DE69833755T2

DE69833755T2 - Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen

Info

Publication number: DE69833755T2
Application number: DE69833755T
Authority: DE
Inventors: Joseph Francis CARR; Biovation Limited Graham Balgownie Drive CARTER; Anne Anita Balgownie Drive HAMILTON; Suzanne Biovation Limited Fiona ADAIR
Original assignee: Biovation Ltd
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1997-05-21
Filing date: 1998-05-21
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2018-05-22
Also published as: EP0983303B1; AU736549B2; EP0983303A1; CA2290485C; DE69833755D1; CA2290485A1; EP1724282A3; WO1998052976A1; US20030153043A1; GB2339430A; US7125689B2; AU7539398A; ES2258817T3; JP2002512624A; GB9925632D0; US7465572B2; EP1724282A2; ATE319745T1; EP1724282B1; US20070014796A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Produktion von im Wesentlichen nicht-immunogenen Proteinen zur Herstellung neuer Therapeutika und In-vivo-Diagnostika, die insbesondere beim Mensch verwendet werden. Die Erfindung betrifft insbesondere eine neue deimmunisierte Version des Bakterienproteins Streptokinase.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, durch das potenziell immunogene Epitope in einem nicht-autologen Protein identifiziert werden können, und bietet ein Methodik, durch die solche Epitope eliminiert werden können. Es gibt eine Reihe erprobter therapeutischer Proteine, deren therapeutische Verwendung aufgrund ihrer Immunogenität beim Mensch eingeschränkt ist. In dem vorliegenden Beispiel wird das therapeutische Protein Streptokinase auf die Anwesenheit potenzieller MHC-Bindungsmotive analysiert, und es wird ein Verfahren zur Entfernung einer Anzahl dieser Moleküle offenbart.
Streptokinase (SK) ist ein Einzelkettenprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 47 kDa, das in bestimmten Stämmen β-hämatolytischer Streptokokken produziert wird (Huang T.T. et al., Mol. Biol. 2 197–205 (1989)). Das Protein hat keine innere enzymatische Aktivität, jedoch hat es eine erhebliche klinische Bedeutung, die auf ihre effiziente Bindung an Human-Plasminogen zurückzuführen ist, was seine Aktivierung zu Plasmin verstärkt und dadurch die Auflösung von Fibrinfilamenten in Blutgerinnseln fördert. Einige Untersuchungen haben gezeigt, dass SK ein wirksames thrombolytisches Mittel bei der Behandlung von Koronarthrombose ist, was das Überleben verbessert (ISIS-2 Collaborative Group, Lancet 349–360 (1988)) und die Funktion des linken Ventrikels nach einem Myokardinfarkt bewahrt. [ISAM Study Group, N. Engl. J. Med. 314, 1465–1471 (1986); Kennedy J. W. et al., Circulation 77, 345–352 (1988)). Trotz des unbestrittenen therapeutischen Wertes von SK ist der nicht-autologe Ursprung des Proteins aufgrund seiner Immunogenität bei Menschen von Nachteil. Die Produktion neutralisierender Antikörper in dem Patient schränkt das Protein im Allgemeinen auf eine einzelne Verwendung ein.
Die vorliegende Erfindung stellt erstmals ein allgemeines Verfahren bereit, um im Wesentlichen nicht-immunogene Proteine, wie das Bakterien-Protein Streptokinase, herzustellen.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um Streptokinase oder ein Teil des Proteins gegenüber einer gegebenen Spezies nicht- immunogen oder weniger immunogen zu machen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) Bestimmen mindestens eines Teils der Aminosäuresequenz von Streptokinase;
(b) Identifizieren eines ersten Satzes von einem oder mehreren potenziellen T-Zell-Epitopen innerhalb der Aminosäuresequenz von Streutokinase durch (i) Analysieren nach überlappenden Peptidsequenzen innerhalb der Aminosäuresequenz, die entweder an MHC-Klasse-II-Moleküle binden oder die Fähigkeit aufweisen, T-Zellen über die Präsentation an MHC-Klasse-II zu stimulieren, hinsichtlich des Vorliegens von MHC-Klasse-II-Bindungsmotiven und (ii) Vergleichen dieser Sequenzen mit humanen MHC-Klasse-II-Bindungsmotiven, die aus MHC-Datenbanken verfügbar sind,
(c) Identifizieren eines zweiten Satzes von einem oder mehreren potenziellen T-Zell-Epitopen, der eine geringere Anzahl an T-Zell-Motiven umfasst, durch Subtrahieren potenzieller T-Zell-Epitope von dem ersten Satz, die auch in Keimliniensequenzen humaner variabler Immunglobulinregionen vorliegen, die aus humanen Keimlinien-Datenbanken erhalten werden, und
(d) Eliminieren mindestens eines der gemäß Schritt (c) identifizierten T-Zell-Epitope aus der Aminosäuresequenz von Streptokinase durch Verändern eines oder mehrerer Aminosäurereste innerhalb oder in Nachbarschaft zu der Sequenz an Positionen, die denjenigen innerhalb des (der) identifizierten T-Zell-Epitop(s/e) entsprechen.

Der Begriff "T-Zell-Epitope" betrifft spezifische Peptid-Sequenzen, die entweder mit einer vernünftigen Effizienz an MHC-Klasse-II-Moleküle binden, oder die bei vorhergehenden oder anderen Untersuchungen die Fähigkeit zur Stimulation von T-Zellen über eine Präsentation auf MHC Klasse II zeigen. Es versteht sich jedoch, dass nicht all diese Peptidsequenzen in das korrekte MHC-Klasse-II-Zellkompartiment für die MHC-Klasse-II-Bindung abgegeben werden, oder geeignet aus einem größeren zellulären Protein für eine nachfolgende MHC-Klasse-II-Bindung freigesetzt werden. Es versteht sich auch, dass sogar diese Peptide, die durch MHC-Klasse-II auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen präsentiert werden, eine T-Zellreaktion hervorrufen, z.B. aus Gründen, die ein Fehlen der geeigneten T-Zell-Spezifität und Toleranz durch das Immunsystem gegenüber der jeweiligen Peptidsequenz beinhalten.
Der Fachmann versteht, dass die vorliegende Erfindung außer für Streptokinase ebenfalls zur Herstellung anderer therapeutischer Proteine verwendbar ist. Proteine, die ansonsten in Mensch immunogen sind, könnten durch Entfernung der T-Zell-Epitope deimmunisiert werden. Ist zudem ein Human-Bezugsprotein mit ähnlicher Sekundärstruktur und identifizierbaren Oberflächen-Aminosäuren verfügbar, könnten die B-Zell-Epitope zusätzlich aus dem Protein entfernt werden, indem man die Oberflächen-Aminosäure aus dem Human-Bezugsprotein anstelle der entsprechenden Aminosäuren in dem Nicht-Human- oder potenziell immunogenen Protein entfernt. Die klinische Verwendung des thrombolytischen Mittels Bakterien-Streptokinase wird beispielsweise durch humane Immunreaktionen gegen das Molekül eingeschränkt, solche Moleküle können zur Entfernung potenzieller T-Zell-Epitope gentechnologisch hergestellt werden, so dass die Immunogenität beseitigt wird.
Die Erfindung wird im Allgemeinen verwendet, um die Immunogenität eines Proteins oder eines Teils davon einer ersten Spezies in Bezug auf das Immunsystem einer zweiten Spezies zu reduzieren. Die erste Spezies kann nichthuman sein, und die zweite Spezies kann human sein. Beispiele für eine übliche nicht-humane Spezies, die sich hinsichtlich der erfindungsgemäßen Ausführungsformen in Bezug auf Immunglobuline eignen, umfassen Säugetiere, insbesondere Nagetiere, wie Ratten und insbesondere Mäuse, und Nutztiere, wie Schaf und Rindvieh. Wie jedoch oben in Bezug auf die bakterielle Streptokinase eindeutig hervorgeht, kann die erste Spezies taxonomisch weit von der zweiten Spezies entfernt sein; ist die erste Spezies nicht-human, kann es sich um ein Nicht-Säugetier und sogar um einen Nicht-Eukaryont handeln. Die Erfindung betrifft selbstverständlich auch andere Spezies als Mensch, und andere Proteine, insbesondere therapeutische Proteine, die im Allgemeinen andere spezifisch bindende Moleküle beinhalten, als Voll-Antikörper.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Überlegung, wie eine Immunreaktion gegen ein Protein gewöhnlich in Menschen als Basis zur Vermeidung oder Eliminierung von Sequenzen in dem Protein erzeugt wird, die an dieser Immunreaktion beteiligt sind. Wird einem Humanpatient ein therapeutisches Protein verabreicht, wird das Protein sowohl durch die humoralen als auch zellulären Arme des Immunsystems überwacht, das auf das Protein reagiert, wenn es als fremd erkannt wird, und wenn das Immunsystem nicht bereits gegenüber der immunogenen Sequenz in dem Protein tolerant ist. Für die humorale Immunreaktion können unreife B-Zellen, die Oberflächenimmunglobuline (sIg) präsen tieren, eine oder mehrere Sequenzen in dem therapeutischen Protein ("B-Zell-Epitope") binden, wenn die Affinität zwischen dem einzelnen sIg und dem B-Zell-Epitop übereinstimmt, und wenn das B-Zell-Epitop derart frei liegt, dass das sIg das B-Zell-Epitop erreichen kann. Der Prozess der sIg-Bindung an das therapeutische Protein kann in der Gegenwart geeigneter Cytokine die B-Zelle stimulieren, damit sie sich differenziert und teilt, so dass lösliche Formen des ursprünglichen sIg bereitgestellt werden, die das therapeutische Protein komplexieren können, damit seine Wirksamkeit begrenzt wird und seine Clearance aus dem Patient erleichtert wird. Für eine effiziente B-Zellreaktion ist eine parallele T-Zellreaktion erforderlich, damit die Cytokine und andere Signale bereitgestellt werden, die nötig sind, damit lösliche Antikörper erzeugt werden. Eine wirksame T-Zell-reaktion erfordert die Aufnahme des therapeutischen Proteins durch antigenpräsentierende Zellen (APCs), die die B-Zellen selbst oder andere kompetente APCs, wie Makrophagen, dendritische Zellen und andere Monocyten, beinhalten. Zudem können nicht-professionelle APCs, wie die Zellen, an die das Protein bindet, das therapeutische Protein aufnehmen und die Zwischenproduktverarbeitung des Proteins bereitstellen, so dass die kompetenten APCs die Proteinkomponenten dann absorbieren können. Die APCs können nach der Aufnahme des therapeutischen Proteins geeignete Peptide aus dem therapeutischen Protein ("T-Zell-Epitope") präsentieren, die mit MHC-Klasse-II-Molekülen an der Zelloberfläche komplexiert sind. Solche Peptid-MHC-Klasse-II-Komplexe können durch Helfer-T-Zellen über den T-Zellrezeptor erkannt werden, und dies führt zur Stimulation der T-Zellen und zur Sekretion von Cytokinen, die die "Hilfe" für die B-Zellen hinsichtlich ihrer Differenzierung zu vollständigen antikörperproduzierenden Zellen bereitstellen. Die T-Zellreaktion kann beispielsweise durch Entzündung und allergische Reaktionen ebenfalls schädliche Auswirkungen auf den Patient haben.
Eine wirksame primäre immunogene Reaktion auf ein therapeutisches Protein erfordert daher gewöhnlich eine Kombination von B- und T-Zell-Reaktionen auf B- und T-Zellepitope. Daher erfordert die Vermeidung einer primären immunogenen Reaktion die Vermeidung oder Eliminierung von B- und T-Zell-Epitopen mit dem therapeutischen Protein. Ohne die B- oder T-Zellreaktion ist die immunogene Reaktion auf ein therapeutisches Protein wahrscheinlich mutiert oder fehlt. Die vorliegende Erfindung stellt daher Verfahren zur Vermeidung oder Eliminierung von T-Zell-Epitopen oder eine Kombination von B- und T-Zell-Epitopen aus den therapeutischen Proteinen bereit, damit im Wesentlichen nicht-immunogene Proteine erzeugt werden, wobei die Vermeidung dieser Epitope in dem therapeutischen Protein besonders betont wird. Für B-Zell-Epitope zieht das Verfahren einen Vorteil aus der Tatsache, dass sIg nur an zugängliche Bereiche des therapeutischen Proteins binden kann, d.h. Sequenzen von frei liegenden Oberflächen-Aminosäuren. Für T-Zell-Epitope werden Sequenzen überlappender Peptide in dem therapeutischen Protein analysiert, so dass man die mutmaßlichen Peptide identifiziert, die sich zur Präsentation durch MHC-Klasse-II-Moleküle eignen. Durch Absuchen des therapeutischen Proteins und, wenn T-Zell-Epitope identifiziert wurden, Ändern von einer und mehreren einzelnen Aminosäuren zur Eliminierung des T-Zell-Epitops kann dann ein Protein ohne T-Zell-Epitope erzeugt werden.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren kombiniert daher die Entfernung der B- und T-Zell-Epitope aus einem therapeutischen Protein, ein Prozess, der als "Deimmunisierung" bezeichnet wird. Die vorliegende Erfindung stellt die Entfernung von humanen (oder von einer zweiten Spezies) T-Zell-Epitopen aus dem therapeutischen Protein bereit, wodurch die Proteinsequenz auf die Gegenwart von MHC-Klasse-II-Bindungsmotiven durch eine geeignete Maßnahme analysiert werden kann. Es kann beispielsweise ein Vergleich mit Datenbanken von MHC-Bindungsmotiven durchgeführt werden, wie beispielsweise durch Absuchen der "Motiv"-Datenbanken auf der weltweiten Internetseite (www) wehil.wehi.edu.au. Alternativ können die MHC-Klasse-II-bindenden Peptide identifiziert werden, indem Rechner-Aufspürungsverfahren eingesetzt werden, wie die von Altuvia et al. (J. Mol. Biol. 249, 244–250, (1995)) beschriebenen, wodurch aufeinanderfolgende überlappende Peptide aus den Proteinsequenzen auf ihre Bindungsenergien an MHC-Klasse-II-Proteine untersucht werden. Zur Unterstützung der Identifkation von MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden, können damit einhergehenden Merkmale aufgefunden werden, die erfolgreich präsentierte Peptide betreffen, wie Amphipathie und Rothbard-Motive, und Spaltstellen für Kathepsin B und andere Prozessierungsenzyme.
Nach der Identifikation von T-Zell-Epitopen einer potenziellen zweiten Spezies (beispielsweise Mensch) werden diese Epitope dann eliminiert, indem eine oder mehrere Aminosäuren bei Bedarf eliminiert werden. Gewöhnlich beinhaltet dies die Veränderung einer oder mehrerer Aminosäure nahe dem Epitop selbst. Dies beinhaltet die Veränderung einer Aminosäure nahe dem Epitop in Bezug auf die Primärstruktur des Proteins, oder einer Aminosäure, die in der Primärstruktur nicht nahe ist, aber nahe in der Sekundärstruktur des Moleküls ist. Die übliche vorgeschlagene Veränderung ist eine Aminosäure-Substitution, jedoch ist unter bestimmten Umständen eine Aminosäure-Addition oder -Deletion möglicherweise geeignet. Sämtliche Veränderungen können vorzugsweise durch DNA-Rekombina tionstechnik durchgeführt werden, so dass das fertige Molekül durch Expression aus einem rekombinanten Wirt beispielsweise durch anerkannte Maßnahmen hergestellt werden kann, jedoch ist die Verwendung von Protein-Chemie oder einer anderen Maßnahme zur molekularen Veränderung in der erfindungsgemäßen Praxis nicht ausgeschlossen.
In der Praxis hat sich herausgestellt, dass potenzielle Human-T-Zell-Epitope sogar in den humanen Keimlinien-V-Region-Framework-Sequenzen identifiziert werden können, wenn ein Vergleich mit Datenbanken MHC-bindender Motive durchgeführt wird. Da Menschen gewöhnlich keine weiterführende Immunreaktion gegen ihre eigenen Proteine aufbauen, sind die Menschen dann gegen diese Epitope tolerant, oder diese potenziellen Epitope können nicht durch humane APCs präsentiert werden, weil sie nicht geeignet prozessiert werden. Daher können diese potenziellen T-Zell-Epitope, die in den Keimlinien-V-Region-Sequenzen vertreten sind, in der Praxis in dem deimmunisierten Antikörper beibehalten werden. Zur Minimierung der Erzeugung zusätzlicher 7-Zell-Epitope während der Eliminierung der potenziellen T-Zell-Epitope aus der therapeutischen Proteinsequenz wird die Eliminierung der T-Zell-Epitope vorzugsweise (aber nicht notwendigerweise) durch Umwandlung in Keimlinien-Aminosäuren einer zweiten Spezies (gewöhnlich Mensch) an Positionen erzielt, die denen der ersten Spezies (gewöhnlich Maus) Aminosäuren in den T-Zell-Epitopen entsprechen. Sobald die anfangs identifizierten T-Zell-Epitope entfernt sind, kann die deimmunisierte Sequenz erneut analysiert werden, damit gewährleistet ist, dass keine neuen T-Zell-Epitope erzeugt werden, und wenn sie erzeugt werden, dass das oder die Epitope wie oben beschrieben deletiert werden können, oder die vorherige Umwandlung in eine entsprechende Keimlinien-Aminosäure wird durch Umwandlung der Aminosäure aus Maus (oder einer anderen ersten Spezies) in eine ähnliche nicht-humane (oder nicht aus der zweiten Spezies stammende) Aminosäure (d.h. beispielsweise mit ähnlicher Größe und/oder Ladung) verändert, bis alle T-Zell-Epitope eliminiert sind.
Der Fachmann weiß, dass es mehrere Variationen des erfindungsgemäßen Verfahrens gibt, die im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegen. Die vorliegende Erfindung betrifft zwar prinzipiell therapeutische Proteine, aus denen humane B- und T-Zell-Epitope deletiert wurden, jedoch versteht man, dass die Entfernung der T-Zell-Epitope allein in einigen Fällen ebenfalls bei der Vermeidung einer immunogenen Reaktion in Patienten wirksam sein kann. Es sollte ebenfalls im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegen, dass man ein bereits existierendes therapeutisches Protein neu entwirft, gegen das ein humane Immunreaktion nachgewiesen wurde und das charakterisiert wurde, um Epitope zu deletieren, die die beobachtete Immunreaktion in Menschen betreffen.
Erfindungsgemäß wird ein durch ein erfindungsgemäßes Verfahren hergestelltes deimmunisiertes Streptokinasemolekül zur Verwendung in der Medizin oder in der Diagnose bereitgestellt. Als bevorzugte Ausführungsform wird ein Streptokinasemolekül bereitgestellt, das die Proteinsequenz von 2 aufweist. Die Erfindung erstreckt sich weiter auf ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Krankheit oder eines Zustands, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge des durch ein erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Moleküls an ein Individuum umfasst.
Die Erfindung wird nachstehend durch das folgende Beispiel veranschaulicht, ist aber nicht darauf eingeschränkt. Das Beispiel betrifft die Zeichnungen. Es zeigt:
1 die Proteinsequenz von Streptokinase aus Streptococcus equisimilis; und
2 die Proteinsequenz eines deimmunisierten Streptokinasemoleküls.
Beispiel 1:
Das folgende Beispiel wurde zur Identifikation von potenziellen MHC-Klasse-II-Bindungsmotiven in Streptokinase verwendet. Die Sequenz der Streptokinase wurde aus der GenBank-Datenbank identifiziert. Die Sequenz mit der Zugriffsnummer 546536 wurde durchweg verwendet (28). Die Sequenz wurde auf die Anwesenheit von potenziellen MHC-Klasse-II-Bindungmotiven durch rechnerunterstützten Vergleich mit einer Datenbank der MHC-Bindungsmotive auf der weltweiten Internetseite wehil.wehi.edu.au analysiert.
Die Ergebnisse des "Such"-Verfahrens zeigen die Anwesenheit von 395 potenziellen MHC-Klasse-II-Bindungsmotiven. Davon stimmten 283 mit Sequenzen überein, die in einer Datenbank von menschlichen Proteinsequenzen aus der variablen Region von Keimlinien-Immunglobulin identifiziert wurden. Diese Epitope wurden nicht weiter auf der Grundlage berücksichtigt, dass die Immunreaktionen im Allgemeinen nicht gegen autologe zirkulierende Proteine, wie Immunglobuline, hervorgerufen werden. Dies beinhaltet die immunologische Toleranz gegen die potenziellen T-Zell-Epitope, die in der Struktur der Immunglobuline (und tatsäch lich der Mehrheit der Human-Proteine) vorhanden sind. Epitope, die von den nicht-autologen Proteinen präsentiert werden, wie SK, die identisch oder ähnlich zu Motiven sind, die in Immunglobulinproteinen vorhanden sind, werden wahrscheinlich auch toleriert und können in der Praxis durch den Deimmunisierungsprozess beibehalten werden.
Nach der Subtraktion der humanen Immunglobulin-Protein-Keimlinienmotive wurden die verbleibenden 112 potenziellen Epitope einzeln auf Ähnlichkeit mit Nichtimmunglobulin-Proteinsequenzen analysiert. In der Praxis wurden vorhergesagte Anker-Rest für jedes potenzielle Epitop in einer Konsensus-Sequenz-Suche von exprimierten Humanproteinen verwendet. Die translatierten Sequenzen in den SwissProt- und GenBank-Datenbanken wurden mit kommerziell erhältlicher Software (DNAstar Madison, WI, USA) abgefragt. Die in bekannten zirkulierenden Humanproteinen identifizierten Epitope wurden nicht weiter berücksichtigt und konnten daher innerhalb des SK-Moleküls ungeändert verbleiben. Ein Beispiel für eine solches abgewiesenes potenzielles Epitop ist durch die Sequenz LLKAIQEQL an den Positionen 79–87 in dem SK-Protein gegeben. Diese Sequenz veranschaulicht ein vorhergesagte Konsensus-Bindungsmotiv für HLA-DR1*0101, wobei die Ankerreste unterstrichen sind. Die Datenbank-Suche mit der Konsensus-Sequenz LxxxAxxxxL identifiziert >4000 Einträge in einem Humanprotein-Subset der SwissProt-Datenbank, einschließlich dem Serumalbumin-Protein (SwissProt-Zugangsnummer P02768). Ein Beispiel für ein Epitop, bei dem keine Übereinstimmung mit einem Humanprotein gefunden wurde, von dem angenommen wird, dass es im allgemeinen Kreislauf vorhanden ist, wird durch die Sequenz YVDVNTN an der Position 299–305 in dem SK-Protein bereitgestellt. Diese Sequenz veranschaulicht ein potenzielles Epitop zur Präsentation durch HLADR4*0401. Die Konsensussequenz identifiziert <50 Humanproteine, die dieses Motiv enthalten, von denen viele intrazelluläre Proteine aus unterschiedlichen Geweben, wie dem Gehirn, sind. Es kann erwogen werden, dass diese im Allgemeinen nicht für das Immunsystem verfügbar sind, damit eine Toleranz erreicht wird, und diese als potenzielles Epitop zur Eliminierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert werden. Entsprechend wurde ein weiteres potenzielles HLA-DR1*0101 Bindungsmotiv in der SK-Peptid-Sequenz KADLLKAI an den Positionen 76–83 des SK-Proteins identifiziert. Dieses Motiv identifiziert <150 humane Proteine in dem gleichen Datensatz und wurde ebenfalls zur Modifikation durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert.
Das Netto-Ergebnis dieser Verfahren war die Identifikation solcher Reste in dem SK-Molekül, die verändert werden sollten, um die potenziellen MHC-Klasse-II-Bindungsmotive zu verändern. Einzelne Aminosäuren in den vorhergesagten Bindungsmotiven wurden zur Veränderung ausgewählt. Mit der Aufgabe der Maximierung der Wahrscheinlichkeit zur Erhaltung der funktionellen Proteinaktivität wurden in allen Fällen konservative Aminosäure-Substitutionen an einer beliebigen gegebenen Stelle gewählt. Eine neue (deimmunisierte) SK-Sequenz wurde erstellt (29) und weiter durch Datenbank-Vergleich wie zuvor analysiert, um eine erfolgreiche Eliminierung potenzieller MHC-Klasse-II-Bindungsmotive zu bestätigen.
Das folgende Verfahren wurde zur Konstruktion von deimmunisierten SK-Molekülen verwendet. Die PCR-Primer SK1 (5'-ggaattcatgattgctggacctgagtggctg) und SK2 (5'-tggatccattatttgtcgttagggtatc) wurden zur Amplifikation des Wild-Typ-SK-Gens aus einem Stamm der Streptococcus-equsimilis-Gruppe C (ATCC-Zugangsnummer 9542) verwendet. Das resultierende 1233bp-Fragment wurde in pUC19 als BamHI-EcoRI-Restriktionsfragment mittels Standard-Techniken kloniert (Sambrook J., Fritsch E.F. & Maniatis T. (Hrsg.) in: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)). Es wurde bestätigt, dass die Gensequenz identisch zu den Datenbankeinträgen ist, wobei kommerziell erhältliche Reagenzsysteme und die vom Händler gelieferten Anweisungen (Amersham, Little Chalfont, UK) verwendet wurden. Stellengerichtete Mutagenese wurde mittels synthetischer Oligonukleotide und dem "Quick-Change"-Verfahren sowie Reagenzien von Stratagene UK Ltd. durchgeführt. Mutierte (deimmunisierte) Versionen des Gens wurden durch Sequenzieren bestätigt. Mutierte SK-Gene wurden als EcoRI-BamHI-Fragmente in den bakteriellen Expressionsvektor pEKG-3 (Estrada M.P. et al., Bio/Technology 10, 1138–1142 (1992)) zur Expression von deimmunisiertem SK subkloniert. Rekombinantes Protein wurde mit einer Plasminogen-Affinitätssäule gemäß dem Verfahren von Rodriguez et al. [Rodriguez P. et al., Biotechniques 7, 638–641 (1992)] gereinigt. Die fibrinolytische Aktivität wurde mit der Kasein/Plaminogen-Plattentechnik und dem In-vitro-Gerinnsel-Lyseassay, wie von Estrada et al. (Estrada et al., ibid) beschrieben, bestimmt.

Claims

Verfahren, um Streptokinase nicht-immunogen oder weniger immunogen zu machen, wenn sie dem Immunsystem einer gegebenen humanen Spezies ausgesetzt wird, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bestimmen mindestens eines Teils der Aminosäuresequenz von Streptokinase; (b) Identifizieren eines ersten Satzes von einem oder mehreren potenziellen T-Zell-Epitopen innerhalb der Aminosäuresequenz von Streptokinase durch (i) Analysieren nach überlappenden Peptidsequenzen innerhalb der Aminosäuresequenz, die entweder an MHC-Klasse-II-Moleküle binden oder die Fähigkeit aufweisen, T-Zellen über die Präsentation an MHC-Klasse-II zu stimulieren, hinsichtlich des Vorliegens von MHC-Klasse-II-Bindungsmotiven und (ii) Vergleichen dieser Sequenzen mit humanen MHC-Klasse-II-Bindungsmotiven, die aus MHC-Datenbanken verfügbar sind, (c) Identifizieren eines zweiten Satzes von einem oder mehreren potenziellen T-Zell-Epitopen, der eine geringere Anzahl an T-Zell-Motiven umfasst, durch Subtrahieren potenzieller T-Zell-Epitope von dem ersten Satz, die auch in Keimliniensequenzen humaner variabler Immunglobulinregionen vorliegen, die aus humanen Keimlinien-Datenbanken erhalten werden, und (d) Eliminieren mindestens eines der gemäß Schritt (c) identifizierten T-Zell-Epitope aus der Aminosäuresequenz von Streptokinase durch Verändern eines oder mehrerer Aminosäurereste innerhalb oder in Nachbarschaft zu der Sequenz an Positionen, die denjenigen innerhalb des (der) identifizierten T-Zell-Epitop(s/e) entsprechen.
Verfahren nach Anspruch 1, das einen weiteren Subtraktionsschritt umfasst, der aus dem zweiten Satz von T-Zell-Motiven diejenigen T-Zell-Epitope, die in humanen Nicht-Immunglobulinprotein-Sequenzen vorliegen, durch Analysieren der Sequenz im Hinblick auf Ähnlichkeit mit diesen Nicht-Immunglobulinprotein-Sequenzen eliminiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Eliminierung der identifizierten potenziellen T-Zell-Epitope durch Veränderung einer oder mehrerer Aminosäuren durch Substitution erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die ursprünglichen Aminosäurereste durch Keimlinienaminosäuren der gegebenen humanen Spezies ersetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, wobei die veränderte Sequenz analysiert wird, um alle T-Zell-Epitope zu identifizieren, die sich durch die Veränderung oder eine vorgeschlagene Veränderung ergeben, und modifiziert wird, um alle dieser T-Zell-Epitope zu eliminieren, wobei die Identifizierung und Veränderung gemäß einem der vorstehenden Patentansprüche durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das deimmunisierte Streptokinasemolekül die Proteinsequenz, wie in 2 dargestellt, besitzt.
Modifizierte Streptokinase, die nicht-immunogen oder weniger immunogen ist, wenn sie dem Immunsystem einer gegebenen humanen Spezies ausgesetzt wird, mit der Proteinsequenz, wie in 2 dargestellt.