JP2010530895A

JP2010530895A - 修飾毒素

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Publication number: JP2010530895A
Application number: JP2010513449A
Authority: JP
Inventors: デイビス，クラウド，ジォフレイー; ダッタ，ディープシカ; ベイカー，マシュー，ポール; ラスト，アリソン，ジェーン; キーン，サイモン
Original assignee: アンジェリカセラピューティックス，インク．
Priority date: 2007-06-21
Filing date: 2008-06-20
Publication date: 2010-09-16
Also published as: EP2167528A2; WO2008157776A8; WO2009014835A2; CA2691539A1; GB2451928A; WO2008157776A2; WO2008157776A3; EP2167528B1; GB0811424D0; US8252897B2; US20090041797A1; WO2009014835A3; JP2016074655A; CA2691539C; EP2167528A4; GB2451928B; JP6188760B2; US20090010966A1; WO2009014835A9; AU2008279550A1

Abstract

本出願は、低下した免疫原性及び血管内皮又は血管内皮細胞に対する低下した結合を示し、それによって血管漏出症候群の発病を抑制する修飾毒素の組成物に関する。また、修飾が少なくとも１個のＴ細胞エピトープの少なくとも１個のアミノ酸内にある修飾ジフテリア毒素由来のポリペプチド担毒体も提供される。別の態様は、修飾が少なくとも１個のＴ細胞エピトープの少なくとも１個のアミノ酸残基及び非修飾未変性ジフテリア毒素の少なくとも１個のＶＬＳモチーフの少なくとも１個のアミノ酸残基にある、修飾ジフテリア毒素由来のポリペプチド担毒体に関する。別の態様は、修飾ジフテリア毒素と、細胞結合部分である非ジフテリア毒素断片とからなる融合タンパク質に関する。別の態様は、悪性疾患又は非悪性疾患を治療するための修飾ジフテリア毒素の使用に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、修飾毒素、修飾毒素を含有する融合タンパク質、その組成物、修飾毒素を調製する方法、及び修飾毒素を用いて癌などの疾患を治療する方法に関する。

（相互参照）
本出願は、２００７年６月２１日付け出願の米国特許仮出願第６０／９４５，５５６号（代理人整理番号３３０９４−７０２．１０１）、２００７年８月６日付け出願の米国特許仮出願第６０／９５４，２７８号（代理人整理番号３３０９４−７０２．１０２）、２００８年２月２９日付け出願の米国特許仮出願第６１／０３２，８８８号（代理人整理番号３３０９４−７０２．１０３）、２００８年４月３日付け出願の米国特許仮出願第６１／０４２，１７８号（代理人整理番号３３０９４−７０２．１０４）、２００７年６月２１日付け出願の米国特許仮出願第６０／９４５，５６８号（代理人整理番号３３０９４−７０３．１０１）、２００７年８月６日付け出願の米国特許仮出願第６０／９５４，２８４号（代理人整理番号３３０９４−７０３．１０２）、２００８年２月２９日付け出願の米国特許仮出願第６１／０３２，９１０号（代理人整理番号３３０９４−７０３．１０３）及び２００８年４月３日付け出願の米国特許仮出願第６１／０４２，１８７号（代理人整理番号３３０９４−７０３．１０４）の利益を主張する。これらの出願のそれぞれは、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。

治療用タンパク質の効果は、例えば、治療用タンパク質に対する望まれていない免疫反応によって制限され得る。例えば、幾つかのマウスモノクロナール抗体は、多くのヒト疾患環境において療法として有望視されているが、ある場合にはかなりの程度のヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応の誘導により機能しなくなっている［Ｓｃｈｒｏｆｆ，Ｒ．Ｗ．ｅｔａｌ．，（１９８５）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４５：８７９−８８５；Ｓｈａｗｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０−１５３５］。モノクロナール抗体については、ＨＡＭＡ反応を減少させようとして多数の技法が開発されている［国際公開第ＷＯ８９／０９６２２号明細書；欧州特許出願公開第ＥＰ０２３９４００公報；欧州特許出願公開第ＥＰ０４３８３１０号公報；国際公開第ＷＯ９１／０６６６７号明細書］。これらの組換えＤＮＡアプローチは、一般に、最終構造体においてヒト遺伝情報を増加させながら、最終抗体構造体においてマウス遺伝情報を減少させている。それにもかかわらず、得られる「ヒト化」抗体は、幾つかの場合においては、患者において免疫反応を未だに誘発している［ＩｓｓａｃｓＪ．Ｄ．（１９９０）Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：４４９，４５６；Ｒｅｂｅｌｌｏ，Ｐ．Ｒ．ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６８：１４１７−１４２０］。

抗体は、免疫反応を開始し得る治療薬として投与される唯一の種類のポリペプチド分子ではない。ヒト起源のタンパク質及びヒトの内部で生じるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヒトにおいて免疫反応をさらに誘発することができる。注目に値する例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子［Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５：１３５３−１３６１］及びインターフェロンα２［Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．ｅｔａｌ．，（１９９６）Ｂｒｉ．Ｊ．Ｈａｅｍ．，９４：３００−３０５；Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔａｌ．，（１９８８）ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１８：１４０９−１４１３］の治療使用が挙げられる。これらのヒトタンパク質が免疫原性であるこのような状況において、これらの対象において別の方法で機能しているこれらのタンパク質に対する免疫学的寛容の推定される破綻が存在する。

治療用タンパク質に対する持続した抗体産生応答は、ヘルパーＴ細胞の増殖及び活性化の刺激を必要とする。Ｔ細胞の刺激は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の相互作用を必要とする。相互作用の中心に、ＡＰＣの表面のペプチドＭＨＣクラスＩＩ複合体に関与するＴ細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）がある。ペプチドは、抗原タンパク質の細胞内プロセシングから派生する。ＭＨＣクラスＩＩ分子表面での提示によってＴ細胞の活性を刺激することができるタンパク質抗原由来のペプチド配列は、一般に「Ｔ細胞エピトープ」と呼ばれる。このようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する任意のアミノ酸残基配列であり、少なくとも原則として、ＴＣＲを、Ｔ細胞応答を促進するのに関与させることによってこれらのＴ細胞の活性化を生じることができる。多くのタンパク質について、少数のヘルパーＴ細胞エピトープが、Ｔ−ヘルパーシグナル伝達を駆動して、治療用タンパク質表面の非常に幅広いレパートリーの露出した表面決定因子であり得るものに対して持続した高親和性のクラス変換抗体反応をもたらすことができることが理解される。

Ｔ細胞エピトープの同定は、治療用タンパク質中のＴ細胞エピトープのエピトープ排除に対する最初のステップとして認められる。国際公開第ＷＯ９８／５２９７６号及び第ＷＯ００／３４３１７号明細書は、ヒトＭＨＣクラスＩＩＤＲアロタイプのサブセットを結合する可能性を有するポリペプチド配列を同定する計算スレッディング法を教示している。これらの応用において、予測されるＴ細胞エピトープは、計算により同定され、その後に関心のタンパク質内の慎重なアミノ酸置換の使用によって除去される。しかし、このスキーム及びその他の計算に基づいたエピトープ同定方法［Ｇｏｄｋｉｎ，Ａ．Ｊ．ｅｔａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：８５０−８５８；Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：５５５−５６１］を用いて、ＭＨＣクラスＩＩ分子を結合することができると予測されるペプチドが、あらゆる状況で、特に生体内で、プロセシング経路又はその他の現象に起因してＴ細胞エピトープとして機能し得ないことが見出されている。さらに、Ｔ細胞エピトープ予測に対する計算法は、一般的にＤＰ又はＤＱ制限を有するエピトープを予測することができなかった。

例えばＭＨＣクラスＩＩ結合表面の供給源として規定されたＭＨＣアロタイプのＢ細胞系を使用する合成ペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子結合能力を測定する生体外方法［ＭａｒｓｈａｌｌＫ．Ｗ．ｅｔａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：４９４６−４９５６；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎｅｔａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：１７９９−１８０８；ＲｏｂａｄｅｙＣ．ｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：３２３８−３２４６］は、ＭＨＣクラスＩＩリガンドの同定に応用し得る。しかし、このような技法は、広い多様性のＭＨＣアロタイプに対する多数の可能なエピトープをスクリーニングするのに適合しないし、結合ペプチドのＴ細胞エピトープとして機能する能力を確認することもできない。

Ｔ細胞エピトープの他に、多数のタンパク質が、血管漏出症候群（ＶＬＳ）を誘発することが知られている。ＶＬＳは、血管内皮に対するタンパク質介在損傷から生じる。組換えタンパク質、免疫毒素及び融合毒素の場合には、損傷は、治療用タンパク質と血管内皮細胞の間の相互作用によって開始する。

ＶＬＳの基礎となるメカニズムは、不明であり、おそらくは内皮細胞（ＥＣ）において開始される事象のカスケードを伴うと思われ、また炎症カスケード及びサイトカインを伴う（Ｅｎｇｅｒｔｅｔａｌ．，１９９７）。ＶＬＳは、血管内皮細胞（ＥＣ）に対する損傷並びに間質性浮腫、体重増加並びにその最も重篤な形での腎障害、失語症及び肺水腫をもたらす液体及びタンパク質の溢出を含む複合病因を有する（ＳａｕｓｖｉｌｌｅａｎｄＶｉｔｅｔｔａ，１９９７；ＢａｌｕｎａａｎｄＶｉｔｅｔｔａ，１９９６；Ｅｎｇｅｒｔｅｔａｌ．，１９９７）。

リシン毒素において見出されるＶＬＳモチーフの一つ、「ＬＤＶ」モチーフが、インテグリン受容体に結合するのに必要とされるフィブロネクチンのサブドメインの活性を本質的に模倣することが報告された。インテグリンは、細胞と細胞及び細胞と細胞外マトリックスの相互作用（ＥＣＭ）に介在する。インテグリンは、種々の細胞表面並びに細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、オステオスポンジン、トロンボンスポンジン及びフォンウィルブランド因子の受容体として機能する。インテグリンは、血管系の発生及び維持において重要な役割を果たし且つ血管新生中の内皮細胞接着性に影響を及ぼす。さらに、リシン「ＬＤＶ」モチーフはロタウイルスコートタンパク質に見出すことができ、このモチーフはウイルスによる細胞への結合及び侵入に重要であることが報告されている（Ｃｏｕｌｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（１０）：５３８９−５４９４（１９９７））。従って、内皮細胞接着、血管安定性、並びにヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に結合するリシン及び血管漏出に介在するＶＬＳモチーフの間に直接的関連があるように思われる。

このモチーフが同類アミノ酸置換によって除去された突然変異体脱グリコシル化リシン毒素Ａ鎖（ｄｇＲＴＡ）が組み立てられており、これらの突然変異体は、マウスモデルにおいてより小さいＶＬＳ効果を例証した（Ｓｍａｌｌｓｈａｗｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１（４）：３８７−９１（２００３））。しかし、これらの構造体の大部分は、野生型リシン毒素ほど細胞障害性ではなかったｄｇＲＴＡ突然変異体を産生し、リシン担毒体の重要な及び機能的に重要な構造変化が突然変異により生じたことを示唆している。ｄｇＲＴＡにおけるモチーフがＨＵＶＥＣ相互作用及びその他のタンパク質におけるＶＬＳに介在したことを示唆する証拠が得られなかったことも留意されるべきである。種々の研究により、突然変異体ｄｇＲＴＡの大部分が余り効果のない担毒体であることが明らかにされており、これらの突然変異担毒体を使用して融合毒素を組み立てることができることを示唆する証拠は得られなかった。

ＶＬＳは、多くの場合、細菌性敗血症中に観察され、ＩＬ−２及び種々のその他のサイトカインを伴い得る（ＢａｌｕｎａａｎｄＶｉｔｅｔｔａ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９９）２２（１）：４１−４７）。ＶＬＳはまた、タンパク質融合毒素又は組換えサイトカイン療法を受けている患者においても観察される。ＶＬＳは、低アルブミン血症、体重増加、肺水腫及び低血圧として現れることができる。免疫毒素及び融合毒素を受け入れているある患者において、筋肉痛及び横紋筋融解症が、筋肉組織又は脳微小血管系における液体蓄積の機能としてＶＬＳから生じる（Ｓｍａｌｌｓｈａｗｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１（４）：３８７−９１（２００３））。ＶＬＳは、リシンＡ鎖、サポリン、シュードモナス菌外毒素Ａ及びジフテリア毒素（ＤＴ）を含有する免疫毒素を用いて治療を受けた患者において生じている。標的毒素、免疫毒素及び組換えサイトカインの有用性に関する臨床試験の全ては、ＶＬＳ効果及びＶＬＳ様効果が治療母集団で観察されたことを報告した。ＶＬＳは、ＤＡＢ_３８９ＩＬ−２を用いて治療を受けた患者の約３０％において生じた（Ｆｏｓｓｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，１（４）：２９８−３０２（２００１）、Ｆｉｇｇｉｔｔｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１（１）：６７−７２（２０００））。ＤＡＢ_３８９ＩＬ−２（本出願において同じ意味でＤＴ_３８７−ＩＬ２ともいう）は、標的リガンドとしてインターロイキン２（ＩＬ−２）に遺伝子融合したＤＴ（ＤＴ担毒体）の触媒（Ｃ）ドメイン及び貫膜（Ｔ）ドメインからなるタンパク質融合毒素である。［Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，１：４９３−４９８（１９８７）；Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１８８５−１１８８９（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（３３）：２０６７３−２０６７７；Ｗａｔｅｒｓｅｔａｌ．，Ａｎｎ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，３０（６３６）：４０３−４０５，（１９９１）；Ｋｉｙｏｋａｗａｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４（４）：４６３−４６８（１９９１）；Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，ＩｎＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４５：９１−１０４（２０００）］。

ＶＬＳはまた、ＩＬ−２、増殖因子、モノクロナール抗体の投与及び伝統的な化学療法の後にも観察されている。重篤なＶＬＳは、液体及びタンパク質溢出、浮腫、低下した組織内灌流、治療の中止及び臓器不全を引き起こし得る［Ｖｉｔｅｔｔａｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ，１４：２５２−２５９（１９９３）；Ｓｉｅｇａｌｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１（２０）：９５１４−９５１８（１９９４）；Ｂａｌｕｎａｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１８（６−７）：３５５−３６１（１９９６）；Ｂａｌｕｎａｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３７（２−３）：１１７−１３２（１９９７）；Ｂａｓｃｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３９（３）：２５５（１９９８）］。

国際公開第ＷＯ８９／０９６２２号明細書欧州特許出願公開第ＥＰ０２３９４００公報欧州特許出願公開第ＥＰ０４３８３１０号公報国際公開第ＷＯ９１／０６６６７号明細書

Ｓｃｈｒｏｆｆ，Ｒ．Ｗ．ｅｔａｌ．，（１９８５）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４５：８７９−８８５Ｓｈａｗｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０−１５３５ＩｓｓａｃｓＪ．Ｄ．（１９９０）Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：４４９，４５６Ｒｅｂｅｌｌｏ，Ｐ．Ｒ．ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６８：１４１７−１４２０Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５：１３５３−１３６１Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．ｅｔａｌ．，（１９９６）Ｂｒｉ．Ｊ．Ｈａｅｍ．，９４：３００−３０５Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔａｌ．，（１９８８）ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１８：１４０９−１４１３Ｇｏｄｋｉｎ，Ａ．Ｊ．ｅｔａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：８５０−８５８Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：５５５−５６１ＭａｒｓｈａｌｌＫ．Ｗｅｔａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：４９４６−４９５６Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎｅｔａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：１７９９−１８０８ＲｏｂａｄｅｙＣ．ｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：３２３８−３２４６Ｃｏｕｌｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（１０）：５３８９−５４９４（１９９７）Ｓｍａｌｌｓｈａｗｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１（４）：３８７−９１（２００３）ＢａｌｕｎａａｎｄＶｉｔｅｔｔａ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９９）２２（１）：４１−４７Ｆｏｓｓｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，１（４）：２９８−３０２（２００１）Ｆｉｇｇｉｔｔｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１（１）：６７−７２（２０００）Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，１：４９３−４９８（１９８７）Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１８８５−１１８８９（１９９０）Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（３３）：２０６７３−２０６７７Ｗａｔｅｒｓｅｔａｌ．，Ａｎｎ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，３０（６３６）：４０３−４０５，（１９９１）Ｋｉｙｏｋａｗａｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４（４）：４６３−４６８（１９９１）Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，ＩｎＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４５：９１−１０４（２０００）Ｖｉｔｅｔｔａｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ，１４：２５２−２５９（１９９３）Ｓｉｅｇａｌｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１（２０）：９５１４−９５１８（１９９４）Ｂａｌｕｎａｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１８（６−７）：３５５−３６１（１９９６）Ｂａｌｕｎａｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３７（２−３）：１１７−１３２（１９９７）Ｂａｓｃｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３９（３）：２５５（１９９８）

従って、野生型ジフテリア毒素に比べて血管漏出症候群の減少をもたらす及び／又は野生型ジフテリア毒素に比べて低下した免疫原性を有する修飾ジフテリア毒素を設計する必要がある。

修飾毒素、修飾毒素を含有する融合タンパク質、その組成物、修飾毒素を調製する方法、及び修飾毒素を用いて癌などの疾患を治療する方法が、本明細書において提供される。

少なくとも１個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個のアミノ酸残基修飾を有する毒素からなる修飾毒素であって前記修飾毒素が未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示すことを特徴とする修飾毒素、修飾毒素を含有する融合タンパク質、その組成物、修飾毒素を調製する方法及び疾患を治療する方法が、本明細書において提供される。

少なくとも１個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個のアミノ酸残基修飾を含有する修飾ジフテリア毒素が本明細書において提供される。前記修飾毒素は、未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示す。Ｔ細胞エピトープは、配列番号：１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６及び１９９から選択されるアミノ酸配列を含有することができる。本明細書に開示される化合物の一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素の少なくとも１個のアミノ酸残基修飾は、配列番号：１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６及び１９９のエピトープコアで行われる。さらに別の実施形態において、少なくとも１個のアミノ酸残基修飾は、配列番号：１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６及び１９９のＮ末端、Ｃ末端、又はその両方で行われる。さらに別の実施形態において、少なくとも１個のアミノ酸残基修飾は、配列番号：１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６及び１９９のエピトープコアで及びＮ末端、Ｃ末端、又はその両方で行われる。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素は、Ｖ７Ｓ、Ｖ７Ｔ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｄ８Ｅ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｔ、Ｖ２９Ｓ、Ｖ２９Ｔ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｄ３０Ｅ、Ｓ３１Ｎ、Ｉ２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２Ｔ、Ｖ９７Ａ、Ｖ９７Ｔ、Ｖ９７Ｄ、Ｌ１０７Ｎ、Ｍ１１６Ａ、Ｍ１１６Ｑ、Ｍ１１６Ｎ、Ｆ１２４Ｈ、Ｖ１４８Ａ、Ｖ１４８Ｔ、Ｌ２９８Ａ及びＬ２９８Ｎの中から選択される１個又はそれ以上の修飾を含有する。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素は、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｔ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｔ及びＶ２９Ｄの中から選択される２個の修飾を含有する。修飾としては、以下に限定されないが、Ｖ７ＮＶ２９Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９Ｄ、Ｖ７ＴＶ２９Ｎ、Ｖ７ＴＶ２９Ｔ又はＶ７ＴＶ２９Ｄが挙げられる。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素は、Ｖ７Ｄ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｔ、Ｌ１０７Ａ、Ｌ１０７Ｎ及びＦ１２４Ｈの中から選択される３個の修飾を含有する。修飾としては、以下に限定されないが、Ｖ７ＤＬ１０７ＡＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＮＬ１０７ＡＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＮＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＴＬ１０７ＡＦ１２４Ｈ及びＶ７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈが挙げられる。

一つの実施形態において、ＤＴバリアントは、例えば、Ｖ７ＤＶ９７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＮＶ９７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＴＶ９７ＡＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＴＶ９７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＴＶ９７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＤＶ９７ＡＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＤＶ９７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＮＶ９７ＡＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ及びＶ７ＮＶ９７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈなどの４つの修飾を含有する。

修飾毒素（毒素を含有する融合物を含む）であって、前記毒素がジフテリア毒素又はその断片からなり且つ未修飾ジフテリア毒素と比べて低下した免疫原性を示す修飾毒素が本明細書において提供される。さらに、ジフテリア毒素と、非ジフテリア毒素ポリペプチド由来のリガンドの少なくとも１個の細胞結合ドメインとを含有する低下した免疫原性を示す修飾毒素が、明細書において提供される。一つの実施形態において、非ジフテリア毒素ポリペプチド由来の細胞結合ドメインは、細胞結合リガンドである。本明細書に開示される化合物の別の実施形態において、修飾毒素は、融合毒素であって、非毒素ポリペプチドが細胞結合リガンド、例えば以下に限定されないが抗体又はその抗原結合断片、サイトカイン、ポリペプチド、ホルモン、増殖因子又はインスリンである融合毒素である。

一つの実施形態において、修飾毒素は、融合毒素であって、細胞結合ドメインが抗体又はその抗原結合断片である融合毒素である。抗体は、例えば、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、ヒト化抗体、遺伝子組換え抗体、移植抗体であることができる。抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ_２、一本鎖結合ポリペプチド、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌであることができる。別の実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、例えば、Ｂ細胞表面分子ＣＤ１９又はＣＤ２２などのＢ細胞表面分子に結合する。あるいは、抗体又はその抗原結合断片は、卵巣受容体ＭＩＳＩＩＲ（ミューラー阻害物質ＩＩ型受容体）に結合する。

非ジフテリア毒素ポリペプチドは、以下に限定されないが、抗体又はその抗原結合断片、ＥＧＦ、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＮＦα、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、エフリン、ＢＦＧＦ及びＴＧＦからなり得る。一つの実施形態において、サイトカインはＩＬ２である。

また、少なくとも１個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個のアミノ酸残基修飾を有する毒素からなる修飾毒素であって、前記修飾毒素が未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示すことを特徴とする修飾毒素が、本明細書において提供される。さらに、少なくとも１個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個のアミノ酸残基修飾を有する修飾毒素であって、前記毒素がジフテリア毒素又はその断片であることを特徴とする修飾毒素が提供される。また、少なくとも１個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個のアミノ酸残基修飾を有する修飾毒素であって、前記毒素がジフテリア融合毒素であることを特徴とする修飾毒素が提供される。さらにまた、少なくとも１個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個のアミノ酸残基修飾を有する修飾毒素であって、前記毒素がジフテリア毒素と、非ジフテリア毒素ポリペプチド由来の少なくとも１個の細胞結合メインとからなるジフテリア融合毒素であることを特徴とする修飾毒素が提供される。また、少なくとも１個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個のアミノ酸残基修飾を有する修飾毒素であって、前記毒素がジフテリア毒素と、非ジフテリア毒素ポリペプチド由来の少なくとも１個の細胞結合メインとからなるジフテリア融合毒素であり且つ非ジフテリア毒素ポリペプチドがＩＬ−２であることを特徴とする修飾毒素が提供される。

低下した免疫原性及び内皮細胞に対して減少した結合を有する修飾ジフテリア毒素を含有する組成物であって、前記修飾ジフテリア毒素が、配列番号２又は２００に列記したようなアミノ酸配列であって、その中に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６及び１９９の中から選択されるアミノ酸配列を含有する少なくとも１個のＴ細胞エピトープが修飾され、及び少なくとも１個のアミノ酸修飾が、配列番号２又は２００の残基７−９、２９−３１及び２９０−２９２の中から選択される領域の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内で行われ、及び前記修飾ジフテリア毒素が、未修飾ジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有し、位置（ｘ）での修飾が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｌ及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基によるＶ又はＩの置換であり；及び／又は位置Ｄ／Ｅでの修飾が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基によるＤ又はＥの置換であり；及び／又は位置（ｙ）での修飾が、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖ及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基による置換であることを特徴とする低下した免疫原性及び内皮細胞に対して減少した結合を有する修飾ジフテリア毒素を含有する組成物が、本明細書において提供される。

未修飾ジフテリア毒素は、例えば、配列番号２又は２００のアミノ酸配列あるいは配列番号：４−１４７のいずれか一つのアミノ酸配列を有することができる。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素は、Ｖ７Ｔ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｔ、Ｓ９Ｇ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｖ２９Ｔ、Ｄ３０Ｎ、Ｓ３１Ｇ、Ｓ３１Ｎ、Ｉ２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２Ｇ及びＳ２９２Ｔの中から選択される１個又はそれ以上の修飾を含有する。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素は、２個の修飾を含有する。このような修飾ジフテリア毒素は、例えば、Ｖ７ＮＶ２９Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９Ｄ、Ｖ７ＴＶ２９Ｎ、Ｖ７ＴＶ２９Ｔ又はＶ７ＴＶ２９Ｄなどの突然変異の組み合わせを含有することができる。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素は、３個の修飾を含有する。このような修飾ジフテリア毒素は、例えば、Ｖ７ＮＶ２９ＮＩ２９０Ｎ，Ｖ７ＮＶ２９ＮＩ２９０Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＳ２９２Ａ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＳ２９２Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＩ２９０Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＩ２９０Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＳ２９２Ａ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＳ２９２Ｔ及びＶ７ＴＶ２９ＴＩ２９０Ｔなどの突然変異の組み合わせを含有することができる。

修飾ジフテリア毒素を含有する組成物は、未修飾ジフテリア毒素と比べて低下した免疫原性（修飾Ｔ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープ）及びヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する低下した結合活性を示す（有する）。このような組成物は、非ジフテリア毒素ポリペプチド、例えば以下に限定されないが、抗体又はその抗原結合断片、ＥＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＮＦα、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、エフリン、ＢＦＧＦ及びＴＧＦをさらに含有することができる。非ジフテリア毒素ポリペプチドはまた、このようなポリペプチドの断片、例えばその細胞結合部分であることもできる。一つの実施形態において、非ジフテリア毒素ポリペプチドは、ＩＬ−２又はその細胞結合部分である。

修飾ジフテリア毒素であって、（ｉ）ジフテリア毒素内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し、（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１個のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾する方法によって調製され、前記修飾ジフテリア毒素が未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示すことを特徴とする修飾ジフテリア毒素が、本明細書において提供される。

また、未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示す修飾ジフテリア毒素を選択する方法であって、（ｉ）配列番号２又は２００のジフテリア毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し、（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１個のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し、（ｉｉｉ）配列番号２又は２００の残基７−９、２９−３１及び２９０−２９２からなる群から選択される領域内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し、この場合に、前記修飾ジフテリア毒素は、未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示し、（ｉｖ）修飾ジフテリア毒素の修飾されたアミノ酸配列を解析して、少なくとも１個のＴ細胞エピトープ又は少なくとも１個のＶＬＳモチーフが修飾されていることを確認し、及び（ｖ）未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示す修飾ジフテリア毒素を選択することからなる方法が、本明細書において提供される。

未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示す修飾ジフテリア毒素を調製する方法であって、（ｉ）配列番号２又は２００のジフテリア毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し、（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１個のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾することからなる方法が、本明細書において提供される。

未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示す修飾ジフテリア毒素を調製する方法であって、（ｉ）配列番号２又は２００のジフテリア毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し；（ｉｉ）ステップ（ｉ）で同定された少なくとも１個のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し；及び（ｉｉｉ）配列番号２又は２００の残基７−９、２９−３１及び２９０−２９２からなる群から選択される領域内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾することからなり、前記修飾ジフテリア毒素が未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示すことを特徴とする方法が、さらに本明細書において提供される。

未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示す修飾ジフテリア毒素を調製する方法であって、（ｉ）配列番号２又は２００のジフテリア毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し；（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１個のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し；（ｉｉｉ）配列番号２又は２００の残基７−９、２９−３１及び２９０−２９２からなる群から選択される領域内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し；（ｉｖ）修飾ジフテリア毒素の修飾されたアミノ酸配列を解析して、Ｔ細胞エピトープの修飾がＶＬＳモチーフを生じているか否かを同定し、及び（ｖ）（ｉｖ）で同定された前記ＶＬＳモチーフを修飾することからなり、前記修飾ジフテリア毒素が未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示すことを特徴とする方法が、さらに本明細書において提供される。

未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示す修飾ジフテリア毒素を調製する方法であって、（ｉ）配列番号２又は２００のジフテリア毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し；（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１個のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し；（ｉｉｉ）配列番号２又は２００の残基７−９、２９−３１及び２９０−２９２からなる群から選択される領域内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し；（ｉｖ）修飾ジフテリア毒素の修飾されたアミノ酸配列を解析して、ＶＬＳモチーフの修飾がＴ細胞エピトープを生じているか否かを同定し、及び（ｖ）（ｉｖ）で同定された前記Ｔ細胞エピトープを修飾することからなり、前記修飾ジフテリア毒素が未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示すことを特徴とする方法が、さらに本明細書において提供される。

修飾ジフテリア毒素（この場合に、前記修飾ジフテリア毒素は、少なくとも１個のＢ細胞エピトープを失っている）を選択する方法であって、（ｉ）ジフテリア毒素ワクチンを用いて免疫された被検体から血清試料を取得し、この場合、前記血清は、前記ジフテリア毒素ワクチンに対する抗体を含有し、（ｉｉ）前記血清を１個又はそれ以上の修飾ジフテリア毒素と接触させ、この場合、前記修飾ジフテリア毒素に対する前記抗体の結合は、複合体を形成し、（ｉｉｉ）前記複合体の有無を検出し、この場合に、複合体が検出される場合には、修飾ジフテリア毒素は、少なくとも１個のＢ細胞エピトープを失っておらず及び複合体の量の低下が検出される場合には、修飾ジフテリア毒素は、少なくとも１個のＢ細胞エピトープを失っており、及び（ｉｖ）少なくとも１個のＢ細胞エピトープを失っている修飾ジフテリア毒素を選択することからなる方法が、本明細書において提供される。

修飾毒素と製薬学的に許容し得る担体又は賦形剤とを含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。

治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物における悪性疾患及びＧＶＨＤなどの非悪性疾患を治療する方法が、本明細書において提供される。

悪性疾患は、血液癌であることができる。悪性疾患は、固形腫瘍であることができる。悪性疾患はまた、転移であることができる。典型的な血液癌としては、以下に限定されないが、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、再発性／難治性Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、再発性／難治性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、皮下脂肪組織様Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、慢性リンパ球性白血病、固形腫瘍及びヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型関連急性Ｔ細胞白血病／リンパ腫が挙げられる。代表的な固形腫瘍としては、以下に限定されないが、皮膚、黒色腫、肺、膵臓、乳房、卵巣、結腸、直腸、胃、甲状腺、喉頭、前立腺、結腸直腸、頭、首、眼、口、器官、食道、胸部、骨、睾丸、リンパ、骨髄、骨、肉腫、腎臓、汗腺、肝臓、腎臓、脳、消化管、上咽頭、尿生殖路、筋肉及びその他の組織の中から選択される組織又は器官の固形腫瘍が挙げられる。転移としては、以下に限定されないが、記載の固形腫瘍のいずれかの転移性腫瘍が挙げられる。

非悪性疾患としては、例えば、ＧＶＨＤ、ａＧＶＨＤ及び乾癬が挙げられる。

本明細書に記載のＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質を投与することによって抗癌剤（例えば、ＲＮＡ導入ＤＣ、抗ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲｓｃＦｖｓなど）の活性を高める方法が、本明細書において提供される。一つの実施形態において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質が、投与され、次いで抗癌剤が投与される。一つの限定されない例において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質は、抗癌剤の少なくとも４日前に投与される。

また、抗癌剤（例えば、ＲＮＡ導入ＤＣ、抗−ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲｓｃＦｖｓなど）と本明細書に記載のＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質とを投与することによってＴｒｅｇの減少又は排除による転移性癌を治療する方法が、本明細書において提供される。転移性腫瘍としては、例えば、転移性腎細胞癌、転移性前立腺癌、転移性卵巣癌及び転移性肺癌が挙げられる。一つの実施形態において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質が投与され、次いで抗癌剤が投与される。一つの限定されない例において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質は、抗癌剤の少なくとも４日前に投与される。

別の態様において、抗癌剤（例えば、ＲＮＡ導入ＤＣ、抗−ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲｓｃＦｖｓなど）と本明細書に記載のＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質とを投与することによってＴｒｅｇの減少又は排除による前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍又は黒色腫を治療する方法が、本明細書において提供される。一つの実施形態において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質が投与され、次いで抗癌剤が投与される。一つの限定されない例において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質は、抗癌剤の少なくとも４日前に投与される。

ドナー母集団のアロタイプの頻度を示す。試験集団及び社会集団において発現されたドナーアロタイプの頻度の比較を示す。ＤＴＴ細胞エピトープマップ及びドナー応答を表す。５１人の健常ドナーに対して試験したオーバーラップペプチドを使用するＤＴ−１のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープマップを示す。バックグラウンド応答率（５．６％）は、赤い点線で示す。この閾値を越える反応を誘導するペプチドは、Ｔ細胞エピトープ（ａ＋記号で示す）を含有する。ＤＴＴ細胞エピトープ１を表す。エピトープ１は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングを使用して同定された。３人のドナーが、ペプチド２に反応した（ドナー３０、３６及び４７）。ペプチド２（配列番号：１６１）について提案された９量体結合レジスターを、表示したｐ１及びｐ９アンカー残基と共に示す。比較のために、ペプチド１及び３（配列番号：１５８及び１６０）を示す。ＤＴＴ細胞エピトープ２を示す。エピトープ２は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングを使用して同定された。４人のドナーが、ペプチド３１に反応した（ドナー１２、２３、３０及び３６）。ペプチド３１（配列番号：１６２）について提案された９量体結合レジスターを、表示したｐ１及びｐ９アンカー残基と共に示す。比較のために、ペプチド３２（配列番号：１６３）を示す。ＤＴＴ細胞エピトープ３を示す。エピトープ３は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングを使用して同定された。３人のドナーが、ペプチド３５に反応した（ドナー１、２及び３５）。ペプチド３５（配列番号：１６６）について提案された９量体結合レジスターを、表示したｐ１及びｐ９アンカー残基と共に示す。比較のために、ペプチド３４（配列番号：１６５）を示す。ＤＴＴ細胞エピトープ４を示す。エピトープ４は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングを使用して同定された。３人のドナーが、ペプチド３９に反応した（ドナー５、１５及び５０）。ペプチド３９（配列番号：１６９）について提案された９量体結合レジスターを、表示したｐ１及びｐ９アンカー残基と共に示す。ＤＴＴ細胞エピトープ５を示す。エピトープ５は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングを使用して同定された。６人のドナーが、ペプチド４０、４１及び４２に反応した。この領域（配列番号：１７３）について提案された９量体結合レジスターを、表示したｐ１及びｐ９アンカー残基と共に示す。ＤＴＴ細胞エピトープ６を示す。エピトープ６は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングを使用して同定された。３人のドナー（ドナー３０、３９及び４９）が、ペプチド４９に反応した。この領域（配列番号：１７５）について提案された９量体結合レジスターを、表示したｐ１及びｐ９アンカー残基と共に示す。ＤＴＴ細胞エピトープ７を示す。エピトープ７は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングを使用して同定された。４人のドナー（ドナー１，１５、３０及び３５）が、ペプチド１００に反応した。ペプチド１００（配列番号：１７８）について提案された９量体結合レジスターを、表示したｐ１及びｐ９アンカー残基と共に示す。比較のために、ペプチド９９（配列番号：１７６）を示す。ＤＴＴ細胞エピトープマップを示す。ＤＴ−１の配列内のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの位置を示す。Ｔ細胞エピトープマッピングにより同定されたＴ細胞エピトープを、配列の上に応答ドナー確認者（identifier）を含むバーとして示す。ＤＴペプチドに対するドナーアロタイプ反応の頻度を示す。試験集団において発現された頻度と比べた応答ドナーアロタイプの頻度（％として表す）の円グラフ表示を示す。分析は、試験集団の８％を超える応答を誘導したエピトープに限定し且つ研究集団において５％を超える頻度で発現されたアロタイプに限定した。無調整ドナーデータについてのＤＴペプチド刺激指数を示す。ボールド体で強調された刺激指数は、陽性応答を示す（ＳＩ＞２．０、ｐ＜０．０５）。イタリック体で強調された数は、ボーダーライン結果を示す（ＳＩ＞１．９、ｐ＜０．０５）。ドナー１３、２０及び３８は、極めて低いＣＰＭなので分析から除外した。調整ドナーデータについてのＤＴペプチド刺激指数を示す。ボールド体で強調された刺激指数は、陽性応答を示す（ＳＩ＞２．０、ｐ＜０．０５）。イタリック体で強調された数は、ボーダーライン結果を示す（ＳＩ＞１．９、ｐ＜０．０５）。ドナー１３、２０及び３８は、極めて低いＣＰＭなので分析から除外した。野生型ΔＲＤＴ（ひし形で示す）は、ＩＶＴＴアッセイにおいてヌル構造体（星印で示す）よりも大きな程度までＴ７−ｌｕｃプラスミドの転写／翻訳を阻害したことを示す。ＤＴ特異抗体は、内皮細胞の表面に結合されたＤＴを検出したことを示す。ＨＵＶＥＣ細胞に対するＤＴバリアントの結合（ＤＴ−Ｇｌｕ５２、ＣＲＭ突然変異体）及びＦＡＣＳ分析を使用する抗体による検出を示す。黒塗りの棒グラフは、結合剤を使用しない結果である。斜線のハッチング棒グラフは、記載の種々の条件を使用するアッセイ対照を示す。クロスハッチング棒グラフは、検出抗体（ＤＴ＋ヤギｐＡｂ抗ＤＴ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）＋抗ｇｔ−ＰＥ）の存在下でのＤＴバリアントを示す。ＨＵＶＥＣ細胞に対するＯＮＴＡＫ−Ａ１４８８及びＤＴ−Ｇｌｕ５２−Ａ１４８８の結合−ＦＡＣＳでの抗体による検出を示す。ＯＮＴＡＫ（登録商標）−Ａ１４８８６：１Ｄ：Ｐ（黄色の上の線、ひし形で示す）；ＤＴ−Ｇｌｕ５２−Ａ１４８８３：１Ｄ：Ｐ（赤色の中間の線、丸で示す）；及びＤＴ−Ｇｌｕ５２−Ａ１４８８２：１Ｄ：Ｐ（緑色の下の線、三角で示す）。ＨＵＶＥＣ細胞を、ＦＡＣＳでＩＬ−２Ｒの発現について試験した；ＯＮＴＡＫ（登録商標）−Ａ１４８８がＩＬ−２受容体を経て結合していないことが確認されたことを示す。毒素と共に短時間インキュベーションした後の細胞膜の完全性の喪失を測定するためにヨウ化プロピジウム及びＦＡＣＳを使用する細胞膜完全性アッセイを例証する。ＯＮＴＡＫ（登録商標）（ひし形で示す）、ＤＴ−Ｇｌｕ５２（四角で示す）及びｒｈＩＬ−２（三角で示す）。ＯＮＴＡＫ（４個のＶＬＳモチーフを含有する）は、ＤＴ−Ｇｌｕ５２（３個のＶＬＳモチーフ）又はｒｈＩＬ−２（１個のＶＬＳモチーフ）のいずれよりも大きい膜損傷を生じさせると思われる。細胞毒性アッセイを、ＤＴ−ＩＬ２Ｔ細胞エピトープ及びＩＶＴＴアッセイで選択されたＶＬＳバリアントリードの活性を確認するのに使用する。ＯＮＴＡＫ(登録商標）（ひし形印）、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２、四角で示す）及び対照（三角で示す）は、ＯＮＴＡＫ(登録商標）が細胞毒性であることを例証する。野生型（ＷＴ）と比べたバリアントのＡＤＰリボシル化活性を例証する。アッセイの閾値は、０．５であった。「^！」又は「^＊」で印を付けた棒線は、統計学的に有意な結果を示す。代表的な数のエピトープバリアントの設計を図解する。野生型（ＷＴ）と比べたバリアントのＡＤＰリボシル化活性を図解する。アッセイの閾値は、０．５であった。ＤＴの野生型及びエピトープ（Ｅｐ）バリアントによる標的Ｔ７−ルシフェラーゼプラスミドの生体外転写／翻訳の阻害を、Ｔ７−連結網状赤血球溶菌液キット及びＳｔｅａｄｙＧｌｏ化学発光試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。ＩＣ_５０を測定し、野生型ＤＴの値をそれぞれのエピトープバリアントの値で除して、プロットした活性比を算出した（Ｙ軸）。反復実験（ｎ＝３）からの平均値を示す。１＝ＷＴ活性。０．５＝最小許容活性の閾値。タンパク質合成の阻害における野生型ＤＴ３８２と比べたＤＴ３８２のエピトープバリアントの相対活性を示す。タンパク質合成の阻害における野生型ＤＴと比べたＶＬＳＤＴバリアントの相対活性を示す。ＨＵＶＥＣ細胞に対する標識ＶＬＳバリアントの結合を示す。ＤＴ３８９−ＩＬ２は、黒塗りのひし形印（◆）として表し、ＤＴ３８２は、黒塗りの四角印（■）として示し、ＤＴ３８２（Ｖ７ＮＶ２９ＴＳ２９２Ｔ）は、黒塗りの三角印（▲）として示し、ＤＴ３８２（Ｖ７ＮＶ２９ＴＩ２９０Ｎ）は、「×」として示し、及びＢＳＡは、黒塗りの丸印（●）として示す。野生型及びヌルＤＴバリアントと比べた修飾ＤＴバリアントについてのＩＣ_５０データを示す。ＷＴは、黒塗りのひし形印（◆）として示し、ヌルＤＴバリアントは、白塗りの四角印（□）として示し、ＤＴ２９Ｎは、記号「＋」として示し、Ｓ３０Ｇは、黒塗りの三角印（▲）として示し及びＶ１４８Ａは、星印（＊）として示す。ＤＡＢ３９８（ＤＴ）の以下のＴ細胞マップを、ｉＴｏｐｅ（商標）Ｔ細胞エピトープ予測ソフトウエアを使用して作製した。Ｔ細胞エピトープを含む可能性がある領域に、ボールド体での可能性のあるｐ１アンカー残基と共に下線を付した。生体外Ｔ細胞アッセイを使用して同定されたＴ細胞エピトープの位置は、囲んで強調した。４重Ｔ細胞エピトープＤＴバリアントについてＩＣ_５０データを示す。ＨＵＶＥＣ細胞に対するＯＮＴＡＫ−４８８、対照ＤＴ（ΔＲ）−４８８及びＢＳＡ−４８８の結合−ＦＡＣＳでの抗体による検出を示す。ＯＮＴＡＫ（登録商標）−４８８２．８：１Ｄ：Ｐ（上の線、さらに印「＋」で示す）、対照ＤＴ（ΔＲ）−４８８３：１Ｄ：Ｐ（上の二番目の線、丸印「●」で示す）、ＢＳＡ−４８８７：１Ｄ：Ｐ（中間の線、星印「＊」で示す）、ＢＳＡ−４８８５：１Ｄ：Ｐ（下から二番目の線、「×」で示す）及びＢＳＡ−４８８２．６：１Ｄ：Ｐ（一番下の線、三角印「▲」で示す）。野生型ＤＴ３８２、ＤＴ３８２バリアント及びヌル構造体ＤＴ３８２（Ｇ５３Ｅ）のアミノ酸配列を示す。下線を付した配列は、ベクター／タグ配列であり、エンテロキナーゼ切断部位はイタリック体で強調し及びＷＴ配列由来の突然変異はボールド体で示す。

文献の援用
本明細書に挙げた全ての刊行物及び特許出願明細書は、それぞれ個々の刊行物又は特許出願明細書が具体的に及び独立して参照することにより組み込まれることを示されているかのように、同じ程度に参照することにより本明細書に組み込まれる。

本出願は、特定の製剤又はプロセスパラメーターに限定されないことが理解されるべきである。なぜならば、これらは、勿論、変化させ得るからである。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とするものであり、限定することを意図するものでないことも理解されるべきである。また、本明細書に記載の方法及び物質と同様又は均等の多数の方法及び物質が本発明の実施において使用できることが理解されるべきである。

本出願に従って、当該技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術を使用し得る。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（１９８９）；「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］；「ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＨａｎｄｂｏｏｋ」ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４）］；「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］、「ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．１９８４）；「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｍｓｅｄｓ．（１９８５）］；「ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；「ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］、「ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬＰｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）が参照される。これらのそれぞれは、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。

Ｉ．Ｔ細胞エピトープを同定する方法
最近、合成ペプチドと組み合わせた組換えＭＨＣ分子の可溶性複合体を開発する技術が使用し始めている［Ｋｅｒｎ，Ｆ．ｅｔａｌ．，（１９９８）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ４：９７５−９７８；Ｋｗｏｋ，Ｗ．Ｗ．ｅｔａｌ．，（２００１）ＴｒｅｎｄｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．，２２：５８３−５８８］。これらの試薬及び手順は、特定のＭＨＣペプチド複合体を結合することができ及び広い多様なＭＨＣアロタイプに対するスクリーニング多重可能性エピトープに適合しないヒト又は実験動物被検体由来の末梢血試料からＴ細胞クローンの存在を同定するのに使用される。

Ｔ細胞活性化の生物学的アッセイは、依然として、試験ペプチド／タンパク質配列の免疫反応を誘発する能力の読み取りを提供するのに最も実用的な選択肢になっている。この種のアプローチの例としては、細菌タンパク質スタフィロキナーゼにＴ細胞増殖アッセイを使用し、次いでＴ細胞株を刺激するのに合成ペプチドを使用してエピトープマッピングするＰｅｔｒａらの研究が挙げられる［Ｐｅｔｒａ，Ａ．Ｍ．ｅｔａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：１５５−１６１］。同様に、破傷風毒素タンパク質の合成ペプチドを使用するＴ細胞増殖アッセイは、毒素の免疫優性エピトープ領域の規定をもたらしている［ＲｅｅｃｅＪ．Ｃ．ｅｔａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：６１７５−６１８４］。国際公開第ＷＯ９９／５３０３８号明細書は、ヒト免疫細胞の単離サブセットを使用し、生体外（in vitro）でその分化を促進し、関心の合成ペプチドの存在下で細胞を培養し及び培養したＴ細胞の誘導された増殖を測定することによって試験タンパク質中のＴ細胞エピトープを決定し得るアプローチを開示している。同じ技法は、Ｓｔｉｃｋｌｅｒらによっても記載されている［Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，Ｍ．Ｍ．ｅｔａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ２３：６５４−６６０］；両方の場合において、この方法は、細菌スブチリシン内のＴ細胞エピトープの検出に適用される。このような技法は、所望の免疫細胞サブセット（樹状細胞、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を得るために、細胞単離法及び多数のサイトカインサプリメントを用いる細胞培養の注意深い適用を必要とする。

国際公開第ＷＯ０２／０６９２３２号明細書は、治療的関心の多数のタンパク質についてＭＨＣクラスＩＩリガンドを定義するコンピューター法を記載している。しかし、生体内で免疫原性ペプチドの提示を導くタンパク質分解プロセシング及びその他の生理学的ステップの必要などの理由により、コンピューターに基づいたスキームによって定義できるペプチドの全レパートリーの比較的少ないサブセットが最終的な生物学的関連性を有することは明らかである。従って、生体外ヒトＴ細胞活性化アッセイが、Ｔ細胞活性化を裏付けることができる毒素のタンパク質配列内の領域を同定するのに使用可能であり、それによってこのタンパク質における免疫原性の問題に最も生物学的に関連する。本明細書で使用する「Ｔ細胞エピトープ」とは、ＭＨＣクラスＩＩに結合することができ、Ｔ細胞を刺激することができ及び／又はＭＨＣクラスＩＩと複合化してＴ細胞を結合することができる（必ずしも測定できるほどに活性化させる必要はない）アミノ酸配列を指す。

本明細書に開示した方法に従って、合成ペプチドは、生体外で培養したヒトＴ細胞において増殖反応を誘発するその能力について試験される。Ｔ細胞は、全血試料から周知の手段で容易に得ることができる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層内に存在する。さらに、ＰＢＭＣ標本は、生理学的比率のＴ細胞と抗原提示細胞を含有し、従って生体外で代理免疫反応を行う良好な物質源である。このようなアッセイの操作において、２．０にほぼ等しいか又はそれを超える刺激指数は、誘導性増殖の有用な尺度である。しかし、刺激指数は、毒素に応じて異なっていてもよく、それぞれの毒素及び対応するペプチドライブラリーについてのベースラインを参照して確定し得る。このような試験の一つの例において、刺激指数（ＳＩ）は、試験ペプチドに対して測定された増殖スコア（例えば、例えば^３Ｈ−チミジン取り込みを使用する場合には放射能の１分当たりのカウント数）を、試験ペプチドと接触していない細胞で測定されたスコアで割り算することによって慣用的に得てもよい。反応を誘発しないペプチドは、ＳＩ＝１．０を示し得るが、０．８−１．２の範囲内のＳＩ値もまた珍しいものではないかもしれない。多数の技術的方法が、記録されたスコアの信頼を確保するために、このようなアッセイの操作に組み込むことができる。典型的には、全ての測定は、少なくとも３回の反復で行われ、平均スコアが算出され得る。算出されたＳＩ＝＞２．０である場合には、３回反復の個々のスコアは、異常データの証拠について調べることができる。試験ペプチドは、細胞と少なくとも２種類の濃度で接触させ、その濃度は、典型的には、最低２倍の濃度差に及ぶであろう。このような濃度範囲は、アッセイに対してキネティック・ディメンションへのオフセットを提供し、単一時間点測定、例えばプラス７日で行われる場合には有用であり得る。幾つかのアッセイにおいては、多重時間経過測定を行ってもよく、これらもまた最低２種類の濃度で提供されるペプチド免疫原を使用して行ってもよい。同様に、ＰＢＭＣドナー試料の大部分が反応性であると予想される対照ペプチドの含有は、それぞれのアッセイプレートに含め得る。インフルエンザ赤血球凝集素ペプチド３０７−３０９、配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡ（配列番号：２０１）；及びクラミジアＨＳＰ６０ペプチド配列ＫＶＶＤＱＩＫＫＩＳＫＰＶＱＨ（配列番号：２０２）は、対照ペプチドをこのようなアッセイに使用した例である。あるいは、又はさらに、アッセイはまた、可能な全タンパク質抗原、例えばキーホールリンペット由来のヘモシアニンを使用でき、それに対する全ＰＢＭＣ試料は、２．０よりも著しく大きいＳＩを示すことが予期されるであろう。このような使用のためのその他の対照抗原は、当該技術において周知であろう。

本明細書に開示の方法は、マップが広い範囲の可能なＭＨＣアロタイプに関連性を有する場合の毒素のエピトープマップを提供できる。マップは、タンパク質を投与される可能性がある患者の大部分についてタンパク質のＴ細胞駆動免疫反応を誘発する能力を除外し得るか又は少なくとも改善し得る修飾タンパク質の設計又は選択を可能にすることを十分に表し得る。改善とは、未修飾タンパク質と比べて免疫反応の低下（すなわち、低下した免疫原性）（例えば、多かれ少なかれ約１．５倍、多かれ少なかれ約２倍、多かれ少なかれ約５倍、多かれ少なかれ約１０倍、多かれ少なかれ約２０倍、多かれ少なかれ約５０倍、多かれ少なかれ約１００倍、多かれ少なかれ約２００倍、多かれ少なかれ約５００倍、又はこれらのこの範囲）を指すことができる。あるいは、低下した免疫原性を有するタンパク質又は毒素とは、未修飾タンパク質と比べて免疫反応を導くその能力の低下％（例えば、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約１０％未満、約２０％未満、約５０％未満、約１００％未満及びこれらの範囲）を指すことができる。従って、スクリーニング方法の実施において、未処置ドナー由来のＰＢＭＣ誘導Ｔ細胞は、ヒト集団に現存の少なくとも９０％を超えるＭＨＣクラスＩＩレパートリー（ＨＬＡ−ＤＲ）の試料を提供するために十分な免疫多様性のドナーのプールから収集される。ナイーブＴ細胞反応が所定の合成ペプチドに対して検出されるべきである場合には、実際にはペプチドは、単離において多数のドナーから誘導されたＰＢＭＣ標本と接触する。ドナーの数（又は「ドナープール」の大きさ）は、実際上は２０人未満の関連のない個人であるとは思われず及びドナープールにおける全試料は、そのＭＨＣクラスＩＩハプロタイプに従って予め選択し得る。

本明細書で使用する「未処置ドナー」という用語は、環境面で、ワクチン接種によって、又は例えば輸血などの他の手段によって、毒素にこれまでに暴露されていない被検体を指す。

ある国の人々は、毒素に対して定期的にワクチン接種を受けているか又は例えばジフテリア毒素などの外因性毒素及び毒素様タンパク質の環境源に暴露されていることが注目される。このような人々において、前記の増加したＳＩスコアによる尺度として想起応答の可能性が存在する。

Ｔ細胞エピトープについてスクリーニングする場合には、Ｔ細胞は、多数の異なる健常ドナーであるが治療的にタンパク質を受け入れていない健常ドナー由来の末梢血試料から得ることができる。必要ならば、患者の血液試料は、１個又はそれ以上のポリペプチドの有無を同定するために抗体を使用するＥＬＩＳＡなどの従来のアッセイを使用して特定のポリペプチドの存在について試験することができる。アッセイは、当該技術で知られている従来の方法を使用して生体外で培養したＰＢＭＣを使用して行われ、ＰＢＭＣを、関心のタンパク質を代表する合成ペプチド種（すなわち、ライブラリー）と接触させ、適当な期間のインキュベーション、細胞増殖などのペプチド誘導Ｔ細胞活性化の測定を行うことを伴う。測定は、任意の適当な手段であることができ且つ例えばＨ^３−チミジンの取り込みを使用して行ってもよく、それによって細胞物質へのＨ^３の蓄積が、実験装置を使用して容易に測定される。ＰＢＭＣ試料及び合成ペプチドのそれぞれの組み合わせについての細胞増殖の程度は、非ペプチド処理ＰＢＭＣ試料において認められる細胞増殖の程度と比較して調べることができる。予期した増殖効果がある1個又は複数個のペプチドを用いた処置の後に認められる増殖反応に対して参照もまたなし得る。これに関して、公知の幅広いＭＨＣ制限を有するペプチド、特にＤＰ又はＤＱイソ型に対してＭＨＣ制限を有するペプチドエピトープを使用することが好都合であるが、本発明はこのような制限ペプチドの使用に限定されない。このようなペプチドは、例えばインフルエンザ赤血球凝集素及びクラミジアＨＳＰ６０に関して上記に記載されている。

一つの限定されない例において、ジフテリア毒素（ＤＴ）についてのＴ細胞エピトープは、マッピングされ、その後に本明細書に記載の方法を使用して修飾される。ＤＴについてエピトープマップの組み立てを促進するために、合成ペプチドのライブラリーが作製される。ペプチドのそれぞれは、長さでアミノ酸残基１５個であり、それぞれは、１２個のアミノ酸残基ずつ一連の次のペプチドに重なり合う。すなわち、一連のそれぞれのペプチドは、分析にさらに３個のアミノ酸を増加的に付加した。このような方法で、所定の隣接したペプチド対は、連続した配列の１８個のアミノ酸をマップ化した。ナイーブＴ細胞アッセイを使用するＤＴについてＴ細胞マップを定義する一つの方法を、実施例７で例証する。毒素のＴ細胞マップを定義する方法によって同定されたペプチドのそれぞれは、ＭＨＣクラスＩＩを結合し、アッセイ系で検出できる増殖爆発を誘発するのに十分な親和性を有する少なくとも１個の同族ＴＣＲに関与できることを示唆する。

ＩＩ．毒素を修飾する方法
本明細書に記載の毒素分子は、組換え方法の使用を含め幾つかの方法のいずれかで調製できる。本明細書において提供されるタンパク質配列及び情報は、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡ)を推定するのに使用できる。これは、例えば、ＤＮＳｓｔａｒｓｏｆｔｗａｒｅｓｕｉｔｅ［ＤＮＡｓｔａｒＩｎｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．，ＵＳＡ］などのコンピューターソフトウエアツールを使用して達成できる。ポリペプチドをコードするこのようなポリヌクレオチド又はその重要なホモローグ、バリアント、切断、伸長もしくは別の修飾が、本明細書において意図される。

毒素のＴ細胞エピトープをマッピングし（同定し）、該エピトープを、修飾された配列がヘルパーＴ反応の誘導を抑制する（部分的に又は完全に）ように修飾する方法が、本明細書において提供される。修飾としては、同様の変化に影響を及ぼすために修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンにおいてなされるアミノ酸の置換、欠失、又は挿入が挙げられる。アミノ酸残基をコードするコドンは、当該技術で周知である。標的配列の定方向突然変異誘発を達成するために組換えＤＮＡ方法を使用することができ、多数のこのような方法が利用でき、本明細書に記載され及び前記のような技術において知られている。一般的に、部位特異的突然変異誘発の技術は周知である。簡潔に述べると、オリゴヌクレオチド指向ＰＣＲ突然変異誘発用の一本鎖鋳型を生成するバクテリオファージベクターが用いられる。ファージベクター（例えば、Ｍ１３）は、市販されており、その使用は、一般に当該技術で周知である。同様に、二本鎖プラスミドもまた、関心のポリヌクレオチドをファージからプラスミドに移す工程を排除する部位特異的変異誘発において常用されている。所定の突然変異配列を有する合成オリゴヌクレオチドプライマーが、この鋳型から修飾された（所望の突然変異体）ＤＮＡの生体外合成を指示するのに使用でき、ヘテロ二本鎖ＤＮＡが、所望のクローンの増殖選択及び同定のためのコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換させるのに使用される。あるいは、１対のプライマーを、二本鎖ベクターの２個の別々の鎖にアニールさせて、ＰＣＲ反応において所望の突然変異を有する両方の対応する相補鎖を同時に合成できる。

一つの実施形態において、Ｓｕｇｉｍｏｔｏらによって報告されているようなプラスミドＤＮＡ鋳型を使用するＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発法が使用できる（Ｓｕｇｉｍｏｔｏｅｔａｌ．，Ａｎｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７９（２）：３０９−３１１（１９８９））。挿入片の挿入標的遺伝子を含有するプラスミド鋳型のＰＣＲ増幅は、所望の突然変異を含む２個の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して達成される。それぞれベクターの向かい合った鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、突然変異誘発グレードのＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼによって温度サイクル中に伸長される。オリゴヌクレオチドプライマーの取り込みの際に、ねじれ型のニック（切れ目）を含有する突然変異プラスミドが生成する。増幅された非メチル化生成物は、ＤｐｎＩで処理して、メチル化親ＤＮＡ鋳型を消化し、突然変異を含む新たに合成されたＤＮＡを選択する。大部分の大腸菌株から単離されるＤＮＡは、ダム・メチル化されることから、メチル化及びヘミメチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩ消化に感受性である。反応生成物は、所望の修飾を有するプラスミドを得るために、大腸菌の高効率株中に形質転換される。ポリペプチド中にアミノ酸修飾を誘導する別の方法は、当該技術において周知であり、本明細書でも使用できる。

タンパク質に適した修飾としては、特定の残基又は残基の組み合わせのアミノ酸置換を挙げ得る。Ｔ細胞エピトープの排除のために、アミノ酸置換は、Ｔ細胞エピトープの活性の抑制又は排除を達成すると予測されるアミノ酸配列内の適切な位置又はアミノ酸残基で行われる。実際に、適切な位置又はアミノ酸残基は、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝内に提供されるポケットの一つの中に結合するアミノ酸残基と同じであることが好ましいであろう。このような修飾は、いわゆるペプチドの「Ｐ１」又は「Ｐ１アンカー」位置の裂隙の第一のポケット内の結合を変化させ得る。ペプチドのＰ１アンカー残基とＭＨＣクラスＩＩ結合溝の第一のポケットとの間の結合相互作用の性質は、全ペプチドに対する全体結合親和性の主要な決定因子であると認められる。アミノ酸配列のこの位置での適切な置換は、一般に、ポケット（例えば、より親水性の残基に対する置換）内に容易に適応しにくいアミノ酸残基を取り込むであろう。ＭＨＣ結合裂隙内のその他のポケット領域内の結合と同じ位置のペプチドのアミノ酸残基もまた、考慮され、この範囲に入る。

所定の可能なＴ細胞エピトープ内の単一のアミノ酸修飾は、１個又はそれ以上のＴ細胞エピトープを排除し得る一つの経路を表すことが理解される。単一のエピトープ内の修飾の組み合わせが、考慮し得、独立して規定されたエピトープが相互に重なり合っている場合には適切であり得る。また、アミノ酸修飾（所定のエピトープ内で単独で又は単一のエピトープ内で組み合わせで）は、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝に関して「ポケット残基」と異なる位置であるが、アミノ酸配列内の任意の位置で行われてもよい。修飾は、当該技術で知られており及び本明細書に記載されている公知のコンピューター法を使用して生じる相同構造又は構造方法を参照して行われてもよく、ポリペプチドの公知の構造的特徴に基づいていてもよい。変化（修飾）は、バリアント分子の構造又は生物活性を復元することを意図し得る。このような代償的変化及び変化としてはまた、ポリペプチドから特定のアミノ酸残基の欠失又は付加（挿入）も挙げ得る。また、構造を変化させる及び／又は分子の生物活性を抑制する修飾及びＴ細胞エピトープを排除し、従って分子の免疫原性を低下させる修飾を行うことができる。あらゆる形の修飾が本明細書において意図される。

タンパク質分子からエピトープを除去する別の手段は、国際公開第ＷＯ０２／０６９２３２号明細書（これもまた参照することによって本明細書に完全に組み込まれる）に記載のスキームに従って開発されたコンピューターツールと共に、本明細書に概説したようなナイーブＴ細胞活性化アッセイスキームの共同使用である。ソフトウエアは、所定のポリペプチド配列について結合スコアを得るためにポリペプチドＭＨＣクラスＩＩ結合相互作用のレベルでの抗原提示のプロセスをシミュレートする。このようなスコアは、集団に現存する主要ＭＨＣクラスＩＩアロタイプの多くについて測定される。このスキームは、任意のポリペプチド配列を試験することができるので、ポリペプチドのＭＨＣクラスＩＩ結合溝と相互作用する能力に関してアミノ酸の置換、付加又は欠失の結果が予測できる。従って、ＭＨＣクラスＩＩと相互作用できる減少した数のアミノ酸を含有し、それによって免疫原Ｔ細胞エピトープとして機能する新たな配列組成を設計できる。一つの所定のドナー試料を使用する生物アッセイが、最大４つのＤＲアロタイプに対する結合を評価できる場合には、コンピューター法は、＞４０のアロタイプを同時に使用して同じポリペプチド配列を試験できる。実際には、このアプローチは、多数のＭＨＣアロタイプと相互作用するその能力において変化させられている新しい配列バリアントの設計を指示することができる。当業者には明らかであるように、望まれていないエピトープを除去するという目的を達成する置換の多数の代替セットに到達できるであろう。しかし、得られる配列は、本明細書に開示の特定の組成物と密接に相同性であると認められ、従って本出願の範囲内に入る。

エピトープマッピング及び場合によりＴ細胞活性化の生物学に基づいたアッセイを使用する再試験と協力して、ＭＨＣクラスＩＩリガンドの同定のため及びＭＨＣクラスＩＩリガンドを欠く配列類縁体の設計のためのコンピューターツールを使用する併用アプローチは、本出願の別の方法及び実施形態である。この実施形態の一般的な方法は、以下の工程、すなわち、
ｉ）ナイーブＴ細胞活性化アッセイ及び関心のタンパク質配列を集合的に包含する合成ペプチドを使用して、Ｔ細胞を活性化することができるエピトープ領域を同定する工程と、
ｉｉ）ペプチドリガンドと１つ又はそれ以上のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを使用して、工程（ｉ）で同定されたエピトープ領域を解析し、それによってエピトープ領域内にあるＭＨＣクラスＩＩリガンドを同定する工程と、
ｉｉｉ）ペプチドリガンドと１つ又はそれ以上のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレートする計算スキームを使用して、もはやＭＨＣクラスＩＩを結合しないか又はより少ない数のＭＨＣアロタイプに対して低い親和性をもって結合するエピトープ領域内に含まれるＭＨＣリガンドの配列類縁体を同定する工程と、及び場合により
ｉｖ）関心のタンパク質内の同定されたエピトープ領域を完全に包含するか又は収集において包含し、ナイーブＴ細胞活性化アッセイにおける配列類縁体を野生型（親）配列と同時に試験するナイーブＴ細胞活性化アッセイ及び合成ペプチドを使用する工程と、
からなる。

一つの実施形態において、未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示す修飾毒素を調製する方法は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し、少なくとも１個の同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾することからなる。

別の実施形態において、未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示す修飾毒素は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し、少なくとも１個の同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾する方法によって生成される。

さらに別の実施形態において、未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示す修飾毒素を選択する方法は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し、少なくとも１個の同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し、未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示す修飾毒素を選択することからなる。
ＤＴＴ細胞エピトープ
また、１個又はそれ以上のＴ細胞エピトープに少なくとも１個の修飾を有するＤＴバリアントが、本明細書において提供される。７個のＴ細胞エピトープが、本明細書に記載の方法及びさらに実施例９に記載の方法によってＤＴ内で同定された。７個のＴ細胞エピトープは、配列番号：１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６及び１９９に示すようなジフテリア毒素アミノ酸配列を含有する。本明細書に記載のように、配列番号：１８１は、配列番号：２又は２００のアミノ酸残基１−２７に対応し、配列番号：１８４は、配列番号：２のアミノ酸残基８５−１１７に対応し、配列番号：１８７は、配列番号：２又は２００のアミノ酸残基９５−１２７に対応し、配列番号：１９０は、配列番号：２又は２００のアミノ酸残基１０４−１３６に対応し、配列番号：１９３は、配列番号：２又は２００のアミノ酸残基１１２−１４４に対応し、配列番号：１９６は、配列番号：２又は２００のアミノ酸残基１３６−１６８に対応し及び配列番号：１９９は、配列番号：２又は２００のアミノ酸残基２８６−３１８に対応する。これらのエピトープは、さらに、エピトープ（９量体結合レジスター）及び隣接アミノ酸残基のＭＨＣクラスＩＩ結合のための最も好ましい結合レジスターであるコア９量体アミノ酸配列を含有する。コア９量体結合レジスターは、一次エピトープであると考えられるが、９量体結合レジスターの外側に配置された残基は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用し且つペプチド/ＭＨＣクラスＩＩ複合体の安定性を支えることが明らかにされている。7個の同定されたＤＴＴ細胞エピトープのコア９量体結合レジスターは、配列番号：１６１、１６４、１６７、１６９、１７３、１７５及び１７８のアミノ酸配列を有する。

本明細書に記載のＴ細胞エピトープは、さらに、エピトープの領域によって特徴付けることができる。このような領域は、エピトープコア、Ｎ末端及びＣ末端を含有する。本明細書で使用する「エピトープコア」とは、Ｔ細胞エピトープのコア９量体アミノ酸配列を指す。エピトープコアは、さらに、Ｎ末端及び／又はＣ末端のコア９量体アミノ酸配列に隣接した０個、１個、２個又は３個のアミノ酸残基を含有することができる。従って、エピトープコアは、ある実施形態においては、約９個のアミノ酸から最大約１５個のアミノ酸までの長さに及ぶことができる。

本明細書で使用する「Ｎ末端」とは、エピトープコアのＮ末端に隣接したアミノ酸を指し、エピトープコアのＮ末端に隣接し且つその上流の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個のアミノ酸を包含する。

本明細書で使用する「Ｃ末端」とは、エピトープコアのＣ末端に隣接したアミノ酸を指し、エピトープコアのＣ末端に隣接し且つその下流の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個のアミノ酸を包含する。

ＤＴＴ細胞エピトープ１は、ＶＤＳＳＫＳＦＶＭ（配列番号：１６１）として示すアミノ酸配列を有する９量体ペプチドからなる。本明細書に記載のように、Ｔ細胞エピトープの排除は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個のアミノ酸を修飾することによって及び／又はエピトープコアのＮ末端及び／又はＣ末端に隣接した０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又はそれ以上のアミノ酸残基を修飾することによって達成できる。

一つの限定されない例において、配列番号：１８１として示すアミノ酸配列を有するＤＴＴ細胞エピトープ１のエピトープコア内の１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素であって、アミノ酸修飾が挿入、欠失又は置換によるものであるジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ１のコアエピトープは、配列番号：１８１に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基７−１５、６−１６、５−１７、４−１８又はこれらの任意の組み合わせを含有することができる。また、本明細書において、配列番号：１８１に示すアミノ酸配列を有するＤＴＴ細胞エピトープ１のＮ末端及び／又はＣ末端に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素が提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ１のＮ末端は、配列番号：１８１に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１−６、１−５、１−４、１−３又はこれらの中の任意の組み合わせを含有する。ＤＴＴ細胞エピトープ１のＣ末端は、配列番号：１８１に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１６−２４、１７−２５、１８−２６、１９−２７又はこれらの中の任意の組み合わせを含有する。また、配列番号：１８１のエピトープコアに及び配列番号：１８１のＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾ジフテリア毒素が、本明細書において提供される。一つの限定されない例において、エピトープコアのＰ１バリン残基は、同定されたＴ細胞エピトープを修飾及び／又は排除するために任意のアミノ酸残基で置換することができる。一つの実施形態において、エピトープコアのＰ１バリン残基は、同定されたＴ細胞エピトープを修飾及び／又は排除するために、残基の極性部分がＤＴ分子上に露出された表面であり且つ疎水性領域が埋め込まれるように、極性アミノ酸残基で置換することができる。極性アミノ酸残基の例としては、以下に限定されないが、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、リシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸／アスパラギン酸塩（Ｄ）、グルタミン酸／グルタミン酸塩（Ｅ）及びグルタミン（Ｑ）が挙げられる。これらの修飾は以下に記載のその他のエピトープに適用できることが理解されるであろう。

ＤＴＴ細胞エピトープ２は、ＶＤＮＡＥＴＩＫＫ（配列番号：１６４）として示すアミノ酸配列を有する９量体ペプチドからなる。このＴ細胞エピトープの排除は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個のアミノ酸を修飾することによって及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又はそれ以上のアミノ酸残基を修飾することによって達成できる。一つの限定されない例において、配列番号：１８４のエピトープコア内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素であって、アミノ酸修飾が挿入、欠失又は置換によるものであるジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ２のコアエピトープは、配列番号：１８４として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１３−２１、１２−２２、１１−２３、１０−２４又はその中の任意の組み合わせを含有する。また、配列番号：１８４に示すアミノ酸配列を有するＤＴＴ細胞エピトープ２のＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ２のＮ末端は、配列番号：１８４として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１−９、２−１０、３−１１、４−１２又はこれらの中の任意の組み合わせを含有する。ＤＴＴ細胞エピトープ２のＣ末端は、配列番号：１８４として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２２−３０、２３−３１、２４−３２、２５−３３又はこれらの中の任意の組み合わせを含有する。また、配列番号：１８４のエピトープコアに及びＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾ジフテリア毒素が、本明細書において提供される。一つの限定されない例において、コア９量体のＰ１バリン残基は、同定されたＴ細胞エピトープを修飾及び／又は排除するために任意のアミノ酸残基で置換することができる。

ＤＴＴ細胞エピトープ３は、ＬＧＬＳＬＴＥＰＬ（配列番号：１６７）として示すアミノ酸配列を有する９量体ペプチドからなる。このＴ細胞エピトープの排除は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個のアミノ酸を修飾することによって及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又はそれ以上のアミノ酸残基を修飾することによって達成することができる。一つの限定されない例において、配列番号：１８７のエピトープコア内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素であって、アミノ酸修飾が挿入、欠失又は置換によるものであるジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ３のコアエピトープは、配列番号：１８７として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１３−２１、１２−２２、１１−２３、１０−２４又はその中の任意の組み合わせを含有することができる。また、配列番号：１８７に示すアミノ酸配列を有するＤＴＴ細胞エピトープ３のＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ３のＮ末端は、配列番号：１８７として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１−９、２−１０、３−１１、４−１２又はその中の任意の組み合わせを含有する。ＤＴＴ細胞エピトープ３のＣ末端は、配列番号：１８７として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２２−３０、２３−３１、２４−３２、２５−３３又はその中の任意の組み合わせを含有する。また、配列番号：１８７のエピトープコアに及びＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾ジフテリア毒素が、本明細書において提供される。一つの限定されない例において、コア９量体のＰ１リシン残基は、同定されたＴ細胞エピトープを修飾及び／又は排除するために、残基の極性部分がＤＴ分子上の露出した表面であり且つ疎疎水性領域が埋め込まれるように、極性アミノ酸残基で置換することができる。さらに別の限定されない例において、コア９量体のＰ６トレオニン及び／又はＰ７グルタミン酸位置は、同定されたＴ細胞エピトープを修飾及び／又は排除するために任意のアミノ酸で置換することができる。

ＤＴＴ細胞エピトープ４は、ＭＥＱＶＧＴＥＥＦ（配列番号：１６９）として示すアミノ酸配列を有する９量体ペプチドからなる。このＴ細胞エピトープの排除は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個のアミノ酸を修飾することによって及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９又はそれ以上のアミノ酸残基を修飾することによって達成することができる。一つの限定されない例において、配列番号：１９０のエピトープコア内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素であって、アミノ酸修飾が挿入、欠失又は置換によるものであるジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ４のコアエピトープは、配列番号：１９０として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１３−２１、１２−２２、１１−２３、１０−２４又はその中の任意の組み合わせを含有することができる。また、配列番号：１９０に示すアミノ酸配列を有するＤＴＴ細胞エピトープ４のＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ４のＮ末端は、配列番号：１９０として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１−９、２−１０、３−１１、４−１２又はその中の任意の組み合わせを含有する。ＤＴＴ細胞エピトープ４のＣ末端は、配列番号：１９０として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２２−３０、２３−３１、２４−３２、２５−３３又はその中の任意の組み合わせを含有する。また、配列番号：１９０のエピトープコアに及びＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾ジフテリア毒素が、本明細書において提供される。一つの限定されない例において、コア９量体のＰ６トレオニン及び／又はＰ７グルタミン酸残基は、同定されたＴ細胞エピトープを修飾及び／又は排除するため任意のアミノ酸で置換することができる。

ＤＴＴ細胞エピトープ５は、ＦＩＫＲＦＧＤＧＡ（配列番号：１７３）として示すアミノ酸配列を有する９量体ペプチドからなる。このＴ細胞エピトープの排除は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個のアミノ酸を修飾することによって及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９又はそれ以上のアミノ酸残基を修飾することによって達成することができる。一つの限定されない例において、配列番号：１９３のエピトープコア内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素であって、アミノ酸修飾が挿入、欠失又は置換によるものであるジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ５のコアエピトープは、配列番号：１９３として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１３−２１、１２−２２、１１−２３、１０−２４又はその中の任意の組み合わせを含有することができる。また、配列番号：１９３に示すアミノ酸配列を有するＤＴＴ細胞エピトープ５のＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ５のＮ末端は、配列番号：１９３として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１−９、２−１０、３−１１、４−１２又はその中の任意の組み合わせを含有する。ＤＴＴ細胞エピトープ５のＣ末端は、配列番号：１９３として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２２−３０、２３−３１、２４−３２、２５−３３又はその中の任意の組み合わせを含有する。また、配列番号：１９３のエピトープコアに及びＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾ジフテリア毒素が、本明細書において提供される。一つの限定されない例において、コア９量体のＰ４アルギニン残基、Ｐ６グリシン残基、Ｐ７アスパラギン酸残基、及び／又はＰ９アラニン残基、あるいはその中の組み合わせは、同定されたＴ細胞エピトープを修飾及び／又は排除するために置換することができる。

ＤＴＴ細胞エピトープ６は、ＶＥＹＩＮＮＷＥＱ（配列番号：１７５）として示すアミノ酸配列を有する９量体ペプチドからなる。このＴ細胞エピトープの排除は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個のアミノ酸を修飾することによって及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９又はそれ以上のアミノ酸残基を修飾することによって達成することができる。一つの限定されない例において、配列番号：１９６のエピトープコア内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素であって、アミノ酸修飾が挿入、欠失又は置換によるものであるジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ６のコアエピトープは、配列番号：１９６として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１３−２１、１２−２２、１１−２３、１０−２４又はその中の任意の組み合わせを含有することができる。また、配列番号：１９６に示すアミノ酸配列を有するＤＴＴ細胞エピトープ６のＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ６のＮ末端は、配列番号：１９６として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１−９、２−１０、３−１１、４−１２又はその中の任意の組み合わせを含有する。ＤＴＴ細胞エピトープ５のＣ末端は、配列番号：１９６として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２２−３０、２３−３１、２４−３２、２５−３３又はその中の任意の組み合わせを含有する。また、配列番号：１９６のエピトープコアに及びＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾ジフテリア毒素が、本明細書において提供される。一つの限定されない例において、コア９量体のＰ１バリンは、同定されたＴ細胞エピトープを修飾及び／又は排除するために、親水性部分が露出した表面であり及び疎水性領域がタンパク質内に埋め込まれるように極性アミノ酸残基で置換することができる。

ＤＴＴ細胞エピトープ７は、ＬＥＫＴＴＡＡＬＳ（配列番号：１７８）として示すアミノ酸配列を有する９量体ペプチドからなる。このＴ細胞エピトープの排除は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個のアミノ酸を修飾することによって及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９又はそれ以上のアミノ酸残基を修飾することによって達成することができる。一つの限定されない例において、配列番号：１９９のエピトープコア内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素であって、アミノ酸修飾が挿入、欠失又は置換によるものであるジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ７のコアエピトープは、配列番号：１９９として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１３−２１、１２−２２、１１−２３、１０−２４又はその中の任意の組み合わせを含有することができる。また、配列番号：１９９に示すアミノ酸配列を有するＤＴＴ細胞エピトープ７のＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素が、本明細書において提供される。ＤＴＴ細胞エピトープ７のＮ末端は、配列番号：１９９として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１−９、２−１０、３−１１、４−１２又はその中の任意の組み合わせを含有する。ＤＴＴ細胞エピトープ７のＣ末端は、配列番号：１９９として示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２２−３０、２３−３１、２４−３２、２５−３３又はその中の任意の組み合わせを含有する。また、配列番号：１９９のエピトープコアに及びＮ末端及び／又はＣ末端内に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾ジフテリア毒素が、本明細書において提供される。一つの限定されない例において、コア９量体のＰ１ロイシンは、同定されたＴ細胞エピトープを修飾及び／又は排除するために任意のアミノ酸で置換することができる。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素は、Ｖ７Ｓ、Ｖ７Ｔ、Ｄ８Ｅ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｔ、Ｖ２９Ｓ、Ｖ２９Ｔ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｄ３０Ｅ、Ｓ３１Ｎ、Ｉ２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２Ｔ、Ｖ９７Ａ、Ｖ９７Ｔ、Ｖ９７Ｄ、Ｌ１０７Ｎ、Ｍ１１６Ａ、Ｍ１１６Ｑ、Ｍ１１６Ｎ、Ｆ１２４Ｈ、Ｖ１４８Ａ、Ｖ１４８Ｔ、Ｌ２９８Ａ及びＬ２９８Ｎの中から選択される１個又はそれ以上の修飾を含有する。

一つの実施形態において、ＤＴバリアントは、４個の修飾、例えばＶ７ＤＶ９７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＮＶ９７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＴＶ９７ＡＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＴＶ９７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＴＶ９７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＤＶ９７ＡＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＤＶ９７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＮＶ９７ＡＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ及びＶ７ＮＶ９７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈなどを含有する。

前述の例及び実施形態の他に、１個又はそれ以上のＴ細胞エピトープに１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾ジフテリア毒素が、本明細書において意図される。一つの限定されない例において、少なくとも１個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個の修飾を有するジフテリア毒素が、本明細書において提供される。別の限定されない例において、前記の１個、２個、３個、４個、５個、６個又は７個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個の修飾を有するジフテリア毒素が、本明細書において提供される。さらなる限定されない例としては、２個以上のＴ細胞エピトープに２個以上のアミノ酸修飾を有するジフテリア毒素が挙げられる。任意の数の前記のＤＴＴ細胞エピトープ内のアミノ酸修飾の任意の組み合わせが、本明細書において意図される。

ＤＴＴ細胞エピトープ及びアロタイプ頻度
抗原内に認められる個々のエピトープは、特異的ＭＨＣクラスＩＩアロタイプによって優先的に提示されることができ、同様に同じ抗原内の他の特異的エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されないかもしれない。特定のエピトープと特異的ＭＣＨクラスＩＩ分子とのこのような会合は、個々のＭＨＣクラスＩＩアロタイプに依存することが明らかにされている。特異的エピトープと特異的アロタイプとの会合もまた、Ｔ細胞エピトープの除去のためにＤＴを修飾する場合に認めることができる。このような考察は、特異的アロタイプについて（例えば、ある種のＭＨＣクラスＩＩアロタイプを有する被検体の特異的集団について）ＤＴ分子の極めて特異的な修飾を可能にすることができる。１人又は複数の被検体のＭＨＣクラスＩＩアロタイプは、当該技術において知られているゲノタイピング法で容易に決定でき、従ってＤＴＴ細胞エピトープと所定のアロタイプの会合は、そのアロタイプに適合した毒素修飾において考察するために、容易に同定される。ＤＴＴ細胞エピトープとＭＨＣクラスＩＩアロタイプとの間の会合の同定は、実施例９、表５及び図１２に示す。本明細書において、毒素の所定のエピトープについて同定されたＭＨＣクラスＩＩ会合に適合したＴ細胞エピトープ修飾を有する修飾毒素が意図される。

本明細書の教示に基づいて、これらの方法を本明細書に記載のその他の毒素に応用できる。例えば、ＭＨＣ会合及びＴ細胞エピトープに関して解析されている毒素のアミノ酸配列が、容易に使用できる。さらに、ＭＨＣ会合に関して解析されていない毒素も解析でき、明細書全体を通じて及び以下の実施例に記載されている方法を使用して試験できる。

Ｂ細胞エピトープの選別
本明細書に記載のようなＴ細胞エピトープの同定及び修飾の他に、Ｂ細胞エピトープの同定及び修飾は、毒素の免疫原性をさらに低下させることができる。血清学的方法、コンピューター法、又は両方の方法の組み合わせを、毒素又は修飾毒素内のＢ細胞エピトープを同定するのに使用できる。血清学的方法は、被検体の免疫原分子、例えばタンパク質、ペプチド及びポリペプチドに対して抗体を生じる能力を用いる。毒素又は修飾毒素が、例えばワクチン接種用のように集団に予め投与されているものである場合には、被検体において生じた抗体反応は、Ｂ細胞エピトープについて毒素又は修飾毒素を選別するのに使用できる。一つの限定されない例において、本明細書に開示されているような修飾されたそのＴ細胞エピトープを既に有している毒素（例えば、ジフテリア毒素）は、Ｂ細胞エピトープを同定するのにさらに選別することができる。修飾毒素の配列に基づいたペプチドライブラリーが合成でき、毒素に対する抗体を含有する毒素ワクチン接種ドナー由来の血清が、ペプチドライブラリーのペプチドに結合する能力について試験することができる。種々の方法及びアッセイ、例えば、以下に限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びウェスタンブロッティング法は、当該技術において周知であり、毒素ワクチン接種ドナーの血清由来の抗体に結合する１個又はそれ以上のペプチドを同定するのに使用できる。ドナー血清中で抗体を結合するこれら１個又はそれ以上のペプチドは、毒素配列内でＢ細胞エピトープを提示する。修飾毒素Ｂ細胞エピトープの同定の後に、Ｂ細胞エピトープに対応するアミノ酸残基は、修飾することができ、修飾毒素はドナー血清に対して再選別される。このプロセスは、修飾毒素の免疫原性をさらに低下させるために多数回行うことができる。本明細書においてＴ細胞エピトープの同定について認められるように、公知のＢ細胞エピトープデータベース及び予測タンパク質モデル化プログラムを利用するコンピューター法を、毒素又は修飾毒素内のＢ細胞エピトープを同定するのに用いることができる。このようなエピトープがコンピューター法で同定され、修飾されると、修飾毒素は、本明細書に記載のようなワクチン接種ドナー血清に対して選別することができる。コンピューターＢ細胞エピトープ選別法は、単独で使用できるし、又は毒素内のＢ細胞エピトープの同定及び修飾のためのペプチドライブラリーＢ細胞エピトープ選別と組み合わせて使用できる。場合により、修飾毒素は、Ｂ細胞エピトープ選別に先立って及び又はそれに続いて選別することができる。また、本明細書において、Ｂ細胞エピトープの修飾中に生じているかもしれない任意のＴ細胞エピトープの存在についてのＢ細胞エピトープ修飾毒素の選別も意図される。

本明細書に記載の発明の出願は、少なくとも１個のＢ細胞エピトープを失っている修飾毒素を選択する方法であって、毒素を用いて免疫されている少なくとも１人の被検体から血清試料を取得し、前記血清は、前記毒素に対する抗体を含有し、前記血清を１個又はそれ以上の修飾毒素と接触させ（前記抗体の前記修飾毒素に対する結合は、複合体を形成する）、前記複合体の有無を検出し（複合体が検出される場合には、修飾毒素は少なくとも１個のＢ細胞エピトープを失っておらず及び複合体の量の低下が検出される場合には、修飾毒素は少なくとも１個のＢ細胞エピトープを失っている）及び少なくとも１個のＢ細胞エピトープ失っている修飾毒素を選択することからなる修飾毒素（前記修飾毒素は、少なくとも１個のＢ細胞エピトープを失っている）を選択する方法を包含する。一つの限定されない実施形態において、複合体の量の低下は、未修飾毒素を用いて観察される量よりも、例えば約１．５倍少ない、約２倍少ない、約５倍少ない、約１０倍少ない、約２０倍少ない、約５０倍少ない、約１００倍少ない、約２００倍少ない、又は約５００倍少ないものであり得る。

ＩＶ．血管漏出症候群
細胞損傷、特に内皮細胞損傷は、ヘビに咬まれたことなどによる毒素又は敗血症性ショックを生じる分子、あるいは治療薬、例えば免疫毒素又はインターロイキンによって生じるか否かに関わらず、患者にとって未だに問題である。

ＶＬＳは、多くの場合に細菌性敗血症中に観察され、ＩＬ−２及び種々の他のサイトカインを伴い得る（ＢａｌｕｎａａｎｄＶｉｔｅｔｔａ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３７：１１７−１３２，１９９６）。ＶＬＳの基礎となるメカニズムは、不明であり、内皮細胞（ＥＣ）内で開始される事象のカスケードを伴うと考えられ、また炎症カスケード及びサイトカインを伴うと考えられる（Ｅｎｇｅｒｔｅｔａｌ．，Ｉｎ：ＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ，Ｆｒａｎｋｅｌ（ｅｄ），２：１３−３３，１９９７）。ＶＬＳは、血管内皮細胞（ＥＣ）に対する損傷並びに間質性浮腫、体重増加及びその最も重症型の腎臓障害、失語症及び肺水腫をもたらす液体及びタンパク質の溢出を伴う複雑な病因を有する（ＳａｕｓｖｉｌｌｅａｎｄＶｉｔｅｔｔａ，Ｉｎ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ−ＢａｓｅｄＴｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ，Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ（ｅｄ．），４：８１−８９，１９９７；ＢａｌｕｎａａｎｄＶｉｔｅｔｔａ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３７：１１７−１３２，１９９６；Ｅｎｇｅｒｔｅｔａｌ．，Ｉｎ：ＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ，Ｆｒａｎｋｅｌ（ｅｄ），２：１３−３３，１９９７）。血管漏出症候群（ＶＬＳ）は、ヒトにおいてこのようにこれまでに試験された全ての免疫毒素、並びにサイトカイン、例えばインターロイキン２（ＩＬ−２）、ＴＮＦ及びアデノウイルスベクターに関連する重大な問題であった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１６：８８９−８９７，１９８７；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３７：１７３５−１７４２，１９８６）。

残基Ｌ７４、Ｄ７５、Ｖ７６で修飾配列を含有するリシン毒素Ａ鎖由来の抗体複合ペプチドは、低下を示した（Ｖｉｔｅｔｔａらの米国特許第６，５６６，５００号公報）。従って、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列（１個又は複数）の１個又はそれ以上のアミノ酸欠失又は突然変異、及び／又は例えばジフテリア毒素などの毒素の１個又はそれ以上のフランキング残基が、これらの配列を含有する毒素分子のＥＣ損傷を誘発する能力を低下又は抑制し得ることが意図される。このような化学物質のＥＣ損傷活性を低下させるか又は排除する少なくとも１個の突然変異モチーフ及び／又は１個又はそれ以上のフランキング残基を含有する１個又はそれ以上のポリペプチドをできることが期待される。

本明細書において、ポリペプチド内の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列の突然変異に基づいて低下したＶＬＳ促進能を有する組成物であって、このような配列それぞれを除去するか又は変化させる組成物、及びそれを使用する方法が、以下に記載される。従って、低下したＶＬＳ促進能を有するポリペプチドを製造する本明細書に記載の全ての方法が、低下したＥＣ損傷活性を有するポリペプチドを製造するのに応用できることが理解されるであろう。全てのこのような方法及びこのような方法で同定又は製造される組成物並びにその均等物が、本発明に包含される。

ある態様において、本出願は、疾患、例えば以下に限定されないが、悪性疾患、例えば皮膚Ｔ細胞リンパ腫、再発性／難治性Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、再発性／難治性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、皮下脂肪組織様Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、慢性リンパ球性白血病及びヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型関連急性Ｔ細胞白血病／リンパ腫など；非悪性疾患、例えば移植片対宿主病及び乾癬など並びにこのような疾患の進行中の内皮細胞に対する損傷（すなわち、ＶＬＳ）の治療薬を製造するための修飾毒素組成物であって、未修飾毒素組成物の配列と比べて除去された又は変更された（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔを含有する配列の少なくとも１個のアミノ酸を有する修飾毒素組成物の使用を提供する。

副作用としての血管漏出症候群（ＶＬＳ）の減少又は排除は、タンパク質治療薬、特に免疫毒素及び融合毒素サブクラスのタンパク質治療薬の「リスク便益比」を向上させることから、著しい進歩に相当する（Ｂａｌｕｎａｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１８（６−７）：３５５−３６１（１９９６）；Ｂａｌｕｎａｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３７（Ｎｏ．２−３）：１１７−１３２（１９９７），Ｂａｓｃｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３９（３）：２５５（１９９８））。細胞毒素及び独特な標的ドメイン（免疫毒素の場合には細胞結合ドメイン）からなる融合タンパク質、すなわち一本鎖分子を開発できることは、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ及び乾癬、移植片拒絶反応及びその他の非悪性医療適用のための治療薬の開発を促進できるであろう（Ｃｈａｕｄｈａｒｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（２３）：９４９１−９４９４（１９９０）；Ｆｒａｎｋｅｌｅｔａｌ．，ｉｎＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＣｈａｒｌｅｓｔｏｎＳ．Ｃ．，（１９９７），Ｋｎｅｃｈｔｌｅｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１５（６３）：１−６（１９９７）；Ｋｎｅｃｈｔｌｅｅｔａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ，１２４（２）：４３８−４４６（１９９８）；ＬｅＭａｉｓｔｒｅ，Ｃｌｉｎ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，１：Ｓ３７−４０（２０００）；Ｍａｒｔｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，４５（６）：８７１−８８１，２００１））。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２（ＯＮＴＡＫ（登録商標））は、現在、唯一の食品医薬品局承認タンパク質融合毒素であり、ＤＴ担毒体及びＬ−２受容体を有する細胞を標的とするサイトカインＩＬ−２を用いており、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の治療について承認されている（Ｆｉｇｇｉｔｔｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１（１）：６７−７２（２０００）；Ｆｏｓｓ，Ｃｌｉｎ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，１（４）：２９８−３０２（２００１）；Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，ＩｎＢａｃｔｅｒｉａｌＴｏｘｉｎｓ：ＭｅｔｈｏｄａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＨｏｌｓｔＯ，ｅｄ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．８９−１００（２０００））。ＯＮＴＡＫ(登録商標）は、デニロイキン・ジフチトックス、ＤＡＢ３８９−ＩＬ−２、又はＯｎｚａｒと種々に呼ばれる。その構造は、順番に、メチオニン残基、天然ＤＴの残基１−３８６、天然ＤＴの残基４８４−４８５及びＩＬ−２の残基２−１３３（配列番号：１４８）からなる。従って、全長のＯＮＴＡＫ（登録商標）は、５２１個のアミノ酸を含有する。ＯＮＴＡＫ（登録商標）のＮ末端で付加されたメチオニン残基の結果として、ジフテリアの配列の番号付与は、一つによればＯＮＴＡＫ（登録商標）の番号を有するレジスターの範囲外であることが認められるべきである。

多数のその他の担毒体、特にリシン毒素及びシュードモナス菌外毒素Ａが、両方の免疫毒素、融合毒素及び化学複合体を開発するのに用いられている。しかし、これらの分子は、臨床試験を成功裏に完了しておらず、全てが著しい副作用としてＶＬＳを示す（Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２８：１９３−２１９（１９９４）；Ｐｕｒｉｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，６１：５６６０−５６６２（１９９６）；Ｐａｓｔａｎ，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ．，２４：１３３３（２）：Ｃ１−６（１９９７）；Ｆｒａｎｋｅｌｅｔａｌ．，Ｓｕｐｒａ（１９９７）；Ｋｒｅｉｔｍａｎｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ，２（９）：１２８２−１２９３（２００１））。従って、ジフテリア毒素について本明細書に記載の修飾は、例えばリシン及びシュードモナス菌外毒素Ａなどのその他の毒素に外挿することができる。

ある実施形態において、１個又はそれ以上の（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔモチーフ又はそのフランキング配列に基づいて修飾された毒素又は化合物が、生体内でＶＬＳを抑制するのに使用できる。従って、（ｘ）Ｄ（ｙ）配列又はフランキング配列に影響を及ぼすこのような突然変異がポリペプチドのＶＬＳを誘発する能力又はこれらの配列に付随する能力を変えることができることが意図される。一つの限定されない例において、ジフテリア毒素は、生体内でＶＬＳを抑制するために修飾される。

ＶＬＳを誘発する低下した能力を有する毒素又は化合物を製造するために、１個又はそれ以上の（最大全部及び例えば全部の）残りの（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列が、ポリペプチドの表面に対して減少した露出を有することが意図される。例えば、ポリペプチドの非露出部分に少なくとも部分的に配置されているか、又は分子の表面に対する完全な又は部分的な露出から遮蔽されている（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列が、ＶＬＳを促進又は誘発する細胞、受容体又はその他の分子とあまり相互作用しないことが意図される。従って、ポリペプチドの一次構造から（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列の完全排除は、低下したＶＬＳを誘発又は促進する能力を有する毒素又は分子を生成させるのに必ずしも必要でないかもしれない。しかし、全ての（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列の除去が、ＶＬＳを誘発又は促進する最も低い能力を有する組成物を製造するために意図される。

突然変異が、あまり露出されていない（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔモチーフを有するポリペプチドを生成しやすいか否かを調べるために、移動された又は付加された（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列の推定される配置は、突然変異した配列を、当業者に公知のこのような方法、例えば以下に限定されないが、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ又はコンピューターモデル化によって決定されるような、突然変異していないポリペプチドの二次及び三次構造の配列と比較することによって決定できる。種々のポリペプチド構造のコンピューターモデルが、文献及びコンピューターデータベースにおいて利用できる。一つの限定されない例において、Ｅｎｔｒｅｚデータベースウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）が、突然変異誘発のための標的配列及び領域を同定するのに使用できる。Ｅｎｔｒｅｚデータベースは、知られている場合には、同定されたアミノ酸配列についての３Ｄ構造のデータベースに相互接続される。このような分子モデルが、外部分子と接触するためにポリペプチドの内部に埋め込まれた同様の配列よりも多く露出しているポリペプチド内の（ｘ）Ｄ（ｙ）、（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ及び／又はフランキング配列を同定するのに使用できる。外部分子と接触するためにより多く露出している（ｘ）Ｄ（ｙ）、（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ及び／又はフランキング配列は、ＶＬＳ及びこれらの配列に付随するその他の毒性効果を促進又は抑制するのにより寄与していると思われ、従って、突然変異誘発のための一次標的であるべきである。突然変異型又は野生型のポリペプチドの構造は、当業者には公知であるように、生体外又は生体内アッセイで使用する前に直接にＸ線結晶学又はＮＭＲで決定できるであろう。

（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含有するアミノ酸配列がポリペプチドにおいて変化させられると、少なくとも１個の毒性効果を誘導又は促進するその能力の変化は、本明細書に記載の又は当業者に公知の技法のいずれかを使用してアッセイできる。

本明細書で使用するように、（ｘ）Ｄ（ｙ）配列又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含有するアミノ酸配列の「変化させる」、「変化させた」、「変化する」及び「変化」とは、当業者には公知のポリペプチド内の（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含有するアミノ酸配列の化学修飾、並びにこのようなアミノ酸配列の任意の突然変異、例えば以下に限定されないが、挿入、欠失、切断又は置換を包含する。このような変化は、（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含有する１個又はそれ以上のアミノ酸配列の少なくとも１個の毒性効果（すなわち、ＶＬＳ、ＥＣ損傷などを促進する能力）を変化させるか又は修飾する（抑制する）ことができる。本明細書で使用するように、（ｘ）Ｄ（ｙ）配列又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含有するアミノ酸配列は、（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔトリ又はテトラペプチド配列に対してＣ末端及び／又はＮ末端の少なくとも１個のフランキング配列を含有することができる。このような「変化」は、合成ポリペプチドにおいて又は突然変異ポリペプチドを生成するために発現される核酸配列においてなされることができる。

一つの態様において、（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含有するアミノ酸配列の変化は、アミノ酸配列の除去によるものである。本明細書で使用するように、（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含有するアミノ酸配列について「除去する」、「除去された」、「除去する」又は「除去」とは、（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔトリ又はテトラペプチド配列、及び／又は少なくとも１個の未変性フランキング配列の存在を排除する一次アミノ酸配列の突然変異を指す。「除去される」又は「欠く」という用語は、同じ意味で使用される。

本出願の一つの態様は、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対して減少した結合を有するジフテリア毒素（ＤＴ）の遺伝子修飾ポリペプチドに関する。これらの修飾ポリペプチドは、以下、修飾ＤＴ、修飾ＤＴポリペプチド又はＤＴバリアントと呼ぶ。本出願は、ＤＴポリペプチドの（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフ内に、すなわち未変性ＤＴ配列（配列番号：１）の残基６−８（ＶＤＳ）、残基２８−３０（ＶＤＳ）及び残基２８９−２９１（ＩＤＳ）に、あるいは配列番号：２又は２００の残基７−９（ＶＤＳ）、残基２９−３１（ＶＤＳ）及び残基２９０−２９２（ＩＤＳ）で１個又はそれ以上の変化を有する修飾ＤＴに関する。（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフは、「ＶＬＳモチーフ」と呼ばれることから、１個又はそれ以上の修飾（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフを有する修飾ＤＴポリペプチドは、「ＶＬＳ修飾ＤＴポリペプチド」と呼ぶことができる。

本出願の一つの態様は、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対して減少した結合を有する毒素（例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ））の遺伝子修飾ポリペプチドに関する。これらの修飾毒素は、以下、修飾毒素と呼ぶ。本出願は、毒素ポリペプチドの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内の１個又はそれ以上の変化を有する修飾毒素を提供する。例えば、ＤＴ内に認められる（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフは、未変性ＤＴ配列（配列番号：１）の残基６−８（ＶＤＳ）、残基２８−３０（ＶＤＳ）及び残基２８９−２９１（ＩＤＳ）で生じるか、あるいは配列番号：２又は２００の残基７−９（ＶＤＳ）、残基２９−３１（ＶＤＳ）及び残基２９０−２９２（ＩＤＳ）で生じる。（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフは、「ＶＬＳモチーフ」と呼ばれることから、１個又はそれ以上の修飾（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフを有する修飾毒素ポリペプチドは、時には、「ＶＬＳ修飾毒素ポリペプチド」と呼ばれる。

ＶＬＳを誘発する、アポトーシスを誘発する及びその他の効果を誘発するような（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔモチーフの同定に関して、ＶＬＳ阻害剤の新しいファミリーの分子の創作は、これらの分子が最大の有益効果を発揮することを可能にする。例えば、本明細書に開示される組成物及び方法を使用する毒素治療薬の低下した毒性は、より大きい患者集団を治療することを可能にするか又はより進行した疾患（例えば、癌）を治療することを可能にする。ある実施形態において、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔモチーフ又はそのフランキング配列に基づいた修飾タンパク質又は融合タンパク質は、ＶＬＳ又は生体内のその他の活性を抑制するのに使用し得る。

（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を欠いているペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を生成させるために、保存アスパラギン酸（Ｄ）又は保存グルタミン酸（Ｅ）を欠失又は変異させるか、アスパラギン酸又はグルタミン酸を別のアミノ酸に置換するか、あるいは１個又はそれ以上のアミノ酸をその位置で又はその位置に隣接した位置で挿入することができる。本明細書において意図する修飾は、欠失又は突然変異事象の結果として、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基による配列内の（Ｄ）又は（Ｅ）残基の置換を含む。

あるいは、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を欠いているペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を生成させるために、保存アスパラギン酸（Ｄ）を欠失又は変異させるか、アスパラギン酸を別のアミノ酸に置換するか、あるいは１個又はそれ以上のアミノ酸をその位置で又はその位置に隣接した位置で挿入することができる。本明細書において意図する修飾は、欠失又は突然変異事象の結果として、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基による配列内の（Ｄ）残基の置換を含む。

一つの実施形態において、（ｘ）残基は、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔを除去するために１個又はそれ以上のアミノ酸の挿入によって欠失、置換又は移動させることができる。本明細書において意図する修飾は、欠失又は突然変異事象の結果として、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基による配列内の（ｘ）残基の置換を含む。

あるいは、（ｘ）残基は、（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔを除去するために、１個又はそれ以上のアミノ酸の挿入によって欠失、置換又は移動させることができる。本明細書において意図する修飾は、欠失又は突然変異事象の結果として、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基による配列内の（ｘ）残基の置換を含む。例えば、記載のようなＶ又はIアミノ酸残基は、このようなアミノ酸残基のいずれかで置換される。

一つの実施形態において、（ｙ）残基は、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔを除去するために、１個又はそれ以上のアミノ酸の挿入によって欠失、置換又は移動させることができる。欠失又は突然変異事象の結果として配列内の（ｙ）残基を置換し得るアミノ酸は、例えば、イソロイシン（Ｉ）；フェニルアラニン（Ｆ）；システイン／シスチン（Ｃ）；メチオニン（Ｍ）；アラニン（Ａ）；グリシン（Ｇ）；トレオニン（Ｔ）；トリプトファン（Ｗ）；チロシン（Ｙ）；プロリン（Ｐ）；ヒスチジン（Ｈ）；グルタミン酸（Ｅ）；グルタミン（Ｑ）；アスパラギン酸（Ｄ）；アスパラギン（Ｎ）；リシン（Ｋ）；及びアルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）並びに、例えば以下に限定されないが、表１に示すアミノ酸である。

あるいは、（ｙ）残基は、（ｘ）Ｄ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を除去するために、１個又はそれ以上のアミノ酸の挿入によって欠失、置換又は移動させることができる。欠失又は突然変異事象の結果として配列内の（ｙ）残基を置換し得るアミノ酸は、例えば、イソロイシン（Ｉ）；フェニルアラニン（Ｆ）；システイン／シスチン（Ｃ）；メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）；グリシン（Ｇ）；トレオニン（Ｔ）；トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）；ヒスチジン（Ｈ）；グルタミン酸（Ｅ）；グルタミン（Ｑ）；アスパラギン酸（Ｄ）；アスパラギン（Ｎ）、リシン（Ｋ）；及びアルギニン（Ｒ）並びに、例えば以下に限定されないが、表１に示すアミノ酸である。

物理的領域、３次元空間、又はＨＵＶＥＣ結合部位及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフの近傍に配置されるその他の残基は、ＶＬＳを抑止する、抑制する、又は除去するために変異又は変化させ得る。フランキング領域内の突然変異について標的とされるアミノ酸としては、天然毒素タンパク質の表面又はその近くのアミノ酸が挙げられる。変化は、タンパク質の表面の特定の領域において帯電を無効にするか又は逆転させ得る（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフの領域内の帯電残基を除去又は置換し得る。変化はまた、物理的領域、空間又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列の近傍又はタンパク質の活性部位のアミノ酸の大きさ及び／又は親水性も変化させ得る。例えば、ＬＤＶは、α４β１インテグリン受容体に対するその結合に関与するフィブロネクチンのＣＳ１ドメインの最小活性部位を構成する（ＭａｋａｒｅｍａｎｄＨｕｍｐｈｒｉｅｓ，１９９１；ＷａｙｎｅｒａｎｄＫｏｖａｃｈ，１９９２；Ｎｏｗｌｉｎｅｔａｌ．，１９９３）。しかし、フィブロネクチン（ＦＮ）は、ＨＵＶＥＣを損傷しない。代わりに、ＦＮは、ＨＵＶＥＣをＲＴＡ介在損傷から保護する（Ｂａｌｕｎａｅｔａｌ．，１９９６）。ＲＴＡと異なり、ＦＮは、トレオニンの代わりにＣ末端ＬＤＶ−フランキングプロリンを有する。ディスインテグリンにおいて、ＲＧＤに隣接する残基は、リガンド結合において役割を果たす（Ｌｕｅｔａｌ．，１９９６）。ＬＤＶ又はホモローグ含有分子の血管統合性を促進する（例えば、ＦＮ）か又はそれを崩壊する（例えば、ＤＴ）能力の間の相違は、ＬＤＶモチーフの配向、又は相互作用（すなわち、結合）のための利用性に依存し得、従ってフランキング配列に依存し得る。従って、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列の１個又はそれ以上のフランキング残基の変化は、分子のＶＬＳを促進する能力を高めるか又は低下させ得る。また、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列を、受容体などの他のタンパク質と相互作用するように、タンパク質の外面に露出する変化は、ＶＬＳ促進活性を高め、これに対してあまり露出されない立体配置はＶＬＳ促進活性を低下させ得る。

（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列のＮ末端又はＣ末端フランキング配列内の少なくとも１個の突然変異、化学修飾、移動又はその他の変化はまた、低下したＶＬＳを促進する能力を有するタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを生成し得る。好ましくは、このような突然変異又は変化は、活性部位に影響を及ぼさない１個又はそれ以上の残基において生じるであろう。他の実施形態において、突然変異又は変化は、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個又はそれ以上のＮ末端及び／又はＣ末端から（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）トリペプチド配列までの１個又はそれ以上の残基において生じるであろう。他の態様において、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）トリペプチドに隣接していない１個又はそれ以上の残基は、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフの機能に寄与し得る。このような残基は、本明細書に記載のような及び当業者に知られているような３次元モデルにおけるトリペプチド配列に対するその近接によって同定し得及びフランキング配列の一部として変化について考慮される。このような変化は、１個又はそれ以上の「野生型」フランキング残基が、変化させられ、除去され、移動され、化学修飾される限りは、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を変化させるために、上記の変化のいずれかを包含し得る。

このようなアミノ酸修飾は、融合タンパク質の状況内の標的細胞にＤＴの触媒ドメインを効率的に送達し及び無傷のＶＬＳモチーフを再構成しない能力についてアッセイできる。本明細書において、低下したＶＬＳ誘発能力を有する修飾ジフテリア毒素が提供される。任意の残りの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列は、可能ならば、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの表面に対する減少した露出を有するべきである。

一つの限定されない例において、ジフテリア毒素の非露出部分に少なくとも部分的に配置されるかあるいは分子の表面に対する完全又は部分露出から保護される（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列は、ＶＬＳを促進又は誘発する細胞、受容体又はその他の分子とあまり相互作用しないであろうことが意図される。従って、ジフテリア毒素の一次構造から（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列の完全排除は、低下したＶＬＳ誘発又は促進能力を有する毒素又は分子を必ずしも生成しないことが意図される。しかし、一つの実施形態において、全ての（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列は、最も低いＶＬＳ誘発能力を有する組成物を生成するために除去される。

突然変異が、あまり露出されていない（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔモチーフを有する修飾毒素を生成しやすいか否かを調べるために、移動されるか又は付加された（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列の推定される配置は、当業者に公知のこのような方法、例えば以下に限定されないが、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ又はコンピューターモデル化によって決定されるように、突然変異配列を突然変異していない(ポリペプチド)毒素の二次及び三次構造の配列と比較することによって決定できる。種々のポリペプチド及びペプチド構造のコンピューターモデルが、文献及びコンピューターデータベースにおいて利用できる。一つの限定されない例において、Ｅｎｔｒｅｚデータベースウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）が、突然変異誘発のための標的配列及び領域を同定するのに使用できる。Ｅｎｔｒｅｚデータベースは、知られている場合には、同定されたアミノ酸配列についての３Ｄ構造のデータベースに相互接続される。このような分子モデルは、外部分子と接触するためにポリペプチド又はポリペプチドの内部に埋め込まれた同様の配列よりも多く露出しているジフテリア毒素内の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ及び／又はフランキング配列を同定するのに使用できる。外部分子（例えば、受容体）と接触するためにより多く露出している（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ及び／又はフランキング配列は、ＶＬＳ及びこれらの配列に付随するその他の毒性効果を促進又は抑制するのにより寄与していると思われ、従って、突然変異誘発のための一次標的であるべきである。ある実施形態において、少なくとも１個の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ及び／又はフランキング配列を付加することが望ましい場合には、外部分子と接触するためにより多く露出しているタンパク質の領域が、このような配列を付加するために部位として好ましい。突然変異型又は野生型(ポリペプチド)毒素の構造は、当業者には公知であるように、生体外又は生体内アッセイで使用する前に直接、Ｘ線結晶学又はＮＭＲで決定できるであろう。

（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）及び／又は（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を含有するアミノ酸配列が(ポリペプチド)毒素において変更されると、少なくとも１個の毒性効果を促進するその能力の変化は、本明細書に記載の技法又は当業者に公知の技法のいずれかを使用してアッセイできる。アミノ酸配列を変化させる方法は、以下により詳しく記載され、また当該技術において知られている。

修飾（変化）は、これらの領域内の未修飾配列又は予め修飾された配列の改変を可能にするが、毒素又は担毒体の細胞毒性を損なわないこれらアミノ酸の置換、挿入又は欠失である。これらの修飾は、内皮細胞との相互作用を媒介するのに関与するためＶＤＳ／ＩＤＳ配列を再生する修飾を含まないであろう。従って、このような非未変性組換え配列は、毒素の独特なドメインの固有の機能を維持し、同時に血管内皮細胞と相互作用するその能力を著しく低下させる新規な一連の突然変異体を含有する。

一つの実施形態において、本発明のＤＴバリアントは、ＶＬＳに関連するモチーフを排除し、それによってこの症候群に一般に付随する臨床副作用を抑制するために、ＤＴ分子の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフの一つの内に、すなわち配列番号：１の残基６−８（ＶＤＳ）、残基２８−３０（ＶＤＳ）及び残基２８９−２９１（ＩＤＳ）内に、少なくとも１個の修飾を含む。しかし、本出願の修飾ＤＴは、タンパク質融合毒素中に組み込まれた場合には、標的真核細胞の細胞質ゾルへのその触媒ドメインの送達を促進するその能力においてＤＴ３８７と同程度に効果があり及び有効である。ＤＴ３８７（配列番号：２）は、触媒ドメイン及びトランスロケーションドメイン及びＮ末端メチオニンの付加を含む未変性ＤＴタンパク質のアミノ酸残基１−３８６を含有する切断ＤＴタンパク質である。ＤＴ_３８９（配列番号：２００）は、順番にメチオニン残基、未変性ＤＴの残基１−３８６及び未変性ＤＴの残基４８４−４８５を含有する切断ＤＴタンパク質である。一つの実施形態において、本発明のＤＴバリアントは、ＶＬＳに関連するモチーフを排除し、それによってこの症候群に一般に付随する臨床副作用を抑制するために、ＤＴ分子の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフの一つの内に、すなわち配列番号：２又は２００の残基７−９（ＶＤＳ）、残基２９−３１（ＶＤＳ）及び残基２９０−２９２（ＩＤＳ）内に、少なくとも１個の修飾を含む。

未修飾ジフテリア毒素は、例えば、配列番号：２又は２００のアミノ酸配列あるいは配列番号：４−１４７のいずれかのアミノ酸配列を有することができる。一つの実施形態において、未修飾ジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する修飾ジフテリア毒素とは、未修飾ジフテリア毒素と比べて実質的に同様の細胞毒性を有するか、あるいは少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％又はそれ以上の細胞毒性を有する修飾ジフテリア毒素を指す。大腸菌中で産生された精製ＤＡＢ_３８９ＩＬ−２は、一般に、５×１０^−１１Ｍ〜１×１０^−１２Ｍの間のＩＣ_５０を生じる。従って、別の実施形態において、未修飾ジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する修飾ジフテリア毒素とは、約５×１０^−１１Ｍ〜約１×１０^−１２Ｍ、約１×１０^−１０Ｍ〜約１×１０^−１０Ｍ、約１×１０^−９Ｍ〜約１×１０^−１０Ｍ、又は約１×１０^−８Ｍ〜約１×１０^−９Ｍの間のＩＣ_５０を有する修飾ジフテリア毒素を指す。未修飾ジフテリア毒素と比べた修飾ジフテリア毒素の細胞毒性は、細胞毒性アッセイ、例えば以下の実施例に記載の細胞毒性アッセイで試験できる。

（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフにおける修飾の他に、修飾ＤＴは、切断された分子が細胞結合ドメインと融合される場合に細胞中に標的細胞をトランスロケーションさせ、殺す能力を保持する限りは、配列番号：２又は２００の１〜３０個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、又は１〜３個のアミノ酸の欠失又は置換をさらに含有することができる。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素であって、前記修飾ジフテリア毒素が配列番号２又は２００に示すようなアミノ酸配列であってその中に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を有し、少なくとも１個のアミノ酸修飾が、例えば、配列番号：２又は２００の残基７−９、２９−３１及び２９０−２９２などの領域の（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフ内で行われ及び修飾ジフテリア毒素が未修飾ジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する修飾ジフテリア毒素が、本明細書において提供される。一つの実施形態において、位置（ｘ）の修飾は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、あるいは表１の修飾又は異常アミノ酸によるＶ又はＩの置換である。一つの実施形態において、位置Ｄの修飾は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒあるいは表１の修飾又は異常アミノ酸によるＤの置換である。一つの実施形態において、位置（ｙ）の修飾は、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖ及び表１の修飾又は異常アミノ酸による置換である。

あるいは、別の実施形態において、その中に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾ジフテリア毒素であって、少なくとも１個のアミノ酸修飾が配列番号：２又は２００の残基７−９、２９−３１及び２９０−２９２からなる群から選択される領域の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内で行われ及び前記修飾ジフテリア毒素が未修飾ジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する、その中に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾ジフテリア毒素が、本明細書において提供される。一つの実施形態において、位置（ｘ）の修飾は、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、あるいは表１の修飾又は異常アミノ酸によるＶ又はＩの置換である。別の実施形態、位置Ｄ／Ｅの修飾は、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ又は表１の修飾又は異常アミノ酸によるＤ／Ｅの置換である。一つの実施形態において、位置（ｙ）の修飾は、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖ及び表１の修飾又は異常アミノ酸による置換である。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素は、Ｖ７Ｔ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｔ、Ｓ９Ｇ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｖ２９Ｔ、Ｄ３０Ｎ、Ｓ３１Ｇ、Ｓ３１Ｎ、１２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２Ｇ及びＳ２９２Ｔの中から選択される１個又はそれ以上の修飾を含む。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素は、２個の修飾を含む。このような修飾ジフテリア毒素は、突然変異の組み合わせ、例えば、Ｖ７ＮＶ２９Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９Ｄ、Ｖ７ＴＶ２９Ｎ、Ｖ７ＴＶ２９Ｔ又はＶ７ＴＶ２９Ｄなどを含むことができる。

一つの実施形態において、修飾ジフテリア毒素は３個の修飾を含む。このような修飾ジフテリア毒素は、突然変異の組み合わせ、例えばＶ７ＮＶ２９ＮＩ２９０Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＩ２９０Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＳ２９２Ａ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＳ２９２Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＩ２９０Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＩ２９０Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＳ２９２Ａ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＳ２９２Ｔ及びＶ７ＴＶ２９ＴＩ２９０Ｔなどを含むことができる。

１個又はそれ以上の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内に約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は最大で約２０個の修飾を含む修飾ジフテリア毒素は、本明細書に記載の方法を使用して、アミノ酸残基を連続的に修飾し、活性を、予め修飾されていない又は予め修飾されたジフテリア毒素に対するそれぞれの修飾の後に比較することによって調製される。あるいは、２個以上の修飾を含む修飾ジフテリア毒素は、本明細書に記載の方法を使用して、２個以上のアミノ酸残基を同時に修飾し、活性を予め修飾されていないジフテリア毒素と比較することによって調製される。修飾毒素は、アッセイ当該技術において知られているアッセイ及び本明細書に記載のアッセイ、例えば以下に限定されないが、細胞毒性アッセイ及びＡＤＰリボシル化アッセイを使用して活性について試験できる。

発現された毒素−突然変異体及び毒素−融合タンパク質は、その機能活性について試験できる。種々の毒素の活性を試験する方法は、当該技術において周知である。例えば、ＤＴバリアント及びＤＴ−融合タンパク質のＶＬＳ効果は、実施例に２に記載のようなＨＵＶＥＣにおいて試験できる。ＤＴバリアント又はＤＴ−融合タンパク質のリボシルトランスフェラーゼ活性は、実施例３に記載のリボシルトランスフェラーゼアッセイで試験できる。ＤＴバリアント又はＤＴ−融合タンパク質の細胞毒性は、実施例４に記載のようにして試験できる。これらのリガンドを使用するＶＬＳ修飾ＤＴ融合毒素は、特異的結合が存在する細胞型の癌又はその他の疾患を治療することに有用である
Ｖ．Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ及びＶＬＳモチーフの修飾を有する毒素
Ｔ細胞及びＢ細胞エピトープの修飾によって免疫原性を低下させる方法並びに本明細書に記載のようなＶＬＳモチーフの修飾によって血管漏出症候群を軽減させる方法の他に、毒素及び修飾毒素は、低下した免疫原性（Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はこれら両方）及び血管漏出症候群を引きこす能力の低下（すなわち、内皮細胞及び血管内皮細胞に対して低下した結合並びに内皮細胞間結合の崩壊の減少及び本明細書に記載のような血管漏出症候群の他の適応症）を示すポリペプチドを生成するために両方の修飾を含むことができる。

Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフ及びこれらの組み合わせに修飾を有する毒素（例えば、ジフテリア毒素）を生成させるために、それぞれの型の修飾のためになされたアミノ酸残基の修飾が、その他の修飾に照らして考慮される。一つの限定されない例において、Ｔ細胞エピトープ及びＶＬＳモチーフの両方の修飾が望ましい。Ｔ細胞エピトープ及びＶＬＳモチーフの両方を修飾する場合には、毒素内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸の修飾は、ＶＬＳモチーフを作り出すべきでない。同様に、毒素内の少なくとも１個のＶＬＳモチーフ内の少なくとも１個のアミノ酸の修飾は、Ｔ細胞エピトープを作り出すべきでない。また、Ｔ細胞エピトープ又はＶＬＳモチーフの修飾は、予め修飾されたＴ細胞又はＶＬＳモチーフを再誘導すべきでない。さらにまた、このようなポリペプチドの修飾はまた、所望の場合には、Ｔ細胞エピトープ又はＶＬＳモチーフを作り出すか又は再誘導すべきでないＢ細胞エピトープの修飾を考慮に入れることもできる。

毒素の細胞毒性に影響を及ぼす修飾も行うことができる。例えば、１個又はそれ以上の修飾が１個又はそれ以上のＴ細胞エピトープに対して行われ、ＶＬＳモチーフ及び／又はＢ細胞エピトープが調製され且つ修飾毒素の細胞毒性が未修飾毒素よりも低い場合には、１個又はそれ以上の修飾は、細胞毒性を未修飾毒素のレベルに匹敵するレベル又は有効レベルまで回復させるために行うことができることが本明細書において意図される。

ジフテリア毒素（Ｔ）の膜挿入ドメイン（トランスロケーションドメイン）は、細胞の細胞質ゾルへの触媒ドメイン（Ｃ）ドメインの送達に関与する両親媒性領域を含む。一つの限定されない例において、領域のヘリカル構造を保持する１個又はそれ以上の異なるアミノ酸残基による両親媒性領域の１個又はそれ以上のアミノ酸残基の置換は、細胞毒性を保持できる。両親媒性領域内の荷電及び疎水性アミノ酸残基及びその修飾の組成及び分布の考察もまた、本明細書において意図される。荷電アミノ酸残基の例としては、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓが挙げられる。疎水性アミノ酸としては、以下に限定されないが、アラニン及びフェニルアラニンが挙げられる。

本明細書に記載のＡＤＰ−リボシル化タンパク質ファミリーの触媒ドメインの結合裂隙の修飾は、細胞毒性に影響を及ぼすこともできる。一つの限定されない例において、ジフテリア毒素ＣドメインのＦ／Ｙ−Ｘ−Ｓ−Ｔ−Ｘモチーフの１個又はそれ以上のアミノ酸残基の修飾は、ポリペプチドの細胞毒性に影響を及ぼすことができる。触媒ドメインを保持する１個又はそれ以上の異なるアミノ酸残基によるこの領域の１個又はそれ以上のアミノ酸残基の置換は、細胞毒性を保持できる。ＡＤＰ−リボシル化タンパク質ファミリー〔例えば、緑膿菌外毒素Ａ〕の関連構成メンバーとの比較は、ジフテリア毒素Ｃドメインなどのドメインのアミノ酸残基修飾及び組成に関する指針を提供できる。これらのような修飾も本明細書において意図される。

低下した免疫原性、低下したＶＬＳ効果（すなわち、減少した内皮細胞結合）及びこれらの組み合わせを有する修飾毒素を調製する方法が、本明細書において提供される。また、低下した免疫原性、低下したＶＬＳ効果及びこれらの組み合わせを有する修飾毒素を選択する方法も、本明細書に記載の発明の範囲に意図される。

一つの実施形態において、毒素は、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフ及びこれらの組み合わせについて修飾され、修飾毒素のアミノ酸配列は、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ又はＶＬＳモチーフの生成又は再導入のために連続的に調べられる。Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフ又はこれらの組み合わせが生成又は再導入されていることが認められる場合には、その中のアミノ酸残基は、前記のＴ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフ又はこれらの組み合わせを除去するために、任意のＴ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフ又はこれらの組み合わせを生成又は再導入することなくさらに修飾される。

別の実施形態において、毒素内のＴ細胞エピトープが、最初に同定され、修飾され、次いで毒素内の任意のＶＬＳモチーフが同定及び修飾される。次いで、修飾毒素は、任意のＴ細胞エピトープの生成及び再導入について調べられ、任意のこのようなＴ細胞エピトープは、ＶＬＳモチーフを生成又は再導入することなく修飾される。さらに別の実施形態において、毒素内のＶＬＳモチーフは、最初に同定及び修飾され、次いで毒素内のＴ細胞エピトープが同定及び修飾される。

本明細書に記載の方法の適用はまた、低下した免疫原性、低下したＶＬＳ効果（すなわち、低下した内皮細胞結合）及びこれらの組み合わせを示す修飾毒素を調製する方法も提供する。また、低下した免疫原性、低下したＶＬＳ効果及びこれらの組み合わせを有する修飾毒素を選択する方法も、本明細書に記載の発明の範囲に意図される。このような特徴のために修飾毒素を試験する方法は、当該技術において公知であり且つ例えば本明細書に提供される実施例に記載される。一つの実施形態において、未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び低下したＶＬＳ効果を示す修飾毒素を調製する方法は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し、少なくとも１個の同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＶＬＳモチーフを同定し及び少なくとも１個の同定されたＶＬＳモチーフ内の少なくとも１個のアミノ酸を修飾することからなる。

別の実施形態において、未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び低下したＶＬＳ効果を示す修飾毒素は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し、少なくとも１個の同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＶＬＳモチーフを同定し及び少なくとも１個の同定されたＶＬＳモチーフ内の少なくとも１個のアミノ酸を修飾する方法によって作り出される。

さらの別の実施形態において、未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び低下したＶＬＳ効果を示す修飾毒素を選択する方法は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＴ細胞エピトープを同定し、少なくとも１個の同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾し、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１個のＶＬＳモチーフを同定し、少なくとも１個の同定されたＶＬＳモチーフ内の少なくとも１個のアミノ酸を修飾し及び未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示す修飾毒素を選択することからなる。

ＶＩ．毒素
本明細書で使用する「毒素」という用語は、任意の抗細胞薬を指し、以下に限定されないが、細胞毒素及び／又は抗細胞薬の任意の組み合わせを包含する。ある態様において、毒素は、例えば、植物毒素、真菌毒素、細菌毒素、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）又はこれらの組み合わせである。毒素としては、以下に限定されないが、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素（ＤＴ）Ａ鎖、シュードモナス菌外毒素、ＲＴＡ、志賀毒素Ａ鎖、志賀様毒素、ゲロニン、モモルジン、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、サポリン、トリコサンチン、オオムギ毒素及び当該技術において公知の種々のその他の毒素が挙げられる。本明細書で使用される毒素は、具体的にはブドウ球菌エンテロトキシン毒素Ｂ（ＳＥＢ）、ヒルジン及びボウガニンタンパク質を除外する。

ジフテリア毒素は、モノ−ＡＤＰ−リボシル化毒素ファミリーのメンバーであり、モノ−ＡＤＰ−リボシル化毒素ファミリーは、さらにコレラ毒素、シュードモナス菌外毒素Ａ、百日咳毒素及びクロストリジウムＣ３様毒素のような毒素を包含する。このファミリーのメンバーは、多数の類似のタンパク質ドメイン及びモチーフ、特に毒素の触媒部位を含む。例えば、このファミリーの多くのメンバーの触媒部位は、これらの毒素の触媒機能において重要なグルタミン酸残基を含むことが知られている。このファミリーのメンバーは、典型的な毒素としてＤＴを使用する本明細書に記載の発明の範囲内にあると考えられる。ＤＴは、３個のドメイン、すなわち触媒ドメイン、貫膜ドメイン及び受容体結合ドメインからなる（Ｃｈｏｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：２１６−２２２（１９９２））。未変性ＤＴの核酸及びアミノ酸配列は、図２にＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ（１９８３）８０：６８５３−６８５７によって記載されている。未変性ＤＴは、ヘパリン結合上皮増殖因子様受容体を発現する細胞を標的とする（Ｎａｇｌｉｓｈｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，６９：１０５１−１０６１（１９９２））。第一世代の標的毒素は、最初は、新規な標的リガンドを、ＤＴ又は細胞結合が欠損したＤＴの突然変異体（例えば、ＣＲＭ４５）などの毒素に化学的に架橋結合させることによって開発された（Ｃａｗｌｅｙ，Ｃｅｌｌ，２２：５６３−５７０（１９８０）；Ｂａｃｈａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１８１（１）：１３１−１３８（１９８６）；Ｂａｃｈａｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１３（３）：１０７２−１０７６（１９８３）；Ｂａｃｈａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８（３）：１５６５−１５７０（１９８３））。特定のクラスの受容体担持細胞の表面の受容体にＤＴ担毒体を指向させる天然細胞結合ドメイン又は架橋リガンドは、無傷の触媒ドメイン及びトランスロケーションドメインを有していなければならない（Ｃａｗｌｅｙｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，２２：５６３−５７０（１９８０）；ｖａｎｄｅｒＳｐｅｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５：２６８（１６）：１２０７７−１２０８２（１９９３）；ｖａｎｄｅｒＳｐｅｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，７（８）：９８５−９８９（１９９４）；ｖａｎｄｅｒＳｐｅｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，７（８）：９８５−９８９（１９９４）；Ｒｏｓｃｏｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１０；２７７（１９）：１６５１７−１６１２７８（２００２））。これらのドメインは、受容体内在化後の標的細胞の送達及び中毒にとって重要である（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８（４８２６）５３６−５３９（１９８７））。毒素、毒素複合体又は融合毒素が細胞表面受容体にいったん結合すると、細胞は、エンドサイト小胞によって毒素結合受容体を内在する。小胞は処理されるにつれて、酸性化されてしまい、ＤＴ担毒体のトランスロケーションドメインは、毒素の９つの貫膜セグメントをエンドサイト小胞の膜内に挿入する構造再構成を行う。この事象は、毒素の触媒ドメインが通り抜ける生産性細孔の形成を引き起こす。いったん転位置すると、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有する触媒ドメインが、標的細胞の細胞質ゾル内に放出され、そこで毒翻訳が自由にでき、従って細胞死を行う（ｖａｎｄｅｒＳｐｅｋｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＢａｃｔｅｒｉａｌＴｏｘｉｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，１４５：８９−９９，Ｈｕｍａｎａｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，（２０００）に概説されている）。

１０個未満のＤＴの分子は、もしこれらが細胞質ゾルに侵入するならば細胞を殺すであろう（しかし、侵入プロセスは非効率であることから、その何倍もの数が細胞表面に結合しなければならない）。この驚くべき能力は、最初は、このような毒があまりにも強くて制御できないという懸念を招く。しかし、ＤＴなどの毒素は、（標的細胞に指向させた場合を除いて）その細胞結合ドメイン又はサブユニットを除去又は修飾することによって簡単に無毒化することができる。次いで、毒素の残りの部分（細胞結合ドメインを欠いている）が、毒素部分を標的細胞に標的として向けるリガンド（例えば、細胞結合ドメインを含有するポリペプチド又はその部分）に連結される。望まれていない交差反応性を欠いている細胞結合ドメインを含有するポリペプチド又はその部分を選択することによって、融合タンパク質は、より安全であり、大部分の従来の抗癌薬よりも小さい非特異的細胞毒性効果を有する。ＤＴなどの毒素のその他の主な魅力は、これらの毒素がタンパク質合成の阻害剤であることから、これらの毒素が分裂している細胞と同じくらい有効に休止細胞を殺すことである。従って、治療時に周期中ではない腫瘍又は感染細胞は、融合タンパク質の細胞毒性から免れない。

ＤＴなどの毒素は、多くの場合、２つのジスルフィド結合鎖、すなわちＡ鎖及びＢ鎖を含有する。Ｂ鎖は、細胞結合領域とトランスロケーション領域の両方を有し、酸性細胞区画の膜を通ってＡ鎖の細胞質ゾル内への挿入を促進する。Ａ鎖は、この場合に、トランスロケーション後に細胞を殺す。その生体内使用のために、リガンドと毒素は、血流及び組織を通り抜けながら安定な状態を保つような方法で連結されるが、毒素部分が細胞質ゾル中に放出できるように標的細胞内では不安定である。

しかし、それにもかかわらず適切な生物学的反応を提供することができる最も小さい分子を用いることが、薬理学的観点から望ましいものであり得る。従って、より小さいＡ鎖ペプチド又は適切な抗細胞応答を提供するであろうその他の毒素を用いることが望ましいものであり得る。

本明細書に記載のジフテリア毒素は、配列番号：２又は２００に示すアミノ酸配列を含有する。また、ジフテリアのバリアントは、その生物活性をさらに保持しながらその核酸配列中に核酸残基の挿入、欠失及び／又は置換を含むことが知られている。ジフテリア毒素のバリアントは、ジフテリア毒素の間で核酸の変異を実証することが特徴付けられおり（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１８１（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ１５６−Ｓ１６７（２０００））、従ってジフテリア毒素は、種々の核酸及び／又はアミノ酸配列を含有することができる。また、核酸残基の挿入、欠失及び／又は置換も、アミノ酸配列に影響を及ぼすことができる。しかし、必ずしも全ての核酸残基の変化が、遺伝暗号の重複性のせいでタンパク質のアミノ酸残基レベルで変化をもたらすとは限らないであろう。ジフテリア毒素の核酸及び／又はアミノ酸の変化（すなわち、挿入、欠失及び／又は置換）もまた、ジフテリア毒素の定義の範囲内に含まれ且つ本明細書において意図される。本明細書で使用されるように、ジフテリア毒素は、配列番号：２又は２００に示すアミノ酸配列を含有し且つさらに配列番号：２又は２００に対して約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同性のアミノ酸配列を含有するジフテリア毒素を包含する。また、ＤＴのＣ末端切断も行うことができ、例えばＤＴ３８９又はＤＴ３８７の約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個又は約５０個のアミノ酸残基の欠失が挙げられる。例えば、本明細書で使用されるように、ジフテリア毒素は、配列番号：２又は１４９のアミノ酸残基１−３８２に示すアミノ酸配列を含有し且つさらに配列番号：２又は１４９のアミノ酸残基１−３８２に対して約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同性のアミノ酸配列を含有するジフテリア毒素を包含する。ジフテリア毒素のバリアントは、修飾することができ、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して機能について試験することができることが理解されるであろう。

一つの態様おいて、本明細書で使用する毒素とは、毒素（例えば、ジフテリア毒素）と少なくとも１個の細胞結合ドメインを含有する非毒素ポリペプチドとの間の融合タンパク質を意図する。一つの限定されない例において、ジフテリア毒素又はその断片は、インターロイキン２（ＩＬ−２）の細胞結合ドメインに融合され、従って融合毒素を作る。本明細書にさらに詳しく説明するように、融合タンパク質毒素は、リンカーポリペプチド及び複合体を含有することもできる。このような毒素も、本明細書に開示される発明の方法によって修飾される毒素として意図される。

一つの実施形態において、毒素は、修飾毒素を含有する融合タンパク質であって、毒素結合ドメインが非毒素ポリペプチドの結合ドメインで置換されている融合タンパク質である。別の実施形態において、毒素は、修飾ジフテリア毒素と非毒素ポリペプチドとからなる融合タンパク質である。別の実施形態において、毒素は、ジフテリア毒素とＩＬ−２とからなる融合タンパク質である。

ジフテリア毒素は代表的な毒素として論じられることが多いが、本明細書に記載の本発明の方法は、前述の毒素のいずれかに適用できることが認められるであろう。

ＶＩＩ．融合タンパク質
本発明はまた、修飾毒素融合タンパク質を提供する。修飾毒素ポリペプチドは、例えば、非毒素ポリペプチドに融合させることができる。一つの実施形態において、非毒素ポリペプチドは、細胞特異的結合リガンドである。本発明において使用される特異的結合リガンドは、リガンド全体を含有するか、又はリガンドの結合ドメイン全体を含むリガンドの部分を含有するか、又は結合ドメインの有効部分を含有することができる。リガンド分子の結合ドメインの全部又は大部分を含有することが最も望ましい。一つの限定されない例において、ＤＴ融合タンパク質は、ＤＴ関連ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の修飾ＤＴ）及び相互にインフレームで融合された非ＤＴポリペプチドを含有する。ＤＴ関連ポリペプチドは、低下した免疫原性又は修飾Ｔ細胞エピトープ、ヒト血管内皮細胞に対する低下した結合、又はこれらの組み合わせを有するＤＴバリアントの全体又は部分に対応する。一つの実施形態において、ＤＴ融合タンパク質は、配列番号：４−１４７の一つに示される修飾ＤＴ配列の少なくとも１つの部分を含有する。別の実施形態において、ＤＴ融合タンパク質は、少なくとも１個のＴ細胞エピトープ修飾を含有する。さらに別の実施形態において、ＤＴ融合タンパク質は、少なくとも１個のＴ細胞エピトープの修飾と、配列番号：４−１４７の１つ又はそれ以上に示す少なくとも１個の修飾とを含有する。さらに別の実施形態、ＤＴ融合タンパク質は、少なくとも１個のＴ細胞エピトープの修飾と、配列番号：４−１４７の１つ又はそれ以上に示す少なくとも１個の修飾と、少なくとも１個のＢ細胞エピトープ修飾を含有する。

本明細書に開示される化合物の一つの実施形態において、修飾毒素は、非ジフテリア毒素ポリペプチドが細胞結合リガンドである融合毒素である。別の実施形態において、細胞結合リガンドは、抗体又はその抗原結合断片、サイトカイン、ポリペプチド、ホルモン、増殖因子又はインスリンである。さらに別の実施形態において、サイトカインはＩＬ−２である。

別の実施形態において、修飾毒素は、細胞結合ドメインが抗体又はその抗原結合断片である融合毒素である。抗体は、例えばモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、ヒト化抗体、遺伝子組換え抗体又は移植抗体であることができる。抗原結合断片は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ_２、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２（Ａ鎖の２個のｓｃＦｖ分子の頭部−尾部のタンデム結合）、一本鎖結合ポリペプチド、ＶＨ又はＶＬであることができる。抗原結合断片を調製する方法は、当該技術において知られており、本明細書に組み込まれる。有用な抗体としては、標的細胞膜又は腫瘍結合抗原の表面で発現される受容体又はその他の部分に特異的に結合できる抗体が挙げられる。

「特異的に結合する」とは、結合剤が、標的細胞表面の抗原に、非関連抗原を結合するよりも大きい親和性で結合することを意味する。このような親和性は、非関連抗原に対する結合剤の親和性よりも少なくとも約１０倍大きい、少なくとも約１００倍大きい、又は少なくとも約１０００倍大きいことが好ましい。「免疫反応性の」及び「特異的に結合する」という用語は、本明細書において同じ意味で使用される。ある実施形態において、抗腫瘍抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２など）は、腫瘍細胞の表面決定因子を認識するものであり且つ受容体介在エンドサイトーシスによってこれらの細胞の中に取り込まれる。別の実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ細胞表面分子に結合し、例えばＢ細胞表面分子は、ＣＤ１９又はＣＤ２２である。あるいは、抗体又はその抗原結合断片は、卵巣受容体ＭＩＳＩＩＲ（ミューラー阻害物質ＩＩ型受容体）に結合する。

細胞特異的結合リガンドとしては、以下に限定されないが、ポリペプチドホルモンを挙げることもでき、例えば、α−ＭＳＨの結合ドメインを使用して作り出されるポリペプチドホルモンは、メラニン細胞に選択的に結合することができ、黒色腫の治療に有用な改良されたｔ−ＭＳＨキメラ毒素の組み立てを可能にする（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８３（２１）：８２５８−８２６２（１９８６））。使用できるその他の特異的結合リガンドとしては、インスリン、ソマトスタチン、インターロイキンＩ及びＩＩＩ並びに顆粒球コロニー刺激因子が挙げられる。細胞特異的結合ドメインを有する他の有用なポリペプチドリガンドは、卵胞刺激ホルモン（卵巣細胞に特異的）、黄体形成ホルモン（卵巣細胞に特異的）、甲状腺刺激ホルモン（甲状腺細胞に特異的）、バソプレシン（子宮細胞、並びに膀胱細胞及び腸細胞に特異的）、プロラクチン（乳房細胞に特異的）及び成長ホルモン（ある種の骨組織細胞に特異的）である。使用できる特異的結合リガンドとしては、サイトカイン、例えば、以下に限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、β−インターフェロン、α−インターフェロン（ＩＮＦ−α）、ＩＮＦ−γ、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＳＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、Ｆｌｔ３及びＢ細胞増殖因子が挙げられる。ＩＬ−２は、活性化Ｔ細胞を伴うアレルギー反応及び自己免疫疾患、例えば全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）におけるその役割から、特に重要である。Ｂ細胞増殖因子を使用して作り出される毒素融合タンパク質は、免疫抑制剤であって増殖するＢ細胞を殺し、Ｂ細胞増殖因子受容体を有し且つ過敏性反応及び臓器拒絶反応に関与する免疫抑制剤として使用できる。その他のサイトカインとしては、サブスタンスＰ（Ｂｅｎｏｌｉｅｌｅｔａｌ．，Ｐａｉｎ，７９（２−３）：２４３−５３（１９９９））、ＶＥＧＦ（Ｈｏｔｚｅｔａｌ．，Ｊ．ＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔＳｕｒｇ．，６（２）：１５９−６６（２００２））、ＩＬ−３（Ｊｏｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐＰｕｒｉｆ．，３３（１）：１２３−３３（２００４））及びＧＭ−ＣＳＦ（Ｆｒａｎｋｅｌｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，８（５）：１００４−１３（２００２））が挙げられる。これらのリガンドを使用する修飾融合毒素は、癌又は特異結合が存在する細胞種のその他の疾患を治療するのに有用である。

ＩＬ−２において、残基１９−２１（配列番号：３）のＬＤＬ配列（「ＶＬＳ」モチーフ）が、α−へリックス中に配置され、部分的に露出される。ＬＤＬモチーフのＡｓｐ−２０をＬｙｓに突然変異させると、ＩＬ−２受容体のβ鎖に対するＩＬ−２の結合及びその後のＴ細胞の増殖を排除する（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．，１９８８）。ＩＬ−２が生体外でアルブミンに対する血管内皮の透過性を直接に増大させること及びこの効果は抗ＩＬ−２受容体モノクロナール抗体によって抑制できることが報告されている（Ｄｏｗｎｉｅｅｔａｌ．，１９９２）。ＩＬ−２中のＬＤＬ配列は、ＨＵＶＥＣを損傷する。ＩＬ−２のＬＤＬ内のＡｓｐ−２０は、受容体結合及び機能活性に関与する（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．，１９８８）。従って、ある実施形態において、ＶＬＳを排除又は抑制するためにＩＬ−２の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列及び／又はフランキング配列の突然変異が、Ａｓｐ−２０に関して保存的であるべきであるか又はＩＬ−２の生物活性を低下させ得ることが意図される。

多数の細胞特異的リガンドについて、結合ドメインが配置されているそれぞれのこのようなリガンド内の領域が、現在知られている。また、固相ポリペプチド合成の進歩は、この技術の当業者がリガンドの種々の断片を合成し、これらの断片を、ＥＬＩＳＡアッセイなどの当該技術において公知の慣用の方法を使用して標識すべき細胞のクラスに結合する能力について試験することによって、実際に任意のこのようなリガンドの結合ドメインを決定ことを可能にする。従って、本発明のキメラ遺伝子融合毒素は、完全なリガンドを必ずしも含む必要がないが、むしろ所望の細胞結合能を示すリガンドの断片だけを含むことができる。同様に、リガンドのアナローグ又はその小さい配列変化を有する細胞結合領域は、合成でき、その細胞に結合する能力について試験することができ、本発明の混成分子に組み込むことができる。細胞結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、１個又はそれ以上のＶＬＳモチーフ、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ又はこれらの組み合わせについて分析することができ、本明細書に記載の概念に従って修飾することができる。

一つの態様において、本発明の毒素融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術で作り出される。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、慣用の方法に従って、例えば、連結のための平滑末端化又はスタッガー末端化された末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、必要に応じて付着末端の充填、望ましくない連結を回避するアルカリホスファターゼ処理、及び酵素連結を用いることによって、インフレームで一緒に連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、慣用の技法、例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成できる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを使用して行うことができ、アンカープライマーは、その後にアニールされ、再増幅されてキメラ遺伝子配列を生じることができる２個の連続する遺伝子断片の間で相補的張出し部分を生じる。

融合タンパク質の適切な立体構造折畳みに必要とされる場合には、ペプチドリンカー配列は、それぞれのポリペプチドがその二次構造及び三次構造中に折畳むことを確実にするのに十分な距離で、非毒素ポリペプチド成分から毒素関連ポリペプチドを離すのに用いることができる。このようなペプチドリンカー配列は、当該技術で周知の標準的技法を使用して融合タンパク質に組み込むことができ且つ以下の因子、（１）その柔軟な伸長した立体構造を採用できる能力、（２）毒素関連ポリペプチド及び非毒素ポリペプチドの表面で機能性エピトープと相互作用できる二次構造を採用することができないこと、及び（３）ポリペプチド機能性エピトープと反応し得る疎水性又は帯電残基の欠如、に基づいて選択することができる。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒ残基を含有する。また、その他の中性に近いアミノ酸、例えばＴｈｒ及びＡｌａも、リンカー配列に使用できる。リンカーとして有効に用いることができるアミノ酸配列としては、以下に限定されないが、Ｍａｒａｔｅａｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号及び同第４，７５１，１８０号公報に開示されているアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般に長さで約１個〜約５０個のアミノ酸であることができる。毒素関連ポリペプチド及び非毒素ポリペプチドが、機能性ドメインを分離し且つ立体障害を抑制するのに使用できる非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合には、リンカー配列は必要とし得ない。

化学的架橋又は複合は、反応生成物に相当する種々の分子種をもたらし、典型的にはこれらの生成物の小さな画分のみが触媒的に及び生物学的に活性である。生物学的に活性であるために、反応生成物は、担毒体の触媒ドメイン及びトランスロケーションドメインの固有の構造及び活性を阻害しない方法で複合されなければならない。反応生成物が、多くの場合、例えば大きさ、電荷密度及び相対疎水性を含め類似の生物物理学的特徴を有することから、不活性種から活性種又は高活性種の分離は、必ずしも可能であるとは限らない。多量の純粋な臨床グレードの活性生成物の化学架橋毒素からの単離は、典型的には、臨床試験用の医薬グレードの生成物の製造及びその後の臨床市場への導入のためには経済的に可能でないことは注目に値する。この問題を回避するために、未変性ＤＴ受容体結合ドメインが代用受容体標的ドメインとしてメラニン細胞刺激ホルモンで遺伝的に置換されている遺伝子ＤＴ型タンパク質融合毒素が作り出される（Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，８３：８２５８−８２６２（１９８６））。このアプローチは、ＩＬ−２受容体の高親和性型を発現したこれらの細胞に対してのみ特異的に細胞毒性であったＤＡＢ４８６ＩＬ−２を作り出すために、代用標的リガンドとしてヒトＩＬ−２と共に使用された（Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，１：４９３−４９８（１９８７））。ＤＡＢ４８６ＩＬ−２に関するその後の研究により、分子のＤＴ部分からの９７個のアミノ酸の切断は、ＩＬ−２受容体標的毒素よりも安定で、より細胞毒性のバージョンＤＡＢ３８９ＩＬ−２をもたらすことが示された（Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１８８５−８８９（１９９０））。元の構造体（４８６体）は、未変性ＤＴ細胞結合ドメインの部分を未だ有していた。ＤＡＢ３８９バージョンは、Ｔドメインと関連受容体結合ドメインの間のランダムコイルにおいて終わる融合タンパク質のＤＴ部分を有するＤＴのＣドメイン及びＴドメインを含有する。それ以来、多数のその他の標的リガンドが、このＤＴ担毒体、ＤＡＢ３８９に遺伝的に融合されている（ＶａｎｄｅｒＳｐｅｋｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＢａｃｔｅｒｉａｌＴｏｘｉｎｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，１４５：８９−９９，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（２０００））。同様のアプローチが、現在、その他の細菌性タンパク質と共に用いられており、遺伝子融合毒素は、多くの場合、生成及び精製することがより容易である。

ＶＩＩＩ．核酸、ベクター及び宿主細胞
本発明の別の態様は、修飾されたＤＴバリアント又はその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（核酸、ＤＮＡ）を含有するベクターに関する。

種々の遺伝子についてヌクレオチド及びポリペプチド配列が、これまでに開示されており、当業者に知られているコンピューターデータベースで見出すことができる。一つのこのようなデータベースは、米国国立生物工学情報センター（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。これらの公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示される技法を使用して又は当業者に知られている任意の技法で増幅及び／又は発現させることができる。また、ポリペプチド配列は、当業者に知られている方法、例えば自動ポリペプチド合成装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から入手できる自動ポリペプチド合成装置を使用するポリペプチド合成で合成できる。

本明細書で使用する「発現ベクター又は構造体」とは、核酸コード配列の部分又は全体を転写することができる遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意の種類の遺伝子構造体を意味する。転写物は、タンパク質に翻訳することができるが、必ずしも翻訳される必要はない。従って、ある実施形態において、発現は、遺伝子の転写及びＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、例えばアンチセンス構造体を作り出すために核酸の転写を含むのみである。

特に有用なベクターは、ＤＮＡセグメントのコード部分が全長タンパク質、ポリペプチド又はより小さいペプチドをコードするか否かに関わらず、プロモーターの転写調節下に配置されるベクターであると考えられる。「プロモーター」とは、細胞の合成装置で、又は遺伝子の特定の転写を開始するのに必要とされる導入された合成装置で認識されるＤＮＡ配列を指す。「操作的に配置された」、「制御下」又は「転写調節下」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼ開始及び遺伝子の発現を制御するために遺伝子産物をコードする核酸に関してプロモーターが正しい配置及び配向にあることを意味する。

プロモーターは、本明細書に開示される組成物に関連して、コードセグメント又はエキソンの上流に配置された５’非コード配列を、例えば組換えクローニング及び／又はＰＣＲ法を使用して単離することによって得ることができることから、遺伝子に必然的に関連するプロモーターの形であることができる。

別の実施形態において、組換え又は異種プロモーターの制御下にコード化ＤＮＡセグメントを配置することによってある利点が得られることが意図される。本明細書で使用する組換え又は異種プロモーターとは、標準的にその自然環境にある遺伝子に関連しないプロモーターを指すことを意図する。このようなプロモーターとしては、他の遺伝子に標準的に関連するプロモーター、及び／又は任意のその他の細菌、ウイルス、真核細胞、又は哺乳動物細胞から単離されたプロモーター、及び／又は「天然に存在」しない人の手で調製されたプロモーター、すなわち異なるプロモーター由来の異なる要素を含有するか、あるいは発現を高めるか、低下させるか又は変化させる突然変異を含有するプロモーターを挙げることができる。

細胞種、組織、又はさらには動物においてＤＮＡセグメントの発現を効率的に指示するプロモーターが、発現のために選択される。タンパク質の発現のためのプロモーター及び細胞種の組み合わせの使用は、一般に、分子生物学の当業者には公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，（１９８９）参照（参照することによって本明細書に組み込まれる）。用いられるプロモーターは、構成性又は誘導性であることができ及び導入されたＤＮＡセグメントの高水準発現を指示するのに適切な条件下で使用でき、例えば組換えタンパク質又はペプチドの大規模産生に都合のよい条件下で使用できる。

プロモーターの中の少なくとも１個のモジュールは、一般に、ＲＮＡ合成の開始部位を配置させる機能を果たす。この最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠く幾つかのプロモーター、例えば哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子用のプロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子用のプロモーターにおいては、開始部位それ自体を覆う個別の要素が、開始の場所を固定するのに役立つ。

さらなるプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらのプロモーター要素は、開始部位の３０−１１０塩基対（ｂｐ）上流の領域に配置されるが、多数のプロモーターが、さらに開始部位の下流に機能性要素を含有することが明らかにされている。プロモーター要素同士の間の間隔は、要素が互いに対して反転又は移動される場合にはプロモーター機能が保たれるように順応性がある場合が多い。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーター要素同士の間の間隔は、活性が低下し始める前には５０ｂｐ離れるまで増大させることができる。プロモーターに応じて、個々の要素は、転写を活性化させるために協調して又は独立して機能を果たすと思われる。

核酸の発現を調節するために用いられる特定のプロモーターは、標的細胞の中で核酸を発現することができる限りは重要であるとは考えられない。従って、ヒト細胞が標的とされる場合には、ヒト細胞の中で発現されることができるプロモーターに隣接した核酸コード領域を配置し且つその制御下に核酸コード領域を配置することが好ましい。一般的に言えば、このようなプロモーターは、ヒトプロモーター又はウイルス性プロモーターを含有してもよい。

発現において、あるものは、典型的には、転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含むであろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾よい実施には重要であるとは考えられず、任意のこのような配列を使用し得る。ポリアデニル化シグナルとしては、以下に限定されないが、種々の標的細胞において十分に機能するのに都合がよく且つ機能することが知られているＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。また、発現カセットの要素として意図されるのは、ターミネーター配列である。これらの要素は、メッセージレベルを高め及びカセットから他の配列への読み取りを最小限にするのに役立ち得る。

特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とし得る。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が挙げられる。外因性翻訳制御シグナル、例えばＡＴＧ開始コドンが提供されることを必要とし得る。当業者は、容易に、これを決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、全挿入片の翻訳を確実にするために所望のコード配列の読み取り枠を有する「インフレーム」になければならないことは周知である。外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然又は合成のものであることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含有させることによって高め得る。

ポリペプチドを他の選択されたタンパク質と同時に発現させることができ、この場合に前記タンパク質を同一細胞中で同時に発現させることができるか又は遺伝子を別の選択されたタンパク質を既に有している細胞に提供できることが意図される。同時発現は、２個の異なる組換えベクター（それぞれは、それぞれのＤＮＡのいずれかのコピーを有する）を細胞に同時に移入することによって達成できる。あるいは、単一の組換えベクターは、前記タンパク質の両方についてコード領域を含有させるために組み立てることができ、これは、次いで単一のベクターを移入した細胞中で発現させることができる。いずれにしても、本明細書において「同時発現」という用語は、同じ組換え細胞中の遺伝子と他の選択されたタンパク質の両方の発現を指す。

本明細書で使用する「操作された」及び「組換え」細胞又は宿主細胞という用語は、外因性ＤＮＡセグメント又は遺伝子、例えばｃＤＮＡ又はタンパク質をコードする遺伝子が導入されている細胞を指すことを意図する。従って、操作された細胞は、組換えにより導入された外因性ＤＮＡセグメント又は遺伝子を含有していいない自然発生の細胞と区別すできる。従って、操作された細胞は、人の手によって導入された遺伝子又は遺伝子を有する細胞である。組換え細胞としては、導入されたｃＤＮＡ又はゲノム遺伝子を有する細胞が挙げられ、また特定の導入された遺伝子に必然的に関連しないプロモーターに隣接して配置された遺伝子も挙げられる。

修飾されているか又は野生型であるかに関わらず、本発明に従って組換えポリペプチドを発現させるためには、野生型又は修飾されたタンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターが１個又はそれ以上のプロモーターの制御下で調製されるであろう。コード配列をプロモーター「の制御下」に置くために、転写読み取り枠の転写開始部位の５’末端を、一般に選択されたプロモーターの「下流の」（すなわち、３’）の約１個〜約５０個のヌクレオチドの間に配置する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされた組換えタンパクの発現を促進する。これが、この文脈において「組換え発現」の意味である。

多くの標準的な技法が、種々の宿主発現系でタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現を達成するために、適切な核酸及び転写／翻訳制御配列を含有する発現ベクターを組み立てるのに利用できる。発現に利用できる細胞の種類としては、以下に限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換させた大腸菌及び枯草菌などの細菌が挙げられる。

原核生物宿主のある種の例は、大腸菌株ＲＲ１、大腸菌ＬＥ３９２、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ．３１５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−、原栄養性、ＡＴＣＣＮｏ．２７３３２５）、枯草菌などの桿菌、並びにその他の腸内細菌、例えばサルモネラ・チフィムリウム、セラチア・マルセセンス及び種々のシュードモナス菌の種である。

一般的に、宿主細胞に適合する種から誘導されるレプリコンと制御配列とを含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、普通、複製部位と、形質転換細胞において表現型の選択を提供できる標識配列とを有する。例えば、大腸菌は、多くの場合、ｐＢＲ３２２（大腸菌種から誘導されるプラスミド）の誘導体を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、従って形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲプラスミド、又は他の微生物プラスミドもしくはファージは、それ自体のタンパク質の発現のために微生物が使用できるプロモーターも含有しなければならないか又は含有するために修飾されなければならない。

さらに、宿主微生物に適合するレプリコンと制御配列とを含有するファージベクターが、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用できる。例えば、ファージλＧＥＭ（商標）−１１が、例えば大腸菌ＬＥ３９２などの宿主細胞を形質転換するのに使用できる組換えファージベクターを調製するのに利用し得る。

別の有用なベクターとしては、後に精製及び分離、又は分割するためのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質を生成させるのに使用するために、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅｅｔａｌ．，１９８５）、及びｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の適した融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどを有するものである。

組換えＤＮＡ組み立てに最も一般的に使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。これらが最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが発見され、利用されており、これらのヌクレオチド配列に関する詳細が公表されており、当業者がこれらをプラスミドベクターと機能的に連結することを可能にさせる。

大腸菌などの細菌細胞での組換えタンパク質産生に関する以下の詳細を、一般的な組換えタンパク質産生に関する典型的な情報として提供し、特定の組換え発現系に対するその適応は、当業者には公知であろう。

発現ベクターを含有する細菌細胞、例えば大腸菌は、多数の適当な培地のいずれかで、例えばＬＢで増殖させる。組換えタンパク質の発現は、例えば、ＩＰＴＧを培地に加えることによって又はインキュベーションをより高い温度に切り替えることによって誘導し得る。細菌を一般的には２〜２４時間のさらにある時間培養した後に、細胞は、遠心分離により収集され、残存培地を除去するために洗浄される。

次いで、細菌細胞は、例えば、細胞ホモジナイザーで破壊することによって溶解され、可溶性細胞成分から濃厚封入体及び細胞膜を分離するために遠心分離される。この遠心分離は、濃厚封入体を緩衝液中への糖類、例えばスクロースの取り込み及び選択速度での遠心分離によって選択的に濃縮する条件下で行うことができる。

組換えタンパク質が封入体中で発現される場合には、多くの場合のように、これらは数種類の溶液のいずれかで洗浄して混入宿主タンパク質の幾つかを除去し、次いで還元剤、例えばβ−メルカプトエタノール又はＤＴＴ（ジチオトレイトール）の存在下で、高濃度の尿素（例えば、８Ｍ）又はグアニジン塩酸塩などのカオトロピック剤を含有する溶液に可溶化させる。

本明細書に記載の方法で製造されるポリペプチドは、過剰発現させることができる、すなわち、細胞でのその自然な発現と比べて高められたレベルで発現させることができることが意図される。このような過剰発現は、放射標識及び／又はタンパク質精製を含め種々の方法で評価することができる。しかし、単純且つ直接的な方法が好ましく、例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びタンパク質染色又はウェスタンブロッティング、次いで定量分析、例えば得られるゲル又はブロットの濃度スキャニングを含む方法が好ましい。天然細胞中の量と比べて組換えタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの量の特異的な増大は、宿主細胞によって産生される他のタンパク質に関して特定のポリペプチドの相対存在量であり、例えばゲル上で目に見えるように、過剰発現を示す。

本明細書において提供される発現ベクターは、修飾ＤＴ又はその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞中のポリヌクレオチドの発現に適した形態で含有する。発現ベクターは、一般的に発現に使用すべき宿主細胞に基づいて選択され、発現されるべきポリヌクレオチド配列に操作的に連結される１個又はそれ以上の調節配列を有する。形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存することができることが当業者には認められるであろう。本明細書に記載の発現ベクターは、本明細書に記載のようなポリヌクレオチド（例えば、修飾ＤＴ又はＤＴ融合タンパク質など）によってコードされるタンパク質、例えば融合タンパク質を産生させるために宿主細胞に導入することができる。

発現ベクターは、原核生物又は真核細胞中での修飾ＤＴ又はＤＴ融合タンパク質の発現のために設計することができる。真核細胞の内部に単一のＤＴ遺伝子が存在すると、細胞を殺すであろう。具体的には、毒素は、翻訳及びリボシル化に必要とされるＥＦ−ｔｕに結合する。従って、ＤＴは、もはやＤＴによって認識されない修飾ＥＦ−ｔｕを有する真核細胞中で発現させることができるだけである（例えば、Ｌｉｕｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，３０：２６２−２７４（２００３）；Ｐｈａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（１２）：８６６５−８（１９９３）；Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，５（１２）：３３５７−６０（１９８５）；Ｋｏｈｎｅｅｔａｌ．，ＳｏｍａＴＣｅｌｌＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１（５）：４２１−３１（１９８５）；Ｍｏｅｈｒｉｎｇｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，４（４）：６４２−５０（１９８４）参照）。また、修飾ＤＴ又はその融合タンパク質は、大腸菌などの細菌細胞中で発現させることができる（Ｂｉｓｈａｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６９（１１）：５１４０−５１（１９８７））。発現及び活性の型及び宿主プロテアーゼ発現のレベルが考慮され、これは操作されたＤＴ担毒体に存在する切断部位に依存する。固有の発現宿主プロテアーゼ発現プロファイルは、産生されたＤＴ融合毒素の収量に悪影響を及ぼすであろう（Ｂｉｓｈａｉｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ（１９８７））。この不可欠な切断部位を変化させて得られる融合タンパク質の細胞選択性を調節することができる程度まで、このような切断部位突然変異体は、ＶＬＳ修飾担毒体であり得ると想定される（Ｇｏｒｄｏｎｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．，６３（１）：８２−７（１９９５）；Ｇｏｒｄｏｎｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．，６２（２）：３３３−４０（１９９４）；Ｖａｌｌｅｒａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，９４：５９７−６０６（２００２）；Ａｂｉ−Ｈａｂｉｂｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，１０４（７）：２１４３−８（２００４））。あるいは、発現ベクターは、生体外で転写及び翻訳することができる。

本出願は、発現のために細胞、組織、哺乳動物にポリヌクレオチドを送達するための遺伝子送達ビヒクルをさらに提供する。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は、遺伝子送達ビヒクルに、局部的に又は全身的に投与することができる。これらの構造体は、生体内又は生体外様式でウイルス又は非ウイルスベクターアプローチを利用できる。このようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物プロモーター又は異種プロモーターを使用して誘導することができる。生体内でのコード配列の発現は、構成性又は調節性であり得る。本発明は、ウイルスベクターを含め意図するポリヌクレオチドを発現することができる遺伝子送達ビヒクルを包含する。例えば、ＰＧ１３パッキング細胞を用いる系を開発したＱｉａｏらは、癌細胞を殺し且つＤＴを自殺ベクターの要素として使用する方法を提供するＤＴ断片を有する組換えレトロウイルスを作り出している。Ｑｉａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６（１４）：７３４３−８（２００２）。

発現させたＤＴ突然変異体及びＤＴ融合タンパク質は、これらの機能活性について試験することができる。ＤＴ活性を試験する方法は、当該技術において周知である。例えば、ＤＴ突然変異体及びＤＴ融合タンパク質のＶＬＳ効果は、実施例２に記載のようにしてＨＵＶＥＣで試験することができる。ＤＴバリアント及びＤＴ融合タンパク質のリボシルトランスフェラーゼ活性は、実施例３に記載のリボシルトランスフェラーゼアッセイにより試験することができる。ＤＴバリアント及びＤＴ融合タンパク質の細胞毒性は、実施例４に記載のようにして試験することができる。

本出願はまた、本明細書に記載の１個又はそれ以上の方法を使用して発現される精製されたポリペプチドを提供し、好ましい実施形態においては、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。本明細書で使用する「精製された」という用語は、哺乳動物細胞又は組換え宿主細胞から単離できるタンパク質様組成物であって、少なくとも１個のポリペプチドが、その天然で得ることができる状態と比べて、すなわち細胞抽出物内のその純度と比べて、任意の程度まで精製されているタンパク質様組成物を指すことを意図する。従って、精製されたポリペプチドはまた、それが天然に存在する環境に存在しない野生型又は修飾ポリペプチドも指す。

「実質的に精製された」という用語が使用される場合には、これは、特定のポリペプチドが組成物の主成分を形成しており、例えば組成物中のタンパク質の約５０％又はそれ以上を構成している組成物を指すであろう。一つの実施形態において、実質的に精製されたポリペプチドは、組成物中の約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％を超えるか又はさらにそれを超えるポリペプチドを構成するであろう。

本発明に適用されるように、「等質性まで精製される」ポリペプチドとは、ポリペプチドが実質的に他のタンパク質及び生物学的成分を含有していない純度レベルを有することを意味する。例えば、精製されたポリペプチドは、多くの場合、分解配列決定を行うことができるように十分に他のタンパク質成分を含有していないであろう。

ポリペプチドの精製の程度を定量する種々の方法は、本明細書の開示に照らして当業者には公知であろう。これらの方法は、例えば、画分の特異タンパク質活性の測定、又はゲル電気泳動で画分内のポリペプチドの数の評価を含む。

所望のポリペプチドを精製するために、少なくとも幾つかの特定のポリペプチドを含有する天然又は組換え組成物は、種々の他の成分を組成物から除去するために分別に供されるであろう。本明細書において以下に詳細に記載する技法の他に、タンパク質精製に使用するのに適した種々のその他の技法は、当業者には周知であろう。これらの技法は、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた沈殿又は熱変性により、次いで遠心分離、クロマトグラフィー工程、例えばイオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、レクチンアフィニティー及び他のアフィニティークロマトグラフィー工程；等電位点電気泳動、ゲル電気泳動；及びこれら及びその他の技法の組み合わせを含む。

別の例は、特定の結合パートナーを使用する特定の融合タンパク質の精製である。このような精製法は、当該技術では日常的である。本発明は特定のタンパク質についてＤＮＡ配列を提供することから、任意の融合タンパク質精製法が現在実施できる。これは、特定のタンパク質−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の生成、大腸菌での発現及びグルタチオン−アガロース上でアフィニティークロマトグラフィーを使用する等質性までの単離又はタンパク質のＮ末端及びＣ末端上のポリヒスチジン標識の生成並びにその後のＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーを使用する精製によって例示される。しかし、所定の多数のＤＮＡ及びタンパク質は、公知であるか、又は本明細書に記載の方法を使用して同定及び増幅し得、任意の精製法がここで用いることができる。

ポリペプチドが常にその最も生成された状態で提供されることは、一般的要件ではない。実際に、それにもかかわらず天然の状態と比べて所望のタンパク質組成物中に豊富である実質的にあまり精製されていないポリペプチドが、ある一定の実施形態において有用性をもつことが意図される。相対精製の低い度合いを示すポリペプチドは、タンパク質生成物の全ての回収において、又は発現されたタンパク質の活性の維持において利点を有し得る。

組成物を調製する方法であって、（ａ）配列番号：４−１４７のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は２個又はそれ以上のこのような修飾を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを組み立て、（ｂ）前記ポリペプチドを、前記ベクターを含有する宿主細胞中で発現させることからなる方法が、本明細書において提供される。一つの実施形態において、組成物は、このような方法で製造され、前記組成物は、配列番号２又は２００の配列を有するＤＴ分子と比べてヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対して低下した結合活性を有する。また、組成物を調製する方法であって、（ａ）少なくとも１個のＴ細胞エピトープ修飾を有する毒素をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを組み立て、（ｂ）前記ポリペプチドを、前記ベクターを含有する宿主細胞中で発現させることからなる方法が、本明細書において提供される。一つの実施形態において、組成物は、このような方法で製造され、毒素はＤＴＴである。一つの実施形態において、組成物は、このような方法で製造され、前記組成物は、配列番号２又は２００の配列を有するＤＴ分子と比べて低下した免疫原性を有する。

未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を有する修飾毒素を調製する方法が、本明細書において提供される。前記方法は、（ａ）毒素をコードする核酸配列を含有するベクター組み立て、前記修飾ジフテリア毒素は、その中に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する配列番号：２に示すようなアミノ酸配列を有するジフテリア毒素からなり、この場合に少なくとも１個のアミノ酸修飾は、Ｔ細胞エピトープ内で行われ、及びこの場合に前記修飾ジフテリア毒素は、未修飾ジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有し、及び（ｂ）前記のポリペプチドを前記のベクターを含有する宿主細胞中で発現させる工程からなる。

別の実施形態は、未修飾ジフテリア毒素と比べて低下した免疫原性及びヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する低下した結合活性を有する修飾ジフテリア毒素を調製する方法を包含する。前記方法は、（ａ）修飾ジフテリア毒素をコードする核酸配列を含有するベクターを組み立て、前記修飾ジフテリア毒素は、その中に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する配列番号：２又は２００に示すようなアミノ酸配列を有するジフテリア毒素からなり、この場合に少なくとも１個のアミノ酸修飾は、Ｔ細胞エピトープ内、配列番号：２又は２００の残基７−９、２９−３１及び２９０−２９２からなる群から選択される領域の（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフ内、Ｂ細胞エピトープ内、又はこれらの組み合わせ内で行われ、及びこの場合に前記修飾ジフテリア毒素は、未修飾ジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有し、及び（ｂ）前記のポリペプチドを前記のベクターを含有する宿主細胞中で発現させる工程からなる。一つの限定されない例において、修飾されたＶＬＳ（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフは、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｌ及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基によるＶ又はＩの置換である位置（ｘ）での修飾であることができ、及びこの場合に位置Ｄ／Ｅの修飾は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基によるＤ／Ｅの置換である。一つの実施形態において、位置（ｙ）での修飾は、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖ及び表１の修飾又は異常アミノ酸による置換である。

未修飾ジフテリア毒素は、例えば、配列番号：２又は２００のアミノ酸配列あるいは配列番号：４−１４７のいずれか１つのアミノ酸配列を有することができる。

細菌完全毒素及び植物完全毒素は、多くの場合に、２つのジスルフィド結合鎖、すなわちＡ鎖及びＢ鎖を含有する。Ｂ鎖は、細胞結合領域（その受容体は、多くの場合、特定されていない）とトランスロケーション領域の両方を有し、酸性細胞区画の膜を通してＡ鎖の細胞質ゾル内への挿入を促進する。次いで、Ａ鎖は、取り込みの後に細胞を殺す。その生体内使用のために、リガンドと毒素は、血流及び組織を通り抜けながら安定な状態を保つような方法で連結されるが、毒素部分が細胞質ゾル中に放出できるように標的細胞内で不安定である。しかし、薬理学的観点からは、それにもかかわらず適切な生物学的反応を提供することができる最も小さい分子を用いることが望ましいものであり得る。従って、適切な抗細胞応答を提供するであろうより小さいＡ鎖ペプチドを用いることを望むことができる。この目的を達成するために、ＤＴは、「切断する」ことができ、適切な毒素活性をさらに保持できる。所望ならば、この切断Ａ鎖は、本明細書に記載の実施形態に従って融合タンパク質に用いることができることが提案される。

あるいは、毒素部分に対する組換えＤＮＡ技術の応用はさらなる利点を提供し得ることが見出し得る。生物活性ＤＴが現在クローン化され、組換え発現されている点で、現在、それにもかかわらず適切な毒素活性を示すより小さいバリアントペプチド又はバリアントペプチドを同定し、調製できる。また、ＤＴが現在クローン化されている事実は、部位特異的変異誘発の応用を可能にし、それによってＤＴＡ鎖、毒素由来のペプチドを容易に調製し、選別することができ且つ本明細書に記載の化合物と共に使用するための別の有用な部分を得ることができる。同定されると、これらの部分は、ＶＬＳ、ＥＣ損傷活性及び／又は本明細書に記載されているか又は当業者に知られているこのような配列の別の効果を促進する能力の低下を示す毒素を作り出すために突然変異させることができる。

このような方法で調製される修飾ジフテリア毒素と非ジフテリア毒素ポリペプチドからなる融合タンパク質であって、前記非ジフテリア毒素ポリペプチドが、抗体又はその抗原結合断片、ＥＧＦ、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＮＦα、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、エフリン、ＢＦＧＦ、ＴＧＦ及びこれらの細胞結合部分の中から選択されるものである融合タンパク質が、本明細書において提供される。一つの実施形態において、非ジフテリア毒素ポリペプチドは、例えば、ＩＬ−２又はその細胞結合部分である。ある実施形態において、融合タンパク質又は毒素は、さらに、少なくとも別の物質を含有する。このような物質は、分子又は部分、例えば、以下に限定されないが、本明細書のどこかに記載のような少なくとも１個のエフェクター（治療薬部分）又はリポーター分子（検出可能な標識）である。

ＩＸ．検出可能な標識
本発明は、標的エピトープ、例えば罹患組織又は疾患を引き起こす細胞で発現されたエピトープ（例えば、癌細胞表面のＩＬ−２受容体）に対する融合タンパク質を提供する。ある実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載の修飾されたＤＴを含有する。別の実施形態において、融合タンパク質は、さらに第二の物質を含有する。このような物質は、例えば、リポーター分子又は検出可能な標識などの分子又は部分であり得る。リポーター分子は、アッセイを使用して検出できる任意の部分である。ポリペプチドに複合されているリポーター分子の限定されない例としては、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子又はリガンド、例えばビオチンが挙げられる。検出可能な標識としては、その特異的な機能特性、及び／又は化学的特性によって検出できる化合物及び／又は要素が挙げられ、これらの使用は、これらが結合されたポリペプチドを検出すること及び／又は所望ならば定量することを可能にする。多数の適切な検出可能な（造影）物質が、ポリペプチドにこれらを付着させる方法があることから、当該技術において知られている（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号、同第４，９３８，９４８号及び同第４，４７２，５０９号公報参照、それぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。使用される造影部分は、常磁性イオン、放射性同位元素、蛍光色素、ＮＭＲ検出可能物質、Ｘ線造影部分であり得る。アジド基を含有する分子も、低強度紫外線によって生じる反応ナイトレン中間体によってタンパク質に対して共有結合を形成するのに使用できる（Ｐｏｔｔｅｒ＆Ｈａｌｅｙ、１９８３）。特に、プリンヌクレオチドの２−及び８−アジド類縁体が、粗細胞抽出物中のタンパク質を結合するヌクレオチドを同定するために、部位特異的光プローブとして使用されている（Ｏｗｅｎｓ＆Ｈａｌｅｙ，１９８７；Ａｔｈｅｒｔｏｎｅｔａｌ．，１９８５）。２−及び８−アジドヌクレオチドもまた、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインを位置決めするために使用されており（Ｋｈａｔｏｏｎｅｔａｌ．，１９８９；Ｋｉｎｇｅｔａｌ．，１９８９；及びＤｈｏｌａｋｉａｅｔａｌ．，１９８９）、ポリペプチド結合剤として使用できる。

Ｘ．組成物及び治療用途
本明細書に記載の化合物のそれぞれは、許容し得る担体又は賦形剤と組み合わせた場合には組成物として使用できる。このような組成物は、生体外での分析に有用であるし、あるいは開示化合物を用いて被検体を治療するために生体内で又は生体外で被検体に投与するのに有用である。

従って、医薬組成物は、有効成分の他に、製薬学的に許容し得る賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知のその他の物質を含有することができる。このような物質は、無毒性であるべきであり且つ有効成分の効果を妨害しないものであるべきである。担体又はその他の物質の正確な性質は、投与の経路に依存するであろう。

本明細書に記載の方法によって同定される関心のタンパク質、例えば抗体を含有する医薬製剤は、所望の精製度を有するタンパク質を、任意の生理学的に許容し得る担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で保管するよう調製できる。許容し得る担体、賦形剤又は安定剤は、用いられる投薬量及び濃度で受容者に対して毒性がなく、これらとしては、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメソニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニム；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール及びｍ−クレゾール）；低分子量（残基約１０個未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖、二糖及びその他の糖質、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート化剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。

本明細書に記載の製剤は、治療される具体的な適応症について必要に応じて２種類以上の活性化合物を含有することもできる。このような分子は、適宜、意図する目的に有効な量で組み合わせて存在させる。

許容し得る担体は、投与される患者に対して生理学的に許容し得るものであり且つそれと共に／その中に投与される化合物の治療特性を保持する。許容し得る担体及びその製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１９９０）に一般的に記載されている。一つの典型的な担体は、生理学的食塩水である。本明細書で使用する「製薬学的に許容し得る担体」という語句は、体のある器官又は部分の投与部位から体の別の器官又は部分に、あるいは生体外アッセイ系において目的化合物を運ぶ又は輸送することに関与する製薬学的に許容し得る物質、組成物又はビヒクル、例えば液状又は固形充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材料を意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分に適合でき且つ投与される被検体に無害であるという意味で「許容し得る」ものでなければならない。許容し得る担体は、目的化合物の特定の活性を変化させるべきではない。典型的な担体及び賦形剤は、本明細書の他の個所に提供されている。

一つの態様において、医薬投与に適合する、溶媒（水性又は非水性）、溶液、エマルジョン、分散媒、被覆剤、等張及び吸収促進又は遅延剤を含有する製薬学的に許容し得る又は生理学的に許容し得る組成物が、本明細書において提供される。従って、医薬組成物又は医薬製剤とは、被検体において医薬用途に適した組成物を指す。医薬組成物及び製剤は、ある量の本明細書に記載の化合物、例えば有効量の本明細書に記載の修飾融合タンパク質と、製薬学的に又は生理学的に許容し得る担体とを含有する。

組成物は、具体的な投与の経路（全身又は局所）に適合するように製剤化することができる。従って、組成物は、種々の経路による投与に適した担体、希釈剤又は賦形剤を含有する。経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤又は液剤の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンなどの固体担体又は補助剤を含有し得る。液状医薬組成物は、一般に液状担体、例えば水、石油、動物又は植物油、鉱油又は合成油を含有する。生理食塩水溶液、デキストロース又は他の糖溶液又はグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールを含有させ得る。

別の実施形態において、組成物は、組成物中の化合物の安定性を向上させる及び／又は組成物の放出速度を調節することを目的として、必要に応じて、許容し得る添加剤をさらに含有することができる。許容し得る添加剤は、目的化合物の特定の活性を変化させない。典型的な許容し得る添加剤としては、以下に限定されないが、糖、例えばマンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、スクロース、ガラクトース、デキストラン、デキストロース、フルクトース、ラクトース及びこれらの混合物が挙げられる。許容し得る添加剤は、許容し得る担体及び／又は賦形剤、例えばデキストロースと組み合わせることできる。あるいは、典型的な許容し得る添加剤としては、以下に限定されないが、ペプチドの安定性を高め且つ溶液のゲル化を低下させるために界面活性剤、例えばポリソルベート２０又はポリソルベート８０が挙げられる。界面活性剤は、溶液の０．０１％〜５％の量で組成物に添加することができる。このような許容し得る添加剤の添加は、貯蔵中の組成物の安定性及び半減期を高める。

医薬組成物は、皮下に、筋肉内に、腹腔内に、経口的に又は静脈内に投与することができる。組成物のエアロゾル送達も、慣用の方法を使用して本明細書において意図される。例えば、静脈内送達は、現在、カニューレ又は直接注入によるか、あるいは超音波誘導細針によって可能である。Ｍｉｓｈｒａ（Ｍｉｓｈｒａｅｔａｌ．，ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．，３（７）：１１７３−１１８０（２００３））は、腫瘍内注入を提供している。

腸内（経口）投与用の製剤は、錠剤（被覆又は未被覆）、カプセル（硬質又は軟質）、微小球、エマルジョン、粉剤、顆粒剤、結晶、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤に含有させることができる。慣用の非毒性固体担体（例えば、医薬グレートのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムが挙げられる）が、固形製剤を調製するのに使用できる。補足活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）も製剤中に包含させることができる。液状製剤もまた、腸内投与に使用できる。担体は、種々の油、例えば石油、動物油、植物油又は合成油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油から選択することができる。適当な医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールが挙げられる。

注射用組成物としては、水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注射剤溶液又は分散液の即時調製用滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与については、適当な担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）及びこれらの適当な混合物を含有する溶媒又は分散媒であることができる。流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤を使用することによって、分散液の場合には必要な粒度を維持することによって及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。抗菌剤及び抗真菌剤としては、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸及びチメロサールが挙げられる。等張剤、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマニトール、ソルビトール及び塩化ナトリウムを組成物に含有させてもよい。得られる溶液は、そのままで使用するためにパッケージするか又は凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は、後で、投与の前に滅菌溶液と組み合わせることができる。

組成物は、例えば、静脈内に、例えば単位用量の注射によって従来どおり投与できる。注射については、有効成分は、実質的に発熱物質を含有しておらず且つ適当なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容し得る水溶液の形態であることができる。例えば、等張ビヒクル、例えば塩化ナトリウム液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液を使用して適当な溶液を調製できる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又はその他の添加剤を含有させてもよい。

一つの実施形態において、組成物は凍結乾燥される。組成物が、医薬に又は本明細書において提供される種々の方法のいずれかにおける使用に考慮される場合には、組成物は、組成物が炎症反応又は安全でないアレルギー反応を引き起こさないように発熱物質を実質的に含有していないことが意図される。

許容し得る担体は、吸収又はクリアランスを安定させるか、高めるか又は遅らせる化合物を含有することができる。このような化合物としては、例えば糖質、例えばグルコース、スクロース又はデキストリン；低分子量タンパク質；ペプチドのクリアランス又は加水分解を抑制する組成物；賦形剤あるいはその他の安定剤及び／又は緩衝剤が挙げられる。吸収を遅らせる物質としては、例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンが挙げられる。洗浄剤もまた、リポソーム担体を含有する医薬組成物の吸収を安定化させるためにあるいは高めるか又は低下させるために使用できる。消化から保護するために、化合物は、酸及び酵素加水分解に耐性にするために組成物と複合化させることができるし、又は化合物は、適度の耐性担体、例えばリポソーム中に複合化させることができる。化合物を消化から保護する手段は、当該技術で知られている（例えば、治療薬の経口送達用脂質組成物を記載しているＦｉｘ（１９９６）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１３：１７６０−１７６４；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４８：１１９−１３５及び米国特許第５，３９１，３７７号公報参照）。

静脈内注射、又は難儀な部位での注射については、有効成分は、発熱物質を含有しておらず且つ適当なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容し得る水溶液の形態である。当業者は、例えば、等張ビヒクル、例えば塩化ナトリウム液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液を使用して適当な溶液を十分に調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又はその他の添加剤を含有させてもよい。

「製薬学的に許容し得る」という語句は、ヒトに投与した場合に、生理学的に許容でき且つ典型的にはアレルギー性副作用又は同様の有害な副作用、例えば急性胃ぜん動異常亢進、眩暈などを生じない分子実体及び組成物を指す。

治療剤組成物に関して使用される場合の「単位用量」という用語は、ヒトのための単位製剤として適当な物理的に不連続な単位を指し、それぞれの単位は、必要な希釈剤、すなわち担体又はビヒクルと共同して所望の治療効果を生じるために算出された所定量の活性物質を含有する。

組成物は、製剤に適合した方法で及び治療有効量で投与できる。投与される量は、治療される被検体、被検体の免疫系の有効成分を利用する能力及び所望の結合能力の程度に依存する。投与に必要とされる有効成分の正確な量は、開業医の判断に左右され且つそれぞれの個人に特有である。初回投与及び追加免疫接種に適した治療計画は、変更することもできるが、初回投与、次いで次の注射又はその他の投与まで１時間又はそれ以上の時間間隔での反復投与によって代表される。あるいは、多くの場合に、血中に１０ナノモル〜１０マイクロモルの濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が意図される。

医師又は獣医は、必要な組成物の「有効量」（ＥＤ_５０）を容易に決定及び処方することができる。例えば、医師又は獣医は、組成物中に用いられる化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされる量よりも少ない量で開始し、所望の効果が達成されるまで製剤を徐々に増やすことができる。

本明細書で使用する「治療有効量」とは、器官又は組織において所望の治療又は予防効果を少なくとも部分的に達成する量である。一例を挙げれば、疾患の予防及び／又は治療処置を成し遂げるのに必要な修飾ＤＴの量は、それ自体固定されない。投与される修飾ＤＴ融合毒素の量は、疾患の種類、疾患の程度及び疾患を患う哺乳動物の種の大きさと共に変化する。一般に、量は、癌の治療に使用される他の細胞毒性薬物に使用される量の範囲内にあるが、ある場合には、修飾ＤＴ融合毒素の特異性及び高められた毒性のために、より少ない量が必要とされるであろう。ある状況で及び現在利用できる技法、例えば（カニューレ又は対流促進送達、選択的放出）によって達成できるように、増強された局所的に増加させた融合毒素量を特定の部位に送達する試みもまた、望ましいものであり得る（Ｌａｓｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，８７：５８６−５９４１（９９７）；Ｌａｓｋｅｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，３：１３６２−１３６８（１９９７），Ｒａｎｄｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６：２１５７−２１６５（２０００）；Ｅｎｇｅｂｒａａｔｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９７：８４６−８５２（２００２），Ｐｒａｄｏｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＡＳＣＯ，２１：６９ｂ（２００２），Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．ＣＬｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１（２）：７２４−９（１９９３））。

一つの実施形態は、本明細書に記載の状態、疾患又は障害を治療するための医薬を調製するために本明細書に記載の組成物の使用を意図する。医薬は、治療を必要とする患者／被検体の物理的特性に基づいて製剤化することができ、状態、疾患又は障害の段階に応じて単一又は多重製剤に製剤化することができる。医薬は、病院及び診療所に配布するのに適切なラベルを有する適当なパッケージにパッケージすることでき、この場合にラベルは、本明細書に記載の疾患を有する被検体の治療についての表示のためのものである。医薬は、単一又は多数の単位としてパッケージできる。製剤及び組成物の投与についての使用説明書が、以下に記載のようなパッケージに含ませることができる。

発明は、さらに、上記に記載の修飾毒素又はその融合タンパク質と製薬学的に許容し得る担体とを含有する医薬組成物に関する。

滅菌注射剤溶液は、所定量の有効成分を、適切な溶媒に、必要に応じて上記に列記した成分の１つ又は組み合わせと共に混和し、次いで滅菌濾過することによって調製できる。一般に、分散液は、有効成分を、基本分散媒と上記に列記した成分からの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに混和することによって調製される。滅菌注射剤溶液の調製用滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これは有効成分と任意の追加の所望の成分との粉末を、これらの予め滅菌濾過された溶液から生成する。

ある実施形態において、本質的に融合タンパク質を含有する製剤を得るためにこの混合物のさらなる精製である。この精製は、さらなるクロマトグラフ分離によって達成でき、例えば、様々な種の免疫毒素を溶出するために塩濃度勾配を使用するアフィニティークロマトグラフィー及び免疫毒素を大きな分子から分離するゲル濾過によって達成できる。

本明細書に記載の化合物の精製に使用するゲルは、ランダム構造を有する３次元網状構造である。モレキュラーシーブゲルは、分析又は分離される物質と結合又は反応しない架橋重合体である。ゲル濾過用途について、ゲル材料は、一般に荷電されていない。ゲル内の空間は、液体で満たされ、液相はゲル容量の大部分を構成する。ゲル濾過カラムに常用される物質としては、デキストラン、アガロース及びポリアクリルアミドが挙げられる。

デキストランは、グルコース残基から構成される多糖であり、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（ＰｈａｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）という名称で市販されている。そのビーズは、種々の細孔サイズを提供することによって異なる大きさの分子を分離することを目的として、種々の架橋度で調製される。アルキルデキストランは、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを用いて架橋されてＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−Ｓ１００−Ｓ１０００を形成し、これはＳＥＰＨＡＤＥＸが達成できる場合よりも広い範囲で分別する強力なビーズを調製することを可能にする。

ポリアクリルアミドは、ゲル濾過媒体としても使用できる。ポリアクリルアミドは、架橋剤としてＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを用いて調製される架橋アクリルアミドの重合体である。ポリアクリルアミドは、種々の大きさの粒子の分離に使用するために、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）から種々の細孔サイズで入手できる。

ゲル物質は、水及び数種類の有機溶媒の中で膨潤する。膨潤は、細孔が溶出液として使用される液体で満たされてしまうプロセスである。より小さい分子が細孔に入るにつれて、ゲルの中を通るこれらの前進は、細孔に入らない大きい分子に比べて遅れ、分離の基礎をなす。ビーズは、種々の用途に使用される種々の細末度で入手できる。ビーズが粗大であれば粗大であるほど、流れは速く且つ分離が悪い。超微細グレードは、最大分離に使用できるが、流れが極めて遅い。微細グレードは、より早い流速を必要とする大きなカラムでの調製作業に使用される。粗いグレードは、分離が時間よりも重要でない大きな製剤用であるか又は分子量に大きな相違を有する分子の分離用である。

アフィニティークロマトグラフィーは、一般に、リガンド又は抗体などの物質によるタンパク質の認識に基づく。カラム材料は、結合分子、例えば活性化色素を、例えば不溶性マトリックスに、共有結合によって連結することによって合成できる。次いで、カラム材料は、所望の物質を溶液から吸着することを可能にする。次に、条件を、結合が生じない条件に変化させ、基質を溶出させる。首尾よいアフィニティークロマトグラフィーについての必要条件は、マトリックスが分子を吸着しなければならないこと、リガンドがその結合活性を変化させることなく連結されなければらないこと、リガンドがその結合が十分に堅固であるように選択されねばならないこと、及び物質を破壊せずに物質を溶出することができなければならないことである。

本明細書に記載の化合物の一つの実施形態は、マトリックスが反応性色素−アガロースマトリックスであるアフィニティークロマトグラフィー法である。Ｂｌｕｅ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ３ＧＡと、アガロース又はＳＥＰＨＡＲＯＳＥとから構成されるカラムマトリックス）が、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスとして使用できる。また、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＣＬ−６Ｂが、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙからＲｅａｃｔｉｖｅＢｌｕｅ２として入手できる。このマトリックスは、融合タンパク質を直接に結合し、塩濃度勾配を用いて溶出することによって融合タンパク質の分離を可能にする。

修飾毒素を含有する組成物が、本明細書において提供される。一つの実施形態において、修飾毒素は、ジフテリア毒素からなり、前記修飾ジフテリア毒素は、その中に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を有する配列番号２又は２００に示したようなアミノ酸配列を含有し、少なくとも１個のアミノ酸修飾は、Ｔ細胞エピトープ内か、配列番号：２又は２００の残基７−９、２９−３１及び２９０−２９２の中から選択される領域の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内か、Ｂ細胞エピトープ内か、又はこれらの組み合わせで行われ、及び前記修飾ジフテリア毒素は、未修飾ジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する。一つの限定されない例において、修飾ＶＬＳ（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフは、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｌ及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基によるＶ又はＩの置換である位置（ｘ）での修飾を含有し、及び位置Ｄ／Ｅでの修飾は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ及び表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基によるＤ又はＥの置換である。一つの実施形態において、位置（ｙ）での修飾は、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖ、及び表１の修飾又は異常アミノ酸による置換である。

未修飾ジフテリア毒素は、例えば、配列番号：２又は２００のアミノ酸配列を有するか又は配列番号：４−１４７のいずれか１つのアミノ酸配列を有することができる。

組成物は、修飾ジフテリア毒素を含有し、前記組成物は、未修飾ジフテリア毒素と比べて低下した免疫原性、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する低下した結合活性及びこれらの組み合わせを有する。このような組成物は、以下に限定されないが、抗体又はその抗原結合断片、ＥＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＮＦα、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、エフリン、ＢＦＧＦ及びＴＧＦを含有する非ジフテリア毒素ポリペプチドをさらに含有する。非ジフテリア毒素ポリペプチドはまた、このようなポリペプチドの断片、例えばその細胞結合部分であることもできる。一つの実施形態において、非ジフテリア毒素ポリペプチドは、ＩＬ−２又はその細胞結合部分である。

低下した免疫原性、ＨＵＶＥＣに対する低下した結合、又はこれらの組み合わせを有し同時に細胞毒性を維持する修飾毒素及びその融合タンパク質は、種々のリンパ系由来の悪性腫瘍（例えば、癌）、固体腫瘍及び非悪性疾患、例えばＧＶＨＤ又は乾癬の治療に使用できる。

典型的な実施形態において、本発明のＴ細胞エピトープ修飾ＤＴ融合毒素は、医学的障害、例えば、Ｔ細胞リンパ腫などの癌、又は標的リガンドが選択的に結合することができる望まれていない細胞の種類の存在に特徴がある非悪性疾患を患う哺乳動物（例えば、ヒト）などの被検体に投与される。

デニロイキン・ジフチトックスは、以前に治療された皮膚Ｔ細胞リンパ腫を有する被検体を治療するのに有効であることが明らかにされている（ＣｈｉｎａｎｄＦｏｓｓ（２００６）ＣｌｉｎｉｃａｌＬｙｍｐｈｏｍａａｎｄＭｙｅｌｏｍａ，７（３）：１９９−２０４；Ｔａｌｐｕｒｅｔａｌ．，（２００６）Ｊ．ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１２６：５７５−５８３）。簡潔に言えば、デニロイキン・ジフチトクスは、静脈内に、連続３日又は５日間、４μｇ／ｋｇ／日、９μｇ／ｋｇ／日又は１８μｇ／ｋｇ／日の用量で３〜２１サイクル投与された。５１％の全反応率が観察された。デニロイキン・ジフチトクスは、米国において皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療用に米国食品医薬品局によって承認されている。

本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質を投与することによって皮膚Ｔ細胞リンパ腫を有する被検体を治療する方法が、本明細書において提供される。

デニロイキン・ジフチトクスは、再発性／難治性のＴ細胞及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫を有する被検体を治療するのに有効であることが明らかにされている（Ｄａｎｇｅｔａｌ．，（２００６）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１３６：４３９−４４７；Ｄａｎｇｅｔａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２２：４０９５−４１０２）。簡潔に言えば、適格患者は、デニロイキン・ジフチトクス（１８μｇ／ｋｇ／日）を３週毎に５日間、最大８サイクルで受けた。このような治療計画は、患者に十分に耐容用性であり、再発性／難治性のＴ細胞及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫を治療するのに有効であった。

本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質を投与することによって再発性／難治性のＴ細胞又はＢ細胞非ホジキンリンパ腫を有する被検体を治療する方法が、本明細書において提供される。

第ＩＩ相臨床試験において、リツキシマブと組み合わせたＯＮＴＡＫ（登録商標）が、再発性／難治性のＢ細胞非ホジキンリンパ腫を患う患者を治療するのに著しく有効であることが明らかにされた。従って、本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質を投与することによって再発性／難治性のＢ細胞非ホジキンリンパ腫を有する被検体を治療する方法が、本明細書において提供される。

デニロイキン・ジフチトクスは、皮下脂肪組織様Ｔ細胞リンパ腫を有する被検体を治療するのに有効であることが明らかにされている（ＭｃＧｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，（２００２）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１３８：７４０−７４２）。簡潔に言えば、ベキサロテン及びインターフェロンαで以前に治療を受けた女性患者は、治療の２ヶ月以内に再発した。この患者は、次いで、静脈内デニロイキン・ジフチトクス（９μｇ／ｋｇ／日を５日間）の１サイクルの治療を受けた。臨床寛解が、全ての皮膚疾患の消散と共に観察され、全身症状が、デニロイキン・ジフチトクスの第三サイクルの完了の２週間後に得られた。

本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質を投与することによって皮下脂肪組織様Ｔ細胞リンパ腫を有する被検体を治療する方法が、本明細書において提供される。一つの限定されない実施形態において、必要ならば、被検体は、１つ又はそれ以上の他の治療、例えばベキサロテン及び／又はインターフェロンαと組み合わせて治療される。

デニロイキン・ジフチトクスは、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型を有する被検体を治療するのに有効であることが明らかにされている（Ｋｅｒｌｅｔａｌ．，（２００６）Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１５４：９８８−９９１）。簡潔に言えば、急速進行性エプスタイン・バーウイルス陽性鼻型節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫を有する５８歳の男性が、ベキサロテンとデニロイキン・ジフチトクスとの組み合わせを用いて治療された。皮膚腫瘍の著しい退縮が、デニロイキン・ジフチトクスの最初のサイクルの後に観察され、デニロイキン・ジフチトクスの月１回のサイクルで５ヶ月間維持された。

本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質をベキサロテンと組み合わせて投与することによって節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型を有する被検体を治療する方法が、本明細書において提供される。

デニロイキン・ジフチトクスは、以前に治療された慢性リンパ球性白血病を有する被検体を治療するのに有効であることが明らかにされている（Ｆｒａｎｋｅｌｅｔａｌ．，（２００６）Ｃａｎｃｅｒ，１０６（１０）：２１５８−２１６４）。簡潔に言えば、デニロイキン・ジフチトクスは、６０分の静脈内輸液として２１日毎に５日間、１８μｇ／ｋｇ／日の用量で最大８サイクル投与された。全体として、患者は、末梢慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞の減少、リンパ節サイズの減少、及びある場合には、骨髄生検から時間と共に確認される寛解を示した。ある場合には、治療された患者は、フルダラビンに対して化学療法抵抗性であった（Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．，（２００４）Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，９（１０Ｐｔ１）：３５５５−３５６１）。

本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質を投与することによって慢性リンパ球性白血病を有する被検体を治療する方法が、本明細書において提供される。

デニロイキン・ジフチトクスは、ヒトＴ細胞リンパ球指向性ウイルス１関連急性Ｔ細胞白血病／リンパ腫を有する被検体を治療するのに有効であることが明らかにされている（Ｖｅｎｕｔｉｅｔａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，４（３）：１７６−１８０）。簡潔に言えば、４サイクルのデニロイキン・ジフチトクスが投与され、これは標準血圧の回復及び骨髄線維症の縮小をもたらした。疾患進行後、４サイクルのハイパーＣＶＡＤ（多分割シクロホスファミド／ドキソルビシン／ビンクリスチン／デカドロン）が投与され、完全臨床寛解が達成された。患者は、デニロイキン・ジフチトクスによる維持療法を１年間受けた。

ハイパーＣＶＡＤ療法と組み合わせて本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質を投与することによってヒトＴ細胞リンパ球指向性ウイルス１関連急性Ｔ細胞白血病／リンパ腫を有する被検体を治療する方法が、本明細書において提供される。

デニロイキン・ジフチトクスは、固体腫瘍を有する被検体を治療するのに有効であることが明らかにされている（ＥｋｌｕｎｄａｎｄＫｕｚｅｌ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＴｈｅｒ．，２００５Ｆｅｂ；５（ｌ）：３３−８）。従って、本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質を投与することによって１種又はそれ以上の固体腫瘍を有する被検体を治療する方法が、本明細書において提供される。典型的な固体腫瘍としては、以下に限定されないが、皮膚、黒色腫、肺、膵臓、乳房、卵巣、結腸、直腸、胃、甲状腺、喉頭、卵巣、前立腺、結腸直腸、頭部、頸部、眼、口、咽頭、食道、胸部、骨、精巣、リンパ、骨髄、骨、肉腫、腎臓、汗腺、肝臓、腎臓、脳、消化管、上咽頭、尿生殖路、筋肉及びその他の組織の中から選択される組織又は器官の固形腫瘍が挙げられる。

急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）は、デニロイキン・ジフチトクスによって認識されるＩＬ−２に対して高親和性の受容体を発現する活性化Ｔ細胞によって部分的に介在される。ステロイド耐性ａＧＶＨＤを患う患者の第ＩＩ相試験において、１群の患者を、４．５μｇ／ｋｇを１日１回、１〜５日、次いで週１回、試験８日目、１５日目、２２日目及び２９日目にの用法で治療した。別の群の患者を、上記と同じ投与スケジュールで９μｇ／ｋｇの用法で治療した。反応を、３６日目及び１００日目に評価した。患者の４１％が反応し、全員が３６日目で完全寛解し、２７％の患者が１００日目で反応する（完全寛解４人及び部分寛解２人）。

本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質を投与することによってａＧＶＨＤを有する被検体を治療する方法が、本明細書において提供される。

乾癬は、Ｔ細胞が皮膚の抗原提示細胞によって慢性的に刺激される免疫介在皮膚疾患である。乾癬は、間欠治療を必要とする慢性の再発性疾患である。デニロイキン・ジフチトクスは、活性化Ｔ細胞を効果的に標的とすることが明らかにされ、乾癬を好転させた。しかし、治療の副作用が血管漏出症候群であった（ＷａｌｓｈａｎｄＳｈｅａｒ．（２００４）ＣＭＡＪ、１７０（１３）：１９３３−１９４１）。重篤な乾癬を患う患者の第ＩＩ相試験において、３５人の患者を、ＯＮＴＡＫ（登録商標）の３種類の用量（０．５、１．５又は５μｇ／ｋｇ／日）の１つを用いて治療し、８週間１週当たり３種類の用量を受けさせた。患者１５人（５又は１．５μｇ／ｋｇ／日を用いて治療した）中８人が、乾癬面積及び重症度指数（ＰｓｏｒｉａｓｉｓＡｒｅａａｎｄＳｅｖｅｒｉｔｙＩｎｄｅｘ）（ＰＡＳＩ）及び医師総合評価（Ｐｈｙｓｉｃａｉｎ’ ＧｌｏｂａｌＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＰＧＡ）により測定される症状の５０％を超える減少を示した。４人の患者（全員が、５μｇ／ｋｇ／日の用量で治療を受けた）が、５段階ＰＧＡ尺度で２段階病状改善の恩恵を受けた。

本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質を投与することによって乾癬を有する被検体を治療する方法が、本明細書において提供される。

また、本明細書に記載の非免疫原性ＤＴ融合タンパク質を投与することによって維持治療を提供する方法が、本明細書において意図される。

Ｄａｎｎｕｌｌら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１５（１２）：３６２３−３６３３（２００５））によって報告されているように、ＲＮＡ移入樹状細胞（ＤＣ）を用いた免疫処置は、転移性癌を有する患者において強いＴ細胞応答を刺激する効果的な方法である（Ｓｕｅｔａｌ．，２００３．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６３：３１２７−２１３３；Ｈｅｉｓｅｒｅｔａｌ．，２００２．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０９：４０９−４１７）。ＩＬ−２受容体α鎖を構成的に発現するＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ２５）は、調節能力において、他のＴ細胞の活性化及び機能を抑制することによって機能する（Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．２００１．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９３：Ｆ４１−Ｆ４６）。これらの生理学的役割は、正常組織によって発現される抗原に対する免疫反応を調節することによって自己免疫の発生から宿主を保護することにある（Ｊｏｎｕｌｅｉｔｅｔａｌ．，２０００．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２：１２１３−１２２２；ＲｅａｄａｎｄＰｏｗｒｉｅ．２００１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６４４−６４９）。腫瘍抗原は大部分が自己抗原であることから、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）もまた腫瘍を有する宿主が効果的な抗腫瘍免疫反応を開始することを防止し得る。過去の研究により、増加させた数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇが進行癌患者で認めることができること（Ｗｏｏｅｔａｌ．，２００２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：４２７２−４２７６）及び高いＴｒｅｇ頻度が生存率の低下に関連すること（Ｃｕｒｉｅｌｅｔａｌ．，２００４．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９４２−９４９）が明らかにされている。腫瘍増殖の制御におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの重要な役割は、抗ＣＤ２５抗体を使用するＴｒａｇの欠乏がマウスにおいて効果的な抗腫瘍免疫を誘発できることを実証することによってさらに強調された（Ｓｈｉｍｉｚｕｅｔａｌ．，１９９９．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：５２１１−５２１８；Ｏｎｉｚｕｋａｅｔａｌ．，１９９９．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５９：３１２８−３１３３）。また、抗ＣＤ２５療法は、ＧＭ−ＣＳＦ分泌Ｂ１６腫瘍細胞の治療効果を高め及び腫瘍を有する動物の生存を延ばした（Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒｅｔａｌ．，２００１．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９４：８２３−８３２）。累積的に、これらの実験データは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの優先的な欠乏を招く薬剤、例えばＩＬ−２受容体ＣＤ２５サブユニットを発現する細胞を標的とする化合物の投与によって癌治療の有効性を高めることができることを示唆している。

組換えＩＬ−２ジフテリア毒素は、転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）患者においてＣＤ２５発現Ｔｒｅｇを排除するためにＤＡＢ３８９ＩＬ−２（デニロイキン・ジフチトクス及びＯＮＴＡＫ（登録商標）としても知られている）を複合する。高親和性ＩＬ−２受容体に対する結合、その後の内在化、及びタンパク質合成の酵素阻害の結果としてＤＡＢ３８９ＩＬ−２の細胞毒性作用が生じ、最終的に細胞死に至る。

ＤＡＢ３８９ＩＬ−２が、ＣＤ２５の中間又は低レベル発現で他のＰＢＭＣ又はＣＤ４＋Ｔ細胞に対する明らかなバイスタンダー毒性なしに、用量に依存した形でヒトＰＢＭＣからＴｒｅｇを選択的に排除することが明らかにされた。Ｔｒｅｇの欠乏は、生体外で増殖性及び細胞毒性Ｔ細胞応答の高められた刺激をもたらしたが、ＤＡＢ３８９ＩＬ−２がＴ細胞初回刺激段階に先立って使用され且つＴ細胞初回刺激中に除かれた場合のみであった。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２、次いで腫瘍ＲＮＡ移入ＤＣを用いた免疫処置によるＲＣＣ患者のＴｒｅｇの欠乏は、腫瘍ＲＮＡ移入ＤＣ単独の投与と比べると腫瘍特異的Ｔ細胞の刺激の向上を招いた。ＣＤ４＋ＣＤ２５高Ｔｒｅｇは、ＤＡＢ３８９ＩＬ−２の単回投与を使用して、明らかなバイスタンダー毒性なしに及びＣＤ２５を発現する他の細胞の機能に影響を及ぼすことなく排除できる。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２は、ＲＣＣ患者の末梢血に存在するＴｒｅｇの数を著しく減少させ、末梢血由来のＦｏｘＰ３転写物の量を減少させ及び生体内でＴｒｅｇ介在免疫抑制活性を抑止した。また、ＤＣを単独で受け入れている被検体と比べた場合に、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の著しく高い頻度は、併用ＤＡＢ３８９ＩＬ−２及びＤＣ免疫処置を用いて治療された患者において測定できる。また、併用療法後にＣＤ４＋Ｔ細胞応答の改善の傾向があった。

新生細胞に対する同種免疫は、エフェクターＴ細胞と調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の間のバランスに依存する。Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクターＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を直接抑制することによって正常細胞及び新生細胞に対する免疫攻撃を防止する。組換えインターロイキン２／ジフテリア毒素複合体（ＤＡＢ／ＩＬ２；デニロイキン・ジフチトクス；ＯＮＴＡＫ（登録商標））の使用が、Ｔｒｅｇ細胞を欠乏させ且つヒトの新生物性腫瘍に対する免疫寛容を破壊する方法として研究された。ＤＡＢ／ＩＬ２（１２μｇ／ｋｇ；毎日４回投与：２１日サイクル）を、転移性黒色腫を有する患者１６人に投与し、数個のＴ細胞サブセットの末梢血濃度及び全身腫瘍組織量に対する影響を測定した。

Ｒａｓｋｕら（Ｊ．ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃｎｅ；６：１２（２００８））は、ＤＡＢ／ＩＬ２がＴｒｅｇ細胞及び全ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の一時的欠乏（＜２１日）を生じたことを見出した。Ｔ細胞の再増殖は、４量体ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ及びｇｐ１００ペプチド／ＭＨＣ複合体を使用してフローサイトメトリーで測定されるように、数人の患者における黒色腫抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の新たな出現と一致した。１６人の患者は、少なくとも１サイクルのＤＡＢ／ＩＬ２を受け入れ、これらの患者の中の５人は、ＣＴ及び／又はＰＥＴ画像化によって測定されるように黒色腫転移の退縮を経験した。１人の患者は、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の新たな出現に関連した幾つかの肝及び肺転移の退縮と共にほぼ完全な寛解を経験した。ただ一つの転移性腫瘍がこの患者に残り、外科切除後に、免疫組織化学分析により、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって取り囲まれたＭＡＲＴ１＋黒色腫細胞が明らかにされた。癌患者のＴ細胞の一時的欠乏は、同種免疫の恒常性制御を混乱させ、新生細胞に対する特異性を有するエフェクターＴ細胞の膨張を可能にし得る。

最近の研究は、自然に誘発される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異免疫の欠如は、単なる受動的プロセスではないこと実証している。Ｂａｒｎｅｔｔら（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５４（６）３２１（２００５））は、腫瘍がＴＡＡ特異的免疫寛容の誘導によってＴＡＡ特異免疫の誘導を積極的に抑制することを実証した。この免疫寛容は、部分的には調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）によって介在される。Ｂａｒｎｅｔｔらは、デニロイキン・ジフチトクス（ＯＮＴＡＫ（登録商標））を使用してヒト癌、例えば卵巣癌においてＴｒｅｇを欠乏させると免疫を高めるという証拠を示した。

ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、効果的な抗腫瘍免疫の欠如に関与している（Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ；１１０（９）：３１９２−２０１）。デニロイキン・ジフチトクス（ＤＡＢ（３８９）ＩＬ−２）は、Ｔｒｅｇ細胞を標的とする手段を提供する。正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓、末梢血及び骨髄のＴｒｅｇ細胞は、デニロイキン・ジフチトクスの単回腹腔内注射後に種々に減少した。その減少は、２４時間以内にはっきり現れ、約１０日持続した。他の薬剤を用いた免疫処置の１日前のデニロイキン・ジフチトクスの注射は、免疫処置単独で誘発させたレベルを超えて抗原特異的Ｔ細胞応答を高めた。Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒらは、マウスモデルにおいて、種々の細胞区画のＴｒｅｇ細胞に対するデニロイキン・ジフチトクスの異なる効果、抗原特異的Ｔ細胞免疫反応を高めるためにデニロイキン・ジフチトクスを他の薬剤と組み合わせる利点、生きているウイルスベクターに対する宿主免疫反応のデニロイキン・ジフチトクスによる阻害の欠如及び免疫原と併用した場合のデニロイキン・ジフチトクスの投与計画の重要性を実証した。

Ｔｒｅｇは、増殖しつつある腫瘍細胞に対する免疫反応を調節し、場合によっては抑制する不可欠な部分であることが明らかにされている。Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ；３３３（１−２）：１６７−７９（２００８））は、３つのＴｒｅｇ欠乏及び／又は排除の方法、すなわち低用量シクロホスファミド（ＣＹ）を利用する方法、Ｔｒｅｇ（ＰＣ６１）表面に見出されるＩＬ−２受容体に対する特異抗体を利用する方法及びデニロイキン・ジフチトックス（ＤＤ）を使用する方法を比較した。Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａは、ＤＤの利用は他のＴ細胞サブセットに対する並行殺細胞作用なしに、＞５０％のＴｒｅｇ細胞減少をもたらすが、Ｂ１６黒色腫に対する抗腫瘍免疫を高めないことを実証した。最後に、ＰＣ６１は、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の全体数の減少なしに、他の試薬よりも長く持続したＴｒｅｇの中程度の減少を示した。

本明細書に記載のＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質を投与することによって抗癌剤（例えば、ＲＮＡ移入ＤＣ、抗ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲｓｃＦｖｓなど）の活性を高める方法が、本明細書において提供される。一つの実施形態において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質が投与され、次いで抗癌剤が投与される。一つの限定されない例において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質は、抗癌剤の少なくとも４日前に投与される。

また、抗癌剤（例えば、ＲＮＡ移入ＤＣ、抗ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲｓｃＦｖｓなど）と、本明細書に記載のＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質とを投与することによってＴｒｅｇの減少又は排除により転移性癌を治療する方法が、本明細書において提供される。転移性腫瘍としては、例えば、転移性腎細胞癌、転移性前立腺癌、転移性卵巣癌及び転移性肺癌が挙げられる。一つの実施形態において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質が投与され、次いで抗癌剤が投与される。一つの限定されない剤において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質は、抗癌剤の少なくとも４日前に投与される。

別の態様において、抗癌剤（例えば、ＲＮＡ移入ＤＣ、抗ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲｓｃＦｖｓなど）と、本明細書に記載のＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質とを投与することによってＴｒｅｇの減少又は排除により前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍又は黒色腫を治療する方法が、本明細書において提供される。一つの実施形態において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質が投与され、次いで抗癌剤が投与される。一つの限定されない剤において、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質は、抗癌剤の少なくとも４日前に投与される。

このような成分の毒性及び治療効果は、ＬＤ_５０（集団の５０％を死に至らせる用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％に治療効果がある用量）を調べるための細胞培養又は実験動物での標準的薬学的手法によって調べることができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。中毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、非癌性細胞及びあるいは正常細胞に対する可能性のある損傷を最小限にする目的で影響を受けた罹患組織の部位にこのような化合物を標的として向け、それによって副作用を軽減する送達システムを設計することに留意するべきである。

細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用する範囲の投薬量を製剤するのに使用できる。このような化合物の投薬量は、毒性をほとんど又は全く有せずＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、用いる剤形及び利用する投与の経路に応じてこの範囲内で変化させ得る。本発明の方法で使用する任意の化合物について、治療有効量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で及び実施例４に以下に示すように測定されるようなＩＣ_５０（すなわち、症状の最大半分の阻止を達成する試験化合物の濃度）を含む血中血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて処方し得る。このような情報は、ヒトに有用な用量をより正確に決定するのに使用できる。血漿中濃度は、例えば、高性能液体クロマトグラフィーで測定し得る。

本出願の化合物及び方法の実施形態は、例証することを意図するものであり、限定することを意図するものではない。修飾及び変化は、タンパク質融合毒素の組み立てにおいてＤＴ担毒体として使用できることに関して機能的にほぼ未変性であることを維持しながら、低下した免疫原性及び／又は減少したＨＵＶＥＣ結合をもたらすことができるＴ細胞エピトープ配列、記載のＶＬＳ配列及びＢ細胞エピトープ配列に対する記載の修飾の周囲のＤＴ担毒体における改変に関与し得る上述の教示に照らして当業者が行うことができる。

本明細書に記載の化合物及び方法、他の目的、例えば選択された細胞集団に対する他の新規な分子の送達に使用できることも、当業者には考えられる。

本出願は、免疫処置の実施形態において使用する組成物を意図する。１個又はそれ以上の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ及び／又はフランキング配列における変化によってＶＬＳ又は他の毒性作用を促進するのにあまり効果がないタンパク質様組成物が、毒素に対する免疫反応を刺激する抗原として有用であることが意図される。具体的な実施形態において、１個又はそれ以上の修飾された（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ及び／又はフランキング配列を含有するＤＴは、有用抗原として意図される。好ましくは、組成物は、望まれていない小分子量分子を除去するために広く透析される及び／又は所定のビヒクルへのより容易な配合のために凍結乾燥される。別の実施形態において、免疫処置に１個又はそれ以上の活性部位残基を欠く毒素（すなわち、トキソイド）を使用することもできる。

本明細書に記載の化合物及び方法は、毒素の量が免疫原性、ＶＬＳ又はこれらの組み合わせの潜在能力をできるだけ多く低下させることが望ましい１つ又は複数の臨床状況においてこのような物質を送達するのに使用される状況下で使用できる。この状況において、触媒ドメイン又はその幾つかの部分は、置換され、不活性化され及び所望の物質又は分子と融合される。酸感受性又はプロテアーゼ感受性の切断部位は、触媒ドメインの残部と所望の物質又は分子との間に挿入できる。

本明細書に開示の修飾毒素に連結し得る物質又は分子としては、以下に限定されないが、選択的送達を必要とされるペプチド又はタンパク質断片、核酸、オリゴヌクレオチド、酸非感受性タンパク質、糖タンパク質、タンパク質又は新規な化学実体が挙げられる。

従って、変化は記載された範囲内にある開示された具体的な実施形態において行い得ることが理解されるべきである。
ＸＩ．パッケージ及びキット
さらに別の実施形態において、本出願は、前記の化合物を使用するためのキットに関する。低下した免疫原性、ＶＬＳ促進又は毒性効果、あるいはこれらの組み合わせを示す毒素はキットで提供できる。このようなキットは、すぐ使用でき且つ保存できる容器において、細胞表面の特定の受容体（例えば、癌細胞表面のＩＬ−２受容体）を標的とする融合タンパク質を生成させるために、毒素を特異的細胞結合リガンドと組み合わせるのに使用し得る。従って、キットは、適当な容器手段に、低下した免疫原性、ＶＬＳ促進又は毒性効果、あるいはこれらの組み合わせを有する組成物を含有するであろう。キットは、適当な容器手段に、修飾ＤＴ又はその融合タンパク質を含有し得る。

キットの容器手段は、一般に、少なくとも１個のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器及び／又はその他の容器手段を含み、その中に少なくとも１個のポリペプチドを入れることができ及び／又は好ましくは適宜分注することができる。キットは、商業規模のために厳重な管理に少なくとも１個の融合タンパク質、検出可能部分、リポーター分子、及び／又は任意の他の試薬容器を入れるための手段を含むことができる。このような容器は、所定のバイアルを格納する射出成形及び／又は吹込成形プラスチック容器を含むことができる。キットはまた、キットの材料の使用について印刷物を含めることもできる。

パッケージ及びキットは、医薬製剤中に緩衝剤、防腐剤及び／又は安定剤をさらに含むことができる。キットのそれぞれの要素は、個々の容器内に封入することができ、種々の容器全部を単一の容器内に入れることができる。本発明のキットは、冷却保存又は室温保存用に設計することができる。

また、製剤は、キットの保存寿命を高めるために安定剤（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含有する。組成物が凍結乾燥される場合には、キットは、凍結乾燥製剤を再構成するために溶液の別の製剤を含有することができる。許容し得る再構成溶液は、当該技術では周知であり、例えば、製薬学的に許容し得るリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。
また、本明細書において提供されるパッケージ又はキットは、さらに、本明細書において提供される他の部分のいずれか、例えば１個又はそれ以上のリポーター分子及び／又は１個又はそれ以上の検出可能な部分／物質を含むことができる。

パッケージ及びキットは、さらに、アッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイ、細胞毒性アッセイ、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性アッセイなどのための１個又はそれ以上の要素を含有することができる。本出願において試験される試料としては、例えば、血液、血漿及び組織切片並びに分泌物、尿、リンパ液及びこれらの産物が挙げられる。パッケージ及びキットは、さらに試料採取用の１個又はそれ以上の要素（例えば、注射器、カップ、綿棒など）を含むことができる。

パッケージ及びキットは、さらに、例えば製品説明、投与の方法及び／又は治療の適応を明記しているラベルを含むことができる。本明細書において提供されるパッケージは、本明細書に記載の組成物のいずれかを含むことができる。パッケージは、さらに、癌を治療するためのラベルを含むことができる。

「パッケージ材料」という用語は、キットの要素を格納する物理的構造を指す。パッケージ材料は、要素を滅菌的に保持することができ、このような目的に常用される材料（例えば、紙、波形繊維、ガラス、プラスチック、箔、アンプルなど）からなることができる。ラベル又はパッケージ挿入物は、適切な取扱説明書を含むことができる。従って、キットは、本発明の任意の方法においてキット要素を使用するためのラベル又は取扱説明書をさらに含むことができる。キットは、本発明の任意の方法において化合物を投与するための取扱説明書と一緒に化合物をパック又はディスペンサーに含むことができる。

取扱説明書としては、本明細書に記載の方法のいずれか、例えば治療方法を実施するための取扱説明書を挙げることができる。取扱説明書は、さらに、十分な臨床指標又は起こり得る有害症状の表示、あるいはヒト被検者に使用するために食品医薬品局などの監督官庁によって要求される追加情報を含むことができる。

取扱説明書は、「印刷物」、例えばキット内又はキットに貼付された紙又は厚紙であるか、あるいはキット又はパッケージ材料に貼付されたラベルであるか、あるいはキットの要素を含むバイアル又は管に取り付けられたラベルであってもよい。取扱説明書は、さらに、コンピューター読み取り可能媒体、例えばディスク（フロッピー（登録商標）ディスク又はハードディスク）、光学ＣＤ、例えばＣＤ−又はＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープ、電気的保存媒体、例えばＲＡＭ及びＲＯＭ、ＩＣチップ及びこれらのハイブリッド、例えば磁気／光学保存媒体に収納してもよい。

本願発明は、本願発明の代表的な実施形態として提供される以下の限定されない実施例を参照することによってよりよく理解し得る。以下の実施例は、発明の実施形態をより十分に例証することを目的として提示されるが、本願発明の広範な範囲を限定すると解釈されるべきではない。本願発明のある実施形態が本明細書に示され、記載されているが、このような実施形態は、単なる例として提供されることは明らかであろう。多数の変化、変更及び置換は、当業者には発明から逸脱することなく思い付くであろう。本明細書に記載の実施形態の種々の代替が本明細書に記載の方法の実施において用い得ることが理解されるべきである。

ＤＴバリアント及びＤＴ融合タンパク質の組み立て、発現及び精製
ＤＴバリアント及びＤＴ融合タンパク質の組み立て
Ｎ末端のメチオニン残基と、未変性ＤＴのアミノ酸残基１−３８６（配列番号：２）（ここでは先端切断担毒体の残基２−３８７）とを含有する切断ＤＴ型担毒体を、ＤＴ３８７又はＤＴ３８７の残基１−３８２として組み立てる。また、ＤＴ型担毒体は、Ｎ末端のメチオニン残基と、未変性ＤＴのアミノ酸残基１−３８６（配列番号：２）（ここでは先端切断担毒体の残基２−３８７）と、未変性ＤＴの残基４８４−４８５とを含有することができ、ＤＴ３８９として組み立てられる。ＤＴ３８７及びＤＴ３８９は、残基７−９（ＶＤＳ）、残基２９−３１（ＶＤＳ）及び残基２９０−２９２（ＩＤＳ）に３つの（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフを含有する。ＤＴ３８２は、ＤＴ３８７又はＤＴ３８９の残基１−３８２を含有する。本明細書に記載のような他のＣ末端切断ＤＴ構造体が、ＤＴバリアントの機能性を試験するために本明細書において提供されるアッセイで使用できる。ＤＴ３８９に行った修飾は切断構造体（例えば、ＤＴ３８２）でも行うことができ、機能性について試験できることが理解されるであろう。図３１に、野生型ＤＴ３８２、ＤＴ３８２バリアント及びヌル構造体ＤＴ３８２（Ｇ５３Ｅ）のアミノ酸配列を示す。下線を付した配列は、ベクター／標識配列であり、エンテロキナーゼ切断部位をイタリック体で強調し、及びＷＴ配列由来の突然変異をボールド体で示す。

部位特異的変異誘発を用いてＤＴの（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフを変化させる。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを使用して、突然変異体を組み立てる。オリゴヌクレオチドプライマーを、ＶＬＳに関与する（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフ内のコード残基を変化させるために設計する。

配列番号：４−１４７を、限定されない典型的な修飾ＤＴ及び対応するアミノ酸配列のリストに示す。

突然変異体を、ヒトインターロイキン２（配列番号：３）又はその細胞結合部分をコードする配列に遺伝子融合されたタンパク質融合毒素に関連して試験する。ＤＴ融合タンパク質を発現させ、精製する。

ＤＴバリアント及びＤＴ融合タンパク質の発現及び精製
切断及び／又は修飾ＤＴタンパク質、修飾ＤＴ突然変異体及び修飾ＤＴ融合タンパク質をコードするプラスミド構造体を、大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞内に形質転換する。大腸菌ＨＭＳ１７４は、組換えタンパク質の過剰発現を達成できるプロテアーゼ欠失株である。組換えタンパク質の発現の誘導は、大腸菌ＨＭＳ１７４にイソプロピルチオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）を加えることによって得られる。インキュベーションの後に、細菌細胞を遠心分離によって収穫し、溶解し、組換えタンパク質を、ＭｕｒｐｈｙとｖａｎｄｅｒＳｐｅｋによって報告された封入体製剤（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＢａｃｔｅｒｉａｌＴｏｘｉｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１４５：８９−９９Ｈｕｍａｎａｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（２０００））からさらに精製する。ＨＵＶＥＣに対する効果がＶＬＳに由来し、内毒素が存在することによらないことを確実にするためにタンパク質製剤から内毒素を除去することが必要であり得る。内毒素は、イオン交換樹脂を通すことによって＜２５０ＥＵ／ｍｌまで除去される。全長物質から分解産物の分離が、イオン交換クロマトグラフィー中に生じる。イオン交換樹脂を用いた別の最終精製の後に、内毒素は、＜２５ＥＵ／ｍｌに減少し、担毒体は、ＶＬＳについて生体外でのＨＵＶＥＣ細胞結合の関数として試験される。ＤＴ_３８７又はＤＴ_３８９担毒体の分析は、前記の方法からの試料が本明細書に記載の及び当該技術で公知の慣用の方法を使用してＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離される場合には、クーマシーブルー染色及びウェスタンブロットを使用して行うことができる。

ＤＴ_３８７又はＤＴ_３８９担毒体のリボシルトランスフェラーゼ活性に影響を及ぼさない適切な発現を有する安定な構造体をもたらす突然変異は、その後に、対応するＶＬＳ修飾ＤＴ−ＥＧＦ及びＶＬＳ修飾ＤＴ−ＩＬ−２タンパク質融合毒素（それぞれ実施例５）において標的とした細胞毒性について試験することができる。

細胞透過性アッセイ
ヒト血管内皮細胞をＥＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄから得られる）中に保持する。サブコンフルエント初期継代細胞を、プラスチック製カバースリップ上に、同等のＴ細胞数で接種する。精製した、内毒素を含有していない野生型ＤＴ担毒体及び突然変異体を、化学的結合によって蛍光標識Ｆ−１５０（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ）で標識する。ＨＵＶＥＣを、等量の標識担毒体と共にインキュベートする。次いで、培地を吸引し、次いで細胞を洗浄し、固定し、分析のために調製した。異なる処理群からのカバースリップ上の細胞の検査は、蛍光担毒体で標識された細胞の数の分析を可能にする。標的リガンドは担毒体表面に存在せず、従ってＨＵＶＥＣ相互作用のレベルは、ＨＵＶＥＣに対する担毒体親和性にのみ比例する。比較を、蛍光顕微鏡を使用し、少なくとも１０個の独立した領域、異なるカバースリップ又は異なるスライドから標識された細胞の数を比較することによって行った。特に突然変異体構造体の場合には、細胞標識は容易に見えないので、ＤＡＰＩ染色剤を使用して細胞を局在化する。４’−６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）は、天然二本鎖ＤＮＡと蛍光複合体を形成することが知られている。それ自体ＤＡＰＩは、細胞化学的検討における有用なツールである。ＤＡＰＩがＤＮＡに結合すると、その蛍光は強く増強される。従って、ＤＡＰＩは細胞核を標識する方法として役立つ。それに対して、Ｆ−１５０ＤＴ担毒体で処理された細胞は、容易に観察される。突然変異体ＤＴ担毒体構造体の定量化を促進するために、シグナル強度及びバックグラウンドシグナルの変化もまた増大させる。

ＨＵＶＥＣ単層の形態に対するＤＴバリアントＩＬ−２融合タンパク質の影響も、例えばＢａｌｕｎａら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ．，１８：３５５−３６１，１９９６）及びＳｏｌｅｒ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．，２０６：２２７−２３４，１９９３）によって報告された方法に従って評価できる。ＤＴのＶＬＳ配列及びＩＬ−２がＨＵＶＥＣを損傷するか否かを調べるために、単層を、種々の濃度のＤＴバリアント、ＤＴバリアント−ＩＬ−２−融合タンパク質又は対照と共にインキュベートする。ＨＵＶＥＣを単離し、培養し、顕微鏡で調べた。簡潔に言えば、ＨＵＶＥＣ単層を、１０^−６Ｍのそれぞれのバリアント、融合タンパク質、対照、又は培地単独と共に３７℃で１８時間インキュベートし、次いで位相顕微鏡（２０倍の倍率）で調べる。正常な単層は、細長い形を有する高密集細胞からなり、これに対して損傷した細胞は、丸まり、プレートから引き離れる。未処理ＨＵＶＥＣは、密集している細長い細胞からなる。単層は、２時間のインキュベーション後に細胞球状化について２時間後に評価することができ及び単層中の間隙の形成について１８時間後に評価することができる。ＨＵＶＥＣに対する毒性効果を評価する。

内皮単層の透過性を生体外で測定する別の方法は、既に詳細に記載されている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２９：２３７−２４９（１９８６）；Ｄｏｗｎｉｅｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７（１）５８−６５（１９９２））。記載されている種々の培地と共にインキュベーションの後に、密集内皮細胞を含有するフィルターをＰＢＳで２回洗浄する。次いで、結合した内皮細胞を有するフィルターを改変フラックスチャンバーに取り付け、このチャンバーを培養皿に入れる。チャンバーの上部ウエルに、５０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有する血清無含有培地を満たす。この皿に、上記と同じ培地を満たす。攪拌バーを下部ウエルに加え、チャンバー全体を電気攪拌装置上に置き、３７℃でインキュベートする。前記チャンバーを、上部ウエルとビーカーの周囲液体の間の培地の量が同じになるまでインキュベートする。従って、上部ウエルと下部ウエルの間に静水圧の差は存在しない。この平衡時間後に、上部ウエルの培地の少量のアリコートを取り出し、［^１２５Ｉ］ウシ血清アルブミン（３０，０００ｃｐｍ／ｍｌ）を含有する培地に置き換える。放射性標識アルブミンを、使用直前に１ＭのＰＢＳに対して十分に透析する。試験の終了後に透析［^１２５Ｉ］アルブミン及び下部ウエルの培地のクロマトグラフ監視により、アルブミンとの同時クロマトグラフ（Ｆｒｉｅｄｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２９：２３７−２４９（１９８６））に対して＞９５％の^１２５Ｉが実証される。^１２５Ｉプローブの添加の１０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分及び２４０分後に、上部ウエル及び下部ウエルの両方から培地の少量のアリコート（三重反復で）を連続的に取り出す。それぞれのアリコートの［^１２５Ｉ］活性をガンマ計数器で測定し、上部ウエル及び下部ウエルからの試料について平均ｃｐｍ／ｍｌを測定する。実験培地を使用してバックグラウンドについて適切な補正を行う。ＢＰＡＥＣ単層の［^１２５Ｉ］アルブミン移動速度を、９０分〜２４０分の定常状態クリアランスに全体にわたる上部ウエル／時間のカウント数に対する下部ウエルのカウントの出現の速度として表す（Ｆｒｉｅｄｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２９：２３７−２４９（１９８６））。それぞれのアルブミン移動速度点（「ｎ」）は、１つの群内の二重反復フィルターの平均速度を表す。それぞれの群のフィルターは、二重反復対照フィルター（すなわち、希釈剤単独と共にインキュベートしたフィルター上の単層）を含有していた。別のフィルターにおいて、非放射性標識ウシ血清アルブミン（最終濃度１％）を、上部ウエルの［^１２５Ｉ］ウシ血清アルブミンと共に加える。単層を渡る［^１２５Ｉ］アルブミン移動速度を、前記の方法を使用して測定する。内皮単層は、未修飾ＤＴ−ＩＬ−２融合タンパク質と比べてＤＴバリアント−ＩＬ−２融合タンパク質に暴露した後にはより損傷を受けていないことが期待される。

さらに別のアッセイにおいて、ＤＴ−ＩＬ−２の突然変異体の溝（ｃｈａｎｎｅｌ）形成活性を、平面脂質二重層膜系を使用して調べ（ｖａｎｄｅｒＳｐｅｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１２０７７−１２０８２（１９９３）；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１３７：１７−２８（１９９４）；Ｈｕｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１１（９）：８１１−８１７（１９９８））、未修飾ＤＴ−ＩＬ−２と比べる。膜は、ポリスチレンカップに形成される５０−１００μｍの開口部を渡って形成される。中性脂質が除去されたレシチン型ＩＩＳ（Ｓｉｇｍａ）の１％ヘキサン溶液（ＫａｇａｗａａｎｄＲａｃｋｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６：５４７７−５４８７（１９７１））を使用して、開口部の両側を被覆し、乾燥させる。次いで、開口部の外側を、軽質石油中で調製される１．５％スクアレン溶液で被覆する。カップを、ＷａｒｎｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）により調製されるブロックのバックチャンバーに入れる。緩衝液（１ＭＫＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ_２、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）を、カップに開口部レベルの上まで加える（０．５ｍｌ）。ブロックのフロントチャンバーに、ＨＥＰＥＳの代わりに３０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．３）を用いる以外は、上記と同じ緩衝液１．０ｍｌを満たす。レシチンヘキサン溶液の５０μｌのアリコートを、フロントチャンバーの緩衝液の上に積層し、ヘキサンを蒸発させる。次いで、フロントチャンバーの緩衝液の高さを下げ、開口部のレベルの上に上げ、平面脂質二重層を形成する。未修飾ＤＴ−ＩＬ−２融合タンパク質及びそのＤＴバリアント−ＩＬ−２融合タンパク質を、２０〜７３０ｎｇ／ｍｌの濃度でフロントチャンバーに加える。＋６０ｍＶの電圧を、電位固定条件を使用して膜に渡って印加する。カップを入れてあるブロックのバックチャンバーを、仮想接地で保持し、電圧はタンパク質を加えるフロントチャンバーを参照する。電流を、標準法（Ｊａｋｅｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：６９８４−６９９１（１９８９））を使用して監視する。溝の伝導度を、式ｇ＝Ｉ／Ｖ（式中、ｇは伝導度であり、Ｉは膜の中を流れる電流であり、及びＶは膜に渡って印加される電圧である）を使用して測定する。脂質二重層は、ＤＴバリアント−ＩＬ−２融合タンパク質に露出の後に未修飾ＤＴ−ＩＬ−２融合タンパク質と比べてより損傷を受けていないことが期待される。

この実施例は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を試験する方法を説明する。リボソーム不活性化タンパク質毒素、例えばジフテリア毒素は、ペプチド鎖伸長因子２（ＥＦ−２）の共有結合的修飾を触媒する。ＥＦ−２の修飾されたヒスチジン残基のリボシル化は、リボソームでのタンパク質合成を停止し、細胞死をもたらす。ＤＴ_３８７突然変異体の触媒活性を調べるそれぞれのリボシルトランスフェラーゼアッセイは、５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭジチオトレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌ精製ＥＦ−２及び１．０ｐＭ［^３２Ｐ］−ＮＡＤ^＋（１０ｍＣｉ／ｍｌ、１０００Ｃｉミリモル、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中で行う。精製突然変異タンパク質を、４０μｌの最終反応容量で試験する。反応を９６ウエルのＶ底マイクロタイタープレート（Ｌｉｎｂｒｏ）で行い、室温で１時間及びインキュベートする。タンパク質を、２００μｌの１０％ＴＣＡを加えることによって沈殿させ、ガラス繊維フィルターで回収し、放射能を標準プロトコールで測定する。ＡＤＰ−リボシル化を測定する従来の方法は、二本鎖（ｄｓ）活性化因子ＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理した透過性細胞を使用し、放射性標識ＮＡＤ^＋のその後の測定は、酸不溶性物質に取り込ませる。ＦＡＣＳに基づいた方法、例えばＫｕｎｚｍａｎｎら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ＆Ａｇｅｉｎｇ，３：８（２００６））によって報告された方法も利用できる。

修飾ＤＴ−ＩＬ−２融合タンパク質細胞の粗製抽出物に関する細胞毒性アッセイ
ＤＴ３８７又はＤＴ３８９構造体を最初に使用して、修飾担毒体が多数の標的リガンドに化学的に連結することができ、機能的標的毒素を生成することを実証する。ＤＴ３８７リンカーＩＬ−２又はＤＴ３８９リンカーＩＬ−２によって代表されるような一本鎖融合毒素は、複合体毒素の発生において典型的に遭遇するスケールアップ精製の問題を回避する。操作された変化の効果を確認するために、多数の修飾ＤＴ３８７ＩＬ−２融合毒素又はＤＴ３８９ＩＬ−２融合毒素を産生させ、細胞毒性アッセイで試験する。

アミノ酸置換を前記のようにして行い、この変化は融合毒素を産生できない不活性担毒体を生じないことを調べるために、細胞毒性アッセイを行う。

細胞毒性アッセイ
細胞毒性アッセイを、ＨＵＴ１０２／６ＴＧ細胞、すなわち高親和性インターロイキン−２受容体を発現するヒトＨＴＬＶｌ形質転換Ｔ細胞株を使用して行う。ＨＵＴ１０２／６ＴＧ細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地に保持する。細胞を、５×ｌ０^４／ウエルの密度で９６ウエルのＶマイクロタイタープレートに接種する。融合タンパク質毒素を、典型的にはウエルに１０^−７Ｍから１０^−１２Ｍに至るまでの範囲のモル濃度で加える。ウエルの最終容量は、２００μｌである。プレートを、５％ＣＯ_２環境で、３７℃で１８時間インキュベートする。このプレートを遠心分離に供して細胞をペレットし、培地を除去し、１．０μＣｉ／ｍｌ［^１４Ｃ］ロイシン（＜２８０ｍＣｉ／ミリモル、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び２１ｍＭグルタミン、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する２００μｌのロイシン無含有最小必須培地に置き換える。細胞を９０分間振盪し、次いでプレートを遠心分離に供して細胞をペレット化する。上清を除去し、細胞を６０μｌの０．４ＭＫＯＨに溶解し、次いで室温で１０分間インキュベーションする。次いで、１４０μｌの１０％ＴＣＡを各ウエルに加え、さらに１０分、室温インキュベーションを行う。沈降したタンパク質を、ＰＨＤ細胞ハーベスターを使用してガラス繊維フィルターで収集し、取り込まれた放射能を、標準方法を使用して測定する。結果を、対照（タンパク質合成を阻害するために加えられた融合タンパク質はない）［^１４Ｃ］−ロイシン取り込みの割合として報告する。Ｔｏｘｉｌｉｇｈｔ（商標）、Ｖｉａｌｉｇｈｔ（商標）及びＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（商標）キットは、バリアントを評価するために使用できる非放射性市販アッセイである。アッセイは９６ウエルプレートフォーマットで行い、感受性及び耐性細胞株を使用して時間にわたって毒素（１０^−７Ｍ〜１０^−１２Ｍ）を滴定する。

大腸菌から産生された医薬グレードＧＭＰ精製ＤＡＢ_３８９ＩＬ−２は、典型的には５×１０^−１１Ｍ〜１×１０^−１２ＭのＩＣ_５０を生じる。部分精製毒素は、部分精製不均質抽出物において１０〜１００倍低い活性を示す。医薬グレード毒素を等質性まで精製し、再生融合毒素の活性画分を生物活性薬として使用する。上記の実施例において、本発明者らは、ミディアムスループット分析を利用して、部分精製修飾ＤＴ−ＩＬ−２融合毒素の受容体特異的細胞毒性を調べ、それを同様に精製したＤＡＢ_３８９ＩＬ−２の活性と比較した。これらのアッセイは、修飾ＤＴ_３８７リンカーＩＬ−２融合のＤＡＢ_３８９ＩＬ−２に対する匹敵する活性を実証する。特異的細胞毒性の算出は部分融合毒素の試料中のタンパク質の全量に基づくことは、注目されるべきである。アッセイについて、等モル濃度の融合毒素を試験した。

各試料中の非融合毒素タンパク質の相対量は、任意の所定の構造体のＩＣ５０を人為的に変えることができる。すなわち、この分析に使用する試料中の非全長又は非融合毒素タンパク質は、もしかするとＩＣ_５０のわずかな相違を説明するであろう。

大腸菌中で産生された精製ＤＡＢ_３８９ＩＬ−２は、典型的には５×１０^−１１Ｍ〜１×１０^−１２ＭのＩＣ_５０を生じる。

ミディアムスループット細胞毒性アッセイを使用して、修飾ＤＴ−ＩＬ−２融合毒素の粗精製物を分析し、これを同様に精製したＤＴ_３８７リンカーＩＬ−２の活性と比較するた。

残基１９−２１（ＬＤＬ）に配置されたＩＬ−２中に１個の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフが存在することは、注目されるべきである。ＶＬＳに対するＩＬ−２の寄与は、ＩＬ−２中の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフを修飾することによって調べ、上記の細胞毒性アッセイを使用して修飾タンパク質を試験することができる。例えば、ＤＴ_３８７又はＤＴ_３８７リンカーＩＬ−２から誘導される修飾ＤＴ突然変異体を使用して、触媒活性、ＶＬＳ活性及び標的毒素の標的細胞の細胞質ゾルへの効果的な送達に対する突然変異の影響を区別することができる。また、ＤＴ_３８７及びＤＴ_３８７リンカーＩＬ−２の修飾ＤＴ突然変異体同士の間の比較は、担毒体単独の修飾配列の影響を、ＤＴ_３８７リンカーＩＬ−２中に存在するＩＬ−２標的リガンドから区別するであろう。別の例において、ＤＴ_３８９及びＤＴ_３８９リンカーＩＬ−２の両方からから誘導される修飾ＤＴ突然変異体を使用して、触媒活性、ＶＬＳ活性及び標的毒素の標的細胞の細胞質ゾルへの効果的な送達に対する突然変異の影響を区別することができる。また、ＤＴ_３８９及びＤＴ_３８９リンカーＩＬ−２の修飾ＤＴ突然変異体同士の間の比較は、担毒体単独の修飾配列の影響を、ＤＴ_３８７リンカーＩＬ−２中に存在するＩＬ−２標的リガンドから区別するであろう。

この実施例は、本明細書に記載の融合タンパク質の効果を生体内で試験する方法を説明する。ある、血管新生したヒト皮膚をＳＣＩＤマウスに移植し、このマウスに毒素含有融合タンパク質を注射し、移植片中の体液蓄積を湿潤／乾燥重量比として測定することによって生体内でヒト内皮に対する毒素含有融合タンパク質の効果を研究するために、モデルが開発されている（Ｂａｌｕｎａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２２（１）：４１−４７（１９９９））。ヒト皮膚中の体液蓄積は、凍結乾燥の前後の皮膚移植片のパンチ生検の重量を測定することによって測定する。このモデルを使用して、生体内で本明細書に記載の修飾ＤＴ融合タンパク質の効果を評価することができる。

正常ＳＣＩＤマウスの肺の体液蓄積も、ＶＬＳの代用モデルとして使用される。ＩＬ−２は、マウスの肺の体液蓄積を誘発することが明らかにされている（ＯｒｕｃｅｖｉｃａｎｄＬａＩａ，Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒＥｍｐｈａｓｉｓＴｕｍｏｒＩｍｍｕｎｏｌ．，１８（４）：２１０−２２０（１９９５））。肺又は皮膚移植片の含水率は、湿潤／乾燥重量比として算出される。このモデルにおいて、肺血管漏出も、^１２５Ｉ−アルブミンが静脈内注射された肺での蓄積を測定することによって評価される（Ｓｍａｌｌｓｈａｗｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：３８７−３９１（２００３））。

多重アッセイ、例えば生体外細胞毒性アッセイ、生体外血管毒性、生体内マウスモデル及び本明細書に記載の又は当該技術で公知の任意の他のアッセイが、本明細書に記載のＤＴバリアントの機能を試験するのに利用できる。

生体外細胞毒性アッセイ
種々の修飾ＤＴ融合タンパク質の細胞毒性活性は、ＣＤ２２^＋Ｄａｕｄｉ細胞及び先に記載のような［^３Ｈ］−ロイシン取り込みを使用して測定される（Ｇｈｅｔｉｅｅｔａｌ．，１９８８）。未処理対照培養物に対して５０％まで［^３Ｈ］−ロイシン取り込みを減少させる融合タンパク質の濃度は、ＩＣ_５０として定義される。

血管毒性
修飾ＤＴを用いて調製された融合タンパク質の血管損傷を誘発させる能力を評価する最初の段階として、ＨＵＶＥＣを使用する一連の生体外試験を行うことができる。生体外アッセイについて、ＨＵＶＥＣ単層の形態に対する修飾ＤＴ融合タンパク質の効果を、先に記載のようにして試験する（Ｂａｌｕｎａｅｔａｌ．，１９９６）。

生体内アッセイ
修飾ＤＴ融合タンパク質の効果は、ＳＣＩＤ／Ｄａｕｄｉ腫瘍モデルで調べることができる（Ｇｈｅｔｉｅｅｔａｌ．，１９９２）。簡潔に言えば、雌性ＳＣＩＤマウスに、当日に５×１０^６個のＤａｕｄｉ細胞を静脈内注射する（Ｉ．Ｖ．、側尾静脈）。融合タンパク質を、１日目、２日目、３日目及び４日目にＩ．Ｖ．注射する。マウス５匹の群を、それぞれの処理に使用し、試験を反復する。処理群には、（１）未処理（対照）、（２）未修飾ＤＴ融合タンパク質、又は（３）未修飾ＤＴ融合タンパク質を受けさせる。マウスを追跡し，その後肢の麻痺が生じたときに犠牲死させる。ＳＣＩＤマウスの肺血管漏出を記載のようにして評価する（Ｂａｌｕｎａｅｔａｌ．，１９９９）。肺の含水量を、１０μｇ修飾ＤＴ融合タンパク質／マウス体重を注射したマウスから取り出した肺の湿潤／乾燥重量比として算出する。

この実施例は、Ｔ細胞エピトープについて毒素をスクリーニングする方法を説明する。ＭＨＣ、ポリペプチド及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の間の相互作用は、Ｔ細胞認識の抗原特異性のための構造的基礎を提供する。Ｔ細胞増殖アッセイは、ＭＨＣに対するポリペプチドの結合及びＴＣＲによるＭＨＣ／ポリペプチド複合体の認識を試験する。この実施例の生体外でのＴ細胞増殖アッセイは、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）及びＴ細胞を含有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激を含む。刺激は、合成ペプチド抗原を使用して生体外で行う。刺激されたＴ細胞増殖は、^３Ｈ−チミジン（^３Ｈ−Ｔｈｙ）を使用して測定し及び取り込まれた^３Ｈ−Ｔｈｙの存在は、洗浄した固定された細胞のシンチレーション計数を使用して評価する。

１２時間未満の時間保存されたヒト血液のドナープールから軟膜を取得し、毒素のアミノ酸残基配列に対応するポリペプチドライブラリーを、公知の方法で合成するか又は又適切な供給源から得る。軟膜の穏やかな遠心分離によって、赤血球及び白血球を、血漿及び血小板から分離する。上部の相（血漿及び血小板を含有する）を除去し、廃棄する。赤血球及び白血球を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１：１で希釈し、その後に１５ｍｌのフィコール・パーク（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に積層する。遠心分離を、製造業者の推奨する条件に従って行い、ＰＢＭＣを血清＋ＰＢＳ／フィコール・パーク界面から収穫する。ＰＢＭＣを、ＰＢＳ（１：１）と混合し、遠心分離により収集する。上清を除去し、廃棄し、ＰＢＭＣペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁する。細胞を遠心分離によって再度ペレット化し、ＰＢＳ上清を廃棄する。次いで、細胞を５０ｍｌのＡＩＭＶ培地を使用して再懸濁し、この時点で計数し、トリパンブルー色素排除を使用して生存率を評価する。細胞を再度遠心分離によって収集し、上清を廃棄する。細胞を、低温保存用に１ｍｌ当たり３×１０^７個の密度で再懸濁する。保存培地は、９０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＡＢヒト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。細胞を、調節凍結容器に移し、−７０℃で一夜置き、その後に長期保存のために液体Ｎ_２に移す。使用する必要がある場合には、細胞を３７℃の水浴で急速解凍し、その後に１０ｍｌの予熱したＡＩＭＶ培地に移す。

ＰＢＭＣを、９６ウエル平底プレート中でウエル当たり２×１０^５ＰＢＭＣの密度でポリペプチド抗原を用いて刺激する。ＰＢＭＣを３７℃で７日間インキュベートし、その後に^３Ｈ−Ｔｈｙと共に振盪する。毒素の配列全体に及ぶ１２個のアミノ酸の増分を重ね合わせた合成ポリペプチド（１５量体）が生成する。

それぞれのポリペプチドを、２０人の未処置ドナーから単離したＰＢＭＣに対して個々にスクリーニングする。免疫原性であることがすでに明らかにされている２個の対照ポリペプチド及び強力な非想起抗原、ＫＬＨを、各ドナーアッセイで使用する。使用する対照抗原は、Ｆｌｕ赤血球凝集素；クラミジアＨＳＰ６０ペプチド及びキーホール・リンペット・ヘモシアニンである。ポリペプチドを、１０ｍＭの最終濃度までＤＭＳＯに溶解し、次いでこれらの原液をＡＩＭＶ培地に１／５００に希釈する（最終濃度２０μＭ）。ポリペプチドを、平底９６ウエルプレートに加えて１００μｌ中２μＭ及び２０μＭの最終濃度を得る。解凍ＰＢＭＣの生存率を、トリパンブルー色素排除によって評価し、次いで細胞を２×１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、１００μｌ（２×１０^５ＰＢＭＣ／ウエル）を、ペプチドを入れた各ウエルに移す。三重反復ウエル培養物を、それぞれのペプチド濃度で評価する。プレートを、５％ＣＯ_２の湿潤雰囲気で、３７℃で７日間インキュベートする。細胞を、１μＣｉ^３Ｈ−Ｔｈｙ／ウエルと共に１８〜２１時間振盪し、その後にフィルターマット上に収穫する。ＣＰＭ値を、マイクロプレートベータトッププレート計数器を使用して調べる。結果を、刺激指数として表す。刺激指数（ＳＩ）は、試験ペプチドに対して測定される増殖スコア（例えば、放射能の１分当たりのカウント数）を、試験ペプチドと接触していない細胞で測定されるスコアで除算することによって誘導される。

脱免疫処置は、数種のタンパク質、例えば植物毒素（欧州特許出願公開第ＥＰ１７３７９６１号公報）及び細菌（国際公開ＷＯ２００４／０１８６８４号明細書）毒素のＴ細胞エピトープ欠乏バリアントを生じさせるのに首尾よく応用されている。脱免疫処置技術は、例えばＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）（Ａｎｔｉｔｏｐｅ，Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）の開発によって改善されており、Ｔ細胞エピトープを測定するためにより感受性である。

Ｔ細胞エピトープは、点突然変異の導入よりもむしろ複合タンパク質（ＣｏｍｐｏｓｉｔｅＰｒｏｔｅｉｎ）（商標）技術（Ａｎｔｉｔｏｐｅ，Ｌｔｄ）を使用して、他のタンパク質由来の配列セグメントで置換することによって除去することができ、その結果Ｔ細胞エピトープは、タンパク質機能を保持しながら除去することにおいてより可変性のある溶液を提供する。

本明細書に記載の方法は、以下の７段階を使用して低下したＶＬＳ及び低下した免疫原性を有するＤＴバリアントを生じさせることにある。

段階１−ＤＴのＴ細胞エピトープマッピング及び選択されたリガンド、例えばヒトＩＬ−２との連結；
段階２−ＶＬＳ及びＤＴ活性についてのアッセイ；
段階３−多数のバリアント（約１００−２５０個のバリアント）をスクリーニングするのに適したフォーマットで、大腸菌での全ＤＴの遺伝子合成、発現及び精製；
段階４−低下したＶＬＳ（ＨＵＶＥＣ結合アッセイ）についてＤＴバリアントの生成及び試験−バリアントを２回試験する（単一遺伝子座／多重遺伝子座）；
段階５−Ｔ細胞エピトープを除去した後のＤＴバリアントの生成及び試験−バリアントを複数回試験する（単一エピトープ、多重エピトープ、最適化）、第２回目の試験はＶＬＳバリアントとの組み合わせを含む（段階４）；
段階６−段階５からのリードＤＴバリアントと、タンパク質リガンド、例えばヒトＩＬ−２との融合によるリードＤＴ−融合バリアントの生成及びタンパク質精製／試験（この段階は任意である）；並びに
段階７−ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）（野生型先端切断ＤＴ（ΔＲ）の対照）による、リードＤＴ１−３８９（「先端切断ＤＴ（ΔＲ）」）バリアントの免疫原性試験。

ＨＵＶＥＣ結合アッセイでのＶＬＳモチーフに突然変異を含むＤＴバリアントの試験及びＩＶＴＴアッセイでの有効性についての全てのＤＴバリアントの試験を、例えば、野生型受容体結合（Ｒ）ドメイン（ＤＴ（ΔＲ））なしで先端切断ＤＴバリアントを用いて行う。細胞毒性アッセイにおける効力についてのリードの試験を、全長ＤＴバージョンと、ＤＴ（ＤＲ）がＩＬ−２に融合している融合タンパク質との両方を用いて行う。１個又はそれ以上のリードＤＴバリアント（段階７）のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）確認について、修飾Ｃ及びＩドメインを有する最適化ＤＴバリアントを、先端切断ＤＴ（ΔＲ）の発現により試験する。

ＤＴのＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピング
[ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ用のドナー選択]
Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ病院地域研究倫理委員会（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌＬｏｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＥｔｈｉｃｓＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって許可された承認に従って英国国立血液サービス（ＵＫＮａｔｉｏｎａｌＢｌｏｏｄＴｒａｎｆｕｓｉｏｎＳｅｒｖｉｃｅ）（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ病院、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から得られた健康な地域社会ドナーの軟膜（２４時間以内に採取した血液から）から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する。ＰＢＭＣを、軟膜からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）密度勾配遠心分離によって単離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋ＲｏｓｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して欠乏させる。ドナーを、ＢｉｏｔｅｓｔＨＬＡＳＳＰ−ＰＣＲに基づいた組織適合キット（Ｂｉｏｔｅｓｔ，Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒｓｔｒａβｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用してＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定することによって特定する。また、対照抗原、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）に対するＴ細胞応答も調べた。ドナー５４人の集団を、社会集団（ｗｏｒｌｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）において発現されるＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数及び頻度を最も良く表すために選択する（表１及び図１）。社会集団において発現されるアロタイプに対して、前記集団で発現されるアロタイプの分析により、＞８０％の範囲が達成されること及び全ての主要ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（社会集団において発現される頻度＞５％を有する個々のアロタイプ）が十分に提示されることが明らかにされた。表１は、ドナーのハプロタイプ、及びドナーＰＢＭＣの処理及び単離中に得られるＫＬＨに対する応答（試験１）と、この試験中の再試験（ＡＮＧ０１）の後に得られるドナー応答との比較を示す。ドナーハプロタイプの概要を表２に示し、試験で使用したドナーアロタイプの頻度と、社会集団において存在する頻度との比較を図１に示す。

表２．ドナーの詳細及びハプロタイプ。ＫＬＨに対するドナー応答（ＳＩ）を、２つの独立した試験について示す。試験１は、新たに単離されたＰＢＭＣについて行い、ＡＮＧ０１はこの試験における再試験である。両方の試験で同じ結果（すなわち、陽性又は陰性）を生じなかった応答は、灰色で強調する。極めて低い基礎ｃｐｍ（＜１５０ｃｐｍ）を有する３人のドナーは、分析から除外した。

[ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ分析：増殖アッセイ]
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）を使用して、Ｃ末端にヒトＩＬ−２の１０個のアミノ酸を有するＤＴのＣ及びＩドメインを含むＤＴ１−３８９の配列から誘導されるオーバーラップペプチドを試験した。Ｃ末端のヒトＩＬ−２の１０個のアミノ酸（ＤＴ１−３８９／ＩＬ−２２−１０）と一緒に、ＤＴ−Ｉの残基１−３８９に及ぶオーバーラップペプチドを設計した。１２個のアミノ酸まで重複する一連の１２８×１５量体ペプチドを、１×ｌ４量体及び１×１１量体と一緒に合成し、５１人の健康なドナーの集団からＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングを使用して誘導された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激するのに使用した。個々のペプチドを、反復培養物中で試験し、Ｔ細胞増殖アッセイを使用して応答を評価して、エピトープの正確な位置を同定した。各ドナー由来のＰＢＭＣを解凍し、計数し、生存率について評価した。細胞を室温のＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で生き返らせ、その後に細胞密度を２．５×１０^６ＰＢＭＣ／ｍｌ（増殖細胞ストック）に調整した。ペプチドを、１０ｍＭの最終濃度までＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）に溶解した。次いで、ペプチド培養ストックを、ＡＩＭＶ培地に５μＭの最終濃度まで希釈することによって調製した。それぞれのペプチド及びそれぞれのドナーについて、６重反復培養物を、平底９６ウエルプレートで１００μｌのペプチド培養ストックを１００μｌの増殖細胞ストックに加えることによって確立した。陽性対照培養物及び陰性対照培養物の両方も、６重反復で確立した。９×９６ウエルプレート全部をそれぞれのドナーについて使用し、それぞれのプレートは、１５個のペプチドを１つの陰性対照（担体単独）と共に６重反復で試験するのに十分であった。最終プレートに、陽性対照ＫＬＨを加えた。

培養物を、合計６日間インキュベートし、その後に各ウエルに０．５μＣｉの^３[Ｈ]−チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を加えた。培養物を、さらに１８時間インキュベートし、その後にＴｏｍＴｅｃＭａｃｈＩＩＩ細胞ハーベスターを使用してフィルターマット上に収穫した。各ウエルについて１分当たりのカウント（ｃｐｍ）を、ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅＢｅｔａＣｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）で、並行して、低バックグラウンドカウントモードで、Ｍｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）シンチレーションカウントすることによって測定した。

増殖アッセイについて、２に相当するか又はそれよりも大きい（ＳＩ≧２）刺激指数（ＳＩ）の実験的閾値は、すでに確立されており、それによってこの閾値を越える増殖反応を誘導する試料は、陽性であると認められる（含有される場合には、境界線ＳＩ≧１．９０が強調される）。広範なアッセイ展開及び過去の研究により、これは多数の偽陽性応答を検出することなく最大感度を可能にする最小シグナル対ノイズ閾値であることを明らかにされている。陽性応答は、以下の統計学的及び実験的閾値によって定義される。

１．試験ウエルｃｐｍと培地対照ウエルとを、対合していない２つの試料のスチューデントのｔ検定を使用して比較することによる応答の有意性（ｐ＜０．０５）。

２．２よりも大きい（ＳＩ≧２）刺激指数、この場合ＳＩ＝試験ウエルの平均（ｃｐｍ）／培地対照ウエルの平均（ｃｐｍ）である。

また、アッセイ内変動を、重複培養物からの生データの変動の係数及び標準偏差（ＳＤ）を算出することによって評価した。

増殖アッセイを、６重反復培養物において設定した（「非調整データ」）。アッセイ内変動性が低いことを確実にするために、データを最大及び最小ｃｐｍ値（「調整データ」）を除いた後に解析し、ドナー応答のＳＩを両方のデータセットを使用して比較した。調整データセット及び非調整データセットの両方からのドナーＳＩの詳細を、図１２及び１３に示す。Ｔ細胞エピトープを、試験＋２×ＳＤ（バックグラウンド応答率）において全てのペプチドに対する応答の平均頻度を算出することによって同定した。この閾値を越えて増殖を誘導した任意のペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含有するとみなす。

[ペプチドのコンピューターｉＴｏｐｅ（商標）分析]
増殖アッセイで陽性であったペプチドの配列を、Ａｎｔｉｔｏｐｅの予測ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウエアを使用して解析した。このソフトウエアは、ペプチドのアミノ酸側鎖とＭＨＣクラスＩＩ結合溝内の特異的結合ポケットとの間の好ましい相互作用を予測する。重要な結合残基の配置は、長いペプチド配列の上に及ぶする１個のアミノ酸によって重ね合わされた１０量体ペプチドを生成することによって調べた。それぞれの１０量体は、ＭＨＣクラスＩＩアロタイプ（合計３２）のＡｎｔｉｔｏｐｅのデータベースと対照して試験し、そのＭＨＣクラスＩＩ分子との適合及び相互作用に基づいて採点した。多数の対立遺伝子に対して高い結合スコアを生じたペプチドは、コア９量体を含有するとみなした。このような試験は、（ａ）ＤＴ１−３８９／ＩＬ−２２−１０ＤＴ１−３８９／ＩＬ−２２−１０の完全Ｔ細胞エピトープマップ、（ｂ）個々のＴ細胞エピトープの効力及びＤＴから除去するための優先順位付けの評価、及び（ｃ）ＭＨＣクラスＩＩアロタイプとのＴ細胞エピトープ関連性の評価を含めＤＴ１−３８９／ＩＬ−２２−１０の包括的なＴ細胞エピトープ分析を提供した。

[Ｔ細胞エピトープの同定]
前記のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）分析を使用して同定された１３０のペプチド全部を、５１人の健康なドナー（５４人のドナーが最初に選択されたが、ドナー１３、２０及び３８は、低い基礎ｃｐｍである、すなわち１５０ｃｐｍのカットオフ値よりも低いｃｐｍであるために分析から除外した）に対して試験するために首尾よく合成した。陽性応答は、所定のペプチドに対してＳＩ≧２を有する有意な（ｐ＜０．０５）応答を生じたドナーによって定義される。ボーダーラインの応答（ＳＩ≧１．９０を有する有意な（ｐ＜０．０５）応答）もまた含めた。非調整データ解析の結果と調製データ解析の結果とを、アッセイ内変動性が低いこと及び陽性応答は個々のウエルでの偽性増殖の結果ではないことを確証するために比較した。それぞれの解析の結果は、方法の間にほとんど相違がないことを示した。従ってＴ細胞エピトープマップは、調整データ解析を使用して編集した。非調整解析と調製解析の両方からのドナー刺激指数を図１２及び１３それぞれに示す。Ｔ細胞エピトープは、試験での全てのペプチドに対する応答の平均頻度プラス標準偏差の２倍（「バックグラウンド応答率」と呼ぶ）を算出することによって同定した。これは、５．６％であると算出され、３人以上のドナーで陽性応答を誘導することについて同等であった。この閾値を上回る増殖反応を誘導するペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含有するとみなした。

表３は、ペプチドのそれぞれに対する個々のドナーの応答の要約を提供する。ペプチドに対する応答の頻度を表すグラフは、図２に見出すことができる。９つのペプチドがバックグラウンド応答率を上回る増殖反応を誘導し（ペプチド２、３１、３５、３９、４０、４１、４２、４９及び１００）、従ってＴ細胞エピトープを含有するとみなした。これら９つのペプチドから、合計７個のＴ細胞エピトープが、ＤＴ−１配列内で同定され、以下でさらに詳しく考察する。

表３．個々のペプチドに対するドナーの応答の概要。陽性応答（ＳＩ≧２及びｐ＜０．０５）はドナー番号によって示し、個々ＳＩは対応するドナーの次の括弧内に示す。ボーダーライン応答（ＳＩ≧１．９及びｐ＜０．０５）は、（＊）で示す。バックグラウンド応答率は５．６％であり、それは３人のドナーと同等であった。

[ＥｐｉＳｃｒｅｅｎによって同定されたＴ細胞エピトープ]
（ａ）エピトープ１−ペプチド２
ペプチド２（ＤＤＶＶＤＳＳＫＳＦＶＭＥＮＦ；配列番号：１５９）は、表２及び図２に示すようなＴ細胞エピトープを含有する。合計３人のドナー（３０、３６及び４７）がペプチド２に応答したが、ドナー３０の応答はボーダーラインであった（１．９２のＳＩ）。前記の明細全体を通じて考察するように、Ｔ細胞エピトープの排除は、同定されたエピトープのアミノ酸の修飾によって達成できる。エピトープのアミノ酸、例えばＭＨＣクラスＩＩ結合裂隙のアンカーポケット（ｐ１及びｐ９）を結合することに関連するアミノ酸残基の修飾は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上のエピトープの首尾よい提示に影響を及ぼすことができる及び／又は防止する（すなわち、エピトープを排除する）ことができる。同様に、ＭＨＣクラスＩＩ結合裂隙の内部ポケットを結合することに関連するアミノ酸残基、及び／又はＭＨＣクラスＩＩ分子に影響を及ぼすか又はそれと相互作用するコア９量体エピトープの外側の残基の修飾は、エピトープを排除できる。Ｔ細胞エピトープの排除のためのアミノ酸残基修飾の種々の組み合わせが、本明細書に記載の方法で調製でき、試験できる。

ＡｎｔｉｔｏｐｅのコンピューターｉＴｏｐｅ（商標）ＭＨＣクラスＩＩ予測ソフトウエアを使用して、ペプチド２を、可能な９量体ＭＨＣクラスＩＩ結合レジスターについて解析した。このソフトウエアは、結合する可能性を有する対立遺伝子の数（合計３２から）に基づいたエピトープについて最も好ましい結合レジスターを、対立遺伝子の平均結合スコア（この場合、陽性閾値は０．５に設定される）と一緒に予測する。この解析の結果は、コア９量体が、バリン（Ｖ８）を可能なｐ１アンカー残基として有するＶＤＳＳＫＳＦＶＭ（配列番号：１６１）であることを示した（図３）。この立体配座において、解析は、３２個の対立遺伝子の中の２５個の結合を予測した。
また、ＶＤＳＳＫＳＦＶＭコア９量体（配列番号：１６１）も、ペプチド２とオバーラップするペプチド１及び３の両方に存在する。興味深いことに、ドナー３６は、ペプチド２及び３の両方に応答し（それぞれ２．１３及び２．０２のＳＩ）、また統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）ペプチド１（ＳＩ＝１．８８）に対する高い応答を有していて、ＶＤＳＳＫＳＦＶＭ（配列番号：１６１）がコア９量体結合レジスターであることを示す。同様に、ドナー３０は、１．６４のＳＩでペプチド１に応答し、これは１．９〜２．０のカットオフよりも明らかに低かったが、統計学的に有意であり（ｐ＜０．０５）、全体的なバックグラウンドＳＩよりも高かった。ドナー４７は、ペプチド１及び３に対する陽性応答を開始しなかった。これは、おそらくはペプチド内のコア９量体の配置によるものと思われる。９量体結合レジスターの外側の残基の相互作用がペプチド：ＭＨＣクラスＩＩ複合体の安定性を裏付けることが十分に実証されている（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｅｔａｌ．，１９９４）。従って、ペプチド２は、コア９量体をＭＨＣクラスＩＩの結合に最適な立体配置で含有していると思われる。ＤＴ−１の結晶構造の精査（Ｓｔｅｅｒｅｅｔａｌ．，２０００）により、ｐ１バリン残基（Ｖ８）が部分的に露出した位置内にあることが明らかにされた。従って、極性置換残基は、極性部分が表面露出され且つ疎水性領域が覆い隠されるように選択できる。Ｔ細胞エピトープに対するこのような修飾は、毒素の免疫原性を低下させることができる。

（ｂ）エピトープ２−ペプチド３１
表３及び図２は、４人のドナー（ドナー１２、２３、３０及び３６）がこの領域にＴ細胞エピトープの存在を示すペプチド３１（ＫＶＬＡＬＫＶＤＮＡＥＴＩＫＫ；配列番号：１６２）に応答したことを示す。また、オーバーラップペプチドの分析により、ドナー２３がペプチド３２に対してボーダーライン応答を生じ、ドナー３６もペプチド３２に応答し、その応答は、閾値下（ＳＩ＝１．８１）であるが統計学的に有意（ｐ＜０．０５）であることが明らかにされた。ｉＴｏｐｅ（商標）コンピューター解析を使用すると、このペプチドのコア９量体は、バリン（Ｖ９７）を主要なｐ１アンカー残基として有するＶＤＮＡＥＴＩＫ（配列番号：１６４）であると予測された（図４）。これは、ドナー２３のペプチド３２に対する応答及びドナー３６の同じコア９量体を含有していたペプチド３２に対する閾値下の応答によって裏付けられた（図５）。この立体配座において、解析は、３２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の中の２８個の結合を示した。構造及び相同性モデリングは、Ｖ９７の配置が分子の表面に十分に露出されており且つ活性部位に関連づけられないことを明らかにした。

（ｃ）エピトープ３−ペプチド３５
ペプチド３５（配列番号：１６６）は、段階１において前記のように刺激の後に陽性増殖応答を生じた３人のドナー（ドナー１、２及び３５）によって示されるようなＴ細胞エピトープを含有する（図２及び表３）。ｉＴｏｐｅ（商標）による解析により、このペプチドについて最も好ましい結合レジスターは、ロイシン（Ｌ１０７）を主要なアンカー残基、ｐ１として有するＬＧＬＳＬＴＥＰＬ（配列番号：１６７）であることが明らかにされた（図５）。この９量体は、３２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の中の１３個を結合する可能性を有していた。ドナー３５もまた、同じコア９量体を含有していたペプチド３４に対して増殖応答（ＳＩ＝１．８３）を有していた。これは、陽性応答についてカットオフ１．９〜２．０より低かったが、統計学的に有意（ｐ＜０．０５）であり、且つ配列ＬＧＬＳＬＴＥＰＬ（配列番号：１６７）がこの領域内のエピトープであることを示す。

このエピトープのためのｐ１アンカーの結晶構造解析及び相同性モデリングは、それが大部分覆い隠されており、少量が表面露出していることを示す。エピトープ１に関しては、ＭＨＣクラスＩＩに対する結合を除去するために極性残基を置換できるであろう。このペプチドのｐ９アンカーもまた覆い隠され、従って、変化は、毒素の表面に十分に露出されているｐ６及びｐ７を含有する他のポケット位置にあると考えられる。

（ｄ）エピトープ４−ペプチド３９
３人のドナー（ドナー５、１５及び５０）が、ペプチド３９（ＬＭＥＱＶＧＴＥＥＦＩＫＲＦＧ；配列番号：１６８）を用いた刺激の後に陽性増殖応答を生じたが、ドナー５０の応答はボーダーライン（１．９４のＳＩ）であった（図２及び表３）。このペプチド内のＴ細胞エピトープは、ｉＴｏｐｅ（商標）解析後にＭＥＱＶＧＴＥＥＦ（配列番号：１６９）をコア９量体ＭＨＣクラスＩＩ結合レジスターとして含有すると予測された（図６）。この立体配座において、位置１１６のメチオニンはｐ１アンカー残基を形成し、このエピトープは、３２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の中の１９個を結合すると予測される。このＭＨＣクラスＩＩ結合レジスターの位置１及び９は、毒素の触媒ドメインのコアの中に覆い隠され、互いに満たされる。従って、これらの残基は、タンパク質の全体的な安定性にとって重要であると考えられる。エピトープ３と同様に、コア９量体の他のポケット、例えばｐ６及びｐ７（これらは十分に露出されている）と相互作用する残基が、置換のために考慮される。

（ｅ）エピトープ５−ペプチド４０、４１及び４２
有力なＴ細胞エピトープは、ペプチド４０、４１及び４２（配列番号：１７０−１７２）内にあると思われる。検出されたエピトープ全部について、この領域のエピトープは、試験集団の１５．７％に相当する合計８人の異なるドナーにおいて応答を誘導するその能力によって示されるように、最も免疫原性である（表３及び図２）。６人のドナーが、ペプチド４０（ドナー１５、３６、４６、４７、４９及び５０）、ペプチド４１（ドナー３５、３６、４０、４６、４９、５０）及び４２（ドナー３５、３６、４０、４７、４９及び５０）に応答し、３つのオーバーラップペプチド全部に対する応答がドナー４９及び５０について観察され、一方ドナー３０、４０、４６及び４７は、２つのオーバーラップペプチドに応答した。ｉＴｏｐｅ（商標）コンピューター解析により、このペプチドについての結合モチーフはフェニルアラニン（Ｆ１２４）をＰ１アンカー残基として有するＦＩＫＲＦＧＤＧＡ（配列番号：１７３）であると予測された（図７）。この９量体は、３つのオーバーラップペプチド全部に存在しており、３２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の中の２３個を結合すると予測された。フェニルアラニン１２４は、触媒ドメインのコア内に実質的に覆い隠され且つＭ１１５及びＶ１１８に対してパックし、従って潜在的に構造上重要であると考えられる。しかし、アンカーの位置４、６、７及び９は、種々の程度に露出されており、エピトープを除去するために標的として向けることができる。

（ｆ）エピトープ６−ペプチド４９
また、ペプチド４９（ＳＳＳＶＥＹＩＮＮＷＥＱＡＫＡ；配列番号：１７４）も、Ｔ細胞エピトープを含有する。図２及び表３は、３人のドナー（ドナー３０、３９及び４９）がペプチド４９による刺激の後に陽性増殖応答を生じたことを示す。ｉＴｏｐｅ（商標）コンピューター解析を使用すると、このペプチドに最も好ましい結合レジスターは、３２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の中の２２個を結合する可能性を有するＶＥＹＩＮＮＷＥＱ（配列番号：１７５、図８）であると予測された。この結合レジスターは、バリン（Ｖ１４８）をｐ１アンカー残基として有していた。ペプチド４９とオーバーラップしたペプチド４８及び５０も同じコア９量体を含有していたが、ドナー３０、３９及び４９は、オーバーラップペプチに応答せず、コア９量体の外側の残基もまたＭＨＣクラスＩＩ分子に対するペプチドの結合に重要であることを実証している。バリン１４８は部分的に表面露出され、従って極性置換残基は、親水性部分が表面露出され且つ疎水性領域が覆い隠されるように選択できる。

（ｇ）エピトープ７−ペプチド１００
エピトープ７は、ペプチド１００（ＬＥＫＴＴＡＡＬＳＩＬＰＧＩＧ、配列番号：１７７）内に見出された。４人のドナー（ドナー１、１５、３０及び３５）がペプチド１００に応答し、ドナー１５の応答はボーダーラインであった。ｉＴｏｐｅ（商標）解析により、このペプチドのコア９量体結合レジスターは、ロイシン（Ｌ２９８）をｐ１アンカー残基として有するＬＥＫＴＴＡＡＬＳ（配列番号：１７８）であると予測された（図９）。この９量体は、３２個の可能なＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の中の２４個を結合すると予測された。この９量体もペプチド９９内に存在し、ドナー３０はこれに対する統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）閾値下応答（ＳＩ＝Ｉ．８４）を開始し、従ってこれらのペプチドの結合モチーフとしてＬＥＫＴＴＡＡＬＳ（配列番号：１７８）を支持する。ロイシン２９８は、トランスロケーションドメインの表面に十分に露出されており且つこのドメインの活性に関連づけられない。従って、それは置換について明らかな問題を有していない。従って、残基は、Ｔ細胞エピトープを修飾／排除することを目的として容易に置換できる。

[Ｔ細胞エピトープ及びアロタイプ応答]
表４は、ＤＴ−１配列内に見出される７個のＴ細胞エピトープの詳細を要約し、図１０は、タンパク質配列内のエピトープの配置を表す。ＤＴ−１とＩＬ−２の間の接合部内にエピトープは検出されなかった。

ペプチド４０、４１及び４２中に配置されたＴ細胞エピトープ（エピトープ５）は、試験集団の１５．７％で応答を誘導した。ペプチド３１及び１００中に配置されたエピトープ（エピトープ２及び７、それぞれ）は、試験集団の７．８４％で応答を誘導した（表４）。ペプチド２内のエピトープ（エピトープ１）、ペプチド３５のエピトープ（エピトープ３）、ペプチド３９内のエピトープ（エピトープ４）及びペプチド４９内のエピトープ（エピトープ６）は、試験集団の５．８８％で応答を誘導した。上記エピトープのそれぞれに対する陽性応答の大きさ（平均ＳＩ）の解析により、全部が２〜２．５の平均ＳＩを有するこれらの有効性においてかなり等しいと思われることが示された。しかし、エピトープ３は、それよりも大きい３．１３の平均ＳＩを有していた。

表４：Ｔ細胞エピトープを含有するペプチドに対する陽性応答の大きさ及び頻度の要約

ＨＬＡ−ＤＲアロタイプの発現と個々のペプチドに応答するドナーの間の関連も解析した。エピトープ２、５及び７（ペプチド３１、４０−４２及び１００）を評価した。表４及び図１２は、ＡＮＧ０１試験集団で発現されたアロタイプの頻度と比べた前記ペプチドのそれぞれに応答するドナーによって発現されるアロタイプの頻度を表す。ＭＨＣクラスＩＩアロタイプと特定のエピトープへの応答との間の関連は、応答する集団内のアロタイプの頻度が２倍を超える観察された頻度（すなわち、試験集団×２における頻度）である場合に認められた。

個々のドナーによって発現されたＭＨＣクラスＩＩアロタイプに対してＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイで観察された陽性ドナー応答同士の比較は、エピトープ２、５及び７に応答するドナーが特定のアロタイプと関連することを示した。エピトー５に対するＴ細胞応答は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５及びＨＬＡ−ＤＲ５の発現と関連していた。このエピトープに応答し且つ及これらのアロタイプを発現するドナーの頻度は、それぞれ１２％、１５％及び１５％であった。これらの全部が、ＡＮＧ０１試験集団内のこれらのアロタイプの頻度（それぞれ５％、７％及び７％であった）の２倍を超えた。また、前記ペプチドのｉＴｏｐｅ（商標）解析により、ＨＬＡ−ＤＲ５が予測されたコア９量体を結合することが明らかにされた。エピトープ２及び７の両方に対するＴ細胞応答は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５及びＨＬＡ−ＤＲＢ５に関連していると思われる。エピトープ２又はエピトープ７に応答し且つＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５及びＨＬＡ−ＤＲＢ５を発現するドナーの頻度は、それぞれの対立遺伝子について２０％及び２１％であり、これはＡＮＧ０１試験群におけるそれぞれの対立遺伝子について観察された頻度７％の２倍を超えていた。これらのペプチドのｉＴｏｐｅ（商標）解析により、それぞれのペプチドについて予測された結合レジスターはＨＬＡ−ＤＲ５を結合する可能性を有していることが明らかにされた。Ｔ細胞エピトープの同定の他に、これらの解析は、特定のペプチドに対するＴ細胞応答とＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の発現との関連も示す。

表５．試験集団内で発現されたアロタイプの頻度と比べた応答ドナーアロタイプの頻度（％として表す）。ＭＨＣクラスＩＩアロタイプとエピトープに対する応答との関連性を灰色で強調する。

[ＶＬＳアッセイ]
種々のアッセイを使用して、本明細書に記載のＤＴバリアントのＶＬＳ活性を評価できる。

一つのアッセイにおいて、ＤＴ−ＩＬ２又はバリアントは、フルオレセインに複合された。標識された細胞の蛍光顕微鏡／手動計数を使用して、ＶＬＳ活性の代用としてＨＵＶＥＣ細胞に対する直接結合を評価することができる。

生体内試験、形態学的変化、細胞単層透過性又は細胞膜完全性の喪失、及びＣＤ３１発現との相関関係は、本明細書に記載のバリアントを検出できる種々の手段に相当し、ＶＬＳ活性を評価するのにも使用できる。

（ａ）抗体を用いた検出
ＤＴ特異抗体を使用して、ＶＬＳモチーフによって内皮細胞表面に結合されたＤＴを検出できる。共通エピトープを、バリアント同士の間の結合の相違を検出するために直接に標識した。ＥＬＩＳＡを使用して、利用できる抗ＤＴ抗体の特異性／親和性を確認した。ここに記載した方法の他に、Ｈｉｓ標識Ａｂは、ＤＴバリアントを選択できる別の手段を提供する。

図１５は、ＨＵＶＥＣ細胞に対するＤＴバリアント（ＤＴ−Ｇｌｕ５２；ＣＲＭ突然変異体）の結合及びＦＡＣＳ分析を使用する抗体による検出を例証する。

（ｂ）直接結合
蛍光色素（Ａｌｅｘａ４８８）に対するＤＴ及び毒素突然変異体の直接複合体を使用して、本明細書に記載のＤＴバリアントを評価できる。Ａｌｅｘａ色素は、高安定性であり、明るい。少量タンパク質標識キット（ＭｉｃｒｏｓｃａｌｅＰｒｏｔｅｉｎＬａｂｅｌｌｉｎｇＫｉｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ａ３０００６）は、タンパク質（２０〜１００μｇ）の微小規模の標識を可能にする。標識の度合い（ＤＯＬ）は最適化することができ、色素：タンパク質（Ｄ：Ｐ）の比は、分光光度計で測定され、再現可能である。ＦＡＣＳを使用して蛍光を測定する。

前記アッセイは、図１６に例示するように、ＨＵＶＥＣ細胞に結合するＯＮＴＡＫ−Ａ１４８８及び対照ＤＴ−Ｇｌｕ５２−Ａ１４８８の良好な検出を達成した。前記アッセイは、図３０に例示するように、ＢＳＡ−Ａ１４８８の結合と比べて、ＨＵＶＥＣ細胞に結合するＯＮＴＡＫ−Ａ１４８８及び対照ＤＴ（ΔＲ）−Ａ１４８８の良好な検出を達成した。

ＨＵＶＥＣ細胞を、ＦＡＣＳでＩＬ−２Ｒ発現について試験した。ＨＵＶＥＣ細胞に結合するＯＮＴＡＫ−Ａ１４８８は、図１７に示すようにＩＬ−Ｒと無関係であることが確認された。

（ｃ）細胞膜完全性
細胞膜完全性を評価して、毒素に露出後の細胞膜の完全性の喪失を測定できる。ＶＬＳモチーフを包含するペプチドを、Ｂａｌｕｎａら（ＰＮＡＳＵＳＡ，９６：３９５７（１９９９））に記載されているような方法を使用して蛍光色素に直接に結合させた。あるいは、本明細書に記載されているか又は当該技術で知られている他のアッセイを利用できる。

細胞膜完全性アッセイは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用して行い、毒素に対する影響を、毒素と短時間インキュベート後の細胞膜の完全性の喪失の代用としてＰＩ取り込みを測定するためにＦＡＣＳで評価した（図１８）。

ＶＬＳを誘導する可能性について、ＨＵＶＥＣ細胞ＤＴ結合アッセイを、ＣドメインとＩドメインのみを含有する切断ＤＴ（ΔＲ）を使用して試験する。ＤＴ分子は、ＨＵＶＥＣに対する結合の分析のために標識する。この工程は、段階３からのＤＴ（ΔＲ）の発現を利用し、従ってＨＵＶＥＣアッセイの生成をＤＴ発現後に開始する。

[ＤＴ活性／細胞毒性アッセイ]
ＤＴ活性の測定に適したアッセイは、すでに確立されている。細胞毒性アッセイを利用して、ＤＴ−ＩＬ２Ｔ細胞エピトープ及びＩＶＴＴアッセイで選択されたＶＬＳバリアントリードの毒素活性を確認する。

（ａ）生体外転写／翻訳（ＩＶＴＴ）アッセイ
ＤＴ活性を測定するために生体外転写／翻訳（ＩＶＴＴ）アッセイを使用すると、ＤＴ遺伝子の直接的転写／翻訳が、ウサギ網状赤血球溶菌液系を使用して試験された。典型的には、これは、標的プラスミド（Ｔ７−ルシフェラーゼ）のＩＶＴＴを測定する化学発光アッセイによるルシフェラーゼ遺伝子の連結転写／翻訳を含み、活性毒素は、ルシフェラーゼシグナルを抑制し、減少する。滴定曲線によるメディアムスループットスクリーニング（ＭＴＳ）を可能にするＰＣＲ生成物を利用し、全てのバリアントを同じ９６ウエルアッセイプレートでのＷＴＤＴと比較した。代用ＩＣ_５０は、阻害曲線から測定できる。ＤＴは結合し、伸長因子−２（ＥＦ−２）の共有結合修飾を生じることから、これは、活性ＤＴバリアントについてルシフェラーゼ産生の阻害を生じるであろう。連結転写／翻訳アッセイを、リボソーム阻害タンパク質の分析に使用して、ＤＴのＣドメインの活性に関する情報を得ることができる。例えば米国特許第５，９７６，８０６号及び同第５，６９５，９８３号明細書（これらのそれぞれは、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されているようなこのような連結転写／翻訳アッセイ反応を実施するのに有用な種々の方法が、当業者に知られている。

本明細書に記載のＩＶＴＴアッセイを使用して、ＷＴＤＲＤＴが９０％に達するＴ７−ｌｕｃプラスミドの転写／翻訳の用量に依存した阻害を実証し、これに対してヌルでは約２０％の阻害で一定値になることが明らかにされた（図１４）。

（ｂ）発光細胞毒性アッセイ
Ｔｏｘｉｌｉｇｈｔ（商標）、Ｖｉａｌｉｇｈｔ（商標）及びＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（商標）キットは、細胞毒性を測定するのに使用できる非放射性の市販アッセイである。アッセイは、９６ウエルプレートフォーマットで行い、感受性及び耐性Ｔ細胞系を使用して時間と共に毒素（１０^−７〜１０^−１２Ｍ）を滴定する。ヒトＴ細胞株に対するＯＮＴＡＫとＩＬ−２の細胞毒性を、Ｔｏｘｉｌｉｇｈｔキットを使用して４８時間評価した。１秒当たりの蛍光カウント（ＬＣＰＳ）は、アデニレートキナーゼ放出の度合いを反映する（図１９）。

（ｃ）リボシルトランスフェラーゼアッセイ
連結転写／翻訳アッセイの他に、リボシルトランスフェラーゼアッセイ（例えば、実施例３に記載）が９６ウエルフォーマットで確立された。このアッセイは、大腸菌でのＤＴ遺伝子の発現（段階３）からのＤＴの試料を使用し、前記の連結転写／翻訳アッセイと同時に試験する。ＡＤＰリボシル化を測定する従来の方法は、二本鎖（ｄｓ）活性化因子ＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理した透過性細胞を使用し、その後の放射標識ＮＡＤ＋の測定は、酸不溶性物質に組み込まれる。

新たなＦＡＣＳに基づいた方法、例えばＫｕｎｚｍａｎｎら（２００６Ｉｍｍｕｎｉｔｙ＆Ａｇｅｉｎｇ）に記載された方法も利用できる。

ＤＴバリアントの細胞毒性の測定のために、（実施例４に記載されているような）細胞毒性アッセイが、開発されており、全長ＤＴバリアントの分析用のための９６ウエルフォーマットでＨＵＴ１０２−６ＴＧ細胞を使用する（ＨＵＴ１０２−６ＴＧは、リードＤＴ−ＩＬ−２タンパク質の最終分析（段階６）に使用される細胞株である）。細胞毒性アッセイは、全長ＤＴの発現を必要とすることから、このアッセイは、段階３でＤＴ発現の後に使用される。

遺伝子の合成、発現及び精製
ＤＴ及びヒトＩＬ−２遺伝子は、段階３の初めに、大腸菌中で発現させるのに最適化させたコドンを使用して、当該技術において知られている慣用の技法を使用して合成される。細胞毒性及びＨＵＶＥＣ結合アッセイ（段階２参照）の分析において使用すべき全長ＤＴ及びＤＴ（ΔＲ）（ＣドメインとＩドメインのみを含有する）を生成させるために、大腸菌の細胞周辺腔内へのＤＴの搬出のための分泌リーダー配列を含むベクター系を使用する。プラスミド及び大腸菌株は、可溶性生成物を生成させるのに最適化させる。Ｈｉｓ標識ＤＴ生成物は、Ｎｉ−ＩＤＡカラムで精製し、スピンカラムは、リードの並行精製を可能にする。ＤＴの精製方法としては、例えば、ＤＴに融合させた親和性標識（例えば、Ｈｉｓ６標識）による精製が挙げられる。段階３で開発された方法は、以下のバリアントの活性を段階４及び５でのリード候補を同定することを目的として正確に比較できるような同様の品質を有する多数のＤＴバリアントの信頼性のある製造を提供する。

ＤＴのＶＬＳバリアントの設計及び組み立て
ＶＬＳを誘導する可能性の低下のためのＤＴのバリアントを、２回の突然変異、すなわち、１回目のＤＴの３つの（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフそれぞれでの別個の突然変異、及び２回目のリード突然変異と任意の追加の突然変異の組み合わせで生じさせる。それぞれのＤＴバリアントを、ＨＵＶＥＣ結合アッセイ（段階２）で試験し、２回目の突然変異の後に選択された最適突然変異を、前記プロジェクトの段階５の中間段階のＴ細胞エピトープ突然変異と組み合わせる。これらのアッセイのためのＤＴバリアントの生成は、大腸菌での先端切断ＤＴ（ΔＲ）の発現によるものである（段階３）。

ＤＴのＴ細胞エピトープバリアントの設計、組み立て及び試験
免疫原性を低下させるためにＴ細胞エピトープを排除するためのＤＴのバリアントを、ＣドメインとＩドメインでの２回の置換によって生成させる。１回目のバリアントは、単一のエピトープ遺伝子座に別個の置換を含み、次いでこれらを２回目のバリアント中で組み合わせて、２つ、３つ又はそれ以上のバリアント遺伝子座の組み合わせを生成させる（Ｔ細胞エピトープの数及び優先順位に依存する）。２回目のバリアントは、段階４からのＶＬＳバリアントとの組み合わせを含む。ＶＬＳ突然変異体をＴ細胞エピトープ置換と組み合わせる追加の工程により、リードＤＴバリアントのさらなる最適化が必要とされる場合には、任意の３回目のＤＴバリアントが含有される。

ＤＴのＴ細胞エピトープ遺伝子座での置換は、（主として）Ｔ細胞エピトープ由来のコアＭＨＣ結合９量体内のアミノ酸を、別のタンパク質、特にＤＴ関連タンパク質の相同遺伝子座で生じるアミノ酸で置換し、同様の三次構造を有する他のタンパク質からの配列セグメントを使用することによって生成される。ペプチドＭＨＣクラスＩＩ結合予測コンピューターソフトウエアｉＴｏｐｅ（商標）（Ａｎｔｉｔｏｐｅ，Ｌｔｄ．）による解析は、Ｔ細胞エピトープの排除のための選択された置換に対する指針として使用される。ＤＴ結晶構造の構造解析もまた、ＤＴの活性を低下させるか又はＤＴ構造の安定性を低下させると最も思われない突然変異に対する指針として使用される。ある場合には、このような構造解析は、活性又は安定性を失うことなくＴ細胞エピトープ内のある置換に適合できるＴ細胞エピトープ遺伝子座の外の代償的な置換を示唆し得る。

ＤＴのＴ細胞エピトープバリアントは、主として、Ｃドメイン内の置換の分析のためのウサギ網状赤血球アッセイ（段階２）並びにＣ及びＩドメイン内の置換の分析のための細胞毒性アッセイ（段階２）を使用して試験する。これらのアッセイのためのＤＴバリアントの発現は、大腸菌での全長ＤＴの転写／翻訳及び発現それぞれ（段階３）を使用する。２回目（及び任意の３回目）の置換由来のリードについて、リボシルトランスフェラーゼ及びＨＵＶＥＣ結合アッセイもリード候補を同定するために使用される。

２６個のエピトープバリアントが、設計され、組み立てられている（図２１）。２６個のうち１０個（１０／２６）のバリアントが、本明細書に記載のようにしてＩＶＴＴアッセイで試験されている。Ｔ細胞エピトープは、相対強度に基づいて優先順位付けされている（図２２）。図２３は、７個のエピトープの突然変異体について代表的な結果を表し、突然変異体が野生型活性を保持するそれぞれのエピトープについて得られていることを実証する。
ＤＴエピトープバリアントはタンパク質合成を阻害する
ＤＴ３８２構造体が使用され、ＤＴの配列番号：２又は１４９のアミノ酸残基１−３８２及びＩＬ２を含有していた。制限酵素部位が、Ｒドメイン又はＩＬ２部分のいずれかでのクローニングのためにアミノ酸残基３８２で操作された。修飾は、以下に記載のようにして組み込まれる。

Ｔ細胞エピトープ１、３及び５が、推定されるＭＨＣクラスＩＩ結合ｐ１アンカー残基で修飾されているＤＴ３８２遺伝子のバリアントを、生成させた。野生型ＤＴ配列の残基Ｖ７、Ｌ１０７及びＦ１２４を、活性を保持しながらＴ細胞エピトープを除去すると予測されたアミノ酸（ＭＨＣクラスＩＩ結合の崩壊によって）に置換した（個々の置換は、単一のエピトープバリアントにおいて活性であると同定された）。単一の及び組み合わせたバリアントの活性を、生体外転写／翻訳アッセイで測定した。それぞれのバリアントの精製ＰＣＲ産物を、ウサギ網状赤血球溶菌液、ＴｎＴ緩衝液、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸混合物−Ｍｅｔ、アミノ酸混合物−Ｌｅｕ及びＲＮａｓｉｎ（＃Ｎ２５１１Ｐｒｏｍｅｇａ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）を含有するＴｎＴ連結転写／翻訳反応混合物（＃Ｌ４６１０Ｐｒｏｍｅｇａ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ、製造業者の取扱い説明書に従う）に、１０．５μｌの全容量で反応当たりにつき１ｎｇ〜６４ｎｇのＤＮＡ範囲を使用して滴定した。反応物を、３０℃で３０分間インキュベートして、種々のバリアントの間のＤＴ遺伝子翻訳の速度の可能な相違を可能にさせた。次いで、２５０ｎｇのＴ７−ルシフェラーゼ対照プラスミドを加え、反応物を３０℃でさらに４５分間インキュベートした。ルシフェラーゼの発現を、製造業者の取扱説明書（＃Ｅ２５１０Ｐｒｏｍｅｇａ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）に従って、反応物をＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬と共にインキュベートした後に、蛍光によって測定した。発光読み取りを、ＢＭＧＦＬＵＯｓｔａｒＯＰＴＩＭＡ蛍光プレートリーダー（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を使用して測定した。

２８個のＶＬＳ突然変異体が設計され、組み立てられている。２８個のうちの１８個（１８／２８）のＶＬＳ突然変異体がＩＶＴＴアッセイで試験されている。公知のＶＬＳバリアントは、野生型（ＷＴ）に匹敵するか又はそれよりも大きい活性を有することが明らかにされ、野生型（ＷＴ）に匹敵するか又はそれよりも大きい活性を実証する多数の代替ＶＬＳバリアントが同定されている（図２０）。

タンパク質合成の％阻害を、反応物中のＤＮＡ濃度に対してプロットし、得られる曲線を使用して、それぞれのバリアントについてＩＣ_５０を算出した。ＩＣ_５０を、アッセイ内変動を見込むために、＝１の値が、野生型に匹敵する活性を表し、＞１の値が、ＤＴ活性の上昇を表し及び＜１の値が、ＤＴ活性の低下を表すように、野生型ＤＴ（どのアッセイプレートにも含まれる）のＩＣ_５０をＤＴバリアントのＩＣ_５０で除算することによって標準化した。

表６：野生型及びヌルＤＴバリアントと比較した修飾ＤＴバリアントのＩＣ_５０データ。単一バリアントのデータを図２７に線グラフとして示し、４重バリアントを図２９に棒グラフトして示す。

４重バリアントＶ７ＤＶ９７ＡＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＤＶ９７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＮＶ９７ＡＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ及びＶ７ＮＶ９７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈは、ＷＴと比べて同等のＩＣ_５０活性を示した。

４重バリアントＶ７ＤＶ９７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＮＶ９７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＴＶ９７ＡＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＴＶ９７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ及びＶ７ＴＶ９７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈは、ＷＴと比べて向上したＩＣ_５０活性を示した。

表７：ＷＴと比較したＶＬＳ及び／又はＴ細胞エピトープバリアントの相対ＩＶＴＴスコア。相対ＩＶＴＴスコアは、野生型ＤＴのＩＣ_５０を突然変異体ＤＴのＩＣ５０で除算することによって決定される。

図２４は、タンパク質合成の阻害において野生型ＤＴ３８２と比べたＤＴ３８２エピトープバリアントの相対活性を表す。データは、ＤＴの次のＴ細胞エピトープバリアント：Ｖ７ＮＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＮＬ１０７ＡＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＤＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＤＬ１０７ＡＦ１２４Ｈ、Ｖ７ＴＬ１０７ＮＦ１２４Ｈ及びＶ７ＴＬ１０７ＡＦ１２４Ｈ及びＶ７ＴＶ２９ＴＩ２９０Ｔの全部が、タンパク質合成の阻害において野生型ＤＴ３８２と同様の活性を示す。これに対して、Ｇ５３Ｅ置換は、活性の低下をもたらす。本明細書に記載のように、Ｇ５２修飾に対する言及は、Ｎ末端メチオニンを含んでいない配列番号：１のＤＴ分子のアミノ酸残基番号付与を指す。

ＤＴＶＬＳバリアントはタンパク質合成を阻害する
認識されたｘ（Ｄ）ｙモチーフが破壊されるように、ＶＬＳモチーフが突然変異するＤＴ３８２遺伝子のバリアントを生成させた。単一及び多重遺伝子座でのバリアントの活性を、ＰＣＲ産物を使用する生体外転写／翻訳アッセイでの活性について評価した（実施例１に記載のように）。

図２５は、タンパク質合成の阻害において野生型ＤＴ３８２と比べたＤＴ３８２のＶＬＳバリアントの相対活性を表す。データは、次のＶＬＳバリアント：Ｖ７ＮＶ２９ＮＩ２９０Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＩ２９０Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＳ２９２Ａ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＳ２９２Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＩ２９０Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＩ２９０Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＳ２９２Ａ及びＶ７ＮＶ２９ＴＳ２９２Ｔの全部がタンパク質合成の阻害において野生型ＤＴ３８２と同等の活性を示すことを示す。

ＨＵＶＥＣに対するＶＬＳバリアントの結合
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＥＢＭ（ＣＣ−３１２４Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に保持した。使用前に、細胞を、酵素無含有解離用緩衝液（Ｃ５９１４Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）を使用してプラスチック培養基板から分離し、１％ＢＳＡと０．０５％ＮａＮ_３とを含有するリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。次いで、細胞を、５％正常ヒト血清を含有する上記と同じ緩衝液中で２０分間インキュベートし、その後にＡｌｅｘａ４８８蛍光色素（Ａ３０００６Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ）に複合されている精製ＤＴ３８２タンパク質又はＤＴ３８２ＶＬＳバリアントの滴定液を、製造業者の取扱い説明書に従って加えた。細胞を、前記標識タンパク質と共に３０分間インキュベートし、その後に洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％ＮａＮ_３緩衝液に再懸濁した。標識ＤＴ−３８９−ＩＬ２融合物を、陽性対照として使用し、標識ＢＳＡを陰性対照として使用した。次いで、細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ）で分析し、細胞集団の蛍光染色を測定した。次いで、バックグラウンドを超える染色を示した細胞％を、使用した標識タンパク質の濃度に対してプロットした。

図２６は、ＨＵＶＥＣ細胞に対する標識ＤＴ３８２ＶＬＳバリアントの結合を表す。標識ＤＴ３８９−ＩＬ２融合物（ＯＮＴＡＫ（登録商標））を陽性対照として使用し、標識ＢＳＡを陰性対照として使用した。データは、精製Ａｌｅｘａ４８８標識ＤＴ３８２及びＤＴ３８９−ＩＬ２（陽性対照）が、ＨＵＶＥＣに同様のレベルで結合することを示す。これに対して、ＶＬＳバリアント、Ｖ７ＮＶ２９ＴＳ２９２Ｔ（示した）、Ｖ７ＮＶ２９ＴＩ２９０Ｎ（示した）及びＶ７ＮＶ２９ＮＩ２９０Ｎ（示されていない）の結合は、ＨＵＶＥＣに対して、ＤＴ３８２又はＤＴ３８９−ＩＬ２と比べて低下したレベルの結合を示す。

ＤＴ由来のペプチドの配列を、ＡｎｔｉｔｏｐｅのｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウエアを使用して解析し、可能なＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを予測した。ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウエアは、生体外ＭＨＣクラスＩＩ結合試験からのデータを、生体外Ｔ細胞アッセイによってＴ細胞エピトープであると実証されているペプチドの大きなデータベースのアラインメントと組み合わせて、スコアリングマトリックスにする。オーバーラップ１３量体ペプチドを、全ＤＴ配列についてアミノ酸１個の増分でｉＴｏｐｅ（商標）を使用して選別した。スコアリングマトリックスから誘導されるような重要なポケット位置でペプチド内のそれぞれのアミノ酸の分布を集計することによって、結合スコアを得た。可能なＴ細胞エピトープを含有するペプチド（９量体）を同定した（下線を付した配列）。この場合に、平均結合スコアは、＞０．６（試験した３２ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子について）の場合及び＞１５個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の場合には、結合すると予測された（図２８）。それぞれの９量体のｐ１アンカー配置をボールド体で強調し、可能な結合ペプチドの完全なリストを、表８に要約する。比較のために、生体外Ｔ細胞アッセイを使用して同定されたＴ細胞エピトープを、囲みで示す。

表８．ｉＴｏｐｅ（商標）ＭＨＣクラスＩＩ結合ソフトウエアを使用してＴ細胞エピトープを含有すると予測された９量体配列のリスト

バリアントＤＴ−ＩＬ２組み立て及び発現
段階６において、１個又はそれ以上のリードＤＴ−ＩＬ２バリアントが、段階５からのリードＤＴバリアントと、段階３からのヒトＩＬ２（２−１３３）遺伝子との融合によって生成される。大腸菌での野生型及びリードＤＴ−ＩＬ２バリアントの発現は、例えば、封入体中のタンパク質凝集体の貯留及び再生を含むＤＴ−ＩＬ２の従来の方法に従う。次いで、野生型及び１個又はそれ以上のリードＤＴ−ＩＬ２バリアントを、段階２に記載のようにして、細胞毒性及びＶＬＳ−関連アッセイで試験する。

ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）を使用するリードＤＴバリアントの免疫原性試験
段階５からのリードＤＴ（ΔＲ）バリアントを精製し、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時Ｔ細胞アッセイを使用して野生型ＤＴ（ΔＲ）と比較する。ＨＬＡアロタイプの発現に社会集団を代表する多数の健康なドナーが、前記のドナーライブラリーから選択される。ドナーを、２〜４×１０^６ＣＤ８＋Ｔ細胞欠乏ＰＢＭＣを含有する別個のバルク培養物中のそれぞれのタンパク質を用いて刺激する。重複試料（Ｔブラストの試料）を５〜８日目にバルク培養物から取り出し、及び増殖をＩＬ−２分泌（ＥＬＩＳＰＯＴ）と共に評価する。野生型とＤＴ（ΔＲ）バリアントの間の評価をさらに確証するために、試験集団に、段階１の間に行ったＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピング試験からの応答ドナー（提供された十分な数のＣＤ８^＋Ｔ細胞欠乏ＰＢＭＣが残る）を補充した。

リードＤＴ（ΔＲ）バリアントにおける免疫原性の喪失を確認することを目的として、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時Ｔ細胞アッセイによるＴ細胞免疫原性の解析を、以下の通りに行う。

（ｉ）健康なドナー由来の軟膜（社会集団について＞８０％ＤＲＢ１アロタイプ範囲を有する）を使用して、生理学的レベルのＡＰＣ及びＣＤ４^＋Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを単離する；
（ｉｉ）各ドナーを、陽性対照抗原、例えばキーホール・リンペット・ヘモシアニン（可能な新抗原）又は破傷風トキソイド（想起抗原）に対して試験する；
（ｉｉｉ）ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞応答の検出を除外するために、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を欠乏させる；
（ｉｖ）リードＤＴ（ΔＲ）バリアント及び野生型ＤＴ（ΔＲ）を、互いに対して比較して、Ｔ細胞ＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化する相対能力を評価する；
（ｖ）データを、統計学的及び頻度分析を含む追加の情報によって裏付けられたＳＩ＞２の陽性応答を有する先に実証したアッセイパラメーターを使用して解析する；
（ｖｉ）ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時Ｔ細胞アッセイからのデータは、個々のＤＴ分子に対するＴ細胞の応答の大きさ及び反応速度論に関する情報を提供する；
（ｖｉｉ）陽性応答を生じるドナーからの残存ＰＢＭＣが、保存され、反復試験研究で使用するために利用できる；及び
（ｖｉｉｉ）ドナーアロタイプ並びにＤＴ（ΔＲ）に対する応答及びバリアントＤＴ（ΔＲ）リードに対する応答の関連性について評価を行う。

ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質のアジュバント効果
臨床試験デザイン及び患者適格性
患者の治療は、治験審査委員会（ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄ）及び米国食品医薬品局によって承認されたプロトコールの一部として書面によるインフォームドコンセントに従って行われる。組織学的に確認された転移性ＲＣＣを有する患者が、試験に適任である。全患者は、適切な肝臓、腎臓及び神経機能、６ヶ月を超える寿命及び７０％以上のカルノフスキーパフォーマンス状況を有することを要求される。患者は、任意の以前の治療に関連したあらゆる毒性から正常な状態に戻っていなければならず、しかも試験に入る前の少なくとも６週間は任意の化学療法、放射線療法又は免疫療法を受けていてはならない。ＣＮＳ転移を有する患者、自己免疫疾患の履歴を有する患者及び重篤な併発性の慢性又は急性疾患を有する患者は、この試験から除外される。免疫抑制剤を受けている患者も除外される。適格対象は、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質（１８μｇ／ｋｇ）の単回投与、次いで腫瘍ＲＮＡ移入ＤＣによる免疫処置を受けるか又はＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質単独を受ける同じ確率で無作為に選ばれる。全ての被検体は、腫瘍ＲＮＡ移入ＤＣの皮内注射を３回受ける。この注射は、２週間の間隔で皮内投与され及びそれぞれの注射で２００μｌの０．９％塩化ナトリウムに懸濁された１×１０^７細胞からなる。処置後に、被検体は、臨床毒性並びに免疫応答及び臨床応答について評価される。調節制限及びある被検体においては腫瘍組織に対する制限されたアクセスにより、腫瘍生検は行われない。

ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質及び組成物の調製
ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質を、２ｍｌの１回使用バイアル中のクエン酸緩衝液に１５０μｇ／ｍｌの濃度で配合された凍結滅菌溶液として提供する。解凍後に、ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質を、滅菌標準食塩水で最終濃度１５μｇ／ｍｌに希釈し、３０分間にわたる静脈内注入によって送達させる。患者は、注入の３０〜６０分前にアセトアミノフェン（６００ｍｇ）及び抗ヒスタミン剤を受けることを許される。ＤＣ培養のために、濃縮白血球画分を、白血球分離により収集する。ＰＢＭＣを、白血球分離生成物から密度勾配遠心分離で単離する（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。半接着性細胞画分を、組換えヒトＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）及び組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、８００Ｕ／ｍｌ；ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐ．）を補足した血清無含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（ＣａｍｂｒｅｘＣｏｒｐ．）中でのＤＣ培養に使用する。７日後に、未成熟ＤＣを、収集し、これに明細胞癌として組織学的に分類される腫瘍組織から抽出した全ＲＮＡを移入する。免疫学的モニタリング研究に使用される対照ＲＮＡを、自己良性腎臓組織（ＲＥ）又はＰＢＭＣから単離する。未成熟ＤＣの移入は、電気穿孔によって行う。ＤＣを、ＰＢＳ中で洗浄し、ＶｉａＳｐａｎ（ＢａｒｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中に４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。次いで、細胞を、１×１０^６細胞当たり５μｇのＲＮＡと共に５分間同時インキュベートし、０．４ｃｍキュベット中で３００Ｖ及び１５０μＦでの指数関数的減衰送達によって電気穿孔する（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。電気穿孔後に、細胞を、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地に再懸濁し、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、１５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）及び１μｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ_２；ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）の存在下で、２０時間で成熟させる。投与の前に、完全成熟ＤＣ：Ｌｉｎ^ｎｅｇ、ＨＬＡクラスＩ及びＩＩ^ｈｉｇｈ、ＣＤ８６^ｈｉｇｈ及びＣＤ８３^ｈｉｇｈの典型的な表現型を満たしていることを確実にするために、細胞を特性決定する。

免疫状態の評価
ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４ＥＬＩＳＰＯＴの分析を、免疫処置の前、間及び後に得られたＰＢＭＣを使用して行う。ＰＢＭＣを、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で一夜培養する。ＰＢＭＣから、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、ネガティブデプレション（ｎｅｇａｔｉｖｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によって単離する（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）。ブロッキング後に、１×１０^５Ｔ細胞及び１×１０^４ＲＮＡ移入ＤＣを、２μｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ捕捉抗体（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．）又はＩＬ−４捕捉抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で予め被覆された９６ウエルニトロセルロースプレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＩＰ、Ｍｉｌｈｐｏｒｅ）のそれぞれのウエルに加える。プレートを、３７℃で２０時間インキュベートし、それぞれのウエルに、ビオチン化ＩＦＮ−γ検出抗体（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．）又はビオチン化ＩＬ−４抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加える。次いで、細胞を、室温でさらに２時間インキュベートし、次いでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、プレートを、基質（ＫＰＬ）と共に展開した。洗浄後に、スポットを、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｚｅｉｓｓ）を使用して計数した。

ＣＴＬアッセイを、ＲＮＡ移入ＤＣを自己ＰＢＭＣと共に同時培養することによって行う。細胞を、一回再刺激し、ＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）を、５日後に加え、その後に隔日で加える。培養の１２日後に、エフェクター細胞を収集する。標的細胞を、１００μＣｉのＮａ_２［５１ＣｒＯ_４］（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、２００μｌの完全ＲＰＭＩ１６４０中で、５％ＣＯ_２中３７℃で１時間標識し、^５１Ｃｒ標識標的細胞を、完全ＲＰＭＩ１６４０培地で、エフェクター細胞と共に３７℃で５時間インキュベートする。次いで、５０μｌの上清を収集し、シンチレーションカウンターで５１Ｃｒの放出を測定する。

増殖アッセイのために、精製ＣＤ３＋Ｔ細胞を、丸底マイクロプレートに、ｍＲＮＡ移入ＤＣの存在下で接種する。Ｔ細胞単独を、バックグラウンド対照として使用する。４日後に、各ウエルに、１μＣｉの［メチル−^３Ｈ］チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をさらに１６時間加える。チミジンの取り込みを、液体シンチレーションカウンターを使用して測定する。

ＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質の細胞毒性を、ＭＴＴアッセイで測定する。細胞を、種々のＤＴバリアント−ＩＬ２融合タンパク質と共に６時間インキュベーションした後に、９６ウエルプレートに５×１０^３細胞／ウエルの密度で接種する。４８時間のインキュベーションの後に、５ｍｇ／ｍｌ貯蔵物から２０μｌのＭＴＴを加える。４時間後に、１００μｌイソプロパノール／０．１Ｍ塩酸を加えることによってホルマザン結晶を溶解する。ホルマザン生成物の吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで、５７０ｎｍで測定する。

ワクチン誘導ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を、ヒトＴｈ−１／Ｔｈ−２サイトカインキット（ＣｙｔｏｋｉｎｅＢｅａｄＡｒｒａｙ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して製造業者の取扱い説明書に従って測定する。単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲＮＡ移入ＤＣを１０：１の比率で用いて、一夜再刺激する。

４色ＦＡＣＳ分析を、以下の抗体：抗ＣＤ４ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５ＲＯ、抗ＣＤ４５ＲＡ（ＣＡＬＴＡＧＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ＣＤ２５ＰＥ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び抗ＧＩＴＲ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）及びイソタイプ対照（ＣＡＬＴＡＧＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して行う。ＣＤ４＋／ＣＤ２５ｎｅｇ、ＣＤ４＋／ＣＤ２５ｉｎｔ及びＣＤ４＋／ＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞の選別を、抗体標識後に、ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａ細胞分別機を使用して行う。ＦｏｘＰ３の細胞内検出のために、細胞を、３０μｇ／ｍｌのジギトニンを用いて４℃で４５分間透過処理する。その後に、細胞を、抗ＦｏｘＰ３抗体（Ａｂｃａｍ）及びＲ−フィコエリトリン抗ヤギＩｇＧを用いて１０μｇ／ｍｌのジギトニンの存在下で、４℃で３０分間染色する。染色後に、細胞を固定し、ＦＡＣＳで分析する。細胞内ＣＴＬＡ−４検出のために、Ｔ細胞を透過処理し、固定し、ビオチン化抗ＣＤ１５２（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、次いでＡＰＣ−ストレプトアビジン（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色する。合計１×１０^６細胞を、染色緩衝液（１％ＰＣＳ、２ｍＭＥＤＴＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを有するＰＢＳ）で懸濁し、抗体と共に４℃で２０分間インキュベートする。

ＤＴバリアント−抗ＩＬ２融合タンパク質投与の前に及び投与の４日後に、試験被検体のＰＢＭＣから単離したＴｒｅｇの抑制活性を、すでに記載されているようにして分析する（Ｔｓａｋｎａｎｒｉｉｓｅｔａｌ．，２００３．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，７４：２９６−３０８）。ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、試験被検体のＰＢＭＣから、磁気ビーズ分離法を使用して単離する。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、完全ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体（０．４μｇ／ウエル）（ＣＡＬＴＡＧＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で予め被覆しておいた９６ウエル丸底プレートに入れる。ＣＤ４＋／ＣＤ２５−細胞を、２．０×１０^４／ウエル単独で塗布するか又はＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞と組み合わせて、三重反復ウエルに、１：２（ＣＤ４＋／ＣＤ２５：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）の比率で塗布する。５日目に、１μＣｉの^３Ｈ−チミジンを、最終１６時間の培養のために加える。次いで、細胞をガラス繊維フィルターで収集し、放射標識チミジンの取り込みについて評価する。

β−アクチン転写物のリアルタイムＰＣＲ型定量の詳細は、文献にすでに記載されている。ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ転写物を、Ｈｓ００２０３９５８ｍｌＴａｑ−Ｍａｎ遺伝子発現アッセイ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造業者によって提供されるプロトコールに従って定量する。全長ＦｏｘＰ３挿入片を含有するプラスミドを使用して、標準曲線を作成する。

処理の前及び後にＴ細胞分析を、免疫療法を完了した患者全員について、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴで行う。免疫処置後の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を、Ｔ細胞応答の変化率の治療の前後で同等であるという帰無仮説を分析するウィルコクソンのマッチドペア符号順位検定を使用して比較する。０．０５よりも小さい２−ｓｉｄｅｄＰ値を統計学的に有意であるとみなす。

本発明は、本発明の精神又はその本質的特徴から逸脱することなく別の形で具体化されてもよいし又は別の方法で実施されてもよい。従って、本明細書の開示は、全ての態様において、例証されており、限定されないとみなされるべきであり、及び均等の意味及び範囲に入る全ての変化がその中に包含されると意図される。

種々の参考文献が本明細書全体を通じて引用され、そのそれぞれは、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。

Claims

少なくとも１個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個のアミノ酸残基修飾を有する毒素からなる修飾毒素であって、前記修飾毒素が未修飾毒素と比べて低下した免疫原性を示すことを特徴とする修飾毒素。
前記毒素がジフテリア毒素又はその断片である、請求項１に記載の修飾毒素。
ジフテリア毒素の少なくとも１個のＴ細胞エピトープに少なくとも１個のアミノ酸残基修飾を含有する修飾ジフテリア毒素であって、前記少なくとも１個のＴ細胞エピトープが配列番号：１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６及び１９９から選択され並びに前記修飾ジフテリア毒素が未修飾ジフテリア毒素と比べて低下した免疫原性を示すことを特徴とする修飾ジフテリア毒素。
前記少なくとも１個のアミノ酸残基修飾が、前記少なくとも１個のＴ細胞エピトープのエピトープコア、Ｎ末端、Ｃ末端、Ｎ末端及びＣ末端、又はこれらの任意の組み合わせにおいて行われる、請求項３に記載の修飾ジフテリア毒素。
前記毒素がジフテリア融合毒素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の修飾毒素。
前記ジフテリア融合毒素が、ジフテリア毒素と、非ジフテリア毒素ポリペプチド由来の少なくとも１個の細胞結合ドメインとを含有してなる、請求項５に記載の修飾毒素。
非ジフテリア毒素ポリペプチドが細胞結合リガンドである、請求項６に記載の修飾毒素。
細胞結合リガンドが、抗体もしくはその抗原結合断片、サイトカイン、ポリペプチド、ホルモン、増殖因子又はインスリンである、請求項７に記載の修飾毒素。
サイトカインがＩＬ−２又はＩＬ−３である、請求項８に記載の修飾毒素。
抗体が、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、ヒト化抗体、遺伝子組換え抗体、又は移植抗体である、請求項８に記載の修飾毒素。
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、Ｆ（ａｂ’）_２、ＳｃＦｖ、（ＳｃＦｖ）２、一本鎖結合ポリペプチド、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌである、請求項８に記載の修飾毒素。
前記修飾ジフテリア毒素が、Ｖ７Ｓ、Ｖ７Ｔ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｄ８Ｅ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｔ、Ｖ２９Ｓ、Ｖ２９Ｔ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｄ３０Ｅ、Ｓ３１Ｎ、Ｉ２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２Ｔ、Ｖ９７Ａ、Ｖ９７Ｔ、Ｖ９７Ｄ、Ｌ１０７Ｎ、Ｍ１１６Ａ、Ｍ１１６Ｑ、Ｍ１１６Ｎ、Ｆ１２４Ｈ、Ｖ１４８Ａ、Ｖ１４８Ｔ、Ｌ２９８Ａ及びＬ２９８Ｎの中から選択される１個又はそれ以上の修飾を含有する、請求項２に記載の修飾ジフテリア毒素。
前記修飾ジフテリア毒素が、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｔ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｔ及びＶ２９Ｄの中から選択される２個の修飾を含有する、請求項２に記載の修飾ジフテリア毒素。
前記修飾ジフテリア毒素が、Ｖ７Ｄ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｔ、Ｌ１０７Ａ、Ｌ１０７Ｎ及びＦ１２４Ｈの中から選択される３個の修飾を含有する、請求項２に記載の修飾ジフテリア毒素。
さらに（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ中に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を含有する修飾毒素であって、前記修飾毒素が未修飾毒素に匹敵する細胞毒性を有し且つ未修飾毒素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示す、請求項１に記載の修飾毒素。
さらにその中に１個又はそれ以上のアミノ酸修飾を含有し、少なくとも１個のアミノ酸修飾が（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内部で行われ、前記修飾ジフテリア毒素が、未修飾ジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有し且つ未修飾毒ジフテリア素と比べて低下した免疫原性及び内皮細胞に対する結合の減少を示す、請求項２〜７のいずれか１項に記載の修飾ジフテリア毒素。
少なくとも１個のアミノ酸修飾が（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内で行われ；及び位置（ｘ）での修飾が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｌ及び明細書の表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基によるＶ又はＩの置換であるか；位置Ｄ／Ｅでの修飾が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ及び明細書の表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基によるＤ又はＥの置換であるか；位置（ｙ）での修飾が、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖ及び明細書の表１の修飾又は異常アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基による置換であるか；又はこれらの組み合わせである、請求項１５又は１６に記載の修飾毒素。
前記修飾ジフテリア毒素が、Ｖ７Ｔ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｔ、Ｓ９Ｇ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｖ２９Ｔ、Ｄ３０Ｎ、Ｓ３１Ｇ、Ｓ３１Ｎ、Ｉ２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２Ｇ及びＳ２９２Ｔから選択される１個又はそれ以上の修飾を含有する、請求項１６に記載の組成物。
前記修飾ジフテリア毒素が、Ｖ７ＮＶ２９Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９Ｄ、Ｖ７ＴＶ２９Ｎ、Ｖ７ＴＶ２９Ｔ又はＶ７ＴＶ２９Ｄから選択される２個の修飾を含有する、請求項１６に記載の組成物。
前記修飾ジフテリア毒素が、Ｖ７ＮＶ２９ＮＩ２９０Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＩ２９０Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＳ２９２Ａ、Ｖ７ＮＶ２９ＮＳ２９２Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＩ２９０Ｎ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＩ２９０Ｔ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＳ２９２Ａ、Ｖ７ＮＶ２９ＴＳ２９２Ｔ及びＶ７ＴＶ２９ＴＩ２９０Ｔの中から選択される３個の修飾を含有する、請求項１６に記載の組成物。
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の前記修飾毒素と製薬学的に許容し得る担体とを含有してなる組成物。
被検体の悪性疾患を治療する方法であって、有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を前記被検体に投与することからなり、前記悪性疾患が血液癌、固形腫瘍又は転移であることを特徴とする方法。
被検体の悪性疾患の治療薬を製剤するための請求項２１に記載の医薬組成物の使用であって、前記悪性疾患が血液癌、固形腫瘍又は転移であることを特徴とする使用。
被検体の非悪性疾患を治療する方法であって、治療有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を前記被検体に投与することからなり、前記非悪性疾患が移植片対宿主病又は乾癬であることを特徴とする方法。
非悪性疾患の治療薬を製剤するための請求項２１に記載の医薬組成物の使用であって、前記非悪性疾患が移植片対宿主病又は乾癬であることを特徴とする使用。
抗癌剤と請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物とを被検体に投与することからなる抗癌剤の活性を高める方法。
被検体の悪性疾患を治療する方法であって、有効量の請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物と抗癌剤とを前記被検体に投与することからなり、前記悪性疾患が血液癌、固形腫瘍又は転移であることを特徴とする方法。
被検体の悪性疾患の治療薬を製剤するための請求項２１に記載の医薬組成物と抗癌剤の使用であって、前記悪性疾患が血液癌、固形腫瘍又は転移であることを特徴とする使用。