JP7059003B2 - 脱免疫化リゾスタフィン及び使用方法 - Google Patents

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Description

緒言
本出願は、２０１４年５月１４日に出願された米国特許出願第６１／９９３，０５６号、２０１４年５月２７日に出願された米国特許出願第６２／００３，２５６号、２０１５年２月１２日に出願された米国特許出願第６２／１１５，３２６号、及び２０１５年４月３０日に出願された米国特許出願第６２／１５５，０７９号の利益を主張し、この内容は、全体として、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された助成金番号１Ｒ２１ＡＩ０９８１２２のもと、政府の支援で行った。政府は、本発明に一定の権利を有する。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）は、ヒト及び動物の皮膚及び粘膜にコロニーを作り、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ブドウ球菌）属の他のメンバーと共に、多種多様な数々の感染に関与している。Ｓ． ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）は、表面への付着を容易にし、感染を開始する「接着性マトリックス分子を認識する微生物表面コンポーネント」と表記される表面タンパク質を含む多くの毒性因子を含む（Ｇｏｒｄｏｎ及びＬｏｗｙ （２００８） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ４６：Ｓ３５０－Ｓ３５９）。Ｓ． ａｕｒｅｕｓは、それに免疫系及び抗生物質の両方を回避させるバイオフィルムも形成できる（Ｄｏｎｌａｎ及びＣｏｓｔｅｒｔｏｎ （２００２） Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １５：１６７－１９３）。ほとんどの株は、多糖類カプセルを有し、感染時に細菌の拡散を強化させるために使用される種々の酵素を分泌する（Ｆｏｓｔｅｒ （２００５） Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３：９４８－９５８）。Ｓ． ａｕｒｅｕｓは、毒性ショック症候群も引き起こすことができ、研究は、ペプチドグリカン及びＳ． ａｕｒｅｕｓ細胞壁のリポテイコ酸が、ラットにおいて毒性ショックを引き起こすために共に作用することを示している（Ｋｉｍｐｅら（１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：１０３５９－１０３６３）。
ブドウ球菌における抗生物質耐性は、ペニシリンがブドウ球菌感染の治療に最初に使用された後に現れる。１９６０年代後半までに８０％を超える臨床分離株に存在した耐性のこの発達（Ｌｏｗｙ （２００３） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１１：１２６５－１２７３）は、日和見病原体と戦うための新しいより強力な薬物の開発を促した。これらの取り組みは、ブドウ球菌感染の負担を緩和するように設計された狭域ペニシリナーゼ耐性薬物であるメチシリンの製造につながった。しかし、最初のメチシリン耐性Ｓ． ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）臨床分離株が発見されるまでに、たった１年しか、かからなかった。
最初は、ＭＲＳＡ感染は、長期の病院治療及び侵襲的外科的処置のみと関連しており、院内感染型ＭＲＳＡ（ＨＣＡ－ＭＲＳＡ）に分類された。しかし、近年、ＭＲＳＡはまた、競技選手、軍の新兵、及び保育所の子供などの高強度の物理的接触を有するグループに影響を及ぼす市中感染型感染（ＣＡ－ＭＲＳＡ）として出現している（Ｒｏｍａｎｏら（２００６） Ｊ． Ａｔｈｌ． Ｔｒａｉｎ． ４１：１４１－１４５； Ｋａｚａｋｏｖａら（２００５） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５２：４６８－４７５； Ｚｉｎｄｅｒｍａｎら（２００４） Ｅｍｅｒｇ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １０：９４１－９４４； Ａｄｃｏｃｋら（１９９８） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７８：５７７－５８０）。
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ細胞壁は、Ｎ－アセチルグルコサミン及びＮ－アセチルムラミン酸の交互多糖類サブユニットからなり、Ｎ－アセチルムラミン酸はペプチド鎖と連結されている。ペプチドグリカンの架橋は、ペンタグリシンインターペプチドブリッジを介してムロペプチド鎖を連結する４つの主要なペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ１、２、３、及び４）により達成される。メチシリン耐性は、トランスペプチダーゼ活性を有するが、ペニシリン及びβ－ラクタム抗生物質に対する親和性が低いペニシリン結合タンパク質ＰＢＰ２ＡをコードするｍｅｃＡ遺伝子を、Ｓ． ａｕｒｅｕｓが取得した時に、生じた。耐性株細胞は、ＰＢＰを依然として産生するが、ＰＢＰ２Ａの発現を考えると、ペプチドグリカン合成がメチシリン及び他のβ－ラクタムの存在下で継続する（Ｈｉｒａｍａｔｓｕら（２００１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：４８６－４９３）。
リゾスタフィンは、ペンタグリシンインターペプチドクロスブリッジを選択的に標的とする、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓにより産生されるグリシル－グリシン亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。リゾスタフィンに対する遺伝子は、単離され、特性決定されている。例えば、Ｅ． ｃｏｌｉのペリプラズムへの単一種のリゾスタフィンの分泌を可能にするために、３６残基シグナルペプチド及び２２４残基長プロペプチドを除去して、それにより、細胞内発現のための開始メチオニンまたは外因性シグナル配列のいずれかへの融合を促進する遺伝子切断が行われている（例えば、ＵＳ２００５／０１１８１５９を参照のこと）。成熟した２４７残基酵素は、Ｃ末端細胞壁結合ドメイン（９２アミノ酸）と１８残基リンカーを介して連結しているＮ末端触媒ドメイン（１３８アミノ酸）からなる（Ｌｕら（２０１３） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５７：１８７２－１８８１）。
リゾスタフィンは、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ感染の治療のための治療薬としての将来性を示している。ブドウ球菌株（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ及びＳｃｈｕｈａｒｄｔ （１９６４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５１：４１４４２１）及び臨床分離株（Ｃｒｏｐｐ及びＨａｒｒｉｓｏｎ （１９６４） Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １０：８２３－８２８）を溶解するタンパク質が示されており、このタンパク質は、ブドウ球菌バイオフィルム（Ｋｏｋａｉ－Ｋｕｎら（２００９） Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｔｈｅｒ． ６４：９４－１００）のものを含む、動物モデルにおける顕著な有効性を実証した（Ｓｃｈｕｈａｒｄｔ及びＳｃｈｉｎｄｌｅｒ （１９６４） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ８８：８１５－８１６； Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら（１９６７） Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ３９：２３０－２４４； Ｇｏｌｄｂｅｒｇら（１９６７） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ７：４５－５３； Ｋｏｋａｉ－Ｋｕｎら（２００７） Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｔｈｅｒ． ６０：１０５１－１０５９； Ｐｌａｃｅｎｃｉａら（２００９） Ｐｅｄ． Ｒｅｓ． ６５：４２０－４２４； Ｃｌｉｍｏら（１９９８） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４２：１３５５－６０）。これらの研究のいくつかにおいて、リゾスタフィンに対する抗体が、長期間、薬物を受けた動物で観察された（Ｃｌｉｍｏら（１９９８） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４２：１３５５－１３６０）。同様に、経鼻リゾスタフィンでのヒト臨床試験は、抗リゾスタフィン抗体力価のわずかな上昇を示した（Ｋｏｋａｉ－Ｋｕｎ （２０１２） ｉｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ： Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ （Ｔｅｇｏｓ及びＭｙｌｏｎａｋｉｓ編） Ｃｈ． １０，１４７－１６５）。
米国特許出願第６１／９９３，０５６号 米国特許出願第６２／００３，２５６号 米国特許出願第６２／１１５，３２６号 米国特許出願第６２／１５５，０７９号 ＵＳ２００５／０１１８１５９ ＵＳ２００８／００９５７５６
Ｇｏｒｄｏｎ及びＬｏｗｙ （２００８） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ４６：Ｓ３５０－Ｓ３５９ Ｄｏｎｌａｎ及びＣｏｓｔｅｒｔｏｎ （２００２） Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １５：１６７－１９３ Ｆｏｓｔｅｒ （２００５） Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３：９４８－９５８ Ｋｉｍｐｅら（１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：１０３５９－１０３６３ Ｌｏｗｙ （２００３） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１１：１２６５－１２７３ Ｒｏｍａｎｏら（２００６） Ｊ． Ａｔｈｌ． Ｔｒａｉｎ． ４１：１４１－１４５ Ｋａｚａｋｏｖａら（２００５） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５２：４６８－４７５ Ｚｉｎｄｅｒｍａｎら（２００４） Ｅｍｅｒｇ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １０：９４１－９４４ Ａｄｃｏｃｋら（１９９８） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７８：５７７－５８０ Ｈｉｒａｍａｔｓｕら（２００１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：４８６－４９３ Ｌｕら（２０１３） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５７：１８７２－１８８１ Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ及びＳｃｈｕｈａｒｄｔ （１９６４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５１：４１４４２１ Ｃｒｏｐｐ及びＨａｒｒｉｓｏｎ （１９６４） Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １０：８２３－８２８ Ｋｏｋａｉ－Ｋｕｎら（２００９） Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｔｈｅｒ． ６４：９４－１００ Ｓｃｈｕｈａｒｄｔ及びＳｃｈｉｎｄｌｅｒ （１９６４） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ８８：８１５－８１６ Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら（１９６７） Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ３９：２３０－２４４ Ｇｏｌｄｂｅｒｇら（１９６７） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ７：４５－５３ Ｋｏｋａｉ－Ｋｕｎら（２００７） Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｔｈｅｒ． ６０：１０５１－１０５９ Ｐｌａｃｅｎｃｉａら（２００９） Ｐｅｄ． Ｒｅｓ． ６５：４２０－４２４ Ｃｌｉｍｏら（１９９８） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４２：１３５５－１３６０ Ｋｏｋａｉ－Ｋｕｎ （２０１２） ｉｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ： Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ （Ｔｅｇｏｓ及びＭｙｌｏｎａｋｉｓ編） Ｃｈ． １０，１４７－１６５
薬物動態を改善し、免疫原性を低減するためには、リゾスタフィンは、分枝状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結されている。ＰＥＧ化が免疫反応性を低減させるが、酵素のＰＥＧ化は、その活性を有意に低減させる（Ｗａｌｓｈら（２００３） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４７：５５４－５５８）。加えて、ＵＳ２００８／００９５７５６は、リゾスタフィンの細胞壁結合ドメインの脱免疫化について記載する。しかし、脱免疫化触媒ドメインを有する多様体は、記載されていない。
本発明は、配列番号４９のＳｅｒ１２４、Ｓｅｒ１２２、Ａｓｎ１２１、Ａｒｇ１１８、Ｉｌｅ９９、Ｌｙｓ９５、Ｔｙｒ９３、Ｌｅｕ８３、Ｌｙｓ４６、Ｉｌｅ４１、Ａｓｎ１３、Ａｓｎ１２のうちの１つ以上の変異を有する脱免疫化リゾスタフィンである。一実施形態では、リゾスタフィンは、非グリコシル化されている。別の実施形態では、変異は、Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ、Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ、Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ４６Ｈｉｓ、Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ、Ａｓｎ１３Ｈｉｓ、Ａｓｎ１２Ｇｌｙ、またはそれらの組み合わせである。さらなる実施形態では、脱免疫化リゾスタフィンは、Ｃ末端結合ドメインに１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。脱免疫化リゾスタフィン及び抗生物質を含有する医薬組成物が提供され、微生物感染を予防または治療する方法も提供される。
図１Ａ～１Ｅは、本発明のリゾスタフィン多様体の配列アライメントを示す。 図１Ａ～１Ｅは、本発明のリゾスタフィン多様体の配列アライメントを示す。 図１Ａ～１Ｅは、本発明のリゾスタフィン多様体の配列アライメントを示す。 図１Ａ～１Ｅは、本発明のリゾスタフィン多様体の配列アライメントを示す。 図１Ａ～１Ｅは、本発明のリゾスタフィン多様体の配列アライメントを示す。 リゾスタフィン触媒ドメインのエピトープマップを示す。予測される結合イベントの総数が、リゾスタフィン一次配列に対してプロットされる。ＥｐｉＭａｔｒｉｘを使用して、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子ＤＲＢ＊０１０１、０３０１、０４０１、０７０１、０８０１、１１０１、１３０１、及び１５０１に対するエピトープを予測した。最大スコアは、８であり、全ての８つの対立遺伝子に結合すると予測されるエピトープを表す。このようなエピトープが、１１６位で観察された。ＥｐｉＳｗｅｅｐ変異の部位を、矢印及び残基番号で示す。エピトープ群を、５つの異なるクラスタに分けた。後で断念したものであるが、リゾスタフィン発現及び活性に有害であることが判明した変異（Ｐｈｅ３８Ｇｌｙ及びＳｅｒ１２４Ｔｙｒ）も示される。 完全長の設計に対して計算された免疫原性スコアの集計を示す。設計中の各ペプチドを、８つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する強バインダー（ＩＣ５０＜１μＭ）、中バインダー（１μＭ＜ＩＣ５０＜１０μＭ）、または弱バインダー（１０μＭ＜ＩＣ５０＜１００μＭ）と評価した。次に、強バインダー、中バインダー、及び弱バインダーを、図に示される集計スコアを得るために、合計した。「ａ」を伴う線は、野生型リゾスタフィン触媒ドメイン中の強バインダーの数を示す一方、「ｂ」を伴う線は、中バインダーの数を示す。バー上の数は、各設計の変異負荷を表す。＊は、復帰設計を示す。 図４Ａ～４Ｃは、Ｆｌｅｘ５及びＦｌｅｘ９多様体のインビボでの有効性及び免疫原性分析を示す。図４Ａ、Ｓ． ａｕｒｅｕｓに感染後のＣ５７Ｂｌ／６マウスの肺への細菌が与える負担（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｕｒｄｅｎ）、及び、野生型ＬＳＴ、多様体Ｆｌｅｘ５、多様体Ｆｌｅｘ９、またはＰＢＳ対照での治療。グループ毎にＮ＝６である。 図４Ｂ、ＨＵＭＩマウス（全て単一のドナーからヒト化された）を、野生型ＬＳＴ（ＷＴ）、多様体Ｆｌｅｘ５、または多様体Ｆｌｅｘ９のいずれかで皮下免疫化し、脾細胞を採取し、同じタンパク質またはＤＭＳＯでエクスビボ再刺激した。増殖を、トリチウム化チミジンの取り込みとして測定した。グループ毎にＮ＝４であり、プールして、３回測定した。 図４Ｃ、トランスジェニックＤＲ４マウスを、野生型ＬＳＴの複数の皮下注射で免疫化した。最後のブースト後に、マウスを、２０週間回復させ、２グループに分け、マウスに野生型ＬＳＴまたは多様体Ｆｌｅｘ５のいずれかで再チャレンジをした。脾細胞を採取し、再チャレンジのタンパク質またはＤＭＳＯでエクスビボ再刺激し、増殖をトリチウム化チミジンの取り込みとして測定した。グループ毎にＮ＝５であり、プールして、３回測定した。統計的有意性を、一元ＡＮＯＶＡ（図４Ａ）または二元ＡＮＯＶＡ（図４Ｂ及び４Ｃ）で評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 多様体Ｌｉｂ５（上）、Ｏｐｔ４（中）、及びＬＳＴＷＴ（野生型）（下）に対する予測されたＤＲ４Ｔ細胞エピトープを示す。ノナマーエピトープを、ＬＳＴアミノ酸配列（Ｘ軸）の対応する位置で横線として示す。ＬＳＴＷＴは、１６の推定エピトープを含有し、Ｏｐｔ４は、５つ含有し、Ｌｉｂ５は、３つだけ含有する。ＬＳＴＷＴにおける重なり合ったエピトープ密度の領域は、Ｘ軸上の塗りつぶされたブロックで強調される。Ｌｉｂ５（上）及びＯｐｔ４（中）における脱免疫化変異の位置は、塗りつぶした縦バーとして示される。各設計に対する変異（Ｍ）及びエピトープ（Ｅ）の総数は、右に示される。 図６Ａ及び６Ｂは、リゾスタフィン触媒及び細胞壁結合ドメインのグローバルエピトープマップをそれぞれ示す。ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１＊０１０１、０３０１、０４０１、０７０１、０８０１、１１０１、１３０１、及び１５０１に対するエピトープを予測した。９つの残基ペプチドエピトープは、実線（１～２％の閾値）及び破線（３～５％の閾値）で示される。リゾスタフィン触媒ドメイン一次配列は、Ｘ軸上に示され、各ペプチドエピトープと関連したＨＬＡ対立遺伝子は、Ｙ軸上に示される。設計性分析に対するリスク領域の高い方は、塗りつぶされたボックスで上部にマークされる。破線を伴うボックスは、脱免疫化Ｆｌｅｘ９の脱免疫化触媒ドメインの開発中に、さらに再設計された中程度のリスク領域を表す。 図６Ａ及び６Ｂは、リゾスタフィン触媒及び細胞壁結合ドメインのグローバルエピトープマップをそれぞれ示す。ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１＊０１０１、０３０１、０４０１、０７０１、０８０１、１１０１、１３０１、及び１５０１に対するエピトープを予測した。９つの残基ペプチドエピトープは、実線（１～２％の閾値）及び破線（３～５％の閾値）で示される。リゾスタフィン触媒ドメイン一次配列は、Ｘ軸上に示され、各ペプチドエピトープと関連したＨＬＡ対立遺伝子は、Ｙ軸上に示される。設計性分析に対するリスク領域の高い方は、塗りつぶされたボックスで上部にマークされる。破線を伴うボックスは、脱免疫化Ｆｌｅｘ９の脱免疫化触媒ドメインの開発中に、さらに再設計された中程度のリスク領域を表す。 ＭＲＳＡ株ＵＳＡ４００に対するＦ１１、Ｆ１２、及びＦ１３の最少阻害濃度（ＭＩＣ）を示す。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＦ１１多様体のインビボ有効性。２×１０８のＭＲＳＡ株ＳＡ４００の腹腔内注射で、マウスにチャレンジし、１時間後に、マウスを１００μｇの野生型ＬＳＴ、Ｆ１１、またはＰＢＳで治療した。生存率が示される。
酵素活性を有意に変更させることなく、リゾスタフィンの触媒ドメインが、脱免疫化できることは、目下示されている。特に、リゾスタフィンのＥｐｉＳｗｅｅｐ分析を使用して、ＭＨＣクラスＩＩ結合イベントを同定した。触媒ドメインに変異を含有する脱免疫化リゾスタフィン多様体を生成し、発現させ、精製し、市販のリゾスタフィンと同等の活性レベルを有することを示した。触媒ドメインの変異を、細胞壁結合ドメインの変異と組み合わせることにより、本発明は、微生物感染を治療するための完全脱免疫化リゾスタフィン多様体及びその使用方法を提供する。
本明細書で使用される場合、リゾスタフィンに関して使用される時の用語「脱免疫化」は、免疫原性が高い領域または残基の特異的除去及び／または修飾が起こっているリゾスタフィン（例えば、リゾスタフィン多様体、誘導体、及び／またはそれらのホモログ）に関する。用語「脱免疫化」は、当該技術分野でよく知られており、とりわけ、抗体を含む他の治療分子からのＴ細胞エピトープの除去に用いられている（例えば、ＷＯ９８／５２９７６またはＷＯ００／３４３１７を参照のこと）。
体液性抗体形成は、ヘルパーＴ細胞の抗原特異的Ｂ細胞との共同を必要とする。分子の免疫原性を低減させるためには、１つのアプローチは、抗原の、Ｂ細胞と相互作用、Ｂ細胞を刺激する能力を低減させること及び／または抗原のヘルパーＴ細胞を刺激する能力を低減させることである。しかし、Ｂ細胞エピトープの同定は、問題があり、それらが不確定な長さであるという事実を考えると、は多くの場合、標的抗原の三次構造に依存する。対照的に、Ｔ細胞エピトープは、短い（９～１５アミノ酸）、直鎖状ペプチド（例えば、Ｄｏｙｔｃｈｉｎｏｖａ及びＦｌｏｗｅｒ （２００６） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３（１３）：２０３７－４４を参照のこと）である。加えて、Ｔ細胞活性化の低減が、より容易に達成し、抗体産生に大きく影響する能力を有する（例えば、Ｔａｎｇｒら（２００５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４：３１８７－３１９６を参照のこと）ことを証拠が示唆している。Ｔ細胞を刺激する抗原決定基を含むアミノ酸配列は、Ｔ細胞エピトープと呼ばれ、抗原提示細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子との関連でディスプレイされる。（例えば、エピトープのＭＨＣ分子への結合を阻害すること、エピトープ及びＭＨＣ分子の間の親和性を変更すること、エピトープの配向が変更され、その上、ＭＨＣ分子の結合領域内にあるような方法で、エピトープを変更すること、またはＭＨＣ分子によるエピトープの提示が変更されるようにエピトープを変更することにより）Ｔ細胞エピトープのＭＨＣ分子に結合する能力を変更することは、免疫原性応答を刺激する（例えば、ヘルパーＴ細胞及びＢ細胞応答を刺激する）ことができない、または、できなくなる、変更されたエピトープを与える可能性を有する。従って、本明細書で記載される方法を使用して、リゾスタフィンのエピトープを同定し、続いて、リゾスタフィンの免疫原性及び体液性抗体応答を誘導する能力を低減させるために変更した。
従って、脱免疫化は、Ｔ細胞エピトープ、好ましくは、ヘルパーＴ細胞エピトープ、の同定、修飾、及び／または除去を含む。本文脈中での、用語Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩ分子との関連で、Ｔ細胞により認識されるＴ細胞エピトープ（すなわち、小さいペプチド）に関する。Ｔ細胞エピトープの同定のための方法は、当該技術分野で知られている（例えば、ＷＯ９８／５２９７６、ＷＯ００／３４３１７、及びＵＳ２００４／０１８０３８６を参照のこと）。同定の種々の方法は、ペプチドスレッディング、ペプチドＭＨＣ結合、ヒトＴ細胞アッセイ、サイトカイン発現パターンの分析、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、クラスＩＩ四量体エピトープマッピング、ＭＨＣ結合モチーフデータベースの調査、及びＴ細胞エピトープのさらなる除去／修飾を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＥｐｉＳｗｅｅｐ法により用いられるものなどの構造誘導型脱免疫化のアプローチが使用される。ＥｐｉＳｗｅｅｐは、構造ベースのタンパク質設計、配列ベースのタンパク質脱免疫化、及び設計空間のパレートフロンティアを見つけるためのアルゴリズムを統合する（Ｐａｒｋｅｒら（２０１３） Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． ２０：１５２－６５）。
上述の技術の適用によるＴ細胞エピトープを同定した時、本明細書にさらに記載されるように、同定されるＭＨＣ結合ペプチド内の１つ以上のアミノ酸置換により、リゾスタフィンまたはそのフラグメント（複数可）（例えば、触媒ドメイン）から、エピトープを、排除、置換、及び／または修飾できる。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ及び／若しくはクラスＩＩ分子への結合を排除若しくは大幅に低減するか、または、代わりにＭＨＣ結合ペプチドをＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子に結合する能力を保持するが、Ｔ細胞活性化及び／若しくは増殖を誘発できない配列に変更する１つ以上のアミノ酸置換が生じる。
成熟リゾスタフィンは、２つの機能ドメイン、Ｓ． ａｕｒｅｕｓの外側細胞壁に結合する９２残基のＣ末端ドメイン及びエンドペプチターゼ活性を有するＮ末端活性部位を有することが示されている（Ｂａｂａ及びＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ （１９９６） ＥＭＢＯ Ｊ． １５：４７８９－４７９７）。リゾスタフィンは、部分的には２つの別々のドメインの異なる溶媒特性に起因して、結晶化に成功していない。しかし、本明細書で記載されるインシリコ方法を使用して、変異の種々の組み合わせを含む高機能性リゾスタフィンタンパク質が生成されている。（活性部位残基を除く）触媒ドメインの各位置で可変なアミノ酸を選択し、免疫原性が低いと予測され、その上、安定性を保持するリゾスタフィン多様体を生成した。各変異を、発現及び活性ついて評価した。両方の点で基準を満たしたとみられる変異のみを選択し、脱免疫化プロセスを再度繰り返した。得られる計画の適切なエネルギーの最小化後に、最良の予測エネルギースコアを有する設計を選択し、実験的に試験した。次に、発現させることができるリゾスタフィン多様体を精製し、活性、安定性、及び免疫原性についてさらに特性決定した。
従って、本発明は、活性を保持し、その上、同時に免疫原性の減少を示す免疫原性エピトープの修飾（例えば、アミノ酸置換などの変異）を含む種々のリゾスタフィン多様体を提供する。本明細書で使用される場合、用語「リゾスタフィン」は、完全長リゾスタフィンまたはその部分をコードするアミノ酸配列及び／または核酸配列、任意のリゾスタフィン変異体または多様体（例えば、配列番号１～４８または２１８～２２０の任意の１つのリゾスタフィン）、任意のリゾスタフィン切断（例えば、１つ以上のアミノ酸が、タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、またはその両方から除去されている）、ならびにブドウ球菌の細胞壁ペプチドグリカンのグリシン含有ブリッジに対するタンパク質分解攻撃のインビトロ及びインビボでのタンパク質分解能を保持する組換え発現させた任意のリゾスタフィンタンパク質を指す。リゾスタフィン多様体（例えば、本明細書に記載される脱免疫化リゾスタフィン）はまた、切断型で発現させても良い。修飾された完全長リゾスタフィンまたはリゾスタフィン多様体は、（宿主細胞株に存在する酵素、または、プロセスの任意の段階で導入される酵素若しくは試薬、のいずれかによる）タンパク質の翻訳後処理により、または、構造遺伝子の変異により、生成されても良い。本明細書に記載するように、リゾスタフィン多様体は、欠失変異、挿入変異、ドメイン除去変異、点変異、及び交換／置換変異を含んでも良い。
本発明は、任意の特定のリゾスタフィン多様体に限定されない。確かに、実施例に記載され、図１Ａ～１Ｅに示されたものを含むが、これらに限定されない種々の多様体は、本発明により提供される。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、野生型配列：
ＡＡＴＨＥＨＳＡＱＷＬＮＮＹＫＫＧＹＧＹＧＰＹＰＬＧＩＮＧＧＭＨＹＧＶＤＦＦＭＮＩＧＴＰＶＫＡＩＳＳＧＫＩＶＥＡＧＷＳＮＹＧＧＧＮＱＩＧＬＩＥＮＤＧＶＨＲＱＷＹＭＨＬＳＫＹＮＶＫＶＧＤＹＶＫＡＧＱＩＩＧＷＳＧＳＴＧＹＳＴＡＰＨＬＨＦＱＲＭＶＮＳＦＳＮＰＴＡＱＤＰＭＰＦＬＫＳＡＧＹＧＫＡＧＧＴＶＴＰＴＰＮＴＧＷＫＴＮＫＹＧＴＬＹＫＳＥＳＡＳＦＴＰＮＴＤＩＩＴＲＴＴＧＰＦＲＳＭＰＱＳＧＶＬＫＡＧＱＴＩＨＹＤＥＶＭＫＱＤＧＨＶＷＶＧＹＴＧＮＳＧＱＲＩＹＬＰＶＲＴＷＮＫＳＴＮＴＬＧＶＬＷＧＴＩＫ（配列番号４９）と比較した時に、単一のアミノ酸置換（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸置換の任意の１つ）を有する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、野生型配列と比較した場合に、２つのアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、野生型配列と比較した時に、３つのアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態では、リゾスタフィン多様体は、野生型配列と比較した時に、４つ以上のアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、触媒ドメインに１つ以上のアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、リゾスタフィン変異体は、Ｓｅｒ１２４、Ｓｅｒ１２２、Ａｓｎ１２１、Ａｒｇ１１８、Ｉｌｅ９９、Ｌｙｓ９５、Ｔｙｒ９３、Ｌｅｕ８３、Ｌｙｓ４６、Ｉｌｅ４１、Ａｓｎ１３、Ａｓｎ１２、またはそれらの組み合わせに、変異を有する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、次の変異：Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ、Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ、Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ４６Ｈｉｓ、Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ、Ａｓｎ１３Ｈｉｓ、及びＡｓｎ１２Ｇｌｙ、のうちの１つまたは組み合わせを有する。他の実施形態では、リゾスタフィン多様体はまた、Ｃ末端結合ドメインに、１つ以上のアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、Ａｓｎ２３６、Ａｒｇ１８６、Ａｌａ１６９、Ｓｅｒ１６６、Ｔｙｒ１６０、またはそれらの組み合わせに、Ｃ末端結合ドメイン変異を有する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、Ｃ末端結合ドメイン変異の次の変異：Ａｓｎ２３６Ａｓｐ、Ａｒｇ１８６Ｔｈｒ、Ａｌａ１６９Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６６Ａｓｎ、及びＴｙｒ１６０Ｈｉｓ、のうちの１つまたは組み合わせを有する。Ｃ末端結合ドメインにおける他の好適なアミノ酸置換は、ＵＳ２００８／００９５７５６に開示されているものを含むが、これらに限定されない。
同様に、本発明は、任意の特定タイプの変異に限定されない。本発明の変異は、アミノ酸交換（複数可）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、付加（複数可）、置換（複数可）、逆位（複数可）、及び／または重複（複数可）を含むが、これらに限定されない。これらの変異／修飾（複数可）は、保存的及び／またはホモログのアミノ酸交換（複数可）も含む。表現型的に／機能的にサイレントなアミノ酸置換を行う方法についてのガイダンスが記載されている。（例えば、Ｂｏｗｉｅ （１９９０）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１３１０を参照のこと）。
本発明は、図１（配列番号１～４８）または配列番号２１８～２２０に示されるポリペプチド配列と、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、最も好ましくは、９９％同一または相同であるアミノ酸配列を有するリゾスタフィン多様体も提供する。
一部の実施形態では、本発明のリゾスタフィン多様体は、非脱免疫化リゾスタフィンにより誘発された免疫応答（例えば、抗リゾスタフィン抗体力価により測定される場合）の９０％未満、より好ましくは、８０％未満、より好ましくは、７０％未満、より好ましくは、６０％未満、より好ましくは、５０％未満、より好ましくは、４０％未満、より好ましくは、３０％未満、より好ましくは、２０％未満、さらにより好ましくは、１０％未満を誘発する。
一部の実施形態では、本発明は、脱免疫化リゾスタフィン多様体をコードする核酸配列を含むプラスミドを提供する。特定の実施形態では、プラスミドは、（例えば、殺菌活性及び免疫原性の低減を示す）リゾスタフィン多様体をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、例えば、精製を容易にする配列と融合された、融合タンパク質（例えば、ヒスチジン伸展）として発現される。一部の実施形態では、本発明の発現ベクターは、配列番号１～４８（図１Ａ～１Ｅ）または配列番号２１８～２２０に記載されるようなアミノ酸配列を有する脱免疫化リゾスタフィン多様体をコードする核酸配列を含む。
リゾスタフィン多様体核酸に加えて、本発明のプラスミドは、制御配列、例えば、プロモーター、転写エンハンサー、及び／またはリゾスタフィン多様体の発現の誘導を可能にする配列、も含んでも良い。例えば、１つの好適な誘導システムは、テトラサイクリン制御性遺伝子発現システム（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５５４７－５５５１； Ｇｏｓｓｅｎら（１９９４） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １２：５８－６２を参照のこと）である。一部の実施形態では、誘導システムは、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターである。
発現プラスミドを使用して、本発明のリゾスタフィン多様体は、多数の既知の方法により産生させることができる。例えば、リゾスタフィン多様体は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ（ＵＳ４，９３１，３９０）；Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＩＣＥ発現システム（ＮＩｓｉｎ制御遺伝子発現）（Ｍｉｅｒａｕら（２００５） Ｍｉｃｒｏｂ． Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ． ４：１－９）；ｐＥＴ２３ｂ（＋）及びｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ－ＴＯＰＯ Ｅ． ｃｏｌｉ発現システム（Ｓｚｗｅｄａら（２００５） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１７：２０３－２１３）；ＢＬ２１（ＤＥ－３） Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｓｈａｒｍａら（２００６） Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． Ｐｕｒｉｆｉｃ． ４５：２０６－２１５）；または、本明細書及び治療用タンパク質の産生のため他の文献に記載されるようなＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｇａｓｓｅｒら（２０１３） Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ８：１９１－２０８； Ｗａｌｓｈ （２０１０） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８：９１７－９２４； Ｓｈｅｋｈａｒ （２００８） Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １５：２０１－２０２； Ｍｅｙｅｒら（２００８） Ｂｉｏｐｒｏｃ． Ｉｎｔｅｒｎａｔ． ６：１０－２１）から発現させ、単離できる。特定の実施形態では、本発明のリゾスタフィン多様体Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現により得られ、これは、効率的及び選択的な分泌、高タンパク質力価、ならびに、高細胞密度培養を特徴とする（Ｖｏｇｌら（２０１３） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４：１０９４－１１０１）。さらに、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓは、安全（ＧＲＡＳ）生体と考えられており、タンパク質分泌に使用できるいくつかのシグナル配列を有し、最も強力な既知のプロモーター（ＡＯＸ）の１つである。Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓは、直接培地へのタンパク質分泌を可能にするので、タンパク質回収及び下流の精製を大幅に単純化する。
本発明のリゾスタフィン多様体は、多数の既知の方法により精製できる。例えば、リゾスタフィンは、高い正電荷のために、陽イオン交換工程を使用して、Ｓ． ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｂ． ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、またはＬ． ｌａｃｔｉｓなどの細菌宿主から精製されている（Ｒｅｃｓｅｉら（１９９０） ｓｕｐｒａ（上記）； Ｍｉｅｒａｕら（２００５） ｓｕｐｒａ； Ｆｅｄｏｒｏｖら（２００３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｍｏｓｃｏｗ） ６８：５０－５３）。Ｅ． ｃｏｌｉで発現された時、リゾスタフィンは、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製されている（Ｓｚｗｅｄａら（２００５） ｓｕｐｒａ； Ｓｈａｒｍａら（２００６） ｓｕｐｒａ）。
リゾスタフィン活性は、いくつかの異なる手段：最少阻害濃度（ＭＩＣ）、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）、ディスク拡散、及び濁度減少（Ｋｕｓｕｍａ及びＫｏｋａｉ－Ｋｕｎ （２００５） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４９：３２５６－３２６３）で測定できる。ＭＩＣアッセイは、Ｓ． Ａｕｒｅｕｓ細胞の成長を防ぐために必要とされるリゾスタフィンの最小濃度を得るために実施される一方、ＭＢＣアッセイは、Ｓ． ａｕｒｅｕｓを死滅させるのに必要とされる薬物の最小濃度を測定するためのＭＩＣアッセイの後に、通常行われる。ＭＩＣアッセイは、治療薬の価値を決定する黄金基準と考えられる。ディスク拡散アッセイは、リゾスタフィン含有ディスクが、Ｓ． Ａｕｒｅｕｓのローン（ｌａｗｎ）上に置かれ、経時的にプレート媒体中に拡散させられる時に生じるクリアランスゾーンの直径を測定することにより、活性を測定するために行われる。濁度減少アッセイは、細胞の溶解が進むに従った、経時的なＳ． ａｕｒｅｕｓ培地の光学的吸収の減少を測定することを含む（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ及びＳｃｈｕｈａｒｄｔ （１９６４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５１：４１４－４２１）。
タンパク質安定性は、いくつかの異なる方法を使用して測定できる。熱安定性を測定するための３つの確立された方法は、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査光散乱（ＤＳＬＳ）、及び示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）を含む。全ての方法は、タンパク質安定性の尺度である、温度の増加に伴いアンフォールドするタンパク質の割合を測定することに基づいている。例えば、温度の小さい増加がタンパク質のアンフォールドをもたらす場合、タンパク質は、非常に安定であると考えられない。ＤＳＣは、熱変性と関連する熱吸収を直接測定し、タンパク質治療薬の安定性の評価に十分定量的であることが証明されている（Ｗｅｎら（２０１１） Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｓｃｉ． １０１：９５５－９６４）。ＤＳＬＳ法は、タンパク質が、温度の増加にさらされる場合に、不可逆的に変性するという仮定に基づいて、タンパク質安定性を測定する。光散乱を使用して、この方法は、変性の結果として生じる凝集をモニタリングする。ＤＳＦでは、疎水性残基と結合する際に蛍光を発する蛍光染料が使用される。温度が増加するにつれて、タンパク質は、アンフォールドし始め、そのコアに見出される疎水性残基を露出させて、蛍光シグナルの増加を引き起こす。シグナルのこの増加は、ある範囲の温度にわたって、モニタリングされ、Ｔｍ値を測定するために使用される。
免疫原性を評価するために、インビトロ及びインビボのモデルが生成されている。ＭＨＣ分子が、Ｔ細胞依存性免疫応答において重要な役割を果たすので、インビトロアッセイは、ペプチドのＭＨＣに結合する能力を試験するために使用できる（Ｓａｌｖａｔら（２０１４） Ｊ． Ｖｉｓ． Ｅｘｐ． ８５）。加えて、ラット、マウス、及び非ヒト霊長類などのいくつかの動物モデルは現在、タンパク質治療約の前臨床評価に使用されており、モデルがヒトに近い程、患者における望ましくない抗体産生を予測することにおいてより正確になるであろう（Ｂｒｉｎｋｓら（２０１３） Ｐｈａｒｍａ． Ｒｅｓ． ３０：１７１９－１７２８）。
一部の実施形態では、本発明は、本発明のリゾスタフィン多様体を含有する医薬組成物を提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明は、リゾスタフィン多様体及び薬学的に許容される担体を含有する組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、（例えば、皮膚、創傷、若しくは器官の）ブドウ球菌感染の治療若しくは予防のための医薬組成物に使用される、または、種々の活性Ｓ． ａｕｒｅｕｓ感染に対する治療法としての、リゾスタフィン多様体（例えば、脱免疫化リゾスタフィン）を提供する。好ましい実施態様では、本発明の医薬組成物は、本発明の治療的有効量のリゾスタフィンを、薬学的に許容される担体と共に含む。本発明は、利用される薬学的に許容される担体のタイプにより限定されない。確かに、水；石油、動物油、植物油、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油などの滅菌液体を含むが、これらに限定されない種々の担体は、当該技術分野においてよく知られている。生理食塩水、水性デキストロース、及びグリセロール溶液はまた、特に、注射用溶液製剤のための液体担体として用いることができる。好適な薬学的担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版に記載されている。
治療的有効量は、感染の治療における救助、援助、予防、または防止効果のいくつかの尺度を提供すると合理的に考えられているリゾスタフィン多様体の量である。治療的有効量は、細菌のコロニー形成または感染を遮断するのに十分と考えられる量であって良い。同様に、治療的有効量は、既存の細菌感染を緩和（例えば、根絶）するのに十分と考えられる量であって良い。本発明の医薬組成物は特に、細菌感染を予防、改善、及び／または治療するのに有用であって良い。
本発明の組成物は、局部的に（例えば、局所的に）または全身的に（例えば、静脈内に）投与されても良い。非経口投与のための製剤は、滅菌水性、または非水溶液、懸濁液、及びエマルションを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、エマルション、または生理食塩水及び緩衝媒体を含む懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、流体及び栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などを含む。例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、及び不活性ガスなどの防腐剤及び他の添加剤も存在しても良い。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬品組成物の意図される使用に応じて、さらなる薬剤も含んでも良い。
本発明によれば、用語「治療」、「治療すること」などは、本明細書では一般に、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、感染を完全に若しくは部分的に予防する観点から防止的であって良く、及び／または、細菌感染を完全に若しくは部分的に治療する（例えば、根絶する）観点から治療的であって良い。本明細書で使用される用語「治療」は、細菌感染が（例えば、感染（例えば、院内感染）しやすい素因があり得るが、感染しているとまだ診断されていない）対象において生じることを予防すること；細菌感染を阻害する；及び／または（ｃ）感染を和らげること（例えば、感染の原因となる細菌の存在を完全に若しくは部分的に低減させること）、を含む。
Ｓ． ａｕｒｅｕｓにより引き起こされるようなブドウ球菌感染は、特に、病院、学校、及び診療所などの環境において、罹患率及び死亡率の重要な原因である。特にリスクのある患者は、幼児、高齢者、免疫不全者、免疫抑制者、及び頻繁な入院を必要とする慢性的な状態の患者を含む。ブドウ球菌感染を発症するリスクのある患者は、入院または外来手術を受けている患者、集中治療室（ＩＣＵ）内の患者、連続血液透析中の患者、ＨＩＶ感染に罹患している患者、ＡＩＤＳに罹患している患者、やけど患者、（例えば、薬物治療または疾患から生じる）免疫力が低下した人々、慢性的病気の患者または衰弱した患者、高齢者、免疫系が未熟な幼児、及び血管内デバイス（例えば、埋め込みデバイス）を有する人々も含む。従って、一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体を含有する組成物は、これらのタイプの対象の任意の１つに、及び（例えば、Ｓ． ａｕｒｅｕｓまたはＳ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにより引き起こされる）細菌感染を有する、または、これにかかりやすい他の対象に投与される。
一部の実施形態では、本発明のリゾスタフィン多様体は、水溶液、半固体製剤、または再構成のための（例えば、凍結乾燥された、結晶若しくは非晶質の、浸透圧の平衡のための追加の溶質を用いる若しくは用いない）乾燥製剤のいずれかとして製剤化される。製剤は、例えば、従来のプロトコール及びレジメによる投与のための、ｐＨが約３～８、通常は５～８である、無毒の安定な薬学的に許容される水性担体媒体中に、または、クリームなどの半固体製剤中に、存在または再構成しても良い。送達は、例えば、眼内投与、静脈内（ｉｖ）、筋肉内、皮下、若しくは腹腔内経路を介する、またはくも膜下腔内、または吸入による、または、医療用具、カテーテル、及び埋め込み型デバイスをコーティングするために使用される、または（例えば、感染を治癒、緩和、若しくは予防するための微生物力価の低減をもたらすために）活性薬剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を超える血液及び組織レベルを可能にするために、感染部位に直接導入することによる可能性がある。一部の実施形態では、抗菌剤は、（例えば、局所または鼻腔内製剤に使用される）クリームなどの半固体製剤として製剤化される。
さらに、リゾスタフィン多様体は、感染症をより有効に治療するために、他の抗菌剤と同時にまたは交互に、同時投与できる。製剤は、局所、眼内、または経鼻用途用の半固体製剤；眼内投与、静脈内ボーラス投与、または末梢注射に適した液体中に存在しても良く、若しくはこれらの中で再構成されても良く、または大量の静脈内点滴溶液に加えることにより、または、低速静脈内注入により投与されることになるより大量の中に存在しても良く、若しくはこれらの中で再構成されても良い。例えば、リゾスタフィン多様体は、細胞壁合成を妨げる、または阻害する抗生物質、例えば、ペニシリン、ナフシリン、及び他のアルファ－ラクタムまたはベータ－ラクタム抗生物質；セファロチン、アミノグリコシド、スルホンアミド、葉酸代謝拮抗剤、マクロライド、キノロンなどのセファロスポリン；バンコマイシン及びポリペプチドなどのグリコペプチドと共に、投与できる。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、タンパク質合成を阻害する１つ以上の抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、及びストレプトグラミンなどのアミノグリコシド）と共に投与される。本発明は、脱免疫化リゾスタフィンと同時投与される薬剤のタイプにより限定されない。確かに、ＵＳ６，０２８，０５１、ＵＳ６，５６９，８３０、及びＵＳ７，０７８，３７７（これらのそれぞれは全体として本明細書で参照により組み込まれる）に記載されるこれらの薬剤を含むが、これらに限定されない種々の薬剤は、同時投与しても良い。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、モノクローナル抗体；リゾスタフィン、リゾチーム、ムタノリシン、及びセロジル（ｃｅｌｌｏｚｙｌ）ムラミダーゼなどの他の非コンジュゲート抗菌酵素；ペプチド（例えば、デフェンシン）；ならびにランチビオティック（例えば、ナイシン）；または任意の他のランチオニン含有分子（例えば、サブチリン）と投与される。
リゾスタフィン多様体と同時投与される薬剤は、固定された組み合わせとしてのリゾスタフィン多様体と共に製剤化されても良く、または、利用可能で実用的であるいかなる製剤においても、及び、感染部位で適切なレベルのこれらの薬剤を提供することが知られているいかなる投与経路によっても、即時に使用されても良い。
好ましい実施態様では、本発明によるリゾスタフィン多様体は、対応する非脱免疫化抗菌剤の抗菌活性の少なくとも一部分を有する。本発明のリゾスタフィン多様体は、増加した投薬量及び／または減少した免疫原性のために頻繁ではない間隔で、投与されても良い。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、非脱免疫化抗菌剤の活性の少なくとも１０％を保持する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、非脱免疫化抗菌剤の活性の少なくとも２０％を保持する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、非脱免疫化抗菌剤の活性の少なくとも３０％を保持する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、非脱免疫化抗菌剤の活性の少なくとも４０％を保持する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、非脱免疫化抗菌剤の活性の少なくとも５０％を保持する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、非脱免疫化抗菌剤の活性の少なくとも６０％を保持する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、非脱免疫化抗菌剤の活性の少なくとも７０％を保持する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、非脱免疫化抗菌剤の活性の少なくとも８０％を保持する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、非脱免疫化抗菌剤の活性の少なくとも９０％を保持する。一部の実施形態では、リゾスタフィン多様体は、非脱免疫化抗菌剤の活性の９０％以上（例えば、９５％、９７％、９９％またはそれ以上）を保持する。
脱免疫化リゾスタフィンの好適な投薬量及びレジメは、感染の重症度及び感染生体の感受性に伴って変化しても良く、併用療法の場合には、同時投与された特定の薬剤（例えば、抗ブドウ球菌剤）に依存しても良い。投薬量は、約０．０５～約５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲に及んでも良く、（例えば、一部の実施形態では、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で変動し、一部の実施形態では、１０～１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲に及び、一部の実施形態では、１００～２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲に及び、一部の実施形態では、２００～４００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲に及び、一部の実施形態では、４００～５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲に及ぶ）、但し、より高い（例えば、５００～１０００ｍｇ／ｋｇ／日）、またはより低い（例えば、０．１～０．５ｍｇ／ｋｇ／日）用量は、提供されるか、単回投薬若しくは分割投薬として与えられるか、または連続注入により与えられても良い。一部の実施形態では、脱免疫化リゾスタフィンは、１日１回、１日２回、１日３回、またはそれ以上の頻度（例えば、１日４回以上）で投与される。一部の実施形態では、脱免疫化リゾスタフィンは、週に１回、週に２回、または１日おきに投与される。一部の実施形態では、脱免疫化リゾスタフィンは、隔週に１回、月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１年に１回、またはそれ以下の頻度で投与される。
特定の実施形態では、本発明の脱免疫化リゾスタフィンは、非グリコシル化される。非グリコシル化は、本明細書で記載されるように実施でき、残基Ｓｅｒ１２６及び／またはＴｈｒ１２７に変異を含むことができる。例示的変異としては、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏ及びＴｈｒ１２７Ａｌａが挙げられる。
一部の実施形態では、本発明の脱免疫化リゾスタフィンは、抗菌活性を保持しながら、リゾスタフィン分子の免疫原性をさらに減少させるために、さらに修飾されても良い。例えば、一部の実施形態では、脱免疫化リゾスタフィンは、水溶性ポリマーにコンジュゲートされる。本発明は、脱免疫化リゾスタフィンがコンジュゲートされる水溶性ポリマーのタイプにより限定されない。確かに、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリオキシエチル化ポリオール、及びポリ（ビニルアルコール）を含むが、これらに限定されない種々の水溶性ポリマーが使用されても良い。ポリ（アルキレンオキシド）としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポロキサマー、及びポロキサミンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、（例えば、脱免疫化リゾスタフィンを１つ以上の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）に連結させるために）使用されるコンジュゲートのタイプにより限定されない。一部の実施形態では、ポリ（アルキレンオキシド）は、ポリ（アルキレンオキシド）の（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステルから形成された）アミド結合を介して遊離アミノ基にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、エステル結合は、コンジュゲートされた後に、コンジュゲートの中に残る。一部の実施形態では、結合は、脱免疫化リゾスタフィン分子に存在するリシン残基を介して生じる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、短時間作用性分解可能な結合を介して生じる。本発明は、利用される分解可能な結合のタイプにより限定されない。確かに、エステル、炭酸エステル、カルバメート、サルフェート、ホスフェート、アシルオキシアルキルエーテル、アセタール、及びケタール結合を含む生理学的に切断可能な結合を含むが、これらに限定されない種々の結合は、本発明において有用であると考えられる。一部の実施形態では、脱免疫化リゾスタフィンは、ＵＳ４，４２４，３１１；ＵＳ５，６７２，６６２；ＵＳ６，５１５，１００；ＵＳ６，６６４，３３１；ＵＳ６，７３７，５０５；ＵＳ６，８９４，０２５；ＵＳ６，８６４，３５０；ＵＳ６，８６４，３２７；ＵＳ６，６１０，２８１；ＵＳ６，５４１，５４３；ＵＳ６，５１５，１００；ＵＳ６，４４８，３６９；ＵＳ６，４３７，０２５；ＵＳ６，４３２，３９７；ＵＳ６，３６２，２７６；ＵＳ６，３６２，２５４；ＵＳ６，３４８，５５８；ＵＳ６，２１４，９６６；ＵＳ５，９９０，２３７；ＵＳ５，９３２，４６２；ＵＳ５，９００，４６１；ＵＳ５，７３９，２０８；ＵＳ５，４４６，０９０及びＵＳ６，８２８，４０１；ならびにＷＯ０２／０２６３０及びＷＯ０３／０３１５８１に記載される方法、試薬、及び／または結合のいずれかを利用するＰＥＧにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、本発明の脱免疫化リゾスタフィン－水溶性ポリマーコンジュゲートは、サードパーティ（例えば、ＮＥＫＴＡＲ、カリフォルニア州サンカルロス）により製造される。一部の実施形態では、コンジュゲートは、（例えば、切断された時、ポリマーの部分または結合が、脱免疫化リゾスタフィン分子に残らないように）ポリマー及び脱免疫化リゾスタフィンの間の結合に存在する切断可能な結合を含む。一部の実施形態では、コンジュゲートは、（例えば、切断された時、ポリマーの小さな部分または結合が、脱免疫化リゾスタフィン分子に残るように）ポリマー自体に存在する切断可能な結合を含む。
一部の実施形態では、本発明の脱免疫化リゾスタフィンは、（例えば、ＵＳ２００３／０２１５４３３及びＷＯ０３／０８２１４８に記載されるように）バイオフィルムの治療及び／または予防のために使用される。他の実施形態では、本発明の脱免疫化リゾスタフィンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバーによる細菌感染を含む微生物感染の予防及び／または治療に使用される。このような方法に従って、治療の必要な対象（例えば、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ感染に罹患するまたはこれを発症するリスクのある対象）に、微生物感染が予防または治療されるように有効量の脱免疫化リゾスタフィンが投与される。この治療の恩恵を受ける対象は、感染の臨床的徴候または症状を示すものを含み、対象は、細菌（例えば、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）に曝露されるか、または対象は、細菌（例えば、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）に曝露されている疑いがある。有効な治療は、よく知られている感染の徴候または症状の減少、減弱、阻害、または改善をもたらすであろう。一部の実施形態では、治療は、例えば、ＵＳ２００３／０２１１９９５に記載されているような経鼻用途、または、ＵＳ２００４／０１９２５８１に記載されているような局所用途を含む。
選択された投薬量レベルは、用いられる特定の脱免疫化リゾスタフィンの活性、投与経路、投与の時期、排泄率または特定の脱免疫化リゾスタフィンの代謝、治療期間、用いられる特定の脱免疫化リゾスタフィンと組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／または材料、年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態、ならびに治療されている患者の過去の病歴を含む種々の要因、ならびに、医学分野でよく知られている類似の要因に依存するであろう。
当該技術分野で通常の技能を有する内科医または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方できる。例えば、内科医または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで、脱免疫化リゾスタフィンの用量を開始でき、所望の効果が達成されるまで、投薬量を徐々に増加させることができた。これは、当業者の範囲であると考えられる。
有効な用量はまた、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ感染の当該技術分野で認識されるモデルにおいて測定できる。有効性をさらに実証するために当業者が使用でき、ヒトにおいて安全及び有効の両方であることになる用量の特定に役立つ、多くの異なるインビボモデル系がある。このような動物モデル系は、よく受け入れられ、新しいヒト医薬品の開発中に使用される。このようなモデル系の例としては、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ創傷感染のモルモットモデル（Ｋｅｒｎｏｄｌｅ及びＫａｉｓｅｒ （１９９４） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３８：１３２５－１３３０）；ウサギにおけるＳ． ａｕｒｅｕｓ膿瘍のウサギモデル（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（１９９９） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４３：６６７－６７１）；Ｓ． ａｕｒｅｕｓ皮膚感染のマウスモデル（Ｇｉｓｂｙ及びＢｒｙａｎｔ （２０００） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４４：２５５－２６０）；深部真皮のＳ． ａｕｒｅｕｓ感染のマウスモデル（Ｇｏｄｉｎら（２００５） Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５５：９８９－９９４）；及びマウス腹腔内感染モデル（Ｐａｔｅｌら（２００４） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８：４７５４－４７６１）が挙げられるが、これらに限定されない。このようなモデルでは、治療薬は、感染に対し試験することができ、確立された感染は、Ｓ． ａｕｒｅｕｓの種々の株を有する動物の接種によるものである。このようなモデルにおける有効性の実証は、様々な方法で測定され、死亡率の減少、動物から採取された組織若しくは血液サンプルの顕微鏡検査により測定された細菌細胞数の低減、またはさらに、動物における創傷治癒の評価を含むが、これらに限定されないであろう。
次の非限定例は、本発明をさらに説明するために提供される。
実施例１：リゾスタフィン触媒ドメインの脱免疫化
材料及び方法
試薬及び培地
プライマーを、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルビル）に、標準脱塩装置と共に注文した。ＰＣＲクリーンアップキット及びゲル抽出キットは、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（カリフォルニア州アーバイン）製であった。市販のリゾスタフィンを、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。プラスミド精製を、ＱＩＡＰＲＥＰ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ； カリフォルニア州バレンシア）を使用して実施した。別途記載のない限り、全ての酵素を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（マサチューセッツ州イプスウィッチ）から入手し、全ての試薬をＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ペンシルベニア州フィラデルフィア）から入手した。リゾスタフィン触媒ドメインから誘導されたペプチドを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）に注文し、これは、純度８５％以上であった。ＭＨＣクラスＩＩＤＲ分子を、Ｂｅｎａｒｏｙａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ワシントン州シアトル）から購入し、抗ＭＨＣクラスＩＩＤＲ抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（カルフォルニア州サンディエゴ）から購入し、ＤＥＬＦＩＡ Ｅｕ標識ストレプトアビジンを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（マサチューセッツ州ボストン）から購入した。
エピトープ予測
リゾスタフィン触媒ドメインのＴ細胞エピトープの含有量を、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ、スコアリングマトリックスを使用して予測した。この予測は、臨床的に観察される治療薬の免疫原性とよく相関することが示されている。ＥｐｉＭａｔｒｉｘは、ＨＬＡ結合を予測するために使用されたポケットプロファイル法である（Ｇｒｏｏｔ及びＭｏｉｓｅ （２００７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ． Ｄｅｖ． １０）。このアプローチでは、タンパク質は、重複するノナマーペプチドに分けられ、次に、これらのそれぞれは、ＨＬＡ対立遺伝子に対する結合能について評価される。９０％を超えるヒト個体群を代表する、最も一般的な８つのＨＬＡ対立遺伝子（ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１５０１）（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら（１９９８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０：３３６３－３３７３）を考慮した。結合能に基づいて、各ペプチドに、対応する標準化されたＺスコアを割り当て、次に、各ペプチドを、クラスタ免疫原性スケールにマッピングした。これらは、無作為に生成されたペプチドに対して予想されることになるものからのエピトープ含有量における偏差を表す（Ｇｒｏｏｔら（２０１３） Ｅｘｐ． Ｒｅｖ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６：６５１－６６２）。ＥｐｉＭａｔｒｉｘ「Ｚ」スケール上の１．６４を上回るペプチドスコアリング（約上位５％）は、対応するＭＨＣ分子に結合する可能性があると考えられた一方、上位１％のペプチドスコアリング（スケール上で２．３２を超える）は、結合する可能性が非常にあった（Ｋｏｒｅｎら（２００７） Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２４：２６－３２）。ペプチドが、４つ以上の対立遺伝子に対し、１．６４より高いスコアを有した場合、ＥｐｉＢａｒを含有すると言われていた（Ｗｅｂｅｒら（２００９） Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ６１：９６５－９７６）。
リゾスタフィンのホモロジーモデリング
ＥｐｉＳｗｅｅｐは、２つの定量化された測定値：エピトープスコア及び力場エネルギー値、に基づいて脱免疫化多様体を分析する。しかし、アルゴリズムは、エネルギーを計算するためにタンパク質の構造を使用する。リゾスタフィンの結晶構造が知られていないので、リゾスタフィンの触媒ドメインに類似したタンパク質の利用可能な結晶構造に基づいて、リゾスタフィンモデルを作製した。リゾスタフィンの配列を、ＰＤＢデータベースと比較して、３つの非常に類似したタンパク質（ＰＤＢアクセッションコード：２Ｂ０ＰＡ、２Ｂ４４Ａ、及び１ＱＷＹＡ）を選択することにより、テンプレートを選択した。ホモロジーモデリングの目的の場合、３０％を超える配列同一性は、十分に正確であると考えられる（Ｒｏｓｔ （１９９９） Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌｅｃｔ． １２：８５－９４）。全てのテンプレート構造は、Ｓ． ａｕｒｅｕｓからの自己溶菌酵素であるＬｙｔＭに属し、これは、リゾスタフィンの触媒ドメインと４８％の配列同一性及び６３％の類似性を有する（Ｌｕら（２０１３） ｓｕｐｒａ）。
テンプレート構造の座標に基づくタンパク質の３次元構造を構築するホモロジーモデリングプロトコールであるＭＯＤＥＬＬＥＲを用いることにより、ＬｙｔＭ結晶構造を使用して、触媒ドメインモデルを構築した（Ｓｈｅｎ及びＳａｌｉ （２００６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １５：２５０７－２５２４）。２５０のモデルを作製し、最も正確なものを、ＤＯＰＥ統計ポテンシャルの観点から選択した（Ｓｈｅｎ及びＳａｌｉ （２００６） ｓｕｐｒａ）。
モデルの完全で正確な構造を可能にするための十分な座標情報がないタンパク質領域の場合、タンパク質ループモデリング法ＦＲＥＡＤを使用して、既存のギャップをリモデリングした（Ｃｈｏｉ及びＤｅａｎｅ （２０１０） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７８：１４３１－１４４０）。得られたホモロジーモデルを、陰溶媒モデル（ＧＢ／ＳＡ）を伴うＡＭＢＥＲ９９ｓｂに対し最小化した。Ｓｃｗｒｌ４を使用して、インシリコ変異を元のモデルに適用することにより、非グリコシル化野生型（１２５ＮＰＴ）をモデル化し（Ｋｒｉｖｏｖら（２００９） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔ． Ｆｕｎｃｔ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ． ７７：７７８－７９５）、続いて、エネルギーの再最小化を行った。
進化情報
脱免疫化のプロセスは、ＭＨＣ結合に寄与すると予測される残基の変異を必要とする。しかし、Ｔ細胞エピトープは、タンパク質の任意の部分に存在する可能性がある。従って、変異のランダム選択は、適切なフォールディング及び機能の阻害をもたらすことができた。この問題は、標的配列とわずかに類似している配列に見出される点変異を採用することにより、軽減できる。どの変異が脱免疫化プロセスに使用できるかを決定するために、ＬＳＴＣＡＴに対する１０，０００のホモログの合計を、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを実行して収集した（３回繰り返し、ｅ－ｖａｌｕｅ（値）＜０．００１）。これらの配列を、フィルタリングして、野生型と＞５０％のギャップまたは＜３５％の配列同一性を有するものを除去した。互いに多くとも９０％の配列同一性を有するように、２１８の代表的な配列の多様なセットをサブセレクトした。許容される変異は、バックグラウンド確率分布の観点から予想される程度、頻繁に現れるが、少なくとも１つの推定エピトープを欠失させると予測されるものであった（ＭｃＣａｌｄｏｎ及びＡｒｇｏｓ （１９８８） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４：９９－１２２）。さらなるフィルタは、Ｐｒｏ及びＣｙｓへの／Ｐｒｏ及びＣｙｓからの変異である活性部位残基を含む変異（３２Ｈｉｓ、３６Ａｓｐ、８２Ｈｉｓ、１１３Ｈｉｓ、及び１１５Ｈｉｓ）、ならびに以前に有害であることが判明した変異（Ｔｈｒ４３Ａｓｐ、Ｓｅｒ５０Ａｓｐ、Ａｓｎ１２１Ａｓｐ、及びＬｅｕ１３５Ｓｅｒ）を除外した。
ＥｐｉＳｗｅｅｐ
構造ベースのＥｐｉＳｗｅｅｐは、タンパク質の脱免疫化を可能にし、その上、タンパク質の安定性及び機能性を保持するタンパク質再設計ツールである。アルゴリズムは、最高の免疫原性、安定性、及び活性スコアを目指して、その時点で実験的に選択される可能性があるパレート最適設計を作製するための検証された免疫情報及び構造モデリングを兼ね備える。ＥｐｉＳｗｅｅｐが最適の設計を選択する方法は、記載されている（Ｐａｒｋｅｒら（２０１３） Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｌ． ２０：１５２－１６５）。要約すると、アルゴリズムは、タンパク質バックボーンが、剛性があると仮定し、回転異性体の離散集合から最良の側鎖コンフォメーションを選択することによる安定性の懸案事項を扱い、これは、全タンパク質のエネルギーを最小化するように選択される。全ての回転異性体及び回転異性体対は、バックボーンとの可能性のある衝突及び互いの可能性のある衝突について評価される。例えば、有意なファン・デル・ワールス半径の重なりを伴う回転異性体、または、回転異性体間エネルギー若しくは回転異性体内エネルギーが例外的に高い回転異性体を含むことが判明したコンフォメーションは、廃棄される（Ｐａｒｋｅｒら（２０１３） ｓｕｐｒａ）。
リゾスタフィン触媒ドメインのＥｐｉＳｗｅｅｐ分析の場合、変異負荷を２～８変異で変動させ、活性部位（Ｈｉｓ３２、Ａｓｐ３６、Ｈｉｓ８２、Ｈｉｓ１１３、及びＨｉｓ１１５）での変異を認めないようにアルゴリズムを制約した。さらに、アルゴリズムは、各変異負荷でのパレート最適計画（可能な限り低い回転異性体のエネルギーを有する設計）だけでなく、追加の１９の次善計画（パレート最適計画と比較して逐次悪化する回転異性体エネルギーを有する設計）も生成するものであった。タンパク質は高度の柔軟性を特徴とするので、この分析を実行して、剛性バックボーンの仮定により起こり得る可能なあらゆる間違いを修正した。実際には、さらなる側鎖の最適化は、ＥｐｉＳｗｅｅｐ設計のパレート最適性を変更させ、それにより設計の選択に影響し得ることが観察されている（Ｐａｒｋｅｒら（２０１３） ｓｕｐｒａ）。
Ｓｅｒ１２６ＰｒｏバックボーンのＥｐｉＳｗｅｅｐ分析
Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏリゾスタフィンバックボーンを使用する分析の場合、アルゴリズムは、１２の許容性の高い変異（Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ、Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ、Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ４６Ｈｉｓ、Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ、Ａｓｎ１３Ｈｉｓ、及び Ａｓｎ１２Ｇｌｙ）のみを考慮した。Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ変異が、極めて有効なエピトープ除去剤（表６）であるので、アルゴリズムを、生成された全ての計画でこの変異を含むようにさらに制約した。ＡＭＢＥＲ（ＡＭＢＥＲ９９ｓｂ）力場及び陰溶媒モデル（ＧＢ／ＳＡ）に対して、分子モデリングソフトウェアＴＩＮＫＥＲを使用して、ＥｐｉＳｗｅｅｐ設計のさらなるポスト処理エネルギーの最小化を実行した。
プラスミド及び株
Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５及び発現ベクターｐＰＩＣ９を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ニューヨーク州グランドアイランド）から入手した。Ｓ． ａｕｒｅｕｓ株ＳＡ１１３及びＳ． ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ ２５９２３）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）から入手した。Ｓ． ａｕｒｅｕｓの他の株（メチシリン感受性株６４４５及び３４２５－１、ならびにＭＲＳＡ株３４２５－３）は、臨床分離株であった。
Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ発現のために最適化されたリゾスタフィン遺伝子の合成
合成リゾスタフィン遺伝子の合成を、記載されるように実施した（Ｚｈａｏら（２０１４） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ８０：２７４６－５３）。Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓによるコドン選好性を反映するために、コドンの大部分を交換した（Ｚｈａｏら（２０００） Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｇｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｘｕｅ Ｂａｏ １６：３０８－１１）。遺伝子配列中のＡ＋Ｔヌクレオチド伸長を阻害するために、二番目に頻度の高いコドンを必要に応じて導入した。
単一点変異体のＰＣＲベースの合成
リゾスタフィン単一変異体を、記載されるように合成した（Ｚｈａｏら（２０１４） ｓｕｐｒａ）。要約すると、表１に示されるプライマーを用いるスプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して、変異を導入した。例えば、Ｓｙｎ＿Ｆ及びＳ１２２Ｇ＿Ｒ、ならびにＳ１２２Ｇ＿Ｆ及びＳｙｎ＿Ｒプライマーを使用して、リゾスタフィン遺伝子を最初に増幅することにより、Ｓｅｒ１２２Ｇｌｙ変異を導入した。次に、得られる（ゲル精製された）遺伝子フラグメントを、等モル比で混合し、Ｓｙｎ＿Ｆ及びＳｙｎ＿Ｒプライマーを使用する後続反応においてテンプレートとして使用した。最終生成物は、Ｓｅｒ１２２Ｇｌｙ変異を有する完全長リゾスタフィン遺伝子であった。ＰＨＵＳＩＯＮ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用して、全てのＰＣＲ反応を実施した。次に、所望の変異を含むリゾスタフィン遺伝子を、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、ｐＰＩＣ９プラスミドにライゲーションした。ライゲーションの最終産物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα交配因子分泌シグナルと融合されたリゾスタフィン遺伝子であった。得られるプラスミドを、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αエレクトロコンピテントセル（Ｆ－ Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ） Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７ （ｒＫ －， ｍＫ ＋） ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ－ ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１）に形質転換させた。クローンを、Ｓｙｎ＿Ｆ及びＳｙｎ＿Ｒプライマーを使用してリゾスタフィン遺伝子の存在について評価し、変異の存在確認するために配列決定した（ｐｒｉｍｅｒｓ ＡＯＸ１＿Ｆ及びＡＯＸ１＿Ｒ）。
Figure 0007059003000001
Figure 0007059003000002
ＬＳＴ統合設計のクローニング
スクリーニングの第１ラウンドで発現せず、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ変異を含有するリゾスタフィン多様体を、その変異なしに合成し、発現について再試験した。スプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して、プライマーＴ１１８Ｒ＿Ｆ及びＴ１１８Ｒ＿Ｒを用いて、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ変異を野生型（Ｔｈｒ１１８）に復帰させた（表１）。
合成遺伝子の挿入のためのｐＰＩＣ９プラスミドを調製するために、サイレント変異を、リゾスタフィンリンカー（残基１３５～１３６）に導入して、制限酵素ＡｆｌＩＩのための切断部位を収容した。必要な変異を導入するために、プライマーＡｆｌＩＩ＿Ｆ及びＡｆｌＩＩ＿Ｒを用いるスプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲを使用した（表１）。合成遺伝子を、ＸｈｏＩ及びＡｆｌＩＩ制限酵素で消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、同様に消化されたｐＰＩＣ９プラスミドにライゲーションした。得られるプラスミドを、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αエレクトロコンピテントセルに形質転換させ、得られるクローンを、変異の存在を確認するために配列決定した。
Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ発現及び精製。
配列分析により、正しい触媒ドメイン変異の存在について、ＤＨ５αクローンを確認した後、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５に電気穿孔する前に、精製されたプラスミドを、ＳａｃＩ高忠実度制限酵素で消化した。得られる形質転換体をＭＤプレート（１．３４％の酵母ニトロゲンベース、０．０００００４％のビオチン、２％のデキストロース、及び１％のアガー）上で成長させた。発現研究の場合、酵母への酸素流量を強化するために４層のチーズクロスで覆われた５００ｍｌの振とうフラスコ中３０℃で、ＢＭＧＹ培地（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、１．３４％の酵母ニトロゲンベース、０．０００００４％のビオチン、１％のグリセロール、１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６）中で、クローンを成長させた。２４時間後、細胞を、１０分間テーブルトップ遠心分離機で３，０００ｒｐｍの遠心分離にかけた。次に、細胞を１００ｍｌのＢＭＭＹ誘導培地（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、１．３４％の酵母ニトロゲンベース、０．０００００４％のビオチン、０．５％のメタノール、１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６）に再懸濁し、３０℃で次の４８時間成長させた。１２時間間隔で、１００％のメタノールを、１％の最終濃度を目指して加えた。誘導の４８時間後、振とうフラスコ培養物を、１５分間３０００ｒｐｍのテーブルトップ遠心分離機で遠心分離した。得られる上清を濾過して、任意の酵母細胞を除去し、ｐＨ７．５のＫＨ２ＰＯ４緩衝液１０ｍＭで、１：５に希釈した。５００μｌのＳＰ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；オハイオ州クリーブランド）を充填した重力カラムに、希釈された上清を流した。ｐＨ７．５のＫＨ２ＰＯ４緩衝液１０ｍＭ中の５０ｍＭのＮａＣｌ ５ｍｌで、カラムを洗浄した。ｐＨ７．５のＫＨ２ＰＯ４緩衝液１０ｍＭ中の２００ｍＭのＮａＣｌのアリコート５００μｌで、タンパク質を溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、リゾスタフィンの純度を測定した。ＮＤ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；デラウェア州ウィルミントン）を使用して、タンパク質濃度を定量化した。精度を確保するために、野生型リゾスタフィン及びその多様体の両方に対し、０．４の吸光度調整係数を使用して、タンパク質吸光度測定値を調整した。要約すると、調整係数を、報告されたＡｂｓ０．１％（＝１ｇ／Ｌ）値の逆数として計算した（ＰｒｏｔＰａｒａｍ、ＥｘＰＡＳｙ）。
培養上清の溶解アッセイ
振とうしながら、３７℃で、トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）において、ミッドログ（ｍｉｄ－ｌｏｇ）または飽和のいずれかまで、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ細胞を成長させた。細胞を、遠心分離により採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：２．７ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．９ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３６．９ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１回洗浄した。Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ（ノースカロライナ州モンロー）製９６ウェルプレート（黒・透明底）中で、アッセイを実施した。最終（２５０μｌ）反応物は、１０μｌのＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓの培養上清、ＯＤ６００＝１．５のＳ． ａｕｒｅｕｓ細胞、及び５μＭのＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；マサチューセッツ州ウォルサム）（全てＰＢＳ中）からなった。励起５０４ｎｍ／発光５２３ｎｍを使用するＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ蛍光マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；カルフォルニア州サニーベール）を使用して、データを収集し、トレースの最も急勾配な直線の傾きから割合を測定した。内部対照としての５００ｎｇの市販のリゾスタフィン（ｓｓＬｙｓ）を用いて、各アッセイを実施した。
各アッセイで使用されるタンパク質の量を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから見積もった。要約すると、１０μｌの培養上清を、別のレーン上の０．５μｇ、０．７μｇ、及び１μｇのｓｓＬｙｓの基準と共に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で実行した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カリフォルニア州カールスバッド）製ＧＥＬＣＯＤＥ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、ゲルを染色し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ５．１ソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カリフォルニア州ヘラクレス）のＱｕａｎｔｉｔｙツールを使用して、バンドを定量化した。
精製タンパク質を使用する溶解アッセイ
第２章第３．２．６節で上述したようにＳＹＴＯＸ（登録商標）動態アッセイを使用して、精製リゾスタフィン多様体の活性を試験した。（培養上清の代わりに）２００ｎｇの精製酵素を、各反応物において使用した。
ＭＩＣアッセイ
２％のＮａＣｌ及び０．１％のウシ血清アルブミンが補充されて総量１００μｌになったミューラーヒントンブロス（ＢＤ）中の～４０，０００Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＳＡ１１３（またはＳ． ａｕｒｅｕｓ ６４４５、３４２５－１、３４２５－３）細胞を含有するポリプロピレンの９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３８７９）のウェルに、２倍連続希釈の酵素を加えることにより、野生型リゾスタフィン及びその多様体のＭＩＣを測定した。Ｏｒｂｉｔ Ｐ４ ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ（ニュージャージー州エジソン）上、９００ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で一晩プレートを成長させた。細菌増殖を完全に阻害する酵素の濃度により、精製リゾスタフィンの阻害活性を測定した。アッセイを、各酵素に対し３回実施した。
ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理
１μｌの１０ＸＧ７緩衝液及び同じ量のＲＥＭＯＶＥ－ＩＴ ＰＮＧａｓｅ Ｆで、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清を処理した。３７℃で１時間反応物をインキュベーションし、結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。
飽和変異誘発
既知の方法（Ｚｈａｏら（２０１４） ｓｕｐｒａ）を使用して、リゾスタフィン触媒ドメインの１２５位での飽和変異誘発を実施した。要約すると、テンプレートとしてのリゾスタフィン合成遺伝子及び縮重ＮＮＫプライマーを使用するスプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、飽和変異誘発を実施した。得られる３２メンバーライブラリを、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換し、４８時間３０℃でＹＰＤ培地（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、１％のメタノール、１％のアガー）上で形質転換体を成長させた。活性酵素を発現する酵母クローンを見出すために、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＳＡ１１３細胞を含有する溶解したトップアガー（０．５％の酵母抽出物、１％のペプトン、１％のＮａＣｌ、０．７５％のアガー）を、ＹＰＭ酵母プレートに注ぎ、１０時間３７℃でインキュベーションした。ハロ形成コロニーを採取し、プライマーＳｙｎ＿Ｆ及びＳｙｎ＿Ｒを使用して増幅し、プライマーＡＯＸ１＿Ｆ及びＡＯＸ１＿Ｒを使用して、遺伝子を配列決定した。
Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清を使用するＭＩＣアッセイ
記載される（Ｚｈａｏら（２０１４） ｓｕｐｒａ）ようにリゾスタフィンＭＩＣを実質的に測定した。要約すると、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清の１００μｌのアリコートを、ＴＢＳで連続希釈した。各ウェルに、ＴＳＢ中～１０６ＣＦＵ／ｍｌのＳ． ａｕｒｅｕｓ ＳＡ１１３を１００μｌ接種した。２４時間３７℃でマイクロプレートをインキュベーションした。培養上清中の阻害活性をＭＩＣ５０として評価し、処理希釈は、５０％の成長の阻害をもたらした。マイクロプレートリーダーで６５０ｎｍの光散乱を測定することにより、ＭＩＣ５０を定量化した。
熱安定性
上述したように、示差走査蛍光測定により、リゾスタフィン多様体の相対的な熱安定性を測定した（Ｎｉｅｓｅｎら（２００７） Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２：２２１２－２２２１）。タンパク質及びＳＹＰＲＯオレンジをＰＢＳで希釈し（それぞれ１００μｇ／ｍｌの最終濃度及び５×２０μｌの反応量）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ７５００ ｆａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムを使用して、２５℃から９４℃まで１℃ずつ増加して、蛍光を定量化した。Ｆａｓｔ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒｓ（ＶＷＲ；ペンシルベニア州ラドノール）用ＰＣＲプレートを使用して、反応物を実施した。予め設定されたＴＡＭＲＡパラメータを使用して、蛍光を定量化した。『ＤＳＦ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖ３．０．ｘｌｓｘ』エクセルシート及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．６．０２ソフトウェアを用いたデータ分析により、融解温度を測定した。
ＭＨＣ結合アッセイ
上述したように（Ｓａｌｖａｔら（２０１４） ｓｕｐｒａ）、３８４ウェルハイスループットアッセイを使用して、ＭＨＣクラスＩＩ競合結合アッセイを実施した。８つの対立遺伝子：ＤＲＢ１＊０１０１、０３０１、０４０１、０７０１、０８０１、１１０１、１３０１、及び１５０１に対し、結合アッセイを実施した。要約すると、５０ｎＭの精製された組換えＭＨＣクラスＩＩタンパク質及びＬＳＴの連続希釈物または多様体ペプチドフラグメント（１００μＭ～１０ｎＭ）の入ったポリプロピレン３８４ウェルプレート中で、各ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する既知のペプチド抗原からなる１００ｎＭのビオチン化対照ペプチドをインキュベーションした。高結合ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたコンフォメーション特異的抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体Ｌ２４３を使用して、平衡化された溶液から、ペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ複合体を捕獲した。ＤＥＬＦＩＡストレプトアビジン－ユーロピウムコンジュゲート及び時間分解蛍光（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ蛍光マイクロプレートリーダー）を使用して、結合された対照ペプチドを定量化した。
バイオフィルム分解アッセイ
振とうしながら、３７℃、ＴＳＢ中で、一晩、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＳＡ１１３を成長させた。次に、５％のエタノール及び０．１％のグルコースが補充されたＴＳＢで１：１００に細胞を希釈し、１００μｌの細胞懸濁液を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９５）のウェルに添加した。振とうなしに、３７℃で一晩、細胞を放置してバイオフィルムを形成した。次に、得られるバイオフィルムを水で３回洗浄し、７５分間、１００μｌ中２００ｎｇの酵素で処理した。無処理ウェルは、０．１％ＢＳＡの入ったＰＢＳを含有していた。処理後に、プレートを水で３回洗浄し、１５分間０．１％のクリスタルバイオレットで染色した。次に、プレートを、再度水で３回洗浄し、乾燥させた。３０％の酢酸２００μｌを、各ウェルに加え、振とうしながら、２５℃で１５分間、クリスタルバイオレット染色液に溶解させた。デスティン（１５０μｌ）を新しい９６ウェルプレートへ移し、５５０ｎｍのＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ １９０分光分析装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；カルフォルニア州サニーベール）で、各ウェルの吸光度を測定した。
マウス肺感染モデル
一晩Ｓ． ａｕｒｅｕｓ株ＡＴＣＣ ２５９２３のＬＢ培養物を、ペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄し、懸濁して、４０μｌのＰＢＳ中の１０８～１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）を得た。ＬＢアガー（ＤＩＦＣＯ）上での投入細菌懸濁液の連続希釈により、実際の接種物を測定し、続いて、２４時間３７℃でインキュベーションを行った。成体雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８～１２週齢；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト）を、イソフルランで簡易麻酔し、これらのマウスに、口腔咽頭吸引で４０μｌの細菌懸濁液を接種させた。感染の１時間後に、２．５μｇの野生型ＬＳＴ、２．５μｇの多様体Ｆｌｅｘ５、２．５μｇの多様体Ｆｌｅｘ９、またはブランク対照のいずれかを含有する２回目の４０μｌのＰＢＳ接種。感染の２４時間後に、マウスを死亡させ、肺を切除し、１ｍｌの冷ＰＢＳ中に置き、均質化した。連続希釈物をＬＢアガー上にプレーティングし、次に、２４時間３７℃のインキュベーションを行うことにより、肺ホモジネートの生菌数を測定した。
ＨＵＭＩマウスの免疫原性研究
（Ｂｒａｉｎａｒｄら（２００９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８３：７３０５－２１）に記載されるように、ヒト骨髄、肝臓、及び胸腺組織を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ －／－マウス（Ｄａｒｔｍｏｕｔｈトランスジェニック及び遺伝的構築物共有リソース）に外科移植することにより、ＨＵＭＩマウスを作製した。全ての動物を、同じヒトドナーからヒト化した。実験的に使用されるマウスは、最低２５％の全末梢血白血球として、ヒトリンパ球を有した。移植の１４週間後、１２匹の雌ＨＵＭＩマウスを各４匹ずつの３グループに分け、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の１００μｇの野生型ＬＳＴ、１００μｇの多様体Ｆｌｅｘ５、または１００μｇの多様体Ｆｌｅｘ９の５０μｌの単回皮下注射で免疫化した。免疫化の２週間後、マウスを死亡させ、各グループに対し脾細胞を採取してプールした。プールされた脾細胞（５×１０５／ウェル）を、５％のウシ胎児血清、Ｌ－グルタミン、抗生物質、及び最終濃度１０μｇ／ｍｌのＬＳＴ若しくは多様体（または対照としての１％のＤＭＳＯ）を含有する培地の入った９６ウェルプレートに３回プレーティングした。インキュベーションの７２時間後、ウェルを１μＣｉの［３Ｈ］チミジン（Ｄｕｐｏｎｔ ＮＥＮ、マサチューセッツ州ボストン）とパルスし、シンチレーションカウンティング（Ｐａｃｋａｒｄ ＭｉｃｒｏＳａｎｔ ＮＸＴ ｃｏｕｎｔｅｒ）によるチミジン取り込みの評価のために、ＵＮＩＦＩＬＴＥＲ９６ウェルＧＦ／Ｃプレートで６時間後に採取した。
トランスジェニックＤＲ４マウスの免疫原性研究
１２匹の雌６～８週齢ＤＲ４トランスジェニックマウス（Ａｂｂノックアウト／トランスジェニックＨＬＡ－ＤＲ４；Ｂ６．１２９Ｓ２－Ｈ２－Ａｂ１ｔｍ１ＧｒｕＴｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ／Ｈ２－Ｅａ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１／Ｈ２－Ｅｂ）１Ｋｉｔｏ；Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）を各３匹ずつの４グループに分け、次の４つのスキームのうちの１つを使用して、野生型ＬＳＴの５０μｌの皮下注射で免疫化した。（ｉ）ＣＦＡ中の１００μｇの酵素で初回の免疫化した後、１４及び２８日目に、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）１００μｇでブーストする；（ｉｉ）ＣＦＡ中の２０μｇの酵素で初回の免疫化した後、１４及び２８日目に、ＩＦＡ２０μｇでブーストする；（ｉｉｉ）ＰＢＳ緩衝液中の１００μｇの酵素で初回の免疫化した後、７、１４、２１及び２８日目に、ＰＢＳ緩衝液１００μｇでブーストする；（ｉｖ）ＰＢＳ緩衝液中の２０μｇの酵素で初回の免疫化した後、７、１４、２１及び２８日目に、ＰＢＳ緩衝液２０μｇでブーストする。野生型ＬＳＴに対する血清ＩｇＧ抗体力価を、１３、２０、２７、３４、及び６２日目に測定した。最終ブーストの５週間後に、１２匹のマウス全ては、１：４０の血清希釈で、最大のＥＬＩＳＡシグナルを示し、全てのシグナルは、１：１６０の希釈で、２０％以内であった。マウスを、研究から２３週まで、さらなる操作なしに収容し、この時点で、ＩｇＧ抗体力価を再度測定し、マウスを同等の平均抗体力価を有する２つの実験群に分けた。９週～２３週の回復期間に、２匹のマウス（１００μｇのアジュバントなしでの最低力価及び１００μｇのアジュバントでの高力価のうちの１匹）は脱毛、体重喪失、及び移動性の低下を受け始め、ＩＡＣＵＣ承認プロトコールにより死亡させたことに注意を要する。２４週目に、１つの群を、ＩＦＡ中の１００μｇの野生型ＬＳＴで、もう１つの群を、ＩＦＣ中の１００μｇの多様体Ｆｌｅｘ５で、再チャレンジした。２６週目に、マウスを死亡させ、各グループに対して脾細胞を採取してプールした。増殖アッセイを、上記のように行った。
バイオインフォマティクス分析
ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、リゾスタフィン及びその相同配列ＡＬＥ－１及びＬｙｔＭの配列アライメントを実施した。
エピトープ予測
Ａｓｎ１２５Ｇｌｎ変異体のリゾスタフィン触媒ドメイン（Ｚｈａｏら（２０１４） ｓｕｐｒａ）のＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析は、ドメインが、合計エピトープスコア４６を有する、多くの予測されたＴ細胞エピトープを有することを示す。タンパク質は、１４例の予測された上位１％のバインダー（ｓｃｏｒｅ（スコア）＞２．３２）及び３２例の上位５％のバインダー（ｓｃｏｒｅ＞１．６４）を有していた。配列はまた、３つのＥｐｉＢａｒｓ（最低４つの対立遺伝子に対して１．６４以上のスコアを有するペプチド）を含有することが判明し、ペプチド１１６ＦＱＲＭＶＮＳＦＳ１２４（配列番号８８）は、全ての８つの対立遺伝子に対して高度に免疫原性があると予測された（表２）。
Figure 0007059003000003
Figure 0007059003000004
予備的設計分析に対する最も頻度の高い変異の選択
ＥｐｉＳｗｅｅｐは、合計１，５３３の計画をもたらし、これらのうちの８１を、２～８の変異の変異負荷でのパレート最適計画として評価した。この時点で、一連の設計を単に選択することは可能であったが、次に、これを、適切なフォールディング及び活性について、実験的分析にかけるであろう。しかし、配列ベースのＥｐｉＳｗｅｅｐに基づく脱免疫化リゾスタフィンを生成する以前の取り組みは、活性多様体をもたらさなかった。構造ベースのＥｐｉＳｗｅｅｐを、代替方法として設計し、これは、良好な結果を生じると想定された。不正確なリゾスタフィン表現がエラーを生じることがあることを考えると、反復フィードバック戦略を用いて、（個別に）１５の最も頻度の高い変異を、タンパク質フォールディング（発現）及び活性の影響について試験した。
結果（表３）は、最も頻度の高い１５の変異が、全計画の９～６７％に、及びパレート最適計画の１～６５％に、存在したことを示した。変異は全て、触媒ドメインの表面に見出された。埋め込まれた残基は、ＥｐｉＳｗｅｅｐにより頻繁には使用されなかった。確かに、埋め込まれた残基Ｓｅｒ４９Ｇｌｙ及びＳｅｒ４９Ａｌａはそれぞれ、１８番目及び２０番目の変異として、位置を占める。ＭＨＣ結合に寄与すると予測されたアミノ酸は、塩基性残基（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）、無極性残基（Ｓｅｒ／Ａｓｎ／Ｔｙｒ）、及び非極性残基（Ｐｈｅ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）を含んだ。これらの残基を、非極性（Ｇｌｙ／Ｍｅｔ）、酸性（Ａｓｐ／Ｇｌｕ）、塩基性（Ｈｉｓ）、または無極性（Ｔｈｒ／Ｇｌｎ／Ｔｙｒ）アミノ酸と交換した。
Figure 0007059003000005
変異は、ペプチドのＨＭＣへの結合を有意に低減させ、免疫原性の小さい多様体を生じることが予測された（表４）。全ての生成されたペプチドでは、変異体ヒット数（ペプチドが結合すると予測された対立遺伝子の数）は、野生型ペプチドのものよりも小さいことを認めることができた。例えば、野生型ＱＲＭＶＮＳＦＳＱ（配列番号１０７）ペプチドの１１８位でのＡｒｇからＴｈｒへの変異を、両方のエピトープを欠失するように予測して、全ての対立遺伝子にわたって０のＺスコアがもたらされた。より大きい免疫原性領域のいくつかは、単一変異で取り組むことが困難であった。さらに、単一変異が、合計の免疫原性スコアを低減させることに意味のある影響がある可能性があることが観察された。例えば、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ変異は、２つのエピトープを欠失し、全体のヒット数を１４から８に低減させた。
Figure 0007059003000006
Figure 0007059003000007
Figure 0007059003000008
Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ発現に対するリゾスタフィン配列の修飾
Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ中でＳ． ｓｉｍｕｌａｎｓリゾスタフィン作製する初期の試みは、タンパク質発現の不足により、妨げられた。従って、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ中の発現に対する遺伝子を、修飾した（Ｚｈａｏら（２０１４） ｓｕｐｒａ）。要約すると、野生型リゾスタフィンの配列を、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓのコドン選好性を反映するように調整した。さらに、配列における不均衡なＡ＋Ｔ含有物を有する長いセグメントを、特定して阻害した。新しいバージョンの遺伝子（ＳＹＮリゾスタフィン）は、振とうフラスコ培養物中に多くとも８０ｍｇ／Ｌのタンパク質を生じ、２Ｌのバイオリアクター中に５００ｍｇ／Ｌのタンパク質を生じることが判明した（Ｚｈａｏら（２０１４） ｓｕｐｒａ）。
ＳＹＮリゾスタフィンで行った後続の発現実験は、タンパク質がＳＤＳ－ＰＡＧＥ中で二重線として移動したことを示した。観察された二重線は、タンパク質のＮ－グリコシル化に起因するものであることが推測された。リゾスタフィン配列の詳細な検査により、それが１２５位にグリコシル化シークオン（ｓｅｑｕｏｎ）を含有したことが明らかとなった。培養上清のＰＮＧａｓｅ処理により、Ｎ－グリカンの存在が確認された。一旦処理されると、タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中で一重線として移動した。
保存的なＡｓｎ→Ｇｌｎ、Ａｓｎ→Ｓｅｒ、及びＡｓｎ→Ａｓｐの単一点変異を導入することにより、Ａｓｎ１２５のグリコシル化シークオンを阻害するための試みがなされた。この分析の結果は、これらの変異が同様の発現レベルを示したが、それぞれ、野生型酵素よりも１０分の１、２０分の１、及び４０分の１に低下したことを示した。
後続の研究では、Ａｓｎ以外の他のどの残基が、１２５位で許容される可能性があり、さらに、Ｎ－グリコシル化配列の阻害を可能にするかを判定するために、飽和変異誘発によるライブラリを作製した（Ｚｈａｏら（２０１４） ｓｕｐｒａ）。ライブラリの結果、ならびに、後続の、リゾスタフィン配列のそのホモログ（ＡＬＥ－１及びＬｙｔＭ）との配列アライメントは、Ａｓｎ１２５が保存された残基であることを示し、その結果、グリコシル化シークオンの他の残基を変異させることに焦点を置く必要があった。従って、２つの他の変異体、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏ及びＴｈｒ１２７Ａｌａは合成され、Ｎ－グリコシル化を効率よく妨げることが判明した。変異体を野生型リゾスタフィンと比較して、同等の活性を示すことが判明した。完全に活性な非グリコシル化変異体が所望されるので、ＥｐｉＳｗｅｅｐアルゴリズムでのさらなる実験的評価のためにリゾスタフィンＳｅｒ１２６Ｐｒｏを選択した。
非グリコシル化リゾスタフィンに対するＥｐｉＳｗｅｅｐ補正
エピトープスコアを測定するために、及び、最も頻度の高い変異を比較するために、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏリゾスタフィンバックボーンを、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ及びＥｐｉＳｗｅｅｐで分析した。結果は、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏ変異体に切り替えると、予測されたエピトープスコアが増加したことを示した。Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏは、Ａｓｎ１２５Ｇｌｎバックボーンに対する４６のエピトープスコアと比較して、５０の合計エピトープスコアを有する（表２）。ＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析はまた、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏが５つのＥｐｉＢａｒｓ（最低４つの対立遺伝子に対して、１．６４以上のＺスコアを有するペプチド）を有する一方、Ａｓｎ１２５Ｇｌｎが３つのＥｐｉＢａｒｓを有したことを示した。Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏバックボーンは、１５例の予測された上位１％のバインダー（ｓｃｏｒｅ＞２．３２）及び３５例の上位５％のＭＨＣバインダー（ｓｃｏｒｅ＞１．６４）を有していた。ペプチド１１６ＦＱＲＭＶＮＳＦＳ１２４（配列番号８８）は、Ａｓｎ１２５Ｇｌｎバックボーンと同程度に問題が残り、８つの対立遺伝子全てに対してより高い免疫原性があると予測された。Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏバックボーン中に存在する４つの新しいエピトープを、ペプチド１１９ＭＶＮＳＦＳＮＰＴ１２７（配列番号１４２）及び１２０ＶＮＳＦＳＮＰＴＡ１２８（配列番号１４３）に導入した（表５）。
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Figure 0007059003000010
Ｓｅｒ１２６ＰｒｏバックボーンのＥｐｉＳｗｅｅｐ分析は、合計２，３３３計画をもたらし、このうちの９６を、（合計１，５３３計画をもたらし、これらのうちの８１がパレート最適であるＡｓｎ１２５Ｇｌｎと比較して）２～８の変異の変異負荷で、パレート最適計画として評価した。表６は、Ａｓｎ１２５Ｇｌｎ及びＳｅｒ１２６Ｐｒｏバックボーンに見出される最も頻度の高い変異を比較する。変異パターンは、新しいバックボーンに切り替えた後に、有意に変化しなかった。ほとんどの変異は、４つの変異：それぞれ１６、１８、２３、及び２４位に移動したＳｅｒ１２２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙ、Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ、及びＩｌｅ９９Ｇｌｎのみを除いて、上位１５に残った。最も頻度の高い変異Ａｒｇ１１８Ｔｈｒは、両方のバックボーンにおいて主要なものとして残った。Ａｓｎ１２５Ｇｌｎバックボーンにおいて、１５の最も頻度の高い変異全てが、表面露出残基であるが、新しいバックボーンが、埋め込まれた残基Ｓｅｒ４９Ｇｌｙを上位１５に押し込んだ。Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙを除くほとんどの変異は、総計画及び最適計画に同様に表され、これは、計画の７２％に存在することから、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏバックボーンで選択された最適計画のいずれかにも存在しないことに変わった。（Ａｓｎ１２５Ｇｌｎバックボーンに基づいて評価された）最も頻度の高い１５の変異は、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏバックボーンを使用して生成された全計画の２～８２％、及びパレート最適計画の０～８８％に存在した。
Figure 0007059003000011
Ａｓｎ１２５Ｇｌｎバックボーンに基づいた１５の変異は、残基のＭＨＣクラスＩＩへの結合を有意に低減させ、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏバックボーンにおける免疫原性が低い多様体を産生することがさらに予測された（表７）。予測される欠失は、Ａｓｎ１２５Ｇｌｎで得られたものと大部分は類似していた。２つのバックボーンがおおよそ同じ数のエピトープを標的にしたので、全体のＡｓｎ１２５Ｇｌｎとの変異ヒット率は３５（Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏとは４０）であり、野生型のヒット率は８４（Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏとは８８）であった。
観察された１つの重要な差異は、Ａｓｎ１２５Ｇｌｎバックボーンにおいて２つのエピトープを欠失するＡｒｇ１１８Ｔｈｒ変異が、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏバックボーンにおいて任意のエピトープを欠失しなかったことであった。しかし、より詳細な検査は、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒが、他の変異がより多くのエピトープを欠失することを助けたことを示した。例えば、Ａｒｇ１１８ＴｈｒをＳｅｒ１２２Ａｓｐと結合した時、２つの変異は、合計１３のエピトープを欠失した。そのようなものであるから、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ変異は、さらなる研究から排除されなかった。しかし、Ｓｅｒ１２２Ｇｌｙ変異は、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐと同じ残基を標的にしたが、（Ｓｅｒ１２２Ａｓｐが除去すると予測された１０ではなく）３つのエピトープを欠失したのみであったので、除外された。
Figure 0007059003000012
Figure 0007059003000013
Figure 0007059003000014
リゾスタフィン多様体の発現レベル及び活性
例え、アルゴリズムが、触媒ドメインのみの脱免疫化に焦点を当てたとしても、適切なタンパク質フォールディングを保証する完全長成熟タンパク質との関連で、単一点変異体を試験したことに注意することが重要である。リゾスタフィンが、培地に分泌されるので、培養上清からのリゾスタフィン活性の単一分析を、タンパク質上の単一点変異の効果の十分な評価とみなした。
リゾスタフィン単一点変異体の分析は、全ての多様体が、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ中に発現されることを明らかにした。従って、最も頻度の高いＥｐｉＳｗｅｅｐ変異は、発現を無効にするものはない。発現レベルが最も低い２つの変異は、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ及びＳｅｒ１２４Ｔｙｒであり、それぞれ、野生型の発現レベルの４７％及び３５％である。さらに、リゾスタフィン多様体のうちの１３が、野生型酵素のものに等しい活性か、またはこれを超過した活性のいずれかを有した。点変異体Ｐｈｅ３８Ｇｌｙは、野生型よりも低い活性（６９％）を有する２つの変異のうちの１つであった。活性が低いもう１つの変異は、野生型活性の１６％を有するＳｅｒ１２４Ｔｙｒであった。Ｐｈｅ３８Ｇｌｙ及びＳｅｒ１２４Ｔｙｒが、野生型活性の＞７０％の閾値活性レベルを満たさなかったので、いずれの酵素も、さらなる研究に含まれなかった。Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ変異の発現レベルは、野生型酵素の５０％未満であったが、この変異により除去されたエピトープの数を考慮して、この酵素をさらに分析した。
バックボーンの柔軟性の調整
ＥｐｉＳｗｅｅｐを使用して得られた全ての設計は、剛性バックボーンを想定していた（本明細書において、「剛性」バックボーン設計と称する）。しかし、タンパク質は、高いレベルの柔軟性で知られているので、ポスト処理エネルギーの最小化工程において、バックボーンを固定したままにすることは、不正確なエネルギー評価をもたらすことにより、脱免疫化多様体の正確性を損なう可能性があることが肯定された。完全に剛性のある設計が、最小化の間、側鎖を緩ませた（一方、バックボーンを固定した）設計と、エネルギーエピトープスコア状況において大幅に異なることが観察されている（Ｐａｒｋｅｒら（２０１３） ｓｕｐｒａ）。従って、計算上許容される方法において、柔軟性を得るためには、ＥｐｉＳｗｅｅｐ設計のさらなるポスト処理エネルギーの最小化を実施した（本明細書において、「柔軟性」バックボーン設計と称する）。この分析の結果は、２つのバックボーンの間に、実際に目に見える動きがあったことを示した。
選択された変異のＥｐｉＳｗｅｅｐ分析
上記のように、１５の最も頻度の高い変異の発現及び活性を分析した。この分析に基づいて、不満足な活性値のために、２つの変異を断念した。加えて、Ｓｅｒ１２２Ｇｌｙは、Ｓｅｒ１２２Ｇｌｙ変異の３つのエピトープと比較して、１０エピトープを欠失させたＳｅｒ１２２Ａｓｐと同じ残基を標的としたので、除去された。最も頻度の高い変異Ａｒｇ１１８Ｔｈｒは、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏバックボーンとの関連で任意のエピトープを欠失せず、発現レベルが比較的低かった。しかし、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒは、標的エピトープにおいて他の変異を助けるので、維持された。例えば、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐと組み合わせた場合、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ変異は、合計１３のエピトープを標的とした。その結果、データセットは、１２の異なる変異：Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ、Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ、Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ４６Ｈｉｓ、Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ、Ａｓｎ１３Ｈｉｓ、及びＡｓｎ１２Ｇｌｙを含有した。
ＥｐｉＳｗｅｅｐ分析をもう一度実施したが、アルゴリズムを、１２の耐性の高い変異のみを使用するように制約した。変異負荷を２～８変異に変動させ、アルゴリズムを、活性部位（Ｈｉｓ３２、Ａｓｐ３６、Ｈｉｓ８２、Ｈｉｓ１１３、及びＨｉｓ１１５）で変異を導入しないように制約した。Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ変異が、極めて有効なエピトープ除去剤であることが観察されたので、アルゴリズムを、生成された全ての計画にこの変異を含むように制約した。従来通り、アルゴリズムは、変異負荷毎に、パレート最適計画及び追加の１９の次善計画を生成した。最も低いエピトープスコアは、２４であることが判明し、８つの変異を含有する計画でしか達成できなかった。最も高いエピトープスコアは４０であり、このスコアを有する計画は、強制Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ変異のみを有した。
パレート最適曲線に沿った多数の計画（固定されたエピトープスコア及び変異負荷で、可能な限り低い回転異性体エネルギーを有する設計）を選択した。ＥｐｉＳｗｅｅｐ分析は、剛性バックボーン計画を生成し、（最も低い）２４から３６の範囲のエピトープスコアを有する、２～８変異の範囲の変異負荷での合計１４のパレート最適計画を選択した。野生型リゾスタフィンバックボーンは５０のエピトープスコアを有するので、この範囲が有意に脱免疫化された設計をカバーしたことが肯定された。
タンパク質の柔軟性の懸案事項に対処するために、エネルギーが最小化されたポスト処理である１４の設計（柔軟性バックボーン設計）も含んだ。剛性バックボーン設計と同じエピトープスコア及び変異負荷での設計を選択し、その結果、多様体を得る２つの異なる方法が直接評価できた。例えば、８つの変異及び２４のエピトープスコアを有するパレート最適な剛性のある計画を選択した場合、同じ変異負荷及びエピトープスコアでの柔軟性バックボーン設計を選択した。いくつかの選択肢に直面した時、回転異性体エネルギーの最も低い柔軟性バックボーン設計を選択した。それらのエネルギーを最小化したので、これらの設計は、パレートフロンティア上に現れなかった。２つの変異計画を、剛性バックボーン設計及び柔軟性バックボーン設計の間で共有したという点に留意すべきである。
合成多様体の発現レベル及び活性
各リゾスタフィン多様体を、振とうフラスコ中で成長させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより発現レベルについて試験した。（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出による）培養上清中の意味のあるレベルで発現することが判明した計画を、相対的な特定の活性についてさらに特性決定した。結果は、２８の剛性バックボーン計画及び柔軟性バックボーン計画のうち１１のみが発現したことを示した。Ｒｉｇｉｄ１を除く全ての多様体の発現レベルは、野生型リゾスタフィンのものよりも低いことが判明した。
全ての計画（Ｆｌｅｘ１；配列番号３２を除く）は、野生型酵素のものよりも低い活性を有したが、２つのみが、市販のＥ． ｃｏｌｉ産生リゾスタフィンよりも低い活性を有した。Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓで産生される野生型リゾスタフィンの活性及びｓｓＬｙｓの活性の間に有意差があることが確認できた。合計１１の発現計画のうち、６つが柔軟性バックボーン設計であり、５つが剛性バックボーン設計であった。剛性のある設計の変異負荷は、２～６の範囲であり、柔軟性のある設計の変異負荷は、２～８の範囲であった。
変異の数が増加するにつれて、計画の活性レベルが減少した。この傾向は、剛性バックボーン設計よりも、柔軟性バックボーン設計において、さらに多く観察された。同様に、柔軟性のある計画では、変異負荷の増加に伴い、発現レベルが減少したことが判明した。この傾向は、剛性バックボーン設計では、観察されなかった。というのは、それらの発現レベルが、変異負荷にかかわらず低いままあったからである。高い発現レベルを有する唯一の剛性のある設計が、２つの変異設計Ｒｉｇｉｄ（リジッド）１であった。これは、剛性のある設計及び柔軟性のある設計（Ｆｌｅｘ（フレックス）１４とも称される）の間で共有された。
非発現変異体の分析
合成設計の半分未満が、意味のあるレベルで発現したので、非発現設計を、変異パターンについて分析した。この分析は、発現設計及び非発現設計は、変異の大部分を共有したことを示した。Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ、Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ、及びＬｙｓ９５Ｇｌｕなどの一部の変異は、非発現計画のほとんどに存在したが、ごく少ない発現計画にしか存在しなかった。同様に、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒは、ほんのわずかの発現計画に存在したが、（強制Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ変異が除外された）他の任意の変異とは異なり、それは非発現計画の全てにおいて見出すことができた。
Figure 0007059003000015
Figure 0007059003000016
以前の結果は、変異Ａｒｇ１１８Ｔｈｒが比較的低い発現レベル（野生型の５０％未満）を有することを示したので、合成計画の大部分で、観察された発現の不足が、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ変異に起因していることがあることが肯定された。これを試験するために、この変異を有する全ての計画において、変異を、野生型に復帰させた。
元の計画及び復帰計画の特性評価
表された全ての計画を、活性及び安定性のさらなる特性評価のために洗練させた。さらに、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ変異をもともと有していたが、目下同じ位置に野生型残基を有していた全ての設計（復帰計画）を評価した。この分析の結果を表９に示した。
Figure 0007059003000017
Figure 0007059003000018
合計３２の（元の及び復帰の）計画のうち、２８が発現すると判明した。よく発現した２８を洗練させて、活性及び安定性について特性決定した。予備的分析の間、Ｒｉｇｉｄ３及びＲｉｇｉｄ１４は、培養上清にわずかに発現することが判明した。Ｒｉｇｉｄ８及びＲｉｇｉｄ１２の復帰バージョンは、発現を有意に改善しなかった。４つの計画は、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ以外の他の変異の存在に起因して、発現レベルが低かったが、明らかな変異パターンは見出せなかった可能性がある。Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ変異が野生型配列に戻った他の全ての計画は、よく発現することが判明した。そのようなものであるから、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ変異が、計画の大部分に対する発現に影響するようにみえた。
結果は、多様体が、野生型酵素と比較して、高レベルの活性及び安定性を有したことを示した。活性値は、野生型活性の％として表現され、９２％（Ｒｉｇｉｄ１３＊）から３６％（Ｆｌｅｘ４＊）までの範囲に及んだ。観察されたＭＩＣ値は、野生型に近く、最も高いものは、０．２５μｇ／ｍｌであった（Ｆｌｅｘ３＊、Ｆｌｅｘ７＊、及びＲｉｇｉｄ４＊）。Ｔｍ値はまた、野生型酵素で観察されたものと類似しており、最も低いＴｍは、１２．３℃の安定性の減少を示した（Ｒｉｇｉｄ１３、表９）。
この分析は、変異負荷の増加が、多様体の活性／Ｔｍ値の減少及びＭＩＣ値の増加をもたらしたことを示した。概して、剛性のある設計は、柔軟性のある設計よりも高い比活性度及び低いＭＩＣ値を有した。しかし、柔軟性のある設計は、高い平均Ｔｍ値により証明されるように、剛性のある設計よりも全体的な安定性がより良好であった。両側ｔ検定の結果に基づいて、２つの設計グループの間で観察された差異は、統計学的に有意であった（ｐ値＜０．０３）。
設計を、さらなる特性評価のために、７つの異なるグループ（表１０）に分けた。表９のデータを使用して、設計グループに対する、柔軟性／剛性のエネルギー、変異負荷、活性、及び安定性の間のピアソン相関関数を計算した。
Figure 0007059003000019
一緒に考えた場合、全ての２８の設計は、変異の数及びＭＩＣ値の間に弱い正相関を示した（表１０の全ての設計）。従って、多様体の変異負荷が増加するにつれて、それらの活性は増加した（ＭＩＣ値が増加した）。変異の数及びＭＩＣの間の強い正相関は、剛性のある復帰計画及び全ての剛性のある計画で見出された。
全ての計画を一緒に分析した時に明らかでない他の相関は、設計を個別に評価した時に明らかになった。例えば、強い負相関が元の柔軟性のある計画、剛性のある復帰計画、及び全ての剛性のある計画の変異負荷及び活性の間に存在することが観察された。強い負相関はまた、柔軟性のある元の計画、柔軟性のある復帰計画、及び全ての柔軟性のある計画の変異の数及びＴｍ値の間に見出された。
全体的に、強い相関は、全ての設計を一緒に考えた時、エネルギー及び活性／安定性項目の間に観察されなかった。観察された唯一の意味のある相関が、柔軟性エネルギー及びＴｍの間の弱い負相関であった（表１０の全ての設計）。柔軟性エネルギー及び活性項目の間に観察される相関は、予想されたものとは反対の徴候を有した。他方では、剛性エネルギー及び活性の間の相関は、有意ではない一方、剛性エネルギー及びＴｍの間の相関は、不正確な徴候を有した。従って、エネルギーが信頼性の高い予測ツールであるかどうかをさらに試験するためには、エネルギーコンポーネントならびに実験的に決定された活性及び安定性値の間の相関を評価した。
柔軟性及び剛性エネルギーは、活性の重要な予測手段ではないものの、それは、溶媒相互作用に起因するエネルギーが代わりに使用できることが判明した（表１１）。機能的な予測手段として期待されるように、溶媒エネルギーは、活性との（弱いが）負相関及びＭＩＣ値との強い正相関を有した。
Figure 0007059003000020
総合すると、これらの結果は、柔軟性バックボーンエネルギーが、安定性の比較的良好な予測ツールであった一方、溶媒相互作用に起因するエネルギーは、ＭＩＣアッセイを使用して観察された実験的活性に対する最良の予測手段であるように見えたことを示した。
リゾスタフィン多様体の免疫反応性の特性決定
野生型リゾスタフィン触媒ドメイン中の予測されたエピトープは、リゾスタフィン配列の全体にわたって広く分布したが、エピトープの大部分が、５つのクラスタにグループ化することができた（図２）。ほとんどのエピトープは、多数の結合イベントを有することが予測された。
多様体の相対免疫原性を評価するために、リゾスタフィン触媒ドメインの配列にまたがる合計２６の合成ペプチドを設計した。特に、焦点を、図２に示される５つの免疫原性クラスタに置いた。記載された各クラスタに対し、野生型ペプチド及び対応する変異ペプチドを設計した。変異ペプチドは、計画に現れた単一変異及び変異の組み合わせの両方を含有した。
合成ペプチドに照らして、各変異を、エピトープを排除する予測された可能性について評価した。ＥｐｉＢａｒｓ（ＥｐｉＭａｔｒｉｘ免疫原性スケールにおいて最低４つの対立遺伝子に対して、１．６４以上のＺスコアを有するペプチド）を、クラスタ２（４５ＶＫＡＩＳＳＧＫＩ５３、配列番号９７）、クラスタ３（８０ＷＭＨＬＳＫＹＮＶ８８、配列番号１４７）、ならびにクラスタ５（１１６ＦＱＲＭＶＮＳＦＳ１２４、配列番号８８；１１９ＭＶＮＳＦＳＮＰＴ１２７、配列番号１４２；及び１２０ＶＮＳＦＳＮＰＴＡ１２８、配列番号１４３）に見出した。
各ペプチドを、高スループットのＭＨＣクラスＩＩ結合アッセイにおいて、８つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合能について実験的に評価した。ＥｐｉＳｗｅｅｐで生成された変異は一般に、ペプチドのＭＨＣへの結合を減少させた。１６８ペアワイズの比較のうち、変異は、７３の場合に結合親和性を減少させ、６０の場合に効果がなく、３５の場合に結合を増加させた。ペプチドを、０．１μＭ未満のＩＣ５０値が観察された場合に強バインダー、ＩＣ５０値が０．１～１μＭの範囲にある場合に中バインダー、ＩＣ５０値が１～１０μＭの範囲にある場合に弱バインダーに分類した。１０μＭを超える全てのペプチドを、非バインダーとみなした。
１０μＭのカットオフを使用して、バインダーを非バインダーから分離し、（５％の閾値での）ＥｐｉＭａｔｒｉｘの予測をＭＨＣクラスＩＩ結合結果と比較した。真陽性（正確に予測されたバインダー）、真陰性（正確に予測された非バインダー）、偽陽性（不正確に予測されたバインダー）、及び偽陰性（不正確に予測された非バインダー）の割合を計算した。結果は、全体的な予測成功率は、予測率を、以前に公表された研究（～７６％として引用する）よりもわずかに低い結果である７０％であったことを示した（Ｇｒｏｏｔら（２０１１） Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：２－７； Ｍｏｉｓｅら（２０１３） Ｈｕｍｍ． Ｖａｃｃｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ９：２０６０－２０６８）。対立遺伝子特異的試験は、予測は、ＤＲＢ１＊０１０１、０３０１、０４０１、及び０７０１に対し、以前に観察された範囲にあったことを明らかにした。０８０１に対するデータは、見出すことができなかった。１３０１の場合、ペプチドの大部分は、弱いまたは非バインダーのいずれかに登録されたことが観察された。この観測結果は、１３０１に使用される試験ペプチドが、本当に強バインダーである可能性があり、そのようなものであるから、データを予測成功率の小さい方に歪めたことを示唆するであろう。同様に、１１０１及び１５０１に対する予測率は、以前に報告されたものよりも低く、全体的な低率の一因となったとも考えられた。
クラスタ１野生型（Ｃ１ＷＴ）エピトープは、試験された８つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のうちの４つに結合すると予測された。予測に従って、Ａｓｎ１２Ｇｌｙ及びＡｓｎ１３Ｈｉｓ変異の両方は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を阻害した。Ａｓｎ１３Ｈｉｓ変異は、ＤＲＢ１＊０８０１及び１１０１エピトープを除去することにおいて良好であり、変異は、ＤＲＢ１＊１５０１エピトープを除去することにおいて、等しく良好であった。しかし、変異は、ＤＲＢ１＊０１０１（Ａｓｎ１２Ｇｌｙ）に対する強い結合及びＤＲＢ１＊１３０１（Ａｓｎ１３Ｈｉｓ）に対する弱い結合ももたらす（表１２）。
Figure 0007059003000021
クラスタ２野生型（Ｃ２ＷＴ）エピトープの場合、ＤＲＢ１＊０１０１、０３０１、０４０１、０７０１、及び１５０１に対する複数のエピトープを有する、７つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合を予測した（表１３）。変異は、ＤＲＢ１＊０１０１及び０７０１を除く７つの対立遺伝子を標的とすると予測され、（０４０１に加えて）これらの３つの対立遺伝子に対し、結合の増加が観察された。１つの例外は、０１０１への結合が２分の１に減少したことを示したＬｙｓ４６Ｈｉｓ変異体であった。Ｌｙｓ４６Ｈｉｓはまた、１１０１への結合を減少させた一方、Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ及びＩｌｅ４１Ｇｌｕ／Ｌｙｓ４６Ｈｉｓは、強い結合をもたらした。全ての変異体は、予測されたように、０３０１に対する親和性が低い。Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ及びＬｙｓ４６Ｈｉｓは、１５０１への結合の減少を示した一方、Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ／Ｌｙｓ４６Ｈｉｓは、強バインダーとして出現した。変異の組み合わせは、特に悪かった。というのは、それが、０３０１を除く全ての対立遺伝子に対する結合の減少をもたらすからである。このクラスタの高い結合親和性は、多数のエピトープにより説明できた。８つの対立遺伝子にわたる合計１３のエピトープのうち、変異は、４つのエピトープのみを阻害すると予測された。さらに、この特定の領域は、ＥｐｉＢａｒを含有し、以前の研究は、これらのエピトープが、ＥｐｉＢａｒｓを含有するエピトープよりも免疫原性が高い傾向にあることを示した（Ｇｒｏｏｔら（２０１１） ｓｕｐｒａ）。
Figure 0007059003000022
クラスタ３野生型（Ｃ３ＷＴ）エピトープは、０８０１及び１５０１に対する複数のエピトープを有する、ＤＲＢ１＊０１０１、０７０１、及び１１０１の予測されたバインダーであった（表１４）。Ｃ３ＷＴは、１３０１に弱く結合することも実験的に示された。Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ変異は、０８０１及び１５０１のみの結合を阻害することが予想された。予測と一致して、０８０１に対する結合が約５分の１に減少したことが見出された。しかし、０７０１において２分の１未満に減少したこと（強から中へ）、１１０１に対して１０分の１に減少したこと、及び０１０１に対して～２０００分の１に低下したこと（強から弱へ）も観察された。結合の増加が、（予測されたものの反対の）１５０１、１３０１、及び０３０１に対し検出された。１５０１の場合、弱バインダーから中バインダーへのシフトが観察された一方、１３０１は依然として弱バインダーであり、０３０１は非バインダーあった。従って、Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ変異は、４つの対立遺伝子への結合を減少させ、２つの他の対立遺伝子の分類の変更を引き起こさなかったので、大いに生産的であった（ペプチドは依然として弱バインダーまたは非バインダーであった）。
Figure 0007059003000023
クラスタ４野生型（Ｃ４ＷＴ）エピトープは、試験された８つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のうちの３つ：ＤＲＢ１＊０１０１、０４０１、及び０８０１に結合すると予測された。０１０１及び０４０１に加えて、０３０１に対する結合（弱）、１１０１に対する結合（強）、１３０１に対する結合（弱）、及び１５０１に対する結合（強）が観察されたが、０８０１に対する結合は観察されなかった（表１５）。予測に従って、変異は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を阻害した。１つの例外は、変異Ｌｙｓ９５Ｇｌｕであり、これは、０１０１及び０８０への結合を減少させたが、代わりに、８つの全ての対立遺伝子にわたって、強い結合をもたらした（または強バインダーとして残った）ことが予測された。変異は、０１０１への結合を有意に減少させ：Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、及びＴｙｒ９３Ｈｉｓ／Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ／Ｉｌｅ９９Ｇｌｎは、強バインダーを弱バインダーまたは非バインダーに変化させ、Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ／Ｌｙｓ９５Ｇｌｕは、強バインダーを中バインダーに変化させた。全ての変異及びそれらの組み合わせは、０３０１に対する結合を弱バインダーから非バインダーに減少させた。同様に、Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ／Ｉｌｅ９９Ｇｌｎを除く全ての変異は、１１０１への結合に有意な減少（強バインダーから弱バインダー／非バインダーに）をもたらし、Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ／Ｌｙｓ９５Ｇｌｕを除く全ての変異体は、１３０１に対する結合を減少させた。最後に、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ及びＴｙｒ９３Ｈｉｓ／Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ／Ｉｌｅ９９Ｇｌｎのみが、１５０１への結合を排除した（強バインダーから弱バインダー／非バインダーに）。変異Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ／Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、及びＴｙｒ９３Ｈｉｓ／Ｌｙｓ９５Ｇｌｕは、非バインダーＣ４ＷＴを弱バインダーに変化させることにより、０７０１に対する結合親和性をわずかに増加させた。全体的な変異Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ／Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ、Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ／Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、及びＴｙｒ９３Ｈｉｓ／Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ／Ｉｌｅ９９Ｇｌｎは、全ての８つの対立遺伝子にわたって最も生産的であった。Ｔｙｒ９３Ｈｉｓ／Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ／Ｉｌｅ９９Ｇｌｎは、全ての８つの対立遺伝子に対する結合を排除したので、特に良好であった。
Figure 0007059003000024
クラスタ５野生型（Ｃ５ＷＴ）エピトープは、ＤＲＢ１＊０３０１及び０８０１を除く全てに対する複数のエピトープを有する、全ての８つの対立遺伝子に結合することが予測された。結合は、０３０１及び１３０１を除く全てにおいて実験的に観察され、０７０１及び０８０１は弱バインダーとして測定された（表１６）。最も高い脱免疫化変異は、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ／Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ／Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙ及びＡｓｎ１２１Ｇｌｙ／Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ／Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙであった。というのは、それらがそれぞれ、６つの対立遺伝子への結合親和性を有意に減少させたからである。０３０１対立遺伝子の場合、変異体のＩＣ５０値は、わずかに減少したが、ペプチドは、非バインダーとして残った。この結果は、変異が全ての８つの対立遺伝子に対する結合を阻害したＥｐｉＳｗｅｅｐ予測と一致した。Ａｓｎ１２１Ｇｌｙは、４つの対立遺伝子への結合を減少させた一方、Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙ及びＡｓｎ１２１Ｇｌｙ／Ｓｅｒ１２２Ａｓｐは、３つの対立遺伝子への結合を減少させた。Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ／Ｓｅｒ１２２Ａｓｐはまた、０３０１への結合をわずかに増加させた（非バインダーから弱バインダーに）。同様に、Ａｒｇ１１８Ｔｈｒ及びＲ１１８Ｔ／Ｓ１２２Ｄは、２つの対立遺伝子への親和性を減少させたが、０３０１への結合における増加（非バインダーから弱バインダーに）を示した。変異の組み合わせにおける、０３０１対立遺伝子に対する結合親和性の観察された増加は、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐが対立遺伝子に対する１つのエピトープを導入すると予測されたという事実により説明できた。実際には、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐは、非バインダーペプチドＣ５ＷＴを中バインダーに変化させた。
Figure 0007059003000025
完全長設計の間の免疫原性を比較するために、各設計に対する集計エピトープスコアを計算した（図３）。この分析は、野生型リゾスタフィン触媒ドメインが合計２６の結合相互作用（またはエピトープ）：１４の強いもの、１つの中程度のもの、及び１１の弱いもの、を有したことを示した。酵素は、１４の非結合相互作用も有した。比較において、設計のうち１８は、野生型よりも低いエピトープスコアを有し、６つは、同じスコアを有し、４つのみが、（最大２つのエピトープだけ）野生型を上回ったエピトープスコアを有した。３つを除く全ての設計はまた、野生型と比較して、より多くの非結合相互作用を有した。エピトープの最小数は、１８であり、それは、多様体のうちの３つ：Ｆｌｅｘ４＊（５変異）、Ｆｌｅｘ１１＊（７変異）、及びＦｌｅｘ１３＊（６変異）、に存在した。さらに、設計のうち１８は、野生型と比較して、強バインダーの数の減少を示した。
強い負相関が、変異の数及び実験的に観察された強バインダーの数の間に認められた（ピアソン計数－０．６９）。同様に、正相関が、エピトープスコア及び強バインダーの数の間に観察された（ピアソン計数０．５２）。同時に、変異負荷／エピトープスコア及びバインダーの総数の間に、相関は認められなかった。この結果は、アルゴリズムが、結合を減少させるだけでなく、主として強いエピトープを標的としていたことも示した。
一般に、より多くの脱免疫化計画が、剛性バックボーン設計よりも、柔軟性バックボーン設計に見出された。概して、数少ない強いもの、中程度のもの、弱いものがあり、全結合相互作用が剛性のある計画よりも柔軟性のある計画で見出された。この傾向は、ほとんどの剛性のある設計が復帰して、１つの変異を失ったという事実により、部分的に説明されても良い。強バインダーの最も少ない数８は、Ｆｌｅｘ１１＊及びＲｉｇｉｄ５＊で観察された。予想通り、合計でわずか２２の結合相互作用：９つの強いもの、６つの中程度のもの、及び７つの弱いもの、を有する最も積極的な計画Ｆｌｅｘ９は、免疫原性の有意な減少を示した。
Ｆｌｅｘ５及びＦｌｅｘ９多様体のインビトロ分析
多様体Ｆｌｅｘ５及びＦｌｅｘ９を発現させ、精製し、生物学的複製において特性決定した。さらなる対照として、野生型ＬＳＴを、商業的供給元から入手し、平行して分析した。多様体の両方の見かけの融解温度は、予備的試験中に得られた値と一致したが、細菌溶解の特異的な割合は、より厳密な分析時にやや高いことが見出された（表１７）。重要なことに、脱免疫化多様体は、両方のアッセイにおいて、商業的に供給されるＬＳＴと同等かまたはこれよりも良好であった。酵素の抗菌活性を、Ｓ． ａｕｒｅｕｓの４つ株に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）を評価することにより、さらに定量化した。株ＳＡ１１３に対するＦｌｅｘ５のＭＩＣは、野生型及び市販のＬＳＴのものと同等であり、それは、ＭＲＳＡ株３４２５－３を含む３つの臨床分離株に対する１回の２倍連続希釈内であった。多様体Ｆｌｅｘ９はまた、良好な殺菌／静菌活性を保持して、２００ｎｇ／ｍｌ（～７ｎＭ）以下で、４つの株全ての副産物を防止した。ＬＳＴＣＡＴ多様体が４つまたは８つの変異をそれぞれコードしたという事実を考えると、それらの高レベルの抗ブドウ球菌活性が顕著であった。
Figure 0007059003000026
Ｆｌｅｘ５及びＦｌｅｘ９多様体のインビボ有効性及び免疫原性
より臨床的に関連する方法において抗菌活性を評価するためには、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ臨床分離株を使用するマウス肺感染モデルを用いた。マウスを、口腔咽頭吸引により、生きているバクテリアに感染させ、１時間後に、２．５μｇの野生型ＬＳＴ、多様体Ｆｌｅｘ５、または多様体Ｆｌｅｘ９を含有する溶液で同じ経路から治療した。感染の２４時間後に、マウスを死亡させ、肺を採取し、生菌数を、肺のホモジネートの連続希釈物をプレーティングすることにより、測定した。全ての３つの酵素は、生理食塩水緩衝液対照と比較して、細菌が与える負担において統計的有意に１０分の１に減少した（一元ＡＮＯＶＡ Ｐ＝０．００７、テューキーの後検定）が、３つの治療の間に有意差はなかった（図４Ａ）。従って、脱免疫化候補は、感染した及び炎症をおこした肺環境において、野生型の有効性を保持した。
ヒト免疫細胞、肝臓組織、及び胸腺組織で外科的にヒト化されていたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ －／－マウス（ＨＵＭＩマウス）を使用して、インビボの免疫原性を評価した。６週齢でのヒト組織の移植後に、ＨＵＭＩマウスを成熟及び成長させ、ヒトＢ細胞及びＴ細胞レパートリーを広めた。移植の１４週後に、マウスを各４匹ずつの３グループに分け、アジュバント中の１００μｇの野生型ＬＳＴ、Ｆｌｅｘ５、またはＦｌｅｘ９で皮下免疫した。免疫化の１３日後に、マウスを死亡させ、各グループに対し脾細胞を採取して、プールし、プールした細胞を、それらの同族タンパク質を用いてエクスビボ再刺激にかけた。７２時間でトリチウム化チミジン取り込みにより、細胞増殖を測定した。刺激指数（タンパク質対ＤＭＳＯ増殖応答）は、野生型ＬＳＴに対し２倍未満であった（図４Ｂ）が、ヒト化マウス由来のＴ細胞が機能障害を示すことが広く知られていることは注目に値する。特に、ヒト化マウス脾細胞は、フィトヘムアグルチニン、イオノマイシン－ＰＭＡ、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体カクテルなどの強力な刺激剤の存在下でさえも、不十分なエクスビボ増殖応答を示したことが示されている（Ｗａｔａｎａｂｅら（２００９） Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：８４３－８５８）。さらに、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の強力な抗原キーホールリンペットヘモシアニンで２～３回のインビボ免疫化後、再刺激されたヒト化マウス脾細胞は、ＩＦＮ－γまたはＩＬ－４を産生できず（Ｗａｔａｎａｂｅら（２００９） Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：８４３－８５８）、２～６倍のエクスビボの刺激指数のみを示した（Ｔｏｎｏｍｕｒａｔら（２００８） Ｂｌｏｏｄ １１１：４２９３－６）。従って、野生型ＬＳＴ脾細胞の有意な（Ｐ＝０．０００５、二元ＡＮＯＶＡ）１．６倍の刺激指数は、特に、今回の研究のマウスがたった１回の免疫化を受けたという事実を考えると、抗原特異的免疫応答の合理的な指標である。野生型免疫化されたグループと比較して、Ｆｌｅｘ５及びＦｌｅｘ９由来のプールされた脾細胞で免疫化されたマウスは、増殖の有意な減少を示した（図４Ｂ）。バックグラウンド除去後、Ｆｌｅｘ５のプールされた細胞は、５０％の応答減少を示し、Ｆｌｅｘ９のプールされた細胞は、６５％の応答減少を示した。
ナイーブ免疫系との関連での特有の免疫原性に加えて、脱免疫化タンパク質が、天然配列対する確立された記憶応答を回避する程度についても考えた。このような研究の長い時間枠及びＨＵＭＩマウスの短い寿命のために、トランスジェニックＤＲ４マウスにおける記憶応答を評価した。このホモ接合型株は、ヒトＨＬＡ ＤＲＡ及びＤＲＢ１＊０４０１ペプチド結合ドメインに基づくキメラＭＨＣクラスＩＩを有するという点を除いて、ネズミの完全な免疫系を有する（Ｉｔｏら（１９９６） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２６３５－４４）。この安定なトランスジェニックモデルは、長期研究を可能にする正常な健康的な寿命を有し、さらに、その抗原提示細胞は、ヒトペプチド結合特異性を示す。１０個のＤＲ４マウスを免疫化し、野生型ＬＳＴの皮下注射で繰り返しブーストした。最後のブーストの１９週間後に、各グループが同様の平均抗体力価を示すように、それらを各５匹ずつの２つのグループに分けた。次に、マウスを、１００μｇの野生型ＬＳＴまたは１００μｇの多様体Ｆｌｅｘ５のいずれかで再チャレンジした。１３日後に、各グループに対し脾細胞を採取して、プールし、最後の再チャレンジからの同族タンパク質を用いてエクスビボ再刺激にかけた。ＨＵＭＩマウスにおける結果と同様に、野生型ＬＳＴ用いたＤＲ４脾細胞のエクスビボ再刺激は、１．８倍の刺激指数をもたらした（図４Ｃ）。ＤＲ２、ＤＲ３、及びＤＱ８トランスジェニックマウスにおける同様に小さい刺激指数は、抗原特異的抗体産生と相関すること及び抗原特異的免疫応答を示すことが、示されていることは注目に値する（Ｄｅｐｉｌら（２００６） Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：２２２５－９）。従って、本明細書に見られる有意な（Ｐ＝０．０００２、二元ＡＮＯＶＡ）１．８倍の刺激指数は、抗薬物免疫応答の合理的な指標であった。野生型ＬＳＴが再チャレンジされたマウスと対照的に、Ｆｌｅｘ５チャレンジグループ由来のプールされた脾細胞の増殖は、バックグラウンドレベル以下であった（図４Ｃ）。従って、野生型ＬＳＴを認識するように用意された免疫細胞は、Ｆｌｅｘ５での再チャレンジ時に活性の低減を示し、脱免疫化多様体が、野生型酵素に対する記憶応答を効果的に回避することを示した。
実施例２：ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１＊０４０１に対するリゾスタフィン触媒及び細胞壁結合ドメインの脱免疫化
概要
ＬＳＴ中の推定Ｔ細胞エピトープの枯渇が抗薬物抗体応答を軽減し、結果として治療有効性を強化することになることを実証するために、この分析を実施した。エピトープ枯渇多様体は、２つの異なる計算的に導かれた戦略を使用して開発された：これらは、経験的な改善が続く、個々の脱免疫化多様体（「ｏｐｔ」多様体と表記される）の構造ベースの設計ならびに機能的に脱免疫化されたメンバー（「ｌｉｂ」多様体と表記される）が強化された組み合わせのライブラリの構造ベースの設計及びスクリーニングである。ヒト化ＨＬＡトランスジェニックマウスを使用して、各方法が推定免疫原性エピトープを欠失し、それによりインビボでの抗ＬＳＴ抗体の形成を妨げる効率性を評価した。続いて、再発性菌血症モデルを使用して、ＬＳＴ脱免疫が全身性Ｓ． ａｕｒｅｕｓ感染のクリアランスを可能にする程度を測定した。脱免疫化多様体及びその野生型対応物の間のこの体系的な比較は、推定Ｔ細胞エピトープ、インビボ免疫原性、及び治療有効性の間の臨床関連の接続の直接実験的証拠を提供する。
概念の証明として、焦点を、北アメリカ人種及びヨーロッパ人種において非常に優性な対立遺伝子ＤＲＢ１＊０４０１（以後ＤＲ４）に置いた。５％の閾値（すなわち、予測されたバインダーの上位５％のペプチド）で、ＰｒｏＰｒｅｄ分析ツール（Ｓｉｎｇｈ及びＲａｇｈａｖａ （２００１） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７：１２３６－７）は、野生型ＬＳＴの内の１６のＤＲ４制限Ｔ細胞エピトープを予測した（ＬＳＴＷＴエピトープスコア＝１６）。タンパク質配列及び構造全体に分布した重なり合ったクラスタ及び孤立したノナマーの両方として、ペプチドエピトープを配置した（図５）。興味深いことに、ＰｒｏＰｒｅｄは、７つの他の代表的なＤＲＢ１対立遺伝子：０１０１、０３０１、０７０１、０８０１、１１０１、１３０１、及び１５０１のいずれよりも、ＤＲ４のためのより多くのエピトープを予測した。それ故、任意の単一対立遺伝子を考慮して、全体的なタンパク質再設計に対してＤＲ４モデルは高い制約を示した。
材料及び方法
材料
プライマーを、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルビル）に、標準脱塩装置と共に注文した。分子クローニングのための制限酵素及びＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州イプスウィッチ）から購入した。他の全ての試薬及び用品は、別途明記のない限り、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ペンシルベニア州フィラデルフィア）製であった。
Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターｐＰＩＣ９及びＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α ［Ｆ－ Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ） Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７ （ｒＫ －， ｍＫ ＋） ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ－ ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ株ＳＡ１１３、及びＭＲＳＡ株ＵＳＡ４００は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）製であった。
ＬＳＴホモロジーモデル
リゾスタフィンの結晶構造を利用できなかったので、２つのドメインのためのホモロジーモデルを作製した。触媒ドメイン（２Ｂ０Ｐ：Ａ、２Ｂ４４：Ａ、及び１ＱＷＹ：Ａ）に対するＬｙｔＭからの３つのテンプレート構造を、選択した（Ｆｉｒｃｚｕｋら（２００５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３５４：５７８－９０； Ｏｄｉｎｔｓｏｖら（２００４） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３５：７７５－８５）。３つのテンプレート構造は、有意な配列同一性（９５％～９７％）を共有し、さらに、それらは、保存された活性部位周辺に高度な可動性ループ（Ｆｉｒｃｚｕｋら（２００５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３５４：５７８－９０）を有する。リゾスタフィン触媒ドメインに対する最も高い配列同一性は、優良なモデル構造を構築するのに十分である４６．７％であった（Ｂａｋｅｒ及びＡｎｄｒｅｊ （２００１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：９３－９６）。ＭＯＤＥＬＬＥＲを使用して、最初のホモロジーモデルを構築した。ループモデリング法ＦＲＥＡＤ（Ｃｈｏｉ及びＤｅａｎｅ （２０１０） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７８：１４３１－１４４０）を使用して、テンプレートなしの領域（２４ＰＬＧＩＮＧＧ３０；配列番号１６８）をモデル化し、これは、１ＧＭＮ：Ａ（１８０ＰＲＧＥＥＧＧ１８６；配列番号１６９）から配列類似ループを選択した（Ｌｉｅｔｈａら（２００１） ＥＭＢＯ Ｊ． ２０：５５４３－５５５５）。配列同一性が高い（８３．５％）単一テンプレート構造（１Ｒ７７：Ａ、リゾスタフィンホモログであるＡＬＥ－１の細胞壁標的ドメイン構造）を使用して、細胞壁結合ドメインを作製した（Ｌｕら（２００６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８１：５４９－５５８）。ＤＯＰＥ統計ポテンシャル関数のスコア（Ｓｈｅｎ及びＳａｌｉ （２００６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １５：２５０７－２５２４）の観点から、良好なモデルを選択した。予測されたループを緩ませるために、ＧＢ／ＳＡを伴うＡＭＢＥＲ９９ｓｂに対し、触媒ドメインモデルを最小化した（Ｈｏｒｎａｋら（２００６） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ６５：７１２－７２５； Ｓｔｉｌｌら（１９９０） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１２：６１２７－６１２９）。
変異選択の前処理
各ドメインの場合、ホモログを見つけるために、非冗長のデータベースに対して、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴの３回の繰り返し（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２）を実行した。同定された配列に対する複数の配列アライメントを作製し、あまりギャッピーでないもの（多くとも２５％）、及びＬＳＴと十分に類似する（少なくとも３５％）が、互いに十分に異なる（多くとも９０％同一）ものを同定するために処理した。一連の１１４の代表的な触媒ドメインホモログ及び２３の代表的な結合ドメイン配列が残った。アミノ酸を、各複数配列アライメント中の各位置で同定し、続いて設計のための可能な変異として使用した。機能的に重要とみられる特定の位置及び変異を、変異させなかった（３２、３６、８２、１１３、１１５、１１７、１１８、１１９、１２５、１２６、１２７位はロックされ；Ｙ３３Ｔ、Ｆ３８Ａ、Ｆ３８Ｇ、Ｍ３９Ａ、Ｉ４１Ｒ、Ｓ１２４Ｙ、及びＲ１１８Ｔは許容されなかった）。第２のフィルタリング工程は、５％の閾値で、ＰｒｏＰｒｅｄを使用して決定されるように、少なくとも１つのエピトープを欠失すると予測されたそれらの変異のみを保った。推定される有害な影響を避けるために、プロリン及びシステインへの変異、ならびに、プロリン及びシステインからの変異も排除した。
スクリーニングが危険性の高い置換を可能にするので、変異の選択肢を、ライブラリ設計のために拡張した。特に、１．５の厳しい閾値に従って、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ（Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ （１９７４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３：２２２－４５）性向を使用して、野生型二次構造環境に受け入れられる可能性のある残基を同定した。加えて、所望のアミノ酸を超える追加のアミノ酸を組み込むことができる縮重オリゴヌクレオチドを有するライブラリを作製したので、縮重オリゴヌクレオチド内の望ましいアミノ酸対望ましくないアミノ酸の比率が２：３を超えたままである限り、これらの追加は許容された。
個々の多様体構造ベースの設計
エピトープ枯渇設計を生成するために、構造ベースの脱免疫化方法ＥｐｉＳｗｅｅｐを、実施例１に記載されるように、各ドメインに適応した。ＡＭＢＥＲ力場（Ｐｅａｒｌｍａｎら（１９９５） Ｃｏｍｐｕｔ． Ｐｈｙｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ９１：１－４１）及び基準エネルギー（Ｌｉｐｐｏｗ及びＴｉｄｏｒ （２００７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８：３０５－３１１）に従い、ＯＳＰＲＥＹ（ｖｅｒ．２．０）（Ｃｈｅｎら（２００９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０６：７６７８－７６７８）を使用して、変異の選択肢のための可能な回転異性体（Ｌｏｖｅｌｌら（２０００） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４０：３８９－４０８）に対する１体及び２体エネルギー項を評価した。５％の閾値で、ＰｒｏＰｒｅｄ（Ｓｉｎｇｈ及びＲａｇｈａｖａ （２００１） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７：１２３６－７）を使用して、バインダーまたは非バインダーのいずれかとして、各ノナマーを特徴づけるＤＲ４エピトープ（ＨＬＡ Ａｌｌｅｌｅ ＤＲＢ１＊０４０１）の含有量を評価した。少なくとも７つの変異は、触媒ドメイン中の全ての予測されたＤＲ４エピトープを枯渇させる必要があり；６つの変異が、細胞壁結合ドメインを完全に枯渇させる必要があったことが判明した。一連の２０のエネルギー最適な及びほぼ最適な完全枯渇設計を、ＥｐｉＳｗｅｅｐ最適化アルゴリズムにより、各ドメインに対して同定した。最もエネルギー最適な触媒ドメイン設計は、分析が潜在的に有害であると特定するＳｅｒ１２４に変異を含有する。しかし、代替二重変異Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ及びＳｅｒ１２２Ｇｌｙが、同じエピトープを除去することが予測され、さらに、これらの２つの変異は、実験的に決定された活性がＬＳＴＷＴよりも高いことを表す。（有害なＳｅｒ１２４変異を含有する）最もエネルギー最適な設計及び代替二重変異設計の間のエネルギー差は、わずかであった（－２９４．９４及び－２９３．９）。従って、細胞壁結合ドメインに対する最もエネルギー最適な設計及び触媒ドメインのＣ末端部分の代替二重変異（Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ及びＳｅｒ１２２Ｇｌｙ）を有するように、設計（Ｏｐｔ１）を選択した。
脱免疫化ライブラリの構造ベースの設計
安定な脱免疫化多様体が強化された組み合わせのライブラリを設計するために、ＥｐｉＳＯＣｏＭと称される方法を開発した。これは、エピトープ分析を用いてＳＯＣｏＭ構造ベースのライブラリ設計アプローチを向上させ、エネルギー及びエピトープ含有量の両方を同時に最適化するために、スイープベースのパレート最適価アルゴリズム（Ｐａｒｋｅｒら（２０１３） Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． ２０：１５２－６５）を用いる所望のライブラリサイズと共に、一連の変異する可能な位置及びそれらの位置に組み込む可能なアミノ酸を考えると、ＥｐｉＳＯＣｏＭは、位置のサブセット及びそれらの位置における置換のサブセットを選択する。その結果、それは、置換の全ての組み合わせ及び対応する野生型残基からなるライブラリの作製を具体的に述べる。ＥｐｉＳＯＣｏＭは、その構成多様体に対する平均エネルギースコア及び平均エピトープについて、ライブラリを最適化し、そのため、一般に、多様体は「良好」であるであろう。そのパレート最適化アルゴリズムは、２つのスコアの間の無制限のトレードオフをする全てのライブラリ設計（位置及び置換）を同定し、そのため、他のいかなるライブラリ設計も、両方のスコアに対し良好でない。
各多様体の明確な回転異性体のモデリングなしに、構造ベースのエネルギーの迅速な評価を可能にするために、ＳＯＣｏＭは、アミノ酸配列のタンパク質特異的機能の観点から、構造ベースの特性を発現させるクラスタ拡張（Ｇｒｉｇｏｒｙａｎら（２００９） Ｎａｔｕｒｅ ４５８：８５９－６４； Ｇｒｉｇｏｒｙａｎら（２００６） ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． ２：ｅ６３）（ＣＥ）手法を用いる。ここで、許容される変異選択に基づいて、ランダムＬＳＴ多様体のエネルギーをモデル化及び評価するために、前処理工程で、Ｒｏｓｅｔｔａ（Ｒｏｈｌら（２００４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３８３：６６－９３）を用いた。これらの構造トレーニングセットにより、ＣＥが、位置特異的な１体及び２体配列ポテンシャルの合計で可能なＬＳＴ多様体Ｓに対するエネルギーΨを表現できる。
Figure 0007059003000027
 （式中、和は、位置ｉにアミノ酸ａｉ及び位置ｊにａｊを含む。）ＣＥガイドラインに従って、合計で９０００の触媒ドメイン及び６０００の細胞壁結合ドメインモデルを使用して、ＣＥモデルをトレーニングした。次に、これらは、触媒ドメインに対する０．８及び細胞壁結合ドメインに対する０．９の、ＣＥ配列ポテンシャル及びＲｏｓｅｔｔａエネルギーの間の相関を達成する（トレーニングセットの～２０％サイズの）重複しないテストセットで、新しいランダムな多様体のエネルギーに対する正確な予測をすることができた。従って、このモデリング工程は、設計最適化の「内部ループ」内のエネルギーの迅速で正確な予測を可能にする。
（可能なライブラリの広範な設計空間にわたって最適化する時に扱いにくい）全てのその多様体を列挙することなくライブラリを評価するために、ＳＯＣｏＭは、ライブラリ平均位置特異的スコアを用いる。例えば、セット｛Ａｒｇ、Ｌｙｓ｝が１つの位置に組み込まれた場合、次に、全ての多様体に対し平均されたその位置のエネルギー的寄与は、Ａｒｇエネルギー及びＬｙｓエネルギーの平均になり；同様に、ライブラリ対し平均されたその位置及び別の｛Ａｓｐ、Ｇｌｕ｝の組み込みからのペアワイズ寄与は、Ａｒｇ：Ａｓｐ、Ａｒｇ：Ｇｌｕ、Ｌｙｓ：Ａｓｐ、及びＬｙｓ：Ｇｌｕの平均になるであろう。従って、許容される変異を考えると、ＳＯＣｏＭは、位置ｉで選択できるアミノ酸の可能なサブセットの平均エネルギー寄与であるΨｉ及び位置ｉ及びｊのペアに対する平均であるΨｉ，ｊを事前計算した。次に、単一多様体に対する等式と類似した等式で、全ライブラリＴにわたる平均エネルギーΨを評価した。
Figure 0007059003000028
 （式中、ここで、和は、位置ｉにアミノ酸Ｔｉ及び位置ｊにＴｊを含む。）従って、最適化内のライブラリの評価は、単一多様体の評価と同様に有効である。
ＥｐｉＳＯＣｏＭを開発するために、エネルギースコアのＳＯＣｏＭ’ｓ処理に対する類似の方法で、ライブラリ平均寄与に対するエピトープスコアを「向上させる」ことも必要であった。次に、アミノ酸｛Ｔｉ、Ｔｉ＋１、…、Ｔｉ＋８｝が、ｉで始まる９つの連続した位置に組み込まれた場合、アミノ酸の種々のノナマーの組み合わせからの平均エピトープスコア寄与
Figure 0007059003000029
 は、
Figure 0007059003000030
 （式中、和は、アミノ酸のそれぞれの組み合わせにわたり、各セットからの１つ、関数ｅ（・）は、９マーのエピトープスコアを与える）として計算される。次に、ライブラリの平均エピトープスコア
Figure 0007059003000031
 は、単純に全ての９マーの和である。
Figure 0007059003000032
ＳＯＣｏＭは、ライブラリサイズの制約を受ける式２を最適化するために、最適な位置のセット及びアミノ酸のセットを選択する整数線形計画法を使用する。ＥｐｉＳＯＣｏＭの場合、２つの目的であるエネルギー（式２）及びエピトープスコア（式４）がある。これらの不整合特性間の最良のバランスを決定する先験的手段がないので、ＥｐｉＳＯＣｏＭは、最良のバランスを表す全てのパレート最適設計を生成し、後続のトレードオフの特性評価及び好適なデザインの選択が可能になる。パレート最適設計を特定するために、それは、ＥｐｉＳｗｅｅｐのものに基づくスイープアルゴリズムを用いる。スイープの各工程で、平均ライブラリエネルギーは、平均エピトープスコア（式４）の制約に従い、最適化される（式２）。制約は、引き続き厳しくなり、その結果、各ライブラリは、以前のものよりも良好なエピトープスコア（及び、それによる不適当なエネルギー）を有さなければならない。パレート最適化は、ＳＯＣｏＭの制約されたバージョンで、反復レイヤーとして実施され、それにより、各設計を最適化するために、ＩＢＭ ＣＰＬＥＸ整数計画ソルバーを使用する。
タンパク質の発現、精製、及び特性評価
ＬＳＴ及びその誘導体を、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓから分泌させた。要約すると、２．５Ｌのバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で、組換えＰｉｃｈｉａ株を培養し、ポリエチレングリコール－６０００（ＰＥＧ－６０００）沈殿による上清から、タンパク質を捕獲し、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより、均質になるまで精製した。ＴＲＩＴＯＮ－Ｘ１１４抽出によりタンパク質製剤から、内毒素を除去した（Ｌｉｕら（１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：４５５－６３）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー分析により、タンパク質発現レベルを推定した。Ｓ． ａｕｒｅｕｓ株ＳＡ１１３に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）の決定により、タンパク質の活性を評価した。タンパク質の活性は、ＬＳＴＷＴに対して決定されたＭＩＣ希釈物と比較して、正規化された百分率として報告される（すなわち、５０％の活性は、野生型と比較して、２倍高いＭＩＣであり、２５％の活性は、野生型と比較して４倍高いＭＩＣである）。
ライブラリの作製及びスクリーニング
表１８に示されるプライマーを用いるスプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、ＬＳＴライブラリを作製した。
Figure 0007059003000033
Figure 0007059003000034
Figure 0007059003000035
Figure 0007059003000036
ＰＣＲ産物を、ｐＰＩＣ９ベクターにライゲーションし、ＤＨ５αに形質転換した。構築物は、確認された配列であり、電気穿孔法により、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換した（Ｗｕ及びＬｅｔｃｈｗｏｒｔｈ （２００４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３６：１５２－４）。反復指向進化戦略として、ライブラリ作製及びスクリーニングを実施した。中程度のスループットのプレートハロ形成アッセイを使用して、活性ライブラリメンバーを同定した。要約すると、ライブラリ作製の各ラウンドからのＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体を、ＹＰＭアガー培地（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、１％のメタノール、１％のアガロース）上に広げ、２日間３０℃でインキュベーションした。表示用トップアガロース（０．５％の酵母抽出物、１％のペプトン、１％のＮａＣｌ、０．１のＯＤ６００ ＳＡ１１３、１％の低融解アガロース）を、ＹＰＭ酵母プレートに注ぎ、１０時間３７℃でプレートをインキュベーションした。特徴的なハロまたはクリアランスゾーンにより、活性酵素を発現する酵母クローンを同定した。各ラウンドに対して、約１０，０００クローンをスクリーニングした。最も大きいハロを示す１０の多様体をコードする遺伝子を、ゲノムに組み込まれたカセットからＰＣＲ増幅し、ｐＰＩＣ９にサブクローニングし、配列決定し、ＭＩＣの測定による機能検証のために、新たに調製されたＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞に再形質転換した。最も脱免疫化され機能的な多様体を、後続のライブラリ作製及びスクリーニングのラウンドに向けた出発点として使用した。
インビボ研究
動物感染、治療、及び免疫化に対するプロトコールを、動物の苦痛を最小限にするように実施した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）から購入した。Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドＡｂｂノックアウト／トランスジェニックＨＬＡ－ＤＲ４マウス（Ｂ６．１２９Ｓ２－Ｈ２－Ａｂ１ｔｍ１Ｇｒｕ Ｔｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ／Ｈ２－Ｅａ，ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１／Ｈ２－Ｅｂ）１Ｋｉｔｏ）を、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入した。
インビボ免疫原性
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の１００μｇの精製された野生型または多様体酵素１００μｌ量を、ＤＲ４（グループ毎にＮ＝５）またはＣ５７Ｂｌ／６（グループ毎にＮ＝４）マウスのいずれかに皮下注射した。免疫化の１３日後、血清を回収し、ＥＬＩＳＡにより、（野生型または多様体タンパク質に特異的な）抗ＬＳＴＩｇＧ抗体力価を測定した。要約すると、野生型または多様体タンパク質抗原を、高結合ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、次にＢＳＡでブロッキングを行った。マウス由来の免疫血清は、コーティングされたプレートに連続希釈し、次に、これを、１：１０００の実用的濃度でヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲート（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス州ダラス）を使用してプローブした。続いて、ＴＭＢ基質（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、プレートを成長させた。報告された力価を、１．５倍の吸光度をもたらす血清倍希釈として定義した。
インビボ有効性
細菌のチャレンジの前に、ＤＲ４マウス（グループ毎にＮ＝３）の免疫系を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ： ２．７ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．９ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３６．９ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の１００μｇのＬＳＴＷＴまたはＬｉｂ５多様体を週１回の皮下注射で、３回プライムした。これらの免疫化及びブーストは、アジュバントを含有しない。抗ＬＳＴ抗体力価を、上記のように測定した。感染及び治療の最初のサイクルの場合、ブタムチンの３％懸濁液中の２×１０８ＣＦＵのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株ＵＳＡ４００の腹腔内投与で、マウスにチャレンジし、１時間後、滅菌ＰＢＳ中の５００μｇのＬＳＴＷＴまたはＬｉｂ５多様体の静脈内（尾静脈内）投与によりマウスを治療した。酵素治療により救助したマウスは、後続の感染及び週１回の間隔での治療サイクルを受けた。最初の細菌曝露後に、生来のネズミ抗菌免疫の発達を補うために、マウスに、２及び３サイクル目に、１×１０９ＣＦＵのＵＳＡ４００でチャレンジしたが、治療は、５００μｇの適切なタンパク質にとどまった。各サイクルにおける致死細菌用量を確認するための対照として、１匹のマウスにＰＢＳの疑似治療を与えた。
個々の多様体の構造ベースの設計
ＥｐｉＳｗｅｅｐアルゴリズム（Ｐａｒｋｅｒら（２０１３） Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． ２０：１５２－６５）を使用して脱免疫化された多様体を最適化し、ＰｒｏＰｒｅｄにより評価されたエピトープ含有量の予測された減少、及び、構造ベースの回転異性体エネルギーにより評価されたタンパク質安定性の予測された維持の間で良好なトレードオフを行った。２０の完全枯渇設計のパネル（すなわち、ＤＲ４エピトープスコア＝０）を、触媒及び細胞壁結合ドメインの両方に対し別々に生成した。各ドメインから、低エネルギー設計を組み合わせた多様体Ｏｐｔ１（表１９）を実験的分析のために選択し、最適化されたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現システムにクローニングした。残念ながら、この１４変異設計は、機能性タンパク質を生成することができなかった（表２０）。
Figure 0007059003000037
Figure 0007059003000038
実施例１のＬＳＴ再設計研究は、単一変異が、別途、安定で活性な脱免疫化多様体を損なう可能性があったことを示している。それ故、変異体及び変異の組み合わせを体系的に復帰させることにより、Ｏｐｔ１設計中の有害な変異を同定した。分離されたＯｐｔ１変異の分析は、Ｍｅｔ１１９Ａｒｇが、タンパク質分泌を単独で無効化したが、設計Ｏｐｔ２（表１９）におけるこの単一変異の復帰が、発現を復元できなかった（表２０）ことを明らかにした。最終的に、３つの変異の組み合わせＳｅｒ１６６Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１６８Ｌｙｓ、及びＶａｌ１９３Ｔｒｐは、発現及びこれらの３つの部位での野生型への復帰を害し、Ｍｅｔ１１９が、発現可能な１０の変異多様体Ｏｐｔ３（表２０）を生成したことが判明した。
Ｏｐｔ３が、妥当な発現レベルを達成する（表２０）が、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度分析は、２つバンドを明らかにした。１つバンドは、予想された２５ｋＤａにあり、もう１つのバンドは、約３０ｋＤａにあった。実施例１の結果に基づいて、Ｃ末端細胞壁結合ドメイン（２３２ＮＫＳ２３４）における潜在的Ｎ結合グルコシル化シークオンが活性化されていたことが推測された。それ故、Ａｓｎ２３６Ａｓｐ変異の脱免疫化は、Ｃ末端エピトープ及びＮ結合グリコシル化シークオンの両方を欠失させるＳｅｒ２３４Ｌｙｓ変異と交換された。得られる１０の変異多様体Ｏｐｔ４は、５つの予測されたＤＲ４エピトープのみを産生し、単一の２５ｋＤａバンドとして表されたが、Ｏｐｔ３よりも低い収率であった（表２０）。高度に操作されたＯｐｔ４多様体がフォールディングされて分泌能力のある状態で生成されたが、続いて、野生型酵素の抗菌活性のほんの小さい画分しかもたないことが判明した（表２０）。
計算ライブラリ設計による構造ベースの脱免疫化
個々の多様体の設計と並行して、代替の組み合わせアプローチを探求し、このアプローチで、計算設計を使用して、機能性脱免疫化多様体が強化されることが予測されるＬＳＴライブラリを生成した。残基位置及び変異を同定するために、構造ベースのライブラリ設計法ＳＯＣｏＭを、エピトープ分析と共に向上させ、それらの組み合わせが、Ｒｏｓｅｔｔａモデルで潜在的にトレーニングされたクラスタ拡張ポテンシャルにより評価された場合の良好なエネルギーに加えて、ＰｒｏＰｒｅｄにより評価された場合の低いエピトープスコアを有する多様体を生成した。最初のラウンドでは、設計は、野生型標準に基づいた一方、続くラウンドでは、標準を、以前のライブラリスクリーニングから選択されたリードクローンに変えた。
ライブラリＡは、触媒ドメイン中の９つの部位を標的とし、相補的なライブラリＢ集団は、細胞壁結合ドメイン中の８つの部位を標的とした（表１８）。脱免疫化ＬＳＴ設計空間が広範であったが、ライブラリサイズ及びアガープレートハロ形成アッセイのスクリーニング能力の間のいくつかのパリティを維持するために、最初のライブラリを、４０，０００未満のメンバーに制約した。ライブラリＡ及びＢの両方から、約１０，０００のクローンをスクリーニングし、それぞれからの１０の大きいハロ形成クローンを配列決定し、機能を確認した。ライブラリＡからの最も有望な多様体（クローンＬｉｂ１）は、触媒ドメインに４つの変異を含有し、ＬＳＴＷＴと等しい抗菌活性をもたらした（表１９及び２０）。同様に、ライブラリＢからの最も有望な多様体（クローンＬｉｂ２）は、細胞壁結合ドメイン中に４つの変異を有し（表１９）、野生型抗菌活性も有した（表２０）。
多様体の対応する脱免疫化ドメインＬｉｂ１及びＬｉｂ２を組み合わせて、８つの変異（表１９）、予測されたエピトープ含有量において５０％の減少、及び５０％の野生型活性の保持（表２０）を含有する多様体Ｌｉｂ３を生成した。続いて、２つのＬｉｂ３ドメインの構造を、モデル化し、別のラウンドの脱免疫化ライブラリ設計のテンプレートとして使用した。得られるライブラリＣは、触媒ドメインの５つの部位及び細胞壁結合ドメイン中の３つの部位を標的とした（表１９）。１０，０００クローンの機能的なスクリーニングは、１０／１６のＤＲ４エピトープを欠失した多様体Ｌｉｂ４をもたらした。そのＬｉｂ３の出発テンプレートと比較して、Ｌｉｂ４は、触媒及び細胞壁結合ドメイン中に１つのさらなる変異をそれぞれ含有し、同等の抗菌活性を保持した（表２０）。モデル化の別の反復ラウンド及び脱免疫化ライブラリ設計でＬｉｂ４のドメインを使用してライブラリＤを生成し、これから、１０，０００クローンをスクリーニングして多様体Ｌｉｂ５を単離した。多様体Ｌｉｂ５は、１３／１６の推定ＤＲ４エピトープ（表１９）を欠失し、さらに、５０％の野生型発現及び５０％の抗菌活性（表２０）を保持した。多様体Ｏｐｔ４と比較して、個々のタンパク質設計取り組みからの最良の酵素Ｌｉｂ５は、低い予測されたエピトープスコア及び高い測定された機能性の両方を示した。
さらなるライブラリ作製及びスクリーニングの取り組み（ライブラリＥ）は、さらなる機能的構築物を同定することができなかった。それ故、１３変異Ｌｉｂ５多様体は、さらなる分析に対するリード候補に指定された。多様体Ｌｉｂ５中に残る３つの推定エピトープ（３３ＹＧＶＤＦＦＭＴＩ４１、配列番号２１５；３８ＦＭＴＩＧＴＰＶＫ４６、配列番号２１６；及び１１６ＦＱＲＭＤＮＴＦＳ１２４、配列番号２１７）は、活性部位Ｚｎ２＋配位（Ｈｉｓ３２、Ａｓｐ３６、及びＨｉｓ１１５）を占めるアミノ酸を包含するか、またはこれらに隣接するかのいずれかであることに注意するのは興味深い。この事実は、これらの領域内の機能的変異の理解しにくい性質を説明し得る。多様なライブラリ集団のスクリーニングは、領域３３～４６の唯一の機能的置換、及び領域１１６～１２４の２つの機能的置換を同定した（表１９）。
エピトープ枯渇設計は、インビボでの免疫原性の有意な減少を示す。
続いて、エピトープ枯渇がインビボ免疫原性に影響を及ぼす程度を評価した。Ｃ５７Ｂｌ／６及びトランスジェニックＤＲ４マウスの両方における抗ＬＳＴ抗体応答を決定し、これらの後者は、内因性マウスＭＨＣクラスＩＩに対して効力がなかったが、ヒトＨＬＡ ＤＲＢ１＊０４０１から誘導されるキメラＭＨＣクラスＩＩ受容体を有した（Ｉｔｏら（１９９６） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３：２６３５－４４）。脱免疫化に対する厳しいベンチマークとして、マウスを、強力な免疫賦活剤である完全フロイントアジュバント中のタンパク質で皮下免疫化した。ＬＳＴＷＴでの単回の免疫化の２週間後に、全てのＤＲ４マウスは、１：１５０及び１：１７００の力価を有する強力な抗ＬＳＴＩｇＧ抗体応答を備えた。対照的に、Ｏｐｔ４で免疫化されたマウスは、顕著な力価低減を示し、２／５のマウスのみが、任意の検出可能な抗ＬＳＴ抗体を示し、それらでさえ、ＬＳＴＷＴで免疫化された動物と比較して実質的に減少した。多様体Ｌｉｂ５はまた、減少した抗体応答を誘発し；１匹の動物しか、高い抗体力価（１：１２００）を示さず、３匹のマウスは、著しく低い抗体力価を示し（１：１５～１：２６）、１匹のマウスは、抗ＬＳＴ抗体のバックグラウンドレベルの付近を示した。重要なことに、Ｃ５７Ｂｌ／６研究室マウス株において、ＬＳＴＷＴ及びＯｐｔ４の両方は、等しく免疫原性を有した一方、Ｌｉｂ５は実際、ＬＳＴＷＴよりも免疫原性が高かった（それぞれ、ＩｇＧ力価１：４４００～１：１５，０００対１：５６０～１： ２１００）。従って、Ｏｐｔ４及びＬｉｂ５の免疫原性の顕著な低減は、天然マウスＭＨＣクラスＩＩとは対照的に、ヒトＤＲ４による分子認識の阻害と本質的に関連した。
対立遺伝子ＤＲ４を除く全てに対するタンパク質設計プロセスが伏せられているが、ＰｒｏＰｒｅｄ予測は、Ｏｐｔ４またはＬｉｂ５のいずれもが、７つの他の代表的なヒトＤＲＢ１対立遺伝子に対するネオエピトープを含有しなかったことを示した（補足図Ｓ１）。実際には、Ｏｐｔ４から欠失された１１の推定ＤＲ４エピトープに加えて、予測は、対立遺伝子ＤＲ１、ＤＲ３、ＤＲ７、ＤＲ１３、及びＤＲ１５と関連する１２のエピトープも欠失されていたことを示唆した。Ｌｉｂ５と同様に、１３のＤＲ４制限エピトープの欠失に加えて、ＰｒｏＰｒｅｄは、他の７つのＤＲＢ１対立遺伝子に関連するさらなる１８のエピトープの欠失を予測した。
リゾスタフィン脱免疫化は、治療有効性が改善された。
一部の実施形態では、ＬＳＴの治療的適用は、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ感染を完全に根絶するために、反復投与を必要としても良い。それ故、可能な臨床適用をより密接に模倣するために、アジュバントの不存在下で、週１回の投薬中に、ＬＳＴＷＴ及びＬｉｂ５の免疫原性をモニタリングした。３回目の免疫の７日後に、ＬＳＴＷＴを受ける全てのＤＲ４マウスは、１：４０～１：１６０の範囲の抗ＬＳＴ力価を有する比較的強い免疫応答を備えていた。同じ時間枠中で、Ｌｉｂ５で免疫化された３匹のマウスのうち１匹のみが、高抗体力価（１：１２０）を獲得し、他の２匹のＬｉｂ５マウスは、バックグラウンドをほんのわずかにしか超えない力価を示した。
続いて、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ再発性菌血症モデルを使用して、ＬＳＴ免疫原性が、インビボの有効性に影響を及ぼす程度を評価した。３週目の抗体力価の測定後に、上記ＤＲ４マウスを、２×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のメチシリン耐性Ｓ． ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株ＵＳＡ４００の腹腔内投与で感染させた。１時間後に、マウスに、５００μｇのＬＳＴＷＴまたはＬｉｂをそれぞれ静脈内ボーラスで与えた。両方の酵素は、この初期感染から、それぞれのグループを救助したが、ＰＢＳ疑似治療を与えられた対照マウスは、過度の罹患故に、死亡しなければならなかった。
１週間後、ＬＳＴＷＴグループ（１：３００～１：６５０）及びＬｉｂ５グループ（１匹のマウスは＞１：１０００で、残りの２匹のマウスは１：１５～１：２０の間）の両方に対する抗体力価は、増加していたが、後者は、全体的に低い傾向を示し続けた。ここで、マウスを、１０９ＣＦＵのＭＲＳＡに感染させ、１時間後に、それぞれの酵素５００μｇの静脈内ボーラスで再度治療した。この２回目の感染サイクルでは、マウスは、より高い抗体力価を獲得し、ＬＳＴＷＴは、３匹の治療されたマウスのうちいずれも救助できなかった。同様に、高い抗体力価を示す１匹のＬｉｂ５マウスは、感染に屈したが、２つの低力価のＬｉｂ５マウスを２回目のＭＲＳＡチャレンジから救助した。
翌週、２匹の生存しているＬｉｂ５マウスの抗体力価は、さらにもう一度増加している（１：７０及び１：１２０）ことが判明したが、特に、それらは、４週目のＬＳＴＷＴ力価以下のままであった。ＭＲＳＡでの３回目の感染サイクルの後に、１匹のマウスを、Ｌｉｂ５で治療して生存させた。これに対して、もう１匹のマウスに、疑似ＰＢＳを与え、これは、感染に屈した。全体として、これらの結果は、ヒト化ＤＲ４マウスは、アジュバントの不存在下でさえ、ＬＳＴＷＴに対する強い免疫応答を備えたことを示した。反復投与中に、抗ＬＳＴＷＴ抗体力価における毎週の増加は、有効性の喪失と相関した。逆に、Ｌｉｂ５脱免疫化多様体を受けた３匹のマウスのうち２匹において、免疫応答を減弱させ、もう一度、インビボ有効性を、抗ＬＳＴ抗体力価で調査した。Ｌｉｂ５は、ＭＲＳＡでの３回の連続チャレンジに対してだけ強力な抗菌有効性を発揮した。
研究の全体にわたって、１：２５６以下の抗ＬＳＴ抗体力価は、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ感染からの酵素の媒介する救助と相関した一方、２５６を超える力価は一般に、抗菌酵素療法の失敗に関連していた。それ故、多様体Ｌｉｂ５の抗薬物抗体応答を軽減する能力は、ＬＳＴＷＴと比較して、有効性の強化を示した。
実施例３：ヒト集団におけるＨＬＡ結合特異性を代表するＨＬＡ対立遺伝子に対するリゾスタフィン触媒及び細胞壁結合ドメインの脱免疫化
ヒトＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１＊０１０１、０３０１、０４０１、０７０１、０８０１、１１０１、１３０１、及び１５０１に対するＬＳＴを脱免疫化するために、機能性脱免疫化多様体で強化されることが予測される個々の多様体及びライブラリを生成した。触媒ドメイン（図６Ａ）及び細胞壁結合ドメイン（図６Ｂ）のエピトープマッピングを、実施例２に記載されるように実施した。この情報ならびに溶媒の近づきやすさ及び進化的保存を使用して、脱免疫化ＬＳＴ変異体を生成した。
特に、細胞壁結合ドメインの変異（表２１）を、Ｆｌｅｘ９変異体（実施例１）またはＦｌｅｘ９誘導体の触媒ドメインにおける変異と組み合わせた。
Figure 0007059003000039
多様体をスクリーニングして、目的の３つの多様体Ｆ１１、Ｆ１２、及びＦ１３を同定した（表２２）。
Figure 0007059003000040
ＭＲＳＡ株ＵＳＡ４００に対しインビトロ阻害活性について、Ｆ１１、Ｆ１２、及びＦ１３をスクリーニングした（図７）。この分析は、多様体Ｆ１１及びＦ１３が、野生型ＬＳＴと比較して、１２．５％のＭＩＣ活性を保持した一方、多様体Ｆ１２が、野生型ＬＳＴと比較して、２５％のＭＩＣ活性を保持したことを示した。さらに、ＭＲＳＡ株ＵＳＡ４００に対する活性の測定前に、１時間５０℃で多様体を加熱した時、野生型ＬＳＴが完全ＭＩＣ活性を保持し、Ｆ１３は、元のＭＩＣ活性の２５％を保持し、Ｆ１２は、元のＭＩＣ活性の５０％を保持したことが判明した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＦ１１多様体のインビボ有効性も分析した。２×１０８のＭＲＳＡ株ＵＳＡ４００の腹腔内注射でマウスにチャレンジし、１時間後に、単回ボーラス静脈内注射として投与される１００μｇの野生型ＬＳＴ、Ｆ１１、またはＰＢＳでマウスを治療した。両方のタンパク質治療に対する生存率は１／３であった。野生型ＬＳＴがこの用量で部分的にのみ有効であることが知られているので、１００μｇの投薬量を選択した。この用量を使用することにより、Ｆ１１多様体に対する明らかな有効性の同等性を実証できた。この分析は、両方のタンパク質がインビボでの同等の有効性有したことを示した（図８）。
ＤＲ４ ＨＬＡトランスジェニックマウス、すなわち、部分的にヒト化された免疫系を有するマウス、におけるＦ１３多様体の免疫原性を、野生型ＬＳＴと比較した。１００μｇの野生型ＬＳＴまたは多様体Ｆ１３を、完全フロイントアジュバントと混合し、ＤＲ４マウスに皮下注射した。１４日後、ＥＬＩＳＡにより抗体力価を測定した。多様体Ｆ１３は、野生型ＬＳＴと比較して２００分の１以下に低下した抗体力価をもたらした。抗菌有効性への抗体力価の影響を評価するために、２×１０８のＭＲＳＡ株ＵＳＡ４００の腹腔内注射でマウスにチャレンジし、１時間後、単回ボーラス静脈内注射として投与される５００μｇの野生型ＬＳＴ、多様体Ｆ１３、またはＰＢＳでマウスを治療した。ＰＢＳ疑似治療を受けたマウスの両方が死亡し、野生型ＬＳＴで治療されたマウスの両方も同じく死亡した。対照的に、多様体Ｆ１３で治療された両方のマウスは生存していた。従って、Ｆ１３の免疫原性の低減により、インビボの治療有効性の強化が与えられた。
同様の一連の実験では、多様体Ｆ１２の免疫原性及び有効性を、ＤＲ４ ＨＬＡトランスジェニックマウスを使用して、アジュバントの不存在下で、野生型ＬＳＴと比較した。０週目に、２×１０８のＭＲＳＡ株ＵＳＡ４００の腹腔内注射で、マウスにチャレンジし、１時間後、単回ボーラス皮下注射として与えられる５００μｇの野生型ＬＳＴまたは５００μｇの多様体Ｆ１２で、マウスを治療した。続いて、１×１０９のＭＲＳＡ株ＵＳＡ４００の腹腔内注射で、マウスに週１回チャレンジし、上記のように治療した。抗体力価を２週目から毎週測定した。野生型ＬＳＴは、合計４回再発性全身性ＭＲＳＡ感染からマウスを救助できたが、５回目の感染からいずれのマウスも救助できなかった（表２３）。多様体Ｆ１２は、４回の再発性全身性ＭＲＳＡ感染から全てのマウスを救助できた（表２４）。多様体Ｆ１２により誘発された抗体力価の大幅な低下は、この多様体が、野生型ＬＳＴよりも効果的であることを示す。
Figure 0007059003000041
Figure 0007059003000042

Claims (11)

  1. 変異：
    ａ）配列番号４９のＡｓｎ２３２Ｇｌｎ、Ａｒｇ１８６Ｔｈｒ、Ａｌａ１６９Ｇｌｙ、Ｔｙｒ１６０Ｈｉｓ、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏ、Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ、Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ、Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ、およびＡｓｎ１２Ｇｌｙ；
    ｂ）配列番号４９のＡｓｎ２３６Ａｓｐ、Ａｓｎ２３２Ｇｌｎ、Ａｒｇ１８６Ｔｈｒ、Ａｌａ１６９Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６６Ａｓｎ、Ｔｙｒ１６０Ｈｉｓ、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏ、Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ、Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ、Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ、およびＡｓｎ１２Ｇｌｙ；
    ｃ）配列番号４９のＡｓｎ２３６Ａｓｐ、Ａｓｎ２３２Ｇｌｎ、Ａｒｇ１８６Ｔｈｒ、Ａｌａ１６９Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６６Ａｓｎ、Ｔｙｒ１６０Ｈｉｓ、Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏ、Ｓｅｒ１２４Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ、Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ、Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ、およびＡｓｎ１２Ｇｌｙ；
    ｄ）配列番号４９のＳｅｒ１２２Ａｓｐ、Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、およびＬｙｓ４６Ｈｉｓ；
    ｅ）配列番号４９のＳｅｒ１２４Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１２２Ａｓｐ、Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ、Ｉｌｅ９９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ９５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ８３Ｍｅｔ、Ｉｌｅ４１Ｇｌｕ、およびＡｓｎ１２Ｇｌｙ；
    ｆ）配列番号４９のＳｅｒ２３４Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１９Ｔｙｒ、Ｉｌｅ２００Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１２２Ｇｌｙ、Ａｓｎ１２１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ８４Ｔｙｒ、Ｖａｌ７５Ｇｌｎ、Ａｓｎ７２Ｈｉｓ、Ｐｈｅ３８Ｓｅｒ、およびＴｙｒ３３Ｔｈｒ；または
    ｇ）配列番号４９のＡｓｎ２３６Ａｓｐ、Ａｓｎ２１９Ｔｙｒ、Ｉｌｅ２００Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１９１Ａｌａ、Ａｒｇ１８６Ｔｈｒ、Ａｌａ１６９Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６６Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１２２Ｔｈｒ、Ｖａｌ１２０Ａｓｐ、Ｓｅｒ８４Ｇｌｙ、Ｖａｌ７５Ｇｌｕ、Ｉｌｅ７０Ｌｙｓ、およびＡｓｎ４０Ｔｈｒ
    を含む、脱免疫化リゾスタフィンまたはその断片であって、前記断片は、リゾスタフィンの触媒活性ドメインを含む、脱免疫化リゾスタフィンまたはその断片。
  2. 前記脱免疫化リゾスタフィンまたはその断片が、非グリコシル化される、請求項１に記載の脱免疫化リゾスタフィンまたはその断片。
  3. 請求項１に記載の脱免疫化リゾスタフィンまたはその断片および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  4. 抗生物質をさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 前記抗生物質が、β－ラクタム、セファロスポリン、アミノグリコシド、スルホンアミド、葉酸代謝拮抗薬、マクロライド、キノロン、グリコペプチド、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 微生物感染を予防または治療するための、請求項３に記載の医薬組成物。
  7. 前記感染が、細菌感染である、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 前記細菌感染が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌により引き起こされる、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. Ｓｅｒ１２６、Ｔｈｒ１２７、および／またはＳｅｒ２３４における変異を含む、請求項２に記載の非グリコシル化リゾスタフィンまたはその断片。
  10. 変異Ｓｅｒ１２６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、および／またはＳｅｒ２３４Ｌｙｓを含む、請求項２に記載の非グリコシル化リゾスタフィンまたはその断片。
  11. 配列番号２１８～２２０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の脱免疫化リゾスタフィンまたはその断片。
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