JP6924745B2 - 感染性疾患に対する抗体 - Google Patents
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Description
以下の説明において多数の用語を使用するが、それらには特許請求される主題の理解を容易にするために以下の定義が与えられる。本明細書で明確に定義されない用語は、それらの平易な通常の意味に従って使用される。
一態様では、本発明は、CaENO1に位置する283LYEQLISEYP292(配列番号1)、278PQLADLYEQL287(配列番号2)、240KGKVGIAMDV249(配列番号3)又は278PQLADLYEQLISEYP292(配列番号4)からなるアミノ酸配列を含むエピトープ配列を提供する。一実施形態では、エピトープ配列は、CaENO1に位置する240KGKVGIAMDV249(配列番号3)又は278PQLADLYEQLISEYP292(配列番号4)からなるアミノ酸配列を含む。
或る特定の実施形態は、本発明のエピトープ又は本発明のカンジダα−エノラーゼに対する抗体と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に既知の任意のタイプの非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材又は配合助剤を意図するものであるが、これらに限定されない。ポリオール、ポリエチレングリコール及びデキストラン等の希釈剤を、コンジュゲートの生物学的半減期を増大するために使用してもよい。
本発明では驚くべきことに、抗CaENO1抗体(CaS1)がカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染に対して効果的な診断薬又は治療処置であることが見出された。したがって、別の態様では、本発明は、被験体の生体サンプルにおけるカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を診断する方法であって、本発明の抗CaENO1抗体を生体サンプルと接触させることと、本発明のCaENO1のエピトープへの抗CaENO1抗体の結合を検出することとを含み、結合の存在が、被験体がカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を患う疑いがあることを示す、方法を提供する。代替的には、本発明は、被験体の生体サンプルにおけるカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を診断する方法であって、本発明のエピトープ配列を生体サンプルと接触させることと、抗CaENO1抗体への本発明のエピトープ配列の結合を検出することとを含み、結合の存在が、被験体がカンジダ感染を患う疑いがあることを示す、方法を提供する。
His−CaENO1タンパク質の発現及び精製
簡潔に述べると、C.アルビカンスα−エノラーゼ遺伝子をpQE30プラスミド内で構築してpQE30−CaENO1ベクターを形成した後、得られるベクターを大腸菌BL21細胞で形質転換した。細菌培養物を、アンピシリン(50μg/ml)を含有する10mlのLB培地中、37℃で一晩増殖させ、同じLB培地で10倍に希釈し、OD600が0.6〜1.0に達するまで更に増殖させた。CaENO1タンパク質の発現を誘導するために、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を培養物中0.5mMの最終濃度まで添加した。細胞ペレットを、1%Triton x−100を含有する2mlの1×PBSに再懸濁し、3サイクルの凍結(−70℃)及び融解(37℃)によって溶解させた。遠心分離の後、得られる細胞溶解物を、Ni2+装填樹脂カラムを用いてインキュベートし、His−CaENO1タンパク質を製造業者(GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン)の取扱い説明書に従って精製した。ヒト、マウス、S.ニューモニエ、S.アウレウスに由来するENO1を同様にして発現させ、精製した。
雌性白色レグホン(ガルス・ドメスティカス(Gallus domesticus))ニワトリを、等量のフロイント完全アジュバント(Sigma、米国)中50gの精製His−CaENO1を用い、筋肉内注射により免疫化した。フロイント不完全アジュバント中のHis−CaENO1を用いた3回の付加的な免疫化を7日間隔で行った。各免疫化の後、卵黄中のポリクローナルIgY抗体を部分的に精製し、酵素結合免疫吸着法(ELISA)によって滴定して、体液性抗his−CaENO1免疫応答の存在を決定した。IgY抗体を、以前に記載されているように10%硫酸デキストランを用いて卵白から分離した卵黄から精製した(Akita EM, Nakai S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J Immunol Methods 1993; 160: 207-14、Akita EM, Nakai S. Production and purification of Fab'fragments from chicken egg yolk immunoglobulin Y (IgY). J Immunol Methods 1993; 162: 155-64)。精製IgY抗体を、0.05%アジ化ナトリウムを含有する5mlのTBSに溶解し、−20℃で保管した。
抗体ライブラリーを以前の報告に基づいて確立した(Andris-Widhopf J, Rader C, Steinberger P et al. Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immunol Methods 2000; 242: 159-81)。簡潔に述べると、最終免疫化後にニワトリから摘出した脾臓を、均質化のために即座にTrizol(Gibco BRL.、米国)に入れた。10μgの全RNAを、SuperScript RTキット(Invitrogen、米国)を用いて第一鎖cDNAに逆転写した。ニワトリ特異的プライマーを用いた増幅の後、重鎖及び軽鎖可変(VH及びVL)領域のPCR産物を2回目のPCRに供し、短リンカー又は長リンカーを有する完全長scFvフラグメントを形成し、これをSfiIで更に消化し、pComb3Xベクターにクローニングした。組換えファージDNAを、エレクトロポレーション(Bio-RadのMicroPulser)によって大腸菌ER2738株に形質転換した。組換えファージの作製を、野生型VCS−M13ヘルパーファージの添加によって開始し、これを続いて4%ポリエチレングリコール8000及び3%NaCl(w/v)で沈殿させ、最後に1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する1×リン酸緩衝食塩水(PBS)に再懸濁した。次いで、scFv抗体ライブラリー中1011プラーク形成単位(pfu)の組換えファージを、精製His−CaENO1タンパク質(0.5μg/ウェル)でプレコーティングしたウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。非結合ファージを除去した後、結合したファージを0.1M HCl/グリシン(pH2.2)/0.1%BSAで溶出させ、2Mトリスベースバッファーで中和し、大腸菌ER2738株の感染に使用した。増幅したファージを沈殿させ、次回の選択のために上記のように回収した。4回目のバイオパニング後に、大腸菌ER2738に由来する全ファージミドDNAを精製し、大腸菌TOP10F’に形質転換した。無作為に選択したクローンのパネルを一晩培養し、1mM MgCl2及びアンピシリン(50μg/ml)を含有するスーパーブロス(super broth)中で100倍希釈し、8時間更に増殖させた。1mMイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いた一晩の誘導の後、細菌を遠心分離によって採取し、ヒスチジン(His)結合バッファー(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、20mMイミダゾール、pH7.4)に再懸濁し、3サイクルの凍結、融解/超音波処理によって溶解させた。scFv抗体をNi2+装填セファロース(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden)を用い、製造業者の取扱い説明書に従って精製した。精製したscFv抗体を、Amicon Ultra−4 Centrifugal Filter Devices(Merck Millipore、ドイツ)を用いて1×PBS中で更に濃縮し、C.アルビカンスに対するそれらの結合能又は中和能について検査した。
細胞増殖及び菌糸形成に対するscFv抗体の効果を決定するために、抗CaENO1 IgY(0.5mg/ml)又はCaS1 scFv(0.5mg/ml)又はPBSを、C.アルビカンス(1×106cfu)とともに37℃で1時間プレインキュベートした。インキュベーションの後、10倍希釈した1ulの各混合物をYPD寒天プレート上にスポッティングし、37℃で一晩インキュベートした。103cfuのC.アルビカンスを0μg/ml(1×PBS対照)、10μg/ml又は100μg/mlのCaS1 scFvと室温で1時間混合した。その後、1ulの各混合物をYPD寒天プレート上にスポッティングし、37℃で5日間インキュベートした。
C.アルビカンス(SC 5314)、C.クルセイ(臨床分離株)、C.トロピカリス(BCRC 20520)、C.パラプシローシス(BCRC 20515)及びC.グラブラータ(BCRC 20586)は、台北医学大学(台湾、台北)のChing-Hua Su博士の好意により提供された。C.アルビカンス(CA6−17、CA7−26、CA7−3、CA10−50、CA7−30、CA10−65)、C.トロピカリス(CT11−52、CT6−29、CT6−50、CT12−54)、C.グラブラータ(CG5−8、CG8−11、CG7−37、CG5−66)及びC.パラプシローシス(CP8−20、CP12−37、CP6−20、CP7−17、CP8−48)は、台北医学大学−萬芳病院の臨床検査部(Department of Laboratory Medicine, Wan Fang Hospital)(台湾、台北)の好意により提供された。カンジダ種をYPD培地中で培養し、それらの同一性をCHROMagarカンジダプレート(CHROMagar、フランス、パリ)によって確認した。MIC試験ストリップを使用し、MICを製造業者により推奨されるように80%阻害で読み取った。
ENO1タンパク質の存在を検出するために、精製組換えENO1タンパク質又は5つのカンジダ属の細胞溶解物をSDS−PAGE分析に供し、ニトロセルロース膜(Amersham Biosciences、英国)に転写した後、TBST中の5%スキムミルクを用いて1時間ブロッキングした。7回目の免疫化後のニワトリに由来する抗CaENO1 IgY(1:3000)又は精製CaS1 scFv抗体(1μg/ml)を添加し、室温で1時間インキュベートした。激しく洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートポリクローナルロバ抗ニワトリIgY抗体(1:3000)(Bethyl Laboratories、米国テキサス州モンゴメリー)を添加し、結合したIgY抗体の検出のために更に1時間インキュベートした。また、ヤギ抗ニワトリ軽鎖抗体(1:3000)(Bethyl Laboratories、米国テキサス州モンゴメリー)、続いてHRPコンジュゲートロバ抗ヤギIgG抗体(Jackson ImmunoResearch、米国)を、結合したscFv抗体の検出に使用した。上記のように洗浄した後、膜をジアミノベンジジン(DAB)又はECL基質で発色させた。ImageQuant LAS4500をECL強度の検出に用いた。
それらの結合反応性を検査するために、7回目の免疫化後にニワトリから精製した一連の希釈IgY抗体(500倍〜256000倍)、又は組換えCaS1 scFv抗体(40μg/ml〜0.078μg/ml)を、ELISAプレートウェルに固定化した精製CaENO1(10μg/ml)とともにインキュベートした。激しく洗浄した後、結合したIgY抗体を、HRPコンジュゲートポリクローナルロバ抗ニワトリIgY抗体(1:3000)(Bethyl Laboratories、米国テキサス州モンゴメリー)を添加することによって検出し、結合したCaS1 scFv抗体をヤギ抗ニワトリ軽鎖抗体(1:3000)(Bethyl Laboratories、米国テキサス州モンゴメリー)、続いてHRPコンジュゲートロバ抗ヤギIgG抗体(Jackson ImmunoResearch、米国)によって検出した。上記のように洗浄した後、テトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液(Sigma、米国)を発色のためにウェルに添加した。1N HClを用いて反応を停止させ、光学密度を450nmでELISAプレートリーダー(BioTek Synergy HT)を用いて測定した。解離定数(KD)を方程式:グラム/分子量(Da)×容量(L)−1に従って算出した。
基質ゲルを線維素溶解活性検出のために調製した33。C.アルビカンス(106細胞)を洗浄し、CaS1scFv(10μg及び100μg)を用いて又は用いずに37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後に細胞を洗浄し、プラスミノーゲン(10μg)とともに30分間インキュベートした。混合物をPBSで洗浄して、遊離プラスミノーゲンを除去した。得られる細胞ペレットを1.25%低融点アガロース、トロンビン(0.05U/ml、Sigma)及びフィブリノーゲン(2mg/ml、Sigma)を含有する基質ゲル中に入れた。ゲルを加湿チャンバ内、37℃で10時間〜14時間、明らかなスポットの出現により線維素溶解活性の存在が示されるまでインキュベートした。
細胞接着アッセイを、ヒト口腔表皮細胞(OECM−1)(XXX)を用いて行った。C.アルビカンス(1×106cfu)を、CaS1 scFv抗体(50μg又は100μg)とともに37℃で1時間プレインキュベートした。インキュベーション後に、混合物を2倍希釈し、96ウェルプレート内で培養した104のOECM−1細胞に添加した。プレートを4℃で2時間更にインキュベートした。1×PBSで3回洗浄した後、プレートを10%ホルムアルデヒドで固定した。上記のように洗浄した後、ウェルをスキムミルクで1時間ブロッキングした。その後、ウサギ抗C.アルビカンス抗体(1:3000、Bethyl、米国)を添加し、更に1時間インキュベートし、続いてHRPコンジュゲート抗ウサギ抗体(1:3000、Bethyl、米国)を添加した。上記のような洗浄を常に工程間で行った。TMBを発色に使用し、これを1N HClで停止させた。色の強度をELISAプレートリーダーにおいて450nmで測定した。
体重約30gの合計20匹のICR雌性マウス(National Laboratory Animal Center(台湾)から購入)を、各群5匹のマウスの群に無作為に分けた。C.アルビカンスを一晩増殖させ、生理食塩水で洗浄した。4つの群のマウスを以下の調製物を用いて側尾静脈から処理した:(i)1×PBS単独;(ii)50μgのCaS1とともにプレインキュベートした1×106cfuのC.アルビカンス細胞;(iii)100μgのCaS1とともにプレインキュベートした1×106cfuのC.アルビカンス細胞;(iv)抗CaENO1 IgYとともにプレインキュベートした1×106cfuのC.アルビカンス細胞。マウスを生存について1日間隔で10日間モニタリングした。マウスの全ての処理及び取扱いは、台北医学大学の動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)によって認可される動物実験プロトコルに従って行った。
C.アルビカンスα−エノラーゼ遺伝子をpQE30プラスミド内で構築して、pQE30−CaENO1ベクターを形成した後、得られるベクターを大腸菌BL21細胞で形質転換した。細胞の発現を濃度1.0mM、0.5mM及び0.1mMのIPTGで4時間、5時間、8時間及び一晩にわたって誘導した。SDS−PAGE(図1A)及びウエスタンブロット分析(図1B)によって発現タンパク質が約49kDaの分子量を有することが見出された。
50μgの実施例1の精製His−CaENO1タンパク質をニワトリに投与し、抗his−CaENO1 IgYポリクローナル抗体を産生させた。ポリクローナル抗体を卵からSDS−PAGE及びウエスタンブロット分析によって精製した。精製抗体の結合能を、ウエスタンブロット及び酵素結合免疫吸着法(ELISA)によってアッセイした。ELISAアッセイでは、BSAを陰性対照として使用し、マウス抗his IgGを第1の抗体として使用し、HRPウサギ抗マウスIgGを第2の抗体として使用した。ウエスタンブロット分析の後、His−CaENO1に特異的に結合する抗his−CaENO1 IgYポリクローナル抗体が3回の免疫化後に産生され、その結合能は各回の免疫化により増大した。
ニワトリ抗CaENO1 IgYの体液性免疫応答をELISA及びウエスタンブロットによって特定した(図2B)。免疫前血清及び非関連BSAタンパク質と比較して、7回目の免疫化後のIgY(500倍〜256000倍希釈)はCaENO1を認識した(図2A)。
ニワトリから精製した抗体は、フレームワーク領域(FR)及び相補性決定領域(CDR)を含む。コロニー#1S1〜#1S12を単離し、ompseqプライマー(5’−AAGACAGCTATCGCGATTGCAGTG−3’)を用いてシークエンシングし、シークエンシング結果をBioEditソフトウェアによって分析した後、得られる配列をニワトリ生殖系列と比較した。10個のクローン中の抗体が軽鎖及び重鎖で同じ配列を有することが見出された(図3)。
最後のバイオパニングによる全ファージミドDNAをTOP10F’大腸菌に形質転換し、個々のscFvを分析した。scFv遺伝子フラグメントを含有するコロニーを選択し、10mLのLB(Lauria−Bertani)ブロス(50μg/mLアンピシリン)中で振盪しながら37℃で一晩培養した後、OD600が0.4〜0.8に達するまで培養物を別の100mLのLB(50μg/mLアンピシリンを含む)に移した。その後、得られる培養物を0.5mM IPTGとともに6時間〜8時間インキュベートして、Hisタグ付きCaS1 scFvタンパク質を発現させた。次いで、培養物を遠心分離に供し、上清を捨て、ペレットを1mLのHis結合バッファー(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、20mMイミダゾール、pH7.4)に再懸濁した。大腸菌細胞を超音波処理で破壊した後、サンプルを3000gの遠心分離に5分間供した。次に、上清中のCaS1 scFv融合タンパク質をNi Sepharose(商標)High Performance(GE healthcare Life science、米国)によって、製造業者により提案されるように精製した。簡潔に述べると、サンプル上清をセファロースに添加し、1時間混合し、1000gの遠心分離に5分間供した。上清を捨てた。セファロースを1mLのHis結合バッファーで2回洗浄して、洗浄液1及び洗浄液2を得た。500μLのHis溶出バッファーをセファロースに添加し、1時間混合した。セファロースを1000gの遠心分離に5分間供し、上清(溶出液1)を回収した。上記の工程を繰り返して溶出液2を得た。溶出液1及び2は精製His−CaS1 scFvを含有する。最後に、セファロースを50μLのHis結合バッファーに再懸濁した。結合上清、洗浄液1、洗浄液2、溶出液1、溶出液2及びセファロースの画分を12%SDS PAGEによって分析した(図4)。
0.25μgのHis−CaENO1を96ハーフエリアプレートの各ウェルに添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートして、タンパク質をウェルの底部に吸着させた。タンパク質を捨て、5%スキムミルクをウェルに添加し、プレートをブロッキングのために37℃で1時間インキュベートした。一方、1μg/mL CaS1を、50μg/mL遊離形態His−CaENO1の2倍及び10倍段階希釈サンプル(すなわち50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、0.19μg/mLの遊離形態His−CaENO1)の各々とともに室温で1時間インキュベートした。次いで、これらのサンプルを、コーティング及びブロッキングした上記のウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートして、競合反応を行った。その後、ウェルをPBSTで6回洗浄した後、ヤギ抗ニワトリ軽鎖(1:3000希釈)をそれに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、ウェルをPBSTで6回洗浄した後、ロバ抗ヤギHRP抗体(1:5000希釈)をそれに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、ウェルをPBSTで6回洗浄した後、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)を添加することによって呈色反応を開始し、反応を1N HClによって終了した。波長450nmでの吸光度を検出してOD450を得た。CaENO1へのCaS1の結合活性を決定するために、ELISA(図5A及び図5B)及び競合ELISA(図5C及び図5D)を行った。図5A及び図5Bに見られるように、CaENO1へのCaS1 scFv抗体の結合活性は濃度依存的であり、ELISA及び競合ELISAによって測定されるようにKDはそれぞれ1.88×10−8M及び8.9×10−8Mである。
このCaS1 scFvを、異なるカンジダ種に対するその結合活性について評価した。5つのカンジダ一般株が得られ、5つのカンジダ種の全溶解物をSDS−PAGE(図6A左)及びその後のウエスタンブロットにおいて分析した。図4A中央に見られるように、抗CaENO1ポリクローナルIgYは予想の通りに試験した5つのカンジダ種を認識することが可能である。しかしながら、CaS1 scFvは図6A右のレーン1に見られるようにC.アルビカンス、レーン3に見られるようにC.トロピカリスとしか反応することができない。このCaS1 scFvはC.クルセイ(レーン2)、C.パラプシローシス(レーン4)及びC.グラブラータ(レーン5)とは反応することができない。ENO1タンパク質配列はC.アルビカンスとC.トロピカリスとで83%相同であり、したがって、CaS1がC.アルビカンス及びC.トロピカリスを認識し得る理由は、これら2つの種がCaS1 scFvに結合し得る同様のエピトープを有することと示唆され得る。
抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及び対照scFvをC.アルビカンスと接触させた後、フローサイトメトリーアッセイに供した。抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及び対照scFvは89.7±2.8%、46.64±3.1%及び23±2.3%のFITC蛍光反応を示し(図7A)、抗体がC.アルビカンスの表面上のα−エノラーゼに結合することができることを意味している。さらに、染色用のヨウ化プロピジウムを使用して、C.アルビカンスの死亡率を特定し、抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及び対照scFvが90±1.5%、37±0.8%、21±1%のC.アルビカンスを死滅させることが見出された(図7A)。図7Bに示されるように、対照scFv及び抗CaENO1 IgYと比較して、scFv CaS1はC.アルビカンスの表面上のα−エノラーゼに結合することで、それらを死滅させることができる。
抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及び対照scFvを、C.アルビカンスの細胞表面上のα−エノラーゼに対するCaS1抗体を特定する免疫蛍光アッセイに使用した。図8に示されるように、抗CaENO1 IgY(1)及びscFv CaS1(2)はC.アルビカンスの表面上のα−エノラーゼに結合するが、対照scFv(3)は結合を示さない。
C.アルビカンスの増殖に対するCaS1の効果を評価し、CaS1 scFvをC.アルビカンスとともにプレインキュベートし、寒天上にプレーティングした。図9Aに見られるように、CaS1 scFvは10−4に希釈した場合に、対照と比較してYPD寒天プレート上で観察されるC.アルビカンスの増殖を減少させた。抗CaENO1 IgYに対する阻害効果はscFv CaS1 scFvと同様である。
C.アルビカンス細胞(1×106)を、50μg及び100μgのscFv CaS1のそれぞれで処理し、得られる混合物をヒト口腔ケラチノサイトOECM−1細胞に添加して、OECM−1細胞に対するC.アルビカンス細胞の結合能を試験した。PBS対照と比較して、50μg及び100μgのscFv CaS1は、OECM−1細胞に対するC.アルビカンス細胞の結合を顕著に低減した(図10)。
表面ENO1がプラスミノーゲン受容体として作用し32、プラスミノーゲンへの結合によりそれがプラスミンへと活性化され、ゲルに含まれるフィブリノーゲン(細胞外基質)の分解がもたらされることが知られている。CaENO1−プラスミノーゲン会合の考え得る生物学的意義を試験するために基質ゲル研究を行い、この結合に対するCaS1 scFvの効果を観察した。
1×106細胞のC.アルビカンス溶液を、各100μgの抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及び対照scFvと混合した後、ICRマウス(各群5匹のマウス)に注射した。10日後に、抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及び対照scFv群の生存率は、それぞれ100%、80%及び0%であった。抗CaENO1 IgY及びscFv CaS1はC.アルビカンスの毒性を中和することができるため、マウスを延命するか又はマウスを死亡から保護し得ることが見出された。
2つのヒト化CaS1 scFv(V1及びV3)を設計した。ヒト化CaS1 scFv V1をヒトフレームワーク(タンパク質構造データバンク:2JIX−L、2ZKH−H)にグラフトし、この最も好適な長さの配列を、Discovery Studioソフトウェアによって分析した。ヒト化CaS1 scFv V3を、Avastin(商標)(タンパク質構造データバンク:2FJG)の配列であるヒトフレームワークにグラフトした。これらのヒト化CaS1 scFv(V1及びV3)はGemonics BioSci & Tech(台湾、新北市)によって合成され、pComb3Xベクターにクローニングし、タンパク質発現のためにTop 10大腸菌内に導入した。発現されたV1及びV3タンパク質をNi+セファロースによって精製し、SDS−PAGE及びウエスタンブロットによって分析した。
hzCaS1 V1、V3及びCaS1 scFvを組換えCaENO1タンパク質の認識に使用した。図13に示されるように、(A)クマシーブルーを染色に使用し、(B)マウス抗ヒトκ、λIgG及びHRPコンジュゲートウサギ抗マウスIgGをウエスタンブロットに使用し(右パネル)、(C)マウス抗HA IgG及びHRPコンジュゲートウサギ抗マウスIgGを使用し、(D)ヤギ抗ニワトリ軽鎖IgG及びHRPコンジュゲートロバ抗ヤギIgGを使用した。レーン1:hzCaS1 scFv V1。レーン2:hzCaS1 scFv V3。レーン3:CaS1 scFv。
精製hzCaS1 V1及びV3 scFvを組換えCaENO1タンパク質の認識に使用した。hzCaS1 V1及びV3 scFvを、段階希釈により一次抗体として使用した。ヤギ抗ニワトリ軽鎖IgGを二次抗体として使用した。HRPコンジュゲートロバ抗ヤギIgGを検出に使用した(図14A及び図14Cを参照されたい)。OD値をパーセンテージで算出した。scFvのKD又は50%有効濃度(EC50)を算出し、モル濃度(M)によって表した。hzCaS1 V1及びV3 scFvのKDは、それぞれ1.51ug/ml=4.6×10−8M及び2.12ug/ml=8.4×10−8Mである。ELISAデータを二連ウェルの平均±SDとして表した(図14B及び図14Dを参照されたい)。
Ni+セファロース上のCaENO1を100ugのhzCaS1 V1、V3及びCaS1 scFvで1時間処理し、続いてプラスミノーゲン(20ug)とともに1時間インキュベートした。CaS1 scFvを用いたCaENO1の各実験群をゲル上に滴下し、室温で2日間インキュベートし、ゲル分解結果を観察し、結果を図15に示す。図15−1では、プラスミノーゲン(1ug/ul)単独(陽性対照)の存在下で、ゲルに見られるように顕著な線維素溶解活性が示される。図15−2では、プラスミノーゲンを含まないNiセファロース(商標)(10ug)単独(陰性対照)上でのCaENO1は、ゲル中で線維素溶解活性を示さない。図15−3では、プラスミノーゲン(20ug)を含むセファロース(商標)(10ug)上でのCaENO1が線維素溶解活性を示す。図15−4、図15−5、図15−6では、hzCaS1 V1(図15−4)、V3(図15−5)、CaS1 scFv(図15−6)(100ug)で処理し、プラスミノーゲン(20ug)とともにインキュベートしたセファロース(商標)(10ug)上のCaENO1は、15−3と比較して線維素溶解活性を示さない。したがって、結果から、CaENO1に結合したプラスミノーゲンが基質ゲル中に存在するトロンビンによって活性化され、周囲のフィブリノーゲンを消化し得ることが示唆される。しかしながら、図15−3に示されるように、線維素溶解活性はプラスミノーゲンの存在下と比較してhzCaS1 V1、V3、CaS1 scFvとともにプレインキュベートしたCaENO1によって顕著に阻害することができる。ゲル中のフィブリノーゲンの分解の阻害は明白である(図15−4、図15−5、図15−6)。本発明者らの結果から、プラスミノーゲンへのCaENO1の結合がhzCaS1 V1、V3、CaS1 scFv抗体によって顕著に低減されたことが示唆される。
9つのPCR増幅フラグメントを、PET−21aベクターにライゲートし、BL−21大腸菌に形質転換した完全長CaENO1(1323bp)を鋳型として用いて得た。挿入されたフラグメントの同一性をシークエンシング(Genomics BioSci & Tech、台湾、新北市)によって確認した。タンパク質発現をIPTG誘導によって行った。SDS−PAGE及びウエスタンブロットを用いて、発現組換えタンパク質を特性化した。
動物モデルにおいてCaS1の生存率を評価した。初めに、ICRマウスに1×106細胞のC.アルビカンスを、PBS単独を用いて又は細胞をCaS1(10μg及び100μg)とともに37℃で1時間プレインキュベートして尾静脈注射した。図17に見られるように、CaS1(10μg及び100μg)とのプレインキュベートは、PBS対照と比較してマウスの生存率をそれぞれ40%及び80%に延長する。抗ヒャッポダ(Deinagkistrodon acutus)scFv(抗DA)はヘビ毒に対する抗体であり、これを非関連scFv対照として使用した。これらのデータから、CaS1 scFvが、ICRマウスにカンジダ血症の致死的チャレンジに対する部分保護活性をもたらすことが示唆される。
カンジダ・アルビカンス細胞をYPD培地中で培養した後、回収した。細胞をPBSで洗浄し、100mMグルコースを含有するYPD培地に107細胞/mlの細胞密度で再懸濁した。96ウェルプレートをCaS1 scFv又はフルコナゾールで処理した後、1mlの細胞懸濁液を接種した。2時間の接着期間の後、PBSで洗浄することによって接種材料を除去し、100mMグルコースを含有するYPD培地をプレートに適用した。プレートをCaS1 scFv又はフルコナゾールで処理し、バイオフィルムを37℃で72時間増殖させた。プレートをPBSで洗浄した後、バイオフィルム形成を顕微鏡検査によって観察した(図18)。
Claims (14)
- 単離された抗CaENO1抗体又はその抗原結合部分であって、その単離された抗体又はその抗原結合部分がCaENO1に結合するように、配列番号5の軽鎖相補性決定領域1(L−CDR1);配列番号6の軽鎖CDR2(L−CDR2);配列番号7の軽鎖CDR3(L−CDR3)、配列番号8の重鎖CDR1(H−CDR1);配列番号9の重鎖CDR2(H−CDR2);及び配列番号10の重鎖CDR3(H−CDR3)を含む、単離された抗CaENO1抗体又はその抗原結合部分。
- 前記単離された抗CaENO1抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体の前記軽鎖が、配列番号13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又は、前記抗体の前記重鎖が、配列番号15及び16からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体。
- (i)配列番号13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、(ii)配列番号15及び16からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含む、ヒト化抗体。
- (i)配列番号13のアミノ酸配列を有する軽鎖と、(ii)配列番号15のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む、又は、(i)配列番号14のアミノ酸配列を有する軽鎖と、(ii)配列番号16のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む、請求項4に記載のヒト化抗体。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
- 被験体においてカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの増殖を阻害し、それにより引き起こされる感染を治療するために使用される抗体であって、前記被験体に投与するために使用される請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
- 被験体においてカンジダ症を治療するために使用される抗体であって、前記被験体に投与するために使用される請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記カンジダ症が侵襲性カンジダ症、抗生物質カンジダ症、腸菌相のディスバイオシス、爪真菌症、皮膚カンジダ症又は粘膜カンジダ症である、請求項8に記載の抗体。
- 被験体においてフルコナゾール耐性カンジダの増殖を阻害するか、又はそれにより引き起こされる感染を治療するために使用される抗体であって、前記被験体に投与するために使用される請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記カンジダがフルコナゾール耐性カンジダ属である、請求項10に記載の抗体。
- 前記フルコナゾール耐性カンジダ属がフルコナゾール耐性のC.アルビカンス又はC.トロピカリスである、請求項11に記載の抗体。
- カンジダによって引き起こされるバイオフィルム形成を阻害する抗体であって、被験体に投与するために使用される請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
- 体外で被験体の生体サンプルにおけるカンジダ、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカスの感染を検出する方法であって、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗CaENO1抗体を前記生体サンプルと接触させることと、CaENO1のエピトープである、 283 LYEQLISEYP 292 (配列番号1)、 278 PQLADLYEQL 287 (配列番号2)、 240 KGKVGIAMDV 249 (配列番号3)又は 278 PQLADLYEQLISEYP 292 (配列番号4)への抗CaENO1抗体の結合を検出することとを含み、該結合の存在が、前記被験体の生体サンプルがカンジダ感染を患う疑いがあることを示す、方法。
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