TWI708784B - 抗感染疾病之抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抗CaENO1抗體及人類化抗體，作為對念珠菌屬(較佳地白色念珠菌、熱帶念珠菌)、耐氟康唑(fluconazole)念珠菌屬、鏈球菌或葡萄球菌引起之感染的有效診斷劑或治療性治療。

Description

抗感染疾病之抗體
本發明係關於一種抗感染性疾病之抗體。特定言之，本發明提供一種抗α-烯醇酶之抗體，其用於抗由念珠菌(Candida)、耐氟康唑(fluconazole)念珠菌、鏈球菌(Streptococcus)或葡萄球菌(Staphylococcus)引起之感染的診斷及治療。
念珠菌疾病常常為慢性的，難以治療，且儘管進行抗真菌療法，仍帶來高死亡率及發病率。念珠菌屬為全球ICU中導致感染之第三大主要原因，占所有真菌感染的高達90%。
診斷侵襲性念珠菌病為困難的，其係由於缺乏特定臨床特徵且血液培養物對於尤其在接受氟康唑預防之患者中分離念珠菌物種具有較低敏感性。針對念珠菌屬之陽性血液培養物保持對診斷念珠菌血症的最高準則。然而，念珠菌屬分離可耗費過多時間，由此延遲有效抗真菌療法。白色念珠菌(Candida albicans)為最重要的人類真菌病原體。特定言之，白色念珠菌(Candida albicans；C.albicans))為機會性人類病原體，其在數個部位處移生，包括皮膚、口腔組織、腸胃道及陰道。白色念珠菌亦為造成50.4%臨床念珠菌血症的主要病原體。當念珠菌酵母進入血流時可出現念珠菌血症，且在健康人類中很少發現。近幾十年來，由於患有缺陷性免疫功能之患者群體增加，念珠菌血症已變成重大問題。雙性黴素(AmB)為針對真菌之抗真菌治療的最 高準則，但此藥物之嚴重副作用限制其臨床應用。廣泛且長期使用唑類已導致快速產生多藥抗性(MDR)，其在抗真菌療法中造成主要障礙。數個報導展示對氟康唑的抗性發生率在近二十年期間上升。
烯醇酶存在於所有能夠糖酵解或醱酵之組織及生物體中。ENO1首先經識別為糖酵解路徑之關鍵組分。ENO1在細胞溶質中經廣泛表現，且亦在細胞表面，如纖維蛋白溶酶原結合受體上發現。白色念珠菌ENO1剔除式突變體展現變化的藥物易感性、菌絲形成及毒性。真菌病原體白色念珠菌中ENO1之表現對於細胞生長至關重要。白色念珠菌中ENO1上之突變在葡萄糖存在下抑制細胞生長。ScFv為重組抗體蛋白質，其由藉由連接子肽組合之重鏈(VH)及輕鏈(VL)之可變區組成。在先前研究中，抗CaENO1 scFv抗體(CaS1)藉由噬菌體呈現來分離，但CaENO1與CaS1之交互作用(抗原決定基)尚不清楚。需要探索且研發關於CaS1 scFv抑制抗CaENO1與纖維蛋白溶酶原之間交互作用的目標。
本發明提供抗CaENO1抗體(CaS1)及人類化抗體，其作為抗由念珠菌(較佳地念珠菌屬、更佳地白色念珠菌、熱帶念珠菌)、耐氟康唑念珠菌(較佳地耐氟康唑念珠菌屬)、鏈球菌或葡萄球菌引起之感染的有效診斷劑或治療性治療。
在本發明中，重組CaENO1及CaS1 scFv經成功地表現且純化。CaS1 scFv識別白色念珠菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌之ENO1蛋白質；尤其CaS1 scFv自臨床結合至耐氟康唑白色念珠菌及熱帶念珠菌，且對小鼠及人類之彼等耐氟康唑白色念珠菌及熱帶念珠菌具有較弱交叉反應性。
本發明亦提供一種抗原決定基序列，其包含由位於CaENO1中之以下組成的胺基酸序列：283LYEQLISEYP292(SEQ ID NO：1)、 278PQLADLYEQL287(SEQ ID NO：2)、240KGKVGIAMDV249(SEQ ID NO：3)或278PQLADLYEQLISEYP292(SEQ ID NO：4)。
本發明亦發現多株IgY抗體對由白色念珠菌表現之重組CaENO1蛋白質以及原生CaENO1展示結合活性，表明在雞中引發較強體液性反應。用短或長連接子建構之抗體庫的複雜性分別為2.4×106及1.36×107。在嚴格篩選之後，顯性CaS1 scFv特定地識別白色念珠菌及熱帶念珠菌之ENO1蛋白質。另外，CaS1 scFv自臨床結合至耐氟康唑白色念珠菌及熱帶念珠菌。CaS1亦減弱白色念珠菌之生長且抑制其附著至口腔表皮樣癌細胞(OECM-1)。另外，CaS1顯著抑制白色念珠菌之表面ENO1結合至纖維蛋白溶酶原，如藉由纖維蛋白基質-凝膠降解分析所展示。顯著地，活體內動物測試展示CaS1抗體延長患有念珠菌血症之小鼠的存活時間。因此，本發明識別對CaENO1具有特定結合活性之新穎CaS1 scFv單株抗體。所有結果將共同在抗白色念珠菌之感染的治療性抗體藥物用於臨床應用上提供巨大幫助。
圖1(A)至(C)展示重組CaENO1蛋白質之表現及純化。(A)重組CaENO1蛋白質之表現藉由0.1(色帶1)、0.5(色帶2)及1.0mM IPTG(色帶3)誘發。庫馬斯藍(Coomassie blue)用於染色。(B)小鼠抗His IgG及HRP結合(conjugated)兔子抗小鼠IgG用於西方墨點法(Western blot)。陽性對照：重組SaENO1蛋白質。(C)在表現及音波處理之後，吾等使用Ni+瓊脂糖純化重組CaENO1蛋白質。色帶1：在Ni2+瓊脂糖結合之後CaENO1純系之清液層。色帶2：第一次洗滌緩衝液之收集。色帶3：第一溶離緩衝液之收集。色帶4：第二次溶離緩衝液。色帶5：表示溶離之後的Ni+瓊脂糖。箭頭表示重組CaENO1蛋白質分子量約50kDa。
圖2A及B展示使用ELISA及西方墨點法對於抗CaENO1 IgY抗體 之分析。(A)純化之重組CaENO1蛋白質及BSA(陰性對照)分別塗佈於ELISA盤上。接著，阻斷盤與一系列來自預免疫或第7次免疫雞之稀釋多株IgY抗體-起培育。(B)白色念珠菌之總體細胞溶解物在SDS-PAGE(色帶1)上觀測。薄膜與來自預免疫(色帶2)或第7次免疫(色帶3)雞之稀釋多株IgY抗體，隨後HRP標記之驢抗雞IgY(1：3,000)一起培育。白色念珠菌之細胞溶解物中表現之所偵測ENO1蛋白質藉由箭頭指示。
圖3展示scFv抗體之VH及VL域的序列比對。10 scFv-S之核苷酸序列經由第4輪淘選隨機地選自抗體庫。推定胺基酸序列與雞生殖系基因之胺基酸序列進行比對。引入序列間隙以藉由空白空間使比對最大化。
圖4展示CaS1 scFv之表現及純化。在表現及音波處理之後，Ni+瓊脂糖用於純化CaS1 scFv。庫馬斯藍用於染色。色帶1：在表現之後CaS1 scFv純系之總體細胞溶解物。色帶2：在Ni+瓊脂糖結合之後的清液層。色帶3：第一次洗滌緩衝液之收集。色帶4：溶離緩衝液之收集。色帶5：第二次溶離緩衝液之收集。色帶6：溶離之後的Ni+瓊脂糖。箭頭表示CaS1 scFv分子量約25kDa。
圖5(A)至(D)展示藉由ELISA及競爭性ELISA的CaS1 scFv之KD測定。(A)純化之CaS1 scFv用於識別重組CaENO1蛋白質。CaS1 scFv用作經系列稀釋之初級抗體。山羊抗雞輕鏈IgG用作二級抗體。HRP結合驢抗山羊IgG用於偵測。(B)OD值計算為百分比。CaS1 scFv之KD為0.498μg/ml=1.88×10-8M。(C)CaS1 scFv用於識別與固定形式重組CaENO1蛋白質競爭的經系列稀釋之自由形式重組CaENO1蛋白質。山羊抗雞輕鏈IgG用作二級抗體。HRP結合驢抗山羊IgG用於偵測。(D)吾等將OD值計算為百分比。CaS1 scFv之KD為4.45μg/ml=8.9×10-8M。ELISA資料表示為重複孔之平均值±SD。
圖6(A)至(D)展示藉由西方墨點法CaS1 scFv抗念珠菌屬上ENO1蛋白質的結合活性。(A)5種念珠菌屬之總體細胞溶解物在SDS-PAGE(左側)上觀測。在轉移至NC薄膜上之後，其用來自第7次免疫雞(1：3,000)之純化抗CaENO1(中間)或如材料及方法中所描述CaS1 scFv(右側)探測。在(A)中色帶1-6分別含有白色念珠菌、克柔念珠菌(C.krusei)、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)及光滑念珠菌(C.glabrate)及純化重組CaENO1之總體細胞溶解物。(B)來自耐氟康唑(FLUR)及氟康唑敏感(FLUS)白色念珠菌(色帶1-7分別表示CA6-17、CA7-26、CA7-3、CA10-50、CA7-30、CA10-65、SC5314)的總體細胞溶解物藉由SDS-PAGE(左側)且用CaS1 scFv藉由西方墨點法(右側)探測。(C)來自FLUR及FLUS及熱帶念珠菌(色帶1-5分別表示CT6-29、CT11-52、CT6-50、CT12-54、BCRC20520)的總體細胞溶解物藉由SDS-PAGE(左側)且用CaS1 scFv藉由西方墨點法(右側)探測。(D)白色念珠菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、小鼠及人類之純化ENO1蛋白質在SDS-PAGE(左側)上觀測。在轉移至NC薄膜上之後，其用如所描述之純化CaS1 scFv(右側)探測。色帶M含有蛋白質標記。
圖7(A)及(B)展示用scFv CaS1對白色念珠菌之流動式細胞測量術分析。(A)白色念珠菌SC 5314經培養隔夜，且105個細胞添加至具有2ml YPD培養基之各個管。實驗抗體添加至各管(1)抗CaENO1 IgY(100μg)(2)對照scFv(100μg)(3)scFv CaS1(100μg)(4)PBS，且在37℃下在恆溫箱中培養2小時。山羊抗雞輕鏈(1：1500)抗體用作偵測抗體；FITC驢抗山羊抗體(1：1000)用作研發出之抗體以偵測反應。碘化丙錠(P1)(1μg/ml)用於偵測細胞死亡。(B)流動式細胞測量術之定量得到A圖(*，p<0.05；**，p<0.01)。流動式細胞測量術表示為重複實驗之平均值±SD。
圖8展示藉由免疫螢光染色，scFv CaS1對白色念珠菌之分析。抗 CaENO1抗體用於偵測白色念珠菌細胞表面ENO1上之α-烯醇酶蛋白質。(1)用抗CaENO1 IgY偵測，且藉由FITC結合兔子抗雞抗體研發。(2)用scFv CaS1偵測，且藉由山羊抗雞輕鏈抗體及FITC兔子抗山羊抗體研發。(3)不相關scFv用於陰性對照上。
圖9展示CaS1 scFv對白色念珠菌生長及菌絲形成的作用。(A)白色念珠菌在YPD培養基中在37℃下培養隔夜。108cfu/ml白色念珠菌分別與相等體積之0.5mg/ml抗CaENO1 IgY、0.5mg/ml CaS1 scFv或1×PBS在室溫下混合1h。將1μl各混合物於10×稀釋液中點樣於YPD瓊脂盤上，且在37℃下培育隔夜。(B)將103cfu白色念珠菌與PBS(對照)、10或100g/ml CaS1 scFv在室溫下混合1h。將1μl各混合物點樣於YPD瓊脂盤上，且在37℃下培育5天。菌絲形成在顯微鏡下觀測。
圖10展示CaS1 ScFv抑制白色念珠菌附著至口腔表皮細胞。將白色念珠菌與1×PBS、50μg或100μg CaS1 scFv在37℃下混合1h，且添加至如本文中所描述培養孔中之OECM-1細胞中。在洗滌之後，附著至白色念珠菌之細胞藉由添加HRP結合抗白色念珠菌抗體偵測。
圖11展示CaS1 scFv對ENO1結合至纖維蛋白溶酶原的作用。CaS1 scFv阻斷CaENO1與纖維蛋白溶酶原結合的能力藉由纖維蛋白基質-凝膠降解分析評價。含有僅白色念珠菌(1)、白色念珠菌+1μg纖維蛋白溶酶原(2)或白色念珠菌+10μg纖維蛋白溶酶原(3)之多種樣品點樣於盤上。除了白色念珠菌首先與10μg(4)或100μg(5)之CaS1 scFv混合，隨後添加10μg纖維蛋白溶酶原以外，進行類似實驗。將不含纖維蛋白溶酶原之白色念珠菌+CaS1 scFv(6)作為陰性對照點樣。
圖12(A)及(B)展示hzCaS1 V1及V3 scFv之表現及純化。在表現及音波處理之後，Ni+瓊脂糖用於純化hzCaS1 V1(A)及V3(B)scFv。庫馬斯藍用於染色(左圖)。西方墨點法中之小鼠抗HA IgG及HRP結合兔子抗小鼠IgG(右圖)。箭頭表示hzCaS1 scFv分子量約25kDa。色帶1： hzCaS1 scFv純系細胞溶解物。色帶2：在Ni2+瓊脂糖結合之後hzCaS1 scFv之清液層。色帶3：第一次洗滌緩衝液之收集。色帶4：第一溶離緩衝液之收集。色帶5：溶離之後的Ni+瓊脂糖。陽性對照：CaS1 scFv。
圖13展示測定CaENO1與hzCaS1 V1、V3之結合親和力。hzCaS1 V1、V3及CaS1 scFv用於識別重組CaENO1蛋白質。(A)庫馬斯藍用於染色。(B)小鼠抗人類κ、λ IgG及HRP結合兔子抗小鼠IgG用於西方墨點法(右圖)。(C)使用小鼠抗HA IgG及HRP結合兔子抗小鼠IgG。(D)使用山羊抗雞輕鏈IgG及HRP結合驢抗山羊IgG。色帶1：hzCaS1 scFv V1。色帶2：hzCaS1 scFv V3。色帶3：CaS1 scFv。
圖14(A)至(D)展示藉由ELISA的hzCaS1 V1及V3 scFv之KD測定。(A、C)純化hzCaS1 V1及V3 scFv用於識別重組CaENO1蛋白質。hzCaS1 V1及V3 scFv用作經系列稀釋之初級抗體。山羊抗雞輕鏈IgG用作二級抗體。HRP結合驢抗山羊IgG用於偵測。(B、D)OD值計算為百分比。scFv之KD或50%有效濃度(EC50)藉由莫耳濃度(M)計算及表示。hzCaS1 V1及V3 scFv之KD分別為1.51μg/ml=4.6×10-8M及2.12μg/ml=8.4×10-8M。ELISA資料表示為重複孔之平均值±SD。
圖15展示CaS1、hzCaS1 V1及V3 scFv抑制CaENO1結合至纖維蛋白溶酶原。Ni+瓊脂糖上之CaENO1用100μg hzCaS1 V1、V3及CaS1 scFv處理1小時，接著用纖維蛋白溶酶原(20μg)培育1小時。具有CaS1 scFv之CaENO1的各實驗組滴落至凝膠上，且在室溫下培育2天以觀測凝膠降解結果。(1)僅纖維蛋白溶酶原(1μg/μl)。(2)在Ni SepharoseTM(10μg)上之CaENO1。(3)在具有纖維蛋白溶酶原(20μg)之SepharoseTM(10ug)上之CaENO1。(4-6)在SepharoseTM(10μg)上之CaENO1用hzCaS1 V1、V3、CaS1 scFv(100μg)處理，且與纖維蛋白溶酶原(20μg)一起培育。
圖16展示具有CaS1 scFv之CaENO1的抗原決定基接近具有CaENO1之纖維蛋白溶酶原的結合位點。指示具有CaS1 scFv之CaENO1的抗原決定基(240KGKVGIAMDV249及278PQLADLYEQLISEYP292)及纖維蛋白溶酶原結合位點(最末阻斷區域指示於圖之序列中)。
圖17展示CaS1 scFv對用白色念珠菌攻擊之小鼠存活之作用。小鼠經分組，且分別用含有106個白色念珠菌之10μg及100μg CaS1 scFv、100μg抗DA scFv(不相關scFv對照)或1×PBS之混合物攻擊。小鼠存活在1天間隔下監測10天。顯而易見，CaS1 scFv抗體在小鼠中提供抗白色念珠菌之致死攻擊的顯著保護活性。
圖18展示白色念珠菌生物膜形成抑制分析。
本發明研發一種CaENO1及抗CaENO1抗體(CaS1)之抗原決定基，其作為抗由念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌引起之感染的有效診斷劑或治療性治療。
定義
在以下描述中，大量術語用於以下所提供定義以促進理解所主張之標的物。在本文中未明確定義之術語根據其普通且一般含義使用。
除非另外規定，否則「一(a/an)」意謂「一或多個」。
如本文所用，術語「抗原決定基」係指抗體結合至抗原之位點。
如本文所用，術語「念珠菌病」係指由於任何類型之念珠菌(一種類型之酵母)的真菌感染。
如本文所用，術語「抗體」係指屬於多株、單株、嵌合及人類化抗體之類別的單鏈、雙鏈及多鏈蛋白質及多肽；其亦包括此等抗體 之合成及基因工程改造變異體。「抗體片段」包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段以及朝向一或多個所需目標抗原決定基具有特異性之抗體的任何部分。
如本文所用，術語「多株抗體」係指在一或多個其他不相同抗體之間或存在下所產生抗體。一般而言，多株抗體由B-淋巴細胞在數個產生不相同抗體之其他B-淋巴細胞存在下產生。通常，多株抗體直接自免疫動物獲得。
如本文所用，術語「單株抗體」係指獲自實質上均勻抗體之群體的抗體。換言之，單株抗體由均勻抗體組成，該均勻抗體自單一細胞純系(例如融合瘤、經針對均勻抗體進行編碼之DNA分子轉染的真核宿主細胞，或經針對均勻抗體進行編碼之DNA分子轉染的原核宿主細胞)生長產生。此等抗體針對單一抗原決定基，且因此具有高度特異性。
如本文所用，術語「單鏈Fv」或「scFv」係指傳統雙鏈抗體之重鏈及輕鏈已經接合形成一個鏈的抗體。通常，連接子肽在兩個鏈之間插入以允許適當摺疊且創建主動結合位點。
術語「連接子肽」包括提及在用以間接將可變重鏈結合至可變輕鏈之抗體結合片段(例如Fv片段)內的胜肽。連接子可為例如一系列單一胺基酸或交替模式之胺基酸。
如本文所用，術語「互補決定區」(CDR)係指在重鏈與輕鏈多肽之可變區內發現之非連續抗原組合位點。CDR已經由Kabat等人，J.Biol.Chem.252：6609-6616(1977)；Kabat等人，U.S.Dept,of Health and Human Services,「Sequences of proteins of immunological interest」(1991)；由Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)描述，其中當彼此比較時，定義包括胺基酸殘基之重疊或亞群。
如本文所用，術語「人類化抗體」係指一種重組蛋白，其中來自一個物種之抗體，例如鼠或雞抗體的CDR自來自該物種之抗體的重及輕可變鏈轉移至人類重及輕可變域(構架區)中。抗體分子之恆定域源自人類抗體之彼等恆定域。在某些情況下，人類化抗體之構架區之特定殘基，尤其接觸或接近CDR序列之彼等特定殘基可經修飾，例如用來自最初鼠、嚙齒動物、類人猴或其他抗體之對應殘基替代。人類化抗體可利用多種方法獲得，包括(a)在保留或不保留關鍵構架殘基的情況下僅將非人類CDR移植(graft)至人類構架及恆定區上，或(b)移植(transplant)整個非人類可變域，但用類人部分藉由替代表面殘基「遮蓋」該整個非人類可變域。適用於實施本發明之該等方法包括Padlan,Mol.Immunol.,31(3)：169-217(1994)中所揭示者。
如本文所用，術語「嵌合抗體」係指含有重及輕抗體鏈之可變域的重組蛋白，包括源自一個物種之抗體(較佳地嚙齒動物抗體或雞抗體、更佳地鼠抗體)的互補決定區(CDR)，同時抗體分子之恆定域源自人類抗體之彼等恆定域。
如本文所用，術語「噬菌體呈現庫」係指噬菌體之群體，其中之每一者含有以重組方式在框架中融合至表面蛋白質的外來cDNA。噬菌體呈現由cDNA在其表面上編碼之外來蛋白質。在細菌宿主，通常大腸桿菌(E.coli)中複製之後，含有所關注之外來cDNA的噬菌體藉由在噬菌體表面上之外來蛋白質表現來選擇。
如本文所用，在兩個核酸或多肽序列之情形下，術語「序列一致性」包括參考兩個序列中之核苷酸(或殘基)，該等兩個序列當在特定比較窗上比對最大對應時為相同的。當序列一致性之百分比在關於蛋白質使用時，認識到，不相同之殘基位置常常因保守胺基酸取代而不同，其中胺基酸殘基取代其他具有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之胺基酸殘基，且因此並不改變分子之功能性。在序列於保守取 代方面不同的情況下，序列一致性百分比可向上調節以校正取代之保守性質。作出此調節之方式為熟習此項技術者已熟知。通常此涉及將保守取代作為部分而非全部失配來進行評分，由此增加序列一致性百分比。因此，例如，在相同胺基酸給出1分，且非保守取代給出0分時，保守取代給出0與1之間之得分。保守取代之得分例如根據Meyers及Miller,Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17(1988)之演算法，例如如程式PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.,USA)中所實施來計算。兩個胜肽序列實質上類似的指示為一個胜肽與針對第二個胜肽所產生之抗體具有免疫反應性。因此，胜肽實質上類似於第二胜肽，例如，在兩個胜肽僅因保守取代而不同的情況下。
如本文所用，「比較窗戶」包括參考具有約10-20個殘基之片段，其中在兩個序列經最佳比對之後，序列可與具有相同數目之連續位置的參考序列進行比較。用於比較之序列比對方法為此項技術中所熟知。用於比較的序列之最佳比對可藉由以下方法進行：Smith及Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)之局部同源性演算法；Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)之同源性比對演算法；Pearson及Lipman,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85：2444(1988)之搜索類似性方法；藉由電腦化實施此等演算法(包括(但不限於)在PC/Gene程序中之CLUSTAL，其藉由Intelligenetics,Mountain View,Calif.,GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA，及TFASTA於Wisconsin Genetics Software Package中，Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wis.,USA)；CLUSTAL程式由Higgins及Sharp,Gene 73：237-244(1988)以及Higgins及Sharp,CABIOS 5：151-153(1989)；Corpet等人，Nucl.Acids Res.16：10881-90(1988)；Huang等人，Computer Applications in the Biosciences 8：155-65(1992)；及Pearson等人，Meth.in Molec.Biol.24：307-31(1994)很好地描述。
如本文所用，術語「診斷性」或「診斷」意謂識別病理狀況之存在或性質。
如本文所用，術語「治療(treatment/treating)」及其類似術語涵蓋對哺乳動物、尤其人類疾病的任何治療，且包括：(a)阻止疾病在可能易患該疾病但尚未診斷患有其之個體中發生；(b)抑制疾病，即遏制其發展；及(c)減輕疾病，即促使疾病消退。
如本文中可互換地所用，術語「個人」、「個體」、「宿主」及「患者」係指哺乳動物，包括(但不限於)鼠(大鼠、小鼠)、非人類靈長類、人類、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。
如本文所用，術語「治療有效量」或「有效量」係指當本發明抗CaENO1抗體投與哺乳動物或其他個體用於治療疾病時，足以實現對該疾病治療之量。
如本文所用，術語「生物樣品」涵蓋多種樣品類型，其獲自可用於診斷或監測分析的個人、個體或患者。該定義涵蓋血液及生物來源之其他液體樣品；固體組織樣品，諸如活組織檢查樣本或組織培養物或源自其之細胞及其後代。
位於白色念珠菌ENO1(CaENO1)中之抗原決定基及抗念珠菌α-烯醇酶之抗體
在一態樣中，本發明提供一種抗原決定基序列，其包含由位於CaENO1中之283LYEQLISEYP292(SEQ ID NO：1)、278PQLADLYEQL287(SEQ ID NO：2)、240KGKVGIAMDV249(SEQ ID NO：3)或278PQLADLYE QLISEYP292(SEQ ID NO：4)組成的胺基酸序列。在一個實施例中，抗原決定基序列包含由位於CaENO1中之240KGKVGIAMDV249(SEQ ID NO：3)或278PQLADLYEQLISEYP292(SEQ ID NO：4)組成的胺基酸序列。
使用純化之CaS1 scFv以識別重組CaENO1蛋白質。該抗原決定基 區域經定位含有198bp核苷酸，其推導出以下胺基酸序列(殘基235至300)：DKAGYKGKVGIAMDVASSEFYKDGKYDLDFKNPESDPSKWLSGPQLADLYEQLISEYPIVSIEDPF(SEQ ID NO：19)(66個胺基酸)。為進一步測定該抗原決定基位置，使用定點突變誘發以根據定位抗原片段之198bp核苷酸序列建構9個胜肽表現噬菌體。在一個實施例中，CaS1 scFv抗體跨越胺基酸殘基301至437結合至纖維蛋白溶酶原之片段，該 序列為
Figure 105110703-A0202-12-0013-3
Figure 105110703-A0202-12-0013-1
Figure 105110703-A0202-12-0013-4
(SEQ ID NO：20)。
在一個態樣中，本發明提供分離之抗-CaENO1抗體或其抗原結合部分，其包含以下中之至少一者：SEQ ID NO：5之輕鏈互補決定區1(L-CDR1)或具有與L-CDR1中之任一者至少80%一致之胺基酸序列的變異體；SEQ ID NO：6之輕鏈CDR2(L-CDR2)或具有與L-CDR2中之任一者至少80%一致之胺基酸序列的變異體；及SEQ ID NO：7之輕鏈CDR3(L-CDR3)或具有與L-CDR3中之任一者至少80%一致之胺基酸序列的變異體；以及以下中之至少一者：SEQ ID NO：8之重鏈CDR1(H-CDR1)或具有與H-CDR1中之任一者至少80%一致之胺基酸序列的變異體；SEQ ID NO：9之重鏈CDR2(H-CDR2)或具有與H-CDR2中之任一者至少80%一致之胺基酸序列的變異體；及SEQ ID NO：10之重鏈CDR3(H-CDR3)或具有與H-CDR3中之任一者至少80%一致之胺基酸序列的變異體；使得該分離抗體或其抗原結合部分結合至CaENO1。較佳地，序列一致性如上所述為至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
重鏈及輕鏈中互補決定區(CDR)之胺基酸序列在下表中列舉。
輕鏈之CDR
Figure 105110703-A0202-12-0014-68
重鏈之CDR
Figure 105110703-A0202-12-0014-66
先前CDR序列藉由使用international ImMunoGeneTics information system®(http：//www.imgt.org)測定。
在一些實施例中，分離之抗CaENO 1抗體為單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
相應地，本發明提供抗CaENO1 scFv單株抗體(CaS1)之輕鏈，其包含由以下序列組成之胺基酸序列：
Figure 105110703-A0202-12-0014-5
Figure 105110703-A0202-12-0014-6
(SEQ ID NO：11)。本發明提供抗CaENO1 scFv單株抗體(CaS1)之重鏈，其包含由以下序列組成之胺基酸序列：
Figure 105110703-A0202-12-0014-7
Figure 105110703-A0202-12-0014-8
(SEQ ID NO： 12)。本發明亦提供抗CaENO1 scFv單株抗體(CaS1)，其包含具有由序列SEQ ID NO：11組成之胺基酸序列的輕鏈及包含由序列SEQ ID NO：12組成之胺基酸序列的重鏈。
抗體分子可為多株或單株抗體或任何其他適合類型之抗體，諸如抗體之片段或衍生物、該抗體之單鏈可變片段(ScFv)或合成同系物，其限制條件為該抗體具有與整個抗體之彼等結合特性相同或類似 的結合特性。在一些實施例中，抗體可以重組方式產生，例如藉由任何適合之噬菌體呈現方法或組合方法產生。多種用於產生抗體之噬菌體呈現及組合方法為此項技術中已知(如例如以下中所描述：Griffths等人(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等人(1991)Nature 352：624-628；Gram等人(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等人(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；及Barbas等人(1991)PNAS 88：7978-7982)。
抗體片段可藉由分裂整個抗體或藉由表現編碼該片段之DNA產生。抗體之片段可藉由出版文獻(Lamoyi等人，J.Immunol.Methods,56：235,1983；Parham,J.Immunol.,131：2895,1983)中所描述方法製備。該等片段可含有Fab片段及F(ab')2片段中之一者或兩者。該等片段亦可含有單鏈可變片段抗體，即scFv、二體(dibody)或其他抗體片段。
單鏈可變片段(scFv)為多肽，其由抗體之重鏈可變區以短肽連接子連接至輕鏈可變區組成。因此，scFv包含整個抗體組合位點。此等鏈可在細菌或真核細胞中產生
諸如產生嵌合或人類化抗體之多種技術可涉及抗體選殖及建構之程序。所關注之抗體的抗原結合可變輕鏈及可變重鏈序列可藉由多個分子選殖程序，諸如RT-PCR、5'-RACE及cDNA庫篩選獲得。來自表現鼠抗體之細胞的抗體之可變重鏈或輕鏈序列基因可藉由PCR擴增及定序來選殖。如由Orlandi等人(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86：3833(1989))所描述，為確認其真實性，經選殖VL及VH基因可在呈嵌合抗體形式之細胞培養物中表現。如由Leung等人(Mol.Immunol.,32：1413(1995))所描述，基於可變重鏈或輕鏈基因序列，人類化抗體可接著經設計且建構。
嵌合抗體為重組蛋白，其中人類抗體之可變區已經由例如小鼠抗體之可變區(包括該小鼠抗體之互補決定區(CDR))置換。當向個體投與時，嵌合抗體展現降低之免疫原性及增加之穩定性。用於建構嵌合抗體之方法為此項技術中所熟知(例如，Leung等人，1994,Hybridoma 13：469)。
嵌合單株抗體可藉由將來自小鼠免疫球蛋白之重及輕可變鏈的小鼠CDR轉移至人類抗體之對應可變域中來加以人類化。嵌合單株抗體中小鼠構架區(FR)亦用人類FR序列置換。為保存人類化單株之穩定性及抗原特異性，一或多個人類FR殘基可經小鼠對應物殘基置換。人類化單株抗體可用於個體之治療性治療。用於產生人類化單株抗體之技術為此項技術中所熟知。(參看，例如Jones等人，1986,Nature,321：522；Riechmann等人，Nature,1988,332：323；Verhoeyen等人，1988,Science,239：1534；Carter等人，1992,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,89：4285；Sandhu,Crit.Rev.Biotech.,1992,12：437；Tempest等人，1991,Biotechnology 9：266；Singer等人，J.Immun.,1993,150：2844。)
在一實施例中，本發明提供以下人類化抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸。
Figure 105110703-A0202-12-0016-69
在一些實施例中，本發明提供包含胺基酸序列之輕鏈，該胺基酸序列具有選自由如SEQ ID NO：13至14中所列之彼等序列組成之群的序列。
在一些實施例中，本發明提供包含胺基酸序列之重鏈，該胺基酸序列具有選自由如SEQ ID NO：15至16中所列之彼等序列組成之群的序列。
在其他實施例中，本發明包含人類化抗體，其包含(i)具有如選自由SEQ ID NO：13至14組成之群之序列中所列胺基酸序列的輕鏈或與SEQ ID NO：13至14中之任一者至少80%一致的變異體，及(ii)具有如選自由SEQ ID NO：15至16組成之群之序列中所列胺基酸序列的重鏈或與SEQ ID NO：15至16中之任一者至少80%一致的變異體。較佳地，序列一致性如上所述為至少90%、91%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
在一較佳實施例中，人類化抗體包含(i)具有如SEQ ID NO：13中所列胺基酸序列的輕鏈及(ii)具有如SEQ ID NO：15(hzCaS1-V1)中所列胺基酸序列的重鏈。在另一較佳實施例中，人類化抗體包含(i)具有如SEQ ID NO：14中所列胺基酸序列的輕鏈及(ii)具有如SEQ ID NO：16(hzCaS1-V3)中所列胺基酸序列的重鏈。
除了重組方法以外，本文中所揭示抗體及其變異體亦可使用標準胜肽合成整體或部分建構。多肽之固相合成可藉由將序列之C端胺基酸附著至不可溶支撐物，接著連續添加序列中之剩餘胺基酸來完成。用於固相合成之技術由以下描述：Barany及Merrifield,The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis，部分A第3-284頁；Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2156,1963，及Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chem.Co.,Rockford,I11.,1984。具有更大長 度之蛋白質可藉由縮合更短片段之胺基末端及羧基末端來合成。
組合物及投藥方法
某些實施例係關於一種醫藥組合物，其包含本發明之抗原決定基或本發明之抗念珠菌α-烯醇酶抗體及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。「醫藥學上可接受之載劑」意欲(但不限於此)為對熟習此項技術者已知的任何類型之無毒性固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料或調配佐劑。稀釋劑，諸如多元醇、聚乙二醇及聚葡萄糖可用於增加結合物之生物半衰期。
本發明之醫藥組合物可根據習知方法(例如Remington's Pharmaceutical Science，最新版，Mark Publishing Company,Easton,U.S.A.)調配，且亦可含有醫藥學上可接受之載劑及添加劑。實例包括(但不限於)界面活性劑、賦形劑、著色劑、調味劑、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑及矯正劑，且可適當使用其他常用載劑。載劑之特定實例包括輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露糖醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、中鏈三酸甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、蔗糖、羧基甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽及此類物。
本發明亦提供用於抑制念珠菌、鏈球菌及葡萄球菌生長及治療由此引起之感染的方法。
一個實施例係針對用於抑制個體念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌生長及治療由此引起之感染的方法，其包含向該個體投與本發明之抗α-烯醇酶抗體。相應地，亦提供本發明之抗α-烯醇酶抗體之用途，其用於製造用以抑制個體念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌生長或治療由此引起之感染的藥劑。
另一實施例係針對一種用於防止個體念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌生長或由其引起之感染的方法，其包含向該個體投與本發明之抗原決定基。相應地，亦提供本發明之抗原決定基之用途，其用於製造用以防止個體念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌生長或由其引起之感染的藥劑。
在一些實施例中，念珠菌為白色念珠菌、熱帶念珠菌及光滑念珠菌、白色念珠菌，鏈球菌為肺炎鏈球菌，且葡萄球菌為金黃色葡萄球菌。
另一實施例係針對一種用於治療個體念珠菌病之方法，其包含向該個體投與本發明之抗α-烯醇酶抗體。相應地，亦提供本發明中抗α-烯醇酶抗體之用途，其用於製造用以治療個體念珠菌病之藥劑。較佳地，念珠菌病為侵襲性念珠菌病、抗生素性念珠菌病、腸菌區之菌群失調(dysbiosis)、甲黴菌病(onychomycosis)、皮膚念珠菌病或黏膜念珠菌病。
另一實施例係針對一種用於抑制個體耐氟康唑念珠菌生長或治療由此引起之感染的方法，其包含向該個體投與本發明之抗α-烯醇酶抗體。相應地，亦提供本發明中抗α-烯醇酶抗體之用途，其用於製造用以抑制個體耐氟康唑念珠菌屬生長或治療由此引起之感染的藥劑。較佳地，耐氟康唑念珠菌為念珠菌屬；更佳地，耐氟康唑念珠菌為耐氟康唑白色念珠菌或熱帶念珠菌。
又一實施例為提供一種用於抑制由念珠菌引起之生物膜形成的方法，其包含向個體投與本發明之抗α-烯醇酶抗體。相應地，亦提供本發明中抗α-烯醇酶抗體之用途，其用於製造用以抑制由念珠菌引起之生物膜形成的藥劑。較佳地，念珠菌為白色念珠菌、熱帶念珠菌及光滑念珠菌、白色念珠菌。生物膜為念珠菌過度生長如此難以失效的主要原因之一。長期存在的念珠菌過度生長具有大量時間建立生物 膜，且此等生物膜對許多治療具有極大耐受性。生物膜發展時間愈長，其對抗真菌治療具有愈多耐受性。此為單獨使用抗真菌藥物常常不足以抑制念珠菌過度生長的原因。出人意料地，本發明發現本發明抗體可有效地抑制念珠菌生物膜形成。
以上方法亦包含伴隨其他標準療法或在其之後投與本發明之抗α-烯醇酶抗體，該等其他標準療法如2009年3月由the Infectious Disease Society of America(IDSA)出版之更新準則中所描述(Pappas PG,Kauffman CA,Andes D,Benjamin DK Jr,Calandra TF,Edwards JE Jr等人Clinical practice guidelines for the management of candidiasis：2009年由the Infectious Diseases Society of America更新.Clin Infect Dis.2009 Mar 1.48(5)：503-35)。
在較佳實施例中，個體為哺乳動物。例示性哺乳動物包括人類、豬、綿羊、山羊、馬、小鼠、狗、貓、母牛等。可用抗體或其醫藥組合物治療之疾病包括念珠菌病。念珠菌病之實例包括(但不限於)侵襲性念珠菌病、抗生素性念珠菌病、腸菌區之菌群失調、甲黴菌病、皮膚念珠菌病及黏膜念珠菌病。
如本文所揭示之抗α-烯醇酶抗體或其醫藥組合物可靜脈內、局部、腹膜內、動脈內、鞘內、膀胱內或瘤內投與。一般技術者將瞭解抗α-烯醇酶抗體或其組合物之有效量可憑經驗確定。應理解，當向人類患者投與時，抗α-烯醇酶抗體或其組合物之總體每日用量將由主治醫師在合理醫療判斷之範圍內決定。任何特定患者的特定治療有效劑量水準將取決於多種因素：待達成之細胞反應類型及程度；所採用特定抗α-烯醇酶抗體或其組合物之活性；患者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及膳食；投藥時間、投藥路徑及抗α-烯醇酶抗體或其組合物的排泄速率；治療之持續時間；與抗α-烯醇酶抗體或其組合物組合或同時使用之藥物；及醫療技術中所熟知的類似因素。
以上經識別組合物及治療方法中之每一者可另外包括另外抗念珠菌、抗鏈球菌或抗葡萄球菌藥物。在一些實施例中，適用於與本發明一起使用之抗念珠菌藥物包括(但不限於)氟康唑、伊曲康唑(itraconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、棘白菌素卡泊芬淨(echinocandins caspofungin)、米卡芬淨(micafungin)、阿尼芬淨(anidulafungin)、伏立康唑(voriconazole)、雙性黴素B(amphotericin B)之脂質調配物、酮康唑(Ketoconazole)、克黴唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、環吡酮(ciclopirox)、咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)及耐絲菌素(nystatin)。在治療方法中，本發明之抗α-烯醇酶抗體可與另外一或多種抗念珠菌、抗鏈球菌或抗葡萄球菌藥物同時、隨後或分別投與。
念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌感染之診斷
本發明出人意料地發現抗CaENO1抗體(CaS1)為抗念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌感染之有效診斷劑或治療性治療。相應地，在另一態樣中，本發明提供一種用於在個體之生物樣品中診斷念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌感染之方法，其包含使本發明之抗CaENO1抗體與生物樣品接觸，及偵測抗CaENO1抗體與本發明CaENO1之抗原決定基的結合，其中結合存在指示個體懷疑患有念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌感染。可替代地，本發明提供一種用於在個體之生物樣品中診斷念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌感染之方法，其包含使本發明之抗原決定基序列與該生物樣品接觸，及偵測本發明之抗原決定基序列與抗CaENO1抗體的結合，其中結合存在指示個體懷疑患有念珠菌感染。
本發明中，偵測包括定量及定性偵測。定性偵測之實例包括以下：簡單偵測存在或不存在抗CaENO1抗體與本發明CaENO1之抗原決定基的結合；判定結合是否超過一定量存在；及比較結合量與其他樣品之結合量(例如，對照樣品)。
用於本發明之診斷性方法的生物樣品不受特定限制，只要其為可含有CaENO1蛋白質之樣品。特定地，自生物(諸如哺乳動物)身體收集之樣品為較佳的。自人類收集之樣品更佳。測試樣品之特定實例包括血液、間質液、血漿、腦脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿液、組織及腹水。
在本發明中，「對照」係指充當供比較用之標準物的樣品，包括陰性對照及來自健康個體之生物樣品。陰性對照可藉由收集來自健康個體之生物樣品且視需要將其混合來獲得。在對照中的抗CaENO1抗體與CaENO1之抗原決定基的結合水準可與個體之生物樣品中的結合水準並行地偵測。可替代地，藉由事先偵測許多健康個體之生物樣品中的結合水準，健康個體中標準物表現水準可以統計方式測定。
在本發明中，結合水準可利用任何方法測定。用於偵測測試樣品中之結合的方法不受特定限制。提供使用抗CaENO1抗體用於偵測之免疫方法，諸如放射免疫分析(RIA)；酵素免疫分析(EIA)；螢光免疫分析(FIA)；發光免疫分析(LIA)；免疫沈澱(IP)；濁度免疫分析(TIA)；西方墨點法(WB)；免疫組織化學(IHC)方法；及單向放射免疫擴散法(SRID)。
本發明亦提供用於診斷念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌感染之診斷劑或套組，其包含用於偵測測試樣品中抗CaENO1抗體與CaENO1結合的診斷劑。本發明之診斷劑包含至少念珠菌感染。
用於診斷癌症之套組可藉由將診斷念珠菌感染之試劑與用於偵測抗CaENO1抗體之另一要素組合來產生。更具體言之，本發明係關於用於診斷念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌感染之套組，其包含結合至CaENO1之抗CaENO1抗體及用於偵測該抗體與CaENO1之間結合的試劑。另外，描述量測操作之說明書可隸屬於本發明之套組。
實例 材料及方法 His-CaENO1蛋白質之表現及純化
簡言之，白色念珠菌α-烯醇酶基因在pQE30質體中建構，形成pQE30-CaENO1載體，且接著所得載體轉型大腸桿菌BL21細胞。細菌培養物在含有胺苄青黴素(ampicillin)(50μg/ml)之10ml LB培養基中在37℃生長隔夜，在相同LB培養基中稀釋10倍，且進一步生長至OD6oo達至0.6與1.0之間。為誘發CaENO1蛋白質表現，添加異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)至培養物中達0.5mM之最終濃度。細胞集結粒再懸浮於含有1% Triton x-100之2ml 1×PBS中，且藉由三個循環之冷凍(-70℃)及解凍(37℃)溶解。在離心之後，所得細胞溶解物與帶Ni2+之樹脂管柱一起培育以根據製造商之說明書(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden)純化His-CaENO1蛋白質。來自人類、小鼠、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌之ENO1以相同方式表現及純化。
動物免疫接種
雌性白色來亨雞(Gallus domesticus)用50g純化His-CaENO1於相等體積之弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)(Sigma,USA)中由肌肉內注射免疫。用His-CaENO1於弗氏不完全佐劑中的三次另外免疫接種以7天間隔進行。在各免疫接種之後，於蛋黃中之多株IgY抗體經部分純化，且藉由酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)滴定，以測定體液抗his-CaENO1免疫反應之存在。如先前所述，使用10%硫酸葡聚糖自與蛋白分離之卵黃純化IgY抗體(Akita EM,Nakai S.Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E.coli strain.J Immunol Methods 1993；160：207-14；Akita EM,Nakai S.Production and purification of Fab' fragments from chicken egg yolk immunoglobulin Y(IgY).J Immunol Methods 1993；162：155-64)。純化 之IgY抗體溶解於5ml含有0.05%疊氮化鈉之TBS中且在-20℃儲存。
建構scFv抗體庫及淘選
該抗體庫係基於先前報告(Andris-Widhopf J,Rader C,Steinberger P等人Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display.J Immunol Methods 2000；242：159-81)建立。簡言之，最終免疫接種後自雞採集之脾即刻置放於Trizol(Gibco BRL.,USA)中均質化。10μg之總體RNA使用SuperScript RT套組(Invitrogen,USA)反轉錄成第一股cDNA。在使用雞特異性引子擴增之後，重鏈及輕鏈可變(VH及VL)區之PCR產物經第二輪PCR，形成具有短或長連接子之全長scFv片段，其進一步用SfiI消化且選殖至pComb3X載體中。重組噬菌體DNA藉由電穿孔(來自Bio-Rad之MicroPulser)轉型至大腸桿菌ER2738菌株中。重組噬菌體之產生藉由添加野生型VCS-M13輔助噬菌體開始，隨後用4%聚乙二醇8000及3% NaCl(w/v)沈澱，且最後再懸浮於含有1%牛血清白蛋白(BSA)之1×磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。接著，將scFv抗體庫中的1011個溶菌斑形成單位(pfu)之重組噬菌體添加至預塗佈有純化His-CaENO1蛋白質(0.5微克/孔)之孔中，且在37℃下培育2小時。在未結合噬菌體移除之後，結合噬菌體用0.1M HCl/甘胺酸(pH 2.2)/0.1% BSA溶離，用2M Tris鹼緩衝劑中和，且用於感染大腸桿菌ER2738菌株。如上文所描述，擴增噬菌體經沈澱，且回收以用於下一輪選擇。在第4次生物淘選之後，來自大腸桿菌ER2738之總體噬菌粒DNA經純化，且轉型至大腸桿菌TOP10F'中。一組隨機選擇之純系經培養隔夜，在含有1mM MgCl2及胺苄青黴素(50μg/ml)之超級培養液中稀釋100×，且進一步生長8小時。在用1mM異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)誘發隔夜之後，細菌經由離心採集，再懸浮於組胺酸(His)-結合緩衝液(20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH7.4)中，且藉由3次循環之 冷凍、解凍/音波處理溶解。scFv抗體使用帶Ni2+之瓊脂糖(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden)根據製造商之說明書純化。純化scFv抗體進一步在1×PBS中使用Amicon Ultra-4離心過濾裝置(Merck Millipore,Germany)濃縮，且檢測其抗白色念珠菌之結合或中和能力。
白色念珠菌生長及菌絲形成
為測定scFv抗體對細胞生長及菌絲形成之作用，將抗CaENO1 IgY(0.5mg/mL)或CaS1 scFv(0.5mg/mL)或PBS與白色念珠菌(1 x 106cfu)在37℃下一起預培育1小時。在培育之後，將1μl各混合物於10倍稀釋液中點樣於YPD瓊脂盤上，且在37℃下培育隔夜。將103cfu白色念珠菌與0(1×PBS對照)、10或100μg/ml CaS1 scFv在室溫下混合1小時。其後，將1μl各混合物點樣於YPD瓊脂盤上，且在37℃下培育5天。
念珠菌屬菌株
白色念珠菌(SC 5314)、克柔念珠菌(臨床分離株)、熱帶念珠菌(BCRC 20520)、近平滑念珠菌(BCRC 20515)及光滑念珠菌(BCRC 20586)由來自Taipei Medical University,Taipei,Taiwan之博士Ching-Hua Su友善提供。白色念珠菌(CA6-17、CA7-26、CA7-3、CA10-50、CA7-30、CA10-65)、熱帶念珠菌(CT11-52、CT6-29、CT6-50、CT12-54)、光滑念珠菌(CG5-8、CG8-11、CG7-37、CG5-66)及近平滑念珠菌(CP8-20、CP12-37、CP6-20、CP7-17、CP8-48)由Department of Laboratory Medicine,Wan Fang Hospital,Taipei Medical University,Taipei,Taiwan友善提供。念珠菌物種在YPD培養基中培養，且其身分藉由CHROMagar念珠菌盤(CHROMagar,Paris,France)確認。使用MIC測試條，且MIC在如製造商所建議之80%抑制下讀取。
西方墨點法
為偵測ENO1蛋白質之存在，純化重組ENO1蛋白質或五種念珠菌屬之細胞溶解物經受SDS-PAGE分析，轉移至硝化纖維素薄膜(Amersham Biosciences,UK)上，且接著用含5%脫脂牛奶之TBST阻斷1小時。添加在第7次免疫接種(1：3,000)之後的來自雞之抗-CaENO1 IgY或純化CaS1 scFv抗體(1μg/ml)，且在室溫下培育1小時。在劇烈洗滌之後，添加辣根過氧化酶(HRP)結合多株驢抗雞IgY抗體(1：3,000)(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,USA)，且培育另外1小時以偵測結合IgY抗體。然而，山羊抗雞輕鏈抗體(1：3,000)(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,USA)，隨後HRP結合驢抗山羊IgG抗體(Jackson ImmunoResearch,USA)用於偵測結合scFv抗體。在如上洗滌之後，薄膜用二胺基聯苯胺(DAB)或ECL受質顯色。ImageQuant LAS4500用於ECL強度偵測。
ELISA及競爭性ELISA
為檢查其結合反應性，自第7次免疫接種之後之雞純化的一系列稀釋IgY抗體(500-256,000倍)或重組CaS1 scFv抗體(40-0.078μg/ml)與固定於ELISA培養盤孔上之純化CaENO1(10μg/ml)一起培育。在劇烈洗滌之後，結合IgY抗體藉由添加HRP結合多株驢抗雞IgY抗體(1：3,000)(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,USA)偵測，同時結合CaS1 scFv抗體藉由山羊抗雞輕鏈抗體(1：3,000)(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,USA)，接著HRP結合驢抗山羊IgG抗體(Jackson ImmunoResearch,USA)偵測。在如上洗滌之後，四甲基聯苯胺(TMB)受質溶液(Sigma,USA)添加至孔中用於顯色。反應用1N HCl停止，且光學密度在450nm下使用ELISA盤讀取器(BioTek Synergy HT)量測。分解常數(KD)根據方程式公克/分子量(Da)×體積(L)-1計算。
對於競爭性ELISA，進行上述程序，除了一系列稀釋CaENO1蛋白質(50-0.097μg/ml)首先與相等體積之CaS1 scFv抗體(1μg/ml)混合1 小時，且添加至盤中以用於偵測結合特異性以外。ELISA測試在用於各樣品之重複孔中進行。ELISA資料呈現為重複實驗之平均值±SD。
纖維蛋白基質-凝膠降解分析
製備基質凝膠用於纖維蛋白溶解活性偵測33。白色念珠菌(106個細胞)經洗滌，且與或不與CaS1 scFv(10及100μg)在37℃下一起培育1小時。在培育之後，細胞經洗滌，且與纖維蛋白溶酶原(10μg)一起培育30min。混合物用PBS洗滌以移除自由纖維蛋白溶醇原。所得細胞集結粒置放於含有1.25%低熔化溫度瓊脂糖、凝血酶(0.05U/ml,Sigma)及纖維蛋白原(2mg/ml,Sigma)之基質凝膠中。凝膠在潮濕室中在37℃下培育10-14小時，直至出現指示纖維蛋白溶解活性之存在的清楚斑點。
附著分析
細胞附著分析使用人類口腔表皮細胞(OECM-1)(XXX)進行。白色念珠菌(1×106cfu)與CaS1 scFv抗體(50或100μg)在37℃下一起預培育1小時。在培育之後，混合物經兩倍稀釋，且添加至96孔盤中培養之104個OECM-1細胞上。盤進一步在4℃下培育2小時。在用1×PBS洗滌3次之後，盤用10%甲醛固定。在如上洗滌之後，孔用脫脂牛奶阻斷1小時。其後，添加兔子抗白色念珠菌抗體(1：3,000,Bethyl,USA)，且培育另外1小時，接著添加HRP結合抗兔子抗體(1：3,000,Bethyl,USA)。如上洗滌始終在步驟之間進行。TMB用於顯色，用1N HCl停止。色彩之強度在450nm下在ELISA盤讀取器上量測。
白色念珠菌感染之小鼠模型
總計20隻重約30g之ICR雌性小鼠(購自National Laboratory Animal Center,Taiwan)隨機地分組，每組5隻小鼠。白色念珠菌生長隔夜，且在生理鹽水中洗滌。四組小鼠經由側尾靜脈用以下製劑處理：(i)僅1×PBS；(ii)與50μg CaS1一起預培育之1×106cfu白色念珠菌 細胞；(iii)與100μg CaS1一起預培育之1×106cfu白色念珠菌細胞；(iv)與抗CaENO1 IgY一起預培育之1×106cfu白色念珠菌細胞。小鼠存活在1天間隔下監測10天。所有小鼠之處理及操作根據由臺北醫學大學(Taipei Medical University)之機構動物護理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)核准之動物實驗協定進行。
實例1 His白色念珠菌α-烯醇酶(his-CaENO1)之融合蛋白質之表現及純化
白色念珠菌α-烯醇酶基因在pQE30質體中建構，形成pQE30-CaENO1載體，且接著所得載體用大腸桿菌BL21細胞轉型。細胞之表現用IPTG在濃度1.0mM、0.5mM及0.1mM下誘發4小時、5小時、8小時及隔夜。發現表現蛋白質藉由SDS-PAGE(圖1A)及西方墨點分析(圖1B)具有約49kDa之分子量。
白色念珠菌α-烯醇酶基因在pQE30質體中建構，形成pQE30-CaENO1載體，且接著所得載體用大腸桿菌BL21細胞轉型。細胞之表現用IPTG在濃度1.0mM、0.5mM及0.1mM下誘發4小時、5小時、8小時及隔夜。發現表現蛋白質藉由SDS-PAGE及西方墨點分析具有約49kDa之分子量。為確認上述表現蛋白質為所需CaENO1蛋白質，實例1中獲得之蛋白質用Ni SepharoseTMHigh Performance純化，該純化蛋白質藉由SDS-PAGE分析，且具有49kDa之蛋白質確認為His-CaENO1(圖1C)。
實例2 His-CaENO1 IgY多株抗體與抗原His-CaENO1之結合分析
50μg實例1之純化His-CaENO1蛋白質向雞投與，產生抗his-CaENO1 IgY多株抗體。多株抗體藉由SDS-PAGE及西方墨點分析自蛋純化。純化抗體之結合能力藉由西方墨點法及醇聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)分析。在ELISA分析中，BSA用作陰性對照，小鼠抗his IgG用作第一抗體，且HRP兔子抗小鼠IgG用作第二抗體。在西方墨點分析之後，特異性結合至His-CaENO1之抗his-CaENO1 IgY多株抗體在免疫接種3次之後產生，且結合能力隨著各輪免疫接種增加。
實例3 雞抗CaENO1 IgY之結合活性、抗CaENO1庫建構及淘選
雞抗CaENO1 IgY之體液性免疫反應藉由ELISA及西方墨點法識別(圖2B)。與預免疫血清及不相關BSA蛋白質相比，第7次免疫接種(500-256000倍稀釋)之後的IgY辨識CaENO1。(圖2A)
兩個具有短連接子及長連接子之庫如表1中展示建構。短及長連接子庫之尺寸分別估計為2.4×106及1.36×107。展示在各淘選之後的溶離滴定量(表1)。在四輪淘選之後，CaENO1結合噬菌體變異體經極大地增濃。此等結果表明非特異性結合噬菌體在淘選過程中得以移除，且具有特異性結合親和力之純系經增濃。序列經確認屬於雞免疫球蛋白生殖系基因。對CaENO1具有最高結合活性之短連接子經識別。此抗CaENO1 scFv單株抗體命名為CaS1。
Figure 105110703-A0202-12-0029-10
7 aa及18 aa之*連接子長度分別為GQSSRSS(SEQ ID NO：17)及GQSSRSSGGGGSSGGGGS(SEQ ID NO：18)。
實例3 scFv抗體之基因定序
自雞純化之抗體包括構架區(FR)及互補決定區(CDR)。群落#1S1至#1S12經分離，且使用ompseq引子(5'-AAGACAGCTATCGCGATTGCAGTG-3')定序，且定序結果藉由BioEdit軟體分析，且接著所得序列與雞生殖系進行比較。發現十種純系中之抗體在輕鏈及重鏈中具有相同序列(圖3)。
實例4 CaS1 scFv之表現及純化.
來自最後生物淘選之總體噬菌粒DNA轉型至TOP10F'大腸桿菌中以分析個體scFv。含有scFv基因片段之群落經選擇，且在10mL LB(Lauria-Bertani)培養液(50μg/mL胺苄青黴素)中在振盪下在37℃下培養隔夜；接著培養物轉移至另一100mL LB(具有50μg/mL胺苄青黴素)中，直至OD600達至0.4至0.8之間。其後，所得培養物與0.5mM IPTG一起培育6-8小時，以表現His標記之CaS1 scFv蛋白質。接著，培養物經受離心，且丟棄清液層，且集結粒用1mL之His結合緩衝液(20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)再懸浮。大腸桿菌細胞經音波處理破壞；接著，樣品經受3000g離心5分鐘。隨後，清液層中CaS1 scFv融合蛋白質藉由如製造商所建議之Ni SepharoseTM High Performance(GE healthcare Life science,USA)純化。簡言之，樣品清液層添加至瓊脂糖，混合1小時，且經受1000g離心5分鐘。丟棄清液層。瓊脂糖用1mL His結合緩衝液洗滌2次，獲得洗液1及洗液2。500μL之His溶離緩衝液添加至瓊脂糖，且混合1小時。瓊脂糖經受1000g離心5分鐘，且收集清液層(溶離液1)。重複以上步驟，獲得溶離液2。溶離液1及2含有純化His-CaS1 scFv。最後，瓊脂糖再懸浮於50μL之His結合緩衝液中。結合清液層、洗液1、洗液2、溶離液1、溶離液2及瓊脂糖之部分藉由12% SDS PAGE分析(圖4)。
實例5 藉由ELISA及競爭性ELISA測定CaS1 scFv之K D .
0.25μg之His-CaENO1添加至96半區盤之各孔，且盤在37℃下培育1小時以使蛋白質吸附至孔之底部。丟棄蛋白質，且5%脫脂牛奶添加至孔中，且盤在37℃下培育1小時以用於阻斷。同時，1μg/mL CaS1與來自50μg/mL自由形式His-CaENO1之各2倍及10次連續稀釋樣品(亦即50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、0.19μg/mL之自由形 式His-CaENO1)在室溫下一起培育1小時。接著，此等樣品添加至上述經塗佈且阻斷孔中，且在37℃下培育1小時以用於進行競爭反應。其後，孔用PBST洗滌6次；接著向其中添加山羊抗雞輕鏈(1：3000稀釋)，且在37℃下培育1小時。其後，孔用PBST洗滌6次；接著向其中添加驢抗山羊HRP抗體(1：5000稀釋)，且在37℃下培育1小時。其後，孔用PBST洗滌6次；接著色彩反應藉由添加3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)開始，且反應藉由1N HCl終止。偵測在450nm波長下之吸光率，獲得OD450。為測定CaS1與CaENO1之結合活性，進行ELISA(圖5A-B)及競爭性ELISA(圖5C-D)。如圖5A及5B所見，CaS1 scFv抗體與CaENO1之結合活性為濃度依賴性的，且如藉由ELISA及競爭性ELISA所量測，KD分別為1.88×10-8M及8.9×10-8M。
實例6 CaS1 scFv結合至白色念珠菌及熱帶念珠菌之細胞溶解物
評價此CaS1 scFv與不同物種之念珠菌的結合活性。獲得五種念珠菌之常見菌株，五個物種念珠菌之總體溶解物以SDS-PAGE(圖6A左側)及隨後西方墨點法分析。如圖4A中間所見，抗CaENO1多株IgY能夠識別正如所期望測試的五個物種之念珠菌。然而，CaS1 scFv可僅與如圖6A右側色帶1中所見白色念珠菌及如色帶3中所見熱帶念珠菌反應。此CaS1 scFv無法與克柔念珠菌(色帶2)、近平滑念珠菌(色帶4)及光滑念珠菌(色帶5)反應。在白色念珠菌與熱帶念珠菌之間的ENO1蛋白質序列為83%同源性，因此，CaS1可辨識白色念珠菌以及熱帶念珠菌的原因可表明此等兩個物種共用可結合至CaS1 scFv之類似抗原決定基。
另外，吾等自臨床檢測CaS1 scFv與耐氟康唑及敏感念珠菌屬的結合活性。念珠菌屬及其MIC列舉於表2中。如圖4D-G中展示，CaS1 scFv可結合至耐氟康唑且敏感白色念珠菌(圖6B)及熱帶念珠菌(圖6C)，但未結合至光滑念珠菌及近平滑念珠菌(資料未示出)。此等資 料表明CaS1 scFv可潛在地用於診斷及/或治療耐氟康唑白色念珠菌及熱帶念珠菌。
另外，如圖6D中所見，吾等亦觀測到CaS1 scFv可結合至不同物種之ENO1。用於白色念珠菌(CaENO1)、肺炎鏈球菌(SpENO1)、金黃色葡萄球菌(SaENO1)、小鼠(mENO1)及人類(hENO1)的ENO1經純化，且經受SDS-PAGE(圖6D左側)及西方墨點法(圖6D右側)。CaS1 scFv不僅結合CaENO1並且結合SpENO1及SaENO1，但極少結合至mENO1及hENO1(圖6D右側)。此等結果表明來自白色念珠菌、肺炎鏈球菌及金黃色葡萄球菌之ENO1可共用可結合至CaS1 scFv之類似抗原決定基。
Figure 105110703-A0202-12-0032-12
實例7 用於識別白色念珠菌之細胞表面上抗α-烯醇酶CaS1抗體的流動式細胞測量術分析
抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及對照scFv與白色念珠菌接觸，且接著經受流動式細胞測量術分析。抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及對照scFv展示89.7 +/- 2.8%、46.64 +/- 3.1%及23 +/- 2.3% FITC螢光反應(圖7A)，表示抗體可結合至白色念珠菌表面上之α-烯醇酶。此外，用於染色之碘化丙錠用於識別白色念珠菌之死亡率，且發現抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及對照scFv殺死90 +/- 1.5%、37 +/- 0.8%、21 +/- 1%之白色念珠菌(圖7A)。如圖7B中展示，與對照svFv及抗CaENO1 IgY相比，scFv CaS1可結合至白色念珠菌表面上之α-烯醇酶，且因此殺死白色念珠菌。
實例8用於識別白色念珠菌之細胞表面上抗α-烯醇酶CaS1抗體的免疫螢光法分析
抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及對照scFv用於免疫螢光法分析以用於識別白色念珠菌細胞表面上之抗α-烯醇酶CaS1抗體。如圖8中展示，抗CaENO1 IgY(1)及scFv CaS1(2)結合至白色念珠菌表面上之α-烯醇酶，然而對照scFv(3)未展示結合。
實例9 藉由CaS1 scFv之白色念珠菌生長及菌絲形成之衰減
吾等評價CaS1對白色念珠菌生長的影響，吾等將CaS1 scFv與白色念珠菌一起預培育，且塗覆於瓊脂上。如圖9A所見，如在YPD瓊脂盤上所觀測，當稀釋至10-4時，與對照相比，CaS1 scFv減少白色念珠菌生長。抗CaENO1 IgY之抑制性效應與scFv CaS1 scFv一樣好。
菌絲形成亦展示在白色念珠菌之毒性中發揮了關鍵作用。因此吾等進一步研究CaS1 scFv是否影響菌絲形成。吾等將CaS1 scFv與白色念珠菌一起預培育，且檢測群落形態。如圖9B中所見，沿著對照群落之邊緣，菌絲清楚地可見，然而對於經CaS1 scFv處理之群落，極少或幾乎沒有觀測到菌絲。當CaS1 scFv與白色念珠菌一起預培育時，菌絲形成之衰減效應為顯而易見的。
實例10抑制白色念珠菌結合至人類口腔角質細胞OECM-1細胞
白色念珠菌細胞(1×106)分別用50μg及100μg之scFv CaS1處理，且所得混合物添加至人類口腔角質細胞OECM-1細胞以測試白色念珠菌細胞與OECM-1細胞之結合能力。與PBS對照相比，50μg及100μg之scFv CaS1顯著減少白色念珠菌細胞與OECM-1細胞之結合(圖10)。
實例11 CaS1 scFv對ENO1與纖維蛋白溶酶原之結合的作用
熟知表面ENO1充當纖維蛋白溶酶原受體32，結合至纖維蛋白溶酶原將使其活化成為纖維蛋白溶酶，且導致凝膠中所含纖維蛋白原(細胞外基質)降解。吾等進行基質凝膠研究以測試CaENO1-纖維蛋白溶酶原締合(association)之可能生物學意義，且觀測CaS1 scFv對此結合(binding)之作用。
代表性盤可見於圖11中。在不存在纖維蛋白溶酶原之情況下，僅念珠菌(圖11-1)或僅CaS1 scFv(圖9-6)並未展示纖維蛋白溶解活性。白色念珠菌與1及10μg之纖維蛋白溶酶原一起培育，導致纖維蛋白溶解活性顯著增加(圖11-2及11-3)。此結果表明CaENO1結合纖維蛋白溶酶原可藉由存在於基質凝膠中之凝血酶活化，以消化周圍纖維蛋白原。然而，與僅存在纖維蛋白溶酶原相比，如圖11-4及11-5中展示，纖維蛋白溶解活性可藉由將白色念珠菌與CaS1(10及100μg)一起預培育而受到顯著抑制。抑制凝膠中纖維蛋白原之降解為顯而易見的。吾等之結果表明CaENO1與纖維蛋白溶酶原之結合藉由CaS1 scFv抗體以劑量依賴性方式顯著減少。
實例12 白色念珠菌毒性藉由ScFv CaS1中和以延長感染小鼠之存活率
1×106個細胞之白色念珠菌溶液與100μg抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及對照scFv中之每一者混合，且接著注射至ICR小鼠中(每組5隻小鼠)。在10天之後，抗CaENO1 IgY、scFv CaS1及對照scFv組之存活 率分別為100%、80%及0%。發現抗CaENO1 IgY及scFv CaS1可中和白色念珠菌之毒性，且因此可延長小鼠之壽命或保護小鼠免於死亡。
實例13 藉由CDR移植之CaS1 scFv之人類化
設計兩種人類化CaS1 scFv(V1及V3)。人類化CaS1 scFv V1移植至人類構架(蛋白質資料庫：2JIX-L、2ZKH-H)上，此最適合之長度序列藉由Discovery Studio軟體分析。人類化CaS1 scFv V3移植至人類構架Avastin®(蛋白質資料庫：2FJG)之序列上。此等人類化CaS1 scFv(V1及V3)藉由Gemonics BioSci & Tech(New Taipei City,Taiwan)合成，選殖至pComb3X載體中，且轉移至Top 10大腸桿菌中用於蛋白質表現。表現之V1及V3蛋白質藉由Ni+瓊脂糖純化且藉由SDS-PAGE及西方墨點法分析。
如圖12中所展示結果，人類化CaS1 scFv V1(圖13A)及V3(圖13B)抗體經設計以合成具有靶基因之質體DNA，且DNA接著轉移至Top 10大腸桿菌中以用於表現。接著，表現之蛋白質用Ni+瓊脂糖純化，且藉由SDS-PAGE分析。之後，表現之蛋白質藉由西方墨點法(抗HA標籤)確認。
實例14 測定CaENO1與hzCaS1 V1及V3之結合能力
hzCaS1 V1、V3及CaS1 scFv用於識別重組CaENO1蛋白質。如圖13中展示，(A)庫馬斯藍用於染色；(B)小鼠抗人類κ、λ IgG及HRP結合兔子抗小鼠IgG用於西方墨點法(右圖)；(C)使用小鼠抗HA IgG及HRP結合兔子抗小鼠IgG；及(D)使用山羊抗雞輕鏈IgG及HRP結合驢抗山羊IgG。色帶1：hzCaS1 scFv V1。色帶2：hzCaS1 scFv V3。色帶3：CaS1 scFv。
實例15 藉由ELISA測定hzCaS1 V1及V3 scFv之K D
純化hzCaS1 V1及V3 scFv用於識別重組CaENO1蛋白質。hzCaS1 V1及V3 scFv用作經系列稀釋之初級抗體。山羊抗雞輕鏈IgG用作二 級抗體。HRP結合驢抗山羊IgG用於偵測(參看圖14(A)及(C))。OD值計算為百分比。計算scFv之KD或50%有效濃度(EC50)且藉由莫耳濃度(M)表示。hzCaS1 V1及V3 scFv之KD分別為1.51μg/ml=4.6×10-8M及2.12μg/ml=8.4×10-8M。ELISA資料表示為重複孔之平均值±SD(參看圖14(B)及(D))。
實例16 CaS1、hzCaS1 V1及V3 scFv抑制CaENO1結合至纖維蛋白溶酶原
Ni+瓊脂糖上之CaENO1用100μg hzCaS1 V1、V3及CaS1 scFv處理1小時，接著用纖維蛋白溶酶原(20μg)培育1小時。具有CaS1 scFv之各實驗組CaENO1滴落至凝膠上，且在室溫下培育2天，觀測凝膠降解結果，結果展示於圖15中。圖15-1如凝膠中所見，在僅存在纖維蛋白溶酶原(1μg/μl)(陽性對照)下展示顯著纖維蛋白溶解活性。圖15-2在無纖維蛋白溶酶原之僅Ni SepharoseTM(10μg)(陰性對照)上之CaENO1在凝膠中不展示纖維蛋白溶解活性。圖15-3在具有纖維蛋白溶酶原(20μg)之SepharoseTM(10ug)上之CaENO1展示纖維蛋白溶解活性。與15-3相比，圖15-4、15-5、15-6在用hzCaS1 V1(圖15-4)、V3(圖15-5)、CaS1 scFv(圖15-6)(100μg)處理且與纖維蛋白溶酶原(20μg)一起培育之SepharoseTM(10μg)上之CaENO1不展示纖維蛋白溶解活性。因此，結果表明CaENO1結合纖維蛋白溶酶原可藉由存在於基質凝膠中之凝血酶活化，以消化周圍血纖維蛋白原。然而，與如圖15-3中展示在纖維蛋白溶酶原存在下相比，纖維蛋白溶解活性可藉由將CaENO1與hzCaS1 V1、V3、CaS1 scFv一起預培育而受到顯著抑制。抑制凝膠中纖維蛋白原之降解為顯而易見的(圖15-4、15-5、15-6)。吾等之結果表明CaENO1與纖維蛋白溶酶原之結合藉由hzCaS1 V1、V3、CaS1 scFv抗體顯著減少。
實例17 使用CaS1 scFv進行CaENO1之抗原決定基定位
九個PCR擴增片段使用全長CaENO1(1323bp)作為模板獲得，接合至PET-21a載體且轉型至BL-21大腸桿菌中。插入片段之身分藉由定序確認(Genomics BioSci & Tech,New Taipei City,Taiwan)。蛋白質表現藉由IPTG誘發進行。SDS-PAGE及西方墨點法用於表徵經表現之重組蛋白質。
對於CaENO1之抗原決定基定位，純化CaS1 scFv用於識別西方墨點法及ELISA上之重組CaENO1蛋白質。抗原決定基區域經定位含有198bp核苷酸，其所推導胺基酸序列(殘基235至300)為DKAGYKGKVGIAMDVASSEFYKDGKYDLDFKNPESDPSKWLSGPQLADLYEQLISEYPIVS IEDPF(SEQ ID NO：19)(66個胺基酸)。
為進一步測定抗原決定基位置，定點突變誘發(孔克爾方法(Kunkel method))用於根據上文所提及具有少量修飾之198bp經定位抗原片段之核苷酸序列建構9個胜肽表現噬菌體(基於Phage Display-A Practical Approach之「Chapter 2,Constructing phage display libraries by oligonucleotide-directed mutagenesis」，由Tim Clackson及Henry B.Lowman編輯，OXFORD University Press 2004)。攜有編碼抗原抗原決定基之核苷酸序列的經修飾pCANTAB 5E DNA轉型至ER2738大腸桿菌中。噬菌粒DNA自大腸桿菌提取，且針對用EcoRI酶限制插入進行分析。檢測病毒粒子表面上表現10種胺基酸之各所得噬菌體在ELISA上抗CaS1 scFv抗體之反應性。組合結果展示CaS1 scFv辨識位於240KGKVGIAMDV249(SEQ ID NO：3)及278PQLADLYEQLISEYP292(SEQ ID NO：4)中之抗原抗原決定基上的胺基酸殘基。
九種如上重組CaENO1蛋白質用於辨識點漬墨法(dot blot)上之純化纖維蛋白溶酶原。結果展示CaS1 scFv抗體結合至跨越胺基酸殘基301至437之纖維蛋白溶酶原片段，該等胺基酸殘基301至437序列為AEDDWDAWVHFFERVGDKIQIVGDDLTVTNPTRIKTAIEKKAANALL
Figure 105110703-A0202-12-0038-13
(SEQ ID NO：20)。以上結果展示於圖16中。
實例18 CaS1 scFv延長感染白色念珠菌之ICR小鼠的存活率
吾等評價動物模型上CaS1之存活率。起初ICR小鼠經尾部靜脈注射僅具有PBS之1×106個細胞之白色念珠菌或與CaS1(10及100μg)在37℃下一起預培育一小時之細胞。如圖17中所見，與PBS對照相比，與CaS1(10及100μg)一起預培育將小鼠存活率分別延長至40%及80%。抗百步蛇(Deinagkistrodon acutus)scFv(抗DA)為針對蛇毒之抗體，其用作不相關scFv對照。此等資料表明CaS1 scFv在ICR小鼠上提供抗念珠菌血症之致死攻擊的部分保護活性。
實例19白色念珠菌生物膜形成抑制分析
白色念珠菌細胞在YPD培養基中培養，且接著收集。細胞用PBS洗滌，且再懸浮於含有100mM葡萄糖細胞密度為107個細胞/毫升之YPD培養基中。96孔盤用CaS1 scFv或氟康唑處理，且接著用1ml細胞懸浮液接種。在兩個小時附著時段之後，接種液藉由用PBS洗滌來移除，且含有100mM葡萄糖之YPD培養基塗覆至盤。盤用CaS1 scFv或氟康唑處理，且生物膜在37℃下生長72小時。盤用PBS洗滌，且接著生物膜形成藉由顯微法觀測(圖18)。
<110> 臺北醫學大學
<120> 抗感染疾病之抗體
<130> T54267/US3387
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 白色念珠菌屬
<400> 1
Figure 105110703-A0202-12-0039-15
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 白色念珠菌屬
<400> 2
Figure 105110703-A0202-12-0039-16
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 白色念珠菌屬
<400> 3
Figure 105110703-A0202-12-0039-17
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 白色念珠菌屬
<400> 4
Figure 105110703-A0202-12-0039-18
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> L-CDR1
<400> 5
Figure 105110703-A0202-12-0039-19
Figure 105110703-A0202-12-0040-20
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> L-CDR2
<400> 6
Figure 105110703-A0202-12-0040-24
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> L-CDR3
<400> 7
Figure 105110703-A0202-12-0040-21
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> H-CDR1
<400> 8
Figure 105110703-A0202-12-0040-22
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> H-CDR2
<400> 9
Figure 105110703-A0202-12-0040-23
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> H-CDR3
<400> 10
Figure 105110703-A0202-12-0041-25
<210> 11
<211> 103
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 抗CaENO1 scFv單株抗體(CaS1)之輕鏈中所包含之胺基酸序列
<400> 11
Figure 105110703-A0202-12-0041-27
<210> 12
<211> 128
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 抗CaENO1 scFv單株抗體(CaS1)之重鏈中所包含之胺基酸序列
<400> 12
Figure 105110703-A0202-12-0041-28
Figure 105110703-A0202-12-0042-29
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hzCaS1-V1 scFv
<400> 13
Figure 105110703-A0202-12-0042-31
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hzCaS1-V3 scFv
<400> 14
Figure 105110703-A0202-12-0043-32
<210> 15
<211> 128
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hzCaS1-V1 scFv
<400> 15
Figure 105110703-A0202-12-0043-34
Figure 105110703-A0202-12-0044-35
<210> 16
<211> 128
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hzCaS1-V3 scFv
<400> 16
Figure 105110703-A0202-12-0044-37
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 抗CaENO1-S庫之連接子
<400> 17
Figure 105110703-A0202-12-0044-38
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 抗CaENO1-L庫之連接子
<400> 18
Figure 105110703-A0202-12-0045-39
<210> 19
<211> 66
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CaENO1之抗原決定基區域
<400> 19
Figure 105110703-A0202-12-0045-41
<210> 20
<211> 137
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 跨越胺基酸殘基301至437之纖維蛋白溶酶原之片段
<400> 20
Figure 105110703-A0202-12-0045-43
Figure 105110703-A0202-12-0046-44

Claims (19)

  1. 一種抗原決定基，其係由位於CaENO1中之283LYEQLIS EYP292(SEQ ID NO：1)、278PQLADLYEQL287(SEQ ID NO：2)、240KGKVGIAMDV249(SEQ ID NO：3)或278PQLADLYEQLISEYP292(SEQ ID NO：4)組成的胺基酸序列。
  2. 一種分離之抗體或其抗原結合部分，其包含以下中之至少一者：SEQ ID NO：5之輕鏈互補決定區1(L-CDR1)；SEQ ID NO：6之輕鏈CDR2(L-CDR2)；及SEQ ID NO：7之輕鏈CDR3(L-CDR3)；以及以下中之至少一者：SEQ ID NO：8之重鏈CDR1(H-CDR1)；SEQ ID NO：9之重鏈CDR2(H-CDR2)；及SEQ ID NO：10之重鏈CDR3(H-CDR3)；使得該分離之抗體或其抗原結合部分結合至CaENO1。
  3. 如請求項2之抗體或其抗原結合部分，其中該分離之抗體為單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
  4. 如請求項2之抗體或其抗原結合部分，其具有由SEQ ID NO：13或14組成之胺基酸序列的輕鏈；以及具有由SEQ ID NO：15或16組成之胺基酸序列的重鏈。
  5. 一種人類化抗體或其抗原結合部分，其包含(i)具有如選自由SEQ ID NO：13至14組成之群之胺基酸序列的輕鏈，及(ii)具有如選自由SEQ ID NO：15至16組成之群之胺基酸序列的重鏈。
  6. 如請求項5之抗體或其抗原結合部分，其包含(i)具有如SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈及(ii)具有如SEQ ID NO：15(hzCaS1-V1)之胺基酸序列的重鏈。
  7. 如請求項5之抗體或其抗原結合部分，其包含(i)具有如SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈及(ii)具有如SEQ ID NO：16(hzCaS1- V3)之胺基酸序列的重鏈。
  8. 一種醫藥組合物，其包含如請求項2至7中任一項之抗體或其抗原結合部分，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  9. 如請求項8之醫藥組合物，其進一步包含一或多種另外抗念珠菌(Candida)、抗鏈球菌(Streptococcus)或抗葡萄球菌(Staphylococcus)藥物。
  10. 如請求項9之醫藥組合物，其中該另外抗念珠菌藥物為氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、棘白菌素卡泊芬淨(echinocandins caspofungin)、米卡芬淨(micafungin)、阿尼芬淨(anidulafungin)、伏立康唑(voriconazole)、雙性黴素B(amphotericin B)之脂質調配物、酮康唑(Ketoconazole)、克黴唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、環吡酮(ciclopirox)、咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)或耐絲菌素(nystatin)。
  11. 一種如請求項2至7中任一項之抗體或其抗原結合部分的用途，其係用於製備用於個體中抑制念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌生長及治療由此引起之感染的藥物。
  12. 一種如請求項2至7中任一項之抗體或其抗原結合部分的用途，其係用於製備用於治療個體念珠菌病之藥物。
  13. 如請求項12之用途，其中該念珠菌病為侵襲性念珠菌病、抗生素性念珠菌病、腸菌區之菌群失調(dysbiosis)、甲黴菌病(onychomycosis)、皮膚念珠菌病或黏膜念珠菌病。
  14. 一種如請求項2至7中任一項之抗體或其抗原結合部分的用途，其係用於製備用於個體中抑制耐氟康唑念珠菌生長或治療由此引起之感染的藥物。
  15. 如請求項14之用途，其中該念珠菌為耐氟康唑念珠菌屬。
  16. 如請求項15之用途，其中該耐氟康唑念珠菌屬為耐氟康唑白色念珠菌(C.albicans)或熱帶念珠菌(C.tropicalis)。
  17. 一種如請求項2至7中任一項之抗體或其抗原結合部分的用途，其係用於製備用於抑制由念珠菌引起之生物膜形成的藥物。
  18. 一種如請求項2至7中任一項之抗體或其抗原結合部分的用途，其係用於製備用於診斷個體之生物樣品中念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌感染的試劑，其中該診斷包含使如請求項2至7中任一項之抗體或其抗原結合部分與該生物樣品接觸，及偵測該抗體或其抗原結合部分與如請求項1之抗原決定基的結合，其中該結合之存在指示該個體懷疑患有念珠菌感染。
  19. 一種如請求項1之抗原決定基的用途，其係用於製備用於診斷個體之生物樣品中念珠菌、鏈球菌或葡萄球菌感染的試劑，其中該診斷包含使如請求項1之抗原決定基與該生物樣品接觸，及偵測如請求項1之抗原決定基與抗CaENO1抗體的結合，其中該結合之存在指示該個體懷疑患有念珠菌感染。
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