KR101953706B1 - 항-gm-csf 항체 및 이것의 사용 - Google Patents

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Abstract

항-GM-CSF 항체 또는 이것의 단편이 제공되며 인간화 항체 및 단편을 포함한다. 또한 치료적, 진단적 및 예후적 목적을 위한 항체 및 단편의 사용이 제공된다. 항체 및 단편의 치료적 사용은, 예를 들어, 염증성 및 자가면역성 질환 및 장애의 치료를 포함한다.

Description

항-GM-CSF 항체 및 이것의 사용
항-GM-CSF 항체 또는 이것의 단편이 제공되며 인간화 항체 및 단편을 포함한다. 또한 치료적, 진단적 및 예후적 목적을 위한 항체 및 단편의 사용이 제공된다. 항체 및 단편의 치료적 사용은, 예를 들어, 염증성 및 자가면역성 질환 및 장애의 치료를 포함한다.
콜로니 자극 인자 2 (CSF2)로도 알려져 있는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF 또는 GM-CSF)는 대식세포, T 세포, 비만 세포, NK 세포, 내피 세포 및 섬유아세포에 의해 분비되는 모노머 당단백질이며, 사이토카인의 기능을 한다. 자연 발생 GM-CSF의 약학적 유사체는 사그래모스팀(sargramostim) 및 몰그래모스팀(molgramostim)로도 불린다. 호중구 증식 및 성숙화를 특이적으로 촉진하는 과립구 콜로니-자극 인자와는 달리, GM-CSF는 더 많은 세포 유형, 특히 대식세포 및 호산구에 영향을 준다.
GM-CSF는 사이토카인의 기능을 하는 모노머 당단백질이다. GM-CSF는 과립구 (호중구, 호산구, 및 호염기구) 및 단핵구를 생산하도록 줄기 세포를 자극한다. 단핵구는 순환에서 빠져 나와 조직으로 이동하며, 그 결과 그것들은 대식세포 및 수지상세포로 성숙한다. 이와 같이, 그것은 면역/염증 캐스케이드(cascade)의 일부이며, 이에 의해 소수의 대식세포의 활성화는, 감염과 싸우는데 중요한 공정인, 세포 수 증가로 빠르게 이어질 수 있다. GM-CSF는 또한 면역계의 성숙한 세포에 대하여 약간의 영향을 미친다. 이것들은, 예를 들어, 호중구 이동의 억제 및 세포 표면에서 발현된 수용체의 변화 유발을 포함한다.
GM-CSF는 신호 변환기 및 전사 활성체, STAT5를 통해 신호를 전달한다. 대식세포에서는, STAT3을 통해 신호를 전달하는 것을 또한 볼 수 있다. 사이토카인은 대식세포를 활성화하여 균류 생존을 억제한다. 그것은 세포 내 자유 아연의 박탈을 유도하고 균류 아연 결핍 및 독성이 절정에 이르는 활성산소종(reactive oxygen species)의 생산을 증가시킨다. 따라서, GM-CSF는 면역계의 발달을 용이하게 하고 감염에 대한 방어를 촉진한다. GM-CSF는 또한 생식계통에 의해 생산되는 엠브리오카인(embryokine)의 기능을 함으로써 배 발생에서 중요한 역할을 한다.
GM-CSF는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조되고 몰그래모스팀 또는, 단백질이 효모 세포에서 발현될 때에는, 사그래모스팀이라는 단백질 치료제로서 판매된다. 그것은 백혈구 세포의 생산을 자극하며 따라서 화학 요법 후 호중구 감소증(neutropenia)을 예방하기 위한 약제로서 사용된다. GM-CSF는 또한 임상 시험에서 HIV-감염된 환자에서 백신 보조제로서의 가능성에 대하여 평가되었다.
그에 반해, GM-CSF의 억제는 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis) (OA), 다발성 경화증(Multiple sclerosis) (MS) 및 판상형 건선(plaque psoriasis)을 포함한 염증성 질환 및 자가면역성 장애와 같은 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. GM-CSF의 억제는 또한 암 치료에 유용할 수 있다.
본 명세서는 인간 GM-CSF 단백질에 대하여 높은 결합 친화도를 갖고 GM-CSF의, 그 수용체로의 결합을 억제하는 강한 활성을 갖는 항-GM-CSF 항체를 제공한다. 이들 항-GM-CSF 항체는 다양한 유형의 염증성 질환, 자가면역성 장애 및 암의 치료와 같은 치료적 목적으로 유용하고, 또한 진단적 및 예후적 목적으로도 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 명세서는 분리된 항체 또는 이것의 단편을 제공하는데, 항체 또는 이것의 단편은 인간 GM-CSF 단백질에 대한 특이성을 갖고 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 사슬 불변 영역이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 아이소타입이다. 일부 구체예에서, 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전한 인간 항체이다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 인간화 항체이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은, 카바트 넘버링(Kabat numbering)에 따라, (a) 위치 1의 Glu, (b) 위치 98의 Arg, (c) 위치 72의 Ser, (d) 위치 68의 Ala, (e) 위치 70의 Leu, (f) 위치 48의 Ile, (g) 위치 26의 Asp, 및 (h) 위치 29의 Leu, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링에 따라 위치 26에서 시작하여 DYTLT (서열 번호: 42) 또는 GYTFT (서열 번호: 43)의 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은, 카바트 넘버링에 따라, (a) 위치 46의 Ala, (b) 위치 60의 Asp, (c) 위치 70의 Asp, (d) 위치 43의 Ser, 및 (f) 위치 87의 Phe, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 8-17로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 8-17로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 11, 14 또는 17의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 19-22로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 19-22로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 19 또는 22의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 이중특이적 항체 또는 단일 사슬 가변 단편이다.
한 구체예에서, 본 명세서는 분리된 항체 또는 이것의 단편이 제공되는데, 항체 또는 이것의 단편은 인간 GM-CSF 단백질에 대한 특이성을 갖고 서열 번호: 23의 VH CDR1, 서열 번호: 24의 VH CDR2, 서열 번호: 25의 VH CDR3, 서열 번호: 26의 VL CDR1, 서열 번호: 27의 VL CDR2, 및 서열 번호: 28의 VL CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 사슬 불변 영역이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 아이소타입이다. 일부 구체예에서, 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전한 인간 항체이다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 인간화 항체이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 카바트 넘버링에 따라, E1, R84, Y27, I28, I48, T68, L70, 또는 T30, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링에 따라 위치 26에서 시작하여 GYIFT (서열 번호: 44), GYIFS (서열 번호: 45), 또는 GGTFS (서열 번호: 46)의 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은, 카바트 넘버링에 따라, V48, D57, Q70 또는 S43, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 29-35로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 29-35로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 34 또는 35의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 36-41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 36-41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 38 또는 39의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 이중특이적 항체 또는 단일 사슬 가변 단편이다.
한 구체예에서, 본 명세서의 항체 또는 이것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 한 구체예에서는, 본 명세서의 항체 또는 이것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 분리된 세포가 제공된다.
한 구체예에서, 본 명세서는 치료가 필요한 환자에서 염증성 또는 자가면역성 질환 또는 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 본 명세서의 항체 또는 이것의 단편, 또는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한 염증성 또는 자가면역성 질환 또는 질병의 치료용 의약의 제조를 위한 항체 또는 이것의 단편, 또는 조성물의 사용이 제공된다.
일부 구체예에서, 염증성 질환 또는 질병은 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 에디슨 병(Addison's disease), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 관절염, 골관절염 (osteoarthritis; OA), 류머티스성 관절염 (RA), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis; PA), 강직성 척추염, 천식, 죽상동맥경화증, 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 크론 병(Crohn's disease), 대장염(colitis), 피부염(dermatitis), 게실염(diverticulitis), 섬유근육통(fibromyalgia), 간염(hepatitis), 과민성 장 증후군 (irritable bowel syndrome; IBS), 전신 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematous; SLE), 신장염(nephritis), 파킨슨 병 (Parkinson's disease; PD), 혈관염(vasculitis), 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한 한 구체예에서는, 치료가 필요한 환자에서 통증을 감소시키거나 완화하는 방법이 제공되며, 본 명세서의 항체 또는 이것의 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 자가면역성 질환 또는 질병은 원형 탈모(alopecia areata), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 간염, 피부근염(dermatomyositis), 당뇨병 (diabetes; 1형), 복강 질환, 자가면역성 소아 특발성 관절염(autoimmune Juvenile idiopathic arthritis), 사구체 신염(glomerulonephritis), 그레이브 병(Graves' disease), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 자가면역성 심근염(autoimmune myocarditis), 다발성 경화증, 천포창(pemphigus)/유사천포창(pemphigoid), 악성 빈혈(pernicious anemia), 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 다발성 근염(polymyositis), 일차성 담즙성 간경화증(primary biliary cirrhosis), 건선, 류머티스성 관절염, 피부경화증(scleroderma)/전신 경화증(systemic sclerosis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 자가면역성 갑상선염(autoimmune thyroiditis), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 자가면역성 포도막염(autoimmune uveitis), 백반증(vitiligo), 및 다발혈관염(polyangiitis)을 동반한 육아종성 림프종(granulomatosis) (베게너 육아종증(Wegener's))으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한 샘플에서 GM-CSF의 발현을 검출하는 방법이 제공되는데, 항체 또는 이것의 단편이 GM-CSF와 결합하는 조건 하에서 샘플과 항체 또는 이것의 단편을 접촉시키는 단계, 및 샘플에서 GM-CSF의 발현을 나타내는 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
도 1은 서브클로닝(subcloning)용 1차 하이브리도마(hybridoma) 클론을 선택하기 위한 확인적 ELISA 결합 검정의 결과를 나타낸다.
도 2는 서브클로닝용 1차 하이브리도마 클론을 선택하기 위한 확인적 ELISA 결합 검정의 결과를 나타낸다.
도 3은 인간 GM-CSF로의 테스트 항체의 용량-의존적 결합을 나타낸다.
도 4는 항체와 재조합 인간 GM-CSF의 결합 동역학을 플롯팅한다.
도 5는 항체에 의한 GM-CSF 수용체 알파(alpha)로의 GM-CSF 결합의 용량-의존적 억제를 나타낸다.
도 6은 항체가 GM-CSF에 의해 유도된 pSTAT5 활성화의 수준을 크게 감소시켰다는 것을 나타낸다.
도 7은 항체에 의한 GM-CSF 의존적 TF-1 증식의 억제를 나타낸다.
도 8은 모든 인간화 항체가 인간 GM-CSF에 대하여 강력한 결합 능력을 입증하였다는 것을 나타낸다.
도 9는 몇몇 인간화 항체가 TF-1 증식의 가장 강력한 억제를 나타냈다는 것을 보여준다.
도 10은 테스트된 항체가 pSTAT5 신호 전달을 효과적으로 차단했다는 것을 나타낸다.
도 11은 붉은 털 원숭이(rhesus) GM-CSF로의 항체의 용량-의존적 결합을 나타낸다.
도 12는 Hu23F4-27의 약물동역학적 파라미터를 플롯팅한다.
정의
용어 "하나의(a)" 또는 "하나의(an)" 실체물은 상기 실체물 중 하나 이상을 지칭한다; 예를 들어, "하나의 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나의(a)" (또는 "하나의(an)"), "하나 이상의", 및 "적어도 하나"는 본원에서 교체 가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 단수형 "폴리펩타이드", 뿐만 아니라 복수형 "폴리펩타이드들"을 포함하도록 의도되고, 아미드 결합 (펩타이드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형으로 결합된 모노머 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하지만, 생성물의 구체적인 길이를 지칭하는 것은 아니다. 따라서, 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하도록 사용되는 어떤 다른 용어도 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 이들 용어 대신에, 또는 이들 용어 중 어느 것과도 교체 가능하게 사용될 수 있다. 따라서, 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하도록 사용되는 어떤 다른 용어도 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 이들 용어 대신에, 또는 이들 용어 중 어느 것과도 교체 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 또한, 제한이 아니라, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해에 의한 절단, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는, 폴리펩타이드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하도록 의도된다. 폴리펩타이드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 생산될 수도 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되어야 하는 것은 아니다. 그것은 화학적 합성을 포함한, 어떤 방식으로도 생성될 수 있다.
용어 "분리된"은 세포, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA에 관하여 본원에서 사용된 바와 같이 거대분자의 천연 공급원에 존재하는 각각 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 지칭한다. 용어 "분리된"은 또한 본원에서 사용된 바와 같이 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때에는 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때에는 화학적 전구물질 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩타이드를 지칭한다. 더욱이, "분리된 핵산"은 단편으로서 자연 발생하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "분리된"은 또한 본원에서 다른 세포 단백질 또는 조직으로부터 분리된 세포 또는 폴리펩타이드를 지칭하는데 사용된다. 분리된 폴리펩타이드는 정제된 폴리펩타이드 및 재조합 폴리펩타이드 둘 다를 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련이 있기 때문에 자연적으로는 존재하지 않는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 형태를 의도하며, 이것의 비-제한적 예는 정상적으로는 발생하지 않는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 함께 조합함으로써 생성될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 개의 펩타이드 또는 두 개의 핵산 분자 간의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 같은 염기 또는 아미노산에 의해 점유되는 경우, 분자는 상기 위치에서 상동성이다. 서열 간 상동성의 정도는 서열에 의해 공유되는 일치하거나 상동성인 위치의 수의 함수이다. "무관하거나" 또는 "비-상동성인" 서열은 본 명세서의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성을 공유하지만, 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 또 다른 서열과 특정 퍼센트 (예를 들어, 60　%, 65　%, 70　%, 75　%, 80　%, 85　%, 90　%, 95　%, 98　% 또는 99　%)의 "서열 동일성"을 가지며, 정렬될 때, 두 서열을 비교하는데 있어서 염기 (또는 아미노산)의 퍼센트가 같다는 것을 의미한다. 이 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology에서 기술된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 기본 매개변수가 정렬에 사용된다. 한 가지 정렬 프로그램은 BLAST이며, 기본 매개변수를 사용한다. 특히, 프로그램은 BLASTN 및 BLASTP이며, 다음의 기본 매개변수를 사용한다: 유전 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프(cut off) = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기술구(Descriptions) = 50개의 서열; 분류 기준 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비-다중, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 생물학적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 명시된 퍼센트 상동성을 갖고 같거나 유사한 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 것들이다.
용어 "동등한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드"는 핵산 또는 이것의 보체의 뉴클레오타이드 서열과 특정 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 지칭한다. 이중 가닥 핵산의 상동체는 핵산 또는 이것의 보체와 어느 정도의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 포함하도록 의도된다. 한 양태에서, 핵산의 상동체는 핵산 또는 이것의 보체와 혼성체화될 수 있다. 유사하게, "동등한 폴리펩타이드"는 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 특정 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 양태에서, 서열 동일성은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. 일부 양태에서, 동등한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 하나, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 추가, 결실, 치환 및 이것들의 조합을 갖는다. 일부 양태에서, 동등한 서열은 참조 서열의 활성 (예를 들어, 에피토프-결합) 또는 구조 (예를 들어, 염 다리)를 보유한다.
혼성체화 반응은 상이한 "엄중도"의 조건 하에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 낮은 엄중도 혼성체화 반응은 약 40℃에서 약 10 x SSC 또는 동등한 이온 강도/온도의 용액에서 수행된다. 중간 엄중도 혼성체화는 전형적으로 약 50℃에서 약 6 x SSC에서 수행되고, 높은 엄중도 혼성체화 반응은 일반적으로 약 60℃에서 약 1 x SSC에서 수행된다. 혼성체화 반응은 또한 당업자에게 널리 공지된 "생리학적 조건" 하에서 수행될 수 있다. 생리학적 조건의 비-제한적 예는 세포에서 일반적으로 발견되는 온도, 이온 강도, pH 및 Mg2+ 농도이다.
폴리뉴클레오타이드는 네 개의 뉴클레오타이드 염기의 특정 서열로 구성된다: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 티민 (T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때에는 티민 대신에 우라실 (U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드 분자의 알파벳 표현이다. 이 알파벳 표현은 중앙 처리 장치를 가진 컴퓨터의 데이터베이스에 입력되어 기능 유전체학 및 상동성 검색과 같은 생물정보학 용도로 사용될 수 있다. 용어 "다형현상(polymorphism)"은 하나 이상의 형태의 유전자 또는 그 일부의 공존을 지칭한다. 적어도 두 개의 다른 형태, 즉, 두 개의 다른 뉴클레오타이드 서열이 존재하는 유전자의 일부는 "유전자의 다형성 영역"이라고 불린다. 다형성 영역은 단일 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이것의 동일성은 다른 대립유전자에서 차이가 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 교체 가능하게 사용되고 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이것의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지되어 있든 아니든, 어떠한 기능을 수행할 수도 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, dsRNA, siRNA, miRNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형(branched) 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체와 같이 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 폴리뉴클레오타이드의 조립 전에 또는 후에 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 폴리머화 이후, 예를 들어, 라벨링 구성요소와의 컨쥬게이션에 의해 더 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자 둘 다를 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본 명세서의 임의의 구체예는 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 또는 예측되는 두 개의 상보적 단일 가닥 형태 각각을 둘 다 포함한다.
용어 "암호화하다"는 폴리뉴클레오타이드에 적용될 때, 고유한 상태에서 또는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩타이드 및/또는 이것의 단편에 대한 mRNA를 생산하기 위해 전사되고 및/또는 번역될 수 있는 경우, 폴리펩타이드를 "암호화한다"고 언급되는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 안티센스(antisense) 가닥은 이러한 핵산의 보체이고, 암호화 서열은 그것으로부터 추정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "항원-결합 폴리펩타이드"는 항원을 특이적으로 인식하여 이것에 결합하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 지칭한다. 항체는 전체 항체 및 이것의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬일 수 있다. 따라서 용어 "항체"는 항원에 결합하는 생물학적 활성을 가진 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이러한 것들의 예는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이것의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역, 또는 이것의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은, 본원에서 사용된 바와 같이, F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 일부이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 같은 항원과 결합한다. 용어 "항체 단편"은 압타머(aptamer), 거울상 압타머(spiegelmer), 및 디아바디를 포함한다. 용어 "항체 단편"은 또한 특이적 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체와 유사한 작용을 하는 임의의 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다.
"단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질을 지칭한다. 일부 양태에서, 영역은 10개 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩타이드로 연결되어 있다. 링커는 유연성을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라 가용성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있고, VH의 N-말단과 VL의 C-말단, 또는 그 반대를 연결할 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래의 면역글로불린의 특이성을 보유한다. ScFv 분자는 업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 5,892,019에서 기술되어 있다.
용어 항체는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 분류의 폴리펩타이드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마(gamma), 뮤(mu), 알파(alpha), 델타(delta), 또는 엡실론(epsilon) (γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며 그것들 중에는 몇몇 하위분류 (예를 들어, γ1-γ4)를 갖는다는 것을 인정할 것이다. 그것은 항체의 "분류"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 결정하는 이 사슬의 특징이다. 면역글로불린 하위분류 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, 등은 널리 특성화되어 기능적 특수성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이 분류 및 아이소타입 각각의 변형된 버젼은 본 명세서의 관점에서 당업자에게 쉽게 구별 가능하며, 따라서, 본 명세서의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 분류는 분명하게 본 명세서의 범위 내에 있고, 하기 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 분류에 관한 것이다. IgG에 관하여, 표준 면역글로불린 분자는 분자량 대략 23,000 달톤의 두 개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 분자량 53,000-70,000의 두 개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 네 개의 사슬은 전형적으로 "Y" 입체배치에서 이황화 결합에 의해 결합되며 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 포함한다.
본 명세서의 항체, 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체, 또는 유도체는 다클론성, 단클론성, 다중특이적, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일 사슬 Fv (scFv), 단일 사슬 항체, 이황화 결합된 Fv (sdFv), VK 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항-이디오타입(anti-idiotypic) (항-Id) 항체 (예를 들어, 본원에서 개시된 LIGHT 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 어떠한 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 분류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위분류일 수 있다.
경쇄는 카파 또는 람다 (K, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 분류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수도 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 두 개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 공유 이황화 결합에 의해 또는 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때에는 비-공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 입체배치의 포크형(forked) 단부의 N-말단에서부터 각 사슬의 바닥의 C-말단까지 계속된다.
경쇄 및 중쇄 둘 다는 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나누어진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이 점에 있어서, 경쇄 (VK) 및 중쇄 (VH) 부분 둘 다의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것을 알 수 있을 것이다. 반대로, 경쇄 (CK) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 분비, 경태반 유동성(transplacental mobility), Fc 수용체 결합, 보체 결합, 등과 같은 중요한 생물학적 성질을 부여한다. 관례적으로 불변 영역 도메인이 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 멀어짐에 따라 불변 영역 도메인의 넘버링이 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분은 불변 영역이다; CH3 및 CK 도메인은 실제로 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 각각 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하여 그것에 특이적으로 결합하게 한다. 즉, 항체의 VK 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)의 서브세트는 3차원 항원-결합 부위를 한정하는 가변 영역을 형성하도록 조합된다. 이 4차 항체 구조는 Y의 각 분지의 단부에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 더 구체적으로는, 항원-결합 부위는 각각의 VH 및 VK 사슬 상의 세 개의 CDR (즉 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에 의해 한정된다. 어떤 경우에는, 예를 들어, 카멜리드(camelid) 종으로부터 유래되거나 카멜리드 면역글로불린을 기반으로 조작된 특정 면역글로불린 분자에서, 완전한 면역글로불린 분자는 단지 중쇄로만 구성될 수 있으며, 경쇄는 없다. 예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 참조.
자연 발생 항체에서, 각각의 항원-결합 도메인에 존재하는 여섯 개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 3차원 입체배치를 취하는 경우에 항원-결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치하는, 짧고, 비-인접한 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역이라고 불리는, 항원-결합 도메인의 나머지 아미노산은 더 적은 분자간 가변성을 나타낸다. 프레임워크 영역은 대부분 β-시트 입체구조를 취하고 CDR은 β-시트 구조를 연결하고, 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프(loop)를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬 간 비-공유 결합에 의한 상호작용에 의해 올바른 배향으로 CDR을 위치시키는 스캐폴드(scaffold)를 형성하는 작용을 한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 대하여 상보적인 표면을 한정한다. 이 상보적 표면은 항체의, 그것의 동족 에피토프로의 비-공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산은 정확하게 한정되어 있기 때문에, 당업자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대하여 쉽게 확인될 수 있다 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987) 참조).
업계 내에서 용어의 둘 이상의 정의가 사용되고 및/또는 수용되는 경우에는, 용어의 정의는 본원에서 사용된 바와 같이 명확하게 반대로 진술되지 않는 한 모든 이러한 의미를 포함하도록 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견된 비-인접한 항원 조합 부위를 기술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 사용이다. 이 특정 영역은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 및 Chothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)에 의해 기술되었으며, 이것들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. Kabat 및 Chothia에 따른 CDR 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 정의의 적용은 본원에서 한정되고 사용된 용어의 범위 내에 있도록 의도된다. 각각의 상기 인용된 참고문헌에 의해 한정된 바와 같이 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교를 위해 하기 표에서 제시된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기의 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 잔기가 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어진 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
Figure 112018033553798-pct00001
Kabat et al.은 또한 어떤 항체에도 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 한정하였다. 당업자는 서열 그 자체를 넘어서 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고도 "카바트 넘버링"의 이 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명확하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "카바트 넘버링"은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)에 의해 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다.
상기 표에 더하여, 카바트 넘버링 시스템은 다음과 같이 CDR 영역을 기술한다: CDR-H1은 대략 아미노산 31 (즉, 최초 시스테인 잔기 이후 대략 9개의 잔기)에서 시작하여, 대략 5-7개의 아미노산을 포함하고, 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-H2는 CDR-H1의 단부 이후 15번째 잔기에서 시작하여, 대략 16-19개의 아미노산을 포함하고, 다음 아르기닌 또는 리신 잔기에서 끝난다. CDR-H3은 CDR-H2의 단부 이후 대략 33번째 아미노산 잔기에서 시작하여; 3-25개의 아미노산을 포함하고; 서열 W-G-X-G에서 끝나며, X는 임의의 아미노산이다. CDR-L1은 대략 잔기 24에서 (즉, 시스테인 잔기 이후) 시작하여; 대략 10-17개의 잔기를 포함하고; 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-L2는 CDR-L1의 단부 이후 대략 16번째 잔기에서 시작하고 대략 7개의 잔기를 포함한다. CDR-L3은 CDR-L2의 단부 이후 (즉, 시스테인 잔기 다음) 대략 33번째 잔기에서 시작하여; 대략 7-11개의 잔기를 포함하고 서열 F 또는 W-G-X-G에서 끝나며, X는 임의의 아미노산이다.
본원에서 개시된 항체는 조류 및 포유동물을 포함한 임의의 동물 기원일 수도 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 쥐, 당나귀, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 라마, 말, 또는 닭 항체이다. 또 다른 구체예에서, 가변 영역은 기원이 콘드릭토이드(condricthoid) (예를 들어, 상어로부터)일 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 불변 영역"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 CH1 도메인, 힌지 (예를 들어, 상부, 중간, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이것의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 항원-결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 항체는 CH2 도메인의 적어도 일부 (예를 들어, 모든 CH2 도메인 또는 이것의 일부)가 결여될 수도 있다. 상기 제시된 바와 같이, 중쇄 불변 영역이 자연 발생 면역글로불린 분자와 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
본원에서 개시된 항체의 중쇄 불변 영역은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 IgGl 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수도 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 불변 영역은 부분적으로는 IgGl 분자로부터 유래되고, 부분적으로는 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로는 IgGl 분자로부터 유래되고 및 부분적으로는 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "경쇄 불변 영역"은 항체 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 불변 영역은 불변 카파 도메인 또는 불변 람다 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
"경쇄-중쇄 쌍"은 경쇄의 CL 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인 사이의 이황화 결합을 통해 다이머를 형성할 수 있는 경쇄 및 중쇄의 컬렉션을 지칭한다.
앞서 언급된 바와 같이, 다양한 면역글로불린 분류의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 널리 공지되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 제1 (가장 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대하여 아미노 말단에 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "CH2 도메인"은 통상적인 넘버링 계획을 사용하여, 예를 들어, 항체의 대략 잔기 244에서 잔기 360까지 연장된 중쇄 분자의 일부를 포함한다 (잔기 244 내지 360, 카바트 넘버링 시스템; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 참조). CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 형성하지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 두 개의 N-결합된 분지형 탄수화물 사슬이 온전한 고유의 IgG 분자의 두 개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 또한 CH3 도메인이 IgG 분자의 CH2 도메인에서 C-말단까지 연장되고 대략 108개의 잔기를 포함한다는 것이 잘 기록되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 결합시키는 중쇄 분자의 일부를 포함한다. 이 힌지 영역은 대략 25개의 잔기를 포함하고 유연하며, 따라서 두 개의 N-말단 항원-결합 영역을 독립적으로 이동시킨다. 힌지 영역은 세 개의 별개의 도메인, 상부, 중간, 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "이황화 결합"은 두 개의 황 원자 사이에서 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 기와 함께 이황화 결합 또는 이황화물 다리를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CK 영역은 이황화 결합에 의해 결합되고 두 개의 중쇄는 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242 (위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에 상응하는 위치에서 두 개의 이황화 결합에 의해 결합된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 얻어지거나 유래되고 불변 영역 (온전하거나, 부분적이거나 또는 본 명세서에 따라 변형될 수도 있다)이 제2 종으로부터 얻어지는 임의의 항체를 의미할 것이다. 특정 구체예에서 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원 (예를 들어, 마우스 또는 영장류)의 것이고 불변 영역은 인간의 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "퍼센트 인간화"는 인간화 도메인 및 생식세포 계열 도메인 간의 프레임워크 아미노산 차이 (즉, 비-CDR 차이)의 수를 결정하고, 총 아미노산 수에서 상기 수를 뺀 다음, 그것을 총 아미노산 수로 나누고 100을 곱하여 계산된다.
"특이적으로 결합하다" 또는 "~에 대한 특이성을 갖는다"는 일반적으로 항체가 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 결합은 항원-결합 도메인과 에피토프 사이에서 약간의 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체가 항원-결합 도메인을 통해 무작위의 무관한 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 에피토프에 결합할 때 항체는 상기 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적 친화도를 정량화하는데 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"보다 주어진 에피토프에 대하여 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수도 있거나, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대하여 갖는 것보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방적(prophylactic) 또는 예방적(preventative) 조치 둘 다를 지칭하며, 그 목적은 원치않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 자가면역성 질환의 진행을 예방하거나 둔화시키는 (줄이는) 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과는, 검출 가능하든 검출 불가능하든, 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 병의 차도 (일부든 전체적이든)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우 예상된 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 것들은 이미 질병 또는 장애에 걸린 것들, 뿐만 아니라 질병 또는 장애에 걸리기 쉬운 것들 또는 질병 또는 장애가 예방되어야 하는 것들을 포함한다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 요법이 필요한 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 농경용 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소, 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료를 필요로 하는 환자" 또는 "치료를 필요로 하는 대상체"와 같은 구절은, 예를 들어, 검출, 진단 절차 및/또는 치료에 사용된 본 명세서의 항체 또는 조성물의 투여로부터 이익을 얻는 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다.
항-GM-CSF 항체
본 명세서는 인간 GM-CSF 단백질에 대하여 높은 친화도를 갖는 항-GM-CSF 항체를 제공한다. 테스트된 항체는 강력한 결합 및 억제 활성을 나타내고 치료적 및 진단적 사용에 유용하다. 원래의 쥐 항체에 더하여, 인간화된 것은 붉은 털 원숭이 GM-CSF 및 인간 GM-CSF에 대하여 강한 결합 친화도를 나타냈으며, 이 결합은 GM-CSF 수용체 알파로의 GM-CSF의 결합을 차단하였고 차단된 GM-CSF는 pSTAT5 신호 전달을 유도하여, GM-CSF 의존적 TF-1 증식을 억제하였다.
본 명세서의 한 구체예에 따르면, 하기 나타난 바와 같이, 서열 번호: 1-6 또는 서열 번호: 23-28에서 한정된 CDR 영역을 가진 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체가 제공된다.
Figure 112018033553798-pct00002
실험예에서 입증된 바와 같이, 이들 CDR 영역을 함유하는 항체는 , 마우스, 인간화 또는 키메라에 관계없이, 강력한 GM-CSF 결합 및 억제 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 항-GM-CSF 항체는 표 1a-b에서 나열된 바와 같이 VH 및 VL CDR을 포함하며, 하나, 두 개 또는 세 개의 추가의 변형을 갖는다. 이러한 변형은 아미노산의 추가, 결실 또는 치환일 수 있다.
일부 구체예에서, 변형은 각각의 CDR의 하나 이하의 잔기에서의 치환이다. 일부 구체예에서, 변형은 하나, 두 개 또는 세 개의 잔기에서의 치환이다. 한 구체예에서, 변형은 잔기 중 하나에서의 치환이다. 일부 구체예에서, 이러한 치환은 보존적 치환이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 업계에서 한정되어 있으며, 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비대전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩타이드에서 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 같은 측쇄 패밀리의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 일련의 아미노산이 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 다른, 구조적으로 유사한 열로 대체될 수 있다.
보존적 아미노산 치환의 비-제한적 예는 하기 표에서 제공되며, 0 또는 그 이상의 유사성 점수는 두 개의 아미노산 사이의 보존적 치환을 나타낸다.
Figure 112018033553798-pct00003
Figure 112018033553798-pct00004
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 상기 치환 중 하나 이하, 두 개 이하, 또는 세 개 이하를 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 인간 GM-CSF 단백질에 대한 특이성을 갖고 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다. VH의 비-제한적 예는 서열 번호: 7-17에서 제공되며, 이것들 중에서 서열 번호: 7은 마우스 VH이고, 서열 번호: 8-17은 인간화된 것이다. 또한, 이들 인간화 VH는 마우스 버젼에 대한 하나 이상의 역돌연변이(back-mutation)를 포함한다. 유사하게, VL (VK)의 비-제한적 예는 서열 번호: 18-22에서 제공된다. 서열 번호: 18은 마우스 서열이고, 서열 번호: 19-22는 인간화 서열이며, 이것들 중에서 서열 번호: 20-22는 예에서 나타난 바와 같이 하나 이상의 역돌연변이를 포함한다.
역돌연변이는 항-GM-CSF 항체의 특정 특성을 보유하는데 유용한 것으로 보인다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 명세서의 항-GM-CSF 항체, 특히 인간 또는 인간화 항체는 역돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, VH 역돌연변이 (즉, 명시된 위치에서 아미노산을 포함함)는, 카바트 넘버링에 따라, (a) 위치 1의 Glu (E1), (b) 위치 98의 Arg (R98), (c) 위치 72의 Ser (S72), (d) 위치 68의 Ala (A68), (e) 위치 70의 Leu (L70), (f) 위치 48의 Ile (I48), (g) 위치 26의 Asp (D26), 및 (h) 위치 29의 Leu (L29), 및 이것들의 조합으로부터 선택된 하나 또는 그 이상이다.
일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 E1을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 E1 및 R98을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 E1 및 상기 나열된 또 다른 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 군 (E1, R98 및 S72), (E1, R98, S72 및 A68), (E1, R98, S72, A68, L70 및 I48), (E1, R98, S72, A68, L70, I48, D26 및 L29), (E1 및 S72), (E1, S72 및 L70), (E1, S72, L70, I48 및 A68), (E1, S72, L70, I48, A68, D26 및 L29)을 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 CDR1의 N-말단 단부에서, 즉, 카바트 넘버링에 따라 위치 26에서 시작하여, DYTLT (서열 번호: 42) 또는 GYTFT (서열 번호: 43)의 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 DYTLT (서열 번호: 42)를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 GYTFT (서열 번호: 43)를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간화 항체는 역돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, VL 역돌연변이는, 카바트 넘버링에 따라, (a) 위치 46의 Ala (A46), (b) 위치 60의 Asp (D60), (c) 위치 70의 Asp (D70), (d) 위치 43의 Ser (S43), 및 (f) 위치 87의 Phe (F87), 및 이것들의 조합으로부터 선택된 하나 또는 그 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간화 항체는 VL 역돌연변이 A46, D60, D70, S43, 또는 F87 중 적어도 두 개, 세 개 또는 네 개를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VL 역돌연변이 A46을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VL 역돌연변이 A46 및 D60 및 상기 나열된 또 다른 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VL 역돌연변이 군 (A46, D60 및 D70) 또는 (A46, D60, D70, S43 및 F87)을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 (E1, R98, S72, A68, L70 및 I48)를 포함하지만 VL 역돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 (E1, S72, L70, I48, A68, D26 및 L29)를 포함하지만 VL 역돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 (E1 및 S72) 및 VL 역돌연변이 (A46, D60, D70, S43 및 F87)를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 명세서의 항-GM-CSF 항체는 서열 번호: 8-17의 VH, 및 서열 번호: 19-22의 VL, 또는 그것들 각각의 생물학적 동등물을 포함한다. VH 또는 VL의 생물학적 동등물은 지정된 아미노산을 포함하는 한편 전체적으로 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열이다. 그러므로, 서열 번호: 10의 생물학적 동등물은 서열 번호: 10에 대하여 전체적으로 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖지만 CDR (서열 번호: 1-3 또는 그것들의 변이체)를 보유하고, 선택적으로 역돌연변이 중 하나 이상, 또는 모두를 보유하는 VH일 수 있다.
한 구체예에서, VH는 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는다. 한 구체예에서, VH는 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는다. 한 구체예에서, VH는 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 갖는다. 나열된 서열들 각각은 또한 그것들의 생물학적 동등물로 치환될 수 있다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 인간 GM-CSF 단백질에 대한 특이성을 갖고 서열 번호: 23의 VH CDR1, 서열 번호: 24의 VH CDR2, 서열 번호: 25의 VH CDR3, 서열 번호: 26의 VL CDR1, 서열 번호: 27의 VL CDR2, 및 서열 번호: 28의 VL CDR3을 포함한다. VH의 비-제한적 예는 서열 번호: 29-35에서 제공되며, 이것들 중에서 서열 번호: 29는 마우스 VH이고, 서열 번호: 30-35는 인간화된 것이다. 또한, 이들 인간화 VH는 마우스 버젼에 대한 하나 이상의 역돌연변이를 포함한다. 유사하게, VL (VK)의 비-제한적 예는 서열 번호: 36-41에서 제공된다. 서열 번호: 36은 마우스 서열이고, 서열 번호: 37-41은 인간화 서열이며, 이것들 중에서 서열 번호: 38-41은 예에서 나타난 바와 같이 하나 이상의 역돌연변이를 포함한다.
역돌연변이는 항-GM-CSF 항체의 특정 특성을 보유하는데 유용한 것으로 보인다. 따라서, 일부 구체예에서는, 본 명세서의 항-GM-CSF 항체, 특히 인간 또는 인간화 항체는 역돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, VH 역돌연변이 (즉, 명시된 위치에서 아미노산을 포함함)는, 카바트 넘버링에 따라, E1, R84, Y27, I28, I48, T68, L70, 또는 T30, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 하나 또는 그 이상이다.
일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 E1을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 E1 및 R84를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 E1 및 상기 나열된 또 다른 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 군 (E1), (E1 및 R84), (E1, R84, Y27 및 I28), (E1, R84, Y27, I28 및 I48), (E1, R84, Y27, I28, I48, T68 및 L70), 또는 (E1, R84, Y27, I28, I48, T68, L70 및 T30)을 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 CDR1의 N-말단 단부에서, 즉, 카바트 넘버링에 따라 위치 26에서 시작하여, GYIFT (서열 번호: 44), GYIFS (서열 번호: 45), 또는 GGTFS (서열 번호: 46)의 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 GYIFT (서열 번호: 44)를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 GYIFS (서열 번호: 45)를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 GGTFS (서열 번호: 46)를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간화 항체는 역돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, VL 역돌연변이는, 카바트 넘버링에 따라, V48, D57, Q70 또는 S43, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 하나 또는 그 이상이다.
일부 구체예에서, 인간화 항체는 VL 역돌연변이 V48, D57, Q70 또는 S43 중 적어도 두 개, 세 개 또는 네 개를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VL 역돌연변이 V48을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VL 역돌연변이 V48 및 D57 및 상기 나열된 또 다른 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VL 역돌연변이 군 (V48), (V48 및 D57), (V48, D57 및 Q70) 또는 (V48, D57, Q70 및 S43)을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 (E1, R84, Y27, I28, I48, T68 및 L70) 및 VL 역돌연변이 V48을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 VH 역돌연변이 (E1, R84, Y27, I28, I48, T68, L70 및 T30) 및 VL 역돌연변이 (V48 및 D57)를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 명세서의 항-GM-CSF 항체는 서열 번호: 30-35의 VH, 및 서열 번호: 37-41의 VL, 또는 그것들의 각각의 생물학적 동등물을 포함한다. VH 또는 VL의 생물학적 동등물은 지정된 아미노산을 포함하는 한편 전체적으로 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열이다. 그러므로, 서열 번호: 35의 생물학적 동등물은 서열 번호: 35에 대하여 전체적으로 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖지만 CDR (서열 번호: 23-25 또는 그것들의 변이체)을 보유하고, 선택적으로 역돌연변이 중 하나 이상, 또는 모두를 보유하는 VH일 수 있다.
한 구체예에서, VH는 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 갖는다. 한 구체예에서, VH는 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 갖는다. 나열된 서열들 각각은 그것들의 생물학적 동등물로 치환될 수 있다.
또한 본원에서 개시된 항체는 그것들이 유래된 자연 발생 결합 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수도 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 지정된 단백질로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 유사하며, 예를 들어, 시작 서열에 대하여 특정 퍼센트 동일성을 가질 수도 있는데, 예를 들어, 그것은 시작 서열에 대하여 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일할 수도 있다.
본 명세서의 항체 및 단편은, 일부 구체예에서는, 단일특이적 또는 이중특이적 항체 또는 단편일 수 있다. 이중특이적 항체에 대하여, 다른 특이성은 GM-CSF의 다른 표적 에피토프 또는 특정 사용, 예를 들어, 치료적 사용에 유용한 다른 표적 단백질에 대한 것일 수 있다. 한 양태에서, 표적 단백질은 사이토카인, 예컨대 TNF-알파, IL-6, IL-1, 및 IL-17이다. 또 다른 양태에서, 표적 단백질은 케모킨, 예컨대 CCL2, CXCL12, 및 CXCL13이다. 또 다른 양태에서, 표적 단백질은 세포 표면 단백질, 예컨대 CD3, CSF-1R, CD20, 및 CD73이다.
특정 구체예에서, 항체는 항체와 정상적으로 회합되지 않은 아미노산 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시적 변형이 하기 더 상세히 기술된다. 예를 들어, 본 명세서의 항체는 플렉시블(flexible) 링커 서열을 포함할 수도 있거나, 또는 기능적 모이어티 (예를 들어, PEG, 약물, 독소, 또는 라벨)를 추가하도록 변형될 수도 있다.
본 명세서의 항체, 이것의 변이체, 또는 유도체는 공유 결합에 의한 부착이 항체가 에피토프에 결합하는 것을 막지 않도록, 즉, 항체로의 어떤 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 제한되는 것이 아니라, 항체는, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해에 의한 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질로의 결합, 등에 의해 변형될 수 있다. 많은 화학적 변형 중 어떤 것도 공지된 기술에 의해 수행될 수 있으며, 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성, 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적으로, 항체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수도 있다.
일부 구체예에서, 항체는 다른 수단에 의해 또 다른 분자에 컨쥬게이션되거나 연결되어 이기능적 분자를 형성할 수 있다. 제2 분자는 치료제, 프로드러그, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 개질제, 의약품, 또는 PEG 중 하나일 수도 있다. 일부 비-제한적 예는 사이토카인 또는 다른 가용성 인자, 예컨대 IL-10, IL-25, IL-27, IL-33, IL-35, 및 IL-36이다. 또한, 일부 구체예에서는, 본 명세서의 항체 또는 단편 및 소분자 약물을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트가 제공된다.
항체는 치료제에 컨쥬게이션되거나 융합될 수도 있으며, 이것은 검출 가능한 라벨, 예컨대 방사성 라벨, 면역조절자, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 광활성 치료제 또는 진단제, 약물 또는 독소일 수도 있는 세포독성제, 초음파 증강제, 비-방사성 라벨, 이것들의 조합 및 업계에 공지된 다른 이러한 작용제를 포함할 수도 있다.
항체는 그것을 화학 발광 화합물에 커플링시킴으로써 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 화학 발광-태그된 항원-결합 폴리펩타이드의 존재는 화학 반응의 과정 동안에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학 발광 라벨링 화합물의 예는 루미놀, 아이소루미놀, 써마틱(theromatic) 아크리디늄 에스터, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스터이다.
항체는 또한 형광 발광 금속, 예컨대 152Eu, 또는 란탄 계열 중 다른 것들을 사용하여 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 이들 금속은 다이에틸렌트라이아민펜트아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA)과 같은 금속 킬레이트 기를 사용하여 항체에 부착될 수 있다. 다양한 모이어티를 항체에 컨쥬게이션하기 위한 기술은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. (52:119-58 (1982))를 참조하면 된다.
항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항체 제조 방법
본 명세서는 또한 본 명세서의 항체, 이것의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자를 제공한다. 본 명세서의 폴리뉴클레오타이드는 같은 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체 또는 유도체의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화할 수도 있다. 추가적으로, 본 명세서의 폴리뉴클레오타이드는 같은 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체 또는 유도체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 일부를 암호화할 수도 있다.
항체를 제조하는 방법은 업계에 널리 공지되어 있고 본원에서 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드의 가변 및 불변 영역은 둘 다 완전한 인간이다. 완전한 인간 항체는 업계에 기술되어 있는 기술을 사용하여 및 본원에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 특이적 항원에 대한 완전한 인간 항체는 항원 시험에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만, 내인성 유전자좌가 무력화된 트랜스제닉(transgenic) 동물에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적 기술은 미국 특허 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140에서 기술되어 있으며 이것들은 그 전문이 참조로 포함된다.
특정 구체예에서, 제조된 항체는 치료하고자 하는 동물, 예를 들어, 인간에서 해로운 면역 반응을 유도하지 않을 것이다. 한 구체예에서, 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체, 또는 유도체는 업계에서 인식되어 있는 기술을 사용하여 그것들의 면역원성을 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 항체는 인간화, 영장류화, 탈면역화될 수 있거나, 또는 키메라 항체가 제조될 수 있다. 이들 유형의 항체는 모체 항체의 항원-결합 성질을 보유하거나 또는 실질적으로 보유하지만, 인간에서 덜 면역원성인 비-인간 항체, 전형적으로 쥐 또는 영장류 항체로부터 유래된다. 이것은 (a) 전체 비-인간 가변 도메인을 인간 불변 영역으로 이식하여 키메라 항체를 생성하는 단계; (b) 중요한 프레임워크 잔기의 체류에 관계없이 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR) 중 하나 이상의 적어도 일부를 인간 프레임워크 및 불변 영역으로 이식하는 단계; 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 섹션으로 그것들을 "클로킹(cloaking)"하는 단계를 포함하는, 다양한 방법에 의해 달성될 수도 있다. 이러한 방법은 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), 및 미국 특허 번호 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, 및 6,190,370에서 개시되며, 이것들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
항체의 면역원성을 감소시키기 위해 탈면역화가 또한 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "탈면역화"는 T-세포 에피토프를 변형시키기 위한 항체의 변화를 포함한다 (예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO/9852976 A1 및 WO/0034317 A2 참조). 예를 들어, 시작 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 분석되고 상보성 결정 영역 (CDR) 및 서열 내 다른 주요 잔기에 관하여 에피토프의 자리를 나타내는, 각각의 V 영역으로부터 인간 T-세포 에피토프 "맵"이 생성된다. 최종 항체의 활성을 변화시킬 위험이 적은 대안의 아미노산 치환을 확인하기 위해 T-세포 에피토프 맵의 개개의 T-세포 에피토프가 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함하는 다양한 대안의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 설계되고 그 이후 이들 서열은 다양한 결합 폴리펩타이드로 통합된다. 전형적으로, 12 내지 24개의 변이체 항체가 생성되어 결합 및/또는 기능에 대하여 테스트된다. 그 다음에 변형된 가변 및 인간 불변 영역을 포함한 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현 벡터로 클로닝되고 이후의 플라스미드는 전체 항체 생산을 위해 세포주로 도입된다. 그 다음에 항체가 적절한 생화학적 및 생물학적 검정에서 비교되고, 최적의 변이체가 확인된다.
본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드의 결합 특이성은 면역침강법, 방사면역검정 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)과 같은 시험관 내(in vitro) 검정에 의해 결정될 수 있다.
대안으로, 단일 사슬 유닛의 생산에 대하여 기술된 (미국 특허 번호 4,694,778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Hustonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879- 5883 (1988); 및 Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)) 기술은 본 명세서의 단일 사슬 유닛을 생산하도록 조정될 수 있다. 아미노산 다리를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 결합시켜, 단일 사슬 융합 펩타이드를 형성함으로써 단일 사슬 유닛이 형성된다. 대장균(E. coli)에서 기능적 Fv 단편의 조립을 위한 기술이 또한 사용될 수 있다 (Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).
단일 사슬 Fv (scFv) 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,258,498; Hustonet al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Sci. USA 90:1995-1999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)에서 기술된 것을 포함한다. 인간에서 항체의 생체 내(in vivo) 사용 및 시험관 내 검출 검정을 포함한 몇몇 사용을 위해, 키메라, 인간화 , 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 키메라 항체는 항체의 다른 부분이 다른 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 쥐 단클론성 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 가진 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816397을 참조하고, 이것들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인간화 항체는 비-인간 종의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자의 프레임워크 영역을 가진 원하는 항원에 결합하는 비-인간 종 항체로부터 유래된 항체 분자이다. 종종, 인간 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항원-결합을 변화시키기 위해, 바람직하게는 개선하기 위해 CDR 공여체 항체의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 업계에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 항원-결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 비정상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (예를 들어, Queen et al., 미국 특허 번호 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) 참조, 이것들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 항체는, 예를 들어, CDR-이식 (EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 버니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., Proc. Natl. Sci. USA 91:969-973 (1994)), 및 사슬 셔플링(shuffling) (미국 특허 번호 5,565,332, 이것은 그 전문이 참조로 포함됨)을 포함한, 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
완전한 인간 항체가 인간 환자의 치료적 처치에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함한, 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 만들어질 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참고하고; 이것들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인간 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포로 도입될 수도 있다. 대안으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포로 도입될 수도 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과는 별도로 또는 이와 동시에 비-기능적으로 될 수도 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포가 확장되고 배반포에 미량주사되어 키메라 마우스를 생산한다. 그 다음에 키메라 마우스는 인간 항체를 발현하는 동형접합성 자손을 생산하기 위해 교배된다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어, 원하는 표적 폴리펩타이드 모두 또는 그 일부로의 정상적인 방식으로 면역화된다. 상기 항원에 대한 단클론성 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 얻을 수 있다. 트랜스제닉 마우스가 보유하고 있는 인간 면역글로불린 이식유전자는 B-세포 분화 동안에 재배열되고, 그 이후 클래스 전환(class switching) 및 체세포 돌연변이된다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 이 기술의 개요에 대해서는, Lonberg and Huszar Int. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995)를 참조하면 된다. 인간 항체 및 인간 단클론성 항체를 생산하기 위한 이 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜에 대한 더 상세한 논의를 위해서는, 예를 들어, PCT 공보 WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 번호 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 및 5,939,598을 참조하고, 이것들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이에 더하여, Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) 및 GenPharm (San Jose, Calif.)과 같은 회사가 상기 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하기 위해 종사할 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 또한 "유도 선택(guided selection)"로 불리는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이 접근법에서 선택된 비-인간 단클론성 항체, 예를 들어, 마우스 항체는 같은 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도하는데 사용된다 (Jespers et al., Bio/Technology 72:899-903 (1988). 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 참조, 이것은 그 전문이 참조로 포함됨).
또 다른 구체예에서, 원하는 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 쉽게 분리되고 시퀀싱될 수 있다. 분리되어 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원의 역할을 한다. 분리되면, DNA는 발현 벡터에 배치된 다음, 면역글로불린을 달리 생산하지 않는 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예컨대 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종(myeloma) 세포로 트랜스펙션될 수도 있다. 더 구체적으로는, 분리된 DNA (본원에서 기술된 바와 같이 합성일 수도 있음)는 본원에 참조로 포함된, 1995년 1월 25일 출원된 Newman et al., 미국 특허 번호 5,658,570에서 기술된 바와 같이 제조 항체를 위해 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝하는데 사용될 수도 있다. 근본적으로, 이것은 선택된 세포로부터 RNA의 추출, cDNA로의 전환, 및 Ig 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 이 목적에 적합한 프라이머는 또한 미국 특허 번호 5,658,570에서 기술되어 있다. 하기 더 상세히 논의되는 바와 같이, 원하는 항체를 발현하는 형질전환된 세포는 면역글로불린의 임상적 및 상업적 공급을 제공하기 위해 비교적 대량으로 성장할 수도 있다.
추가적으로, 일상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여, 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드의 CDR 중 하나 이상은 프레임워크 영역 내에, 예를 들어, 인간 프레임워크 영역으로 삽입되어 비-인간 항체를 인간화할 수도 있다. 프레임워크 영역은 자연 발생 또는 공통 프레임워크 영역, 및 바람직하게는 인간 프레임워크 영역일 수도 있다 (예를 들어, 인간 프레임워크 영역의 목록에 대해서는 Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998) 참조). 바람직하게는, 프레임워크 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오타이드는 원하는 폴리펩타이드의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, LIGHT를 암호화한다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환은 프레임워크 영역 내에서 이루어질 수도 있으며, 바람직하게는, 아미노산 치환은 항체의, 그 항원으로의 결합을 개선한다. 추가적으로,
이러한 방법은 하나 이상의 사슬 간 이황화 결합이 결여된 항체 분자를 생성하기 위해 사슬 간 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 만드는데 사용될 수도 있다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 다른 변화는 본 명세서에 및 해당 분야의 기술 범위 내에 포함된다.
이에 더하여, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자의 유전자를 스플라이싱(splicing)함으로써 "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))이 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 키메라 항체는 다른 부분이 다른 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 쥐 단클론성 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 가진 것이다.
하지만 재조합 항체를 생산하기에 고도로 효율적인 또 다른 수단이 Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992)에서 개시된다. 구체적으로, 이 기술은 원숭이 가변 도메인 및 인간 불변 서열을 함유하는 영장류화 항체를 생성한다. 이 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 더욱이, 이 기술은 또한 일반적으로 할당된 미국 특허 번호 5,658,570, 5,693,780 및 5,756,096에서 기술되며, 이것들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
대안으로, 항체 생산 세포주는 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 선택되고 배양될 수도 있다. 이러한 기술은 다양한 실험 매뉴얼 및 주요 간행물에 기술되어 있다. 이 점에 있어서, 하기 기술된 바와 같이 본 명세서에서 사용에 적합한 기술은 Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)에서 기술되며 이것은 증보판을 포함하여, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
추가적으로, 당업자에게 공지된 표준 기술은 본 명세서의 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이를 도입하는데 사용될 수 있으며, 아미노산 치환을 초래하는 부위-특이적 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 변이체 (유도체 포함)는 참조 가변 중쇄 영역, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 가변 경쇄 영역, CDR-L1, CDR-L2, 또는 CDR-L3에 관하여 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 암호화한다. 대안으로, 돌연변이는, 예를 들어, 포화 돌연변이 유발에 의해 암호화 서열 모두 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 결과로 생성된 돌연변이는 생물학적 활성에 대하여 스크리닝되어 활성을 보유한 돌연변이를 확인할 수 있다.
치료 방법 및 사용
본원에서 기술된 바와 같이, 본 명세서의 항체, 변이체 또는 유도체는 특정 치료 및 진단 방법에 사용될 수도 있다.
본 명세서는 본원에서 기술된 장애 또는 질병 중 하나 이상을 치료하기 위해 환자, 예컨대 동물, 포유동물, 및 인간에게 본 명세서의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 항체-기반 요법에 더 관련되어 있다. 본 명세서의 치료적 화합물은 본 명세서의 항체 (본원에서 기술된 바와 같이 이것의 변이체 및 유도체를 포함함) 및 본 명세서의 항체 (본원에서 기술된 바와 같이 이것의 변이체 및 유도체를 포함함)를 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 항체 및 단편은, 일부 구체예에서, 염증성 또는 자가면역성 질환 또는 장애, 또는 암을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 또한 본 명세서의 항체 및 단편은 통증의 근본적인 메커니즘 또는 통증 그 자체를 치료하는데 유용한 것으로 생각된다.
과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)는 원래 골수 전구물질로부터 과립구 및 대식세포 둘 다의 콜로니를 생성하는 능력으로 공지되어 있었다. 그것은 또한 예비 생존, 활성화, 및 분화 요인으로서 성숙한 골수 세포에 작용하는 것으로 나타났다. 최근 연구는 GM-CSF가 또한 많은 전염증성 기능을 가족 자가면역성 및 염증성 질환의 발달에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다.
GM-CSF는 대식세포, 호중구, 및 호산구의 생존 및 활성화, 뿐만 아니라 수지상세포 (DC) 성숙화를 촉진한다. GM-CSF는 대식세포를 M1-유사 염증성 대식세포로 양그고하시킬 수 있으며, 이것은 다양한 염증성 사이토카인, 예컨대 TNF, IL-6, IL-12p70, IL-23, 또는 IL-1β를 생산하고, 따라서 Th1-Th17 반응을 촉진한다. 다른 한편으로는, GM-CSF 및 Th2 면역력의 연관성이 또한 알레르기성 기도 염증에서 보고된다.
GM-CSF 수용체는 낮은 친화도로 GM-CSF에 결합하는 α-서브유닛 (GMRα) 및 IL-3 및 IL-5 수용체와 공유하는 신호 변환 βc-서브유닛으로 구성된다. GM-CSF 및 GMRα의 2원 복합체는 유리 βc-서브유닛과 상호작용하여 고-친화도 헥사머 복합체를 형성한다. 두 개의 헥사머 복합체의 측방 응집에 의해 형성된 도데카머 복합체는 βc-서브유닛과 회합된 Jak2가 다이머화 및 트랜스인산화할 수 있게 하지만, 헥사머 복합체는 그렇지 않다. 이 구조는 GM-CSF 수용체 활성화의 용량-의존적 반응으로 이어진다. 저농도의 GM-CSF는, 정상 조건에서와 같이, βc Ser585 인산화를 유발하고 단지 세포 생존으로만 이어지는 14-3-3/PI-3 키나제 경로를 활성화한다. 고농도의 GM-CSF는, 염증 조건에서와 같이, βc Ser585 인산화 및 매개된 βc Tyr577 인산화 및 Jak2/STAT5 경로, Ras/미토겐-활성화된 단백질 키나제 경로, 및 PI-3 키나제 경로의 활성화를 중지시켜, 세포 생존, 증식, 및 활성화를 촉진시킨다.
다양한 세포는 GM-CSF를 생산할 수 있다. GM-CSF의 주요 공급원은 T 및 B 세포, 단핵구/대식세포 내피 세포, 및 섬유아세포이다. 호중구, 호산구, 상피 세포, 중피 세포, 파네스(Paneth) 세포, 연골 세포, 및 종양 세포가 또한 GM-CSF를 생산할 수 있다. GM-CSF의 생산은 TNF, IL-1, toll-유사 수용체 아고니스트, 및 프로스타글란딘 E2를 포함한 다양한 요인에 의해 자극된다. 최근에는, 자가면역성 및 염증성 질환에서 GM-CSF-생산 CD4 T 세포의 병원성이 명확해지고 점점 더 주목받고 있다.
최근의 증거는 많은 자가면역성 질환의 발달에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 나타냈다. GM-CSF 고갈 또는 중성화는 실험적 자가면역성 뇌수막염 (EAE), 관절염, 관절염-관련 간질성 폐 질환, 신장염, 또는 건선을 포함한, 많은 자가면역성 질환 모델을 억제한다. 또한 GM-CSF의 억제가 암 치료에 유용할 수 있다는 것이 제안된다.
일부 구체예에서, 개시된 항체, 단편 및 조성물로 치료하고자 하는 염증성 질환 또는 질병은 알츠하이머 병, 에디슨 병, 죽상동맥경화증, 강직성 척추염, 관절염, 골관절염 (OA), 류머티스성 관절염 (RA), 건선성 관절염 (PA), 강직성 척추염, 천식, 죽상동맥경화증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 크론 병, 대장염, 피부염, 게실염, 섬유근육통, 간염, 과민성 장 증후군 (IBS), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 신장염, 파킨슨 병 (PD), 혈관염, 및 궤양성 대장염 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, 개시된 항체, 단편 및 조성물로 치료하고자 하는 자가면역성 질환 또는 질병은 원형 탈모, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 피부근염, 당뇨병 (1형), 복강 질환, 자가면역성 소아 특발성 관절염, 사구체 신염, 그레이브 병, 길랭-바레 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 중증 근무력증, 자가면역성 심근염, 다발성 경화증, 천포창/유사천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발성 근염, 일차성 담즙성 간경화증, 건선, 류머티스성 관절염, 피부경화증/전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반 루푸스, 자가면역성 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자가면역성 포도막염, 백반증, 및 다발혈관염을 동반한 육아종성 림프종 (베게너 육아종증) 중 하나 이상을 포함한다.
류머티스성 관절염 (RA)는 주로 관절에 영향을 미치는 장기간의 자가면역성 장애이다. 그것은 전형적으로 따뜻하고, 붓고, 고통스러운 관절을 유발한다. 통증 및 뻣뻣함은 종종 휴식 후 악화된다. 가장 일반적으로, 손목 및 손이 포함되며, 전형적으로 신체 양 측면의 같은 관절이 포함된다. 질환은 또한 신체의 다른 부분에도 영향을 미칠 수 있다. 류머티스성 관절염의 원인이 분명하지는 않지만, 유전적 및 환경적 요인의 조합을 포함할 것으로 생각된다. 근본적인 메터니즘은 관절을 공격하는 신체의 면역계를 포함한다. 이것은 관절낭의 염증 및 농후화를 초래한다. 치료의 목적은 통증을 줄이고, 염증을 감소시키고, 개인의 전체적인 기능을 개선하는 것이다. 진통제, 스테로이드, 및 NSAID가 증상을 돕기 위해 빈번하게 사용된다. 질병 개질 류머티스성 관절염 치료제 (DMARD)라고 불리는 약제, 예컨대 하이드록시클로로퀸 및 메토트렉세이트의 군이 질환의 진행을 늦추려고 시도하는데 사용될 수도 있다.
골관절염 (OA)는 관절 연골 및 기본적인 뼈의 쇠약으로부터 발생하는 관절 질환의 한 유형이다. 가장 일반적인 증상은 관절 통증 및 뻣뻣함이다. 처음에는, 운동 후에만 증상이 발생할 수 있지만, 시간이 흐르면 끊임없이 반복될 수도 있다. 다른 증상은 관절 붓기, 운동 범위 감소, 및 등이 영향을 받을 때 팔과 다리의 쇠약 또는 마비를 포함할 수도 있다. 원인은 이전의 관절 손상, 비정상적이니 관절 또는 사지 발달, 및 유전적 요인을 포함한다. 위험은 과체중이고, 한쪽 다리의 길이가 다르고, 높은 수준의 관절 스트레스를 초래하는 직업을 가진 사람들에서 더 크다. 골관절염은 관절의 기계적 스트레스 및 하급 염증 과정에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 치료는 운동, 관절 스트레스를 감소시키려는 노력, 후원 단체, 및 진통제를 포함한다.
다발성 경화증 (MS)은 뇌 및 척수의 신경 세포의 절연 커버가 손상된 탈수초 질환이다. 이 손상은 신경계의 일부가 의사소통하는 능력에 지장을 주며, 육체적, 정신적, 및 가끔은 정신의학적 문제를 포함한, 광범위한 징후 및 증상을 초래한다. 구체적인 증상은 복시, 한쪽 눈의 실명, 근육 쇠약, 감각의 문제, 또는 협응력 문제를 포함할 수 있다. 원인이 분명하지는 않지만, 근본적인 메커니즘은 면역계에 의한 파괴 또는 미엘린 생산 세포의 장애인 것으로 생각된다. 다발성 경화증에 대해서는 공지된 치유법이 없다. 치료는 발병 후 기능을 개선하고 새로운 발병을 예방하려는 시도를 한다.
천식은 폐의 기도의 일반적인 장기간의 염증성 질환이다. 그것은 가변적이고 재발하는 증상, 가역적 기류 폐색, 및 기관지 경련(bronchospasm)을 특징으로 한다. 증상은 천명(wheezing), 기침, 흉부교액감(chest tightness), 및 호흡곤란의 에피소드를 포함한다. 천식은 유전적 및 환경적 요인의 조합에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 환경적 요인은 대기 오염 및 알레르기 유발 항원에 대한 노출을 포함한다. 천식은 증상의 빈도, 1초당 강제 호기량 (FEV1), 및 최고 호기 유속에 따라 분류된다. 또한 아토피성 또는 비-아토피성으로 분류될 수 있는데, 아토피성은 1형 과민 반응을 일으키는 성향을 지칭한다. 천식에 대해서는 치유법이 없다. 증상은 알레르기 유발 항원 및 자극물과 같은 촉발자를 방지함으로써, 및 흡입된 코르티코스테로이드의 사용에 의해 예방될 수 있다. 천식 증상이 제어되지 않은 채로 유지되는 경우 흡입된 코르티코스테로이드에 더하여 지속 작용 베타 아고니스트 (LABA) 또는 항류코트리엔제가 사용될 수도 있다. 급속하게 악화되는 증상의 치료는 보통 흡입된 단기 작용 베타-2 아고니스트, 예컨대 입으로 섭취된 살부타몰 및 코르티코스테로이드로 이루어진다. 매우 심각한 경우에는, 정맥 내 코르티코스테로이드, 마그네슘 설페이트, 및 입원이 필요할 수도 있다.
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 장기간 열악한 기류를 특징으로 하는 폐색성 폐 질환의 유형이다. COPD는 두 가지 주요 질병, 기종(emphysema) 및 만성 기관지염(chronic bronchitis)을 포함할 수 있다. 기종에서, 많은 기낭들 사이의 벽이 손상되어 있다. 결과로서, 기낭은 형태를 상실하고 늘어지게 된다. 이 손상은 또한 기낭의 벽을 파괴하며, 많은 작은 것들 대신에 개수가 더 적고 크기가 더 큰 기낭으로 이어진다. 이 경우에, 폐에서 가스 교환의 양이 감소된다. 만성 기관지염에서, 기도의 라이닝(lining)은 일정하게 자극되고 염증이 생긴 상태를 유지하고, 이것은 라이닝을 부풀어 오르게 한다. 많은 점액이 기도에 형성되어, 호흡하기 어렵게 만든다. COPD에 대하여 공지된 치유법은 없지만, 증상이 치료 가능하고 그 진행은 지연될 수 있다.
통증은 극심한 또는 손상을 주는 자극에 의해, 예컨대 발가락을 찧거나, 손가락에 화상을 입거나, 상처에 알콜이 닿거나, 또는 "척골단(funny bone)"을 부딪침으로써 종종 유발되는 고통스러운 느낌이다. 통증은 복합적인 주관적 현상이며, 통증을 한정하는 것은 어려운 일이다. 통증은 또한 실제의 또는 잠재적인 조직 손상에 관련된 불쾌한 감각 및 정서적 경험으로도 불린다. 통증은 가끔 근본적인 질병, 예컨대 염증의 증상으로 간주된다.
일부 구체예에서, 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 본 명세서의 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 수반한다.
암의 비-제한적 예는 방광암, 유방암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 췌장암, 전립선암, 및 갑상선암을 포함한다.
본 명세서의 항체 또는 이것의 변이체, 또는 유도체로 치료, 예방, 진단 및/또는 예후될 수도 있는, 증가된 세포 생존률과 관련된 추가적인 질환 또는 질병은 악성 종양 및 관련 장애, 예컨대 백혈병 (급성 백혈병 (예를 들어, 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myelocytic leukemia) (골수아구성(myeloblastic), 전골수구성(promyelocytic), 골수성 단핵구성(myelomonocytic), 단핵구성(monocytic), 및 적백혈병(erythroleukemia)) 포함) 및 만성 백혈병 (예를 들어, 만성 골수성 백혈병(chronic myelocytic leukemia) (과립구성 백혈병(granulocytic leukemia)) 및 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)) 포함), 진성 다혈구증(polycythemia vera), 림프종 (예를 들어, 호지킨 질환(Hodgkin's disease) 및 비-호지킨 질환(non-Hodgkin's disease)), 다발성 골수종(multiple myeloma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질환, 및 제한되는 것은 아니지만, 육종 및 암종, 예컨대 섬유 육종(fibrosarcoma), 점액 육종(myxosarcoma), 지방 육종(liposarcoma), 연골 육종(chondrosarcoma), 골 육종(osteogenic sarcoma), 척색종(chordoma), 혈관 육종(angiosarcoma), 내피 육종(endotheliosarcoma), 림프관 육종(lymphangiosarcoma), 림프관 내피 육종(lymphangioendotheliosarcoma), 윤활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근 육종(leiomyosarcoma), 횡문근 육종(rhabdomyo sarcoma), 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 한선 암종(sweat gland carcinoma), 피지선 암종(sebaceous gland carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma), 유두상 선암종(papillary adenocarcinoma), 낭선암종(cystadenocarcinoma), 수질 암종(medullary carcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 신장세포 암종(renal cell carcinoma), 간종양(hepatoma), 담관 암종(bile ductcarcinoma), 융모 암종(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 배아 암종(embryonal carcinoma), 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁암, 고환 종양, 폐암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수아세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관아세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodendroglioma), 뇌수막종(menangioma), 흑색종, 신경아세포종(neuroblastoma) 및 망막아세포종(retinoblastoma)을 포함하는 고형 종양의 진행, 및/또는 전이를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
임의의 특정 환자에 대한 구체적인 투약량 및 치료 양생법은 사용된 특정 항체, 이것의 변이체 또는 유도체, 환자의 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 및 식단, 및 투여 시기, 배설률, 약물 조합, 및 치료되는 특정 질환의 심각도를 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 의료 종사자에 의한 이러한 요인의 판단은 해당 기술 분야의 범위 내에 있다. 양은 또한 치료하고자 하는 개개의 환자, 투여 경로, 제형의 유형, 사용된 화합물의 특성, 질환의 심각도, 및 원하는 효과에 따라 다를 것이다. 사용된 양은 업계에 널리 공지된 약리학적 및 약물동역학적 원칙에 의해 결정될 수 있다.
항체, 변이체의 투여 방법은 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내, 경막 외, 및 경구 경로를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 임의의 편리한 경로로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막 피부 라이닝(lining) (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수도 있고 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수도 있다. 따라서, 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드를 함유하는 약학적 조성물은 경구로, 직장으로, 비경구로, 지주막 수조 내로(intracistemally), 질 내로, 복강 내로, 국부적으로 (분말, 연고, 안약 또는 경피성 패치에 의해), 볼로, 또는 경구 또는 비강 스프레이로서 투여될 수도 있다.
용어 "비경구"는 본원에서 사용된 바와 같이 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 흉골 내, 피하 및 관절 내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 지칭한다.
투여는 전신 또는 국소적일 수 있다. 이에 더하여, 본 명세서의 항체를, 심실 내 및 척추강 내 주사를 포함한, 임의의 적합한 경로에 의해 중추신경계로 도입하는 것이 바람직할 수도 있다; 심실 내 주사는, 예를 들어, 레저버(reservoir), 예컨대 Ommaya 레저버에 부착된 심실 내 카테터(catheter)에 의해 촉진될 수도 있다. 폐 투여는 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제가 들어있는 제형의 사용에 의해 이용될 수 있다.
본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수도 있다; 이것은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 수술 중 국소적 주입에 의해, 예로서, 수술 후 상처 드레싱(dressing)을 동반한, 국부적 도포에 의해, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 이식에 의해 달성될 수도 있으며, 상기 이식은 다공성, 비-다공성, 또는 막, 예컨대 실라스틱(sialastic) 막, 또는 섬유를 포함한, 젤라틴 재료로 이루어진다. 바람직하게는, 본 명세서의 항체를 포함한 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수되지 않는 재료를 사용하도록 주의를 기울여야 한다.
또 다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 소포, 특히 리포솜에서 전달될 수 있다 (Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327 참조; 일반적으로 같은 내용 참조).
또 다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 제어된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 한 구체예에서는, 펌프가 사용될 수도 있다 (Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574 참조). 또 다른 구체예에서는, 폴리머 재료가 사용될 수 있다 (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 참조; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조). 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 시스템은 치료 표적, 즉, 뇌 근처에 배치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만을 필요로 한다 (예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 다른 제어된 방출 시스템은 Langer에 의한 리뷰에서 논의된다 (1990, Science 249:1527-1533).
본 명세서의 조성물이 단백질을 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 특정 구체예에서, 핵산은 그것을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하여 그것이 세포 내에 있도록 투여함으로써, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해 (미국 특허 번호 4,980,286 참조), 또는 직접적인 주사에 의해, 또는 극미립자 폭발(microparticle bombardment) (예를 들어, 유전자 총(gene gun); Biolistic, Dupont)의 사용에 의해, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 트랜스펙션제로 코팅함으로써, 또는 핵으로 들어가는 것으로 알려져 있는 호메오박스(homeobox)-유사 펩타이드에 결합된 핵산을 투여함으로써 (예를 들어, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 참조), 등에 의해 투여되어 생체 내에서 암호화된 단백질의 발현을 촉진할 수 있다. 대안으로, 핵산은 세포 내로 도입되어 상동 재조합에 의해 발현용 숙주 세포 DNA 내에 포함될 수 있다.
염증성, 면역성 또는 악성 질환, 장애 또는 질병의 치료, 억제 및 예방에 효과적인 본 명세서의 항체의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 이에 더하여, 시험관 내 검정은 최적의 투약량의 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 선택적으로 이용될 수도 있다. 제형에 이용하고자 하는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환, 장애 또는 질병의 심각도에 따라 달라질 것이고, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라서 결정되어야 한다. 유효량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수도 있다.
일반적인 명제로서, 환자에게 투여되는, 본 명세서의 항원-결합 폴리펩타이드의 투약량은 전형적으로 환자 체중의 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 환자 체중의 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 또는 환자 체중의 1 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩타이드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종의 항체보다 인간의 신체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 인간 항체의 더 낮은 투약량 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다. 또한, 본 명세서의 항체의 투약량 및 투여 빈도는, 예를 들어, 지질화와 같은 변형에 의해 항체의 흡수 및 조직 침투 (예를 들어, 뇌로)를 향상시킴으로써 감소될 수도 있다.
본 명세서의 항체, 이것의 변이체, 또는 유도체의 투여를 포함한, 감염성 또는 악성 질환, 질병 또는 장애의 치료 방법은 전형적으로, 인간에 사용하기 전에, 원하는 치료적 또는 예방적 활성에 대하여, 시험관 내 테스트된 다음, 허용 가능한 동물 모델에서 생체 내 테스트된다. 트랜스제닉 동물을 포함한 적합한 동물 모델은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에서 기술된 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유용성을 입증하기 위한 시험관 내 검정은 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩타이드의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩타이드의 효과는 당업자에게 공지된 기술, 예컨대 본원의 다른 곳에서 개시된 검정을 활용하여 결정될 수 있다. 본 명세서에 따르면, 특정 항원-결합 폴리펩타이드의 투여가 지시되는지를 결정하는데 사용될 수 있는 시험관 내 검정은 환자 조직 샘플이 배양물에서 성장하고, 화합물에 노출되거나 그렇지 않으면 화합물이 투여되는 시험관 내 세포 배양 검정을 포함하고, 조직 샘플에 대한 이러한 화합물의 효과가 관찰된다.
다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜, 극미립자, 미소캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포에서의 캡슐화, 수용체-매개 세포 내 섭취(endocytosis) (예를 들어, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구성, 등이 공지되어 있으며 본 명세서의 항체 또는 본 명세서의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는데 사용될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 명세서의 조성물은 항신생물제, 항바이러스제, 항세균제 또는 항생제 또는 항진균제와 조합하여 투여된다. 업계에 공지된 이들 작용제 중 어느 것도 본 명세서의 조성물에서 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 명세서의 조성물은 화학치료제와 조합하여 투여된다. 본 명세서의 조성물과 함께 투여될 수도 있는 화학치료제는 항생제 유도체 (예를 들어, 독소루비신, 블레오마이신, 다우노루비신, 및 닥티노마이신); 항에스트로겐제 (예를 들어, 타목시펜); 대사 길항 물질 (예를 들어, 플루오로우라실, 5-FU, 메토트렉세이트, 플록수리딘, 인터페론 알파-2b, 글루탐산, 플리카마이신, 메르캅토퓨린, 및 6-티오구아닌); 세포독성제 (예를 들어, 카르무스틴, BCNU, 로무스틴, CCNU, 시토신 아라비노시드, 사이클로포스파미드, 에스트라무스틴, 하이드록시유레아, 프로카르바진, 미토마이신, 부설판, 시스(cis)-플라틴, 및 빈크리스틴 설페이트); 호르몬 (예를 들어, 메드록시프로게스테론, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨, 에티닐 에스트라디올, 에스트라디올, 메게스트롤 아세테이트, 메틸테스토스테론, 다이에틸스틸베스트롤 다이포스페이트, 클로로트라이아니센, 및 테스토락톤); 질소 머스타드 유도체 (예를 들어, 메팔렌, 코람부실, 메클로르에타민 (질소 머스타드) 및 티오테파); 스테로이드 및 조합 (예를 들어, 베타메타손 나트륨 포스페이트); 및 기타 (예를 들어, 다이카르바진, 아스파라기나제, 미토탄, 빈크리스틴 설페이트, 빈블라스틴 설페이트, 및 에토포시드)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
조합 조성물 및 요법
본 명세서의 항-GM-CSF 항체는, 일부 구체예에서, 또 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 제2 치료제는 항-염증제이다. 비-제한적 예는 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 셀레콕시브 (Celebrex), 피록시캄 (Feldene), 인도메타신 (Indocin), 멜록시캄 (Mobic Vivlodex), 케토프로펜 (Orudis, Ketoprofen ER, Oruvail, Actron), 설린닥 (Clinoril), 디플루니살 (Dolobid), 나부메톤 (Relafen), 옥사프로진 (Daypro), 톨메틴 (Tolmetin Sodium, Tolectin), 살살레이트 (Disalcid), 에토돌락 (Lodine), 페노프로펜 (Nalfon), 플루르비프로펜 (Ansaid), 케토롤락 (Toradol), 메클로페나메이트, 및 메페남산 (Ponstel)을 포함한다.
일부 구체예에서, 제2 치료제는 자가면역성 질환을 치료하는데 적합하다. 비-제한적 예는 글루코코르티코이드, 항-CD3 항체, 예컨대 무로모납-CD3, IL-2a 억제자, 예컨대 바실릭시맙 (Simulect) 및 다클리쥬맙 (Zenapax), 칼시뉴린 억제자, 예컨대 타크롤리무스 및 사이클로스포린, 시롤리무스, 에베롤리무스, 인터페론, 오피오이드, TNF-결합 단백질 또는 항체, 및 마이코페놀레이트를 포함한다.
일부 구체예에서, 제2 치료제는 암 화학치료제이다. 화학치료제는 그것들의 작용 메커니즘에 의해, 예를 들어, 다음 군으로 분류될 수 있다:
- 대사 길항 물질/항암제, 예컨대 피리미딘 유사체 플록수리딘, 카페시타빈, 및 시타라빈;
- 퓨린 유사체, 폴레이트 안타고니스트, 및 관련 억제자;
- 천연물, 예컨대 빈카(vinca) 알칼로이드 (빈블라스틴, 빈크리스틴) 및 미소관, 예컨대 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론, 비노렐빈 (NAVELBINE®), 및 에피포도필로톡신 (에토포시드, 테니포시드)를 포함하는 항증식제/체세포 분열 방지제;
- DNA 손상제, 예컨대 액티노마이신, 암사크린, 부설판, 카르보플라틴, 클로람부실, 씨스플라틴, 사이클로포스파미드 (CYTOXAN®), 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 아이포스파미드, 멜팔란, 메르클로르에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소유레아, 프로카르바진, 탁솔, 탁소텔, 테니포시드, 에토포시드, 및 트라이에틸렌티오포스포르아미드;
- 항생제, 예컨대 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신), 및 미토마이신;
- 효소, 예컨대 L-아스파라긴을 체계적으로 대사시키고 자체 아스파라긴을 합성할 수 없는 세포를 박탈하는 L-아스파라기나제;
- 항혈소판제;
- 항증식성/체세포 분열 방지성 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드 사이클로포스파미드 및 유사체 (멜팔란, 클로람부실, 헥사메틸멜라민, 및 티오테파), 알킬 니트로소유레아 (카르무스틴) 및 유사체, 스트렙토조신, 및 트라이아젠 (다카르바진);
- 항증식성/체세포 분열 방지성 대사 길항 물질, 예컨대 엽산 유사체 (메토트렉세이트);
- 백금 배위 결합 착물 (씨스플라틴, 옥실로플라티님, 및 카르보플라틴), 프로카르바진, 하이드록시유레아, 미토탄, 및 아미노글루테티미드;
- 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 바이칼루타미드, 및 닐루타미드), 및 아로마타제 억제자 (레트로졸 및 아나스트로졸);
- 응고 방지제, 예컨대 헤파린, 합성 헤파린 염, 및 트롬빈의 다른 억제자;
- 섬유소 용해제, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성화제, 스트렙토키나제, 유로키나제, 아스피린, 다이피리다몰, 티클로피딘, 및 클로피도그렐;
- 이동 방지제;
- 항분비제 (브레벨딘);
- 면역억제자 타크롤리무스, 시롤리무스, 아자티오프린, 및 마이코페놀레이트;
- 화합물 (TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 억제자 (혈관 내피 성장 인자 억제자 및 섬유아세포 성장 인자 억제자);
- 안지오텐신 수용체 차단물질, 질소 산화물 공여체;
- 안티센스 올리고뉴클레오타이드;
- 항체, 예컨대 트라스투쥬맙 및 리툭시맙;
- 세포 주기 억제자 및 분화 유도물질, 예컨대 트레티노인;
- 억제자, 토포이소머라제 억제자 (독소루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신, 이리노테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 및 이리노테칸), 및 코르티코스테로이드 (코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 및 프레드니솔론);
- 성장 인자 신호 전달 키나제 억제자;
- 기능 장애 유도물질;
- 독소, 예컨대 콜레라(Cholera) 독소, 리신, 슈도모나스(Pseudomonas) 내독소, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 아데닐레이트 사이클라제 독소, 디프테리아(diphtheria) 독소, 및 카스파제 활성화제;
- 및 크로마틴.
조성물
본 명세서는 또한 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 항체의 유효량, 및 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 제2 치료제를 더 포함한다.
특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 동물, 및 더 구체적으로는 인간에서의 사용에 대하여 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열되었음을 의미한다. 또한, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 일반적으로 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제형 보조제일 것이다.
용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클(vehicle)을 지칭한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일일 수 있으며, 석유계, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등을 포함한다. 물은 약학적 조성물이 정맥 내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이, 특히 주사용액에 대하여, 액체 담체로서 이용될 수도 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔(silica gel), 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크(talc), 나트륨 클로라이드, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 또한, 필요한 경우, 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 함유할 수 있다. 항세균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트; 킬레이트 시약, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 및 장성 조정제, 예컨대 나트륨 클로라이드 또는 덱스트로스가 또한 구상된다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지효성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 좌제로서 전통적인 바인더(binder) 및 담체, 예컨대 트리글리세리드로 제형화될 수 있다. 경구용 제형은 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트, 등을 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin에 기술되어 있으며, 본원에 참조로 포함된다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태로, 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 맞춰야 한다. 모 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 다회수 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
한 구체예에서, 조성물은 인간에게로의 정맥 내 투여에 적합한 약학적 조성물로서 일상적인 과정에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥 내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 버퍼 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서의 통증을 완화하기 위한 국소 마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분은 활성제의 양을 표시하는 밀봉된 용기, 예컨대 앰플 또는 사세(sachette) 내 단위 투약 형태로, 예를 들어, 동결건조된 분말 또는 무수 농축액으로서 별도로 공급되거나 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 그것은 멸균 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유한 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분이 혼합될 수 있도록 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 명세서의 화합물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 음이온으로 형성된 것들, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등으로부터 유래된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2 철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.
실시예
실시예 1. 쥐 항체의 생성
이 실시예는 하이브리도마 기술을 사용하여 항-인간-GM-CSF 마우스 단클론성 항체를 제조하는 방법을 기술한다. 재조합 인간 GM-CSF 단백질을 항원으로 사용하였다. 인간 GM-CSF에 대한 마우스 단클론성 항체를 생성하기 위해서, BALB/c, C57/BL6 또는 SJL 마우스를 포함한 다른 계통의 6-8주령 마우스를 먼저 20 μg 재조합 인간 GM-CSF로 면역화하였다. 최초 면역화 후 제14 일, 제28 일 및 제42 일에, 면역화된 마우스를 5 μg 재조합 단백질로 재면역화하였다. GM-CSF 단백질에 결합하는 항체를 생산하는 마우스를 생산하기 위해서, 면역화된 마우스의 혈청을 ELISA에 의해 테스트하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 1 μg/ml, 100 μl/웰의 인간 GM-CSF 단백질로 실온 (RT)에서 밤새도록 코팅한 다음, 100 μl/웰의 5% BSA로 블로킹하였다. 면역화된 마우스의 혈장의 희석액을 각 웰에 추가하고 RT에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 ABTS 기질로 현상하였고 분광광도계로 OD 405nm에서 분석하였다. 충분한 역가의 항-GM-CSF IgG를 가진 마우스를 면역화 후 제60 일에 25 μg 재조합 인간 GM-CSF 단백질로 부스팅하였다(boost). 결과로 생긴 마우스를 융합에 사용하였다.
하이브리도마 상층액을 항-GM-CSF IgG에 대하여 ELISA 스크리닝(screening)에 의해 테스트하였다. 서브클로닝을 위해 한계 희석 방법을 사용하여 주요 ELISA 양성 하이브리도마 클론을 선택하였고 확인적 ELISA 결합 검정 (도 1) 및 TF-1 증식 검정 (도 2)에 의해 추가로 테스트하였다. GM-CSF 자극 전에, TF-1 세포를 RPMI1640 기본 배지로 세척하였고 밤새도록 영양분을 공급하지 않았다. 제2 일에, 이들 영양분을 공급받지 못한 세포를 수거한 다음 평평한 바닥 96 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 50 μl 중 3X105개 세포/ml의 농도로 분주하였다.
0.2 ng/ml (4X) 농도의 인간 재조합 GM-CSF (Genscript)를 20% 하이브리도마 배양 상층액 (4X)과 1:1 혼합하였고 혼합물 50 μl을 TF-1 세포에 추가하여, GM-CSF에 대한 최종 농도는 0.05 ng/ml였고 하이브리도마 상층액에 대한 최종 농도는 5%였다. 하이브리도마 상층액을 추가하지 않고 0.05 ng/ml의 GM-CSF의 최종 농도로 TF-1 세포를 인큐베이션하여 최대 세포 증식 (0% 억제)을 측정하였다. 검정에서 GM-CSF를 제외하고 RPMI1640 완전 배지에서만 세포를 유지하면서 TF-1 증식의 100% 억제를 측정하였다. 그 다음에 TF-1 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존률을 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay로 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
종합적으로는 세 개의 하이브리도마 단일클론 23F4, 32C4 및 50C5가 TF-1 증식의 상당한 억제를 나타내는 한편 추가의 특성화를 위해 23F4 및 50C5를 선택하였다.
실시예 2. 인간 또는 붉은 털 원숭이 GM-CSF로의 쥐 항체의 결합
이 실시예는 재조합 인간 또는 붉은 털 원숭이 GM-CSF 단백질 (1 μg/ml@100 μl)로의 마우스 항-GM-CSF mAb의 ELISA 결합의 용량 반응을 테스트하였다.
재조합 인간 또는 붉은 털 원숭이 GM-CSF 단백질 (Genscript)을 PBS 중 1 μg/ml로 실온 (RT)에서 2 h 동안 미세역가 플레이트에 코팅하였다. 항원의 코팅 후 웰을 1% BSA가 들어있는 PBS/0.05% Tween (PBST)로 RT에서 1 h 동안 블로킹하였다. PBST로 웰의 세척 후, 다른 농도의 항-GM-CSF 항체를 웰에 추가하였고 RTd에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 결합 항체를 검출하기 위해서, 마우스 Fc에 대한 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체 (Jackson Immuno Research)를 추가한 다음, 형광원 기질 (Roche)을 추가하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에는, 플레이트의 웰을 PBST로 세 번 세척하였다. 형광 발광을 TECAN Spectrafluor 플레이트 판독기에서 측정하였다.
도 3에서 도시된 바와 같이, 23F4 및 50C5 항체 둘 다는 각각 11.8 ng/ml 및 14.6 ng/ml의 EC50으로 인간 GM-CSF에, 그리고 각각 10.2 ng/ml 및 21.7 ng/ml의 EC50으로 붉은 털 원숭이 GM-CSF에 용량-의존적 결합을 나타냈다.
실시예 3. 인간 GM-CSF로의 쥐 항체의 결합 동역학
도 4는 재조합 인간 GM-CSF로의 23F4 및 50C5의 결합 동역학을 플롯팅하였다. 재조합 인간 GM-CSF를 일련의 농도 (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM)를 가진 피분석물로서 설정하였다. 항원으로의 항체의 결합 동역학 검정을 Biacore T200 시스템을 사용하여 마우스 항체 캡쳐 방법을 통해 수행하였다. 항-마우스 Fc IgG를 제조사의 지시에 따라 CM5 센서 칩에 고정하였다. 테스트 항체를 주사하고 고정된 항-마우스 Fc IgG로 캡쳐하였다. 그런 다음 일련의 농도의 항원을 개별적으로 주사하였고, 각 농도의 항원 피분석물에 대한 결합 프로파일을 각각 기록하였다. 검정 시스템을 30초 동안 10 mM 글리신-HCL pH 1.5를 주사하여 재생시켰다. 러닝 버퍼는 HBS-EP+ (10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% P20)였다. 검정 온도는 25 ℃였고, 결합 및 해리 시간은 각각 180 및 600초였다.
Biacore 데이터를 1:1 결합 모델에 따라 Biacore T200 평가 소프트웨어 1.0을 사용하여 적합하게 조정하여 결합 (ka) 및 해리 (kd) 속도 상수, 뿐만 아니라 평형 상수 (KD)를 계산하였다. 도 4에 더하여, 일부 요약 데이터가 하기 표에서 제공된다.
Figure 112018033553798-pct00005
실시예 4. 쥐 항체에 의한 GM-CSF 수용체 알파로의 GM-CSF 결합의 차단
GM-CSF 수용체 알파 사슬로의 GM-CSF 결합의 차단에 있어서 항체의 효능을 테스트하기 위해, 재조합 인간 GM-CSF 수용체 알파 단백질 (CD116)을 PBS 중의 2 μg/ml로 4℃에서 밤새도록 미세역가 플레이트에 코팅하였다. 항원의 코팅 후 웰을 1% BSA가 들어있는 PBS/0.05% Tween (PBST)로 RT에서 1 h 동안 블로킹하였다. PBST로 웰의 세척 후, 다른 농도의 항-GM-CSF 항체를 비오티닐화된 인간 GM-CSF 단백질 (0.05 μg/ml)의 존재 하에 웰에 추가하였고 RT에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다.
코팅된 수용체로의 비오티닐화된 GM-CSF의 결합의 검출을 위해, HRP-컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 추가한 후 이어서, 형광원 기질 (Roche)을 추가하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에는, 플레이트의 웰을 PBST로 세 번 세척하였다. 형광 발광을 TECAN Spectrafluor 플레이트 판독기에서 측정하였다. 도 5에서 도시된 바와 같이, 두 항체는 모두 GM-CSF 수용체 알파로의 GM-CSF 결합의 용량-의존적 억제를 나타냈다.
실시예 5. 쥐 항체 유도된 pSTAT5 신호 전달에 의한 GM-CSF의 차단
CD14+ 단핵구를 CD14 양성 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 말초 인간 혈액으로부터 정제하였다. 정제된 단핵구를 다른 농도의 23F4 항체의 존재 하에서 인간 GM-CSF (0.2 ng/ml)로 37℃에서 30초 동안 자극하였다. 인큐베이션 후, 세포를 수거하여 FACS 버퍼 (1x PBS+ 2% FBS)로 세척하였고 2% PFA를 투과시킨 다음 매우 찬 메탄올을 사용하여 세포 고정하였다. 그 다음에 PE-컨쥬게이션된 항-pSTAT5 항체를 4℃에서 30분 동안 또 다른 인큐베이션을 위해 세포에 추가하였고 유동 세포 분석법으로 분석하였다. % 억제를 [1-(MFI 테스트 샘플/MFI 대조군)] x 100%로 계산하였다. 항체의 추가는 0.1 또는 1 μg/ml의 용량의 GM-CSF에 의해 유도된 pSTAT5 활성화의 수준을 크게 감소시킬 수 있다 (도 6).
실시예 6. 쥐 항체에 의한 GM-CSF 의존적 TF-1 증식의 억제
GM-CSF 자극 전에, TF-1 세포를 RPMI1640 기본 배지로 세척하였고 밤새도록 영양분을 공급하지 않았다. 제2 일에, 이들 영양분을 공급받지 못한 세포를 수거한 다음 평평한 바닥 96 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 50 μl 중 3X105개 세포/ml의 농도로 분주하였다. 0.2 ng/ml의 농도 (4X)의 인간 재조합 GM-CSF (Genscript)를 쥐 항-GM-CSF 항체 (완전 배지에서 희석되어 0.01 ng/ml - 1000 ng/ml)와 1:1 혼합하였고 혼합물 50 μl를 TF-1 세포에 추가하였다. 항체를 추가하지 않고 0.05 ng/ml의 GM-CSF의 최종 농도로 TF-1 세포를 인큐베이션하여 최대 세포 증식 (0% 억제)을 측정하였다. 검정에서 GM-CSF를 제외하고 RPMI1640 완전 배지에서만 세포를 유지하면서 TF-1 증식의 100% 억제를 측정하였다. 그 다음에 TF-1 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존률을 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay로 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. TF-1 증식의 억제시 23F4 및 50C5에 대한 IC50 값은 둘 다 약 10.9 ng/ml였다 (도 7).
실시예 7. 쥐 항체의 인간화
쥐 항체의 가변 영역 유전자를 이용하여 인간화 MAb를 생성하였다. 이 방법의 첫 번째 단계에서, 항체의 VH 및 VK의 아미노산 서열을 인간 Ig 유전자 서열의 이용 가능한 데이터베이스와 비교하여 종합적으로 가장 일치하는 인간 생식세포 계열 Ig 유전자 서열을 발견하였다.
그 다음에 항체 중쇄 및 경쇄의 CDR1, 2 및 3이 인간 Ig 유전자의 프레임워크 서열로 이식된 인간화 가변 도메인 서열을 설계하였다. 그 다음에 3D 모델을 생성하여 마우스 아미노산을 인간 아미노산으로 대체하는 것 (역돌연변이)이 결합 및/또는 CDR 입체구조에 영향을 미칠 수 있는 임의의 프레임워크 위치가 존재하는지를 결정하였다. 적절한 서열 및 역돌연변이가 하기 표에서 나타난다.
23F4 VH의 CDR 서열
Figure 112018033553798-pct00006
23F4 VL의 CDR 서열
Figure 112018033553798-pct00007
23F4에 대한 인간화 설계
Figure 112018033553798-pct00008
인간화 항체 23F4 중 일부의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 하기 표에서 나열하였다.
인간화 항체 서열 (CDR 잔기는 밑줄 그어져 있고 역돌연변이는 박스는 표시된 박스 내에 있다)
Figure 112018033553798-pct00009
인간화 항체 23F4에 대한 VH/VK의 조합
Figure 112018033553798-pct00010
50C5 VH의 CDR 서열
Figure 112018033553798-pct00011
50C5 VL의 CDR 서열
Figure 112018033553798-pct00012
50C5에 대한 인간화 디자인
Figure 112018033553798-pct00013
인간화 항체 서열 (CDR 잔기는 밑줄 그어져 있고 역돌연변이는 박스는 표시된 박스 내에 있다)
Figure 112018033553798-pct00014
인간화 항체 50C5에 대한 VH/VK의 조합
Figure 112018033553798-pct00015
실시예 8. 인간 GM-CSF로의 인간화 항체의 결합
인간화 변이체를 앞서 기술된 바와 같이 재조합 인간 GM-CSF로의 결합에 대하여 테스트하였다. 재조합 인간 GM-CSF 단백질 (Genscript)을 PBS 중의 1 ug/ml로 실온 (RT)에서 2 h 동안 미세역가 플레이트에 코팅하였다. 항원의 코팅 후 웰을 1% BSA가 들어있는 PBS/0.05% Tween (PBST)로 RT에서 1 h 동안 블로킹하였다. PBST로 웰의 세척 후, 다른 농도의 항-GM-CSF 인간화 항체를 웰에 추가하여 RT에서 1 h 동안 인큐베이션하였다.
결합 항체의 검출을 위해서, 마우스 Fc에 대한 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체 (Jackson Immuno Research)를 추가한 다음, 형광원 기질 (Roche)을 추가하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에는, 플레이트의 웰을 PBST로 세 번 세척하였다. 형광 발광을 TECAN Spectrafluor 플레이트 판독기에서 측정하였다. 도 8에서 도시된 바와 같이, 모든 인간화 변이체는 키메라 항체와 비교하여 인간 GM-CSF에 대하여 유사한 결합 효능을 입증하였다.
실시예 9. 인간화 항체의 결합 동역학
인간화 항체의 결합 동역학을 앞서 기술된 바와 같이 Biacore에 의해 측정하였다. 재조합 인간 GM-CSF를 일련의 농도 (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM)를 가진 피분석물로서 설정하였다. 항원으로의 항체의 결합 동역학 검정을 Biacore T200 시스템을 사용하여 인간 항체 캡쳐 방법을 통해 수행하였다. 항-인간 Fc IgG를 제조사의 지시에 따라 CM5 센서 칩에 고정하였다. 테스트 항체를 주사하고 고정된 항-인간 Fc IgG로 캡쳐하였다. 그런 다음 일련의 농도의 항원을 개별적으로 주사하였고, 각 농도의 항원 피분석물에 대한 결합 프로파일을 각각 기록하였다.
검정 시스템을 30초 동안 10 mM 글리신-HCL pH 1.5를 주사하여 재생시켰다. 러닝 버퍼는 HBS-EP+ (10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% P20)였다. 검정 온도는 25 ℃였고, 결합 및 해리 시간은 각각 180 및 600초였다. Biacore 데이터를 1:1 결합 모델에 따라 Biacore T200 평가 소프트웨어 1.0을 사용하여 적합하게 조정하여 결합 (ka) 및 해리 (kd) 속도 상수, 뿐만 아니라 평형 상수 (KD)를 계산하였다. 하기 표에서 나타난 바와 같이, 키메라 항체와 비교하여 23F4, Hu23F4-13, Hu23F4-27 및 Hu23F4-36으로부터 가장 강력한 결합 친화도를 입증하였다; 키메라 항체와 비교하여 50C5, Hu50C5-8, Hu50C5-17, Hu50C5-18, Hu50C5-19, Hu50C5-21 및 Hu50C5-23으로부터 가장 강력한 결합 친화도를 입증하였다.
Figure 112018033553798-pct00016
Figure 112018033553798-pct00017
실시예 10. 인간화 항체에 의한 TF-1 증식의 억제
GM-CSF 자극 전에, TF-1 세포를 RPMI1640 기본 배지로 세척하였고 밤새도록 영양분을 공급하지 않았다. 제2 일에, 이들 영양분을 공급받지 못한 세포를 수거한 다음 평평한 바닥 96 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 50 ul 중 3X105개 세포/ml의 농도로 분주하였다. 0.2 ng/ml의 농도 (4X)의 인간 재조합 GM-CSF (Genscript)를 인간화 항-GM-CSF 항체 (완전 배지에서 희석되어 0.01 ng/ml - 1000 ng/ml)와 1:1 혼합하였고 혼합물 50 ul를 TF-1 세포에 추가하였다. 항체를 추가하지 않고 0.05 ng/ml의 GM-CSF의 최종 농도로 TF-1 세포를 인큐베이션하여 최대 세포 증식 (0% 억제)을 측정하였다. 검정에서 GM-CSF를 제외하고 RPMI1640 완전 배지에서만 세포를 유지하면서 TF-1 증식의 100% 억제를 측정하였다. 그 다음에 TF-1 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존률을 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay로 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
TF-1 증식의 억제시 23F4 및 50C5에 대한 IC50 값은 둘 다 약 10.9 ng/ml였다 (도 7).
테스트된 23F4의 인간화 항체 중에서, Hu23F4-13, Hu23F4-27 및 Hu23F4-36이 각각 4.95 ng/ml, 3.95 ng/ml 및 3.30 ng/ml의 IC50으로 가장 강력한 억제를 나타냈다 (도 9). 테스트된 50C5의 인간화 항체 중에서, Hu50C5-23은 14.31 ng/ml의 IC50으로 가장 강력한 억제를 나타냈다 (도 9).
Figure 112018033553798-pct00018
Figure 112018033553798-pct00019
실시예 11. 인간화 항체에 의한 pSTAT5 신호 전달의 차단
CD14+ 단핵구를 CD14 양성 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 말초 인간 혈액으로부터 정제하였다. 정제된 단핵구를 다른 농도의 인간화 항체의 존재 하에서 37℃에서 30분 동안 인간 GM-CSF (0.2 ng/ml)로 자극하였다. 인큐베이션 후, 세포를 수거하여 FACS 버퍼 (1x PBS + 2% FBS)로 세척하고 2% PFA를 투과시킨 다음 매우 찬 메탄올을 사용하여 세포 고정하였다. 그 다음에 PE-컨쥬게이션된 항-pSTAT5 항체를 4℃에서 30분 동안 또 다른 인큐베이션을 위해 세포에 추가하였고 유동 세포 분석법으로 분석하였다. % 억제를 [1-(MFI 테스트 샘플/MFI 대조군)] x 100%로 계산하였다. Hu23F4-13, Hu23F4-27, Hu23F4-36, Hu50C5-17 및 Hu50C5-23의 추가는 0.1 또는 1 μg/ml의 용량의 GM-CSF에 의해 유도된 pSTAT5 활성화의 수준을 크게 감소시킬 수 있다 (도 10).
실시예 12. 붉은 털 원숭이 GM-CSF로의 인간화 항체의 결합
재조합 붉은 털 원숭이 GM-CSF 단백질 (Genscript)을 PBS 중의 1 ug/ml로 실온 (RT)에서 2 h 동안 미세역가 플레이트에 코팅하였다. 항원의 코팅 후, 웰을 1% BSA가 들어있는 PBS/0.05% Tween (PBST)로 RT에서 1 h 동안 블로킹하였다. PBST로 웰의 세척 후, 다른 농도의 인간화 항-GM-CSF 항체를 웰이 추가하였고 RT에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 결합 항체의 검출을 위해, 마우스 Fc에 대한 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체 (Jackson Immuno Research)를 추가한 다음, 형광원 기질 (Roche)을 추가하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에는, 플레이트의 웰을 PBST로 세 번 세척하였다. 형광 발광을 TECAN Spectrafluor 플레이트 판독기에서 측정하였다. 도 11에서 도시된 바와 같이, Hu23F4-13, Hu23F4-27 및 Hu23F4-36은 각각 7.44 ng/ml, 6.25 ng/ml 및 7.75 ng/ml의 EC50으로 붉은 털 원숭이 GM-CSF로의 용량-의존적 결합을 나타냈다; Hu50C5-17 및 Hu50C5-23은각각 18.86 ng/ml 및 21.63 ng/ml의 EC50으로 붉은 털 원숭이 GM-CSF로의 용량-의존적 결합을 나타냈다.
Figure 112018033553798-pct00020
실시예 13. 붉은 털 원숭이에서 Hu23F4-27의 약물동역학
이전 시험관 내 생체 활성 검정의 결과로부터, 나이브(naive) 붉은 털 원숭이에서의 약물동역학적 성질을 결정하기 위해 Hu23F4-27을 선택하였다. Hu23F4-27 항체를 볼루스 정맥 내 주사로 각각 0.4 mg/kg, 2 mg/kg 및 10 mg/kg의 다른 용량으로 나이브 붉은 털 원숭이에 투여하였다. 투약 후 28일 이후의 선택된 시점에서 혈장 샘플을 수거하였고, 각각의 단백질의 농도를 ELISA로 결정하였다. 그 다음에 약물동역학적 매개변수를 WinNonlin (Certara, CA)을 이용한 비-구획적 방법을 사용하요 계산하였고 도 12에서 도시한다.
Figure 112018033553798-pct00021
* * *
본 명세서는 기술된 특정 구체예에 의해 범위가 제한되어서는 안되며, 이것은 본 명세서의 개개의 양태의 단일 예시로서 의도되고, 기능적으로 동등한 임의의 조성물 또는 방법은 본 명세서의 범위 내에 있다. 본 명세서의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서의 방법 및 조성물에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 따라서, 본 명세서는 본 명세서의 변형 및 변화가 첨부된 청구항 및 그 동등물의 범위 내에 있는 한 그것들을 커버하도록 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개개의 간행물 또는 특허 출원이 참조로 구체적으로 및 개별적으로 포함되도록 나타난 바와 같은 정도로 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> I-MAB <120> ANTI-GM-CSF ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 54LW-258793-WO <150> CN201610831525.9 <151> 2016-09-19 <150> CN201610832677.0 <151> 2016-09-19 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Ser His Tyr Leu His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Lys Ala Asn Gln Asn Val Gly Thr Thr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 His Gln Tyr Thr Thr Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 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Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ser His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ser His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Lys Tyr Leu Asn Trp Asn Phe Asp Val Trp 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Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Thr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Asn Gln Asn Val Gly Thr Thr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Thr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Asn Gln Asn Val Gly Thr Thr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Thr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Asn Gln Asn Val Gly Thr Thr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr Thr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> 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Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ile Glu Tyr Asn Gln His Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ile Glu Tyr Asn Gln His Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ile Glu Tyr Asn Gln His Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ile Glu Tyr Asn Gln His Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ile Glu Tyr Asn Gln His Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Leu Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Glu Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Asp Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Glu 100 105 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Leu Asn Glu Asn Ile Tyr 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<220> <223> Synthetic <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Leu Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Glu Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Leu Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Glu Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr 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Thr 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 Gly Tyr Ile Phe Ser 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 Gly Gly Thr Phe Ser 1 5

Claims (26)

  1. 인간 GM-CSF 단백질에 대한 특이성을 갖고 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함하는, 분리된 항체 또는 이것의 단편.
  2. 제1 항에 있어서, 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  3. 제1 항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 사슬 불변 영역인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  4. 제1 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 아이소타입인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  5. 제4 항에 있어서, 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  6. 제1 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전한 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  7. 제1 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.

  8. 제7 항에 있어서, 카바트 넘버링에 따라,
    (a) 위치 1의 Glu,
    (b) 위치 98의 Arg,
    (c) 위치 72의 Ser,
    (d) 위치 68의 Ala,
    (e) 위치 70의 Leu,
    (f) 위치 48의 Ile,
    (g) 위치 26의 Asp, 및
    (h) 위치 29의 Leu, 및 이것들의 조합
    으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  9. 제8 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 적어도 (a) 위치 1의 Glu를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  10. 제8 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링에 따라 위치 26에서 시작하여 DYTLT (서열 번호: 42) 또는 GYTFT (서열 번호: 43)의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  11. 제7 항에 있어서, 카바트 넘버링에 따라,
    (a) 위치 46의 Ala,
    (b) 위치 60의 Asp,
    (c) 위치 70의 Asp,
    (d) 위치 43의 Ser, 및
    (f) 위치 87의 Phe, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  12. 제1 항에 있어서, 서열 번호: 8-17로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 8-17로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  13. 제1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 11, 14 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  14. 제1 항에 있어서, 서열 번호: 19-22로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 19-22로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  15. 제1 항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 19 또는 22의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  16. 제1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  17. 제1 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 이중특이적 항체 또는 단일 사슬 가변 단편인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  18. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 세포.
  20. 치료가 필요한 환자에서 자가면역성 질환 또는 질병을 치료하기 위한 조성물로서, 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  21. 제20 항에 있어서, 자가면역성 질환 또는 질병은 에디슨 병, 원형 탈모, 강직성 척추염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 피부근염, 1형 당뇨병, 복강 질환, 자가면역성 소아 특발성 관절염, 사구체 신염, 그레이브 병, 길랭-바레 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 중증 근무력증, 자가면역성 심근염, 다발성 경화증, 천포창, 유사천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발성 근염, 일차성 담즙성 간경화증, 건선, 건선성 관절염, 류머티스성 관절염, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반 루푸스, 자가면역성 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자가면역성 포도막염, 백반증, 궤양성 대장염, 다발혈관염을 동반한 육아종성 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제20 항에 있어서, 자가면역성 질환 또는 질병은 류머티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 샘플에서 GM-CSF의 발현을 검출하는 방법으로서, 항체 또는 이것의 단편이 GM-CSF와 결합하는 조건 하에서 샘플과 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편을 접촉시키는 단계, 및 샘플에서 GM-CSF의 발현을 나타내는 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
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