KR20030081480A - 감소된 면역원성을 갖는 변형된 모양체 신경자극 인자（ｃｎｔｆ） - Google Patents

Abstract

본 발명은 특히 인간에게, 구체적으로는 치료용으로 투여되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는, 인간 대상체로의 투여시에 면역 반응을 유인하는 폴리펩티드 성향의 감소를 초래하도록 변형된 변형 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 발명은, 생체내에서 사용될 경우, 임의의 미변형 단백질과 비교하여, 면역원성이 실질적으로 없거나 감소된 CNTF 단백질을 유도하기 위한 인간 모양체 신경자극 인자 (CNTF)의 변형에 관한 것이다.

Description

감소된 면역원성을 갖는 변형된 모양체 신경자극 인자 （ＣＮＴＦ）{MODIFIED CILIARY NEUROTROPHIC FACTOR (CNTF) WITH REDUCED IMMUNOGENICITY}

치료 단백질에 대한 원치않는 면역 반응으로 인해 치료 단백질의 효험성이 제한되는 수많은 경우가 존재한다. 몇몇 마우스 모노클로날 항체는 수많은 인간 질병 환경에서 치료제로서 장래성을 보여주었지만, 일부 경우에 심각한 정도의 인간 항-뮤린 항체 (HAMA) 반응의 유도로 인해 실패되었다 [Schroff, R.W. 등 (1985)Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D.L. 등 (1985)J. Immunol. 135:1530-1535]. 모노클로날 항체의 경우, HAMA 반응을 감소시키고자 수많은 기술이 개발되어 왔다 [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이러한 재조합 DNA 접근법은 일반적으로 최종 항체 구축물 중에 마우스 유전 정보를 감소시키는 반면, 최종 구출물 중에 인간 유전 정보는 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화" 항체는, 일부 경우에, 여전히 환자에게서 면역 반응을 유인하였다 [Issacs J.D. (1990)Sem. Immunol. 2:449, 456; Rebello, P.R. 등 (1999)Transplantation 68: 1417-1420].

항체가 치료제로서 투여되는 폴리펩티드 (면역반응을 상승시킬 수 있음)의 유일한 분야는 아니다. 인간 내에 존재하는 것과 동일한 인간 아미노산 서열을 갖는 인간 기원의 단백질 조차도 인간에게서 면역반응을 여전히 유도할 수 있다. 주목할만한 예로는 무엇보다도 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 [Wadhwa, M. 등 (1999)Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] 및 인터페론 알파 2 [Russo, D. 등 (1996)Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein, R. 등 (1988)New Engl. J. Med. 318: 1409-1413] 의 치료 용도가 포함된다.

면역 반응 유도의 주된 인자는 MHC 클래스 II 분자 상으로의 제시를 통한 T-세포의 활성화를 자극할 수 있는 단백질 펩티드, 소위 "T-세포 에피토프" 내에 존재한다. 상기 잠재적인 T-세포 에피토프는 MHC 클래스 II 분자와의 결합 활성을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로서 통상적으로 정의된다. 상기 T-세포 에피토프는 MHC 결합을 확립하기 위해 측정될 수 있다. 함축적으로, "T-세포 에피토프" 는, MHC 분자에 결합될 경우, T-세포 수용체 (TCR) 에 의해 인식될 수 있고, 적어도 원칙적으로는 T-세포 반응을 촉진시키기 위해 TCR 에 체결되어 상기 T-세포의 활성화를 유도하는 에피토프를 의미한다. 그러나, 일반적으로, 상기 펩티드는 최종 단백질이 투여되는 유기체 내에서 "자기 (self)" 로서 인식되어지기 때문에, MHC 클래스 II 분자와 결합하는 것으로 밝혀진 일부 펩티드는 단백질 서열 중에 유지될 수 있는 것으로 이해된다.

이러한 T-세포 에피토프 펩티드 중 일부는 세포내에서의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 분해 동안에 방출될 수 있고, 이어서 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 의 분자에 의해 제시된 다음, T-세포의 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있다. MHC 클래스 II 에 의해 제시된 펩티드의 경우, 상기한 T-세포의 활성화는 예를 들어 상기 항체를 생성하는 B-세포의 직접적인 자극에 의해 항체 반응을 일으킬 수 있다.

MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T-세포 선별 및 활성화에 중심적인 역할을 하는 상당히 다형성(polymorphic)인 단백질의 군이다. 인간 백혈구 항원 군 DR (HLA-DR) 은 상기 군의 단백질의 주요한 이소타입이고, 본 발명의 주요 초점이다. 그러나, 이소타입 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능을 수행하며, 따라서 본 발명은 이들에도 동일하게 적용할 수 있다. MHC 클래스 II DQ 분자는 이들의 C-말단에서 세포막을 통해 삽입된 알파 및 베타 사슬로 이루어진다. 각각의 이종이합체 (hetero-dimer) 는 9 내지 20 아미노산 길이의 다양한 펩티드에 결합하는 리간드 결합 도메인을 갖지만, 결합 그루브 (groove) 는 최대 11 개의 아미노산까지 수용할 수 있다. 리간드 결합 도메인은 아미노산 1 내지 85 의 알파 사슬 및 아미노산 1 내지 94 의 베타 사슬로 구성된다. DQ 분자는 최근 상동성 구조를 갖는 것으로 보여졌으며, DP 계열의 단백질도 또한 매우 유사할 것으로 예상된다. 인간에서, DR 이소타입 중 약 70 개의 상이한 알로타입이 공지되었으며, DQ 의 경우 30 개의 상이한 알로타입이 존재하고, DP 의 경우 47 개의 상이한 알로타입이 공지되었다. 각각의 개체는 2 내지 4 개의 DR 대립유전자, 2 개의 DQ 및 2 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 수많은 DR 분자의 구조가 해석되었으며, 이러한 구조는 펩티드의 소수성 잔기 (포켓 잔기)를 체결하는 수많은 소수성 포켓을 갖는 개방말단형(open-ended) 펩티드 결합 그루브에 관한 것이다 [Brown 등Nature(1993)364: 33; Stern 등 (1994)Nature 368: 215]. 클래스 II 분자의 상이한 알로타입을 판명하는 다형성은 펩티드 결합 그루브내 펩티드에 대한 상이한 결합 표면의 폭넓은 다양화(diversity)에 기여하고, 집단 수준에서 외래 단백질을 인식하여 병원성 유기체에 대한 면역반응을 일으키는 능력에 대한 최대의 융통성을 보증한다. 상이한 지리학상 집단 및 인종군 중의 뚜렷한 "계열" 을 갖는 리간드 결합 도메인내에는 상당량의 다형성이 존재한다. 이런 다형성은 펩티드 결합 도멘인의 결합 특성에 영향을 미쳐서, 일부 중복될 수 있을지라도, 상이한 "계열"의 DR 분자는 상이한 서열 특성을 갖는 펩티드에 대해 특이성 가질 것이다. 이런 특이성은 Th-세포 에피토프가 유도되는 동일 단백질 상에 존재하는 β-세포 에피토프에 대한 항체 반응의 유도를 궁극적으로 책임지는 Th-세포 에피토프 (클래스 II T-세포 반응)의 인식을 결정한다. 따라서, 개체내 단백질에 대한 면역 반응은 개체의 HLA-DR 알로타입의 펩티드 결합 특이성의 기능인 T-세포 에피토프 인식에 의해 상당한 영향을 받을 것이다. 따라서, 전체 집단에 관련하여 단백질 또는 펩티드내 T-세포 에피토프를 동정하기 위해서, 가능한한 전세계 집단의 높은 백분율로 전환하도록, 가능한한 다양한 세트의 HLA-DR 알로타입의 결합 특성이 요구될 수 있다.

본 발명의 목적 단백질과 같은 치료 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로를 통해 진행된다. 이때, 외인성 단백질이 삼켜지고, DR, DQ 또는 DP 형태의 MHC 클래스 II 분자와 연합된 제시를 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 무엇보다 전문 항원제시세포 (APC), 예컨대 대식세포 및 수상돌기세포에 의해 발현된다. T-세포 표면 상의 동종(cognate) T-세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 체결은, 일정한 다른 수용체, 예컨대 CD4 분자의 교차 결합과 함께, T-세포 내의 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 다른 림프구, 예컨대 항체를 생성하는 B-세포를 더욱 활성화시키거나, 전체 세포 면역 반응으로서 T-킬러 세포를 활성화시키는 사이토카인의 방출을 유도한다. APC 표면 상에서의 제시를 의한 소정의 MHC 클래스 II 에 결합하는 펩티드의 능력은 수많은 인자에 의존하며, 가장 중요하게는 그의 1 차 서열에 의존한다. 이는, 이의 단백질분해 절단 성향과, MHC 클래스 II 분자의 펩티드 결합 내에서의 크레프트(cleft) 결합을 위한 친화도 모두에 영향을 미친다. MHC 클래스 II/APC 표면 상의 펩티드 복합체는 펩티드의 노출 잔기 및 MHC 클래스 II 분자 모두에 의해 제공된 항원 결정기를 인식할 수 있는 특정 T-세포 수용체 (TCR) 에 대한 결합면을 나타낸다.

당업계에서, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 합성 펩티드를 동정하는 절차가 존재한다 (예컨대, WO 98/52976 및 WO 00/34317). 이러한 펩티드는, 처리 경로 또는 다른 현상으로 인해, 모든 상황에서, 특히 생체내에서 T-세포 에피토프로서 기능할 수 있는 것은 아니다. T-세포 에피토프 동정은 에피토프의 제거를 제 1 단계로 한다. 단백질로부터 잠재적인 T-세포 에피토프의 동정 및 제거는 종래에 개시되어 왔다. 당업계에서, 실험적으로 결정된 T-세포 에피토프 중에서 인식 서열 모티프를 스캐닝하는 컴퓨터적 수단에 의해, 다르게는 MHC 클래스 II 결합 펩티드, 특히 DR-결합 펩티드를 예상하는 컴퓨터적 기술을 사용하여 통상적으로 T-세포 에피토프를 검출할 수 있는 방법이 제공되었다. WO 98/52976 및 WO 00/34317 은 인간 MHC 클래스 II DR 알로타입의 서브세트에 결합하는 잠재성을 갖는 폴리펩티드 서열을 동정하는 컴퓨터적 스레딩(threading) 접근법을 제시한다. 상기 제시에 의하면, 예상된 T-세포 에피토프는 비인간 및 인간 기원의 치료 항체 또는 비항체의 1 차 서열내에서 신중한 아미노산 치환의 사용에 의해 제거된다.

인간 또는 실험 동물 대상체 유래의 말초 혈액 샘플로부터 T-세포 클론에 결합할 수 있는 합성 펩티드와 조합된 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 탐색하는 다른 기술이 당업계에서 사용되고 있으며 [Kern, F. 등 (1998)Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W.W. 등 (2001)TRENDS in Immunology 22: 583-588], 에피토프 동정 전략으로 또한 탐색될 수 있다.

상기 지적한 바와 같이, 이의 결과로서, 원칙적으로는 치료학적으로 가치있고 본래 면역원성인 소정의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 T-세포 에피토프를 동정하고, 이를 제거하거나 적어도 감소시키는 것이 요구되고 있다.

상기 치료적으로 가치있는 분자 중 하나는 인간 모양체 신경 자극 인자 (CNTF) 이다. CNTF 는 각종 신경 세포류의 생존 인자이다. 이 단백질은 200 개의 아미노산 잔기를 포함하고, 다른 포유동물 기원의 CNTF 단백질과 상당한 서열 상동성을 공유한다. 인간 CNTF 에 대한 유전자가 인간에서 임상 실험용으로 이용될 수 있는 단백질의 재조합 형태로 클로닝되었다 [Masiakowaski, P. 등 (1991)Eur. J. Biochem. 57: 1003-1012; Negro, A. 등 (1991)Eur. J. Biochem. 201: 289-294]. CNTF 는 근위축성 외측 경화증 (amyostrophic lateral sclerosis) 과 같은 운동 뉴론 (motor neurone) 질환의 치료를 위한 치료제로서 조사중에 있다. 이 단백질은 비계가 적은 부위의 체질량과는 반대로 실질적으로 지방에 편향적인 중량 감소를 유도하고, 따라서 비만 치료의 상당한 가치를 또한 가질 수 있다.

이외에, 변형된 CNTF 를 포함하는 CNTF 분자 및 이의 용도가 제공되었지만 [US 5,349,056; US 5,332,67; US 5,667,968], 상기 개시물 중 어떤 것도 단백질의 면역원성 특성에 대한 T-세포 에피토프의 중요성을 인식하지 못하였고, 본 발명에 따른 방안에 따라 특이적이고 제어된 방식으로 상기 특성에 직접적으로 영향을 미치는 것에 대해 착상하지 못하였다. CNTF 의 1 차 서열은 하기와 같다:

그러나, 강화된 특성을 갖는 CNTF 유사체에 대한 지속적인 요구가 존재한다. 목적하는 강화는 또 다른 계획 및 상기 치료제의 발현과 정제 양식뿐만 아니라, 특히 단백질의 생물학적 특성의 개선도 포함한다. 인간 대상체에 투여될 경우, 생체내 특성의 강화에 대한 특정 요구도 필요하다. 이와 관련하여, 인간 대상체에서 면역 반응을 유도하는 잠재성이 감소되거나 없는 CNTF 를 제공하는 것이 매우 요구된다.

본 발명은 특히 인간에게, 구체적으로는 치료용으로 투여되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는, 인간 대상체로의 투여시에 면역 반응을 유인하는 폴리펩티드 성향의 감소를 초래하도록 변형된 변형 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 발명은, 생체내에서 사용될 경우, 임의의 미변형 단백질과 비교하여, 면역원성이 실질적으로 없거나 감소된 CNTF 단백질 변이체를 유도하기 위한 인간 모양체 신경자극 인자의 변형에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 감소된 면역원성을 갖는 변형된 CNTF 변이체를 생성할 수 있는 방법에 의해 상기 미변형 단백질로부터 유도된 T-세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다.

발명의 개요 및 상세한 설명

본 발명은 잠재적인 T-세포 에피토프의 수를 감소시키거나 제거하는 수단에 의해 면역 특성이 변형된 형태의 인간 모양체 신경자극 인자 (CNTF) 를 제공한다.

본 발명은 MHC 클래스 II 결합 잠재성으로 인해 잠재적인 T-세포 에피토프인 CNTF 1차 서열 중에서 동정된 서열을 개시한다. 본 개시물은 구체적으로 200 개의 아미노산 잔기를 갖는 인간 CNTF 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따라 특정 아미노산 치환, 부가 또는 결실에 의해 원칙적으로는 생물학적 활성에 영향을 주지 않으면서 변경된 상기 분자의 1 차 서열 중의 특정 위치를 개시한다. 면역원성의 소실이 생물학적 활성의 동시적소실에 의해서만 성취될 수 있는 경우, 상기 단백질의 아미노산 중의 추가적인 변경에 의해서 상기 활성을 회복시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 변형 분자의 제조 방법을 제공하며, 상기 T-세포 에피토프를 동정하는 상기 방법 모두는 면역원성 부위를 감소시키거나 제거하기 위해변경을 요구한다.

본 발명에 따른 단백질은 인간 대상체 내에서 증가된 순환 시간을 나타낼 것으로 예상되며, CNTF 에 대한 수많은 징후의 경우와 같은 만성 또는 재발 질환 환경에 특히 이점을 가질 것이다. 본 발명은 생체내에서 강화된 특성을 나타낼 것으로 예상되는 CNTF 단백질의 변형된 형태를 제공한다. 이러한 변형된 CNTF 분자는 약학적 조성물 중에 사용될 수 있다.

요약하자면, 본 발명은 하기 사항에 관한 것이다:

인간 CNTF 의 생물학적 활성을 가지면서, 생체내에서 사용될 경우 실질적으로 비(非)면역원성이거나 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미(未)변형 분자 보다 면역원성이 감소된 변형 분자;

상기 특정화된 분자로서, 상기 면역원성의 소실이 본래의 미변형 분자로부터 유도된 하나 이상의 T-세포 에피토프를 제거하는 것에 의해 성취됨을 특징으로 하는 분자;

상기 특정화된 분자로서, 상기 면역원성의 소실이 상기 분자로부터 유도된 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 수를 감소시키는 것에 의해 성취됨을 특징으로 하는 분자;

상기 특정화된 분자로서, 하나의 T-세포 에피토프가 제거됨을 특징으로 하는 분자;

상기 특정화된 분자로서, 상기 본래 존재하는 T-세포 에피토프가 클래스 II 상에서의 제시를 통해 T-세포를 자극하거나 결합시킬 수 있는 능력을 나타내는MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열을 가짐을 특징으로 하는 분자;

상기 특정화된 분자로서, 상기 펩티드 서열이 표 1 에 나타내어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 분자;

상기 특정화된 분자로서, 임의의 본래 존재하는 T-세포 에피토프 중의 1 내지 9 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 하나의 아미노산 잔기가 변경됨을 특징으로 하는 분자;

상기 특정화된 분자로서, 아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환, 부가 또는 결실임을 특징으로 하는 분자;

상기 특정화된 분자로서, 하나 이상의 아민소나 잔기 치환이 표 2 에 나타낸 바와 같이 수행됨을 특징으로 하는 분자;

상기 특정화된 분자로서, (추가적으로) 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 상기 분자로부터 유도된 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 알로타입 수의 감소를 위해 표 3 에 나타낸 바와 같이 수행됨을 특징으로 하는 분자;

상기 특정화된 분자로서, 필요한 경우 통상적으로 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실에 의해 추가적인 다른 변경을 상기 분자의 생물학적 활성을 회복하기 위해 수행됨을 특징으로 하는 분자;

상기 및 하기에 정의된 바와 같은 임의의 상기 특정된 변형 분자를 코딩하는 DNA 서열 또는 분자;

임의적으로 약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 상기 및/또는 특허청구범위에서 정의된 CNTF 의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물;

상기 인용된 특허청구범위 중 임의의 특허청구범위에서 정의된 CNTF 의 생물학적 활성을 갖는 변형 분자의 제조 방법에 있어서, 하기 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법: (i) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계; (ii) 실험관내 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술, 또는 생물학적 검사를 사용하여 펩티드와 MHC 분자의 결합을 측정하는 것을 포함하는 임의의 방법에 의해서, 단백질의 아미노산 서열 중에서 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정하는 단계; (iii) 실험관내 또는 컴퓨터 이용 기술, 또는 생물학적 검사를 사용하여 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정된 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 변형된, 동정된 잠재적인 T-세포 에피토프 중의 하나 이상의 아미노산을 갖는 새로운 서열의 변이체를 고안하는 단계; (iv) 재조합 DNA 기술에 의해 상기 서열 변이체를 구축하고, 목적하는 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계; 및 (v) 임의적으로 단계 (ii) 내지 (iv) 를 반복하는 단계.

상기 특정화된 방법으로서, 단계 (iii) 이 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프 중의 1 내지 9 개의 아미노산 잔기가 치환, 부가 또는 결실되어 수행됨을 특징으로 하는 방법;

상기 특정화된 방법으로서, 상기 변경이 상동성 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조로 하여 수행됨을 특징으로 하는 방법;

상기 특정화된 방법으로서, 상기 단계 (ii) 가 하기 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역의 선택 단계; (b) 소정의 균일한 크기를 가지며, 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 중복 아미노산 잔기 분획을 연속 샘플링하는 단계; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 분획에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값을 더하여 각각의 상기 샘플링된 분획에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 계산하는 단계; 및 (d) 상기 분획에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기준으로, 펩티드의 치료 이용성을 본질적으로 감소시키지 않고 펩티드에 대한 전체 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위한, 변형에 적합한 하나 이상의 상기 분획을 동정하는 단계; 이때, 단계 (c) 는 하기 단계에 의해 12-6 반데르 발스 (van der Waal's) 리간드-단백질 에너지 반발 항 및 리간드 배치 에너지 항을 포함하도록 변형된 봄 스코어링 함수 (Boehm scoring function) 를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 한다: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 첫번째 데이타 베이스를 제공하는 단계; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 두번째 데이타 베이스를 제공하는 단계; (3) 상기 첫번째 데이타 베이스로부터 모델을 선택하는 단계; (4) 상기 두번째 데이타 베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하는 단계; (5) 각각의 샘플링된 분획에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄를 동정하는 단계; (6) 각각 샘플링된 절편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화성 값을 결정하는 단계; 및 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 (1) 내지 (5)의 단계를 반복하는 단계;

잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖고, 면역원성이 미변형된 CNTF로부터 생성되며, 표 1 에 나타낸 기로부터 선택된 13mer T-세포 에피토프 펩티드, 및 실질적으로 면역원성이 없지만 생체내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형 분자 보다 면역원성이 감소된 CNTF 의 제조를 위한 이의 용도;

상기 특정화된 13mer T-세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기 (consecutive amino acid residue) 로 이루어진 펩티드 서열, 및 실질적으로 면역원성이 없거나 생체내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형 분자 보다 면역원성이 감소된 CNTF 의 제조를 위한 이의 용도;

상기 및 하기에 특정화된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있는 인간 CNTF 의 생물학적 활성을 갖는, 면역원성이 변형된 분자.

본 발명의 이해에 따르면, "T 세포 에피토프" 라는 용어는 MHC 클래스 II 에 결합할 수 있고, T 세포를 자극하고/하거나 또한 MHC 클래스 II 와의 복합체로 T 세포와 결합할 수 있는 (반드시 측정가능하게 활성화될 필요는 없음) 아미노산 서열을 의미한다. 본원 및 첨부되는 특허청구범위에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은 (본원에서 하기에 정의되는) 펩티드 결합에 의해 함께 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20 가지의 상이한 천연 생성 아미노산이 있으며, 이들의 임의의 수를 임의의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 사용되는 천연 생성 아미노산은 모두 L-배치를 갖는다. 합성펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2 가지 상이한 배치의 아미노산의 다양한 조합을 이용하는 통상적인 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 소수의 아미노산 단위만을 포함한다. 단 (short) 펩티드, 예컨대 10 개 미만의 아미노산 단위를 갖는 것들을 때로 "올리고펩티드" 로 부른다. 다른 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예컨대 100 개 전후를 포함하며, "폴리펩티드" 로 부른다. 통상적으로, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있고, "올리고펩티드" 는 통상적으로 "단" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 임의 언급은 또한 올리고펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "펩티드" 에 대한 임의 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 - 즉, 상이한 단백질의 수는 실제로 무한하다.

"알파 탄소 (Cα)" 는, 펩티스 사슬내에 있는 탄소-수소 (CH) 성분의 탄소 원자이다. "측쇄" 는 단순 또는 복합적인 기 또는 부분구조를 포함할 수 있고 펩티드의 차원과 비교하여 현저하게 다양할 수 있는 물리적 차원을 갖는, Cα에 대한 펜던트 기이다.

본 발명은 본원에 개시된 것과 실질적으로 동일한 1 차 아미노산 서열을 갖는 임의의 CNTF 종의 분자에 적용할 수 있고, 따라서 유전 공학적 수단 또는 다른 절차에 의해 유도된 CNTF 분자를 포함할 것이며, 200 아미노산 잔기 내외를 함유할 수 있다.

다른 포유동물 기원에서 동정된 바와 같은 CNTF 단백질은 통상적으로 본 발명의 개시물 중의 수많은 펩티드 서열을 갖고, 하기 개시된 나열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 수많은 펩티드 서열을 통상적으로 갖는다. 따라서, 이러한 단백질 서열은 본 발명의 범위에 동등하게 속한다.

본 발명은 자가조직 숙주 (autologous host) 내로 도입된 가용성 단백질이 면역 반응을 유발하여, 상기 가용성 단백질에 결합하는 숙주 항체의 발전을 만들어낸다는 실제 현실을 극복하기 위한 것으로 간주된다. 그 중에서도 한 예는 인터페론 알파 2 이며, 일부 인간 환자는 상기 단백질이 내인성으로 생산된다는 사실에도 불구하고 항체를 만든다 [Russo, D. 등 (1996)ibid; Stein, R. 등 (1988)ibid]. 동일한 상황이 CNTF 의 치료적 사용에 관련되어 있는 것 같으며, 본 발명은 인간 숙주에 투여될 경우 면역 반응을 유인하는 성향을 변경시킨 CNTF 단백질을 제공하는 것에 의해 상기 문제를 해결하고자하는 것이다.

변형된 CNTF 를 유도하는 본 발명의 일반적인 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계;

(b) 실험관내 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술 또는 생물학적 검사를 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의해, 단백질 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정하는 단계;

(c) 실험관내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 검사를 이용하여 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정된 T-세포 에피토프의 활성을 본질적으로 감소시키거나 제거시키는 방식으로 변형된, 동정된 잠재적인 T-세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체를 고안하는 단계. 새로운 잠재적인 T-세포 에피토프가 다시 T-세포 에피토프의 활성을 본질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 변형되지 않는 한, 상기 서열 변이체는 서열 변이에 의한 새로운 잠재적인 T-세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성된다;

(d) 재조합 DNA 기술에 의해 상기 서열 변이체를 구축하고, 자명하게 공지된 재조합 기술에 따라 요망되는 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해서 상기 변이체를 시험하는 단계.

단계 (b) 에 따른 잠재적인 T-세포 에피토프의 동정은 종래에 선행 기술에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법은 WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317 에 개시되어 있고, 바람직하게는 CNTF-유도된 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 결합 성향을 동정하는데 사용될 수 있다.

계산에 의해 T-세포 에피토프를 동정함에 있어 매우 효율적인 또 다른 방법은, 본 발명에 따른 바람직한 구현예인 실시예에 기재되어 있다.

실제로, 수많은 변이체 CNTF 단백질을 제조하여, 목적하는 면역 및 기능 특성을 시험하였다. 변이체 단백질은 가장 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 제조되지만, CNTF 절편의 화학적 합성을 포함하는 다른 절차도 고려될 수 있다.

상기 방안의 단계 (b) 에 따른, 200 아미노산 잔기의 인간 CNTF 단백질 서열에 관련된 분석 결과를 표 1 에 나타낸다.

표 1: 잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간 CNTF 중의 펩티드 서열

펩티드는 13mer 이고, 아미노산은 단일 문자 코드를 사용하여 동정된다.

상기 방안의 단계 (c) 및 (d) 에 따른, 본 발명의 변형된 분자에 관련된 고안 및 구축의 결과는 표 2 및 표 3 에 나타낸다.

표 2: 인간 CNTF 의 잠재적인 T-세포 에피토프의 제거를 유도하는 치환 (WT = 야생형)

표 3: 하나 이상의 MHC 알로타입에 대한 잠재적인 T-세포 에피토프의 제거를 유도하는 추가적인 치환

본 발명은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 단백질로부터 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프의 실질적인 활성 감소 또는 제거를 유도하는 위치에서 수행된 CNTF 유사체에 관한 것이다. 표 1 에서 동정된 임의의 잠재적인 MHC 클래스 II 리간드 중의 특정 지점에서의 하나 이상의 아미노산 치환은, 인간 숙주에 치료제로써 투여할 경우 감소된 면역원성 잠재성을 갖는 CNTF 를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 치환은, T-세포 에피토프 활성의 실질적인 감소 또는 제거를 성취할 것으로 예상되는 펩티드 서열 중의 적당한 지점에서 수행된다. 실제로, 적당한 지점은 바람직하게는 MHC 클래스 II 결합 그루브 내에 제공된 포켓 중 하나에 결합하는 아미노산 잔기와 동일할 것이다.

펩티드의 소위 P1 또는 P1 고정자 (anchor) 위치에서 크레프트의 제 1 포켓 중의 결합을 변경하는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 고정자 잔기 및 MHC 클래스 II 결합 그루브 중 제 1 의 포켓 사이의 결합 상호작용의 특성은, 전체 펩티드에 대한 전체적인 결합 친화도를 갖는 주요 결정인자로서 인식된다. 펩티드의 이 위치에서의 적합한 치환은, 포켓내에 용이하게 수용되지 않는 잔기, 예컨대 더욱 친수성인 잔기로의 치환에 대한 것일 것이다. MHC 결합 크레프트 중의 다른 포켓 영역 내에서의 결합과 동등한 위치에서의 펩티드 중의 아미노산 잔기가 또한 고려되며, 이는 본 발명의 범위내에 속한다.

소정의 잠재적인 T-세포 에피토프내에서의 단일 아미노산 치환은 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 경로이다. 단일 에피토프 내에서의 조합된 치환이 고려될 수 있고, 예를 들어 개별적으로 정의된 에피토프가 서로 중복될 경우 특히 적합할 수 있다. 또한, 소정의 에피토프 내에서 단독의 아미노산 치환 또는 단일 에피토프내에서 조합된 아미노산 치환은, MHC 클래스 II 결합 그루브에 대한 "포켓 잔기"와 동등하지 않은 위치이지만 펩티드 서열 중의 임의의 지점에서 수행될 수 있다. 치환은, 상동 구조, 또는 당업계에 공지된 컴퓨터 이용 기술을 이용하여 생성된 구조적 방법을 참고로 하여 수행될 수 있고, 본 발명에 따른 분자의 공지된 구조적 특징에 기초할 수 있다. 상기 모든 치환은 본 발명의 범위내에 속한다.

상기 동정된 펩티드 내부가 아닌 아미노산 치환은, 특히 나열된 펩티드 중에서 만들어진 치환(들)과 조합되어 만들어질 경우, 고려될 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자의 구조 또는 생물학적 활성을 회복시키기 위한 변화가 고려될 수 있다. 이러한 보상적 변화, 및 목적하는 활성을 갖는 변이체를 초래하는 CNTF 폴리펩티드로부터의 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 부가를 포함하기 위한 변화, 및 이의 임의의 개시된 펩티드의 변화와의 조합은 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명이 변형된 CNTF 에 관한 것인 한, 상기 변형 CNTF 단백질 또는 변형CNTF 단백질의 절편을 함유하는 조성물 및 관련 조성물은 본 발명의 범위내인 것으로 고려되어야만 한다. 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 변형된 CNTF 실체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 다른 양태에 의하면, 본 발명은 변형된 CNTF 단백질을 사용하는 인간의 치료적 처방 방법에 관한 것이다.

단백질 또는 폴리펩티드의 전체 구조를 결정하는데 중요한 역할을 하는 여러 요인들이 있다. 첫번째로, 펩티드 결합, 즉 사슬 내에서 아미노산을 서로 연결하는 결합은 공유 결합이다. 상기 결합은 구조에 있어서는 평면이고, 본질적으로는 치환 아미드이다. "아미드" 는 -CONH- 기를 포함하는 임의의 유기 화합물 기이다.

인접한 아미노산의 Cα를 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기 도시한 바와 같이 나타낼 수 있다:

O=C 및 C-N 원자가 비교적 고정된 평면 상에 놓이므로, 상기 축에 대해서는 자유 회전이 일어나지 않는다. 따라서, 파선으로 도식적으로 묘사된 평면은 때때로 "아미드" 또는 "펩티드 평면" 으로 불리며, 여기에 펩티드 골격의 산소 (O), 탄소 (C), 질소 (N), 및 수소 (H) 원자가 놓인다. 상기 아미드 평면의 반대 코너에는 Cα원자가 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에대해 실질적으로 회전이 없으므로, 폴리펩티드 사슬은 Cα원자를 연결하는 일련의 평면 펩티드 연결을 포함한다.

폴리펩티드 또는 단백질의 전체 구조 또는 배치를 정의하는데 있어 중요한 역할을 하는 두번째 요인은 공통 Cα연결에 대한 각각의 아미드 평면의 회전각이다. "회전각" 및 "비틀기 (torsion) 각" 이라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. O, C, N, 및 H 원자가 아미드 평면에 존재한다고 가정하면 (일부 배치의 경우, 상기 원자의 평면성이 약간의 차이가 있을 수 있지만, 통상적으로 타당한 가정임), 상기 회전각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 배치, 즉 이웃 잔기 사이에서 존재하는 구조를 정의한다. 상기 두 가지의 각은 φ및 ψ로 공지되어 있다. 따라서 한 세트의 각 φ_i, ψ_i(여기서 아래첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄) 는 폴리펩티드 2차 구조를 효과적으로 정의한다. φ, ψ각을 정의하는데 사용되는 관례, 즉 아미드 평면이 0 도 각을 형성하는 참조점 및 어느 각이 φ이고 어느 각이 ψ인지에 대한 정의는, 주어진 폴리펩티드에 대하여 문헌에 정의되어 있다. 예컨대, 본원에 참고문헌으로 도입된 [Ramachandran 등. Adv. Prot. Chem. 23: 283-437 (1968), 페이지 285-94] 를 참고.

본 발명의 방법은 임의의 단백질에 적용될 수 있으며, 인간에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브의 일차 포켓 1 고정 위치는 특정 아미노산 측쇄에 대해 잘 고안된 특이성을 갖는다는 발견에 부분적으로는 근거한다. 상기 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 번 위치에서 아미노산의 정체성 (identity)에 의해 결정된다. 상기 부위는 포켓 1 의 저부에 위치하며, 상기 포켓에 의해 수용될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다 [Marshall, K. W., J. Immunol., 152: 4946-4956 (1994)]. 상기 잔기가 글리신이라면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산 (소수성 지방족원: 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌; 및 방향족원: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판) 은 포켓 내에 수용될 수 있고, 방향족 측쇄가 바람직하다. 상기 포켓 잔기가 발린이라면, 상기 아미노산의 측쇄는 포켓 내로 돌출하여, 소수성 지방족 측쇄만이 수용될 수 있도록, 수용될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한한다. 따라서, 아미노산 잔기 서열에서, 소수성 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산이 발견된다면, MHC 클래스 II 에 제한된 T 세포 에피토프가 존재할 가능성이 있다. 그러나, 측쇄가 소수성 지방족이라면, 방향족 측쇄보다 대략 2 배 더 T 세포 에피토프와 회합될 가능성이 있다 (전체 집단에 대해 포켓 1 유형의 대략적인 균일한 분포로 가정함).

본 발명을 구현하는 컴퓨터적 방법은 하기와 같이 T 세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 펩티드 영역을 프로필한다:

(1) 소정의 길이의 펩티드 분획의 일차 서열을 스캐닝하고, 존재하는 모든 소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 확인한다. (2) 소수성 지방족 측쇄에 방향족 측쇄보다 더 큰 값; 바람직하게는 방향족 측쇄에 지정된 값의 약 2 배, 예컨대, 소수성 지방족 측쇄에 대한 값을 2 로, 방향족 측쇄에 대한 값을 1 로 지정한다. (3) 존재하는 것들에 대해 결정된 값을 펩티드 내의 소정의 균일한 길이를 갖는 각각의 중복되는 아미노산 잔기 분획 (윈도우) 에 대해 합산하고, 특정 분획 (윈도우) 에 대한 전체 값을 분획의 중간 위치에 있는 단일 아미노산 잔기 (윈도우) 에, 바람직하게는 샘플링된 분획의 정중앙 근처의 잔기 (윈도우) 에 부여한다. 상기 절차를 각각의 샘플링된 중복 아미노산 잔기 분획 (윈도우) 에 대해 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에는 특정 분획 (윈도우) 에 존재하는 T 세포 에피토프의 가능성에 관련된 값이 부여된다. (4) 상기 단계 3 에 기재된 바에 따라 계산되어 부여된 값을 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 축에 대해 플롯팅할 수 있다. (5) 소정의 값, 예컨대 값 1 의 스코어를 갖는 서열의 모든 부분은, T 세포 에피토프를 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 필요하다면 변형될 수 있다.

본 발명의 상기 특정 양태는 T 세포 에피토프를 포함할 것 같은 펩티드 영역을 나타낼 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 상기 영역에서의 펩티드 변형은 MHC 클래스 II 결합 특징을 변형시킬 수 있는 잠재성을 갖는다.

본 발명의 또다른 양태에 따르면, MHC 클래스 II 대립유전자의 모델과 펩티드의 상호작용을 고려한 보다 복잡한 컴퓨터적 방법을 이용하여, T 세포 에피토프가 보다 정확히 예측될 수 있다. 상기 특정 양태에 따른 펩티드 내에 존재하는 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 예측에는, 모든 공지된 MHC 클래스 II 분자의 구조를 기반으로 하는 42 개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자 모델의 구축 및 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 동정에 있어서 상기 모델을 이용하는 방법; 상대적인 펩티드 골격 알파 탄소 (Cα) 위치에 있어서 공지된 변화를 가능케 하기 위한 각각의 모델에 대한 펩티드 골격 라이브러리의 구축; 펩티드 및 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용에 결정적인 위치에서 각각의 20 개 아미노산 대안물에 대한 각 모델과 각각의 골격의 도킹을 위한 아미노산 측쇄 배치의 라이브러리 구축; 및 특정 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 특정 펩티드에 대한 최적의 골격 및 측쇄 배치를 선택하기 위한 스코어링 함수 및 상기 상호작용으로부터 결합 스코어의 파생과 함께 상기 골격 및 측쇄 배치 라이브러리의 사용이 고려된다.

MHC 클래스 II 분자의 모델은 Brookhaven 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에서 찾을 수 있는 여러 유사한 구조로부터 상동성 모델링을 통해 유도될 수 있다. 이들은 에너지 최소화를 위한 CHARMm 역장 (force-field) (Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca. 에서 구입가능) 와 함께 시뮬레이션된 어닐링 함수를 도입한 반자동 상동성 모델링 소프트웨어 (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993. J. Mol Biol 234: 779-815)를 이용하여 수행될 수 있다. 대안적인 모델링 방법도 또한 이용할 수 있다.

본 발명의 방법은, MHC 클래스 II 분자의 작은 세트에 대한 결합 그루브 내 각각의 위치에서 대안적인 각각의 아미노산의 실험적으로 유도된 결합 데이타의 라이브러리를 이용하는 다른 컴퓨터적 방법 (Marshall, K. W., 등, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1(3): 157-162) (1995); 또는 그루브 내에서 특정 유형의 결합 포켓의 결합 특징을 정의하기 위해, 다시 MHC 클래스 II 분자의 비교적 작은 서브세트를 이용한 후 추가적인 '버츄얼' MHC 클래스 II 분자를 인공적으로 생성시키기 위해, 상기 포켓 라이브러리로부터의 포켓 유형을 '혼합 및 매칭' 시키는 유사한 실험적 결합 데이타를 이용하는 또다른 컴퓨터적 방법 (Sturniolo T., 등,Nat. Biotech, 17(6): 555-561 (1999)) 과 매우 상이하다. 두 가지 종래 방법 모두, 분석의 복잡성 및 다수의 펩티드 변이체를 합성해야 한다는 필요성으로 인해, 단지 소수의 MHC 클래스 II 분자만이 실험적으로 스캐닝될 수 있다는 주요 단점을 갖는다. 따라서, 첫번째 종래 방법은 소수의 MHC 클래스 II 분자만을 예측할 수 있다. 두번째 종래 방법은 또한, 상이한 클래스 II 대립유전자와 함께 있는 경우, 한 분자 내의 유사한 아미노산이 배열된 포켓이 동일한 결합 특징을 갖는다고 가정하면, 포켓 라이브러리 내에 포함되는 포켓을 포함하는 MHC 클래스 II 분자만이 '버추얼하게' 생성될 수 있다는 추가 단점을 갖는다. 본원에 기재된 모델링 접근법을 이용하여, 임의의 수 및 유형의 MHC 클래스 II 분자의 구조를 유추할 수 있고, 따라서 전체 집단을 대표하도록 대립유전자를 특이적으로 선택할 수 있다. 또한, 스캐닝되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 복잡한 실험을 통해 추가적인 데이타를 생성시킨 것보다 더 많은 모델을 만들어서 증가시킬 수 있다.

골격 라이브러리의 이용은 특정한 MHC 클래스 II 분자로 도킹되는 경우, 스캐닝되는 다양한 펩티드의 Cα원자의 위치에서 변화를 허용한다. 이는 다시, 특히 포켓에서의 아미노산 결합의 스캐닝을 위해 단순화한 펩티드 골격의 이용에 의존하는 상기 기재된 대안적인 종래의 다른 컴퓨터적 방법과 대조적이다. 이러한 단순화된 골격은 '실제' 펩티드에서 발견되는 골격 배치의 대표물이 아닐 수 있어, 펩티드 결합의 예측이 부정확해진다. 본 발명의 골격 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합한 모든 펩티드의 골격을 포개고, 결합 그루브 내에 위치하는 11 개 아미노산 각각의 Cα원자 사이의 제곱 평균 (RMS) 편차를 확인함으로써 생성된다. 상기 라이브러리는 소수의 적합하고 이용가능한 마우스 및 인간 구조 (현재 13 개) 로부터 유도될 수 있지만, 더욱 큰 다양성을 가능케하기 위해, 각각의 C"-α위치에 대한 RMS 수를 50% 증가시킨다. 이어서 각각의 아미노산의 평균 Cα위치를 결정하고, 그 반경이 그 지점에서의 RMS 편차 + 50% 가 되는 상기 지점 근처로 구를 그린다. 상기 구는 허용되는 모든 Cα위치를 나타낸다.

최소의 RMS 편차를 갖는 Cα로부터 작업시 (결합 그루브의 11 개 잔기의 위치 2 에 해당하는, 상기 언급된 포켓 1 의 아미노산의 것), 구는 3 차원적으로 격자형이며, 격자 내의 각각의 정점이 상기 아미노산의 Cα의 가능한 위치로서 사용된다. 후속 아미노산에 대한 펩티드 결합에 해당되는, 후속 아미드 평면은 각각의 상기 Cα들에 그래프트되며, φ및 Ψ각은 후속 Cα의 위치를 정하기 위해, 설정된 간격으로 단계적으로 회전된다. 후속 Cα가 상기 Cα 에 대해 '허용되는 위치의 구' 내에 속하는 경우, 디펩티드의 방위 (orientation)가 허용되지만, 구의 외부에 속하는 경우 디펩티드는 거부된다. 이어서, 상기 절차를, 모든 9 개의 후속 Cα들이 선행 Cα들의 가능한 모든 순열로부터 위치될 때까지, 각각의 후속 Cα위치에 대해 펩티드가 포켓 1 Cα'시드 (seed)' 로부터 성장하도록 반복한다. 이어서 상기 절차를 단일 Cα선행 포켓 1 에 대해 1 번 더 반복하여, 결합 그루브 내에 위치하는 골격 Cα위치의 라이브러리를 생성시킨다.

생성되는 골격의 수는 여러 의존에 근거한다: '허용된 위치의 구' 의 크기; 포켓 1 위치에서 '일차 구' 의 격자의 세밀함; 후속 Cα의 위치를 정하는데 사용되는 Φ및 Ψ각의 단계적 회전의 적합성. 상기 절차를 이용하여, 커다란 골격 라이브러리가 생성될 수 있다. 골격 라이브러리가 커질수록, MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 내의 특정 펩티드에 대한 최적의 체결성이 발견될 가능성이 높아질 것이다. 결합 도메인의 아미노산과의 충돌로 인해, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자 모델의 도킹에 적합하지는 않을 것이므로, 각각의 대립유전자에 대해, 상기 대립유전자가 수용될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의 서브세트를 생성한다. MHC 클래스 II 분자 모델과 함께 골격 라이브러리의 이용은 각각의 허용되는 골격에 도킹된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각 위치에서 각각의 아미노산에 대해 허용된 측쇄 배치로 이루어진 방대한 데이타베이스를 생성시킨다. 상기 데이타 세트는 MHC 클래스 II 분자가 골격에 도킹되고, 아미노산 측쇄가 목적하는 위치의 골격상에 그래프트되는 단순한 입체 오버랩 함수를 이용하여 생성된다. 측쇄의 각각의 회전가능한 결합은 설정된 간격으로 단계적으로 회전되며, 원자의 생성된 위치는 언급된 결합에 의존한다. 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄 원자의 상호작용이 주지되며, 위치는 하기 기준에 따라 허용되거나 거부된다: 위치된 모든 원자의 오버랩의 총 합은 소정 값을 초과하지 말아야 한다. 따라서, 배치 탐색의 엄격성 (stringency) 은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 총 오버랩에 대한 소정의 한계치의 함수이다. 상기 후자의 값은 특정 포켓이 고정된 것으로 공지된 경우 작을 수 있지만, 엄격성은 포켓 측쇄의 위치가 비교적 유동적인 것으로 공지된 경우 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓 내에서 유연성의 변동을 모방할 수 있다. 이어서 각각의 MHC 클래스 II 분자와도킹된 경우, 상기 배치 탐색을 각 골격의 매 위치마다 각각의 아미노산에 대해 반복하여 측쇄 배치의 방대한 데이타베이스를 생성시킨다.

상술된 골격/측쇄 배치의 거대 데이타베이스를 스캐닝하여 실험적으로 유도되어야 하는 펩티드 리간드 배치와 함께 MHC 클래스 II 분자 모델 사이의 결합 에너지를 추정하기 위해, 적합한 수학적 표현을 사용한다. 따라서, 하기 계산에 9 내지 20 개 아미노산 길이 (길이는 각각의 스캐닝에 대해 일정하게 유지됨) 의 각각의 가능한 펩티드를 적용시켜, 잠재적인 T 세포 에피토프에 대해 단백질을 스캐닝한다: 상기 분자에 대해 허용되는 펩티드 골격과 함께 MHC 클래스 II 분자를 선택하고, 목적하는 펩티드 서열에 해당하는 측쇄를 그 위에 그래프트한다. 골격 상의 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 정체성 및 원자간 거리 데이타를 상기 아미노산에 허용되는 각각의 배치에 대해 수집한다 (상술한 데이타베이스로부터 수득됨). 이를 골격 및 스코어링 함수를 이용하여 유도된 펩티드 스코어에 따라 각각의 측쇄에 대해 반복한다. 상기 골격에 대한 최적 스코어를 유지하고, 선택된 모델에 대해 허용된 각각의 골격에 대해 상기 절차를 반복한다. 허용된 모든 골격에 대한 스코어를 비교하고, 최고 스코어를 상기 MHC 클래스 II 모델에서 목적하는 펩티드에 대한 펩티드 스코어로 간주한다. 이어서 상기 절차를 스캐닝되는 단백질에서 유도되는 가능한 모든 펩티드로 각각의 모델에 대해 반복하고, 모델에 대비한 펩티드 스코어를 나타낸다.

본 발명에 있어서, 결합 친화도 계산에 제시되는 각각의 리간드는 상술한 바와 같은 펩티드 또는 단백질에서 선택되는 아미노산 분획이다. 따라서, 상기리간드는 공지된 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되는 약 9 내지 20 개 아미노산 길이를 갖는 아미노산 연장물에서 선택된다. "아미노산" 및 "잔기" 라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. 골격 라이브러리로부터 골격 상에 그래프트될 것으로 조사된 펩티드의 연속 아미노산 형태인 리간드를, 펩티드 골격의 C"-α원자의 축를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리로부터의 MHC 클래스 II 분자의 결합 크레프트 내에 위치시키고, 각각의 측쇄에 허용되는 배치를 허용되는 배치의 데이타베이스로부터 선택한다. 관련된 원자 정체성 및 원자간 거리를 또한 상기 데이타베이스로부터 검색하고, 펩티드 결합 스코어를 계산하는데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 리간드를 위치 지정 돌연변이형성 (mutagenesis)에 대한 후보물로 지정한다. 지정된 리간드 (즉 관심 단백질 내임) 의 아미노산 치환을 수행한 후, 스코어링 함수를 이용해서 재시험하여, 결합 친화도를 소정 임계값 미만으로 감소시키는 변화를 결정한다. 이어서, 상기 변화를 관심 단백질 내로 도입하여 T 세포 에피토프를 제거시킬 수 있다.

펩티드 리간드 및 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 사이의 결합에는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비공유 상호작용이 관여된다: 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 (친유성) 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 설명되는 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 포함된다. 수소 결합은 극성 또는 대전된 기 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합이고, 2 개의 다른 원자에 의해 공유되는 수소 원자로 구성된다는 것이 이해되어야 한다. 수소 공여자의 수소는 양전하를 갖는 반면, 수소 수용자는 부분적인 음전하를 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용을 위해, 수소 결합 공여자는 수소가 부착된 질소, 또는 산소 또는 질소에 부착된 수소일 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 부착되지 않은 산소, 수소가 부착되지 않고 1 또는 2 개 연결을 갖는 질소, 또는 1 개 연결만을 갖는 황일 수 있다. 특정 원자, 예컨대 수소에 부착된 산소 또는 이민 질소 (예, C=NH) 는 수소 수용자 및 공여자 둘 다 될 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/몰 범위이고, 반 데르 발스 결합보다 훨씬 더 강하지만, 공유 결합보다는 약하다. 수소 결합은 또한 상당한 방향성이 있고, 공여자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 함께 선형이 될때 가장 강하다. 정전기적 결합은 반대로 하전된 이온쌍 사이에서 형성되며, 상호작용의 강도는 쿨롱의 법칙에 따라 원자간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍 사이의 최적 거리는 약 2.8Å 이다. 단백질/펩티드 상호작용에서, 정전기적 결합은 아르기닌, 히스티딘 또는 리신 및 아스파테이트 또는 글루타메이트 사이에 형성될 수 있다. 결합의 강도는 이온화기의 pKa 및 매질의 유전 상수에 의존할 것이지만, 이들은 대략 수소 결합의 강도와 유사하다.

친유성 상호작용은 단백질 및 펩티드 리간드 사이에 일어나는 친화적인 소수성-소수성 접촉이다. 통상적으로, 이들은 용매에 노출되지 않게 결합 그루브의 포켓 내에 묻혀있는 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄 사이에 일어날 것이다. 소수성 잔기의 용매로의 노출은, 주변 용매 분자가 서로 우리 모양의 포접 구조를 형성하도록 수소 결합이 유도되므로 매우 불리하다. 생성되는 엔트로피의 감소도매우 불리하다. 친유성 원자는 극성이나 수소 수용자가 아닌 황이거나 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다.

반 데르 발스 결합은 3 - 4Å 떨어진 원자 사이에서 발견되는 비특이적 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 약하고 덜 특이적이다. 원자 주위의 전하 분포는 시간에 따라 변화하며, 어떤 경우에도 전하 분포는 비대칭이다. 상기 일시적인 전하의 비대칭은 주위 원자에서도 유사한 비대칭을 유도한다. 원자 사이에 생성된 인력은 반 데르 발스 접촉 거리에서 최대에 이르지만, 약 1Å 내지 약 2Å 에서 급격히 감소한다. 반대로, 원자가 상기 접촉 거리 미만으로 분리되면, 원자의 외부 전자 구름이 겹치면서 증가되는 강한 반발력이 우세해진다. 인력이 정전기적 및 수소 결합에 비해 비교적 약하지만 (약 0.6 Kcal/몰), 반발력은 특히 펩티드 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있는지의 여부를 결정하는데 매우 중요할 수 있다.

하나의 구현예에서, 봄 (Boehm) 스코어링 함수 (SCORE1 접근법) 를 사용하여 결합 상수를 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8(3): 243-256 (1994), 본원에 그 전문이 도입됨). 또다른 구현예에서, 스코어링 함수 (SCORE2 접근법) 를 사용하여, T 세포 에피토프를 포함하는 리간드의 지표로서 결합 친화성을 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 12(4): 309-323 (1998) 본원에 그 전문이 도입됨). 그러나, 상기 참고문헌에 기재된 바와 같은 Boehm 스코어링 함수는 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있음이 이미 공지되어 있고, 단백질/리간드 복합체의 구조가 해석되었으며, 해석된 구조가 단백질데이타 뱅크 ("PDB") 에 존재하는, 단백질에 대한 리간드의 결합 친화성을 추정하는데 사용된다. 따라서, 스코어링 함수는 공지된 포지티브 결합 데이타의 이점과 함께 개발되었다. 포지티브 및 네거티브 결합자들 사이의 구별을 위해, 반발 항이 공식에 부가될 수 있다. 또한, 상기 Boehm 함수의 에너지 항에 근거한 영역을 이용하기보다 한쌍씩 (pairwise)의 친유성 상호작용을 계산하여, 보다 만족스러운 결합 에너지의 추정이 얻어진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 결합 에너지는 변형 Boehm 스코어링 함수를 이용하여 추정된다. 변형 Boehm 스코어링 함수에서, 단백질 및 리간드 사이의 결합 에너지 (ΔG_bind) 는 하기 변수를 고려하여 추정된다: 리간드의 이행 (translational) 및 회전 엔트로피의 전체적인 소실로 인한 결합 에너지의 감소 (ΔG₀); 1 개 이상의 파트너가 중성인 이상적인 수소 결합의 분포 (ΔG_hb); 비교란(uperturbed) 이온 상호작용의 분포 (ΔG_ionic); 친유성 리간드 원자 및 친유성 수용자 원자 사이의 친유성 상호작용 (ΔG_lipo); 리간드의 내부 자유도의 동결 (freezing), 즉 각각의 C-C 결합에 대한 회전 자유도의 감소로 인한 결합 에너지의 소실 (ΔG_rot); 단백질 및 리간드 사이의 상호작용 에너지 (E_VdW). 상기 항을 고려하여 수학식 1 을 얻는다:

(ΔG_bind) = (ΔG₀) + (ΔG_hb×N_hb) + (ΔG_ionic×N_ionic) + (ΔG_lipo×N_lipo) + (ΔG_rot+ N_rot) + (E_VdW).

여기서, N 은 특정 항에 대해 자격을 부여하는 상호작용의 수이고, 하나의 구현예에서, ΔG₀, ΔG_hb, ΔG_ionic, ΔG_lipo및 ΔG_rot은 각각 하기 값을 갖는 상수이다: 5.4, -4.7, -4.7, -0.17, 및 1.4.

항 N_hb는 하기 수학식 2 에 따라 계산된다:

N_hb= Σ_h-bondsf (ΔR, Δα) × f (N_neighb) × f_pcs

f (ΔR, Δα) 는 이상적인 상황으로부터 수소 결합의 큰 편차를 설명하는 페널티 함수이며, 수학식 3 에 따라 계산된다:

f (ΔR, Δ-α) = f1 (ΔR) × f2 (Δα)

여기서, ΔR ≤TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 이거나

ΔR ≤0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 - (ΔR - TOL)/0.4 이거나

ΔR > 0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 0 이고,

또한: Δα < 30°인 경우, f2 (Δα) = 1 이거나

Δα ≤ 80°인 경우, f2 (Δα) = 1 - (Δα-30)/50 이거나

Δα > 80°인 경우, f2 (Δα) = 0 이다.

TOL 은 수소 결합 길이 = 0.25Å 에서의 허용 편차이다.

ΔR 은 이상값 = 1.9Å 로부터 H-O/N 수소 결합 길이의 편차이다.

Δα는 그 이상값 180°로부터 수소 결합각 ∠_N/O-H..O/N의 편차이다.

f(N_neighb) 는 단백질 표면의 오목부 및 볼록부를 구별하므로, 단백질 표면에서 발견되는 것보다 포켓에서 발견되는 극성 상호작용에 더 큰 무게를 부여한다. 상기 함수는 하기 수학식 4 에 따라 계산된다:

f(N_neighb) = (N_neighb/N_neighb,0)^α(여기서 α = 0.5 임).

N_neighb는 임의의 주어진 단백질 원자에 대해 5Å 보다 더 가까운 비수소 단백질 원자의 수이다.

N_neighb,0는 상수 = 25 이다.

f_pcs는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적을 허용하는 함수이므로, 강한 및 약한 수소 결합 사이를 구분하며, 그 값은 하기 기준에 따라 결정된다:

A_polar/N_HB< 10Ų인 경우 f_pcs= β이거나

A_polar/N_HB> 10Ų인 경우 f_pcs= 1 이다.

A_polar는 극성 단백질-리간드 접촉 표면의 크기이다.

N_HB는 수소 결합의 수이다.

β는 값이 1.2 인 상수이다.

변형 Boehm 스코어링 함수의 실행을 위해, 이온성 상호작용으로부터의 분포ΔG_ionic은 동일한 기하 의존성이 가정되었으므로, 상술된 수소 결합으로부터와 유사한 방식으로 계산된다.

항 N_lipo는 하기 수학식 5 에 따라 계산된다:

N_lipo= Σ_1Lf(r_1L)

f(r_1L) 은 모든 친유성 리간드 원자 l 및 모든 친유성 단백질 원자 L 에 대해 하기 기준에 따라 계산된다:

r_1L≤ Rl 인 경우 f(r_1L) =1,

R2 < r_lL> R1 인 경우 f(r_1L) = (r_1L-R1)/ (R2-R1),

r_1L≥ R2 인 경우 f(r_1L) = 0

여기서, R1 = r_l ^vdw+ r_L ^vdw+ 0.5 이고

R2 = R1 + 3.0 이고

r_l ^vdw은 원자 l 의 반 데르 발스 반경이고

r_L ^vdw은 원자 L 의 반 데르 발스 반경이다.

항 N_rot는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이며, 비환식 sp³-sp³및sp³-sp²결합의 수로 고려된다. 말단 -CH₃또는 -NH₃의 회전은 고려되지 않는다.

최종 항 E_VdW는 하기 수학식 6 에 따라 계산된다:

E_VdW= ε₁ε₂((r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw)¹²/r¹²- (r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw)⁶/r⁶).

여기서, ε₁및 ε₂는 원자 정체성에 근거하는 상수이며,

r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw는 반 데르 발스 원자 반경이고,

r 은 원자 쌍 사이의 거리이다.

수학식 6 에 있어서, 하나의 구현예에 의하면, 상수 ε₁및 ε₂는 하기 주어진 원자 값이다: 각각 C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황 원자에 대한 것). 수학식 5 및 6 에 대해, 반 데르 발스 반경은 하기 주어진 원자 값이다: C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Å.

상기 수학식에서 주어진 모든 소정의 값 및 상수는 특히 본원에서 수행되는 계산의 유형에 따라 단백질 리간드 상호작용의 현재 이해의 제약 내에서 결정되는 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 상기 스코어링 함수가 더욱 개선됨에 따라, 상기 값 및 상수는 리간드에 대한 단백질의 결합 에너지 추정에 대해서 목적하는 결과를 제공하는 임의의 적합한 수치값으로 변화될 수 있고, 따라서 본 발명의 범위 내에 속한다. 상술한 바와 같이, 스코어링 함수는 측쇄 배치, 원자 정체성 및 원자간 거리의 데이타베이스에서 추출되는 데이타에 적용된다. 본 발명의 설명을 위해, 상기 데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4 개의 해석된 구조이다. 상기 설명으로부터, 본 발명의 컴퓨터적 방법의 구축의 모듈 특성은, 신규 모델이 쉽게 추가되고, 펩티드 골격 라이브러리 및 측쇄 배치 탐색 함수로 스캐닝될 수 있어, 상술한 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 의해 처리될 수 있는 부가적인 데이타 세트를 생성시킬 수 있음을 의미하는 것이 자명하다. 이는, 존재하는 대립유전자의 보다 정확한 모델을 생성하는데 데이타가 이용가능하다면, 스캐닝된 MHC 클래스 II 분자의 목록이 쉽게 증가되거나 구조 및 회합 데이타가 대체될 수 있게 한다. 본 발명의 예측 방법은 각종 MHC 클래스 II 분자에 대한 친화도가 종래에 실험적으로 결정된 수많은 펩티드를 포함하는 데이타 세트를 위해 수정될 수 있다. 계산된 데이타와 실험 데이타의 비교를 통해, 실험적으로 측정된 모든 T-세포 에피토프가 정확하게 예측될 수 있는 것으로 알려진 값의 종류가 결정될 수 있다. 상기 스코어링 함수가 이용가능한 일부 복잡한 방법론에 비해 비교적 간단하지만, 계산은 극히 신속히 수행됨이 이해되어야 한다. 또한, 그 목적이 선택된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 내에 도킹된 각각의 펩티드에 대한 자체 실제 결합 에너지를 계산하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 기본적인 목적은 선택된 단백질의 일차 서열 (즉, 아미노산 서열) 을 근거로 T 세포 에피토프의 위치 예측에 도움을 주는 비교 결합 에너지 데이타를 수득하는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 상기 선택된 임계값 초과의 결합 에너지는 리간드 중 T 세포 에피토프의 존재를 제시할 것이다. 이어서, 리간드를 1 차 이상의 아미노산 치환에 적용시켜 결합 에너지를 재계산한다. 신속한 계산 특성으로 인해, 상기 펩티드 서열의 조작은 효율적인 비용으로 이용가능한 컴퓨터 하드웨어 상의 프로그램의 사용자 인터페이스 내에서 쌍방향으로 수행될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 하드웨어에 대한 거대한 투자가 요구되지는 않는다. 당업자에게는, 동일한 목적을 위해 다른 이용가능한 소프트웨어를 이용할 수 있음이 자명할 것이다. 특히, 단백질 결합 부위 내로 리간드를 도킹시킬 수 있는 보다 복잡한 소프트웨어를 에너지 최소화와 함께 이용할 수 있다. 도킹 소프트웨어의 예에는 하기가 있다: DOCK (Kuntz 등, J. Mol. Biol., 161: 269-288 (1982)), LUDI (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8: 623-632 (1994)) 및 FLEXX (Rarey M., 등, ISMB, 3: 300-308 (1995)). 분자 모델링 및 조작 소프트웨어의 예에는 하기가 포함된다: AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.). 상기 컴퓨터적 방법의 이용은 필요한 계산을 수행하는데 걸리는 처리 시간의 길이로 인해, 본 발명의 방법의 효율을 상당히 제한할 것이다. 그러나, 상기 방법이 본 발명의 방법을 통해 '포지티브 결합자' 로 발견되는 펩티드에 대해 보다 정확한 결합 에너지의 계산을 얻기 위한 '2 차 스크린' 으로 사용될 수 있다. 복잡한 분자 기계적 또는 분자 동력학적 계산을 위한 처리 시간의 제한은 상기 계산을 가능하게 하는 소프트웨어의 고안 및 컴퓨터 하드웨어의 현재 기술 한계 둘 다에 의해 정의되는 것이다. 미래에는, 보다 효율적인 코드의 기록 및 지속적인 컴퓨터 프로세서의 속도 증가로 인해, 보다 제어가능한 시간틀 내에서 상기 계산이이루어질 것임을 예견할 수 있다. 폴딩된 단백질 구조 내에서 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 거대분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있고: [Brooks, B. R., 등, J. Comput. Chem., 4: 187-217 (1983)], 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있으며: [Dauber-Osguthorpe 등, Proteins 4(1): 31-47 (1988)], 이들은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다. 유용한 배경 정보는 또한, 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Fasman, G. D. 편저, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9].

Claims (29)

1. 인간 모양체 신경자극 인자 (CNTF) 의 생물학적 활성을 가지면서, 생체내에서 사용될 경우 실질적으로는 면역원성이 없거나 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형 분자 보다 면역원성이 낮음을 특징으로 하는 변형된 분자.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역원성의 소실이 본래 미변형 분자로부터 유도된 하나 이상의 T-세포 에피토프를 제거하는 것에 의해 성취됨을 특징으로 하는 분자.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 면역원성의 소실은 상기 분자로부터 유도된 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 알로타입 (allotype)의 수의 감소에 의해 성취됨을 특징으로 하는 분자.
4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 하나의 T-세포 에피토프가 제거됨을 특징으로 하는 분자.
5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 본래 존재하는 T-세포 에피토프가 클래스 II 상에서의 제시를 통해 T-세포를 자극하거나 그와 결합하는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열임을 특징으로 하는 분자.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 펩티드 서열이 표 1 에 표시된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 분자.
7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프내 1 내지 9 개의 아미노산 잔기가 변형됨을 특징으로 하는 분자.
8. 제 7 항에 있어서, 하나의 아미노산 잔기가 변경됨을 특징으로 하는 분자.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 특정한 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들)의 치환임을 특징으로 하는 분자.
10. 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 2 에 나타낸 바와 같이 수행됨을 특징으로 하는 분자.
11. 제 10 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 상기 분자로부터 유도된 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 수의 감소를 위해 표 3 에 나타낸 바와 같이 수행됨을 특징으로 하는 분자.
12. 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 표 3 에 나타낸 바와 같이수행됨을 특징으로 하는 분자.
13. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)에서 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 결실임을 특징으로 하는 분자.
14. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 본래 존재하는 것으로의 특정 위치(들)에서의 아미노산(들)의 부가임을 특징으로 하는 분자.
15. 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자의 생물학적 활성을 회복하기 위해 추각적으로 다른 변경이 수행됨을 특징으로 하는 분자.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 추가적으로 다른 변경이 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실임을 특징으로 하는 분자.
17. 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 변경이 상동 단백질 서열을 참조로 하여 만들어짐을 특징으로 하는 변형된 분자.
18. 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 변경이 컴퓨터 이용 모델링(in silico) 기술을 참조로하여 만들어짐을 특징으로 하는 변형된 분자.
19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 변형된 CNTF 를 코딩하는 DNA 서열.
20. 임의적으로 약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에서 정의된 CNTF 의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
21. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에서 정의된 CNTF 의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자의 제조 방법에 있어서, 하기 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법:

    (i) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계;

    (ii) 실험관내 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술, 또는 생물학적 검사를 사용하여 펩티드와 MHC 분자의 결합을 측정하는 것을 포함하는 임의의 방법에 의해서, 단백질의 아미노산 서열 중에서 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정하는 단계;

    (iii) 실험관내 또는 컴퓨터 이용 기술, 또는 생물학적 검사를 사용하여 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해, 또는 펩티드-MHC 복합체와 T-세포의 결합에 의해, 측정된 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 변형된, 동정된 잠재적인 T-세포 에피토프 중의 하나 이상의 아미노산을 갖는 새로운 서열의 변이체를 고안하는 단계;

    (iv) 재조합 DNA 기술에 의해 상기 서열 변이체를 구축하고, 목적하는 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계; 및

    (v) 임의적으로 단계 (ii) 내지 (iv) 를 반복하는 단계.
22. 제 21 항에 있어서, 단계 (iii) 은 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프내 1 내지 9 개의 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 상기 변형이 상동 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조로 하여 만들어짐을 특징으로 하는 방법.
24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii) 가 하기 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:

    (a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역의 선택 단계;

    (b) 소정의 균일한 크기를 가지며, 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 중복 아미노산 잔기 분획을 연속 샘플링하는 단계;

    (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 분획에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값을 더하여 각각의 상기 샘플링된 분획에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 계산하는 단계; 및

    (d) 상기 분획에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기준으로,펩티드의 치료 이용성을 본질적으로 감소시키지 않고 펩티드에 대한 전체 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위한, 변형에 적합한 하나 이상의 상기 분획을 동정하는 단계.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (c) 가 하기 단계에 의해 12-6 반데르 발스 (van der Waal's) 리간드-단백질 에너지 반발 항 및 리간드 배치 에너지 항을 포함하도록 변형된 봄 스코어링 함수 (Boehm scoring function) 를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:

    (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 첫번째 데이타 베이스를 제공하는 단계;

    (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 두번째 데이타 베이스를 제공하는 단계;

    (3) 상기 첫번째 데이타 베이스로부터 모델을 선택하는 단계;

    (4) 상기 두번째 데이타 베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하는 단계;

    (5) 각각의 샘플링된 분획에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄를 동정하는 단계;

    (6) 각각 샘플링된 분획에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화성 값을 결정하는 단계; 및 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 (1) 내지 (5) 의 단계를 반복하는 단계.
26. 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖고, 미변형 CNTF 로부터 생성되며, 표 1 에 나타낸 군으로부터 선택된 13mer T-세포 에피토프 펩티드.
27. 제 26 항에 따른 13mer T-세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기 (consecutive amino acid residue)로 이루어진 펩티드 서열.
28. 생체내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형 분자 보다 면역원성이 작거나 실질적으로는 면역원성이 없는 CNTF 의 제조를 위한, 제 26 항에 따른 13mer T-세포 에피토프 펩티드의 용도.
29. 생체내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형 분자 보다 면역원성이 작거나 실질적으로는 면역원성이 없는 CNTF 의 제조를 위한, 제 27 항에 따른 펩티드 서열의 용도.