KR100899970B1 - Ｔ-세포 에피토프의 동정 방법 및 감소된 면역원성을 갖는분자의 제조를 위한 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 살아있는 숙주에서 면역 반응을 일으키는 T-세포 에피토프를 동정하는 신규한 접근법에 관한 것이다. 상기 신규한 방법에 의해, 관련된 미변형 존재와 비교하여, 투여 종의 면역계에 노출될 경우 면역원성이 없거나 적어도 감소된 생물학적 화합물이 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 신규한 생물학적 분자, 특히 단백질 및 항체에 관한 것이다.

Description

Ｔ-세포 에피토프의 동정 방법 및 감소된 면역원성을 갖는 분자의 제조를 위한 용도{METHOD FOR IDENTIFICATION OF T-CELL EPITOPES AND USE FOR PREPARING MOLECULES WITH REEDUCED IMMUNOGENICITY}
본 발명은, 컴퓨터 보조 방법에 의해서 펩티드내 MHC 클래스 II 분자 결합 부위에 대한 잠재적인 T-세포 에피토프 값의 계산을 포함하는, 살아있는 숙주에서 면역 반응을 일으키는 T-세포 에피토프를 동정하는 신규한 접근법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 숙주, 바람직하게는 인간에 노출시킬 경우 면역원성(immunogenic) 반응을 유인하는 생물학적 분자, 상기 모든 단백질 및 항체의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의해, 투여 종의 면역계에 노출시킬 경우, 상기한 본래의 면역원성 분자의 서열 내의 잠재적인 T-세포 에피토프를 감소시키거나 제거하는 것에 의해, 관련된 미변형 존재와 비교하여, 면역원성이 없거나 감소된 분자가 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 신규한 생물학적 분자에 관한 것이다.
포유류, 특히 인간에서의 면역원성으로 인해 다수의 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질의 치료적 용도가 축소되었다. 예를 들면, 뮤린 항체를 면역억제되지 않은 환자에 투여하는 경우, 대다수의 상기 환자들은 인간 항-뮤린 (anti-murine) 항체 (HAMA)를 만들어서, 도입된 외래 물질에 대한 면역 반응을 나타낸다 (예를 들어, Schroff, R.W. 등 (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D.L. 등 (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535). 두 가지의 심각한 결과가 존재한다. 첫 번째로는, 치료 항체 또는 면역복합체가 예를 들면 종양과 결합하여 치료적 기능을 수행할 기회를 갖기 전에, 환자의 항-뮤린 항체는 상기 치료 항체 또는 면역복합체와 결합하여 이를 제거할 수 있다. 두 번째로는, 환자에 뮤린 항체에 대한 알레르기성 민감성을 유발하여, 이후의 뮤린 면역글로불린에 임의로 노출될 때 과민성 쇼크의 위험에 처할 수 있다.
HAMA 문제를 해결하기 위해서, 인간 내 치료적 모노클로날 항체의 사용을 가능하게 하는 여러 기술이 채택되었다 (예를 들면, WO-A-8909622, EP 0239 400, EP 0438 310, WO-A-9109967 참조). 이들 재조합 DNA 접근법에서는 일반적으로 최종 항체 구축물 내 마우스 유전 정보는 감소되지만, 최종 구축물 내 인간 유전 정보는 증가된다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화" 항체는 여러 경우에서 여전히 환자에게서 면역 반응을 유도시킨다 (Issacs J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. 등 (1999) Transplantation 68: 1417-1420).
상기 방법론의 공통적인 양태는, 인간 항체 단백질에 존재하는 것과 동일한 아미노산 잔기, 심지어는 아미노산 잔기 서열의 상당 영역을, 통상적으로는 설치류 유래의 치료 항체 내로 도입하는 것이었다. 항체에 있어서, 상이한 종의 항체 분자 사이의 비교적 고도의 구조적 (및 기능적) 보존성으로 인해, 상기 방법이 가능하다. 그러나, 잠재적인 치료용 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질에 있어서, 숙주 종 (예를 들면, 인간) 내에 치료용 단백질에 대한 구조적 상동성이 존재하지 않는 경우에는 상기 방법이 적용될 수 없다. 더욱이, 상기 방법들에서는, 인간 아미노산 잔기 서열의 일반적 도입이 리모델링된 (re-modeled) 항체를 비-면역원성으로 만들 것이라고 가정하였다. 그러나, 특정한 짧은 펩티드 서열 ("T-세포 에피토프")은 세포 내 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 분해 도중 방출되고, 이어서 주요 조직적합성 복합체 (major histocompatability complex, MHC)의 분자에 의해 제시되어, T-세포의 활성화를 유발시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. MHC 클래스 II에 의해 제시되는 펩티드에 있어서, 상기한 T-세포의 활성화는, 이어서 B 세포의 직접적 자극에 의한 항체 반응을 일으켜서 상기 항체를 생산시킬 수 있다. 따라서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하는 것이 바람직할 것이다. 인간 유래이고 인간 내에서 생성되는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질조차도 여전히 인간에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 대표적인 예로서 치료 용도의 과립구-대식세포 콜로니 자극인자 (Wadhaw, M. 등 (1999) Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361) 및 인터페론 알파 2 (Russo, D. 등 (1996) Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein, R. 등 (1988) New Engl. J. Med. 318: 1409-1413)이 포함된다.
단백질로부터의 T-세포 에피토프의 제거는 이미 공지되어 있다 (예를 들면 WO 98/52976, WO 00/34317). 선행기술에 개시된 일반적인 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계.
(b) 실험관내 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술 또는 생물학적 검사를 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의해, 단백질 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정하는 단계.
(c) 실험관내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 검사를 이용하여 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정된 T-세포 에피토프의 활성을 본질적으로 감소시키거나 제거시키는 방식으로 변형된, 동정된 잠재적인 T-세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안 단계. 상기 서열 변이체는 서열 변이에 의한 새로운 잠재적인 T-세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성되는데, 새로운 잠재적인 T-세포 에피토프가 다시 T-세포 에피토프의 활성을 본질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 변형되지 않는 한, 그렇게 된다.
(d) 재조합 DNA 기술에 의해 상기 서열 변이체를 구축하고, 요망되는 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해서 상기 변이체를 평가하는 단계.
인간 또는 실험 동물 대상체의 말초 혈액 시료로부터의 T-세포 클론에 결합할 수 있는, 합성 펩티드와 조합된 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 개발하기 위한 기타 기술이 당 분야에서 사용되어 왔으며 [Kern, F. 등 (1998) Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W.W. 등 (2001) TRENDS in Immunology 22: 583-588], 또한 에피토프 동정전략에도 사용될 수 있다.
잠재적인 T-세포 에피토프는 일반적으로 MHC 클래스 II 분자와 결합할 수 있는 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 이러한 잠재적인 T-세포 에피토프는 MHC 결합의 구축을 위해 측정될 수 있다. 함축적으로, 용어 "T- 세포 에피토프"는 MHC 분자에 결합하는 경우 T-세포 수용체에 의해 인식될 수 있고, 최소한 원칙적으로는 상기 T-세포의 활성화를 유도할 수 있는 에피토프이다. 그러나, 통상적으로 MHC 클래스 II 분자와 결합하는 것으로 발견되는 특정 펩티드들은, 최종 단백질이 투여되는 유기체 내의 면역계에 의해 상기 펩티드들이 관용되기 때문에, 단백질 서열 내에 보유될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명은, 치료 목적을 가지고 자가조직 숙주 (autologous host) 내로 도입된 가용성 단백질이 면역 반응을 유발하여, 상기 가용성 단백질에 결합하는 숙주 항체의 발전을 만들어낸다는 실제 현실을 극복하기 위한 것으로 간주된다. 그 중에서도 한 예는 인터페론 알파 2 이며, 일부 인간 환자는 상기 단백질이 내인성으로 생산된다는 사실에도 불구하고 항체를 만든다 [Russo, D. 등 (1996) Brit. J. Haem. 94: 300-305; Stein, R. 등 (1988) New Engl. J. Med. 318: 1409-1413].
MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T-세포의 선택 및 활성화에 중요한 역할을 담당하는 매우 다형성인 단백질군이다. 인간 백혈구 항원군 DR (HLA-DR) 가 상기 단백질군의 이소타입 (isotype)이며, 본 발명에서 주로 초점을 맞추고 있다. 그러나, 이소타입 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능을 수행하므로, 본 발명은 이들에도 대등하게 적용가능하다. MHC HLA-DR 분자는 동종이합체 (homo-dimer)인데, 여기서 각각의 "반쪽"은 α 및 β 사슬로 구성된 이종이합체 (hetero-dimer)이다. 각각의 이종이합체는 펩티드에 결합하는 길이 9 내지 20 개 아미노산의 리간드 결합 도메인을 보유하지만, 결합 그루브 (groove) 는 최대 9 - 11 개 아미노산을 수용할 수 있다. 리간드 결합 도메인은 1 내지 85 개 아미노산의 α 사슬 및 1 내지 94 개 아미노산의 β 사슬로 구성된다. 최근에 DQ 분자는 상동 구조를 갖는 것으로 나타났고, DP 패밀리의 단백질도 또한 매우 유사한 것으로 추정된다. 인간에서는 DR 이소타입에 대해서는 대략 70 개의 상이한 알로타입 (allotype) 이 공지되어 있고, DQ 에 대해서는 30 개의 상이한 알로타입이 있으며, DP 에 대해서는 47 개의 상이한 알로타입이 공지되어 있다. 각 개체는 2 내지 4 개의 DR 대립유전자 (allele), 2 개의 DQ 및 2 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 여러 DR 분자의 구조가 밝혀져 있고, 상기 구조는 펩티드의 소수성 잔기 (포켓 잔기) 가 체결되는 여러 소수성 포켓을 갖는 개방말단 펩티드 결합 그루브를 나타낸다 [Brown 등, Nature (1993) 364: 33; Stern 등, (1994) Nature 368: 215]. 클래스 II 분자의 상이한 알로타입을 나타내는 다형성(polymorphism) 은 펩티드 결합 그루브 내에서 펩티드에 대한 상이한 결합 표면의 상당한 다양성에 기여하며, 집단 수준에서는 외래 단백질을 인식하고 병원성 유기체에 대해 면역 반응을 유발하는 능력에 대해 최대의 유연성을 보장한다.
상이한 지리학적 집단 및 인종군 내 별개의 "패밀리" 를 갖는 리간드 결합 도메인 내에 상당량의 다형성이 존재한다. 상기 다형성은 펩티드 결합 도메인의 결합 특징에 영향을 미쳐서, DR 분자의 상이한 "패밀리" 는 상이한 서열 특성을 갖는 펩티드에 대해 특이성을 가질 것이지만, 일부 중복이 있을 수 있다. 상기 특이성은 Th-세포 에피토프가 유도된 것과 동일한 단백질 상에 존재하는 B-세포 에피토프에 대한 항체 반응을 유도하는 데 궁극적으로 관여하는 Th-세포 에피토프의 인식 (클래스 II T-세포 반응)을 결정한다. 따라서, 개체에서의 단백질에 대한 면역 반응은, 개체의 HLA-DR 알로타입의 펩티드 결합 특이성의 작용인 T-세포 에피토프 인식에 의해 크게 영향을 받는다. 그러므로, 전체 집단 차원에서 단백질 또는 펩티드 내의 T-세포 에피토프의 동정을 위해서는, 가능한 한 다양한 HLA-DR 알로타입 세트의 결합 특성을 고려하여, 가능한 한 높은 퍼센트의 전체 집단을 커버하는 것이 바람직하다.
면역 반응 유도의 주요 요인은 MHC 클래스 II 분자 상으로의 제시를 통해 T-세포의 활성을 자극할 수 있는 펩티드의 단백질내 존재이다. 따라서, 면역원성을 제거하거나 감소시키기 위해서는, 단백질로부터 T-세포 에피토프를 동정하고 제거하는 것이 바람직하다.
미변형 생물학적 분자는, 수많은 상이한 숙주 세포 형태를 이용하여, 당업계에 자명하게 공지된 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.
그러나, 강화된 특성을 갖는 상기 생물학적 분자의 유사체에 대한 요구가 존재한다. 목적하는 강화는, 상기 치료제의 발현 및 정제에 대한 대안적인 체계 및 양식 뿐만 아니라, 상기 단백질의 생물학적 특성의 개선도 포함한다. 인간 환자에게 투여할 경우에 생체내 특성의 강화에 대한 특별한 요구도 존재한다. 이와 관련하여, 인간 환자에게서 면역 반응을 유도할 가능성이 감소되거나 없는 선별된 생물학적 분자를 제공하는 것이 상당히 요구된다. 상기 단백질은 인간 대상체내에서 증가된 순환 시간을 나타내고, 상기 생물학적 분자에 대한 수많은 징후의 경우에서와 같이, 만성 또는 재발 질환 환경에 있어서 특정한 이득을 가질 수 있을 것으로 예상된다.
발명의 개요
따라서, 본 발명은 하기 두 가지의 일반적인 양태에 관한 것이다:
(a) 개선된 특성을 갖는 생물학적 분자의 새로운 서열 변이체를 고안하고 구축하기 위해, 상기한 지식에 기초하여, 광범위하게 다양한 수의 MHC 클래스 II 분자에 대한 T-세포 에피토프를 동정하고 계산하기 위한 편리하고 효과적인 컴퓨터적 방법; 및
(b) 특히 인간에게 투여하기 위한, 구체적으로는 치료적 용도를 위한 신규한 생물학적 활성 분자; 본 발명에 따른 상기 생물학적 분자는, 본 발명에 따라 제조된 면역원성이 변형된 폴리펩티드, 단백질 또는 면역글로불린 (항체)이며, 상기 변형은 인간 대상체로의 투여시에 생물학적 분자가 면역 반응을 유인하는 성향의 감소를 초래한다.
특히, 본 발명은, 생체내에서 사용될 때, 실질적으로 비면역성이거나 임의의 미변형 대응체 보다 낮은 면역원성을 갖는 단백질을 초래하기 위한, 높은 치료적 이점을 갖고 인간 또는 비인간 기원으로부터 유래하며 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는, 일반적으로 잘 알려진 각종 단백질 및 항체의 변형에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 방법에 따라 변형된 분자는 인간 대상체내에서 증가된 순환시간을 나타내며, 수많은 징후에 대한 경우에서와 같이, 만성 또는 재발 질환 환경에 특별한 이점을 가질 것으로 예상된다. 본 발명은, 특정 구현예에서와 같이, 발명 방법의 효험성을 증명하기 위하여, 생체내에서 강화된 특성을 나타낼 것으로 예상되는 상기 분자의 변형 형태를 제공한다. 변형된 면역원성을 갖는, 즉 감소된 잠재적인 면역원성을 갖는 이러한 분자들은 약학 조성물내에 사용될 수 있다. 상기 변형 분자를 본원에서는 변형된 "면역원성" 으로 칭한다.
부분적으로는 컴퓨터적 방법에 의한 T-세포 에피토프의 동정 방법은 이론적인 T-세포 에피토프 값을 계산하여 단백질 내의 잠재적인 MHC 클래스 II 분자 결합 펩티드를 동정하기 위해 이용될 수 있으며; 이때 상기 결합 부위는 단백질내 아미노산 부위의 서열을 포함한다. 이어서, 동정된 펩티드는 단백질의 치료적 가치를 실질적으로는 감소시키기 않고, 가능하게는 강화시키도록 변형될 수 있다. 이런 컴퓨터적 방법은, 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 단백질의 영역을 선택하고; 선택된 영역으로부터 셋 이상의 아미노산 잔기로 구성된, 소정의 균일한 크기를 갖는 중복 아미노산 잔기 분획 (윈도우) 을 연속 샘플링한 다음; 각각의 샘플링된 분획에 대해 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 계산하고; 상기 분획에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기초로 하여, 변형에 적합할 수 있는 샘플링된 분획의 하나 이상을 동정하는 것을 포함한다. 이어서, 펩티드에 대한 전체적인 MHC 클래스 II 결합 스코어가 단백질의 실질적인 치료적 가치의 감소 없이 변형될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 선택된 아미노산 잔기 분획에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어는, 펩티드의 샘플링된 아미노산 잔기 분획내에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값을 합하는 것에 의해 계산된다. 이어서, 그래프 개관 (graphical overview) 을 생성하기 위해서, 상기 합의 값을 상기 분획의 거의 중간지점의 단일 아미노산에 지정할 수 있다. 이 절차를, 펩티드 영역 또는 관심있는 영역 중의 중복 분획 (윈도우) 의 각각에 대해 반복한다. 존재하는 각 방향족 측쇄에 대해 지정된 값은 소수성 지방족 측쇄 각각에 대해 지정된 값의 거의 절반이다. 소수성 지방족 측쇄는 발린, 루신, 이소루신 및 메티오닌 내에 존재하는 것들이다. 방향족 촉쇄는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 내에 존재하는 것들이다. 방향족 측쇄에 대해 바람직한 지정된 값은 약 1 이고, 소수성 지방족 측쇄에 대해서는 약 2 이다. 그러나, 다른 값이 이용될 수 있다.
따라서, 첫 번째 양태에서, 본 발명은, 실험관내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 검사를 사용하여, 상기 펩티드와 MHC 분자의 결합을 측정하는 것을 포함하는 단계에 의해, 생물학적 분자의 아미노산 서열내의 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프 펩티드를 동정하는데 적합한 컴퓨터 계산을 기초로하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다.
(a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역을 선택하는 단계;
(b) 소정의 균일한 크기를 가지며, 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 중복 아미노산 잔기 분획을 연속 샘플링하는 단계;
(c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 분획에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값을 합산하여 각각의 상기 샘플링된 분획에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 계산하는 단계; 및
(d) 상기 분획에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어에 기초하여, 펩티드의 치료 용도를 본질적으로 감소시키지 않으면서 펩티드에 대한 전체 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위한, 변형에 적합한 하나 이상의 상기 분획을 동정하는 단계.
특정 구현예에서, 본 발명은, 하기에 의해, 12-6 반데르 발스의 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 배치 에너지 항목을 포함하도록 변형된 Boehm 스코어링 함수 (Boehm scoring function) 를 사용하여 수행되는 방법에 관한 것이다:
(1) MHC 클래스 II 분자 모델에 대한 제 1 의 데이타베이스를 제공하는 단계;
(2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격에 대한 제 2 의 데이타베이스를 제공하는 단계;
(3) 상기 제 1 의 데이타베이스로부터 모델을 선택하는 단계;
(4) 상기 제 2 의 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하는 단계;
(5) 각각의 샘플링된 분획내에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄의 동정 단계;
(6) 각각의 샘플링된 분획내에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화성 값을 결정하는 단계; 및
임의로는, (7) 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 (1) 내지 (5) 의 단계를 반복하는 단계.
다른 구현예에서, 각각의 샘플링된 서열에 대한 결합 스코어는 하기에 의해서 계산된다: (i) MHC 클래스 II 분자 모델에 대한 제 1 의 데이터베이스를 제공하는 단계; (ii) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격에 대한 제 2 의 데이터베이스를 제공하는 단계; (iii) 각 골격의 각 위치에서 20 개 아미노산 각각에 대해 허용된 아미노산 측쇄 배치에 대한 제 3 의 데이터베이스를 제공하는 단계; (iv) 상기 제 1 의 데이터베이스로부터 모델을 선택하는 단계; (v) 상기 제 2 의 데이터베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하는 단계; (vi) 제 3 의 데이터베이스로부터의 허용된 배치와 함께, 각각의 샘플링된 분획내에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄를 동정하는 단계; (vii) 각각의 허용된 배치 중의 각 샘플링된 분획내에 존재하는 모든 측쇄에 대해 최적의 결합 친화성 값을 결정하는 단계; (viii) 상기 각각의 골격에 대해 단계 (v) 내지 (vii) 를 반복하여, 최적의 결합 스코어를 결정하는 단계; (ix) 상기 각각의 모델에 대해 단계 (iv) 내지 (viii) 를 반복하는 단계.
상기 기재한 세 가지 데이터베이스는 하나의 데이터베이스로 결합될 수 있거나 결합된 데이터베이스를 제공하기 위하여 임의의 두 가지 데이터베이스로 결합될 수 있다는 것이 이해되어야만 한다. 샘플링되는 아미노산 잔기 분획의 길이는 다양할 수 있다. 바람직하게는, 샘플링된 아미노산 잔기 분획은 약 10 내지 약 15 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 약 13 개의 아미노산 잔기로 구성된다. 샘플링된 아미노산 잔기 분획은 다양한 정도로 중복될 수 있다. 바람직하게는 샘플링된 아미노산 잔기 분획은 실질적으로 중복된다. 가장 바람직하게는, 연속적인 샘플링된 아미노산 잔기 분획 (consecutive sampled amino acid residue segment)은 하나 외의 모든 아미노산 잔기가 서로 중복된다. 즉, n 개의 잔기를 갖는 아미노산 잔기 분획에서, n-1 잔기는 다음의 연속적인 샘플링된 아미노산 잔기 분획과 중복된다.
따라서, 더욱 구체적으로는, 본 발명은 또한 하기의 더욱 바람직한 구현예에 관한 것이다.
Figure 112003030457578-pct00001
상기의 특정화된 방법으로서, 각 방향족 측쇄에 대해 지정된 값이 각 소수성 지방족 측쇄에 대해 지정된 값의 약 절반임을 특징으로 하는 방법.
Figure 112003030457578-pct00002
상기의 특정화된 방법으로서, 샘플링된 아미노산 잔기 분획이 13 개의 아미노산 잔기로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
Figure 112003030457578-pct00003
상기의 특정화된 방법으로서, 연속적인 샘플링된 아미노산 잔기 분획은 1 내지 5 개의 아미노잔 잔기가 중복됨을 특징으로 하는 방법.
Figure 112007014650232-pct00004
상기의 특정화된 방법으로서, 연속적인 샘플링된 아미노산 잔기 분획은 서로 실질적으로 중복됨을 특징으로 하는 방법.
Figure 112003030457578-pct00005
상기의 특정화된 방법으로서, 연속적인 샘플링된 아미노산 잔기 분획에서 하나 이외의 모든 아미노산 잔기가 중복됨을 특징으로 하는 방법.
제 2 의 기초 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 T-세포 에피토프가 제거된 상이한 생물학적 분자의 변형된 형태를 제공하며, 상기 변형은 상기 및 특허청구범위에 기재된 방법에 의해 성취될 수 있다. 상기 분자는 또한 상기 인용된 선형 기술에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있지만, 본 발명의 방법에 의해 수득된 분자는 강화된 특성을 나타낸다. 선행 기술의 교침에 의하면, 예상된 T-세포 에피토프는 비인간 및 인간 유래의 치료 항체 또는 비항체 단백질의 1차 서열내에서 신중한 아미노산 치환의 사용에 의해 제거된다.
본 발명은 생체내에서 강화된 특성을 나타낼 것으로 예상되는 단백질 및 면역글로불린의 변형된 형태를 제공한다.
따라서, 본 발명의 목적은 모체 분자로부터 유도되 면역원성이 변형된 생물학적 분자의 제조 방법을 제공하며, 이때 상기 변형된 분자는 상기 모체 분자와는 상이한 아미노산 서열을 갖고, 투여 종의 면역계에 노출되었을 경우 모체 분자와 비교하여 면역원성의 감소를 나타내며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함함을 특징으로 한다: (i) 모체 생물학적 분자 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계: (ii) 실험관내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 검사를 사용하여 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합을 측정하는 것을 포함하는 임의의 방법에 의해서, 단백질 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프를 동정하는 단계; (iii) 원래 동정되었던 T 세포 에피토프 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형에 의해 신규한 서열 변이체를 고안하는 단계로서, 상기 변이체는, 실험관내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 검사를 사용하여 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합에 의해 또는 T 세포에 대한 펩티드-MHC 복합체의 결합에 의해 측정된, T 세포 에피토프 서열의 활성 또는 갯수 및/또는 상기 생물학적 분자로부터 유도된 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 갯수를 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 변형되도록 하는 것인 고안 단계; (iv) 상기 서열 변이체를 재조합 DNA 기술로 구축하고, 요망되는 특성을 가진 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계; 및 (v) 단계 (ii) - (iv) 를 임의로 반복하는 단계로서, 단계 (ii) 에 따른 T 세포 에피토프 서열의 동정이 상기 및 하기에 특정된 방법에 의해 수행됨을 특징으로 하는 단계.
본 발명에 따른 상기 단계 (iii) 의 특정 구현예는 하기에 개요된 단계에 관한 것이다:
Figure 112003030457578-pct00006
상기의 특정화된 방법으로서, 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프 서열 중의 1 내지 9 개의 아미노산 잔기가 변형됨을 특징으로 하는 방법.
Figure 112003030457578-pct00007
상기의 특정화된 방법으로서, 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프 서열의 중의 하나의 아미노산 잔기가 변형됨을 특징으로 하는 방법.
Figure 112003030457578-pct00008
상기의 특정화된 방법으로서, 상기 아미노산 변형이 상동성 단백질 서열 및 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조로 하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
Figure 112003030457578-pct00009
상기의 특정화된 방법으로서, 아미노산 잔기의 변형이 특정 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환, 결실 또는 부가임을 특징으로 하는 방법.
Figure 112003030457578-pct00010
상기의 특정화된 방법으로서, 바람직하게는 치환, 부가 또는 결실에 의한 추가적인 다른 변형이 상기 생물학적 분자의 생물학적 활성을 회복시키기 위해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
단계 (ii) 를 제외한 개시된 방법의 다른 단계들은 당업자에게 자명하게 공지된 방법 및 기술에 의해 성취될 수 있다. 변형된 생물학적 분자는 바람직하게는 재조합 기술에 의해 제조되기 때문에, 단계 (i) 의 방법에 의해 동정된 아미노산 잔기의 교환을 완료한 후에, 아미노산 잔기로부터 추정된 대응 DNA 를 구축한다. 본원에서 사용된 재조합 기술은 당업계에서 자명하게 공지되어 있다 (예컨대, Sambrook 등, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory Press, NY, USA).
본 발명에 따라 수득된 생물학적 분자는 바람직하게는 펩티드, 단백질, 항체, 항체 절편 또는 융합 단백질이다. 본 발명은 또한 변형, 변이체, 돌연변이, 절편, 유도체, 또는 동일하거나 유사한 생물학적 및/또는 약리학적 활성을 갖는 상기 분자의 비(非)-, 부분- 또는 완전 글리코실화 형태를 포함한다.
본 발명에서 개시된 방법이 특정한 생물학적 분자에 한정되지는 않지만, 본 발명의 특정한 구현예는 바람직하게는 당업계에 공지된 분자를 제공하며, 치료적 이점 및 가치를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 목적은 또한 모체 분자로부터 유도된 면역원성이 변형된 생물학적 분자를 제공하는 것으로, 상기 변형된 분자는 상기 모체 분자와는 상이한 아미노산 서열을 갖고, 투여 종의 면역계에 노출될 경우 모체 분자와 비교하여 면역원성의 감소를 나타내며, 상기 및 하기에서 상세히 기술된 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된다.
상기 방법에 의해 수득된 특히 관심있는 생물학적 분자는 하기의 군으로부터 선택된다:
(a) 모노클로날 항체:
항-40 kD 당단백질 항원 항체 KS 1/4,
항-GD2 항체 14.18
항-Her2 항체 4D5 (뮤린) 및 인간화 버젼 (Herceptin
Figure 112003030457578-pct00011
),
항-Her1 (EGFR) 항체 c225 및 h425,
항-IL-2R (항-Tac) 항체 (Zenapax
Figure 112003030457578-pct00012
),
항-CD52 항체 (CAMPATH
Figure 112003030457578-pct00013
),
항-CD20 항체 (C2B8, Rituxan
Figure 112003030457578-pct00014
; Bexxar
Figure 112003030457578-pct00015
),
인간 C5 보체 단백질에 대한 항체.
(b) 인간 단백질:
sTNF-R1, sTNF-R2, sTNFR-Fc (Enbrel
Figure 112003030457578-pct00016
)
단백질 C, acrp30, 리신 A, CNTFR 리간드,
서브틸리신, GM-CSF, 인간 여포 자극 호르몬 (h-fsh),
β-글루코세레브로시다아제, GLP-1, 아포리포프로테인 A1,
렙틴 (인간 비만 단백질), KGF, G-CSF,
BDNF, EPO, Il-1R 안타고니스트.
본 발명의 제 3 의 기초 양태는 면역원성이 미변형된 모체 생물학적 분자로부터 유도된 T-세포 에피토프에 관한 것이다. 이들 에피토프는 바람직하게는 13mer 펩티드이다. 이들 내에서, 9 개의 연속적인 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 서열이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 에피토프 및 서열에 대한 접근법을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
Figure 112003030457578-pct00017
동일한 생물학적 활성을 갖지만 면역원성이 감소된 생물학적 분자를 제조하기 위한, 기술된 임의의 방법에 따라 동정된 면역원성이 미변형된 모체 생물학적 분자의 아미노산 서열 내의 잠재적인 T-세포 에피토프의 용도.
Figure 112003030457578-pct00018
상기 T-세포 에피토프가 13mer 펩티드임을 특징으로 하는 잠재적인 T-세포 에피토프 펩티드의 대응 용도.
Figure 112003030457578-pct00019
모체 미변형 분자와 비교하여 동일한 생물학적 활성을 갖지만 면역원성이 감소된 생물학적 분자를 제조하기 위한, 상기 특정된 13mer T-세포 에피토프의 9 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열의 용도.
도면의 간단한 설명
도 1 은 본 발명의 컴퓨터적 방법의 하나의 양태를 보여주는 흐름도이다.
도 2 는 본 발명을 구현하는 컴퓨터적 방법을 위한 데이터베이스 생성을 보여주는 흐름도이다.
도 3 은 잠재적인 T-세포 에피토프를 위한 펩티드를 프로필하는 데이터베이스 질의 (database interrogation) 를 나타내는 흐름도이다.
도 4 는 컴퓨터적 방법을 나타내는 추가적인 흐름도이다.
도 5 는 글루탐산 데카르복실라아제 (MW: 65000) 이성질체 (GAD 65)의 아미노산 잔기 축 (위치)에 대한 T-세포 에피토프 가능성 지수의 플롯이다.
도 6 은 에리트로포이에틴 (EPO) 의 아미노산 잔기 축 (위치)에 대한 T-세포 에피토프 가능성 지수의 플롯이다.
도 7 은 인간화 항-A33 모노클로날 항체 경쇄의 아미노산 잔기 축 (위치)에 대한 T-세포 에피토프 가능성 지수의 플롯이다.
도 8 은 인간화 항-A33 모노클로날 항체 중쇄의 아미노산 잔기 축 (위치)에 대한 T-세포 에피토프 가능성 지수의 플롯이다.
상기 도 5 내지 8 에서, 실선 (━━) 은 도 1 에 나타낸 흐름도에 따른 컴퓨터적 방법에 의해 계산된 T-세포 에피토프 지수를 나타내고; 점선 (
Figure 112003030457578-pct00020
Figure 112003030457578-pct00021
Figure 112003030457578-pct00022
) 은, 본 발명의 또 다른 양태에 따라, 도 3 에 기재된 흐름도에 따른 컴퓨터적 방법에 따라 계산된 T-세포 에피토프의 예상 갯수를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따르면, "T 세포 에피토프" 라는 용어는 적당한 효율로 MHC 클래스 II 분자 (또는, 비인간 종의 균등물)에 결합할 수 있고, T 세포를 자극하고/하거나 또한 MHC 클래스 II 와 복합체로 T 세포와 결합할 수 있는 (반드시 이를 활성화시키는지 측정할 필요없음) 아미노산 서열을 의미한다. 본원 및 첨부되는 청구항에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은 (본원에서 하기에 정의되는) 펩티드 결합에 의해 함께 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20 가지의 상이한 천연 생성 아미노산이 있으며, 이들의 임의의 수를 임의의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 사용되는 천연 생성 아미노산은 모두 L-배치를 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2 가지 상이한 배치의 아미노산의 다양한 조합을 이용하는 통상적 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 소수의 아미노산 단위만을 포함한다. 단 (short) 펩티드, 예컨대 10 개 미만의 아미노산 단위를 갖는 것들을 때로 "올리고펩티드" 로 부른다. 다른 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예컨대 100 개 전후를 포함하며, "폴리펩티드" 로 부른다. 통상적으로, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있고, "올리고펩티드" 는 통상적으로 "단" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 임의 언급은 또한 올리고펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "펩티드" 에 대한 임의 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 - 즉, 상이한 단백질의 수는 실제로 무한하다.
이전 및 이후에 사용되는 용어 "적거나 또는 감소된 면역원(성)" 은 상대적인 용어이며, 생체 내에서 동일한 유형의 종에 노출되었을 때 본 발명에 의해 변형된 분자와 비교한 각각의 공급 기원 분자의 면역원성에 관한 것이다. 본 발명에 따라 사용되는 용어 "변형된 단백질" 은, 감소된 수의 T 세포 에피토프를 가지며, 따라서 투여 종의 면역계에 노출되는 경우, 모체 단백질에 비해 감소된 면역원성을 유도하는 단백질을 설명한다. 본 발명에 따라 사용되는 용어 "미변형 단백질" 은 "변형 단백질" 과 비교되는 "모체" 단백질을 설명하며, 더 많은 수의 T 세포 에피토프를 가지며, 따라서 투여 종의 면역계에 노출되는 경우 변형 단백질에 비해 증강된 면역원성을 갖는다.
"알파 탄소 (Cα)" 는, 펩티스 사슬내에 있는 탄소-수소 (CH) 성분의 탄소 원자이다. "측쇄" 는 단순 또는 복합적인 기 또는 부분구조를 포함할 수 있고 펩티드의 차원과 비교하여 현저하게 다양할 수 있는 물리적 차원을 갖는, Cα에 대한 펜던트 기이다.
T-세포 에피토프는 특정 T-세포 에피토프와 MHC 클래스 II 분자의 결합에 중요한 아미노산 잔기를 고려하는 것에 의한 본 발명의 컴퓨터적 방법에 의해 동정될 수 있다. 동정되었다면, 잠재적인 T-세포 에피토프는, 아미노산 잔기 서열로부터, 그 서열 중의 중요 아미노산 잔기의 변형, 예컨대 돌연변이에 의해 제거되거나 삭제될 수 있다. 상대적으로 낮은 전체 결합 스코어를 초래하는 결실, 부가 또는 치환에 의한, T-세포 에피토프를 함유할 것 같은 영역 중의 펩티드 서열에 대해 수행되는 임의의 변형은, 아미노산 잔기 서열의 면역원성을 낮게 하는 효과를 가질 것이다. 일부 경우에, 일정한 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 결합을 강화하는 것이 요구될 수 있다. 예를 들면, T-세포 에피토프를 함유하는 것으로 알려진 자기 항원(autoantigen) 영역의 펩티드 유사체로 개체를 처리할 경우, 자가면역질환을 겪는 개체에서 일부 자기항원에 대한 관용이 회복될 수 있음이 제안되었다. 천연 에피토프는 통상적으로 MHC 클래스 II 분자에 대한 보통의 친화도를 갖는 반면, 펩티드 유사체는 MHC 클래스 II 분자에 대해 상대적으로 높은 친화도를 갖도록 제조될 수 있다. 이런 높은 친화도는, 이런 높은 친화도 에피토프를 제시하는 상기 T-세포가 제거되도록 하기 위한 면역 감시 (immune surveillance)를 촉진하거나 이들이 아네르기가 되도록(anergised) 함에 있어 중요하다. T-세포 에피토프에 대한 상기 변형은 또한 단백질 수준의 펩티드 및 치료제로서 투여되는 전체 단백질에서 만들어 질 수 있다.
단백질 또는 폴리펩티드의 전체 구조를 결정하는데 중요한 역할을 하는 여러 요인들이 있다. 첫번째로, 펩티드 결합, 즉 사슬 중의 아미노산을 함께 연결하 는 결합은 공유 결합이다. 상기 결합은 구조에 있어서는 평면이고, 본질적으로 치환 아미드이다. "아미드" 는 하기의 기를 포함하는 임의의 유기 화합물 기이다.
Figure 112003030457578-pct00023
인접한 아미노산의 Cα를 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기 도시한 바와 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112003030457578-pct00024
O=C 및 C-N 원자가 비교적 고정된 평면 상에 놓이므로, 상기 축에 대해서는 자유 회전이 일어나지 않는다. 따라서, 파단선으로 도식적으로 묘사된 평면은 때때로 "아미드" 또는 "펩티드 평면" 으로 불리며, 여기에 펩티드 골격의 산소 (O), 탄소 (C), 질소 (N), 및 수소 (H) 원자가 놓인다. 상기 아미드 평면의 반대 코너에는 Cα원자가 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에 대해 실질적으로 회전이 없으므로, 폴리펩티드 사슬은 Cα원자를 연결하는 일련의 평면 펩티드 연결을 포함한다.
폴리펩티드 또는 단백질의 전체 구조 또는 배치를 정의하는데 있어 중요한 역할을 하는 두번째 요인은 공통 Cα연결에 대한 각각의 아미드 평면의 회전각이다. "회전각" 및 "비틀기 (torsion) 각" 이라는 용어는 이후 동일한 용어로 간 주된다. O, C, N, 및 H 원자가 아미드 평면에 존재한다고 가정하면 (일부 배치의 경우, 상기 원자의 평면성이 약간의 차이가 있을 수 있지만, 통상적으로 타당한 가정임), 상기 회전각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 배치, 즉 이웃 잔기 사이에서 존재하는 구조를 정의한다. 상기 두 가지의 각은 φ및 ψ로 공지되어 있다. 따라서 한 세트의 각 φi, ψi (여기서 아래첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄) 는 폴리펩티드를 효과적으로 정의한다. φ, ψ각을 정의하는데 사용되는 관례, 즉 아미드 평면이 0 도 각을 형성하는 참조점 및 어느 각이 φ이고 어느 각이 ψ인지에 대한 정의는, 주어진 폴리펩티드에 대하여 문헌에 정의되어 있다. 예컨대, 본원에 참고문헌으로 도입된 [Ramachandran 등. Adv. Prot. Chem. 23: 283-437 (1968), 페이지 285-94] 를 참고.
본 발명의 방법은 임의 단백질에 적용될 수 있으며, 인간에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브의 일차 포켓 1 고정 위치는 특정 아미노산 측쇄에 대해 잘 고안된 특이성을 갖는다는 발견에 부분적으로는 근거한다. 상기 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 번 위치에서 아미노산의 정체 (identity)에 의해 결정된다. 상기 부위는 포켓 1 의 저부에 위치하며, 상기 포켓에 의해 조절될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다 [Marshall, K. W., J. Immunol., 152: 4946-4956 (1994)]. 상기 잔기가 글리신이라면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산 (소수성 지방족원: 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌; 및 방향족원: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판) 은 포켓 내에 수용될 수 있고, 방향족 측쇄가 바람직하 다. 상기 포켓 잔기가 발린이라면, 상기 아미노산의 측쇄는 포켓 내로 돌출하여, 소수성 지방족 측쇄만이 수용될 수 있도록, 수용될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한한다. 따라서, 아미노산 잔기 서열에서, 소수성 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산이 발견된다면, MHC 클래스 II 에 제한된 T 세포 에피토프가 존재할 가능성이 있다. 그러나, 측쇄가 소수성 지방족이라면, 방향족 측쇄보다 대략 2 배 더 T 세포 에피토프와 회합될 가능성이 있다 (전체 집단에 대해 포켓 1 유형의 대략적인 균일한 분포로 가정함).
본 발명을 구현하는 컴퓨터적 방법은 하기와 같이 T 세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 펩티드 영역을 프로필한다:
(1) 소정의 길이의 펩티드 분획의 일차 서열을 스캐닝하고, 존재하는 모든 소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 확인한다. (2) 소수성 지방족 측쇄에 방향족 측쇄보다 더 큰 값; 바람직하게는 방향족 측쇄에 지정된 약 2 배의 값, 예컨대, 소수성 지방족 측쇄에 대한 값을 2 로, 방향족 측쇄에 대한 값을 1 로 지정한다. (3) 존재하는 것들에 대해 결정된 값을 펩티드 내의 소정의 균일한 길이인 각각의 중복되는 아미노산 잔기 분획 (윈도우) 에 대해 합산하고, 특정 분획 (윈도우) 에 대한 전체 값을 분획의 중간 위치에 있는 단일 아미노산 잔기 (윈도우) 에, 바람직하게는 샘플링된 분획의 정중앙 근처의 잔기 (윈도우) 에 부여한다. 상기 절차를 각각의 샘플링된 중복 아미노산 잔기 분획 (윈도우) 에 대해 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에는 특정 분획편 (윈도우) 에 존재할 T 세포 에피토프의 가능성에 관련된 값이 부여된다. (4) 상기 단계 3 에 기재된 바에 따 라 계산되어 부여된 값을 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 축에 대해 플롯팅할 수 있다. (5) 소정의 값, 예컨대 값 1 의 스코어를 갖는 서열의 모든 부분은, T 세포 에피토프를 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 필요하다면 변형될 수 있다.
본 발명의 상기 특정 양태는 T 세포 에피토프를 포함할 것 같은 펩티드 영역을 나타낼 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 상기 영역에서의 펩티드 변형은 MHC 클래스 II 결합 특징을 변형시킬 수 있는 잠재성을 갖는다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면, MHC 클래스 II 대립유전자의 모델과 펩티드의 상호작용을 고려한 보다 복잡한 컴퓨터적 방법을 이용하여, T 세포 에피토프가 보다 정확히 예측될 수 있다. 상기 특정 양태에 따른 펩티드 내에 존재하는 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 예측에는, 모든 공지된 MHC 클래스 II 분자의 구조를 기반으로 하는 42 개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자 모델의 구축 및 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 동정에 있어서 상기 모델을 이용하는 방법; 상대적인 펩티드 골격 알파 탄소 (Cα) 위치에 있어서 공지된 변화를 가능케 하기 위한 각각의 모델에 대한 펩티드 골격 라이브러리의 구축; 펩티드 및 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용에 결정적인 위치에서 각각의 20 개 아미노산 대안물에 대한 각 모델과 도킹하는 각각의 골격에 대한 아미노산 측쇄 배치의 라이브러리 구축; 및 특정 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 특정 펩티드에 대한 최적의 골격 및 측쇄 배치, 및 상기 상호작용으로부터의 결합 스코어 편차를 선택하기 위한 스코어링 함수와 함께 상기 골격 및 측쇄 배치 라이브러리의 사용이 고려된다.
MHC 클래스 II 분자의 모델은 Brookhaven 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에서 찾을 수 있는 여러 유사한 구조로부터 상동성 모델링을 통해 유도될 수 있다. 이들은 에너지 최소화를 위한 CHARMm 역장 (force-field) (Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca. 에서 구입가능) 와 함께 시뮬레이션된 어닐링 함수를 도입한 반자동 상동성 모델링 소프트웨어 (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993. J. Mol Biol 234: 779-815)를 이용하여 수행될 수 있다. 대안적인 모델링 방법도 또한 이용할 수 있다.
본 발명의 방법은, MHC 클래스 II 분자의 작은 세트에 대한 결합 그루브 내 각각의 위치에서 대안적인 각각의 아미노산의 실험적으로 유도된 결합 데이타의 라이브러리를 이용하는 다른 컴퓨터적 방법 (Marshall, K. W., 등, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1(3): 157-162) (1995); 또는 그루브 내에서 특정 유형의 결합 포켓의 결합 특징을 정의하기 위해, 다시 MHC 클래스 II 분자의 비교적 작은 서브세트를 이용한 후 상기 포켓 라이브러리의 포켓 유형을 추가적인 '버츄얼' MHC 클래스 II 분자를 인공적으로 생성시키기 위해 '혼합 및 매칭' 시키는 유사한 실험적 결합 데이타를 이용하는 또다른 컴퓨터적 방법 (Sturniolo T., 등, Nat. Biotech, 17(6): 555-561 (1999)) 과 매우 상이하다. 두 가지 종래 방법 모두, 분석의 복잡성 및 다수의 펩티드 변이체를 합성해야 한다는 필요성으로 인해, 단지 소수의 MHC 클래스 II 분자만이 실험적으로 스캐닝될 수 있다는 주요 단점을 갖는다. 따라서, 첫번째 종래 방법은 소수의 MHC 클래스 II 분자만을 예측할 수 있다. 두번째 종래 방법은 또한, 상이한 클래스 II 대립유전자와 함께 있는 경 우, 한 분자 내의 유사한 아미노산이 배열된 포켓이 동일한 결합 특징을 갖는다고 가정하고, 포켓 라이브러리 내에 포함되는 포켓을 포함하는 MHC 클래스 II 분자만이 '버추얼하게' 생성될 수 있다는 추가 단점을 갖는다. 본원에 기재된 모델링 접근법을 이용하여, 임의의 수 및 유형의 MHC 클래스 II 분자의 구조를 유추할 수 있고, 따라서 전체 집단을 대표하도록 대조유전자를 특이적으로 선택할 수 있다. 또한, 스캐닝되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 복잡한 실험을 통해 추가적인 데이타를 생성시킨 것보다 더 많은 모델을 만들어서 증가시킬 수 있다.
골격 라이브러리의 이용은 특정한 MHC 클래스 II 분자로 도킹되는 경우, 스캐닝되는 다양한 펩티드의 Cα원자의 위치에서의 변화를 허용한다. 이는 다시, 특히 포켓에서의 아미노산 결합의 스캐닝을 위해 단순화한 펩티드 골격의 이용에 의존하는 상기 기재된 대안적인 종래의 다른 컴퓨터적 방법과 대조적이다. 이러한 단순화된 골격은 '실제' 펩티드에서 발견되는 골격 배치의 대표물이 아닐 수 있어, 펩티드 결합의 예측이 부정확해진다. 본 발명의 골격 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합한 모든 펩티드의 골격을 포개고, 결합 그루브 내에 위치하는 11 개 아미노산 각각의 Cα원자 사이의 제곱 평균 (RMS) 편차를 확인함으로써 생성된다. 상기 라이브러리는 소수의 적합하고 이용가능한 마우스 및 인간 구조 (현재 13 개) 에서 유도될 수 있지만, 더욱 큰 다양성을 가능케하기 위해, 각각의 C"-α위치에 대한 RMS 수를 50% 증가시킨다. 이어서 각각의 아미노산의 평균 Cα위치를 결정하고, 그 반경이 그 지점에서의 RMS 편차 + 50% 가 되는 상기 지점 근처로 구를 그린다. 상기 구는 허용되는 모든 Cα위치를 나타낸다.
최소의 RMS 편차를 갖는 Cα로부터 작업시 (결합 그루브의 11 개 잔기의 위치 2 에 해당하는, 상기 언급된 포켓 1 의 아미노산의 것), 구는 3 차원적으로 격자형이며, 격자 내의 각각의 정점이 상기 아미노산의 Cα의 가능한 위치로서 사용된다. 후속 아미노산에 대한 펩티드 결합에 해당되는, 후속 아미드 평면은 각각의 상기 Cα들에 그래프트되며, φ및 Ψ각은 후속 Cα의 위치를 정하기 위해, 설정된 간격으로 단계적으로 회전된다. 후속 Cα가 상기 Cα 에 대해 '허용되는 위치의 구' 내에 속하는 경우, 디펩티드의 방위 (orientation)가 허용되지만, 구의 외부에 속하는 경우 디펩티드는 거부된다. 이어서, 상기 절차를, 모든 9 개의 후속 Cα들이 선행 Cα들의 가능한 모든 순열로부터 위치될 때까지, 각각의 후속 Cα위치에 대해 펩티드가 포켓 1 Cα'시드 (seed)' 로부터 성장하도록 반복한다. 이어서 상기 절차를 단일 Cα선행 포켓 1 에 대해 1 번 더 반복하여, 결합 그루브 내에 위치하는 골격 Cα위치의 라이브러리를 생성시킨다.
생성되는 골격의 수는 여러 요인에 근거한다: '허용된 위치의 구' 의 크기; 포켓 1 위치에서 '일차 구' 의 격자의 세밀함; 후속 Cα의 위치를 정하는데 사용되는 Φ및 Ψ각의 단계적 회전의 적합성. 상기 절차를 이용하여, 커다란 골격 라이브러리가 생성될 수 있다. 골격 라이브러리가 커질수록, MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 내의 특정 펩티드에 대한 최적의 체결성이 발견될 가능성이 높아질 것이다. 결합 도메인의 아미노산과의 충돌로 인해, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자 모델의 도킹에 적합하지는 않을 것이므로, 각각의 대립유전자에 대해, 상기 대립유전자가 수용될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의 서브세트를 생성한다. MHC 클래스 II 분자 모델과 함께 골격 라이브러리의 이용은 각각의 허용되는 골격에 도킹된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각 위치에서 각각의 아미노산에 대해 허용된 측쇄 배치로 구성되는 방대한 데이타베이스를 생성시킨다. 상기 데이타 세트는 MHC 클래스 II 분자가 골격에 도킹되고, 아미노산 측쇄가 목적하는 위치의 골격상에 그래프트되는 단순한 입체 오버랩 함수를 이용하여 생성된다. 측쇄의 각각의 회전가능한 결합은 설정된 간격으로 단계적으로 회전되며, 원자의 생성된 위치는 언급된 결합에 근거한다. 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄 원자의 상호작용이 주지되며, 위치는 하기 기준에 따라 허용되거나 거부된다: 위치된 모든 원자의 오버랩의 총 합은 소정 값을 초과하지 말아야 한다. 따라서, 배치 탐색의 엄격성 (stringency) 은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 총 오버랩에 대한 소정의 한계치의 함수이다. 상기 후자의 값은 특정 포켓이 고정된 것으로 공지된 경우 작을 수 있지만, 엄격성은 포켓 측쇄의 위치가 비교적 유동적인 것으로 공지된 경우 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓 내에서 유연성의 변동을 모방할 수 있다. 이어서 각각의 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 경우, 상기 배치 탐색을 각 골격의 매 위치마다 각각의 아미노산에 대해 반복하여 측쇄 배치의 방대한 데이타베이스를 생성시킨다.
상술된 골격/측쇄 배치의 거대 데이타베이스를 스캐닝하여 실험적으로 유도되어야 하는 펩티드 리간드 배치와 함께 MHC 클래스 II 분자 모델 사이의 결합 에너지를 추정하기 위해, 적합한 수학적 표현을 사용한다. 따라서, 하기 계산에 9 내지 20 개 아미노산 길이 (길이는 각각의 스캐닝에 대해 일정하게 유지됨) 의 각각의 가능한 펩티드를 적용시켜, 잠재적인 T 세포 에피토프에 대해 단백질을 스캐닝한다: 상기 분자에 대해 허용되는 펩티드 골격과 함께 MHC 클래스 II 분자를 선택하고, 목적하는 펩티드 서열에 해당하는 측쇄를 그 위에 그래프트한다. 골격 상의 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 정체 및 원자간 거리 데이타를 상기 아미노산에 허용되는 각각의 배치에 대해 수집한다 (상술한 데이타베이스로부터 수득됨). 이를 골격 및 스코어링 함수를 이용하여 유도된 펩티드 스코어에 따라 각각의 측쇄에 대해 반복한다. 상기 골격에 대한 최적 스코어를 유지하고, 선택된 모델에 대해 허용된 각각의 골격에 대해 상기 절차를 반복한다. 허용된 모든 골격에 대한 스코어를 비교하고, 최고 스코어를 상기 MHC 클래스 II 모델에서 목적하는 펩티드에 대한 펩티드 스코어로 간주한다. 이어서 상기 절차를 스캐닝되는 단백질에서 유도되는 가능한 모든 펩티드로 각각의 모델에 대해 반복하고, 모델에 대비한 펩티드 스코어를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 결합 친화성 계산에 제시되는 각각의 리간드는 상술한 바와 같은 펩티드 또는 단백질에서 선택되는 아미노산 분획이다. 따라서, 상기 리간드는 공지된 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되는 약 9 내지 20 개 아미노산 길이의 아미노산 연장물에서 선택된다. "아미노산" 및 "잔기" 라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. 골격 라이브러리로부터 골격 상에 그래프트될 것으로 조사된 펩티드의 연속 아미노산 형태인 리간드를, 펩티드 골격의 C"-α원자의 축를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리로부터의 MHC 클래 스 II 분자의 결합 틈 내에 위치시키고, 각각의 측쇄에 허용되는 배치를 허용되는 배치의 데이타베이스로부터 선택한다. 관련된 원자 정체 및 원자간 거리를 또한 상기 데이타베이스로부터 검색하고, 펩티드 결합 스코어를 계산하는데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 리간드를 위치 지정 돌연변이형성 (mutagenesis)에 대한 후보물로 지정한다. 지정된 리간드 (즉 관심 단백질 내임) 의 아미노산 치환을 수행한 후, 스코어링 함수를 이용해서 재시험하여, 결합 친화성을 소정 임계값 미만으로 감소시키는 변화를 결정한다. 이어서, 상기 변화를 관심 단백질 내로 도입하여 T 세포 에피토프를 제거시킬 수 있다.
펩티드 리간드 및 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 사이의 결합에는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비공유 상호작용이 관여된다: 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 (친유성) 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 설명되는 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 포함된다. 수소 결합은 극성 또는 대전된 기 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합이고, 2 개의 다른 원자에 의해 공유되는 수소 원자로 구성된다는 것이 이해되어야 한다. 수소 공여자의 수소는 양전하를 갖는 반면, 수소 수용자는 부분적인 음전하를 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용을 위해, 수소 결합 공여자는 수소가 부착된 질소, 또는 산소 또는 질소에 부착된 수소일 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 부착되지 않은 산소, 수소가 부착되지 않고 1 또는 2 개 연결을 갖는 질소, 또는 1 개 연결만을 갖는 황일 수 있다. 특정 원자, 예컨대 수소에 부착된 산소 또는 이 민 질소 (예, C=NH) 는 수소 수용자 및 공여자 둘 다 될 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/몰 범위이고, 반 데르 발스 결합보다 훨씬 더 강하지만, 공유 결합보다는 약하다. 수소 결합은 또한 상당한 방향성이 있고, 공여자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 함께 선형이 될때 가장 강하다. 정전기적 결합은 반대로 하전된 이온쌍 사이에서 형성되며, 상호작용의 강도는 쿨롱의 법칙에 따라 원자간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍 사이의 최적 거리는 약 2.8Å 이다. 단백질/펩티드 상호작용에서, 정전기적 결합은 아르기닌, 히스티딘 또는 리신 및 아스파테이트 또는 글루타메이트 사이에 형성될 수 있다. 결합의 강도는 이온화기의 pKa 및 매질의 유전 상수에 의존할 것이지만, 이들은 대략 수소 결합의 강도와 유사하다.
친유성 상호작용은 단백질 및 펩티드 리간드 사이에 일어나는 친화적인 소수성-소수성 접촉이다. 통상적으로, 이들은 용매에 노출되지 않게 결합 그루브의 포켓 내에 묻혀있는 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄 사이에 일어날 것이다. 소수성 잔기의 용매로의 노출은, 주변 용매 분자가 서로 우리 모양의 포접 구조를 형성하도록 수소 결합이 유도되므로 매우 불리하다. 생성되는 엔트로피의 감소도 매우 불리하다. 친유성 원자는 극성이나 수소 수용자가 아닌 황이거나 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다.
반 데르 발스 결합은 3 - 4Å 떨어진 원자 사이에서 발견되는 비특이적 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 약하고 덜 특이적이다. 원자 주위의 전하 분포는 시간에 따라 변화하며, 어떤 경우에도 전하 분포는 비대칭이다. 상기 일시적인 전하의 비대칭은 주위 원자에서도 유사한 비대칭을 유도한다. 원자 사이에 생성된 인력은 반 데르 발스 접촉 거리에서 최대에 이르지만, 약 1Å 내지 약 2Å 에서 급격히 감소한다. 반대로, 원자가 상기 접촉 거리 미만으로 분리되면, 원자의 외부 전자 구름이 겹치면서 증가되는 강한 반발력이 우세해진다. 인력이 정전기적 및 수소 결합에 비해 비교적 약하지만 (약 0.6 Kcal/몰), 반발력은 특히 펩티드 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있는지의 여부를 결정하는데 매우 중요할 수 있다.
하나의 구현예에서, Boehm 스코어링 함수 (SCORE1 접근법) 를 사용하여 결합 상수를 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8(3): 243-256 (1994), 본원에 그 전문이 도입됨). 또다른 구현예에서, 스코어링 함수 (SCORE2 접근법) 를 사용하여, T 세포 에피토프를 포함하는 리간드의 지표로서 결합 친화성을 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 12(4): 309-323 (1998) 본원에 그 전문이 도입됨). 그러나, 상기 참고문헌에 기재된 바와 같은 Boehm 스코어링 함수는 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있음이 이미 공지되어 있고, 단백질/리간드 복합체의 구조가 해석되었으며, 해석된 구조가 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에 존재하는, 단백질에 대한 리간드의 결합 친화성을 추정하는데 사용된다. 따라서, 스코어링 함수는 공지된 포지티브 결합 데이타의 이점과 함께 개발되었다. 포지티브 및 네거티브 결합자들 사이의 구별을 위해, 반발 항이 공식에 부가될 수 있다. 또한, 상기 Boehm 함수의 에너지 항에 근거한 영역을 이용하기보다 한쌍씩 (pairwise)의 친유성 상호작용을 계산하여, 보다 만족 스러운 결합 에너지의 추정이 얻어진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 결합 에너지는 변형 Boehm 스코어링 함수를 이용하여 추정된다. 변형 Boehm 스코어링 함수에서, 단백질 및 리간드 사이의 결합 에너지 (ΔGbind) 는 하기 변수를 고려하여 추정된다: 리간드의 이행 (translational) 및 회전 엔트로피의 전체적인 소실로 인한 결합 에너지의 감소 (ΔG0); 1 개 이상의 파트너가 중성인 이상적인 수소 결합의 분포 (ΔGhb); 비교란 이온 상호작용의 분포 (ΔGionic); 친유성 리간드 원자 및 친유성 수용자 원자 사이의 친유성 상호작용 (ΔGlipo); 리간드의 내부 자유도의 동결 (freezing), 즉 각각의 C-C 결합에 대한 회전 자유의 감소로 인한 결합 에너지의 소실 (ΔGrot); 단백질 및 리간드 사이의 상호작용 에너지 (EVdW). 상기 항을 고려하여 수학식 1 을 얻는다:
Figure 112007014650232-pct00096
여기서, N 은 특정 항에 대해 자격을 부여하는 상호작용의 수이고, 하나의 구현예에서, ΔG0, ΔGhb, ΔGionic, ΔGlipo 및 ΔGrot 은 각각 하기 값을 갖는 상수이다: 5.4, -4.7, -4.7, -0.17, 및 1.4.
항 Nhb 는 하기 수학식 2 에 따라 계산된다:
Figure 112007014650232-pct00097
f (ΔR, Δα) 는 이상적인 상황에 대한 수소 결합의 큰 편차를 설명하는 페널티 함수이며, 수학식 3 에 따라 계산된다:
f (ΔR, Δ-α) = f1 (ΔR) × f2 (Δα)
여기서, ΔR ≤TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 이거나
ΔR ≤0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 - (ΔR - TOL)/0.4 이거나
ΔR > 0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 0 이고,
또한: Δα < 30°인 경우, f2 (Δα) = 1 이거나
Δα ≤ 80°인 경우, f2 (Δα) = 1 - (Δα-30)/50 이거나
Δα > 80°인 경우, f2 (Δα) = 0 이다.
TOL 은 수소 결합 길이 = 0.25Å 에서의 관용 편차이다.
ΔR 은 이상값 = 1.9Å 로부터 H-O/N 수소 결합 길이의 편차이다.
Δα는 그 이상값 180°로부터 수소 결합각 ∠N/O-H..O/N 의 편차이다.
f(Nneighb) 는 단백질 표면의 오목부 및 볼록부를 구별하므로, 단백질 표면에서 발견되는 것보다 포켓에서 발견되는 극성 상호작용에 더 큰 무게를 부여한다. 상기 함수는 하기 수학식 4 에 따라 계산된다:
Figure 112007014650232-pct00098
Nneighb 는 임의의 주어진 단백질 원자에 대해 5Å 보다 더 가까운 비수소 단백질 원자의 수이다.
Nneighb,0 는 상수 = 25 이다.
fpcs 는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적을 허용하는 함수이므로, 강한 및 약한 수소 결합 사이를 구분하며, 그 값은 하기 기준에 따라 결정된다:
Apolar/NHB < 10Å2 인 경우 fpcs = β이거나
Apolar/NHB > 10Å2 인 경우 fpcs = 1 이다.
Apolar 는 극성 단백질-리간드 접촉 표면의 크기이다.
NHB 는 수소 결합의 수이다.
β는 값이 1.2 인 상수이다.
변형 Boehm 스코어링 함수의 실행을 위해, 이온성 상호작용으로부터의 분포 ΔGionic 은 동일한 기하 의존성이 가정되었으므로, 상술된 수소 결합으로부터와 유사한 방식으로 계산된다.
항 Nlipo 는 하기 수학식 5 에 따라 계산된다:
Figure 112007014650232-pct00099
f(r1L) 은 모든 친유성 리간드 원자 l 및 모든 친유성 단백질 원자 L 에 대해 하기 기준에 따라 계산된다:
r1L ≤ Rl 인 경우 f(r1L) =1,
R2 < rlL > R1 인 경우 f(r1L) = (r1L-R1)/ (R2-R1),
r1L ≥ R2 인 경우 f(r1L) = 0
여기서, R1 = rl vdw + rL vdw + 0.5 이고
R2 = R1 + 3.0 이고
rl vdw 은 원자 l 의 반 데르 발스 반경이고
rL vdw 은 원자 L 의 반 데르 발스 반경이다.
항 Nrot 는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이며, 비환식 sp3-sp3 및 sp3-sp2 결합의 수로 고려된다. 말단 -CH3 또는 -NH3 의 회전은 고려되지 않는다.
최종 항 EVdW 는 하기 수학식 6 에 따라 계산된다:
Figure 112007014650232-pct00100
여기서, ε1 및 ε2 는 원자 정체에 근거하는 상수이며,
r1 vdw + r2 vdw 는 반 데르 발스 원자 반경이고,
r 은 원자 쌍 사이의 거리이다.
수학식 6 에 있어서, 하나의 구현예에 의하면, 상수 ε1 및 ε2 는 하기 주어진 원자 값이다: 각각 C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황 원자에 대한 것). 수학식 5 및 6 에 대해, 반 데르 발스 반경은 하기 주어진 원자 값이다: C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Å.
상기 수학식에서 주어진 모든 소정의 값 및 상수는 특히 본원에서 수행되는 계산의 유형에 따라 단백질 리간드 상호작용의 현재 이해의 제약 내에서 결정되는 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 분자 상호작용의 모델링 분야의 발전의 결과, 상기 스코어링 함수가 더욱 개선됨에 따라, 상기 값 및 상수는 리간드에 대한 단백질의 결합 에너지 추정에 대해서 목적하는 결과를 제공하는 임의의 적합한 수치값으로 변화될 수 있고, 따라서 본 발명의 범위 내에 속한다.
상술한 바와 같이, 스코어링 함수는 측쇄 배치, 원자 정체 및 원자간 거리의 데이타베이스에서 추출되는 데이타에 적용된다. 본 발명의 설명을 위해, 상기 데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4 개의 해석된 구조이다. 상기 설명으로부터, 본 발명의 컴퓨터적 방법의 구축의 모듈 특성은, 신규 모델이 쉽게 추가되고, 펩티드 골격 라이브러리 및 측쇄 배치 탐색 함수로 스캐닝될 수 있어, 상술한 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 의해 처리될 수 있는 부가적인 데이타 세트를 생성시킬 수 있음을 의미하는 것이 자명하다. 이는, 존재하는 대립유전자의 보다 정확한 모델을 생성하는데 데이타가 이용가능하다면, 스캐닝된 MHC 클래스 II 분자의 목록이 쉽게 증가되거나 구조 및 회합 데이타가 대체될 수 있게 한다.
상기 스코어링 함수가 이용가능한 일부 복잡한 방법론에 비해 비교적 간단하지만, 계산은 극히 신속히 수행됨이 이해되어야 한다. 또한, 그 목적이 선택된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 내에 도킹된 각각의 펩티드에 대한 자체 실제 결합 에너지를 계산하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 기본적인 목적은 선택된 단백질의 일차 서열 (즉, 아미노산 서열) 을 근거로 T 세포 에피토프의 위치 예측에 도움을 주는 비교 결합 에너지 데이타를 수득하는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 상기 선택된 임계값 초과의 결합 에너지는 리간드 중 T 세포 에피토프의 존재를 제시할 것이다. 이어서, 리간드를 1 차 이상의 아미노산 치환에 적용시켜 결합 에너지를 재계산한다. 신속한 계산 특성으로 인해, 상기 펩티드 서열의 조작은 효율적인 비용으로 이용가능한 컴퓨터 하드웨어 상의 프로그램의 사용자 인터페이스 내에서 쌍방향으로 수행될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 하드웨어에 대한 거대한 투자가 요구되지는 않는다.
당업자에게는, 동일한 목적을 위해 다른 이용가능한 소프트웨어를 이용할 수 있음이 자명할 것이다. 특히, 단백질 결합 부위 내로 리간드를 도킹시킬 수 있 는 보다 복잡한 소프트웨어를 에너지 최소화와 함께 이용할 수 있다. 도킹 소프트웨어의 예에는 하기가 있다: DOCK (Kuntz 등, J. Mol. Biol., 161: 269-288 (1982)), LUDI (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8: 623-632 (1994)) 및 FLEXX (Rarey M., 등, ISMB, 3: 300-308 (1995)). 분자 모델링 및 조작 소프트웨어의 예에는 하기가 포함된다: AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.). 상기 컴퓨터적 방법의 이용은 필요한 계산을 수행하는데 걸리는 처리 시간의 길이로 인해, 본 발명의 방법의 효율을 상당히 제한할 것이다. 그러나, 상기 방법이 본 발명의 방법을 통해 '포지티브 결합자' 로 발견되는 펩티드에 대해 보다 정확한 결합 에너지의 계산을 얻기 위한 '2 차 스크린' 으로 사용될 수 있다.
복잡한 분자 기계적 또는 분자 동역학적 계산을 위한 처리 시간의 제한은 상기 계산을 가능하게 하는 소프트웨어의 고안 및 컴퓨터 하드웨어의 현재 기술 한계 둘 다에 의해 한정되는 것이다. 미래에는, 보다 효율적인 코드의 기록 및 지속적인 컴퓨터 프로세서의 속도 증가로 인해, 보다 제어가능한 시간틀 내에서 상기 계산이 이루어질 것임을 예견할 수 있다. 폴딩된 단백질 구조 내에서 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 거대분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있고: [Brooks, B. R., 등, J. Comput. Chem., 4: 187-217 (1983)], 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있으며: [Dauber-Osguthorpe 등, Proteins 4(1): 31-47 (1988)], 이들은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다. 유용한 배경 정보는 또한, 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Fasman, G. D. 편저, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9].
본 예측 방법은 각종 MHC 클래스 II 분자에 대한 친화도가 사전에 실험적으로 측정된 많은 수의 펩티드를 포함하는 데이터 세트에 대해 보정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본원에 기재된 임의의 하나의 특정 예측 방법, 또는 각 펩티드/MHC 클래스 II 쌍에 대해 수치 스코어를 생성하는 펩티드-MHC 클래스 II 상호작용을 예측하는 컴퓨터에 기초한 임의의 다른 방법은 각종 MHC 클래스 II 분자에 대한 친화도가 사전에 실험적으로 결정된 많은 수의 펩티드를 포함하는 데이터 세트에 대해 보정된다. 보정 데이터와 실험 데이터의 비교에 의해, 실험적으로 결정된 모든 T-세포 에피토프를 정정하여 예측하는 것으로 공지된 커트 값이 결정될 수 있다.
구체적으로, 컴퓨터로부터 유도된 수치 스코어는 데이터 세트 내의 각 펩티드/MHC 클래스 II 쌍에 대해서 계산된다. 상기 스코어는 높은 스코어가 결합 가능성의 증가를 나타내도록 계산된다. 실험적으로 결합하는 것으로 밝혀진 펩티드/MHC 클래스 II 쌍에 대하여 가장 낮은 컴퓨터에 기초한 스코어를 컷오프(cutoff)인 것으로 간주한다. 상기 컷오프 보다 현저하게 낮은 모든 컴퓨터에 기초한 스코어는 비결합 펩티드/MHC 클래스 II 쌍을 나타내는 것으로 간주하는 반면, 컷오프를 초과하는 컴퓨터에 기초한 스코어는 잠재적인 결합 펩티드/MHC 클래스 II 쌍을 나타낸다. 일반적으로, 제공된 컴퓨터 스코어 계산 알고리즘의 경우, 스코어가 컷오프를 초과하지만 실제적으로는 결합하지 않는 일부 펩티드/MHC 클래스 II 조합이 존재할 것이다. 따라서, 본 발명의 상기 바람직한 구현예는 폴스-포지티브를 생성할 수 있지만, 폴스 네거티브는 전혀 또는 거의 생성하지 않는다.
상기 본 발명의 컷오프에 기초한 구현예는, 단백질로부터 대부분의 또는 모든 T-세포 에피토프를 돌연변이에 의해 제거하는 것이 목적일 경우에 특히 유용하다. 구체적으로, 본 발명의 방법의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 대부분의 또는 모든 T-세포 에피토프는 하기와 같이 단백질로부터 제거된다. 잠재적인 T-세포 에피토프에 대한 단백질 서열이 컴퓨터에 기초한 알고리즘에 의해 스캐닝된다. MHC 클래스 II 에 대한 결합 가능성이 더욱 높으면 증가된 스코어로 보정하면서, 각각의 잠재적인 T-세포 에피토프에 스코어를 제공한다. 컷오프 보다 높은 스코어를 갖는 각각의 펩티드 분획을, 변이된 분획의 스코어가 컷오프 미만이 되도록 변이시킨다. 주어진 목적에 요구되는 활성 미만으로 단백질의 활성을 감소시키지 않는 돌연변이가 바람직하게는 선택된다. 컴퓨터에 의해 예상된 T-세포 에피토프의 대부분 또는 모두를 결여시킨 복수 변이된 단백질이 고안된다. 상기 복수 변이된 단백질을 "탈면역화 단백질" 이라고 부른다.
탈면역화 단백질은 표준 방법에 의해 합성된다. 예를 들면, 탈면역화 단백질을 코딩하는 인공 DNA 서열이 합성 올리고뉴클레오타이드로부터 조립되고, 발현 벡터로 결찰된 다음, 탈면역화 단백질의 발현을 촉진하는 요소에 기능적으로 연결된다. 이어서, 탈면역화 단백질을 표준 방법에 의해 정제한다. 초래된 탈면역화 단백질은 순종의 T-세포 에피토프가 제거되도록 한 변이된 아미노산을 함 유한다. 또한, 탈면역화 단백질은 종종 T-세포 에피토프일 것으로 알고리즘에 의해 예상되지만 실제로는 T-세포 에피토프가 아닌 분획 중의 변이된 아미노산 에피토프를 함유할 것이다. 그러나, 단백질 활성에 거의 영향을 갖지 않는 돌연변이가 선택되기 때문에, 현저하게 해로운 결과는 잘못 예측된 에피토프를 갖는 돌연변이로부터 유도되지는 않을 것이다. 또한, T-세포 에피토프의 부족은 변형된 단백질에 대한 B 세포 반응을 방지하기 때문에, 단백질로의 새로운 B 세포 에피토프의 도입 가능성으로부터 해로운 결과가 유도되지는 않을 것이다.
탈면역화 및 치료 목적을 위해 MHC 클래스 II 결합을 강화시키는 변형을 위해 고려될 수 있는 다양한 펩티드에 대한 상술한 방법론의 적용은 하기에 예시된다.
본 발명은 본원에 기재된 것과 실질적으로 동일한 1차 아미노산 서열과 함께 정의된 생물학적 및/또는 약리학적 활성을 갖는 임의의 생물학적 분자에 적용될 수 있고, 따라서 유전공학적 수단 또는 다른 절차에 의해 유도된 분자를 포함할 수 있다. 용어 "생물학적 분자"는 생물학적 기능을 갖고, 생물학적, 약리학적 또는 약학적 효과 또는 활성을 유도하는 분자로 본원에 사용된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 생물학적 분자는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질이다. 하기의 단백질, 면역글로불린이 바람직하다. 또한, 본 발명은, 원칙적으로는 동일한 생물학적 활성 및 유사한 (감소된) 면역원성을 갖는 특정 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 면역글로불린의 변이체 및 다른 변형을 포함한다. 또한, sFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fc 와 같은 항체의 절편 및 단백질의 생물학적 효과를 갖는 절편 이 포함된다. 인간 기원의 항체 또는 인간화 항체는 인간에게서 면역원성이 자명하게 낮거나 전혀 나타내지 않고, 비인간 항체와 비교하여 면역원성 에피토프가 없거나 작은 갯수로 갖는다. 그럼에도 불구하고, 이들 중의 일부는 인간에게서 현저한 면역 반응을 유인하는 것으로 나타나기 때문에, 상기 분자를 탈면역화시킬 필요가 또한 있다. 또한, 목적하지 않게 너무 강한 면역 반응을 유인하는 항원은 본 발명의 방법에 따라 변형될 수 있고, 면역원성은 감소되지만 예컨대 백신으로서 항원을 사용하기에는 충분히 강한 항원을 초래할 수 있다.
예컨대 다른 포유동물 공급원으로부터 동정된 렙틴과 같은 일부 분자는 통상적으로 본 개시 중의 수많은 펩티드 서열을 갖고, 대부분은 통상적으로 개시된 목록의 것과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 펩티드 서열을 가질 것이다. 따라서, 상기 단백질 서열은 본 발명의 범위내에 동등하게 속한다.
본 발명은, 단백질로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프의 제거 또는 그의 실질적인 활성 감소를 초래하는 위치에서 수행한 본 발명에 따른 생물학적 분자의 유사체에 관한 것이다.
하기 실시예의 표에서 동정된 임의의 잠재적인 MHC 클래스 II 리간드내의 특정한 지점에서의 하나 이상의 아미노산의 치환은, 인간 숙주에 치료제로서 투여될 경우, 감소된 잠재적인 면역원성을 갖는 분자를 초래할 수 있다. 바람직하게는, T-세포 에피토프의 활성의 실질적인 감소 또는 제거를 성취하는 것으로 예상되는 펩티스 서열내의 적당한 위치에서 아미노산 치환이 수행된다. 실제로, 상기 적당한 지점은 바람직하게는 MHC 클래스 II 결합 그루브내에 제공된 소수성 포켓 중 하나 내에서 결합하는 아미노산과 동등할 것이다. MHC 결합 틈(cleft)내 다른 포켓 영역 내에서의 결합과 동등한 위치에서 펩티드내 아미노산 잔기는 또한 고려되고, 본 발명의 범위내에 속한다.
주어진 잠재적인 T-세포 에피토프내의 단일 아미노산 치환은 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 경로이다. 단일 에피토프 내의 조합된 치환이 고려될 수 있으며, 예컨대 개별적으로 정의된 에피토프가 서로 중복되는 경우에 특히 적합하다. 또한, 주어진 에피토프내에서 단독으로 또는 단일 에피토프내에서 조합된 아미노산 치환은 MHC 클래스 II 결합 그루브에 대한 "포켓 잔기"와 동등하지는 않더라도, 펩티드 서열내의 임의의 위치에서 수행될 수 있다. 상기 모든 치환은 본 발명의 범위내에 속한다.
상기 동정된 펩티드 내부와는 다른 아미노산 치환이, 나열된 펩티드 내에서 수행된 치환(들)과 조합하여 수행될 경우 특히 고려될 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자의 구조 또는 생물학적 활성을 회복하기 위한 변형이 고려될 수 있다. 상기 보상적인 변화, 및 목적하는 활성을 갖는 변이체를 생성하고 개시된 펩티드의 임의의 변화와 조합되는 본 발명에 따른 분자로부터의 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 부가를 포함하는 변화는 본 발명의 범위에 속한다.
또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 면역원성이 감소된 상기 생물학적 분자를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 유전자 구축물 및 유전자 산물의 제조 방법은 당업계에 자명하게 공지되어 있다. 마지막 양태에 의하면, 본 발명은 본 발명에서 개시된 방법에 의해 수득될 수 있는 상기 생물학적 분자를 포함하는 약학 조 성물, 및 상기 변형된 분자 및 약학적 조성물을 사용하는 인간의 치료적 처방 방법에 관한 것이다.
하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 본원에 기재된 컴퓨터적 방법은 임의의 펩티드 내에서 T-세포 에피토프를 찾을 경우, 매우 우수한 지침을 제공한다. 따라서, 이는, 하나 이상의 아미노산 잔기 변화에 의해 변형될 경우, T-세포 에피토프를 제거하는 효과를 가지고, 따라서 펩티드의 치료적 가치를 강화하는 아미노산 잔기 서열 영역의 동정을 가능하게한다. 상기 방법에 의해서, 강화된 특성 및 약리학적 가치를 갖는 펩티드, 단백질, 면역글로불린 및 융합 단백질 등과 같은 생물학적 분자가 제조될 수 있다.
하기의 상세한 설명 및 실시예들은 예시하고자 의도된 것이며, 한정하는 것으로 간주되어서는 않된다. 본 발명의 범위내의 다른 변형이 또한 가능하며, 이는 당업자에게 용이하게 인식될 것이다.
실시예 1
본 실시예는 I 형 당뇨병의 발전에 관련된 자기항원 글루탐산 데카르복실라아제 이성질체 (GAD 65; MW : 65,000) 의 T-세포 에피토프 가능성 프로필을 보여준다. 상기의 특정한 단백질은 T-세포 에피토프의 친화도를 증가시키기 위한 잠재적인 표적이 될 수 있고, 상대적으로 큰 펩티드 (585 아미노산 잔기)이고, 따라서 프로필하기 위해 상대적으로 큰 샘플 크기를 제공하기 때문에, T-세포 에피토프 가능성 지수를 나타내기 위한 우수한 예를 제공한다.
GAD65 에 대한 T-세포 에피토프 가능성 프로필은 도 5 에 나타낸다. 실선은 도 1 에 보여지는 컴퓨터적 방법을 사용하여 계산된 T-세포 에피토프 지수를 나타내고, 점선은 도 3 및 4 에서 나타내어진 컴퓨터적 방법을 사용하여 예상된 T-세포 에피토프 지수를 나타낸다.
실시예 2
본 실시예는 적혈구 세포수를 상승(boost)시키기 위한 정맥내 (IV) 투여 약물로서 폭넓게 사용되는 193 아미노산 잔기 길이의 사이토카인인 에리트로포이에틴 (EPO)의 T-세포 에피토프 가능성 프로필을 나타낸다. 이는, 치료적 가치가 있지만 적당하지 않거나 요구되지 않는 면역 반응을 유도할 수 있고, IV 투여 경로로 사용되며, 따라서 이의 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정한 후에 탈면역화에 의해 이득을 얻을 수 있는 생물학적 약물의 우수한 예이다.
EPO 에 대한 T-세포 에피토프 가능성 프로필은 도 6 에 나타낸다. 실선은 도 1 에 보여지는 컴퓨터적 방법을 사용하여 계산된 T-세포 에피토프 지수를 나타내고, 점선은 도 3 및 4 에서 나타내어진 컴퓨터적 방법을 사용하여 예상된 T-세포 에피토프 지수를 나타낸다.
실시예 3
도 7 및 도 8 은, A33 항원을 표적하는 마우스 인간화 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 T-세포 에피토프 지수를 나타낸다. 후자는 95% 초과의 장 암 (bowel cancer)의 표면 상에서 발현되는 경막 (transmembrane) 당단백질이고, 따라서 항암 치료제로서 잠재성을 갖는다.
도 7 및 도 8 에서, 실선은 도 1 에 보여지는 컴퓨터적 방법을 사용하여 계산된 T-세포 에피토프 지수를 나타내고, 점선은 도 3 및 4 에서 나타내어진 컴퓨터적 방법을 사용하여 예상된 T-세포 에피토프 지수를 나타낸다.
실시예 4 (렙틴)
상기 치료적으로 가치있는 분자 중 하나는 "렙틴" 으로 불려지는 인간 비만 단백질이다. 렙틴은 지방 질량을 유지하는 항상성 메커니즘에 관련된 146 아미노산 잔기의 분비성 신호전달 단백질이다 (예컨대, WO 00/40615, WO 98/28427, WO 96/05309). 이 단백질 (및 이의 안타고니스트) 은 당뇨병, 고혈압 및 콜레스테롤 물질 대사의 치료를 위한 현저한 치료적 잠재성을 제공한다. 이 단백질은 수많은 상이한 숙주 T-세포 유형을 이용하여 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. (한 문자 코드로 나타내어진) 렙틴의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00025
면역원성이 미변형된 인간 비만 단백질 (렙틴)의 서열의 일부이고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 아미노산 서열은, 본 발명의 방법에 따라 동정된 하기의 군으로부터 선택된다.
Figure 112003030457578-pct00026
상기 인용된 임의의 펩티드 서열은 하나 이상의 아미노산을 교환하는 것에 의해 변형시켜 면역원성이 감소되거나 전혀 없는 서열을 수득하기 위해서 사용될 수 있다.
인간 렙틴 (WT = 야생형) 의 잠재적인 T-세포 에피토프의 제거를 유도하는 본 발명의 방법에 따라 수행된 치환은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00027
실시예 5 (Il-1R 안타고니스트)
IL-1 은 각종 조직에 대한 다면작용 효과 (pleiotropic effect)를 갖지만 류마티스 관절염에 관련된 병리학 및 국부 조직 손상에 관련된 다른 질환에 기여할 수 있는 중요한 염증 및 면역 조절 사이토카인이다. IL-1 의 작용을 억제할 수 있는 IL-1 수용체 안타고니스트가 정제되고, 유전자 클로닝되었다 [Eisenburg S.P. 등 (1990) Nature, 343: 341-346; Carter, D.B. 등 (1990) Nature, 344: 633-637]. 그외에 IL-1Ra 분자 [예컨대, US 5,075,222]가 제공되었다.
(한문자 코드로 나타낸) Il-1Ra 의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00028
면역원성이 미변형된 IL-1Ra 의 서열의 일부이고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 아미노산 서열은 하기의 군으로부터 선택된다.
Figure 112003030457578-pct00029
상기 인용된 임의의 펩티드 서열은 하나 이상의 아미노산을 교환하는 것에 의해 변형시켜 면역원성이 감소되거나 전혀 없는 서열을 수득하기 위해서 사용될 수 있다.
잠재적인 T-세포 에피토프의 제거를 유도하는 치환은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00030
실시예 6 (BDNF)
또 다른 치료적으로 가치있는 분자는 "인간 뇌 유래의 신경자극 인자 (BDNF)" 이다. BDNF 는 신경 성장 인자 계열의 단백질의 당단백질이다. 119 아미노산의 성숙 당단백질은 큰 전구체로부터 처리되어, 신경 세포 집단의 생존을 촉진하는 신경 자극 인자를 생성한다 [Jone K.R. & Reichardt, L.F. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87: 8060-8064]. 이러한 신경 세포는 중추 신경계에 모두 위치되거나 이에 직접적으로 연결된다. BNDF 의 재조합 제제는 신경 재생의 촉진 및 퇴행성 질환의 치료를 위한 치료적 잠재성을 갖는 단백질을 탐색할 수 있도록 하였다.
(한문자 코드로 표시된) 인간 뇌 유래의 신경 자극 인자 (BDNF) 의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure 112003030457578-pct00031
다르게는, 미변형된 BNDF 분자 [US 5,770,577] 및 재조합 BNDF 분자의 상업적 생성물로의 접근법 [US 5,986,070] 이 제공된다.
면역원성이 미변형된 인간 뇌 유래 신경 자극 인자 (BDNF) 의 서열의 일부이고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 아미노산 서열은 하기의 군으로부터 선택된다:
Figure 112003030457578-pct00032
상기 인용된 임의의 펩티드 서열은 하나 이상의 아미노산 서열을 변형시켜 면역원성이 감소되거나 전혀 없는 서열을 수득하기 위해 사용될 수 있다:
인간 뇌 유래 신경 자극 인자 (BDNF) (WT = 야생형)의 잠재적인 T-세포 에피토프의 제거를 유도하는 치환은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00033
Figure 112003030457578-pct00034
실시예 7 (EPO)
또 다른 치료적으로 가치있는 분자는 에리트리포이에틴 (EPO)이다. EPO 는 적혈구 선대 세포를 적혈구 (erythrocyte)로 성숙시키는데 관련된 당단백질 호르몬이다. 천연의 EPO 는 태아기의 간 및 어른의 신장에서 생성되고, 혈액 중에서 순환하여, 골수에서 적혈구 세포의 생성을 자극한다. 신장으로부터의 감소된 EPO 생성으로 인해, 빈혈은 신부전증 (renal failure) 의 거의 변함없는 결과 이다. 재조합 EPO 는 만성 신부전증으로부터 초래되는 빈혈의 효과적인 치료법으로서 사용된다. 인간 에리트로포이에틴 중 1-165 의 아미노산 서열을 갖는 재조합 EPO (포유 동물 세포에서 발현) [Jacobs, K. 등 (1985) Nature, 313, 806-810; Lin, F.-K. 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7580-7585] 는 말단 시알산 잔기를 각각 함유하는 3 개의 N-연결 및 1 개의 O-연결 올리고사카라이드를 함유한다. 후자는 간의 아시알로글리코프로테인 결합 단백질에 의해 순환으로부터의 빠른 제거를 EPO 가 피할 수 있도록 함에 있어 중요하다.
(한문자 코드로 표시된) EPO의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00035
면역원성이 미변형된 인간 에리트로포이에틴 (EPO) 의 서열의 일부이고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 아미노산 서열은 하기의 군으로부터 선택된다:
Figure 112003030457578-pct00036
Figure 112003030457578-pct00037
인간 에리트로포이에틴 (EPO) (WT = 야생형)의 잠재적인 T-세포 에피토프의 제거를 유도하는 치환은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00038
Figure 112003030457578-pct00039
실시예 8 (G-CSF)
과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 는 혈액 호중구 (neutrophil)의 증가가 이득을 제공하는 징후의 치료에 현재 사용되는 중요한 조혈 사이토카인이다. 상기는 암 치료, 각종 감염 질환 및 패혈증과 같은 관련 질병 상태를 포함한다. G-CSF 는 또한 단독으로, 또는 골수 이식을 위한 조혈 세포의 생체외 전개에서 다른 화합물과 사이토카인의 조합으로 사용된다.
이 사이토카인의 경우, 두 가지 형태의 인간 G-CSF 가 통상적으로 인식된다. 하나는 177 아미노산의 단백질이고 다른 하나는 174 아미노산의 단백질이며 [Nagata 등 (1986), EMBO J. 5: 575-581], 174 아미노산 형태는 특이성이 가장 높은 생체내 생물학적 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 재조합 DNA 기술은, 진핵 및 원핵 숙주 세포 발현계를 모두 이용하여, 상업적 규모의 양으로 G-CSF 의 생산을 가능하게 한다.
(한문자 코드로 표시된) 인간 과립구 자극 인자 (G-CSF) 의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00040
G-CSF 의 다른 펩티드 유사체 및 펩티드 절편은 앞서 개시되었고, 부위 특이적 아미노산 치환에 의해 또는 화학적 부가에 의한 변형에 의해 변형된 형태를 포함한다. 따라서, US 4,810,643 은 다른 아미노산으로 대체된 특정한 Cys 잔기를 갖는 유사체 및 첫 번째 위치 (N-말단) 위치에 Ala 잔기를 갖는 G-CSF 를 개시한다. EP 0335423 은 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 중의 하나 이상의 아미노기의 변형을 개시한다. EP0272703 은 N 말단 근처의 아마노산을 치환하거나 결실시킨 G-CSF 유도체를 개시한다. EP 0459630 은 Cys17 및 Asp27 이 Ser 잔기로 대체된 G-CSF 유도체를 개시한다. EP 0 243 153 은 재조합 생성물의 증가된 수율을 위해 하나 이상의 효모 KEX2 프로테아제 처리 부위를 불활성화시켜 변형시킨 G-CSF 를 개시하고, US 4,904,584 는 리신 변형 단백질을 개시한다. WO 90/12874 는 또한 Cys 변형 변이체를 개시하고, 호주 특허 문헌 AU 10948/92 는 원핵 세포에서의 발현 후 단백질의 폴딩을 돕기 위한 목적으로 G-CSF 분자의 어느 한 말단으로의 아미노산의 첨가를 개시한다. AU-76380/91 은 G-CSF 174 아미노산 형태의 50-56 위치에서의 G-CSF 변이체, 및 177 아미노산 형태의 53-59 위치에서의 G-CSF 변이체를 개시한다. 특정 His 잔기에서의 추가적인 변화가 또한 개시되었다.
면역학적으로 미변형인 인간 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 서열의 일부이고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 아미노산 서열은 하기의 군으로부터 선택된다:
Figure 112003030457578-pct00041
상기 인용된 임의의 펩티드 서열은 하나 이상의 아미노산을 교환하여 변형시킴으로써 면역원성이 감소되거나 전혀 없는 서열을 수득하기 위해 사용될 수 있다.
인간 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) (WT = 야생형) 의 잠재적인 T-세포 에피토프의 제거를 유도하는 치환은 다음과 같다:
Figure 112003030457578-pct00042
실시예 9 (KGF)
또 다른 가치있는 분자는 케라티노사이트 성장 인자 (KGF) 이다. KGF 는 섬유아세포 성장 인자 (FGF)/헤파린 결합 성장인자 계열의 단백질에 속한다. 이는 폐에서 주로 발현되는 분비성 당단백질로, 케라티노사이트 및 기타 상피 세포의 성장을 자극하여 치유를 촉진시킬 수 있다 [Finch 등 (1989), Science 24: 752-755; Rubin 등 (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 802-806]. 성숙 (처리된) 형태의 당단백질은 163 개의 아미노산 잔기를 포함하고, 특정 세포주의 배양 후에 조건화 배지로부터 단리될 수 있거나 [Rubin 등, (1989) ibid.], 재조합 기술을 사용하여 생산될 수 있다 [Ron 등 (1993) J. Biol. Chem. 268: 2984-2988]. 이 단백질은 수많은 상당한 질환 및 상처 회복 환경에 있어서 상피 세포 성장의 자극으로 인해 치료적 가치가 있다. 구체적으로, 상기 개시물은 163 개 아미노산 잔기의 성숙 (처리된) 형태인 인간 KGF 단백질에 관한 것이다. 다른 것들에서도, KGF 분자 [예컨대, US 6,008,328; WO 90/08771] 및 변형된 KGF [Ron 등 (1993) ibid; WO 9501434]를 제공한다. 그러나, 상기 개시내용은 단백질의 면역원성 특성에 대한 T-세포 에피토프의 중요성을 인식하지 못하며, 본 발명의 개념에 따른 특정되고 제어된 방식으로 상기 특성에 직접적으로 영향을 미치는 것에 대해서도 고려하지 않는다.
(한문자 코드로 표시된) 케라티노사이트 성장 인자 (KGF) 의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00043
면역학적으로 변형되지 않은 인간 케라티노사이트 성장 인자 (KGF) 서열의 일부이고, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 아미노산 서열은 하기의 군으로부터 선택된다:
Figure 112003030457578-pct00044
Figure 112003030457578-pct00045
상기 인용된 임의의 펩티드 서열은 하나 이상의 아미노산을 교환하여 변형시킴으로써 면역원성이 감소되거나 전혀 없는 서열을 수득하기 위하여 사용될 수 있다.
인간 케라티노사이트 성장 인자 (KGF) (WT = 야생형) 의 잠재적인 T-세포 에피토프의 제거를 유도하는 치환은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00046
실시예 10 (가용성 TNF RI)
sTNF-RI (가용성 종양 괴사 인자 수용체 타입 I) 은 종래에 기재된 종양 괴사 인자 수용체 [Gray, P.W. 등 (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87: 7380-7384; Loetschere, H. 등 (1990) Cell 61: 351-359; Schall, T.J. 등 (1990) Cell 61: 361-370] 의 유도체로, 온전한 수용체의 세포외 도메인을 포함하고 약 30 KDa 의 분자량을 나타낸다. 추가적인 가용성 TNF 억제제, 특히 40 KDa 의 형태가 또한 공지되었다 [US 6,143,866]. 상기 가용성 형태는 종양 괴사 인자 알파와 높은 친화도로 결합할 수 있고, 실험관내에서 사이토카인의 세포독성 활성을 억제한다. sTNF-RI 의 재조합 제제는 과도한 수준의 종양 괴사 인자가 발병학적 효과를 유발하는 질환의 치료에 상당한 치료적 가치가 있다. 악액질, 패혈증, 및 특히 류마티스 관절염 및 그외의 다른 것들을 포함하는 자가면역 질병과 같은 징후는 sTNF-RI 의 상기 치료 제제에 의해 표적될 수 있다. Brewer 등 (US 6,143,866) 을 포함한 다른 것들은 변형된 sTNF-RI 분자를 제공한다.
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는, 인간 30 KDa sTNF-RI 중의 펩티드 서열은 다음과 같다:
Figure 112003030457578-pct00047
상기 인용된 임의의 펩티드 서열은 하나 이상의 아미노산을 교환하여 변형시킴으로써 면역원성이 감소되거나 전혀 없는 서열을 수득하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 11 (가용성 TNF-R2)
가용성 종양 괴사 인자 수용체 2 (sTNF-R2) 는, 종래에 기재된 인간 종양 괴 사 인자 수용체 2 [Smith, C.A. 등 (1990) Science 248: 1019-1023; Kohno, T. 등 (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87: 8331-8335; Beltinger, C.P. 등 (1996) Genomics 35: 94-100] 의 유도체로, 온전한 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 가용성 형태는 종양 괴사 인자와 높은 친화도로 결합할 수 있고, 실험관내에서 상기 사이토카인의 세포독성 활성을 억제한다. sTNF-R2 의 재조합 제제는 과도한 수준의 종양 괴사 인자가 발병학적 효과를 유발하는 질환의 치료에 상당한 치료적 가치를 갖는다. 이태너셉트 (ethanercept) 로 불려지는 특정한 재조합 제제는 류마티스 관절염의 치료를 위한 임상 승인을 취득하였고, 상기 및 그외 유사한 제제는 악액질, 패혈증 및 자가면역 질환과 같은 다른 징후의 치료에 있어 가치를 가질 수 있다. 이태너셉트는 인간 IgG1 분자의 Fc 도메인과 조합된 인간 TNFR2 분자의 세포외 도메인을 포함하는 이합체 융합 단백질이다. 상기 이합체 분자는 934 아미노산을 포함한다 [US 5,395,760; US 5,605,690; US 5,945,397; US RE36,755].
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간 TNFR2 단백질의 TNF 결합 도메인 중의 펩티드 서열은 다음과 같다:
Figure 112003030457578-pct00048
실시예 12 (β-GCR)
베타-글루코세레브로시다아제 (β-D-글루코실-N-아실스핑고신 글루코히드롤라아제, E.C.3.2.1.45) 는 497 아미노산 잔기의 단위체 당단백질이다. 이 효소는 당지질 글루코세레브로시드의 글루코오스와 세라미드로의 가수분해를 촉매한다. GCR 활성의 결핍은 가우쳐 질환 (Gaucher disease) 으로 언급되는 라이소좀 저장 질환을 초래한다. 이 질환은, 간, 비장, 골수 및 기타 기관에서 축적되는, 글루코세레브로시드 집결 조직 대식세포의 축적을 특징으로 한다. 이 질환은, 신경 침습 (neuronal involvement)이 없는 혈액학적 문제를 갖는 타입 1 질환으로부터, 태생 후 초기에 과도한 신경 침습을 갖는 타입 2 질환에까지 심각성의 정도가 다양하며, 일반적으로는 진행성이어서 2 살 내에 치사한다. 타입 3 질환은 또한 일부 분류내에서 인식되어지며, 또한 신경학적 침습을 나타낸다. 가우쳐 질환에 대한 종래의 유일한 유용한 치료법은 인간 태반으로부터 유래한 GCR 의 투여였지만, 더욱 최근에는 재조합 GCR ("세레다아제 (ceredase)" 및 "세레자임(cerezyme)")의 약학적 제제가 타입 1 질환의 치료에 있어서 효능을 나타내었다 [Niederau, C. 등 (1998) Eur. J. Med. Res. 3: 25-30].
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간 GCR 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00049
Figure 112003030457578-pct00050
실시예 13 (단백질 C)
단백질 C 는 응혈의 조절에 관련된 비타민 K 의존성 세린 프로테아제이다. 이 단백질은 트롬빈에 의해 활성화되어, 응혈 캐스케이드 중의 인자 Va 및 VIII 를 차례로 분해(하향조절)하는 활성화 단백질 C 를 생성한다. 단백질 C 는 단일쇄 전구체로서 간에서 발현되고, 디술피드 연결에 의해 함께 지탱되는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 분자를 초래하는 일련의 진행 사건을 수행한다. 단백질 C 는 트롬빈에 의해 중쇄의 N-말단으로부터 테트라데칸펩티드의 절단에 의해 활성화된다. 본래 또는 활성화 형태의 단백질 C 의 약학적 제제는 혈관 질환 및/또는 후천성 단백질 C 결핍을 갖는 환자의 치료에 있어 가치를 갖는다. 따라서, 이러한 환자는 혈전성 중풍 (thrombotic stroke), 또는 패혈증에 관련된 단백질 C 결핍, 이식 절차, 임신, 중화상, 주요 수술 또는 기타 심각한 외상으로부터 고생하는 개체를 포함한다. 단백질 C 는 또한 유전적 단백질 C 결핍을 갖는 개체의 치료에 사용된다. 본 개시물은, 구체적으로는, 155 개 아미노산 잔기의 경쇄 및 262 아미노산 잔기의 중쇄를 포함하는 성숙 (처리된) 인간 단백질 C [Foster, D.C. 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 4673-4677; Beckman, R.J. 등 (1985) Nucleic Acids Res. 13: 5233-5247]에 관한 것이다. 그외에, 단백질 C 분자를 포함하는 활성화 단백질 C 제형 및 사용 방법이 제공된다 [US 6,159,468; US 6,156,734; US 6,037,322; US 5,618,714]. 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간 단백질 C 중쇄 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00051
Figure 112003030457578-pct00052
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 단백질 C 경쇄 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00053
실시예 14 (서브틸리신)
서브틸리신들은 상당히 경제적 및 상업적 중요성을 갖는 프로테아제 계열의 효소이다. 이들은 세제 또는 화장품의 성분으로서, 또는 직물의 제조 및 기타 산업 및 소비 제제에 있어서 사용될 수 있다. 특정한 인간 대상체가 박테리아 서브틸리신에 노출될 경우, 이들 개체들에서 원치않는 과민반응이 유발될 수 있다. 강화된 특성, 특히 단백질의 생물학적 특성이 개선된 서브틸리신 유사체에 대한 요구가 존재한다. 이와 관련하여, 인간 대상체에 면역 반응을 유도하는 잠재성이 감소되거나 존재하지 않는 서브틸리신을 제공하는 것이 상당히 요구되고 있다. 박테리아, 균, 또는 포유 동물 유기체 및 인간을 포함한 척추동물 공급원을 포함하는 기타 공급원으로부터 동정된 서브틸리신 단백질은 통상적으로 본 개시물중의 수많은 펩티드 서열을 갖고, 통상적으로 개시된 목록의 것과 실질적으로 동일한 수많은 펩티드 서열을 갖는다. 따라서, 상기 단백질 서열은 본 발명의 범위내에 동등하게 속한다. 그외에, 변형된 서브틸리신을 포함한 서브틸리신 분자가 제공 되었다 [US 5,700,676; US 4,914,031; US 5,397,705; US 5,972,682].
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 B. 렌투스 서브틸리신 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00054
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 B. 아밀로리쿠에파시엔스 서브틸리신 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00055
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 B. 서브틸리스 서브틸리신 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00056
Figure 112003030457578-pct00057
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 B. 리체니포르미스 서브틸리신 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00058
Figure 112003030457578-pct00059
실시예 15 (CNTF 의 리간드)
본 발명은 인간의 모양체 신경자극 인자 (CNTF) 수용체 복합체에 대한 이종이합체 리간드 (heterodimeric ligand) 를 포함하는 단백질 서브유닛의 변형된 형태를 제공한다. 수용체 복합체는 CNTF 와, 카디오트로핀(cardiotrophin)형 사이토카인 (CLC) 및 가용성 수용체 사이토카인형 인자 1 (CLF) 를 함유하는 이종이 합체 복합체를 포함한 둘 이상의 리간드에 의해 활성화된다 [Elson G.C.A. 등 (2000) Nature Neuroscience 3: 867-872]. CLC 는 IL-6 계열의 사이토카인 단백질이고, 신규한 뉴로트로핀-1/B 세포 자극 인자-3 으로도 또한 알려져 있다 [Senaldi, G. 등 (1999) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 11458-11463, US 5,741,772]. CLF 는 사이토카인 타입 I 수용체 계열의 단백질과 유사하고 [Elson, G.C.A. 등 (1998) Journal of Immunol. 161: 1371-1379], NR6 로서 또한 동정되었다 [Alexander W.S. 등 (1999) Curr. Biol. 9: 605-608]. CLC 및 CLF 의 회합에 의해 형성된 이종이합체는 CNTFR 과 직접적으로 상호작용하는 것으로 보여졌으며, 그리하여 생성된 삼합체 복합체는 CNTFR 복합체의 다른 인식 성분, 예컨대 gp130 및 LIFR 을 발현하는 세포내에서 신호전달 사건을 자극할 수 있다 [Elson G.C.A. 등 (2000) ibid].
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간 CLC 의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00060
Figure 112003030457578-pct00061
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간 CLF 의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00062
Figure 112003030457578-pct00063
실시예 16 (여포 자극 호르몬)
본 발명은 하나 이상의 T 세포 에피토프가 제거된 인간 hFSH 의 변형된 형태를 제공한다. hFSH 는 두 개의 당단백질 서브유닛을 함유하는 이합체 구조를 갖는 당단백질 호르몬이다. 이 단백질은 인간 불임의 치료에 있어 치료적으로 사용되며, 이 단백질의 제조합 형태는 수많은 임상실험의 대상체이었다 [Out, H.J. 등 (1995) Hum. Reprod. 10: 2534-2540; Hedon, B. 등 (1995) Hum. Repord. 10: 3102-3106; Recombinant Human FSH study Group (1995) Fertil. Steril. 63: 77-86; Provost, R.R. (1998) Pharmacotherapy 18: 1001-1010].
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간 hFSH 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00064
실시예 16 (리신 A)
본 발명은 하나 이상의 T 세포 에피토프가 제거된 리신 독소 A-사슬 (RTA)의 변형된 형태를 제공한다. 리신은 본래에는 카스토르 식물의 씨로부터 단리되는 세포독소이고, 타입 II 리보좀 불활성화 단백질 (RIP) 의 예이다. 본래의 성숙 단백질은 267 개 아미노산 잔기의 RTA 및 그에 디술피드 연결로 연결된 262 아미노산 잔기의 리신 B-사슬을 포함하는 이종이합체이다. B-사슬은 갈락토시드에 대해 결합 친화도를 갖는 렉틴이다. 본래 단백질은 B-사슬을 통해 세포에 결합하여, 세포내이입 (endocytosis)에 의해 세포로 들어갈 수 있다. 세포 내부에서, RTA 가 디술피드 연결의 환원에 의해 B-사슬로부터 방출되고, 알려지지 않은 메커니즘을 통해 엔도좀으로부터 세포질로 방출된다. 세포질에서, 독소는 특정한 N-글리코실라아제로서 작용하여 리보좀을 빠르게 분해함으로써, 단백질 번역 및 세포 사멸의 중단을 초래한다. RTA 및 기타 RIP 의 과도한 세포독성은, 암과 특정 세포 집단의 제거가 요구되는 기타 질환의 치료에 실험적 치료법으로써 이들의 사용을 유도하였다. RTA 에 연결된 항체 분자를 함유하는 면역독소(Immunotoxin) 분자가 제조되었고, 수많은 임상 실험에서 사용되었다 [Ghetie, M.A. 등 (1991) Cancer Res. 51: 5876-5880; Vitetta, E.S. 등 (1991) Cancer Res. 51: 4052-5058; Amlot, P.L. 등 (1993) Blood 82: 2624-2633; Conry, R.M. 등 (1995) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 18: 231-241; Schnell, R. 등 (2000) Leukaemia 14: 129-135]. 면역독소에서, 항체 도메인은 목적하는 표적 세포의 표면과의 결합을 제공하고, RTA 와의 연결은 화학적 가교연결을 통해 또는 재조합 융합 단백질로서 이루어질 수 있다.
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 리신 독소 a-사슬 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00065
실시예 17 (지방세포 보체 관련 단백질)
본 발명은 하나 이상의 T 세포 에피토프가 제거된 인간 또는 마우스 Acrp30 의 변형된 형태를 제공한다. Acrp30 은 지방 세포에 의해 유일하게 발현되는 분자량 약 30 kDa 의 풍부한 혈청 단백질이다 [Scherer, P.E. 등 (1995) J. Biol. Chem. 270: 26746-26749]. 인간 유전자 Acrp30 단백질 서열은 예컨대 US 5,869,330 에서 개시한다. 이 단백질의 분비는 인슐린에 의해 강화되고, 이 단백질의 수준은 비만 대상체에게서 감소된다. 상기 단백질은 에너지 균형의 조절, 특히 지방산 물질대사의 조절에 관련되어 있다. 4 개의 서열 도메인이 마우스 및 인간 단백질에서 동정되었고, 이는 절단된 N-말단 시그널, 다른 단백질과의 인식된 상동성이 없는 영역, 콜라겐-유사 도메인 및 구체(globular) 도메인을 포함한다. 구체 도메인은 프로테아제 처리에 의해 마우스 단백질로부터 제거되어, gAcrp30 을 생성할 수 있다. 뮤린 gAcrp30 제제는 약학적 특성을 갖고, 고지방 식이 투여 또는 정맥내(i.v.) 지질 주입 후에 마우스 혈청 중의 유리 지방산의 상승된 수준을 감소시키는 것으로 보여졌다 [Fruebis, J. 등 (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 2005-2010].
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 마우스 Acrp30 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00066
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간 Acrp30 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00067
실시예 18 (항-C5 항체)
본 발명은 인간 C5 보체 단백질에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체의 변형된 형태를 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 T 세포 에피토프가 제거된 변형된 항체를 제공한다. C5 보체 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 항체는 C5 전화효소 (convertase)의 절단 활성을 차단하여, 프로-염증(pro-inflammatory) 성분 C5a 및 C5b-9 의 생성을 억제한다. 보체계의 활성화는 수많은 급성 및 만성 질환의 발병에 있어 상당한 기여 인자이며, C5 수준에서의 보체 캐스케이드의 억제는 이들 중 일부에 대한 치료 경로로서 가망이 있다 [Morgan B.P. (1994) Eur. J. Clin. Invest. 24: 219-228]. 수많은 항-C5 항체 및 이들의 치료적 사용 방법이 당업계에 기술되었다 [Wurzner R. 등 (1991) Complement Inflamm. 8: 328-340; Thomas, T.C. 등 (1996) Molecular Immunology 33: 1389-14012; US 5,853,722; US 6,074,64]. 5G1.1 로 명칭된 항체 [Thomas, T.C. 등 (1996) ibid] 및 단일쇄 인간화 변이체에 대하여, 심폐바이패스 (cardiopulmonary bypass) [Fitch, J.C.K. 등 (1999) Circulation 100: 2499-2506] 및 류마티스 관절염을 포함한 수많은 질환의 징후에 대한 임상실험이 수행되었다. 본 발명은, 5G1.1 로 지칭된 항-C5 항체 [Thomas, T.C 등] 내에서 동정된 서열을 개시한다. 개시된 서열은, MHC 클래스 II 결합 잠재성으로 인해, 잠재적인 T 세포 에피토프가 되는 항체 서열 중 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 도메인으로부터 유래한다. 본 개시물은 또한 단일쇄 및 "인간화" 변이체 5G1.1 항체 [Thomas, T.C. 등 (1996) ibid] 내의 잠재적인 에피토프를 동정한다.
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 항체 5G1.1 의 중쇄 가변 영역 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00068
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 항체 5G1.1 의 경쇄 가변 영역 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00069
실시예 19 (항-CD20 항체)
본 발명은 인간 CD20 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체의 변형된 형태를 제공한다. CD20 은, 90% 초과의 B-세포 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymhomas) (NHL) 을 포함하는 미숙 B-세포 및 성숙 B-세포 상에 발현된는 B-세포 특이적 표면 분자이다. CD20 을 표적하는 모노클로날 항체 및 방사선면역복합체 (radioimmunoconjugate)는 NHL 의 새로운 치료법으로서 대두되었다. 중요한 예는 모노클로날 항체 2B8 [Reff, M.E. 등 (1994) blood 83: 435-445] 및 B1 [US 6,090,365] 를 포함한다. 2B8 의 가변 영역 도메인이 클로닝되었고, 인간 보존 영역 도메인 (constant region domain) 과 결합시켜, 미국에서는 RituxanTM 으로 [US 5,776,456], 유럽에서는 MabTheraR (rituximab) 로 시판되는 C2B8 으로 지칭된 키메라 항체를 생산한다. C2B8 은 NHL 및 기타 B-세포 질환의 치료를 위한 가치있는 치료제로서 인식된다 [Maloney, D.G. 등 (1997) J. Clin. Oncol. 15: 3266-3274; Maloney, D.G. 등 (1997) Blood 90: 2188-2195]. B1 항체는, 본 경우에, 이 분자 (BexxarTM) 가 131I 방사선면역복합체이고 본래 (콘쥬게이트되지 않은) 항체가 림프종 및 치료저항성 백혈병 (refractory leukemia)의 자가유래 골수 이식 치료를 위한 생체외 정화 요법에서의 유용성을 가질지라도, NHL 치료제로서의 사용에 대한 유사한 성취도 인식되었다 [Freedman, A.S. et al(1990), J. Clin. Oncol. 8: 784]. C2B8 (rituximab) 및 BexxarTM 과 같은 항체의 성공에도 불구하고, 강화된 특성을 갖는 항-CD20 유사체에 대한 지속적인 요구가 존재한다.
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 항체 2B8 의 중쇄 가변 영역 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00070
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 항체 2B8 의 경쇄 가변 영역 중의 펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112003030457578-pct00071
실시예 20
본 발명은 인간 IL-2 수용체에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체의 변형된 형태를 제공한다. 모노클로날 항체는 항-Tac 로 지칭되고, 변형된 형태는 하나 이상의 T 세포 에피토프가 제거된다. 항-Tac 항체는, T 및 B 림프구의 표면 상에 발현되는 인간 고친화성 IL-2 수용체의 알파 서브유닛 (p55-알파, CD25 또는 Tac) 와 매우 특이적으로 결합된다. 항체 결합은 IL-2 가 그의 수용체에 결합하여 T-세포 활성화를 성취해내는 능력을 차단한다. IL-2 안타고니스트로서 작용하는 항-Tac 항체의 능력은 기관 이식 거부의 치료에 있어서 상당한 임상적 잠재성을 갖는다. 마우스 항체를 이용한 임상 연구는, 환자의 높은 비율에서 HAMA 반응의 발전으로 통상적인 면역 억제법 이상으로 장기적 이득이 확인되지는 못했을지라도, 신장 이식을 수행한 환자에게 일부 초기적 이득을 보여주었다 [Kirkham, R.L. 등 (1991) Transplantation 51: 107-113]. 상당한 성분의 단백질이 인간 항체 유전자로부터 동정된 단백질 서열을 함유하도록 가공된 "인간화" 항-Tac 항체가 개발되었다 [Queen, C. 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 10029-10033; US 5,530,101; US 5,585,089; US 6,013,256]. "인간화" 항-Tac (ZenapaxTM 또는 daclizumab) 는, 숙주 질환에 대한 급속한 이식 조작 및 신장 이식 거부의 억제를 위한 면역 억제제로서 임상 실험이 수행되었다 [Anasetti, C. 등 (1994), Blood 84: 1320-1327; Anasetti, C. 등 (1995) Blood 86: Supplement 1:62a; Eckhoff, D.E. 등 (2000) Transdplantation 69: 1867-1872; Ekberg, H. 등 (1999) Transplant Proc. 31: 267-268].
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 마우스 항-Tac 항체의 중쇄 가변 영역 중의 펩티드 서열:
Figure 112003030457578-pct00072
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 마우스 항-Tac 항체의 경쇄 가변 영역 중의 펩티드 서열:
Figure 112003030457578-pct00073
Figure 112003030457578-pct00074
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간화 항-Tac 항체의 중쇄 가변 영역 중의 펩티드 서열:
Figure 112003030457578-pct00075
잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간화 항-Tac 항체의 경쇄 가변 영역 중의 펩티드 서열:
Figure 112003030457578-pct00076
실시예 21 (14.18 항체)
다른 언급이 없다면, 가변 중쇄 및 경쇄 중의 모든 아미노산은 문헌 [Kabat 등, 1991 (Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services)] 에서와 같이 번호매김된다. 잠재적인 T-세포 에피토프는, 중쇄 및 경쇄의 첫번째 아미노산으로부터 계수하여, 에피토프의 첫번째 아미노산의 선상 번호를 이용하여 번호매김된다.
1 마우스 서브그룹 프레임워크와의 비교
뮤린 14.18 VH 및 VK 의 아미노산 서열을, Kabat 뮤린 중쇄 및 경쇄 서브그룹 (Kabat 등, 1991)의 공통 서열과 비교하였다. 14.18 VH 는 마우스 중쇄 서브그룹 II(A) 로 지정할 수 있다. 14.18 VH 의 서열을 서열번호 1 로 나타낸다. 상기 서브그룹에 대한 공통 서열과의 비교는 81 위치의 히스티딘 (일반적으로는 글루타민), 82a 위치의 리신 (일반적으로는 세린 또는 아스파라긴), 93 위치의 발린 (일반적으로는 알라닌) 및 94 위치의 세린 (일반적으로는 아르기닌)이 이 서브그룹에 있어서 비통상적임을 보여준다. 19, 40 및 66 위치의 잔기는 또한 이 서브그룹에서 빈번하지 않게 발견되지만, 항체 구조 및 결합에 약간의 효과를 미치는 것으로 여겨진다. 14.18 VK 는 마우스 카파쇄 서브그룹 II 로 지정될 수 있다. 이 서브그룹에 대한 공통서열과의 비교는 49 위치의 히스티딘이 이 서브그룹에 있어서 비통상적임을 보여준다. 이 잔기는 가장 통상적으로는 티로신이다.
2 인간 프레임워크 (framework) 와의 비교
뮤린 14.18 VH 및 VK 의 아미노산 서열을, 인간 생식선 VH (Tomlinson, I.M. 등 J. Mol. Biol. 1992: 227, 776-798) 및 VK (Cox, 등 (Eur. J. Immunol. 1994; 1-4-: 827-36)) 서열의 디렉토리 중의 서열, 및 또한 인간 생식선 J 영역 서열 (Routledge, E.G. 등, "Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man," Clark, M.등 편저, Academic Titles, Nottingham, pp 13-14, 1991) 과 비교하였다. 14.18 VH 에 대해 선택된 참조 인간 프레임워크는 인간 JH6 를 갖는 DP25 이었다. 이 생식선 서열은 어떠한 아미노산 변화도 없는 재배열 성숙 항체 유전자에서 발견되었다. 프레임워크 3 에 대해서, 성숙 인간 항체 29 의 서열이 사용되었다. 이 서열은 CDR3 에 바로 인접한 뮤린 서열과 동일하다. 14.18 VK 에 대해 선택된 참조 인간 프레임워크는 DPK22 이었다. 이 생식선 서열은 어떠한 아미노산 변화도 없는 재배열 성숙 항체 유전자 내에서 발견되었다. 프레임워크 2 에 대해서, 성숙 인간 항체 163.5 의 서열이 사용되었다. 이 서열은 CDR2 에 바로 인접한 뮤린 서열과 동일하다. J 영역 서열은 인간 JK2 (Routledge 등, 1993) 이었다.
3 "베니어 (veneered)" 서열의 고안
참조 인간 프레임워크 서열의 동정 후에, 14.18 VH 및 VK 프레임워크 내의 일정한 비동일(non-identical) 아미노산 잔기를 인간 참조 서열 중의 대응 아미노산으로 변화시켰다. 항체 구조 및 결합에 중요하다고 여겨지는 잔기를 상기 공정으로부터 배제하고, 변형시키지 않았다. 이 단계에서 유지되는 뮤린 잔기는, N-말단의 잔기로부터 멀리 떨어진, 예컨대 최종 항체의 CDR들에 가까운 대부분 비표면 매장 잔기이었다. 표면 잔기는 주로 인간의 것이고 매장 잔기는 본래의 뮤린 서열과 같으므로, 이 공정은 폭넓게는 "베니어" 항체와 유사한 서열을 생산한다.
4 펩티드 스레딩 분석 (Peptide Threading Analysis)
뮤린 및 베니어의 14.18 VH 및 VK 서열을 본 발명에 따른 방법을 사용하여 분 석하였다. 아미노산 서열을 모든 가능한 13mer 로 나눈다. 13mer 펩티드는 HLA-DR 알로타입의 결합 그루브 (groove) 의 모델 및 각 대립유전자에 대한 각각의 펩티드에 지정된 결합 스코어로 순서대로 나타내어진다. 배치 스코어는 펩티드의 각 포켓 결합 측쇄에 대해서 계산된다. 이 스코어는 입체 오버랩, 펩티드와 결합 그루브 내 잔기 사이의 잠재적인 수소 결합, 펩티드와 포켓 잔기 사이의 정전기적 상호작용 및 선호되는 접촉에 기초한다. 이어서, 각 측쇄의 배치를 변형시키고, 스코어를 재계산한다. 가장 높은 배치 스코어가 측정된 후, 이어서 그루브 결합 소수성 잔기, 비그루브 친수성 잔기 및 결합 그루브로 맞춰지는 잔기의 수를 기초로 하여 결합 스코어가 계산된다. MHC 클래스 II 에 대한 공지된 결합자는 거의 폴스 네거티브 (false negative) 가 없는 상당한 결합 스코어를 달성한다. 따라서, 현 분석에서 현저한 결합 스코어를 성취하는 펩티드는 잠재적인 T-세포 에피토프인 것으로 고려된다. 뮤린 및 베니어 서열에 대한 펩티드 스레딩 분석 결과를 하기 표 1 에 나타낸다.
뮤린 및 베니어 14.18 서열 중의 잠재적인 T-세포 에피토프
서열 잠재적인 T-세포의 수 잠재적인 에피토프의 위치
뮤린 14.18 VH 11 3(17), 9(15), 30(5), 35(17), 39(15), 43(9), 58(12), 62(11), 81(11), 84(16), 101(7)
베니어 14.18 VH 5 43(9), 58(12), 62(11), 81(11), 84(16)
뮤린 14.18 VK 7 7(7), 13(11), 27(15), 49(11), 86(17), 97(11), 100(4)
베니어 14.18 VK 5 27(15), 49(11), 86(17), 97(11), 100(17)
5 잠재적인 T 세포 에피토프의 제거
잠재적인 T-세포 에피토프는 에피토프를 구성하는 특정 펩티드 중에서 아미 노산 치환를 수행하는 것에 의해 제거된다. 치환은 가능하다면 유사한 물리화학적 특성을 갖는 아미노산을 삽입하여 수행하였다. 그러나, 일부의 잠재적인 에피토프를 제거하기 위해서, 상이한 크기, 전하 또는 소수성을 갖는 아미노산이 치환될 필요가 있다. IT 변화는 결합에 효과를 가질 수 있는 CDR 내에서 수행되어야만 하고, 특정 아미노산 치환의 존재 또는 부재하에서 변이체를 만드는 것이 필요하다. 치환용 아미노산 잔기의 선상 번호는 괄호내의 Kabat 번호로 나타내었다. 잠재적인 T 세포 에피토프는 13mer의 첫번째 잔기의 선상 번호에 의해 언급된다.
베니어 14.18 중쇄 가변 영역으로부터 T-세포 에피토프를 제거하는데 요구되는 아미노산 변화는 하기와 같았다:
1. CDR2 중의 잔기 50 의 알리닌의 루신으로의 치환과 함께 잔기 41 (Kabat 번호 41) 의 프롤린을 이소루신으로 치환하는 것은 위치 43 의 잠재적인 에피토프를 제거한다.
2. (1) 과 다르게는, 위치 41 (Kabat 번호 41) 의 프롤린과 함께, 잔기 45 (Kabat 번호 45) 의 루신을 트레오닌으로 치환하는 것은 또한 위치 43 의 잠재적인 에피토프를 제거한다.
3. CDR2 에서 잔기 66 (Kabat 번호 65) 의 글리신을 세린으로, 잔기 68 (Kabat 번호 67) 의 알라닌을 발린으로 치환하는 것은 위치 58 의 잠재적인 에피토프를 제거한다. 세린은 인간 및 마우스 항체 서열 중 이 위치에서 발견된다.
4. 잔기 70 (Kabat 번호 69) 의 루신을 이소루신으로 치환하는 것은 위치 62 의 잠재적인 에피토프에 결합하는 MHC 알로타입의 수를 11 개로부터 4 개로 감소시킨다.
5. 잔기 72 (Kabat 번호 71) 의 발린을 알라닌으로 치환하는 것은 위치 62 의 잠재적인 에피토프를 제거한다. 이 위치의 아미노산 크기는 중요하며, 알라닌은 발란과 크기 및 소수성에 있어서 유사하다.
6. 잔기 91 (Kabat 번호 87) 의 세린을 트레오닌으로 치환하는 것은 위치 81 및 84 의 잠재적인 에피토프를 제거한다.
베니어 14.18 경쇄 가변 영역으로부터 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하는데 요구되는 아미노산 치환은 하기와 같았다:
1. 잔기 32 (Kabat 번호 27e) 의 아르기닌을 세린으로 치환하는 것은 위치 27 의 잠재적인 에피토프를 제거한다. 이 잔기는 CDR2 내에 존재하지만, 세린은 종종 마우스 및 인간 항체 중 tWs 위치에서 발견된다. 상기 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하는 CDR 외에는 변화가 전혀 없다.
2. 잔기 54 (Kabat 번호 49) 의 히스티딘을 티로신으로 치환하는 것은 위치 43 의 잠재적인 에피토프를 제거한다. 티로신은 마우스 및 인간 항체의 위치 49 에서 발견되는 가장 빈번한 아미노산이다.
3. (2) 와 다르게, 위치 43 의 잠재적인 에피토프를 제거하기 위하여, 잔기 51 (Kabat 번호 46) 의 루신을 메티오닌으로 치환한다. 메티오닌은 크기 및 소수성에 있어서 루신과 유사하다.
4. 잔기 88 (Kabat 번호 83) 의 루신을 메티오닌으로 치환하는 것은 위치 86 의 잠재적인 에피토프를 제거한다.
5. CDRH3 중의 잔기 102 (Kabat 번호 96) 의 루신을 트레오닌으로 치환하는 것은, 위치 105 (Kabat 번호 100) 의 글루타민의 글리신으로의 치환과 조합할 경우, 위치 97 의 잠재적인 에피토프와 결합하는 MHC 알로타입의 수를 11 개로부터 5 개로 감소시킨다.
6. 위치 97 의 잠재적인 에피토프를 제거하는 (5) 와는 다른 변화는 잔기 102 (Kabat 번호 96) 의 루신을 프롤린으로 치환하는 것이다.
7. 잔기 110 (Kabat 번호 104) 의 루신을 발린으로 치환하는 것은 위치 100 의 잠재적인 에피토프를 제거한다.
6 탈면역화 서열의 고안
탈면역화 중쇄 및 경쇄 서열은, 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하는데 요구되는 변화를 참조로 하고 항체 구조 및 결합에 중요할 수 있는 프레임워크 잔기를 고려하여 고안되었다. 베니어 서열에 기초한 탈면역화 서열에 더하여, 뮤린 서열에 기초한 VH 및 VK 각각에 대해, 마우스 펩티드 스레드된 (Mouse Peptide Threaded; MoPT) 버젼으로 명명되는 추가적인 서열이 고안되었다. 상기 버젼의 경우, T-세포 에피토프를 제거하기 위해 뮤린 서열에 직접적인 변화를 만들지만, 결합에 해로운 것으로는 여겨지지 않는 CDR 외부의 변화만을 만든다. 표면 (B-세포) 에피토프를 제거하고자 하는 시도는 본 버젼의 탈면역화 서열에서 행해지지 않았다.
1차 탈면역화 VH 는 상기 섹션 5 에서의 1, 3, 4, 5 및 6 의 치환을 포함하 고, 잠재적인 T-세포 에피토프를 전혀 포함하지 않는다. 추가로 4 의 탈면역화 VHS 서열이 항체 결합에 요구되는 각종 치환의 효과를 시험하기 위하여 고안되었다. 버젼 2 는 동일한 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하기 위해 다른 치환 (상기 섹션 2.5 에서 2)이 사용되는 버젼 1 의 대안이다. 1차 탈면역화 서열 (14.18 DIVH1) 에 행해진 누적 변형 및 잔존하는 잠재적인 T-세포 에피토프를 하기 표 2 에 기술한다. 마우스 스레드된 버젼은 비교를 위해 포함시킨다.
탈면역화 14.18 VH 중의 아미노산 변화 및 잠재적인 에피토프
변이체 누적 잔기 변형 잠재적인 에피토프 (시험된 18 개로부터의 잠재적인 MHC 결합자의 번호)
14.18 DIVH1 없음 없음
14.18 DIVH2 41I →P, 45L →T 50L →A 없음
14.18 DIVH3 65S →G 58(8)
14.18 DIVH4 71A →V 58(8), 62(4)
14.18 DIVH5 45T →L, 41P →I 43(9), 58(8), 62(4)
14.18 MoPTVH NA 43(9), 58(12), 62(11)
1차 탈면역화 VK 는 상기 섹션 5 에서의 1, 2, 4, 6 및 7 의 치환을 포함한다. 1차 탈면역화 VK 는 잠재적인 T-세포 에피토프가 전혀 포함되지 않는다. 추가로 5 의 탈면역화 VKS 서열이 항체 결합에 요구되는 각종 치환의 효과를 시험하기 위하여 고안되었다. 버젼 2 는, 위치 43 의 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하기 위해 상이한 치환이 사용되는 버젼 1 에 대한 대안이다. 버젼 3 은, 위치 97 의 잠재적인 에피토프에 결합하는 MHC 알로타입의 수를 11 개에서 5 개로 감소시키는 다른 치환 (상기 섹션 2.5 에서 6) 을 포함한다. 1차 탈면역화 서열 (14.18DIVK1) 에 행해진 누적 변형 및 잔존하는 잠재적인 T-세포 에피토프를 하 기 표 3 에 나타내었다.
탈면역화 14.18 VK 중의 아미노산 변화 및 잠재적인 에피토프
변이체 누적 잔기 변화* 잠재적인 에피토프 (시험된 18 개로부터의 잠재적인 MHC 결합자의 번호)
14.18 DIVK1 없음 없음
14.18 DIVK2 46L →M, 49Y →H 없음
14.18 DIVK3 96P →T, 100Q →G 97(5)
14.18 DIVK4 96T →L 97(11)
14.18 DIVK5 27e S →R 27(15), 97(11)
14.18 DIVK6 46M →L 27(15), 49(11), 97(11)
14.18 MoPTVK NA 27(15), 49(11), 97(11), 100(4)
Figure 112003030457578-pct00077
Figure 112003030457578-pct00078
Figure 112003030457578-pct00079
실시예 22 (KS 항체)
1 마우스 서브그룹 프레임워크와의 비교
뮤린 KS VH 및 VK 의 아미노산 서열을 Kabat 뮤린 중쇄 및 경쇄 서브그룹에 대한 공통 서열 (Kabat 등, 1991) 과 비교하였다. 뮤린 KS VH 는 임의의 하나의 서브그룹로 지정될 수 없지만, 서브그룹 II(A) 및 V(A) 와 가장 가까웠다. 비통상적인 잔기는 일반적으로 발린인 위치 2, 일반적으로 글루탐산인 위치 46, 일반적으로 트레오닌인 위치 68 에서 발견된다. 잔기 69 는 더욱 통상적으로는 루신 또는 이소루신이다. 위치 82b 에서, 세린이 매우 종종 발견된다. 뮤린 KS VK 는 서브그룹 VI (도 2) 로 지정될 수 있다. 비통상적인 잔기는 통상적으로 모두 루신인 잔기 46 및 47 에서 발견된다. 잔기 58 은, 이 위치에서 일반적으로 발견되는 루신 또는 발린으로, 비통상적이다.
2 인간 프레임워크와의 비교
뮤린 KS VH 및 VK 의 아미노산 서열을 인간 생식선 VH (Tomlinson 등, 1992) 및 VK (COX 등 1994) 서열의 디렉토리 중의 서열, 및 인간 생식선 J 영역 서열 (Routledge 등, 1993) 과 비교하였다. KS VH 에 대해 선택된 참조 인간 프레임 워크는 인간 JH6 을 갖는 DP10 이었다. 이 생식선 서열은 아미노산 변화가 전혀 없는 재배열 성숙 항체 유전자 중에서 발견되었다. KS VK 에 대해 선택된 참조 인간 프레임워크는 B1 이었다. 프레임워크-2에 대해서, 성숙 인간 항체 IMEV 의 서열이 사용되었다 (Kabat 등 1991). 이 서열은 CDR2 에 바로 인접한 뮤린 서열과 동일하다. J 영역 서열은 인간 JK4 이었다. 이 생식선 서열은 재배열 성숙 경쇄로서 발견되지는 않았다.
3 베니어 서열의 고안
참조 인간 프레임워크 서열의 동정 후, 425 VH 및 VK 프레임워크 내의 일정한 비일치 아미노산 잔기가 인간 참조 서열 중의 대응 아미노산으로 변화되었다. 항체 구조 및 결합에 중요할 것으로 여겨지는 잔기를 이 절차로부터 배제하고, 변형하지 않았다. 이 단계에서 유지되는 뮤린 잔기는, N-말단의 잔기로부터 떨어져 있는 예컨대 최종 항체의 CDR들에 가까운 대부분 비표면 매장 잔기이었다. 이 절차는, 표면 잔기가 주로 인간의 것이고 매장 잔기가 본래 뮤린 서열의 것이므로, "베니어" 항체와 폭넓게 유사한 서열을 생성한다.
4 펩티드 스레딩 분석
뮤린 및 베니어의 KS VH 및 VK 서열을, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 분석하였다. 아미노산 서열을 모든 가능한 13mer 로 나누었다. 13-mer 펩티드를, HLA-DR 알로타입의 결합 그루브의 모델 및 각 대립유전자에 대한 각 펩티드에 지정된 결합 스코어로 차례대로 표시하였다. 배치 스코어는 펩티드의 각 포켓 결합 측쇄에 대해 계산하였다. 이 스코어는 입체 오버랩, 펩티드와 결합 그루브 내 잔기 사이의 수소 결합, 펩티드와 포켓 잔기 사이의 정전기적 상호작용 및 선호되는 접촉에 기초하였다. 이어서, 각 측쇄의 배치를 변형하고, 스코어를 재계산하였다. 가장 높은 배치 스코어가 측정되면, 이어서 결합 스코어가 그루브 결합 소수성 잔기, 비그루브(non-groove) 친수성 잔기 및 결합 그루브에 끼워지는 잔기의 수에 기초하여 계산된다. MHC 클래스 II 에 대한 공지된 결합자는 거의 폴스 네거티브가 없는 현저한 결합 스코어를 성취한다. 따라서, 현 분석으로부터 현저한 결합 스코어를 성취하는 펩티드는 잠재적인 T-세포 에피토프인 것으로 고려된다. 뮤린 및 베니어 서열에 대한 펩티드 스레딩 분석의 결과를 하기 표 1 에 나타낸다.
표 1: 뮤린 및 베니어의 KS 서열 중의 잠재적인 T-세포 에피토프
서열 잠재적인 T-세포 에피토프의 수 잠재적인 에피토프의 위치 (잠재적인 MHC 결합자의 번호)
뮤린 KS VH 6 35(11), 62(17), 78(12), 81(12), 89(6), 98(15)
뮤린 KS VH 5 30(7), 62(15), 78(11), 89(6), 98(15)
뮤린 KS VK 6 1(14), 2(5), 17(5), 27(5), 51(13), 72(18)
베니어 KS VK 3 1(17), 27(5), 51(13)
5 잠재적인 T 세포 에피토프의 제거
에피토프를 구성하는 특정한 펩티드의 아미노산 치환을 수행하여, 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하였다. 가능하다면, 유사한 생리화학적 특성을 갖는 아미노산을 삽입하여 치환을 수행하였다. 그러나, 일부 잠재적인 에피토프를 제거하기 위해서, 상이한 크기, 전하 또는 소수성을 갖는 아미노산이 치환될 필요가 있다. 결합에 대해 효과를 가질 수 있는 CDR들 내에 변화가 만들어진다면, 이어서 특정 아미노산 치환의 존재 또는 부재하에 변이체를 만들 필요가 있다. 치환에 대한 아미노산의 번호매김은 Kabat 에 따라 한다. 잠재적인 T 세포 에피토프는 13mer 의 첫 번째 잔기의 선상 번호에 의해 언급된다.
베니어 KS 중쇄 가변 영역으로부터 T-세포 에피토프를 제거하는데 요구되는 아미노산 변화는 하기와 같다:
1. 잔기 38 (Kabat 번호 38)의 리신을 아르기닌으로 치환하는 것은 잔기 번호 30 의 잠재적인 에피토프를 제거한다.
2. 잔기 72 (Kabat 번호 71)의 루신을 알라닌으로 치환하고, 잔기 70 (Kabat 번호 69)의 페닐알라닌을 이소루신으로 치환하는 것은 잔기 62 의 잠재적인 에피토프를 제거한다. Kabat 번호 69 의 이소루신 및 Kabat 번호 71 의 알라닌은 인간 생식선 VH 서열 DP10 에서 발견된다.
3. 잔기 79 (Kabat 번호 78)의 알라닌을 루신으로 치환하는 것은 잔기 번호 78 의 잠재적인 에피토프를 제거한다.
4. 잔기 91 (Kabat 번호 87)의 메티오닌을 트레오닌으로 치환하는 것은 잔기 번호 89 의 잠재적인 에피토프를 제거한다.
5. CDRH3 중의 잔기 100 (Kabat 번호 96)의 이소루신을 메티오닌으로 치환하는 것은 잔기 번호 98 의 잠재적인 에피토프를 제거한다. 상기 잠재적인 에피토프를 제거한 CDRH3 에는 어떠한 변화도 없다.
베니어 KS 경쇄 가변 영역으로부터 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하는데 요구되는 아미노산 치환은 하기와 같았다:
1. 잔기 32 (Kabat 번호 33)의 메티오닌을 이소루신으로 치환하는 것은 잔기 번호 27 의 잠재적인 에피토프를 제거한다. 상기 잔기는 CDR2 내에 존재한다. 이소루신은 인간 항체의 이 위치에서 통상적으로 발견된다.
2. 위치 1 의 잠재적인 에피토프는 잔기 (Kabat 번호 3)의 루신을 발린으로 치환하는 것에 의해 제거된다.
3. 잔기 59 (Kabat 번호 60)의 알라닌을 세린으로 치환하는 것은 잔기 번호 51 의 잠재적인 에피토프를 제거한다.
6 탈면역화 서열의 고안
탈면역화 중쇄 및 경쇄 서열은, 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하는데 요구되는 변화를 참조로 하고 항체 구조 및 결합에 중요할 수 있는 프레임워크 잔기를 고려하여 고안되었다. 베니어 서열에 기초한 탈면역화 서열에 더하여, 마우스 펩티드 스레드된 (MoPT) 버젼으로 명명되는 뮤린 서열에 기초한 각각의 VH 및 VK 에 대한 추가적인 서열이 고안되었다. 이 버젼에 있어서, T-세포 에피토프를 제거하기 위해서 뮤린 서열에 대해 직접적으로 변화를 수행하였지만, 결합에 해로운 것으로는 여겨지지 않는 CDR 외부의 변화만을 수행하였다. 표면 (B 세포) 에피토프를 제거하고자 하는 시도는 이 버젼의 탈면역화 서열에서는 행하지 않았다. 1차 탈면역화 VH 는 상기 섹션 5 에서의 1 내지 5 의 치환과 잔기 43 (Kabat 번호 43)에서의 하나의 그외 변화를 포함한다. 뮤린 서열에서 발견되는 리신으로 인간 프레임워크 유래의 글루타민을 치환하였다. 리신은 양전하이므로, 글루타민과는 현저하게 상이하고; 이 영역은 VH/VL 접촉부에 포함될 수 있다. 1차 탈면역화 VH 는 잠재적인 T-세포 에피토프를 포함하지 않는다. 추가로 4 의 탈면역화 VH 가 항체 결합에 요구되는 각종 치환기의 효과를 시험하기 위해서 고안되었다. 1차 탈면역화 서열 (KSDIVHv1)에 행해진 누적 변형 및 잔존하는 잠재적인 T-세포 에피토프는 하기 표 2 에 기재한다.
표 2: 탈면역화 KS VH 중의 아미노산 변화 및 잠재적인 에피토프
변이체 누적 잔기 변형 잠재적인 에피토프 (시험된 18 개로부터의 잠재적인 MHC 결합자의 번호)
KSDIVHv1 없음 없음
KSDIVHv2 96M →I 98(15)
KSDIVHv3 71A →L, 78L →A 62(16), 78(11), 98(15)
KSDIVHv4 38R →K 30(7), 62(16), 78(11), 98(15)
KSDIVHv5 68T →A, 69I →F 30(7), 62(17), 78(11), 98(15)
KSMoPTVH NA 98(15), 78(12)
1 차 탈면역화 VK 는 상기 섹션 5 에서의 1 내지 3 의 치환을 포함한다. 추가로 3 개의 탈면역화 VK 는 항체 결합에 요구되는 각종 치환기의 효과를 시험하기 위하여 고안되었다. 1차 탈면역화 서열 (KSDIVKv1)에 행해진 누적 변형 및 잔존하는 잠재적인 T-세포 에피토프를 하기 표 3 에 기재한다.
표 3: 탈면역화 KS VK 중의 아미노산 변화 및 잠재적인 에피토프
변이체 누적 잔기 변형 잠재적인 에피토프 (시험된 18 개로부터의 잠재적인 MHC 결합자의 번호)
KSDIVKv1 없음 없음
KSDIVKv2 33I →M 27(5)
KSDIVKv3 3V →L 1(17), 27(5)
KSDIVKv4 60S →A 1(17), 27(5), 5(13)
KSMoPTVK NA 없음
Figure 112003030457578-pct00080
Figure 112003030457578-pct00081

Claims (21)

  1. 실험관내 (in vitro) 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술, 또는 생물학적 검사를 이용하여, MHC 분자에 대한 펩티드의 결합을 측정하는 것을 포함하는 단계에 의해서, 생물학적 분자의 아미노산 서열 중에서 하나 이상의 잠재적인(potential) T-세포 에피토프 펩티드를 동정하는데 적합한 방법에 있어서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법:
    (a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 영역을 선택하는 단계;
    (b) 소정의 균일한 크기를 가지며, 선택된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 중복 아미노산 잔기 분획을 연속 샘플링하는 단계;
    (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 분획에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 지정된 값을 합산하여 상기 샘플링된 각각의 분획에 대해 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 계산하는 단계로서, 하기 단계에 의해, 12-6 반데르 발스의 리간드-단백질 에너지 반발 항목 및 리간드 배치 에너지 항목을 포함하도록 변형된 Boehm 스코어링 함수 (Boehm scoring function) 를 사용하여 수행되는 단계:
    (1) MHC 클래스 II 분자 모델에 대한 제 1 의 데이타베이스를 제공하는 단계;
    (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격에 대한 제 2 의 데이타베이스를 제공하는 단계;
    (3) 상기 제 1 의 데이타베이스로부터 모델을 선택하는 단계;
    (4) 상기 제 2 의 데이타베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하는 단계;
    (5) 각각의 샘플링된 분획내에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄를 동정하는 단계;
    (6) 각각의 샘플링된 분획내에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화성 값을 결정하는 단계; 및
    임의로는, (7) 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 (1) 내지 (5) 의 단계를 반복하는 단계; 및
    (d) 상기 분획에 대한 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기준으로, 펩티드의 치료 용도를 본질적으로 감소시키지 않으면서 펩티드에 대한 전체 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위한, 변형에 적합한 하나 이상의 상기 분획을 동정하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 각각의 방향족 측쇄에 지정된 값이 각각의 소수성 지방족 측쇄에 지정된 값의 약 절반임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플링된 아미노산 잔기 분획이 13 개의 아미노산 잔기로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 연속적인 샘플링된 아미노산 잔기 분획은 1 개 내지 5 개의 아미노산 잔기가 중복됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 연속적인 샘플링된 아미노산 잔기 분획 중 하나를 제외한 모든 아미노산 잔기가 중복됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 모체 분자로부터 유도된 면역원성이 변형된 생물학적 분자의 제조 방법에 있어서, 상기 변형된 분자는 상기 모체 분자와 상이한 아미노산 서열을 갖고, 투여 종의 면역계에 노출될 경우 모체 분자와 비교하여 감소된 면역원성을 나타내며; 상기 방법은 하기의 단계:
    (i) 모체 생물학적 분자 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계:
    (ii) 실험관내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 검사를 사용하여 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합을 측정하는 것을 포함하는 임의의 방법에 의해서, 단백질의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프를 동정하는 단계;
    (iii) 원래 동정되었던 T 세포 에피토프 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형에 의해 신규한 서열 변이체를 고안하는 단계로서, 상기 변이체는, 실험관내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 검사를 사용하여 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합에 의해 또는 T 세포에 대한 펩티드-MHC 복합체의 결합에 의해 측정된, T 세포 에피토프 서열의 활성 또는 갯수 및/또는 상기 생물학적 분자로부터 유도된 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 갯수를 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 변형되도록 하는 것인 고안하는 단계;
    (iv) 상기 서열 변이체를 재조합 DNA 기술로 구축하고, 요망되는 특성을 가진 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계; 및
    (v) 단계 (ii) - (iv) 를 임의로 반복하는 단계
    를 포함하며,
    상기 단계 (ii) 에 따른 T 세포 에피토프 서열의 동정은 제 1 항에 기재된 방법에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 임의의 본래 존재하는 T-세포 에피토프 서열 중 1 내지 9 개의 아미노산 잔기가 변형됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 임의의 본래 존재하는 T-세포 에피토프 서열 중 하나의 아미노산 잔기가 변형됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 아미노산 변형이 상동성 단백질 서열을 참조로 하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 아미노산 변형이 컴퓨터 이용 모델링 기술을 참조로 하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 변형이 특정 위치(들)에서의 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 다른 아미노산 잔기(들)로의 치환, 결실 또는 부가임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 분자의 생물학적 활성을 회복시키기 위해 추가적으로 다른 변형이 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 추가적으로 다른 변형이 특정 아미노산(들)의 치환, 첨가 또는 결실임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성이 감소된 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 항체 또는 이들의 절편을 제조하기 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질 또는 항체가 하기의 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법:
    (a) 모노클로날 항체:
    항-40 kD 당단백질 항원 항체 KS 1/4,
    항-GD2 항체 14.18,
    항-Her2 항체 4D5 (뮤린) 및 인간화 버젼 (Herceptin
    Figure 112007014650232-pct00082
    ),
    항-IL-2R (항-Tac) 항체 (Zenapax
    Figure 112007014650232-pct00083
    ),
    항-CD52 항체 (CAMPATH
    Figure 112007014650232-pct00084
    ),
    항-CD20 항체 (C2B8, Rituxan
    Figure 112007014650232-pct00085
    ; Bexxar
    Figure 112007014650232-pct00086
    ),
    인간 C5 보체 단백질에 대한 항체,
    (b) 단백질:
    sTNF-R1, sTNF-R2, sTNFR-Fc (Enbrel
    Figure 112007014650232-pct00087
    ),
    단백질 C, acrp30, 리신 A, CNTFR 리간드,
    서브틸리신, GM-CSF, 인간 여포 자극 호르몬 (h-fsh),
    β-글루코세레브로시다아제, GLP-1, 아포리포프로테인 A1.
  18. 삭제
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  21. 삭제
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