JP2013116912A - 抗gm−csf抗体とその使用 - Google Patents
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Abstract
GM−CSF/GM−CSF受容体の相互作用を効果的に阻害できるヒトおよびヒト化抗体を提供することは本発明の目的である。ヒトへの投与に安全な抗体を提供することが、本発明の別の目的である。GM−CSFの存在に関連する病気および/または状態を、一つ以上の本発明の抗体を用いることによって治療するための方法を提供することも本発明の目的である。
【解決手段】
本発明は、様々な疾患または状態において肝要な役割を果たすGM−CSFに対して特異的な組換え型抗原結合領域、抗体およびその機能性フラグメントを提供する。それに応じて、これらの抗体は、例えば、関節リウマチなどの炎症性疾患を治療するのに使用することができる。本発明の抗体はまた、様々な疾患の進行におけるGM−CSFの役割のさらに詳しい調査と同様に診断法分野においても使用することができる。本発明はまた、前述の抗体をコードする核酸配列、同じく前述の抗体を含むベクター、医薬組成物および使用説明書付きのキットを提供する。
【選択図】なし
Description
免疫系におけるその多様な活性化機能のために、GM−CSFを抗炎症療法の標的として検討できる。関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、クローン病、乾癬、喘息、アトピー性皮膚炎、またはショックなどの、慢性および急性炎症性疾患に対して、GM−CSF活性の阻害と、続くGM−CSF応答細胞の有害な活性化の減少が有効かもしれない(Hamiton,1993;Zhangら、1998;Hamilton, 2002)。
いくつかのグループがGM−CSFならびにその受容体が関節炎患者の滑膜関節内に存在することを示した(Alvaro−Graciaら、1991;Xuら、1989;Haworthetら、1991)。さらに、フェルティ症候群における好中球減少症のためにGM−CSFを用いて治療された患者(Hazenbergら、1989)、または化学療法後の患者(de Vriesら、1991)において、GM−CSFが関節リウマチの発赤の原因となることが示された。
a) 成熟単球、マクロファージ、および好中球の活性と数を阻害または減少させることが予想される。特に好中球とマクロファージは滑液と滑膜に豊富である。滑膜中のマクロファージ数が関節リウマチの関節のびらんの程度と相関することが示されてきた(Mulherinら、1996;Burmesterら、1997)。マクロファージは様々な他の炎症性サイトカインマトリクス分解プロテアーゼの源である。好中球によるH202の産生は、関節炎の関節内で起こる破壊過程の一部である(Babior,2000)。GM−CSFの阻害はまた、b)骨髄樹状細胞(DC)の分化と滑膜のDC(=滑膜細胞)の活性化を阻害または減少させることが予想される。GM−CSFはDCとRA滑膜細胞上のHLAクラスII発現を上方調節し維持する(Alvaro−Gracia JMら、1991)。DCは関節内で、炎症性T細胞の選択的活性化に関連する機能を獲得す
るように指示される。特異的HLA−DR対立遺伝子はRAの罹患性と関連付けられ、DCの抗体提示を介したT細胞の活性化はこの種の免疫性疾患において重要な役割を果たすかもしれない(Santiago−Schwarzら、2001)。
多発性硬化症においては、GM−CSFレベルの上昇は、MSの活動期と相関し(Carrieriら、1998; McQualterら、2001)GM−CSF−/− マウスはMS、実験的脳脊髄炎、EAEのためのモデル系において疾患を発症できない(McQualterら、2001)。
喘息では、肺におけるGM−CSF量の増加が報告されている(Broide and
Firestein,1991)。好酸球が上昇すると同時に、GM−CSFはインターロイキン−5と相乗して i)前駆細胞から好酸球への分化を刺激する、ii)それらの機能性活性化を刺激する、ならびにiii)肺における好酸球の寿命を延長するという三つの方式で機能する(Broideら、1992;Yamashitaら、2002)。故に、GM−CSFの阻害による喘息の気道における好酸球の寿命の減少は、疾患を改善する可能性がある。抗GM−CSF中和抗体の有用性が、そのような抗体の投与が気道過敏性と気道炎症の著しい減少をもたらした、マウス喘息モデルにおいてさらに示された(Yamashitaら、2002)。
異なるマウスモデルにおいて、マウスでの抗GM−CSF抗体22E9の使用によって、肺のLPS依存性炎症を軽減できた(Bozinovskiら、2003)。
顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)遺伝子をホモの状態でノックアウトしたマウスは正常に発育し、12週齢まで造血に大きな異常は見られない。大部分のGM−CSF欠乏マウスが一見健康で繁殖能を持つが、全てがコラーゲン線維束の破壊と減少を伴う乱れた血管細胞外基質と、肺界面活性物質クリアランスの障害と、肺での微生物病原体への抵抗の低下を伴う肺の異常を発現する。後者の病理の特徴は、ヒトの疾患である、肺胞タンパク症(PAP)に類似する。GM−CSFが正常レベルの主要な種類の成熟造血細胞と、血液、骨髄、および脾臓内にあるそれらの前駆物質を維持するのに必要不可欠とは思われない。しかし、それらはGM−CSFが正常な血管の発達、呼吸生理学、局所感染に対する抵抗に不可欠であるように示唆している(Stanleyら、1994;Dranoffら、1994;Plenzら、2003;Shibataら、2001)。近年では、GM−CSFに対する自己抗体とPAPの強い関連性が、ヒトにおけるPAPの発生機序におけるGM−CSFシグナル伝達異常をさらに示唆している。合わせて、これらの観察はGM−CSFが肺における肺胞マクロファージ固有の免疫機能と界面活性物質の恒常性の調節において重要な役割を担うことを示している(Bonfield ら、2002;TrapnellとWhitsett,2002;Uchidaら、2004;Kitamuraら、1999)。
その他の副作用は予想されていない。
対応するように、抗GM−CSF抗体療法に対する大きな潜在性の観点から、GM−CSF/GM−CSF受容体相互作用を効果的に阻害する、高親和性を持つヒト抗GM−CSF抗体に対する高いニーズがある。さらに、一つ以上の非ヒト種のGM−CSFと交差反応できる一つ以上の抗体を持つことは、動物ベースの生体内モデルにおいてそれらの有効性を試験するために有利である。
抗体または機能性抗体をさらに提供する。そのような抗体またはその機能性フラグメントは、配列番号:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51、または52に表されるHCDR3領域を含む抗原結合領域を含んでもよく、この抗原結合領域は配列番号:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51、または52に表されるHCDR2領域をさらに含んでもよく、この抗原結合領域は配列番号:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51、または52に表されるHCDR1領域をさらにまた含んでもよい。そのような抗体またはその機能性フラグメントは配列番号:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51、または52に表される重鎖可変領域を含む抗原結合領域を含んでもよい。本発明のそのようなGM−CSF特異性抗体は配列番号:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60、または61に表されるLCDR3領域を含む抗原結合領域を含んでもよく、この抗原結合領域はさらに配列番号:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60、または61に表されるLCDR2領域を含んでもよく、この抗原結合領域は配列番号:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60、または61に表されるLCDR1をさらにまた含んでもよい。そのような抗体またはその機能性フラグメントは 配列番号:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60、または61に表される軽鎖可変領域を含む抗原結合領域を含んでもよい。
本発明のヒトまたはヒト化抗体(およびそれらの機能性フラグメント)は、溶液平衡滴定(SET)、および/またはTF1増殖アッセイによって検討されるように、ラットおよび/またはアカゲザル(マカク属)GM−CSFと交差反応性であってもよい。
本発明は、GM−CSFに特異的な、または高い親和性を持ち、一つ以上のほかの新しい特性を持つ新しい抗体の発見に基づく。好ましくは、本発明の一つの抗体は被験者に治療上の利益をもたらすことができる。ヒトのまたはヒト化してよい本発明の抗体を、本明細書でより十分に説明する多くの状況で使用できる。
ら得られる、キメラのもの、または(iii)一つ以上の可変領域の骨格がヒト由来で一方、可変領域のCDRが非ヒト由来であり、定常領域(もしあれば)がヒト由来である、CDRグラフトとして定義される。
ュータ内設計は、例えばヒトの配列のデータベースを解析することにより、またそこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することにより達成される。コンピュータ内で作成された配列を設計し得るための方法は、例えばKnappikら、J.Mol.Biol.(2000)296:57; Krebsら、J.Immunol.Methods.(2001)254:67;および米国特許番号第6,300,064号 Knappikらにおいて記述され、これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書を通して、以下の本発明の代表的な抗体に対して言及される。「antibody nos.」または「MOR」03684、04251、03929、04252、04287、04290、04302、04350、04354、04357、03682、04283、04297、および04342。MOR03684は、配列番号:1(DNA)/配列番号:11(タンパク質)に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号:21(DNA)/配列番号:31(タンパク質)に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。MOR04251は、配列番号:2(DNA)/配列番号:12(タンパク質)に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号:22(DNA)/配列番号:32(タンパク質)に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。MOR03929は、配列番号:3(DNA)/配列番号:13(タンパク質)に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号:23(DNA)/配列番号:33(タンパク質)に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。MOR04252は、配列番号:4(DNA)/配列番号:14(タンパク質)に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号:24(DNA)/配列番号:34(タンパク質)に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。
好ましくは、本発明の抗体はGM−CSFと結合できるだけでなく、ヒトGM−CSFとCHO−K1細胞に発現させたヒトGM−CSF受容体のアルファ鎖との結合を、少なくとも25%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも85%、最も好ましくは少なくとも100%の程度で阻害できる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、0.5μg/mlのヒトGM−CSFと2×105個のCHO−K1細胞に発現させたヒトGM−CSF受容体のアルファ鎖との結合を、少なくとも50%の程度で、CHO−K1細胞に発現させたヒトGM−CSF受容体アルファ鎖の濃度が、約2×105個のCHO−GMRa#11細胞に発現させたヒトGM−CSF受容体アルファ鎖の濃度と同様である条件下と、発明的な抗体の濃度が約5μg/mlである条件下で阻害できる。
本発明の抗体はここで開示された特定のペプチド配列に限らない。むしろ、ポリペプチドの変異体も含む。当該開示内容、従来技術および参考文献を参照して、熟練労働者はここで開示された機能的な抗体の変異体を準備、テストおよび活用できると同時に、前記変異体も本発明の範囲内であることを理解する。この文脈において、「GM−CSFとGM−CSF受容体のアルファ鎖との相互作用をブロックする能力」は、本発明の抗GM−CSF抗体で説明された機能的特性を意味する。
ポリペプチド変異体は、本明細書で開示される全ての抗体ペプチド配列の分子構造を保存するよう構成される。各アミノ酸の特性を考慮にいれると、いくつかの合理的な代用は前記熟練労働者に認識される。アミノ酸の代用、すなわち「保存代用」が、例えば、極性、電荷、溶解度、疎水性、および/または関係する前記残基の両親媒性の特性における類似性を基本にして、製造される。
本発明は本発明の抗体をコードするDNA分子にも関する。該配列は、図1aおよび2aに示されるDNA分子を含むがこれに限らない。
a.Tm=69.3+0.41(G+C)%
b.二重DNAのTmは、不適当な塩基対の数が1%増加する度に1℃減少する。
c.(Tm)μ2−(Tm)μ1=18.5 log10μ2/μl
μlおよびμ2は、2つの溶液のイオン強度である。
れる。高ストリンジェンシーの場合、短い(<20 nt)オリゴヌクレオチドプローブが用いられない限り、温度は通常65℃から70℃の間である。典型的なハイブリダイゼーション溶液は、6X SSC、0.5% SDS、5X Denhardt溶液および非特異的担体DNA100μgを含む。Ausubelら、2.9節、別冊27(1994)参照。当然ながら、異なるところも多いが、機能性では同等であり、緩衝条件は周知である。相関性の程度が低い場所では、低温で設定される。低ストリンジェンシー結合温度は約25℃から40℃である。中ストリンジェンシーは少なくとも約40℃から65℃より低い。高ストリンジェンシーは少なくとも約65℃である。
本明細書に記載されるDNA分子の変異体はいくつかの異なる方法で構成されることが認識される。例えば、完全合成DNAとして構成されてよい。効果的に20から約150までのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを合成する方法は、多様にある。Ausubelら、2.11節、別冊21参照(1993)。部分的に一致するオリゴヌクレオチドは、Khoranaら、J.Mol.Biol.72:209−217(1971)の報告によれば、一応合成され、組み立てられる。Ausubelら、supra、8.2節も参照。合成DNAは、適切なベクターにクローンを促進するために遺伝子の5’および3’末端で作り変えられた適切な制限領域を伴って設計されることが望ましい。
結合する。結果生じた子孫はDNA配列を利用して確認できる望ましい突然変異体(mutant)を有する。さらに、子孫ファージが望ましい変異体(mutant)になる可能性を高める多様な方法がある。これらの方法は当該分野に従事する者にとって周知であり、このような変異体(mutants)を生成するキットは商業的に入手可能である。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列を1つ以上含む組換えDNA構築物を提供する。本発明の組換えDNA構築物は、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウィ
ルスベクターなどのベクターとの関連で使用され、そこに本発明の抗体をコードするDNA分子を挿入する。
細菌の使用に有効な発現ベクターは、望ましいタンパク質をコードした構造的DNA配列を適切な翻訳開始シグナルおよびターミネーションシグナルとともに、機能性プロモーターと作動可能なリーディングフェーズにおいて挿入することで構築される。前記ベクターは、1つ以上の表現型選択可能マーカーおよび複製オリジンからなり、前記ベクターを維持し、望ましくは、宿主内での増幅を提供する。形質転換に適した原核性の宿主は、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌およびシュードモナス菌、ストレプトミセス菌およびブドウ球菌属内の多様種を含む。
療法は、治療効果のある量の本発明に含まれる抗体を、治療を必要とする対象に投与することを含む。ここでの「治療効果のある」量は、GM−CSFと、対象物の治療部位における受容体との間の相互作用を、一用量または複用量摂生に従って、単体でまたは他の製剤との組み合わせで、効果的にブロックするに十分な量と定義され、副作用を緩和しながらも、当該量は毒性学的に許容し得る。対象物は、ヒトまたはヒト以外の動物(例えば、ラットまたはアカゲザル)でよい。
章、484〜528ページ(第18版、Alfonso R.Gennaro,編集、Easton,Pa.;Mack Pub.Co.,1990)に掲載されている。詳細には、治療効果量の決定には、製剤の毒性および効力等の要因にも左右される。毒性は当該技術および前述参照で公知の方法を用いて決定される。効力は、下記の例で解説される方法に関連した同じ手引きを利用して決定される。
GM−CSFは、リンパ球、単球、内皮細胞、繊維芽細胞およびいくつかの悪性細胞を含む多様な細胞によって発現するため、本発明の非GM−CSF抗体は患者の異なる組織内でGM−CSFの蓄積部位を投影または視覚化するために適用される。これに関し、放射線同位元素、アフィニティーラベル(ビオチン、アビジンなど)、蛍光ラベル、常磁性原子などの使用により、抗体は検知可能となり分類される。分類手順は当該技術においては公知である。画像診断における抗体の臨床的使用は、Grossman, H. B.,Urol.Clin.North Amer.13:465−474(1986)),
Unger,E.C.ら、Invest.Radiol.20:693−700(1985)),および、Khaw,B.A.ら、Science 209:295−297(1980)) により見直される。
検知可能で分類された抗体の病巣の検知は、例えば炎症部位から予測可能である。1つの実施態様において、組織または血液のサンプルを採取し、検知可能で分類された抗体内で前記サンプルを培養する実験が行われる。好ましい実施態様は、当該技術が、磁気画像、蛍光関節撮影法など非侵襲性の方法で実施される。そのような診断テストは、GM−CSFの存在または欠如が関連指標である疾患治療の結果を監視することで適用される。本発明は、ここで説明されている生体外での診断において、非GM−CSF抗体の使用も考慮に入れる。
本発明の抗体は、薬剤学的に有効な組成物を準備する公知の方法に従い処方され、本発明の抗体(機能性フラグメントを含む)は薬剤学的に許容し得る担体との組み合わせで結合される。適切な媒体およびそれらの製剤は、例えばREMINGSTONの薬剤学(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)(第18版、Alfonso R.Gennaro,編集、Easton,Pa.:Mack Pub.Co.,1990)で解説されている。効果的な投与に最適で薬剤学的に許容し得る組成物を形成するために、当該組成物は、適切な担体と共に、本発明の1つ以上の抗体の効果的な用量を含む。
実施例1:HuCAL GOLD(R)ライブラリーからのヒトGM−CSF特異性抗体
の生成
A.ファージの増殖および精製
HuCAL GOLD(R)ライブラリーは、クロラムフェニコールを34μg/mlお
よびブドウ糖1%を含む2xYT培地内で増殖させた(2xYT−CG)。0.5のOD600における(振動を与えずに37℃で30分、250rpmで振動させ37℃で30分)補助ファージ感染(VCSM13)後、細胞を遠沈し(4120g、5分、4℃)2
xYT/34μg/ml、クロラムフェニコール/50μg/ml、カナマイシン/0.25mM IPTG、そして22℃で一晩増殖させた。ファージは、上清からPEG沈殿させ、PBS/20%グリセロールに再懸濁し、−80℃で保管した。パニングラウンド感におけるファージの増殖は、以下のように実施された:対数中期段階の大腸菌TG1細胞は、溶離したファージを感染させ、ブドウ糖1%とクロラムフェニコール34μg/mlを追加したLB寒天で培養した。30℃で一晩培養した後、コロニーを破片にし、0.5のOD600nmになるまで2xYT−CGを接種するために使用し、前述のとおり補助ファージが加えられた。
ヒトGM−CSFを認識する抗体の選択には、いくつかのパニング戦略が適用された。概要は、HuCAL GOLD(R)抗体−ファージを異なるVHマスター遺伝子を含む3つのプールに分割した。これらのプールは個々に、a)3ラウンドの固相支持体としてニュートラアビジン社のコーティングされた96ウェルプレートに直接コーティングされたビオチン化ヒトGM−CSFタンパク質(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社製造)上の固相パニングまたはb)3ラウンドのためにDynabeads(Dynal,ノルウェー オスロー)をコーティングしたストレプトアビジン上に捕獲されたビオチン化ヒトGM−CSFタンパク質上の溶液パニングに供した。
Tween20室温で30分を含むブロッキングブッファー100μlに予め吸収させた。ブロックされたファージは、室温で30分ニュートラビジン社プレートのウェルにl00μ1アリコートに移した。このステップは前吸収のために2度繰り返された。
コーティングされ、ブロックされたニュートラアビジン社のマイクロタイタープレートの洗浄(2x 300μ1 PBS)の後、予め吸収された0.1mlのファージをコーティングされたウェルに加え、室温で1.5時間インキュベートして静かに振動させた。このインキュベートに続いて、PBS/0.05% Tween20での室温における10回の洗浄後、が実施された。
選択されたHuCAL GOLD(R)ファージの挿入物をコードするFabは発現ベクターpMORPH(R)X9_Fab_FH(図5)にサブクローン化され、水溶性Fabの急速発現を促進した。選択されたクローンのDNAはXbalおよびEcoRIにより消化し、それによりFabコーディング挿入物(ompA−VLCLおよびphoA−Fd)を切除し、XbaI/EcoRIにより消化したベクターpMORPH(R)X9_F
ab_FHにクローン化した。これらのベクター内で発現するFabは、検知および精製のため2つのC−末端タグ(それぞれFLAGTMおよび6xHis)を有した。
pMORPH(R)X9_Fab_FHにサブクローニングされた後に獲得された単体コロ
ニーは、各ウェル100μl 2xTY/Cm/1% Glu培地を有するウェルに植え付けるために使用されて37℃で一晩成育させた。TG−1大腸菌培養の5μlは100μl 2xTY/Cm/0.1% Glu培地/ウェルを有する無菌性の96−ウェルマイクロタイタープレートに移した。マイクロタイタープレートは、培養物が0.5のOD600nmでわずかに混濁(2〜4時間)するまで、マイクロプレートシェイカーでこれらの発現プレートに、各ウェル20μl 2xYT/Cm/3mM IPTGが加えられ(濃縮終了0.5mM IPTG)、気体透過性テープで密封され、400rpmの振動で一晩30℃に設定されインキュベートされた。
発現プレートの個々のウェルに、40μ1 BEL buffer(2xBBS/EDTA:24.7g/l ホウ酸, 18.7g NaCl/l,1.49g EDTA/l, pH8)が加えられたが、2.5mg/mlのリゾチームが含まれ、マイクロタイタープレートシェーカで22℃1時間(400 rpm)に設定されインキュベートされた。BEL抽出物は、ELISAまたはBioVeris M−series(R) 38
4 アナライザー(実施例2参照)による結合分析に利用された。
TG−1 細胞内で、pMORPH(R)X9_Fab_FHによりコードされたFabフ
ラグメントの発現は、34μg/mlのクロラムフェニコールで補完された2xYT 培地の1 1と培養するシェーカーフラスコ内で実施した。0.5mM IPTGの導入後、細胞は1.6時間22℃で増殖させた。細胞ペレットの全体細胞抽出物は、フレンチプレスまたはニッケル/ニトリオトリ酢酸クロマトグラフィーによって単離されたFabフラグメントによって調合された(キアゲン、ヒルデン、ドイツ)。濃縮は、紫外線光度法によって決定された(Krebsら、2001)。
hGM−CSF特異性のFabをコードするクローンを識別するために、上述のパニング法によって選択された個々の大腸菌クローンのBEL抽出物を、ELISAまたはBio Veris(Bio Veris M−series(R)384Analyzer)に
よって分析した。
ヒト組換えビオチン化GM−CSF(R&D Systems)を、PBS中1.5μg/mlで、室温で2時間ニュートラアビジン社マイクロタイタープレートにコーティングした。
加し、また室温で1時間インキュベートした。一次抗体を検出するために、以下の二次抗体、アルカリホスファターゼ(AP)−共役アフィニティー精製F(ab')2フラグメ
ント、ヤギ抗ヒトIgG、ヤギ抗マウスIgGまたはヤギ抗ラットIgG(Jackson Immuno Research)を適用した。AP−共役を検出するために、製造業者による取扱説明書に従って、AttoPhos(Roche)などの蛍光発生基質を使用した。全てのインキュベーションのステップの間に、マイクロタイタープレートのウェルをPBS−Tで3度、また二次抗体による最終インキュベーションの後で3度洗浄した。TECANSpectrafluorプレートリーダーで蛍光を測定した。
大腸菌溶解物(BEL抽出物)でのGM−CSF結合Fab抗体を検出するためのELISA実験に代わり、BioVerisM−SERIES(R)384AnalyzerBioVeris,Europe社、ウイットニー、オックスフォードシャー、英国)で結合を分析した。
g/mlの濃度でこの二次抗体をGM−CSF結合ビーズに加えた。Fab抗体を含む大腸菌発現培養の希釈BEL抽出物(上記参照)の100μlまたは60μlを96のウェルまたは384ウェルプレートに満たし、各々、GM−CSF結合ビーズとともに抗Fab−BV−tagTM二次抗体混合の25または15μlをそれぞれのウェルに加え、室温で2時間プレート振動装置でインキュベートした。Bio Veris M−SERIES(R)384Analyzerでプレートを分析した。
以下の検体、ラットおよびマウスGM−CSF、ヒトIL−3、ヒトIL−4、ヒトIL−5、ヒトIL−13、ヒトM−CSF(全て英国、ロンドン、ペプロテック社から)に対して抗hGM−CSF抗体の交差反応性を決定した。
サイクルの後で、100mM HCI(5μl)によってフローセルを発生させた。
MOR03684およびMOR03682を含む7つのHuCAL(R)抗hGM−CSF抗体を検査し、ヒトGM−CSFに対して特異的として、他のサイトカインまたはマウスもしくはラットGM−CSFのいずれとも結合しなかった。対照的に、Fab MOR03929は、ラットGM−CSFに対して著しい交差反応性を示した。
HuCAL GOLD(R)ライブラリーから選択された74の異なるhGM−CSF特異的抗体の、hGM−CSFとその受容体との間の相互作用を抑制するための効力を検査した。相互作用は、(i)一方はGM−CSF依存性TF−1細胞株(Kitamuraら、1989)を使用した増殖アッセイであり、また(ii)他方は、GM−CSF受容体のアルファ鎖を発現する組換え型CHO細胞株によるFACS分析である、2つの方法で検査した。TF−1増殖アッセイでは、アルファ鎖およびベータ鎖から成る内因性のGM−CSF受容体を有するGM−CSFの相互作用をブロックするための抗GM−CSF抗体の能力を分析し、細胞増殖の減少をもたらした。FACSアッセイでは、GM−CSF受容体のGM−CSFとアルファ鎖との間の相互作用の特異的抑制を決定した。
アカゲザルGM−CSF完全長cDNA(GenBank受入番号:AY007376)を遺伝子合成(geneART GmbH、レーゲンスブルク、ドイツ)によって合成し、pCR−Script−Ampベクター(Stratagene,ラホーヤ、カルフォルニア州、米国)にクローン化した。次に、cDNAを真核性の発現ベクターpcDNA3.1(+)(Invitrogen,ペイズリー、英国)にクローン化してpcDNA−macGM−CSFを得た。Qiagen(ヒルデン、ドイツ)からのRNeasyキットを使用して、l×10e7TF−1細胞から単離させたRNAからRT−PCR技法によってヒトGM−CSFのcDNA(Genbank受入番号NP000749)をクローン化した。ランダムな六量体(Gibco)を使用してSuperscriptIIキットによって逆転写を実行し、続いてPCRによるGM−CSFcDNAの増幅を実行した。得たPCR生成物を発現ベクターpcDNA3.1(+)にクローン化してpcDNA−huGM−CSFを得た。
プロバイダーの手順(DSMZ,ブラウシュバイク、ヂオイツ; DSMZ No.AC
C 334)によると、TF−1(Kitamuraら、1989)細胞は、増殖した。TF−1細胞は、RPMI1640培地(10%FCS)で二度洗浄され、その後、96穴平底マルチウェル培養皿のウェルあたり50μlに2×105細胞/mlの濃度で播種された。0.5ng/mlのヒト組換えGM−CS(”Leucomax”、ESSEX Pharma,ミュンヘン)およびHuCAL(R)Fab抗体(RPMI1640培
地内で200ng/ml〜200μg/mlに希釈、10%FCS)を30分混合し、GM−CSFの最終濃度が0.25ng/mlになるように、混合の50μlをTF−1細胞に加えた。最大細胞増殖(0%阻害)は、0.25ng/mlのGM−CSFの最終濃度で、抗体の追加なしで、TF−1細胞をインキュベートしながら測定された。TF−1増殖の100%阻害は、そのアッセイからGM−CSFを除外し、RPMI1640培地
(10%FCS)内にのみ、細胞を保持することにより測定された。その後、TF1細胞は、加湿室内で、5%のCO2を使用して、37℃で72時間、インキュベートされた。製造者の推奨により、細胞活力は、MTTまたはXTT試薬(Roche,マンハイム、ドイツ)を加えることにより、測定された。全体の19のFabは、TF−1増殖の有意な阻害を示すことが確認された。結合MOR03682、MOR03684およびMOR03929は、2μMの濃度で、50%より大きいTF1細胞増殖の一貫した阻害を示した。これらの最適化されていないFabの阻害活性は、最大阻害度を達成できなかったため、IC50の投与量を決定するには十分強力ではなかった。相対的に、単クローン抗体BVD2−21 C1I(BD Biosciences Pharmingen; Cat#554503)およびMAB215(R&D Systems; Cat#MAB215)は、TF−1増殖を最大阻害できた。
C.抗体−hGM−CSF Fabによる、GM−CSF受容体アルファへのGM−CSF結合のブロック
GM−CSF受容体アルファ鎖を発現した細胞面へのGM−CSF結合を分析するために、cDNAが発現ベクターにクローン化され、CHO−K1細胞(DSMZ ACC 110)に安定に導入された。
および
3’:C−flGCRa:ACCCTCCAATTGTCAGGTAATTTCCTTCACGGTCである。
クローンの間で、解析されたクローンCHO−GMRa#11が、蛍光強度の最高の中央値を示した。157の蛍光中央値(MFL値)が、CHO−GMRa#11(図6)に対して測定された。
細胞に加える前に、室温で30分間、FACSバッファ(PBS/3%FBS/NaN3 0.05%)内で、増加する濃度(0.1から100μg/ml)で抗体をビオチン化されたGM−CSF(0.5μg/ml)とともにコインキュベートした。
すべての染色は、ウェルあたり1−5×105細胞で96穴丸底マルチウェル培養皿(Nalge Nunc)内に実施された。2×10E5 CHO−GMRa#11細胞は、FACSバッファを含有する50μlの抗体/GM−CSF内に取り、1時間4℃でインキュベートされた。その後、細胞は、150μlのFACSバッファ/ウェルで1度洗浄され、FACSバッファ内で1:400に希釈したl00μ1のフィコエリトリンのラベル化されたストレプトアビジン(BD Biosciences Pharmingen)内に取った。4℃で1時間インキュベートした後、細胞は、FACSバッファで2度洗浄され、100μlのFACSバッファ内で再懸濁され、ビオチン結合GM−CSFは、FACScalibur(Becton Dickinson)内で、細胞のFL2蛍光強度を介して測定された。IC50値は、非線形回帰曲線に適用するGraphPad Prism v3.03ソフトウェアを使用して、取得した用量反応曲線から測定された。Fab 抗体MOR03682、MOR03684およびMOR03929は、GM−CSF受容体アルファを発現した細胞面へのGM−CSF結合の有意な抑制を示した。
A.Fabライブラリーおよびパニングの親和性成熟の発生
抗−GM−CSF Fabフラグメントの親和性および阻害活性を増加するために、クローンMOR03682、MOR03684およびMOR03929は、親和性成熟を受けた。この点について、CDR領域は、トリヌクレオチド定方向突然変異誘発(Virnekasら、1994;Nagyら、2002)を使用して、カセット式変異誘発により最適化された。配列分析は、分析された3つの親クローンのCDRの間で配列相同性を示さなかった。表2aおよび2bは、親クローンMOR03682、MOR03684およびMOR03929に対して、6つのCDRペプチド配列を提供する。
Fab最適化として使用されたプロトコルを以下に簡潔に説明する。発現ベクターpMORPH(R)X9Fab_FHからのFabフラグメントは、ファージミドベクターにクローンされた(US 6,753,136)。その後、2つの異なる方法は、親Fabの親和性および有効性を最適化するために適用された。
大腸菌溶解物(BEL抽出物)におけるGM−CSF結合Fab抗体を検出するために、基本的に実施例2Bに説明したBio VerisM−384SERIES(R)Workstation(Bio Veris Europe社、ウィットニー、オックスフォードシャー、英国)で結合を分析した。最も高いECL値を有するFabを精製して、溶解平衡滴定による親和性測定(SET;Haenelら、2005)および表面プラズモン共鳴(Biacore)を行った(実施例4D参照)。
さらなる親和性の改良のために、同じ親クローンに由来した成熟Fabからの単独で最適化されたH−CDR2およびL−CDR3を、この組み合わせがさらなる親和性を得る結果となる確率が高いので、組み合わせた(Yangら、1995;Schierら、1996;Chenら、1999)。改良した親和性を有するFabが、H−CDR2およびL−CDR3ライブラリーの両方から識別されるので、X−クローニングと呼ばれるこの手順を、親クローンMOR03929に由来した結合剤に適用した。軽鎖全体(XbaI/SphIフラグメント)をL−CDR3−最適化ドナークローンからH−CDR2−最適化受容体クローンに移転することによりこれを達成した。
KDの決定のために、Fabの単量体比(分析的SECによって分析された少なくとも90%の単量体含有量;Superdex75、Amersham Pharmacia)を使用した。
標準EDC−NHSアミン結合反応を利用して、10mM Na−酢酸塩pH4.5で、〜100RU組換えヒトGM−CSF(Peprotech)の密度でコーティングされたF1チップ(Biacore、スウェーデン)上で動力SPR分析をさらに実行した。基準のフローセルでそれぞれの量のHASを固定した。PBS(136mM NaCI,2.7mM KCI,10mM Na2HPO4,1.76mM KH2PO4 pH7.4)+0.005%Tween20を泳動用緩衝剤として使用した。6.3〜200nMの濃度シリーズにおいて20μl/分の流速でFabを適用した。会合相を60sに、
解離相を120s(親)または最大600s(親和性最適化)に設定した。長期にわたって解離相を監視するために、基本的にDrakeら、(2004)に従って以下の条件を使用した。200nMの単一濃度でFabを適用し、流速を100pl/分に、解離相を6000〜18.000sに設定した。これらのアッセイ条件下で決定した基準から外れた率に基づき、Fabの親和性を決定し、表4に示した。
ヒトGM−CSFの代わりに溶液中の検体としてラットGM−CSF(Peprotech)を使用して、基本的に実施例4Dに説明したようにラットGM−CSFに対する親和性の決定を行った。Haenelら(2005)に従って親和性を計算した。このアッセイでは、ラットGM−CSFに対するFab MOR04357の親和性はKD=1.0nMであると決定した。
A.GM−CSF受容体アルファ結合アッセイ
0.5μg/ml(35nM)のビオチン化GM−CSFを使用して、GM−CSF受容体結合アッセイを上述のように実行した(実施例3C)。CHO−GMRa#11細胞(0%抑制)に対するGM−CSFの最大結合を、抗体を加えることなく、0.5μg/mlのビオチン化GM−CSFの最終GM−CSF濃度で細胞をインキュベートすることにより測定した。GM−CSF結合の100%抑制を、アッセイからGM−CSFを除外することにより測定した。非線形回帰曲線適合を適用したGraph Pad Prism v3.03ソフトウェアを使用して得た用量反応曲線からIC50値を決定した。
改良した親和性を有するFab、親Fabおよび単クローン性対照IgGを分析した。表5は、これらのアッセイから得たIC50値を要約している。5μg/mlの抗体濃度で得た%抑制もまた、表5に示している。
実施例3Bに説明したようにTF−1増殖アッセイを実行した。単クローン性対照IgGと同様に、改良した親和性を有するFabおよび親Fabを分析した。非線形回帰曲線適合を適用したGraph Pad Prism v3.03ソフトウェアを使用して得た用量反応曲線からIC50値を決定した。表6は、これらのアッセイから得たIC50値を要約している。
表6:TF−1増殖アッセイにおける抗hGM−CSF Fabおよび対照IgGのIC50値
A.哺乳類の発現系における発現のためのFab DNA配列の遺伝子最適化
哺乳類遺伝子発現のためのMOR04357のVHおよびVLのDNAを最適化するために(例えば、コドン使用頻度の変更、GC含有量など)、Geneart(ドイツ、レーゲンスブルク)で遺伝子合成をして、pPCR−Scriptvectorsにクローン化し055906pPCR−Scriptおよび055907pPCR−Scripを得る、最適化VHおよびVLDNA配列などを定義するのに、Geneart(ドイツ、レーゲンスブルク)によるGene OptimizerTMソフトウェアを利用した。配列番号:48は、それぞれのVH配列を示すが、配列番号:57はそれぞれのVL配列を示す。
全長免疫グロブリン(Ig)を発現するために、遺伝子最適化重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変領域フラグメントをpPCR−Scriptベクター(実施例5a)からサブクローン化して、ヒトIgGIのためにpMORPH(R)2hIgベクターシリーズに変化させた。MOR04357のコドン最適化VHを、NheIlBIpI温浸を経て055906pPCR−Scriptから単離し、同じ制限酵素によりpMorph2_h_IgGlfマスターベクターカットに挿入した。このベクターはすでにヒトガンマ1定常領域を含んでいた。得られた発現核外遺伝子をpMorph2_h_IgGlfMOR04357_coと命名した。MOR04357のコドン最適化VLを、NhellHpaT温浸を経て055907pPCR−Scriptから単離し、同じ制限酵素によりpMorph2_h_Iglambda2マスターベクターカットに挿入した。このベクターはすでにヒトラムダ定常領域を含んでいた。得られた発現核外遺伝子をpM2_h_Iglambda2_MOR04357_coと命名した。
等モル量のIgG重鎖および軽鎖発現ベクターDNAにより、真核性のHKB11細胞に核酸を入れた。トランスフェクションの3日から7日後に細胞培養浮遊物を採取した。浮遊物のpHを8.0に調節および除菌後、溶液を標準タンパク質A親和性クロマトグラフィー(rProteinA FFまたはMabSelect SURE,GE Healthcare)にかけた。緩衝剤交換を1xDulbcecco'sPBS(pH7,2,インビトロジェン社)に実行し、試料を除菌した(0,2μm)。MOR04357IgGIを1xDulbcecco'sPBS(pH6,5,インビトロジェン社)に対して透析した。変性させている間に、SDS−PAGEでの条件を軽減して、またはAgilentBioAnalyzerを使用して、SE−HPLCによる自然な状態で、IgGの純度を分析した。
KDの決定のために、IgGIの単量体比(分析的SECによって分析された少なくとも90%の単量体含有量;Superdex75、AmershamPharmacia)を使用した。溶液およびデータ評価における電気化学発光(ECL)ベースの親和性の決定は、基本的にHaenelら、2005が説明しているように、また実施例4Bに説明しているように実行した。ヒト組換えGM−CSFに対するMOR04357IgGIのKD値は、1.1pMであると決定した。
ヒトGM−CSFの代わりに溶液中の検体としてラットGM−CSF(Peprotech)を使用して、基本的に実施例4Dに説明したようにラットGM−CSFに対する親和性の決定を行った。Haenelら(2005)に従って親和性を計算した。ラット組換え型GM−CSFに対するMOR04357IgGIのKD値は130pMであると決定した。
A.ヒトおよびアカゲザルGM−CSFを使用して、抗hGM−CSF IgGによるTF−1のGM−CSF依存増殖の抑制
実施例3Bに説明しているように、TF−1増殖アッセイを実行した。IgG1型でMOR04357を分析し、対照として単クローン性対照IgGを分析した。非線形回帰曲線適合を適用したGraph Pad Prism v3.03ソフトウェアを使用して得た用量反応曲線からIC50値を決定した。表8は、これらのアッセイから得たIC50値を要約している。まず第一に、0.25ng/mlの濃度で組換え型ヒトGM−CSFを大腸菌に生成し、第二に、組換えヒトGM−CSFを含み、pcDNA−huGM−CSFにより一時的に核酸を入れられたHEK293から浮遊物を培養し(実施例3A参照)、第三に、組換え型アカゲザル(アカゲザル)GM−CSFを含み、pcDNA−macGM−CSFにより一時的に核酸を入れられたHEK293細胞から浮遊物を培養する(実施例3A参照)。TF−1増殖アッセイについては、TF−1細胞が0.25ng/mlの確定濃度の大腸菌で生成した精製された組換えヒトGM−CSFで得られる増殖と比べて類似した増殖を示すような希釈で、それぞれのGM−CSFのソースとしてHEK293培養浮遊物を使用した。
Claims (5)
- ヒトGM−CSFに対して特異的な抗原結合領域より成る単離したヒトもしくはヒト化抗体またはその機能性フラグメントであって、前記単離したヒトもしくはヒト化抗体またはその機能性フラグメントは、(i)0.5μg/mlヒトGM−CSFの、約2×105CHO−K1細胞に発現する前記ヒトGM−CSF受容体のアルファ鎖との相互作用を、(a)前記CHO−K1細胞で発現する前記ヒトGM−CSF受容体アルファ鎖の前記濃度は、約2×105CHO−GMRa#11細胞に発現するヒトGM−CSF受容体アルファ鎖の前記濃度と類似している、および(b)前記単離したヒトもしくはヒト化抗体またはその機能性フラグメントの前記濃度は約5μg/mlである、という条件下で少なくとも50%ブロックでき、(ii)TF−1増殖アッセイで0.25ng/mlヒトGM−CSFを、対照抗体BVD2−21C11より少なくとも5倍低いIC50値で中和することができる、単離したヒトもしくはヒト化抗体またはその機能性フラグメントおよび医薬的に許容し得る担体またはその賦形剤を含む医薬組成物の有効量を必要としている被験者に投与するステップを含む、GM−CSFの望ましくない存在に関連する疾患または状態を治療する方法。
- 前記疾患または状態は炎症性疾患である、請求項1に記載の方法。
- 前記炎症性疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、乾癬、喘息、アトピー性皮膚炎およびショック状態のリストから選ばれる、請求項2に記載の方法。
- ヒトGM−CSFに対して特異的な抗原結合領域より成る単離したヒトもしくはヒト化抗体またはその機能性フラグメントであって、前記単離したヒトもしくはヒト化抗体またはその機能性フラグメントは、(i)0.5μg/mlヒトGM−CSFの、約2×105CHO−K1細胞に発現する前記ヒトGM−CSF受容体のアルファ鎖との相互作用を、(a)前記CHO−K1細胞で発現する前記ヒトGM−CSF受容体アルファ鎖の前記濃度は、約2×105CHO−GMRa#11細胞に発現するヒトGM−CSF受容体アルファ鎖の前記濃度と類似している、および(b)前記単離したヒトもしくはヒト化抗体またはその機能性フラグメントの前記濃度は約5μg/mlである、という条件下で少なくとも50%ブロックでき、(ii)TF−1増殖アッセイで0.25ng/mlヒトGM−CSFを、対照抗体BVD2−21C11より少なくとも5倍低いIC50値で中和することができる、単離したヒトもしくはヒト化抗体またはその機能性フラグメントであって、前記ヒト抗体は合成ヒト抗体である、前記抗体またはその機能性フラグメント。
- 前記CDR領域において少なくとも60パーセントの配列同一性を有する重鎖のアミノ酸配列を含み、前記CDR領域は配列番号:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51または52に表現される、ヒトGM−CSFに対して特異的な単離した抗原結合領域、または
前記CDR領域において少なくとも60パーセントの配列同一性を有する軽鎖のアミノ酸配列を含み、前記CDR領域は配列番号:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60または61に表現される、ヒトGM−CSFに対して特異的な単離した抗原結合領域
であって、前記配列同一性は少なくとも80パーセントである、前記の単離した抗原結合領域。
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