CN109219616A - Gm-csf抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抗GM‑CSF抗体或其片段，其包括人源化抗体和片段。本发明还提供了所述抗体和其片段用于疾病治疗、诊断和预后目的的用途。所述抗体和其片段的治疗用途包括例如治疗炎性和自身免疫性疾病和病症。

Description

GM-CSF抗体及其用途

背景技术

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF)，也称为集落刺激因子2(CSF2)，是巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、NK细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的单体糖蛋白，起细胞因子的作用。天然存在的GM-CSF的药物类似物也被称为沙格司亭和莫拉司亭。与特异性促进嗜中性粒细胞增殖和成熟的粒细胞集落刺激因子不同，GM-CSF影响更多的细胞类型，尤其是巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。

GM-CSF是一种具有细胞因子功能的单体糖蛋白。GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。单核细胞离开循环并迁移到组织中，然后它们成熟为巨噬细胞和树突状细胞。因此，其是免疫/炎症级联反应的一部分，通过这种级联反应，少量巨噬细胞的激活可以迅速导致其数量的增加，这是对抗感染至关重要的过程。GM-CSF也对免疫系统的成熟细胞具有一些作用。这些包括例如抑制嗜中性粒细胞迁移并引起在细胞表面表达的受体的改变。

GM-CSF通过信号转导子和转录激活子STAT5发出信号。在巨噬细胞中，它也被证明通过STAT3发出信号。细胞因子激活巨噬细胞以抑制真菌存活。它诱导细胞内游离锌的丧失，并增加活性氧的产生，最终导致真菌的锌饥饿和毒性。因此，GM-CSF有助于免疫系统的发育并促进对感染的防御。GM-CSF还通过作为生殖道产生的胚胎因子而在胚胎发育中起作用。

GM-CSF使用重组DNA技术生产，并作为被称作莫拉司亭的蛋白质治疗剂，或者当蛋白质在酵母细胞中表达时，其作为沙格司亭销售。它被作为刺激产生白血细胞的药物，从而预防化疗后的嗜中性粒细胞减少症。GM-CSF还在临床试验中，被评估了其作为HIV感染患者疫苗佐剂的潜力。

相反，GM-CSF的抑制可用于治疗疾病诸如炎性疾病和自身免疫性疾病，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎(OA)、多发性硬化症(MS)和斑块型银屑病。GM-CSF的抑制也可用于治疗癌症。

发明内容

本发明提供了抗GM-CSF抗体，所述抗GM-CSF抗体对人GM-CSF蛋白具有高结合的亲和力，并具有抑制GM-CSF与其受体结合的有效活性。这些抗GM-CSF抗体可用于治疗目的，例如治疗各种类型的炎症性疾病、自身免疫性疾病和癌症，也可用于诊断和预后的目的。

在一个实施例中，本发明提供了一种分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能够特异性结合人GM-CSF蛋白，并且包含如SEQ ID NO：1所示的VH CDR1、如SEQ ID NO：2所示的VH CDR2、如SEQ ID NO：3所示的VH CDR3、如SEQ ID NO：4所示的VL CDR1、如SEQ IDNO：5所示的VL CDR2和如SEQ ID NO：6所示的VL CDR3。在一些实施例中，抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其组合。在一些实施例中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施例中，抗体或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD其中一种同种型。在一些实施例中，同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施例中，抗体或其片段是一种嵌合抗体、一种人源化抗体或是一种全人源抗体。

在某一方面，抗体或其片段是一种人源化抗体。在一些实施例中，抗体或其片段是人源化抗体。在一些实施例中，抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包括一个或多个选自以下组的氨基酸残基及其组合，所述组由：

(a)第1位的Glu，

(b)第98位的Arg，

(c)第72位的Ser，

(d)第68位的Ala，

(e)第70位的Leu，

(f)第48位的Ile，

(g)第26位的Asp，和

(h)第29位的Leu组成；所述氨基酸残基根据Kabat编号。

在一些实施例中，重链可变区从第26位开始包括DYTLT片段(SEQ ID NO:42)或GYTFT片段(SEQ ID NO:43)，所述氨基酸残基根据Kabat编号。

在一些实施例中，抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包括一个或多个选自以下组的氨基酸残基及其组合，所述组由：

(a)第46位的Ala，

(b)第60位的Asp，

(c)第70位的Asp，

(d)第43位的Ser，和

(f)第87位的Phe组成；所述氨基酸残基根据Kabat编号。

在一些实施例中，抗体或其片段包含重链可变区，所述重链区包括选自由SEQ IDNO：8～17组成的组所示的氨基酸序列，或与选自由SEQ ID NO：8～17组成的组所示氨基酸序列具有至少90％序列同源性的肽。在一些实施例中，重链可变区包括如SEQ ID NO：11、14或17所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包括选自由SEQID NO：19～22组成的组所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：19～22所示氨基酸序列具有至少90％序列同源性的肽。在一些实施例中，轻链可变区包括如SEQ ID NO：19或22所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，重链可变区包括如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列以及轻链可变区包括如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其片段是双特异性抗体或单链可变片段。

在一个实施例中，本发明公开提供了分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段对人GM-CSF蛋白具有特异性，并且包括如SEQ ID NO：23所示的VH CDR1、如SEQ ID NO：24所示的VH CDR2，如SEQ ID NO：25所示的VH CDR3、如SEQ ID NO：26所示的VL CDR1、如SEQID NO：27所示的VL CDR2和如SEQ ID NO：28所示的VL CDR3。在一些实施例中，抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其组合。在一些实施例中，轻链恒定区是κ链或λ链恒定区。在一些实施例中，抗体或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的同种型。在一些实施例中，同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施例中，抗体或其片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。

在一些实施例中，抗体或其片段是人源化抗体。在一些实施例中，抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包括选自由E1、R84、Y27、I28、I48、T68、L70或T30组成的组的一个或多个氨基酸残基及其组合；所述氨基酸残基根据Kabat编号。

在一些实施例中，重链可变区开始包含GYIFT(SEQ ID NO：44)、GYIFS(SEQ ID NO：45)或GGTFS片段(SEQ ID NO：46)；所述片段从根据Kabat编号的第26位氨基酸残基开始。

在一些实施例中，抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含一个或多个选自由V48、D57、Q70或S43组成的组的氨基酸残基及其组合；所述氨基酸残基中根据Kabat编号。

在一些实施例中，抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包括选自由SEQID NO：29～35组成的组所示的氨基酸序列，或与选自由SEQ ID NO：29～35组成的组所示的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的肽。在一些实施例中，重链可变区包括如SEQ IDNO：34或35所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包括有SEQ IDNO：36～41组成的组所示的氨基酸序列，或与选自由SEQ ID NO：36～41组成的组所示的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的肽。在一些实施例中，轻链可变区包括如SEQ ID NO：38或39所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，重链可变区包括如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列和轻链可变区包括如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。在一些实施例中，重链可变区包括如SEQ IDNO：35所示的氨基酸序列和轻链可变区包括如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其片段是双特异性抗体或单链可变片段。

在一些实施例中提供了包含本发明公开的抗体或其片段的组合物和药学可接受的载体。此外，在一些实施例中还提供了一种分离的细胞，所述细胞包含编码本发明公开的抗体或其片段的一个或多个多核苷酸。

在一个实施例中，本发明公开提供了治疗有需求患者的炎性或自身免疫疾病或病症的方法，其包括向患者施用本发明公开的抗体或其片段或其组合物。本发明还提供了所述抗体或其片段或其组合物在制备用于治疗炎性或自身免疫性疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施例中，炎性疾病或病症包括阿尔茨海默病、艾迪生病、动脉粥样硬化、强直性脊柱炎、关节炎、骨关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎(PA)、强直性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)、克罗恩氏病、结肠炎、皮炎、憩室炎、纤维肌痛、肝炎、肠易激综合征(IBS)、系统性红斑狼疮(SLE)、肾炎、帕金森病(PD)、血管炎和溃疡性结肠炎。

在一个实施例中，还提供了一种减轻或缓解有需求患者的疼痛的方法，其包括向患者施用本发明公开的抗体或其片段。

在一些实施例中，自身免疫性疾病或病症包括斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、乳糜泻、自身免疫性幼年特发性关节炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、格林巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、自身免疫性心肌炎、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/系统性硬化症、干燥综合征红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性葡萄膜炎、白癜风和伴有多血管炎的肉芽肿病(Wegener's)。

本发明还提供了检测样品中GM-CSF的表达的方法，包括在使所述抗体或其片段与GM-CSF结合的条件下，使样品与抗体或其片段接触，并检测反映样品中GM-CSF表达的结合。

详细说明

定义

应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。

在本发明中，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得。它可能以包括化学合成的任何方式产生。

本发明中关于细胞、核酸所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA或RNA是指分别与存在于大分子的天然来源中的其它DNA或RNA所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。

在本发明中，术语“重组”涉及多肽或多核苷酸，意指天然不存在的多肽或多核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多核苷酸或多肽。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。

术语“不相关的”或“非同源的”序列表示与本发明公开的序列之一有小于40％的同一性，但优选小于25％的同一性。

多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列有具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用本领域已知的软件程序来确定该比对和同源性百分比或序列同一性，比如Ausubelet al.eds.(2007)在Current Protocols in Molecular Biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST。特别是程序是BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多核苷酸是具有上述指定百分比的同源性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多核苷酸。

术语“等价的核酸或多核苷酸”是指具有与核酸或其互补物的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物意指包括具有与其或其互补序列具有一定同源性的核苷酸序列的核酸。一方面，核酸的同源物能够与核酸或其互补物杂交。同样地，“等价的多肽”是指与参考多肽的氨基酸序列具有一定同源性或序列同一性的多肽。在某些方面，序列同一性为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些方面，与参考的多肽或多核苷酸相比，等价的多肽或多核苷酸具有1、2、3、4或5个添加、缺失、取代及其组合。在某些方面，等价的序列保留参考序列的活性(例如表位结合)或结构(例如盐桥)。

杂交反应可以在不同的“严谨性”条件下进行。通常在约40℃条件下，在约10×SSC或相同等离子强度/温度的溶液中进行低严谨的杂交反应。通常在约50℃条件下，在约6×SSC中进行中度严谨的杂交反应，通常在约60℃条件下，在约1×SSC中进行高度严谨的杂交反应。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。不受限制的生理条件的实施例通常指在同一个细胞中存在的温度、离子强度、pH和Mg²⁺浓度。

多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、和当多核苷酸是RNA时胸腺嘧啶置换为尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。术语“多态性”是指多于一种形式的基因或其一部分的共存，具有至少两种不同形式(即两种不同的核苷酸序列)的基因的一部分被称为“基因的多态性区域”。多态性区域可以是单核苷酸，在不同的等位基因中其具有不同的同一性。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。

术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，其编码序列可以从中推导出来。

在本发明中，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的含蛋白质或肽。包括但不局限的该实施例包括重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分。

在本发明中，术语“片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab’)₂、F(ab)₂、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。

“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。

术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等，已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。本领域普通技术人员容易想到这些种类和同种型中的每一种改变形式，因此都在本发明公开的保护范围内，所有的免疫球蛋白种类都显然在本发明公开的保护范围内，后面的讨论通常针对免疫球蛋白分子的IgG种类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链典型地通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”口开始并延续通过可变区包围重链。

本发明公开的抗体、抗原结合多肽、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长类化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段例如Fab、Fab'和F(ab')₂、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)，包含VK或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如本发明公开的LIGHT抗体的抗Id抗体)。本发明公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或者亚类。

轻链可以分为kappa或lambda(κ、λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤，B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。

轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能使用。就这点而言，应理解，轻链(Vκ)和重链(VH)链部分的可变区决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CK)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CK结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。

如上所述，可变区使得抗体能够选择性识别和特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VK结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集结合形成了限定三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由VH和VK链中各自的三个CDR定义(即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。在某些情况下，例如某些来源于骆驼科动物的免疫球蛋白分子或基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，没有轻链。例如参见Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)。

在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是特异性地定位以形成抗原结合结构域的短的、非连续的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“构架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。构架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。特定位置的CDR形成的抗原结合域界定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以容易地鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸，因为其已经被精确定义(参见“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)以及Chothiaand Lesk,J.MoI.Biol.,196:901-917(1987))。

在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括其所有的含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“CDR”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences ofProteins of Immunological Interest"(1983)和Chothia等在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过本发明引用其全部内容并入本文。

根据Kabat和Chothia定义的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR都在本发明所定义和使用的术语的范围内。包含以上引用的每个参考文献所定义的CDR的适量的氨基酸残基在下表中被列出进行比较。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可以常规地根据抗体的可变区氨基酸序列确定出哪些残基包含特定的CDR。

	Kabat	Chothia
			CDR-H1	31-35	26-32
CDR-H2	50-65	52-58
			CDR-H3	95-102	95-102
CDR-L1	24-34	26-32
			CDR-L2	50-56	50-52
CDR-L3	89-97	91-96

Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将该“Kabat编号”系统应用到任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。本发明所使用的“Kabat编号”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.ofHealth and Human Services在“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)中提出的编号系统。

除上述表格之外，Kabat编号系统如下述方式介绍CDR区：CDR-H1在大约第31个氨基酸(即第一个半胱氨酸残基之后的大约9个残基)开始，包括大约5-7个氨基酸，并在下一个色氨酸残基处结束。CDR-H2在CDR-H1结束后的第15个残基处开始，包括大约16-19个氨基酸残基，并在下一个精氨酸或赖氨酸残基处结束。CDR-H3从CDR-H2结束后的大约第33个氨基酸残基开始；包括3-25个氨基酸；并以序列W-G-X-G结束，其中X指任何氨基酸。CDR-L1大约从第24个残基开始(即在半胱氨酸残基之后)；包括约10-17个残基；并在下一个色氨酸残基处结束。CDR-L2从CDR-L1结束后的大约第16个残基开始，包括大约7个残基。CDR-L3在CDR-L2结束后的大约第33个残基(即在半胱氨酸残基之后)开始；包括大约7-11个残基并且以序列F或W-G-X-G结束，其中X指任何氨基酸。

本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、豚鼠源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施例中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。

在本发明中，术语“重链恒定区”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或变体或片段中的至少一种。例如，本发明公开的抗原结合多肽可以包括含有CH1结构域的多肽链、包含CH1结构域以及至少一部分铰链区以及CH2结构域的多肽链、包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链、包含CH1结构域、至少一部分铰链区以及CH3结构域的多肽链，或包含CH1结构域、至少一部分铰链区以及CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施例中，本发明公开的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。此外，本发明中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如全部或部分CH2结构域)。如上所述，本领域普通技术人员应当理解，重链恒定区可以被修饰从而使得它们天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列发生变化。

在本发明中，抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。

在本发明中，术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。

“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。

如上所述，各种免疫球蛋白种类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。在本发明中，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。CH1结构域与VH结构域相邻，并且是免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。

在本发明中，术语“CH2结构域”包括使用常规编号方案时，从抗体的约第244个残基延伸至第360个残基的部分重链分子(第244至360个残基，Kabat编号系统；第231-340个残基，EU编号系统；参见Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983))。CH2结构域是独特的，因为该结构域不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入两个N-连接的分支碳水化合物链。还有文献记载，CH3结构域从CH2结构域开始延伸到IgG分子的C-末端，大约包含108个残基。

在本发明中，术语“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的部分重链分子。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Rouxetal.,J.Immunol161:4083(1998))。

在本发明中，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸包含可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接的硫醇基团。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CK区通过二硫键连接，两条重链通过两个二硫键在Kabat编号系统中对应的位置239和242(位置226或229，EU编号系统)处相连接。

在本发明中，术语“嵌合抗体”被认为是指其免疫反应性区域或位点从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(在本发明中可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施例中，靶结合区或位点来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区是人源。

在本发明中，“人源化百分比”是通过测定人源化结构域与种系结构域之间的框架氨基酸差异(即非CDR区的差异)的数目，从氨基酸的总数中减去该数目，然后除以氨基酸总数乘以100计算而来。

“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间具有互补性。根据这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域与该表位结合时，比它结合到随机的、不相关的表位更容易，其被称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本发明中用于限定某种抗体与某个表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”比抗体“B”对特定表位具有更高的特异性，或者可以认为抗体“A”以比结合相关表位“D”更高的特异性结合表位“C”。

在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如自身免疫性疾病的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”通常指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家养动物、农场动物和动物园、运动或宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。

在本发明中，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”等短语包括从施用本发明公开的抗体或组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的受试者，例如哺乳动物受试者。

抗PD-L1抗体

本发明提供了对人GM-CSF蛋白具有高亲和力的抗GM-CSF抗体。被测抗体表现出有效的结合和抑制活性，并可用于治疗和诊断用途。除原始的鼠抗之外，人源化抗体还表现出对猕猴GM-CSF和人GM-CSF强亲和力的结合，其结合阻断了GM-CSF与GM-CSF受体α的结合，并阻断了GM-CSF诱导的pSTAT5的信号传导，以及抑制了GM-CSF依赖性的TF-1增殖。

根据本发明公开的一个实施例，提供了一种抗体，其包括重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域具有如序列SEQ ID NO：1～6或SEQ ID NO：23～28中所定义的CDR区，如下所示。

表1 a23F4的CDR区序列

名称	序列	SEQ ID NO:
			VH CDR1	SHYLH	1
VH CDR2	WIFPGDDKTKYNEKFKG	2
			VH CDR3	GTKYLNWNFDV	3
VL CDR1	KANQNVGTTLA	4
			VL CDR2	SASYRYS	5
VL CDR3	HQYTTYPLT	6

表1 b50C5的CDR区序列

名称	序列	SEQ ID NO:
			VH CDR1	PYSIH	23
VH CDR2	YINPSTGYIEYNQHFKD	24
			VH CDR3	GGDYEGYFDY	25
VL CDR1	RLNENIYSFLA	26
			VL CDR2	NAETLAE	27
VL CDR3	QQHYGTPYT	28

如实施例中的实验所示，含有这些CDR区的抗体，无论是小鼠、人源化还是嵌合体，都具有有效的结合和抑制GM-CSF的活性。在一些实施例中，本发明公开的抗GM-CSF抗体包含表1a和1b中列出的VH和VL的CDR，其一个、两个或三个可以被进一步修饰，这些修饰可以是氨基酸的添加、删除或取代。

在一些实施例中，所述修饰是在各个CDR中的至多一个残基进行取代。在一些实施例中，所述修饰是在一个、两个或三个这样的残基进行取代。在一个实施例中，所述修饰是在一个残基进行取代。在一些实施例中，这样的取代是保守取代。

“保守性氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸家族、包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选将免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基置换为来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基。在另一个实施例中，一串氨基酸可以用同一个侧链家族成员中顺序和/或组成不同的结构相似的一串氨基酸进行置换。

下表中提供了保守的氨基酸取代的非限制性实施例，其中0或更高的类似得分表明了两个氨基酸之间的保守的可取代性。

表2氨基酸相似性矩阵

	C	G	P	S	A	T	D	E	N	Q	H	K	R	V	M	I	L	F	Y	W
																					W	-8	-7	-6	-2	-6	-5	-7	-7	-4	-5	-3	-3	2	-6	-4	-5	-2	0	0	17
Y	0	-5	-5	-3	-3	-3	-4	-4	-2	-4	0	-4	-5	-2	-2	-1	-1	7	10
																					F	-4	-5	-5	-3	-4	-3	-6	-5	-4	-5	-2	-5	-4	-1	0	1	2	9
L	-6	-4	-3	-3	-2	-2	-4	-3	-3	-2	-2	-3	-3	2	4	2	6
																					I	-2	-3	-2	-1	-1	0	-2	-2	-2	-2	-2	-2	-2	4	2	5
M	-5	-3	-2	-2	-1	-1	-3	-2	0	-1	-2	0	0	2	6
																					V	-2	-1	-1	-1	0	0	-2	-2	-2	-2	-2	-2	-2	4
R	-4	-3	0	0	-2	-1	-1	-1	0	1	2	3	6
																					K	-5	-2	-1	0	-1	0	0	0	1	1	0	5
H	-3	-2	0	-1	-1	-1	1	1	2	3	6
																					Q	-5	-1	0	-1	0	-1	2	2	1	4
N	-4	0	-1	1	0	0	2	1	2
																					E	-5	0	-1	0	0	0	3	4
D	-5	1	-1	0	0	0	4
																					T	-2	0	0	1	1	3
A	-2	1	1	1	2
																					S	0	1	1	1
P	-3	-1	6
																					G	-3	5
C	12

表3保守的氨基酸取代

在一些实施例中，抗体或其片段包含至多一个、至多两个或至多三个上述取代。

在一些实施例中，抗体或其片段能够特异性结合人GM-CSF蛋白，并且包括如SEQID NO：1所示的VH CDR1、如SEQ ID NO：2所示的VH CDR2、如SEQ ID NO：3所示的VH CDR3、如SEQ ID NO：4所示的VL CDR1、如SEQ ID NO：5所示的VL CDR2和如SEQ ID NO：6所示的VLCDR3。VH序列的非限制性实例如SEQ ID NO：7～17所示，其中SEQ ID NO：7是小鼠VH序列，SEQ ID NO：8～17是人源化的VH序列。并且这些人源化VH包括对小鼠VH的一个或多个回复突变。同样地，VL(VK)的非限制性实例如SEQ ID NO：18～22所示，SEQ ID NO：18是小鼠序列，SEQ ID NO：19～22是人源化序列，其中SEQ ID NO：20～22包括一个或多个回复突变，如实施例中所示。

回复突变对于保留抗GM-CSF抗体的某些特性是有用的。因此，在一些实施例中，本发明公开的抗GM-CSF抗体，特别是全人源或人源化抗体，包括一个或多个回复突变。在一些实施例中，VH回复突变(即在指定位置包含的氨基酸)是一种或多种选自以下组的氨基酸残基及其组合，所述组由：(a)第1位的Glu(E1)，(b)第98位的Arg(R98)，(c)第72位的Ser(S72)，(d)第68位的Ala(A68)，(e)第70位的Leu(L70)，(f)第48位的Ile(I48)，(g)第26位的Asp(D26)，和(h)第29位的Leu(L29)组成；所述氨基酸残基根据Kabat编号。

在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变E1。在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变E1和R98。在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变E1和上述所列的另一种突变。在一些实施例中，人源化抗体包括至少VH的回复突变组(E1、R98和S72)，(E1、R98、S72和A68)，(E1、R98、S72、A68、L70和I48)，(E1、R98、S72、A68、L70、I48、D26和L29)，(E1和S72)，(E1、S72和L70)，(E1、S72、L70、I48和A68)，(E1、S72、L70、I48、A68、D26和L29)。

在一些实施例中，重链可变区包括在CDR1的N-末端，即从第26位氨基酸残基开始的DYTLT(SEQ ID NO:42)或GYTFT片段(SEQ ID NO:43)；所述氨基酸残基根据Kabat编号。在一个实施例中，重链可变区包含DYTLT(SEQ ID NO：42)。在一个实施例中，重链可变区包含GYTFT(SEQ ID NO：43)。

在一些实施例中，人源化抗体包括一个或多个回复突变。在一些实施例中，VL的回复突变是选自以下一种或多种氨基酸残基及其组合：(a)第46位的Ala(A46)，(b)第60位的Asp(D60)，(c)第70位的Asp(D70)，(d)第43位的Ser(S43)，和(f)第87位的Phe(F87)；所述氨基酸残基根据Kabat编号。

在一些实施例中，人源化抗体包括VL的回复突变A46、D60、D70、S43或F87中的至少两个、三个或4个突变。在一些实施例中，人源化抗体包含至少VL的回复突变A46。在一些实施例中，人源化抗体包括至少VL的回复突变A46和D60以及上述所列的另一种突变。在一些实施例中，人源化抗体包括至少VL的回复突变组(A46、D60和D70)或(A46、D60、D70、S43和F87)。

在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变(E1、R98、S72、A68、L70和I48)并且不包含VL的回复突变。在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变(E1、S72、L70、I48、A68、D26和L29)并且不包含VL的回复突变。在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变(E1和S72)和VL的回复突变(A46、D60、D70、S43和F87)。

在一些实施例中，本发明公开的抗GM-CSF抗体包含如SEQ ID NO：8～17所示的VH和如SEQ ID NO：19～22所示的VL，或其各自的生物学等价物。VH或VL的生物学等价物是包含指定氨基酸，同时具有总体80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同源性的序列。因此，SEQ ID NO：10序列的生物学等价物可以是与SEQ ID NO：10序列具有总体80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同源性但保留了其CDRs的序列(SEQ ID NO：1～3或其变体)，并且任选地保留一个或多个或所有的回复突变。

在一个实施例中，VH具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列并且VL具有如SEQ IDNO：19所示的氨基酸序列。在一个实施例中，VH具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列并且VL具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。在一个实施例中，VH具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列并且VL具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。值得注意的是，每一个所列举的序列也可以用它们的生物学等价物取代。

在一些实施例中，抗体或其片段对人GM-CSF蛋白具有特异性并且包含如SEQ IDNO：23所示的VH CDR1，如SEQ ID NO：24所示的VH CDR2，如SEQ ID NO：24所示的VH CDR3：25，如SEQ ID NO：26所示的VL CDR1，如SEQ ID NO：27所示的VL CDR2和如SEQ ID NO：28所示的VL CDR3。VH的非限制性实例如序列SEQ ID NO：29～35所示，其中SEQ ID NO：29是小鼠VH序列，SEQ ID NO：30～35是人源化的VH序列。并且这些人源化VH包括对小鼠VH的一个或多个回复突变。同样地，VL(VK)的非限制性实例如序列SEQ ID NO：36～41所示，其中SEQ IDNO：36是小鼠VH序列，SEQ ID NO：37～41是人源化的VH序列，其中SEQ ID NO：38～41包括一个或多个回复突变，如实施例所示。

回复突变可用于保留抗GM-CSF抗体的某些特征。因此在一些实施例中，本发明公开的抗GM-CSF抗体，特别是全人源或人源化的抗体，包括一个或多个回复突变。在一些实施例中，VH回复突变(即包括在指定位置处的氨基酸)选自E1、R84、Y27、I28、I48、T68、L70或T30中一个或多个氨基酸残基及其组合；所述氨基酸残基根据Kabat编号。

在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变E1。在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变E1和R84。在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变E1和上述所列的另一种突变。在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变组合(E1)，(E1、R84)，(E1、R84、Y27和I28)，(E1、R84、Y27、I28和I48)，(E1、R84、Y27、I28、I48、T68和L70)或(E1、R84、Y27、I28、I48、T68、L70和T30)。

在一些实施例中，重链可变区在CDR1的N-末端，即从根据Kabat编号的第26位开始包含GYIFT(SEQ ID NO:44)、GYIFS(SEQ ID NO:45)或GGTFS片段(SEQ ID NO:46)。在一个实施例中，重链可变区包含GYIFT(SEQ ID NO：44)。在一个实施例中，重链可变区包含GYIFS(SEQ ID NO：45)。在一个实施例中，重链可变区包含GGTFS(SEQ ID NO：46)。

在一些实施例中，人源化抗体包括一个或多个回复突变。在一些实施例中，VL的回复突变选自V48、D57、Q70或S43中的一个或多个氨基酸残基及其组合；所述氨基酸残基根据Kabat编号。

在一些实施例中，人源化抗体包括VL的回复突变V48、D57、Q70或S43中的至少两个、三个或四个。在一些实施例中，人源化抗体至少包括VL的回复突变V48。在一些实施例中，人源化抗体包括至少VL的回复突变V48和D57和上述所列的另一种突变。在一些实施例中，人源化抗体至少包括VL的回复突变组合(V48)，(V48和D57)，(V48、D57和Q70)或(V48、D57、Q70和S43)。

在一些实施例中，人源化抗体包括至少VH的回复突变(E1、R84、Y27、I28、I48、T68和L70)和VL的回复突变V48。在一些实施例中，人源化抗体至少包括VH的回复突变(E1、R84、Y27、I28、I48、T68、L70和T30)和VL的回复突变(V48和D57)。

在一些实施例中，本发明公开的抗GM-CSF抗体包含如SEQ ID NO：30～35所示的VH、如SEQ ID NO：37～41所示的VL，或其各自的生物学等价物。VH或VL的生物学等价物是包含指定氨基酸的序列，同时具有总体80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。因此，序列SEQ ID NO：35的生物学等价物质可以是与SEQ ID NO：35具有总体80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的VH，但保留CDRs(序列SEQ ID NO：23～25或其变体)，并且选择性地保留一个或多个或所有的回复突变。

在一个实施例中，VH具有如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，VL具有如SEQ IDNO：38所示的氨基酸序列。在一个实施例中，VH具有如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列，VL具有如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列。值得注意的是，每一个所列举的序列也可以用它们的生物学等价物取代。

本领域普通技术人员还应当理解，本发明所公开的抗体是可以被修饰的，修饰后其氨基酸序列不同于衍生出该抗体的天然存在的结合多肽的氨基酸序列。例如，衍生自同一指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可以是与起始序列相似的，例如具有一定的百分比同一性，例如它可以与起始序列的百分比同一性是60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。

在一些实施例中，本公开的抗体和其片段可以是单特异性或双特异性抗体或片段。对于双特异性抗体，另一个特异性可以针对GM-CSF的不同目标表位或可用于特定用途(例如治疗用途)的不同靶蛋白。一方面，所述靶蛋白是s细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1和IL-17。另一方面，所述靶蛋白是趋化因子，如CCL2、CXCL12和CXCL13。另一方面，所述靶蛋白是细胞表面蛋白，如CD3、CSF-1R、CD20和CD73。

在某些实施例中，抗体包含氨基酸序列或一个或多个通常与抗体无关的基团。下面更详细地描述了示例性修饰。例如，本发明公开的抗体可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性部分(例如PEG、药物、毒素或标签)。

本发明公开的抗体、变体或衍生物包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体可以通过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等进行修饰。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，抗体可以含有一个或多个非经典的氨基酸。

在一些实施例中，抗体可以通过缀合或其他方式连接至另一个分子以形成双功能分子。第二个分子可以是治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或PEG的其中一种。一些非限制性实施例所述第二个分子是细胞因子或其他可溶性因子，例如IL-10、IL-25、IL-27、IL-33、IL-35和IL-36。在一些实施例中还提供了包含本发明公开的抗体或片段和小分子药物的抗体-药物缀合物。

抗体可以与治疗剂缀合或融合，所述治疗剂可包括可检测标记如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂或诊断剂、可以是药物或毒素的细胞毒性剂、超声增强剂、非放射性标记物及其组合，和本领域已知的其它此类试剂。

抗体可以通过将其偶联至化学发光化合物而可被检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光，来确定化学发光标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯(theromatic acridiniumester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

抗体还可以使用荧光发射金属元素例如¹⁵²Eu或其它镧系元素来可检测地标记。这些金属元素可以使用如二乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)这样的金属螯合基团连接到抗体上。用于将各种基团缀合至抗体的技术是众所周知的，参见例如Arnon etal.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.(1985)、Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery”,inControlled Drug Delivery (2nd Ed.)、Robinson et al.,(eds.),Marcel Dekker,Inc.,pp.623-53(1987)、Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:A Review”,in Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications、Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)、“Analysis,Results,AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”,in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwin etal.(eds.),Academic Press pp.303-16(1985)和Thorpe et al.,“The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”,Immunol.Rev.(52:119-58(1982))。

编码抗体的多核苷酸和制备抗体的方法

本发明还公开了编码本发明所述抗体、变体及其衍生物的分离的多核苷酸或核酸分子。本发明公开的多核苷酸可以编码在同一多核苷酸分子上或在不同的多核苷酸分子上的抗原结合多肽、变体或衍生物的整个重链和轻链可变区。此外，本发明公开的多核苷酸可以编码在相同的多核苷酸分子上或在不同的多聚核苷酸分子上的抗原结合多肽、变体或衍生物的部分重链和轻链可变区。

制备抗体的方法是本领域公知的并且在本发明中有所描述。在某些实施例中，本发明公开的抗原结合多肽的可变区和恒定区都是全人源的。可以使用本领域中公开的技术和本发明所述的技术制备全人源抗体。例如，针对特定抗原的全人源抗体可以通过将抗原施用于转基因动物中来制备，所述转基因动物已经被改良过以响应抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已被禁用。可用于制备这种抗体的示例性技术参见美国专利6,150,584、6,458,592、6,420,140，其全部内容通过引用并入本文。

在某些实施例中，制备的抗体不会在待治疗的动物、例如人类中引起有害的免疫应答。在一个实施例中，本发明公开的抗原结合多肽、变体或衍生物使用本领域公认技术修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以被人源化、灵长类化、去免疫化或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低。其可以通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人源的可变区移植到人源的恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分移植到人源的框架和恒定区中，保留或不保留关键的框架残基；或(c)移植整个非人源的可变区，但通过用类人源的部分置换表面残基从而“隐藏”它们。此类方法参见Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57:6851-6855(1984)、Morrison etal.,Adv.Immunol.44:65-92(1988)、Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536(1988)、Padlan,Molec.Immun.25:489-498(1991)、Padlan,Molec.Immun.31:169-217(1994)和美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,190,370，其全部内容通过引用并入本文。

去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。在本发明中，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如国际申请公开号：WO/9852976 A1和WO/0034317 A2)。例如，分析来自起始抗体的可变重链和可变轻链的序列，并产生来自每个V区的人T细胞表位“图谱”，其显示表位相对于互补决定区(CDRs)和序列内其它关键残基的位置。分析来自T细胞表位图的单个T细胞表位，以鉴定具有较低风险改变最终抗体活性的可选择的氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列可选的可变重链和可变轻链序列，随后将这些序列掺入到一系列结合多肽中。典型地，产生12至24种抗体的变体，并检测其结合能力和/或功能。然后将包含修饰过的可变区和人类恒定区的完整重链和轻链的基因克隆到表达载体中，随后将质粒转入细胞系以产生完整的抗体。然后利用合适的生物化学和生物学实验中比较抗体，鉴定出最佳的变体。

本发明公开的抗原结合多肽的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、放射免疫实验(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测。

可选地，用于生产单链单元的技术(美国专利号4,694,778、Bird,Science242:423-442(1988)、Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55:5879-5883(1988)和Wardet al.,Nature 334:544-554(1989))可适用于生产本发明公开的单链单元。通过经由氨基酸桥接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.,Science 242:1038-1041(1988))。

可用于生产单链Fv(scFv)和抗体的技术的实例如美国专利4,946,778和5,258,498，以及Huston et al.,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)、Shu et al.,Proc.Natl.Sci.USA 90:1995-1999(1993)和Skerra et al.,Science 240:1038-1040(1988)中所述。对于包括在人体内使用抗体和体外检测实验的某些用途，可以优选使用嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的一类分子，例如具有鼠源单克隆抗体的可变区和人源免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见Morrison,Science 229:1202(1985)、Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986)、Gillies et al.,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)和美国专利5,807,715、4,816,567和4,816397，其全部内容通过引用并入本文。

人源化抗体是能够结合目标抗原的非人源抗体衍生的抗体分子，所述目标抗原具有非人源的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。通常人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，优选能够改善抗原结合的残基。这些框架取代可以通过本领域公知的方法鉴定，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合起重要作用的框架残基和通过序列对比以鉴定特定位置上异常的框架残基。(参考Queen et al.,美国专利号5,585,089、Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)，其全部内容通过引用并入本文)。可以使用本领域公知的多种技术使抗体人源化，例如CDR移植(EP 239,400、PCT公布文本WO 91/09967、美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)，修复或者表面重排(EP 592,106、EP 519,596、Padlan,Molecular Immunology28(4/5):489-498(1991)、Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)、Roguska.et al.,Proc.Natl.Sci.USA 91:969-973(1994))，以及链的重排(U.S.Pat.No.5,565,332)，其全部内容通过引用并入本文。

对于治疗人类患者来说，全人源抗体是特别理想的。全人源抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自人免疫球蛋白序列的抗体文库进行的噬菌体展示方法。也可参考美国专利4,444,887和4,716,111，以及PCT公布文本WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，每个专利其全部内容通过引用并入本文。

还可以转基因小鼠来生产人源抗体，所述小鼠不能表达功能性内源性免疫球蛋白但能表达人类免疫球蛋白基因。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机引入或通过同源重组引入到小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人的可变区、恒定区和多样性区域引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链的免疫球蛋白基因可以通过同源重组分别或同时通过引入人免疫球蛋白基因座而丧失功能。特别地，JH区域的纯合缺失可以防止内源抗体的产生。将修饰过的胚胎干细胞扩增并显微注射进囊胚中以产生嵌合小鼠。然后培育嵌合小鼠以产生表达人源抗体的纯合后代。用选择出的抗原例如全部或部分期望的多肽靶点以常规方式免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得靶向抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术可以产生可用于治疗的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于这种生产全人源抗体的技术相关综述，可以参见Lonberg and Huszar Int.Rev.Immunol.73:65-93(1995)。关于生产全人源抗体和人单克隆抗体的该技术的详细讨论和生产这种抗体的步骤，本发明全部参见PCT公布文本WO 98/24893、WO 96/34096、WO 96/33735，以及美国专利5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，其全部内容通过引用并入本文。此外，诸如Abgenix(Freemont,Calif.)和GenPharm(San Jose,Calif.)之类的公司，可以使用上述类似技术提供针对所选抗原的全人源抗体。

也可以使用被称为“引导选择”的技术来生产识别选择性表位的全人源抗体。在该方法中使用选择的非人单克隆抗体、例如小鼠抗体来引导识别相同表位的全人源抗体的筛选。(参见Jespers et al.,Bio/Technology 72:899-903(1988)以及美国专利5,565,332，其全部内容通过引用并入本文)。

在另一个实施例中，使用常规方法(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以容易地分离编码所需单克隆抗体的DNA并对其进行测序。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离出来，DNA可以被置于表达载体中，然后被转染到原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中。更特别地，分离的DNA(如本文所述可以是合成的)可用于克隆用于制备抗体的恒定区和可变区的序列，如本发明引用的Newman et al和公布于1995年1月25日的美国专利5,658,570中所述，其全部内容通过引用并入本文。实质上，这需要从所选细胞中提取RNA并转化成cDNA，然后使用1g特异性引物通过PCR技术进行扩增。适于此目的的合适的探针在美国专利5,658,570中也有所提及。如下面将更详细地讨论的，可以相对大批量培养表达所需抗体的转化细胞以提供免疫球蛋白的临床和商业需求。

此外，使用常规重组DNA技术可将本发明的抗原结合多肽的一个或多个CDR插入框架区，例如插入到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，并且优选人类框架区(参见Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。优选地，用框架区和CDR组合产生的多核苷酸编码与所需多肽(例如LIGHT)的至少一个表位特异性结合的抗体。优选地，在框架区内进行一个或多个氨基酸取代，并且优选能够提高抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与到链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。

此外，还开发了用于生产“嵌合抗体”的技术(Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA:851-855(1984)、Neuberger et al.,Nature 372:604-608(1984)、Takeda et al.,Nature 314:452-454(1985))，其通过剪接来自鼠抗分子、具有合适抗原特异性的基因，以及可以使用的来自具有合适生物学活性的人抗分子的基因。在本发明中，嵌合抗体是其不同部分来源于不同动物物种的分子，例如那些含有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体。

此外，在Newman,Biotechnology 10:1455-1460(1992)中公开了另一种生产重组抗体的高效方法，特别地，该技术能产生含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类抗体，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，该技术也在共同转让的美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中有所提及，上述每种专利的全部内容通过引用并入本文。

或者，可以使用本领域技术人员公知的技术选择和培养生产抗体的细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述。在这方面，下文描述的适合本发明使用的技术参考Current Protocols in Immunology,Coligan et al.,Eds.,GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley and Sons,New York(1991)有所提及，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。

此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明所述抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变。优选地，变体(包括衍生物)编码相对于参考的重链可变区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链可变区CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的取代、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、小于5个氨基酸的取代、小于4个氨基酸的取代、小于3个氨基酸的取代或小于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列时随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。

治疗方法和用途

在本发明中，本发明的抗体、变体或衍生物可用于某些治疗和诊断方法中。

本发明将进一步描述基于抗体的疗法，将本发明所述的抗体施用于患者例如动物、哺乳动物和人体内，从而治疗本文所述的一种或多种紊乱或病症。本发明的治疗性化合物包括但不限于本发明所述抗体(包括本发明所述的变体和衍生物)和编码本发明所述抗体(包括本发明所述的变体和衍生物)的核酸或多核苷酸。

在一些实施例中，本发明公开的抗体和其片段可用于制造用于治疗炎性或自身免疫性疾病或病症或癌症的药物。本发明公开的抗体和其片段还被确信可用于治疗疼痛或疼痛本身的潜在机制。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)最初是由其能够从骨髓前体产生粒细胞和巨噬细胞集落而被得知的。它也被证明对成熟的骨髓细胞有促存活、活化和分化因子的作用。近期的研究表明，GM-CSF也具有许多促炎症的功能，并在自身免疫性疾病和炎性疾病的发展中起关键作用。

GM-CSF促进巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的存活和活化，以及树突细胞(DC)的成熟。GM-CSF可将巨噬细胞极化为M1型炎性巨噬细胞，其产生多种炎性细胞因子如TNF、IL-6、IL-12p70、IL-23或IL-1β，从而促进Th1-Th17应答。另一方面，在过敏性气道炎症中也报道了GM-CSF和Th2免疫的关联性。

GM-CSF受体由以低亲和力结合GM-CSF的α亚基(GMRα)和与IL-3和IL-5受体共有的信号转导βc-亚基组成。GM-CSF和GMRα的二元复合物与游离的βc亚基相互作用，形成高亲和力的六聚体复合物。由两个六聚体复合物侧向聚集形成十二聚体复合物，从而使得与βc亚基相关的Jak2能够二聚化并转磷酸化，但六聚体复合物无此功能。这种结构导致了GM-CSF受体激活的剂量依赖性应答。正常情况下，低浓度的GM-CSF引起βcSer585磷酸化并激活14-3-3/PI-3激酶途径，这仅导致细胞存活。如在炎症条件下，更高浓度的GM-CSF关闭βcSer585磷酸化并介导βcTyr577磷酸化和激活Jak2/STAT5途径、Ras/丝裂原活化蛋白激酶途径和PI-3激酶途径，从而促进细胞存活、增殖和活化。

各种细胞可以产生GM-CSF。GM-CSF的主要来源是T细胞和B细胞、单核细胞/巨噬细胞内皮细胞和成纤维细胞。嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、上皮细胞、间皮细胞、潘氏(Paneth)细胞、软骨细胞和肿瘤细胞也可以产生GM-CSF。GM-CSF的产生受多种因素刺激，包括TNF、IL-1、toll样受体激动剂和前列腺素E2。近来，产生GM-CSF的CD4T细胞在自身免疫性疾病和炎性疾病中的致病机理变得明朗化，并受到越来越多的关注。

最近的证据显示GM-CSF在许多自身免疫性疾病的发展中起关键作用。GM-CSF的耗竭或中和能够抑制许多自身免疫性疾病模型，包括实验性的自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、关节炎、关节炎相关性间质性肺病、肾炎或牛皮癣。抑制GM-CSF还被认为可用于治疗癌症。

在一些实施例中，本发明公开的抗体、片段及其组合物治疗的炎性疾病或病症包括阿尔茨海默病、艾迪生病、动脉粥样硬化、强直性脊柱炎、关节炎、骨关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎(PA)、强直性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)、克罗恩氏病、结肠炎、皮炎、憩室炎、纤维肌痛、肝炎、肠易激综合征(IBS)、系统性红斑狼疮(SLE)、肾炎、帕金森病(PD)、血管炎和溃疡性结肠炎中的一种或多种。

在一些实施例中，本发明公开的抗体、片段及其组合物治疗的自身免疫性疾病或病症包括斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、乳糜泻、自身免疫性幼年特发性关节炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、格林巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、自身免疫性心肌炎、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/系统性硬化症、干燥综合征(syndrome)、红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性葡萄膜炎、白癜风和伴有多血管炎的肉芽肿病(Wegener's)中的一种或多种。

类风湿性关节炎(RA)是主要影响关节的长期自身免疫性病症。它通常会导致关节温热、肿胀和疼痛。休息后疼痛和僵硬往往恶化。最常见的情况涉及腕部和手部，通常在身体两侧涉及相同的关节。该疾病也可能影响身体的其他部位。虽然引起类风湿性关节炎的原因尚不清楚，但据信其涉及遗传和环境综合的因素。潜在的机制涉及身体的免疫系统攻击关节，从而导致关节囊的炎症和增厚。治疗类风湿性关节炎的目的是减轻疼痛、减少炎症并改善人的整体功能。止痛药、类固醇和NSAID经常用于症状的缓解。一组被称为疾病修饰抗风湿药物(DMARDs)，如羟氯喹和甲氨蝶呤，可以用来减缓疾病的进程。

骨关节炎(OA)是一种关节疾病，其由关节软骨和在其下面的骨头的破坏引起。最常见的症状是关节疼痛和僵硬。最初，可能仅在运动后出现症状，但随着时间的推移症状可能会持续出现。其他一些可能的症状包括关节肿胀、活动范围减小，以及背部受到影响时手臂和腿部无力或麻木。原因包括既往的关节损伤、关节或肢体发育异常以及遗传因素。那些体重超重、腿长不同，以及工作导致高度关节压力的人患病风险更大。骨关节炎被认为是由关节的机械应力和低度炎症过程引起的。治疗包括锻炼、尽量减轻关节压力、互助小组和止痛药物。

多发性硬化症(MS)是一种脱髓鞘疾病，其中脑和脊髓中的神经细胞的绝缘盖被损坏。这种损坏破坏了部分神经系统的传达能力，导致一系列的症状和体征，包括身体、心理甚至精神方面的问题。具体的症状包括视力重影、一只眼睛失明、肌肉无力、感知困难或协调困难。虽然原因尚不清楚，但其潜在的发病机制被认为是免疫系统的破坏或髓鞘生成细胞的故障。多发性硬化症的治疗尚无已知方法。治疗试图改善在疾病发作后的相应功能并防止新的发作。

哮喘是一种常见的肺部呼吸道长期炎性疾病。它的特征是可变的和反复发作的症状、可逆的气流阻塞和支气管痉挛。症状包括喘息、咳嗽、胸闷和气短。哮喘被认为是由遗传和环境因素共同造成的。环境因素包括暴露于空气污染和过敏原。根据症状的发生频率、一秒用力呼气量(FEV1)和呼气峰值流速可对哮喘进行分类。其也可以分类成特应性或非特应性，其中特应性是指倾向于发展为1型超敏反应。目前没有治愈哮喘的方法。可以通过避免触发，如过敏原和刺激物，以及使用吸入性皮质类固醇来预防症状。如果哮喘症状仍不受控制，则除了吸入皮质类固醇外，还可以使用长效β受体激动剂(LABA)或抗白三烯药物。迅速恶化的症状通常是通过吸入短效β-2激动剂，如沙丁胺醇和口服皮质类固醇进行治疗。在非常严重的情况下，可能需要静脉注射皮质类固醇、硫酸镁以及住院治疗。

慢性阻塞性肺病(COPD)是一种以长期气流受限为特征的阻塞性肺病。COPD可以包括两种主要症状，即肺气肿和慢性支气管炎。在肺气肿中，许多气囊之间的囊壁被破坏。结果导致气囊失去了其原有形状并变得松软。这种破坏还会损坏气囊的壁，导致数量更少体积更大的气囊替代原先许多的小气囊。如果发生此类情况，肺部的气体交换量就会减少。在慢性支气管炎中，气道的内层始终处于刺激和发炎状态，这会导致内层的肿胀。气道中会形成很多粘稠的粘液，从而使呼吸困难。目前尚无已知的治愈COPD的方法，但是其症状是可治疗的，并能延迟其疾病进程。

疼痛是一种痛苦的感觉，通常由强烈的或破坏性的刺激而引起，例如碰伤脚趾、烧伤手指、酒精置于伤口上或撞击肘关节突出的那块骨头。疼痛是一种复杂的主观现象，疼痛的定义一直是一个挑战。疼痛也被认为是与实际或潜在的组织损伤相关的不愉快的感觉和情绪体验。疼痛有时被认为是潜在疾病的症状，如炎症。

在一些实施例中，提供了用于治疗有需要的患者的癌症的方法。在一个实施例中，所述方法需要向患者施用有效量的本发明公开的抗体。

癌症的非限制性实例包括膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌，子宫内膜癌、食管癌、头颈癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。

可以用本发明所述抗体或变体或其衍生物来治疗、预防、诊断和/或预测的、与细胞存活增加相关的其他疾病或病症，包括但不限于恶性肿瘤和/或相关疾病的进程或转移，所述疾病例如白血病{包括急性白血病[例如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病(包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、粒单核细胞性、单核细胞性和红白血病)]和慢性白血病[例如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病]}、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病，以及实体瘤包括但不限于肉瘤和癌症如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所使用的特定抗体及其变体或衍生物、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及期望的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。

抗体及其变体的施用方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬脊膜外和口服注射。抗原结合多肽或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜衬里(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明的抗原结合多肽的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾。

本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。

施用方式可以是全身施用或局部施用。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管连接到如贮液囊(可以是Ommaya贮液囊)来辅助注射。也可以通过肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及使用雾化剂的制剂。

可能需要将本发明的抗原结合多肽或组合物局部施用于需要治疗的区域；可以通过但不限于以下方式实现：手术期间局部输注，例如与手术后伤口敷料联合的局部应用，通过注射，通过导管，借助栓剂或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜例如硅橡胶膜，或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。

在另一个实施例中，抗原结合多肽或组合物可以递送到囊泡，特别是脂质体中(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533、Treat et al.,in Liposo mes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,NewYork,pp.353-365(1989)、Lopez-Berestein,同上,pp.317-327；参见同上)

在其他实施例中，还可以在控释系统中递送抗原结合多肽或组合物。在一个实施例中，可以施用泵(参见Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201、Buchwald etal.,1980,Surgery 88:507、Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施例中，可以使用聚合物材料(参见Medical Applications of Controlled Release,Langerand Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)、Controlled DrugBioavailability,Drug Prod uct Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)、Ranger and Peppas,J.,1983,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61、另见Levy et al.,1985,Science 228:190、During et al.,1989,Ann.Neurol.25:351、Howard et al.,1989,J.Neurosurg.71:105)。在另一个实施方案中，还可以将控释系统放置在治疗靶位(即大脑)的附近，因此仅需要全身剂量的一部分剂量(参见例如Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。其他控释系统在Langer的综述(1990,Science 249:1527-1533)中进行了讨论。

在一具体实施例中，本发明组合物包含编码蛋白质的核酸或多核苷酸，可以通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分，来体内施用所述核酸以促进其编码的蛋白质的表达，然后通过下述方式施用上述部分载体使其变为胞内部分，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或者通过与已知进入细胞核的同源异型盒类肽连接施用(参见例如Joliot et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.US A88:1864-1868)等等。可选地，核酸可以通过同源重组在引入细胞内并整合至宿主细胞DNA中用于表达。

可以通过标准的临床技术确定本发明抗体的剂量，该剂量将有效治疗、抑制和预防炎症、免疫或恶性疾病、紊乱或病症。此外，可以任选地采用体外实验来帮助确定最佳剂量范围。制剂使用的准确剂量也取决于给药途径和疾病、紊乱或病症的严重程度，且应根据医师的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统得到的剂量反应曲线推测出来。

作为一般建议，本发明的抗原结合多肽施用于患者的剂量通常为0.1mg至100mg/每kg患者体重，0.1mg至20mg/每kg病人的体重，或1mg到10mg/每kg病人的体重。通常，由于对外源多肽的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期比其他物种的抗体长。因此，较低剂量的人抗体和较少的给药频率通常是可行的。此外，可以通过例如脂质化等修饰来增强抗体摄取和组织穿透能力(例如进入脑内)，从而减少本发明抗体的施用的剂量和频率。

通常在进行体外测试用于治疗感染性或恶性疾病、紊乱或病症的方法，包括施用本发明所述抗体、变体或衍生物，然后在可接受的动物模型中体内测试期望的治疗性或预防性活性，最后施用于人体。合适的动物模型(包括转基因动物)是本领域普通技术人员所公知的。例如，用于证明本发明所述抗原结合多肽的治疗用途的体外测定包括抗原结合多肽对细胞系或患者组织样品的影响。抗原结合多肽对细胞系和/或组织样品的作用可以利用本领域技术人员已知的技术进行检测，例如本发明其他部分公开的技术。根据本发明的内容，可用于确定是否施用特异性抗原结合多肽的体外测定实验包括体外细胞培养实验，其中患者组织样品在培养物中培养，并暴露于或以其他方式施用化合物，并观察这种化合物对组织样品的影响。

各种递送系统是已知的，并且可用于施用本发明抗体或编码本发明抗体的多核苷酸时，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu and Wu,1987,J.Biol.Ch em.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。

在另一个实施例中，本发明公开的组合物与抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗菌剂或抗生素剂或抗真菌剂组合施用。本领域任何已知的这些药剂可以在本发明公开的组合物中施用。

在另一个实施例中，本发明的组合物与化疗剂组合施用。可与本发明组合物一起施用的化疗剂包括但不限于抗生素衍生物(例如阿霉素、博来霉素、柔红霉素和放线菌素D)、抗雌激素药(如他莫昔芬)、抗代谢物(如氟尿嘧啶、5-FU、甲氨蝶呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、光神霉素，巯基嘌呤和6-硫基鸟嘌呤)、细胞毒性剂(如卡莫司汀、BCNU、洛莫司汀、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)、激素(如甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠、炔雌醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲睾酮、己烯雌酚二磷酸、氯烯雌醚和睾内酯)、氮芥衍生物(例美法仑、苯丁酸氮芥、二氯甲基二乙铵(氮芥)和噻替哌)、类固醇及其组合(如倍他米松磷酸钠)，以及其它化合物(如氮烯唑胺、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱和依托泊苷)。

联合组合物和疗法

在一些实施例中，本发明公开的抗GM-CSF抗体可以与另一种治疗剂一起使用。

在一些实施例中，第二种治疗剂是抗炎剂。其非限制性实例包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、塞来昔布(Celebrex)、吡罗昔康(Feldene)、吲哚美辛(Indocin)、美洛昔康(Mobic Vivlodex)、酮洛芬(Orudis，Ketoprofen ER，Oruvail，Actron)、舒林酸(Clinoril)、二氟尼柳(Dolobid)、萘丁美酮(Relafen)、奥沙普秦(Daypro)、托美丁(Tolmetin Sodium，Tolectin)、双水杨酯(Disalcid)、依托度酸(Lodine)、非诺洛芬(Nalfon)、氟比洛芬(Ansaid)、酮咯酸(Toradol)、甲氯芬那酸钠盐和甲芬那酸(Ponstel)。

在一些实施例中，第二种治疗剂适用于自身免疫性疾病的治疗。其非限制性实例包括糖皮质激素、抗CD3抗体如Muromonab-CD3、IL-2a抑制剂如巴利昔单抗(Simulect)和达珠单抗(Zenapax)、钙调磷酸酶抑制剂如他克莫司和环孢素、西罗莫司、依维莫司、干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白或抗体和麦考酚酯。

在一些实施方案中，第二治疗剂是癌症化疗剂。化疗剂可以通过其作用机制归类为例如以下分组：

-抗代谢物/抗癌剂，如嘧啶类似物氟尿苷、卡培他滨和阿糖胞苷；

-嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂；

-抗增殖/抗有丝分裂剂包括：长春花生物碱(长春碱，长春新碱)等天然产物和紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)、长春碱、诺考达唑、埃博霉素、长春瑞滨和表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)等微管；

-DNA损伤剂如放线菌素、安吖啶、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、异环磷酰胺、美法仑、氮芥、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、甲基苄肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、依托泊苷和三乙基硫代磷酰胺；

-抗生素如放线菌素D、阿霉素、伊达比星、蒽环类抗生素、米托蒽醌、博来霉素、光神霉素(光辉霉素)和丝裂霉素等；

-酶类如L-天冬酰胺酶，其系统地代谢L-天冬酰胺并且去除不具有合成其自身天冬酰胺能力的细胞；

-抗血小板药物；

-抗增殖/抗有丝分裂的烷化剂如氮芥芥环磷酰胺及其类似物(美法仑，苯丁酸氮芥，六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基亚硝基脲(卡莫司汀)及其类似物、链脲佐菌素和三氮烯(达卡巴嗪)；

-抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；

-铂配位络合物(顺铂、奥拉铂和卡铂)、甲基苄肼、羟基脲、米托坦和氨鲁米特；

-激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺和尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑和阿那曲唑)；

-抗凝血剂，如肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂；

-纤维蛋白溶解剂，如组织纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定和氯吡格雷；

-抗迁移剂；

-抗分泌剂(布雷韦丁)；

-免疫抑制剂：他克莫司、西罗莫司、硫唑嘌呤和霉酚酸酯；

-化合物(TNP-470、染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子抑制剂和成纤维细胞生长因子抑制剂)；

-血管紧张素受体抑制剂，一氧化氮供体；

-反义寡核苷酸；

-抗体，如曲妥珠单抗和利妥昔单抗；

-细胞周期抑制剂和分化诱导剂，如维甲酸；

-抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(阿霉素、柔红霉素、放线菌素D、西尼平苷(eniposid)、表阿霉素、依托泊苷、依达比星、伊立替康、米托蒽醌、拓扑替康和伊立替康)和皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松和泼尼松龙)；

-生长因子信号转导激酶抑制剂；

-功能障碍诱导剂；

-毒素如霍乱毒素，蓖麻毒蛋白，假单胞菌外毒素，百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶毒素，白喉毒素和半胱天冬酶激活剂；

-和染色质。

组合物

本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效剂量的抗体和可接受的载体。在一些实施例中，组合物还包含第二种治疗剂。

在一个具体实施例中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物，特别是用于人类的药物。此外，“药学上可接受的载体”通常将是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。

术语“载体”是指施用于治疗的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖在本发明中也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液剂、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington's PharmaceuticalSciences中有所描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗原结合多肽，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

在一个实施例中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。具有代表性地是，用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。

本发明的化合物可以配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括衍生自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的与阴离子形成的盐，以及衍生自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的与阳离子形成的盐。

附图说明

图1为挑选用于亚克隆的初次杂交瘤克隆的ELISA结合验证实验的结果。

图2为挑选用于亚克隆的初次杂交瘤克隆的ELISA结合验证实验的结果。

图3显示被测抗体与人GM-CSF能够剂量依赖性地结合。

图4为抗体与重组人GM-CSF的结合动力学的曲线图。

图5显示抗体能够剂量依赖性地抑制GM-CSF与GM-CSF受体α的结合。

图6显示抗体能够显着降低由GM-CSF诱导的pSTAT5活化水平。

图7显示抗体能够抑制GM-CSF依赖性的TF-1增殖。

图8显示所有的人源化抗体均表现出对人GM-CSF的有效结合效力。

图9显示少数的人源化抗体表现出对TF-1增殖的最强烈地抑制。

图10显示被测抗体能够有效地阻断了pSTAT5的信号传导。

图11显示抗体能够剂量依赖性地结合猕猴GM-CSF。

图12为Hu23F4-27的药代动力学参数的曲线图。

具体实施方式

实施例1鼠源化抗体的生产

本实施例描述了利用杂交瘤技术生产抗人GM-CSF的小鼠单克隆抗体的方法。以重组的人GM-CSF蛋白质作为抗原。为生产抗人GM-CSF的小鼠单克隆抗体，首先用20μg重组人GM-CSF免疫不同品系的6～8周龄的小鼠，包括BALB/c、C57/BL6或SJL小鼠。首次免疫后的第14、28和42天，用5μg重组蛋白分别对免疫后的小鼠进行再次免疫。为选出能够产生与GM-CSF蛋白结合的抗体的小鼠，用ELISA法对免疫后的小鼠血清进行检测。简言之，用溶于PBS的1μg/ml的人GM-CSF蛋白包被微孔板，每孔100μl，室温过夜后用5％的BSA封闭。将稀释后的免疫小鼠血浆加入微孔板的各孔中，室温孵育1～2小时。用PBS/Tween缓冲液洗微孔板，然后加入结合了辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG抗体，并在室温中孵育1小时。洗板后，在微孔板中加入ABTS底物显影，并用分光光度计在OD405nm的条件下分析。免疫后第60天，用25μg重组的人GM-CSF蛋白对有足够抗GM-CSFIgG血清的小鼠进行增强免疫。所得小鼠用于融合。

杂交瘤上清液通过ELISA筛选实验来检测其中的抗GM-CSF IgG的含量。初次ELISA阳性的杂交瘤克隆通过使用有限稀释法、进一步的确认性ELISA结合实验(图1)以及TF-1增殖实验(图2)被挑选出来进行亚克隆。在GM-CSF刺激之前，用RPMI1640基础培养基洗涤TF-1细胞并饥饿过夜。在第2天，收集这些饥饿的细胞，然后以50μl/每孔、3×10⁵个细胞/毫升的浓度接种于平底96孔细胞培养板。

浓度为0.2ng/ml(4×)的人重组GM-CSF(购于Genscript)与20％的杂交瘤培养上清液(4×)通过1:1混合，并将50μl的混合液加入到TF-1细胞中，因此GM-CSF的终浓度是0.05ng/ml，杂交瘤上清液的终浓度是5％。在不添加杂交瘤上清液的情况下，以GM-CSF0.05ng/ml的终浓度培养TF-1细胞，并检测最大细胞增殖(0％抑制)。通过不添加GM-CSF并仅将细胞保持在RPMI1640完全培养基中培养，从而检测TF-1细胞增殖的100％抑制。然后将TF-1细胞在37℃下温育72小时。根据制造商的方法，通过CellTiter-Glo发光法检测细胞活力实验检测细胞活力。

总共有三个杂交瘤单克隆23F4、32C4和50C5显示出对TF-1增殖有显著地抑制，而选择23F4和50C5用于进一步表征。

实施例2鼠源抗体与人或猕猴GM-CSF的结合

本实施例检测小鼠的抗GM-CSF单抗与重组人或猕猴GM-CSF蛋白(1μg/ml@100μl)的ELISA结合的剂量反应。

将1μg/ml溶于PBS的重组人或猕猴GM-CSF蛋白(购于Genscript)包被在微孔板中，室温下(RT)孵育2小时。抗原包被后，用含有1％BSA的PBS/0.05％吐温(PBST)在室温下封闭微孔板1小时。用PBST洗涤微孔板后，向孔中加入不同浓度的抗GM-CSF抗体，并在室温下温育1小时。为了检测结合的抗体，在微孔板中加入针对小鼠Fc的HRP缀合的二抗(购于Jackson Immuno Research)，然后加入荧光底物(购于Roche)。在所有的孵育步骤之间，微孔板的孔用PBST洗涤三次。在TECAN Spectrafluor读板仪上测量荧光。

如图3所示，抗体23F4和50C5均显示对人GM-CSF(EC50分别为11.8ng/ml和14.6ng/ml)以及猕猴GM-CSF(EC50分别为10.2ng/ml和21.7ng/ml)的剂量依赖性结合。

实施例3鼠源抗体与人GM-CSF的结合动力学

图4绘制了23F4和50C5与重组人GM-CSF的结合动力学。将重组人GM-CSF设置为具有一系列浓度(100、50、25、12.5、6.25、3.125nM)的分析物。通过小鼠抗体捕获的方法，使用Biacore T200系统进行抗原抗体的结合动力学实验。参照制造商的说明书，将抗小鼠FcIgG固定在CM5传感器芯片上。通过固定化的抗小鼠Fc IgG捕获注射进去的被测抗体。然后分别注射一系列浓度的抗原，并分别记录每种浓度的抗原分析物的结合谱。通过注射pH为1.5的10mM甘氨酸-HCL，持续30秒后来再生该检测系统。运行缓冲液是HBS-EP+(10mMHEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.05％P20)。测定温度为25℃，结合和解离时间分别为180和600秒。

使用Biacore T200评估软件1.0，根据1:1的结合模型拟合Biacore的数据，从而计算结合(ka)和解离(kd)速率常数以及平衡常数(KD)。除了图4之外，下表列出了一些汇总数据。

实施例4通过鼠源抗体阻断GM-CSF与GM-CSF受体α的结合

为了检测抗体在阻断GM-CSF与GM-CSF受体α链的结合中的效力，将溶于PBS中的2μg/ml的重组人GM-CSF受体α蛋白(CD116)包被到微孔板中，4℃过夜。抗原包被后，用含有1％BSA的PBS/0.05％吐温(PBST)在室温下封闭微孔板1小时。用PBST洗涤微孔板后，在生物素化的人GM-CSF蛋白质(0.05μg/ml)存在的情况下，将不同浓度的抗GM-CSF抗体加入微孔板中，并在室温孵育1小时。

为了检测生物素化的GM-CSF与包被的受体的结合，加入HRP缀合的链霉亲和素蛋白，然后加入荧光底物(Roche)。在所有的孵育步骤之间，用PBST洗涤微孔板的孔三次。在TECAN Spectrafluor读板仪上检测荧光。如图5所示，两种抗体都显示出GM-CSF与GM-CSF受体α结合的剂量依赖性抑制。

实施例5通过鼠源抗体诱导的pSTAT5信号传导阻断GM-CSF

通过使用CD14阳性微珠(购于Miltenyi Biotec)从人外周血液中纯化出CD14+单核细胞。在不同浓度的23F4抗体存在的情况下，纯化的单核细胞用人GM-CSF(0.2ng/ml)刺激，在37℃孵育30分钟。孵育后，收集细胞并用FACS缓冲液(1×PBS+2％FBS)洗涤，接着用2％PFA渗透，然后用冰甲醇进行固定细胞。然后加入PE标记的抗pSTAT5抗体到细胞中，在4℃再孵育30分钟，然后使用流式细胞仪分析。通过[1-(MFI测试样品/MFI对照样品)]×100％计算抑制率％。抗体的增加可以显着降低由0.1或1μg/ml剂量的GM-CSF诱导的pSTAT5活化水平(图6)。

实施例6通过鼠源抗体抑制GM-CSF依赖性的TF-1增殖

在GM-CSF刺激之前，用RPMI1640基础培养基洗涤TF-1细胞并使细胞饥饿过夜。在第2天，收集饥饿的细胞并以每孔50μl、3×10⁵个细胞/毫升的浓度接种于平底96孔细胞培养板。浓度为0.2ng/ml(4×)的人重组GM-CSF(购于Genscript)与鼠源的抗GM-CSF抗体(浓度为0.01ng/ml-1000ng/ml，稀释于完全培养基中)以1:1混合，并将50μl的混合液加入到TF-1细胞中。在不添加抗体的情况下，以0.05ng/ml GM-CSF的终浓度培养TF-1细胞，并检测最大细胞增殖(0％抑制)。通过不添加GM-CSF并仅将细胞保持在RPMI1640完全培养基中培养，从而检测TF-1细胞增殖的100％抑制。然后将TF-1细胞在37℃下温育72小时。根据制造商的方法，通过CellTiter-Glo发光法检测细胞活力实验检测细胞活力。23F4和50C5抑制TF-1增殖的IC50值均为约10.9ng/ml(图7)。

实施例7鼠源抗体的人源化

使用鼠源抗体的可变区基因来生产人源化单抗。在该过程的第一步中，将抗体的VH和VK的氨基酸序列与可用的人Ig基因序列数据库进行比较，从而找到总体最佳匹配的人种系Ig基因序列。

然后设计人源化可变结构域序列，其中将抗体重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3移植到人Ig基因的框架序列上。然后产生3D模型以确定是否存在任何的框架位置，在这些位置上将小鼠氨基酸取代为人氨基酸(回复突变)，可能影响结合特性和/或CDR的构象。相关序列和回复突变显示在下表中。

23F4 VH的CDR序列

CDR1	SHYLH(SEQ ID NO.1)
		CDR2	WIFPGDDKTKYNEKFKG(SEQ ID NO.2)
CDR3	GTKYLNWNFDV(SEQ ID NO.3)

23F4 VL的CDR序列

CDR1	KANQNVGTTLA(SEQ ID NO.4)
		CDR2	SASYRYS(SEQ ID NO.5)
CDR3	HQYTTYPLT(SEQ ID NO.6)

23F4的人源化设计

下表中列出了一些人源化抗体23F4的氨基酸序列和核苷酸序列。

人源化抗体序列(CDR残基用下划线划出，回复突变用黑框框出)

用于人源化抗体23F4的VH/VK组合

50C5 VH的CDR序列

CDR1	PYSIH(SEQ ID NO.23)
		CDR2	YINPSTGYIEYNQHFKD(SEQ ID NO.24)
CDR3	GGDYEGYFDY(SEQ ID NO.25)

50C5 VL的CDR序列

CDR1	RLNENIYSFLA(SEQ ID NO.26)
		CDR2	NAETLAE(SEQ ID NO.27)
CDR3	QQHYGTPYT(SEQ ID NO.28)

50C5的人源化设计

人源化抗体序列(CDR残基用下划线划出，回复突变用黑框框出)

用于人源化抗体50C5的VH/VK组合

实施例8人源化抗体与人GM-CSF的结合

用上述方法检测人源化变体与重组人GM-CSF的结合。将溶于PBS的1μg/ml的重组人GM-CSF蛋白(购于Genscript)包被在微孔板中，室温下(RT)孵育2小时。抗原包被后，用含有1％BSA的PBS/0.05％吐温(PBST)在室温下封闭微孔板1小时。用PBST洗涤微孔板后，将不同浓度的抗GM-CSF抗体加入到微孔中，并在室温下温育1小时。

为了检测结合的抗体，在微孔板中加入针对小鼠Fc的HRP缀合的二抗(购于Jackson Immuno Research)，然后加入荧光底物(购于Roche)。在所有的孵育步骤之间，用PBST洗涤微孔板的孔三次。在TECAN Spectrafluor读板仪上测量荧光。如图8所示，与嵌合抗体相比，所有人源化变体都表现出相似的结合人GM-CSF的效力。

实施例9人源化抗体的结合动力学

通过上述的Biacore方法，检测人源化抗体的结合动力学。将重组人GM-CSF设置为具有一系列浓度(100、50、25、12.5、6.25、3.125nM)的分析物。通过人抗体捕获的方法，使用Biacore T200系统测定抗原抗体的结合动力学。参照制造商的说明书，将抗人Fc IgG固定在CM5传感器芯片上。通过固定化抗人Fc IgG捕获被注射进去的待测抗体。然后分别注射一系列浓度的抗原，并分别记录每种浓度的抗原分析物的结合谱。

通过注射pH为1.5的10mM甘氨酸-HCL，持续30秒后再生该检测系统。运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES，pH 7.4,150mM NaCl，3mMEDTA和0.05％P20)。测定温度为25℃，结合和解离时间分别为180和600秒。使用Biacore T200评估软件1.0，根据1:1的结合模型拟合Biacore的数据，从而计算结合(ka)和解离(kd)速率常数以及平衡常数(KD)。如下表所示，与嵌合抗体相比，源于23F4的Hu23F4-13、Hu23F4-27和Hu23F4-36表现出最强的结合亲和力；与嵌合抗体相比，源于50C5的Hu50C5-8、Hu50C5-17、Hu50C5-18、Hu50C5-19、Hu50C5-21和Hu50C5-23表现出最强的结合亲和力。

实施例10人源化抗体对TF-1增殖的抑制

在GM-CSF刺激之前，用RPMI1640基础培养基洗涤TF-1细胞并使细胞饥饿过夜。在第2天，收集饥饿的细胞并以每孔50μl、3×10⁵个细胞/毫升的浓度接种于平底96孔细胞培养板。浓度为0.2ng/ml(4X)的人重组GM-CSF(购于Genscript)与人源化的抗GM-CSF抗体(浓度为0.01ng/ml-1000ng/ml，稀释于完全培养基中)以1:1混合，并将50μl的混合液加入到TF-1细胞中。在不添加抗体的情况下，以0.05ng/ml GM-CSF的终浓度培养TF-1细胞，并检测最大细胞增殖(0％抑制)。通过不添加GM-CSF并仅将细胞保持在RPMI1640完全培养基中培养，从而检测TF-1细胞增殖的100％抑制。然后将TF-1细胞在37℃下温育72小时。根据制造商的方法，通过CellTiter-Glo发光细胞活力实验检测细胞活力。在源自23F4的被检测的人源化抗体中，Hu23F4-13、Hu23F4-27和Hu23F4-36显示出最强的抑制能力，IC50分别为4.95ng/ml、3.95ng/ml和3.30ng/ml(图9)。在源自50C5的被检测的人源化抗体中，Hu50C5-23显示出最强的抑制能力，IC50为14.31ng/ml(图9)。

抗体名称	TF-1增殖的IC50
		Hu23F4-chimera	8.55ng/ml
Hu23F4-5	15.58ng/ml
		Hu23F4-6	7.87ng/ml
Hu23F4-13	4.95ng/ml
		Hu23F4-20	8.77ng/ml
Hu23F4-23	9.08ng/ml
		Hu23F4-25	12.22ng/ml
Hu23F4-27	3.95ng/ml
		Hu23F4-29	27.44ng/ml
Hu23F4-36	3.30ng/ml

实施例11通过人源化抗体阻断pSTAT5信号传导

通过使用CD14阳性微珠(购于Miltenyi Biotec)从人外周血液中纯化出CD14+单核细胞。在不同浓度的人源化抗体存在的情况下，纯化的单核细胞在37℃用人GM-CSF(0.2ng/ml)刺激30分钟。温育后，收集细胞并用FACS缓冲液(1×PBS+2％FBS)洗涤，接着用2％PFA渗透，然后用冰甲醇进行固定细胞。然后将缀合了PE的抗pSTAT5抗体加入到细胞中，在4℃再孵育30分钟，然后使用流式细胞仪分析。通过[1-(MFI测试样品/MFI对照样品)]×100％计算抑制率％。Hu23F4-13、Hu23F4-27、Hu23F4-36、Hu50C5-17和Hu50C5-23的增加可以显著降低由0.1或1μg/ml剂量的GM-CSF诱导的pSTAT5活化水平(图10)。

实施例12人源化抗体与猕猴GM-CSF的结合

将溶于PBS的1μg/ml的重组猕猴GM-CSF蛋白(购于Genscript)并包被在微孔板中，室温下(RT)孵育2小时。抗原包被后，用含有1％BSA的PBS/0.05％吐温(PBST)在室温下封闭微孔板1小时。用PBST洗涤微孔板后，将不同浓度的人源化抗GM-CSF抗体加入到微孔中，并在室温下温育1小时。为了检测结合的抗体，在微孔板中加入针对小鼠Fc的HRP缀合的二抗(购于Jackson Immuno Research)，然后加入荧光底物(购于Roche)。在所有的孵育步骤之间，用PBST洗涤微孔板的孔三次。在TECANSpectrafluor读板仪上测量荧光。如图11所示，Hu23F4-13、Hu23F4-27和Hu23F4-36显示出与猕猴GM-CSF剂量依赖性的结合，EC50分别为7.44ng/ml、6.25ng/ml和7.75ng/ml；Hu50C5-17和Hu50C5-23显示出与猕猴GM-CSF剂量依赖性的结合，EC50分别为18.86ng/ml和21.63ng/ml。

实施例13Hu23F4-27在猕猴中的药代动力学

从先前体外生物活性检测结果中，选择Hu23F4-27来确定新生食蟹猴的药代动力学性质。将Hu23F4-27抗体分别以0.4mg/kg、2mg/kg和10mg/kg的不同剂量通过静脉施用至新生猕猴。在给药28天内选定的时间点收集血浆样品，并使用ELISA测定相应蛋白质的浓度。然后使用WinNonlin(Certara，CA)的非隔室方法计算药代动力学参数，如图12中所示。

本发明的范围并不受所述旨在作为各个方面的单个说明的具体实施例的限制，并在功能上等同的任何组合物或方法均在本发明的保护范围内。对本领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，落入本发明附属权利要求及其等同物范围内的修改和变化均属于本发明保护范围。

本发明中提及的所有出版物和专利申请通过引用结合于此，其程度与每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示通过引用结合于此相同。

序列表

<110> 爱迈博

<120> GM-CSF抗体及其用途

<130> P1810057WP

<150> CN201610831525.9

<151> 2016-09-19

<150> CN201610832677.0

<151> 2016-09-19

<160> 46

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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50 55 60

Lys Asp Arg Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Leu Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Glu Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Thr

65 70 75 80

Asp Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Glu

100 105

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Leu Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 38

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Leu Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Leu Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Glu Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Leu Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Glu Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 41

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Leu Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Glu Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 42

Asp Tyr Thr Leu Thr

1 5

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 43

Gly Tyr Thr Phe Thr

1 5

<210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 44

Gly Tyr Ile Phe Thr

1 5

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 45

Gly Tyr Ile Phe Ser

1 5

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 46

Gly Gly Thr Phe Ser

1 5

Claims (26)

1.一种分离的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段特异性结合人GM-CSF蛋白，该抗体或其片段包括如SEQ ID NO：1所示的VH CDR1、如SEQ ID NO：2所示的VH CDR2、如SEQ ID NO：3所示的VH CDR3、如SEQ ID NO：4所示的VL CDR1、如SEQ ID NO：5所示的VLCDR2和如SEQ ID NO：6所示的VL CDR3。

2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其组合。

3.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述轻链恒定区是κ链或λ链恒定区。

4.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的其中一种同种型。

5.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述同种型为IgG 1、IgG 2、IgG 3或IgG 4。

6.如权利要求1～5任一所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。

7.如权利要求6所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段是人源化抗体。

8.如权利要求7所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包括一个或多个选自以下组的氨基酸残基及其组合，所述组由：

(a)第1位的Glu，

(b)第98位的Arg，

(c)第72位的Ser，

(d)第68位的Ala，

(e)第70位的Leu，

(f)第48位的Ile，

(g)第26位的Asp，和

(h)第29位的Leu组成；所述氨基酸残基根据Kabat编号。

9.如权利要求8所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区包括至少(a)第1位的Glu残基。

10.如权利要求8所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区包含从第26位开始的DYTLT片段(SEQ ID NO:42)或GYTFT片段(SEQ ID NO:43)；所述氨基酸根据Kabat编号。

11.如权利要求7所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包括一个或多个选自以下组的氨基酸残基及其组合，所述的组由：

(a)第46位的Ala，

(b)第60位的Asp，

(c)第70位的Asp，

(d)第43位的Ser，和

(f)第87位的Phe组成；所述氨基酸残基根据Kabat编号。

12.如权利要求1～11任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包括选自由SEQ ID NO：8-17组成的组所示的氨基酸序列，或其序列与选自由SEQ ID NO：8～17组成的组所示的氨基酸序列至少有90％同源性的肽。

13.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区包含如SEQ IDNO：11、14或17所示的氨基酸序列。

14.如权利要求1～13任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO：19～22组成的组所示的氨基酸序列，或其序列与选自由SEQ ID NO：19～22组成的组所示的氨基酸序列至少有90％同源性的肽。

15.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO：19或22所示的氨基酸序列。

16.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区包含如SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。

17.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段是双特异性抗体或单链可变片段。

18.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1～17任一项所述的抗体或其片段和药学可接受的载体。

19.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞包含编码如权利要求1～17任一项所述的抗体或其片段的一种或多种多核苷酸。

20.一种在有需要的患者中治疗炎性疾病或自身免疫性疾病或病症的方法，其特征在于，所述方法包括向所述患者施用如权利要求1～17任一项所述的抗体或其片段。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述炎性疾病选自由阿尔茨海默病、艾迪生病、动脉粥样硬化、强直性脊柱炎、关节炎、骨关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎(PA)、强直性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)、克罗恩氏病、结肠炎、皮炎、憩室炎、纤维肌痛、肝炎、肠易激综合征(IBS)、系统性红斑狼疮(SLE)、肾炎、帕金森病(PD)、血管炎和溃疡性结肠炎组成的组。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述自身免疫性疾病或病症选自由斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、乳糜泻、自身免疫性幼年特发性关节炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、格林巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、自身免疫性心肌炎、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/系统性硬化症、干燥综合征(syndrome)、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性葡萄膜炎、白癜风和伴有多血管炎的肉芽肿病(Wegener's)组成的组。

23.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，其特征在于，所述方法包括向所述患者施用如权利要求1～17任一项所述的抗体或其片段。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、头颈癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌。

25.一种在有需要的患者中减少或缓解疼痛的方法，其特征在于，所述方法包括向所述患者施用如权利要求1～17任一项所述的抗体或其片段。

26.一种检测样品中GM-CSF表达的方法，其特征在于，其包括在使所述抗体或其片段与GM-CSF结合的条件下，使样品与权利要求1～17任一项所述的抗体或其片段接触，并检测反映样品中GM-CSF表达的结合。