KR20030074785A - 감소된 면역원성을 갖는 개질 과립구 집락 자극인자(ｇ-ｃｓｆ) - Google Patents

감소된 면역원성을 갖는 개질 과립구 집락 자극인자(ｇ-ｃｓｆ) Download PDF

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Abstract

본 발명은 특히 인간에게, 특히 치료적 용도를 위해 투여되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 개질 폴리펩티드이며, 여기서 개질은 인간 대상체에 투여시 면역 반응을 일으키는 폴리펩티드의 특성을 감소시킨다. 본 발명은 특히 생체 내에서 사용되는 경우, 임의의 비개질 대조물에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 단백질을 만드는 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 개질에 관한 것이다.

Description

감소된 면역원성을 갖는 개질 과립구 집락 자극인자 (Ｇ-ＣＳＦ) {MODIFIED GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR (G-CSF) WITH REDUCED IMMUNOGENICITY}
치료적 단백질의 효능이 치료적 단백질에 대한 원치않는 면역 반응에 의해 제한되는 경우가 많이 있다. 일부 마우스 단일클론 항체들은 여러 인간 질환 설정에 있어서 치료법으로 유망하게 나타났지만, 일부 경우 심각한 정도의 인간 항-쥐과 (antimurine) 항체 (HAMA) 반응의 유도로 인해 실패하였다 [Schroff, R. W. 등, (1985)Cancer Res.45: 879-885; Shawler, D. L. 등, (1985)J. Immunol.135: 1530-1535]. 단일클론 항체에 대해, HAMA 반응을 감소시키기 위한 시도로여러 기술이 개발되고 있다 [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이들 재조합 DNA 접근법으로 인해 일반적으로 최종 항체 구축물 내 마우스 유전 정보는 감소되었지만, 최종 구축물 내 인간 유전 정보는 증가되었다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화" 항체는 여러 경우에서 여전히 환자에게서 면역 반응을 유도하였다 [Issacs J. D. (1990)Sem. Immunol.2: 449, 456; Rebello, P. R. 등, (1999)Transplantation 68: 1417-1420].
항체가, 면역 반응을 일으킬 수 있는 치료제로서 투여되는 유일한 폴리펩티드 분자 클래스는 아니다. 인간 유래이고 인간에서 생성되는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질도 여전히 인간에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 대표적인 예에는 그 중에서도 과립구-대식세포 집락 자극인자 [Wadhwa, M. 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] 및 인터페론 알파 2 [Russo, D. 등, (1996)Bri. J. Haem.94: 300-305; Stein, R. 등, (1988)New Engl. J. Med.318: 1409-1413] 의 치료적 사용이 포함된다.
면역 반응 유도의 주요 요인은 MHC 클래스 II 분자 상으로의 제시를 통해 T 세포의 활성을 자극할 수 있는 펩티드, 소위 "T 세포 에피토프" 의 단백질 내 존재이다. 상기 잠재적인 T 세포 에피토프는 통상 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 상기 T 세포 에피토프는 MHC 결합의 구축으로 측정될 수 있다. 함축적으로는, "T 세포 에피토프" 는 MHC 분자에 결합하는 경우 T 세포 수용체 (TCR) 에 의해 인식될 수 있고, 최소한 원칙적으로 TCR 의 관여에 의해 상기 T 세포의 활성화를 유도하여 T 세포반응을 자극할 수 있는 에피토프를 의미한다. 그러나, 보통은 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 것으로 발견된 특정 펩티드들은, 상기 펩티드가 최종 단백질이 투여되는 유기체 내에서 "자가" 로 인식되기 때문에 단백질 서열 내에 보유될 수 있는 것으로 이해된다.
특정한 상기 T 세포 에피토프 펩티드는 세포 내에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 분해 도중 방출되고, 이어서 주 조직적합 복합체 (major histocompatability complex, MHC) 의 분자에 의해 제시되어 T 세포의 활성화를 유발시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. MHC 클래스 II 에 의해 제시되는 펩티드에 있어서, T 세포의 상기 활성화는 이어서, 예를 들어 B 세포의 직접적 자극에 의한 항체 반응을 일으켜서 상기 항체를 생산시킬 수 있다.
MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T 세포의 선택 및 활성화에 중요한 역할을 담당하는 매우 다형성인 단백질군이다. 인간 백혈구 항원기 DR (HLA-DR) 가 상기 단백질군의 주요 이종형(isotype) 이며, 본 발명에서 주로 초점을 맞추고 있다. 그러나, 이종형 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능을 수행하므로, 본 발명은 상기물에도 대등하게 적용가능하다. MHC 클래스 II DR 분자는 세포막을 통해 이들의 C 말단에서 부가되는 알파 및 베타 사슬로 이루어진다. 각각의 이종이합체 (hetero-dimer) 는 펩티드에 결합하는 길이 9 내지 20 개 아미노산의 리간드 결합 도메인을 보유하지만, 결합 그루브 (groove) 는 최대 11 개 아미노산을 수용할 수 있다. 리간드 결합 도메인은 알파 사슬의 1 내지 85 개 아미노산 및 베타 사슬의 1 내지 94 개 아미노산으로 구성된다. 최근에 DQ 분자는 상동 구조를 갖는것으로 나타났고, DP 군의 단백질도 또한 매우 유사한 것으로 추정된다. 인간에서는 DR 이종형에 대해서는 대략 70 개의 상이한 동종이형 (allotype) 이 공지되어 있고, DQ 에 대해서는 30 개의 상이한 동종이형이 있으며, DP 에 대해서는 47 개의 상이한 동종이형이 공지되어 있다. 각 개인은 2 내지 4 개의 DR 대립유전자 (allele), 2 개의 DQ 및 2 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 여러 DR 분자의 구조가 밝혀져 있고, 상기 구조는 펩티드의 소수성 잔기 (포켓 잔기) 가 관여되는 여러 소수성 포켓을 갖는 개방말단 펩티드 결합 그루브를 나타낸다 [Brown 등,Nature(1993)364: 33; Stern 등, (1994)Nature 368: 215]. 클래스 II 분자의 상이한 동종이형을 나타내는 다형성(polymorphism) 은 펩티드 결합 그루브 내에서 펩티드에 대한 상이한 결합 표면의 상당한 다양성에 기여하며, 집단 수준에서는 외래 단백질을 인식하고 병원성 유기체에 대해 면역 반응을 유발하는 능력에 대해 최대 유연성을 보장한다. 상이한 지리학적 집단 및 인종군 내 별개의 "군"에 따라 리간드 결합 도메인 내에 상당량의 다형성이 존재한다. 상기 다형성은 펩티드 결합 도메인의 결합 특징에 영향을 미쳐서, DR 분자의 상이한 "군"은 상이한 서열 특성을 갖는 펩티드에 대해 특이성을 가질 것이지만, 일부 겹침이 있을 수 있다. 상기 특이성이 Th-세포 에피토프가 유도된 것과 동일한 단백질 상에 존재하는 B-세포 에피토프에 대한 항체 반응을 유도하는 데 궁극적으로 관여하는 Th-세포 에피토프의 인식 (클래스 II T 세포 반응)을 결정한다. 따라서, 개인에서의 단백질에 대한 면역 반응은, 개인의 HLA-DR 동종이형의 펩티드 결합 특이성의 작용인 T 세포 에피토프 인식에 의해 크게 영향을 받는다. 그러므로, 전체 집단 차원에서 단백질 또는 펩티드 내의 T 세포 에피토프의 동정을 위해서는, 가능한 한 다양한 HLA-DR 동종이형 세트의 결합 특성을 고려하여, 가능한 한 높은 퍼센트의 전체 집단을 커버하는 것이 바람직하다.
본 발명의 목적 단백질과 같은 치료적 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로를 통해 진행된다. 여기에서, 외인성 단백질이 포획되고, DR, DQ 또는 DP 유형의 MHC 클래스 II 분자와의 연합된 제시를 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 그 중에서도 대식세포 및 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포 (APC) 에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 특정한 기타 공수용체 (coreceptor) 의 교차 결합과 함께, T 세포 표면 상의 동족 (cognate) T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 참여는 T 세포에서의 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 B 세포와 같은 기타 임파구를 추가 활성화시키는 시토카인을 방출시켜, 항체를 생산시키거나 완전 세포성 면역 반응으로서 T 킬러 세포를 활성화시킨다.
APC 표면 상의 제시를 위해 주어진 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드의 능력은 여러 요인, 가장 중요하게는 그 일차 서열에 의존한다. 이는, 그 단백분해 절단에 대한 경향 및 MHC 클래스 II 분자 상의 펩티드 결합 틈 (cleft) 내에서의 결합에 대한 그 친화도 둘 다에 영향을 미칠 것이다. APC 표면 상의 MHC 클래스 II/펩티드 복합체는 노출된 펩티드 잔기 및 MHC 클래스 II 분자 모두에 의해 제공되는 결정기를 인식할 수 있는 특정 T 세포 수용체 (TCR) 에 결합면을 제시한다.
당 분야에는, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 합성 펩티드를 동정하는 절차가 있다 (예, W098/52976 및 WO00/34317). 상기 펩티드는 모든 상황에서, 특히 생체 내에서, 처리 경로 또는 기타 현상으로 인해 T 세포 에피토프로 작용하지 못할 수 있다. T 세포 에피토프 동정이 에피토프 제거의 제 1 단계이다. 단백질로부터의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정 및 제거에 대해서는 이미 개시되어 있다. 당 분야에서, 컴퓨터 수단에 의해 T 세포 에피토프의 검출을 가능하게 하기 위해 통상 실험적으로 결정된 T 세포 에피토프에서 인식된 서열 모티브를 스캐닝 (scanning)하거나, 이와는 달리 MHC 클래스 II-결합 펩티드 및 특히 DR-결합 펩티드를 예측하는 컴퓨터 기술을 사용하는 방법들이 제공되었다.
W098/52976 및 WO00/34317 은 인간 MHC 클래스 II DR 동종이형의 하위 세트에 결합할 수 있는 가능성을 갖는 폴리펩티드 서열을 동정하기 위한 컴퓨터 분석 접근법을 교시하고 있다. 상기 교시에서, 예측된 T 세포 에피토프는 비인간 및 인간 유래 둘 다의 치료적 항체 또는 비항체 단백질의 일차 서열 내에서의 적절한 아미노산 치환을 이용하여 제거된다.
인간 또는 실험 동물 대상체의 말초 혈액 시료로부터의 T 세포 클론에 결합할 수 있는, 합성 펩티드와 조합된 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 개발하기 위한 기타 기술이 당 분야에서 사용되어 왔으며 [Kern, F. 등, (1998)Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W. W. 등, (2001)TRENDS in Immunology 22: 583-588], 또한 에피토프 동정 전략에도 사용될 수 있다.
상기에 서술된 바와 같이, 그리고 그 결과로서, 원칙적으로 치료적으로 유용하지만 원래는 면역원성인 주어진 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 T 세포 에피토프를 동정하고, 제거하거나 또는 최소한 감소시키는 것이 바람직할 것이다.
G-CSF 는 혈액 호중구의 증가가 이익이 되는 적응증의 치료에 현재 사용되는 중요 조혈 시토카인이다. 상기 증상은 암치료, 패혈증과 같은 각종 감염성 질환 및 관련 상태를 포함한다. G-CSF 는 또한 골수 이식을 위한 조혈 세포의 체외 확장에서 단독으로 또는 기타 화합물 및 시토카인과 조합되어 사용된다.
인간 G-CSF의 두 가지 형태가 상기 시토카인에 대해 흔히 인식된다. 하나는 177 개 아미노산의 단백질이고, 다른 하나는 174 개 아미노산의 단백질인데 [Nagata 등 (1986),EMBO J.5:575-581], 상기 174 개 아미노산 형태가 가장 높은 특이적 체내 생물학적 활성을 갖는다는 것이 발견되었다. 진핵성 및 원핵성 모두의 숙주 세포 발현 시스템을 이용하는 재조합 DNA 기술이 상업적 규모의 G-CSF 생산을 가능하게 하였다.
인간 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 아미노산 서열 (단글자 코드로 표시)은 하기와 같다:
TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQ ALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPT
QGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP.
위치 특이적 아미노산 치환에 의해 및 또는 화학적 첨가생성물에 의한 개질에 의해 개질된 형태를 포함하는, G-CSF의 기타 폴리펩티드 유사체 및 펩티드 단편이 이미 개시되었다. 이에 따라, US 4,810,643 은 특정 Cys 잔기가 다른 아미노산으로 대체된 유사체, 및 제 1 위치 (N-말단)에 Ala 잔기를 갖는 G-CSF에 대해 개시한다. EP 0 335 423 은 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노기의 개질에 대해 개시한다. EP 0 272 703에는 N 말단 근처에서 아미노산이 치환되거나 결실된 G-CSF 유도체에 대해 개시한다. EP 0 459 630 은 Cys 17 및 Asp 27 이 Ser 잔기로 치환된 G-CSF 유도체에 대해 개시한다. EP 0 243 153 은 재조합 생산에서의 수율 증가를 위해 하나 이상의 효모 KEX2 프로테아제 처리 위치를 비활성화함으로써 개질된 G-CSF 에 대해 개시하고, US 4,904,584는 라이신 개질 단백질에 대해 개시한다. WO 90/12874 는 추가 Cys 개질 변이체에 대해 개시하고, 호주 특허공보 AU-A-10948/92 는 원핵성 발현 후 분자의 접힘을 보조하는 목적을 위한, G-CSF 분자의 임의의 한 쪽 말단으로의 아미노산 부가에 대해 개시한다. AU-76380/91 은 G-CSF 174 개 아미노산 형태의 50-56 위치, 및 177 개 아미노산 형태의 53-59 위치에서의 G-CSF 변이체에 대해 개시한다. 특정 His 잔기에서의 추가적 변경에 대해서도 또한 개시되어 있다.
상기 접근법의 다수가 G-CSF 의 상업적 생산에서의 개선, 예를 들면 개선된 시험관 내 안정성을 목적으로 하고 있음을 이해해야 한다. 이들 교시 중 그 어느 것도 단백질의 면역원성 특성에 대한 T 세포 에피토프의 중요성을 인식하거나, 본 발명의 방법에 따른 특정적이고 조절된 방식으로 상기 특성에 직접적으로 영향을 주는 것을 착상해내지 않았다.
그러나, 증강된 특성을 갖는 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 유사체에 대한 지속적인 요구가 존재한다. 목적하는 증강에는 상기 치료물의 발현 및 정제에대한 대안적인 방법 및 양식 뿐만 아니라, 특히 단백질의 생물학적 특성의 개선이 포함된다. 특히 인간 대상체에 투여될 경우 생체 내 특성의 증강에 대한 요구가 존재한다. 이와 관련하여, 인간 대상체에서 면역 반응을 유도할 잠재성이 감소되거나 없는 G-CSF 를 제공하는 것이 크게 요구된다.
본 발명은 특히 인간에게, 특히 치료적 용도를 위해 투여되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 개질 폴리펩티드인데, 여기서 개질은 인간 대상체에 투여시 면역 반응을 일으키는 폴리펩티드의 특성을 감소시킨다. 본 발명은 특히, 생체 내에서 사용되는 경우, 임의의 비개질 대조물에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 단백질 변이체를 만드는 인간 G-CSF 의 개질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감소된 면역원성을 갖는 개질 과립구 집락 자극인자 변이체를 생성시킬 수 있는 방법에 의해 상기 비개질 단백질에서 유도된 T 세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 개요 및 설명
본 발명은, 잠재적인 T 세포 에피토프의 수를 감소시키거나 제거시킴으로써 면역 특징이 개질된 "과립구 집락 자극인자 (G-CSF)" 의 개질형을 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 T 세포 에피토프가 제거된 인간 G-CSF 의 개질형을 제공한다. 본 발명은 G-CSF의 일차 서열 내에서 MHC 클래스 II 결합 잠재성으로 인해 잠재적 T 세포 에피토프인 것으로 동정된 서열에 대해 개시한다. 상기 개시는 구체적으로 177 개 아미노산 종 및 174 개 아미노산 종인 인간 G-CSF 단백질의 인식된 형태 모두에 관한 것이다.
본 발명은 본원에 개시된 것과 실질적으로 동일한 일차 아미노산 서열을 갖는 임의의 G-CSF 종의 분자에 적용될 수 있으며, 따라서 유전공학적 수단 또는 기타 처리에 의해 유도된 G-CSF 분자를 포함하고, 177 개 또는 174 개의 아미노산 잔기를 포함하지 않을 수 있다.
쥐과, 소과, 개과 및 기타 포유류 원으로부터 동정된 것과 같은 G-CSF 단백질은 본 발명에서 개시된 펩티드의 다수를 공통적으로 가지며, 개시 열거된 것과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 펩티드 서열의 다수를 공통적으로 가진다. 따라서, 상기 단백질 서열은 대등하게 본 발명의 범위에 속한다.
또한 본 발명은, 원칙적으로 생물학적 활성에는 영향을 미치지 않으면서 특정 아미노산 치환, 부가 또는 결실에 의해 경변되어야 하는, 본 발명에 따른 분자의 일차 서열 내 특정 위치를 개시하고 있다. 면역원성의 소실이 생물학적 활성의 동시적 소실에 의해서만 달성될 수 있는 경우, 단백질의 아미노산 서열 내에서의 추가적 변경에 의해 상기 활성을 복구시킬 수 있다.
또한 본 발명은 상기 개질 분자의 제조 방법, 및 모든 방법 중에서 면역원성 부위를 감소 또는 제거시키기 위해 변경이 필요한 상기 T 세포 에피토프의 동정 방법을 개시하고 있다.
본 발명에 따른 단백질은 인간 대상체 내에서 증가된 순환 시간을 나타낼 것으로 추정되며, 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)에 대한 여러 적응증의 경우에서와 같은 만성 또는 재발성 질환 조건에서 특히 유용할 것이다. 본 발명은 생체 내에서 증강된 특성을 나타낼 것으로 예측되는 G-CSF 단백질의 개질형을 제공한다. 상기 개질 G-CSF 분자는 약학 조성물에 사용될 수 있다.
요약하면, 본 발명은 하기 문제들에 관한 것이다:
ㆍ생체 내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없고, 인간 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자;
ㆍ상기 면역원성의 소실이 본래 비개질된 분자에서 유도된 1 개 이상의 T 세포 에피토프를 제거함으로써 수득되는, 상기 명시된 분자;
ㆍ상기 면역원성의 소실이 상기 분자에서 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수 감소에 의해 수득되는, 상기 명시된 분자;
ㆍ1 개의 T 세포 에피토프가 제거된, 상기 명시된 분자;
ㆍ상기 본래 존재하는 T 세포 에피토프가 클래스 II 상의 제시를 통해 T 세포를 자극하거나 결합할 수 있는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인, 상기 명시된 분자;
ㆍ상기 펩티드 서열이 표 1 에 나타내어진 군으로부터 선택되는, 상기 명시된 분자;
ㆍ임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프 내 1-9 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 개의 아미노산 잔기가 변경된, 상기 명시된 분자;
ㆍ아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)의 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들)의 잔기(들)의 치환, 부가 또는 결실인, 상기 명시된 분자;
ㆍ1 회 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 2 에 나타내어진 바와 같이 수행되는, 상기 명시된 분자;
ㆍ(부가적으로) 1 회 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 3 에 나타내어진 바와 같이, 상기 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수를 감소시키기 위해 수행되는, 상기 명시된 분자;
ㆍ필요한 경우, 통상적으로 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실에 의한 추가적 변경이 상기 분자의 생물학적 활성의 복구를 위해 수행되는, 상기 명시된 분자;
ㆍ상기 및 하기 명시된 바와 같은 임의의 상기 개질 분자를 코딩하는 DNA 서열 또는 분자;
ㆍ상기 및/또는 청구범위에서 정의된 바와 같은 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함께 함유하는 약학 조성물;
ㆍ하기 단계를 포함하는, 상기 언급된 청구항 중 임의 청구항에서 정의된 바와 같은 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자의 제조 방법: (i) 폴리펩티드 또는 그의 일부의 아미노산 서열의 결정; (ii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술 또는 생물학적 분석을 이용한, 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의한, 단백질의 아미노산 서열 내의 1 개 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정; (iii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용하여 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정된 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소 또는 제거시키는 방식으로 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안; (iv) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축, 및 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기 변이체의 평가; 및 (v) 임의로 단계 (ii) - (iv) 의 반복;
ㆍ단계 (iii) 이 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프에서 1-9 개의 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 수행되는, 상기 명시된 방법;
ㆍ상동성 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조하여 개질이 수행되는, 상기 명시된 방법;
ㆍ상기 단계 (ii) 가 하기 단계들 (a) 내지 (d)에 의해 수행되는, 상기 명시된 방법: (a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역을 선택; (b) 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고 소정의 균일 크기를 갖는, 겹치는 아미노산 잔기 절편의 순차적 샘플링; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값의 합산에 의한, 각각의 상기 샘플링된 절편의 MHC 클래스 II 분자 결합 점수 계산; 및 (d) 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 점수를 기준으로, 펩티드의 치료적 효용성을 실질적으로 감소시키지 않으면서 펩티드의 MHC 클래스 II 결합 점수를 바꾸기 위한, 개질에 적합한 1 개 이상의 상기 절편의 동정; 여기서, 단계 (c) 는 바람직하게는 하기 (1) 내지 (6)에 의해, 12-6 반 데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 입체 에너지 항목을 포함하도록 개질된 Boehm 점수계산 함수를 이용하여 수행된다: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 제 1 데이타베이스를 제공; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 제 2 데이타베이스를 제공; (3) 상기 제 1 데이타베이스로부터 모델 선택; (4) 상기 제 2 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격의 선택; (5) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄의 동정; (6) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화도값 결정; 및 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5) 를 반복;
ㆍ표 1 에 나타낸 바와 같은 군으로부터 선택된, 면역학적으로 비개질된 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)로부터 생성되고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13머 (13mer) T 세포 에피토프 펩티드, 및 생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 G-CSF 의 제조를 위한 그의 용도;
ㆍ상기 명시된 바와 같은 13머 T 세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상 연속 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드 서열, 및 생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 G-CSF 의 제조를 위한 그의 용도.
"T 세포 에피토프" 라는 용어는 본 발명의 이해에 따라 MHC 클래스 II 에 결합할 수 있고, T 세포를 자극하고/하거나 또한 MHC 클래스 II 와의 복합체로서 T 세포와 결합할 수 있는 (반드시 이를 측정가능하게 활성화시킬 필요는 없음) 아미노산 서열을 의미한다. 본원 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은, (본원에서 하기에 정의되는) 펩티드 결합에 의해 함께 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20 개의 상이한 천연 발생 아미노산이 있으며, 이들의 임의 수를 임의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 사용되는 천연 발생 아미노산은 모두 L-입체구조를 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2 가지 상이한 입체구조의 아미노산의 다양한 조합을 이용하는 통상적 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부펩티드는 소수의 아미노산 단위만을 함유한다. 짧은 펩티드, 예컨대 10 개 미만의 아미노산 단위를 갖는 것들을 때로 "올리고펩티드" 로 부른다. 다른 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예컨대 100 개 전후를 함유하며, "폴리펩티드" 로 불린다. 통상적으로, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 함유하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있는 반면, "올리고펩티드" 는 통상적으로 "짧은" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 모든 언급은 올리고펩티드도 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "펩티드" 에 대한 모든 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 - 따라서 상이한 단백질의 수는 실제로 무한하다.
"알파 탄소 (Cα)" 는 펩티드 사슬 내에 있는 탄소-수소 (CH) 성분의 탄소 원자이다. "측쇄" 는 펩티드의 크기에 비해 상당히 다양할 수 있는 물리적 크기를 갖는, 단순하거나 복잡한 기 또는 부분을 구성할 수 있는 Cα에 대한 펜던트 기이다.
본 발명은 본원에 개시된 것과 실질적으로 동일한 일차 아미노산 서열을 갖는 임의의 G-CSF 분자종에 적용될 수 있고, 따라서 유전 공학적 수단 또는 기타 방법에 의해 유도된 G-CSF 분자를 포함할 것이며, 177 개 또는 174 개 전후의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.
다른 포유류원으로부터 동정된 바와 같은 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 단백질은 본 개시물의 여러 펩티드 서열을 공통적으로 가지며, 개시된 서열목록에서의 서열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 여러 펩티드 서열을 공통적으로 갖는다. 따라서 상기 단백질 서열이 동등하게 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명은, 자가 유기체 내로 도입되는 가용성 단백질이 가용성 단백질에 결합하는 숙주 항체의 생성을 일으키는 면역 반응을 유발할 수 있는 실제 현실을 극복하기 위한 것으로 간주된다. 이들 중 한 예는, 인터페론 알파 2 인데, 인간 환자의 일부는 상기 단백질이 내인성으로 생산됨에도 불구하고 항체를 만든다 [Russo, D. 등, (1996)ibid; Stein, R. 등, (1988)ibid]. 동일한 상황이 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 치료적 사용에도 관련될 수 있으며, 본 발명은 인간 숙주에게 투여 시 면역 반응을 일으키는 경향이 변화된 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 단백질을 제공함으로써 이를 해결하고자 한다.
개질 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)를 만드는 본 발명의 일반적 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열의 결정;
(b) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의한, 단백질의 아미노산 서열 내의 1 개 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정;
(c) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용하여 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정된 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소 또는 제거시키는 방식으로 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안. 상기 서열 변이체는 서열 변이에 의한 새로운 잠재적 T 세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성되는데, 새로운 잠재적 T 세포 에피토프가 다시 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 개질되지 않는 한, 그렇게 된다; 및
(d) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축, 및 널리 공지된 재조합 기술에 따라 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기 변이체의 평가.
단계 (b) 에 따른 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정은 선행 기술에 미리 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법은 WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317 에 개시되어 있으며, 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자에 대한 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)-유래 펩티드의 결합 성향을 확인하는 데 사용될 수 있다.
계산에 의한 T 세포 에피토프 동정에 매우 효과적인 또다른 방법이 본 발명에 따른 바람직한 구현예인 실시예에 기재되어 있다.
실제로, 여러 변이체 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 단백질이 제조되고, 목적하는 면역 및 기능적 특징에 대해 평가될 것이다. 변이체 단백질은 가장 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 것이지만, 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 단편의 화학적 합성을 포함하는 기타 방법도 포함될 수 있다.
상기 계획의 단계 (b) 에 따른, 174 개 및 177 개 형태 모두의 전체 인간 G-CSF 단백질 서열에 관련된 분석 결과를 표 1 에 나타낸다.
펩티드 서열은 G-CSF의 177 개 및 174 개 아미노산 형태 모두에서 동정된 펩티드를 포함한다. 펩티드는 13머이고, 아미노산은 단글자 코드를 이용하여 확인된다.
상기 계획의 단계 (c) 및 (d) 에 따른, 본 발명의 개질 분자에 관련된 구축물 및 고안의 결과를 표 2 및 3 에 나타낸다.
본 발명은, 1 회 이상의 아미노산 잔기의 치환이, 단백질로부터의 1 개 이상의 잠재적 T 세포 에피토프의 제거 또는 활성의 실질적 감소를 일으키는 위치에서 수행되는 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 유사체에 관한 것이다. 표 1 에 확인된 임의의 잠재적 MHC 클래스 II 리간드 내의 특정 위치에서의 1 회 이상의 아미노산 치환은, 인간 숙주에게 치료제로서 투여되는 경우 감소된 면역원성 잠재력을 갖는 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 분자를 얻게 할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 T 세포 에피토프의 활성을 제거하거나 실질적으로 감소시킬 것으로추정되는 펩티드 서열 내의 적절한 지점에서 수행된다. 실제로, 적절한 지점은 바람직하게는 MHC 클래스 II 결합 그루브 내에 제공되는 1 개의 포켓 내의 아미노산 잔기 결합과 동일할 것이다.
펩티드의 소위 P1 또는 P1 고정 위치에서 틈의 제 1 포켓 내의 결합을 변경시키는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 고정 잔기와 MHC 클래스 II 결합 그루브의 제 1 포켓 사이의 결합 상호작용의 질은 전체 펩티드의 전체 결합 친화성의 주요 결정기로 인식된다. 펩티드의 상기 위치에서의 적절한 치환은 포켓 내에서 덜 쉽게 수용되는 잔기에 대한 것으로, 예를 들어 보다 친수성 잔기로의 치환일 것이다. MHC 결합 틈 내의 다른 포켓 영역 내에서의 결합에 상응하는 위치에서의 펩티드의 아미노산 잔기도 또한 고려되며, 본 발명의 범위 내에 속한다.
주어진 잠재적 T 세포 에피토프 내의 단일 아미노산 치환이 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 경로로 이해된다. 단일 에피토프 내의 치환의 조합이 포함될 수 있고, 예를 들어 개별적으로 정의된 에피토프가 서로 겹치는 경우 특히 적절할 수 있다. 또한, 주어진 에피토프 내에서 단독으로 또는 단일 에피토프 내에서 조합된 아미노산 치환은 MHC 클래스 II 결합 그루브에 대해 "포켓 잔기" 에 해당하지 않는 위치 뿐만 아니라 펩티드 서열 내의 임의 위치에서도 수행될 수 있다. 치환은 상동성 구조 또는 당 분야에 공지된 컴퓨터 이용 기술을 사용하여 생성되는 구조적 방법을 참조하여 수행될 수 있고, 본 발명에 따른 분자의 공지된 구조적 특징에 근거할 수 있다. 상기 모든 치환은 본 발명의 범위 내에 속한다.
상기 동정된 펩티드 내부의 것 이외의 아미노산 치환이, 특히 열거된 펩티드 내에서 이루어지는 치환(들)과의 조합으로 수행되는 경우에는 고려될 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자의 구조 또는 생물학적 활성을 복구시키기 위한 변화가 고려될 수 있다. 상기 보상적인 변화들, 및 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 폴리펩티드로부터의 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 부가을 포함하여 목적하는 활성을 갖는 변이체를 수득하게 하고, 임의의 개시된 폴리펩티드 내의 변화와 조합된 변화들도 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명이 개질 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)에 관한 것인 한, 상기 개질 G-CSF 단백질 또는 개질 G-CSF 단백질의 단편을 함유하는 조성물 및 관련 조성물은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주되어야 한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 개질 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 물질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 개질 G-CSF 단백질을 이용한 인간의 치료적 처치 방법에 관한 것이다.
단백질 또는 폴리펩티드의 전체 구조를 결정하는 데 중요한 역할을 하는 여러 요인들이 있다. 첫 번째로, 펩티드 결합, 즉 사슬 내의 아미노산을 함께 연결하는 결합은 공유 결합이다. 상기 결합은 평면 구조이며, 본질적으로 치환 아미드이다. "아미드" 는 -CONH- 그룹을 함유하는 유기 화합물의 임의 기이다.
인접한 아미노산의 Cα를 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기 도시한 바와 같이 나타낼 수 있다:
O=C 및 C-N 원자들이 비교적 고정된 평면 상에 놓이므로, 상기 축에 대해서는 자유 회전이 일어나지 않는다. 따라서, 점선으로 도식적으로 묘사된 평면은 때때로 "아미드" 또는 "펩티드 평면" 으로 불리며, 여기에 펩티드 골격의 산소 (O), 탄소 (C), 질소 (N), 및 수소 (H) 원자가 놓인다. 상기 아미드 평면의 반대 구석에는 Cα원자가 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에 대해 실질적으로 회전이 없으므로, 폴리펩티드 사슬은 Cα원자를 연결하는 일련의 평면 펩티드 결합을 포함한다.
폴리펩티드 또는 단백질의 전체 구조 또는 입체구조를 정의하는 데 중요한 역할을 하는 제 2 요인은 공통 Cα결합에 대한 각각의 아미드 평면의 회전각이다. "회전각" 및 "비틀기 (torsion) 각" 이라는 용어는 이후 동등한 용어로 간주된다. O, C, N, 및 H 원자가 아미드 평면에 존재한다고 가정하면 (일부 입체구조에 대해 상기 원자의 평면성이 약간 변경될 수 있지만, 통상적으로 타당한 가정임), 상기 회전각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 입체구조, 즉 인접한 잔기 사이에 존재하는 그대로의 구조를 정의한다. 상기 두 각은 φ및 ψ로 공지되어 있다. 따라서, 한 세트의 각 φ1, ψ1(여기서 아래첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄)은 폴리펩티드의 2 차 구조를 효과적으로 정의한다. 주어진 폴리펩티드에대해 φ, ψ각을 정의하는데 사용되는 관례, 즉 아미드 평면이 0 도 각을 형성하는 기준점 및 어느 각이 φ이고 어느 각이 ψ인가에 대한 정의는 문헌에 정의되어 있다. 예컨대, 본원에 참고문헌으로 도입된 [Ramachandran 등.Adv. Prot. Chem. 23: 283-437 (1968), 페이지 285-94] 를 참조.
본 발명의 방법은 어느 단백질에나 적용될 수 있으며, 부분적으로, 인간에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브의 일차 포켓 1 고정 위치는 특정 아미노산 측쇄에 대해 잘 고안된 특이성을 갖는다는 발견에 근거한다. 상기 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 번 위치에서 아미노산의 정체성에 의해 결정된다. 상기 부위는 포켓 1 의 기저부에 위치하며, 상기 포켓에 의해 수용될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다 [Marshall, K. W.,J. Immunol.,152: 4946-4956 (1994)]. 상기 잔기가 글리신이라면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산 (소수성 지방족은: 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌이고, 방향족은: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이다) 은 포켓 내에 수용될 수 있는데, 방향족 측쇄가 바람직하다. 상기 포켓 잔기가 발린이라면, 상기 아미노산의 측쇄는 포켓 내로 돌출하여, 소수성 지방족 측쇄만이 수용될 수 있도록, 수용될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한한다. 따라서, 아미노산 잔기 서열에서, 소수성 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산이 발견되는 어느 곳에나, MHC 클래스 II 에 제한된 T 세포 에피토프가 존재할 가능성이 있다. 그러나, 측쇄가 소수성 지방족이라면, 방향족 측쇄에 비해 T 세포 에피토프와 연합될 가능성이 2 배 가량 더 높다 (전체 집단에 대해 포켓 1 유형의 대략 균일한 분포를 가정함).
본 발명을 구현하는 전산적인 방법은 하기와 같이 T 세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 펩티드 영역을 프로파일링한다:
(1) 소정의 길이의 펩티드 절편의 일차 서열을 스캐닝하고, 존재하는 모든 소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 확인한다. (2) 소수성 지방족 측쇄에 방향족 측쇄보다 더 높은 값; 바람직하게는 방향족 측쇄에 지정된 값의 약 2 배, 예컨대, 소수성 지방족 측쇄에 대한 값으로 2, 및 방향족 측쇄에 대한 값으로 1 을 지정한다. (3) 존재하는 것으로 결정된 값을 펩티드 내의 소정의 균일한 길이를 갖는 각각의 겹치는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 합산하고, 특정 절편 (윈도우) 에 대한 전체 값을 절편 (윈도우)의 중간 위치에 있는 단일 아미노산 잔기에, 바람직하게는 샘플링된 절편 (윈도우)의 대략 정중앙 위치의 잔기에 부여한다. 상기 절차를 각각의 샘플링된 겹치는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에는 T 세포 에피토프가 상기 특정 절편 (윈도우)에 존재할 가능성에 관련된 값이 부여된다. (4) 상기 단계 3 에 기재된 바와 같이 계산 및 부여된 값을 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 축에 대해 플롯팅할 수 있다. (5) 소정의 값, 예컨대 값 1 의 점수를 갖는 서열의 모든 부분은, T 세포 에피토프를 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 필요하다면 개질될 수 있다.
본 발명의 상기 특정 측면은 T 세포 에피토프를 포함할 것 같은 펩티드 영역을 나타낼 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 상기 영역에서의 펩티드 개질은 MHC 클래스 II 결합 특징을 개질시킬 수 있는 가능성을 갖는다.
본 발명의 또다른 측면에 따라, MHC 클래스 II 대립유전자의 모델과 펩티드의 상호작용을 고려한 보다 복잡한 전산적 방법을 이용하여, T 세포 에피토프가 보다 정확히 예측될 수 있다. 상기 특정 측면에 따른 펩티드 내에 존재하는 T 세포 에피토프의 전산적 예측에는, 모든 공지된 MHC 클래스 II 분자의 구조를 기반으로 하는 42 개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자 모델의 구축, 및 T 세포 에피토프의 전산적 동정에 있어서 상기 모델의 이용 방법, 상대적인 펩티드 골격 알파 탄소 (Cα) 위치에 있어서 공지된 변화를 가능케 하기 위한 각각의 모델에 대한 펩티드 골격 라이브러리의 구축, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용에 대해 결정적인 위치의 20 개 아미노산 대안물 각각에 대한 각 모델을 사용한 각각의 골격 잔교 (dock)에 대한 아미노산 측쇄 입체구조의 라이브러리 구축, 및 특정 MHC 클래스 II 분자로 도킹된 특정 펩티드에 대한 최적 골격 및 측쇄 입체구조를 선택하기 위한 점수계산 기능 및 상기 상호작용으로부터 결합 점수의 유도와 연관된, 상기 골격 및 측쇄 입체구조의 라이브러리의 사용이 포함된다.
MHC 클래스 II 분자의 모델은 Brookhaven 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에서 찾을 수 있는 여러 유사한 구조로부터 상동성 모델링을 통해 유도할 수 있다. 이들은 에너지 최소화를 위한 CHARMm 력장 (force-field) (Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca. 에서 구입가능) 와 함께 시뮬레이션된 어닐링 기능을 도입한 반자동 상동성 모델링 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다 (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993.J. Mol Biol 234: 779-815). 대안적인 모델링 방법도 또한 이용할 수 있다.
본 발명의 방법은, MHC 클래스 II 분자의 작은 세트를 위한 결합 그루브 내 각각의 위치에서 대안적인 각각의 아미노산의 실험적으로 유도된 결합 데이타의 라이브러리를 이용하는 다른 전산적 방법 (Marshall, K. W., 등,Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids,1(3): 157-162) (1995), 또는 그루브 내의 특정 유형의 결합 포켓의 결합 특징을 정의하기 위해, 다시 MHC 클래스 II 분자의 비교적 작은 서브세트를 이용한 후 상기 포켓 라이브러리로부터의 포켓 유형을 '혼합 및 대조'하여 추가적인 '버츄얼' MHC 클래스 II 분자를 인공적으로 생성시키는 유사한 실험적 결합 데이타를 이용하는 또다른 전산적 방법 (Sturniolo T., 등,Nat. Biotech,17(6): 555-561 (1999))과는 상당히 상이하다. 두 가지 선행 방법 모두, 분석의 복잡성 및 다수의 펩티드 변이체를 합성해야 한다는 필요성으로 인해, 단지 소수의 MHC 클래스 II 분자만이 실험적으로 스캐닝될 수 있다는 주요 단점을 갖는다. 따라서, 첫번째 선행 방법은 소수의 MHC 클래스 II 분자에 대해서만 예측할 수 있다. 두번째 선행 방법도 또한, 한 분자 내의 유사한 아미노산이 배열된 포켓이 상이한 클래스 II 대립유전자의 맥락에서 동일한 결합 특징을 갖는다는 가정을 하고, 포켓 라이브러리 내에 포함되는 포켓을 포함하는 MHC 클래스 II 분자만이 '버추얼하게' 생성될 수 있다는 추가적 단점을 갖는다. 본원에 기재된 모델링 접근법을 이용하여, 임의 수 및 유형의 MHC 클래스 II 분자의 구조를 유추할 수 있고, 따라서 전체 집단을 대표하도록 대조유전자를 구체적으로 선택할 수 있다. 또한, 스캐닝되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 복잡한 실험을 통해 추가적인 데이타를 생성시켜야 하는 것보다 훨씬 더 많은 모델을 만들어서 증가될 수있다.
골격 라이브러리의 이용은 특정한 MHC 클래스 II 분자로 도킹되는 경우, 스캐닝되는 다양한 펩티드의 Cα원자의 위치에서의 변화를 허용한다. 이는 다시, 특히 포켓에서의 아미노산 결합의 스캐닝을 위해 단순화한 펩티드 골격의 이용에 의존하는 상기 기재된 대안적인 전산적 선행 방법과 대조적이다. 이러한 단순화된 골격은 '실제' 펩티드에서 발견되는 골격 입체구조의 대표물이 아닐 수 있어, 펩티드 결합의 예측이 부정확해진다. 본 발명의 골격 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합된 모든 펩티드의 골격을 포개고, 결합 그루브 내에 위치하는 11 개 아미노산 각각의 Cα원자 사이의 제곱 평균 제곱근 (RMS) 편차를 확인함으로써 생성된다. 상기 라이브러리는 소수의 적합하고 이용가능한 마우스 및 인간 구조 (현재 13 개) 에서 유도될 수 있지만, 더욱 큰 다양성을 가능케하기 위해, 각각의 C"-α위치에 대한 RMS 수를 50% 증가시킨다. 이어서 각각의 아미노산의 평균 Cα위치를 결정하고, 반경이 그 지점에서의 RMS 편차 + 50% 가 되는 상기 지점 주위로 구를 그린다. 상기 구가 허용되는 모든 Cα위치를 나타낸다.
최소의 RMS 편차를 갖는 Cα로 작업시 (결합 그루브 내 11 개 잔기의 위치 2 에 해당하는, 상기 언급된 포켓 1 의 아미노산의 것), 구를 3 차원적 격자로 분할하고, 격자 내의 각각의 정점을 상기 아미노산의 Cα의 가능한 위치로서 사용한다. 후속 아미노산으로의 펩티드 결합에 해당되는, 후속 아미드 평면은 상기 Cα들의 각각에 그래프트되며, φ및 Ψ각은 후속 Cα의 위치를 정하기 위해, 설정된 간격으로 단계적으로 회전된다. 후속의 Cα가 상기 Cα 에 대해 '허용되는 위치의 구' 내에 속하는 경우, 디펩티드의 배향이 허용되지만, 구의 외부에 속하는 경우 디펩티드는 거부된다. 이어서, 상기 절차를, 모든 9 개의 후속 Cα들이 선행 Cα들의 가능한 모든 순열로부터 배치될 때까지, 각각의 후속 Cα위치에 대해, 펩티드가 포켓 1 Cα'시드 (seed)' 로부터 성장하도록 반복한다. 이어서, 상기 절차를 단일 Cα선행 포켓 1 에 대해 한 번 더 반복하여, 결합 그루브 내에 위치하는 골격 Cα위치의 라이브러리를 생성시킨다.
생성되는 골격의 수는 여러 요인에 의존한다: '허용된 위치의 구' 의 크기; 포켓 1 위치에서 '일차 구' 의 격자의 세밀함; 후속 Cα의 위치를 정하는데 사용되는 Φ및 Ψ각의 단계적 회전의 세밀함. 상기 방법을 이용하여, 커다란 골격 라이브러리가 생성될 수 있다. 골격 라이브러리가 커질수록, MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 내의 특정 펩티드에 대한 최적의 피트 (fit) 가 발견될 가능성이 높아질 것이다. 결합 도메인의 아미노산과의 충돌로 인해, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자 모델의 도킹에 적합하지는 않을 것이므로, 각각의 대립유전자에 대해, 상기 대립유전자에 의해 수용될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의 서브세트를 생성한다. MHC 클래스 II 분자 모델과 함께 골격 라이브러리의 이용은, 각각의 허용되는 골격에 도킹된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각 위치에서 각각의 아미노산에 대해 허용된 측쇄 입체구조로 구성되는 방대한 데이타베이스를 생성시킨다. 상기 데이타 세트는, MHC 클래스 II 분자가 골격에 도킹되고, 아미노산 측쇄가 목적하는 위치에서 골격에 그래프트되는 단순한입체 오버랩 함수를 이용하여 생성된다. 측쇄의 각각의 회전가능한 결합은 설정된 간격으로 단계적으로 회전되며, 수득된 원자 위치는 언급된 결합에 의존한다. 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄 원자간의 상호작용이 주지되며, 위치는 하기 기준에 따라 허용되거나 거부된다: 그 때까지 배치된 모든 원자의 겹침의 총 합은 소정 값을 초과하지 말아야 한다. 따라서, 입체구조 탐색의 엄격성 (stringency) 은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 총 오버랩에 대한 소정 한계의 함수이다. 상기 후자의 값은 특정 포켓이 경직된 것으로 공지된 경우 작을 수 있지만, 엄격성은 포켓 측쇄의 위치가 비교적 유동적인 것으로 공지된 경우 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓 내에서 유연성의 변동을 모사할 수 있다. 이어서, 각각의 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 경우, 상기 입체구조 탐색을 각 골격의 매 위치마다 모든 아미노산에 대해 반복하여, 측쇄 입체구조의 방대한 데이타베이스를 생성시킨다.
상술된 골격/측쇄 입체구조의 거대 데이타베이스를 스캐닝하여 실험적으로 유도되어야 하는 펩티드 리간드 입체구조와 함께 MHC 클래스 II 분자 모델간의 결합 에너지를 추정하기 위해, 적합한 수학적 표현을 사용한다. 따라서, 하기 계산에 9 내지 20 개 아미노산 길이 (길이는 각각의 스캐닝에 대해 일정하게 유지됨) 의 각각의 가능한 펩티드를 적용시켜, 잠재적인 T 세포 에피토프에 대해 단백질을 스캐닝한다: 상기 분자에 대해 허용되는 펩티드 골격과 함께 MHC 클래스 II 분자를 선택하고, 목적하는 펩티드 서열에 해당하는 측쇄를 그 위에 그래프트한다. 골격 상의 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 정체 및 원자간 거리 데이타를 상기아미노산에 허용되는 각각의 입체구조에 대해 수집한다 (상술한 데이타베이스로부터 수득됨). 이를 골격을 따라 각각의 측쇄에 대해 반복하고, 점수계산 함수를 이용하여 펩티드 점수를 유도한다. 상기 골격에 대한 최고 점수를 간직하고, 선택된 모델에 대해 허용된 각각의 골격에 대해 절차를 반복한다. 허용된 모든 골격에 대한 점수를 비교하고, 최고 점수를 상기 MHC 클래스 II 모델에서 목적하는 펩티드에 대한 펩티드 점수로 간주한다. 이어서 스캐닝되는 단백질로부터 유도되는 가능한 모든 펩티드로써 각각의 모델에 대해 상기 절차를 반복하고, 모델 대비 펩티드 점수를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 결합 친화성 계산에 제시되는 각각의 리간드는 상술한 바와 같은 펩티드 또는 단백질에서 선택되는 아미노산 절편이다. 따라서, 상기 리간드는 공지된 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되는 약 9 내지 20 개 아미노산 길이의 아미노산 연장물에서 선택된다. "아미노산" 및 "잔기" 라는 용어는 이후 동등한 용어로 간주된다. 조사될 펩티드의 연속적 아미노산이 골격 라이브러리로부터의 골격 상에 그래프트된 형태인 리간드를, 펩티드 골격의 C"-α원자의 좌표를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리로부터의 MHC 클래스 II 분자의 결합 틈 내에 위치시키고, 각각의 측쇄에 허용되는 입체구조를 허용되는 입체구조의 데이타베이스로부터 선택한다. 관련된 원자 정체 및 원자간 거리를 또한 상기 데이타베이스로부터 검색하고, 펩티드 결합 점수를 계산하는 데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 리간드를 위치 지정 돌연변이화에 대한 후보물로 지정한다. 지정된 리간드 내 (즉, 관심단백질 내임)에 아미노산 치환을 수행한 후, 점수계산 함수를 이용해서 재시험하여, 결합 친화도를 소정 역치값 미만으로 감소시키는 변화를 결정한다. 이어서, 상기 변화를 관심 단백질 내로 도입하여 T 세포 에피토프를 제거시킬 수 있다. 펩티드 리간드와 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 사이의 결합에는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비공유 상호작용이 관여된다: 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 (친유성) 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 설명되는 바와 같은 펩티드 점수계산 함수에 포함된다. 수소 결합은 극성 또는 하전된 기 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합이고, 2 개의 다른 원자에 의해 공유되는 수소 원자로 구성된다는 것이 이해되어야 한다. 수소 공여자의 수소는 양전하를 갖는 반면, 수소 수용자는 부분적인 음전하를 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용의 목적 하에, 수소 결합 공여자는 수소가 부착된 질소, 또는 산소 또는 질소에 부착된 수소일 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 부착되지 않은 산소, 수소가 부착되지 않고 1 또는 2 개의 연결을 갖는 질소, 또는 1 개의 연결만을 갖는 황일 수 있다. 특정 원자, 예컨대 수소에 부착된 산소 또는 이민 질소 (예, C=NH) 는 수소 수용자 및 공여자 둘 다 될 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/몰 범위이고, 반 데르 발스 결합보다 훨씬 더 강하지만, 공유 결합보다는 약하다. 수소 결합은 또한 매우 방향성이 있고, 공여자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 함께 선형이 될때 가장 강하다. 정전기적 결합은, 반대로 하전된 이온쌍 사이에서 형성되며, 상호작용의 강도는 쿨롱의 법칙에 따라 원자간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍 사이의 최적 거리는 약 2.8Å 이다. 단백질/펩티드 상호작용에서, 정전기적 결합은 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신과 아스파르테이트 또는 글루타메이트 사이에 형성될 수 있다. 결합의 강도는 이온화기의 pKa 및 매질의 유전 상수에 의존할 것이지만, 이들은 대략 수소 결합의 강도와 유사하다. 친유성 상호작용은 단백질 및 펩티드 리간드 사이에 일어나는 호의적인 소수성-소수성 접촉이다. 통상적으로 이들은, 용매에 노출되지 않도록 결합 그루브의 포켓 내에 묻혀있는 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄 사이에 일어날 것이다. 소수성 잔기의 용매로의 노출은, 주위 용매 분자가 서로 수소 결합을 형성하도록 강요되어, 우리 모양의 포접화합물 (clathrate) 구조를 형성하므로 매우 불리하다. 생성되는 엔트로피의 감소도 매우 불리하다. 친유성 원자는 극성도 수소 수용자도 아닌 황이거나, 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다. 반 데르 발스 결합은 3 - 4Å 떨어진 원자 사이에서 발견되는 비특이적 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 약하고 덜 특이적이다. 원자 주위의 전하 분포는 시간에 따라 변화하며, 어떤 경우에도 전하 분포는 비대칭적이다. 상기 일시적인 전하의 비대층은 주위 원자에서도 유사한 비대칭을 유도한다. 생성된 원자 사이의 인력은 반 데르 발스 접촉 거리에서 최대치에 이르지만, 약 1Å 내지 약 2Å 에서 급격히 감소한다. 반대로, 원자가 상기 접촉 거리 미만으로 분리되면, 원자의 외부 전자 구름이 겹치면서, 점점 더 강해지는 척력이 우세해진다. 인력이 정전기적 및 수소 결합에 비해 비교적 약하지만 (약 0.6 Kcal/몰), 척력은 특히 펩티드 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있는지 여부를 결정하는데 매우 중요할 수 있다.
한 구현예에서는, Boehm 점수계산 함수 (SCORE1 접근법) 를 사용하여 결합 상수를 추정한다 (Boehm, H. J.,J. Comput Aided Mol. Des.,8(3): 243-256 (1994), 본원에 그 전문이 도입됨). 또다른 구현예에서는, 점수계산 함수 (SCORE2 접근법) 를 사용하여, T 세포 에피토프를 포함하는 리간드의 지표로서 결합 친화성을 추정한다 (Boehm, H. J.,J. Comput Aided Mol. Des.,12(4): 309-323 (1998) 본원에 그 전문이 도입됨). 그러나, 상기 참고문헌에 기재된 바와 같은 Boehm 점수계산 함수는, 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있음이 이미 공지되어 있고, 단백질/리간드 복합체의 구조가 해석되었으며, 해석된 구조가 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에 존재하는 경우의 단백질에 대한 리간드의 결합 친화성을 추정하는 데 사용된다. 따라서, 점수계산 함수는 공지된 긍정적 결합 데이타의 덕에 개발되었다. 긍정적 및 부정적 결합자들 사이의 구별을 가능하게 하기 위해, 반발 항목이 등식에 첨가되어야 한다. 또한, 상기 Boehm 함수의 면적 기준 에너지 항목을 이용하기보다는 쌍쌍의 (pairwise) 친유성 상호작용을 계산하여, 보다 만족스러운 결합 에너지의 추정이 얻어진다. 따라서, 바람직한 구현예에서는 결합 에너지가 변경된 Boehm 점수계산 함수를 이용하여 추정된다. 변경된 Boehm 점수계산 함수에서는, 단백질 및 리간드 사이의 결합 에너지 (ΔGbind)가 하기 파라미터를 고려하여 추정된다: 리간드의 전체적인 병진 및 회전 엔트로피의 소실로 인한 결합 에너지의 감소 (ΔG0); 1 개 이상의 파트너가 중성인 경우의 이상적인 수소 결합의 기여 (ΔGhb); 비교란 (unperturbed) 이온 상호작용의 기여 (ΔGionic);친유성 리간드 원자와 친유성 수용자 원자 사이의 친유성 상호작용 (ΔGlipo); 리간드의 내부 자유도 동결, 즉 각각의 C-C 결합에 대한 회전 자유의 감소로 인한 결합 에너지의 소실 (ΔGrot); 단백질과 리간드 사이의 상호작용 에너지 (EVdW). 상기 항목을 고려하여 수학식 1 을 수득한다:
[수학식 1]
(ΔGbind) = (ΔG0) + (ΔGhb×Nhb) + (ΔGionic×Nionic) + (ΔGlipo×Nlipo) + (ΔGrot+ Nrot) + (EVdW).
식 중, N 은 특정 항목에 대해 한정하는 상호작용의 수이고, 한 구현예에서, ΔG0, ΔGhb, ΔGionic, ΔGlipo및 ΔGrot은 각각 하기 값을 갖는 상수이다: 5.4, -4.7, -4.7, -0.17, 및 1.4.
항목 Nhb는 하기 수학식 2 에 따라 계산된다:
[수학식 2]
Nhb= Σh-bondsf (ΔR, Δα) × f (Nneighb) × fpcs
f (ΔR, Δα) 는 이상적인 상황으로부터의 수소 결합의 큰 편차를 설명하는 페널티 함수이며, 수학식 3 에 따라 계산된다:
[수학식 3]
f (ΔR, Δ-α) = f1 (ΔR) × f2 (Δα)
[식 중, ΔR ≤TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 이거나
ΔR ≤0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 - (ΔR - TOL)/0.4 이거나
ΔR > 0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 0 이고,
또한: Δα < 30°인 경우, f2 (Δα) = 1 이거나
Δα ≤ 80°인 경우, f2 (Δα) = 1 - (Δα-30)/50 이거나
Δα > 80°인 경우, f2 (Δα) = 0 이며,
TOL 은 수소 결합 길이 = 0.25Å 에서의 관용 편차이고,
ΔR 은 이상값 = 1.9Å 로부터 H-O/N 수소 결합 길이의 편차이며,
Δα는 이상값 180°로부터 수소 결합각 ∠N/O-H..O/N의 편차이다].
f(Nneighb) 는 단백질 표면의 오목한 부분과 볼록한 부분을 구별하므로, 단백질 표면에서 발견되는 것보다는 포켓 내에서 발견되는 극성 상호작용에 더 큰 비중을 부여한다. 상기 함수는 하기 수학식 4 에 따라 계산된다:
[수학식 4]
f(Nneighb) = (Nneighb/Nneighb,0)α[식 중, α = 0.5 이다].
Nneighb는 임의의 주어진 단백질 원자에 대해 5Å 보다 더 가까운 비수소 단백질 원자의 수이다.
Nneighb.0는 상수 = 25 이다.
fpcs는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적을 허용하는 함수이므로, 강한 수소 결합과 약한 수소 결합 사이를 구별하며, 그 값은 하기 기준에 따라 결정된다:
Apolar/NHB< 10Å2인 경우 fpcs= β이거나
Apolar/NHB> 10Å2인 경우 fpcs= 1 이다
[식 중, Apolar는 극성 단백질-리간드 접촉면의 크기이고,
NHB는 수소 결합의 수이며,
β는 그 값이 1.2 인 상수이다].
변경된 Boehm 점수계산 함수의 실행에 있어서, 동일한 기하학적 의존성이 가정되므로, 이온성 상호작용의 기여인 ΔGionic은 상술된 수소 결합의 기여에 대해서와 유사한 방식으로 계산된다.
항목 Nlipo는 하기 수학식 5 에 따라 계산된다:
[수학식 5]
Nlipo= Σ1Lf(r1L)
f(r1L) 은 모든 친유성 리간드 원자, l 및 모든 친유성 단백질 원자, L 에 대해 하기 기준에 따라 계산된다:
r1L≤ Rl 인 경우 f(r1L) =1,
R2 < rlL> R1 인 경우 f(r1L) = (r1L-R1)/ (R2-R1),
r1L≥ R2 인 경우 f(r1L) = 0
[식 중, R1 = rl vdw+ rL vdw+ 0. 5 이고,
R2 = R1 + 3.0 이며,
rl vdw은 원자 l 의 반 데르 발스 반경이고,
rL vdw은 원자 L 의 반 데르 발스 반경이다].
항목 Nrot는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이며, 비환식 sp3-sp3및 sp3-sp2결합의 수로 여겨진다. 말단 -CH3또는 -NH3의 회전은 고려되지 않는다.
최종 항목 EVdW는 하기 수학식 6 에 따라 계산된다:
[수학식 6]
EVdW= ε1ε2((r1 vdw+ r2 vdw)12/r12- (r1 vdw+ r2 vdw)6/r6)
[식 중, ε1및 ε2는 원자 정체에 근거하는 상수이고,
r1 vdw+ r2 vdw는 반 데르 발스 원자 반경이며,
r 은 원자 쌍 사이의 거리이다].
수학식 6 에 대해, 한 구현예에서, 상수 ε1및 ε2에 각각 하기의 원자 값이 주어진다: C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황 원자에 대한 것). 수학식 5 및 6 에 대해, 반 데르 발스 반경에 하기의 원자 값이 주어진다: C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Å.
상기 수학식에서 주어진 모든 소정의 값 및 상수는, 특히 본원에서 수행되는 계산의 유형에 따라 단백질 리간드 상호작용에 대한 현재의 이해 내용의 한계 내에서 결정되는 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 상기 점수계산 함수가 더욱 개선됨에 따라, 상기 값 및 상수가 변할 수 있으므로, 리간드에 대한 단백질의 결합 에너지의 추정 차원에서 목적하는 결과를 제공하는 임의의 적합한 수치값이 사용될 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 범위 내에 속한다.
상술한 바와 같이, 점수계산 함수는 측쇄 임체구조, 원자 정체 및 원자간 거리의 데이타베이스에서 추출되는 데이타에 적용된다. 본원의 목적 하에, 상기 데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4 개의 해석된 구조이다. 상기 기재로부터, 본 발명의 전산적 방법의 구축의 모듈적 성질은, 펩티드 골격 라이브러리, 및 상술한 바와 같이 펩티드 점수계산 함수에 의해 처리될 수 있는 부가적 데이터 세트를 생성시키는 측쇄 입체구조 탐색 함수를 사용하여, 신규 모델이 간단하게 첨가되고 스캐닝될 수 있음을 의미하는 것이 자명하다. 이는, 존재하는 대립유전자의 보다 정확한 모델을 생성시키도록 데이타가 존재한다면, 스캐닝된 MHC 클래스 II 분자의 목록이 쉽게 증가되게 하거나, 구조 및 관련 데이타가 대체될 수 있게 한다.
본 발명의 예측 방법은, 다양한 MHC 클래스 II 분자에 대한 친화성이 미리실험적으로 결정된 다수의 펩티드를 포함하는 데이타 세트에 대해 보정될 수 있다. 계산된 데이타 대 실험적 데이타를 비교함으로써, 모든 실험적으로 결정된 T 세포 에피토프가 정확히 예측된 것으로 공지되는 하한치가 결정될 수 있다.
상기 점수계산 함수는 이용가능한 일부 복잡한 방법론에 비해 비교적 단순하지만, 계산은 극히 신속히 수행됨이 이해되어야 한다. 또한, 그 목적이, 선택된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 내에 도킹된 각각의 펩티드에 대한 실제 결합 에너지 그 자체를 계산하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 기본적인 목적은, 선택된 단백질의 일차 구조 (즉, 아미노산 서열)를 근거로 T 세포 에피토프의 위치 예측에 도움을 주는, 비교적인 결합 에너지 데이타를 수득하는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 상기 선택된 역치값 초과의 결합 에너지는 리간드 내 T 세포 에피토프의 존재를 제시할 것이다. 이어서, 리간드를 1 회 이상의 아미노산 치환 처리하여, 결합 에너지를 재계산할 수 있다. 신속한 계산의 속성으로 인해, 상기 펩티드 서열의 조작은, 비용효과적으로 이용가능한 컴퓨터 하드웨어 상의 프로그램의 사용자 인터페이스 내에서 쌍방향으로 수행될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 하드웨어에 대한 거대한 투자가 요구되지 않는다. 당업자에게는, 동일한 목적을 위해 다른 이용가능한 소프트웨어를 사용할 수 있음이 자명할 것이다. 특히, 단백질 결합 부위 내로 리간드를 도킹시킬 수 있는 보다 복잡한 소프트웨어를 에너지 최소화와 연관시켜 이용할 수 있다. 도킹 소프트웨어의 예에는 하기가 있다: DOCK (Kuntz 등,J. Mol. Biol.,161: 269-288 (1982)), LUDI (Boehm, H. J.,J. Comput Aided Mol. Des.,8: 623-632 (1994)) 및 FLEXX (RareyM., 등,ISMB,3: 300-308 (1995)). 분자 모델링 및 조작 소프트웨어의 예에는 하기가 포함된다: AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.). 상기 전산적 방법의 사용은, 필요한 계산을 수행하는 데 걸리는 처리 시간의 길이로 인해, 본 발명의 방법의 효율을 상당히 제한할 것이다. 그러나, 상기 방법들이, 본 발명의 방법을 통해 '긍정적 결합자' 로 밝혀지는 펩티드에 대한 보다 정확한 결합 에너지의 계산을 수득하기 위한 '2 차 스크린' 으로 사용될 수도 있다. 복잡한 분자 기계적 또는 분자 역학적 계산을 위한 처리 시간의 제한은, 상기 계산을 수행하는 소프트웨어의 고안 및 컴퓨터 하드웨어의 현재의 기술 한계 둘 다에 의해 정의되는 것이다. 미래에는, 보다 효율적인 코드의 기록 및 지속적인 컴퓨터 프로세서의 속도 증가로 인해, 보다 제어가능한 시간틀 내에서 상기 계산이 이루어질 것임을 예견할 수 있다. 폴딩된 단백질 구조 내에서 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 거대분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있고: [Brooks, B. R., 등,J. Comput. Chem.,4: 187-217 (1983)], 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있으며: [Dauber-Osguthorpe 등,Proteins 4(1): 31-47 (1988)], 이들은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다. 유용한 배경 정보는 또한, 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Fasman, G. D. 편저,Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9].

Claims (29)

  1. 생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없고, 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역원성의 소실이 본래 비개질된 분자로부터 유도된 1 개 이상의 T 세포 에피토프를 제거함으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 분자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 면역원성의 소실이 상기 분자에서 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수의 감소에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 분자.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 1 개의 T 세포 에피토프가 제거된 것을 특징으로 하는 분자.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 본래 존재하는 T 세포 에피토프는 클래스 II 상의 제시를 통해 T 세포를 자극하거나 이에 결합할 수 있는 능력을 나타내는 펩티드 서열 또는 MHC 클래스 II 리간드인 것을 특징으로 하는 분자.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 펩티드 서열이 표 1 에 나타내어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분자.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프 내 1-9 개의 아미노산 잔기가 변경된 것을 특징으로 하는 분자.
  8. 제 7 항에 있어서, 1 개의 아미노산 잔기가 변경된 것을 특징으로 하는 분자.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)의 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환인 것을 특징으로 하는 분자.
  10. 제 9 항에 있어서, 1 회 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 2 에 나타내어진 바와 같이 수행되는 것을 특징으로 하는 분자.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 분자에서 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수의 감소를 위해, 1 회 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 3 에 나타내어진 바와 같이 추가 수행되는 것을 특징으로 하는 분자.
  12. 제 9 항에 있어서, 1 회 이상의 아미노산 치환이 표 3 에 나타내어진 바와 같이 수행되는 것을 특징으로 하는 분자.
  13. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)에서의 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 결실인 것을 특징으로 하는 분자.
  14. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 본래 존재하는 것들에 대한 특정 위치(들)에서의 아미노산(들)의 부가인 것을 특징으로 하는 분자.
  15. 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자의 생물학적 활성을 복구시키기 위해 부가적으로 추가 변경이 수행되는 것을 특징으로 하는 분자.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 부가적인 추가 변경이 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실인 것을 특징으로 하는 분자.
  17. 아미노산 변경이 상동성 단백질 서열을 참조하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 개질 분자.
  18. 아미노산 변경이 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 개질 분자.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 개질 과립구 집락 자극인자 (G-CSF) 를 코딩하는 DNA 서열.
  20. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함께 함유하는 약학 조성물.
  21. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자의 제조 방법:
    (i) 폴리펩티드 또는 그의 일부의 아미노산 서열의 결정;
    (ii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의한, 단백질의 아미노산 서열 내의 잠재적인 1 개 이상의 T 세포 에피토프의 동정;
    (iii) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 또는 펩티드-MHC 착물과 T 세포의 결합에 의해 측정된 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소 또는 제거시키는 방식으로 개질된, 동정된잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안;
    (iv) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축 및 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기 변이체의 평가; 및
    (v) 선택적으로 단계 (ii) - (iv) 의 반복.
  22. 제 21 항에 있어서, 단계 (iii) 이 임의의 본래 존재하는 T 세포 에피토프 내에서 1-9 개의 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 변경이 상동성 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii) 가 하기 단계들에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역의 선택; (b) 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고 소정의 균일 크기를 갖는, 겹치는 아미노산 잔기 절편의 순차적 샘플링; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 소수성 아미노산 잔기 측쇄 각각에 대해 지정된 값의 합산에 의한, 각각의 상기 샘플링된 절편 각각에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 점수 계산; 및 (d)상기 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 점수를 기준으로, 펩티드의 치료적 효용성을 실질적으로 감소시키지 않으면서 펩티드의 전체 MHC 클래스 II 결합 점수를 바꾸기 위한, 개질에 적합한 1 개 이상의 상기 절편의 동정
  25. 제 24 항에 있어서, 단계 (c) 는 하기에 의해, 12-6 반 데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 입체 에너지 항목을 포함하도록 개질된 Boehm 점수계산 함수를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 제 1 데이타베이스를 제공;
    (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 제 2 데이타베이스를 제공;
    (3) 상기 제 1 데이타베이스로부터 모델 선택;
    (4) 상기 제 2 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격의 선택;
    (5) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄의 동정;
    (6) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화도 값의 결정;
    및 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5) 를 반복.
  26. 표 1 에 나타낸 바와 같은 군으로부터 선택된, 면역학적으로 비개질된 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)로부터 생성되고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는, 13머 (13mer) T 세포 에피토프 펩티드.
  27. 제 26 항에 따른 13머 T 세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상의 연속 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드 서열.
  28. 생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 제조를 위한, 제 26 항에 따른 13머 T 세포 에피토프 펩티드의 용도.
  29. 생체 내에서 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자에 비해 면역원성이 적거나 실질적으로 없는 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 제조를 위한, 제 27 항에 따른 펩티드 서열의 용도.
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