CN100404673C - 鉴定t细胞表位的方法及制备具有降低的免疫原性的分子的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定在活的宿主体内引起免疫反应的T细胞表位的新方法。通过这种新方法，可产生当暴露于给定物种的免疫系统并与相关的未修饰化合物比较时没有免疫原性或至少具有降低的免疫原性的生物化合物。因此本发明也涉及通过本发明方法获得的新生物分子，尤其是蛋白质和抗体。

Description

鉴定T细胞表位的方法及制备具有降低的免疫原性的分子的用途
技术领域
本发明涉及鉴定在活的宿主体内引起免疫反应的T细胞表位的新方法，该方法包括使用计算机辅助方法计算肽中针对MHC II类分子结合位点的潜在T细胞表位值。本发明还涉及用于制备当暴露于宿主，优选地暴露于人时可引起免疫原性反应的生物分子，尤其是蛋白质和抗体的方法。通过这种新方法，可制备当暴露于给定物种的免疫系统并与相关的未修饰分子比较时没有免疫原性或具有降低的免疫原性的分子，方式为在所述最初具免疫原性的分子的序列中减少或去除潜在的T细胞表位。因此，本发明也涉及通过本发明方法获得的新生物分子。
背景技术
许多肽、多肽和蛋白质的治疗性应用由于它们在哺乳动物，尤其是人中的免疫原性而受到限制。例如，当鼠抗体施予没有被免疫抑制的患者时，大多数患者显示出对导入的外源物质的免疫反应，产生人抗鼠抗体(HAMA)(例如Schroff，R.W.等人(1985)癌研究(Cancer Res.)45：879-885；Shawler，D.L.等人(1985)免疫学杂志(J.Immunol.)135：1530-1535)。这将引起两个严重的后果。其一，患者的抗鼠抗体可结合治疗性抗体或免疫接合物且在治疗性抗体或免疫接合物有机会结合如肿瘤并实施其治疗功能之前将其清除。其二，患者可对鼠抗体产生变态敏感性并在将来暴露于鼠免疫球蛋白后有出现过敏性休克的危险。
已使用了一些技术来解决HAMA问题，由此可在人身上使用治疗性单克隆抗体(参见例如，WO-A-89/09622，EP-A-0239400，EP-A-0438310，WO-A-91/09967)。这些重组DNA方法通常减少最终抗体构建体中的鼠的遗传信息同时增加人的遗传信息。但是，所得的″人源化″抗体在一些情况下仍然会使患者产生免疫反应(Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2：449，456；Rebello，P.R.等人(1999)移植(Transplantation)68：1417-1420)。
这些方法的一个共同方面是向治疗性抗体，通常为啮齿动物来源的治疗性抗体中引入与存在于人抗体蛋白质中的那些氨基酸残基相同的氨基酸残基，甚至是显著量的氨基酸残基序列。对抗体，该方法可归因于不同物种间抗体分子的结构(和功能的)相对高保守性。但是对潜在的治疗性肽、多肽和蛋白质，当在宿主种(如人)中不存在结构同系物时，此类方法将不适用。而且，这些方法假定人氨基酸残基序列的一般性导入将使重构抗体成为非免疫原性的。但是，正如已知的，某些短肽序列(″T细胞表位″)可在肽、多肽或蛋白质的细胞内降解期间释放，并接下来被主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递以启动T细胞活化。对于被MHC II类呈递的肽，T细胞的活化然后可通过直接刺激产生抗体的B细胞引起抗体反应。因此，可能希望消除肽、多肽或蛋白质中的潜在T细胞表位。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫反应。明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)5：1353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94：300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)318：1409-1413)。
关于从蛋白质中消除T细胞表位以前已有公开(参见例如WO98/52976，WO 00/34317)。在现有技术中公开的通用方法包括下列步骤：
(a)确定多肽或其部分的氨基酸序列；
(b)使用任一方法在该蛋白质的氨基酸序列中鉴定出一个或多个潜在的T细胞表位，所述方法包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合；
(c)设计在已确定的潜在T细胞表位中具有一个或多个氨基酸改变的新序列变体，以实质上减少或消除T细胞表位的活性，此效果可以通过使用体外或in silico技术或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合而确定。构建此类序列变体时应避免由该序列变体产生新的潜在T细胞表位，否则再对此新的潜在T细胞表位进行改变以实质性减少或消除T细胞表位的活性；
(d)通过重组DNA技术构建此类序列变体，并试验所述变体，以鉴定一个或多个具有所希望特性的变体。
其它利用重组MHC分子与合成肽组合形成的可与来自人或实验动物受试者外周血样本的T细胞克隆结合的可溶复合体的技术已用于本领域[Kern，F.等人(1998)自然医药(Nature Medicine)4：975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫学趋势(TRENDS in Immunology)22：583-588]，这些技术也可用于表位鉴定策略。
潜在的T细胞表位一般定义为具有结合MHC II类分子的能力的任何氨基酸残基序列。可测定此类潜在的T细胞表位来建立MHC结合。隐含地，术语″T细胞表位″为这样的表位，当其结合MHC分子时可被T细胞受体识别，并且其可以至少在原则上引起这些T细胞活化。但是，通常都知道，可以将某些被发现可以结合MHC II类分子的肽保留在蛋白质序列中，因为此类肽在最终蛋白质所施用至的生物体内具免疫耐受性。
本发明旨在克服这样的实际问题：将可溶蛋白质导入欲治疗的自体宿主中时可引发免疫反应而产生结合该可溶蛋白质的宿主抗体。例子之一为干扰素α2，尽管该蛋白质为内源产生的但部分人类患者仍产生针对它的抗体[Russo，D.等人(1996)Brit.J.Haem.94：300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)318：1409-1413]。
MHC II类分子为一组在T辅助细胞的选择和活化中起中心作用的高度多态性蛋白质。人类白细胞抗原群DR(HLA-DR)为该组蛋白质的主要同种型，也是本发明的主要集中点。但是，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使相类似的作用，因此本发明同样适用于它们。MHC HLA-DR分子为同源二聚体，其中每″一半′为由α和β链组成的异源二聚体。虽然结合沟可容纳最多9-11个氨基酸，但每一异源二聚体具有一个能结合长度在9至20个氨基酸之间的肽的配体结合结构域。配体结合结构域由α链的1至85位氨基酸和β链的1至94位氨基酸组成。最近证实DQ分子具有同源结构，预期DP家族的蛋白质亦非常相似。人类已知存在DR同种型的约70种不同的同种异型，对于DQ已知存在30种不同的同种异型且对于DP已知存在47种不同的同种异型。每一个体具有二至四个DR等位基因，两个DQ和两个DP等位基因。已解析了许多DR分子的结构，这些结构揭示了一个具有一些可结合肽的疏水残基(口袋残基)的疏水口袋的敞口肽结合沟[Brown等人，自然(Nature)(1993)364：33；Stern等人(1994)自然(Nature)368：215]。确定II类分子的不同同种异型的多态性促成了肽结合沟内用于结合肽的不同表面的大量多样性，并在群体水平上确保了在识别外源蛋白质并引起对病原生物体的免疫反应的能力方面有最大的灵活性。
在配体结合结构域内有相当多的多态性，其中在不同地理人群和种族群体中具有不同的″家族″。该多态性影响肽结合结构域的结合特性，因此DR分子的不同″家族″将对具有不同序列特性的肽存在特异性，虽然可能存在一些重叠。该特异性决定了Th-细胞表位的识别(II类T细胞反应)，其最终负责驱动对B细胞表位的抗体反应，其中所述B细胞表位存在于Th-细胞表位所来自的同一蛋白质上。这样，个体对蛋白质的免疫反应很大程度上受T细胞表位识别的影响，其随个体的HLA-DR同种异型的肽结合特异性而改变。因此，为了在世界人群中鉴定蛋白质或肽中的T细胞表位，就可能希望考虑到尽可能多样的HLA-DR同种异型集合的结合特性，由此覆盖尽可能高的世界人口百分率。
诱导免疫反应的一个主要因素是在蛋白质中存在可通过在MHC II类分子上呈递刺激T细胞活化的肽。这样，为了消除或降低免疫原性，就希望鉴定并去除蛋白质的T细胞表位。
通过重组技术，使用一系列不同的宿主细胞类型可产生未修饰的生物分子，这本身为本领域熟知。但是，仍需要具有增强特性的所述生物分子的类似物。所需的增强包括所述治疗剂表达和纯化的备选方案和形式，以及特别是对蛋白质生物特性的改良。尤其需要的是增强当施用于人受试者时的体内特征。鉴于此，极为希望提供在人受试者体内具有降低的或没有诱导免疫反应的能力的所选生物分子。此类蛋白质预期将显示出在人受试者体内有增加的循环时间，并且可尤其有利于慢性或复发性疾病，如所述生物分子的许多适应症。
发明内容
本发明因此涉及两个总的方面：
(a)一种方便而有效的计算法，其可用于针对全球多种多样的MHC II类分子鉴定和计算T细胞表位，及基于该认知，设计并构建生物分子的具有改良特性的新序列变体，和
(b)欲施用的，特别是欲施用于人的，且尤其是用于治疗性用途的新生物活性分子；所述生物分子根据本发明为本发明方法所产生的免疫原性改变的多肽、蛋白质或免疫球蛋白(抗体)，其中所述改变导致生物分子在施用于人受试者后产生免疫反应的倾向降低。
具体地说，本发明涉及通过本发明方法修饰一些通常熟知的人源或非人源的具有高治疗价值的蛋白质和抗体，以产生当体内使用时较任一未修饰的对应物而言基本上没有免疫原性或具有较小免疫原性的蛋白质。根据本发明的新方法修饰的分子预期在人受试者体内可显示出增加的循环时间，并且可尤其有利于慢性或复发性疾病，如许多适应征。作为具体的实施方案并为了阐明本发明方法的有效性，本发明提供了预计在体内可显示出增强特性的所述分子的修饰形式。免疫原性改变的这些分子，即具有降低的免疫原性潜能的这些分子可用于药物组合物中。此类修饰分子在此处称为″免疫原性″改变的分子。
部分借助于计算机手段的T细胞表位鉴定方法可用于计算理论上的T细胞表位值，并由此确定出蛋白质中潜在的MHC II类分子结合肽；其中结合位点包含蛋白质中的一系列氨基酸位点。此后可修饰经确定的肽，且不显著降低，并可能地增强该蛋白质的治疗价值。该计算法包括：选择具有已知氨基酸残基序列的蛋白质的一个区域；依次从所选区域中采集具预定一致大小的并至少由三个氨基酸残基构成的重叠氨基酸残基片段(窗口)；对每一所述采集片段计算MHC II类分子结合分值；以及基于所计算的片段的MHC II类分子结合分值，鉴定至少一个适于改变的所述采集片段。然后可以改变肽的总MHC II类结合分值并且不实质性地降低该蛋白的治疗价值。
在本发明的一个方面中，所选氨基酸残基片段的MHC II类分子结合分值是通过对在所采集的该肽的氨基酸残基片段中存在的每一疏水氨基酸残基侧链进行赋值求和来计算的。为了产生一个图形概况，然后可将总值赋予大概位于该片段中点位置的单一氨基酸残基。对一个或多个目标肽区域中的每一重叠片段(窗口)重复该过程。赋予每一存在的芳族侧链的值约为赋予每一疏水性脂肪族侧链的值的一半。疏水性脂肪族侧链为存在于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸中的侧链。芳族侧链为存在于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸中的侧链。对于芳族侧链优选的赋值为大约1，而对于疏水性脂肪族侧链优选的赋值为大约2。但是也可使用其它值。
因此，在第一个方面中，本发明提供了通过包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定所述肽与MHC分子的结合的步骤，适用于鉴定生物分子氨基酸序列中的一个或多个潜在T细胞表位肽的基于计算的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；
(b)依次从所选区域中采集具预定一致大小的并至少由三个氨基酸残基构成的重叠氨基酸残基片段；
(c)对每一所述采集片段计算MHC II类分子结合分值，方法为对所述采集的氨基酸残基片段中的每一疏水氨基酸残基侧链赋值求和；以及
(d)基于所计算的片段的MHC II类分子结合分值，鉴定出至少一个适于改变的所述片段，以改变肽的总MHC II类结合分值并且不实质性降低该肽的治疗性用途。
在一个特定的实施方案中，本发明涉及这样的方法，其中步骤(c)通过应用改进的
Figure C0280515700101
评分函数及如下方式实施，其中所述
Figure C0280515700102
评分函数的改进为在其中包括12-6范德华配体-蛋白质能量排斥项和配体构象能量项，而所述方式为
(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；
(2)针对所述MHC II类分子模型提供所容许的肽主链的第二数据库；
(3)从所述第一数据库选择一个模型；
(4)从所述第二数据库选择一个容许的肽主链；
(5)鉴定在每一采集片段中存在的氨基酸残基侧链；
(6)确定每一采集片段中存在的所有侧链的结合亲和性值；以及任选地
(7)对每一所述模型和每一所述主链重复步骤(1)至(5)。
在一个进一步的实施方案中，每一采集序列的结合分值按如下计算：(i)提供MHC II类分子模型第一数据库；(ii)针对所述MHC II类分子模型提供所容许的肽主链的第二数据库；(iii)在每一主链的每一位置针对20种氨基酸中的每一种提供容许的氨基酸侧链构象的第三数据库；(iv)从所述第一数据库选择一个模型；(v)从所述第二数据库选择一个容许的肽主链；(vi)鉴定在每一采集片段中存在的氨基酸残基侧链并从所述第三数据库鉴定它们的容许构象；(vii)在每一容许构象中确定每一采集片段中存在的所有侧链的最佳结合亲和性值；(viii)对每一所述主链重复步骤(v)至(vii)，并确定最佳结合分值；以及(ix)对每一所述模型重复步骤(iv)至(viii)。
应理解上述三个数据库可合并为一个数据库，或可合并任意两个数据库以提供组合的数据库。可变化所采集的氨基酸残基片段的长度。优选地，采集的氨基酸残基片段由约10个至约15个氨基酸残基组成，更优选地由约13个氨基酸残基组成。采集的氨基酸残基片段可以在不同程度上重叠。优选地，采集的氨基酸残基片段基本上重叠。最优选地，连续采集的氨基酸残基片段除一个氨基酸残基外相互完全重叠。也就是说，在具有n个残基的氨基酸残基片段中，有n-1个残基与下一个连续采集的氨基酸残基片段重叠。
这样，更详细地说，本发明还涉及下列其它优选的实施方案：
如前所述的方法，其中赋予每一芳族侧链的值约为赋予每一疏水性脂肪族侧链的值的一半；
·如前所述的方法，其中采集的氨基酸残基片段由13个氨基酸残基组成；
·如前所述的方法，其中连续采集的氨基酸残基片段有一个至五个氨基酸残基的重叠；
·如前所述的方法，其中连续采集的氨基酸残基片段基本上相互重叠；
如前所述的方法，其中在连续采集的氨基酸残基片段中，只有一个氨基酸残基不发生重叠。
在第二个基本的方面，本发明提供了不同生物分子的去除了一个或多个T细胞表位的修饰形式，其中所述修饰可通过本发明所述的方法完成。虽然也可通过上面引用的现有技术中描述的方法产生这些分子，但是，通过本发明方法获得的分子显示出增强的特性。在现有技术的教导中，预测的T细胞表位可以通过在非人源的和人源的治疗性抗体蛋白质或非抗体蛋白质的一级序列中使用明智的氨基酸替换而去除。
本发明提供了蛋白质和免疫球蛋白的预期可显示出增强的体内特性的修饰形式。
因此，本发明的一个目的是提供从亲本分子制备免疫原性改变的生物分子的方法，其中修饰分子具有不同于所述亲本分子的氨基酸序列，并且相对于亲本分子而言，当暴露于给定物种的免疫系统时显示出降低的免疫原性；所述方法包括：(i)确定亲本生物分子或其部分的氨基酸序列；(ii)用任一方式鉴定出蛋白氨基酸序列中的一个或多个潜在的T细胞表位，所述方式包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合，(iii)通过在最初确定的T细胞表位序列中改变至少一个氨基酸残基来设计新的序列变体，其中所述变体中的改变使得可以实质上减少或消除T细胞表位序列的活性或数量和/或实质上减少或消除可结合来自所述生物分子的肽的MHC同种异型的数量，上述效果可以通过使用体外或insilico技术或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合或通过肽-MHC复合体与T细胞的结合而确定，(iv)通过重组DNA技术构建此类序列变体，并试验所述变体以确定一个或多个具有所希望特性的变体，以及(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)，其中步骤(ii)对T细胞表位序列的鉴定可以按上文和下文描述的方法实现。
本发明步骤(iii)的具体实施方案概括地涉及以下步骤：
·如前所述的方法，其中在任一最初存在的T细胞表位序列中改变1-9个氨基酸残基；
·如前所述的方法，其中在任一最初存在的T细胞表位序列中改变一个氨基酸残基；
·如前所述的方法，其中氨基酸的改变是参考同源蛋白质序列和/或参考in silico模建技术而进行的；
·如前所述的方法，其中氨基酸残基的改变为在特定位点处用另一氨基酸残基对最初存在的氨基酸残基进行替换或添加或对最初存在的氨基酸残基进行删除；
·如前所述的方法，其中额外地进一步进行改变，优选地通过替换、添加或删除特定的氨基酸来进行改变以恢复所述生物分子的生物活性。
除了步骤(ii)外，所公开方法的其它步骤可通过为本领域技术人员熟知的方法和技术完成。因为修饰的生物分子优选地通过重组技术制备，故可从本方法步骤(i)确定的氨基酸序列出发在氨基酸残基的交换完成后推导出相应的DNA构建体。此处所用的重组技术为本领域熟知(例如Sambrook等人，1989，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA)。
根据本发明获得的生物分子优选地为肽、蛋白质、抗体、抗体片段或融合蛋白。本发明还包括所述分子的具有相同或相似的生物学和/或药理学活性的修饰形式、变体、突变体、片段、衍生物、非糖基化形式、部分糖基化形式或完全糖基化形式。
虽然本发明中公开的方法不限于特定的生物分子，但本发明的具体实施方案优选地提供了在本领域公知的并显示出治疗益处和治疗价值的分子。因此本发明的再一个目的是提供通过上文和下文中详细公开的本发明方法获得的衍生自亲本分子的免疫原性改变的生物分子，其中该修饰分子具有的氨基酸序列不同于所述亲本分子的氨基酸序列，并且该修饰分子相对于亲本分子而言，当暴露于给定物种的免疫系统时显示出降低的免疫原性。
通过所述方法获得的特别令人感兴趣的生物分子选自：
(a)单克隆抗体：
抗40kD糖蛋白抗原的抗体KS 1/4，
抗GD2抗体14。18，
抗Her2抗体4D5(鼠)和人源化形式(
Figure C0280515700141
)，
抗Her1(EGFR)抗体c225和h425，
抗IL-2R(抗Tac)抗体(
Figure C0280515700142
)，
抗CD52抗体(
Figure C0280515700143
)；
抗CD20抗体(C2B8，
Figure C0280515700144
；
Figure C0280515700145
)，
针对人C5补体蛋白质的抗体，
(b)人蛋白质：
sTNF-R1，sTNF-R2，sTNFR-Fc(
Figure C0280515700146
)，
蛋白质C，acrp30，蓖麻毒素A，CNTFR配体，
枯草杆菌蛋白酶，GM-CSF，人促卵泡激素(h-fsh)，
β-葡糖脑苷脂酶，GLP-1，载脂蛋白Al，
leptin(人肥胖蛋白)，KGF，G-CSF，
BDNF，EPO，IL-1R拮抗剂。
本发明的第三个基本方面涉及来自免疫原性未改变的亲本生物分子的T细胞表位序列。这些表位优选地为13聚体(mer)肽。在这些肽中优选具有9个连续氨基酸残基的序列。因此本发明的另一目的是提供此类表位和序列的用途。更详细地说，本发明涉及：
·通过所述任一方法在免疫原性未改变的亲本生物分子的氨基酸序列中鉴定到的潜在T细胞表位肽的用途，用于制备具有相同生物活性的免疫原性降低的生物分子；
·潜在T细胞表位肽的相应用途，其中所述T细胞表位为13mer肽；
·由上述13mer T细胞表位中至少9个连续氨基酸残基组成的肽序列的用途，用于制备具有与亲本未修饰分子相同的生物活性但免疫原性降低的生物分子。
附图说明
图1为阐述本计算法的一个方面的流程图；
图2的流程图阐述了实现本发明计算法所进行的数据库产生；
图3的流程图阐述了为了描绘出肽中潜在的T细胞表位进行的数据库访问(interrogation)；
图4为阐述本计算法的另一流程图；
图5为相对于谷氨酸脱羧酶(MW：65000)同工型(GAD 65)的氨基酸残基坐标(位置)的T细胞表位可能性指数图；
图6为相对于促红细胞生成素(EPO)的氨基酸残基坐标(位置)的T细胞表位可能性指数图；
图7为相对于人源化抗A33单克隆抗体轻链的氨基酸残基坐标(位置)的T细胞表位可能性指数图；以及
图8为相对于人源化抗A33单克隆抗体重链的氨基酸残基坐标(位置)的T细胞表位可能性指数图。
在上述图5-8中，实线(-)描述的是按照图1所示流程图中的计算法计算的T细胞表位指数，虚线(...)描述的是根据本发明的另一方面按照图3所示流程图中的计算法预测的T细胞表位数目。
发明详述
术语″T细胞表位″根据本发明的理解是指这样的氨基酸序列，其可以以合理的效率结合MHC II类分子(或结合它们在非人物种中的等同物)、可刺激T细胞和/或也可在与MHC II类的复合体中结合(不必可测得地活化)T细胞。
根据本发明的理解，此处引用的术语″肽″为包括两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸通过肽键(定义在下文中)连接。有20种不同的天然存在氨基酸参与肽的生物产生，它们可以以任何数目及任意顺序连接形成肽链或环。用于肽生物产生中的天然存在氨基酸均具有L-构型。可使用L-氨基酸、D-氨基酸、或两种不同构型的氨基酸的各种组合通过常规的合成法制备合成肽。某些肽仅包含为数不多的氨基酸单元。短肽，如具有少于10个氨基酸单元的短肽，有时称为“寡肽”。其它肽包含大量的氨基酸残基，例如高达100个或更多个残基，被称为“多肽”。按照惯例，认为“多肽”可为包含三个或多个氨基酸的任何肽链，而“寡肽”通常为特定类型的“短”多肽。因此，如此处所用，谈及“多肽”时也包括寡肽。而且任何谈及的“肽”都包括多肽、寡肽和蛋白质。氨基酸的每一种不同排列都将形成不同的多肽或蛋白质。可形成的多肽数及因此形成的不同蛋白质的数目实际上是不受限的。
此前和此后所用术语″较小或降低的免疫原性″为相对术语，涉及当暴露于同一类型物种体内时，将各最初的源分子与本发明的修饰分子进行免疫原性的比较。
术语“经修饰的蛋白质“如本发明所用，描述的是具有较少的T细胞表位数并因此当暴露于给定物种的免疫系统时相对于亲本蛋白质而言引起降低的免疫原性的蛋白质。术语“未修饰的蛋白质”如本发明所用，描述的是“经修饰的蛋白质”的“亲本”蛋白质，其具有较多的T细胞表位，并因此当暴露于给定物种的免疫系统时相对于经修饰的蛋白质而言具有增强的免疫原性。
“α碳(Cα)”是肽链的碳-氢(CH)组分中的碳原子。“侧链”是Cα的侧基，其可包含简单的或复杂的基团或部分，且具有与所述肽的大小相比可显著变化的外形大小。
T细胞表位可通过本发明的计算法并考虑到对于特定T细胞表位与MHC II类分子的结合而言重要的氨基酸残基而确定。在确定潜在的T细胞表位后，可通过改变(如突变)氨基酸残基序列中的关键氨基酸残基而去除或清除该序列中的潜在T细胞表位。在可能包含T细胞表位的区域中通过缺失、添加或替换对肽序列所作的可导致相对较低的总结合分值的任何改变都将使氨基酸残基序列具有较小免疫原性。在一些情况下，可能希望增强某些肽与MHC II类分子的结合。例如，已有人提出，如果用自身抗原中已知含有T细胞表位的区域的肽类似物治疗患有自身免疫性疾病的个体，可在此类个体中恢复对某些自身抗原的耐受。天然表位通常与MHCII类分子具有中等的亲和性，但可制备对MHC II类分子具有相当高的亲和性的肽类似物。这种高亲和性对提高免疫监视从而清除呈递这种高亲和性表位的T细胞，或使它们变得无反应性是重要的。对T细胞表位的这种修饰也可在肽的蛋白质水平进行，并将完整的蛋白质作为治疗剂施用。
在确定蛋白质或多肽的总体结构时有许多因素起到重要的作用。首先，肽键，即在链中将氨基酸连接在一起的键，为共价键。该键在结构上是平面的，实质上是一个取代的酰胺。“酰胺”指含有如下基团的一组有机化合物中的任一化合物：
Figure C0280515700171
连接邻近氨基酸的Cα的平面肽键可如下描述：
Figure C0280515700172
由于O＝C和C-N原子位于相对刚性的平面中，围绕这些轴不发生自由旋转。因此，由虚线图示性描述的平面有时称为″酰胺″或″肽平面″，其中有肽主链的氧原子(O)、碳原子(C)、氮原子(N)和氢原子(H)。Cα原子位于该酰胺平面的相对角。由于围绕肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上没有旋转，多肽链因此包含一系列连接Cα原子的平面肽键。
在规定多肽或蛋白质的总体结构或构象时起重要作用的第二个因素是每一酰胺平面围绕共同Cα键的旋转角。术语″旋转角″和″扭转角″在后文中认为是同等术语。假定O、C、N和H原子保持在酰胺平面中(这通常为有根据的假设，虽然在一些构象中这些原子与平面存在一些轻微的偏离)，这些旋转角可以定义N和R多肽的主链构象，即存在于邻近残基间的结构。这两个角被称作为φ和ψ。这样一组角φi和ψi角有效地定义了多肽的二级结构，其中下标i表示多肽链的特定残基。在文献中规定了用于定义φ角、ψ角的规定，即酰胺平面为零度角时的参照点，以及对于给定多肽应定义哪个角是φ、哪个角是ψ。参见如Ramachandran等人，Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)，285-94页，在此引用作为参考。
本方法可用于任一蛋白质，其部分地基于如下发现：在人类中MHC II类分子结合沟的主要口袋1锚位置对特定的氨基酸侧链具有设计好的特异性。该口袋的特异性由MHC II类分子β链86位处的氨基酸的身份确定。该位点位于口袋1的底部并决定了可被该口袋容纳的侧链的大小。Marshall，K.W.免疫学杂志(J.Immunol.)，152：4946-4956(1994)。如果该残基为甘氨酸，则所有的疏水性脂肪族和芳族氨基酸(疏水脂肪族氨基酸为：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸，芳族氨基酸为：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容纳于口袋中，优选芳族侧链。如果该口袋残基为缬氨酸，则该氨基酸的侧链伸入口袋中并限制了可容纳的肽侧链大小，以至于只能容纳疏水性脂肪族侧链。因此，在一个氨基酸残基序列中无论何处存在具有疏水性脂肪族或芳族侧链的氨基酸，在该处都有可能存在MHC II类限制的T细胞表位。但是，如果侧链为疏水性脂肪族侧链时，其与芳族侧链相比约两倍的可能性与T细胞表位相关(前提是口袋1型在世界人群中大约呈平均分布)。
将本发明具体化的计算法描绘出肽区域包含T细胞表位的可能性，见如下：
(1)扫描预定长度肽片段的一级序列，并确定存在的所有疏水性脂肪族和芳族侧链。(2)对疏水性脂肪族侧链赋予较芳族侧链大的值；优选地约是赋予芳族侧链的值的两倍，例如，给疏水性脂肪族侧链赋值为2，给芳族侧链赋值为1。(3)对肽中具预定统一长度的每一重叠氨基酸残基片段(窗口)，将经确定存在的值相加，并将特定片段(窗口)的总值赋予位于该片段(窗口)中间位置的某一单个氨基酸残基，优选地赋予大约位于该采集片段(窗口)中点的残基。对每一采集的重叠氨基酸残基片段(窗口)重复该过程。这样，肽的每一氨基酸残基都被赋予了与在该特定片段(窗口)中存在T细胞表位的可能性相关的值。(4)根据如上步骤3所述计算的并赋予的值可相对于被评定的全长氨基酸残基序列中的氨基酸坐标绘图。(5)具有预定值如值为1的各序列部分被认为可能包含T细胞表位，并且需要的话可对其进行改变。
本发明的该特定方面提供了一种通用方法，根据该方法可以描述可能包含T细胞表位的肽区域。在这些区域中进行肽修饰可能改变MHC II类结合特性。根据本发明的另一方面，通过使用考虑肽与MHC II类等位基因模型的相互作用的更复杂计算法可更精确地预测T细胞表位。
根据该特定方面，对肽中存在的T细胞表位的计算预测考虑到：基于所有已知MHC II类分子的结构构建至少42个MHC II类等位基因模型；使用这些模型计算鉴定T细胞表位的方法；对每一模型构建肽主链文库以允许在相关肽主链α碳(Cα)位置具有已知的变异性；在肽和MHC II类分子间相互作用关键的位置处，对与每一模型对接(dock)的每一主链，相对于20种氨基酸替代物中每一种构建氨基酸侧链构象文库；以及将这些主链和侧链构象文库与评分函数结合用于选择与特定MHC II类分子对接的特定肽的最佳主链和侧链构象并得出该相互作用的结合分值。
通过同源模建可以从Brookhaven蛋白质数据库(“PDB”)中的许多相似结构得出MHC II类分子的模型。这些可通过使用合并了模拟复性函数的半自动同源模建软件(Modeller，Sali A.&Blundell TL.1993，分子生物学杂志(J.Mol Biol)234：779-815)，和用于能量最小化的CHARMm力场(可购自Molecular Simulations Inc.San Diego，Ca.)进行。也可使用其它模建方法。
本方法明显不同于其它计算法，所述其它计算法在于使用通过实验得出的针对一小群MHC II类分子的结合沟中每一位置处每一备选氨基酸的结合数据文库(Marshall，K.W.等人，Biomed.Pept.Protiens Nucleic Acids，1(3)：157-162)(1995)；或者在于使用类似的实验性结合数据以定义结合沟中特定类型的结合口袋的结合特征(这又一次使用了相当少的MHC II类分子亚群)，然后‘混合和匹配’来自该口袋文库的口袋类型以人工产生更‘实际的’MHC II类分子(Sturniolo T.等人，自然生物技术(Nat.Biotech)，17(6)：555-561(1999))。这两种现有方法的主要不利之处在于，由于试验的复杂性并需要合成大量的肽变体，故只有少量的MHC II类分子可进行实验扫描。因此，第一种现有方法只能对少数MHC II类分子进行预测。第二种现有方法还假设在不同II类等位基因的背景下在一个分子中衬有相似氨基酸的口袋将具有相同的结合特性，这样该方法的另一不利之处在于只有那些所含口袋被包含在口袋文库中的MHC II类分子可得以‘真实’构建。使用此处描述的模建方法，可推导出任何数目和类型的MHC II类分子的结构，因此可特异性地选择出代表全球人群的等位基因。此外，可通过建立其它的模型而不需通过复杂的实验产生另外的数据来增加所扫描的MHC II类分子数。
主链文库的使用使得扫描的各种肽在结合特定的MHC II类分子时Cα原子处可进行变化。这又与上述备选的现有计算法不同，现有计算法在于使用简化的肽主链来观察在特定口袋中氨基酸的结合。这些简化的主链不可能代表在‘真实的’肽中存在的主链构象，从而导致肽结合预测的不准确性。本主链文库是通过叠加蛋白质数据库中与MHC II类分子结合的所有肽的主链并考虑到位于结合沟中的11个氨基酸的每一个的Cα原子间的均方根(RMS)差而构建的。虽然该文库可从小量合适的可获得的小鼠和人结构(目前为13种结构)推导出，但为了允许更大变异性的可能，将每一C″-α位置的RMS数提高50％。然后确定每一氨基酸的平均Cα位置，并围绕该点绘制球，其半径等于在该位置处的RMS差加50％。该球代表所有允许的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸残基的Cα，等同于结合沟中11个残基的位置2)起运作，将所述的球三维网格化，网格内的每个顶点作为该氨基酸的Cα的可能位置。将后续的酰胺平面(相应于与后续氨基酸的肽键)移动到这些Cα的每一个上面，将φ和ψ角以设定的间隔逐步地转动以便于安置后续的Cα。如果后续的Cα落入对这一Cα而言‘可被允许的位置球’中，则此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外则所得的二肽不能被接受。对每一后续Cα位置均重复这一过程，使肽从所述的口袋1Cα‘种子’开始生长，直到全部9个后续的Cα的位置均根据之前Cα的所有可能排列确定下来。然后对口袋1前的单个Cα重复上述步骤1次以上以构建定位于结合沟内的主链Cα位置文库。
生成的主链数目取决于几种因素：‘可被允许的位置球’的大小；对口袋1位点处′最初的球′网格化的细度；用于定位后续Cα的φ和ψ角逐步旋转的细度。利用这一程序可以构建大的主链文库。主链文库越大越可能发现对MHC II类分子结合沟内的特定肽而言的最适主链。鉴于和结合结构域的氨基酸可能存在冲突，所以不是所有的主链均适合于与所有MHC II类分子模型‘对接’(docking)，故对每个等位基因建立亚文库以包含适合被该等位基因容纳的主链。利用所述的主链文库并结合MHC II类分子模型可以构建出由与每一容许主链对接的每一MHC II类分子结合沟的每一位点中的每一氨基酸的容许侧链构象所组成的详尽数据库。可以利用简单的立体重叠函数构建这一数据组，其中，主链与MHC II类分子对接，氨基酸侧链在所需位置被嫁接到主链上。将侧链上可旋转的键以设定的间隔逐步旋转，记录下依赖于该键的原子的最终定位。将所述原子与结合沟侧链原子间的相互作用记录下来，根据下述的标准确定是否接受这些位置：如此定位的所有原子的重叠总量不能超过预定值。因此，构象搜索的严谨度是在键的逐步旋转中所用的间隔及对总重叠的预定限度的函数。如果已知特定的口袋是刚性的，则后一值可较小，但若已知口袋侧链的位置相对灵活则严谨度可放松。这样便可以模拟结合沟口袋内灵活性的变化。针对与每一MHC II类分子对接后每一主链的所有位点上的所有氨基酸重复这种构象搜索以建立详尽的侧链构象数据库。
用适当的数学表达式评价MHC II类分子模型与肽配体构象的结合能量，所述的肽配体构象为通过扫描上述的主链/侧链构象大数据库根据经验获得。这样，通过对每一长度在9-20个氨基酸范围内变化(尽管对于每一次扫描长度是一定的)的可能肽进行下述计算，可以扫描蛋白以搜索潜在的T-细胞表位：选择MHC II类分子及适合于该分子的肽主链，将相应于所需肽序列的侧链移植到其上。对于氨基酸的每一容许构象(由上述数据库获得)，收集与主链上特定位点的特定侧链相关的原子身份和原子间距数据。沿主链对每一侧链重复此过程，利用评分函数推导肽得分。保留该主链的最佳得分，对所选模型的每一容许主链重复该过程。比较所有容许主链的得分，最高的得分被认为是该MHC II类模型中所需肽的得分。对每一模型用从扫描的蛋白得到的所有可能肽重复上述过程，列出肽相对于模型的得分。
在本发明中，用于结合亲和力计算的每种配体都是选自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配体为来自已知序列的肽、多肽或蛋白的长度为约9到20个氨基酸的选定氨基酸链。此后术语“氨基酸”和“残基”视为等同的术语。将移植到选自上述主链文库的主链上的待检测肽中的连续氨基酸形式的配体，通过肽主链上C″-α原子坐标定位到来自MHC II类分子模型库的MHC II类分子的结合裂缝中，并从容许构象的数据库中选择每一侧链的容许构象。相关的原子身份和原子间距也可以从这一数据库获得并用于计算肽结合分数。将对MHC II类结合口袋具有高亲和力的配体作为侯选者标记出来用于定点诱变。在标记的配体中(也由此在目的蛋白中)进行氨基酸替代，然后用评分函数重新测定以确定使结合亲和力降低到预定的阈值以下的变化。这些变化即可引入到目的蛋白中以去除T-细胞表位。肽配体与MHC II类分子结合沟的结合涉及非共价键相互作用，其包括但不限于：氢键、静电相互作用、疏水(亲脂)相互作用和范德华相互作用。它们被包括在下面将详细描述的肽评分函数中。应当理解，氢键是非共价键，其可在极性或带电的基团之间形成，由被两个其他原子共享的氢原子构成。氢供体中的氢带正电荷，而氢受体带有部分负电荷。为肽/蛋白相互作用的目的，氢键供体可以是连接氢的氮，或连接在氧或氮上的氢。氢键受体原子可以是没有连接氢的氧、没有连接氢并具有一或两个连接的氮或仅有一个连接的硫。某些原子，如连接了氢的氧或亚胺氮(如C＝NH)，既可以是氢受体也可以是氢供体。氢键的能量在3-7Kcal/mol，大大强于范德化键，但弱于共价键。氢键具有高度的方向性，且当供体原子、氢原子和受体原子共线时最强。静电键是在带有相反电荷的离子对间形成的，根据库仑定律这种相互作用的强度与原子间距离的平方成反比。离子对间的最佳距离是约2.8
Figure C0280515700221
。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、组氨酸或赖氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之间形成静电键。该键的强度依赖于电离基团的pKa和介质的介电常数，尽管其与氢键的强度类似。
亲脂相互作用是蛋白和肽配体之间发生的有利疏水-疏水相互作用。这种相互作用通常出现在埋于结合沟口袋中的肽的疏水性氨基酸侧链间，以使它们不暴露在溶剂中。将疏水残基暴露于溶剂中是非常不利的，因为周围的溶剂分子将被迫在彼此间形成氢键而形成笼状结构。所致的熵值降低是非常不利的。亲脂性原子可以是既非极性又不是氢受体的硫和非极性的碳原子。
范德华键是相距3-4
Figure C0280515700231
的原子间的非特异性的力。它比氢键和静电键弱、特异性低。原子周围的电荷分布随时间变化，并且在任何瞬间电荷分布均是不对称的。这种瞬间的电荷不对称性诱导临近原子中的类似不对称性。在范德华接触距离中所导致的原子之间的吸引力达到最大，而在约1
Figure C0280515700232
到2处迅速消失。相反，当原子间隔的距离小于此接触距离时，由于原子外部的电子云重叠使不断增强的斥力成为主导。尽管与静电和氢键相比，此吸引力相对较弱(约0.6Kcal/mol)，但所述斥力对于决定肽配体是否能与蛋白成功结合可能非常重要。
在一个实施方案中，利用
Figure C0280515700234
评分函数(SCORE1方法)评估结合常数(，H.J.J.Comput Aided Mol.Des.8(3)：243-256(1994)，该文献在此全文引入作为参考)。在另一个实施方案中，用评分函数(SCORE2方法)评估结合亲和力作为配体含有T-细胞表位的指示物(
Figure C0280515700236
，H.J.J.Comput Aided Mol.Des.12(4)：309-323(1998)，该文献在此全文引入作为参考)。但是上述文献中描述的评分函数是用于评估下述情况中配体对蛋白的结合亲和力的，即已知所述的配体可成功地与所述蛋白结合，且蛋白/配体复合物的结构已解析，这一结构已列于蛋白数据库(″PDB″)中。因此，利用已知的阳性结合数据对评分函数作了发展。为了区分阳性和阴性的结合体，可以任选地向方程中加入排斥项。此外，可通过以成对的方式计算亲脂相互作用，而非利用上述
Figure C0280515700238
函数中基于面积的能量项来进行更理想的结合能量评估。因此，在一个优选实施方案中，用改进的评分函数评估结合能。在改进的
Figure C02805157002310
评分函数中，在评估蛋白和配体之间的结合能(ΔGbind)时考虑了下述参数：由于配体的平移和转动熵的整体损失造成的结合能减低(ΔG0)；理想氢键的贡献(ΔGhb)，其中至少一个配对物是中性的；无扰离子相互作用的贡献(ΔGionic)；亲脂配体原子和亲脂受体原子之间的亲脂相互作用(ΔGhpo)；由于配体中内在自由度的冻结，即绕每一C-C键的旋转自由度降低而造成的结合能损失(ΔGrot)；蛋白和配体之间相互作用的能量(EvdW)。考虑到这些项给出等式1：
(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(Evdw)
其中N是对于特定项符合的相互作用的数目，在一个实施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常数，其值分别为：5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb项依照等式2计算：
Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcs
f(ΔR，Δα)是罚函数，其解决氢键自理想情况的巨大偏离，其依照等式3计算：
f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)
其中：
如果ΔR＜＝TOL        则f1(ΔR)＝1，或者
如果ΔR＜＝0.4+TOL    则f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者
如果ΔR＞0.4+TOL      则f1(ΔR)＝0
并且：
如果Δα＜30°       则f2(Δα)＝1，或者
如果Δα＜＝80°     则f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者
如果Δα＞80°       则f2(Δα)＝0
TOL是氢键键长＝0.25
Figure C0280515700241
中所能允许的偏差
ΔR是H-O/N氢键键长与理想值＝1.9
Figure C0280515700242
的偏差
Δα是氢键键角∠N/O-H..O/N与180°理想值的偏差
f(Nneighb)区分蛋白表面的凹凸部分，并因此赋予口袋中的极性相互作用比蛋白表面的极性相互作用更高的权重。这一函数根据下述等式4计算：
f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5
Nneighb为蛋白中与任意给定蛋白原子之间的距离小于5
Figure C0280515700251
的非氢原子的数量。
Nneighb，0是常数＝25
fpcs是考虑到每氢键的极性接触表面面积的函数，由此可以区分强和弱的氢键，其值由下述的标准确定：
当Apolar/NHB＜10
Figure C0280515700252
时fpcs＝β
当Apolar/NHB＞10
Figure C0280515700253
时fpcs＝1
Apolar是极性蛋白-配体接触面的大小
NHB是氢键的数目
β是常数＝1.2
由于假定了相同的几何相关性，在实施改进的
Figure C0280515700254
评分函数时，离子相互作用的贡献ΔGionic用与上述有关氢键的类似方式计算。
Nlipo项按下述的等式5计算：
Nlipo＝∑lLf(rlL)
根据下述标准，对于所有亲脂配体原子l和所有亲脂蛋白原子L，计算f(rlL)：
当rlL＜＝R1时        f(rlL)＝1
当R2＜rlL＞R1时      f(rlL)＝(rlL-R1)/(R2-R1)
当rlL＞＝R2时        f(rlL)＝0
其中：R1＝rl vdw+rL vdw+0.5
      R2＝R1+3.0
      rl vdw是原子l的范德华半径
      rL vdw是原子L的范德华半径
Nrot项是氨基酸侧链中可旋转的键的数目，其被视为无环的sp3-sp3及sp3-sp2键的数目。末端-CH3或-NH3的旋转未考虑进去。
最终，项Evdw依照如下等式6计算：
Evdw＝ε1ε2((r1 vdw+r2 vdw)12/r12-(r1 vdw+r2 vdw)6/r6)，
其中：ε1和ε2是取决于原子身份的常数
r1 vdw+r2 vdw是范德华原子半径
r是原子对间的距离。
关于式6，在一个实施方案中，ε1和ε2常数被赋予如下原子值，分别为：C：0.245，N：0.283，O：0.316，S：0.316(即分别对于碳、氮、氧和硫原子)。对于式5和6，给予范德华半径如下原子值，分别为C：1.85，N：1.75，O：1.60，S：2.00
Figure C0280515700261
应当理解上述等式中所有预定的值和给定的常数都是在现有的对蛋白配体相互作用的理解局限内具体相对于此处所用的计算类型确定的。因此，随着分子相互作用模建领域发展所导致的这种评分函数的进一步精练，这些值和常数也会因此而改变，任何能在蛋白和配体结合能的评估方面给出所需结果的适宜数值均可使用，而且，其也落入本发明的保护范围内。
如上所述，所述的评分函数应用于由上述侧链构象、原子身份和原子间距数据库中提取的数据。为本说明书的目的，该数据库中包含的MHC II类分子数是42个模型加上4个已解析的结构。从上述描述中可清楚地了解到，本发明的计算构建方法的模块性质意味着，可简单地添加新的模型，并利用肽主链文库和侧链构象搜索功能进行扫描以创建其它的可通过上述的肽评分函数处理的数据集。这使得被扫描的MHC II类分子库可以很容易地增加，或者如果可以获得相关数据，则可以替换结构和相关数据以创建现有等位基因的更精确的模型。
应当理解，尽管上述评分函数与现有的一些复杂方法相比相对简单，但计算进行得非常迅速。还应当理解的是，其目的并不在于计算出对接到所选择的MHC II类蛋白结合沟内的每种肽的真正结合能本身。根本的目的在于获得相对的结合能数据以助于根据所选蛋白的一级结构(即氨基酸序列)预测T-细胞表位的定位。相对高的结合能或结合能高于选定的阈值意味着在配体中存在T-细胞表位。然后可以将所述配体进行至少一轮氨基酸替代，并再次计算结合能。由于计算可迅速进行，对肽序列的这些操作可在现有成本划算的计算机硬件上于程序用户界面中互动进行。由此不需要对计算机硬件进行大量投资。
本领域的技术人员应当了解，也可使用其他软件达到相同的目的。特别是可以使用能将配体对接入蛋白结合位点的更复杂的软件，并与能量最小化相结合。对接软件的例子包括：DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.161：269-288(1982))，LUDI(
Figure C0280515700271
，H.J.J.Comput Aided Mol.Des.8：623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3：300-308(1995))。分子建模和操作软件的例子包括：AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用这些计算方法将严重限制本发明方法的信息吞吐量，这是由于进行必要的计算所需的处理时间导致的。但是可行的方式为，将这些方法作为‘二级筛选’以获得关于通过本发明的方法发现为‘阳性结合体’的肽的更精确的肽结合能计算值。用于复杂的分子机械或分子动力学计算的处理时间的限制性是由进行所述计算的软件设计和目前计算机硬件技术的限制共同确定的。可以预期在将来，随着编写更高效的代码和计算机处理器速度的不断提高，在更易控制的时间构架内进行上述计算是可行的。有关用于大分子的能量函数的其他信息和有关在折叠蛋白结构内发生的多种相互作用的考虑可参考下述文献：Brooks，B.R.等.J.Comput.Chem.4：187-217(1983)，有关蛋白-配体一般相互作用的信息参见：Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)：31-47(1988)，这些文献均全文引入作为参考。其他有用的背景资料也可参见Fasman，G.D.编，Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Plenum Press，New Yor k，ISBN：0-3064313-9。
本预测方法可用包含大量肽的数据集校准，其中所述肽对多种MHCII类分子的亲和性事先已通过实验确定。
根据本方法的一个优选实施方案，此处所述的任一具体预测方法，或可以对每一肽/MHC II类结合对产生数字分值的任一其它基于计算机的肽-MHC II类相互作用预测法，都可以用包含大量肽的数据集校准，其中所述肽对多种MHC II类分子的亲和性事先已通过实验确定。将计算值与实验数据相比较，可确定一截断值，已知该值之上所有经实验确定的T-细胞表位都得以正确的预测。
具体地说，对数据集中的每一肽/MHC II类对基于计算机计算数字分值。计算该分值，使较高的分值代表增加的结合可能性。将实验发现可结合的肽/MHC II类对的基于计算机的最小分值视为截断值。明显低于该截断分值的所有基于计算机的分值被认为代表不结合的肽/MHC II类对，而高于该截断分值的基于计算机的分值代表潜在结合的肽/MHC II类对。一般对于一个给定的基于计算机的分值算法，有一些肽/MHC II类组合会给出高于截断值的分值但它们实际上并不结合。这样，本方法的该优选实施方案可产生假阳性，但不会或几乎不会产生假阴性。
当目的是通过突变消除蛋白质中的大多数或所有T细胞表位时，本方法的该基于截断值的实施方案尤其有用。具体地说，根据本发明方法的一个更优选实施方案，可以按如下从蛋白质中去除大多数或所有的T细胞表位。通过基于计算机的算法扫描蛋白质序列，寻找潜在的T细胞表位。对每一潜在的T细胞表位给出一个分值，其中增高的分值与较高的MHC II类结合可能性相关。突变其分值高于截断值的每一肽片段，从而使突变后片段的分值小于截断值。优选选择不使蛋白质活性降低至为特定目的所需的活性之下的突变。可以设计丧失了计算机预测的大多数或所有T细胞表位的多重突变蛋白质。此多重突变蛋白质称为″去免疫蛋白质″。
可以通过标准方法合成去免疫蛋白质。例如，从合成的寡核苷酸组装编码去免疫蛋白质的人工DNA序列，将其连接入表达载体并功能性地连接可促进去免疫蛋白质表达的元件。然后通过标准方法纯化去免疫蛋白质。所得的去免疫蛋白质包含突变的氨基酸，由此去除了真正的T细胞表位。此外，去免疫蛋白质经常在经算法预测为T细胞表位但实际上不为T细胞表位的片段中包含突变氨基酸。但是，在错误预测的表位中的突变并不会带来明显有害的结果，因为选择的突变几乎对蛋白质活性没有影响。而且，在蛋白质中可能导入新B细胞表位也不会带来有害的结果，因为T细胞表位的缺乏可阻止对经修饰蛋白质的B细胞应答。
以下示例了上述方法对多种肽的应用，这些肽可以为了治疗目的而考虑去免疫或修饰以增强MHC II类结合。
本发明可用于任何具有明确生物学和/或药理学活性并具有与此处公开的序列基本上相同的一级氨基酸序列的生物分子，并因此包括通过基因工程方法或其它方法获得的分子。术语″生物分子″此处用于描述具有生物学功能并能引起生物学、药理学或药物学效应或活性的分子。优选地，本发明的生物分子为肽、多肽、蛋白质。在蛋白质中，优选免疫球蛋白。本发明也包括特定多肽、蛋白质、融合蛋白、免疫球蛋白的大体上具有相同生物活性和相似(降低的)免疫原性的变体和其它修饰形式。而且包括抗体片段，像sFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fc以及蛋白质的生物活性片段。人源抗体或人源化抗体本身在人体中显示较低的免疫原性或没有免疫原性，与非人抗体相比没有或具有较少数目的免疫原性表位。然而仍需要提供此类分子的去免疫形式，因为已证实此类分子中的一些可在人体中引起明显的免疫反应。而且，可引起不希望的和太强的免疫反应的抗原也可根据本发明方法修饰，并产生具有降低的但又足够强的免疫原性以致可以用作如疫苗的抗原。
一些分子，诸如从其它哺乳动物源鉴定的那些，像leptin共有本公开的许多肽序列并且共有许多这样的肽序列，其具有与公开的列表中的序列实质上相同的序列。因此，此类蛋白质序列同样在本发明的范围内。
本发明涉及本发明生物分子的类似物，其中在导致蛋白质中一个或多个潜在T细胞表位的活性显著降低或去除的位置处进行了至少一个氨基酸残基的替换。
对实施例列表中确定的任一潜在的MHC II类配体，在特定位点处进行一个或多个氨基酸的替换可导致这样的分子，当其作为治疗剂施用于人宿主时具有降低的免疫原性潜能。优选地，氨基酸替换在肽序列中预计可实现T细胞表位活性的显著降低或去除的合适位点处进行。实践中，合适的位点优选对应于在MHC II类结合沟所提供的一个疏水口袋内进行结合的氨基酸残基。所述肽中处于与MHC结合裂缝的其他口袋区域结合的位置的氨基酸残基也被认为是落入本发明的范围内。
可以理解，由给定的潜在T-细胞表位内的单一氨基酸替代导致该表位去除的路线是最优选的。也可以在单一表位内进行组合替代，例如，这对于单独定义的表位间彼此重叠的情况特别适宜。此外，在给定的表位内的单氨基酸替代或在一个表位内的组合氨基酸替代也可以在非对应于MHC II类结合沟的″口袋残基″的位置，而是在所述肽序列的任意位点进行。所有此类替代均落入本发明的范围内。
也可以考虑在上面所鉴定的肽之外进行氨基酸替代，特别是与在所列肽内进行的替代相结合的情况下。例如可以考虑利用某种改变恢复变体分子的结构或生物学活性。这种补偿性的改变和在本发明分子中缺失或添加特定的氨基酸残基以得到具有所需活性的变体的改变，以及在任何本发明公开的肽中的改变均落入本发明的范围内。
在另一方面，本发明涉及编码所述具有降低的免疫原性的生物分子的核酸。制备基因构建体和基因产物的方法为本领域熟知。在最后的一个方面，本发明涉及包含可通过本发明所公开的方法获得的所述生物分子的药物组合物，并涉及使用此修饰分子和药物组合物治疗人的方法。
从下列实施例可见，上文中所述的计算法可以很好地指示出在任一肽中何处可能存在T细胞表位。这由此使得可鉴定这样的氨基酸残基序列区域，该区域如果由于一个或多个氨基酸残基的改变而发生变化的话，将影响T细胞表位的去除并由此增强肽的治疗价值。通过该方法，可制备具有增强的特性和药理学价值的生物分子，如肽、蛋白质、免疫球蛋白和融合蛋白等。
上述说明和实施例用于举例阐述而不用作限制。再者，在本发明精神和范围内的其它变体是可能的，而且它们是易于为本领域技术人员明了的。
具体实施方式
实施例1
该实施例显示了自身抗原谷氨酸脱羧酶同工型(GAD 65；MW：65.000)的T细胞表位可能性曲线，所述自身抗原谷氨酸脱羧酶同工型参与I型糖尿病的发展。该特定蛋白质可为用于增加T细胞表位亲和性的潜在靶标，且为阐示T细胞表位可能性指数提供了一个好的实例，因为它是一个相对长的肽(585个氨基酸残基)，这就为作图提供了一个相对大的样本。
图5示出的是GAD 65的T细胞表位可能性曲线。实线代表按照图1所示的计算法计算的T细胞表位指数，虚线代表按照图3和4所示的计算法预测的T细胞表位指数。
实施例2
该实施例显示了促红细胞生成素(EPO)的T细胞表位可能性曲线，所述促红细胞生成素(EPO)为长193个氨基酸残基的细胞因子，广泛用作静脉内(IV)施用药来增加红细胞数。它代表了具有治疗价值的生物药的一个好实例，但由于它可诱导不适当的或不希望有的免疫反应，尤其是使用IV施用途径时，故在鉴定了其中的潜在T细胞表位后对其进行去免疫是有益的。
图6示出的是EPO的T细胞表位可能性曲线。实线代表按照图1所示的计算法计算的T细胞表位指数，虚线代表按照图3和4所示的计算法预测的T细胞表位指数。
实施例3
图7和8示出的是针对A33抗原的小鼠人源化单克隆抗体之重链和轻链的T细胞表位指数。A33抗原为在＞95％肠癌表面表达的跨膜糖蛋白，因此，其抗体具有抗癌治疗的潜能。
在图7和8中，实线代表按照图1所示的计算法计算的T细胞表位指数，虚线代表按照图3和4所示的计算法预测的T细胞表位指数。
实施例4(leptin)：
这些治疗上有价值的分子之一为人肥胖蛋白，称为″leptin″。
Leptin为参与维持脂肪块的稳态机制的146个氨基酸残基的信号传递分泌蛋白质(例如WO 00/40615，WO 98/28427，WO 96/05309)。该蛋白质(及其拮抗剂)为糖尿病、高血压和胆固醇代谢的治疗提供了显著的治疗潜力。该蛋白质可通过重组技术使用一系列不同的宿主T细胞类型产生。
leptin的氨基酸序列(用单字母代码表示)如下：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSM
PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDM
LWQLDLSPGC
作为免疫原性未改变的人肥胖蛋白(leptin)序列的一部分并且具有潜在的MHC II类结合活性的氨基酸序列选自按照本发明方法鉴定的下列序列：
VPIQKVQDDTKTL，QKVQDDTKTLIKT，KTLIKTIVTRIND，TLIKTIVTRINDI，
KTIVTRINDISHT，TIVTRINDISHTQ，TRINDISHTQSVS，NDISHTQSVSSKQ，
QSVSSKQKVTGLD，SSKQKVTGLDFIP，QKVTGLDFIPGLH，TGLDFIPGLHPIL，
LDFIPGLHPILTL，DFIPGLHPILTLS，PGLHPILTLSKMD，GLHPILTLSKMDQ，
HPILTLSKMDQTL，PILTLSKMDQTLA，LTLSKMDQTLAVY，SKMDQTLAVYQQI，
QTIAVYQQILTSM，LAVYQQILTSMPS，AVYQQILTSMPSR，QQILTSMPSRNVI，
QILTSMPSRNVIQ，TSMPSRNVIQISN，SRNVIQISNDLEN，RNVIQISNDLENL，
NVIQISNDLENLR，IQISNDLENLRDL，NDLENLRDLLHVL，LENLRDLLHVLAF，
ENLRDLLHVLAFS，RDLLHVLAFSKSC，DLLHVLAFSKSCH，LHVLAFSKSCHLP，
HVLAFSKSCHLPW，LAFSKSCHLPWAS，CHLPWASGLETLD，SGLETLDSLGGVL，
DSLGGVLEASGYS，SLGGVLEASGYST，GGVLEASGYSTEV，SGYSTEVVALSRL，
任一上面引用的肽序列都可通过替换一个或多个氨基酸进行改变而用于获得具有降低的或没有免疫原性的序列。
根据本发明方法实施的导致人leptin(WT＝野生型)中的潜在T细胞表位消除的替换为：
实施例5(IL-1R拮抗剂)：
IL-1为一种重要的炎性和免疫调节细胞因子，其对多种组织具有多效性，但可促成与类风湿性关节炎相关的病理现象和与局部组织损伤相关的其它疾病。已纯化了可抑制IL-1作用的IL-1受体拮抗剂并克隆了该基因[Eisenburg S.P.等人(1990)自然(Nature)，343：341-346；Carter，D.B.等人(1990)自然(Nature)，344：633-637]。其它人已提供了IL-1Ra分子[例如US 5,075,222]。
IL-1Ra的氨基酸序列(用单字母代码表示)如下：
RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDWPIEPHALFLGIHGGKMCLSC
VKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPD
EGVMVTKFYFQEDE
为免疫原性未改变的IL-1Ra序列的一部分并且具有潜在的MHC II类结合活性的氨基酸序列选自下列序列：
RKSSKMQAFRIWD，SKMQAFRIWDVNQ，QAFRIWDVNQKTF，
FRIWDVNQKTFYL，RIWDVNQKTFYLR，IWDVNQKTFYLRN，
WDVNQKTFYLRNN，KTFYLRNNQLVAG，TFYLRNNQLVAGY，
FYLRNNQLVAGYL，LRNNQLVAGYLQG，RNNQLVAGYLQGP，
NQLVAGYLQGPNV，QLVAGYLQGPNVN，LVAGYLQGPNVNL，
AGYLQGPNVNLEE，GYLQGPNVNLEEK，PNVNLEEKIDVVP，
VNLEEKIDVVPIE，EKIDVVPIEPHAL，IDVVPIEPHALFL，
DVVPIEPHALFLG，VPIEPHALFLGIH，HALFLGIHGGKMC，
ALFLGIHGGKMCL，LFLGIHGGKMCLS，LGIHGGKMCLSCV，
GKMCLSCVKSGDE，MCLSCVKSGDETR，SCVKSGDETRLQL，
ETRLQLEAVNITD，TRLQLEAVNITDL，LQLEAVNITDLSE，
EAVNITDLSENRK，VNITDLSENRKQD，TDLSENRKQDKRF，
ENRKQDKRFAFIR，KRFAFIRSDSGPT，FAFIRSDSGPTTS，
AFIRSDSGPTTSF，TSFESAACPGWFL，SFESAACPGWFLC，
PGWFLCTAMEADQ，WFLCTAMEADQPV，TAMEADQPVSLTN，
QPVSLTNMPDEGV，VSLTNMPDEGVMV，TNMPDEGVMVTKF，
PDEGVMVTKFYFQ，EGVMVTKFYFQED，GVMVTKFYFQEDE
任一上面引用的肽序列都可通过替换一个或多个氨基酸的改变用于获得具有降低的或没有免疫原性的序列。
导致潜在的T细胞表位消除的替换为：
残基    WT
#       残基                   替换
10      M  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
13      F  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
15      I  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
16      W  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
18      V  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
23      F  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
24      Y  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
25      L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
30      L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
31      V  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
34      Y  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
35      L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
40      V  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
42      L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
46      I  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
48      V  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
49      V  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
51      I  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
56      L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
57      F  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
58      L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
60      I  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
65      M  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
67      L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
70      V  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
78      L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
80      L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
83      V  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
85      I  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
88      L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
98      F  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
100     F  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
101     I  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
119     W  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
120     F  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
121     L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
125     M  A  C  D  E  C  H  K  N  P  Q  R  S  T
131     V  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
133     L  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
136     M  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
141     V  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
142     M  A  C  D  E  G  H  K  N  P  Q  R  S  T
实施例6(BDNF)：
另一在治疗上有价值的分子是“人脑源性神经营养因子(BDNF)”。BDNF为糖蛋白，属于神经生长因子蛋白质家族。成熟的含119个氨基酸的糖蛋白从较大的前体加工而来，产生促进神经细胞群存活的神经营养因子[Jones K.R.和Reichardt，L.F.(1990)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87：8060-8064]。此类神经细胞均位于中枢神经系统中或直接与其相连。BDNF的重组制品使得该蛋白质的治疗性潜能可被开发用于促进神经再生和退行性疾病的治疗。
人脑源性神经营养因子(BDNF)的氨基酸序列(用单字母代码表示)如下：
HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCR
GIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
其它人已提供了修饰的BDNF分子[US，5,770,577]并提供了用于重组BDNF分子商业生产的方法[US，5,986,070]。
为免疫原性未改变的人脑源性神经营养因子(BDNF)序列的一部分并且具有潜在的MHC II类结合活性的氨基酸序列选自下列序列：
GELSVCDSISEWV，LSVCDSISEWVTA，DSISEWVTAADKK，SEWVTAADKKTAV，
EWVTAADKKTAVD，WVTAADKKTAVDM，KTAVDMSGGTVTV，TAVDMSGGTVTVL，
VDMSGGTVTVLEK，GTVTVLEKVPVSK，VTVLEKVPVSKGQ，TVLEKVPVSKGQL，
EKVPVSKGQLKQY，VPVSKGQLKQYFY，GQLKQYFYETKCN，KQYFYETKCNPMG，
QYFYETKCNPMGY，YFYETKCNPMGYT，NPMGYTKEGCRGI，MGYTKEGCRGIDK，
RGIDKRHWNSQCR，RHWNSQCRTTQSY，HWNSQCRTTQSYV，QSYVRALTMDSKK，
SYVRALTMDSKKR，RALTMDSKKRIGW，LTMDSKKRIGWRF，KRIGWRFIRIDTS，
IGWRFIRIDTSCV，GWRFIRIDTSCVC，WRFIRIDTSCVCT，RFIRIDTSCVCTL，
IRIDTSCVCTLTI，IDTSCVCTLTIKR
任一上面引用的肽序列都可通过替换一个或多个氨基酸的改变用于获得具有降低的或没有免疫原性的序列。
导致人脑源性神经营养因子(BDNF)(WT＝野生型)中潜在的T细胞表位消除的替换为：
Figure C0280515700361
Figure C0280515700371
实施例7(EPO)
另一治疗上有价值的分子是促红细胞生成素(EPO)。EPO为糖蛋白激素，其参与类红细胞祖先细胞成熟为红细胞。天然EPO在胎儿期由肝脏产生，在成人中由肾脏产生，并在血液中循环以刺激骨髓中红细胞的产生。肾功能衰竭一个几乎必然的后果是贫血，这是因从肾脏产生的EPO减少所致。重组EPO被用作慢性肾功能衰竭所致贫血的有效治疗剂。具有人促红细胞生成素的1-165位氨基酸序列的重组EPO(在哺乳动物细胞中表达)[Jacobs，K.等人(1985)自然(Nature)，313：806-810；Lin，F.-K.等人(1985)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)82：7580-7585]含有三个N-连接的和一个O-连接的寡糖链，每一个均含有末端唾液酸残基。后者对于避免EPO被肝脱唾液酸糖蛋白结合蛋白从循环中快速清除是重要的。
EPO的氨基酸序列(用单字母代码表示)如下：
APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLAL
LSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTF
PKLRVYSNFLRCKLKLYTGEACRTGDR
为免疫原性未改变的人促红细胞生成素(EPO)序列的一部分并且具有潜在的MHC II类结合活性的氨基酸序列选自下列序列：
PRLICDSRVLERY RLICDSRVLERYL ICDSRVLERYLLL  CDSRVLERYLLEA SRVLERYLLEAKE，
RVLERYLLEAKEA LERYLLEAKEAEN ERYLLEAKEAENI，RYLLEAKEAENIT YLLEAKEAENITT，
LEAKEAENITTGC KEAENITTGCAEH ENITTGCAEHCSL  CSLNENITVPDTK NENITVPDTKVNF
ENITVPDTKVNFY  NITVPDTKVNFYA  ITVPDTKVNFYAW，TKVNFYAWKRMEV  VNFYAWKRMEVGQ
NFYAWKRMEVGQQ  YAWKRMEVGQQAV  KRMEVGQQAVEVW，RMEVGQQAVEVWQ，MEVGQQAVEVWQG
QAVEVWQGLALLS，AVEVWQGLALLSE  VEVWQGLALLSEA，EVWQGLALLSEAV  VWQGLALLSEAVL
WQGLALLSEAVLR，QGLALLSEAVLRG，LALLSEAVLRGQA，ALLSEAVLRGQAL  LSEAVLRGQALLV
SEAVLRGQALLVN，EAVLRGQALLVNS，AVLRGQALLVNSS，QALLVNSSQPWEP，ALLVNSSQPWEPL，
LLVNSSQPWEPLQ，QPWEPLQLHVDKA，EPLQLHVDKAVSG，LQLHVDKAVSGLR，LHVDKAVSGLRSL，
KAVSGLRSLTTLL，SGLRSLTTLLRAL，RSLTTLLRALGAQ，SLTTLLRALGAQK，TTLLRALGAQKEA，
TLLRALGAQKEAI，RALGAQKEAISPP，AQKEAISPPDAAS，EAISPPDAASAAP，SPPDAASAAPLRT，
ASAAPLRTITADT，APLRTITADTFRK，RTITADTFRKLFR，TITADTFRKLFRV，DTFRKLFRVYSNF，
RKLFRVYSNFLRG，KLFRVYSNFLRGK  FRVYSNFLRGKLK，RVYSNFLRGKLKL，YSNFLRGKLKLYT，
SNFLRGKLKLYTG，NFLRGKLKLYTGE，RGKLKLYTGEACR，GKLKLYTGEACRT，LKLYTGEACRTGD，
KLYTGEACRTGDR
导致人促红细胞生成素(EPO)(WT＝野生型)中潜在的T细胞表位消除的替换为：
Figure C0280515700381
Figure C0280515700391
实施例8(G-CSF)
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)为一种目前用于治疗如下适应征的重要造血细胞因子，其中对于所述适应征，血液中嗜中性粒细胞的增加将提供益处。它们包括癌症治疗、多种感染性疾病和相关病症如脓毒症。G-CSF也可单独使用或与其它化合物和细胞因子联用，用于骨髓移植中使用的造血细胞的离体扩增。对于该细胞因子，通常认为有两种形式的人G-CSF。一种为具177个氨基酸的蛋白质，另一种为具174个氨基酸的蛋白质[Nagata等人，(1986)，EMBO J.5：575-581]，发现具174个氨基酸的形式具有最大的特异性体内生物学活性。重组DNA技术使得可以利用真核和原核宿主细胞表达体系使G-CSF以商业规模的量产生。
人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的氨基酸序列(用单字母代码表示)如下：
TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLS
QLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVL
VASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP.
以前已公开了G-CSF的其它多肽类似物和肽片段，包括通过定点氨基酸替换和/或通过化学加合物修饰的改变形式。这样US 4,810,643公开了特定的Cys残基用另一氨基酸替换的类似物，及在第一(N-末端)位置处具有Ala残基的G-CSF。EP 0335423公开了在具有G-CSF活性的多肽中对至少一个氨基的修饰。EP 0272703公开了在靠近N-末端处具有氨基酸替换或缺失的G-CSF衍生物。EP 0459630公开了Cys17和Asp27被Ser残基替换的G-CSF衍生物。EP 0243153公开了这样的G-CSF，其通过失活至少一个酵母KEX2蛋白酶加工位点而进行修饰，用于在重组产生中增加产量，且US 4,904,584公开了改变赖氨酸的蛋白质。WO 90/12874公开了进一步改变Cys的变体，且澳大利亚专利文献AU 10948/92公开了添加氨基酸至G-CSF分子的任一末端，用于在原核表达后帮助该分子折叠。AU 76380/91公开了在174个氨基酸形式的G-CSF的50-56位置处的G-CSF变体，以及在177个氨基酸形式的G-CSF的53-59位置处的G-CSF变体。也公开了在特定His残基处的其它变化。
为免疫原性未改变的人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)序列的一部分并且具有潜在的MHC II类结合活性的氨基酸序列选自下列序列：
TPLGPASSLPQSF，SSLPQSFLLKCLE，QSFLLKCLEQVRK，SFLLKCLEQVRKI，
FLLKCLEQVRKIQ，KCLEQVRKIQGDG，EQVRKIQGDGAAL，RKIQGDGAALQEK，
AALQEKLVSECAT，EKLVSECATYKLC，KLVSECATYKLCH，AALQEKLCATYKL，
EKLCATYKLCHPE，ATYKLCHPEELVL，YKLCHPEELVLLG，EELVLLGHSLGIP，
ELVLLGHSLGIPW，HSLGIPWAPLSSC，IPWAPLSSCPSQA，APLSSCPSQALQL，
QALQLAGCLSQLH，GCLSQLHSGLFLY，SQLHSGLFLYQGL，SGLFLYQGLLQAL，
GLFLYQGLLQALE，LFLYQGLLQALEG，FLYQGLLQALEGI，QGLLQALEGISPE，
GLLQALEGISPEL，QALEGISPELGPT，EGISPELGPTLDT，PTLDTLQLDVADF，
DTLQLDVADFATT，LQLDVADFATTIW，LDVADFATTIWQQ，TTIWQQMEELGMA，
TIWQQMEELGMAP，QQMEELGMAPALQ，EELGMAPALQPTQ，LGMAPALQPTQGA，
PALQPTQGAMPAF，GAMPAFASAFQRR，PAFASAFQRRAGG，SAFQRRAGGVLVA，
GGVLVASHLQSFL，GVLVASHLQSFLE，VLVASHLQSFLEV，SHLQSFLEVSYRV，
QSFLEVSYRVLRH，SFLEVSYRVLRHL，LEVSYRVLRHLAQ
任一上面引用的肽序列可通过替换一个或多个氨基酸的改变用于获得具有降低的或没有免疫原性的序列。
导致人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(WT＝野生型)中潜在的T细胞表位消除的替换为：
Figure C0280515700411
实施例9(KGF)：
另一有价值的分子是角质细胞生长因子(KGF)。KGF为成纤维细胞生长因子(FGF)/肝素-结合生长因子蛋白质家族中的一员。它为一种主要在肺中表达的分泌糖蛋白，通过刺激角质细胞和其它上皮细胞的生长而促进伤口愈合[Finch等人(1989)，科学(Science)24：752-755；Rubin等人(1989)，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)86：802-806]。该糖蛋白的成熟(已加工的)形式包含163个氨基酸残基，并且可以在培养特定细胞系后自条件培养基中分离[Rubin等人(1989)，见上]，或者可使用重组技术产生[Ron等人(1993)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：2984-2988]。该蛋白质具有治疗价值，可以用于在一些重要的疾病和损伤修复情况中刺激上皮细胞生长。本公开特别地涉及成熟(已加工的)形式的含163个氨基酸残基的人KGF蛋白质。其它人也已提供了KGF分子[例如US，6,008,328；W090/08771；]，包括修饰的KGF[Ron等人(1993)见上；W09501434]。然而此类教导没有认识到T细胞表位对蛋白质免疫原性特性的重要性，也没有考虑到按照本发明方案以特异的和受控的方式直接影响所述特性。
角质细胞生长因子(KGF)的氨基酸序列(用单字母代码表示)如下：
MCNDMTPEQMATNVNCSSPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLFCRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKNNYNIME
IRTVAVGIVAIKGVESEFYLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFKELILENHYNTYASAKWTHNGGEMFVALN
QKGIPVRGKKTKKEQKTAHFLPMAIT
为免疫原性未改变的人角质细胞生长因子(KGF)序列的一部分并且具有潜在的MHC II类结合活性的氨基酸序列选自下列序列：
NDMTPEQMATNVN，DMTPEQMATNVNC  EQMATNVNCSSPE  TNVNCSSPERHTR，
RSYDYMEGGDIRV，YDYMEGGDIRVRR，DYMEGGDIRVRRL，GDIRVRRLFCRTQ，
IRVRRLFCRTQWY，RRLFCRTQWYLRI，RLFCRTQWYLRID，TQWYLRIDKRGKV，
QWYLRIDKRGKVK，WYLRIDKRGKVKG  LRIDKRGKVKGTQ，GKVKGTQEMKNNY，
QEMKNNYNIMEIR，NNYNIMEIRTVAV  YNIMEIRTVAVGI，NIMEIRTVAVGIV，
MEIRTVAVGIVAI  RTVAVGIVAIKGV  VAVGIVAIKGVES  VGIVAIKGVESEF，
VAIKGVESEFYLA，KGVESEFYLAMNK，SEFYLAMNKEGKL  EFYLAMNKEGKLY，
FYLAMNKEGKLYA，LAMNKEGKLYAKK，GKLYAKKECNEDC  KLYAKKECNEDCN，
CNFKELILENHYN，KELILENHYNTYA  ELILENHYNTYAS  LILENHYNTYASA，
NHYNTYASAKWTH  NTYASAKWTHNGG  AKWTHNGGEMFVA，GEMFVALNQKGIP
EMFVALNQKGIPV，FVALNQKGIPVRG，VALNQKGIPVRGK，KGIPVRGKKTKKE，
IPVRGKKTKKEQK，KTKKEQKTAHFLP
任一上面引用的肽序列都可通过替换一个或多个氨基酸的改变用于获得具有降低的或没有免疫原性的序列。
导致人角质细胞生长因子(KGF)(WT＝野生型)中潜在的T细胞表位消除的替换为：
实施例10(可溶的TNF RI)：
sTNF-RI(可溶性肿瘤坏死因子I型受体)为以前描述的人肿瘤坏死因子受体的衍生物[Gray，P.W.等人(1990)美国国家科学院院报(ProC.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87：7380-7384；Loetschere，H.等人(1990)细胞(Cell)61：351-359；Schall，T.J.等人(1990)细胞(Cell)61：361-370]，其包含完整受体的胞外结构域，并显示约30KDa的分子量。也已知其他可溶性TNF抑制剂，尤其是40KDa形式[US 6,143,866]。这些可溶形式在体外可以以高亲和性结合肿瘤坏死因子α，并抑制该细胞因子的细胞毒活性。sTNF-RI的重组制品具有重要的治疗价值，可以用于治疗其中过高的肿瘤坏死因子水平引起致病效应的疾病。此类sTNF-RI治疗性制品可靶向以下适应征，如恶病质、脓毒症和自身免疫性疾病，其中所述自身免疫性疾病包括，且尤其包括类风湿性关节炎等。包括Brewer等人，US，6,143,866在内的其它人已提供了修饰的sTNF-RI分子。
在人30KDa sTNF-RI中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下：
DSVCPQGKYIHPQ，KYIHPQNNSICCT，NSICCTKCHKGTY，TYLYNDCPGPGQD，
YLYNDCPGPGQDT，NHLRHCLSCSKCR，HCLSCSKCRKEMG，KEMGQVEISSCTV，
GQVEISSCTVDRD，VEISSCTVDRDTV，CTVDRDTVCGCRK，DTVCGCRKNQYRH，
NQYRHYWSENLFQ，RHYWSENLFQCFN，HYWSENLFQCFNC，ENLFQCFNCSLCL，
NLFQCFNCSLCLN，QCFNCSLCLNGTV，CSLCLNGTVHLSC，LCLNGTVHLSCQE，
GTVHLSCQEKQNT，VHLSCQEKQNTVC，EKQNTVCTCHAGF，NTVCTCHAGFFLR，
GFFLRENECVSCS，FFLRENECVSCSN，ECVSCSNCKKSLE，KSLECTKLCLPQI，
TKLCLPQIENVKG，LCLPQIENVKGTE，PQIENVKGTEDSG，SGTTVLLPLVIFF
任一上面引用的肽序列都可通过替换一个或多个氨基酸的改变用于获得具有降低的或没有免疫原性的序列。
实施例11(可溶性TNF-R2)：
可溶性肿瘤坏死因子受体2(sTNF-R2)为以前描述的人肿瘤坏死因子受体2的衍生物[Smith，C.A.等人(1990)科学(Science)248：1019-1023；Kohno，T.等人(1990)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87：8331-8335；Beltinger，C.P.等人(1996)基因组学(Genomics)35：94-100]，其包含完整受体的胞外结构域。此可溶形式在体外可以以高亲和性结合肿瘤坏死因子，并抑制该细胞因子的细胞毒活性。sTNF-R2的重组制品具有重要的治疗价值，其可以用于治疗其中过高的肿瘤坏死因子水平引起致病效应的疾病。一种称为ethanercept的特定重组制品已获得临床批准用于治疗类风湿性关节炎，该药剂和其他类似药剂在治疗其它适应征如恶病质、脓毒症和自身免疫性疾病中具有价值。Ethanercept为二聚体融合蛋白，其包含人TNFR2分子的胞外结构域和人IgG1分子的Fc结构域。该二聚体分子包含934个氨基酸[US，5,395,760；US，5,605,690；US，5,945,397；US，RE36,755]。
在人TNFR2蛋白的TNF结合结构域中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下：
TPYAPEPGSTCRL，CRLREYYDQTAQM，REYYDQTAQMCCS，EYYDQTAQMCCSK，
AQMCCSKCSPGQH，KCSPGQHAKVFCT，AKVFCTKTSDTVC，KVFCTKTSDTVCD，
STYTQLWNWVPEC，TQLWNWVPECLSC，QLWNWVPECLSCG，NWVPECLSCGSRC，
ECLSCGSRCSSDQ，SRCSSDQEVTQAC，QEVTQACTREQNR，QNRICTCRPGWYC，
NRICTCRPGWYCA，PGWYCALSKQEGC，GWYCALSKQEGCR，CALSKQEGCRLCA，
APLRKCRPGFGVA，PGFGVARPGTETS，FGVARPGTETSDV，SDVVCKPCAPGTF，
GTFSNTTSSTDIC，TDICRPHQICNVV，HQICNVVAIPGNA，ICNVVAIPGNASR，
CNVVAIPGNASKD，NVVAIPGNASRDA，VAIPGNASRDAVC，DAVCTSTTTPTRS，
TRSMAPGAVHLPQ，RSMAPGAVHLPQP，VHLPQPVSTRSQH，QPVSTRSQHTQPT，
PEPSTAPSTSFLL，SFLLPMGPSPPAE，FLLPMGPSPPAEG
实施例12(β-GCR)
β-葡糖脑苷脂酶(β-D-葡糖基-N-酰基鞘氨醇葡糖水解酶，E.C.3.2.1.45)为含497个氨基酸残基的单体糖蛋白。该酶催化糖脂葡糖脑苷脂水解为葡萄糖和神经酰胺。GCR活性不足导致称为戈谢氏病(Gaucherdisease)的溶酶体贮积疾病。该疾病的特征在于葡糖脑苷脂聚积，其充盈了在肝脏、脾、骨髓和其它器官中聚集的组织巨噬细胞。该疾病具有不同程度的严重性，从具血液病方面问题但不连累神经的1型疾病至出生后早期显现的广泛连累神经的2型疾病，其中所述2型疾病一般是进行性的且在2岁以内致死。在一些分类中也认可3型疾病，该3型疾病也显示出连累神经。以前用于Gaucher病治疗的唯一有用的疗法为施用来自人胎盘的GCR(称作阿糖苷酶)，但最近重组GCR的药物制品(″Ceredase″和″Cerezyme″)在1型疾病的治疗中已显示出有效[Niederau，C.等人(1998)Eur.J.Med.Res.3：25-30]。
在人GCR中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
PCIPKSFGYSSVV，KSFGYSSVVCVCN，FGYSSVVCVCNAT，SSVVCVCNATYCD，SVVCVCNATYCDS，
VCVCNATYCDSFD，ATYCDSFDPPTFP，DSFDPPTFPALGT，PTFPALGTFSRYE，PALGTFSRYESTR，
GTFSRYESTRSGR，SRYESTRSGRRME，GRRMELSMGPIQA，RRMELSMGPIQAN，RMELSMGPIQANH，
MELSMGPIQANHT，LSMGPIQANHTGT，MGPIQANHTGTGL，GPIQANHTGTGLL，TGLLLTLQPEQKF，
GLLLTLQPEQKFQ，LLLTLQPEQKFQK，LTLQPEQKFQKVK，TLQPEQKFQKVKG，PEQKFQKVKGFGG，
QKFQKVKGFGGAM，QKVKGFGGAMTDA，KGFGGAMTDAAAL，GFGGAMTDAAALN，GAMTDAAALNILA，
AMTDAAALNILAL，MTDAAALNILALS，AALNILALSPPAQ，ALNILALSPPAQN，LNILALSPPAQNL，
NILALSPPAQNLL，LALSPPAQNLLLK，ALSPPAQNLLLKS，PAQNLLLKSYFSE，AQNLLLKSYFSEE，
QNLLLKSYFSEEG，NLLLKSYFSEEGI，LLLKSYFSEEGIG，KSYFSEEGIGYNI，SYFSEEGIGYNII，
FSEEGIGYNIIRV，EGIGYNIIRVPMA，GIGYNIIRVPMAS，IGYHIIRVPMASC，YNIIRVPMASCDF，
NIIRVPMASCDFS，IIRVPMASCDFSI，IRVPMASCDFSIR，VPMASCDFSIRTY，PMASCDFSIRTYT，
SCDFSIRTYTYAD，CDFSIRTYTYADT，FSIRTYTYADTPD，RTYTYADTPDDFQ，TYTYADTPDDFQL，
YTYADTPDDFQLH，ADTPDDFQLHNFS，PDDFQLHNFSLPE，DDFQLHNFSLPEE，FQLHNFSLPEEDT，
HNFSLPEEDTKLK，FSLPEEDTKLKIP，SLPEEDTKLKIPL，EEDTKLKIPLIHR，TKLKIPLIHRALQ，
KLKIPLIHRALQL，LKIPLIHRALQLA，IPLIHRALQLAQR，PLIHRALQLAQRP，HRALQLAQRPVSL，
RALQLAQRPVSLL，ALQLAQRPVSLLA，LQLAQRPVSLLAS，RPVSLLASPWTSP，PVSLLASPWTSPT，
VSLLASPWTSPTW，SLLASPWTSPTWL，SPWTSPTWLKTNG，TSPTWLKTNGAVN，PTWLKTNGAVNGK，
TWLKTNGAVNGKG，GAVNGKGSLKGQP，GSLKGQPGDIYHQ，GDIYHQTWARYFV，DIYHQTWARYFVK，
QTWARYFVKFLDA，WARYFVKFLDAYA，ARYFVKFLDAYAE，RYFVKFLDAYAEH，YFVKFLDAYAEHK，
FVKFLDAYAEHKL，VKFLDAYAEHKLQ，KFLDAYAEHKLQF，DAYAEHKLQFWAV，YAEHKLQFWAVTA，
HKLQFWAVTAENE，LQFWAVTAENEPS，QFWAVTAENEPSA，FWAVTAENEPSAG，WAVTAENEPSAGL，
VTAENEPSAGLLS，PSAGLLSGYPFQC，AGLLSGYPFQCLG，GLLSGYPFQCLGF，SGYPFQCLGFTPE，
YPFQCLGFTPEHQ，QCLGFTPEHQRDF，LGFTPEHQRDFIA，FTPEHQRDFIARD，RDFIARDLGPTLA，
DFIARDLGPTLAN，RDLGPTLANSTHH，LGPTLANSTHHNV，PTLANSTHHNVRL，HNVRLLMLDDQRL，
VRLLMLDDQRLLL，RLLMLDDQRLLLP，LLMLDDQRLLLPH，LMLDDQRLLLPHW，DDQRLLLPHWAKV，
DQRLLLPHWAKVV，QRLLLPHWAKVVL，RLLLPHWAKVVLT，LLLPHWAKVVLTD，PHWAKVVLTDPEA，
WAKVVLTDPEAAK  AKVVLTDPEAAKY，KVVLTDPEAAKYV，VVLTDPEAAKYVH，EAAKYVHGIAVHW，
AKYVHGIAVHWYL，KWVHGIAVHWYLD，YVHGIAVHWYLDF，HGIAVHWYLDFLA，IAVHWYLDFLAPA，
VHWYLDFLAPAKA  HWYLDFLAPAKAT，WYLDFLAPAKATL，LDFLAPAKATLGE，DFLAPAKATLGET，
AKATLGETHRLFP，ATLGETHRLFPNT，GETHRLFPNTMLF  ETHRLFPNTMLFA，THRLFPNTMLFAS，
HRLFPNTMLFASE，RLFPNTMLFASEA，FPNTMLFASEACV，NTMLFASEACVGS，TMLFASEACVGSK，
MLFASEACVGSKF，ACVGSKFWEQSVR，GSKFWEQSVRLGS，SKFWEQSVRLGSW，KFWEQSVRLGSWD，
QSVRLGSWDRGMQ，VRLGSWDRGMQYS，RLGSWDRGMQYSH，GSWDRGMQYSHSI，WDRGMQYSHSIIT，
RGMQYSHSIITNL，MQYSHSIITNLLY，QYSHSIITNLLYH  YSHSIITNLLYHV，HSIITNLLYHVVG，
SIITNLLYHVVGW，TNLLYHVVGWTDW，NLLYHVVGWTDWN  LLYHVVGWTDWNL，YHVVGWTDWNLAL，
HVVGWTDWNLALN，VVGWTDWNLALNP  VGWTDWNLALNPE，TDWNLALNPEGGP，WNLALNPEGGPNW，
LALNPEGCPNWVR  PNWVRNFVDSPII  NWVRNFVDSPIIV  RNFVDSPIIVDIT  NFVDSPIIVDITK
SPIIVDITKDTFY  PIIVDITKDTFYK  IIVDITKDTFYKQ，VDITKDTFYKQPM，DTFYKQPMFYHLG
TFYKQPMFYHLGH，QPMFYHLGHFSKF  PMFYHLGHFSKFI，MFYHLGHFSKFIP，YHLGHFSKFIPEG，
GHFSKFIPEGSQR  SKFIPEGSQRVGL，KFIPEGSQRVGLV，IPEGSQRVGLVAS  QRVGLVASQKNDL
VGLVASQKNDLDA  GLVASQKNDLDAV  SQKNDLDAVALMH，NDLDAVALMHPDG，DAVALMHPDGSAV，
VALMHPDGSAVVV，ALMHPDGSAVVVV，SAVVVVLNRSSKD，AVVVVLNRSSKDV，VVVVLNRSSKDVP，
VVVLNRSSKDVPL，VVLNRSSKDVPLT，KDVPLTIKDPAVG，VPLTIKDPAVGFL，PLTIKDPAVGFLE，
LTIKDPAVGFLET，PAVGFLETISPGY，VGFLETISPGYSI，GFLETISPGYSIH，FLETISPGYSIHT，
ETISPGYSIHTYL，PGYSIHTYLWHRQ，PGYSIHTYLWRRQ
实施例13(蛋白质C)：
蛋白质C为一种维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶，其参与血液凝固的调节。该蛋白质由凝血酶活化以产生活化的蛋白质C，其接下来在血液凝固级联中降解(下调)因子Va和VIIIa。蛋白质C在肝脏中以单链前体表达，经过一系列的加工后产生包含通过二硫键连接在一起的轻链和重链的分子。蛋白质C通过凝血酶从重链的N-末端切割下十四肽而活化。天然或活化形式的蛋白质C药物制品在治疗患有血管疾病和/或蛋白质C后天性缺乏的患者中是有用的。此类患者因此包括患有血栓性卒中的个体或患有与脓毒症、移植操作、怀孕、严重烧伤、重要外科手术或其它严重创伤相关的蛋白质C缺乏的个体。蛋白质C也用于治疗遗传性蛋白质C缺乏的个体。本公开具体涉及成熟(经加工)形式的人蛋白质C，其包含155个氨基酸残基的轻链和262个氨基酸残基的重链[Foster，D.C.等人(1985)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)82：4673-4677；Beckman，R.J.等人(1985)核酸研究(Nucleic Acids Res).13：5233-5247]。其它人已提供了蛋白质C分子(包括活化的蛋白质C制剂)和使用方法[US，6159,468；US，6,156,734；US，6,037,322；US，5,618,714]。
在人蛋白质C重链中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
DQEDQVDPRLIDG，QEDQVDPRLIDGK，DQVDPRLIDGKMT，QVDPRLIDGKMTR，VDPRLIDGKMTRR
DPRLIDGKMTRRG  PRLIDGKMTRRGD，RLIDGKMTRRGDS，SPWQVVLLDSKKK，WQVVLLDSKKKLA，
QVVLLDSKKKLAC，VVLLDSKKKLACG，VLLDSKKKLACGA，DSKKKLACGAVLI，SKKKLACGAVLIH，
KKLACGAVLIHPS，CGAVLIHPSWVLT，GAVLIHPSWVLTA，VLIHPSWVLTAAH，PSWVLTAAHCMDE
SWVLTAAHCMDES，WVLTAAHCMDESK，AAHCMDESKKLLV，HCMDESKKLLVRL，SKKLLVRLGEYDL
KKLLVRLGEYDLR  KLLVRLGEYDLRR，LLVRLGEYDLRRW，VRLGEYDLRRWEK，RLGEYDLRRWEKW
LGEYDLRRWEKWE  GEYDLPRWEKWEI  YDLRRWEKWELDL  RRWEKWELDLDIK  EKWELDLDIKEVE
WELDLDIKEVFVH，LDLDIKEVFVHPN  LDIKEVFVHPNYS，IKEVFVHPNYSKS，KEVFVHPNYSKST
EVFVHPNYSKSTT，VFVHPNYSKSTTD，PNYSKSTTDNDIA，SKSTTDNDIALLH，TTDNDIALLHLAQ，
TDNDIALLHLAQP，DNDIALLHLAQPA，NDIALLHLAQPAT，IALLHLAQPATLS，ALLHLAQPATLSQ，
LHLAQPATLSQTI，AQPATLSQTIVPI，PATLSQTIVPICL，ATLSQTIVPICLP，TLSQTIVPICLPD
QTIVPICLPDSGL，TIVPICLPDSGLA，IVPICLPDSGLAE，VPICLPDSGLAER，ICLPDSGLAEREL，
PDSGLAERELNQA，SGLAERELNQAGQ，GLAERELNQAGQE，LAERELNQAGQET，RELNQAGQETLVT，
GQETLVTGWGYHS，ETLVTGWGYHSSR，TLVTGWGYHSSRE，TGWGYHSSREKEA，WGYHSSREKEAKR，
WGYHSSREKEAKR，SREKEAKRNRTFV，RNRTFVLNFIKIP，NRTFVLNFIKIPV，RTFVLNFIKIPVV，
TFVLNFIKIPVVP，FVLNFIKIPVVPH，LNFIKIPVVPHNE，NFIKIPVVPHNEC，IKIPVVPHNECSE，
IPVVPHNECSEVM，PVVPHNECSEVMS，VVPHNECSEVMSN，NECSEVMSNMVSE，SEVMSNMVSENML，
EVMSNMVSENMLC，VMSNMVSENMLCA，SNMVSENMLCAGI，MVSENMLCAGILG，VSENMLCAGILGD，
ENMLCAGILGDRQ，NMLCAGILGDRQD，AGILGDRQDACEG，GILGDRQDACEGD，GPMVASFHGTWFL，
PMVASFHGTWFLV，MVASFHGTWFLVG，ASFHGTWFLVGLV，GTWFLVGLVSWGE，TWFLVGLVSWGEG，
WFLVGLVSWGEGC，FLVGLVSWGEGCG，VGLVSWGEGCGLL，GLVSWGEGCGLLH，VSWGEGCGLLHNY，
EGCGLLHNYGVYT，CGLLHNYGVYTKV，GLLHNYGVYTKVS，LHNYGVYTKVSRY，HNYGVYTKVSRYL，
YGVYTKVSRYLDW，GVYTKVSRYLDWI，TKVSRYLDWIHGH，SRYLDWIHGHIRD，RYLDWIHGHIRDK，
LDWIHGHIRDKEA，DWIHGHIRDKEAP  HGHIRDKEAPQKS，GHIRDKEAPQKSW
在人蛋白质C轻链中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
NSFLEELRHSSLE，SFLEELRHSSLER，EELRHSSLERECI，LRHSSLERECIEE，SSLERECIEEICD，
ECIEEICDFEEAK，IEEICDFEEAKEI，EEICDFEEAKEIF，EICDFEEAKEIFQ，CDFEEAKEIFQNV，
KEIFQNVDDTLAF，EIFQNVDDTLAFW，IFQNVDDTLAFWS，QNVDDTLAFWSKH，DDTLAFWSKHVDG，
DTLAFWSKHVDGD，LAFWSKHVDGDQC，AFWSKHVDGDQCL，WSKHVDGDQCLVL，KHVDGDQCLVLPL，
QCLVLPLEHPCAS，CLVLPLEHPCASL，LVLPLEHPCASLC，LPLEHPCASLCCG，ASLCCGHGTCIDG，
HGTCIDGIGSFSC，TCIDGIGSFSCDC，DGIGSFSCDCRSG，GSFSCDCRSGWEG，CRSGWEGRFCQRE，
SGWEGRFCQREVS，GWEGRFCQREVSF，GRFCQREVSFLNC，RFCQREVSFLNCS，QREVSFLNCSLDN，
REVSFLNCSLDNG，VSFLNCSLDNGGC，SFLNCSLDNGGCT，CSLDNGGCTHYCL，THYCLEEVGWRRC，
YCLEEVGWRRCSC，EEVGWRRCSCAPG，VGWRRCSCAPGYK，RRCSCAPGYKLGD，APGYKLGDDLLQC，
PGYKLGDDLLQCH，YKLGDDLLQCHPA，LGDDLLQCHPAVK，GDDLLQCHPAVKF，DDLLQCHPAVKFP，
DLLQCHPAVKFPC，PAVKFPCGRPWKR，VKFPCGRPWKRME，RPWKRMEKKRSHL
实施例14(枯草杆菌蛋白酶)
枯草杆菌蛋白酶为一类具有显著经济和工业重要性的蛋白酶。它们可用作去污剂或化妆品的成分，或用于纺织品生产和其它工业及消费制品中。某些特定的人对象在暴露于细菌枯草杆菌蛋白酶后可在个体中激发不希望有的超敏反应。故需要具有增强的特性且尤其是生物特性改良的枯草杆菌蛋白酶类似物。鉴于此，高度希望提供在人受试者体内具有降低的或没有诱导免疫反应的能力的枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶，诸如从其它来源包括细菌、真菌或从脊椎动物来源(包括哺乳动物和人)鉴定的枯草杆菌蛋白酶，共有许多本公开的肽序列，并且共有许多具有与公开列表中的序列实质上相同的序列的肽序列。此类蛋白质序列因此同样在本发明的范围内。其它人已提供了枯草杆菌蛋白酶分子，包括经修饰的枯草杆菌蛋白酶[US，5,700,676；US，4914,031；US，5,397,705；US，5,972,682]。
在迟缓芽孢杆菌(B.lentus)枯草杆菌蛋白酶中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
QSVPWGISRVQAP，SVPWGISRVQAPA，WGISRVQAPAAHN，SRVQAPAAHNRGL，
VQAPAAHNRGLTG，AHNRGLTGSGVKV，RGLTGSGVKVAVL，SGVKVAVLDTGIS，
GVKVAVLDTGIST，VKVAVLDTGISTH，VAVLDTGISTHPD，AVLDTGISTHPDL，
TGISTHPDLNIRG，ISTHPDLNIRGGA，HPDLNIRGGASFV，PDLNIRGGASFVP，
LNIRGGASFVPGE，ASFVPGEPSTQDG，SFVPGEPSTQDGN，EPSTQDGNGHGTH，
GHGTHVAGTIAAL，HGTHVAGTIAALN，THVAGTIAALNNS，AGTIAALNNSIGV，
GTIAALNNSIGVL，AALNNSIGVLGVA，ALNNSIGVLGVAP，NSIGVLGVAPSAE，
GVLGVAPSAELYA，LGVAPSAELYAVK，APSAELYAVKVLG，AELYAVKVLGASG，
ELYAVKVLGASGS，YAVKVLGASGSGS，VKVLGASGSGSVS，KVLGASGSGSVSS，
SGSGSVSSIAQGL，SGSVSSIAQGLEW，GSVSSIAQGLEWA，SSIAQGLEWAGNN，
QGLEWAGNNGMHV，LEWAGNNGMHVAN，NNGMHVANLSLGS，NGMHVANLSLGSP，
MHVANLSLGSPSP  HVANLSLGSPSPS，VANLSLGSPSPSA，ANLSLGSPSPSAT，
LSLGSPSPSATLE，SPSPSATLEQAVN，SPSATLEQAVNSA，PSATLEQAVNSAT，
ATLEQAVNSATSR，TLEQAVNSATSRG，QAVNSATSRGVLV，RGVLVVAASGNSG，
GVLVVAASGNSGA，VLVVAASGNSGAG，LVVAASGNSGAGS，VAASGNSGAGSIS，
GSISYPARYANAM，ISYPARYANAMAV，YPARYANAMAVGA，ARYANAMAVGATD，
NAMAVGATDQNNN，MAVGATDQNNNRA，AVGATDQNNNRAS，NNRASFSQYGAGL，
RASFSQYGAGLDI，ASFSQYGAGLDIV，SQYGAGLDIVAPG，GAGLDIVAPGVNV，
AGLDIVAPGVNVQ  LDIVAPGVNVQST，DIVAPGVNVQSTY，APGVNVQSTYPGS，
PGVNVQSTYPGST  VNVQSTYPGSTYA，STYPGSTYASLNG，STYASLNGTSMAT，
ASLNGTSMATPHV  NGTSMATPHVAGA  MATPHVAGAAALV，TSMATPHVAGAAA，
PHVAGAAALVKQK，AALVKQKNPSWSN  ALVKQKNPSWSNV，PSWSNVQIRNHLK，
WSNVQIRNHLKNT，SNVQIRNHLKNTA，VQIRNHLKNTATS，QIRNHLKNTATSL，
RNHLKNTATSLGS，NHLKNTATSLGST，HLKNTATSLGSTN，ATSLGSTNLYGSG，
TSLGSTNLYGSGL，LGSTNLYGSGLVN，TNLYGSGLVNAEA，NLYGSGLVNAEAA，
LYGSGLVNAEAAT
在淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
QSVPYGVSQIKAP，SVPYGVSQIKAPA  VPYGVSQIKAPAL，YCVSQIKAPALHS，
VSQIKAPALHSQG，SQIKAPALHSQGY，PALHSQGYTGSNV，QGYTGSNVKVAVI，
SNVKVAVIDSGID，VKVAVIDSGIDSS，KVAVIDSGIDSSH  VAVIDSGIDSSHP，
AVIDSGIDSSHPD，VIDSGIDSSHPDL，SGIDSSHPDLKVA，DSSHPDLKVAGGA，
SHPDLKVAGGASM，HPDLKVAGGASMV，PDLKVAGGASMVP，DLKVAGGASMVPS，
LKVAGGASMVPSE，GGASMVPSETNPF，ASMVPSETNPFQD，SMVPSETNPFQDN，
NPFQDNNSHGTHV，FQDNNSHGTHVAG，SHGTHVAGTVAAL，HGTHVAGTVAALN，
THVAGTVAALNNS，AGTVAALNNSIGV，GTVAALNNSIGVL，AALNNSIGVLGVA，
ALNNSIGVLGVAP，NNSIGVLGVAPSA，NSIGVLGVAPSAS，SIGVLGVAPSASL，
IGVLGVAPSASLY，GVLGVAPSASLYA，LGVAPSASLYAVK，APSASLYAVKVLG，
ASLYAVKVLGADG，SLYAVKVLGADGS，YAVKVLGADGSGQ，VKVLGADGSGQYS，
KVLGADGSGQYSW，ADGSGQYSWIING，GQYSWIINGIEWA，YSWIINGIEWAIA，
SWIINGIEWAIAN，WIINGIEWAIANN，NGIEWAIANNMDV，IEWAIANNMDVIN，
WAIANNMDVINMS，ANNMDVINMSLGG，NNMDVINMSLGGP，MDVINMSLGGPSG，
DVINMSLGGPSGS，INMSLGGPSGSAA，MSLGGPSGSAALK，AALKAAVDKAVAS，
ALKAAVDKAVASG，AAVDKAVASGVVV，AVDKAVASGVVVV，KAVASGVVVVAAA，
SGVVVVAAAGNEG，GVVVVAAAGNEGT，VVVVAAAGNEGTS，VVVAAAGNEGTSG，
AAAGNEGTSGSSS，SSTVGYPGKYPSV，STVGYPGKYPSVI，VGYPGKYPSVIAV，
GKYPSVIAVGAVD，PSVIAVGAVDSSN，SVIAVGAVDSSNQ，IAVGAVDSSNQRA，
GAVDSSNQRASFS，VDSSNQRASFSSV，ASFSSVGPELDVM，SSVGPELDVMAPG，
GPELDVMAPGVSI，PELDVMAPGVSIQ，ELDVMAPGVSIQS，LDVMAPGVSIQST，
DVMAPGVSIQSTL，APGVSIQSTLPGN，PGVSIQSTLPGNK，VSIQSTLPGNKYG，
STLPGNKYGAYNG，GNKYGAYNGTSMA，NKYGAYNGTSMAS，GAYNGTSMASPHV，
YNGTSMASPHVAG，TSMASPHVAGAAA，MASPHVAGAAALI，PHVAGAAALILSK，
AAALILSKHPNWT，AALILSKHPNWTN，ALILSKHPNWTNT，LILSKHPNWTNTQ，
PNWTNTQVRSSLE，TQVRSSLENTTTK，QVRSSLENTTTKL，VRSSLENTTTKLG，
SSLENTTTKLGDS，TKLGDSFYYGKGL，LGDSFYYGKGLIN，DSFYYGKGLINVQ，
SFYYGKGLINVQA，FYYGKGLINVQAA，YYGKGLINVQAAA
在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)枯草杆菌蛋白酶中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
QSVPYGISQIKAP，SVPYGISQIKAPA，VPYGISQIKAPAL，YGISQIKAPALHS，
ISQIKAPALHSQG，SQIKAPALHSQGY，PALHSQGYTGSNV，QGYTGSNVKVAVI，
SNVKVAVIDSGID，VKVAVIDSGIDSS，KVAVIDSGIDSSH，VAVIDSGIDSSHP，
AVIDSGIDSSHPD，VIDSGIDSSHPDL，SGIDSSHPDLNVR，DSSHPDLNVRGGA，
HPDLNVRGGASFV，PDLNVRGGASFVP  DLNVRGGASFVPS，LNVRGGASFVPSE
GGASFVPSETNPY，ASFVPSETNPYQD，SFVPSETNPYQDG，NPYQDGGSHGTHV，
SHGTHVAGTIAAL，HGTHVAGTIAALN，THVAGTIAALNNS，AGTIAALNNSIGV，
GTIAALNNSIGVL，AALNNSIGVLGVS，ALNNSIGVLGVSP，NNSIGVLGVSPSA，
NSIGVLGVSPSAS，IGVLGVSPSASLY，GVLGVSPSASLYA，LGVSPSASLYAVK，
SPSASLYAVKVLD  ASLYAVKVLDSTG  YAVKVLDSTGSCQ，VKVLDSTGSGQYS
KVLDSTGSGQYSW，STGSGQYSWIING，GQYSWIINGIEWA，YSWIINGIEWAIS，
SWIINGIEWAISN，WIINGIEWAISNN，NGIEWAISNNMDV，IEWAISNNMDVIN，
WAISNNMDVINMS  SNNMDVINMSLGG，NNMDVINMSLGGP，MDVINMSLGGPTG，
DVINMSLGGPTGS，INMSLGGPTGSTA，MSLGGPTGSTALK，TALKTVVDKAVSS，
ALKTVVDKAVSSG，KTVVDKAVSSGIV，TVVDKAVSSGIVV，VVDKAVSSGIVVA，
KAVSSGIVVAAAA，VSSGIVVAAAAGN，SGIVVAAAAGMEG，GIVVAAAAGNEGS，
IVVAAAAGNEGSS，VVAAAAGNEGSSG，AAAGNEGSSGSTS，TSTVGYPAKYPST，
STVGYPAKYPSTI，VGYPAKYPSTIAV，AKYPSTIAVGAVN，PSTIAVGAVNSSN，
STIAVGAVNSSNQ，TIAVGAVNSSNQR，IAVGAVNSSNQRA，GAVNSSNQRASFS，
VNSSNQRASFSSA，NQRASFSSAGSEL，ASFSSAGSELDVM，GSELDVMAPGVSI，
ELDVMAPGVSIQS，SELDVMAPGVSIQ，LDVMAPGVSIQST，DVMAPGVSIQSTL，
APGVSIQSTLPGG，PGVSIQSTLPGGT，VSIQSTLPGGTYG，STLPGGTYGAYNG，
GGTYGAYNGTSMA，GTYGAYNGTSMAT，GAYNGTSMATPHV，YNGTSMATPHVAG，
TSMATPHVAGAAA，MATPHVAGAAALI，PHVAGAAALILSK，GAAALILSKHPTW，
AALILSKHPTWTN，ALILSKHPTWTNA，LILSKHPTWTNAQ，PTWTNAQVRDRLE，
AQVRDRLESTATY，QVRDRLESTATYL，DRLESTATYLGNS，ATYLGNSFYYGKG，
TYLGNSFYYGKGL，LGNSFYYGKGLIN，NSFYYGKGLINVQ，SFYYGKGLINVQA，
FYYGKGLINVQAA，YYGKGLINVQAAA
在地衣芽孢杆菌(B.Iicheniformis)枯草杆菌蛋白酶中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
QTVPYGIPLIKAD，VPYGIPLIKADKV，YGIPLIKADKVQA，IPLIKADKVQAQG，
PLIKADKVQAQGF，IKADKVQAQGFKG，DKVQAQGFKGANV，QGFKGANVKVAVL，
ANVKVAVLDTGIQ，VKVAVLDTGIQAS，KVAVLDTGIQASH，VAVLDTGIQASHP，
AVLDTGIQASHPD，VLDTGIQASHPDL，DTGIQASHPDLNV，TGIQASHPDLNVV，
QASHPDLNVVGGA，HPDLNVVGGASFV，PDLNVVGGASFVA，DLNVVGGASFVAG，
LNVVGGASFVAGE，NVVGGASFVAGEA，ASFVAGEAYNTDG，SFVAGEAYNTDGN，
EAYNTDGNGHGTH，GHGTHVAGTVAAL，HGTHVAGTVAALD，THVAGTVAALDNT，
GTVAALDNTTGVL，TVAALDNTTGVLG，AALDNTTGVLGVA，DNTTGVLGVAPSV，
TTGVLGVAPSVSL，TGVLGVAPSVSLY，GVLGVAPSVSLYA，LGVAPSVSLYAVK，
APSVSLYAVKVLN，PSVSLYAVKVLNS，VSLYAVKVLNSSG，SLYAVKVLNSSGS，
YAVKVLNSSGSGS，VKVLNSSGSGSYS，KVLNSSGSGSYSG，GSYSGIVSGIEWA，
TNGMDVINMSLGG，NGMDVINMSLGGA，MDVINMSLGGASG，DVINMSLGGASGS，
INMSLGGASGSTA，MSLGGASGSTAMK，TAMKQAVDNAYAR，AMKQAVDNAYARG，
QAVDNAYARGVVV，NAYARGVVVVAAA，RGVVVVAAAGNSG，GVVVVAAAGNSGN，
VVVVAAAGNSGNS，VVVAAAGNSGNSG，NTIGYPAKYDSVI，IGYPAKYDSVIAV，
AKYDSVIAVGAVD，DSVIAVGAVDSNS，SVIAVGAVDSNSN，IAVGAVDSNSNRA，
AVGAVDSNSNRAS，GAVDSNSNRASFS，AVDSNSNRASFSS，SNRASFSSVGAEL，
ASFSSVGAELEVM，SSVGAELEVMAPG，GAELEVMAPGAGV，AELEVMAPGAGVY，
ELEVMAPGAGVYS  LEVMAPGAGVYST，EVMAPGAGVYSTY，APGAGVYSTYPTN
AGVYSTYPTNTYA，GVYSTYPTNTYAT  STYPTNTYATLNG  NTYATLNGTSMAS，
ATLNGTSMASPHV，LNGTSMASPHVAG，TSMASPHVAGAAA，MASPHVAGAAALI，
PHVAGAAALILSK，GAAALILSKHPNL，AALILSKHPNLSA，ALILSKHPNLSAS，
LILSKHPNLSASQ，SKHPNLSASQVRN，HPNLSASQVRNRL，PNLSASQVRNRLS，
LSASQVRNRLSST，SQVRNRLSSTATY，QVRNRLSSTATYL，NRLSSTATYLGSS，
ATYLGSSFYYGKG，TYLGSSFYYGKGL，LGSSFYYGKGLIN，SSFYYGKGLINVE，
SFYYGKGLINVEA，FYYGKGLINVEAA，YYGKGLINVEAAA
实施例15(CNTF的配体)：
本发明提供了人睫状神经营养因子(CNTF)受体复合体的异源二聚体配体包含的蛋白质亚单位的修饰形式。该受体复合体由至少两种配体活化，包括CNTF和含有心脏营养因子(cardiotrophin)样细胞因子(CLC)和可溶性受体细胞因子样因子1(CLF)的异源二聚体复合体[Elson G.C.A.等人(2000)自然神经科学(Nature Neuroscience)3：867-872]。CLC为IL-6细胞因子家族的蛋白质，也公知为新的神经营养因子-1/B细胞刺激因子-3[Senaldi，G.等人(1999)美国国家科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)96：11458-11463，US，5,741,772]。CLF与细胞因子I型受体家族的蛋白质同源[Elson，G.C.A.等人(1998)免疫学杂志(Journal of Immunol).161：1371-1379]，已确定为NR6[Alexander W.S.等人(1999)Curr.BioI.9：605-608]。CLC和CLF结合形成的异源二聚体已显示出可以直接与CNTFR相互作用，由此形成的三体复合体可刺激细胞内的信号转导事件，由此使其它已知的CNTFR复合体成分如gp130和LIFR[Elson G.C.A.等人(2000)同上]表达。
在人CLC中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
PGPSIQKTYDLTR PSIQKTYDLTRYL IQKTYDLTRYLEH，RTYDLTRYLEHQL，
YDLTRYLEHQLRS LTRYLEHQLRSLA TRYLEHQLRSLAG，RYLEHQLRSLAGT，
HQLRSLAGTYLNY QLRSLAGTYLNYL PSLAGTYLNYLGP  GTYLNYLGPPFNE，
TYLNYLGPPFNEP NYLGPPTNEPDFN PPFNEPDFNPPRL  PFNEPDFNPPRLG
PDFNPPRLGAETL FNPPRLGAETLPR PPLGAETLPRATV  LGAETLPRATVDL
ETLPRATVDLEVW PRATVDLEVWRSL ATVDLEVWRSLND  TVDLEVWRSLNDK
VDLEVWRSLNDKL LEVWRSLNDKLRL 
Figure C0280515700521
PSLNDKLRLT  VWRSLNDKLRLTQ，
RSLNDKLRLTQNY DKLRLTQNYEAYS RLRLTQNYEAYSH  LRLTQNYEAYSHL
TQNYEAYSHLLCY QNYEAYSHLLCYL EAYSHLLCYLRGL  SHLLCYLRGLNRQ，
HLLCYLRGLNRQA LCYLRGLNRQAAT CYLRGLNRQAATA  RGLNRQAATAELR
GLNRQAATAELRR，QAATAELRRSLAH，AATAELRRSLAHF  AELRRSLAHFCTS，
ELRRSLAHFCTSL，RSLAHFCTSLQGL，AHFCTSLQGLLGS，TSLQGLLGSIAGV，
SLQGLLGSIAGVM，QGLLGSIAGVMAA，GLLGSIAGVMAAL  LLGSIAGVMAALG，
GSIAGVMAALGYP  SIAGVMAALGYPL，AGVMAALGYPLPQ  GVMAALGYPLPQP，
AALGYPLPQPLPG，LGYPLPQPLPGTE，YPLPQPLPGTEPT，QPLPGTEPTWTPG，
PTWTPGPAHSDFL，WTPGPAHSDFLQK，HSDFLQKMDDFWL，SDFLQKMDDFWLL，
DFLQKMDDFWLLK，FLQKMDDFWLLKE，QKMDDFWLLKELQ，DDFWLLKELQTWL，
DFWLLKELQTWLW，FWLLKELQTWLWR，WLLKELQTWLWRS，KELQTWLWRSAKD，
ELQTWLWRSAKDF，QTWLWRSAKDFNR，TWLWRSAKDFNRL，WLWRSAKDFNRLK，
WRSAKDFNRLKKK，RSAKDFNRLKKKM，KDFNRLKKKMQPP，NRLKKKMQPPAAA，
RLKKKMQPPAAAV，LKKKMQPPAAAVT，KKMQPPAAAVTLH，KMQPPAAAVTLHL，
QPPAAAVTLHLGA
在人CLF中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
TAVISPQDPTLLI，AVISPQDPTLLIG，VISPQDPTLLIGS，QDPTLLIGSSLLA，
DPTLLIGSSLLAT，PTLLIGSSLLATC，TLLIGSSLLATCS，LLIGSSLLATCSV，
IGSSLLATCSVHG，SSLLATCSVHGDP，SLLATCSVHGDPP，CSVHGDPPGATAE，
GDPPGATAEGLYW，EGLYWTLNGRRLP，GLYWTLNGRRLPP，WTLNGRRLPPELS，
RRLPPELSRVLNA，RLPPELSRVLNAS，PELSRVLNASTLA，ELSRVLNASTLAL，
LSRVLNASTLALA，SRVLNASTLALAL，RVLNASTLALALA，LNASTLALALANL，
NASTLALALANLN，STLALALANLNGS，LALALANLNGSRQ，LALANLNGSRQRS，
ANLNGSRQRSGDN，DNLVCHARDGSIL，NLVCHARDGSILA，VCHARDGSILAGS，
RDGSILAGSCLYV，DGSILAGSCLYVG，GSILAGSCLYVGL，SILAGSCLYVGLP，
SCLYVGLPPEKPV，CLYVGLPPEKPVN，LYVGLPPEKPVNI，VGLPPEKPVNISC，
KPVNISCWSKNMK，VNISCWSKNMKDL，KNMKDLTCRWTPG，KDLTCRWTPGAHG，
CRWTPGAHGETFL，RWTPGAHGETFLH，HGETFLHTNYSLK，ETFLHTNYSLKYK，
TFLHTNYSLKYKL，TNYSLKYKLRWYG，YSLKYKLRWYGQD，LKYKLRWYGQDNT，
YKLRWYGQDNTCE，LRWYGQDNTCEEY，RWYGQDNTCEEYH，EEYHTVGPHSCHI，
HTVGPHSCHIPKD，PHSCHIPKDLALF，CHIPKDLALFTPY，IPKDLALFTPYEI，
KDLALFTPYEIWV，ALFTPYEIWVEAT，TPYEIWVEATNRL，YEIWVEATNRLGS，
EIWVEATNRLGSA，IWVEATNRLGSAR，EIWVEATNRLGSA，NRLGSARSDVLTL，
EATNRLGSARSDV，SARSDVLTLDILD，SDVLTLDILDVVT，DVLTLDILDVVTT，
LTLDILDVVTTDP，LDILDVVTTDPPP，DILDVVTTDPPPD，LDVVTTDPPPDVH，
ARSDVLTLDILDV，PDVHVSRVGGLED  VHVSRVCGLEDQL，SRVGGLEDQLSVR，
DVVTTDPPPDVHV，GGLEDQLSVRWVS，RVGGLEDQLSVRW  DQLSVRWVSPPAL，
LSVRWVSPPALKD，VRWVSPPALKDFL，RWVSPPALKDFLF，GLEDQLSVRWVSP，
PALKDFLFQAKYQ，KDFLFQAKYQIRY，DFLFQAKYQIRYR，FLFQAKYQIRYRV
VSPPALKDFLFQA，AKYQIRYRVEDSV  YQIRYRVEDSVDW，IRYRVEDSVDWKV，
YRVEDSVDWKVVD，FQAKYQIRYRVED  DSVDWKVVDDVSN，VDWKVVDDVSNQT，
VEDSVDWKVVDDV，KVVDDVSNQTSCR，DDVSNQTSCRLAG，WKVVDDVSNQTSC，
QTSCRLAGLKPGT，CRLAGLKPGTVYF，AGLKPGTVYFVQV，GTVYFVQVRCNPF，
TVYFVQVRCNPFG，VYFVQVRCNPFGI，FVQVRCNPFGIYG，VQVRCNPFGIYGS，
NPFGIYGSKKAGI，PFGIYGSKKAGIW，FGIYGSKKAGIWS，GIYGSKKAGIWSE，
SKKAGIWSEWSHP，AGIWSEWSHPTAA，GIWSEWSHPTAAS，SEWSHPTAASTPR，
SHPTAASTPRSER，PSSGPVRRELKQF，GPVRRELKQFLGW，RELKQFLGWLKKH，
KQFLGWLKKHAYC，QFLGWLKKHAYCS，LGWLKKHAYCSNL，GWLKKHAYCSNLS，
HAYCSNLSFRLYD，AYCSNLSFRLYDQ，SNLSFRLYDQWRA，LSFRLYDQWRAWM，
FRLYDQWRAWMQK，RLYDQWRAWMQKS，DQWRAWMQKSHKT，RAWMQKSHKTRNQ，
AWMQKSHKTRNQD  HKTRNQDEGILPS，EGILPSGRRGTAR，GILPSGRRGTARG，
实施例16(促卵泡激素)
本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的人hFSH的修饰形式。hFSH为一种包含两个糖蛋白亚单位的具有二聚体结构的糖蛋白激素。该蛋白质治疗性地用于人不育症，且该蛋白质的重组形式已是许多临床试验的对象[Out，H.J.等人(1995)Hum.Reprod.10：2534-2540；Hedon，B.等人(1995)Hum.Reprod.10：3102-3106；重组人FSH研究组(1995)Fertil.Steril.63：77-86；PreVost，R.R.(1998)Pharmacotherapy 18：1001-1010].
在人hFSH中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
KTLQFFFLFCCWK，LQFFFLFCCWKAI，QFFFLFCCWKAIC，FFFLFCCWKAICC，
FFLFCCWKAICCN，FLFCCWKAICCNS，CCWKAICCNSCEL，KAICCNSCELTNI，
CELTNITIAIEKE，TNITIAIEKEECR，ITIAIEKEECRFC，IAIEKEECRFCIS，
CRFCISINTTWCA，FCISINTTWCAGY，ISINTTWCAGYCY，TTWCAGYCYTRDL，
AGYCYTRDLVYKD，YCYTRDLVYKDPA，RDLVYKDPARPKI，DLVYKDPARPKIQ，
LVYKDPARPKIQK，PKIQKTCTFKELV，CTFKELVYETVRV，KELVYETVRVPGC，
ELVYETVRVPGCA，LVYETVRVPGCAH，ETVRVPGCAHHAD，VRVPGCAHHADSL，
DSLYTYPVATQCH，SLYTYPVATQCHC，YTYPVATQCHCGK，YPVATQCHCGKCD，
CTVRGLGPSYCSF，RGLGPSYCSFGEM
实施例16(蓖麻毒素A)
本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的蓖麻毒素A-链(RTA)的修饰形式。蓖麻毒素为最初从蓖麻植物的种籽中分离的一种细胞毒素，为II型核糖体失活蛋白质(RIP)的一个实例。天然的成熟蛋白质为异源二聚体，其包含通过二硫键连接的具有267个氨基酸残基的RTA和具有262个氨基酸残基的蓖麻毒素B-链。B-链为与半乳糖苷具结合亲和性的凝集素。天然蛋白质可通过B-链结合细胞并通过胞吞作用进入细胞。在细胞内，通过二硫键的还原作用，RTA自B-链释放，并通过未知的机制从内体释放入胞质。在胞质中该毒素作为特异的N-糖基化酶降解核糖体，快速导致蛋白质翻译的停止和细胞死亡。RTA和其它RIP的极端细胞毒性导致它们被用于实验治疗癌症和其它需要去除特定细胞群的疾病。已制备了与RTA连接的包含抗体分子的免疫毒素分子，并已用于一系列的临床试验[Ghetie，M.A.等人(1991)癌研究(Cancer Res.)51：5876-5880；Vitetta，E.S.等人(1991)癌研究(Cancer Res.)51：4052-4058；Amlot，P.L.等人(1993)血液(Blood)82：2624-2633；Conry，R.M.等人(1995)J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.18：231-241；Schnell，R.等人(2000)Leukaemia14：129-135]。在免疫毒素中，抗体结构域提供了与目标靶细胞表面的结合，并且其与RTA的连接可通过化学交联进行或以重组融合蛋白的形式进行。
在蓖麻毒素a-链中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
KQYPIINFTTAGA，YPIINFTTAGATV，PIINFTTAGATVQ，INFTTAGATVQSY，
ATVQSYTNFIRAV，QSYTNFIRAVRGR，TNFIRAVRGRLTT，NFIRAVRGRLTTG，
RAVRGRLTTGADV，GRLTTGADVRHEI，ADVRHEIPVLPNR，HEIPVLPNRVGLP，
IPVLPNRVGLPIN，PVLPNRVGLPINQ，NRVGLPINQRFIL，VGLPINQRFILVE，
LPINQRFILVELS，QRFILVELSNHAE，RFILVELSNHAEL，FILVELSNHAELS，
ILVELSNHAELSV，VELSNHAELSVTL，AELSVTLALDVTN，LSVTLALDVTNAY，
VTLALDVTNAYVV，LALDVTNAYVVGY，LDVTNAYVVGYRA，NAYVVGYRAGNSA，
AYVVGYRAGNSAY，YVVGYRAGNSAYF，VGYRAGNSAYFFH，SAYFFHPDNQEDA，
AYFFHPDNQEDAE，YFFHPDNQEDAEA，EAITHLFTDVQNR，THLFTDVQNRYTF，
HLFTDVQNRYTFA，TDVQNRYTFAFGG，NRYTFAFGGNYDR，YTFAFGGNYDRLE，
FAFGGNYDRLEQL，GNYDRLEQLAGNL，DRLEQLAGNLREN，EQLAGNLRENIEL，
GNLRENIELGNGP，ENIELGNGPLEEA，IELGNGPLEEAIS，GPLEEAISALYYY，
EAISALYYYSTGG，SALYYYSTGGTQL，ALYYYSTGGTQLP，LYYYSTGGTQLPT，
YYYSTGGTQLPTL，TQLPTLARSFIIC，PTLARSFIICIQM，RSFIICIQMISEA，
SFIICIQMISEAA，FIICIQMISEAAR，ICIQMISEAARFQ，IQMISEAARFQYI，
QMISEAARFQYIE，ARFQYIEGEMRTR，FQYIEGEMRTRIR，QYIEGEMRTRIRY
GEMRTRIRYNRRS，TRIPYNPRSAPDP  IRYNRRSAPDPSV，PSVITLENSWGRL
SVITLENSWGRLS  ITLENSWGRLSTA  NSWGRLSTAIQES  GRLSTAIQESNQG
TAIQESNQGAFAS  GAFASPIQLQRRN  SPIQLQRRNGSKF，IQLQRRNGSKFSV
SKFSVYDVSILIP，FSVYDVSILIPII  SVYDVSILIPIIA，YDVSILIPIIALM，
VSILIPIIALMVY，SILIPIIALMVYR，IPIIALMVYRCAP  IALMVYRCAPPPS，
ALMVYRCAPPPSS  LMVYRCAPPPSSQ，MVYRCAPPPSSQF
实施例17(脂肪细胞补体相关蛋白)：
本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的人或小鼠Acrp30的修饰形式。Acrp30为高丰度的血清蛋白质，分子量约为30kDa，专门由脂肪细胞表达[Scherer，P.E.等人(1995)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270：26746-26749]。人基因Acrp30蛋白质序列例如在US，5,869,330中公开。胰岛素增强该蛋白质的分泌，且该蛋白质水平在肥胖受试者中降低。该蛋白质参与能量平衡的调节且尤其参与脂肪酸代谢的调节。在小鼠和人蛋白质中确定了四个序列结构域，包括切割的N-末端信号、与其它蛋白质没有被认知的同源性的区域、胶原蛋白样结构域和球状结构域。球状结构域用蛋白酶处理可从小鼠蛋白质中去除，产生gAcrp30。鼠gAcrp30的制品具有药学特性，并且已证实当给小鼠施与高脂肪餐或静脉内注射脂类后，鼠gAcrp30制品可以降低小鼠血清中升高的游离脂肪酸水平[Fruebis，J.等人(2001)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)98：2005-2010]。
在小鼠Acrp30中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
DDVTTTEELAPAL，TTTEELAPALVPP，EELAPALVPPPKG，LAPALVPPPKGTC，
PALVPPPKGTCAG，ALVPPPKGTCAGW，AGWMAGIPGHPGH，GWMAGIPGHPGHN，
AGIPGHPGHNGTP，GTPGRDGRDGTPG，GDAGLLGPKGETG，AGLLGPKGETGDV，
GLLGPKGETGDVG，GETGDVGMTGAEG，GDVGMTGAEGPRG，VGMTGAEGPRGF P，
RGFPGTPGRKGEP，TPGRKGEPGEAAY，GRKGEPGEAAYMY，AAYMYRSAFSVGL，
AYMYRSAFSVGLE，YMYRSAFSVGLET，SAFSVGLETRVTV，FSVGLETRVTVPN，
VGLETRVTVPNVP，GLETRVTVPNVPI，ETRVTVPNVPIRF，TRVTVPNVPIRFT，
VTVPNVPIRFTKI，VPNVPIRFTKIFY，PNVPIRFTKIFYN，VPIRFTKIFYNQQ，
IRFTKIFYNQQNH，RFTKIFYNQQNHY，TKIFYNQQNHYDG，KIFYNQQNHYDGS，
IFYNQQNHYDGST，QQNHYDGSTGKFY，NHYDGSTGKFYCN，GKFYCNIPGLYYF，
KFYCNIPGLYYFS，CNIPCLYYFSYHI，PGLYYFSYHITVY，GLYYFSYHITVYM，
LYYFSYHITVYMK，YYFSYHITVYMKD，FSYHITVYMKDVK，SYHITVYMKDVKV，
YHITVYMKDVKVS，HITVYMKDVKVSL，ITVYMKDVHSLF，TVYMKDVKVSLFK，
VYMKDVKVSLFKK  KDVKVSLFKKDKA，VKVSLFKKDKAVL，VSLFKKDKAVLFT
SLFKKDKAVLFTY  FKKDKAVLFTYDQ，KDKAVLFTYDQYQ，KAVLFTYDQYQEK，
AVLFTYDQYQEKN，VLFTYDQYQEKNV，FTYDQYQEKNVDQ，YDQYQEKNVDQAS
DQYQEKNVDQASG，EKNVDQASGSVLL，KNVDQASGSVLLH  ASGSVLLHLEVGD
GSVLLHLEVGDQV，SVLLHLEVGDQVW，VLLHLEVGDQVWL，LHLEVGDQVWLQV
LEVGDQVWLQVYG  DQVWLQVYCDGDH，QVWLQVYGDGDHN，VWLQVYGDGDHNG
LQVYGDGDHNGLY，QVYGDGDHNGLYA，VYGDGDHNGLYAD，GDHNGLYADNVND，
NGLYADNVNDSTF，GLYADNVNDSTFT，LYADNVNDSTFTG，DNVNDSTFTGFLL，
VNDSTFTGFLLYH，STFTGFLLYHDTN
在人Acrp30中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
PGVLLPLPKGACT，GVLLPLPKGACTG，VLLPLPKGACTGW，LPLPKGACTGWMA，
PLPKGACTGWMAG，TGWMAGIPGHPGH，GWMAGIPGHPGHN，AGIPGHPGHNGAP，
GAPGRDGRDGTPG，GDPGLIGPKGDIG，PGLIGPKGDIGET，GLIGPKGDIGETG，
GPKGDIGETGVPG，GDIGETGVPGAEG，TGVPGAEGPRGFP，RGFPGIQGRKGEP，
PGIQGRKGEPGEG，GRKGEPGEGAYVY，GAYVYRSAFSVGL，AYVYRSAFSVGLE，
YVYRSAFSVGLET，RSAFSVGLETYVT，SAFSVGLETYVTI，AFSVGLETYVTIP，
FSVGLETYVTIPN，VGLETYVTIPNMP，GLETYVTIPNMPI，ETYVTIPNMPIRF，
TYVTIPNMPIRFT，VTIPNMPIRFTKI，IPNMPIRFTKIFY，PNMPIRFTKIFYN，
MPIRFTKIFYNQQ，IRFTKIFYNQQNH，RFTKIFYNQQNHY，TKIFYNQQNHYDG，
KIFYNQQNHYDGS，IFYNQQNHYDGST，QQNHYDGSTGKFH，NHYDGSTGKFHCN，
GKFHCNIPGLYYF，CNIPGLYYFAYHI，PGLYYFAYHITVY，GLYYFAYHITVYM，
LYYFAYHITVYMK，YYFAYHITVYMKD，FAYHITVYMKDVK，AYHITVYMKDVKV，
YHITVYMKDVKVS，HITVYMKDVKVSL，ITVYMKDVKVSLF，TVYMKDVKVSLFK，
VYMKDVKVSLFKK，KDVKVSLFKKDKA，VKVSLFKKDKAML，VSLFKKDKAMLFT，
SLFKKDKAMLFTY，FKKDKAMLFTYDQ，KDKAMLFTYDQYQ，KAMLFTYDQYQEN，
AMLFTYDQYQENN，MLFTYDQYQENNV，FTYDQYQENNVDQ，YDQYQENNVDQAS，
DQYQENNVDQASG，ENNVDQASGSVLL，NNVDQASGSVLLH，ASGSVLLHLEVGD，
GSVLLHLEVGDQV，SVLLHLEVGDQVW，VLLHLEVGDQVWL，LHLEVGDQVWLQV，
LEVGDQVWLQVYG，DQVWLQVYGEGER，QVWLQVYGEGERN，WLQVYGEGERNG，
LQVYGEGERNGLY，QVYGEGERNGLYA，NGLYADNDNDSTF，GLYADNDNDSTFT，
LYADNDNDSTFTG，DNDSTFTGFLLYH，STFTGFLLYHDTN
实施例18(抗C5抗体)：
本发明提供了对人C5补体蛋白质具有结合特异性的单克隆抗体的修饰形式。本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的修饰抗体。与C5补体蛋白质具结合特异性的抗体可阻断C5转化酶的切割活化，并因此阻止促炎组分C5a和C5b-9的产生。补体系统的活化在许多急性和慢性疾病的发病机理中是一个重要的参与因素，并且在C5水平上抑制补体级联为这些疾病中的某些疾病提供了一种很有希望的治疗途径[Morgan B.P.(1994)Eur.J.Clin.Invest.24：219-228]。在本领域已描述了许多抗C5抗体和治疗性应用它们的方法[Wurzner R.等人(1991)Complement Inflamm。8：328-340；Thomas，T.C.等人(1996)分子免疫学(MolecularImmunology)33：1389-14012；US，5,853,722；US，6,074,64]。命名为5G1.1的抗体[Thomas，T.C.等人(1996)同上]和其单链人源化变体正在对许多疾病适应征进行临床试验，其中所述适应征包括心肺动脉分流术[Fitch，J.C.K.等人(1999)循环(Circulation)100：2499-2506]和类风湿性关节炎。本发明公开了在命名为5G1.1的抗C5抗体[Thomas，T.C.等人]中鉴定到的序列。所公开的序列来自于抗体序列重链和轻链的可变区结构域，因为它们具MHC II类结合潜力，故为潜在的T细胞表位。本公开进一步确定了在5G1.1抗体的单链和″人源化″变体[Thomas，T.C.等人(1996)同上]的蛋白质序列中的潜在表位。
在5G1.1抗体的重链可变区中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
VQLQQSGAELMKP，QSGAELMKPGASV，AELMKPGASVKMS，ELMKPGASVKMSC，ASVKMSCKATGYI，
VKMSCKATGYIFS，KMSCKATGYIFSN，ATGYIFSNYWIQW，TGYIFSNYWIQWI，GYIFSNYWIQWIK，
YIFSNYWIQWIKQ，SNYWIQWIKQRPG，NYWIQWIKQRPGH，YWIQWIKQRPGHG，IQWIKQRPGHGLE，
QWIKQRPGHGLEW，HGLEWIGEILPGS，LEWIGEILPGSGS，EWIGEILPGSGST，WIGEILPGSGSTE，
GEILPGSGSTEYT，EILPGSGSTEYTE，TEYTENFKDKAAF，ENFKDKAAFTADT，FKDKAAFTADTSS，
KAAFTADTSSNTA，AAFTADTSSNTAY，TAYMQLSSLTSED，AYMQLSSLTSEDS，MQLSSLTSEDSAV，
SSLTSEDSAVYYC，SLTSEDSAVYYCA，TSEDSAVYYCARY，SAVYYCARYFFGS，AVYYCARYFFGSS，
VYYCARYFFGSSP，CARYFFGSSPNWY，ARYFFGSSPNWYF，RYFFGSSPNWYFD，YFFGSSPNWYFDV，
PNWYFDVWGAGTT，NWYFDVWGAGTTV，WYFDVWGAGTTVT，FDVWGAGTTVTVS，DVWGAGTTVTVSS
在5G1.1抗体的轻链可变区中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
IQMTQSPASLSAS，ASLSASVGETVTI，ASVGETVTITCGA，ETVTITCGASENI，VTITCGASENIYG，
TITCGASENIYGA，ENIYGALNWYQRK，NIYGALNWYQRKQ，GALNWYQRKQGKS，LNWYQRKQGKSPQ，
NWYQRKQGKSPQL，GKSPQLLIYGATN，PQLLIYGATNLAD，QLLIYGATNLADG，LLIYGATNLADGM，
LIYGATNLADCMS  TNLADGMSSRFSC  DGMSSRFSGSGSG，SRFSGSGSGRQYY  SGSGRQYYLKISS，
RQYYLKISSLHPD  QYYLKISSLHPDD  YYLKISSLHPDDV，LKISSLHPDDVAT，SSLHPDDVATYYC，
SLHPDDVATYYCQ，DDVATYYCQNVLN  ATYYCQNVLNTPL，TYYCQNVLNTPLT，YYCQNVLNTPLTF
YCQNVLNTPLTFG，CQNVLNTPLTFGA QNVLNTPLTFGAG，NVLNTPLTFGAGT，TPLTFGAGTKLEL
实施例19(抗CD20抗体)：
本发明提供了对人CD20抗原具有结合特异性的单克隆抗体的修饰形式。CD20为B细胞特异的表面分子，其表达在前B细胞和成熟B细胞(包括大于90％的B细胞非何杰金淋巴瘤(NHL))上。靶向CD20的单克隆抗体和放射免疫接合物已呈现出可作为NHL的新治疗剂。重要的实例包括单克隆抗体2B8[Reff，M.E.等人(1994)血液(Blood)83：435-445]和B1[US，6,090,365]。已克隆了2B8的可变区结构域，并将其与人恒定区结构域组合产生了命名为C2B8的嵌合抗体，该嵌合抗体在美国市场上为RituxanTM[US，5,776,456]或在欧洲市场上为MabTheraR(rituximab)。C2B8被认为是有价值的治疗NHL和其它B细胞疾病的治疗药物[Maloney，D.G.等人(1997)临床肿瘤杂志(J.Clin.Oncol.)15：3266-3274；Maloney，D.G.等人(1997)血液(Blood)90：2188-2195]。B1抗体同样也已注册用作NHL的治疗剂，虽然在此情况下分子(BexxarTM)为131I放射免疫接合物，而天然(非接合的)抗体被用于淋巴瘤和顽固性白血病自体骨髓移植治疗中的离体清除(purge)方案[Freedman，A.S.等人(1990)，临床肿瘤杂志(J.Clin.Oncol.)8：784]。尽管有抗体如C2B8(rituximab)和BexxarTM的成功，但仍需要具有增强特性的抗CD20类似物。
在抗体2B8重链可变区中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
VQLQQPGAELVKA，LQQPGAELVKAGA，AELVKAGASVKMS，ELVKAGASVKMSC，
ASVKMSCKASGYT，VKMSCKASGYTFT，KMSCKASGYTFTS，ASGYTFTSYNMHW，
SGYTFTSYNMHWV，YTFTSYNMHWVKQ，TSYNMHWVKQTPG，YNMHWVKQTPGRG，
MHWVKQTPGRGLE，HWVKQTPGRGLEW，TPGRGLEWIGAIY，RGLEWIGAIYPGN，
GLEWIGAIYPGNG，EWIGAIYPGNGDT，GAIYPGNGDTSYN，AIYPGNGDTSYNQ，
YPGNGDTSYNQKF，TSYNQKFKGKATL，YNQKFKGKATLTA，QKFKGKATLTADK，
ATLTADKSSSTAY，TAYMQLSSLTSED，AYMQLSSLTSEDS，MQLSSLTSEDSAV，
SSLTSEDSAVYYC，SLTSEDSAVYYCA，TSEDSAVYYCARS，SAVYYCARSTYYG，
AVYYCARSTYYGG，VYYCARSTYYGGD，STYYGGDTYFNVW，TYYGGDTYFNVWG，
DTYFNVWGAGTTV，TYFNVWGAGTTVT  FNVWGAGTTVTVS，NVWGAGTTVTVSA
在抗体2B8轻链可变区中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
QIVLSQSPAILSA，IVLSQSPAILSAS，QSPAILSASPGEK，PAILSASPGEKVT，
AILSASPGEKVTM，EKVTMTCRASSSV，VTMTCRASSSVSY，TMTCRASSSVSYI，
SSVSYIHWFQQKP，VSYIHWFQQKPGS，SYIHWFQQKPGSS，IHWFQQKPGSSPK，
KPWLYATSNLASG，PWIYATSNLASGV，WIYATSNLASGVP，ATSNLASGVPVRF，
SNLASGVPVRFSG，SGVPVRFSGSGSG，VPVRFSGSGSGTS，VRFSGSGSGTSYS，
GTSYSLTISRVEA，TSYSLTISRVEAE，SYSLTISRVEAED，YSLTISRVEAEDA，
LTISRVEAEDAAT，SRVEAEDAATYYC，RVEAEDAATYYCQ，ATYYCQQWTSNPP，
TYYCQQWTSNPPT，QQWTSNPPTFGGG，NPPTFGGGTKLEI
实施例20：
本发明提供了对人IL-2受体具有结合特异性的单克隆抗体的修饰形式。该单克隆抗体命名为抗Tac，其修饰形式去除了一个或多个T细胞表位。抗Tac抗体以高特异性结合在T和B淋巴细胞表面表达的人高亲和性IL-2受体的α亚单位(p55-α、CD25或Tac)。抗体的结合阻断了IL-2结合受体并活化T细胞的能力。抗Tac抗体作为IL-2拮抗剂的能力在器官移植排斥治疗中具有显著的临床潜力。使用小鼠抗体的临床研究显示出对进行肾移植的患者有一些最初的益处，但没有观察到超过常规免疫抑制的长期益处，这是因为在大部分患者中发生了HAMA反应[Kirkham，R.L.等人(1991)移植(Transplantation)51：107-113]。已研发了″人源化的″抗Tac抗体，其中蛋白质的相当大成分经改造而含有鉴定自人抗体基因的蛋白质序列[Queen，C.等人(1989)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)86：10029-10033；US，5,530,101；US，5,585,089；US，6,013,256].″人源化″抗Tac(ZenapaxTM或daclizumab)已作为免疫抑制剂进行了临床试验，用于治疗急性移植物抗宿主病和抑制肾移植排斥[Anasetti，C.等人(1994)，血液(Blood)84：1320-1327；Anasetti，C.等人(1995)血液(Blood)86：Supplement 1：62a；Eckhoff，D.E.等人(2000)移植(Transp1antation)69：1867-1872；Ekberg，H.等人(1999)TransplantProc.31：267-268].
在小鼠抗Tac抗体的重链可变区中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
VQLQQSGAELAKP，AELAKPGASVKMS，ASVKMSCKASGYT，VKMSCKASGYTFT，
KMSCKASGYTFTS，ASGYTFTSYRMHW，SGYTFTSYRMHWV，YTFTSYRMHWVKQ，
TSYRMHWVKQRPG，YRMHWVKQRPGQG，MHWVKQRPGQGLE，HWVKQRPGQGLEW，
RPGQGLEWIGYIN，QGLEWIGYINPST，LEWIGYINPSTGY，EWIGYINPSTGYT，
IGYINPSTGYTEY，GYINPSTGYTEYN，TGYTEYNQKFKDK，TEYNQKFKDKATL，
QKFKDKATLTADK，ATLTADKSSSTAY，TAYMQLSSLTFED，AYMQLSSLTFEDS，
YMQLSSLTFEDSA  MQLSSLTFEDSAV，SSLTFEDSAVYYC，SLTFEDSAVYYCA，
LTFEDSAVYYCAR，SAVYYCARGGGVF，AVYYCARGGGVFD，VYYCARGGGVFDY，
GGVFDYWGQGTTL，GVFDYWGQGTTLT，FDYWGQGTTLTVS，DYWGQGTTLTVSS
在小鼠抗Tac抗体的轻链可变区中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
QIVLTQSPAIMSA，IVLTQSPAIMSAS，QSPAIMSASPGEK，PAIMSASPGEKVT，
AIMSASPGEKVTI，EKVTITCSASSSI，VTITCSASSSISY，TITCSASSSISYM，
SSISYMHWFQQKP，ISYMHWFQQKPGT，SYMHWFQQKPGTS，MHWFQQKPGTSPK，
HWFQQKPGTSPKL，SPKLWIYTTSNLA，PKLWIYTTSNLAS，KLWIYTTSNLASG，
LWIYTTSNLASGV，WIYTTSNLASGVP，TTSNLASGVPARF，SNLASGVPARFSG，
SGVPARFSGSGSG，ARFSGSGSGTSYS，GTSYSLTISRMEA，TSYSLTISRMEAE，
SYSLTISRMEAED，YSLTISRMEAEDA，LTISRMEAEDAAT，SRMEAEDAATYYC，
ATYYCHQRSTYPL，TYYCHQRSTYPLT，STYPLTFGSGTKL，TYPLTFGSGTKLE，
YPLTFGSGTKLEL
在人源化抗Tac抗体的重链可变区中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
VQLVQSGAEVKKP，QLVQSGAEVKKPG，AEVKKPGSSVKVS，SSVKVSCKASGYT，
VKVSCKASGYTFT，KVSCKASGYTFTS，ASGYTFTSYRMHW，SGYTFTSYRMHWV，
YTFTSYRMHWVRQ，TSYRMHWVRQAPG，YRMHWVRQAPGQG，MHWVRQAPGQGLE，
HWVRQAPGQGLEW，RQAPGQGLEWIGY，APGQGLEWIGYIN，QGLEWIGYINPST，
LEWIGYINPSTGY，EWIGYINPSTGYT，WIGYINPSTGYTE，IGYINPSTGYTEY，
GYINPSTGYTEYN，TGYTEYNQKFKDK，TEYNQKFKDKATI，QKFKDKATITADE，
ATITADESTNTAY，TITADESTNTAYM，TNTAYMELSSLRS，TAYMELSSLRSED，
AYMELSSLRSEDT，MELSSLRSEDTAV，SSLRSEDTAVYYC，SLRSEDTAVYYCA，
RSEDTAVYYCARG，TAVYYCARGGGVF，AVYYCARGGGVFD，VYYCARGGGVFDY，
GGVFDYWGQGTLV，GVFDYWGQGTLVT，FDYWGQGTLVTVS，DYWGQGTLVTVSS
在人源化抗Tac抗体的轻链可变区中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为：
IQMTQSPSTLSAS，STLSASVGDRVTI，ASVGDRVTITCSA，DRVTITCSASSSI，
VTITCSASSSISY，TITCSASSSISYM，SSISYMHWYQQKP，ISYMHWYQQKPGK，
SYMHWYQQKPGKA，MHWYQQKPGKAPR，HWYQQKPGKAPKL，QKPGKAPKLLIYT，
PKLLIYTTSNLAS，KLLIYTTSNLASG，LLIYTTSNLASGV，LIYTTSNLASGVP，
TTSNLASGVPARF，SNLASGVPARFSG，SGVPARFSGSGSG，ARFSGSGSGTEFT，
SGSGTEFTLTISS，GTEFTLTISSLQP，TEFTLTISSLQPD，FTLTISSLQPDDF，
LTISSLQPDDFAT，TISSLQPDDFATY，SSLQPDDFATYYC，SLQPDDFATYYCH，
DDFATYYCHQRST，ATYYCHQRSTYPL，TYYCHQRSTYPLT，STYPLTFGQGTKV，
TYPLTFGQGTKVE，YPLTFGQGTKVEV
实施例21(14.18抗体)：
除非另外指出，在重链和轻链可变区中的所有氨基酸按在Kabat等人，1991(Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Departmentof Health and Human Services)中所述编号。潜在的T细胞表位用表位的第一个氨基酸的线性编号来编号，其中所述表位的第一个氨基酸的线性编号通过从重链和轻链的第一个氨基酸开始计数得到。
1.与小鼠亚组框架比较
将鼠14.18VH和VK的氨基酸序列与Kabat鼠重链和轻链亚组的共有序列(Kabat等人，1991)比较。14.18VH可定为小鼠重链亚组II(A)。14.18VH的序列如SEQ No.l所示。与该亚组的共有序列比较显示在位置81处的组氨酸(通常为谷氨酰胺)、在位置82a处的赖氨酸(通常为丝氨酸或天冬酰胺)、在位置93处的缬氨酸(通常为丙氨酸)和在位置94处的丝氨酸(通常为精氨酸)对该亚组是非常见的。也发现在位置19、40和66处的残基在该亚组中是罕见的，但它们被认为对抗体的结合和结构影响极小。14.18VK可定为小鼠κ链亚组II。与该亚组的共有序列比较显示在位置49处的组氨酸对该亚组是非常见的。该残基常见的是酪氨酸。
2.与人构架比较
将鼠14.18VH和VK的氨基酸序列与人胚系VH(Tomlinson等人，(1992)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227：776-798)和VK(Cox等人，(1994)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)1-4：827-836)序列目录中的序列比较，并也与人胚系J区序列(在“预防性和治疗性应用于人的抗体分子的蛋白质工程”(Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic andTherapeutic Applications in Man)，Clark，M.编辑，Academic Titles，Nottingham一书中的l3-44页，Routledge，E.G.等人，1993)比较。所选的用于14.18VH的参照人构架为具有人JH6的DP25。该胚系序列已在没有氨基酸改变的已重排成熟抗体基因中找到。对构架3，使用了成熟人抗体29的序列。该序列与紧靠CDR3的鼠序列相同。所选的用于14.18VK的参照人构架为DPK22。该胚系序列已在没有氨基酸改变的已重排成熟抗体基因中找到。对构架2，使用了成熟人抗体163.5的序列。该序列与紧靠CDR2的鼠序列相同。J区序列为人JK2(Routledge等人，1993)。
3.″贴面化″序列的设计
确定参照人构架序列后，将14.18VH和VK构架中某些不一致的氨基酸残基改变为人参照序列中的相应氨基酸。被认为对抗体结构和结合关键的残基不包括在该过程中，且不进行改变。在此阶段仍保留的鼠残基主要是不位于表面的隐蔽残基，以及例如在最后的抗体中靠近CDR的N-末端残基。该方法产生的序列大致类似于“贴面化”抗体(veneered antibody)，因为表面残基主要是人的，而隐蔽残基为原来的鼠序列。
4.肽的穿线分析(threading analysis)
使用本发明方法分析鼠14.18VH和VK序列和贴面化14.18VH和VK序列。将氨基酸序列分成所有可能的13聚体(mer)。将这些13mer的肽依次呈递给HLA-DR同种异型的结合沟模型，并且相对于每一等位基因将结合分值赋予每一个肽。针对肽的每一口袋结合侧链计算构象分值。该分值基于立体重叠、肽和结合沟中的残基间的潜在氢键、静电相互作用以及肽和口袋残基间的有利接触。然后改变每一侧链的构象并再次计算分值。确定了最高的构象分值后，基于与沟结合的疏水残基、非沟的亲水残基和适合进入结合沟的残基数目计算结合分值。MHC II类的已知结合体得到相当大的结合分值，几乎没有假阴性。这样，在当前的分析中得到相当大结合分值的肽被认为是潜在的T细胞表位。对鼠和贴面化序列的肽穿线分析结果在表1中给出。
表1：在鼠和贴面化14.18序列中潜在的T细胞表位
  序列  潜在的T细胞表位数   潜在表位的位置
  鼠14.18VH   11   3(17)，9(15)，30(5)，35(17)，39(15)，43(9)，58(12)，62(11)，81(11)，84(16)，101(7)
  贴面化14.18VH   5   43(9)，58(12)，62(11)，81(11)，84(16)
  鼠14.18VK   7   7(7)，13(11)，27(15)，49(11)，86(17)，97(11)，100(4)
  贴面化14.18VK   5   27(15)，49(11)，86(17)，97(11)，100(17)
5.潜在T细胞表位的去除
在构成表位的特定肽中对氨基酸进行替换而去除潜在的T细胞表位。如果可能的话通过插入具有类似物理化学特性的氨基酸进行替换。但是为了去除一些潜在的表位，可能需要替换为具有不同大小、电荷或疏水性的氨基酸。如果在CDR中进行可能对结合产生影响的改变，则需要产生有和没有此特定氨基酸替换的变体。我们给出用于替换的氨基酸残基的线性编号并在括号中给出Kabat编号。通过13mer中第一个残基所在的线性编号谈及潜在的T细胞表位。
从贴面化14.18重链可变区去除T细胞表位所需的氨基酸改变如下：
1.在残基41位(Kabat编号41)用异亮氨酸替换脯氨酸，以及在CDR2中残基50位用亮氨酸替换丙氨酸去除位置43处的潜在表位。
2.(1)的备选方案，在残基45位(Kabat编号45)用苏氨酸替换亮氨酸，在位置41处(Kabat编号41)为脯氨酸时，这也可去除位置43处的潜在表位。
3.在CDR2中残基66位(Kabat编号65)用丝氨酸替换甘氨酸，且在残基68位(Kabat编号67)用缬氨酸替换丙氨酸去除在位置58处的潜在表位。在人和小鼠抗体序列的该位置发现了丝氨酸。
4.在残基70位(Kabat编号69)用异亮氨酸替换亮氨酸，这将使与位置62处的潜在表位结合的MHC同种异型的数量从11减少至4。
5.在位置72处(Kabat编号71)用丙氨酸替换缬氨酸去除在位置62处的潜在表位。在该位置处氨基酸的大小是关键的，而丙氨酸的大小和疏水性类似于缬氨酸。
6.在残基91位(Kabat编号87)用苏氨酸替换丝氨酸去除在位置81和84处的潜在表位。
从贴面化14.18轻链可变区去除潜在T细胞表位所需的氨基酸替换如下：
1.在残基32位(Kabat编号27e)用丝氨酸替换精氨酸去除在位置27处的潜在表位。该残基位于CDR2中，但是在小鼠和人抗体的该位置常见丝氨酸。在该CDR外的变化不能消除该潜在的T细胞表位。
2.在位置54处(Kabat编号49)用酪氨酸替换组氨酸去除在位置43处的潜在表位。在小鼠和人抗体的位置49处酪氨酸是最常见的氨基酸。
3.用于去除位置43处的潜在表位的变化(2)的备选方案为在残基51位(Kabat编号46)用甲硫氨酸替换亮氨酸。甲硫氨酸在大小和疏水性上类似于亮氨酸。
4.在残基88位(Kabat编号83)用甲硫氨酸替换亮氨酸去除在位置86处的潜在表位。
5.在CDRH3中残基102位(Kabat编号96)用苏氨酸替换亮氨酸，当其与在位置105处(Kabat编号100)由谷氨酰胺向甘氨酸的改变相组合时，将使与位置97处的潜在表位结合的MHC同种异型的数量从11减少至5。
6.用于去除在位置97处的潜在表位的变化(5)的备选方案为在残基102位(Kabat编号96)用脯氨酸替换亮氨酸。
7.在残基110位(Kabat编号104)用缬氨酸替换亮氨酸去除在位置100处的潜在表位。
6.去免疫序列的设计
参考去除潜在的T细胞表位所需的变化并考虑对抗体结构和结合可能关键的构架残基，设计去免疫的重链和轻链序列。除了基于贴面化序列的去免疫序列外，还对基于鼠序列的VH和VK各设计了另一序列，称为小鼠穿线肽形式(Mouse Peptide Threaded)(Mo PT)。对该形式而言，直接在鼠序列中进行改变以去除T细胞表位，但仅在CDR外进行被认为无害于结合的改变。在此形式的去免疫序列中没有尝试去除表面(B细胞)表位。
最初的去免疫VH包括上面第5节中的1、3、4、5和6替换并且不包括潜在的T细胞表位。设计了另外4个去免疫的VH，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响。版本2是版本1的备选，其中使用了备选的替换(上面2.5节中的2)以去除相同的潜在T细胞表位。对最初的去免疫序列(14.18DIVH1)进行的累积改变和仍然保留的潜在T细胞表位详见表2。包括小鼠的穿线形式用于比较。
表2：在去免疫的14.18VH中氨基酸的改变和潜在的表位
  变体   累积的残基改变  潜在的表位(18个受检对象中，潜在MHC结合者的数目)
  14.18DIVH1   没有   没有
  14.18DIVH2   41I→P，45L→T，50L→A   没有
  14.18DIVH3   65S→G   58(8)
  14.18DIVH4   71A→V   58(8)，62(4)
  14.18DIVH5   45T→L，41P→I   43(9)，58(8)，62(4)
  14.18MoPTVH   NA   43(9)，58(12)，62(11)
最初的去免疫VK包括上面的第5节中1、2、4、6和7的替换。该最初的去免疫VK不包括潜在的T细胞表位。进一步设计了5个去免疫的VK序列，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响。版本2是版本1的备选，其中使用不同的替换去除位置43处的潜在T细胞表位。版本3包括备选替换(上面部分2.5中的6)，其使与位置97处的潜在表位结合的MHC同种异型的数量从11减少至5。对最初的去免疫序列(14.18DIVK1)进行的累积替换和仍然保留的潜在T细胞表位详见表3。
表3：在去免疫的14.18VK中氨基酸的改变和潜在的表位
  变体   累积的残基改变<sup>＊</sup>   潜在的表位′(18个受检对象中，潜在MHC结合者的数目)
  14.18DIVKI   没有   没有
  14.18DIVK2   46L→M，49Y→H   没有
  14.18DIVK3   96P→T，100Q→G   97(5)
  14.18DIVK4   96T→L   97(11)
  14.18DIVK5   27e S→R   27(15)，97(11)
  14.18DIVK6   46M→L   27(15)，49(11)，97(11)
  14.18MoPTVK   NA   27(15)，49(11)，97(11)，100(4)
修饰表位的序列为：
14.18VH贴面化：
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAPGQRLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRAT
LSVDKSSSQAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18VK贴面化：
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDLAVYFCSQSTHVPPLTFGQGTKLEIK
14.18去免疫的VH1
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAIGQRLEWIGLIDPYYGGTSYNQKFKSRVT
ITADKSSSQAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18去免疫的VK1
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDMAVYFCSQSTHVPPPTFGQGTKVEIK
14.18去免疫的VH2
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAPGQRTEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKSRVT
ITADKSSSQAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18去免疫的VK2
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKMLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDMAVYFCSQSTHVPPPTFGQGTKVEIK
14.18去免疫的VH3
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAPGQRTEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRVT
ITADKSSSQAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18去免疫的VK3
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKMLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDMAVYFCSQSTHVPPTTFGGGTKVEIK
14.18去免疫的VH4
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAPGQRTEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRVT
ITVDKSSSQAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18去免疫的VK4
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKMLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDMAVYFCSQSTHVPPLTFGGGTKVEIK
14.18去免疫的VH5
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAIGQRLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRVT
ITVDKSSSQAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18去免疫的VK5
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKMLIHKVSNRFSCVPDRFSC
SGSGTDFTLTISRLEAEDMAVYFCSQSTHVPPLTFGGGTKVEIK
14.18VH小鼠，穿线肽(Mo PT)
EVQLVQSGPEVEKPSASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRAT
LTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18VK小鼠，穿线肽(Mo PT)
DVVMTQTPGSLPVSAGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLKISRVEAEDSGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK
14.18VH小鼠
EVQLLQSGPELEKPSASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRAT
LTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSS
14.18VK小鼠
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK
实施例22(KS抗体)
1与小鼠亚组构架的比较
将鼠KSVH和VK的氨基酸序列与Kabat鼠重链和轻链亚组(Kabat等人，1991)的共有序列比较。鼠KS VH不属于任一亚组，但最接近于亚组II(A)和V(A)。在通常为缬氨酸的位置2处发现了不寻常残基，在通常为谷氨酸的位置46处发现了不寻常残基，并且在通常为苏氨酸的位置68处发现了不寻常残基。残基69较常见地为亮氨酸或异亮氨酸。在82b处最经常见到的是丝氨酸。鼠KS VK可以被归于亚组VI(′图2)。在46和47位见到了不寻常残基，在这两位置处通常均为亮氨酸。残基58为不寻常的，在该位置处通常为亮氨酸或缬氨酸。
2与人构架进行比较
将鼠KS VH和VK的氨基酸序列与人胚系VH(Tomlinson，I.M等人，1992)和VK(Cox等人，1994)序列目录中的序列比较，并与人胚系J区序列(Routledge等人，1993)比较。所选的用于KS VH的参照人构架为具有人JH6的DP10。已发现该胚系序列存在于没有氨基酸变化的重排成熟抗体基因中。所选的用于KS VK的参照人构架为B1。对于构架-2，使用成熟人抗体IMEV的序列(Kabat等人1991)。该序列与紧靠CDR2的鼠序列相同。J区序列为人JK4。还未发现该胚系序列以重排的成熟抗体轻链形式存在。
3.贴面化序列的设计
确定参照人构架序列后，将425VH和VK构架中某些不一致的氨基酸残基改变为人参照序列中的相应氨基酸。被认为对抗体结构和结合关键的残基不包括在该过程中，且不进行改变。在此阶段仍保留的鼠残基主要是不位于表面的隐蔽残基，及例如在最后的抗体中靠近CDR的N-末端残基。该方法产生的序列大致类似于“贴面化”抗体，因为表面残基主要是人的，而隐蔽残基为原来的鼠序列。
4.肽穿线分析(threading analysis)
使用本发明方法分析鼠KS VH和VK序列和贴面化KS VH和VK序列。将氨基酸序列分成所有可能的13mer。将这些13mer的肽依次呈递给HLA-DR同种异型的结合沟模型，并且相对于每一等位基因将结合分值赋予每一个肽。对肽的每一口袋结合侧链计算构象分值。该分值基于立体重叠、肽和结合沟中的残基间的潜在氢键、静电相互作用以及肽和口袋残基间的有利接触。然后改变每一侧链的构象并再次计算分值。确定了最高的构象分值后，基于与沟结合的疏水残基、非沟的亲水残基和适合进入结合沟的残基数目计算结合分值。MHC II类的已知结合者得到显著的结合分值，几乎没有假阴性。这样，在当前的分析中达到显著结合分值的肽被认为是潜在的T细胞表位。对鼠和贴面化序列的肽穿线分析结果在表1中给出。
表1：在鼠和贴面化KS序列中潜在的T细胞表位
 序列  潜在的T细胞表位数   潜在表位的位置(潜在的MHC结合者的数目)
 鼠KS VH   6   35(11)，62(17)，78(12)，81(12)，89(6)，98(15)
 鼠KS VH   5   30(7)，62(15)，78(11)，89(6)，98(15)
 鼠KS VK   6   1(14)，2(5)，17(5)，27(5)，51(13)，72(18)
 贴面化KS VK   3   1(17)，27(5)，51(13)
5.潜在T细胞表位的去除
在构成表位的特定肽中对氨基酸进行替换而去除潜在的T细胞表位。如果可能的话通过插入具有类似物理化学特性的氨基酸进行替换。但是为了去除一些潜在的表位，可能需要替换为具有不同大小、电荷或疏水性的氨基酸。如果在CDR中进行可能对结合产生影响的改变，则需要产生有和没有此特定氨基酸替换的变体。用于替换的氨基酸残基的编号按Kabat进行。通过13mer中第一个残基所在的线性编号谈及潜在的T细胞表位。
从贴面化KS重链可变区去除T细胞表位所需的氨基酸改变如下：
1.在残基38位(Kabat编号38)用精氨酸替换赖氨酸去除残基30位的潜在表位。
2.在残基72位(Kabat编号71)用丙氨酸替换亮氨酸并在残基70位(Kabat编号69)用异亮氨酸替换苯丙氨酸去除残基62位的潜在表位。在人胚系VH序列DP10中发现Kabat编号69位为异亮氨酸而Kabat编号71位为丙氨酸。
3.在残基79位(Kabat编号78)用亮氨酸替换丙氨酸去除残基78位的潜在表位。
4.在残基91位(Kabat编号87)用苏氨酸替换甲硫氨酸去除残基89位的潜在表位。
5.在CDRH3中残基100位(Kabat编号96)用甲硫氨酸替换异亮氨酸去除残基98位的潜在表位。在CDRH3外的变化没有能消除该潜在表位的。
从贴面化KS轻链可变区去除潜在T细胞表位所需的氨基酸替换如下：
1.在残基32位(Kabat编号33)用异亮氨酸替换甲硫氨酸去除残基27位的潜在表位。该残基在CDR2中。在人抗体的该位置处常见异亮氨酸。
2.在残基处(Kabat编号3)用缬氨酸替换亮氨酸去除位置1处的潜在表位。
3.在残基59位(Kabat编号60)用丝氨酸替换丙氨酸去除残基51位的潜在表位。
6去免疫序列的设计
参考去除潜在的T细胞表位所需的变化并考虑对抗体结构和结合可能关键的构架残基，设计去免疫的重链和轻链序列。除了基于贴面化序列的去免疫序列外，对基于鼠序列的VH和VK各设计了另一序列，称为小鼠穿线肽形式(Mouse Peptide Threaded version)(Mo PT)。对该形式而言，直接在鼠序列中进行改变以去除T细胞表位，但仅在CDR外被认为无害于结合的位置进行改变。在此形式的去免疫序列中没有尝试去除表面(B细胞)表位。
最初的去免疫VH包括上面第5节中的1至5替换和在残基43位(Kabat编号43)的一个额外变化。用在鼠序列中存在的赖氨酸替换来自人构架的谷氨酰胺。赖氨酸带正电荷，因此明显不同于谷氨酰胺；该区域可能参与VH/VL接触。该最初的去免疫VH不包括潜在的T细胞表位。另设计了4个去免疫的VH，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响。对此最初的去免疫序列(KSDIVHv1)进行的累积改变和仍然保留的潜在T细胞表位详见表2。
表2：在去免疫的KS VH中氨基酸的改变和潜在的表位
 变体   累积的残基改变   潜在的表位(18个受检对象中，潜在MHC结合者的数目)
 KSDIVHv1   没有   没有
 KSDIVHv2   96M→I   98(15)
 KSDIVHv3   71A→L，78L→A   62(16)，78(11)，98(15)
 KSDIVHv4   38R→K   30(7)，62(16)，78(11)，98(15)
 KSDIVHv5   68T→A，69I→F   30(7)，62(17)，78(11)，98(15)
 KSMoPTVH   NA   98(15)，78(12)
最初的去免疫VK包括上面第5节中的替换1至3。另设计了3个去免疫的VK，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响。对最初的去免疫序列(KSDIVKv1)进行的累积替换和仍然保留的潜在T细胞表位详见表3。
表3：在去免疫的KS VK中氨基酸的改变和潜在的表位
  变体   累积的残基改变  潜在的表位(18个受检对象中，潜在MHC结合者的数目)
  KSDIVKv1   没有   没有
  KSDIVKv2   33I→M   27(5)
  KSDIVKv3   3V→L   1(17)，27(5)
  KSDIVKv4   60S→A   1(17)，27(5)，5(13)
  KSMoPTVK   NA   没有
修饰表位的序列：
KS VH贴面化：
QIQLVQSGPELKKPGSSVKiSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFT
fTlETSTSTAYLQLNNLRsEDmATYfCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS
KS VK贴面化：
QILLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYMLWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPARFSGSGSGTS
YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS去免疫的VH1
QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFT
ITAETSTSTLYLQLNNLRSEDTATYFCVRFMSKGDYWGQGTTVTVSS
KS去免疫的VK1
QIVLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYILWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPSRFSGSGSGTS
YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS去免疫的VH2
QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFT
ITAETSTSTLYLQLNNLRSEDTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS
KS去免疫的VK2
QIVLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYMLWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPSRFSGSGSGTS
YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS去免疫的VH3
QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFT
ITLETSTSTAYLQLNNLRSEDTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS
KS去免疫的VK3
QILLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYMLWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPSRFSGSGSGTS
YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS去免疫的VH4
QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFT
ITLETSTSTAYLQLNNLRSEDTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS
KS去免疫的VK4
QILLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYMLWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPARFSGSGSGTS
YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS去免疫的VH5
QIQLVQSGPELKKPGS SVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFA
FTLETSTSTAYLQLNNLRSEDTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS
KS去免疫的VK5
QILLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIYDTSNLASGFPARFSGSGSGTS
YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS VH小鼠，穿线肽(Mo PT)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFV
FSLETSASTAFLQLNNLRSEDTATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS
KS VK小鼠，穿线肽(Mo PT)
QIVLTQSPATLSASPGERVTITCSASSSVSYMLWYLQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPSRFSGSGSGTT
YSLIISSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK
KS VH小鼠
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFA
FSLETSASTAFLQINNLRNEDMATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS
KS VK小鼠
QILLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPARFSGSGSGTS
YSLIISSMEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK

Claims (16)

1.适于在生物分子的氨基酸序列中通过一些步骤鉴定一个或多个潜在的T细胞表位肽的方法，所述步骤包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定所述肽与MHC分子的结合，所述方法包括下列步骤：
(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；
(b)依次从所选区域中采集具预定一致大小的并至少由三个氨基酸残基构成的重叠氨基酸残基片段；
(c)对每一所述采集片段计算MHC II类分子结合分值，方法为对所述采集的氨基酸残基片段中的每一疏水氨基酸残基侧链赋值求和；以及
(d)基于所计算的片段的MHC II类分子结合分值，鉴定出至少一个适于改变的所述片段，以改变肽的总MHC II类结合分值并且不实质性降低该肽的治疗性用途，
其中步骤(c)通过应用改进的
Figure C028051570002C1
评分函数及如下方式实施，其中所述
Figure C028051570002C2
评分函数的改进为在其中包括12-6范德华配体-蛋白质能量排斥项和配体构象能量项，而所述方式为：
(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；
(2)针对所述MHC II类分子模型提供所容许的肽主链的第二数据库；
(3)从所述第一数据库选择一个模型；
(4)从所述第二数据库选择一个容许的肽主链；
(5)鉴定在每一采集片段中存在的氨基酸残基侧链；
(6)确定每一采集片段中存在的所有侧链的结合亲和性值；以及任选地
(7)对每一所述模型和每一所述主链重复步骤(1)至(5)。
2.权利要求1的方法，其中对每一芳族侧链的赋值约为对每一疏水性脂肪族侧链的赋值的一半。
3.权利要求1的方法，其中采集的氨基酸残基片段由13个氨基酸残基组成。
4.权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中连续采集的氨基酸残基片段有一个至五个氨基酸残基的重叠。
5.权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中连续采集的氨基酸残基片段基本上相互重叠。
6.权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中在连续采集的氨基酸残基片段中，只有一个氨基酸残基不发生重叠。
7.自亲本分子制备免疫原性改变的生物分子的方法，其中修饰的分子具有不同于所述亲本分子的氨基酸序列，并且相对于亲本分子而言当暴露于给定物种的免疫系统时显示出降低的免疫原性；所述方法包括：
(i)确定亲本生物分子或其部分的氨基酸序列；
(ii)用任一方法鉴定出蛋白氨基酸序列中的一个或多个潜在的T细胞表位，此方法包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合，
(iii)通过在最初确定的T细胞表位序列中改变至少一个氨基酸残基来设计新的序列变体，所述变体的修饰导致实质上减少或消除T细胞表位序列的活性或数量和/或实质上减少或消除能够结合来自所述生物分子的肽的MHC同种异型的数量，上述效果通过使用体外或in silico技术或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合或通过肽-MHC复合体与T细胞的结合而确定，
(iv)通过重组DNA技术构建此类序列变体，并试验所述变体以确定一个或多个具有所希望特性的变体，以及
(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)，
所述方法的特征在于根据步骤(ii)对T细胞表位序列的鉴定按照权利要求1至6中任意一项所述的方法实现。
8.权利要求7的方法，其中在任一最初存在的T细胞表位序列中改变1-9个氨基酸残基。
9.根据权利要求8的方法，其中在任一最初存在的T细胞表位序列中改变一个氨基酸残基。
10.权利要求7的方法，其中氨基酸的改变是参考同源蛋白质序列而进行的。
11.权利要求7的方法，其中氨基酸的改变是参考in silico模建技术而进行的。
12.权利要求7的方法，其中氨基酸残基的改变为在特定位点处对最初存在的氨基酸残基用另一氨基酸残基进行替换、添加或对其进行删除。
13.权利要求7的方法，其中额外地进行进一步改变，以恢复所述生物分子的生物活性。
14.权利要求13的方法，其中额外的进一步改变为特定氨基酸的替换、添加或删除。
15.根据权利要求7至14中任意一项所述的方法，其用于制备免疫原性降低的多肽、蛋白质、融合蛋白、抗体或其片段。
16.权利要求15的方法，其中所述多肽、蛋白质、融合蛋白或抗体选自：
(a)单克隆抗体：
抗40kD糖蛋白抗原的抗体KS 1/4，
抗GD2抗体14.18，
鼠抗Her2抗体4D5和其人源化形式
Figure C028051570004C1
抗IL-2R/Tac抗体
Figure C028051570004C2
抗CD52抗体
Figure C028051570004C3
抗CD20抗体C2B8，
Figure C028051570004C4
针对人C5补体蛋白质的抗体；
(b)蛋白质：
sTNF-R1，sTNF-R2，sTNFR-Fc
Figure C028051570004C5
蛋白质C，acrp30，蓖麻毒素A，CNTFR配体，
枯草杆菌蛋白酶，GM-CSF，人促卵泡激素，
β-葡糖脑苷脂酶，GLP-1，载脂蛋白Al。
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