 15 până la 20 de aminoacizi. Linkerul este de obicei bogat în glicină pentru flexibilitate, precum şi serină sau treonină pentru solubilitate şi poate conecta fie capătul N-terminal al VH cu capătul C-terminal al VL, fie viceversa. Această proteină păstrează specificitatea imunoglobulinei originale, în ciuda îndepărtării regiunilor constante şi a introducerii linkerului.

Moleculele bispecifice cu un singur lanţ sunt cunoscute în domeniu şi sunt descrise în WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Löffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Tehnicile descrise pentru producerea de anticorpi cu un singur lanţ (a se vedea, printre altele, Brevetul SUA 4.946.778, Kontermann şi Dübel (2010), loc. cit. şi Little (2009), loc. cit.) pot fi adaptate pentru a produce constructe de anticorpi cu lanţ unic care recunosc în mod specific (o) ţintă(e) aleasă(e).

Fragmente variabile bivalente (numite şi divalente) sau bispecifice cu un singur lanţ (bi-scFv sau di-scFv având formatul (scFv)2 pot fi proiectate prin legarea a două molecule scFv (de ex. cu linkeri aşa cum este descris mai sus). Dacă aceste două molecule scFv au aceeaşi specificitate de legare, molecula (scFv)2 rezultată se va numi de preferinţă bivalentă (adică are două valenţe pentru acelaşi epitop ţintă). Dacă cele două molecule scFv au specificităţi de legare diferite, molecula (scFv)2 rezultată va fi, de preferinţă, numită bispecifică. Legarea poate fi realizată prin producerea unui singur lanţ peptidic cu două regiuni VH şi două regiuni VL, producând scFv tandem (a se vedea de ex. Kufer P. şi colab., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). O altă posibilitate este crearea de molecule scFv cu peptide linker care sunt prea scurte pentru ca cele două regiuni variabile să se plieze împreună (de ex. aproximativ cinci aminoacizi), forţând scFv-urile să dimerizeze. Acest tip este cunoscut sub numele de diacorpi (a se vedea de ex. Hollinger, Philipp şi colab., (July 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8.).

Conform unui exemplu de realizare preferat al constructului de anticorp conform invenţiei, lanţul greu (VH) şi lanţul uşor (VL) al unui domeniu de legare care se leagă fie la antigenul ţintă MSLN, fie la CD3 nu sunt conectate direct printr-un linker peptidic descris mai sus, ci domeniul de legare se formează datorită formării unei molecule bispecifice aşa cum este descris pentru diacorp. Astfel, lanţul VH al domeniului de legare CD3 poate fi fuzionat la VL al domeniului de legare MSLN prin intermediul unui astfel de linker peptidic, în timp ce lanţul VH al domeniului de legare MSLN este fuzionat la VL al domeniului de legare CD3 printr-un astfel de linker peptidic.

Anticorpii cu un singur domeniu cuprind doar un domeniu variabil de anticorp (monomeric) care este capabil să se lege selectiv la un antigen specific, independent de alte regiuni sau domenii V. Primii anticorpi cu un singur domeniu au fost proiectaţi din anticorpi cu lanţ greu găsiţi în camelide şi aceştia sunt numiţi fragmente VHH. Peştii cartilaginoşi au, de asemenea, anticorpi cu lanţ greu (IgNAR) din care se pot obţine anticorpi cu un singur domeniu numiţi fragmente VNAR. O abordare alternativă este împărţirea domeniilor variabile dimerice de imunoglobulinele comune de ex. de la oameni sau rozătoare în monomeri, obţinând astfel VH sau VL ca un Ab cu un singur domeniu. Deşi majoritatea cercetărilor privind anticorpii cu un singur domeniu se bazează în prezent pe domenii variabile ale lanţului greu, nanocorpii derivaţi din lanţurile uşoare s-au dovedit, de asemenea, a se lega în mod specific de epitopii ţintă. Exemplele de anticorpi cu un singur domeniu se numesc sdAb, nanocorpi sau anticorpi cu un singur domeniu variabil.

A (mAb cu un singur domeniu)2 este, prin urmare, un construct de anticorpi monoclonali compus din (cel puţin) doi anticorpi monoclonali cu un singur domeniu, care sunt selectaţi individual din grupul care cuprinde VH, VL, VHH şi VNAR. Linkerul este, de preferinţă, sub forma unui linker peptidic. În mod similar, un "mAb cu un singur domeniu scFv" este un construct de anticorp monoclonal compus din cel puţin un anticorp cu un singur domeniu aşa cum este descris mai sus şi o moleculă scFv aşa cum este descrisă mai sus. Din nou, linkerul este, de preferinţă, sub forma unui linker peptidic.

Prezenta invenţie furnizează un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă la un epitop al MSLN care este cuprins în regiunea descrisă în SECV ID NR: 245 (cluster 2+3), în care primul domeniu de legare al constructului de anticorp bispecific cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR- H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din:

a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 161, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 162, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 163, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 164, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 165 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 166;

b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 171, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 172, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 173, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 174, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 175 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 176;

c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 181, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 182, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 183, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 184, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 185 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 186;

d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 191, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 192, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 193, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 194, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 195 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 196;

e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 201, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 202, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 203, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 204, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 205 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 206.

Într-un exemplu de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei cuprinde o regiune VH selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 177, SECV ID NR: 187, SECV ID NR: 197, şi SECV ID NR: 207.

Într-un alt exemplu de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei cuprinde o regiune VL selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 178, SECV ID NR: 188, SECV ID NR: 198, şi SECV ID NR: 208.

Într-un alt exemplu de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei cuprinde o regiune VH şi o regiune VL selectate din grupul constând din perechi formate dintr-o regiune VH şi o regiune VL aşa cum este descris în SECV ID NR: 167+168, SECV ID NR: 177+178, SECV ID NR: 187+188, SECV ID NR: 197+198, şi SECV ID NR: 207+208.

Într-un alt exemplu de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei cuprinde o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209.

Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă la un epitop al MSLN care este cuprins în regiunea descrisă în SECV ID NR: 244 (cluster 1+2).

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp bispecific dezvăluit aici poate cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 după cum urmează:

(a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 151, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 152, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 153, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 154, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 155 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 156; sau

(b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 221, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 222, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 223, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 224, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 225 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 226.

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp dezvăluit aici poate cuprinde o regiune VH descrisă în SECV ID NR: 157 sau SECV ID NR: 227.

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp dezvăluit aici poate cuprinde o regiune VL descrisă în SECV ID NR: 158, şi SECV ID NR: 228.

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp dezvăluit aici poate cuprinde o regiune VH şi o regiune VL selectate din grupul constând din perechi formate dintr-o regiune VH şi o regiune VL aşa cum este descris în SECV ID NR: 157+158, şi SECV ID NR: 227+228.

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp dezvăluit aici poate cuprinde o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 159, şi SECV ID NR: 229.

Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă la un epitop al MSLN care este cuprins în regiunea descrisă în SECV ID NR: 241 (cluster 4).

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp bispecific dezvăluit aici poate cuprinde o regiune VH care cuprinde CDR-H1 aşa cum este descris în SECV ID NR: 211, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 212, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 213, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 214, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 215 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 216.

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp dezvăluit aici poate cuprinde o regiune VH descrisă în SECV ID NR: 217.

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp dezvăluit aici poate cuprinde o regiune VL descrisă în SECV ID NR: 218.

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp dezvăluit aici poate cuprinde o regiune VH şi o regiune VL aşa cum sunt descrise în SECV ID NR: 217+218.

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp dezvăluit aici poate cuprinde o polipeptidă aşa cum este descrisă în SECV ID NR: 219.

Un alt construct de anticorp dezvăluit aici poate fi, de asemenea, definit ca un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare (de preferinţă uman) care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare concurează pentru legarea cu un anticorp selectat din grupul constând din MS-3, MS-4 şi MS-5, adică, un anticorp care cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din cele descrise mai sus.

Celulele T sau limfocitele T sunt un tip de limfocite (în sine un tip de globule albe) care joacă un rol central în imunitatea mediată de celule. Există mai multe subseturi de celule T, fiecare cu o funcţie distinctă. Celulele T se pot distinge de alte limfocite, cum ar fi celulele B şi celulele NK, prin prezenţa unui receptor de celule T (TCR) pe suprafaţa celulei. TCR este responsabil pentru recunoaşterea antigenilor legaţi de moleculele complexului de histocompatibilitate majoră (MHC) şi este compus din două lanţuri de proteine ​​diferite. În 95% din celulele T, TCR constă dintr-un lanţ alfa (α) şi unul beta (β). Când TCR se angajează cu peptida antigenică şi MHC (complexul peptidă/MHC), limfocitul T este activat printr-o serie de evenimente biochimice mediate de enzime asociate, co-receptori, molecule adaptoare specializate şi factori de transcripţie activaţi sau eliberaţi

Complexul receptor CD3 este un complex proteic şi este compus din patru lanţuri. La mamifere, complexul conţine un lanţ CD3γ (gamma), un lanţ CD3δ (delta) şi două lanţuri CD3ε (epsilon). Aceste lanţuri se asociază cu receptorul de celule T (TCR) şi aşa-numitul lanţ ζ (zeta) pentru a forma complexul CD3 al receptorului de celule T şi pentru a genera un semnal de activare în limfocitele T. Lanţurile CD3γ (gamma), CD3δ (delta) şi CD3ε (epsilon) sunt proteine de suprafaţă celulară foarte înrudite ale superfamiliei imunoglobulinei conţinând un singur domeniu de imunoglobulină extracelulară. Cozile intracelulare ale moleculelor CD3 conţin un singur motiv conservat cunoscut sub numele de motiv de activare pe bază de tirozină imunoreceptoare sau ITAM pe scurt, care este esenţial pentru capacitatea de semnalizare a TCR. Molecula epsilon CD3 este o polipeptidă care la om este codificată de gena CD3E care rezidă pe cromozomul 11. Cel mai preferat epitop al epsilon CD3 este cuprins în resturile de aminoacizi 1-27 din domeniul extracelular epsilon CD3 uman.

Liza redirecţionată a celulelor ţintă prin recrutarea celulelor T de către un construct de anticorp multispecific, cel puţin bispecific, implică formarea sinapselor citolitice şi eliberarea de perforină şi granzime. Celulele T angajate sunt capabile de liza celulelor ţintă în serie şi nu sunt afectate de mecanismele de evadare imună care interferează cu procesarea şi prezentarea antigenului peptidic sau diferenţierea celulelor T clonale; a se vedea, de exemplu, WO 2007/042261.

Citotoxicitatea mediată de constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 poate fi măsurată în diferite moduri. A se vedea Exemplele 5. Celulele efectoare pot fi de ex. celule T CD8 pozitive stimulate îmbogăţite (umane) sau celule mononucleare (umane) din sânge periferic nestimulat (uman) (PBMC). Dacă celulele ţintă sunt de origine macac sau exprimă sau sunt transfectate cu MSLN de macac, celulele efectoare ar trebui să fie, de asemenea, de origine macac, cum ar fi o linie de celule T de macac, de ex. 4119LnPx. Celulele ţintă ar trebui să exprime (cel puţin domeniul extracelular al) MSLN, de ex. MSLN umană sau de macac. Celulele ţintă pot fi o linie celulară (cum ar fi CHO) care este transfectată stabil sau tranzitoriu cu MSLN, de ex. MSLN umană sau de macac. Alternativ, celulele ţintă pot fi o linie celulară expresoare naturală pozitivă MSLN, cum ar fi linia de celule umane OVCAR-8. De obicei, valorile CE50 sunt de aşteptat să fie mai mici cu liniile celulare ţintă care exprimă niveluri mai mari de MSLN pe suprafaţa celulei. Raportul efector la celulă ţintă (E:T) este de obicei aproximativ 10:1, dar poate varia, de asemenea. Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 poate fi măsurată într-un test de eliberare în crom 51 (timp de incubaţie de aproximativ 18 ore) sau într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS (timp de incubaţie de aproximativ 48 de ore). Modificări ale timpului de incubaţie a testului (reacţie citotoxică) sunt, de asemenea, posibile. Alte metode de măsurare a citotoxicităţii sunt bine-cunoscute persoanei calificate şi cuprind teste MTT sau MTS, teste bazate pe ATP, inclusiv teste bioluminescente, testul de sulforodamină B (SRB), testul WST, testul clonogen şi tehnologia ECIS.

Activitatea citotoxică mediată de constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 din prezenta invenţie este măsurată, de preferinţă, într-un test de citotoxicitate pe bază de celule. Poate fi, de asemenea, măsurată printr-un test de eliberare în crom 51. Este reprezentată de valoarea CE50, care corespunde jumătăţii concentraţiei efective maxime (concentraţia constructului de anticorp care induce un răspuns citotoxic la jumătatea distanţei dintre valoarea de referinţă şi maximă). De preferinţă, valoarea CE50 a constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 este ≤5000 pM sau ≤4000 pM, mai preferabil ≤3000 pM sau ≤2000 pM, chiar mai preferabil ≤1000 pM sau ≤500 pM, chiar mai preferabil ≤400 pM sau ≤300 pM, chiar mai preferabil ≤200 pM, chiar mai preferabil ≤100 pM, chiar mai preferabil ≤50 pM, chiar mai preferabil ≤20 pM sau ≤10 pM, şi cel mai preferabil ≤5 pM.

Valorile CE50 date mai sus pot fi măsurate în diferite teste. Persoana calificată este conştientă că valoarea CE50 poate fi de aşteptat să fie mai mică atunci când celulele T CD8+ stimulate/îmbogăţite sunt utilizate ca celule efectoare, în comparaţie cu PBMC nestimulate. În plus, poate fi de aşteptat ca valorile CE50 să fie mai mici atunci când celulele ţintă exprimă un număr mare de antigen ţintă în comparaţie cu un şobolan cu exprimare ţintă scăzută. De exemplu, atunci când celulele T CD8+ umane stimulate/îmbogăţite sunt utilizate ca celule efectoare (şi fie celule transfectate cu MSLN, cum ar fi celulele CHO, fie o linie de celule umane pozitive pentru MSLN OVCAR-8 sunt folosite ca celule ţintă), valoarea CE50 a constructului de anticorp bispecific MSLN xCD3 este, de preferinţă, ≤1000 pM, mai preferabil ≤500 pM, chiar mai preferabil ≤250 pM, chiar mai preferabil ≤100 pM, chiar mai preferabil ≤50 pM, chiar mai preferabil ≤10 pM şi cel mai preferabil ≤5 pM. Când PBMC-urile umane sunt utilizate ca celule efectoare, valoarea CE50 a constructului de anticorp bispecific MSLNxCD3 este, de preferinţă, ≤5000 pM sau ≤4000 pM (în special atunci când celulele ţintă sunt o linie celulară umană MSLN pozitivă OVCAR-8), mai preferabil ≤2000 pM (în special atunci când celulele ţintă sunt celule transfectate cu MSLN, cum ar fi celulele CHO), mai preferabil ≤1000 pM sau ≤500 pM, chiar mai preferabil ≤200 pM, chiar mai preferabil ≤150 pM, chiar mai preferabil ≤100 pM, şi cel mai preferabil ≤50 pM sau mai mică. Atunci când o linie de celule T de macac, cum ar fi LnPx4119, este utilizată ca celule efectoare şi o linie de celule transfectate cu MSLN de macac, cum ar fi celulele CHO, este utilizată ca linie de celule ţintă, valoarea CE50 a constructului de anticorp bispecific MSLN xCD3 este, de preferinţă, ≤2000 pM sau ≤1500 pM, mai preferabil ≤1000 pM sau ≤500 pM, chiar mai preferabil ≤300 pM sau ≤250 pM, chiar mai preferabil ≤100 pM, şi cel mai preferabil ≤50 pM.

De preferinţă, constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 din prezenta invenţie nu induc/mediază liza sau nu induc/mediază în esenţă liza celulelor negative MSLN, cum ar fi celulele CHO. Termenul "nu induc liza", "nu induc în esenţă liza", "nu mediază liza" sau "nu mediază în esenţă liza" înseamnă că un construct de anticorp conform prezentei invenţii nu induce sau mediază liza pentru mai mult de 30%, preferabil nu mai mult de 20%, mai preferabil nu mai mult de 10%, în mod deosebit de preferabil nu mai mult de 9%, 8%, 7%, 6% sau 5% din celulele negative MSLN, prin care liza unei linii celulare umane pozitive MSLN OVCAR-8 (a se vedea mai sus) este setată să fie 100%. Acest lucru se aplică de obicei pentru concentraţiile de construct de anticorp de până la 500 nM. Persoana calificată ştie cum să măsoare liza celulară fără alte precizări. Mai mult, prezenta specificaţie dă instrucţiuni specifice cu privire la modul în care se măsoară liza celulară.

Diferenţa de activitate citotoxică dintre izoforma monomerică şi dimerică a constructelor individuale de anticorpi bispecifici MSLN xCD3 este denumită "decalaj de potenţă". Acest decalaj de potenţă poate fi calculat, de ex. ca raport între valorile CE50 ale formei monomerică şi dimerică a moleculei, a se vedea Exemplul 5.8. Decalajele de putere ale constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 din prezenta invenţie sunt, de preferinţă, ≤ 5, mai preferabil ≤ 4, chiar mai preferabil ≤ 3, chiar mai preferabil ≤ 2, mai preferabil ≤ 1, şi cel mai preferabil ≤ 0,3.

Primul şi/sau cel de al doilea (sau orice alt) domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei este, de preferinţă, specific între specii pentru membrii ordinului mamifer al primatelor. Domeniile de legare la CD3 specifice între specii sunt, de exemplu, descrise în WO 2008/119567. Conform unui exemplu de realizare, primul şi/sau al doilea domeniu de legare, în plus faţă de legarea la MSLN umană şi, respectiv, CD3 uman, se vor lega de asemenea de MSLN / CD3 de primate, inclusiv (dar fără a se limita la) primate din lumea nouă (cum ar fi Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus sau Saimiri sciureus), primate din lumea veche (cum ar fi babuini şi macaci), giboni, urangutani şi hominine non-umane. Este avut în vedere ca primul domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei care se leagă la MSLN umană de pe suprafaţa unei celule ţintă se leagă, de asemenea, cel puţin la MSLN de macac şi/sau al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman de pe suprafaţa unei celule T se leagă, de asemenea, cel puţin la CD3 de macac. Un macac preferat este Macaca fascicularis. Macaca mulatta (Rhesus) este de asemenea avut în vedere.

Într-un aspect al invenţiei, primul domeniu de legare se leagă la MSLN umană şi în plus se leagă la MSLN de macac, cum ar fi MSLN de Macaca fascicularis, şi mai preferabil, la MSLN de macac exprimat pe celulele de macac de suprafaţă. O MSLN preferată de Macaca fascicularis este descrisă în SECV ID NR: 234. Afinitatea primului domeniu de legare pentru MSLN de macac este, de preferinţă, ≤15 nM, mai preferabil ≤10 nM, chiar mai preferabil ≤5 nM, chiar mai preferabil ≤1 nM, chiar mai preferabil ≤ 05 nM, chiar mai preferabil ≤0,1 nM, şi cel mai preferabil ≤0,05 nM sau chiar ≤0,01 nM.

De preferinţă, decalajul de afinitate al constructelor de anticorpi conform invenţiei pentru legarea MSLN de macac faţă de MSLN umană [ma MSLN:hu MSLN] (după cum s-a determinat de ex. prin BiaCore sau prin analiză Scatchard) este <100, preferabil <20, mai preferabil <15, în continuare preferabil <10, chiar mai preferabil <8, mai preferabil <6 şi cel mai preferabil <2. Intervalele preferate pentru decalajul de afinitate al constructelor de anticorpi conform invenţiei pentru legarea MSLN de macac faţă de MSLN umană sunt între 0,1 şi 20, mai preferabil între 0,2 şi 10, chiar mai preferabil între 0,3 şi 6, chiar mai preferabil între 0,5 şi 3 sau între 0,5 şi 2,5 şi cel mai preferabil între 0,5 şi 2 sau între 0,6 şi 2. A se vedea Exemplele 3.

Prin urmare, în conformitate cu această invenţie, sunt preferate constructe de anticorpi care cuprind un liant MSLN pentru clusterul de epitop 2+3, care se arată că au un decalaj de afinitate ≤15. În plus, sunt preferate constructe de anticorpi care cuprind un liant MSLN pentru clusterul de epitop 2+3 având un decalaj de afinitate ≤6, cum ar fi constructe de anticorpi bispecifici pe bază de MS-3, MS-4 sau MS-5.

Într-un exemplu de realizare a constructului de anticorp conform invenţiei, al doilea domeniu de legare se leagă la epsilon CD3 uman şi la epsilon CD3 de Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus sau Saimiri sciureus. De preferinţă, al doilea domeniu de legare se leagă de un epitop extracelular al acestor lanţuri epsilon CD3. Este avut în vedere, de asemenea, că al doilea domeniu de legare se leagă la un epitop extracelular al lanţului epsilon CD3 uman şi al Macaca. Cel mai preferat epitop al epsilon CD3 este cuprins în resturile de aminoacizi 1-27 din domeniul extracelular epsilon CD3 uman. Chiar mai specific, epitopul cuprinde cel puţin secvenţa de aminoacizi Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Callithrix jacchus şi Saguinus oedipus sunt ambele primate din lumea nouă aparţinând familiei de Callitrichidae, in timp ce Saimiri sciureus este o primată din lumea nouă aparţinând familiei de Cebidae.

Este de preferat în special pentru constructul de anticorp din prezenta invenţie ca al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T să cuprindă o regiune VL care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate dintre:

(a) CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 27 din WO 2008/119567, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 28 din WO 2008/119567 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 29 din WO 2008/119567;

(b) CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 117 din WO 2008/119567, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 118 din WO 2008/119567 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 119 din WO 2008/119567; şi

(c) CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 153 din WO 2008/119567, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 154 din WO 2008/119567 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 155 din WO 2008/119567.

Într-un exemplu de realizare preferat alternativ al constructului de anticorp din prezenta invenţie, al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T cuprinde o regiune VH care cuprinde CDR-H 1, CDR-H2 şi CDR-H3 selectate dintre:

(a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 12 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 13 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 14 din WO 2008/119567;

(b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 30 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 31 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 32 din WO 2008/119567;

(c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 48 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 49 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 50 din WO 2008/119567;

(d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 66 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 67 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 68 din WO 2008/119567;

(e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 84 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 85 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 86 din WO 2008/119567;

(f) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 102 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 103 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 104 din WO 2008/119567;

(g) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 120 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 121 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 122 din WO 2008/119567;

(h) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 138 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 139 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 140 din WO 2008/119567;

(i) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 156 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 157 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 158 din WO 2008/119567; şi

(j) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 174 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 175 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 176 din WO 2008/119567.

În plus, pentru constructul de anticorp din prezenta invenţie este de preferat ca al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T să cuprindă o regiune VL selectată din grupul constând dintr-o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 18, SECV ID NR: 27, SECV ID NR: 36, SECV ID NR: 45, SECV ID NR: 54, SECV ID NR: 63, SECV ID NR: 72, SECV ID NR: 81, SECV ID NR: 90, SECV ID NR: 99, şi SECV ID NR: 102 (a se vedea, de asemenea, SECV ID NR: 35, 39, 125, 129, 161 sau 165 din WO 2008/119567).

Este de preferat ca al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T să cuprindă o regiune VH selectată din grupul constând dintr-o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 17, SECV ID NR: 26, SECV ID NR: 35, SECV ID NR: 44, SECV ID NR: 53, SECV ID NR: 62, SECV ID NR: 71, SECV ID NR: 80, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 98, şi SECV ID NR: 101 (a se vedea, de asemenea, SECV ID NR: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 sau 181 din WO 2008/119567).

Mai preferabil, constructul de anticorp din prezenta invenţie este caracterizat de al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T cuprinzând o regiune VL şi o regiune VH selectată din grupul constând din:

(a) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 17 sau 21 din WO 2008/119567 şi o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 15 sau 19 din WO 2008/119567;

(b) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 35 sau 39 din WO 2008/119567 şi o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 33 sau 37 din WO 2008/119567;

(c) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 53 sau 57 din WO 2008/119567 şi o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 51 sau 55 din WO 2008/119567;

(d) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 71 sau 75 din WO 2008/119567 şi o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 69 sau 73 din WO 2008/119567;

(e) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 89 sau 93 din WO 2008/119567 şi o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 87 sau 91 din WO 2008/119567;

(f) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 107 sau 111 din WO 2008/119567 şi o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 105 sau 109 din WO 2008/119567;

(g) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 125 sau 129 din WO 2008/119567 şi o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 123 sau 127 din WO 2008/119567;

(h) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 143 sau 147 din WO 2008/119567 şi o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 141 sau 145 din WO 2008/119567;

(i) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 161 sau 165 din WO 2008/119567 şi o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 159 sau 163 din WO 2008/119567; şi

(j) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 179 sau 183 din WO 2008/119567 şi o regiune VH cum s-a descris în SECV ID NR: 177 sau 181 din WO 2008/119567.

De asemenea, preferat în legătură cu constructul de anticorp din prezenta invenţie este un al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T cuprinzând o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 102 şi o regiune VH cum s-a descris SECV ID NR: 101.

Conform unui exemplu de realizare preferat al constructului de anticorp din prezenta invenţie, domeniile de legare şi în special al doilea domeniu de legare (care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T) au următorul format: Perechile de regiuni VH şi regiuni VL sunt în formatul unui anticorp cu un singur lanţ (scFv). Regiunile VH şi VL sunt aranjate în ordinea VH-VL sau VL-VH. Este de preferat ca regiunea VH să fie poziţionată N-terminal la o secvenţă linker, şi regiunea VL să fie poziţionată C-terminal la o secvenţă linker.

Un exemplu de realizare preferat al constructului de anticorp descris mai sus din prezenta invenţie este caracterizat prin al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T cuprinzând o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103 (a se vedea, de asemenea, SECV ID NR: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 sau 187 din WO 2008/119567).

Este avut în vedere, de asemenea, că constructul de anticorp conform invenţiei are, în plus faţă de funcţia sa de a se lega la moleculele ţintă MSLN şi CD3, o funcţie suplimentară. În acest format, constructul de anticorp este un construct de anticorp trifuncţional sau multifuncţional prin ţintirea celulelor ţintă prin legarea la MSLN, medierea activităţii celulelor T citotoxice prin legarea CD3 şi furnizarea unei funcţii suplimentare, cum ar fi un domeniu constant Fc complet funcţional care mediază citotoxicitatea celulară dependentă de anticorp prin recrutarea de celule efectoare, cum ar fi celulele NK, o etichetă (fluorescentă etc.), un agent terapeutic, cum ar fi o toxină sau un radionuclid şi/sau mijloace de creştere a timpului de înjumătăţire plasmatică etc.

Exemple de mijloace de creştere a timpului de înjumătăţire plasmatică a constructelor de anticorpi conform invenţiei includ peptide, proteine sau domenii de proteine, care sunt fuzionate sau ataşate în alt mod la constructele de anticorpi. Grupul de peptide, proteine sau domenii proteice include peptide care se leagă la alte proteine cu profil farmacocinetic preferat în corpul uman, cum ar fi albumina serică (a se vedea WO 2009/127691). Un concept alternativ al unor astfel de peptide care extind timpul de înjumătăţire include peptidele care se leagă de receptorul Fc neonatal (FcRn, a se vedea WO 2007/098420), care poate fi de asemenea utilizat în constructele prezentei invenţii. Conceptul de ataşare a unor domenii mai mari de proteine sau proteine complete include de ex. fuziunea albuminei serice umane, a variantelor sau mutanţilor de albumină serică umană (a se vedea WO 2011/051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) sau domenii ale acestora precum şi fuziunea regiunii constante a imunoglobulinelor (domenii Fc) şi variante ale acestora. Astfel de variante ale domeniilor Fc pot fi optimizate/modificate pentru a permite împerecherea dorită de dimeri sau multimeri, pentru a elimina legarea receptorului Fc (de exemplu, receptorul Fcy) sau din alte motive. Un alt concept cunoscut în domeniu pentru a prelungi timpul de înjumătăţire al compuşilor proteici mici din corpul uman este pegilarea acelor compuşi, cum ar fi constructul de anticorp din prezenta invenţie.

Într-un exemplu de realizare preferat, constructul de anticorp conform invenţiei este descris după cum urmează:

(a) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209,; o un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; şi o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi o opţional, o etichetă His, cum ar fi cea descrisă în SECV ID NR 10;

(b) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine pornind de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209; o un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; o opţional, un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 104-134; şi o opţional, o etichetă His, cum ar fi cea descrisă în SECV ID NR 10;

(c) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi QRFVTGHFGGLX1PANG (SECV ID NR: 135) unde X1 este Y sau H; şi o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209; o un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi QRFVTGHFGGLHPANG (SECV ID NR: 137) sau QRFCTGHFGGLHPCNG (SECV ID NR: 139); şi o opţional, o etichetă His, cum ar fi cea descrisă în SECV ID NR 10;

(d) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 17, SECV ID NR: 26, SECV ID NR: 35, SECV ID NR: 44, SECV ID NR: 53, SECV ID NR: 62, SECV ID NR: 71, SECV ID NR: 80, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 98, şi SECV ID NR: 101; o un linker peptidic având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 8; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 178, SECV ID NR: 188, SECV ID NR: 198, şi SECV ID NR: 208 şi un reziduu de serină la capătul C-terminal; o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 140; şi o o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal: § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 177, SECV ID NR: 187, SECV ID NR: 197, şi SECV ID NR: 207; § un linker peptidic având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 8; § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 18, SECV ID NR: 27, SECV ID NR: 36, SECV ID NR: 45, SECV ID NR: 54, SECV ID NR: 63, SECV ID NR: 72, SECV ID NR: 81, SECV ID NR: 90, SECV ID NR: 99, şi SECV ID NR: 102 şi un reziduu de serină la capătul C-terminal; § o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 141;

(e) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 17, SECV ID NR: 26, SECV ID NR: 35, SECV ID NR: 44, SECV ID NR: 53, SECV ID NR: 62, SECV ID NR: 71, SECV ID NR: 80, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 98, şi SECV ID NR: 101; o un linker peptidic având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 8; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 178, SECV ID NR: 188, SECV ID NR: 198, şi SECV ID NR: 208; o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 142; şi o o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal: § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 177, SECV ID NR: 187, SECV ID NR: 197, şi SECV ID NR: 207; § un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 8; § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 18, SECV ID NR: 27, SECV ID NR: 36, SECV ID NR: 45, SECV ID NR: 54, SECV ID NR: 63, SECV ID NR: 72, SECV ID NR: 81, SECV ID NR: 90, SECV ID NR: 99, şi SECV ID NR: 102 şi un reziduu de serină la capătul C-terminal; § o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 143;

(f) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209; o un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; şi o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 144; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 145;

(g) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 146; şi o o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal: § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi § o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 147;

(h) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 148; şi o o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal: § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi § o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 149; sau

(i) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209; o un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; şi o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 150.

De asemenea, aici sunt dezvăluite constructe de anticorpi descrise după cum urmează:

(a) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 219, şi SECV ID NR: 229; o un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; şi o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi o opţional, o etichetă His, cum ar fi cea descrisă în SECV ID NR 10;

(b) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine pornind de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 219, şi SECV ID NR: 229; o un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; o opţional, un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 104-134; şi o opţional, o etichetă His, cum ar fi cea descrisă în SECV ID NR 10;

(c) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi QRFVTGHFGGLX1PANG (SECV ID NR: 135) unde X1 este Y sau H; şi o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 219, şi SECV ID NR: 229; o un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi QRFVTGHFGGLHPANG (SECV ID NR: 137) sau QRFCTGHFGGLHPCNG (SECV ID NR: 139); şi o opţional, o etichetă His, cum ar fi cea descrisă în SECV ID NR 10;

(d) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 17, SECV ID NR: 26, SECV ID NR: 35, SECV ID NR: 44, SECV ID NR: 53, SECV ID NR: 62, SECV ID NR: 71, SECV ID NR: 80, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 98, şi SECV ID NR: 101; o un linker peptidic având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 8; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 158, SECV ID NR: 218, şi SECV ID NR: 228 şi un reziduu de serină la capătul C-terminal; o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 140; şi o o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal: § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 157, SECV ID NR: 217, şi SECV ID NR: 227; § un linker peptidic având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 8; § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 18, SECV ID NR: 27, SECV ID NR: 36, SECV ID NR: 45, SECV ID NR: 54, SECV ID NR: 63, SECV ID NR: 72, SECV ID NR: 81, SECV ID NR: 90, SECV ID NR: 99, şi SECV ID NR: 102 şi un reziduu de serină la capătul C-terminal; § o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 141;

(e) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 17, SECV ID NR: 26, SECV ID NR: 35, SECV ID NR: 44, SECV ID NR: 53, SECV ID NR: 62, SECV ID NR: 71, SECV ID NR: 80, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 98, şi SECV ID NR: 101; o un linker peptidic având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 8; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 158, SECV ID NR: 218, şi SECV ID NR: 228; o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 142; şi o o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal: § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 157, SECV ID NR: 217, şi SECV ID NR: 227; § un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 8; § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 18, SECV ID NR: 27, SECV ID NR: 36, SECV ID NR: 45, SECV ID NR: 54, SECV ID NR: 63, SECV ID NR: 72, SECV ID NR: 81, SECV ID NR: 90, SECV ID NR: 99, şi SECV ID NR: 102 şi un reziduu de serină la capătul C-terminal; § o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 143;

(f) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 219, şi SECV ID NR: 229; o un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; şi o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 144; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 145;

(g) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 219, şi SECV ID NR: 229; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 146; şi o o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal: § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi § o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 147;

(h) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 219, şi SECV ID NR: 229; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 148; şi o o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal: § o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi § o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 149; sau

(i) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 219, şi SECV ID NR: 229; o un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; şi o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 150.

După cum s-a descris mai sus, mai multe constructe de anticorpi preferate ale invenţiei sunt modificate prin fuziune cu un alt fragment, cum ar fi albumină sau variante de albumină. Dacă aceste constructe de fuziune sunt caracterizate pentru proprietăţile lor, în special afinitatea ţintă sau activitatea citotoxică, persoana de specialitate va fi conştientă de faptul că constructele de fuziune similare sau constructele de anticorpi bispecifici nemodificate pot fi de aşteptat să aibă proprietăţi similare (sau chiar mai bune). De exemplu, dacă un construct de anticorp bispecific fuzionat cu albumină are o activitate citotoxică apreciabilă sau de dorit sau o afinitate ţintă, poate fi de aşteptat ca o activitate citotoxică/afinitate ţintă identică/similară sau chiar mai mare să fie observată pentru constructul fără albumină.

Conform unui alt exemplu de realizare preferat, constructul de anticorp bispecific al invenţiei cuprinde (în plus faţă de cele două domenii de legare) un al treilea domeniu care cuprinde doi monomeri polipeptidici, fiecare cuprinzând o balama, un domeniu CH2 şi un domeniu CH3, în care respectivele două polipeptide (sau monomeri polipeptidici) sunt fuzionate una cu cealaltă prin intermediul unui linker peptidic. De preferinţă, al treilea domeniu cuprinde într-o ordine N- la C-terminal: balama-CH2-CH3-linker-balama-CH2-CH3. Secvenţele de aminoacizi preferate pentru al treilea domeniu menţionat sunt descrise în SECV ID NR: 260-267. Fiecare dintre doi monomeri polipeptidici menţionaţi are, de preferinţă, o secvenţă de aminoacizi care este selectată din grupul constând din SECV ID NR: 252-259, sau care este cel puţin 90% identică cu acele secvenţe. Într-un alt exemplu de realizare preferat, primul şi al doilea domeniu de legare a constructului de anticorp bispecific al invenţiei sunt fuzionate cu al treilea domeniu printr-un linker peptidic care este, de exemplu, selectat din grupul constând din SECV ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 şi 9.

În conformitate cu prezenta invenţie, o „balama» este o regiune balama IgG. Această regiune poate fi identificată prin analogie folosind numerotarea Kabat, a se vedea poziţiile 223-243 Kabat. În conformitate cu cele de mai sus, cerinţa minimă pentru o „balama» sunt reziduurile de aminoacizi corespunzătoare întinderii IgG1 de la D231 la P243 conform numerotării Kabat. Termenii CH2 şi CH3 se referă la regiunile constante 2 şi 3 ale lanţului greu al imunoglobulinei. Aceste regiuni pot fi, de asemenea, identificate prin analogie folosind numerotarea Kabat, a se vedea poziţiile Kabat 244-360 pentru CH2 şi poziţiile Kabat 361-478 pentru CH3. Se înţelege că există o oarecare variaţie între imunoglobuline în ceea ce priveşte regiunea lor Fc IgG1, regiunea Fc IgG2, regiunea Fc IgG3, regiunea Fc IgG4, regiunea Fc IgM, regiunea Fc IgA, regiunea Fc IgD şi regiunea Fc IgE (a se vedea, de ex., Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). Termenul monomer Fc se referă la ultimele două regiuni constante de lanţ greu ale IgA, IgD şi IgG şi la ultimele trei regiuni constante de lanţ greu ale IgE şi IgM. Monomerul Fc poate include, de asemenea, balama flexibilă N-terminală la aceste domenii. Pentru IgA şi IgM, monomerul Fc poate include lanţul J. Pentru IgG, porţiunea Fc cuprinde domeniile de imunoglobulină CH2 şi CH3 şi balama între primele două domenii şi CH2. Deşi limitele porţiunii Fc ale unei imunoglobuline pot varia, poate fi definit un exemplu pentru o porţiune Fc cu lanţ greu IgG umană care cuprinde o balama funcţională, domeniul CH2 şi CH3, de ex. pentru a cuprinde reziduuri D231 (ale domeniului balama) la P476 (a capătului C-terminal al domeniului CH3), sau D231 la L476, respectiv, pentru IgG4, în care numerotarea este conform Kabat.

Constructul de anticorp conform invenţiei poate cuprinde, prin urmare, într-o ordine de la N- la C-terminal:

(a) primul domeniu de legare;

(b) un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 2, 8 şi 9;

(c) al doilea domeniu de legare;

(d) un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1, 2, 4, 5, 6, 8 şi 9;

(e) primul monomer polipeptidic din al treilea domeniu (cuprinzând o balama, un domeniu CH2 şi un domeniu CH3);

(f) un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 301, 302, 303 şi 304; şi

(e) al doilea monomer polipeptidic din al treilea domeniu (cuprinzând o balama, un domeniu CH2 şi un domeniu CH3).

De asemenea, se preferă ca constructul de anticorp conform invenţiei să cuprindă într-o ordine de la N- la C-terminal:

• primul domeniu de legare având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209; • un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 2, 8 şi 9; • al doilea domeniu de legare având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103 (a se vedea, de asemenea, SECV ID NR: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 sau 187 din WO 2008/119567); • un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1, 2, 4, 5, 6, 8 şi 9; şi • al treilea domeniu având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 260-267.

De asemenea, aici sunt dezvăluite constructe de anticorpi care cuprind într-o ordine de la N- la C-terminal:

• primul domeniu de legare având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 219, şi SECV ID NR: 229; • un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 2, 8 şi 9; • al doilea domeniu de legare având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103 (a se vedea, de asemenea, SECV ID NR: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 sau 187 din WO 2008/119567); • un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1, 2, 4, 5, 6, 8 şi 9; şi • al treilea domeniu având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 260-267.

Constructul de anticorp descris aici cuprinde sau constă dintr-o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 268 la 299.

De asemenea, de preferinţă, într-un exemplu de realizare al invenţiei constructul de anticorp din prezenta invenţie cuprinde sau constă dintr-o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 276 la 287.

De asemenea, într-un exemplu de realizare preferat al invenţiei, constructul de anticorp din prezenta invenţie cuprinde sau constă dintr-o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 276, 280 şi 284, mai preferabil cuprinde sau constă dintr-o polipeptidă cum s-a descris în SECV ID NR: 280.

Modificările covalente ale constructelor de anticorpi sunt, de asemenea, incluse în cadrul acestei invenţii şi sunt în general, dar nu întotdeauna, efectuate post-translaţional. De exemplu, mai multe tipuri de modificări covalente ale constructului de anticorp sunt introduse în moleculă prin reacţia resturilor specifice de aminoacizi ale constructului de anticorp cu un agent organic de derivatizare care este capabil să reacţioneze cu lanţurile laterale selectate sau cu resturile N- sau C-terminale.

Reziduurile de cisteinil reacţionează cel mai frecvent cu α-haloacetaţii (şi aminele corespunzătoare), cum ar fi acidul cloracetic sau cloracetamida, pentru a furniza derivaţi de carboximetil sau carboxiamidometil. Reziduurile de cisteinil sunt, de asemenea, derivatizate prin reacţie cu bromotrifluoracetonă, acid α-bromo-β-(5-imidozoil) propionic, fosfat de cloracetil, N-alchilmaleimide, 3-nitro-2-piridil disulfură, 2-piridil disulfură de metil, p-cloromercuribenzoat, 2-cloromercuri-4-nitrofenol sau cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Reziduurile histidil sunt derivatizate prin reacţia cu dietilpirocarbonat la pH 5,5-7,0 deoarece acest agent este relativ specific pentru lanţul lateral histidil. Bromura de para-bromfenacil este de asemenea utilă; reacţia se efectuează, de preferinţă, în cacodilat de sodiu 0,1 M la pH 6,0. Reziduurile de lizinil şi amino terminale reacţionează cu anhidridele acidului succinic sau ale altor acizi carboxilici. Derivatizarea cu aceşti agenţi are ca efect inversarea sarcinii reziduurilor de lizinil. Alţi reactivi adecvaţi pentru derivatizarea reziduurilor care conţin alfa-amino includ imidoesteri, cum ar fi picolinimidat de metil; fosfat de piridoxal; piridoxal; cloroborohidrură; acid trinitrobenzensulfonic; O-metilizouree; 2,4-pentandionă; şi reacţie catalizată de transaminază cu glioxilat.

Reziduurile de arginil sunt modificate prin reacţia cu unul sau mai mulţi reactivi convenţionali, printre care fenilglioxal, 2,3-butandionă, 1,2-ciclohexandionă şi ninhidrină. Derivatizarea reziduurilor de arginină necesită ca reacţia să fie efectuată în condiţii alcaline din cauza pKa ridicat al grupării funcţionale a guanidinei. Mai mult, aceşti reactivi pot reacţiona cu grupările de lizină, precum şi cu gruparea epsilon-amino a argininei.

Se poate realiza modificarea specifică a reziduurilor de tirozil, cu un interes deosebit în introducerea de marcaje spectrale în reziduurile de tirozil prin reacţia cu compuşi aromatici de diazoniu sau tetranitrometan. Cel mai frecvent, N-acetilimidizolul şi tetranitrometanul sunt utilizate pentru a forma specii de O-acetil tirozil şi, respectiv, derivaţi 3-nitro. Reziduurile de tirozil sunt iodate folosind 125I sau 131I pentru a prepara proteine marcate pentru utilizare în radioimunotest, metoda cloraminei T descrisă mai sus fiind adecvată.

Grupările laterale carboxil (aspartil sau glutamil) sunt modificate selectiv prin reacţia cu carbodiimide (R'-N=C=N--R'), unde R şi R' sunt opţional grupări alchil diferite, cum ar fi 1-ciclohexil-3-( 2-morfolinil-4-etil)carbodiimidă sau 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimidă. Mai mult, reziduurile de aspartil şi glutamil sunt transformate în reziduuri de asparaginil şi glutaminil prin reacţie cu ioni de amoniu.

Derivatizarea cu agenţi bifuncţionali este utilă pentru reticularea constructelor de anticorpi din prezenta invenţie la o matrice sau o suprafaţă suport insolubilă în apă pentru utilizare într-o varietate de metode. Agenţii de reticulare utilizaţi în mod obişnuit includ, de ex., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehidă, esteri de N-hidroxisuccinimidă, de exemplu, esteri cu acid 4-azidosalicilic, imidoesteri homobifuncţionali, inclusiv esteri disuccinimidilici, cum ar fi 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionat) şi maleimide bifuncţionale, cum ar fi bis-N-maleimido-1,8-octan. Agenţi de derivare cum ar fi metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidat produc intermediari fotoactivabili care sunt capabili să formeze legături încrucişate în prezenţa luminii. Alternativ, pentru imobilizarea proteinelor se utilizează matrice reactive insolubile în apă, cum ar fi carbohidraţii activaţi cu bromură de cianogen şi substraturile reactive, aşa cum este descris în Brevetele SUA Nr. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; şi 4.330.440.

Reziduurile glutaminil şi asparaginil sunt frecvent deamidate la reziduurile corespunzătoare de glutamil şi, respectiv, aspartil. Alternativ, aceste reziduuri sunt deamidate în condiţii uşor acide. Oricare dintre aceste reziduuri se încadrează în cadrul acestei invenţii.

Alte modificări includ hidroxilarea prolinei şi lizinei, fosforilarea grupărilor hidroxil ale reziduurilor seril sau treonil, metilarea grupărilor α-amino ale lanţurilor laterale de lizină, arginină şi histidină (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetilarea aminei N-terminale şi amidarea oricărei grupări carboxil C-terminale.

Un alt tip de modificare covalentă a constructelor de anticorpi incluse în cadrul acestei invenţii cuprinde modificarea modelului de glicozilare al proteinei. După cum este cunoscut în domeniu, modelele de glicozilare pot depinde atât de secvenţa proteinei (de ex., prezenţa sau absenţa unor reziduuri particulare de aminoacizi de glicozilare, discutate mai jos), sau de celula gazdă sau organismul în care este produsă proteina. Sistemele de exprimare particulare sunt discutate mai jos.

Glicozilarea polipeptidelor este în mod tipic fie legată de N, fie legată de O. Legat de N se referă la ataşarea fragmentului carbohidrat la lanţul lateral al unui reziduu de asparagină. Secvenţele tri-peptidice asparagină-X-serină şi asparagină-X-treonină, în care X este orice aminoacid cu excepţia prolinei, sunt secvenţele de recunoaştere pentru ataşarea enzimatică a fragmentului de carbohidrat la lanţul lateral al asparaginei. Astfel, prezenţa oricăreia dintre aceste secvenţe tri-peptidice într-o polipeptidă creează un potenţial situs de glicozilare. Glicozilarea legată de O se referă la ataşarea unuia dintre zaharurile N-acetilgalactozamină, galactoză sau xiloză, la un hidroxiaminoacid, cel mai frecvent serină sau treonină, deşi pot fi utilizate şi 5-hidroxiprolină sau 5-hidroxilizină.

Adăugarea situsurilor de glicozilare la constructul de anticorp este realizată în mod convenabil prin modificarea secvenţei de aminoacizi astfel încât aceasta să conţină una sau mai multe dintre secvenţele tri-peptidice descrise mai sus (pentru situsurile de glicozilare legate de N). Modificarea poate fi făcută, de asemenea, prin adăugarea sau substituirea cu unul sau mai multe reziduuri de serină sau treonină la secvenţa de pornire (pentru situsurile de glicozilare legate de O). Pentru uşurinţă, secvenţa de aminoacizi a unui construct de anticorp este modificată, de preferinţă, prin modificări la nivelul ADN-ului, în special prin mutarea ADN-ului care codifică polipeptida la baze preselecţionate astfel încât să se genereze codoni care se vor translata în aminoacizii doriţi.

Un alt mijloc de creştere a numărului de fragmente de carbohidrat de pe constructul de anticorp este prin cuplarea chimică sau enzimatică a glicozidelor la proteină. Aceste proceduri sunt avantajoase prin faptul că nu necesită producerea de proteine ​​într-o celulă gazdă care are capacităţi de glicozilare pentru glicozilare legată de N şi O. În funcţie de modul de cuplare utilizat, zaharul (zaharurile) poate fi ataşat/pot fi ataşate la (a) arginină şi histidină, (b) grupări carboxil libere, (c) grupări sulfhidril libere, cum ar fi cele ale cisteinei, (d) grupări hidroxil libere, cum ar fi cele ale serinei, treoninei sau hidroxiprolinei, (e) reziduuri aromatice, cum ar fi cele ale fenilalaninei, tirozinei sau triptofanului sau (f) gruparea amidă a glutaminei. Aceste metode sunt descrise în WO 87/05330, şi în Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306.

Îndepărtarea fragmentelor de carbohidrat prezente pe constructul de anticorp iniţial poate fi realizată chimic sau enzimatic. Deglicozilarea chimică necesită expunerea proteinei la compusul acid trifluormetansulfonic sau la un compus echivalent. Acest tratament are ca rezultat scindarea majorităţii sau a tuturor zaharurilor, cu excepţia zaharului de legătură (N-acetilglucozamina sau N-acetilgalactozamina), lăsând polipeptida intactă. Deglicozilarea chimică este descrisă de Hakimuddin şi colab., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 şi de Edge şi colab., 1981, Anal. Biochem. 118:131. Scindarea enzimatică a fragmentelor de carbohidraţi de pe polipeptide poate fi realizată prin utilizarea unei varietăţi de endo- şi exo-glicozidaze aşa cum este descris de Thotakura şi colab., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. Glicozilarea la situsurile potenţiale de glicozilare poate fi prevenită prin utilizarea compusului tunicamicină aşa cum este descris de Duskin şi colab., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. Tunicamicina blochează formarea legăturilor proteină-N-glicozidă.

Alte modificări ale constructului de anticorp sunt de asemenea avute în vedere aici. De exemplu, un alt tip de modificare covalentă a constructului de anticorp cuprinde legarea constructului de anticorp la diferiţi polimeri neproteici, incluzând, dar fără a se limita la, diferiţi polioli, cum ar fi polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialchileni sau copolimeri de polietilenglicol şi polipropilenglicol, în modul prezentat în Brevetele SUA Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 sau 4.179.337. În plus, aşa cum se ştie în domeniu, substituţiile de aminoacizi pot fi făcute în diferite poziţii în cadrul constructului de anticorp, de ex. pentru a facilita adăugarea de polimeri, cum ar fi PEG.

În unele exemple de realizare, modificarea covalentă a constructelor de anticorpi ale invenţiei cuprinde adăugarea uneia sau mai multor etichete. Gruparea de etichetare poate fi cuplată la constructul de anticorp prin braţe distanţiere de diferite lungimi pentru a reduce potenţialul obstacol steric. Diferite metode pentru etichetarea proteinelor sunt cunoscute în domeniu şi pot fi utilizate în realizarea prezentei invenţii. Termenul "etichetă" sau "grupare de etichetare" se referă la orice etichetă detectabilă. În general, etichetele se încadrează într-o varietate de clase, în funcţie de testul în care urmează să fie detectate - următoarele exemple includ, dar nu se limitează la:

a) etichete izotopice, care pot fi izotopi radioactivi sau grei, cum ar fi radioizotopi sau radionuclizi (de ex., 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)

b) etichete magnetice (de ex., particule magnetice)

c) fragmente active redox

d) coloranţi optici (incluzând, dar nelimitându-se la, cromofori, fosfor şi fluorofori), cum ar fi grupări fluorescente (de ex., FITC, rodamină, fosfor lantanid), grupări chemioluminescente şi fluorofori care pot fi fie fluoruri cu „moleculă mică», fie fluoruri proteinacee

e) grupări enzimatice (de ex., peroxidază de hrean, β-galactozidază, luciferază, fosfatază alcalină)

f) grupări biotinilate

g) epitopi polipeptidici predeterminaţi recunoscuţi de un raportor secundar (de ex., secvenţe pereche cu fermoar de leucină, situsuri de legare pentru anticorpi secundari, domenii de legare a metalelor, etichete de epitop etc.)

Prin "etichetă fluorescentă" se înţelege orice moleculă care poate fi detectată prin intermediul proprietăţilor sale fluorescente inerente. Etichetele fluorescente adecvate includ, dar nu se limitează la, fluoresceină, rodamină, tetrametilrodamină, eozină, eritrozină, cumarină, cumarină de metil, piren, verde malacit, stilben, galben Lucifer, albastru cascadă J, roşu Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, verde Oregon, coloranţii Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633 , Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), albastru cascadă, galben cascadă şi R-ficoeritrină (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamină şi roşu Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Coloranţii optici adecvaţi, inclusiv fluoroforii, sunt descrişi în Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland.

Etichetele fluorescente proteice adecvate includ, de asemenea, dar nu se limitează la, proteină fluorescentă verde, inclusiv o specie Renilla, Ptilosarcus sau Aequorea de GFP (Chalfie şi colab., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., număr de acces Genbank U55762), proteină fluorescentă albastră (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim şi colab., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), proteină fluorescentă galbenă îmbunătăţită (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferază (Ichiki şi colab., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β galactozidază (Nolan şi colab., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. S.U.A. 85:2603-2607) şi Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Brevetele SUA Nr. 5.292.658; 5.418.155; 5.683.888; 5.741.668; 5.777.079; 5.804.387; 5.874.304; 5.876.995; 5.925.558).

Domeniile fermoar de leucină sunt peptide care promovează oligomerizarea proteinelor în care se găsesc. Fermoarele de leucină au fost identificate iniţial în mai multe proteine care leagă ADN-ul (Landschulz şi colab., 1988, Science 240:1759), şi de atunci au fost găsite într-o varietate de proteine diferite. Printre fermoarele de leucină cunoscute se numără peptidele naturale şi derivaţii acestora care dimerizează sau trimerizează. Exemple de domenii de fermoar leucină adecvate pentru producerea de proteine oligomerice solubile sunt descrise în Cererea PCT WO 94/10308, şi fermoarul de leucină derivat din proteina D surfactant pulmonar (SPD) descris în Hoppe şi colab., 1994, FEBS Letters 344:191. Utilizarea unui fermoar de leucină modificat care permite trimerizarea stabilă a unei proteine heterologe fuzionate cu acesta este descrisă în Fanslow şi colab., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. Într-o abordare, proteinele de fuziune recombinante care cuprind un fragment de anticorp MSLN sau un derivat fuzionat cu o peptidă cu fermoar de leucină sunt exprimate în celule gazdă adecvate, iar fragmentele sau derivaţii de anticorp MSLN oligomerici solubili care se formează sunt recuperaţi din supernatantul culturii.

Constructul de anticorp conform invenţiei poate cuprinde, de asemenea, domenii suplimentare, care sunt de ex. utile în izolarea moleculei sau se referă la un profil farmacocinetic adaptat al moleculei. Domeniile utile pentru izolarea unui construct de anticorp pot fi selectate dintre motivele peptidice sau fragmentele introduse secundar, care pot fi capturate într-o metodă de izolare, de ex. o coloană de izolare. Exemplele de realizare nelimitative ale unor astfel de domenii suplimentare cuprind motive peptidice cunoscute sub numele de eticheta Myc, eticheta HAT, eticheta HA, eticheta TAP, eticheta GST, domeniul de legare a chitinei (eticheta CBD), proteina de legare a maltozei (eticheta MBP), eticheta Flag, eticheta Strep şi variantele acestora (de ex., eticheta Strepll) şi eticheta His. Toate constructele de anticorpi descrise aici caracterizate prin CDR-urile identificate sunt preferate să cuprindă un domeniu cu etichetă His, care este în general cunoscut ca o repetare a reziduurilor His consecutive în secvenţa de aminoacizi a unei molecule, de preferinţă de cinci, şi mai preferabil de şase reziduuri His (hexa-histidină). Eticheta His poate fi localizată de ex. la capătul N- sau C-terminal al constructului de anticorp, de preferinţă este situat la capătul C-terminal. Cel mai preferabil, o etichetă hexa-histidină (HHHHHH) (SECV ID NR:10) este legată prin legătură peptidică la capătul C-terminal al constructului de anticorp conform invenţiei.

Primul domeniu de legare al constructului de anticorp din prezenta invenţie se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă. Secvenţa de aminoacizi preferată a MSLN umană este reprezentată de NR: 231, 232 şi 233. Primul domeniu de legare conform invenţiei se leagă, de preferinţă, la MSLN atunci când este exprimat prin celule sau linii celulare care exprimă în mod natural şi/sau prin celule sau linii celulare transformate sau transfectate (stabil/tranzitoriu) cu MSLN. Într-un exemplu de realizare preferat, primul domeniu de legare se leagă de asemenea la MSLN atunci când MSLN este utilizată ca moleculă "ţintă" sau "ligand" într-un test de legare in vitro, cum ar fi BIAcore sau Scatchard. "Celula ţintă" poate fi orice celulă procariotă sau eucariotă care exprimă MSLN pe suprafaţa sa; de preferinţă, celula ţintă este o celulă care face parte din corpul uman sau animal, cum ar fi o celulă de cancer ovarian, celulă de cancer pancreatic, celulă de mezoteliom, celulă de cancer pulmonar, celulă de cancer gastric şi celulă de cancer de sân triplu negativ.

Afinitatea primului domeniu de legare pentru MSLN umană este de preferinţă ≤20 nM, mai preferabil ≤10 nM, chiar mai preferabil ≤5 nM, chiar mai preferabil ≤2 nM, chiar mai preferabil ≤1 nM, chiar mai preferabil ≤0,6 nM, chiar mai preferabil ≤0,5 nM, şi cel mai preferabil ≤0,4 nM. Afinitatea poate fi măsurată, de exemplu, într-un test BIAcore sau într-un test Scatchard, de ex. aşa cum este descris în Exemple. Alte metode de determinare a afinităţii sunt, de asemenea, bine-cunoscute persoanei de specialitate; a se vedea de ex. Exemplul 3 anexat.

Sunt de asemenea avute în vedere modificări ale secvenţei de aminoacizi ale constructelor de anticorpi descrise aici. De exemplu, poate fi de dorit să se îmbunătăţească afinitatea de legare şi/sau alte proprietăţi biologice ale constructului de anticorp. Variantele secvenţei de aminoacizi ale constructelor de anticorpi sunt preparate prin introducerea modificărilor adecvate de nucleotide în constructele de anticorpi ale acidului nucleic sau prin sinteza peptidelor. Toate modificările secvenţei de aminoacizi descrise mai jos ar trebui să aibă ca rezultat un construct de anticorp care păstrează încă activitatea biologică dorită (legare la MSLN şi la CD3) a moleculei parentale nemodificate.

Termenul "aminoacid" sau "reziduu de aminoacid" se referă în mod obişnuit la un aminoacid având definiţia recunoscută în domeniu, cum ar fi un aminoacid selectat din grupul constând din: alanină (Ala sau A); arginină (Arg sau R); asparagină (Asn sau N); acid aspartic (Asp sau D); cisteină (Cys sau C); glutamină (Gln sau Q); acid glutamic (Glu sau E); glicină (Gly sau G); histidină (His sau H); izoleucină (He sau I): leucină (Leu sau L); lizină (Lys sau K); metionină (Met sau M); fenilalanină (Phe sau F); prolină (Pro sau P); serină (Ser sau S); treonină (Thr sau T); triptofan (Trp sau W); tirozină (Tyr sau Y); şi valină (Val sau V), deşi aminoacizi modificaţi, sintetici sau rari pot fi utilizaţi după cum se doreşte. În general, aminoacizii pot fi grupaţi ca având un lanţ lateral nepolar (de ex., Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); un lanţ lateral încărcat negativ (de ex., Asp, Glu); un lanţ lateral încărcat pozitiv (de ex., Arg, His, Lys); sau un lanţ lateral polar neîncărcat (de ex., Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp şi Tyr).

Modificările aminoacizilor includ, de exemplu, ştergeri din, şi/sau inserări în, şi/sau substituţii ale, reziduurilor din secvenţele de aminoacizi ale constructelor de anticorpi. Orice combinaţie de ştergere, inserare şi substituţie este făcută pentru a ajunge la constructul final, cu condiţia ca constructul final să posede caracteristicile dorite. Modificările aminoacizilor pot, de asemenea, modifica procesele post-translaţionale ale constructelor de anticorpi, cum ar fi schimbarea numărului sau poziţiei situsurilor de glicozilare.

De exemplu, 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 aminoacizi pot fi inseraţi sau şterşi în fiecare dintre CDR-uri (desigur, în funcţie de lungimea lor), în timp ce 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, sau 25 de aminoacizi pot fi inseraţi în sau eliminaţi din fiecare dintre FR-uri. De preferinţă, inserţiile de secvenţe de aminoacizi includ fuziuni amino- şi/sau carboxil-terminale variind în lungime de la 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 sau 10 reziduuri la polipeptide care conţin o sută sau mai multe reziduuri, precum şi inserţii intra-secvenţă ale resturilor de aminoacizi unice sau multiple. O variantă de inserţie a constructului de anticorp conform invenţiei include fuziunea la capătul N-terminal sau la capătul C-terminal al constructului de anticorp a unei enzime sau fuziunea la o polipeptidă care creşte timpul de înjumătăţire plasmatică al constructului de anticorp.

Situsurile de cel mai mare interes pentru mutageneza substituţională includ CDR-urile lanţului greu şi/sau uşor, în special regiunile hipervariabile, dar sunt de asemenea avute în vedere modificări FR în lanţul greu şi/sau uşor. Substituţiile sunt preferabil substituţii conservatoare aşa cum este descris aici. De preferinţă, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 sau 10 aminoacizi pot fi substituiţi într-o CDR, în timp ce 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 sau 25 aminoacizi pot fi substituiţi în regiunile cadru (FR), în funcţie de lungimea CDR sau FR. De exemplu, dacă o secvenţă CDR cuprinde 6 aminoacizi, se preconizează că unul, doi sau trei dintre aceşti aminoacizi sunt substituiţi. În mod similar, dacă o secvenţă CDR cuprinde 15 aminoacizi, se preconizează ca unul, doi, trei, patru, cinci sau şase dintre aceşti aminoacizi sunt substituiţi.

O metodă utilă pentru identificarea anumitor reziduuri sau regiuni ale constructelor de anticorpi care sunt locaţii preferate pentru mutageneză este numită "mutageneză cu scanare cu alanină", aşa cum este descris de Cunningham şi Wells în Science, 244: 1081-1085 (1989). Aici, un reziduu sau un grup de reziduuri ţintă din constructul de anticorp este identificat (de ex. reziduuri încărcate, cum ar fi arg, asp, his, lys şi glu) şi înlocuit cu un aminoacid neutru sau încărcat negativ (cel mai preferabil alanină sau polialanină) pentru a afecta interacţiunea aminoacizilor cu epitopul.

Acele locaţii de aminoacizi care demonstrează sensibilitate funcţională la substituţii sunt apoi rafinate prin introducerea de alte variante sau de variante suplimentare la, sau pentru, situsurile de substituţie. Astfel, în timp ce situsul sau regiunea pentru introducerea unei variaţii a secvenţei de aminoacizi este predeterminat, natura mutaţiei în sine nu trebuie predeterminată. De exemplu, pentru a analiza sau optimiza performanţa unei mutaţii la un anumit situs, scanarea cu alanină sau mutageneza aleatorie pot fi efectuate la un codon sau regiune ţintă, iar variantele de construct de anticorp exprimate sunt selectate pentru combinaţia optimă a activităţii dorite. Tehnicile pentru realizarea mutaţiilor de substituţie la situsurile predeterminate din ADN având o secvenţă cunoscută sunt bine-cunoscute, de exemplu, mutageneza primerului M13 şi mutageneza PCR. Screening-ul mutanţilor se face folosind teste ale activităţilor de legare a antigenului, cum ar fi legarea MSLN sau CD3.

În general, dacă aminoacizii sunt substituiţi în una sau mai multe sau toate CDR-urile lanţului greu şi/sau uşor, este de preferat ca secvenţa "substituită" obţinută atunci să fie în proporţie de cel puţin 60% sau 65%, mai preferabil 70% sau 75%, chiar mai preferabil 80% sau 85%, şi în mod deosebit preferabil 90% sau 95% identică cu secvenţa CDR "originală". Aceasta înseamnă că este dependentă de lungimea CDR în măsura în care este identică cu secvenţa "substituită". De exemplu, o CDR având 5 aminoacizi este de preferinţă 80% identică cu secvenţa sa substituită pentru a avea cel puţin un aminoacid substituit. În consecinţă, CDR-urile constructului de anticorp pot avea diferite grade de identitate faţă de secvenţele lor substituite, de exemplu, CDRL1 poate avea 80%, în timp ce CDRL3 poate avea 90%.

Substituţiile (sau înlocuirile) preferate sunt substituţii conservatoare. Cu toate acestea, este avută în vedere orice substituţie (inclusiv substituţia neconservatoare sau una sau mai multe dintre "substituţiile de exemplu" enumerate în Tabelul 1, de mai jos) atâta timp cât constructul de anticorp îşi păstrează capacitatea de a se lega la MSLN prin primul domeniu de legare şi la CD3 sau CD3 epsilon prin intermediul celui de al doilea domeniu de legare şi/sau CDR-urile sale au o identitate cu secvenţa apoi substituită (cel puţin 60% sau 65%, mai preferabil 70% sau 75%, chiar mai preferabil 80% sau 85% şi în mod deosebit de preferabil 90% sau 95% identice cu secvenţa CDR "originală").

Substituţiile conservatoare sunt prezentate în Tabelul 1 sub titlul "substituţii preferate". Dacă astfel de substituţii duc la o schimbare a activităţii biologice, atunci pot fi introduse modificări mai substanţiale, denumite "substituţii de exemplu" în Tabelul 1, sau aşa cum este descris mai jos în referinţă la clasele de aminoacizi, şi produsele selectate pentru o caracteristică dorită.

Tabelul 1: Substituţii de aminoacizi

Original Substituţii de exemplu Substituţii preferate Ala (A) val, leu, ile val Arg (R) lys, gln, asn lys Asn (N) gln, his, asp, lys, arg gln Asp (D) glu, asn glu Cys (C) ser, ala ser Gln (Q) asn, glu asn Glu (E) asp, gln asp Gly (G) Ala ala His (H) asn, gln, lys, arg arg Ile (I) leu, val, met, ala, phe leu Leu (L) norleucină, ile, val, met, ala ile Lys (K) arg, gln, asn arg Met (M) leu, phe, ile leu Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr tyr Pro (P) Ala ala Ser (S) Thr thr Thr (T) Ser ser Trp (W) tyr, phe tyr Tyr (Y) trp, phe, thr, ser phe Val (V) ile, leu, met, phe, ala leu

Modificările substanţiale ale proprietăţilor biologice ale constructului de anticorp din prezenta invenţie sunt realizate prin selectarea substituţiilor care diferă semnificativ în efectul lor asupra menţinerii (a) a structurii scheletului polipeptidic în zona substituţiei, de exemplu, sub formă de foaie sau conformaţie elicoidală, (b) sarcinii sau hidrofobicităţii moleculei la situsul ţintă sau (c) celei mai mari părţi a lanţului lateral. Reziduurile naturale sunt împărţite în grupuri pe baza proprietăţilor comune ale lanţului lateral: (1) hidrofobe: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofile neutre: cys, ser, thr; (3) acide: asp, glu; (4) bazic: asn, gin, his, lys, arg; (5) reziduuri care influenţează orientarea lanţului: gly, pro; şi (6) aromatice: trp, tyr, phe.

Substituţiile neconservatoare vor presupune înlocuirea unui membru al uneia dintre aceste clase cu o altă clasă. Orice reziduu de cisteină care nu este implicat în menţinerea conformaţiei corecte a constructului de anticorp poate fi substituit, în general cu serină, pentru a îmbunătăţi stabilitatea oxidativă a moleculei şi pentru a preveni reticularea aberantă. În schimb, se pot adăuga legături de cisteină la anticorp pentru a îmbunătăţi stabilitatea acestuia (în special în cazul în care anticorpul este un fragment de anticorp, cum ar fi un fragment Fv).

Pentru secvenţele de aminoacizi, identitatea şi/sau asemănarea secvenţei este determinată prin utilizarea tehnicilor standard cunoscute în domeniu, inclusiv, dar fără a se limita la, algoritmul de identitate a secvenţei locale al Smith şi Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, algoritmul de aliniere a identităţii secvenţei al Needleman şi Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, metoda de căutare a asemănării Pearson şi Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. S.U.A. 85:2444, implementări computerizate ale acestor algoritmi (GAP, BESTFIT, FASTA şi TFASTA în Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin), programul de secvenţă Best Fit descris de Devereux şi colab., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, de preferinţă folosind setările implicite sau prin inspecţie. De preferinţă, procentul de identitate este calculat de FastDB pe baza următorilor parametri: penalizare de nepotrivire de 1; penalizare de decalaj de 1; penalizare pentru dimensiunea decalajului de 0,33; şi penalizare de alăturare de 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Un exemplu de algoritm util este PILEUP. PILEUP creează o aliniere de secvenţă multiplă dintr-un grup de secvenţe conexe utilizând alinieri progresive, în perechi. Poate, de asemenea, să traseze un copac care să arate relaţiile de grupare utilizate pentru a crea alinierea. PILEUP foloseşte o simplificare a metodei de aliniere progresivă a Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360; metoda este similară cu cea descrisă de Higgins şi Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Parametri utili PILEUP, care includ o greutate implicită a golului de 3,00, o greutate implicită a lungimii golului de 0,10 şi goluri finale ponderate.

Un alt exemplu de algoritm util este algoritmul BLAST, descris în: Altschul şi colab., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul şi colab., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; şi Karin şi colab., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. S.U.A. 90:5873-5787. Un program BLAST deosebit de util este programul WU-BLAST-2 care a fost obţinut din Altschul şi colab., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 foloseşte mai mulţi parametri de căutare, majoritatea fiind setaţi la valorile implicite. Parametrii ajustabili sunt setaţi cu următoarele valori: interval de suprapunere=1, fracţiune de suprapunere=0,125, prag de cuvinte (T)=ll. Parametrii HSP S şi HSP S2 sunt valori dinamice şi sunt stabiliţi de programul însuşi în funcţie de compoziţia secvenţei particulare şi de compoziţia bazei de date particulare în raport cu care este căutată secvenţa de interes; cu toate acestea, valorile pot fi ajustate pentru a creşte sensibilitatea.

Un algoritm util suplimentar este BLAST golit, aşa cum este raportat de Altschul şi colab., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. BLAST golit foloseşte scoruri de substituţie BLOSUM-62; parametru prag T setat la 9; metoda cu două lovituri pentru a declanşa extensii fără gol, încarcă lungimi de goluri de k un cost de 10 + k; Xu setat la 16, şi Xg setat la 40 pentru etapa de căutare a bazei de date şi la 67 pentru etapa de ieşire a algoritmilor. Alinierile golite sunt declanşate de un scor care corespunde la aproximativ 22 de biţi.

În general, omologia aminoacizilor, asemănarea sau identitatea dintre variantele individuale de CDR-uri sunt de cel puţin 60% faţă de secvenţele descrise aici şi, mai tipic, cu omologii sau identităţi în creştere, de preferinţă, de cel puţin 65% sau 70%, mai preferabil cel puţin 75% sau 80%, chiar mai preferabil de cel puţin 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% şi aproape 100%. În mod similar, "procent (%) identitate de secvenţă a acidului nucleic" în raport cu secvenţa de acid nucleic a proteinelor de legare identificate aici este definit ca procentul de reziduuri de nucleotide dintr-o secvenţă candidat care sunt identice cu reziduurile de nucleotide din codificarea secvenţei constructului de anticorp. O metodă specifică utilizează modulul BLASTN al WU-BLAST-2 setat la parametrii impliciţi, cu intervalul de suprapunere şi fracţia de suprapunere setată la 1 şi, respectiv, 0,125.

În general, omologia secvenţei de acid nucleic, asemănarea sau identitatea dintre secvenţele de nucleotide care codifică variantele CDR individuale şi secvenţele de nucleotide descrise aici sunt de cel puţin 60% şi, mai tipic, cu omologii sau asemănări în creştere, de preferinţă, de cel puţin 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, sau 99% şi aproape 100%. Astfel, o "variantă de CDR" este una cu omologia, asemănarea sau identitatea specificată cu CDR părinte a invenţiei şi împarte funcţia biologică, incluzând, dar fără a se limita la, cel puţin 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, sau 99% din specificitatea şi/sau activitatea CDR părinte.

Într-un exemplu de realizare, procentul de identitate cu linia germinală umană a constructelor de anticorpi conform invenţiei este ≥ 70% sau ≥ 75%, mai preferabil ≥ 80% sau ≥ 85%, chiar mai preferabil ≥ 90% şi cel mai preferabil ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95% sau chiar ≥ 96%. Identitatea faţă de produsele genei germinale ale anticorpilor umani este considerată a fi o caracteristică importantă pentru a reduce riscul proteinelor terapeutice de a provoca un răspuns imun împotriva medicamentului la pacient în timpul tratamentului. Hwang & Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) demonstrează că reducerea porţiunilor non-umane ale constructelor de anticorpi în medicament conduce la o scădere a riscului de a induce anticorpi anti-medicament la pacienţi în timpul tratamentului. Prin compararea unui număr exhaustiv de medicamente cu anticorpi evaluate clinic şi a datelor imunogenităţii respective, se arată tendinţa că umanizarea regiunilor V ale anticorpilor face proteina mai puţin imunogenă (în medie 5,1% dintre pacienţi) decât anticorpii care prezintă regiuni V neumane nealterate (în medie 23,59% dintre pacienţi). Un grad mai mare de identitate cu secvenţele umane este, prin urmare, de dorit pentru terapeutica proteică bazată pe regiunea V sub formă de constructe de anticorpi. În acest scop al determinării identităţii liniei germinale, regiunile V ale VL pot fi aliniate cu secvenţele de aminoacizi ale segmentelor V ale liniei germinale umane şi ale segmentelor J (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) folosind software-ul Vector NTI şi secvenţa de aminoacizi calculată prin împărţirea reziduurilor de aminoacizi identici la numărul total de reziduuri de aminoacizi ale VL în procente. Acelaşi lucru poate fi valabil şi pentru segmentele VH (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) cu excepţia faptului că VH CDR3 poate fi exclusă din cauza diversităţii sale ridicate şi a lipsei partenerilor de aliniere existenţi ai liniei germinale umane VH CDR3. Tehnicile recombinate pot fi apoi utilizate pentru a creşte identitatea secvenţei la genele germinale ale anticorpilor umani.

Într-un exemplu de realizare suplimentar, constructele de anticorpi bispecifici ale prezentei invenţii prezintă randamente mari de monomeri în condiţii standard la scară de cercetare, de ex., într-un proces standard de purificare în două etape. De preferinţă, randamentul de monomeri al constructelor de anticorpi conform invenţiei este ≥ 0,25 mg/L supernatant, mai preferabil ≥ 0,5 mg/L, chiar mai preferabil ≥ 1 mg/L, şi cel mai preferabil ≥ 3 mg/L supernatant.

De asemenea, randamentul de izoforme ale constructului de anticorp dimeric şi, prin urmare, procentul de monomer (adică, monomer: (monomer + dimer)) din constructele de anticorpi pot fi determinate. Productivitatea constructelor de anticorpi monomerici şi dimerici şi procentul de monomeri calculat poate, de ex., să fie obţinut în etapa de purificare SEC a supernatantului de cultură din producţia standardizată la scară de cercetare în sticle cu roll on. Într-un exemplu de realizare, procentul de monomer al constructelor de anticorpi este ≥ 80%, mai preferabil ≥ 85%, chiar mai preferabil ≥ 90% şi cel mai preferabil ≥ 95%.

Într-un exemplu de realizare, constructele de anticorpi au o stabilitate plasmatică preferată (raportul dintre CE50 cu plasmă şi CE50 fără plasmă) de ≤ 5 sau ≤ 4, mai preferabil ≤ 3,5 sau ≤ 3, chiar mai preferabil ≤ 2,5 sau ≤ 2 şi cel mai preferabil ≤ 1,5 sau ≤ 1. Stabilitatea plasmatică a unui construct de anticorp poate fi testată prin incubarea constructului în plasma umană la 37°C timp de 24 de ore urmată de determinarea CE50 într-un test de citotoxicitate cu eliberare de crom 51. Celulele efectoare din testul de citotoxicitate pot fi stimulate de celule T CD8 pozitive umane îmbogăţite. Celulele ţintă pot, de ex., să fie celule CHO transfectate cu MSLN umană. Raportul celulă efector-ţintă (E:T) poate fi ales să fie 10: 1. Fondul de plasmă umană utilizat în acest scop este derivat din sângele donatorilor sănătoşi colectat de seringile acoperite cu EDTA. Componentele celulare sunt îndepărtate prin centrifugare şi faza plasmatică superioară este colectată şi ulterior reunită. Ca martor, constructele de anticorpi sunt diluate imediat înainte de testul de citotoxicitate în mediu RPMI-1640. Stabilitatea plasmei este calculată ca raport dintre CE50 (după incubarea plasmei) şi CE50 (martor). A se vedea Exemplul 6.

În plus, este de preferat ca conversia monomer în dimer a constructelor de anticorpi conform invenţiei să fie scăzută. Conversia poate fi măsurată în condiţii diferite şi analizată prin cromatografie de excludere pe baza mărimii de performanţă ridicată. A se vedea Exemplul 9. De exemplu, incubarea izoformelor monomerice ale constructelor de anticorpi poate fi efectuată timp de 7 zile la 37°C şi concentraţii, de ex., de 100 µg/ml sau 250 µg/ml într-un incubator. În aceste condiţii, este de preferat ca constructele de anticorpi conform invenţiei să prezinte un procent de dimeri care este ≤5%, mai preferabil ≤4%, chiar mai preferabil ≤3%, chiar mai preferabil ≤2,5%, chiar mai preferabil ≤2%, chiar mai preferabil ≤1,5% şi cel mai preferabil ≤1% sau ≤0,5% sau chiar 0%.

De asemenea, este de preferat ca constructele de anticorpi bispecifici ale prezentei invenţii să prezinte o conversie a dimerului foarte scăzută după un număr de cicluri de îngheţare/dezgheţare. De exemplu, monomerul constructului de anticorp este ajustat la o concentraţie de 250 µg/ml, de ex., în tampon de formulare generic şi supus la trei cicluri de îngheţare/dezgheţare (îngheţare la -80°C timp de 30 de minute, urmată de dezgheţare timp de 30 de minute la temperatura camerei), urmate de SEC de înaltă performanţă pentru a determina procentul de construct de anticorp monomeric iniţial, care a fost transformat în construct de anticorp dimeric. De preferinţă, procentele de dimer ale constructelor de anticorpi bispecifici sunt ≤5%, mai preferabil ≤4%, chiar mai preferabil ≤3%, chiar mai preferabil ≤2,5%, chiar mai preferabil ≤2%, chiar mai preferabil ≤1,5%, şi cel mai preferabil ≤1% sau chiar ≤0,5%, de exemplu după trei cicluri de îngheţ/dezgheţ.

Constructele de anticorpi bispecifici din prezenta invenţie prezintă, de preferinţă, o termostabilitate favorabilă cu temperaturi de agregare ≥45°C sau ≥50°C, mai preferabil ≥51°C, ≥52°C, ≥53°C sau ≥54°C, chiar mai preferabil ≥56°C sau ≥57°C, şi cel mai preferabil ≥58°C sau ≥59°C. Parametrul de termostabilitate poate fi determinat în termeni de temperatură de agregare a anticorpilor după cum urmează: Soluţia de anticorp la o concentraţie de 250 µg/ml este transferată într-o cuvă de unică folosinţă şi plasată într-un dispozitiv Dynamic Light Scattering (DLS). Proba este încălzită de la 40°C la 70°C la o rată de încălzire de 0,5°C/min, cu achiziţie constantă a razei măsurate.

Creşterea razei care indică topirea proteinei şi agregarea este utilizată pentru a calcula temperatura de agregare a anticorpului. A se vedea Exemplul 10.

Alternativ, curbele de topire ale temperaturii pot fi determinate prin calorimetrie cu scanare diferenţială (DSC) pentru a determina stabilităţile biofizice intrinseci ale proteinelor constructelor de anticorpi. Aceste experimente sunt efectuate folosind un dispozitiv VP-DSC MicroCal LLC (Northampton, MA, S.U.A.). Absorbţia energetică a unei probe care conţine un construct de anticorp este înregistrată de la 20°C la 90°C comparativ cu o probă care conţine doar tamponul de formulare. Constructele de anticorpi sunt ajustate la o concentraţie finală de 250 µg/ml, de ex., în tampon de rulare SEC. Pentru înregistrarea curbei de topire respective, temperatura generală a probei este mărită în trepte. La fiecare temperatură T se captează energia probei şi se înregistrează referinţa tamponului de formulare. Diferenţa de absorbţie a energiei Cp (kcal/mol/° C) a probei minus referinţa este reprezentată grafic în funcţie de temperatura respectivă. Temperatura de topire este definită ca temperatura la prima maximă de absorbţie a energiei.

Constructele de anticorpi bispecifici MSLN xCD3 ale invenţiei sunt, de asemenea, preconizate a avea o turbiditate (măsurată prin OD340 după concentrarea constructului de anticorp monomeric purificat la 2,5 mg/ml şi incubare peste noapte) de ≤ 0,2, de preferinţă de ≤ 0,15, mai preferabil de ≤ 0,12, chiar mai preferabil de ≤ 0,1 sau chiar ≥0,09, şi cel mai preferabil de ≤ 0,08 sau ≥0,07. A se vedea Exemplul 11.

Într-un alt exemplu de realizare, constructul de anticorp conform invenţiei este stabil la pH acid. Cu cât constructul anticorpului se comportă mai tolerant la pH nefiziologic, cum ar fi pH 5,5 (un pH care este necesar pentru a rula, de ex., o cromatografie cu schimb de cationi), cu atât este mai mare recuperarea constructului de anticorp eluat dintr-o coloană de schimb ionic faţă de cantitatea totală de proteine încărcate. Recuperarea constructului de anticorp dintr-o coloană de schimb ionic (de ex., cationic) la pH 5,5 este de preferinţă ≥ 30%, mai preferabil ≥ 40%, mai preferabil ≥ 50%, chiar mai preferabil ≥ 60%, chiar mai preferabil ≥ 70%, chiar mai preferabil ≥ 80%, chiar mai preferabil ≥ 90%, chiar mai preferabil ≥ 95% şi cel mai preferabil ≥ 99%. A se vedea Exemplul 7.

În plus, este avut în vedere că constructele de anticorpi bispecifici ale prezentei invenţii prezintă eficacitate terapeutică sau activitate anti-tumorală. Acest lucru poate, de ex., să fie evaluat într-un studiu, aşa cum este dezvăluit în următorul exemplu de model de xenogrefă tumorală umană în stadiu avansat:

În ziua 1 a studiului, 5×106 celule ale unei linii de celule canceroase umane MSLN pozitive (de ex., OVCAR-8) sunt injectate subcutanat în flancul dorsal drept al şoarecilor femele NOD/SCID. Când volumul mediu al tumorii atinge aproximativ 100 mm3, celulele T pozitive la CD3 uman expandate in vitro sunt transplantate la şoareci prin injectarea a aproximativ 2×107 celule în cavitatea peritoneală a animalelor. Şoarecii din grupul de control 1 al vehiculului nu primesc celule efectoare şi sunt folosiţi ca martor netransplantat pentru comparaţie cu grupul de control 2 al vehiculului (care primesc celule efectoare) pentru a monitoriza impactul celulelor T singure asupra creşterii tumorii. Tratamentul cu anticorpi începe când volumul mediu al tumorii ajunge la aproximativ 200 mm3. Dimensiunea medie a tumorii pentru fiecare grup de tratament în ziua începerii tratamentului nu trebuie să fie statistic diferită de nici un alt grup (analiza varianţei). Şoarecii sunt trataţi cu 0,5 mg/kg/zi dintr-un construct de anticorp bispecific MSLN xCD3 prin injectare intravenoasă în bolus timp de aproximativ 15 până la 20 de zile. Tumorile sunt măsurate prin etrier în timpul studiului şi progresul este evaluat prin compararea volumelor tumorale (TV) între grupuri. Inhibarea creşterii tumorii T/C [%] este determinată prin calcularea TV ca T/C% = 100 × (TV mediană a grupului analizat) / (TV mediană a grupului de control 2).

Persoana calificată ştie cum să modifice sau să adapteze anumiţi parametri ai acestui studiu, cum ar fi numărul de celule tumorale injectate, situsul injectării, numărul de celule T umane transplantate, cantitatea de constructe de anticorpi bispecifici care urmează să fie administrate şi orarele, ajungând totuşi la un rezultat semnificativ şi reproductibil. De preferinţă, inhibarea creşterii tumorii T/C [%] este ≤ 70 sau ≤ 60, mai preferabil ≤ 50 sau ≤ 40, chiar mai preferabil ≤ 30 sau ≤ 20 şi cel mai preferabil ≤ 10 sau ≤ 5 sau chiar ≤ 2,5.

Invenţia furnizează în plus o polinucleotidă/moleculă de acid nucleic care codifică un construct de anticorp conform invenţiei.

O polinucleotidă este un biopolimer compus din 13 sau mai mulţi monomeri nucleotidici legaţi covalent într-un lanţ. ADN (cum ar fi ADNc) şi ARN (cum ar fi ARNm) sunt exemple de polinucleotide cu funcţie biologică distinctă. Nucleotidele sunt molecule organice care servesc drept monomeri sau subunităţi ale moleculelor de acid nucleic precum ADN sau ARN. Molecula de acid nucleic sau polinucleotida poate fi dublu catenară şi monocatenară, liniară şi circulară. Este cuprinsă, de preferinţă, într-un vector care este preferabil cuprins într-o celulă gazdă. Celula gazdă menţionată este, de ex. după transformare sau transfecţie cu vectorul sau polinucleotida conform invenţiei, capabilă să exprime constructul de anticorp. În acest scop, polinucleotida sau molecula de acid nucleic este legată operativ de secvenţe martor.

Codul genetic este setul de reguli prin care informaţiile codificate în materialul genetic (acizi nucleici) sunt traduse în proteine. Decodificarea biologică în celulele vii este realizată de ribozom care leagă aminoacizii într-o ordine specificată de ARNm, folosind molecule de ARNt pentru a transporta aminoacizii şi pentru a citi trei nucleotide ARNm la un moment dat. Codul defineşte modul în care secvenţele acestor triplete de nucleotide, numite codoni, specifică ce aminoacid va fi adăugat în continuare în timpul sintezei proteinelor. Cu unele excepţii, un codon cu trei nucleotide într-o secvenţă de acid nucleic specifică un singur aminoacid. Deoarece marea majoritate a genelor sunt codificate cu exact acelaşi cod, acest cod particular este adesea denumit codul genetic canonic sau standard. În timp ce codul genetic determină secvenţa de proteine pentru o anumită regiune de codificare, alte regiuni genomice pot influenţa când şi unde sunt produse aceste proteine.

Mai mult, prezenta dezvăluire furnizează un vector care cuprinde o polinucleotidă/moleculă de acid nucleic conform invenţiei.

Un vector este o moleculă de acid nucleic folosită ca vehicul pentru a transfera material genetic (străin) într-o celulă. Termenul "vector" cuprinde - dar nu se limitează la - plasmide, virusuri, cosmide şi cromozomi artificiali. În general, vectorii proiectaţi cuprind o origine a replicării, un situs de multiclonare şi un marker selectabil. Vectorul în sine este, în general, o secvenţă nucleotidică, de obicei o secvenţă ADN, care cuprinde o inserţie (transgenă) şi o secvenţă mai mare care serveşte drept "schelet" al vectorului. Vectorii moderni pot cuprinde caracteristici suplimentare în afară de inserţia transgenică şi un schelet: promotor, marker genetic, rezistenţă la antibiotice, genă raportor, secvenţă de ţintire, etichetă de purificare a proteinelor. Vectorii numiţi vectori de exprimare (constructe de exprimare) sunt în mod specific pentru exprimarea transgenului în celula ţintă şi, în general, au secvenţe de control.

Termenul "secvenţe de control" se referă la secvenţe de ADN necesare pentru exprimarea unei secvenţe de codificare legate operabil într-un anumit organism gazdă. Secvenţele de control care sunt potrivite pentru procariote, de exemplu, includ un promotor, opţional o secvenţă operator şi un situs de legare a ribozomilor. Se ştie că celulele eucariote utilizează promotori, semnale de poliadenilare şi potenţiatori.

Un acid nucleic este "legat operabil" atunci când este amplasat într-o relaţie funcţională cu o altă secvenţă de acid nucleic. De exemplu, ADN-ul pentru o pre-secvenţă sau un lider secretor este legat operabil de ADN-ul pentru o polipeptidă dacă este exprimat ca o preproteină care participă la secreţia polipeptidei; un promotor sau amplificator este legat operabil de o secvenţă de codificare dacă afectează transcrierea secvenţei; sau un situs de legare a ribozomului este legat operabil de o secvenţă de codificare dacă este poziţionat astfel încât să faciliteze translaţia. În general, "legat operabil" înseamnă că secvenţele ADN care sunt legate sunt adiacente şi, în cazul unui lider secretor, adiacente şi în fază de citire. Cu toate acestea, amplificatorii nu trebuie să fie adiacenţi. Legarea se realizează prin ligare la situsuri de restricţie convenabile. Dacă astfel de situsuri nu există, adaptoarele sau linkerele oligonucleotidice sintetice sunt utilizate în conformitate cu practica convenţională.

"Transfecţia" este procesul de introducere deliberată a moleculelor de acid nucleic sau a polinucleotidelor (inclusiv vectori) în celulele ţintă. Termenul este utilizat mai ales pentru metodele non-virale în celulele eucariote. Transducţia este adesea utilizată pentru a descrie transferul de molecule de acid nucleic sau de polinucleotide mediat de virus. Transfecţia celulelor animale implică de obicei deschiderea porilor tranzitorii sau "găurilor" în membrana celulară, pentru a permite absorbţia materialului. Transfecţia poate fi efectuată folosind fosfat de calciu, prin electroporare, prin stoarcere celulară sau prin amestecarea unei lipide cationice cu materialul pentru a produce lipozomi, care se fuzionează cu membrana celulară şi îşi depun încărcătura în interior.

Termenul "transformare" este utilizat pentru a descrie transferul non-viral al moleculelor de acid nucleic sau al polinucleotidelor (inclusiv vectori) în bacterii şi, de asemenea, în celule eucariote non-animale, inclusiv celule vegetale. Transformarea este, prin urmare, modificarea genetică a unei celule eucariote bacteriene sau non-animale, rezultată din absorbţia directă prin membrana celulară (membranele celulare) din mediul înconjurător şi încorporarea ulterioară a materialului genetic exogen (molecule de acid nucleic). Transformarea poate fi efectuată prin mijloace artificiale. Pentru ca transformarea să se întâmple, celulele sau bacteriile trebuie să se afle într-o stare de competenţă, care ar putea apărea ca răspuns limitat la condiţii de mediu, cum ar fi înfometarea şi densitatea celulară.

Mai mult, invenţia furnizează o celulă gazdă transformată sau transfectată cu polinucleotida/molecula de acid nucleic conform invenţiei. Sunt, de asemenea, dezvăluite celulele gazdă transformate sau transfectate cu vectorul descris aici.

Aşa cum sunt utilizaţi aici, termenii "celulă gazdă" sau "celulă receptor" sunt intenţionaţi să includă orice celulă individuală sau cultură celulară care poate fi sau a fost receptor de vectori, molecule exogene de acid nucleic şi polinucleotide care codifică constructul de anticorp al prezentei invenţii; şi/sau receptori ai constructului de anticorp în sine. Introducerea materialului respectiv în celulă se realizează prin transformare, transfecţie şi altele asemenea. Termenul "celulă gazdă" este, de asemenea, destinat să includă descendenţi sau descendenţi potenţiali ai unei singure celule. Deoarece anumite modificări pot apărea în generaţiile următoare, fie din cauza mutaţiei naturale, accidentale sau deliberate, fie din cauza influenţelor mediului, astfel de descendenţi nu pot fi, de fapt, complet identici (în morfologie sau în complement genomic sau ADN total) cu celula părinte, dar sunt încă incluşi în domeniul de aplicare al termenului aşa cum este utilizat aici. Celulele gazdă adecvate includ celule procariote sau eucariote şi includ în plus, dar nu se limitează la, bacterii, celule de drojdie, celule fungice, celule vegetale şi celule animale, cum ar fi celule de insecte şi celule de mamifere, de exemplu, murine, de şobolan, de macac sau umane.

Constructul de anticorp conform invenţiei poate fi produs în bacterii. După exprimare, constructul de anticorp conform invenţiei este izolat de pasta celulară de E. coli într-o fracţiune solubilă şi poate fi purificat, de exemplu, prin cromatografie de afinitate şi/sau de excludere pe baza mărimii. Purificarea finală poate fi efectuată similar cu procesul de purificare a anticorpului exprimat, de ex., în celule CHO.

În plus faţă de procariote, microbii eucarioţi, cum ar fi ciupercile filamentoase sau drojdia, sunt gazde de clonare sau exprimare adecvate pentru constructul de anticorp conform invenţiei. Saccharomyces cerevisiae, sau drojdia obişnuită de panificaţie, este cea mai utilizată dintre microorganismele gazdă eucariote inferioare. Cu toate acestea, un număr de alte genuri, specii şi tulpini sunt disponibile în mod obişnuit şi utile aici, cum ar fi Schizosaccharomyces pombe, gazde Kluyveromyces, cum ar fi K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans, şi K. marxianus; yarrowia (EP 402 226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, cum ar fi Schwanniomyces occidentalis; şi ciuperci filamentoase, cum ar fi gazde Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, şi Aspergillus, cum ar fi A. nidulans şi A. niger.

Celulele gazdă adecvate pentru exprimarea constructului de anticorp glicozilat conform invenţiei sunt derivate din organisme multicelulare. Exemplele de celule nevertebrate includ celule de plante şi insecte. Au fost identificate numeroase tulpini şi variante baculovirale şi celule gazdă de insecte permisive corespunzătoare de la gazde, cum ar fi Spodoptera frugiperda (omidă), Aedes aegypti (ţânţar), Aedes albopictus (ţânţar), Drosophila melanogaster (drosofila), şi Bombyx mori. O varietate de tulpini virale pentru transfecţie sunt disponibile public, de ex., varianta L-1 a Autographa californica NPV şi tulpina Bm-5 a Bombyx mori NPV, şi astfel de virusuri se pot utiliza ca virus aici conform prezentei invenţii, în special pentru transfecţia celulelor de Spodoptera frugiperda.

Culturile de celule vegetale de bumbac, porumb, cartofi, soia, petunia, roşii, Arabidopsis şi tutun pot fi, de asemenea, folosite ca gazde. Clonarea şi vectorii de exprimare utili în producţia de proteine ​​în cultura celulelor vegetale sunt cunoscute de specialiştii în domeniu. A se vedea de ex. Hiatt şi colab., Nature (1989) 342: 76-78, Owen şi colab. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko şi colab. (1995) The Plant J 8: 745-750, şi Fecker şi colab. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

Cu toate acestea, interesul a fost cel mai mare în celulele de vertebrate, iar propagarea celulelor de vertebrate în cultură (cultură de ţesuturi) a devenit o procedură de rutină. Exemple de linii de celule gazdă de mamifere utile sunt linia CV1 de rinichi de maimuţă transformată de SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linia renală embrionară umană (293 sau 293 celule subclonate pentru creştere în cultură în suspensie, Graham şi colab. , J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); celule renale de pui de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celule ovariene de hamster chinezesc/-DHFR/-DHFR (CHO, Urlaub şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 77: 4216 (1980)); celule Sertoli de şoarece (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); celule renale de maimuţă (CVI ATCC CCL 70); celule renale de maimuţă verde africană (VERO-76, ATCC CRL1587); celule de carcinom cervical uman (HELA, ATCC CCL 2); celule renale canine (MOCK, ATCC CCL 34); celule hepatice de şobolan buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celule pulmonare umane (W138, ATCC CCL 75); celule hepatice umane (Hep G2,1413 8065); tumoare mamară de şoarece (MMT 060562, ATCC CCL5 1); celule TRI (Mather şi colab., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); celule MRC 5; celule FS4; şi o linie de hepatom uman (Hep G2).

Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, un procedeu pentru producerea unui construct de anticorp conform invenţiei, procedeul menţionat cuprinzând cultivarea unei celule gazdă a invenţiei în condiţii care să permită exprimarea constructului de anticorp conform invenţiei şi recuperarea constructului de anticorp produs din cultură.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "cultură" se referă la menţinerea, diferenţierea, creşterea, proliferarea şi/sau propagarea in vitro a celulelor în condiţii adecvate într-un mediu. Termenul "exprimare" include orice etapă implicată în producerea unui construct de anticorp conform invenţiei incluzând, dar fără a se limita la, transcriere, modificare post-transcripţională, translaţie, modificare post-translaţională şi secreţie.

Când se utilizează tehnici de recombinare, constructul de anticorp poate fi produs intracelular, în spaţiul periplasmatic sau secretat direct în mediu. Dacă constructul de anticorp este produs intracelular, ca primă etapă, resturile de particule, fie celule gazdă, fie fragmente lizate, sunt îndepărtate, de exemplu, prin centrifugare sau ultrafiltrare. Carter şi colab., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) descriu o procedură pentru izolarea anticorpilor care sunt secretaţi în spaţiul periplasmatic al E. coli. Pe scurt, pasta celulară este decongelată în prezenţa acetatului de sodiu (pH 3,5), EDTA şi fenilmetilsulfonilfluorură (PMSF) timp de aproximativ 30 de minute. Resturile celulare pot fi îndepărtate prin centrifugare. În cazul în care anticorpul este secretat în mediu, supernatanţii din astfel de sisteme de exprimare sunt, în general, mai întâi concentraţi utilizând un filtru de concentraţie de proteine disponibil comercial, de exemplu, o unitate de ultrafiltrare Amicon sau Millipore Pellicon. Un inhibitor de protează, cum ar fi PMSF, poate fi inclus în oricare dintre etapele anterioare pentru inhibarea proteolizei şi pot fi incluse antibiotice pentru a preveni creşterea contaminanţilor accidentali.

Constructul de anticorp conform invenţiei preparat din celulele gazdă poate fi recuperat sau purificat utilizând, de exemplu, cromatografie cu hidroxilapatită, electroforeză pe gel, dializă şi cromatografie de afinitate. Alte tehnici de purificare a proteinelor, cum ar fi fracţionarea pe o coloană schimbătoare de ioni, precipitarea cu etanol, HPLC cu fază inversă, cromatografia pe silice, cromatografia pe heparină SEPHAROSE™, cromatografia pe o răşină schimbătoare de anioni sau cationi (cum ar fi o coloană de acid poliaspartic), focalizarea cromatografică, SDS-PAGE şi precipitarea cu sulfat de amoniu sunt, de asemenea, disponibile în funcţie de anticorpul care trebuie recuperat. În cazul în care constructul de anticorp conform invenţiei cuprinde un domeniu CH3, răşina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) este utilă pentru purificare.

Cromatografia de afinitate este o tehnică preferată de purificare. Matricea de care este ataşat ligandul de afinitate este cel mai adesea agaroză, dar sunt disponibile şi alte matrice. Matricele stabile mecanic, cum ar fi sticla cu pori controlaţi sau poli(stirendivinil)benzenul, permit viteze de curgere mai rapide şi timpi de procesare mai scurţi decât se poate obţine cu agaroză.

Mai mult, invenţia furnizează o compoziţie farmaceutică care cuprinde un construct de anticorp conform invenţiei. Este de preferat pentru compoziţia farmaceutică a invenţiei ca omogenitatea constructului de anticorp să fie ≥ 80%, mai preferabil ≥ 81%, ≥ 82%, ≥ 83%, ≥ 84% sau ≥ 85%, mai preferabil ≥ 86%, ≥ 87%, ≥ 88%, ≥ 89% sau ≥ 90%, mai preferabil ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94% sau ≥ 95% şi cel mai preferabil ≥ 96%, 97%, ≥ 98% sau ≥ 99%.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "compoziţie farmaceutică" se referă la o compoziţie care este adecvată pentru administrare la un pacient, de preferinţă la un pacient uman. Compoziţia farmaceutică preferată în mod deosebit a acestei invenţii cuprinde unul sau mai multe constructe de anticorpi conform invenţiei, de preferinţă într-o cantitate eficientă terapeutic. De preferinţă, compoziţia farmaceutică mai cuprinde formulări adecvate ale unuia sau mai multor purtători, stabilizatori, excipienţi, diluanţi, solubilizatori, surfactanţi, emulgatori, conservanţi şi/sau adjuvanţi (eficienţi farmaceutic). Constituenţii acceptabili ai compoziţiei sunt de preferinţă netoxici pentru destinatari la dozele şi concentraţiile utilizate. Compoziţiile farmaceutice conform invenţiei includ, dar nu se limitează la, compoziţii lichide, congelate şi liofilizate.

Compoziţiile inventive pot cuprinde un purtător acceptabil farmaceutic. În general, aşa cum este utilizat aici, "purtător acceptabil farmaceutic" înseamnă orice soluţie apoasă şi neapoasă, soluţii sterile, solvenţi, tampoane, de ex. soluţii saline tamponate cu fosfat (PBS), apă, suspensii, emulsii, cum ar fi emulsii ulei/apă, diferite tipuri de agenţi de umectare, lipozomi, medii de dispersie şi acoperiri, care sunt compatibile cu administrarea farmaceutică, în special cu administrarea parenterală. Utilizarea unor astfel de medii şi agenţi în compoziţii farmaceutice este bine-cunoscută în domeniu, iar compoziţiile care cuprind astfel de purtători pot fi formulate prin metode convenţionale bine-cunoscute.

Anumite exemple de realizare furnizează compoziţii farmaceutice care cuprind constructul de anticorp conform invenţiei şi în plus unul sau mai mulţi excipienţi, cum ar fi cei descrişi ilustrativ în această secţiune şi în altă parte aici. Excipienţii pot fi utilizaţi în invenţie în acest sens pentru o mare varietate de scopuri, cum ar fi ajustarea proprietăţilor fizice, chimice sau biologice ale formulărilor, cum ar fi ajustarea vâscozităţii, sau a proceselor invenţiei pentru a îmbunătăţi eficacitatea şi/sau pentru a stabiliza astfel de formulări şi procese împotriva degradării şi deteriorării datorate, de exemplu, stresurilor care apar în timpul fabricaţiei, transportului, depozitării, pregătirii înainte de utilizare, administrării şi ulterior.

În anumite exemple de realizare, compoziţia farmaceutică poate conţine materiale de formulare în scopul modificării, menţinerii sau conservării, de ex., a pH-ului, osmolarităţii, vâscozităţii, clarităţii, culorii, izotonicităţii, mirosulului, sterilităţii, stabilităţii, vitezei de dizolvare sau eliberare, adsorbţiei sau penetrării compoziţiei (a se vedea, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Ediţia 18", (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company). În astfel de exemple de realizare, materialele de formulare adecvate pot include, dar nu se limitează la:

• aminoacizi, cum ar fi glicina, alanina, glutamina, asparagina, treonina, prolina, 2-fenilalanina, inclusiv aminoacizii încărcaţi, de preferinţă lizina, acetatul de lizină, arginina, glutamatul şi/sau histidina • antimicrobiene, cum ar fi agenţi antibacterieni şi antifungici • antioxidanţi, cum ar fi acidul ascorbic, metionina, sulfitul de sodiu sau hidrogensulfitul de sodiu; • tampoane, sisteme tampon şi agenţi de tamponare care sunt utilizaţi pentru a menţine compoziţia la pH fiziologic sau la un pH uşor mai scăzut, de obicei într-un interval de pH de la aproximativ 5 la aproximativ 8 sau 9; exemple de soluţii tampon sunt borat, bicarbonat, Tris-HCI, citraţi, fosfaţi sau alţi acizi organici, succinat, fosfat, histidină şi acetat; de exemplu, tampon Tris de aproximativ pH 7,0-8,5, sau tampon acetat de aproximativ pH 4,0-5,5; • solvenţi neapoşi, cum ar fi propilenglicolul, polietilenglicolul, uleiuri vegetale, cum ar fi uleiul de măsline şi esteri organici injectabili, cum ar fi oleatul de etil; • purtători apoşi incluzând apă, soluţii alcoolice/apoase, emulsii sau suspensii, inclusiv soluţii saline şi medii tamponate; • polimeri biodegradabili, cum ar fi poliesterii; • agenţi de încărcare, cum ar fi manitolul sau glicina; • agenţi de chelare, cum ar fi acidul etilendiaminotetraacetic (EDTA); • agenţi izotonici şi de întârziere a absorbţiei; • agenţi de complexare, cum ar fi cafeina, polivinilpirolidona, beta-ciclodextrina sau hidroxipropil-beta-ciclodextrina) • materiale de umplutură; • monozaharide; dizaharide; şi alţi carbohidraţi (cum ar fi glucoza, manoza sau dextrinele); carbohidraţii pot fi zaharuri nereducătoare, de preferinţă trehaloză, zaharoză, octasulfat, sorbitol sau xilitol; • proteine, polipeptide sau purtători proteici (cu greutate moleculară mică), cum ar fi albumina serică umană sau bovină, gelatina sau imunoglobulinele, de preferinţă de origine umană; • coloranţi şi aromatizanţi; • agenţi reducători care conţin sulf, cum ar fi glutationul, acidul tioctic, tioglicolatul de sodiu, tioglicerolul, [alfa]-monotioglicerolul şi tiosulfatul de sodiu • agenţi de diluare; • agenţi de emulsionare; • polimeri hidrofili, cum ar fi polivinilpirolidona) • contraioni care formează sare, cum ar fi sodiul; • conservanţi, cum ar fi antimicrobieni, antioxidanţi, agenţi de chelare, gaze inerte şi altele asemenea; exemple sunt: clorură de benzalconiu, acid benzoic, acid salicilic, timerosal, alcool fenetilic, metilparaben, propilparaben, clorhexidină, acid sorbic sau peroxid de hidrogen); • complexe metalice, cum ar fi complexe Zn-proteină; • solvenţi şi co-solvenţi (cum ar fi glicerina, propilenglicolul sau polietilenglicolul); • zaharuri şi alcooli de zahăr, cum ar fi trehaloză, zaharoză, octasulfat, manitol, sorbitol sau xilitol stahioză, manoză, sorboză, xiloză, riboză, mioinizitoză, galactoză, lactitol, ribitol, mioinizitol, galactitol, glicerol, ciclitoli (de ex., inozitol), polietilenglicol; şi alcooli de zahăr polihidrici; • agenţi de suspendare; • surfactanţi sau agenţi de umectare, cum ar fi pluronici, PEG, esteri de sorbitan, polisorbaţi, cum ar fi polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamină, lecitină, colesterol, tiloxapal; surfactanţii pot fi detergenţi, de preferinţă cu o greutate moleculară > 1,2 KD şi/sau un polieter, de preferinţă cu o greutate moleculară > 3 KD; exemple nelimitative pentru detergenţii preferaţi sunt Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 şi Tween 85; exemple nelimitative de polieteri preferaţi sunt PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 şi PEG 5000; • agenţi de îmbunătăţire a stabilităţii, cum ar fi zaharoza sau sorbitolul; • agenţi de creştere a tonicităţii, cum ar fi halogenuri de metale alcaline, de preferinţă clorură de sodiu sau potasiu, manitol sorbitol; • vehicule de livrare parenterală, inclusiv soluţie de clorură de sodiu, dextroză Ringer, dextroză şi clorură de sodiu, Ringer lactat sau uleiuri fixe; • vehicule de administrare intravenoasă, incluzând substanţe de completare cu fluide şi nutrienţi, agenţi de completare cu electroliţi (cum ar fi cele pe bază de dextroză Ringer).

Este evident pentru specialiştii în domeniu că diferiţii constituenţi ai compoziţiei farmaceutice (de ex., cei enumeraţi mai sus) pot avea efecte diferite, de exemplu, iar aminoacidul poate acţiona ca un tampon, un stabilizator şi/sau un antioxidant; manitolul poate acţiona ca un agent de încărcare şi/sau un agent de creştere a tonicităţii; clorura de sodiu poate acţiona ca vehicul de livrare şi/sau agent de creştere a tonicităţii; etc.

Este avut în vedere că compoziţia conform invenţiei poate cuprinde, în plus faţă de polipeptida conform invenţiei definită aici, alţi agenţi activi biologic, în funcţie de utilizarea intenţionată a compoziţiei. Astfel de agenţi pot fi medicamente care acţionează asupra sistemului gastro-intestinal, medicamente care acţionează ca citostatice, medicamente care previn hiperuricemia, medicamente care inhibă imunoreacţiile (de ex. corticosteroizi), medicamente care modulează răspunsul inflamator, medicamente care acţionează asupra sistemului circulator şi/sau agenţi, cum ar fi citokinele cunoscute în domeniu. Este avut în vedere, de asemenea, ca constructul de anticorp din prezenta invenţie să fie aplicat într-o co-terapie, adică, în combinaţie cu un alt medicament anti-cancer.

În anumite exemple de realizare, compoziţia farmaceutică optimă va fi determinată de un specialist în domeniu în funcţie, de exemplu, de calea de administrare intenţionată, formatul de livrare şi doza dorită. A se vedea, de exemplu, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. În anumite exemple de realizare, astfel de compoziţii pot influenţa starea fizică, stabilitatea, viteza eliberarea in vivo şi rata de eliminare in vivo a constructului de anticorp conform invenţiei. În anumite variante de realizare, vehiculul primar sau purtătorul dintr-o compoziţie farmaceutică poate fi fie apos, fie neapos. De exemplu, un vehicul sau purtător adecvat poate fi apă pentru preparate injectabile, soluţie salină fiziologică sau lichid cefalorahidian artificial, eventual suplimentat cu alte materiale comune în compoziţii pentru administrare parenterală. Soluţia salină tamponată neutră sau soluţia salină amestecată cu albumină serică sunt alte vehicule cu titlu de exemplu. În anumite exemple de realizare, constructul de anticorp al compoziţiilor invenţiei poate fi preparat pentru depozitare prin amestecarea compoziţiei selectate având gradul dorit de puritate cu agenţi de formulare opţionali (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) sub formă de turtă liofilizată sau soluţie apoasă. Mai mult, în anumite exemple de realizare, constructul de anticorp conform invenţiei poate fi formulat ca un liofilizat utilizând excipienţi adecvaţi, cum ar fi zaharoza.

Când se are în vedere administrarea parenterală, compoziţiile terapeutice pentru utilizare în această invenţie pot fi furnizate sub formă de soluţie apoasă apirogenă, acceptabilă parenteral, cuprinzând constructul de anticorp dorit al invenţiei într-un vehicul acceptabil farmaceutic. Un vehicul deosebit de potrivit pentru injecţia parenterală este apa distilată sterilă în care constructul de anticorp conform invenţiei este formulat ca o soluţie sterilă, izotonică, conservată corespunzător. În anumite exemple de realizare, preparatul poate implica formularea moleculei dorite cu un agent, cum ar fi microsfere injectabile, particule bio-erodabile, compuşi polimerici (cum ar fi acidul polilactic sau acidul poliglicolic), perle sau lipozomi, care pot furniza eliberarea controlată sau susţinută a produsului care poate fi livrat prin injecţie depozit. În anumite exemple de realizare, acidul hialuronic poate fi de asemenea utilizat, având ca efect promovarea unei durate susţinute în circulaţie. În anumite exemple de realizare, dispozitivele de eliberare a medicamentelor implantabile pot fi utilizate pentru a introduce constructul de anticorp dorit.

Compoziţiile farmaceutice suplimentare vor fi evidente pentru specialiştii în domeniu, incluzând formulări care implică constructul de anticorp conform invenţiei în formulări cu livrare/eliberare susţinută sau controlată. Tehnicile pentru formularea unei varietăţi de alte mijloace de livrare susţinută sau controlată, cum ar fi purtători de lipozomi, microparticule bioerodabile sau granule poroase şi injecţii depozit, sunt, de asemenea, cunoscute specialiştilor în domeniu. A se vedea, de exemplu, cererea internaţională de brevet nr. WO93/15722, care descrie eliberarea controlată a microparticulelor polimerice poroase pentru livrarea compoziţiilor farmaceutice. Preparatele cu eliberare susţinută pot include matrice polimerice semipermeabile sub formă de articole modelate, de ex., filme sau microcapsule. Matricele cu eliberare susţinută pot include poliesteri, hidrogeluri, polilactide (aşa cum sunt dezvăluite în Brevetul SUA Nr. 3.773.919 şi publicaţia cererii de brevet european nr. EP 058481), copolimeri de acid L-glutamic şi gamma etil-L-glutamat (Sidman şi colab., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroxietil-metacrilat) (Langer şi colab., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 şi Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etilen-acetat de vinil (Langer şi colab., 1981, supra) sau acid poli-D(-)-3-hidroxibutiric (publicaţia cererii de brevet european nr. EP 133.988). Compoziţiile cu eliberare susţinută pot include, de asemenea, lipozomi care pot fi preparaţi prin oricare dintre mai multe metode cunoscute în domeniu. A se vedea, de ex., Eppstein şi colab., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. S.U.A. 82:3688-3692; publicaţiile cererilor de brevet european nr. EP 036.676; EP 088.046 şi EP 143.949.

Constructul de anticorp poate fi, de asemenea, prins în microcapsule preparate, de exemplu, prin tehnici de coacervare sau prin polimerizare interfacială (de exemplu, hidroximetilceluloză sau microcapsule de gelatină şi, respectiv, microcapsule de poli(metilmetacilat), în sisteme de administrare coloidală a medicamentelor (de exemplu, lipozomi), microsfere de albumină, microemulsii, nanoparticule şi nanocapsule), sau în macroemulsii. Astfel de tehnici sunt dezvăluite în Remington's Pharmaceutical Sciences, ediţia a 16-a, Oslo, A., Ed., (1980).

Compoziţii farmaceutice utilizate pentru administrarea in vivo sunt de obicei furnizate ca preparate sterile. Sterilizarea poate fi realizată prin filtrare prin membrane de filtrare sterile. Când compoziţia este liofilizată, sterilizarea utilizând această metodă poate fi efectuată fie înainte, fie după liofilizare şi reconstituire. Compoziţiile pentru administrare parenterală pot fi stocate sub formă liofilizată sau într-o soluţie. Compoziţiile parenterale sunt, în general, amplasate într-un recipient având un orificiu de acces steril, de exemplu, o pungă de soluţie intravenoasă sau un flacon având un dop de străpuns de un ac hipodermic de injecţie.

Un alt aspect al invenţiei include constructul de anticorp auto-tamponant al formulărilor invenţiei, care poate fi utilizat drept compoziţii farmaceutice, aşa cum este descris în cererea de brevet internaţional WO 06138181A2. Sunt disponibile o varietate de expuneri privind stabilizarea proteinelor şi materialele de formulare şi metodele utile în acest sens, cum ar fi Arakawa şi colab., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick şi colab., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution" în: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, ed. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), şi Randolph şi colab., "Surfactant-protein interactions", Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), a se vedea în special părţile relevante pentru excipienţi şi procese ale acestora pentru formulări de proteine auto-tamponante în conformitate cu prezenta invenţie, în special în ceea ce priveşte produsele farmaceutice proteice şi procedeele pentru utilizări medicale veterinare şi/sau umane.

Sărurile pot fi utilizate în conformitate cu anumite exemple de realizare ale invenţiei, de exemplu, pentru a ajusta puterea ionică şi/sau izotonicitatea unei formulări şi/sau pentru a îmbunătăţi solubilitatea şi/sau stabilitatea fizică a unei proteine sau a altui ingredient al unei compoziţii în conformitate cu invenţia. După cum se ştie, ionii pot stabiliza starea nativă a proteinelor prin legarea la reziduurile încărcate de pe suprafaţa proteinei şi prin protejarea grupărilor încărcate şi polare din proteină şi prin reducerea rezistenţei interacţiunilor lor electrostatice, a interacţiunilor atractive şi de respingere. Ionii pot stabiliza, de asemenea, starea denaturată a unei proteine ​​prin legarea, în special, la legăturile peptidice denaturate (--CONH) ale proteinei. Mai mult, interacţiunea ionică cu grupările încărcate şi polare dintr-o proteină poate reduce, de asemenea, interacţiunile electrostatice intermoleculare şi, prin urmare, poate preveni sau reduce agregarea şi insolubilitatea proteinelor.

Speciile ionice diferă semnificativ în ceea ce priveşte efectele lor asupra proteinelor. Au fost dezvoltate mai multe clasificări categorice ale ionilor şi efectelor acestora asupra proteinelor, care pot fi utilizate în formularea compoziţiilor farmaceutice în conformitate cu invenţia. Un exemplu este seria Hofmeister, care clasifică dizolvaţi ionici şi polari neionici prin efectul lor asupra stabilităţii conformaţionale a proteinelor în soluţie. Dizolvaţii stabilizatori sunt denumiţi „kosmotropici». Dizolvaţii destabilizanţi sunt denumiţi „chaotropici». Kosmotropii sunt utilizaţi în mod obişnuit la concentraţii mari (de ex., >1 molar sulfat de amoniu) pentru a precipita proteinele din soluţie ("salifiere"). Chaotropii sunt utilizaţi în mod obişnuit pentru a denatura şi/sau pentru a solubiliza proteinele ("solubilizare salină"). Eficacitatea relativă a ionilor de "salifiere» şi "solubilizare salină» defineşte poziţia lor în seria Hofmeister.

Aminoacizii liberi pot fi utilizaţi în constructul de anticorp al formulărilor din invenţie în conformitate cu diferite exemple de realizare ale invenţiei ca agenţi de încărcare, stabilizatori şi antioxidanţi, precum şi alte utilizări standard. Lizina, prolina, serina şi alanina pot fi utilizate pentru stabilizarea proteinelor într-o formulare. Glicina este utilă în liofilizare pentru a asigura structura şi proprietăţile corecte ale turtei. Arginina poate fi utilă pentru a inhiba agregarea proteinelor, atât în formulări lichide, cât şi în formulări liofilizate. Metionina este utilă ca antioxidant.

Poliolii includ zaharuri, de ex., manitol, zaharoză şi sorbitol şi alcooli polihidroxilici, cum ar fi, de exemplu, glicerol şi propilenglicol şi, în scopul discutării aici, polietilenglicol (PEG) şi substanţe înrudite. Poliolii sunt kosmotropici. Sunt agenţi stabilizatori utili atât în formulări lichide, cât şi în formulări liofilizate pentru a proteja proteinele de procesele de degradare fizică şi chimică. Poliolii sunt, de asemenea, utili pentru ajustarea tonicităţii formulărilor. Printre polioli utili în anumite exemple de realizare ale invenţiei se numără manitolul, utilizat în mod obişnuit pentru a asigura stabilitatea structurală a turtei în formulările liofilizate. Asigură stabilitatea structurală a turtei. Este utilizat în general cu un lioprotector, de ex., zaharoză. Sorbitolul şi zaharoza sunt printre agenţii preferaţi pentru ajustarea tonicităţii şi ca stabilizatori pentru a proteja împotriva tensiunilor de îngheţ-dezgheţ în timpul transportului sau preparării volumelor în timpul procesului de fabricaţie. Zaharurile reducătoare (care conţin grupări de aldehidă sau cetonă libere), cum ar fi glucoza şi lactoza, pot glica reziduuri de lizină şi arginină de suprafaţă. Prin urmare, în general nu se numără printre poliolii preferaţi pentru utilizare în conformitate cu invenţia. În plus, zaharurile care formează astfel de specii reactive, cum ar fi zaharoza, care este hidrolizată în fructoză şi glucoză în condiţii acide şi, în consecinţă, generează glicare, nu sunt, de asemenea, printre poliolii preferaţi ai invenţiei în acest sens. PEG este util pentru stabilizarea proteinelor şi ca crioprotector şi poate fi utilizat în invenţie în acest sens.

Exemplele de realizare a constructului de anticorp al formulărilor din invenţie cuprind în plus surfactanţi. Moleculele de proteine pot fi susceptibile la adsorbţie pe suprafeţe şi la denaturare şi agregare consecventă la interfeţele aer-lichid, solid-lichid şi lichid-lichid. Aceste efecte se amplifică în general invers cu concentraţia de proteine. Aceste interacţiuni dăunătoare cresc în general invers cu concentraţia de proteine şi de obicei sunt exacerbate de agitaţia fizică, cum ar fi cea generată în timpul transportului şi manipulării unui produs. Surfactanţii sunt utilizaţi în mod obişnuit pentru a preveni, minimiza sau reduce adsorbţia la suprafaţă. Surfactanţii utili din invenţie în această privinţă includ polisorbat 20, polisorbat 80, alţi esteri ai acizilor graşi ai polietoxilaţilor de sorbitan şi poloxamer 188. Surfactanţii sunt, de asemenea, utilizaţi în mod obişnuit pentru a controla stabilitatea conformaţională a proteinelor. Utilizarea surfactanţilor în acest sens este specifică proteinelor, deoarece orice surfactant dat va stabiliza de obicei unele proteine ​​şi le va destabiliza pe altele.

Polisorbaţii sunt susceptibili la degradarea oxidativă şi adesea, aşa cum sunt furnizaţi, conţin cantităţi suficiente de peroxizi pentru a provoca oxidarea lanţurilor laterale ale reziduurilor de proteine, în special metionina. În consecinţă, polisorbaţii trebuie utilizaţi cu atenţie şi, atunci când sunt folosiţi, trebuie utilizaţi la cea mai mică concentraţie eficientă. În acest sens, polisorbaţii exemplifică regula generală conform căreia excipienţii trebuie utilizaţi în concentraţiile lor eficiente cele mai scăzute.

Exemplele de realizare a constructului de anticorp al formulărilor invenţiei cuprind în plus unul sau mai mulţi antioxidanţi. Într-o oarecare măsură oxidarea dăunătoare a proteinelor poate fi prevenită în formulările farmaceutice prin menţinerea nivelurilor adecvate de oxigen şi temperatură ambientală şi evitarea expunerii la lumină. Excipienţii antioxidanţi pot fi folosiţi şi pentru a preveni degradarea oxidativă a proteinelor. Printre antioxidanţii utili în această privinţă se numără agenţii reducători, captatorii de oxigen/radicali liberi şi agenţii de chelare. Antioxidanţii pentru utilizare în formulări de proteine terapeutice în conformitate cu invenţia sunt de preferinţă solubili în apă şi îşi menţin activitatea pe toată durata de valabilitate a unui produs. EDTA este un antioxidant preferat în conformitate cu invenţia în acest sens. Antioxidanţii pot deteriora proteinele. De exemplu, agenţii reducători, cum ar fi glutationul în special, pot perturba legăturile disulfură intramoleculare. Astfel, antioxidanţii pentru utilizare în invenţie sunt selectaţi, printre altele, să elimine sau să reducă suficient posibilitatea de a deteriora proteinele în formulare.

Formulările în conformitate cu invenţia pot include ioni metalici care sunt co-factori proteici şi care sunt necesari pentru a forma complexe de coordonare a proteinelor, cum ar fi zincul necesar pentru a forma anumite suspensii de insulină. Ionii metalici pot, de asemenea, inhiba unele procese care degradează proteinele. Cu toate acestea, ionii metalici catalizează şi procesele fizice şi chimice care degradează proteinele. Ionii de magneziu (10-120 mM) pot fi folosiţi pentru a inhiba izomerizarea acidului aspartic în acid izoaspartic. Ionii Ca+2 (până la 100 mM) pot creşte stabilitatea dezoxiribonucleazei umane. Mg+2, Mn+2, şi Zn+2, de altfel, pot destabiliza rhDNaza. În mod similar, Ca+2 şi Sr+2 pot stabiliza Factorul VIII, poate fi destabilizat de Mg+2, Mn+2 şi Zn+2, Cu+2 şi Fe+2, iar agregarea sa poate fi crescută de ionii Al+3.

Exemplele de realizare a constructului de anticorp al formulărilor din invenţie cuprind în plus unul sau mai mulţi conservanţi. Conservanţii sunt necesari atunci când se dezvoltă formulări parenterale cu doze multiple care implică mai multe extracţii din acelaşi recipient. Funcţia lor principală este de a inhiba creşterea microbiană şi de a asigura sterilitatea produsului pe toată durata de valabilitate sau pe durata utilizării produsului medicamentos. Conservanţii utilizaţi în mod obişnuit includ alcool benzilic, fenol şi m-crezol. Deşi conservanţii au o istorie lungă de utilizare cu parenteralele cu molecule mici, dezvoltarea formulărilor de proteine ​​care includ conservanţi poate fi o provocare. Conservanţii au aproape întotdeauna un efect destabilizator (agregare) asupra proteinelor, iar acest lucru a devenit un factor major în limitarea utilizării lor în formulări de proteine ​​cu doze multiple. Până în prezent, cele mai multe medicamente proteice au fost formulate numai pentru o singură utilizare. Cu toate acestea, atunci când sunt posibile formulări cu mai multe doze, acestea au avantajul suplimentar de a permite confortul pacientului şi o comercializare crescută. Un bun exemplu este cel al hormonului de creştere uman (hGH) în care dezvoltarea formulărilor conservate a condus la comercializarea unor prezentări mai convenabile, cu stilou de injecţie multi uz. Cel puţin patru astfel de dispozitive stilou care conţin formulări conservate de hGH sunt disponibile în prezent pe piaţă. Norditropin (lichid, Novo Nordisk), Nutropin AQ (lichid, Genentech) şi Genotropin (liofilizat - cartuş cu cameră dublă, Pharmacia & Upjohn) conţin fenol în timp ce Somatrope (Eli Lilly) este formulat cu m-crezol. Mai multe aspecte trebuie luate în considerare în timpul formulării şi dezvoltării formelor de dozare conservate. Concentraţia eficientă de conservant în produsul medicamentos trebuie optimizată. Acest lucru necesită testarea unui conservant dat sub formă de dozare cu intervale de concentraţie care conferă eficacitate antimicrobiană fără a compromite stabilitatea proteinelor.

După cum ar fi de aşteptat, dezvoltarea formulărilor lichide care conţin conservanţi este mai dificilă decât a formulărilor liofilizate. Produsele liofilizate pot fi liofilizate fără conservant şi reconstituite cu un conservant care conţine diluant în momentul utilizării. Acest lucru scurtează timpul în care un conservant este în contact cu proteina, minimizând semnificativ riscurile de stabilitate asociate. Cu formulările lichide, eficacitatea şi stabilitatea conservanţilor trebuie menţinute pe întreaga durată de valabilitate a produsului (aproximativ 18 până la 24 de luni). Un punct important de remarcat este că eficacitatea conservantului trebuie demonstrată în formularea finală care conţine medicamentul activ şi toate componentele de excipient.

Constructele de anticorpi dezvăluite aici pot fi, de asemenea, formulate ca imuno-lipozomi. Un "lipozom" este o veziculă mică compusă din diferite tipuri de lipide, fosfolipide şi/sau surfactant, care este utilă pentru livrarea unui medicament la un mamifer. Componentele lipozomului sunt aranjate în mod obişnuit într-o formaţiune bistratificată, similară cu aranjamentul lipidic al membranelor biologice. Lipozomii care conţin constructul de anticorp sunt preparaţi prin metode cunoscute în domeniu, cum sunt cele descrise în Epstein şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 82: 3688 (1985); Hwang şi colab. , Proc. Natl Acad. Sci. SUA, 77: 4030 (1980); Brevetele SUA Nr. 4.485.045 şi 4.544.545; şi WO 97/38731. Lipozomii cu timp de circulaţie îmbunătăţit sunt dezvăluiţi în Brevetul SUA Nr. 5.013. 556. Lipozomii deosebit de utili pot fi generaţi prin metoda de evaporare în fază inversă cu o compoziţie lipidică cuprinzând fosfatidilcolină, colesterol şi fosfatidiletanolamină derivată de PEG (PEG-PE). Lipozomii sunt extrudaţi prin filtre cu dimensiunea definită a porilor pentru a produce lipozomi cu diametrul dorit. Fragmentele Fab' ale constructului de anticorp din prezenta invenţie pot fi conjugate la lipozomi aşa cum este descris în Martin şi colab. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) printr-o reacţie de schimb de disulfuri. Un agent chimioterapeutic este opţional conţinut în lipozom. A se vedea Gabizon şi colab. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

Odată ce compoziţia farmaceutică a fost formulată, aceasta poate fi păstrată în flacoane sterile sub formă de soluţie, suspensie, gel, emulsie, solid, cristal sau sub formă de pulbere deshidratată sau liofilizată. Astfel de formulări pot fi depozitate fie într-o formă gata de utilizare, fie într-o formă (de ex., liofilizată) care este reconstituită înainte de administrare.

Activitatea biologică a compoziţiei farmaceutice definită aici poate fi determinată, de exemplu, prin teste de citotoxicitate, aşa cum este descris în următoarele exemple, în WO 99/54440 sau de Schlereth şi colab. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). "Eficacitate" sau "eficacitate in vivo" aşa cum este utilizată aici se referă la răspunsul la terapie prin compoziţia farmaceutică a invenţiei, folosind, de ex., criterii de răspuns NCI standardizate. Succesul sau eficacitatea in vivo a terapiei folosind o compoziţie farmaceutică a invenţiei se referă la eficacitatea compoziţiei pentru scopul propus, adică capacitatea compoziţiei de a provoca efectul dorit, adică epuizarea celulelor patologice, de ex. celulelor tumorale. Eficacitatea in vivo poate fi monitorizată prin metode standard stabilite pentru entităţile bolii respective, incluzând, dar fără a se limita la numărătoarea de globule albe, diferenţiale, sortarea celulelor activate prin fluorescenţă, aspiraţia măduvei osoase. În plus, pot fi utilizaţi diferiţi parametri chimici clinici specifici bolii şi alte metode standard stabilite. În plus, se pot utiliza tomografia asistată de computer, raze X, tomografie prin rezonanţă magnetică nucleară (de ex. pentru evaluarea răspunsului pe baza criteriilor Institutului Naţional al Cancerului [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Raportul unui grup de lucru internaţional pentru standardizarea criteriilor de răspuns pentru limfoamele non-Hodgkin. Grupul de lucru internaţional sponsorizat de NCI. J Clin Oncol. 1999 apr;17(4):1244]), scanarea prin tomografie cu emisie de pozitroni, numărarea globulelor albe, diferenţiale, sortarea celulelor activate prin fluorescenţă, aspiraţia măduvei osoase, biopsiile/histologiile ganglionilor limfatici şi diverşi parametri de chimie clinică specifici limfomului (de exemplu, lactat dehidrogenază) şi alte metode standard stabilite.

O altă provocare majoră în dezvoltarea medicamentelor, cum ar fi compoziţia farmaceutică a invenţiei, este modularea predictibilă a proprietăţilor farmacocinetice. În acest scop, poate fi stabilit un profil farmacocinetic al medicamentului candidat, adică un profil al parametrilor farmacocinetici care afectează capacitatea unui anumit medicament de a trata o afecţiune dată. Parametrii farmacocinetici ai medicamentului care influenţează capacitatea unui medicament de a trata o anumită entitate de boală includ, dar nu se limitează la: timpul de înjumătăţire, volumul de distribuţie, metabolismul hepatic de prim pasaj şi gradul de legare a serului sanguin. Eficacitatea unui medicament dat poate fi influenţată de fiecare dintre parametrii menţionaţi mai sus.

"Timp de înjumătăţire" înseamnă timpul în care 50% dintr-un medicament administrat sunt eliminate prin procese biologice, de ex. metabolism, excreţie etc. Prin "metabolismul hepatic de prim pasaj" se înţelege tendinţa unui medicament de a fi metabolizat la primul contact cu ficatul, adică în timpul primei sale treceri prin ficat. "Volumul de distribuţie" înseamnă gradul de reţinere a unui medicament în diferite compartimente ale corpului, cum ar fi de ex. spaţii intracelulare şi extracelulare, ţesuturi şi organe etc. şi distribuţia medicamentului în aceste compartimente. "Gradul de legare a serului sanguin" înseamnă tendinţa unui medicament de a interacţiona cu şi de a se lega de proteinele serice din sânge, cum ar fi albumina, ducând la o reducere sau pierdere a activităţii biologice a medicamentului.

Parametrii farmacocinetici includ, de asemenea, biodisponibilitatea, timpul de întârziere (Tlag), Tmax, ratele de absorbţie, concentraţie mai mare de debut şi/sau Cmax pentru o anumită cantitate de medicament administrată. "Biodisponibilitate" înseamnă cantitatea de medicament din compartimentul de sânge. "Timp de întârziere" înseamnă întârzierea dintre administrarea medicamentului şi detectarea şi capacitatea acestuia de a fi măsurat în sânge sau plasmă. "Tmax" este timpul după care se atinge concentraţia maximă în sânge a medicamentului, iar "Cmax" este concentraţia din sânge maxim obţinută cu un anumit medicament. Timpul pentru atingerea unei concentraţii în sânge sau ţesuturi a medicamentului care este necesară pentru efectul său biologic este influenţat de toţi parametrii. Parametrii farmacocinetici ai constructelor de anticorpi bispecifici care prezintă specificitate între specii, care pot fi determinaţi în testele preclinice pe animale la primate non-cimpanzeu, aşa cum s-a subliniat mai sus, sunt de asemenea prezentaţi, de ex. în publicaţia de către Schlereth şi colab. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

Un exemplu de realizare furnizează constructul de anticorp conform invenţiei pentru utilizare în prevenirea sau tratamentul unei boli cu tumoare solidă sau a unei boli cu cancer metastatic.

Formulările descrise aici sunt utile drept compoziţii farmaceutice în tratamentul, ameliorarea şi/sau prevenirea afecţiunii medicale patologice descrise aici la un pacient care are nevoie de aceasta. Termenul "tratament" se referă atât la tratamentul terapeutic, cât şi la măsurile profilactice sau preventive. Tratamentul include aplicarea sau administrarea formulării pe corp, un ţesut izolat sau o celulă de la un pacient care are o boală/tulburare, un simptom al unei boli/tulburări sau o predispoziţie către o boală/tulburare, cu scopul de a trata, vindeca, alina, uşura, modifica, remedia, ameliora, îmbunătăţi sau afecta boala, simptomul bolii sau predispoziţia spre boală.

Termenul "ameliorare", aşa cum este utilizat aici, se referă la orice îmbunătăţire a stării de boală a unui pacient care are o tumoare sau cancer sau un cancer metastatic, aşa cum este specificat mai jos, prin administrarea unui construct de anticorp conform invenţiei la un subiect care are nevoie de acesta. O astfel de îmbunătăţire poate fi văzută şi ca o încetinire sau oprire a progresiei p a tumorii sau a cancerului sau cancerului metastatic al pacientului. Termenul "prevenire", aşa cum este utilizat aici, înseamnă evitarea apariţiei sau reapariţiei la un pacient care are o tumoare sau cancer sau un cancer metastatic, aşa cum este specificat mai jos, prin administrarea unui construct de anticorp conform invenţiei la un subiect care are nevoie de aceasta.

Termenul "boală" se referă la orice condiţie care ar beneficia de tratamentul cu constructul de anticorp sau compoziţia farmaceutică descrisă aici. Aceasta include tulburări sau boli cronice şi acute, inclusiv acele condiţii patologice care predispun mamiferul la boala în cauză.

Un "neoplasm" este o creştere anormală a ţesutului, de obicei, dar nu întotdeauna, formând o masă. Atunci când se formează şi o masă, este denumită în mod obişnuit "tumoare". Neoplasmele sau tumorile sau pot fi benigne, potenţial maligne (precanceroase) sau maligne. Neoplasmele maligne sunt denumite în mod obişnuit cancer. De obicei, invadează şi distrug ţesutul înconjurător şi pot forma metastaze, adică se răspândesc în alte părţi, ţesuturi sau organe ale corpului. Prin urmare, termenul "cancer metastatic" cuprinde metastaze la alte ţesuturi sau organe decât cel al tumorii originale. Limfoamele şi leucemiile sunt neoplasme limfoide. În scopul prezentei invenţii, acestea sunt cuprinse, de asemenea, de termenii "tumoare" sau "cancer".

Într-un exemplu de realizare preferat al invenţiei, boala cu tumoare solidă şi boala cu cancer metastatic pot fi derivate din oricare dintre cele de mai sus.

Bolile cu tumoare preferate în legătură cu această invenţie sunt selectate dintr-un grup constând din cancer de sân, carcinoid, cancer de col uterin, cancer colorectal, cancer endometrial, cancer gastric, cancer de cap şi gât, mezoteliom, cancer de ficat, cancer pulmonar, cancer ovarian, cancer pancreatic, cancer de prostată, cancer de piele, cancer renal şi cancer de stomac. Mai preferabil, boala cu tumoare sau cancer, care este de preferinţă o boală cu tumoare solidă, poate fi selectată din grupul constând din cancer ovarian, cancer pancreatic, mezoteliom, cancer pulmonar, cancer gastric şi cancer de sân triplu negativ. Boala cu cancer metastatic poate fi derivată din oricare dintre cele de mai sus.

De asemenea, este dezvăluită o metodă pentru tratamentul sau ameliorarea bolii cu tumoare sau cancer sau a unei boli cu cancer metastatic, cuprinzând etapa de administrare la un subiect care are nevoie de aceasta a constructului de anticorp conform invenţiei sau a constructului de anticorp produs conform metodei invenţiei.

Termenii "subiect care are nevoie" sau cei "care au nevoie de tratament" îi includ pe cei care suferă deja de tulburare, precum şi pe cei la care tulburarea trebuie să fie prevenită. Subiectul care are nevoie sau "pacient» include subiecţi umani şi alte mamifere care primesc fie tratament profilactic, fie terapeutic.

Constructul de anticorp conform invenţiei va fi proiectat în general pentru căi şi metode specifice de administrare, pentru doze şi frecvenţe specifice de administrare, pentru tratamente specifice ale bolilor specifice, cu intervale de biodisponibilitate şi persistenţă, printre altele. Materialele compoziţiei sunt de preferinţă formulate în concentraţii care sunt acceptabile pentru situsul de administrare.

Formulările şi compoziţiile pot fi astfel concepute în conformitate cu invenţia pentru eliberare prin orice cale de administrare adecvată. În contextul prezentei invenţii, căile de administrare includ, dar nu se limitează la acestea

• căi topice (cum ar fi epicutanată, inhalatorie, nazală, oftalmică, auriculară/aurală, vaginală, mucozală); • căi enterale (cum ar fi orală, gastrointestinală, sublinguală, sublabială, bucală, rectală); şi • căi parenterale (cum ar fi intravenoasă, intraarterială, intraos, intramusculară, intracerebrală, intracerebroventriculară, epidurală, intratecală, subcutanată, intraperitoneală, extra-amniotică, intraarticulară, intracardiacă, intradermică, intralezională, intrauterină, intravezicală, intravitreală, transdermică, intranazală, transmucozală, intrasinovială, intraluminală).

Compoziţiile farmaceutice şi constructul de anticorp din această invenţie sunt deosebit de utile pentru administrare parenterală, de ex., administrare subcutanată sau intravenoasă, de exemplu prin injectare, cum ar fi injecţia în bolus sau prin perfuzie, cum ar fi perfuzia continuă. Compoziţiile farmaceutice pot fi administrate folosind un dispozitiv medical. Exemple de dispozitive medicale pentru administrarea compoziţiilor farmaceutice sunt descrise în Brevetele SUA Nr. 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447. 233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851; şi 5.399.163.

În special, prezenta invenţie asigură o administrare neîntreruptă a compoziţiei adecvate. Ca exemplu nelimitativ, administrarea neîntreruptă sau substanţial neîntreruptă, adică continuă, poate fi realizată printr-un mic sistem de pompare purtat de pacient pentru măsurarea afluxului de agent terapeutic în corpul pacientului. Compoziţia farmaceutică care cuprinde constructul de anticorp conform invenţiei poate fi administrată prin utilizarea respectivelor sisteme de pompare. Astfel de sisteme de pompare sunt în general cunoscute în domeniu şi se bazează în mod obişnuit pe schimbul periodic de cartuşe care conţin agentul terapeutic care trebuie perfuzat. Când se schimbă cartuşul într-un astfel de sistem de pompare, poate apărea o întrerupere temporară a fluxului de altfel neîntrerupt al agentului terapeutic în corpul pacientului. Într-un astfel de caz, faza de administrare anterioară înlocuirii cartuşului şi faza de administrare care urmează înlocuirii cartuşului ar fi totuşi luate în considerare în sensul mijloacelor farmaceutice şi metodelor conform invenţiei care alcătuiesc împreună o "administrare neîntreruptă» a unui astfel de agent terapeutic.

Administrarea continuă sau neîntreruptă a constructelor de anticorpi conform invenţiei poate fi intravenoasă sau subcutanată prin intermediul unui dispozitiv de livrare a fluidului sau a unui mic sistem de pompare incluzând un mecanism de antrenare a fluidului pentru antrenarea fluidului dintr-un rezervor şi un mecanism de acţionare pentru acţionarea mecanismului de antrenare. Sistemele de pompare pentru administrare subcutanată pot include un ac sau o canulă pentru penetrarea pielii unui pacient şi livrarea compoziţiei adecvate în corpul pacientului. Respectivele sisteme de pompare pot fi fixate sau ataşate direct la pielea pacientului independent de o venă, arteră sau un vas de sânge, permiţând astfel un contact direct între sistemul de pompare şi pielea pacientului. Sistemul de pompare poate fi ataşat la pielea pacientului timp de 24 de ore până la câteva zile. Sistemul de pompare poate fi de dimensiuni mici, cu un rezervor pentru volume mici. Ca exemplu nelimitativ, volumul rezervorului pentru compoziţia farmaceutică adecvată, care trebuie administrată, poate fi între 0,1 şi 50 ml.

Administrarea continuă poate fi, de asemenea, transdermică prin intermediul unui plasture purtat pe piele şi înlocuit la intervale. Un specialist în domeniu este conştient de sistemele de plasturi pentru livrarea de medicamente adecvate în acest scop. Este de remarcat faptul că administrarea transdermică este deosebit de susceptibilă de administrare neîntreruptă, deoarece schimbul unui prim plasture epuizat poate fi realizat în mod avantajos simultan cu amplasarea unui nou, al doilea plasture, de exemplu pe suprafaţa pielii imediat adiacentă primului plasture epuizat, şi imediat înainte de îndepărtarea primului plasture epuizat. Nu apar probleme de întrerupere a fluxului sau de defectare a celulei de alimentare.

În cazul în care compoziţia farmaceutică a fost liofilizată, materialul liofilizat este mai întâi reconstituit într-un lichid adecvat înainte de administrare. Materialul liofilizat poate fi reconstituit în, de ex., apă bacteriostatică pentru preparate injectabile (BWFI), soluţie salină fiziologică, soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS) sau aceeaşi formulare în care se afla proteina înainte de liofilizare.

Compoziţiile din prezenta invenţie pot fi administrate subiectului într-o doză adecvată care poate fi determinată de ex. prin studii de creştere a dozei prin administrarea de doze crescânde din constructul de anticorp conform invenţiei care prezintă specificitate între specii descrisă aici pentru primatele non-cimpanzei, de exemplu macaci. Aşa cum s-a arătat mai sus, constructul de anticorp conform invenţiei care prezintă specificitatea între specii descrisă aici poate fi utilizat în mod avantajos în formă identică în testarea preclinică la primatele non-cimpanzei şi ca medicament la om. Regimul de dozare va fi determinat de medicul curant şi de factorii clinici. Aşa cum este bine-cunoscut în domeniul medical, dozele pentru orice pacient depind de mulţi factori, inclusiv dimensiunea pacientului, suprafaţa corpului, vârsta, compusul specific care trebuie administrat, sexul, timpul şi calea de administrare, starea generală de sănătate şi alte medicamente care sunt administrate concomitent.

Termenul "doză eficientă" sau "dozaj eficient" este definit ca o cantitate suficientă pentru a obţine sau cel puţin a obţine parţial efectul dorit. Termenul "doză eficientă terapeutic" este definit ca o cantitate suficientă pentru a vindeca sau cel puţin a stopa parţial boala şi complicaţiile acesteia la un pacient care suferă deja de boală. Cantităţile sau dozele eficiente pentru această utilizare vor depinde de condiţia de tratat (indicaţia), de constructul de anticorp livrat, de contextul terapeutic şi obiective, de severitatea bolii, de terapia anterioară, de istoricul clinic al pacientului şi de răspunsul la agentul terapeutic, calea de administrare, dimensiunea (greutatea corpului, suprafaţa corpului sau dimensiunea organului) şi/sau starea (vârsta şi starea generală de sănătate) a pacientului şi starea generală a sistemului imunitar propriu al pacientului. Doza adecvată poate fi ajustată în funcţie de judecata medicului curant astfel încât să poată fi administrată pacientului o dată sau într-o serie de administrări şi pentru a obţine efectul terapeutic optim.

O doză tipică poate varia de la aproximativ 0,1 µg/kg până la aproximativ 30 mg/kg sau mai mult, în funcţie de factorii menţionaţi mai sus. În exemple de realizare specifice, doza poate varia de la 1,0 µg/kg până la aproximativ 20 mg/kg, opţional de la 10 µg/kg până la aproximativ 10 mg/kg sau de la 100 µg/kg până la aproximativ 5 mg/kg.

O cantitate eficientă terapeutic dintr-un construct de anticorp conform invenţiei are ca rezultat, de preferinţă, o scădere a severităţii simptomelor bolii, o creştere a frecvenţei sau duratei perioadelor fără simptome ale bolii sau o prevenire a afectării sau dizabilităţii cauzate de boală. Pentru tratarea tumorilor care exprimă MSLN, o cantitate eficientă terapeutic din constructul de anticorp conform invenţiei, de ex. un construct de anticorp anti-MSLN/anti-CD3, de preferinţă inhibă creşterea celulară sau creşterea tumorii cu cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 40%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 60%, cel puţin aproximativ 70%, la cel puţin aproximativ 80%, sau cel puţin aproximativ 90% faţă de pacienţii netrataţi. Capacitatea unui compus de a inhiba creşterea tumorii poate fi evaluată într-un model animal predictiv al eficacităţii în tumorile umane.

Compoziţia farmaceutică poate fi administrată ca unic agent terapeutic sau în combinaţie cu terapii suplimentare, cum ar fi terapiile anti-cancer, după cum este necesar, de ex. alte medicamente proteice şi neproteice. Aceste medicamente pot fi administrate simultan cu compoziţia care cuprinde constructul de anticorp conform invenţiei aşa cum este definit aici sau separat înainte sau după administrarea respectivului construct de anticorp la intervale şi doze definite în timp util.

Termenul "doză eficientă şi netoxică", aşa cum este utilizat aici, se referă la o doză tolerabilă dintr-un construct de anticorp inventiv care este suficient de mare pentru a provoca epuizarea celulelor patologice, eliminarea tumorii, contracţia tumorii sau stabilizarea bolii fără sau în esenţă fără efecte toxice majore. Astfel de doze eficiente şi netoxice pot fi determinate de exemplu prin studii de creştere a dozei descrise în stadiul tehnicii şi ar trebui să fie sub doza care să inducă efecte adverse severe (toxicitate care limitează doza, DLT).

Termenul "toxicitate" aşa cum este utilizat aici se referă la efectele toxice ale unui medicament manifestate în efecte adverse sau efecte adverse severe. Aceste efecte secundare se pot referi la o lipsă de tolerabilitate a medicamentului în general şi/sau o lipsă de toleranţă locală după administrare. Toxicitatea poate include, de asemenea, efecte teratogene sau cancerigene cauzate de medicament.

Termenul "siguranţă", "siguranţă in vivo" sau "tolerabilitate", aşa cum este utilizat aici, defineşte administrarea unui medicament fără a induce efecte adverse severe direct după administrare (toleranţă locală) şi pe o perioadă mai lungă de aplicare a medicamentului. "Siguranţa", "siguranţa in vivo" sau "tolerabilitatea" pot fi evaluate, de ex., la intervale regulate în timpul perioadei de tratament şi de urmărire. Măsurătorile includ evaluarea clinică, de ex. manifestări ale organelor şi screeningul anomaliilor de laborator. Se poate efectua evaluarea clinică şi se pot înregistra/codifica abateri la constatările normale în conformitate cu standardele NCI-CTC şi/sau MedDRA. Manifestările organelor pot include criterii, cum ar fi alergie/imunologie, sânge/măduvă osoasă, aritmie cardiacă, coagulare şi altele asemenea, aşa cum este stabilit de ex. în Criteriile terminologice comune pentru efecte adverse v3.0 (CTCAE). Parametrii de laborator care pot fi testaţi includ, de exemplu, hematologia, chimia clinică, profilul de coagulare şi analiza urinei şi examinarea altor fluide corporale precum ser, plasmă, lichid limfoid sau spinal, seroase şi altele asemenea. Siguranţa poate fi astfel evaluată de ex. prin examinare fizică, tehnici imagistice (adică ultrasunete, raze X, scanări CT, imagistică prin rezonanţă magnetică (RMN), alte măsuri cu dispozitive tehnice (adică electrocardiogramă), semne vitale, prin măsurarea parametrilor de laborator şi înregistrarea efectelor adverse. De exemplu, efectele adverse la primatele non-cimpanzeu în utilizările şi metodele conform invenţiei pot fi examinate prin metode histopatologice şi/sau histochimice.

Se face referire şi la termenii de mai sus, de ex. în Evaluarea preclinică a siguranţei produselor farmaceutice derivate din biotehnologie S6; Ghid tripartit armonizat ICH; Întâlnirea Comitetului Director al ICH din 16 iulie 1997.

Într-un alt exemplu de realizare, invenţia furnizează un kit care cuprinde un construct de anticorp conform invenţiei şi/sau o celulă gazdă a invenţiei.

În contextul prezentei invenţii, termenul "kit" înseamnă două sau mai multe componente - dintre care una corespunzând constructului de anticorp, compoziţiei farmaceutice, vectorului sau celulei gazdă a invenţiei - ambalate împreună într-o cutie, un recipient sau în alt fel. Prin urmare, un kit poate fi descris ca un set de produse şi/sau ustensile care sunt suficiente pentru a atinge un anumit obiectiv, care poate fi comercializat ca o singură unitate.

Kitul poate cuprinde unul sau mai multe recipiente (cum ar fi flacoane, fiole, recipiente, seringi, sticle, pungi) de orice formă, dimensiune şi material adecvate (de preferinţă impermeabile, de ex. plastic sau sticlă) care conţine constructul de anticorp sau compoziţia farmaceutică a prezentei invenţii într-o doză adecvată pentru administrare (a se vedea mai sus). Kitul poate conţine în plus instrucţiuni de utilizare (de ex. sub forma unui prospect sau manual de instrucţiuni), mijloace pentru administrarea constructului de anticorp conform prezentei invenţii, cum ar fi o seringă, pompă, un perfuzor sau altele asemenea, mijloace pentru reconstituirea constructului de anticorp conform invenţiei şi/sau mijloace pentru diluarea constructului de anticorp conform invenţiei.

Invenţia furnizează, de asemenea, kituri pentru o unitate de administrare cu doză unică. Kitul conform invenţiei poate conţine, de asemenea, un prim recipient care cuprinde un construct de anticorp uscat/liofilizat şi un al doilea recipient care cuprinde o formulare apoasă. În anumite exemple de realizare ale acestei invenţii, sunt furnizate kituri care conţin seringi preumplute cu o singură cameră şi cu mai multe camere (de ex., seringi cu lichid şi lioseringi).

Figurile arată:

Figura 1:

Reprezentare schematică a himerei MSLN umană-şoarece. Himerele MSLN au fost generate cu 6 schimburi distincte de întindere de secvenţă de la MSLN umană la MSLN de şoarece. Variantele respective au fost exprimate pe suprafaţa clonelor de celule CHO (E1-E6). A se vedea Exemplul 1.

Figura 2

Reactivitatea încrucişată a constructelor de anticorpi anti-MSLN detectate prin citometrie în flux: legarea la MSLN şi CD3 umane şi de macac. A se vedea Exemplul 4.

Figura 3

Analiza constructelor de anticorpi anti-MSLN prin citometrie în flux: legarea la variantele umane v2 şi v6. A se vedea Exemplul 4.

Figura 4

Potenţa constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 în redirecţionarea celulelor T efectoare CD8+ umane stimulate împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN umană a fost măsurată într-un test de eliberare a 51Cr de 18 ore (raport efector-ţintă 10:1).

Figura 5

Potenţa constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 în redirecţionarea celulelor T efectoare CD8+ umane stimulate împotriva OVCAR-8 pozitiv la MSLN a fost măsurată într-un test de eliberare a 51Cr de 18 ore (raport efector-ţintă 10:1).

Figura 6

Potenţa constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 în redirecţionarea celulelor T în PBMC umane nestimulate (CD14-/CD56-) împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN umană în absenţa şi prezenţa MSLN solubile a fost măsurată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 de ore (raport efector-ţintă 10:1).

Figura 7

Potenţa constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 în redirecţionarea celulelor T în PBMC umane nestimulate (CD14-/CD56-) împotriva liniei de celule umane MSLN pozitive OVCAR-8 a fost măsurată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 de ore.

Figura 8

Confirmarea constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 cu reactivitate încrucişată sunt capabile să redirecţioneze celulele T de macac împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN de macac, un test de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 de ore a fost efectuat cu o linie de celule T de macac LnPx4119 ca celule T efectoare (raport efector-ţintă 10:1).

Figura 9

Diferenţa de potenţă dintre izoformele monomerice şi dimerice ale constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 în redirecţionarea celulelor T în celulele T efectoare CD8+ umane stimulate împotriva celulelor CHO umane transfectate cu MSLN a fost măsurată într-un test de eliberare a 51Cr de 18 ore (raport efector-ţintă 10:1).

Figura 10

Stabilitatea constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 după incubare timp de 96 de ore în plasmă umană. Test pe bază de 51Cr de 18 ore. Celule efectoare: celule T CD8 umane îmbogăţite stimulate. Celule ţintă: celule CHO transfectate cu MSLN umană. Raportul dintre celula efector şi ţintă (E:T): 10:1. Proteina BiTE aşa cum este indicat.

Figura 11

Omogenitatea proteinei constructelor de anticorpi ale invenţiei analizată prin cromatografie cu schimb de cationi de înaltă rezoluţie CIEX

Figura 12

Hidrofobicitatea de suprafaţă a constructelor de anticorpi bispecifici din invenţie testată prin cromatografie de interacţiune hidrofobă HIC în modul flux

Figura 13

Conversia monomer în dimer după trei cicluri de îngheţ/dezgheţ.

Figura 14

Conversia monomer în dimer după 7 zile de incubare la 250 µg/ml

Figura 15: Evaluarea activării celulelor T independente de ţintă prin constructe de anticorpi HLE BiTE® mezotelină (MS). 2(a) construct de anticorp conform invenţiei în testul de activare de 48 de ore cu PBMC umane (3x); diluţii în serie HLE BiTE® (iniţial 20 nM; 1:5, 7x+martor); fără sau cu blocarea FcR [10 mg/ml hulgG (Kiovog, Baxter)]; Măsurarea FACS a exprimării CD69 şi CD25 [nu este prezentată] pe celulele T D4+, CD8+. 2(b) construct de anticorp hetero-Fc în testul de activare de 48 de ore cu PBMC umane şi PBMC epuizate de celule CD14+/CD33+ (3x); diluţii în serie HLE BiTE® (iniţial 20 nM; 1:5, 7x+martor); Măsurarea FACS a exprimării CD69 şi CD25 [nu este prezentată] pe celulele T D4+, CD8+.

Figura 16: Evaluarea activării celulelor T independente de ţintă prin constructe de anticorpi HLE BiTE® CDH19. 3(a) construct de anticorp conform invenţiei în testul de activare de 48 de ore cu PBMC umane (3x); diluţii în serie HLE BiTE® (iniţial 20 nM; 1:5, 7x+martor); fără sau cu blocarea FcR [10 mg/mL hulgG (Kiovog, Baxter)]; Măsurarea FACS a exprimării CD69 şi CD25 [nu este prezentată] pe celulele T D4+, CD8+. 3(b) construct de anticorp hetero-Fc în testul de activare de 48 de ore cu PBMC umane şi PBMC epuizate de celule CD14+/CD33+ (3x); diluţii în serie HLE BiTE® (iniţial 20 nM; 1:5, 7x+martor); Măsurarea FACS a exprimării CD69 şi CD25 [nu este prezentată] pe celulele T D4+, CD8+. 3(c) construct de anticorp X în testul de activare de 48 de ore cu PBMC umane şi PBMC epuizate de celule CD14+/CD33+ (3x); diluţii în serie HLE BiTE® (iniţial 20 nM; 1:5, 7x+martor); Măsurarea FACS a exprimării CD69 şi CD25 [nu este prezentată] pe celulele T D4+, CD8+.

Figura 17: Legarea complementului C1q a constructelor de anticorpi de fuziune Fc BiTE®. Constructele de anticorpi de fuziune Fc BiTE® (Fc BiTE® cu lanţ unic (triunghi), Fc BiTE® hetero (pătrate), BiTE® canonic (cerc)) au fost acoperite pe o placă Maxisorp (în serii de diluţie), înainte de incubarea cu ser uman combinat şi de incubarea cu anticorpul murin policlonal anti-CC1q uman, vizualizat cu conjugatul Fc-AP anti-şoarece de capră.

Figura 18: Profilurile PK medii ale patru perechi de proteine de fuziune BiTE®-HLE după administrarea unei singure doze la maimuţele cynomolgus. Din motive de comparabilitate, concentraţiile serice au fost normalizate în funcţie de doză la 15 µg/kg şi indicate în nmol.

Figura 19: Profilurile PK medii ale cinci constructe diferite de anticorpi BiTE®, fiecare fuzionat la un fragment de extindere a timpului de înjumătăţire al scFc. Din motive de comparabilitate, concentraţiile serice au fost normalizate în funcţie de doză la 15 µg/kg şi indicate în nmol.

Exemple:

Următoarele exemple ilustrează invenţia. Aceste exemple nu ar trebui interpretate ca limitând cadrul acestei invenţii. Prezenta invenţie este limitată numai de revendicări.

Exemplul 1

Generarea de celule CHO care exprimă MSLN de tip sălbatic şi himerică

Antigenul MSLN poate fi subdivizat în şase subdomenii sau regiuni diferite care sunt definite, în scopurile exemplelor 1 şi 2. Secvenţa aa a acestor şase subdomenii este descrisă în SECV ID NR: 238-243.

Au fost generate următoarele molecule; a se vedea şi Figura 1:

• hu orl MSLN-E1 mu SECV ID NR: 246 • hu orl MSLN-E2 mu SECV ID NR: 247 • hu orl MSLN-E3 mu SECV ID NR: 248 • hu orl MSLN-E4 mu SECV ID NR: 249 • hu orl MSLN-E5 mu SECV ID NR: 250 • hu orl MSLN-E6 mu SECV ID NR: 251 • hu orl MSLN- complet umană SECV ID NR: 231

Pentru generarea de celule CHO care exprimă MSLN umană, de macac cynomolgus ("cyno") şi umană trunchiată marcată N-terminal V5 , secvenţele de codificare respective pentru MSLN umană (SEQ ID NR: 231; a se vedea, de asemenea, numărul de acces GeneBank NM_005823), cyno MSLN (SECV ID NR: 234, a se vedea LMR C52457) şi cele şase versiuni MSLN umană/murină himerice (a se vedea mai sus) au fost donate într-o plasmidă denumită pEF-DHFR (pEF-DHFR este descrisă în Raum şi colab. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Pentru exprimarea la suprafaţa celulară a MSLN umană şi cyno a fost utilizată peptida semnal iniţială. Toate procedurile de clonare au fost efectuate conform protocoalelor standard (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, ediţia a 3-a, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Pentru fiecare construct, o plasmidă corespunzătoare a fost transfectată în celule CHO cu deficit de DHFR pentru exprimarea eucariotă, aşa cum este descris de Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Exprimarea MSLN umană, himerică şi cyno pe celulele CHO a fost verificată într-un test FACS utilizând un anticorp monoclonal de şoarece IgG2b anti-MSLN umană. Drept control negativ, celulele au fost incubate cu anticorp de control izotip în locul primului anticorp. Probele au fost măsurate prin citometrie în flux.

Exemplul 2

Cartografierea epitopilor constructelor de anticorpi anti-MSLN

Celulele transfectate cu molecule MSLN umană şi MSLN umană himerică (a se vedea Exemplul 1) au fost colorate cu extract periplasmic brut, nediluat, care conţine constructe de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 (cu domeniul de legare CD3 fiind denumit I2C) fuzionat cu o albumină umană (varianta 1), în PBS/1,5%FCS. Moleculele legate au fost detectate cu un anticorp monoclonal de şoarece anti-CD3 cu domeniu de legare (50 µl) urmat de un IgG anti-şoarece Fc-gamma-PE (1:100, 50 µl; Jackson Immunoresearch # 115-116-071) Toţi anticorpii au fost diluaţi în PBS/1,5% FCS. Drept control negativ, celulele au fost incubate cu PBS/2% FCS în locul extractului periplasmatic. Probele au fost măsurate prin citometrie în flux.

Regiunile care au fost recunoscute de domeniile de legare MSLN respective sunt indicate în tabelul de secvenţe (Tabelul 2). Pierderea semnalului FACS în constructele MSLN himerice respective care cuprind clusterul de epitopi murin a fost citită pentru relevanţa clusterului respectiv pentru legare. În cazul în care semnalul FACS a fost afectat negativ pentru mai mult de una, respectiv două clone MSLN himerică, s-a ajuns la concluzia că ambele clustere sunt relevante.

Tabelul 2: Cartografierea clusterelor de epitopi pentru MS-1 până la MS-8

Cluster de epitopi Liant E 1+2 MS-1 E 2+3 MS-2 E 2+3 MS-3 E 2+3 MS-4 E 2+3 MS-5 E 2+3 MS-6 E 4 MS-7 E 1+2 MS-8

Exemplul 3

Analiza Scatchard a afinităţii constructului de anticorp bispecific MSLNxCD3 pentru MSLN umană şi de macac pe celulele pozitive la antigenul ţintă şi determinarea diferenţei de afinitate interspecii

Afinităţile constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 pentru celulele CHO transfectate cu MSLN umană sau de macac au fost, de asemenea, determinate prin analiza Scatchard ca metoda cea mai fiabilă pentru măsurarea decalajelor de afinitate potenţiale dintre MSLN umană şi de macac. Pentru analiza Scatchard, experimentele de legare la saturaţi sunt efectuate folosind un sistem de detectare monovalentă pentru a determina cu precizie legarea monovalentă a constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 la linia celulară respectivă.

2 × 104 celule din linia celulară respectivă (linia celulară CHO cu exprimare MSLN umană recombinantă, linia celulară CHO cu exprimare MSLN de macac recombinantă) au fost incubate fiecare cu câte 50 µl dintr-o serie de diluţii triplete (douăsprezece diluţii la 1:2) ale respectivului construct de anticorp bispecific MSLNxCD3 (până la atingerea saturaţiei), începând de la 10-20 nM, urmate de o incubare de 16 ore la 4°C sub agitare şi o etapă de spălare reziduală. Apoi, celulele au fost incubate încă o oră cu 30 µl dintr-o soluţie conjugată CD3xALEXA488. După o etapă de spălare, celulele au fost resuspendate în 150 µl de soluţie tampon FACS conţinând 3,5 % formaldehidă, incubate timp de încă 15 minute, centrifugate, resuspendate în soluţie tampon FACS şi analizate cu ajutorul unui aparat FACS Cantoll şi al software-ului FACS Diva. Datele au fost generate din două seturi independente de experimente, fiecare folosind triplicate. Analiza Scatchard respectivă a fost calculată pentru a extrapola legarea maximă (Bmax). Concentraţiile de constructe de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 la legarea a jumătate din maxim au fost determinate reflectând KD-urile respective. Valorile măsurătorilor triplicate au fost reprezentate grafic sub formă de curbe hiperbolice şi sub formă de curbe în formă de S pentru a demonstra variaţii de concentraţie adecvate de la legarea minimă la cea optimă.

Valorile prezentate în Tabelul 3 au fost derivate din două experimente independente per construct de anticorp bispecific MSLNxCD3. Analiza Scatchard pe bază de celule a confirmat că constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 ale invenţiei sunt subnanomolare în afinitatea pentru MSLN umană şi MSLN de macac şi prezintă un mic decalaj de afinitate interspecie cyno/umană de aproximativ 1.

Tabelul 3: Afinităţile (KD) ale constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 aşa cum au fost determinate în analiza Scatchard bazată pe celule cu decalajul de afinitate calculat KD MSLN de macac / KD MSLN umană. Constructele de anticorpi au fost măsurate în două experimente independente, fiecare folosind triplicate.

Anticorp BiTE MS × I2C-HALB Afinitate bazată pe celule MSLN* um [nM] Afinitate bazată pe celule MSLN* mac [nM] Decalaj de afinitate MSLN KDmac/ KDum MS-1 1,25 ± 0,8 13,86 ± 2,9 11,08 MS-8 4,68 ± 0,4 85,86 ± 16,7 18,35 MS-2 1,40 ± 0,9 10,16 ± 3,5 7,28 MS-3 0,74 ± 0,8 0,82 ± 0,5 1,12 MS-4 0,91 ± 1,0 0,77 ± 0,7 0,85 MS-5 0,39 ± 0,3 2,31 ± 3,7 5,91 MS-6 0,60 ± 0,3 9,03 ± 3,7 15,04 MS-7 1,06 ± 0,5 4,07 ± 1,0 3,86

Exemplul 4

Legare bispecifică şi reactivitate încrucişată între specii

Pentru confirmarea legării la MSLN şi CD3 umană şi la MSLN şi CD3 cyno, constructele de anticorpi bispecifici ale invenţiei au fost testate prin citometrie în flux folosind

• celule CHO transfectate cu MSLN umană, cu izoforma MSLN umană (NM_013404=SECV ID NR:232 şi AY743922=SECV ID NR:233), respectiv cu MSLN de macac, • linie celulară umană pozitivă la MSLN umană OVCAR-8, • linie de celule de leucemie cu celule T umane care exprimă CD3 HPB-all (DSMZ, Braunschweig, ACC483) şi • linie de celule T care exprimă CD3 cynomolgus LnPx 4119

Pentru citometria în flux, 200.000 de celule din liniile celulare respective au fost incubate timp de 60 min la 4°C cu 50 µl de construct de anticorp bispecific purificat la o concentraţie de 5 µl/ml. Celulele au fost spălate de două ori în PBS/2% FCS şi apoi incubate cu un anticorp intern de şoarece (2 µg/ml) specific pentru partea de legare CD3 a constructelor de anticorpi bispecifici timp de 30 de minute la 4°C. După spălare, anticorpii de şoarece legaţi au fost detectaţi cu un Fcy-PE anti-şoarece de capră (1:100) timp de 30 de minute la 4°C. Probele au fost măsurate prin citometrie în flux. Celulele CHO netransfectate au fost utilizate ca martor negativ.

Rezultatele sunt prezentate în figurile 2 şi 3. Constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 ale invenţiei au colorat celulele CHO transfectate cu MSLN umană, izoforma MSLN artificială şi cu MSLN cyno şi, de asemenea, au colorat linia de celule umane pozitive pentru MSLN umană OVCAR-8 (expresor natural). Liniile de celule T umane şi cyno care exprimă CD3 au fost, de asemenea, recunoscute de constructele de anticorpi bispecifici. Mai mult, nu a existat nicio colorare a celulelor de control negativ (CHO netransfectate).

Exemplul 5

Activitate citotoxică

Potenţa constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 ale invenţiei de a redirecţiona celulele T efectoare împotriva celulelor ţintă care exprimă MSLN a fost analizată în cinci teste de citotoxicitate in vitro:

• Potenţa constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 de a redirecţiona celulele T efectoare CD8+ umane stimulate împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN umană a fost măsurată într-un test de eliberare a 51Cr de 18 ore (raport efector-ţintă 10:1). Figura 4 şi Tabelul 4

• Potenţa constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 de a redirecţiona celulele T efectoare CD8+ umane stimulate împotriva liniei celulare pozitive la MSLN OVCAR-8 a fost măsurată într-un test de eliberare a 51Cr de 18 ore (raport efector-ţintă 10:1). Figura 5 Tabelul 5

• Potenţa constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 de a redirecţiona celulele T în PBMC umane nestimulate (CD14-/CD56-) împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN umană în absenţa şi prezenta MSLN solubile a fost măsurată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 ore (raport efector-ţintă 10:1). Figura 6 şi Tabelul 6

• Potenţa constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 de a redirecţiona celulele T în PBMC umane nestimulate (CD14-/CD56-) împotriva liniei celulare umane pozitive la MSLN OVCAR-8 a fost măsurată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 ore. Figura 7

• Pentru confirmarea faptului că constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 cu reactivitate încrucişată sunt capabile să redirecţioneze celulele T de macac împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN de macac, a fost efectuat un test de citotoxicitate bazat pe FACS timp de 48 de ore cu o linie de celule T de macac LnPx4119 ca celule T efectoare (raport efector-ţintă 10:1). Figura 8

• Diferenţa de potenţă dintre izoformele monomerice şi dimerice ale constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 în redirecţionarea celulelor T din celulele T efectoare CD8+ umane stimulate împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN umană a fost măsurată într-un test de eliberare a 51Cr de 18 ore (raport efector-ţintă 10:1). Figura 9

Exemplul 5.1

Test de eliberare a cromului cu celule T umane stimulate

Celule T stimulate îmbogăţite pentru celule T CD8+ au fost obţinute aşa cum este descris în cele ce urmează. Un vas Petri (145 mm diametru, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) a fost acoperit cu un anticorp specific anti-CD3 disponibil comercial (OKT3, Orthoclone) într-o concentraţie finală de 1 µg/ml timp de 1 oră la 37°C. Proteina nelegată a fost îndepărtată printr-o etapă de spălare cu PBS. 3-5 ×107 PBMC umane au fost adăugate la vasul Petri preacoperit în 120 ml de RPMI 1640 cu glutamină stabilizată / 10% FCS / IL-2 20 U/ml (Proleukin®, Chiron) şi stimulate timp de 2 zile. În a treia zi, celulele au fost colectate şi spălate o dată cu RPMI 1640. IL-2 a fost adăugat la o concentraţie finală de 20 U/ml şi celulele au fost cultivate din nou timp de o zi în acelaşi mediu de cultură celulară ca mai sus. Limfocitele T citotoxice (CTL) CD8+ au fost îmbogăţite prin epuizarea celulelor T CD4+ şi celulelor NK CD56+ folosind Dynal-Beads conform protocolului producătorului. Celulele ţintă CHO transfectate cu MSLN cyno sau MSLN umană au fost spălate de două ori cu PBS şi marcate cu 11,1 MBq 51Cr într-un volum final de 100 µl RPMI cu 50% FCS timp de 60 de minute la 37°C. Ulterior, celulele ţintă marcate au fost spălate de 3 ori cu 5 ml RPMI şi apoi utilizate în testul de citotoxicitate. Testul a fost efectuat într-o placă cu 96 de godeuri într-un volum total de 200 µl RPMI suplimentat cu un raport E:T de 10:1. S-a utilizat o concentraţie iniţială de 0,01 - 1 µg/ml de construct de anticorp bispecific purificat şi diluţii de trei ori ale acestuia. Timpul de incubaţie pentru test a fost de 18 ore. Citotoxicitatea a fost determinată ca valori relative ale cromului eliberat în supernatant în raport cu diferenţa de liză maximă (adăugarea de Triton-X) şi liză spontană (fără celule efectoare). Toate măsurătorile au fost efectuate în patru exemplare. Măsurarea activităţii cromului în supernatanţi a fost efectuată într-un contor gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Köln, Germania). Analiza rezultatelor a fost efectuată cu Prism 5 pentru Windows (versiunea 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, SUA). Valorile CE50 calculate prin programul de analiză din curbele sigmoidale de răspuns la doză au fost utilizate pentru compararea activităţii citotoxice.

Exemplul 5.2

Potenţa de redirecţionare a celulelor T efectoare umane stimulate împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN umană

Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 conform invenţiei a fost analizată într-un test de citotoxicitate cu eliberare de 51-crom (51Cr) folosind celule CHO transfectate cu MSLN umană ca celule ţintă şi celule T CD8+ umane stimulate ca celule efectoare. Experimentul a fost realizat aşa cum este descris în Exemplul 8.1.

Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 4. Constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 au arătat o activitate citotoxică foarte puternică împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN umană în intervalul picomolar cu 1 cifră.

Tabelul 4: Valorile CE50 [pM] ale constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 analizate într-un test de citotoxicitate cu eliberare de 51-crom (51Cr) folosind celule CHO transfectate cu MSLN umană ca celule ţintă şi celule T CD8 umane stimulate ca celule efectoare.

BiTE × I2C-HALB EC50 [pM] MS 1 1,5 MS 8 6,5 MS 2 2,0 MS 3 0,2 MS 4 0,1 MS 5 0,2 MS 6 0,5 MS 7 6,0

Exemplul 5.3

Potenţa de redirecţionare a celulelor T efectoare umane stimulate împotriva liniei celulare umane MSLN-pozitive OVCAR-8

Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 a fost analizată într-un test de citotoxicitate cu eliberare de 51-crom (51Cr) utilizând linia celulară umană MSLN-pozitivă OVCAR-8 ca sursă de celule ţintă şi celulele T CD8+ umane stimulate ca celule efectoare. Testul a fost efectuat aşa cum este descris în Exemplul 8.1.

În conformitate cu rezultatele testelor de eliberare de 51-crom cu limfocite T CD8+ umane îmbogăţite stimulate ca celule efectoare şi celule CHO transfectate cu MSLN umană ca celule ţintă, constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 din prezenta invenţie sunt, de asemenea, potente cu privire la activitatea citotoxică împotriva celulelor ţintă expresoare naturale (a se vedea Tabelul 5).

Tabelul 5: Valorile CE50 [pM] ale constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 analizate într-un test de citotoxicitate cu eliberare de 51-crom (51Cr) de 18 ore cu linia celulară umană MSLN-pozitivă OVCAR-8 ca sursă de celule ţintă şi celule T CD8 umane îmbogăţite stimulate ca celule efectoare.

BiTE x I2C-HALB CE50 [pM] MS 1 0,2 MS 8 1,3 MS 2 0,8 MS 3 0,1 MS 4 0,1 MS 5 0,3 MS 6 0,2 MS 7 0,5

Exemplul 5.4

Test de citotoxicitate bazat pe FACS cu PBMC umane nestimulate

Izolarea celulelor efectoare

Celulele mononucleare din sângele periferic uman (PBMC) au fost preparate prin centrifugare în gradient de densitate Ficoll din preparate limfocitare îmbogăţite (straturi leucocitare), un produs secundar al băncilor de sânge care colectează sânge pentru transfuzii. Straturile leucocitare au fost furnizate de o bancă locală de sânge, iar PBMC au fost preparate în aceeaşi zi de recoltare a sângelui. După centrifugarea la densitate Ficoll şi spălări extinse cu PBS Dulbecco (Gibco), eritrocitele rămase au fost îndepărtate din PBMC prin incubare cu tampon de liză eritrocitară (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 100 µM EDTA). Trombocitele au fost îndepărtate prin intermediul supernatantului în urma centrifugării PBMC la 100 × g. Limfocitele rămase cuprind în principal limfocite B şi T, celule NK şi monocite. PBMC au fost ţinute în cultură la 37°C/5% CO2 în mediu RPMI (Gibco) cu 10% FCS (Gibco).

Epuizarea celulelor CD14+ şi CD56+

Pentru epuizarea celulelor CD14+, s-au utilizat microperle CD14 umane (Milteny Biotec, MACS, #130-050-201), iar pentru epuizarea celulelor NK s-au utilizat microperle CD56 umane (MACS, #130-050-401). PBMC au fost numărate şi centrifugate timp de 10 minute la temperatura camerei cu 300 × g. Supernatantul a fost aruncat, iar peletul celular a fost resuspendat în tamponul de izolare MACS [80 µl/ 107 celule; PBS (Invitrogen, #20012-043), 0,5% (v/v) FBS (Gibco, #10270-106), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich, #E-6511)]. S-au adăugat microperle CD14 şi microperle CD56 (20 µl/107 celule) şi s-au incubat timp de 15 minute la 4 - 8°C. Celulele au fost spălate cu tampon de izolare MACS (1 - 2 ml/107 celule). După centrifugare (a se vedea mai sus), supernatantul a fost aruncat şi celulele au fost resuspendate în tampon de izolare MACS (500 µl/108 celule). Celulele negative CD14/CD56 au fost apoi izolate folosind coloane LS (Miltenyi Biotec, # 130-042-401). PBMC fără celule CD14 +/CD56 + au fost cultivate în mediu complet RPMI adică RPMI1640 (Biochrom AG, # FG1215) suplimentat cu 10% FBS (Biochrom AG, # S0115), 1x aminoacizi neesenţiali (Biochrom AG, # K0293), Tampon 10 mM Hepes (Biochrom AG, # L1613), piruvat de sodiu 1 mM (Biochrom AG, # L0473) şi 100 U/ml penicilină/streptomicină (Biochrom AG, # A2213) la 37°C într-un incubator cât a fost necesar.

Etichetarea celulelor ţintă

Pentru analiza lizei celulare în testele de citometrie în flux, s-a utilizat colorantul fluorescent de membrană DiOC18 (DiO) (Molecular Probes, #V22886) pentru a marca celulele CHO transfectate cu MSLN umană sau MSLN de macac ca celule ţintă şi pentru a le distinge de celulele efectoare. Pe scurt, celulele au fost recoltate, spălate o dată cu PBS şi ajustate la 106 celule/ml în PBS conţinând 2 % (v/v) FBS şi colorantul de membrană DiO (5 µl/106 celule). După incubare timp de 3 minute la 37°C, celulele au fost spălate de două ori în mediu RPMI complet şi numărul de celule a fost ajustat la 1,25 × 105 celule/ml. Vitalitatea celulelor a fost determinată folosind 0,5% (v/v) soluţie izotonică de EosinG (Roth, # 45380).

Test bazat pe citometrie de flux

Acest test a fost conceput pentru a cuantifica liza celulelor CHO transfectate cu MSLN cyno sau umană în prezenţa unor diluţii seriale de constructe de anticorpi bispecifici MSLN. S-au amestecat volume egale de celule ţintă marcate cu DiO şi de celule efectoare (adică PBMC fără celule CD14+), rezultând un raport de celule E:T de 10:1. 160 µl din această suspensie au fost transferaţi în fiecare godeu al unei plăci cu 96 de godeuri. S-au adăugat 40 µl de diluţii seriale ale constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 şi un control negativ bispecific (un construct de anticorp bispecific bazat pe CD3 care recunoaşte un antigen ţintă irelevant) sau mediu complet RPMI ca un control negativ suplimentar. Reacţia citotoxică mediată de anticorpi bispecifici s-a desfăşurat timp de 48 de ore într-un incubator umidificat cu 7% CO2. Apoi celulele au fost transferate pe o nouă placă cu 96 de godeuri şi pierderea integrităţii membranei celulare ţintă a fost monitorizată prin adăugarea de iodură de propidiu (PI) la o concentraţie finală de 1 µg/ml. PI este un colorant impermeabil de membrană care în mod normal este exclus din celulele viabile, în timp ce celulele moarte îl preiau şi devin identificabile prin emisie fluorescentă.

Probele au fost măsurate prin citometrie în flux pe un instrument FACSCanto II şi analizate cu software-ul FACSDiva (ambele de la Becton Dickinson). Celulele ţintă au fost identificate ca fiind celule DiO-pozitive. Celulele ţintă PI-negative au fost clasificate drept celule ţintă vii. Procentul de citotoxicitate a fost calculat conform următoarei formule:

n = numărul de evenimente

Folosind software-ul GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), procentul de citotoxicitate a fost reprezentat grafic în raport cu concentraţiile de construct de anticorp bispecific corespunzătoare. Curbele de răspuns la doză au fost analizate cu cele patru modele de regresie logistică parametrice pentru evaluarea curbelor de răspuns la doză sigmoidă cu panta fixă pe vârf şi au fost calculate valorile CE50.

Exemplul 5.5

Potenţa de redirecţionare a PBMC umane nestimulate împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN umană în absenţa şi în prezenţa MSLN solubilă

Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 a fost analizată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS utilizând celule CHO transfectate cu MSLN umană ca celule ţintă şi PBMC umane nestimulate ca celule efectoare. Testul a fost efectuat aşa cum este descris în Exemplul 8.4 de mai sus.

Rezultatele testelor de citotoxicitate bazate pe FACS cu PBMC umane nestimulate ca celule efectoare şi celule CHO transfectate cu MSLN umană ca ţinte sunt prezentate în Tabelul 7.

Tabelul 6: Activitatea citotoxică a PBMC umane nestimulate împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN umană în absenţa şi prezenţa MSLN solubilă

fără sMSLN cu 50 ng/ml sMSLN cu 400 ng/ml sMSLN BiTE x I2C-HALB CE50 [pM] CE50 [pM] CE50 [pM] MS-1 12 53 215 MS-8 3,4 8,3 39 MS-2 2,4 2,9 6,3 MS-3 1,2 3,0 16 MS-4 1,5 3,9 11 MS-5 1,0 2,2 11 MS-6 1,1 2,6 12 MS-7 8,1 28 166

De aşteptat, valorile CE50 au fost în general mai mari în testele de citotoxicitate cu PBMC nestimulate ca celule efectoare în comparaţie cu testele de citotoxicitate folosind celule T CD8+ umane stimulate (a se vedea Exemplul 8.2).

Exemplul 5.6

Potenţa de redirecţionare a PBMC umane nestimulate împotriva celulelor liniei de celule MSLN-pozitive OVCAR-8

Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 a fost analizată în plus într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS utilizând linia celulară umană MSLN-pozitivă OVCAR-8 ca sursă de celule ţintă şi PBMC umane nestimulate ca celule efectoare. Testul a fost efectuat aşa cum este descris în Exemplul 8.4 de mai sus. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 7.

Tabelul 7: Valorile CE50 [pM] ale constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 măsurate într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 de ore cu PBMC umane nestimulate ca celule efectoare şi linia celulară umană OVCAR-8 ca sursă de celule ţintă.

BiTE x I2C-HALB CE50 [pM] MS 1 5,9 MS 8 13 MS 2 18 MS 3 1,5 MS 4 2,0 MS 5 1,9 MS 6 2,3 MS 7 9,7

Exemplul 5.7

Potenţa de redirecţionare a celulelor T de macac împotriva celulelor CHO care exprimă MSLN de macac

Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 a fost analizată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS utilizând celule CHO transfectate cu MSLN de macac (cyno) ca celule ţintă şi linia de celule T de macac 4119LnPx (Knappe şi colab. Blood 95:3256-61 (2000)) ca sursă de celule efectoare. Marcarea ca celule ţintă a celulelor CHO transfectate cu MSLN de macac şi testul activităţii citotoxice bazat pe citometrie de flux au fost efectuate aşa cum este descris mai sus.

Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 8. Celulele T de macac din linia celulară 4119LnPx au fost determinate să omoare eficient celulele CHO transfectate cu MSLN de macac prin constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 ale invenţiei.

Tabelul 8: Valorile CE50 [pM] ale MSLNxCD3 bispecifice măsurate într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 de ore cu linia de celule T de macac 4119LnPx ca celule efectoare şi celule CHO transfectate cu MSLN de macac ca celule ţintă.

BiTE x I2C-HALB CE50 [pM] MS 1 434 MS 8 1589 MS 2 583 MS 3 56 MS 4 67 MS 5 85 MS 6 100 MS 7 1791

Exemplul 5.8

Decalajul de potenţă între izoforma monomerică şi dimerică a constructelor de anticorpi bispecifici

Pentru a determina diferenţa de activitate citotoxică dintre izoforma monomerică şi dimerică a constructelor individuale de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 (denumită decalaj de potenţă), a fost efectuat un test de citotoxicitate cu eliberare de 51-crom timp de 18 ore aşa cum este descris mai sus (Exemplul 8.1) cu monomer şi dimer de construct de anticorp bispecific purificat. Celulele efectoare au fost celule T CD8 + umane îmbogăţite stimulate. Celulele ţintă au fost celule CHO transfectate cu MSLN um. Raportul efector-celulă ţintă (E:T) a fost de 10:1. Decalajul de potenţă a fost calculat ca raport între valorile EC50.

Rezultatele testelor cu celule T CD+ umane îmbogăţite stimulate ca celule efectoare şi celule CHO transfectate cu MSLN umană ca ţinte sunt prezentate în Tabelul 9.

Tabelul 9: Activitatea citotoxică a PBMC umane nestimulate împotriva celulelor CHO transfectate cu MSLN umană folosind constructe de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 monomerice şi dimerice

BiTE x I2C-HALB CE50 [pM] Monomer Dimer Raport monomer la dimer (CE50 Monomer /CE50 Dimer) MS 1 1,5 1,7 0,9 MS 8 6,5 9,5 0,7 MS 2 2,0 2,0 1,0 MS 3 0,2 0,7 0,3 MS 4 0,1 0,9 0,1 MS 5 0,2 1,1 0,2 MS 6 0,5 3,4 0,1 MS 7 6,0 21 0,3

Exemplul 6

Stabilitate după incubare timp de 24 de ore în plasmă umană

Constructele de anticorpi bispecifici purificate au fost incubate într-un raport de 1:5 într-un fond de plasmă umană la 37°C timp de 96 de ore la o concentraţie finală de 2-20 µg/ml. După incubarea cu plasmă, constructele de anticorpi au fost comparate într-un test de eliberare de 51-crom cu celule T CD8+ umane îmbogăţite stimulate şi celule CHO transfectate cu MSLN umană la o concentraţie iniţială de 0,01-0,1 µg/ml şi cu un raport celulă efector-ţintă (E:T) de 10:1 (test după cum este descris în Exemplul 8.1). Constructele de anticorpi bispecifici proaspăt dezgheţate neincubate au fost incluse ca martori.

Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 10 de mai jos; Toate constructele de anticorpi testate au avut o stabilitate plasmatică foarte favorabilă (CE50 plasmă / CE50 control) de ≤ 4,.

Tabelul 10: Valorile EC50 ale constructelor de anticorpi cu şi fără incubaţie plasmatică şi valoarea calculată plasmă/control

BiTE x I2C-HALB CE50 [pM] Raport plasmă la martor (CE50 Plasmă /CE50 Martor) cu plasmă fără plasmă MS 1 3,0 1,5 2,0 MS 8 4,8 6,5 0,7 MS 2 6,7 2,0 3,4 MS 3 0,3 0,2 1,5 MS 4 0,4 0,1 4 MS 5 0,3 0,2 1,5 MS 6 0,6 0,5 1,2 MS 7 11,4 6,0 1,9

Exemplul 7

Omogenitatea proteinelor prin cromatografie cu schimb de cationi de înaltă rezoluţie

Omogenitatea proteinelor constructelor de anticorpi conform invenţiei a fost analizată prin cromatografie cu schimb de cationi de înaltă rezoluţie CIEX.

50 µg de monomer de construct de anticorp au fost diluaţi cu 50 ml tampon de legare A (20 mM fosfat dihidrogen de sodiu, 30 mM NaCI, 0,01% octanat de sodiu, pH 5,5) şi 40 ml din această soluţie au fost aplicaţi pe o coloană BioPro SP-F de 1 ml (YMC, Germania) conectată la un dispozitiv Äkta Micro FPLC (GE Healthcare, Germania). După legarea probei, a fost efectuată o etapă de spălare cu tampon de legare suplimentară. Pentru eluarea proteinelor, s-a aplicat un gradient de sare în creştere liniar folosind tampon B (20 mM dihidrogen fosfat de sodiu, 1000 mM NaCI, 0,01% octanat de sodiu, pH 5,5) până la 50% procent tampon B pe 10 volume de coloane. Întreaga rulare a fost monitorizată la 280, 254 şi 210 nm absorbanţă optică. Analiza a fost făcută prin integrarea maximă a semnalului de 280 nm înregistrat în foaia de evaluare a rulării software-ului Äkta Unicorn.

Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 11 de mai jos. Aproape toate constructele de anticorpi testate au o omogenitate foarte favorabilă de ≥ 80% (aria de sub curbă (= ASC) a vârfului principal). Singura excepţie este constructul bispecific MS-2xCD3-HALB cu doar 67% omogenitate.

Tabelul 11: Omogenitatea proteinelor în constructele de anticorpi (% ASC a vârfului principal)

MSLN HALB BiTE ASC a Vârfului Principal [%] MS 1 100 MS 8 93 MS 2 67 MS 3 87 MS 4 80 MS 5 89 MS 6 81 MS 7 100

Exemplul 8

Hidrofobicitatea suprafeţei măsurată prin butil HIC

Hidrofobicitatea de suprafaţă a constructelor de anticorpi bispecifici ale invenţiei a fost testată în cromatografie prin interacţiune hidrofobă HIC în modul de flux.

50 µg de monomer de construct de anticorp au fost diluaţi cu tampon de formulare generic până la un volum final de 500 µl (10 mM acid citric, 75 mM lizină HCI, 4% trehaloză, pH 7,0) şi aplicaţi pe o coloană butil sefaroză FF de 1 ml (GE Healthcare, Germania) conectată la un sistem Äkta Purifier FPLC (GE Healthcare, Germania). Întreaga rulare a fost monitorizată la 280, 254 şi 210 nm absorbanţă optică. Analiza a fost făcută prin integrarea maximă a semnalului de 280 nm înregistrat în foaia de evaluare a rulării software-ului Äkta Unicorn. Comportamentul de eluare a fost evaluat prin compararea ariei şi vitezei de creştere şi declin a semnalului proteic, indicând astfel puterea de interacţiune a fuziunii de albumină BiTE cu matricea.

Constructele de anticorpi au avut un comportament de eluţie bun, care a fost în mare parte rapidă şi completă; a se vedea Tabelul 12.

Tabelul 12: Hidrofobicitatea de suprafaţă a constructelor de anticorpi bispecifici

MSLN HALB BiTE Comportament de eluţie pe butil în HIC MS 1 1 MS 8 1 MS 2 1 MS 3 1 MS 4 1 MS 5 1 MS 6 1 MS 7 1

Exemplul 9

Conversia monomerului în dimer după (i) trei cicluri de îngheţ/dezgheţ şi (ii) 7 zile de incubaţie la 250 µg/ml

Constructul monomeric de anticorp bispecific MSLNxCD3 a fost supus la diferite condiţii de stres urmate de SEC de înaltă performanţă pentru a determina procentul de construct de anticorp monomeric iniţial, care a fost transformat în construct de anticorp dimeric.

1. (i) 25 µg de construct de anticorp monomeric au fost ajustate la o concentraţie de 250 µg/ml cu tampon de formulare generic şi apoi congelate la -80°C timp de 30 min urmate de decongelare timp de 30 min la temperatura camerei. După trei cicluri de îngheţ/dezgheţ, conţinutul de dimer a fost determinat prin HP-SEC. 2. (ii) 25 µg de construct de anticorp monomeric au fost ajustate la o concentraţie de 250 µg/ml cu tampon generic de formulare urmat de incubare la 37°C timp de 7 zile. Conţinutul de dimeri a fost determinat prin HP-SEC.

O coloană SEC TSK Gel G3000 SWXL de înaltă rezoluţie (Tosoh, Tokyo-Japonia) a fost conectată la un Äkta Purifier 10 FPLC (GE Lifesciences) echipat cu un autosampler A905. Echilibrarea coloanei şi tamponul de funcţionare au constat din 100 mM KH2PO4 - 200 mM Na2SO4 ajustat la pH 6,6. Soluţia de anticorp (25 µg proteină) a fost aplicată pe coloana echilibrată şi eluarea a fost efectuată la un debit de 0,75 ml/min la o presiune maximă de 7 MPa. Întreaga rulare a fost monitorizată la 280, 254 şi 210 nm absorbanţă optică. Analiza a fost făcută prin integrarea maximă a semnalului de 210 nm înregistrat în foaia de evaluare a rulării software-ului Äkta Unicorn. Conţinutul de dimeri a fost calculat prin împărţirea ariei vârfului dimerului la aria totală a monomerului plus vârful dimerului.

Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 13 de mai jos. Constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 conform invenţiei au prezentat procente de dimeri de 0,0% după trei cicluri de îngheţ/dezgheţ şi procente de dimeri de ≤ 2,2% după 7 zile de incubaţie la 37°C.

Tabelul 13: Procentul de construct de anticorp bispecific MSLNxCD3 monomeric versus dimeric, determinat prin cromatografie de excludere pe baza mărimii de înaltă performanţă (HP-SEC).

MSLN HALB BiTE Conversie dimer BiTE [%] MS 1 0,2 MS 8 1,6 MS 2 0,0 MS3 1,7 MS 4 0,3 MS 5 1,2 MS 6 0,4 MS 7 2,2

Exemplul 10

Termostabilitate

Temperatura de agregare a anticorpilor a fost determinată după cum urmează: 40 µl de soluţie de construct de anticorp la 250 µg/ml au fost transferaţi într-o cuvă de unică folosinţă şi plasaţi într-un dispozitiv Wyatt Dynamic Light Scattering DynaPro Nanostar (Wyatt). Proba a fost încălzită de la 40°C la 70°C la o rată de încălzire de 0,5°C/min, cu achiziţie constantă a razei măsurate. Creşterea razei indicând topirea proteinei şi agregarea a fost utilizată de pachetul software livrat cu dispozitivul DLS pentru a calcula temperatura de agregare a constructului de anticorp.

Toate constructele de anticorpi bispecifici MSLNxCD3 testate ale invenţiei au arătat stabilitate termică la temperaturi de agregare ≥49°C, aşa cum se arată în Tabelul 14 de mai jos. Grupul de constructe de anticorpi care se leagă de clusterul de epitopi 2+3 a avut chiar o stabilitate termică de ≥51° şi până la peste 56°C.

Tabelul 14: Termostabilitatea constructelor de anticorpi bispecifici, determinată de DLS (dispersie dinamică a luminii)

MSLN HALB BiTE Stabilitate termică DLS TA [°C] MS 1 49,3 MS 8 51,0 MS 2 53,1 MS 3 51,6 MS 4 56,5 MS 5 54,4 MS 6 53,9 MS 7 51,4

Exemplul 11

Turbiditate la concentraţia de anticorpi de 2500 µg/ml

1 ml de soluţie de construct de anticorp purificat cu o concentraţie de 250 µg/ml a fost concentrat prin unităţi de concentrare spin la 2500 µg/ml. După 16h de stocare la 5°C, turbiditatea soluţiei de anticorp a fost determinată prin măsurarea absorbţiei optice OD340 nm împotriva tamponului de formulare generic.

Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 15 de mai jos. Toate constructele de anticorpi testate au o turbiditate foarte favorabilă de ≤ 0,09.

Tabelul 15: Turbiditatea constructelor anticorpului după concentrare la 2,5 mg/ml peste noapte

MSLN HALB BiTE Turbiditate după 16h la 2500 µg/ml [OD340] MS 1 0,080 MS 8 0,079 MS 2 0,070 MS 3 0,087 MS 4 0,076 MS 5 0,071 MS 6 0,070 MS 7 0,066

Exemplul 12: Exprimarea CD69 indusă de BiTE® pe celulele T în absenţa celulelor ţintă

PBMC izolate de la donatori umani sănătoşi au fost cultivate cu constructe de anticorpi bispecifici CDH19/CD3 sau MSLN/CD3 HLE crescând timp de 48 de ore. Exprimarea markerului de activare CD69 pe celulele T a fost determinată prin imunocolorare şi citometrie în flux şi conjugate mAb specifice antigenului.

Activarea celulelor T independentă de ţintă în ceea ce priveşte reglarea ascendentă a CD69 a fost observată pentru toate constructele anti-CDH 19, dar a fost cel mai pronunţată pentru moleculele heteroFc şi anticorp X. Reglarea ascendentă CD69 de către antiCDH19-scFc a avut loc la concentraţii mai mari şi amplitudinea a fost parţial mai mică în comparaţie cu celelalte două constructe pe bază de Fc.

Pentru anti-MSLN, aproape nicio activare a celulelor T independentă de ţintă nu a fost observată pentru molecula care conţine scFc, în timp ce constructul heteroFc a indus o reglare ascendentă puternică a CD69 pe celulele T de suprafaţă celulară în absenţa celulelor ţintă.

Activarea celulelor T independentă de ţintă indusă de constructele BiTE® care conţin Fc cu un singur lanţ sau fuziune hetero-Fc la capătul C-terminal pentru următoarele constructe:

constructe BiTE® (diluţii seriale: 0,1 pM - 2 µM)

a. MSLN scFc; 1,14 mg/ml;

b. MSLN Hetero Fc; 1,02 mg/

Celule efectoare PBMC umane (3 donatori; #065, #823, #836 (scFc) #401, #415, #433 (heteroFc); #590, #595, 598, #605 (anticorp X)).

48 h perioadă de incubare.

Determinarea exprimării CD69 pe celulele T CD4+ şi CD8+ cu citometru de flux şi conjugate mAb specifice antigenului. Pentru rezultate a se vedea Figura 15.

Activarea celulelor T independentă de ţintă indusă de constructele de anticorpi BiTE® care conţin Fc cu un singur lanţ, hetero-Fc sau fuziune încrucişată la capătul C-terminal au fost evaluate pentru următoarele constructe:

constructe BiTE® (diluţii seriale: 0,1 pM - 2 µM)

c. CDH19 scFc; 245,3 µg/ml(

d. CDH-19 Hetero Fc; 1 mg/ml

e. CDH19 anticorp X; 6,3 mg/ml

Celule efectoare PBMC umane (3 până la 4 donatori; #386, #392, #401 (scFc) #282, #284, #287 (heteroFc)).

48 h perioadă de incubare.

Determinarea exprimării CD69 pe celulele T CD4+ şi CD8+ cu citometru de flux şi conjugate mAb specifice antigenului. Pentru rezultate a se vedea Figura 16.

Exemplul 13:

Constructele de anticorpi BiTE® purificate au fost acoperite pe o placă Maxisorb în concentraţie descrescătoare (100nM, diluţii 1:4). După spălare de 3 ori cu PBS-T şi blocare cu PBS/3% (g/v) BSA (60 min, 37°C), plasmă umană reunită a fost incubată timp de 60 min, 80 rpm la temperatura camerei. După spălare de 3x, a fost adăugat un anticorp monoclonal de şoarece specific pentru subunitatea A C1q umană (CC1q) (Thermo MA1-83963, 1:500) timp de 60 min, 80 rpm, temperatura camerei, după etapele de spălare descrise, un mAb Fc-POX de capră anti-şoarece (1:5.000) a fost incubat timp de 60 min, 80 rpm, temperatura camerei. După spălare suplimentară, substratul TMB a fost incubat şi oprit după reacţia colorimetrică prin adăugare de H2SO4. Absorbţia a fost determinată la 450 nm.

Rezultat: După cum se arată în figura 17, la concentraţii mari, constructul hetero Fc BiTE® (pătrate) a arătat semnale de legare mai mari pentru CC1q uman în comparaţie cu un construct Fc cu un singur lanţ BiTE® (triunghi). Drept control negativ a fost utilizat un BiTE® canonic (cerc), care nu a arătat nicio legare semnificativă de CC1q.

Exemplul 14: Farmacocinetica constructelor de anticorpi BiTE® fuzionate cu proteine Fc-(scFc) şi hetero-Fc (hetFc) cu un singur lanţ

Diverşi anticorpi de legare la ţintă BiTE® au fost fuzionaţi la două fragmente diferite de extindere a timpului de înjumătăţire. Cele două variante HLE diferite per anticorp BiTE®, denumit ulterior BiTE®-scFc şi BiTE®-hetFc, au fost testate la maimuţa cynomolgus în contextul studiilor farmacocinetice (PK). Nomenclatura corespunzătoare a acestor molecule este rezumată pe scurt în Tabelul 16 de mai jos.

Tabelul 16 Nomenclatura compuşilor pentru nouă constructe de anticorpi HLE BiTE® cu doză unică

sinonim compus denumire compus de test Compus 1a CD33cc-scFc Compus 1b CD33cc-hetFc Compus 2a MSLN-scFc Compus 2b MSLN-hetFc Compus 3a CDH19-scFc Compus 3b CH19-hetFc Compus 4 CD20-scFc Compus 5a DLL3-scFc Compus 5b DLL3-hetFc

Constructul de anticorp HLE BiTE® a fost administrat ca bolus intravenos (compuşii 1b-5b) şi perfuzie intravenoasă (compusul 1a, 30 min) la 6 µg/kg (compus 2b), 12 µg/kg (compuşii 2a şi 3a-5b) şi 15 µg/ kg (compuşii 1a şi, respectiv, 1b). Pentru fiecare dintre compuşii denumiţi mai sus a fost utilizat un grup de cel puţin două până la trei animale. S-au recoltat probe de sânge şi s-a preparat ser pentru determinarea concentraţiilor serice. Nivelurile serice de construct de anticorp BiTE® au fost măsurate utilizând un imunotest. Testul este realizat prin capturarea BiTE® prin intermediul fragmentului său ţintă, în timp ce un anticorp direcţionat împotriva părţii de legare a CD3 a constructului a fost utilizat pentru detectare. Profilurile serice de concentraţie-timp au fost utilizate pentru a determina parametrii PK. Punctele de timp pentru prelevarea de sânge sunt enumerate în Tabelul 17 de mai jos.

Tabelul 17 Momentele de prelevare a probelor de sânge în timpul studiului PK

momente de prelevare a probelor de sânge comp. 1a [h] momente de prelevare a probelor de sânge comp. 1b [h] momente de prelevare a probelor de sânge comp. 2a-5b [h] 0,085 0,085 0,05 4,00 1 0,25 24,00 4 0,5 48,00 12 1 72,00 24 4 96,00 48 8 120,00 72 24 144,00 96 48 168 144 72 168 168 240 336

Farmacocinetica a patru perechile de constructe de anticorpi BiTE®-HLE sunt prezentate, cu titlu de exemplu, în Figura 18. Fiecare pereche reprezintă aceeaşi proteină BiTE® fuzionată fie cu o extensie scFc sau cu o extensie hetFc. Pentru toate proteinele, nivelurile serice au fost cuantificabile pentru toate momentele de timp la toate animalele după administrarea BiTE®-HLE. Profilurile PK descriu un declin bifazic, exponenţial după fiecare dintre administrările cu un singur element de testare.

Parametrii farmacocinetici au fost determinaţi folosind metode standard de analiză non-compartimentală (NCA). Utilizând analiza necompartimentală, s-au estimat următorii parametri PK: ASCinf (Aria de sub curba concentraţiei serice-timp), Vss (volum de distribuţie la starea de echilibru), CL (eliminare sistemică) şi t1/2 terminal (timp de înjumătăţire terminal).

Parametrii PK pentru fiecare compus testat sunt rezumaţi ca medie a n=2 şi respectiv n=3, în Tabelul 18 de mai jos.

Tabelul 18 Parametrul farmacocinetic al variantelor scFc şi heteroFc din diferiţi lianţi BiTE®-ţintă la maimuţele cynomolgus.

element de test t1/2 terminal [h] ASCinf [h*ng/ml] CL [ml/h/kg] Vss [mL/kg] Compus 1a 167 6645 1,4 256 Compus 1b 95 4955 2,6 261 Compus 2a 213 12072 0,73 179 Compus 2b 116 6971 0,8 78 Compus 3a 61 3293 3,6 129 Compus 3b 59 3633 3,3 79 Compus 4 97 6266 1,9 180 Compus 5a 234 24769 0,48 144 Compus 5b 173 14639 0,82 166

În general, ASCinf pentru diferitele perechi BiTE® -HLE de lianţi ţintă fuzionaţi fie cu fragmentul scFc, fie cu hetFc, respectiv, au variat între 3293 h*ng/ml şi 24769 h*ng/ml, în funcţie de contextul ţintă BiTE®. Toate fuziunile HLE analizate au atins valori ale eliminării sistemice de 0,48 până la 3,6 ml/h/kg. Volumele corespunzătoare de distribuţie au variat între 78 şi 261 ml/kg.

Exemplul 15:

Substanţele medicamentoase preformulate care conţin MSLN-HALB, MSLN-hFc şi, respectiv, MSLN-scFc purificate au fost schimbate cu tampon prin ultrafiltrare/diafiltrare folosind membrane cu o limită de greutate moleculară (MWCO) de 10 kDa. Formularea finală a fost obţinută prin adăugarea de soluţii stoc concentrate. Formulările rezultate pentru fiecare construct sunt enumerate în Tabelul 19 şi cuprind K60RTrT compus 20 mM din fosfat de potasiu, 150 mM clorhidrat de L-arginină, trehaloză dihidrat 6% (g/v), polisorbat 80 0,01% (g/v) la pH 6,0 şi G40MSuT compus din 10 mM glutamat, 4% (g/v) manitol, 2% (g/v) zaharoză, 0,01% (g/v) polisorbat 80 la pH 4,0. Concentraţia ţintă a proteinei a fost de 1,0 mg/ml. Constructele MSLN formulate au fost umplute până la 1 ml în flacoane de sticlă de tip I care au fost astupate cu dopuri din cauciuc butilic şi sertizate cu garnituri de aluminiu. Flacoanele umplute au fost incubate la -20, 5, 25 şi 37°C. Un flacon din fiecare versiune a fost supus la cinci cicluri de îngheţ şi dezgheţ (F/T). Temperatura ţintă de îngheţ a fost de -29°C. Temperatura ţintă de dezgheţ a fost de 2°C. Viteza de generare a fost de aproximativ 0,3 K/min.

Particulele vizuale au fost evaluate în conformitate cu metoda descrisă de Ph Eur 2.9.20 de către operatori instruiţi. Numărătorile de particule vizuale per flacon sunt prezentate în Tabelul 7. Numărul de particule proteice vizuale (mai mare de 125 µm) a fost mai mare pentru MSLN-hFc în comparaţie atât cu MSLN-hALB cât şi cu MSLN-scFc.

Tabelul 19: Numărul de particule proteice vizuale pe flacon pentru probele stresate şi nestresate (T0) care conţin diferite constructe BiTE® anti-mezotelină (MSLN) cu timp de înjumătăţire prelungit. K60RTrT indică o formulare care conţine 20 mM fosfat de potasiu, 150 mM clorhidrat de L-arginină, 6% (g/v) trehaloză dihidrat, 0,01 % (g/v) polisorbat 80, pH 6,0. G40MSuT indică o formulare care conţine 10 mM glutamat, 4% (g/v) manitol, 2% (g/v) zaharoză, 0,01% (g/v) polisorbat 80, pH 4,0

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT Număr de particule proteice vizibile (>125µm) per flacon T0 0 0 1 0 0 5 cicluri F/T 0 2 2 0 1 2w 5°C 0 2 2 0 0 2w 25°C 0 2 1 0 0 2w 37°C 0 2 2 0 0 4w -20°C 0 2 1 0 0 4w 5°C 0 1 2 0 0 4w 25°C 0 2 2 0 0 4w 37°C 0 2 2 0 0

Probele descrise mai sus au fost, de asemenea, analizate prin cromatografie cu excludere pe baza mărimii de performanţă ultra-înaltă (SE-UPLC) pentru a cuantifica conţinutul procentual de specii cu greutate moleculară mare (HMWS). SE-UPLC a fost efectuată pe un sistem UPLC AcquityH-Class (Waters) folosind o coloană Acquity UPLC BEH200 SEC de 150 mm (Waters). Temperatura coloanei a fost setată la 25°C. Separarea variantelor de mărime a fost realizată prin aplicarea unei metode izocratice cu un debit de 0,4 ml/min. Faza mobilă a fost compusă din fosfat de sodiu 100 mM, NaCI 250 mM la pH 6,8. Durata totală a ciclului este de 6,0 minute. Probele au fost ţinute la 8°C în autosampler până la analiză. S-a injectat o cantitate totală de 3 µg proteină. Pentru a evita transferul, a fost efectuată o injecţie intermediară cu 40% acetonitril după fiecare probă. Detectarea s-a bazat pe emisia de fluorescenţă (excitaţie la 280 nm, emisie la 325 nm). Integrarea maximă a fost realizată folosind software-ul Empower®. A fost raportată aria de sub curbă relativă HMWS (Tabelul 20).

Constructele pe bază de Fc au prezentat conţinuturi mai mici de HMWS în varianta de formulare G40MSuT decât în K60RTrT independent de condiţia de stres. A devenit evident că MSLN-scFc conţinea mai puţine HMWS decât MSLN-hFc atât în preparatele G40MSuT, cât şi în K60RTrT. MSLN-scFc în formularea sa preferată (G40MSuT) a fost mai puţin predispus la formarea HMWS decât MSLN-hALB formulat în K60RTrT. În experimentele anterioare, acest tampon a arătat un potenţial de stabilizare îmbunătăţit pentru constructele pe bază de hALB în comparaţie cu formulările cu valori mai acide ale pH-ului.

Tabelul 20: Privire de ansamblu asupra conţinutului de HMWS în preparatele MSLN-HALB, -hFc şi -scFc stresate şi nestresate (T0) determinat prin SE-UPLC

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT %HMWS T0 1,8 6,7 3,3 2,5 1,3 5 cicluri F/T 2,0 7,2 4,1 3,0 1,5 2w 5°C n.t. n.t. n.t. 2,9 1,1 2w 25°C n.t. 6,6 2,7 2,4 0,5 2w 37°C 2,6 6,3 2,1 2,7 0,3 4w -20°C 5,9 8,7 1,6 6,6 0,3 4w 5°C 2,0 8,2 2,8 3,6 0,6 4w 25°C 2,2 6,8 2,6 2,7 0,4 4w 37°C 3,5 7,6 1,9 4,3 0,3 n.t. = netestat

Abundenţa modificărilor chimice la stresul termic (incubare la 37°C) a fost monitorizată prin cartografierea peptidelor. Probele de proteine au fost digerate enzimatic şi peptidele rezultate au fost separate utilizând cromatografia în fază inversă. Eluatul coloanei a fost injectat direct în sursa de ioni a unui spectrometru de masă pentru identificarea şi cuantificarea peptidelor.

Pentru a obţine o acoperire maximă, au fost efectuate două digestii enzimatice separate: o dată cu tripsină şi o dată cu chimotripsină. În fiecare caz, proteinele au fost denaturate cu clorură de guanidină şi apoi reduse cu ditiotreitol (DTT). După incubare în DTT, resturile de cisteină liberă au fost alchilate prin adăugarea de acid iodoacetic. Probele au fost apoi schimbate cu tampon în Tris 50 mM pH 7,8 pentru digestie. Tripsina şi chimotripsina au fost adăugate în tuburi de reacţie separate într-un raport de 1:10 (probă:enzimă) fiecare. Probele au fost digerate timp de 30 de minute la 37°C şi reacţia a fost stinsă prin adăugarea de acid trifluoracetic.

O încărcătură de 5 µg din fiecare digestat a fost injectată separat pe o coloană cu fază inversă Zorbax SB-C18 (Agilent #859700-902) echilibrată în acid formic (FA) 0,1% (v/v). Un gradient de 156 de minute de până la 90% acetonitril care conţine 0,1% FA a fost utilizat pentru a elua peptidele direct în sursa de ioni de electronebulizare a unui spectrometru de masă Q-Exactive Plus (Thermo Scientific). Datele au fost colectate în modul dependent de date utilizând o metodă a primilor 12 precursori în care o scanare completă (rezoluţie 70 000; interval de scanare 200-2000 m/z) a fost urmată de disociere indusă de coliziune de mare energie (HCD) a celor 12 ioni cei mai abundenţi (rezoluţie 17 500).

Peptidele au fost identificate pe baza spectrului de masă precis şi a spectrului de masă tandem folosind software-ul intern. Identificările au fost verificate manual. Cantităţile relative de peptide modificate şi nemodificate au fost calculate pe baza abundenţei ionilor folosind software-ul Pinpoint (Thermo Scientific).

Procentele modificărilor chimice ale regiunilor de determinare a complementarităţii (CDR) şi ale porţiunii de extindere a timpului de înjumătăţire (fie hALB, fie Fc) detectate în preparatele MSLN-HALB, -hFc şi -scFc sunt indicate în Tabelul 21. Când s-au comparat condiţii similare de formulare, a devenit evident că, în general, modificările chimice au fost cel mai puţin abundente în constructele scFc.

Tabelul 21: Privire de ansamblu asupra modificărilor chimice din preparatele MSLN-hALB, -hFc şi -scFc stresate şi nestresate (T0) determinate prin cartografierea peptidelor

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT %N101 deamidare (CDR) T0 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 2w 37°C 0,7 0,8 3,0 0,7 3,2 4w 37°C 1,3 n.t. 8,5 n.t. 6,4 %N162 deamidare (CDR) T0 3,0 1,7 1,9 2,3 2,5 2w 37°C 15,9 11,6 2,7 15,0 3,3 4w 37°C 26,8 n.t. 3,7 n.t. 4,1

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT %M279 oxidare (CDR) T0 0,6 1,4 1,6 0,6 1,0 2w 37°C 1,2 0,8 0,8 0,6 1,0 4w 37°C 0,9 n.t. 0,8 n.t. 0,6 %N348 deamidare (CDR) T0 0,5 3,2 3,3 0,5 0,9 2w 37°C 20,5 21,6 1,9 9,4 1,3 4w 37°C 22,8 n.t. 2,0 n.t. 2,9

%N351 deamidare (CDR) T0 0,2 2,9 2,6 0,5 1,0 2w 37°C 6,6 12,7 0,9 3,8 0,4 4w 37°C 8,7 n.t. 0,8 n.t. 0,8 %M530 oxidare (Fc) T0 n.a. 3,9 4,1 2,6 3,2 2w 37°C n.a. 9,0 3,1 4,0 4,3 4w 37°C n.a. n.t. 3,4 n.t. 3,5

%N603 deamidare (Fc) T0 n.a. 1,3 1,9 1,3 1,4 2w 37°C n.a. 7,9 4,6 7,0 5,6 4w 37°C n.a. n.t. 6,9 n.t. 8,1 %M706 oxidare (Fc) T0 n.a. 3,2 3,6 1,5 2,1 2w 37°C n.a. 6,0 2,8 2,1 2,5 4w 37°C n.a. n.t. 2,6 n.t. 2,0 %M587 oxidare (hALB) T0 1,0 n.a. n.a. n.a. n.a. 2w 37°C 2,2 n.a. n.a. n.a. n.a. 4w 37°C 2,3 n.a. n.a. n.a. n.a.

%M623 oxidare (hALB) T0 1,9 n.a. n.a. n.a. n.a. 2w 37°C 2,4 n.a. n.a. n.a. n.a. 4w 37°C 3,0 n.a. n.a. n.a. n.a. %M798 oxidare (hALB) T0 1,4 n.a. n.a. n.a. n.a. 2w 37°C 3,3 n.a. n.a. n.a. n.a. 4w 37°C 3,5 n.a. n.a. n.a. n.a.

%M829 oxidare (hALB) T0 8,9 n.a. n.a. n.a. n.a. 2w 37°C 42,9 n.a. n.a. n.a. n.a. 4w 37°C 44,1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. = nu se aplică; n.t. = netestat

Exemplul 16:

MSLN-HALB, -hFc, -scFc formulate aşa cum este descris în Exemplul 15 au fost supuse unui experiment cu salt de pH. Concentraţia materiilor prime a fost de 1,0 mg/ml. Un volum de 0,38 ml din fiecare materie primă a fost introdus într-un flacon de sticlă. După precondiţionare la 37°C, soluţiile au fost îmbogăţite cu soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS) de 20 de ori care a fost compusă din fosfat de potasiu 0,090 M, fosfat de sodiu 0,480 M (ambii dibazici), clorură de potasiu 0,052 M şi NaCl 2,76 M. Probele îmbogăţite au fost incubate la 37°C timp de două săptămâni. După incubare, acestea au fost analizate prin SE-UPLC utilizând metoda descrisă în Exemplul 15 şi a fost raportat conţinutul procentual de HMWS (Tabelul 22). Când s-au comparat toate constructele formulate în K60RTrT, conţinutul de HMWS a crescut în următoarea ordine: hALB < scFc < hFc. MSLN-scFc a arătat, de asemenea, un conţinut mai scăzut de HMWS decât MSLN-hFc atunci când a fost formulat în G40MSuT.

Tabelul 22: Privire de ansamblu asupra conţinutului de HMWS în preparatele MSLN-HALB, - hFc şi -scFc stresate (salt pH + 2w 37°C) determinat prin SE-UPLC

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT %HMWS 2w 37°C 1,5 8,3 7,1 5,4 5,1

Exemplul 17:

MSLN-HALB, -hFc şi -scFc formulate aşa cum este descris în Exemplul 15 au fost supuse la stres prin agitare. Concentraţia materiilor prime a fost de 1,0 mg/ml. Un volum de 0,5 ml din fiecare soluţie a fost filtrat printr-un filtru adecvat de 0,22 µm şi introdus în flacoane de sticlă de 3cc. Flacoanele au fost amplasate într-o cutie de plastic, asigurându-se că flacoanele nu au fost deplasate în interiorul cutiei în timpul agitării. Cutia a fost amplasată pe un agitator orbital. Probele au fost agitate la 500 rpm timp de 65 de ore. Particulele vizuale au fost evaluate în conformitate cu metoda descrisă de Ph Eur 2.9.20. Metoda a fost efectuată de operatori instruiţi. Numărătorile de particule vizuale per flacon sunt prezentate în Tabelul 23. Particulele proteice vizibile au fost observate numai în preparatele MSLN-hFc.

Tabelul 23: Numărul de particule proteice vizibile per flacon în probe agitate

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT Număr de particule proteice vizibile (>125µm) per flacon 65h, 500 rpm 0 1 1 0 0

Probele de mai sus au fost, de asemenea, analizate prin cromatografie de performanţă ultra-înaltă cu excludere pe baza mărimii (SE-UPLC) pentru a cuantifica conţinutul procentual de specii cu greutate moleculară mare (HMWS). S-a aplicat aceeaşi metodă ca cea descrisă în Exemplul 15. Conţinutul de HMWS al probelor agitate este subliniat în Tabelul 24. Formarea de HMWS a fost cea mai pronunţată în MSLN-hFc când s-au comparat preparatele K60RTrT. Pentru constructele pe bază de Fc, conţinutul de HMWS ar putea fi redus prin scăderea pH-ului formulării (G40MSuT). Dar din nou, HMWS au fost mai abundente în MSLN-hFc decât în MLSN-scFc.

Tabelul 24: Privire de ansamblu asupra conţinutului de HMWS în preparatele MSLN-HALB, - hFc şi -scFc stresate (salt pH + 2w 37°C) determinat prin SE-UPLC

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT %HMWS 65h, 500 rpm 1,8 5,8 2,4 1,8 0,3

Exemplul 17:

MSLN-HALB, -hFc şi -scFc formulate aşa cum este descris în Exemplul 15 au fost expuse la lumină vizibilă şi UVA (fotostres). Concentraţia de proteine a totalizat 1 mg/ml în toate preparatele. Soluţiile de proteine au fost filtrate printr-un filtru cu dimensiunea porilor de 0,22 µm şi umplute la 0,5 ml în flacoane de sticlă de tip I. MSLN-hALB şi -scFc au fost supuse la două teste diferite, inclusiv lumină vizibilă 0,2 MLux / lumină UVA 25 W*h/m2 şi lumină vizibilă 1,2MLux / 173 W*h/m2 respectiv. MSLN-hFc a fost supus la două teste diferite, inclusiv lumină vizibilă 0,2 MLux fără lumină UVA şi lumină vizibilă 1,2 MLux / lumină UVA 30 W*h/m2 respectiv. Temperaturile camerei au fost ajustate la 25°C. După expunerea la lumină, probele au fost analizate prin inspecţie vizibilă (Tabelul 25), SE-UPLC (Tabelul 26) şi cartografierea peptidelor (Tabelul 27). Metodele menţionate mai sus au fost efectuate conform procedurilor descrise în Exemplul 15. Deşi MSLN-HALB şi -scFc au fost expuse la doze mai mari de lumină UVA, nu au fost observate particule proteice vizibile, în timp ce probele de MSLN-hFc au prezentat o particulă proteică vizibilă per flacon pentru ambele teste, indiferent de formulare.

Tabelul 25: Privire de ansamblu asupra numărului de particule proteice vizibile per flacon în preparate MSLN-hALB, -hFc şi scFc determinat după expunerea la lumină

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT Număr de particule proteice vizibile (>125µm) per flacon T0 0 0 1 0 0 Test 1 01) 12) 12) 01) 01) Test 2 03) 14) 14) 03) 03) 1) lumină vizibilă 0,2 MLux / lumină UVA 25 W*h/m2, 2) lumină vizibilă 0,2 MLux fără lumină UVA, 3) lumină vizibilă 1,2 MLux / 173 W*h/m2, 4) lumină vizibilă 1,2 MLux / 30 W*h/m2

HMWS au crescut în următoarea ordine MSLN-hALB < -scFc < -hFc când proteina a fost formulată în K60RTrT. HMWS ar putea fi reduse pentru constructele pe bază de Fc atunci când este formulată în G40MSuT. Cu toate acestea, HMWS au fost din nou mai puţin pronunţate pentru MSLN-scFc. MSLN-hFc s-a dovedit a fi deosebit de sensibil la expunerea la lumină UVA.

Tabelul 26: Privire de ansamblu asupra conţinutului de HMWS în preparatele MSLN-HALB, -hFc şi -scFc determinat după expunerea la lumină prin SE-UPLC

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT %HMWS T0 1,8 6,7 3,3 2,5 1,3 Test 1 1,81) 6,32) 2,52) 2,11) 0,41) Test 2 2,03) 11,04) 2,14) 2,43) 0,33) 1) lumină vizibilă 0,2 MLux / lumină UVA 25 W*h/m2, 2) lumină vizibilă 0,2 MLux fără lumină UVA, 3) lumină vizibilă 1,2 MLux / 173 W*h/m2, 4) lumină vizibilă 1,2 MLux / 30 W*h/m2

Procentele modificărilor chimice ale regiunilor de determinare a complementarităţii (CDR) şi ale porţiunii de extindere a timpului de înjumătăţire (fie hALB, fie Fc) detectate în preparatele MSLN-HALB, -hFc şi -scFc sunt indicate în Tabelul 27. Când s-au comparat condiţii similare de formulare, a devenit evident că, în general, modificările chimice au fost cel mai puţin abundente în constructele scFc.

Tabelul 27: Privire de ansamblu asupra modificărilor chimice în preparate MSLN-HALB, -hFc, şi -scFc determinate după expunere la lumină prin cartografierea peptidelor

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT %N101 deamidare (CDR) T0 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 Test 1 0,21) n.t. 0,32) n.t. 0,51) Test 2 0,23) n.t. 0,64) n.t. 0,74) %N162 deamidare (CDR) T0 3,0 1,7 1,9 2,3 2,5 Test 1 3,01) n.t. 2,12) n.t. 2,71) Test 2 3,63) n.t. 3,14) n.t. 2,83)

%M279 oxidare (CDR) T0 0,6 1,4 1,6 0,6 1,0 Test 1 0,81) n.t. 2,62) n.t. 0,61) Test 2 1,03) n.t. 6,34) n.t. 0,74) %N348 deamidare (CDR) T0 0,5 3,2 3,3 0,5 0,9 Test 1 0,41) n.t. 2,72) n.t. 0,21) Test 2 0,93) n.t. 3,94) n.t. 0,24)

%N3b1 deamidare (CDR) T0 0,2 2,9 2,6 0,5 1,0 Test 1 0,41) n.t. 2,02) n.t. 0,31) Test 2 0,53) n.t. 2,64) n.t. 0,34) %M530 oxidare (Fc) T0 n.a. 3,9 4,1 2,6 3,2 Test 1 n.a. n.t. 7,62) n.t. 3,11)

Construct hALB hFc scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT K60RTrT G40MSuT Test 2 n.a. n.t. 21,84) n.t. 4,13) %M706 oxidare (Fc) T0 n.a. 3,2 3,6 1,5 2,1 Test 1 n.a. n.t. 6,52) n.t. 1,81) Test 2 n.a. n.t. 17,84) n.t. 2,73)

%M587 oxidare (hALB) T0 1,0 n.a. n.a. n.a. n.a. Test 1 1,5 n.a. n.a. n.a. n.a. Test 2 2,4 n.a. n.a. n.a. n.a. %M623 oxidare (hALB) T0 1,9 n.a. n.a. n.a. n.a. Test 1 4,0 n.a. n.a. n.a. n.a. Test 2 4,1 n.a. n.a. n.a. n.a.

%M796 oxidare (hALB) T0 1,4 n.a. n.a. n.a. n.a. Test 1 2,1 n.a. n.a. n.a. n.a. Test 2 3,1 n.a. n.a. n.a. n.a. %M829 oxidare (hALB) T0 8,9 n.a. n.a. n.a. n.a. Test 1 31,0 n.a. n.a. n.a. n.a. Test 2 25,2 n.a. n.a. n.a. n.a.

n.a. = nu se aplică; n.t. = netestat

Exemplul 18:

MSLN-hALB a fost formulat în K60RTrT şi MSLN-scFc a fost formulat în G40MSuT conform procedurii descrise în Exemplul 15. Concentraţiile de proteine au totalizat 0,05 mg/ml. Recipientele din sticlă (borosilicat, tip I, flacon de 13 mm 3cc de la West, nr. art. 68000375) şi recipientele de test din polipropilenă (2 ml cu inel O, de ex. de la Sarstedt, nr. art. 72.694.005) sunt umplute cu 500 µl de soluţie de testare. Soluţia de testare a fost lăsată timp de cinci minute în primul recipient de testare. Apoi a fost eşantionată o alicotă de 150 µl pentru analiză. Soluţia de testare rămasă (350 µl) a fost transferată secvenţial dintr-un recipient de testare în altul (cinci recipiente în total). În fiecare flacon, soluţia a fost lăsată timp de cinci minute înainte de următorul transfer. A fost folosit acelaşi vârf de pipetă pentru fiecare etapă de transfer. Acelaşi test a fost efectuat folosind sticle de policarbonat de 30 ml (Nalgene, PCS-000295 cu închidere, PP/20-415/ZTPE). Pentru acest tip de recipient, primul recipient a fost umplut cu 5 ml. După ce a fost eşantionată o alicotă de 150 µl, volumul rezidual a fost transferat dintr-un recipient de testare în altul (conform procedurii descrise mai sus). Probele extrase din recipientul #1 şi #5 au fost analizate prin SE-UPLC (metoda aşa cum este descrisă în Exemplul 15). În plus, detectarea proteinei a fost efectuată cu un detector PDA (280 nm) pentru a determina concentraţiile de proteine. Recuperarea procentuală a proteinei din fiecare recipient de testare este indicată de Tabelul 28. S-a arătat că recuperarea proteinei a fost mai pronunţată pentru MSLN-scFc decât pentru MSLN-hALB, indiferent de tipul de recipient.

Tabelul 28: Recuperarea proteinelor din diferite tipuri de recipiente pentru MSLN-HALB şi -scFc determinată prin SE-UPLC

Construct hALB scFc Formulare K60RTrT G40MSuT % recuperare proteine (de la val. nominală) Sticlă de tip I 80,0 92,0 Polipropilenă 87,0 97,3 Policarbonat 87,0 96,0

Exemplul 19:

MSLN-hALB a fost formulat în K60RTrT şi MSLN-scFc a fost formulat în K60RTrT şi G40MSuT conform procedurii descrise în Exemplul 15. Concentraţia de proteină a totalizat 1,0 mg/ml. 1950 µl din fiecare soluţie de testare au fost adăugaţi cu 50 µl dintr-o soluţie standard de siliciu de 1000 ppm (Specpure de la AlfaAesar, nr. art. 38717) rezultând o îmbogăţire de 25 ppm. O soluţie de testare neîmbogăţită a servit ca probă de control. Soluţia de testare îmbogăţită precum şi proba de control au fost introduse în flacoane de sticlă de tip I de 3cc şi au fost incubate la 37°C timp de 24 de ore. Toate probele au fost analizate prin SE-UPLC conform metodei descrise în Exemplul 15 pentru a cuantifica cantitatea de HMWS (Tabelul 29). Când au fost formulate în K60RTrT, MSLN-hALB şi -scFc au prezentat creşteri similare ale HMWS la îmbogăţirea cu siliciu. Pentru constructul scFc s-a putut demonstra că această creştere ar putea fi redusă prin scăderea pH-ului formulării la 4,0. Conform experimentelor preliminare, această abordare nu a fost fezabilă pentru MLSN-hALB, deoarece s-a dovedit a suferi fragmentare la valori ale pH-ului formulării de 5,0 şi mai mici.

Tabelul 29: Privire de ansamblu asupra conţinuturilor de HMWS în preparate MSLN-HALB, lu -scFc determinate prin SE-UPLC după îmbogăţire cu 25 ppm silicon

Construct hALB scFc Formulare K60RTrT K60RTrT G40MSuT Δ%HMWS (comparativ cu martorul fără îmbogăţire) 25 ppm îmbogăţire 1,0 1,0 0,2

Tabelul 30: Lista secvenţelor

SECV ID NR: Descriere Sursă Secvenţa 1. Linker peptidic artificială GGGG 2. Linker peptidic artificială GGGGS 3. Linker peptidic artificială GGGGQ 4. Linker peptidic artificială PGGGGS 5. Linker peptidic artificială PGGDGS 6. Linker peptidic artificială SGGGGS 7. Linker peptidic artificială GGGGSGGGS 8. Linker peptidic artificială GGGGSGGGGS 9. Linker peptidic artificială GGGGSGGGGSGGGGS 10. Hexahistidină artificială HHHHHH 11. CDR-L1 a F6A artificială GSSTGAVTSGYYPN 12. CDR-L2 a F6A artificială GTKFLAP 13. CDR-L3 a F6A artificială ALWYSNRWV 14. CDR-H1 a F6A artificială IYAMN 15. CDR-H2 a F6A artificială RIRSKYNNYATYYADSVKS 16. CDR-H3 a F6A artificială HGNFGNSYVSFFAY 17. VH al F6A artificială 18. VL al F6A artificială 19. VH-VL a F6A artificială 20. CDR-L1 a H2C artificială GSSTGAVTSGYYPN 21. CDR-L2 a H2C artificială GTKFLAP 22. CDR-L3 a H2C artificială ALWYSNRWV 23. CDR-H1 a H2C artificială KYAMN 24. CDR-H2 a H2C artificială RIRSKYNNYATYYADSVKD 25. CDR-H3 a H2C artificială HGNFGNSYISYWAY 26. VH al H2C artificială 27. VL al H2C artificială 28. VH-VL a H2C artificială 29. CDR-L1 a HIE artificială GSSTGAVTSGYYPN 30. CDR-L2 a HIE artificială GTKFLAP 31. CDR-L3 a HIE artificială ALWYSNRWV 32. CDR-H1 a HIE artificială SYAMN 33. CDR-H2 a HIE artificială RIRSKYNNYATYYADSVKG 34. CDR-H3 a HIE artificială HGNFGNSYLSFWAY 35. VH al HIE artificială 36. VL al HIE artificială 37. VH-VL ale HIE artificială 38. CDR-L1 a G4H artificială GSSTGAVTSGYYPN 39. CDR-L2 a G4H artificială GTKFLAP 40. CDR-L3 a G4H artificială ALWYSNRWV 41. CDR-H1 a G4H artificială RYAMN 42. CDR-H2 a G4H artificială RIRSKYNNYATYYADSVKG 43. CDR-H3 a G4H artificială HGNFGNSYLSYFAY 44. VH al G4H artificială 45. VL al G4H artificială 46. VH-VL ale G4H artificială 47. CDR-L1 a A2J artificială RSSTGAVTSGYYPN 48. CDR-L2 a A2J artificială ATDMRPS 49. CDR-L3 a A2J artificială ALWYSNRWV 50. CDR-H1 a A2J artificială VYAMN 51. CDR-H2 a A2J artificială RIRSKYNNYATYYADSVKK 52. CDR-H3 a A2J artificială HGNFGNSYLSWWAY 53. VH al A2J artificială 54. VL al A2J artificială 55. VH-VL ale A2J artificială 56. CDR-L1 a E1L artificială GSSTGAVTSGYYPN 57. CDR-L2 a E1L artificială GTKFLAP 58. CDR-L3 a E1L artificială ALWYSNRWV 59. CDR-H1 a E1L artificială KYAMN 60. CDR-H2 a E1L artificială RIRSKYNNYATYYADSVKS 61. CDR-H3 a E1L artificială HGNFGNSYTSYYAY 62. VH al E1L artificială 63. VL al E1L artificială QPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 64. VH-VL ale E1L artificială 65. CDR-L1 a E2M artificială RSSTGAVTSGYYPN 66. CDR-L2 a E2M artificială ATDMRPS 67. CDR-L3 a E2M artificială ALWYSNRWV 68. CDR-H1 a E2M artificială GYAMN 69. CDR-H2 a E2M artificială RIRSKYNNYATYYADSVKE 70. CDR-H3 a E2M artificială HRNFGNSYLSWFAY 71. VH al E2M artificială 72. VL al E2M artificială 73. VH-VL ale E2M artificială 74. CDR-L1 a F7O artificială GSSTGAVTSGYYPN 75. CDR-L2 a F7O artificială GTKFLAP 76. CDR-L3 a F7O artificială ALWYSNRWV 77. CDR-H1 a F7O artificială VYAMN 78. CDR-H2 a F7O artificială RIRSKYNNYATYYADSVKK 79. CDR-H3 a F7O artificială HGNFGNSYISWWAY 80. VH al F7O artificială 81. VL al F7O artificială 82. VH-VL ale F7O artificială 83. CDR-L1 a F12Q artificială GSSTGAVTSGNYPN 84. CDR-L2 a F12Q artificială GTKFLAP 85. CDR-L3 a F12Q artificială VLWYSNRWV 86. CDR-H1 a F12Q artificială SYAMN 87. CDR-H2 a F12Q artificială RIRSKYNNYATYYADSVKG 88. CDR-H3 a F12Q artificială HGNFGNSYVSWWAY 89. VH al F12Q artificială 90. VL al F12Q artificială 91. VH-VL ale F 12Q artificială 92. CDR-L1 a I2C artificială GSSTGAVTSGNYPN 93. CDR-L2 a 12C artificială GTKFLAP 94. CDR-L3 a artificială VLWYSNRWV I2C 95. CDR-H1 a I2C artificială KYAMN 96. CDR-H2 a I2C artificială RIRSKYNNYATYYADSVKD 97. CDR-H3 a I2C artificială HGNFGNSYISYWAY 98. VH al I2C artificială 99. VL al I2C artificială 100. VH-VL ale I2C artificială 101. VH al F12q artificială 102. VL al F12q artificială 103. F12q scFv 104. HALB umană 105. HALB7 artificială 106. HALB098 artificială 107. HALB 114 artificială 108. HALB254 artificială 109. HALB253 artificială 110. HALB131 artificială 111. HALB 13 5 artificială 112. HALB 133 artificială 113. HALB234 artificială 114. HALB C34S artificială 115. HALB7 C34S artificială 116. HALB098 C34S artificială 117. HALB 114 C34S artificială 118. HALB254 C34S artificială 119. HALB253 C34S artificială 120. HALB131 C34S artificială 121. HALB 13 5 C34S artificială 122. HALB 133 C34S artificială 123. HALB234 C34S artificială 124. HALB C34A artificială 125. HALB7 C34A artificială 126. HALB098 C34A artificială 127. HALB 114 C34A artificială 128. HALB254 C34A artificială 129. HALB253 C34A artificială 130. HALB131 C34A artificială 131. HALB135 C34A artificială 132. HALB133 C34A artificială 133. HALB234 C34A artificială 134. Ab156 artificială RDWDFDVFGGGTPVGG 135. peptidă de legare FcRn liniară artificială QRFVTGHFGGLXPANG 136. peptidă de legare FcRn liniară Y artificială QRFVTGHFGGLYPANG 137. peptidă de legare FcRn liniară H artificială QRFVTGHFGGLHPANG 138. peptidă de legare FcRn de bază H artificială TGHFGGLHP 139. peptidă de legare FcRn ciclică H artificială QRFCTGHFGGLHPCNG 140. HC corp de încrucişare 1

141. LC corp de încrucişare 1 142. HC corp de încrucişare 2 143. LC corp de încrucişare 2 144. Hetero-Fc ligand Fc 145. Hetero-Fc partener Fc 146. Maxicorp 1 ţintă Fc 147. Maxicorp 1 CD3 Fc 148. Maxicorp 2 ţintă Fc 149. Maxicorp 2 CD3 Fc 150. Mono Fc 151. MS_1 VH CDR1 SSSYYWG 152. MS_1 VH CDR2 SIYYSGITNYNPSLKS 153. MS_1 VH CDR3 PSNYDAFDI 154. MS_1 VL CDR1 TGSSSNIGAGYDVH 155. MS_1 VL CDR2 GNSKRPS 156. MS_1 VL CDR3 QSYDSSLGGWV 157. MS_1 VH 158. MS_1 VL 159. MS_1 scFv 160. MS_1 moleculă bispecifică 161. MS_2 VH CDR1 DHYMS 162. MS_2 VH CDR2 YISSSGSTIYYADSVKG 163. MS_2 VH DLGPSFDY CDR3 164. MS_2 CDR1 RASQGISSWLA 165. MS_2 VL CDR2 AASRLQS 166. MS_2 CDR3 QQANSFPRT 167. MS_2 VH 168. MS_2 VL 169. MS_2 scFv 170. MS_2 moleculă bispecifică 171. MS_3 CDR1 DYYMT 172. MS_3 VH CDR2 YISSSGSTIYYADSVKG 173. MS_3 VH CDR3 DRNSHFDY 174. MS_3 VL CDR1 RASQGITRWLA 175. MS_3 VL CDR2 AASVLQS 176. MS_3 VL CDR3 QQSNSFPRT 177. MS_3 VH 178. MS_3 VL EDFATYYCQQSNSFPRTFGQGTKVEIK 179. MS_3 scFv 180. MS_3 moleculă bispecifică 181. MS_4 VH CDR1 DYYMT 182. MS_4 VH CDR2 YISSSGSTIYYADSVKG 183. MS_4 VH CDR3 DRNSHFDY 184. MS_4 VL CDR1 RASQGINTWLA 185. MS_4 VL CDR2 GASGLQS 186. MS_4 VL CDR3 QQAKSFPRT 187. MS_4 VH 188. MS_4 VL 189. MS_4 scFv 190. MS_4 moleculă bispecifică 191. MS_5 VH CDR1 DHYMS 192. MS_5 VH CDR2 YISSSGGIIYYADSVKG 193. MS_5 VH CDR3 DVGSHFDY 194. MS_5 VL CDR1 RASQDISRWLA 195. MS_5 VL CDR2 AASRLQS 196. MS_5 VL CDR3 QQAKSFPRT 197. MS_5 VH 198. MS_5 VL 199. MS_5 scFv 200. MS_5 moleculă bispecifică 201. MS_6 VH CDR1 DHYMS 202. MS_6 VH CDR2 YISNSGSIIYYVDSVKG 203. MS_6 VH CDR3 DVRTAFDY 204. MS_6 VL CDR1 RASQSIGSWLA 205. MS 6 VL AASSLQS CDR2 206. MS_6 VL CDR3 QQANSFPRT 207. MS_6 VH 208. MS_6 VL 209. MS_6 scFv 210. MS_6 moleculă bispecifică 211. MS_7 VH CDR1 SKFMT 212. MS_7 VH CDR2 VIYSGGKTYYADSVKG 213. MS_7 VH CDR3 DSGGWGYFDY 214. MS_7 VL CDR1 KSSQSVLYSSNNKNYLA 215. MS_7 VL CDR2 WASTRES 216. MS_7 VL CDR3 QQYYSTPPT 217. MS_7 VH 218. MS_7 VL 219. MS_7 scFv 220. MS_7 moleculă bispecifică 221. MS_8 VH CDR1 SYYWN 222. MS_8 VH CDR2 RIYYNGNTYYNPSLKS 223. MS_8 VH CDR3 PKLGIDAFDI 224. MS_8 VI, CDR1 TGSSSNIGAGYDVH 225. MS_8 VL CDR2 GNSNRPS 226. MS_8 VL CDR3 QSYDSSLSGWV 227. MS_8 VH 228. MS_8 VL 229. MS_8 scFv 230. MS_8 moleculă bispecifică 231. MSLN umană v1 NM_005823 umană 232. MSLN umană v2 NM_013404 umană 233. MSLN umană v6 AY743 922 umană 234. MSLN cyno v1 LMR C52457 macac 235. factor de potenţare a megacariocitelor NM 005823 umană 236. MSLN, scindată din NM_005823 umană 237. scindare C-terminală NM 005823 umană GTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA 238. MSLN-E 1 umană EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTY 239. MSLN-E 2 umană EQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDI 240. MSLN-E 3 umană RKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVP 241. MSLN-E 4 umană PSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLG 242. MSLN-E 5 umană GAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGP 243. MSLN-E 6 umană HVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEAL 244. MSLN-E 1+2 umană EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYL FLKMSPEDI 245. MSLN-E 2+3 umană 246. hu orl MSLN-E 1 mu artificială 247. hu orl MSLN-E2 mu artificială 248. hu orl MSLN-E3 mu artificială 249. hu orl MSLN-E4 mu artificială 250. hu orl MSLN-E5 mu artificială 251. hu orl MSLN-E6 mu artificială 252. Fc monomer-1 +c/-g 253. Fc monomer-2 +c/g/delGK 254. Fc monomer-3 - 255. Fc monomer-4 c/+g/delGK 256. Fc monomer-5 -c/-g 257. Fc monomer-6 -c/-g/delGK 258. Fc monomer-7 +c/+g 259. Fc monomer-8 +c/+g/delG K 260. scFc-1 261. scFc-2 262. scFc-3 263. scFc-4 264. scFc-5 265. scF c-6 266. scFc-7 267. scFc-8 268. MS_1xCD3 -scFc Moleculă bispecifică HLE 269. MS_lxCD3 - scFc delGK Moleculă bispecifică HLE 270. MS_1_CCx CD3-scFc Moleculă bispecifică HLE 271. MS_1_CCx CD3-scFc_delGK Moleculă bispecifică HLE

272. MS _2xCD3 -scFc Moleculă bispecifică HLE 273. MS_2xCD3 - scFc_delGK Moleculă bispecifică HLE 274. MS_2_CCx CD3-scFc Moleculă bispecifică HLE 275. MS_2_CCx CD3-scFc_delGK Moleculă bispecifică HLE 276. MS_3xCD3 -scFc Moleculă bispecifică HLE 277. MS_3xCD3 - scFc_delGK Moleculă bispecifică HLE 278. MS_3_CCx CD3-scFc Moleculă bispecifică HLE 279. MS_3_CCx CD3-scFc_delGK Moleculă bispecifică HLE 280. MS _4xCD3 -scFc Moleculă bispecifică HLE 281. MS_4xCD3 - scFc_delGK Moleculă bispecifică HLE 282. MS_4_CCx CD3-scFc Moleculă bispecifică HLE 283. MS_4_CCx CD3-scFc_delGK Moleculă bispecifică HLE 284. MS_5xCD3 -scFc Moleculă bispecifică HLE 285. MS_5xCD3 - scFc_delGK Moleculă bispecifică HLE 286. MS_5_CCx CD3-scFc Moleculă bispecifică HLE 287. MS_5_CCx CD3-scF c del GK Moleculă bispecifică HLE 288. MS_6xCD3 Moleculă -scFc bispecifică HLE 289. MS_6xCD3 scFc delGK Moleculă bispecifică HLE 290. MS_6_CCx CD3-scFc Moleculă bispecifică HLE 291. MS_6_CCx CD3-scFc delGK Moleculă bispecifică HLE 292. MS_7xCD3 -scFc Moleculă bispecifică HLE 293. MS_7xCD3 scFc delGK Moleculă bispecifică HLE 294. MS_7_CCx CD3-scFc Moleculă bispecifică HLE 295. MS_7_CCx CD3-scFc delGK Moleculă bispecifică HLE 296. MS _ 8xCD3 -scFc Moleculă bispecifică HLE 297. MS_8xCD3 scFc delGK Moleculă bispecifică HLE 298. MS_8_CCx CD3-scFc Moleculă bispecifică HLE 299. MS_8_CCx CD3-scFc delGK Moleculă bispecifică HLE 300. Linker peptidic Linker (G4S)4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 301. Linker peptidic Linker (G4S)5 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 302. Linker peptidic Linker (G4S)6 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 303. Linker peptidic Linker (G4S)7 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 304. Linker peptidic Linker (G4S)8 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

Claims (14)

1. Construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă la MSLN umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă la CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă la un epitop al MSLN care este cuprins în regiunea descrisă în SECV ID NR: 245;

în care primul domeniu de legare care leagă MSLN umană cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din:

a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 161, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 162, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 163, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 164, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 165 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 166;

b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 171, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 172, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 173, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 174, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 175 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 176;

c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 181, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 182, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 183, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 184, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 185 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 186;

d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 191, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 192, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 193, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 194, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 195 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 196; şi

e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 201, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 202, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 203, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 204, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 205 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 206.

2. Construct de anticorp conform revendicării 1, în care al doilea domeniu de legare se leagă la epsilon CD3 uman şi la epsilon CD3 Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus sau Saimiri sciureus.

3. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările precedente, în care constructul de anticorp este într-un format selectat din grupul constând din mAb cu un singur domeniu (scFv)2, scFv, diacorpi şi oligomeri ai acestor formate.

4. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările precedente, în care primul domeniu de legare cuprinde o regiune VH selectată din grupul constând din cele prezentate în SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 177, SECV ID NR: 187, SECV ID NR: 197, şi SECV ID NR: 207, şi/sau în care primul domeniu de legare cuprinde o regiune VL selectată din grupul constând din cele prezentate în SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 178, SECV ID NR: 188, SECV ID NR: 198, şi SECV ID NR: 208.

5. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările precedente, în care primul domeniu de legare cuprinde o regiune VH şi o regiune VL selectate din grupul constând din perechi formate dintr-o regiune VH şi o regiune VL aşa cum este prezentat în SECV ID NR: 167+168, SECV ID NR: 177+178, SECV ID NR: 187+188, SECV ID NR: 197+198, şi SECV ID NR: 207+208.

6. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările precedente, în care primul domeniu de legare cuprinde o polipeptidă selectată din grupul constând din cele prezentate în SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209.

7. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 4, cuprinzând:

(a) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209;

• un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; şi

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi

• opţional o etichetă His, cum ar fi cea prezentată în SECV ID NR 10;

(b) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine pornind de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209;

• un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9;

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103;

• opţional un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9;

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 104-134; şi

• opţional o etichetă His, cum ar fi cea prezentată în SECV ID NR 10;

(c) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi QRFVTGHFGGLX1PANG (SECV ID NR: 135) unde X1 este Y sau H; şi

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209;

• un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9;

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103;

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi QRFVTGHFGGLHPANG (SECV ID NR: 137) sau QRFCTGHFGGLHPCNG (SECV ID NR: 139); şi

• opţional o etichetă His, cum ar fi cea prezentată în SECV ID NR 10;

(d) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 17, SECV ID NR: 26, SECV ID NR: 35, SECV ID NR: 44, SECV ID NR: 53, SECV ID NR: 62, SECV ID NR: 71, SECV ID NR: 80, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 98, şi SECV ID NR: 101;

• un linker peptidic având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 8;

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 178, SECV ID NR: 188, SECV ID NR: 198, şi SECV ID NR: 208 şi un reziduu de serină la capătul C-terminal;

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 140; şi o polipeptidă cuprinzând, în următoarea ordine, pornind de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 177, SECV ID NR: 187, SECV ID NR: 197, şi SECV ID NR: 207;

• un linker peptidic având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 8;

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 18, SECV ID NR: 27, SECV ID NR: 36, SECV ID NR: 45, SECV ID NR: 54, SECV ID NR: 63, SECV ID NR: 72, SECV ID NR: 81, SECV ID NR: 90, SECV ID NR: 99, şi SECV ID NR: 102 şi un reziduu de serină la capătul C-terminal;

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 141;

(e) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 17, SECV ID NR: 26, SECV ID NR: 35, SECV ID NR: 44, SECV ID NR: 53, SECV ID NR: 62, SECV ID NR: 71, SECV ID NR: 80, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 98, şi SECV ID NR: 101;

• un linker peptidic având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 8;

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 178, SECV ID NR: 188, SECV ID NR: 198, şi SECV ID NR: 208;

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 142; şi

o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 177, SECV ID NR: 187, SECV ID NR: 197, şi SECV ID NR: 207;

• un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 8;

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 18, SECV ID NR: 27, SECV ID NR: 36, SECV ID NR: 45, SECV ID NR: 54, SECV ID NR: 63, SECV ID NR: 72, SECV ID NR: 81, SECV ID NR: 90, SECV ID NR: 99, şi SECV ID NR: 102 şi un reziduu de serină la capătul C-terminal;

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 143;

(f) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209;

• un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; şi

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 144; şi

o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 145;

(g) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209; şi

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 146; şi

o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 147;

(h) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209; şi

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 148; şi

o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 149; sau

(i) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209;

• un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1-9; şi

• o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103; şi

• o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 150.

8. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 6 cuprinzând într-o ordine de la N- la C-terminal:

• primul domeniu de legare având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 179, SECV ID NR: 189, SECV ID NR: 199, şi SECV ID NR: 209;

• un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 2, 8 şi 9;

• al doilea domeniu de legare având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 19, SECV ID NR: 28, SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 46, SECV ID NR: 55, SECV ID NR: 64, SECV ID NR: 73, SECV ID NR: 82, SECV ID NR: 91, SECV ID NR: 100, şi SECV ID NR: 103 (a se vedea, de asemenea, SECV ID NR: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 sau 187 din WO 2008/119567);

• un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 1, 2, 4, 5, 6, 8 şi 9; şi

• al treilea domeniu de legare având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 260-267.

9. Construct de anticorp conform revendicării 8, cuprinzând o secvenţă selectată din grupul constând din SECV ID NR: 276 la 287

10. Polinucleotidă care codifică un construct de anticorp aşa cum este definit în oricare dintre revendicările precedente.

11. Celulă gazdă transformată sau transfectată cu polinucleotida definită în revendicarea 10.

12. Compoziţie farmaceutică cuprinzând un construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 9.

13. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 9 pentru utilizare în prevenirea sau tratamentul unei boli cu tumoare solidă sau a unei boli cu cancer metastatic.

14. Kit cuprinzând un construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 9, o polinucleotidă conform revendicării 10 şi/sau o celulă gazdă conform revendicării 11.