(要旨)
本開示は、哺乳動物における免疫応答を調節するために有用な組成物および方法に関する。説明において詳述されかつ実用的な実施例において例示されるように、本発明者らは、抗CD200抗体が、レシピエント哺乳動物において腎臓同種移植片の生存を実質的に長期化させるために単一薬剤治療(このような治療は、本明細書において「単独療法」ともいわれる)として治療上有効であるということを発見した。移植レシピエントへのこの発見の利益は、数多い。例えば、単独療法としての抗CD200抗体の使用は、腎臓の同種移植片レシピエントのクオリティーオブライフを改善し得る。なぜなら、同種移植片拒絶は、1種以上の免疫抑制剤(そのうちの多く(単独でもしくは組み合わせのいずれかにおいて)は、重篤な副作用(例えば、脱毛、骨髄消耗(bone marrow depletion)、胃腸の不調、掻痒症、血小板減少症、貧血、腎毒性、膵炎、および感染症)を生じ得る)で一般に処置されるからである。狭い治療用量範囲内ですら、免疫抑制剤(例えば、カルシニューリンインヒビター(例えば、シクロスポリンA(CsA)およびFK−506))は、例えば、極めて腎毒性であり得る。Calneら、(1978) Lancet 2:1323−1327およびGaston (2009) Clin J Am Soc Nephrol 4(12):2029−2034。CsAもしくはFK−506の治療量以下の投与量での処置は、腎毒性の顕著に低いリスクを生じるが、移植片生存に関して治療的利益における顕著な低下を伴う。例えば、SeronおよびMoreso(2004) Transplant Proc 36:257Sを参照のこと。カルシニューリン治療に付随する制限および副作用を考慮すると、例えば、これらインヒビターの必要条件(用量レベルにおいてだろうと、処置の長さにおいてだろうと)を減少させ得ると同時に、移植片生存を長期化することに関して、治療効力の高いレベルを維持し得る新たな化合物を同定することは、明らかに非常に価値がある。本開示は、抗CD200抗体がこのような化合物であることを示す。
1種以上のさらなる免疫抑制剤の非存在下で抗CD200抗体を使用して、腎臓同種移植片生存を長期化する能力は、腎臓同種移植片レシピエントに、免疫抑制剤治療(例えば、組み合わせ治療)と関連した消耗性の副作用の多くを伴わずに、同じかもしくはさらにより大きな治療効果を提供する。さらに、上記1種以上のさらなる免疫抑制剤は、しばしば、上記患者に長期的に、またはおそらく無期限に、移植片生存を維持するために、投与されなければならない。本開示から明らかであり、実用的な実施例において例示されるように、抗CD200抗体単独療法は、いくつかの実施形態において、移植後7〜14日間にわたって投与され得、さらなる免疫抑制療法を必要としない場合ですら、上記移植片の長期間の生存をさらになお達成し得る。
抗CD200抗体単独療法の効力にも関わらず、本明細書に記載される抗CD200抗体はまた、治療プラットフォームとして有用である。すなわち、移植患者に柔軟な、代替の治療選択肢を提供する。例えば、本発明者らは、同種移植片を有する哺乳動物への抗CD200抗体の治療的投与が、上記哺乳動物に投与されている1種以上のさらなる免疫抑制剤の早期の中止(および/もしくは低下した用量)を可能にし得、治療効力をさらになお維持し得るということを発見した。実用的な実施例において記載されるように、同種移植片器官を有する哺乳動物への抗CD200抗体の投与は、同時のカルシニューリンインヒビター治療の早期の中止およびより低い投与量のうちの一方もしくは両方を可能にし、上記同種移植片の生存を長期化するにおいて治療効力をさらになお維持する。別の例において、ミコフェノレートを含まないかもしくはこれが低下した治療選択肢もまた、本明細書において提供される。
本発明者らはまた、哺乳動物への抗CD200抗体の皮下投与、またはより局所のもしくはデポー送達が、上記抗体の全身送達と同程度に有効に、同種移植片器官の生存を長期化し得ることを発見した。実用的な実施例において例示されるように、単独療法としての抗CD200抗体の皮下投与は、上記抗体の静脈内送達と同様に、レシピエント哺乳動物における腎臓同種移植片の生存を実質的に長期化し得る。上記例はまた、抗CD200抗体の皮下投与が、1種以上のさらなる免疫抑制剤との組み合わせにおいて、同種移植片器官(例えば、心臓)の生存を長期化し得る実験の結果を提供する。多くの利益は、抗CD200抗体の皮下送達もしくはデポー送達に付随する。例えば、頻繁なおよび/もしくは長期的な投与を要する治療適用のために、皮下送達もしくはデポー送達は、全体で上記治療剤のより少ない回数の投与を可能にし得る(上記治療剤のより高い濃度が各間隔において投入(deposit)され、上記化合物を上記哺乳動物にゆっくりと放出する)。第2に、抗CD200抗体の皮下(もしくはデポー)送達は、全身送達形態とともに、より多くの患者に、上記治療剤がどのようにおよびいつ投与されるかに関する選択を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、患者が、抗CD200抗体を自己投与することは、可能であり得る(例えば、このような医薬のために通院するか、または在宅看護師(in−home nurse)の訪問の調整をする(これらはともに、コストがかかりかつ不便であり得る)必要性を回避する)。従って、増大した患者選択肢は、同種移植片を有する患者にとって容易な自己投与選択肢を提供することによって、増大した患者コンプライアンスを最終的には明らかにする。
この目的のために、本開示は、上記抗体の皮下投与が有益である適用において使用するための、抗CD200抗体を含む水性溶液、およびその溶液を含む治療キットを提供する。上記溶液は、上記抗CD200抗体を少なくとも10mg/mLの濃度において含み得る。
よって、一局面において、本開示は、腎臓同種移植片の生存を長期化させるための方法を特徴とする。上記方法は、それを必要とするレシピエント哺乳動物に、抗CD200抗体を単一薬剤(単独療法)として上記レシピエント哺乳動物において腎臓同種移植片の生存を長期化するために有効な量で投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法はまた、上記腎臓同種移植片を上記レシピエント哺乳動物に移植する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ドナー哺乳動物(上記ドナー哺乳動物から、上記腎臓同種移植片が得られた)から取り出す前に、抗CD200抗体を上記ドナー哺乳動物に投与する工程をさらに包含し得る。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物に、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植後、少なくとも7日間(例えば、少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、28日間、29日間、30日間、31日間)にわたって投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植後、最大7日間まで(例えば、最大8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、28日間、29日間、30日間、31日間、32日間、33日間、34日間、35日間、36日間、37日間、38日間、39日間、40日間、41日間、42日間、43日間、44日間、45日間、46日間、47日間、48日間、49日間、もしくは50日間まで)にわたって、少なくとも1日1回投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の投与後、少なくとも7日間にわたって、しかし30日間未満(例えば、29日間未満、28日間、27日間、26日間、25日間、24日間、23日間、22日間、21日間、20日間、19日間、18日間、17日間、16日間、15日間、14日間、13日間、12日間、11日間、10日間、9日間、もしくは8日間)にわたって、少なくとも1日1回投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物への同種移植片の移植後、少なくとも2日間(例えば、少なくとも2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、もしくは14日間)にわたって有効なままであるのに十分大きい用量で投与され得る(上記抗体は、有効用量を維持するために必要である限り頻繁に投与される(例えば、単一用量は、14日間にわたって有効なままであるように十分大きいものであり得、この場合においては、単一用量のみが、上記抗体の有効量が14日間のみにわたって必要とされれば、14日ごとに1回もしくは1回だけ必要とされる)。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の有効量は、少なくとも7日間(例えば、少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、もしくは28日間以上)にわたって、上記レシピエント哺乳動物において維持される。上記のように、上記抗CD200抗体の単一用量が、上記哺乳動物において、上記抗CD200抗体の有効量を少なくとも7日間(例えば、少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、もしくは28日間以上)にわたって維持するために十分であり得ることは理解される。
使用される特定の投与スケジュール(例えば、量、頻度、および/もしくは間隔)が、患者間で変動し得るが、本明細書に記載される抗CD200抗体は、それを必要とする哺乳動物(例えば、患者)にこのようなレジメンの下で、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植後、上記哺乳動物において上記抗体の有効量を少なくとも7日間(例えば、少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、28日間、29日間、30日間、31日間)にわたって維持するように投与され得る。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植前および移植後、上記レシピエント哺乳動物に投与される。例えば、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植前の少なくとも1週間にわたって上記レシピエント哺乳動物に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の少なくとも2用量(例えば、少なくとも3用量、4用量、5用量、6用量、7用量、8用量、9用量、もしくはさらに10以上の用量)が、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植前に、上記レシピエント哺乳動物に投与される。
いくつかの実施形態において、上記腎臓同種移植片は、上記レシピエント哺乳動物に関して完全にMHC不適合である。いくつかの実施形態において、上記レシピエント哺乳動物は、上記腎臓同種移植片に対して予備感作(presensitize)される。いくつかの実施形態において、上記腎臓同種移植片は、上記レシピエント哺乳動物に関して、ABO不適合である。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物に静脈内投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物に皮下投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物に筋肉内投与される。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、少なくとも100日間にわたって腎臓同種移植片生存を生じる。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、少なくとも6ヶ月間(例えば、7ヶ月間、8ヶ月間、9ヶ月間、10ヶ月間、11ヶ月間、12ヶ月間、16ヶ月間、18ヶ月間、20ヶ月間、もしくは24ヶ月間以上)の腎臓同種移植片生存を生じる。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、長期間の腎臓同種移植片生存を生じる。
いくつかの実施形態において、上記レシピエント哺乳動物および上記腎臓同種移植片ドナーは、ヒトである。
別の局面において、本開示は、レシピエント哺乳動物において同種移植片器官の生存を長期化するための方法を特徴とし、上記方法は、それを必要とする同種移植片器官レシピエントに:(a)1種以上の免疫抑制剤;および(b)抗CD200抗体を投与し、それによって、上記患者において上記移植片の生存を長期化する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種での処置の、上記抗CD200抗体の非存在下での上記少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続期間と比較してより短い継続期間を可能にする。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種の、上記抗CD200抗体の非存在下での上記少なくとも1種の免疫抑制剤の用量レベルもしくは量と比較して低下した用量レベルもしくは量の要件を可能にする。
いくつかの実施形態において、上記免疫抑制剤のうちの少なくとも1種は、IL−2インヒビターであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、上記免疫抑制剤のうちの少なくとも1種は、mTORインヒビター(例えば、ラパマイシン)である。いくつかの実施形態において、上記免疫抑制剤のうちの少なくとも1種は、カルシニューリンインヒビター(例えば、シクロスポリンAもしくはFK−506)である。
いくつかの実施形態において、上記レシピエント哺乳動物への上記抗CD200抗体の投与は、少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続期間を少なくとも20%短くする。いくつかの実施形態において、上記レシピエント哺乳動物への上記抗CD200抗体の投与は、少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続期間を少なくとも50%短くする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ミコフェノレート治療(例えば、MMF治療)に感受性の患者にとっての代替治療ストラテジーを提供する。このような実施形態において、本明細書は、上記患者に、抗CD200抗体およびカルシニューリンインヒビター(例えば、シクロスポリンAもしくはタクロリムス)を投与する工程を包含する、ミコフェノレートを含まない選択肢を提供する(例えば、ここで上記インヒビターは、上記抗CD200抗体治療の非存在下で上記患者を処置するために必要とされる上記カルシニューリンインヒビターのその対応する量もしくは頻度より少ない量および/もしくは頻度において投与される)。
いくつかの実施形態において、例えば、患者が、カルシニューリンインヒビターに対して感受性がある場合、本明細書に記載される方法は、抗CD200抗体がミコフェノレート含有化合物(例えば、MMF)と関連して上記患者に投与される、カルシニューリンインヒビターを含まない代替選択肢を患者に提供する。上記ミコフェノレート化合物は、上記抗CD200抗体治療の非存在下で上記患者を処置するために必要とされる上記化合物の量もしくは頻度より少ない量および/もしくは頻度において上記患者に投与され得る。
別の局面において、本開示は、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するための方法を特徴とし、上記方法は、上記哺乳動物(例えば、ヒト)に:(a)本明細書に記載される抗CD200抗体および(b)ミコフェノレート含有化合物(例えば、MMF)を長期的に投与し、それによって、上記哺乳動物における上記同種移植片の生存を長期化する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体および/もしくはミコフェノレート含有化合物は、少なくとも7日間にわたって長期的に投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体もしくはミコフェノレート含有化合物は、少なくとも14日間にわたって長期的に投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の長期的投与は、上記哺乳動物において有効な量を維持するために必要とされる上記ミコフェノレート含有化合物の投与の、上記抗体の非存在下で有効量を維持するために必要とされる上記化合物の量および/もしくは頻度と比較して低下した量および/もしくは頻度を可能にする。
別の局面において、本開示は、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するための方法を特徴とし、上記方法は、上記哺乳動物(例えば、ヒト)に:(a)本明細書に記載される抗CD200抗体および(b)IL−2インヒビター(例えば、カルシニューリンインヒビター(例えば、シクロスポリンA))を長期的に投与し、それによって、上記哺乳動物における上記同種移植片の生存を長期化する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体および/もしくはIL−2インヒビターは、少なくとも7日間にわたって長期的に投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体もしくはIL−2インヒビターは、少なくとも14日間にわたって長期的に投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の長期的投与は、上記哺乳動物における有効量の維持に必要とされる上記IL−2インヒビターの投与の、上記抗体の非存在下で有効量を維持するために必要とされる上記インヒビターの量および/もしくは頻度と比較して低下した量および/もしくは頻度を可能にする。
別の局面において、本開示は、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するための方法を特徴とし、ここで上記方法は、上記同種移植片の移植の後(および必要に応じて、移植前および/もしくは移植中)に、上記レシピエント哺乳動物に:(a)抗CD200抗体および(b)1種以上のさらなる免疫抑制剤を投与する工程を包含し、ここで上記1種以上のさらなる免疫抑制剤は、ミコフェノレート化合物(例えば、MMF)およびIL−2インヒビター(例えば、カルシニューリンインヒビター(例えば、シクロスポリンA))を含み、上記さらなる免疫抑制剤のうちの1種以上は、上記抗CD200抗体の非存在下での等価な治療効力に必要とされる用量もしくは頻度よりも低い用量および/もしくは少ない頻度において投与される。等価な治療効力は、例えば、付随する抗CD200抗体治療の非存在下で上記1種以上のさらなる免疫抑制剤を投与された患者集団において観察される標準的もしくは歴史的な(historical)効力であり得る。
抗CD200抗体および1種以上の免疫抑制剤を含む、本明細書において記載される組み合わせ治療において、「1種以上の免疫抑制剤」は、用語「1種以上のさらなる免疫抑制剤」と交換可能に使用され得ることは理解される。
さらに別の局面において、本開示は、レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化するための方法を特徴とし、上記方法は、それを必要とする同種移植片器官のレシピエント哺乳動物に:(a)1種以上の免疫抑制剤;および(b)抗CD200抗体を投与し、それによって、上記哺乳動物における上記移植片の生存を長期化する工程を包含し、ここで上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物に皮下投与されるか、または上記レシピエント哺乳動物に静脈内投与される。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種での処置の、上記抗CD200抗体の非存在下での上記少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続期間に対してより短い継続期間を可能にする。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種の、上記抗CD200抗体の非存在下での上記少なくとも1種の免疫抑制剤の用量レベルもしくは量に対して低下した用量レベルもしくは量の要件を可能にする。
本明細書中に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物に皮下投与される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物に静脈内投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記方法は、上記ドナー哺乳動物(このドナー哺乳動物から、同種移植片器官が得られる)から取り出す前に、抗CD200抗体を上記ドナー哺乳動物に投与する工程をさらに包含し得る。
いくつかの実施形態において、上記同種移植片は、上記レシピエント哺乳動物に対して完全にMHC不適合である。いくつかの実施形態において、上記レシピエント哺乳動物は、上記同種移植片に対して予備感作される。いくつかの実施形態において、上記同種移植片は、上記レシピエント哺乳動物に対してABO不適合である。
いくつかの実施形態において、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種は、アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、フルダラビン、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、非ステロイド系抗炎症薬、およびIL−2インヒビター(例えば、mTORインヒビター(例えば、ラパマイシン)もしくはカルシニューリンインヒビター(例えば、FK−506もしくはシクロスポリンA))からなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、2種以上の免疫抑制剤が、上記レシピエント哺乳動物に投与される。いくつかの実施形態において、上記2種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも2種は、シクロスポリンAとシクロホスファミド、FK−506とシクロホスファミド、またはカルシニューリンインヒビター(シクロスポリンAもしくはFK−506)とミコフェノレート化合物(例えば、ミコフェノール酸モフェチルもしくはミコフェノール酸ナトリウム)である。
さらに別の局面において、本開示は、同種移植片器官をレシピエント哺乳動物に移植するための方法を特徴とする。上記方法は、(a)同種移植片器官をレシピエント哺乳動物に移植する前に、抗CD200抗体を上記レシピエント哺乳動物に投与する工程;(b)上記同種移植片器官を上記レシピエント哺乳動物に移植する工程;および(c)上記同種移植片器官の移植後に、抗CD200抗体を上記レシピエント哺乳動物に投与する工程を包含する。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物に皮下投与もしくは静脈内投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、単一薬剤治療(単独療法)として投与される。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ドナー哺乳動物(このドナー哺乳動物から、同種移植片器官が得られる)から取り出す前に、抗CD200抗体を上記ドナー哺乳動物に投与する工程を包含し得る。
いくつかの実施形態において、上記同種移植片は、上記レシピエント哺乳動物に対して完全にMHC不適合である。いくつかの実施形態において、上記レシピエント哺乳動物は、上記同種移植片に対して予備感作される。いくつかの実施形態において、上記同種移植片は、上記レシピエント哺乳動物に対してABO不適合である。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記レシピエント哺乳動物に、1種以上の免疫抑制剤(例えば、本明細書に記載される免疫抑制剤のうちのいずれか)を投与する工程を包含し得る。例えば、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種は、アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、フルダラビン、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、非ステロイド系抗炎症薬、およびIL−2インヒビター(例えば、mTORインヒビター(例えば、ラパマイシン)もしくはカルシニューリンインヒビター(例えば、FK−506もしくはシクロスポリンA))からなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、2種以上の免疫抑制剤は、上記レシピエント哺乳動物に投与される。いくつかの実施形態において、上記2種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも2種は、シクロスポリンAとシクロホスファミド、FK−506とシクロホスファミド、またはカルシニューリンインヒビター(シクロスポリンAもしくはFK−506)とミコフェノレート化合物(例えば、ミコフェノール酸モフェチルもしくはミコフェノール酸ナトリウム)である。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種での処置の、上記抗CD200抗体の非存在下での上記少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続期間に対してより短い継続期間を可能にする。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種の、上記抗CD200抗体の非存在下での上記少なくとも1種の免疫抑制剤の用量レベルもしくは量に対して低下した用量レベルもしくは量の要件を可能にする。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記同種移植片器官は、腎臓、肺、心臓、膵臓、脈管組織、肝臓もしくはその1つ以上の肝葉、皮膚、眼、胃腸組織、神経組織、筋組織、骨もしくは軟骨、骨髄、結合組織、赤血球、島細胞、角膜、および眼の水晶体からなる群より選択される。上記同種移植片器官は、いくつかの実施形態において、心臓もしくは腎臓である。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物への上記同種移植片の移植後、少なくとも7日間(例えば、少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、28日間、29日間、30日間、31日間)にわたって、上記レシピエント哺乳動物に投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物への上記同種移植片の移植後、最大7日間(例えば、最大8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、28日間、29日間、30日間、31日間、32日間、33日間、34日間、35日間、36日間、37日間、38日間、39日間、40日間、41日間、42日間、43日間、44日間、45日間、46日間、47日間、48日間、49日間、もしくは50日間)までにわたって、少なくとも1日1回投与される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物への上記同種移植片の移植後、少なくとも7日間であるが、30日間未満(例えば、29日間、28日間、27日間、26日間、25日間、24日間、23日間、22日間、21日間、20日間、19日間、18日間、17日間、16日間、15日間、14日間、13日間、12日間、11日間、10日間、9日間、もしくは8日間未満)にわたって、少なくとも1日1回投与される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、抗CD200抗体は、2日ごとに1回、上記レシピエント哺乳動物に投与される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗体は、少なくとも1週間に1回投与され得る。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗体は、少なくとも2週間に1回(例えば、少なくとも12日ごと、13日ごと、14日ごと、15日ごと、もしくは16日ごとに1回)投与され得る。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種は、上記レシピエント哺乳動物に長期的に投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、CD200とCD200レセプターとの間の相互作用を阻害する。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、重鎖定常領域の非改変形態と比較して、低下したエフェクター機能を有するその対応する改変重鎖定常領域を含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、完全抗体である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、齧歯類抗体、脱免疫化抗体、もしくは霊長類化抗体(primatized antibody)である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、完全抗CD200抗体のCD200結合フラグメントである。上記CD200結合フラグメントは、一本鎖抗体、Fab、Fab’、F(ab)’2、F(ab’)3、Fv、Fd、ミニボディー、ダイアボディー、および単一ドメイン抗体からなる群より選択されるものであり得る。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、サマリズマブ(samalizumab)である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記レシピエント哺乳動物は、ヒトであり、上記同種移植片器官は、ヒトから得られる。
さらに別の局面において、本開示は、レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化させるための方法を特徴とし、上記方法は、同種移植片器官を有するレシピエント哺乳動物に、抗CD200抗体を、上記レシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果の発生を生成および維持し、従って、上記レシピエント哺乳動物における上記同種移植片器官の生存を長期化させるのに十分な量および頻度において投与する工程を包含する。
別の局面において、本開示は、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するための方法を特徴とし、上記方法は、(i)同種移植片器官を有するレシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生成するのに有効な抗CD200抗体の相対的用量を決定する工程;上記レシピエント哺乳動物に、上記抗CD200抗体の相対的用量を、上記レシピエント哺乳動物において上記所望の免疫調節効果を維持するのに十分な頻度で投与する工程を包含する。
さらに別の局面において、本開示は、レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化するための方法を特徴とし、上記方法は、同種移植片器官を有するレシピエント哺乳動物に:(a)抗CD200抗体および(b)1種以上の免疫抑制剤を投与する工程を包含し、ここで上記抗体および1種以上の免疫抑制剤は、上記レシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果の発生を生成および維持し、従って、上記レシピエント哺乳動物における上記同種移植片器官の生存を長期化するのに十分な量および頻度において投与される。
別の局面において、本開示は、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するための方法を特徴とし、上記方法は、同種移植片器官を有するレシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生成するのに有効な、(i)抗CD200抗体および(ii)1種以上の免疫抑制剤の相対的用量を決定する工程;ならびに上記レシピエント哺乳動物に、上記抗CD200抗体および1種以上の免疫抑制剤の上記相対的用量を、上記レシピエント哺乳動物において、上記所望の免疫調節効果を維持するのに十分な頻度で投与する工程を包含する。
実用的な実施例において詳述されるように、本発明者らは、レシピエント哺乳動物に移植するための抗CD200抗体の投与が、上記哺乳動物における脾細胞によるSHIP(SH2含有イノシトール5’−ホスファターゼ)の発現を低下させることを発見した。SHIPは、PI3−キナーゼに刺激の際に、造血細胞の増殖、生存、活性化を抑制する細胞内ホスファターゼである。Lioubinら、(1996) Mol Cell Biol 14:5682−5691およびLiuら、(1997) J Biol Chem 272:8983−8988。
SHIP欠損マウスは、報告に拠れば、増大した数の単球およびマクロファージ、増強した生存、増殖および分化を有するそれらの造血性前駆体を示す。さらに、SHIP欠損マウスはまた、MHC不適合骨髄を激しく拒絶できず、同種骨髄移植後の移植片対宿主病(GVHD)の発症に対して耐性である。Wangら、(2002) Science 295:2094−2097。さらに、SHIP欠損マウスのT細胞は、Tregへと発生する増強した能力を有する。Kerr (2008) Curr Stem Cell Res Ther 3(2):99−106。
本開示は、いかなる特定の理論にも作用機構にも束縛されないが、本発明者らは、同種移植片レシピエント哺乳動物に投与される抗CD200抗体の治療効果が、少なくとも一部は、SHIP依存性機構に由来すると考える。すなわち、同種移植片を有する哺乳動物への抗CD200抗体の投与は、免疫細胞によるSHIP発現を低下させ、このことは、次に、とりわけ、単球およびマクロファージ、損なわれた抗原特異的T細胞増殖、増強されたTreg発生、およびより顕著なTh1サイトカイン表現型を生じる。よって、いくつかの実施形態において、抗CD200抗体は、1種以上のさらなる免疫抑制剤ありもしくはなしで、上記哺乳動物から得られた生物学的サンプルにおいて免疫細胞による低下したSHIP発現を維持するために十分な量および頻度において、同種移植片レシピエントに投与され得る。すなわち、上記所望の免疫調節効果は、上記哺乳動物から得られた生物学的サンプル(例えば、血液サンプルもしくは脾臓組織サンプル)中の複数の免疫細胞(例えば、T細胞、B細胞、顆粒球、単球、および/もしくはマクロファージ)による低下したSHIP発現であり得る。上記機構(繰り返すと、本開示の範囲を限定しないが)は、CD200をなぜ阻害するかに関する知見を提供し、免疫抑制タンパク質は、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するために有用である。
いくつかの実施形態において、上記所望の免疫調節効果は、以下からなる群より選択される:(i)CD11c+CD49b−細胞によるCD40の発現における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプの細胞によるCD40の発現レベルに対する低下;(ii)CD11c+CD49b−細胞によるMHCクラスIIの発現における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプの細胞によるMHCクラスIIの発現レベルに対する低下;(iii)CD11c+CD49b−細胞によるCD80の発現における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプの細胞によるCD80の発現レベルに対する低下;(iv)CD11c+CD49b−細胞によるIL−12の発現における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプの細胞によるIL−12の発現レベルに対する増大;(v)調節性T細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプの調節性T細胞の濃度に対する増大;(vi)Gr−1+CD11b+CD45+細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのGr−1+CD11b+CD45+細胞の濃度に対する増大;(vii)F4/80+CD45+細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのF4/80+CD45+細胞の濃度に対する低下;(viii)CD3+CD25+T細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのCD3+CD25+T細胞の濃度に対する低下;(ix)CD3+CD8+T細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのCD3+CD8+T細胞の濃度に対する低下;(x)CD3+CD200R+細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのCD3+CD200R+細胞の濃度に対する増大;(xi)CD19+CD45+細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのCD19+CD45+T細胞の濃度に対する低下;ならびに(xii)上記レシピエント哺乳動物から得られた生物学的サンプル中の複数の免疫細胞(例えば、T細胞、B細胞、および/もしくはマクロファージ)によるSHIPの発現における低下。いくつかの実施形態において、上記調節性T細胞は、CD4+CD25+FoxP3+細胞である。いくつかの実施形態において、上記CD11c+CD49b−細胞は、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)である。いくつかの実施形態において、本明細書で考察される特定の細胞集団の濃度は、全脾細胞集団に対する上記細胞集団の濃度である。いくつかの実施形態において、上記バイオマーカーのうちの少なくとも2種の変化は、所望の免疫調節効果が、上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。いくつかの実施形態において、上記バイオマーカーのうちの少なくとも3種(例えば、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、もしくは全て)における変化は、免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、CD11c+CD49b−細胞によるCD40の発現における少なくとも10%(例えば、少なくとも11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、もしくは75%以上)の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、CD11c+CD49b−細胞によるMHCクラスIIの発現における少なくとも10%(例えば、少なくとも11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、もしくは75%以上)の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、CD11c+CD49b−樹状細胞によるCD80の発現における少なくとも50%(例えば、少なくとも51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、もしくは90%以上)の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、CD11c+CD49b−細胞によるIL−12の発現における少なくとも50%(例えば、少なくとも51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、もしくは90%以上)の増大は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、Gr−1+CD11b+CD45+細胞の濃度における少なくとも50%(例えば、少なくとも75%、100%、125%、150%、175%、200%、225%、250%、275%、300%、325%、350%、375%、もしくは400%以上)の増大は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、調節性T細胞の濃度における少なくとも少なくとも50%(例えば、少なくとも75%、100%、125%、150%、175%、200%、225%、250%、275%、300%、325%、350%、375%、もしくは400%以上)の増大は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、F4/80+CD45+細胞の濃度における少なくとも50%(例えば、少なくとも51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、もしくは90%以上)の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、CD3+CD25+T細胞の濃度における少なくとも50%(例えば、少なくとも51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、もしくは90%以上)の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、CD3+CD8+T細胞の濃度における少なくとも10%(例えば、少なくとも11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、もしくは75%以上)の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、CD3+CD4+T細胞の濃度における少なくとも5%(例えば、少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、もしくは75%以上)の増大は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、CD3+CD200R+細胞の濃度における少なくとも5%(例えば、少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、もしくは75%以上)の増大は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、CD19+CD45+細胞の濃度における少なくとも50%(例えば、少なくとも51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、もしくは90%以上)の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、複数の免疫細胞(例えば、T細胞、B細胞、および/もしくはマクロファージ)によるSHIP発現における少なくとも20%(例えば、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、もしくは75%)の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す。
いくつかの実施形態において、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種は、アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、フルダラビン、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、非ステロイド系抗炎症薬、ラパマイシン、およびFK−506からなる群より選択される。例えば、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種は、シクロスポリンAである。
さらに別の局面において、本開示は、少なくとも、または約10mg/mL(例えば、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、もしくは100mg/mL以上)に等しい濃度において抗CD200抗体を含む水性溶液を提供する。
別の局面において、本開示は、(i)本明細書に記載される上記抗CD200抗体含有水性溶液のうちのいずれか;および(ii)上記溶液を哺乳動物に送達するための手段を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、上記手段は、上記哺乳動物への上記溶液の皮下送達もしくは筋肉内送達に適している。いくつかの実施形態において、上記手段は、シリンジもしくはペン型注射器である。
いくつかの実施形態において、上記キットは、哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化することにおける使用のための1種以上の免疫抑制剤をさらに含み得る。上記薬剤は、アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、フルダラビン、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、非ステロイド系抗炎症薬、ラパマイシン、およびFK−506からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、上記キットは、カルシニューリンインヒビター(例えば、シクロスポリンAもしくはFK−506)およびシクロホスファミドのうちの一方もしくは両方を含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、カルシニューリンインヒビター(例えば、シクロスポリンAもしくはFK−506)およびミコフェノレート化合物のうちの一方もしくは両方を含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、ラパマイシン、もしくはFK−506を含む。
さらに別の局面において、本開示は、1つ以上の容器(ここで各容器は、少なくとも10mg/mLの濃度の抗CD200抗体を含む無菌用液を含み、各容器は、上記抗CD200抗体の少なくとも1の薬学的単位投与形態を含む)を含むキットを特徴とする。いくつかの実施形態において、各容器は、0.05mg〜10mgの間の上記抗CD200抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、約1mg〜100mgの間の上記抗CD200抗体を含む。いくつかの実施形態において、各容器は、0.1mL〜1mL(両端含む)の容積を有する。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つの容器は、哺乳動物への皮下注射に、または哺乳動物への筋肉内注射に適した水性溶液を含む。
本明細書に記載されるキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、CD200とCD200レセプターとの間の相互作用を阻害する。上記抗CD200抗体は、重鎖定常領域の非改変形態と比較して、低下したエフェクター機能を有するその対応する改変重鎖定常領域を含む。上記抗CD200抗体は、完全抗体であり得る。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、齧歯類抗体、脱免疫化抗体、もしくは霊長類化抗体である。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、完全抗CD200抗体のCD200結合フラグメントである。例えば、上記CD200結合フラグメントは、一本鎖抗体、Fab、Fab’、F(ab)’2、F(ab’)3、Fv、Fd、ミニボディー、ダイアボディー、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、サマリズマブである。
別の局面において、本開示は、少なくとも10mg/mLの濃度の抗CD200抗体を含む無菌溶液を含む充填済みシリンジを特徴とする。いくつかの実施形態において、上記溶液は、皮下投与のために処方される。いくつかの実施形態において、上記溶液は、筋肉内投与のために処方される。
いくつかの実施形態において、上記シリンジは、上記溶液中に上記抗CD200抗体の少なくとも1の薬学的単位投与形態を含む。いくつかの実施形態において、上記シリンジは、約1mg〜100mgの間の上記抗CD200抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記薬学的単位投与形態は、容積1mL以下(例えば、0.5mL以下)を有する。
本明細書に記載される充填済みシリンジのうちのいずれかのいくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、CD200とCD200レセプターとの間の相互作用を阻害する。上記抗CD200抗体は、重鎖定常領域に非改変形態と比較して、低下したエフェクター機能を有するその対応する改変重鎖定常領域を含み得る。上記抗CD200抗体は、完全抗体であり得る。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、齧歯類抗体、脱免疫化抗体、もしくは霊長類化抗体である。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、完全抗CD200抗体のCD200結合フラグメントである。例えば、上記CD200結合フラグメントは、一本鎖抗体、Fab、Fab’、F(ab)’2、F(ab’)3、Fv、Fd、ミニボディー、ダイアボディー、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、サマリズマブである。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、交換可能に使用され、長さもしくは翻訳後修飾に拘わらず、アミノ酸の任意のペプチド結合した鎖を意味する。本明細書に記載されるCD200タンパク質は、野生型タンパク質を含むかもしくは野生型タンパク質であってもよく、50個以下(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、12個、15個、20個、25個、30個、35個、40個もしくは50個以下)の保存的アミノ酸置換を有する改変体であり得る。保存的置換は、代表的には、以下の群内の置換を含む:グリシンおよびアラニン;バリン、イソロイシン、およびロイシン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニン;リジン、ヒスチジンおよびアルギニン;ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
本明細書に記載されるCD200タンパク質はまた、上記タンパク質の「抗原性ペプチドフラグメント」を含み、これらは、全長CD200タンパク質より短いが、上記全長タンパク質が哺乳動物において抗原性応答を誘導する能力のうちの少なくとも10%(例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、もしくは100%以上)を保持する(以下の「抗体を生成するための方法」を参照のこと)。CD200タンパク質の抗原性ペプチドフラグメントは、上記タンパク質の末端欠失改変体および内部欠失改変体を含む。欠失改変体は、(2個以上のアミノ酸の)1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、もしくは20個の、アミノ酸セグメントもしくは連続しない単一のアミノ酸を欠き得る。抗原性ペプチドフラグメントは、長さが少なくとも6個(例えば、少なくとも7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、もしくは200個以上)のアミノ酸残基(例えば、配列番号1〜3のうちのいずれか1つにおける少なくとも6個の連続するアミノ酸残基)であり得る。いくつかの実施形態において、ヒトCD200タンパク質の抗原性ペプチドフラグメントは、長さが225個未満(例えば、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、95個、90個、85個、80個、75個、60個、50個、49個、48個、47個、46個、45個、44個、43個、42個、41個、40個、39個、38個、37個、36個、35個、34個、33個、32個、31個、30個、29個、28個、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、もしくは7個未満)のアミノ酸残基(例えば、配列番号1〜3のうちのいずれかにおける225個未満の連続するアミノ酸残基)である。いくつかの実施形態において、全長CD200タンパク質の抗原性ペプチドフラグメントは、長さが少なくとも6個のアミノ酸残基であるが、225個未満のアミノ酸残基である。
いくつかの実施形態において、上記ヒトCD200タンパク質は、配列番号1もしくは配列番号2(以下を参照のこと)に示されるアミノ酸配列を有する上記ヒトCD200タンパク質に対して70(例えば、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100)%同一であるか、またはそれ以上のアミノ酸配列を有し得る。
パーセント(%)アミノ酸配列同一性は、参照配列および候補配列をアラインし、必要であればギャップを導入して、最大%配列同一性を達成した後の、参照配列中のアミノ酸に同一である候補配列中のアミノ酸のパーセンテージとして定義される。%配列同一性を決定する目的のアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある種々の方法で、例えば、公に入手可能なコンピューターソフトウェア(例えば、BLAST、BLAST−2、ALIGN、ALIGN−2もしくはMegalign(DNASTAR)ソフトウェア)を使用して、達成され得る。アラインメントを測定するための適切なパラメーター(比較されている配列の全長にわたり最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む)は、公知の方法によって決定され得る。
例示的なヒトCD200タンパク質およびこれらの抗原性ペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、当該分野で公知であり、以下に記載される。
本明細書で使用される場合、抗CD200抗体は、完全抗体および上記完全抗体のCD200結合フラグメントの両方を含む。完全抗体は、異なる抗体アイソタイプ(IgM抗体、IgG抗体、IgA抗体、IgD抗体、およびIgE抗体を含む)を含む。用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化抗体もしくはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化ヒト抗体、および完全ヒト抗体を含む。上記抗体は、種々の種のうちのいずれか(例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、サル、ヒヒ、もしくはチンパンジー)、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット、およびマウス)のうちのいずれかにおいて作製され得るかもしくはこれらのうちのいずれかに由来し得る。上記抗体は、精製されていてもよいし、組換え抗体であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「抗体フラグメント」、「抗原結合フラグメント」、もしくは類似の用語は、抗原(例えば、ヒトCD200もしくは本明細書において定義されるとおりのそのフラグメント)に結合する能力を保持する抗体のフラグメント(例えば、一本鎖抗体、単鎖Fvフラグメント(scFv)、Fdフラグメント、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、もしくはF(ab’)2フラグメント)に言及する。scFvフラグメントは、上記scFvが由来する上記抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む単一のポリペプチド鎖である。さらに、イントラボディー、ミニボディー、トリアボディー、およびダイアボディーはまた、抗体の定義に含まれ、本明細書に記載される方法における使用に適合している。例えば、Todorovskaら、(2001) J Immunol Methods 248(1):47−66;HudsonおよびKortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177−189;Poljak (1994) Structure 2(12):1121−1123;RondonおよびMarasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257−283(これらのうちの各々の開示は、それらの全体が本明細書に参考として援用される)を参照のこと。二重特異的抗体(DVD−Ig抗体を含む;以下を参照のこと)はまた、用語「抗体」によって包含される。二重特異的抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくは、ヒト抗体もしくはヒト化抗体である。
抗体のCD200結合フラグメントはまた、例えば、単一ドメイン抗体(例えば、ラクダ化(camelized)単一ドメイン抗体)を含む。例えば、Muyldermansら、(2001) Trends Biochem Sci 26:230−235;Nuttallら、(2000) Curr Pharm Biotech 1:253−263 ;Reichmannら、(1999) J Immunol Meth 231:25−38;PCT出願公開番号WO 94/04678およびWO 94/25591;ならびに米国特許第6,005,079号(これらのうちの全ては、それらの全体が本明細書に参考として援用される)を参照のこと。いくつかの実施形態において、本開示は、単一ドメイン抗体を形成するような改変を有する2個のVHドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
本明細書で使用される場合、用語「長期的に」(例えば、化合物を長期的に投与するために)、もしくは類似の用語は、少なくとも7日間(例えば、少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間)にわたって、上記被験体において上記薬剤の有効量を維持するために十分な量および頻度において、薬剤(例えば、本明細書に記載される抗CD200抗体および/もしくは免疫抑制剤)が被験体(例えば、移植患者)に投与される、投与法に言及する。いくつかの実施形態において、薬剤は、少なくとも1ヶ月(例えば、少なくとも2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、もしくは6ヶ月)にわたって被験体に長期的に投与され得る。いくつかの実施形態において、薬剤は、1年以上にわたって被験体に長期的に投与され得る。
別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が支配する。好ましい方法および材料は、以下に記載されるが、本明細書に記載されるものに類似もしくは等価な方法および材料はまた、本開示の方法および組成物の実施もしくは試験において使用され得る。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
本開示の他の特徴および利点(例えば、レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化するための方法)は、以下の説明、実施例および特許請求の範囲から明らかである。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
腎臓同種移植片の生存を長期化するための方法であって、該方法は、腎臓同種移植片の生存の長期化を必要とするレシピエント哺乳動物に、該レシピエント哺乳動物における該腎臓同種移植片の生存を長期化するために有効な量および頻度において、単一薬剤として抗CD200抗体を投与する工程を包含する、方法。
(項目2)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植後、該レシピエント哺乳動物に、少なくとも7日間にわたって投与される、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植後、最大7日間までにわたって少なくとも1日1回投与される、項目1に記載の方法。
(項目4)
上記抗CD200抗体が、上記腎臓移植片の移植後、上記哺乳動物に、最大14日間までにわたって少なくとも1日1回投与される、項目1に記載の方法。
(項目5)
上記抗CD200抗体の有効量が、上記レシピエント哺乳動物において少なくとも7日間にわたって維持される、項目1に記載の方法。
(項目6)
上記抗CD200抗体の有効量が、上記レシピエント哺乳動物において少なくとも14日間にわたって維持される、項目1に記載の方法。
(項目7)
上記抗CD200抗体の単一用量が、上記抗CD200抗体の有効量を上記哺乳動物において少なくとも7日間にわたって維持するために十分である、項目5に記載の方法。
(項目8)
上記抗CD200抗体の単一用量が、上記抗CD200抗体に有効量を上記哺乳動物において少なくとも14日間にわたって維持するために十分である、項目6に記載の方法。
(項目9)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植前および移植後に、該レシピエント哺乳動物に投与される、項目1に記載の方法。
(項目10)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植の少なくとも1週間前に、該レシピエント哺乳動物に投与される、項目9に記載の方法。
(項目11)
上記抗CD200抗体の少なくとも2用量が、上記レシピエント哺乳動物への上記腎臓同種移植片の移植前に、該レシピエント哺乳動物に投与される、項目9または10に記載の方法。
(項目12)
上記腎臓同種移植片が得られたドナー哺乳動物から取り出す前に、抗CD200抗体を該ドナー哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目13)
上記腎臓同種移植片が、上記レシピエント哺乳動物に対して完全にMHC不適合である、項目1に記載の方法。
(項目14)
上記レシピエント哺乳動物が、上記腎臓同種移植片に予備感作される、項目1に記載の方法。
(項目15)
上記腎臓同種移植片が、上記レシピエント哺乳動物に対してABO不適合である、項目1に記載の方法。
(項目16)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物に静脈内投与される、項目1に記載の方法。
(項目17)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物に皮下投与される、項目1に記載の方法。
(項目18)
上記抗CD200抗体の投与が、少なくとも100日間にわたって腎臓同種移植片の生存を生じる、項目1に記載の方法。
(項目19)
上記抗CD200抗体の投与が、少なくとも6ヶ月間にわたって腎臓同種移植片の生存を生じる、項目1に記載の方法。
(項目20)
上記抗CD200抗体の投与が、少なくとも1年間にわたって腎臓同種移植片の生存を生じる、項目1に記載の方法。
(項目21)
レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化するための方法であって、該方法は、同種移植片器官の生存の長期化を必要とする同種移植片器官のレシピエント哺乳動物に:(a)1種以上の免疫抑制剤;および(b)抗CD200抗体を投与し、それによって、該レシピエント哺乳動物における該移植片の生存を長期化する工程を包含し、ここで該抗CD200抗体の投与は、該1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種での処置の、該抗CD200抗体の非存在下での該少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続期間に対してより短い継続期間を可能にする、方法。
(項目22)
上記レシピエント哺乳動物への上記抗CD200抗体の投与が、少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続期間を少なくとも20%短くする、項目21に記載の方法。
(項目23)
上記レシピエント哺乳動物への上記抗CD200抗体の投与が、少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続期間を少なくとも50%短くする、項目21に記載の方法。
(項目24)
レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化するための方法であって、該方法は、同種移植片器官の生存の長期化を必要とする同種移植片器官のレシピエント哺乳動物に:(a)1種以上の免疫抑制剤;および(b)抗CD200抗体を投与し、それによって、該哺乳動物における該移植片の生存を長期化する工程を包含し、ここで該抗CD200抗体は、該レシピエント哺乳動物に皮下投与されるか、または該レシピエント哺乳動物に静脈内投与される、方法。
(項目25)
上記抗CD200抗体の投与が、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種での処置の、該抗CD200抗体の非存在下での該少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続時間に対してより短い継続時間を可能にする、項目24に記載の方法。
(項目26)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物に皮下投与される、項目21〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物に静脈内投与される、項目21〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
上記同種移植片器官が得られたドナー哺乳動物から取り出す前に、該ドナー哺乳動物に抗CD200抗体を投与する工程をさらに包含する、項目21〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
上記同種移植片器官が、上記レシピエント哺乳動物に関して完全にMHC不適合である、項目21〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
上記レシピエント哺乳動物が、上記同種移植片器官に予備感作される、項目21〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
上記同種移植片器官が、上記レシピエント哺乳動物に対してABO不適合である、項目21〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種が、アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、フルダラビン、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、非ステロイド系抗炎症薬、ラパマイシン、およびFK−506からなる群より選択される、項目21〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
2種以上の免疫抑制剤が、上記レシピエント哺乳動物に投与される、項目21〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目34)
上記2種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも2種が、シクロスポリンAとシクロホスファミドである、項目33に記載の方法。
(項目35)
同種移植片器官をレシピエント哺乳動物に移植するための方法であって、該方法は、
(a)同種移植片器官をレシピエント哺乳動物に移植する前に、抗CD200抗体を該レシピエント哺乳動物に投与する工程;
(b)該同種移植片器官を該レシピエント哺乳動物に移植する工程;および
(c)該同種移植片器官の移植後に、抗CD200抗体を該レシピエント哺乳動物に投与する工程、
を包含する、方法。
(項目36)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物に皮下投与されるかもしくは静脈内投与される、項目35に記載の方法。
(項目37)
上記抗CD200抗体が、単一薬剤治療として投与される、項目35に記載の方法。
(項目38)
上記同種移植片器官が得られたドナー哺乳動物から取り出す前に、抗CD200抗体を該ドナー哺乳動物を投与する工程をさらに包含する、項目35に記載の方法。
(項目39)
上記同種移植片器官が、上記レシピエント哺乳動物に関して完全にMHC不適合である、項目35に記載の方法。
(項目40)
上記レシピエント哺乳動物が、上記同種移植片器官に予備感作される、項目35に記載の方法。
(項目41)
上記同種移植片器官が、上記レシピエント哺乳動物に関してABO不適合である、項目35に記載の方法。
(項目42)
上記レシピエント哺乳動物に1種以上の免疫抑制剤を投与する工程をさらに包含する、項目35に記載の方法。
(項目43)
上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種が、アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、フルダラビン、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、非ステロイド系抗炎症薬、ラパマイシン、およびFK−506からなる群より選択される、項目42に記載の方法。
(項目44)
2種以上の免疫抑制剤が、上記レシピエント哺乳動物に投与される、項目35に記載の方法。
(項目45)
上記2種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも2種が、シクロスポリンAとシクロホスファミドである、項目44に記載の方法。
(項目46)
上記同種移植片器官の拒絶を予防するために、上記抗CD200抗体の投与が、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種での処置の、該抗CD200抗体の非存在下での該少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続期間に対してより短い継続期間を可能にするか、または該抗CD200抗体の投与は、該1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種の、該抗CD200抗体の非存在下での該少なくとも1種の免疫抑制剤の用量に対してより低い用量を可能にする、項目42〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
上記同種移植片器官が、腎臓、肺、心臓、膵臓、脈管組織、肝臓もしくはその1つ以上の肝葉、皮膚、眼、胃腸組織、神経組織、筋組織、骨もしくは軟骨、骨髄、結合組織、赤血球、島細胞、角膜、および眼の水晶体からなる群より選択される、項目21〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目48)
上記同種移植片器官が、心臓もしくは腎臓である、項目21〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物に1日1回投与される、項目21〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物に2日ごとに1回投与される、項目21〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目51)
上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種が、上記レシピエント哺乳動物に長期的に投与される、項目21〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目52)
上記抗CD200抗体が、上記同種移植片器官の移植後、少なくとも7日間にわたって投与される、項目21〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目53)
上記抗CD200抗体が、上記同種移植片器官の移植後、少なくとも14日間にわたって投与される、項目21〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目54)
上記抗CD200抗体の有効量が、上記レシピエント哺乳動物において少なくとも7日間にわたって投与される、項目21〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目55)
上記抗CD200抗体の有効量が、上記レシピエント哺乳動物において少なくとも14日間にわたって維持される、項目21〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目56)
上記抗CD200抗体の単一用量が、該抗CD200抗体の有効量を、上記哺乳動物において少なくとも7日間にわたって維持するのに十分である、項目54に記載の方法。
(項目57)
上記抗CD200抗体の単一用量が、該抗CD200抗体の有効量を、上記哺乳動物において少なくとも14日間にわたって維持するのに十分である、項目55に記載の方法。
(項目58)
上記抗CD200抗体が、CD200とCD200レセプターとの間の相互作用を阻害する、項目1〜57のいずれか1項に記載の方法。
(項目59)
上記抗CD200抗体が、重鎖定常領域の非改変形態と比較して、低下したエフェクター機能を有するその対応する改変重鎖定常領域を含む、項目1〜58のいずれか1項に記載の方法。
(項目60)
上記抗CD200抗体が、完全抗体である、項目1〜59のいずれか1項に記載の方法。
(項目61)
上記抗CD200抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、齧歯類抗体、脱免疫化抗体、もしくは霊長類化抗体である、項目1〜60のいずれか1項に記載の方法。
(項目62)
上記抗CD200抗体が、完全抗CD200抗体のCD200結合フラグメントである、項目1〜59または61のいずれか1項に記載の方法。
(項目63)
上記CD200結合フラグメントが、一本鎖抗体、Fab、Fab’、F(ab)’ 2 、F(ab’) 3 、Fv、Fd、ミニボディー、ダイアボディー、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される、項目62に記載の方法。
(項目64)
上記抗CD200抗体が、サマリズマブである、項目60に記載の方法。
(項目65)
レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化するための方法であって、該方法は、同種移植片器官を有するレシピエント哺乳動物に:(a)抗CD200抗体および(b)1種以上の免疫抑制剤を投与する工程を包含し、ここで該抗体および該1種以上の免疫抑制剤は、該レシピエント哺乳動物において、所望の免疫調節効果の発生を生成および維持し、従って、該レシピエント哺乳動物における該同種移植片器官の生存を長期化するために十分な量および頻度において投与される、方法。
(項目66)
レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するための方法であって、該方法は、
(i)抗CD200抗体および(ii)1種以上の免疫抑制剤の、同種移植片器官を有するレシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生成するために有効な相対的用量を決定する工程;ならびに
該レシピエント哺乳動物に、該相対的用量の該抗CD200抗体および該1種以上の免疫抑制剤を、該レシピエント哺乳動物において、該所望の免疫調節効果を維持するために十分な頻度で投与する工程
を包含する、方法。
(項目67)
上記所望の免疫調節効果は、以下:
(i)CD11c + CD49b − 細胞によるCD40の発現における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物において同じ組織学的タイプの細胞によるCD40の発現レベルに対する低下;
(ii)CD11c + CD49b − 細胞によるMHCクラスIIの発現における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプの細胞によるMHCクラスIIの発現レベルに対する低下;
(iii)CD11c + CD49b − 細胞によるCD80の発現における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプの細胞によるCD80の発現レベルに対する低下;
(iv)CD11c + CD49b − 細胞によるIL−12の発現における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプの細胞によるIL−12の発現レベルに対する増大;
(v)調節性T細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプの調節性T細胞の濃度に対する増大;
(vi)Gr−1 + CD11b + CD45 + 細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのGr−1 + CD11b + CD45 + 細胞の濃度に対する増大;
(vii)F4/80 + CD45 + 細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのF4/80 + CD45 + 細胞の濃度に対する低下;
(viii)CD3 + CD25 + T細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのCD3 + CD25 + T細胞の濃度に対する低下;
(ix)CD3 + CD8 + T細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのCD3 + CD8 + T細胞の濃度に対する低下;
(x)CD19 + CD45 + 細胞の濃度における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の上記レシピエント哺乳動物における同じ組織学的タイプのCD19 + CD45 + T細胞の濃度に対する低下;ならびに
(xi)複数の免疫細胞によるSHIP発現における、上記抗CD200抗体および上記1種以上の免疫抑制剤の投与前の同じ組織学的タイプの免疫細胞におけるSHIPの発現レベルに対する低下、
からなる群より選択される、項目65または66に記載の方法。
(項目68)
上記調節性T細胞が、CD4 + CD25 + FoxP3 + 細胞である、項目67に記載の方法。
(項目69)
CD11c + CD49b − 細胞によるCD40の発現における少なくとも30%の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す、項目67に記載の方法。
(項目70)
CD11c + CD49b − 細胞によるMHCクラスIIの発現における少なくとも40%の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す、項目67に記載の方法。
(項目71)
CD11c + CD49b − 樹状細胞によるCD80の発現における少なくとも70%の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す、項目67に記載の方法。
(項目72)
CD11c + CD49b − 細胞によるIL−12の発現における少なくとも60%の増大は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す、項目67に記載の方法。
(項目73)
Gr−1 + CD11b + CD45 + 細胞の濃度における少なくとも300%の増大は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す、項目67に記載の方法。
(項目74)
調節性T細胞の濃度における少なくとも300%の増大は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す、項目67に記載の方法。
(項目75)
F4/80 + CD45 + 細胞の濃度における少なくとも80%の増大は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す、項目67に記載の方法。
(項目76)
CD3 + CD25 + T細胞の濃度における少なくとも50%の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す、項目67に記載の方法。
(項目77)
CD3 + CD8 + T細胞の濃度における少なくとも20%の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す、項目67に記載の方法。
(項目78)
CD19 + CD45 + 細胞の濃度における少なくとも50%の低下は、所望の免疫調節効果が上記レシピエント哺乳動物において起こったことを示す、項目67に記載の方法。
(項目79)
少なくとも1つの所望の免疫調節効果の発生は、上記抗CD200抗体での治療が治療上有効であることを示す、項目67に記載の方法。
(項目80)
少なくとも3つの所望の免疫調節効果の発生は、上記抗CD200抗体での治療が治療上有効であることを示す、項目67に記載の方法。
(項目81)
上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種が、アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、フルダラビン、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、非ステロイド系抗炎症薬、ラパマイシン、およびFK−506からなる群より選択される、項目67に記載の方法。
(項目82)
上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種が、シクロスポリンAである、項目67に記載の方法。
(項目83)
少なくとも10mg/mLの濃度の抗CD200抗体を含む、水性溶液。
(項目84)
上記溶液中の上記抗CD200抗体の濃度は、少なくとも50mg/mLである、項目83に記載の水性溶液。
(項目85)
上記溶液中の上記抗CD200抗体の濃度は、少なくとも100mg/mLである、項目83に記載の水性溶液。
(項目86)
上記溶液中の上記抗CD200抗体の濃度は、10mg/mL〜200mg/mL(両端含む)の間である、項目83に記載の水性溶液。
(項目87)
(i)項目83〜86のいずれか1項に記載の水性溶液;および(ii)該溶液を哺乳動物へ送達するための手段、を含む、キット。
(項目88)
上記手段は、上記哺乳動物への上記溶液の皮下送達もしくは筋肉内送達に適している、項目87に記載のキット。
(項目89)
上記手段は、シリンジもしくはペン型注射器である、項目87または88に記載のキット。
(項目90)
レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化することにおける使用のための1種以上の免疫抑制剤をさらに含む、項目87〜89のいずれか1項に記載のキット。
(項目91)
上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種が、アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、フルダラビン、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、非ステロイド系抗炎症薬、ラパマイシン、およびFK−506からなる群より選択される、項目90に記載のキット。
(項目92)
上記キットは、シクロスポリンAおよびシクロホスファミドのうちの一方もしくは両方を含む、項目90または91のいずれかに記載のキット。
(項目93)
上記キットは、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、ラパマイシン、もしくはFK−506を含む、項目90または91に記載のキット。
(項目94)
1つ以上の容器を含むキットであって、ここで各容器は、少なくとも10mg/mLの濃度の抗CD200抗体を含む滅菌用液を含み、各容器は、該抗CD200抗体の少なくとも1つの薬学的単位投与形態を含む、キット。
(項目95)
各容器は、0.05mg〜10mgの間の上記抗CD200抗体を含む、項目94に記載のキット。
(項目96)
上記キットは、約1mg〜100mgの間の上記抗CD200抗体を含む、項目94または95に記載のキット。
(項目97)
各容器は、容積0.1mL〜1mL(両端含む)を有する、項目94〜96のいずれか1項に記載のキット。
(項目98)
少なくとも1つの容器は、哺乳動物への皮下注射に、または哺乳動物への筋肉内注射に適した水性溶液を含む、項目94〜97のいずれか1項に記載のキット。
(項目99)
上記抗CD200抗体が、CD200とCD200レセプターとの間の相互作用を阻害する、項目94〜98のいずれか1項に記載のキット。
(項目100)
上記抗CD200抗体が、重鎖定常領域の非改変形態と比較して、低下したエフェクター機能を有するその対応する改変重鎖定常領域を含む、項目94〜99のいずれか1項に記載のキット。
(項目101)
上記抗CD200抗体が、完全抗体である、項目94〜100のいずれか1項に記載のキット。
(項目102)
上記抗CD200抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、齧歯類抗体、脱免疫化抗体、もしくは霊長類化抗体である、項目94〜101のいずれか1項に記載のキット。
(項目103)
上記抗CD200抗体が、完全抗CD200抗体のCD200結合フラグメントである、項目94〜100または102のいずれか1項に記載のキット。
(項目104)
上記CD200結合フラグメントが、一本鎖抗体、Fab、Fab’、F(ab)’ 2 、F(ab’) 3 、Fv、Fd、ミニボディー、ダイアボディー、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される、項目103に記載のキット。
(項目105)
上記抗CD200抗体が、サマリズマブである、項目101に記載のキット。
(項目106)
少なくとも10mg/mLの濃度において抗CD200抗体を含む滅菌用液を含む、充填済みシリンジ。
(項目107)
上記溶液は、皮下投与のために処方されている、項目106に記載の充填済みシリンジ。
(項目108)
上記溶液は、筋肉内投与のために処方されている、項目106に記載の充填済みシリンジ。
(項目109)
上記シリンジは、上記溶液中に上記抗CD200抗体の少なくとも1つの薬学的単位投与形態を含む、項目106に記載の充填済みシリンジ。
(項目110)
上記シリンジは、約1mg〜100mgの間の上記抗CD200抗体を含む、項目106〜109のいずれか1項に記載の充填済みシリンジ。
(項目111)
上記薬学的単位投与形態は、1mL以下の容積を有する、項目106〜110のいずれか1項に記載の充填済みシリンジ。
(項目112)
上記薬学的単位投与形態は、0.5mL以下の容積を有する、項目106〜111のいずれか1項に記載の充填済みシリンジ。
(項目113)
上記抗CD200抗体が、CD200とCD200レセプターとの間の相互作用を阻害する、項目106〜112のいずれか1項に記載の充填済みシリンジ。
(項目114)
上記抗CD200抗体が、重鎖定常領域の非改変形態と比較して、低下したエフェクター機能を有するその対応する改変重鎖定常領域を含む、項目106〜113のいずれか1項に記載の充填済みシリンジ。
(項目115)
上記抗CD200抗体が、完全抗体である、項目106〜114のいずれか1項に記載の充填済みシリンジ。
(項目116)
上記抗CD200抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、齧歯類抗体、脱免疫化抗体、もしくは霊長類化抗体である、項目106〜115のいずれか1項に記載の充填済みシリンジ。
(項目117)
上記抗CD200抗体が、完全抗CD200抗体のCD200結合フラグメントである、項目106〜114または116のいずれか1項に記載の充填済みシリンジ。
(項目118)
上記CD200結合フラグメントが、一本鎖抗体、Fab、Fab’、F(ab)’ 2 、F(ab’) 3 、Fv、Fd、ミニボディー、ダイアボディー、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される、項目117に記載の充填済みシリンジ。
(項目119)
上記抗CD200抗体が、サマリズマブである、項目115に記載の充填済みシリンジ。
(項目120)
上記レシピエント哺乳動物が、ヒトであり、上記同種移植片は、ヒト同種移植片である、項目1〜82のいずれか1項に記載の方法。
(詳細な説明)
本開示は、抗CD200抗体(上記抗体のCD200結合フラグメントを含む)、薬学的組成物、およびキット(これらのうちの各々は、哺乳動物において免疫応答を調節するために有用である)を提供する。この節において詳述されるように、上記抗体(または組成物もしくはキット)は、レシピエント哺乳動物(例えば、ヒト)において移植片の生存を長期化するための方法において、単独でもしくは組み合わせにおいて使用され得る。限定されるとは決して解釈されないが、上記抗体、キット、および組み合わせが使用され得る適切な適用は、この節において示され、以下の実施例において例示される。
(抗CD200抗体)
本開示は、ヒトCD200ポリペプチドに結合する抗体(ときおり、上記抗体は、本明細書において「抗CD200抗体」といわれる)を特徴とする。また、上記抗体の抗原結合(CD200結合)フラグメントを特徴とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、ヒトCD200タンパク質内の細胞外エピトープに結合する。例えば、上記抗CD200抗体は、ヒトCD200タンパク質における細胞外エピトープに結合し得、このタンパク質は、以下のアミノ酸配列:
(配列番号1; GenBankアクセッション番号NP_005935.2)を有する。配列番号1は、全長の前駆ヒトCD200アイソフォームAタンパク質のアミノ酸配列を示す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、ヒトCD200タンパク質中のエピトープに結合し、このタンパク質は、以下のアミノ酸配列:
(配列番号2; GenBankアクセッション番号NP_001004196.2)を有する。配列番号2は、全長CD200アイソフォームBタンパク質のアミノ酸配列を示す。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、ヒトCD200タンパク質に存在するエピトープに結合し、このタンパク質は、以下のアミノ酸配列:
(配列番号3;Genbankアクセッション番号 CAA28943.1;McCaughanら(1987) Immunogenetics 25:329−335の図3)を有する。配列番号3は、全長ヒトCD200タンパク質の例示的配列である。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、例えば、(i)配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸1〜233;(ii)配列番号2に示されるアミノ酸配列のアミノ酸1〜258;または(iii)配列番号3に示されるアミノ酸配列のアミノ酸1〜229の中にあるかもしくはこれらと重複するエピトープにおいてCD200タンパク質の細胞外部分に結合し得る。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、リーダー配列を欠いている上記ヒトCD200タンパク質内の細胞外エピトープに結合する。例えば、本明細書に記載される抗CD200抗体は、配列番号1(これは、上記アミノ末端リーダー配列を除いたヒトCD200アイソフォームAの成熟形態の細胞外部分に対応する)に示されるアミノ酸配列のアミノ酸31〜233の中にあるかもしくはこれと重複するエピトープにおいてCD200タンパク質に結合し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、配列番号2(これは、上記アミノ末端リーダー配列を除いたヒトCD200アイソフォームBの成熟形態の細胞外部分に対応する)に示されるアミノ酸配列のアミノ酸56〜258の中にあるかもしくはこれと重複するエピトープにおいてCD200タンパク質に結合し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、配列番号3(これは、上記アミノ末端リーダー配列を除いたヒトCD200の成熟形態の細胞外部分に対応する)に示されるアミノ酸配列のアミノ酸27〜229の中にあるかもしくはこれと重複するエピトープにおいてCD200タンパク質に結合し得る。
「エピトープ」とは、抗体によって結合されるタンパク質(例えば、ヒトCD200タンパク質)の部位をいう。「重複エピトープ」は、少なくとも1個(例えば、2個、3個、4個、5個、もしくは6個)の共通するアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、ヒトCD200タンパク質(例えば、配列番号1、配列番号2、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する上記ヒトCD200タンパク質、または上記CD200タンパク質の成熟形態の細胞外ドメイン)に特異的に結合する。用語「特異的結合」もしくは「特異的に結合する」とは、生理学的条件下で比較的安定な複合体(例えば、抗CD200抗体とCD200タンパク質との間の複合体)を形成する2つの分子に言及する。代表的には、結合は、会合定数(Ka)が106M−1より高い場合に特異的とみなされる。従って、抗CD200抗体は、CD200タンパク質に少なくとも106(もしくはこれより高い)(例えば、少なくとも107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、もしくは1015以上、もしくはこれらより高い)M−1のKaで特異的に結合し得る。ヒトCD200タンパク質に特異的に結合する抗体の例は、以下に記載される:例えば、米国特許第7,408,041号;同第7,427,665号;同第7,435,412号;および同第7,598,353号(これらの各々の開示は、それらの全体が本明細書に参考として援用される)。
いくつかの例示的な抗CD200抗体のアミノ酸配列は、例えば、米国特許第7,408,041号に記載される。例えば、上記抗CD200抗体は、米国特許第7,408,041の図23に示されるFab抗体(d1B10、d1A5、d1B5、c2aB7、c1A10、もしくはc2aA10)のうちの1つの重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含み得る。図23に示される配列は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、米国特許第7,408,041号の図23に示されるFab抗体のうちの1つの重鎖CDRおよび軽鎖CDRの対になったセットを含む。例えば、本明細書に記載される抗CD200抗体は、上記d1B10 Fab抗体に由来するCDRの対になったセットを含む:以下の配列:GFTFSGFAMS(配列番号4)を含む重鎖CDR1(HCDR1);以下の配列:SISSGGTTYYLDSVKG(配列番号5)を含む重鎖CDR2(HCDR2);以下の配列:GNYYSGTSYDY(配列番号6)を含む重鎖CDR3(HCDR3);以下の配列:RASESVDSYGNSFMH(配列番号7)を含む軽鎖CDR1(LCDR1);以下の配列:RASNLES(配列番号8)を含む軽鎖CDR2(LCDR2);および以下の配列:QQSNEDPRT(配列番号9)を含む軽鎖CDR3(LCDR3)。
別の例において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、上記d1A5 Fab抗体に由来するCDRの対になったセットを含み得る:(i)以下の配列:GFNIKDYYMH(配列番号10)を含むHCDR1;以下の配列:WIDPENGDTKYAPKFQG(配列番号11)を含むHCDR2;以下の配列:KNYYVSNYNFFDV(配列番号12)を含むHCDR3;以下の配列:SASSSVRYMY(配列番号13)を含むLCDR1;以下の配列:DTSKLAS(配列番号14)を含むLCDR2;および以下の配列:FQGSGYPLT(配列番号15)を含むLCDR3。
別の例において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、上記d1B5 Fab抗体に由来するCDRの対になったセットを含み得る:以下のアミノ酸配列:GFNIKDYYIH(配列番号16)を含むHCDR1;以下のアミノ酸配列:WIDPEIGATKYVPKFQG(配列番号17)を含むHCDR2;以下のアミノ酸配列:LYGNYDRYYAMDY(配列番号18)を含むHCDR3;以下のアミノ酸配列:KASQNVRTAVA(配列番号19)を含むLCDR1;以下のアミノ酸配列:LASNRHT(配列番号20)を含むLCDR2;および以下のアミノ酸配列:LQHWNYPLT(配列番号21)を含むLCDR3。
別の例において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、上記c2aB7 Fab抗体に由来するCDRの対になったセットを含み得る:アミノ酸配列:GYSFTDYIIL(配列番号22)を含むHCDR1;アミノ酸配列:HIDPYYGSSNYNLKFKG(配列番号23)を含むHCDR2;アミノ酸配列:SKRDYFDY(配列番号24)を含むHCDR3;アミノ酸配列:KASQDINSYLS(配列番号25)を含むLCDR1;アミノ酸配列:RANRLVD(配列番号26)を含むLCDR2;およびアミノ酸配列:LQYDEFPYT(配列番号27)を含むLCDR3。サマリズマブは、米国特許第7,408,041号の図23にもともと示された上記c2aB7 Fab抗体の前述の対になったCDRのセットを含む。
なお別の例において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、上記c1A10 Fab抗体に由来するCDRの対になったセットを含み得る:アミノ酸配列:GYTFTEYTMH(配列番号28)を含むHCDR1;アミノ酸配列:GVNPNNGGALYNQKFKG(配列番号29)を含むHCDR2;アミノ酸配列:RSNYRYDDAMDY(配列番号30)を含むHCDR3;アミノ酸配列:KSSQSLLDIDEKTYLN(配列番号31)を含むLCDR1;アミノ酸配列:LVSKLDS(配列番号32)を含むLCDR2;およびアミノ酸配列:WQGTHFPQT(配列番号33)を含むLCDR3。
そしてなお別の例において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、上記c2aA10 Fab抗体に由来するCDRの対になったセットを含み得る:アミノ酸配列:AFNIKDHYMH(配列番号34)を含むHCDR1;アミノ酸配列:WIDPESGDTEYAPKFQG(配列番号35)を含むHCDR2;アミノ酸配列:FNGYQALDQ(配列番号36)を含むHCDR3;アミノ酸配列:TASSSVSSSYLH(配列番号37)を含むLCDR1;アミノ酸配列:STSNLAS(配列番号38)を含むLCDR2;およびアミノ酸配列:RQYHRSPPIFT(配列番号39)を含むLCDR3。
抗CD200抗体のCDRのさらなる例示的なセットは、例えば、米国特許第7,427,665号に記載される。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、サマリズマブ(Alexion Pharmaceuticals, Inc., Cheshire, CT)である。
抗体がタンパク質抗原に結合するか否か、そして/またはタンパク質抗原に対する抗体の親和性を決定するための方法は、当該分野で公知である。例えば、タンパク質抗原に対する抗体の結合は、種々の技術(例えば、ウェスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴(SPR)法(例えば、BIAcoreシステム;Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,SwedenおよびPiscataway,N.J.)、もしくは酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)が挙げられるが、これらに限定されない)を使用して検出および/もしくは定量され得る。例えば、HarlowおよびLane(1988) 「Antibodies:A Laboratory Manual」 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.;Benny K.C.Lo(2004) 「Antibody Engineering:Methods and Protocols」,Humana Press(ISBN:1588290921);Borrebaek(1992) 「Antibody Engineering,A Practical Guide」,W.H.Freeman and Co.,NY;Borrebaek(1995) 「Antibody Engineering」,2nd Edition,Oxford University Press,NY,Oxford;Johneら(1993) J Immunol Meth 160:191−198;Jonssonら(1993)Ann Biol Clin 51:19−26;およびJonssonら(1991)Biotechniques 11:620−627を参照のこと。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、ヒトCD200タンパク質の中にあるかもしくはこれと重複するエピトープに結合する別の抗体の結合を交差ブロック(crossblock)する。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、ヒトCD200タンパク質のペプチドフラグメントの中にあるかもしくはこれと重複するエピトープに結合する抗体の結合を交差ブロックし得る。上記ペプチドフラグメントは、例えば、配列番号1〜3のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列を有するヒトCD200タンパク質のフラグメントであり得る。本明細書に記載される場合、用語「交差ブロック抗体」とは、上記抗体の非存在下での上記エピトープへの上記抗CD200抗体の結合の量と比較して、CD200タンパク質上のエピトープへの抗CD200抗体の結合の量を低下させる抗体をいう。第1の抗体が、エピトープへの第2の抗体の結合を交差ブロックするか否かを決定するために適した方法は、当該分野で公知である。
特定の抗体(例えば、抗CD200抗体)が結合する上記エピトープを同定するための方法はまた、当該分野で公知である。例えば、抗CD200抗体の結合エピトープは、CD200タンパク質のいくつかの(例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、もしくは30個以上の)重複するペプチドフラグメント(例えば、例えば、配列番号1〜3のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のいくつかの重複するフラグメント)に対する上記抗体の結合を測定することによって同定され得る。次いで、種々の重複するペプチドの各々は、固体支持体(例えば、マルチウェルアッセイプレートの別個のウェル)上の特有のアドレスに結合される。次に、上記抗CD200抗体は、上記抗CD200抗体を、上記抗体がそのエピトープに結合するのを可能にする時間量および条件下で、上記アッセイプレートにおける上記ペプチドの各々に接触させることによって、問い合わせされる。結合しない抗CD200抗体は、上記ウェルの各々を洗浄することによって除去される。次に、上記抗CD200抗体に結合する、検出可能に標識された二次抗体を、上記プレートのウェルに存在する場合、上記ウェルの各々に接触させ、結合しない二次抗体は、洗浄工程によって除去される。ウェルにおける上記検出可能に標識された二次抗体によって生成される検出可能なシグナルの存在もしくは量は、上記抗CD200抗体が、上記ウェルと関連した特定のペプチドフラグメントに結合するという指標である。例えば、HarlowおよびLane(前出),Benny K.C.Lo(前出)、および米国特許出願公開第20060153836号(その開示は、その全体が本明細書に参考として援用される)を参照のこと。抗体が結合する特定のエピトープはまた、BIAcoreクロマトグラフィー技術を使用して同定され得る(例えば、Pharmacia BIAtechnology Handbook,「Epitope Mapping」,Section 6.3.2,(May 1994);およびJohneら(1993)J Immunol Methods 160:191−8を参照のこと)。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗CD200抗体、もしくはそのCD200結合フラグメントは、細胞の表面に発現されるヒトCD200ポリペプチドに結合する。抗体が、細胞の表面に発現されるタンパク質に結合するか否かを決定するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、Petermannら(2007) J Clin Invest 117(12):3922−3929;Rijkersら(2008)
Mol Immunol 45(4):1126−35;およびKretz−Rommel(2007) J Immunol 178(9):5595−5605に記載される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗CD200抗体もしくはそのCD200結合フラグメントは、CD200タンパク質とCD200レセプターとの間の相互作用を阻害する。薬剤(例えば、抗CD200抗体)が、CD200とCD200Rとの間の相互作用を阻害するか否かを決定するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、HatherlyおよびBarclay(2004) Eur J Immunol 34(6):1688−1694に記載される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、上記抗体の非存在下でのCD200とそのレセプターとの間の相互作用のレベルと比較して、CD200とそのレセプターとに間の相互作用を少なくとも20%(例えば、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくはさらに100%)阻害する。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体もしくはそのCD200結合フラグメントは、インビトロおよび/もしくはインビボでの破骨細胞の形成を阻害する。抗体が破骨細胞の形成を阻害するか否かを決定するために適した方法は、当該分野で公知であり、例えば、PCT公開WO 08/089022およびCuiら(2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(36):14436−14441に記載される。例えば、マウス骨髄細胞は、抗CD200抗体の存在下もしくは非存在下で、例えば、RANKLおよびM−CSFの存在下で培養され得る。上記抗体の非存在下で形成される破骨細胞のパーセンテージと比較した、上記抗体の存在下での上記骨髄細胞から形成される破骨細胞のパーセンテージの低下は、上記抗体がインビトロでの破骨細胞形成を阻害することを示す。
CD200は、正常細胞(例えば、内皮細胞)で発現されるので、抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)もしくは補体依存性細胞傷害(CDC)を媒介しないか、もしくは媒介する能力が低下するように改変された定常領域を有する改変抗CD200抗体(もしくはそのCD200結合フラグメント)を投与することは、いくつかの実施形態において有利であり得る。CD200発現はまた、いくらかの活性化された正常細胞(例えば、活性化T細胞)上でアップレギュレートされ、このような細胞をエフェクター機能を有する抗CD200抗体による死滅に弱くする。エフェクター機能が減殺されているかエフェクター機能を欠いている抗CD200抗体を使用して、ADCCもしくはCDCによるこれら細胞の死滅を回避することは、有利であり得る。抗CD200抗体のエフェクター機能は、エフェクター機能を有する免疫グロブリン定常領域(例えば、IgG1定常ドメイン)を、エフェクター機能を有さない定常領域(例えば、IgG2/IgG4融合定常領域)で置換することによって排除され得る。抗体重鎖定常領域のエフェクター機能を低減または排除するためのさらなる方法は、以下に記載される。
(抗体を生成するための方法)
本開示に従う抗体、もしくはその抗原結合フラグメントを生成するために適した方法は、当該分野で公知であり(例えば、米国特許第7,408,041号およびPCT出願公開番号WO 09/014745を参照のこと)、本明細書に記載される。例えば、モノクローナル抗CD200抗体は、CD200発現細胞、CD200ポリペプチド、もしくはCD200ポリペプチドの抗原性フラグメントを免疫原として使用して生成され得、従って、抗体生成細胞および次に、モノクローナル抗体が単離され得る動物において免疫応答が惹起され得る。このような抗体の配列が決定され得、上記抗体もしくはその改変体は、組み換え技術によって生成され得る。組み換え技術は、上記モノクローナル抗体ならびにヒトCD200に結合し得るポリペプチドの配列に基づいて、キメラ抗体、CDRグラフト化抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を生成するために使用され得る。
さらに、組換えライブラリーから得られる抗体(「ファージ抗体」)は、ベイト(bait)として、標的特異性に基づいて上記抗体もしくはポリペプチドを単離するために、CD200発現細胞、もしくはそれから得られるポリペプチドを使用して選択され得る。非ヒトおよびキメラ抗CD200抗体の生成および単離は、十分に当業者の技術範囲内である。
組換えDNA技術は、非ヒト細胞において生成される抗体の1つ以上の特徴を改変するために使用され得る。従って、キメラ抗体は、診断適用もしくは治療適用においてその免疫原性を低下させるために構築され得る。さらに、免疫原性は、CDRグラフト化、および必要に応じて、フレームワーク改変によって、上記抗体をヒト化することによって最小限にされ得る。米国特許第5,225,539号および同第7,393,648号(これらの各々の内容は、本明細書に参考として援用される)を参照のこと。
抗体は、動物血清から得られ得るか、またはモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントの場合には、細胞培養物において生成され得る。組換えDNA技術は、確立された手順(細菌細胞培養物もしくは好ましくは、哺乳動物細胞培養物における手順が挙げられる)に従って上記抗体を生成するために使用され得る。上記選択された細胞培養システムは、好ましくは、上記抗体生成物を分泌する。
別の実施形態において、本明細書で開示される抗体の生成のためのプロセスは、宿主(例えば、E.coliもしくは哺乳動物細胞)を培養する工程を包含し、上記宿主は、ハイブリッドベクターで形質転換されている。上記ベクターは、1個以上の発現カセットを含み、上記発現カセットは、上記抗体タンパク質をコードする第2のDNA配列に適切なリーディングフレームで連結されたシグナルペプチドをコードする第1のDNA配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。次いで、上記抗体タンパク質は、集められ、単離される。必要に応じて、上記発現カセットは、抗体タンパク質(各々個々に、適切なリーディングフレームでシグナルペプチドに作動可能に連結される)をコードするポリシストロン性(例えば、二シストロン性)DNA配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。
インビトロでのハイブリドーマ細胞もしくは哺乳動物宿主細胞の増殖は、適切な培養培地中で行われ、上記培養培地は、哺乳動物血清(例えば、ウシ胎仔血清)、もしくは微量元素および増殖持続補助物質(例えば、フィーダー細胞(例えば、正常マウス腹腔滲出細胞)、脾細胞、骨髄マクロファージ、2−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸など)が必要に応じて補充された習慣的な標準培養培地(例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)もしくはRPMI 1640培地)を含む。細菌細胞もしくは酵母細胞である宿主細胞の増殖は、同様に、当該分野で公知の適切な培養培地中で行われる。例えば、細菌に関して、適切な培養培地としては、LE培地、NZCYM培地、NZYM培地、NZM培地、Terrific Broth培地、SOB培地、SOC培地、2xYT培地、もしくはM9最小培地が挙げられる。酵母に関しては、適切な培養培地としては、YPD培地、YEPD培地、最小培地、もしくは完全ミネラルドロップアウト培地(Complete Minimal Dropout Medium)が挙げられる。
インビトロ生成は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、スケールアップ生成を可能にして、大量の所望の抗体を与える。細菌細胞、酵母、植物、もしくは哺乳動物細胞培養の技術は、当該分野で公知であり、均質な懸濁培養(例えば、エアリフトリアクター中もしくは連続撹拌リアクター中で)、および固定化されたもしくは閉じ込められた細胞培養(例えば、中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上で)が挙げられる。
大量の所望の抗体はまた、インビボで哺乳動物細胞を増殖させることによって得られ得る。この目的のために、上記所望の抗体を生成するハイブリドーマ細胞が、組織適合性哺乳動物の中に注射されて、抗体生成腫瘍の増殖を引き起こす。必要に応じて、上記動物は、注射前に、炭化水素(特に、ミネラルオイル(例えば、プリスタン(テトラメチル−ペンタデカン)))で刺激される。1〜3週間後、上記抗体は、それら哺乳動物の体液から単離される。例えば、適切なメラノーマ細胞と、Balb/cマウスに由来する抗体生成脾細胞との融合によって得られるハイブリドーマ細胞または上記所望の抗体を生成するハイブリドーマ細胞株Sp2/0に由来するトランスフェクトされた細胞は、必要に応じて、プリスタンで予め処理したBalb/cマウスの腹腔内に注射される。1〜2週間後に、腹水を上記動物から採取する。
前述のおよび他の技術は、例えば、KohlerおよびMilstein,(1975) Nature 256:495−497;米国特許第4,376,110号;HarlowおよびLane,Antibodies:a Laboratory Manual,(1988) Cold Spring Harbor(これらの開示はすべて、本明細書に参考として援用される)おいて考察されている。組換え抗体分子の調製のための技術は、上記参考文献に記載され、そして例えば:WO97/08320;米国特許第5,427,908号;米国特許第5,508,717号;Smith(1985) Science 225:1315−1317;ParmleyおよびSmith(1988) Gene 73:305−318;De La Cruzら(1988) J Biol Chem 263:4318−4322;米国特許第5,403,484号;米国特許第5,223,409号;WO88/06630;WO92/15679;米国特許第5,780,279号;米国特許第5,571,698号;米国特許第6,040,136号;Davisら(1999) Cancer Metastasis Rev.18(4):421−5;Taylorら(1992) Nucleic Acids Res 20:6287−6295;およびTomizukaら(2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(2):722−727(これらの各々の内容は、それらの全体が本明細書に参考として援用される)においても記載される。
上記細胞培養上清は、CD200発現細胞の免疫蛍光染色によって、イムノブロッティングによって、酵素イムノアッセイ(例えば、サンドイッチアッセイもしくはドットアッセイ、またはラジオイムノアッセイ)によって、優先的に上記所望の抗体についてスクリーニングされる。
上記抗体の単離のために、上記培養上清もしくは腹水中の免疫グロブリンは、例えば、硫酸アンモニウムでの沈殿、吸湿性物質(例えば、ポリエチレングリコール)に対する透析、選択膜を介する濾過などによって、濃縮され得る。必要な場合および/もしくは所望される場合、上記抗体は、習慣的なクロマトグラフィー法(例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAE−セルロースに対するクロマトグラフィーおよび/もしくは(イムノ−)アフィニティークロマトグラフィー(例えば、CD200発現細胞株に由来する1種以上の表面ポリペプチド、またはプロテインAもしくはプロテイン−Gでのアフィニティークロマトグラフィー))によって精製される。
別の実施形態は、適切な哺乳動物におけるCD200タンパク質に対して指向される抗体を分泌する細菌細胞株の調製のためのプロセスを提供する。例えば、ウサギは、CD200発現組織もしくは細胞またはCD200ポリペプチドもしくはそのフラグメントに由来するプールされたサンプルで免疫化される。上記免疫化されたウサギから生成されるファージディスプレイライブラリーが構築され、当該分野で周知の方法(例えば、本明細書に参考として援用される種々の文献中で開示される方法)に従って所望の抗体についてパニング(pan)される。
上記モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞がまた、開示される。上記好ましいハイブリドーマ細胞は、一般に、安定であり、所望の特異性の本明細書に記載されるモノクローナル抗体を分泌し、インビトロでの融解および増殖によって極低温で凍結した培養物から増殖させられ得るか、もしくはインビボで腹水として増殖させられ得る。
別の実施形態において、CD200タンパク質に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株の調製のためのプロセスが提供される。そのプロセスにおいて、適切な哺乳動物(例えば、Balb/cマウス)は、CD200の1種以上のポリペプチドもしくは抗原性フラグメントで、またはCD200発現細胞に由来する1種以上のポリペプチドもしくは抗原性フラグメント、上記CD200発現細胞自体、もしくは記載されるように精製ポリペプチドを含む抗原性キャリアで免疫化される。上記免疫化された哺乳動物の抗体生成細胞は、培養において短時間増殖させられるか、または適切な骨髄腫細胞株の細胞と融合される。上記融合において得られたハイブリッド細胞は、クローニングされ、望ましい抗体を分泌する細胞クローンが選択される。例えば、ヒトCD200を発現する慢性リンパ性白血病(CLL)細胞株で免疫化したBalb/cマウスの脾細胞は、骨髄腫細胞株PAIもしくは骨髄腫細胞株Sp2/0−Ag 14の細胞と融合される。次いで、得られたハイブリッド細胞は、望ましい抗体の分泌についてスクリーニングされ、陽性のハイブリドーマ細胞がクローニングされる。
ハイブリドーマ細胞株を調製するための方法は、ヒトCD200タンパク質を含む免疫原性組成物(またはその免疫原性フラグメント)を数回(例えば、4〜6回)数ヶ月にわたって(例えば、2〜4ヶ月の間)皮下注射および/もしくは腹腔内注射することによってBalb/cマウスを免疫化する工程を包含する。上記免疫化したマウス由来の脾細胞は、最後の注射の2〜4日後に採取され、融合促進剤(好ましくは、ポリエチレングリコール)の存在下で、骨髄腫細胞株PAIの細胞と融合される。好ましくは、上記骨髄腫細胞は、分子量約4000の約30%〜約50% ポリエチレングリコールを含む溶液中に、上記免疫化したマウスに由来する3〜20倍過剰の脾細胞と融合される。融合後、上記細胞を前述で記載されるように、通常の骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞よりも多く増殖させないようにするために、周期的な間隔で、選択培地(例えば、HAT培地)を補充した適切な培養培地中で増殖される。
上記抗体およびそのフラグメントは、「キメラ」であり得る。キメラ抗体およびその抗原結合フラグメントは、2種以上の異なる種(例えば、マウスおよびヒト)に由来する部分を含む。キメラ抗体は、ヒト定常ドメイン遺伝子セグメントの中にスプライシングされた所望の特異性のマウス可変領域とともに生成され得る(例えば、米国特許第4,816,567号)。この様式において、非ヒト抗体は、これをヒト臨床適用(例えば、ヒト被験体における免疫関連障害を処置もしくは予防するための方法)により適切にするように改変され得る。
本開示のモノクローナル抗体は、上記非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態を含む。ヒト化もしくはCDRグラフト化mAbは、ヒトのための治療剤として特に有用である。なぜなら、それらは、マウス抗体ほど迅速には循環から浄化されず、代表的には、有害な免疫反応を誘起しないからである。ヒト化抗体を調製する方法は、一般には、当該分野で周知である。例えば、ヒト化は、Winterおよび共同研究者らの方法に従って、齧歯類CDRもしくはCDR配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって本質的に行われ得る(例えば、Jonesら(1986) Nature 321:522−525;Riechmannら(1988) Nature 332:323−327;およびVerhoeyenら(1988) Science 239:1534−1536を参照のこと)。また、例えば、Staelensら(2006) Mol Immunol 43:1243−1257を参照のこと。いくつかの実施形態において、非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形態は、ヒト抗体(レシピエント抗体)であり、ここで、上記レシピエント抗体の超可変(CDR)領域残基が、所望の特異性、親和性、および結合能を有する非ヒト種(ドナー抗体)(例えば、マウス、ラット、ウサギ、もしくは非ヒト霊長類)に由来する超可変領域残基で置換されている。いくつかの例において、上記ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基はまた、対応する非ヒト残基によって置換される(いわゆる、「復帰変異」)。さらに、ファージディスプレイライブラリーは、上記抗体配列内の選択された位置においてアミノ酸を変動させるために使用され得る。ヒト化抗体の特性はまた、上記ヒトフレームワークの選択によって影響を受ける。さらに、ヒト化抗体およびキメラ抗体は、抗体特性(例えば、親和性もしくはエフェクター機能)をさらに改善するために、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見いだされない残基を含むように改変され得る。
完全ヒト抗体はまた、本開示において提供される。用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域(存在する場合)を有する抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る(例えば、インビトロでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によって導入される変異もしくはインビボでの体性変異)。しかし、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種(例えば、マウス)の生殖細胞系に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフト化された抗体(すなわち、ヒト化抗体)を含まない。完全ヒト抗体もしくはヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子(可変(V)、多様性(D)、結合(J)、および定常(C)エキソン)を有するトランスジェニックマウスまたはヒト細胞に由来し得る。例えば、いまや、免疫の際に、内因性免疫グロブリン生成の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを生成し得るトランスジェニック動物(例えば、マウス)を生成することは可能である。(例えば、Jakobovitsら(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:2551;Jakobovitsら(1993) Nature 362:255−258;Bruggemannら(1993) Year in Immunol 7:33;およびDuchosalら(1992) Nature 355:258を参照のこと。)トランスジェニックマウス系統は、再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子に由来する遺伝子配列を含むように操作され得る。上記ヒト配列は、ヒト抗体の重鎖および軽鎖両方をコードし得、マウスにおいて正確に機能し、再配列を受けて、ヒトにおけるものと類似の広い抗体レパートリーを提供し得る。上記トランスジェニックマウスは、上記標的タンパク質(例えば、CD200タンパク質、そのフラグメント、またはCD200タンパク質を発現する細胞)で免疫化されて、特異的抗体の多様なアレイおよびそれらのコードRNAを作製し得る。このような抗体の上記抗体鎖成分をコードする核酸は、次いで、上記動物からディスプレイベクターへとクローニングされ得る。代表的には、重鎖および軽鎖の配列をコードする別個の核酸集団は、クローニングされ、上記別個の集団は、次いで、ベクターへの挿入の際に組換えられ得、その結果、上記ベクターの任意の所定のコピーは、重鎖および軽鎖のランダム組換えを受容する。上記ベクターは、抗体鎖を発現するように設計され、その結果、それらは、組み立てられ得、上記ベクターを含むディスプレイパッケージ(display package)の外側表面にディスプレイされ得る。例えば、抗体鎖は、上記ファージの外側表面のファージコートタンパク質との融合タンパク質として発現され得る。その後、ディスプレイパッケージは、標的へ結合する抗体のディスプレイについてスクリーニングされ得る。
さらに、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーに由来し得る(Hoogenboomら(1991) J Mol Biol 227:381;Marksら(1991) J Mol Biol 222:581−597;およびVaughanら(1996) Nature Biotech 14:309(1996))。合成ファージライブラリーが作製され得、これは、合成ヒト抗体V領域のランダム化組み合わせを使用する。抗原に対する選択によって、完全ヒト抗体が作製され得、これは、上記V領域が本質的にヒトのものに非常に類似している。例えば、米国特許第6,794,132号、同第6,680,209号、および同第4,634,666号、ならびにOstbergら(1983) Hybridoma 2:361−367(これらの各々の内容は、それらの全体が本明細書に参考として援用される)を参照のこと。
ヒト抗体の生成に関しては、Mendezら(1998) Nature Genetics 15:146−156、ならびにGreenおよびJakobovits(1998) J Exp Med 188:483−495(それらの開示は、それらの全体が本明細書に参考として援用される)もまた参照のこと。ヒト抗体は、米国特許第5,939,598号;同第6,673,986号;同第6,114,598号;同第6,075,181号;同第6,162,963号;同第6,150,584号;同第6,713,610号;および同第6,657,103号、ならびに米国特許出願公開第20030229905 A1号、同第20040010810 A1号、同第US 20040093622 A1号、同第20060040363 A1号、同第20050054055 A1号、同第20050076395 A1号、同第20050287630 A1号においてさらに考察されかつ詳述される。国際公開番号WO 94/02602、WO 96/34096、およびWO 98/24893、ならびに欧州特許第EP 0 463 151 B1号もまた参照のこと。上記で引用される特許、出願、および参考文献の各々の開示は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
代替のアプローチにおいて、他のもの(GenPharm International,Inc.を含む)は、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用した。上記ミニ遺伝子座アプローチにおいて、外因性Ig遺伝子座は、上記Ig遺伝子座から構成要素(piece)(個々の遺伝子)を含めることを介して模倣される。従って、1個以上のVH遺伝子、1個以上のDH遺伝子、1個以上のJH遺伝子、ミュー定常領域、および第2の定常領域(好ましくは、ガンマ定常領域)は、動物への挿入のために構築物へと形成される。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,625,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号;同第5,770,429号;同第5,789,650号;同第5,814,318号;同第5,591,669号;同第5,612,205号;同第5,721,367号;同第5,789,215号;同第5,643,763号;同第5,569,825号;同第5,877,397号;同第6,300,129号;同第5,874,299号;同第6,255,458号;および同第7,041,871号(これらの開示は、それら全体が本明細書に参考として援用される)において記載される。欧州特許第0 546 073 B1号、国際特許公開番号WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852、およびWO 98/24884(これらの各々の開示は、それら全体が本明細書に参考として援用される)もまた参照のこと。Taylorら(1992) Nucleic Acids Res 20:6287;Chenら(1993) Int Immunol 5:647;Tuaillonら(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:3720−4;Choiら(1993) Nature Genetics 4:117;Lonbergら(1994) Nature 368:856−859;Taylorら(1994) Int Immunol 6:579−591;Tuaillonら(1995) J. Immunol. 154:6453−65;Fishwildら(1996) Nature Biotechnol 14:845;およびTuaillonら(2000) Eur J Immunol 10:2998−3005(これらの各々の開示は、それら全体が本明細書に参考として援用される)をさらに参照のこと。
特定の実施形態において、脱免疫化抗CD200抗体もしくはその抗原結合フラグメントが提供される。脱免疫化抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、所定の種(例えば、ヒト)に対して上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントを非免疫原性にするかもしくは免疫原性を低くするように改変された抗体である。脱免疫化は、当業者に公知の種々の技術のうちのいずれかを利用して、上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントを改変することによって達成され得る(例えば、PCT公開番号WO 04/108158およびWO 00/34317を参照のこと)。例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列内の潜在的なT細胞エピトープおよび/もしくはB細胞エピトープを同定し、上記潜在的なT細胞エピトープおよび/もしくはB細胞エピトープのうちの1個以上を、例えば、組み換え技術を使用して、上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントから除去することによって、脱免疫化され得る。次いで、上記改変された抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、必要に応じて、生成され得、試験されて、1個以上の所望の生物学的活性(例えば、結合親和性)を保持するが、免疫原性が低下した抗体もしくはその抗原結合フラグメントを同定する。潜在的なT細胞エピトープおよび/もしくはB細胞エピトープを同定するための方法は、当該分野で公知の技術(例えば、コンピューター化方法(例えば、PCT公開番号WO 02/069232を参照のこと)、インビトロもしくはインシリコ技術、および生物学的アッセイもしくは物理的方法(例えば、MHC分子へのペプチドの結合の決定、上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントを受容するための上記種に由来する上記T細胞レセプターへのペプチド:MHC複合体の結合の決定、上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントを受容するための上記種のMHC分子を有するトランスジェニック動物を使用する上記タンパク質もしくはそのペプチド部分の試験、または上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントを受容するための上記種に由来する免疫系細胞で再構成したトランスジェニック動物での試験など)を使用して行われ得る。種々の実施形態において、本明細書に記載される脱免疫化抗CD200抗体としては、脱免疫化抗原結合フラグメント、Fab、Fv、scFv、Fab’およびF(ab’)2、モノクローナル抗体、マウス抗体、操作された抗体(例えば、キメラ抗体、一本鎖抗体、CDRグラフト化抗体、ヒト化抗体、および人工的に選択された抗体)、合成抗体および半合成抗体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、抗CD200抗体の重鎖可変ドメインおよび/もしくは軽鎖可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えDNA、またはCD200タンパク質発現細胞株が生成される。用語DNAは、コード一本鎖DNA、上記コードDNAおよびこれに相補的なDNAからなる二本鎖DNA、またはこれらの相補的な(一本鎖)DNA自体を含む。
さらに、抗CD200抗体の重鎖可変ドメインおよび/もしくは軽鎖可変ドメインをコードするDNAは、重鎖可変ドメインおよび/もしくは軽鎖可変ドメイン、またはこれらの変異体をコードする忠実なDNA配列を含むように、酵素的にもしくは化学的に合成され得る。上記忠実なDNAの変異体は、1もしくはそれより多いアミノ酸が欠失されるか、挿入されるか、もしくは1もしくはそれより多い他のアミノ酸と交換された、上述の抗体の重鎖可変ドメインおよび/もしくは軽鎖可変ドメインをコードするDNAである。好ましくは、上記改変は、ヒト化および発現最適化の適用において上記抗体の重鎖可変ドメインのCDRおよび/もしくは軽鎖可変ドメインのCDRの外にある。用語である変異体DNAはまた、1もしくはそれより多いヌクレオチドが、同じアミノ酸をコードする新たなコドンを有する他のヌクレオチドによって置換されるサイレント変異体を包含する。用語である変異体配列はまた、縮重配列を含む。縮重配列は、非制限数のヌクレオチドが、元々コードされるアミノ酸配列の変更を生じることなしに他のヌクレオチドによって置換されるという点で上記遺伝子コードの意味の範囲内で縮重である。このような縮重配列は、上記重鎖マウス可変ドメインおよび/もしくは軽鎖マウス可変ドメインの最適な発現を得るために、それらの異なる制限部位および/もしくは特定の宿主(特に、E.coli)によって好まれる特定のコドンの頻度に起因して有用であり得る。
用語である変異体は、当該分野で公知の方法に従って、上記忠実なDNAのインビトロ変異誘発によって得られるDNA変異体を含むことが意図される。
完全な四量体免疫グロブリン分子の組み立ておよびキメラ抗体の発現に関しては、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードする上記組換えDNA挿入物は、重鎖および軽鎖の定常ドメインをコードする対応するDNAと融合され、次いで、例えば、ハイブリッドベクターの中へ組み込んだ後に、適切な宿主細胞の中に移される。
ヒト定常ドメインIgG(例えば、γ1、γ2、γ3もしくはγ4、特定の実施形態においては、γ1もしくはγ4)に融合された、抗CD200抗体発現細胞株の重鎖マウス可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えDNAが、使用され得る。ヒト定常ドメインκもしくはλ(好ましくは、κ)に融合された抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えDNAもまた、提供される。
別の実施形態は、上記重鎖可変ドメインおよび上記軽鎖可変ドメインが、スペーサー基(必要に応じて、上記宿主細胞における上記抗体のプロセシングを促進するシグナル配列および/または上記抗体の精製を促進するペプチドをコードするDNA配列および/または切断部位および/またはペプチドスペーサーおよび/もしくは因子を含む)によって連結された組換えポリペプチドをコードする組換えDNAに関する。
よって、本開示のモノクローナル抗体もしくは抗原結合フラグメントは、他の因子(例えば、治療剤もしくは検出可能な標識)に結合体化されていない裸の抗体もしくは抗原結合フラグメントであり得る。あるいは、上記モノクローナル抗体もしくは抗原結合フラグメントは、因子(例えば、細胞傷害性薬剤、低分子、ホルモン、酵素、増殖因子、サイトカイン、リボザイム、ペプチド摸倣物、化学物質、プロドラッグ、コード配列を含む核酸分子(例えば、アンチセンス、RNAi、遺伝子標的化構築物など)もしくは検出可能な標識(例えば、NMRもしくはX線造影剤、蛍光分子など)に結合体化され得る。特定の実施形態において、抗CD200抗体もしくは抗原結合フラグメント(例えば、Fab、Fv、一本鎖(scFv)、Fab’、およびF(ab’)2)は、上記抗体もしくは抗原結合フラグメントの半減期を増大させる分子に連結される(上記を参照のこと)。
いくつかの考えられるベクター系は、哺乳動物細胞での、クローニングされた重鎖および軽鎖の遺伝子の発現のために利用可能である。1つのクラスのベクターは、所望の遺伝子配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みに依拠する。安定に組み込まれたDNAを有する細胞は、薬物耐性遺伝子(例えば、E.coli gpt(MulliganおよびBerg(1981) Proc Natl Acad Sci USA,78:2072〜2076)もしくはTn5 neo(SouthernおよびBerg(1982)J Mol Appl Genet 1:327〜341)を同時に導入することによって選択され得る。上記選択マーカー遺伝子は、発現されるべきDNA遺伝子配列に連結され得るか、または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入され得るかのいずれかである(Wiglerら(1979) Cell 16:777〜785)。第2のクラスのベクターは、染色体外プラスミドに自律的に複製する能力を付与するDNAエレメントを利用する。これらベクターは、動物ウイルス(例えば、ウシパピローマウイルス(Sarverら(1982) Proc Natl Acad Sci USA,79:7147〜7151)、ポリオーマウイルス(Deansら(1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292〜1296)、もしくはSV40ウイルス(LuskyおよびBotchan(1981) Nature 293:79〜81))に由来し得る。
免疫グロブリンcDNAは、抗体タンパク質をコードする成熟mRNAを表す配列のみから構成されるので、上記遺伝子の転写および上記RNAのプロセシングを調節するさらなる遺伝子発現エレメントは、免疫グロブリンmRNAの合成に必要とされる。これらエレメントは、スプライシングシグナル、転写プロモーター(誘導性プロモーターが挙げられる)、エンハンサー、および終止シグナルを含み得る。このようなエレメントを組み込むcDNA発現ベクターは、OkayamaおよびBerg(1983) Mol Cell Biol 3:280〜289;Cepkoら(1984) Cell 37:1053〜1062;およびKaufman(1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:689〜693によって記載されるものを含む。
本開示から明らかなように、上記抗CD200抗体は、治療(例えば、免疫関連障害を処置するための治療(組み合わせ治療を含む))において使用され得る。
本開示の治療実施形態において、二重特異的抗体が企図される。二重特異的抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくは、ヒトもしくはヒト化抗体である。この場合、上記結合特異性のうちの1つは、細胞(例えば、免疫細胞)上のヒトCD200抗原に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。
二重特異的抗体を作製するための方法は、当業者の範囲内である。伝統的には、二重特異的抗体の組換え生成は、2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づき、ここで、上記2つの重鎖は、異なる特異性を有する(MilsteinおよびCuello(1983) Nature 305:537−539)。所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。上記融合は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン(ヒンジ、CH2、およびCH3領域のうちの少なくとも一部を含む)とのものである。上記免疫グロブリン重鎖融合物、および所望であれば、上記免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは、別個の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体を生成するための例示的な現在公知の方法のさらなる詳細については、例えば、Sureshら(1986) Methods Enzymol 121:210〜228;PCT公開番号WO 96/27011;Brennanら(1985) Science 229:81〜83;Shalabyら J Exp Med(1992) 175:217−225;Kostelnyら(1992) J Immunol 148(5):1547−1553;Hollingerら(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6444−6448;Gruberら(1994) J Immunol 152:5368〜5474;およびTuttら(1991) J Immunol 147:60〜69を参照のこと。二重特異的抗体はまた、架橋された抗体もしくは異種結合体(heteroconjugate)抗体を含む。異種結合体抗体は、任意の都合のよい架橋法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は、当該分野で周知であり、多くの架橋技術とともに、米国特許第4,676,980号に開示される。
二重特異的抗体フラグメントを作製し、組換え細胞培養物から直接単離するための種々の技術はまた、記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して生成された。例えば、Kostelnyら(1992) J Immunol 148(5):1547−1553を参照のこと。Fosタンパク質およびJunタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって2つの異なる抗体のFab’部分に連結され得る。上記抗体ホモダイマーは、モノマーを形成するためのヒンジ領域において還元され得、次いで、上記抗体ヘテロダイマーを形成するために再酸化され得る。この方法はまた、抗体ホモダイマーの生成のために利用され得る。Hollingerら(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6444−6448によって記載される上記「ダイアボディー」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替機構を提供した。上記フラグメントは、リンカーによって軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含み、ここで、上記リンカーは、あまりに短くて、同じ鎖上の上記2つのドメインの間で対形成をさせない。よって、1つのフラグメントの上記VHドメインおよびVLドメインは、別のフラグメントの相補的なVLドメインおよびVHドメインと対形成させられ、それによって、2つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Fv(scFv)ダイマーの使用による二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーがまた、報告された。例えば、Gruberら(1994) J Immunol 152:5368〜5374を参照のこと。あるいは、上記抗体は、例えば、Zapataら(1995) Protein Eng 8(10):1057−1062に記載されるように「直線状抗体」であり得る。簡潔には、これら抗体は、抗原結合領域の対を形成するタンデムFdセグメントの対(VH−CH1−VH−CH1)を含む。直線状抗体は、二重特異的もしくは単一特異的(monospecific)であり得る。
本開示はまた、二重特異的抗体(例えば、Wuら(2007) Nat Biotechnol 25(11):1290−1297に記載される四価二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)分子)の改変体形態を包含する。上記DVD−Ig分子は、2つの異なる親抗体に由来する2つの異なる軽鎖可変ドメイン(VL)が、組換えDNA技術によって、タンデムで直接、もしくは短いリンカーを介して連結され、続いて、上記軽鎖定常ドメインが連結されるように設計される。2つの親抗体に由来するDVD−Ig分子を生成するための方法は、例えば、PCT公開番号WO 08/024188およびWO 07/024715(これらの各々の開示は、それら全体が本明細書に参考として援用される)にさらに記載される。
(エフェクター機能)
免疫系の細胞との抗体および抗体−抗原複合体の相互作用は、種々の応答に影響を及ぼす(本明細書においてエフェクター機能といわれる)。例示的エフェクター機能としては、Fcレセプター結合、ファゴサイトーシス、細胞表面レセプター(例えば、B細胞レセプター;BCR)のダウンレギュレーションなどが挙げられる。他のエフェクター機能としては、ADCC(これによって、抗体がナチュラル・キラー(NK)細胞もしくはマクロファージ上のFcレセプターを結合する(細胞死をもたらす)、およびCDC(これは、補体カスケードの活性化を介して誘導される細胞死である)(Daeron (1997) Annu Rev Immunol 15:203−234;WardおよびGhetie (1995) Therapeutic Immunol 2:77−94;およびRavetchおよびKinet (1991) Annu Rev Immunol 9:457−492において総説される)が挙げられる。このようなエフェクター機能は、一般に、上記Fc領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と合わせられることを必要とし、本明細書中で開示されるように、種々のアッセイを使用して評価され得る。
いくつかの抗体エフェクター機能(ADCCが挙げられる)は、Fcレセプター(FcR)(これは、抗体のFc領域に結合する)によって媒介される。ADCCにおいて、NK細胞もしくはマクロファージは、上記抗体複合体のFc領域に結合し、その標的細胞の溶解を促進する。NK細胞上のFcRの架橋は、パーフォリン/グランザイム媒介性細胞傷害性を誘発するのに対して、マクロファージにおいては、この架橋は、メディエーター(例えば、一酸化窒素(NO)、TNF−α、および反応性酸素種)の放出を促進する。CD200陽性標的細胞に関しては、抗CD200抗体は、上記標的細胞に結合し、上記Fc領域は、エフェクター機能を上記標的細胞へと指向する。特定のFcRに対する抗体の親和性、よって、上記抗体によって媒介されるエフェクター活性は、上記Fcおよび/もしくは上記抗体の定常領域のアミノ酸配列および/もしくは翻訳後修飾を変化させることによって、調節され得る。
FcRは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性によって定義される;IgG抗体に関するFcレセプターは、FcγRといわれ、IgEに関しては、FcεRといわれ、IgAに関しては、FcαRといわれるなど。FcγRの3つのサブクラスが同定された:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)。各FcγRサブクラスは、2種もしくは3種の遺伝子によってコードされるので、選択的RNAスプライシングは、複数の転写物をもたらすので、FcγRアイソフォームにおいて広い多様性が存在する。上記FcγRIサブクラス(FcγRIA、FcγRIBおよびFcγRIC)をコードする3種の遺伝子は、染色体1の長腕の領域1q21.1にクラスター化され;FcγRIIアイソフォーム(FcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIIC)をコードする遺伝子、ならびにFcγRIII(FcγRIIIAおよびFcγRIIIB)をコードする2種の遺伝子は、領域1q22において全てクラスター化される。これら異なるFcRサブタイプは、異なる細胞タイプで発現される(RavetchおよびKinet (1991) Annu Rev Immunol 9:457−492において総説される)。例えば、ヒトにおいて、FcγRIIIBは、好中球でのみ見いだされるのに対して、FcγRIIIAは、マクロファージ、単球、ナチュラル・キラー(NK)細胞、およびT細胞の亜集団で見いだされる。顕著なことには、FcγRIIIAは、NK細胞(ADCCに関与する細胞タイプのうちの1つ)に存在する唯一のFcRである。
FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIは、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)レセプターであり;FcγRIは、その細胞外ドメインにおいて3個のIgSFドメインを有する一方で、FcγRIIおよびFcγRIIIは、細胞外ドメインにおいてわずか2個のIgSFドメインのみを有する。Fcレセプターの別のタイプは、新生児型Fcレセプター(FcRn)である。FcRnは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)に構造上類似しており、β2−ミクログロブリンに非共有的に結合したα鎖からなる。
FcγRに対するヒト抗体およびマウス抗体の結合部位は、残基233〜239(Kabatら、(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Marylandにおけるとおりの、EUインデックス番号付け)からなる、いわゆる「下部ヒンジ領域(lower hinge region)」に以前にマッピングされた。Woofら、(1986) Molec Immunol 23:319−330;Duncanら、(1988) Nature 332:563;CanfieldおよびMorrison (1991) J Exp Med 173:1483−1491;Chappelら、(1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:9036−9040。残基233〜239のうち、P238およびS239は、おそらく結合に関与するとして引用された。
FcγRへの結合におそらく関与する、他の以前に引用された領域は、ヒトFcγRIに関してG316−K338(ヒトIgG)(配列比較のみによる;置換変異体は評価しなかった)(Woofら、(1986) Molec Immunol 23:319−330);ヒトFcγRIII(ペプチドに基づく)に関してK274〜R301(ヒトIgG1)(Sarmayら、(1984) Molec Immunol 21:43−51);ヒトFcγRIII(ペプチドに基づく)に関してY407−R416(ヒトIgG)(Gergelyら、(1984) Biochem Soc Trans 12:739−743 (1984));ならびにマウスFcγRIIに関してN297およびE318(マウスIgG2b)(Lundら、(1992) Molec Immunol 29:53−59)である。
ヒトエフェクター細胞は、1種以上のFcRを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。特定の実施形態において、上記細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を発揮する。ADCCを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球(PBMC)、ナチュラル・キラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞および好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、その天然供給源から、例えば、血液もしくはPBMCから単離され得る。
CDCにおいて、上記抗体−抗原複合体は、補体に結合し、補体カスケードの活性化および膜侵襲複合体の生成を生じる。古典的補体経路の活性化は、同族抗原に結合している(適切なサブクラスの)抗体への補体系の第1成分(C1q)の結合によって開始され;従って、補体カスケードの活性化は、C1qタンパク質への上記免疫グロブリンの結合親和性によって一部調節される。C1qおよび2つのセリンプロテアーゼであるC1rおよびC1sは、複合体C1(CDC経路の第1成分)を形成する。C1qは、分子量約460,000を有し、6つのコラーゲン性の「柄(stalk)」が6つの球状ヘッド領域につながっている構造を有する6価分子である。BurtonおよびWoof (1992) Advances in Immunol 51:1−84。補体カスケードを活性化するために、C1qが、抗原性標的に結合したIgG1、IgG2、もしくはIgG3のうちの少なくとも2つの分子(ただしIgMではただ1つの分子)に結合することが必要である(WardおよびGhetie (1995) Therapeutic Immunol 2:77−94)。補体活性化を評価するために、CDCアッセイ(例えば、Gazzano−Santoroら、(1996) J Immunol Methods 202:163に記載されるとおり)が、行われ得る。
上記IgG分子の種々の残基が、C1q(CH2ドメインのGlu318、Lys320およびLys322残基、おなじβ鎖の近位にあるターン上に位置したアミノ酸残基331、下部ヒンジ領域に位置したLys235およびGly237残基、ならびにCH2ドメインのN末端領域に位置した残基231〜238を含む)への結合に関与することが提唱された。例えば、Xuら、(1993) J Immunol 150:152A;PCT公開番号WO 94/29351;Taoら、(1993) J Exp Med 178:661−667;Brekkeら、(1994) Eur J lmmunol 24:2542−2547;Burtonら、(1980) Nature 288:338−344;ならびに米国特許第5,648,260号および同第5,624,821号を参照のことのこと。IgGがC1qに結合し、補体カスケードを活性化する能力がまた、2つのCH2ドメインの間に位置した炭水化物部分(これは、通常、Asn297に固定される)の存在、非存在もしくは改変に依存することが、さらに提唱された。例えば、WardおよびGhetie (1995) Therapeutic Immunology 2:77−94を参照のこと。特定の実施形態において、これらの残基のうちの1個以上は、改変されても、置換されても、除去されてもよく、または1個以上のアミノ酸残基は、本明細書において提供される抗CD200抗体のCDC活性を増強もしくは低下させるように、挿入されてもよい。
(エフェクター機能を低下もしくは排除するための方法)
上記標的特異的抗体の定常領域が関わるエフェクター機能は、上記定常領域もしくはFc領域の特性を変化させることによって調節され得る。変化したエフェクター機能としては、例えば、以下の活性のうちの1つ以上における調節が挙げられる:ADCC、CDC、アポトーシス、1個以上のFcレセプターへの結合、および炎症促進性応答。調節とは、第2の抗体の活性と比較して、本発明の抗体によって示されるエフェクター機能活性の増大、減少、もしくは排除をいう。特定の実施形態において、上記第2の抗体は、改変されていない天然に存在するエフェクター機能を有する抗体である。特定の実施形態において、調節は、活性が破壊もしくは完全に存在しない状況を含む。さらに、いくつかの場合において、非改変抗体は、本明細書で開示されるchC2aB7−hG1抗体もしくはhB7V3V2−hG1抗体の活性に類似もしくは等価なエフェクター機能活性を示し得る。
変化したFcR結合親和性および/もしくはADCC活性および/もしくは変化したCDC活性を有する改変定常領域は、天然のもしくは親のポリペプチドと、または天然の配列もしくは定常領域を含むポリペプチドと比較して、増強したかもしくは減少したかのいずれかのFcR結合活性および/もしくはADCC活性および/もしくはCDC活性を有するポリペプチドである。FcRへの増大した結合を示すポリペプチド改変体は、上記親ポリペプチドより大きな親和性で少なくとも1つのFcRを結合する。FcRへの低下した結合を示すポリペプチド改変体は、親ポリペプチドより低下した親和性で少なくとも1つのFcRを結合する。FcRへの低下した結合を示すこのような改変体は、FcRへの結合をほとんど有さなくてもよいし、認め得るほどの結合を全く有さなくてもよい(FcRへの、天然配列の免疫グロブリン定常領域もしくはFc領域の結合のレベルと比較して、上記FcRへの結合の例えば、0〜50%(例えば、50%未満、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%))。同様に、変化したADCC活性および/もしくはCDC活性を示す改変抗CD200抗体は、上記天然もしくは親のポリペプチドと比較して、増大したかもしくは低下したかのいずれかのADCC活性および/もしくはCDC活性を示し得る。例えば、いくつかの実施形態において、改変定常領域を含む上記抗CD200抗体は、上記定常領域の天然形態のADCC活性および/もしくはCDC活性のうちの約0〜50%(例えば、50%未満、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%)を示し得る。低下したADCCおよび/もしくはCDCを示す改変定常領域を含む抗CD200抗体は、本明細書で例示されるように、低下したADCC活性および/もしくはCDC活性を示してもよいし、これら活性を全く示さなくてもよい。
天然配列のFc領域もしくは定常領域は、天然において見いだされるFc領域もしくは定常鎖領域のアミノ酸配列に同一のアミノ酸配列を含む。改変もしくは変化したFc領域もしくは定常領域は、例えば、少なくとも1個のアミノ酸改変、挿入、もしくは欠失によって天然配列の重鎖領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、上記改変もしくは変化した定常領域は、天然配列の定常領域ともしくは親ポリペプチドの定常領域と比較して、少なくとも1個のアミノ酸置換、挿入、および/もしくは欠失を、例えば、天然配列の定常領域においてもしくは親ポリペプチドの定常領域において例えば、約1〜約100個のアミノ酸置換、挿入、および/もしくは欠失を有する。いくつかの実施形態において、本明細書の改変もしくは変化した定常領域は、天然配列の定常領域および/もしくは親ポリペプチドの定常領域と少なくとも約70%の相同性(類似性)もしくは同一性を、およびいくつかの場合においては、少なくとも約75%、および他の場合においては、上記と少なくとも約80%の相同性もしくは同一性、および他の実施形態においては、上記と少なくとも約85%、90%もしくは95%の相同性もしくは同一性を有する。上記改変もしくは変化した定常領域はまた、1個以上のアミノ酸欠失もしくは挿入を含み得る。さらに、上記改変定常領域は、変化した翻訳後修飾(例えば、変化したグリコシル化パターンが挙げられる)を生じる1個以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を含み得る。
変化したエフェクター機能を有するかもしくはエフェクター機能を有しない抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、改変定常領域、Fc領域、もしくは重鎖領域を有する抗体を操作もしくは生成することによって生成され得る;組換えDNA技術ならびに/もしくは細胞培養および発現条件は、変化した機能および/もしくは活性を有する抗体を生成するために使用され得る。例えば、組換えDNA技術は、エフェクター機能を含む抗体機能に影響を及ぼす領域(例えば、Fc領域もしくは定常領域)において、1個以上のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を操作するために使用され得る。あるいは、翻訳後修飾(例えば、グリコシル化パターン)の変化は、上記抗体が生成される細胞培養および発現条件を操作することによって、達成され得る。1個以上の置換、付加、もしくは欠失を抗体のFc領域に導入するために適した方法は、当該分野で周知であり、例えば、Sambrookら、(1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition,” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;HarlowおよびLane (1988),前出; Borrebaek (1992),前出;Johneら、(1993),前出;PCT公開番号WO 06/53301;および米国特許第7,704,497号に記載される標準のDNA変異誘発技術が挙げられる。
よって、本開示の特定の局面および方法は、1個以上のアミノ酸置換、挿入、および/もしくは欠失を含む、変化したエフェクター機能を有する抗CD200抗体に関する。いくつかの実施形態において、このような改変抗CD200抗体は、低下したエフェクター機能を示すか、またはエフェクター機能を全く示さない。いくつかの実施形態において、改変抗体は、ハイブリッド定常領域もしくはその部分(例えば、G2/G4ハイブリッド定常領域(例えば、Burtonら、(1992) Adv Immun 51:1−18;Canfieldら、(1991) J Exp Med 173:1483−1491;およびMuellerら、(1997) Mol Immunol 34(6):441−452を参照のこと)を含む。例えば(およびKabat番号付けに従って)、上記IgG1およびIgG4定常領域は、G249G250残基を含むのに対して、上記IgG2定常領域は、残基249を含まないが、G250を含む。G2/G4ハイブリッド定常領域において、上記249−250領域が上記G2配列に由来する場合、上記定常領域は、249位のグリシン残基を導入して、G249/G250を有するG2/G4融合物を生成するようにさらに改変され得る。
上記に記載されるようにG2/G4構築物を使用することに加えて、低下したエフェクター機能を有する抗CD200抗体は、上記抗体の特定の領域のアミノ酸配列において他のタイプの変化を導入することによって生成され得る。このようなアミノ酸配列変化としては、例えば、PCT公開番号WO 94/28027およびWO 98/47531;ならびにXuら、(2000) Cell Immunol 200:16−26に記載されるAla−Ala変異が挙げられるが、これらに限定されない。従って、いくつかの実施形態において、定常領域内に変異(上記Ala−Ala変異を含む)を有する抗CD200抗体は、エフェクター機能を低下もしくは破壊するために使用され得る。これら実施形態によれば、抗CD200抗体の定常領域は、234位のアラニンに対する変異もしくは235位のアラニンに対する変異を含む。さらに、上記定常領域は、二重変異を含み得る:234位のアラニンに対する変異および235位のアラニンに対する第2の変異。一実施形態において、上記抗CD200抗体は、IgG4フレームワークを含み、ここで上記Ala−Ala変異は、234位においてフェニルアラニンからアラニンへの変異および/もしくは235位においてロイシンからアラニンへの変異を説明する。別の実施形態において、上記抗CD200抗体は、IgG1フレームワークを含み、ここで上記Ala−Ala変異は、234位においてロイシンからアラニンへの変異および/もしくは235位においてロイシンからアラニンへの変異を説明する。抗CD200抗体は、代わりにもしくはさらに、他の変異(CH2ドメインにおける点変異K322Aを含む(Hezarehら、(2001) J Virol 75:12161−8))を有していてもよい。上記定常領域において上記変異を有する抗体は、さらに、ブロッキング抗体もしくは非ブロッキング抗体であり得る。
重鎖定常領域に導入される場合、低下したエフェクター機能を生じるさらなる置換は、例えば、Shieldsら、(2001) J Biol Chem 276(9):6591−6604に記載される。Shieldsら(その開示は、その全体において本明細書中に参考として援用される)の特に、表1(「ヒトFcRnおよびFcγRへのヒトIgG1改変体の結合)を参照のこと。抗IgE抗体のライブラリー(上記ライブラリーの各抗体は、上記重鎖定常領域において1個以上の置換だけ異なる)を、Fcレセプターのパネル(FcRn、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIIIAが挙げられる)への結合についてスクリーニングすることによって、上記著者らは、特異的Fc−Fcレセプター相互作用を調節する多くの置換を同定した。例えば、CH2ドメインがD265A置換を含む(重鎖アミノ酸番号付けは、Kabatら(前出)に従う)改変IgG2a重鎖定常領域は、上記改変定常領域とIgG FcレセプターであるFcγRIIB、FcγRIII、FcγRI、およびFcγRIVとの間の相互作用の完全な喪失を生じる。Shieldsら、(2001)、6595頁、表1。Baudinoら、(2008) J Immunol 181:6664−6669 (前出)もまた参照のこと。
ヒンジ領域内の変化はまた、エフェクター機能に影響を及ぼす。例えば、上記ヒンジ領域の欠失は、Fcレセプターに対する親和性を低下させ得、補体活性化を低下させ得る(Kleinら、(1981) Proc Natl Acad Sci USA 78: 524−528)。従って、本開示はまた、上記ヒンジ領域における変化を有する抗体に関する。
いくつかの実施形態において、抗CD200抗体は、補体依存性細胞傷害性(CDC)を増強もしくは阻害するかのいずれかのために改変され得る。調節されたCDC活性は、上記抗体のFc領域において1個以上のアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を導入することによって達成され得る。例えば、米国特許第6,194,551号を参照のこと。代わりにもしくはさらに、システイン残基が上記Fc領域に導入され得、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このようにして生成されるホモダイマー抗体は、改善されたかもしくは低下した内部移行能力および/または増大もしくは低下した補体媒介性細胞殺傷を有し得る。例えば、Caronら、(1992) J Exp Med 176:1191−1195およびShopes (1992) Immunol 148:2918−2922;PCT公開番号WO 99/51642およびWO 94/29351;DuncanおよびWinter (1988) Nature 322:738−40;ならびに米国特許第5,648,260号および同第5,624,821号を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Wolffら、(1993) Cancer Research 53:2560−2565に記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体が操作され得(これは、二重のFc領域を有する)、それによって、増強された補体溶解およびADCC能力を有し得る。例えば、Stevensonら、(1989) Anti−Cancer Drug Design 3:219−230を参照のこと。
抗体のエフェクター機能を調節する別の潜在的手段としては、グリコシル化の変化(これは、例えば、Raju (2003) BioProcess International 1(4):44−53にまとめられている)が挙げられる。WrightおよびMorrisonによれば、ヒトIgGオリゴサッカリドの微小不均一性は、生物学的機能(例えば、CDCおよびADCC、種々のFcレセプターへの結合、ならびにC1qタンパク質への結合)に影響を及ぼし得る。(1997) TIBTECH 15:26−32。抗体のグリコシル化パターンは、細胞を生成する条件および細胞培養条件に依存して異なり得る(Raju,前出)。このような差異は、エフェクター機能および薬物動態の両方における変化をもたらし得る。例えば、Israelら、(1996) Immunology 89(4):573−578;Newkirkら、(1996) Clin Exp Immunol 106(2):259−264を参照のこと。エフェクター機能における差異は、上記IgGが上記エフェクター細胞上の上記Fcγレセプター(FcγR)に結合する能力に関連し得る。Shieldsらは、IgGと、FcγRへの改善された結合を有する、アミノ酸配列における改変体とが、ヒトエフェクター細胞を使用して、最大100%まで増強されたADCCを示し得ることを示した。(2001) J Biol Chem 276(9):6591−6604。これら改変体は、上記結合界面において見いだされなかったアミノ酸変化を含むが、上記糖成分の性質およびその構造パターンの両方がまた、観察される差異に寄与し得る。さらに、IgGのオリゴサッカリド成分におけるフコースの存在もしくは非存在は、結合およびADCCを改善し得る。例えば、Shieldsら、(2002) J Biol Chem 277(30):26733−26740を参照のこと。Asn297に結合したフコシル化炭水化物が欠如したIgGは、上記FcγRIレセプターへの通常のレセプター結合を示した。対照的に、上記FcγRIIIAレセプターへの結合は、50倍改善され、増強されたADCCが、特に、より低い抗体濃度において、付随した。
Shinkawaらは、ラットハイブリドーマにおいて生成された上記ヒトIL−5レセプターに対する抗体が、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)において生成された抗体と比較した場合、50%を超えて高いADCCを示すことを実証した(Shinkawaら、(2003) J Biol Chem 278(5):3466−73)。モノサッカリド組成およびオリゴサッカリドプロフィールは、上記ラットハイブリドーマ生成IgGが、CHO生成タンパク質より低い含有量のフコースを有することを示した。上記著者らは、IgG1のフコシル化の欠如が、ADCC活性の増強において重要な役割を有すると結論づけた。
異なるアプローチが、Umanaら(彼らは、chCE7(キメラIgG1抗神経芽腫抗体のグリコシル化パターンを変化させた)によってとられた。((1999) Nat Biotechnol 17(2):176−180)。テトラサイクリンを使用して、彼らは、ADCC活性に関与したオリゴサッカリドを二分する(bisect)グリコシルトランスフェラーゼ酵素(GnTIII)の活性を調節した。親抗体のADCC活性は、バックグラウンドレベルをかろうじて上回った。異なるテトラサイクリンレベルにおいて生成した上記chCE7のADCC活性の測定は、最大のchCE7インビトロADCC活性についてのGnTIII発現の最適範囲を示した。この活性は、定常領域に会合した、二分された複合型オリゴサッカリドのレベルと相関した。新たに至適化された改変体は、実質的なADCC活性を示した。同様に、WrightおよびMorrisonは、グリコシル化欠損CHO細胞株において抗体を生成し、この細胞株において生成した抗体が、補体媒介性細胞溶解の能力がないことを示した。(1994) J Exp Med 180:1087−1096。従って、エフェクター機能に影響を及ぼす公知の変化は、グリコシル化パターンの改変もしくはグリコシル化残基の数の変化を含むので、本開示は、グリコシル化がエフェクター機能(ADCCおよびCDCを含む)を増強させるかもしくは低下させるかのいずれかであるように変化しているCD200抗体に関する。変化したグリコシル化は、グリコシル化残基の数の減少もしくは増加、ならびにグリコシル化残基のパターンもしくは位置の変化を含む。
抗体のエフェクター機能を変化させるためのなお他のアプローチが存在する。例えば、抗体生成細胞は、高度変異誘発性(hypermutagenic)であり得、それによって、抗体分子全体を通じて無作為に変化したポリペプチドの残基を有する抗体を生成し得る。例えば、PCT公開番号WO 05/011735を参照のこと。高度変異誘発性宿主細胞は、DNAミスマッチ修復が欠損している細胞を含む。このようにして生成される抗体は、抗原性が低下し得るか、そして/または有益な薬物動態特性を有し得る。さらに、このような抗体は、増強もしくは低下したエフェクター機能のような特性について選択され得る。
エフェクター機能が、抗体の結合親和性に従って変動し得ることは、さらに理解される。例えば、高親和性を有する抗体は、比較的低い親和性を有する抗体と比較して、補体系を活性化することにおいてより効率的であり得る(Marzocchi−Machadoら、(1999) Immunol Invest 28:89−101)。よって、抗体は、その抗原に対する結合親和性が低下するように変化させられ得る(例えば、1個以上のアミノ酸残基の置換、付加、もしくは欠失のような方法によって上記抗体の可変領域を変化させることによる)。低下した結合親和性を有する抗CD200抗体は、低下したエフェクター機能(例えば、低下したADCCおよび/もしくはCDCを含む)を示し得る。
(抗体結合体)
本明細書に記載の抗体は、例えば、発現の前またはそれらの発現もしくは精製の後に改変され得る。上記改変は、共有結合的もしくは非共有結合的な改変であり得る。このような改変は、例えば、上記ポリペプチドの標的とされたアミノ酸残基と、選択された側鎖もしくは末端残基と反応し得る有機性誘導体化剤とを反応させることによって、上記抗体に導入され得る。改変に適切な部位は、種々の基準(例えば、上記抗体の構造分析もしくはアミノ酸配列分析を含む)のうちのいずれかを使用して選択され得る。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、異種部分に結合体化され得る。上記異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療剤(例えば、毒素もしくは薬物)、または検出可能な標識(例えば、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、もしくは発光標識が挙げられるが、これらに限定されない)であり得る。適切な異種ポリペプチドとしては、上記抗体の精製に使用するために、例えば、抗原性タグ(例えば、FLAG、ポリヒスチジン、ヘマグルチニン(HA)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、もしくはマルトース結合タンパク質(MBP))が挙げられる。異種ポリペプチドはまた、診断マーカーもしくは検出可能なマーカーとして有用なポリペプチド(例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、もしくはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT))が挙げられる。上記異種部分がポリペプチドである場合、この部分は、融合タンパク質として本明細書に記載の抗体に組み込まれ得る。
適切な放射性標識としては、例えば、32P、33P、14C、125I、131I、35S、および3Hが挙げられる。適切な蛍光標識としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、DyLight 488、フィコエリスリン(PE)、ヨウ化プロピジウム(PI)、PerCP、PE−Alexa Fluor(登録商標) 700、Cy5、アロフィコシアニン、およびCy7が挙げられるが、これらに限定されない。発光標識としては、例えば、種々の発光ランタニド(例えば、ユーロピウムもしくはテルビウム)キレートのうちのいずれかが挙げられる。例えば、適切なユーロピウムキレートとしては、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)もしくはテトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−四酢酸(DOTA)のユーロピウムキレートが挙げられる。酵素標識としては、例えば、アルカリホスファターゼ、CAT、ルシフェラーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。
2つのタンパク質(例えば、抗体および異種部分)は、公知の化学的架橋剤のうちのいずれかを使用して架橋され得る。このような架橋剤の例としては、「ヒンダード(hindered)」ジスルフィド結合を含む連結を介して2個のアミノ酸残基を連結するものである。これら連結において、架橋ユニットの中のジスルフィド結合は、例えば、還元型グルタチオンもしくは酵素ジスルフィドレダクターゼの作用による還元から保護される(上記ジスルフィド結合のいずれかの側上の基を妨げることによって)。1つの適切な試薬である4−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)は、上記タンパク質のうちの一方の上の末端リジンおよび他方のタンパク質の末端システインを利用して、2個のタンパク質の間でこのような連結を形成する。各タンパク質の上の異なるカップリング部分によって架橋するヘテロ二官能性試薬はまた、使用され得る。他の有用な架橋剤としては、2個のアミノ基(例えば、N−5−アジド−2−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド)、2個のスルフヒドリル基(例えば、1,4−ビス−マレイミドブタン)、アミノ基とスルフヒドリル基(例えば、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)、アミノ基とカルボキシル基(例えば、4−[p−アジドサリチルアミド]ブチルアミン)、およびアミノ基とアルギニンの側鎖に存在するグアニジウム基(例えば、p−アジドフェニルグリオキサール一水和物)を連結する試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、放射性標識は、上記抗体のアミノ酸骨格に直接結合体化され得る。あるいは、上記放射性標識は、遊離アミノ基に結合して、関連タンパク質のメタ−ヨードフェニル(mIP)誘導体(例えば、Rogersら(1997) J Nucl Med 38:1221−1229を参照のこと)もしくは次に上記タンパク質の骨格に結合するキレート(例えば、DOTAもしくはDTPAに)を形成するより大きな分子の一部(例えば、メタ−[125I]ヨードフェニル−N−ヒドロキシスクシンイミドにおける125I([125I]mIPNHS))として含まれ得る。上記放射性標識もしくはこれらを含むより大きな分子/キレートを、本明細書に記載される抗体に結合体化するための方法は、当該分野で公知である。このような方法は、上記タンパク質を、上記放射性標識もしくはキレートを上記タンパク質に結合するのを促進させる条件(例えば、pH、塩濃度、および/もしくは温度)下で上記放射性標識とインキュベートする工程を包含する(例えば、米国特許第6,001,329号を参照のこと)。
蛍光標識(ときおり「フルオロフォア」といわれる)をタンパク質(例えば、抗CD200抗体)に結合体化するための方法は、タンパク質化学の分野で公知である。例えば、フルオロフォアは、上記フルオロフォアに結合されるスクシンイミジル(NHS)エステル部分もしくはテトラフルオロフェニル(TFP)エステル部分を使用して、タンパク質の遊離アミノ基(例えば、リジンの)もしくはスルフヒドリル基(例えば、システイン)に結合体化され得る。いくつかの実施形態において、上記フルオロフォアは、ヘテロ二官能性架橋剤部分(例えば、スルホ−SMCC)に結合体化され得る。適切な結合体化法は、抗体タンパク質を、上記フルオロフォアと、上記タンパク質への上記フルオロフォアの結合を促進する条件下でインキュベートする工程を包含する。例えば、WelchおよびRedvanly(2003) 「Handbook of Radiopharmaceuticals:Radiochemistry and Applications」, John Wiley and Sons(ISBN 0471495603)を参照のこと。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、例えば、循環中(例えば、血中、血清中、もしくは組織中)での上記抗体の安定化および/もしくは保持を改善する部分で改変され得る。例えば、抗CD200抗体は、例えば、Leeら(1999) Bioconjug Chem 10(6):973−8;Kinstlerら(2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477−485;およびRobertsら(2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54:459−476に記載されるように、PEG化され得る。上記安定化部分は、上記抗体の安定性もしくは保持を、少なくとも1.5倍(例えば、少なくとも2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、もしくは50倍以上)、改善し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体は、グリコシル化され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体は、上記抗体もしくはフラグメントが、還元されるかもしくはグリコシル化されないように、酵素処理もしくは化学的処理に供され得るかもしくは細胞から生成され得る。還元されたグリコシル化を有する抗体を生成するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第6,933,368号;Wrightら(1991) EMBO J 10(10):2717−2723;およびCoら(1993) Mol Immunol 30:1361に記載される。
(薬学的組成物および処方物)
抗CD200抗体を含む組成物は、例えば、同種移植片器官の生存を長期化させるためにレシピエント哺乳動物に投与するための、薬学的組成物として処方され得る。上記薬学的組成物は、一般に、薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、生理学的に適合性である任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などをいい、これらを含む。上記組成物は、薬学的に受容可能な塩(例えば、酸付加塩もしくは塩基付加塩)を含み得る。例えば、Bergeら、(1977) J Pharm Sci 66:1−19を参照のこと。
上記組成物は、標準的方法に従って処方され得る。薬学的処方物は、十分に確立された技術であり、例えば、Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy,” 20th Edition, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472);Anselら、(1999) “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,” 7th Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727);およびKibbe (2000) “Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association,” 3rd Edition (ISBN: 091733096X)においてさらに記載されている。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、適した濃度において、および2〜8℃での貯蔵に適切な緩衝化溶液として、処方され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、0℃未満の温度(例えば、−20℃もしくは−80℃)での貯蔵のために処方され得る。
上記薬学的組成物は、種々の形態にあり得る。これら形態としては、例えば、液体、半固体および個体の投与形態が挙げられる(例えば、液体溶液(例えば、注射用および注入用の溶液)、分散物もしくは懸濁物、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤)。好ましい形態は、一部、意図された投与様式および治療適用に依存する。例えば、全身送達もしくは局所送達が意図された抗CD200抗体を含む組成物は、注射用もしくは注入用の溶液の形態にあり得る。よって、上記組成物は、非経口様式(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射)による投与のために処方され得る。「非経口投与」、「非経口投与される」、および他の文法的に等価な語句は、本明細書で使用される場合、経腸的投与および局所投与以外の、通常は、注射による投与様式をいい、静脈内、鼻内、眼内、肺、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、肺内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、大脳内、頭蓋内、頸動脈内および胸骨内の注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない(以下を参照のこと)。
上記組成物は、高濃度での安定した貯蔵に適切な、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソーム、もしくは他の規則正しい構造として処方され得る。滅菌注射用溶液は、本明細書に記載される抗体を、必要な場合、上記に列挙される成分のうちの1種もしくは組み合わせとともに適切な溶媒中で必要な量において組み込むことによって調製され得、続いて、濾過滅菌され得る。一般に、分散物は、本明細書に記載される抗CD200抗体を、基本的な分散媒および上記に列挙されるものに由来する必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌散剤の場合において、調製法は、真空乾燥および凍結乾燥を含み、上記方法から、本明細書に記載される抗体と予め滅菌濾過された溶液に由来する任意のさらなる所望の成分との散剤が得られる。溶液の適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には必要とされる粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる試薬(例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチン)を上記組成物中に含めることによってもたらされ得る。
特定の実施形態において、上記抗CD200抗体は、インプラントおよび微小被包された送達システムを含め、上記化合物を迅速な放出から保護するキャリアとともに調製され得る(例えば、制御放出処方物)。生分解性で生体適合性のポリマーが使用され得る(例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸)。このような処方物の調製のための多くの方法は、当該分野で公知である。例えば、J.R. Robinson (1978) 「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems」, Marcel Dekker, Inc., New York.を参照のこと。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗CD200抗体は、例えば、循環における(例えば、血液、血清、もしくは他の組織における)その安定化および/もしくは保持を改善する部分で、改変され得る。上記安定化部分は、上記抗体の安定性、もしくは保持を、少なくとも1.5倍(例えば、少なくとも2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、もしくは50倍以上)改善し得る。
いくつかの実施形態において、抗CD200抗体は、単位投与形態において存在し、上記単位投与形態は、自己投与に特に適切であり得る。本開示の処方された生成物は、容器(代表的には、例えば、バイアル、カートリッジ、充填済みシリンジもしくは使い捨てペン)内に含まれ得る。投与装置(doser)(例えば、米国特許第6,302,855号に記載される投与デバイス)はまた、例えば、本開示の注射システムとともに使用され得る。
本開示の注射システムは、米国特許第5,308,341号に記載されるとおりの送達ペン(delivery pen)を使用し得る。ペン型デバイス(最も一般的には、糖尿病を有する患者へのインスリンの自己送達のために使用される)は、当該分野で周知である。このようなデバイスは、少なくとも1つの注射ニードル(例えば、約5〜8mmの長さの31ゲージニードル)を含み得、代表的には、治療溶液の1以上の治療単位用量で予め充填され、上記溶液を可能な限りほとんど疼痛を伴わずに、被験体に迅速に送達するために有用である。
1つの医薬送達ペンは、バイアルホルダー(この中に、インスリンもしくは他の医薬のバイアルが収納され得る)を含む。上記バイアルホルダーは、近位端および遠位端を有する概して管状の構造である。上記バイアルホルダーの遠位端は、両頭ニードル(double−ended needle)カニューレと係合するための取り付け手段を含む。上記近位端はまた、ドライバおよび用量設定装置を含むペン本体と係合するための取り付け手段を含む。先行技術のバイアルホルダーとともに使用するための、バイアルを含む使い捨ての医薬(例えば、抗CD200抗体)は、貫通可能なエラストマー隔壁(両頭ニードルカニューレのうちの一方の端で穿孔され得る)を有する遠位端を含む。このバイアルの近位端は、上記バイアルの円筒型の壁と液密でかみ合う状態でスライド可能に配置されたストッパーを含む。この医薬送達ペンは、上記医薬のバイアルを上記バイアルホルダーへ挿入することによって使用される。次いで、ペン本体は、上記バイアルホルダーの近位端に繋がれる。上記ペン本体は、上記ペンによって送達されるべき医薬の用量を指定するための用量設定装置、および上記バイアルのストッパーを上記選択された用量に対応する距離にわたって遠位方向に動かすための駆動装置を含む。上記ペンのユーザーは、両頭ニードルカニューレの近位点が上記バイアルの隔壁を穿通するように、上記バイアルホルダーの遠位端に上記ニードルカニューレを取り付ける。次いで、上記患者は、用量を選択し、上記ペンを操作して、上記ストッパーを上記選択された用量を送達するように遠位方向に動かす。上記用量選択装置は、上記選択された用量を注射すると、ゼロに戻る。次いで、上記患者は、上記ニードルカニューレを取り外して廃棄し、次の必要とされる医薬投与のために、便利な場所に上記先行技術の医薬送達ペンをしまっておく。上記バイアル中の医薬は、数回のこのような医薬の投与の後に空になる。次いで、上記患者は、上記バイアルホルダーを上記ペン本体から外す。次いで、上記空のバイアルは、外されて廃棄され得る。新たなバイアルが上記バイアルホルダーに挿入され得、上記バイアルホルダーおよびペン本体は、上記で説明されるように、再度組み立てられ、使用され得る。よって、医薬送達ペンは、一般に、正確な投与および使用しやすさのための駆動機構を有する。
回転可能なノブのような投薬機構は、上記ユーザーが医薬の予めパッケージされたバイアルから上記ペンによって注射される医薬の量を正確に調節することを可能にする。医薬の上記用量を注射するために、上記ユーザーは、上記ニードルを皮膚の下に挿入し、上記ノブを押し込めるだけ奥に1回押し込む。上記ペンは、完全に機械式のデバイスであってもよいし、上記ユーザーに挿入される医薬の投与量を正確に設定および/または示すために電子回路と組み合わされてもよい。米国特許第6,192,891号を参照のこと。
いくつかの実施形態において、上記ペン型デバイスのニードルは、使い捨てであり、上記キットは、1つ以上の使い捨ての交換用のニードルを含む。現在特徴付けられている抗体溶液のいずれか1つの送達に適したペン型デバイスはまた、例えば、米国特許第6,277,099号;同第6,200,296号;および同第6,146,361号(これらのうちの各々の開示は、それらの全体において本明細書に参考として援用される)に記載されている。マイクロニードルベースのペン型デバイスは、例えば、米国特許第7,556,615号(この開示は、その全体において本明細書に参考として援用される)において記載される。Scandinavian Health Ltdによって製造されたPrecision Pen Injector (PPI)デバイス、MollyTMもまた参照のこと。
本開示はまた、医薬の長期的および/もしくは自己投与に適した、制御放出処方物もしくは長期放出処方物をもたらす。上記種々の処方物は、ボーラスとしての静脈投与によって、もしくは一定の期間にわたる連続注入によって、上記医薬(例えば、本開示の抗体および少なくとも1種の免疫抑制剤)での処置が必要な患者(例えば、同種移植片のレシピエント)に投与され得る。
いくつかの実施形態において、抗CD200抗体は、徐放性(sustained−release)投与、長期放出投与、時限(timed−release)投与、制御放出投与、もしくは連続放出投与のために処方される。いくつかの実施形態において、デポー処方物は、上記抗体をそれを必要とする被験体に投与するために使用される。この方法において、上記抗体は、数時間もしくは数日の期間にわたって活性薬剤の緩やかな放出を提供する1種以上のキャリアとともに処方される。このような処方物は、しばしば、身体に徐々に分散して、上記活性薬剤を放出する分解マトリクスに基づく。
抗CD200抗体のデポー注射に適した1つの処方物は、ポリマーデポーシステムに依拠する。上記ポリマーは、生分解性ポリマー(例えば、ポリ(乳酸)(PLA)および/もしくはポリ(乳酸−co−グリコール酸)(PLGA))であり得、溶媒、開始剤と混合したプレポリマー、被包されたポリマー粒子もしくはポリマーマイクロスフェア中の溶液の形態にあり得る。上記ポリマーもしくはポリマー粒子は、上記活性薬剤を捕捉し、徐々に分解して、ゆっくりと拡散することによっておよび/もしくは上記マトリクスが吸収されるにつれて上記薬剤を放出する。このようなシステムの例としては、米国特許第4,938,763号;同第5,480,656号;および同第6,113,943号に記載されるものが挙げられ、最大数ヶ月までの期間にわたって活性薬剤の送達を生じ得る。
別のデポーシステムは、米国特許第5,807,573号に記載され、このシステムは、脂質ベース(ジアシルグリセロール、リン脂質および必要に応じて、水、グリセロール、エチレングリコールもしくはプロピレングリコール)である。適切なデポー処方物はまた、例えば、米国特許出願公開番号20060165800(短い継続期間にわたって被験体に有益な薬剤を全身送達および局所送達するための注射用デポーゲル組成物を記載する);Bariら、(2010) Int J Pharm Sci Rev Res 3(1):1−10(哺乳動物への治療タンパク質の非経口的送達に適した長期放出処方物を記載する);および米国特許出願公開番号20090010928(これは、デポー抗体処方物(例えば、50mM L−ヒスチジン、150mM NaCl(HClでpH6.0に調節)からなる水性緩衝液中に処方された、5mg/mLのモノクローナル抗体を含む組成物を含む)を記載する)において記載されている。
抗CD200抗体組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形態において調製され得る。「投与単位形態」とは、本明細書において使用される場合、処置されるべき被験体のための単位投与量として適した物理的に別個の単位をいう;各単位は、選択された薬学的キャリアと会合した状態で所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含む。
本開示は、CD200に結合する抗体(例えば、サマリズマブ)を含む水性溶液を提供する。いくつかの実施形態において、上記溶液は、抗CD200抗体の高濃度溶液であり得る。このような溶液は、ときおり、「高濃度抗体溶液」と本明細書でいわれる。本明細書で使用される場合、水性溶液中の抗CD200抗体の「高濃度」は、少なくとも10mg/mL以上(例えば、少なくとも11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、105mg/mL、110mg/mL、115mg/mL、120mg/mL、125mg/mL、130mg/mL、135mg/mL、140mg/mL、145mg/mL、150mg/mL、155mg/mL、160mg/mL、165mg/mL、170mg/mL、175mg/mL、180mg/mL、185mg/mL、190mg/mL、195mg/mL、200mg/mL、205mg/mL、210mg/mL、215mg/mL、220mg/mL、225mg/mL、230mg/mL、235mg/mL、240mg/mL、245mg/mL、もしくは250mg/mL以上)である上記抗体の濃度である。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、200mg/mLより高い(例えば、200mg/mL、205mg/mL、210mg/mL、215mg/mL、220mg/mL、225mg/mL、230mg/mL、235mg/mL、240mg/mL、245mg/mL、250mg/mL、255mg/mL、260mg/mL、265mg/mL、270mg/mL、275mg/mL、280mg/mL、285mg/mL、もしくは290mg/mLより高い)濃度において上記溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、上記抗体は、例えば、10mg/mL〜200mg/mL、20mg/mL〜200mg/mL、30mg/mL〜200mg/mL、40mg/mL〜200mg/mL、50mg/mL〜200mg/mL、60mg/mL〜200mg/mL、70mg/mL〜200mg/mL、80mg/mL〜200mg/mL、90mg/mL〜200mg/mL、100mg/mL〜200mg/mL、110mg/mL〜200mg/mL、120mg/mL〜200mg/mL、130mg/mL〜200mg/mL、140mg/mL〜200mg/mL、150mg/mL〜200mg/mL、10mg/mL〜100mg/mL、20mg/mL〜100mg/mL、30mg/mL〜100mg/mL、40mg/mL〜100mg/mL、50mg/mL〜100mg/mL、60mg/mL〜100mg/mL、70mg/mL〜100mg/mL、80mg/mL〜100mg/mL、90mg/mL〜100mg/mL、10mg/mL〜150mg/mL、20mg/mL〜150mg/mL、30mg/mL〜150mg/mL、40mg/mL〜150mg/mL、50mg/mL〜150mg/mL、60mg/mL〜150mg/mL、70mg/mL〜150mg/mL、80mg/mL〜150mg/mL、90mg/mL〜150mg/mL、100mg/mL〜150mg/mL、110mg/mL〜150mg/mL、120mg/mL〜150mg/mL、40mg/mL〜50mg/mL、10mg/mL〜250mg/mL、20mg/mL〜250mg/mL、30mg/mL〜250mg/mL、40mg/mL〜250mg/mL、50mg/mL〜250mg/mL、60mg/mL〜250mg/mL、70mg/mL〜250mg/mL、80mg/mL〜250mg/mL、90mg/mL〜250mg/mL、100mg/mL〜250mg/mL、110mg/mL〜250mg/mL、120mg/mL〜250mg/mL、130mg/mL〜250mg/mL、140mg/mL〜250mg/mL、150mg/mL〜250mg/mL、160mg/mL〜250mg/mL、170mg/mL〜250mg/mL、180mg/mL〜250mg/mL、190mg/mL〜250mg/mL、200mg/mL〜250mg/mL、200mg/mLより高い(例えば、少なくとも201mg/mL)〜250mg/mL、または200mg/mLより高い(例えば、201mg/mL以上)〜300mg/mLの濃度において上記溶液中に存在する。
いくつかの実施形態において、抗CD200抗体は、単独療法として使用するためのものであり、そのように処方される。いくつかの実施形態において、抗CD200抗体は、1種以上のさらなる活性薬剤とともに、もしくはこれらとともに使用するために処方され得る。例えば、上記1種以上のさらなる活性薬剤は、哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化するために有用であり得る。このような薬剤としては、例えば、モノクローナル抗CD3抗体OKT3、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)、シクロスポリンA、もしくはタクロリムス(FK 506)が挙げられる。さらに、グルココルチコイドおよび/もしくはアザチオプリン(もしくは他のプリンアナログ)は、移植前に宿主に投与され得る。移植拒絶を予防もしくは阻害することを補助するために使用される薬物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ATGもしくはALG、OKT3、ダクリズマブ、バシリキシマブ、コルチコステロイド、15−デオキシスペルグアリン、LF15−0195、シクロスポリン、タクロリムス、プリンアナログ(例えば、アザチオプリン)、メトトレキサート、ミコフェノレート化合物(例えば、ミコフェノール酸モフェチルもしくはミコフェノール酸ナトリウム)、6−メルカプトプリン、ブレディニン、ブレキナル、レフルノミド、シクロホスファミド、シロリムス、抗CD4モノクローナル抗体、CTLA4−Ig、リツキサン、抗CD154モノクローナル抗体、抗LFAlモノクローナル抗体、抗LFA−3モノクローナル抗体、抗CD2モノクローナル抗体、および抗CD45抗体。
移植片拒絶を遅らせるために(すなわち、移植片生存を長期化するために)利用される多くの薬物は、種々の方法において機能する。シクロスポリンAは、移植片拒絶を阻害するために最も広く使用されている免疫抑制薬のうちの1つである。それは、インターロイキン−2すなわちIL−2のインヒビターである(それは、インターロイキン−2のmRNA転写を妨げる)。より直接的には、シクロスポリンは、T細胞レセプター刺激に際して通常起こるカルシニューリン活性化を阻害する。カルシニューリンは、NFAT(活性化T細胞の核因子)を脱リン酸化し、それによって、NFATが核に入り、インターロイキン−2プロモーターに結合することを可能にする。このプロセスをブロックすることによって、シクロスポリンAは、上記CD4+T細胞の活性化、および別に存在する事象の生じたカスケードを阻害する。タクロリムスは、カルシニューリン阻害を介してインターロイキン−2の生成を阻害することによって作用する別の免疫抑制剤である。ラパマイシン(シロリムス)、SDZ RAD、およびインターロイキン−2レセプターブロッカーは、インターロイキン−2の作用を阻害する薬物であり、従って、上記の事象のカスケードを妨げる。プリンもしくはピリミジン生合成のインヒビターはまた、移植片拒絶を阻害するために使用される。これらインヒビターは、DNA合成を妨げ、それによって、T細胞増殖を含む細胞分裂を阻害する。その結果は、新たなT細胞の形成を妨げることによる、T細胞活性の阻害である。プリン合成のインヒビターとしては、以下が挙げられる:アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)、ミコフェノール酸ナトリウム(Novartis)、およびミゾリビン(ブレディニン)。ピリミジン合成のインヒビターとしては、ブレキナルナトリウムおよびレフルノミドが挙げられる。
シクロホスファミドは、プリン合成およびピリミジン合成の両方のインヒビターである。T細胞活性化を阻害するためのなお別の方法は、T細胞に対する抗体でレシピエントを処置することである。OKT3は、T細胞レセプターの一部であるCD3に対するマウスモノクローナル抗体である。この抗体は,最初に、T細胞レセプターを介してT細胞を活性化し、次いで、上記活性化T細胞のアポトーシスを誘導する。
同種移植片拒絶を遅らせるための多くの他の薬物および方法は、当業者に公知であり、使用されている。1つのアプローチは、T細胞を、例えば、照射によって枯渇させることである。T細胞の枯渇は、しばしば、骨髄移植において、特に、主要なHLAの部分的不適合が存在する場合に使用されてきた。上記CD40リガンド−CD40相互作用のインヒビター(ブロッカー)および/または上記CD28−B7相互作用のブロッカーの、レシピエントへの投与も、使用されてきた(米国特許第6,280,957号)。PCT出願公開番号WO 01/37860は、Th1免疫応答を阻害するために、抗CD3抗体およびIL−5の投与を開示する。PCT出願公開番号WO 00/27421は、腫瘍壊死因子αアンタゴニストを投与することによって、角膜移植片拒絶の予防もしくは処置のための方法を教示する。Glotzら、(2002) Am J Transplant 2:758−760は、静脈内免疫グロブリンの投与(IVIg)が、抗HLA抗体の力価における顕著なかつ持続した減少を誘導し得、それによって、HLA不適合器官の生存を可能にすることを示す。類似のプロトコルは、血漿交換(Xaubeら、(1984) Lancet 1:824−828)もしくは免疫抑制剤と合わせた免疫吸着技術(Hiesseら、(1992) Nephrol Dial Transplant 7:944−951)もしくはこれら方法の組み合わせ(Montgomeryら, 2000 Transplantation 70:887−895)を含んだ。Changelianら(2003) Science 302:875−878は、免疫抑制がJanusキナーゼ3(JAK3)(これは、共通するγ鎖(γc)を使用するサイトカインレセプター(インターロイキン−2、−4、−7、−9、−15、−21)の適切なシグナル伝達に必須の酵素である)の経口インヒビターによって引き起こされるモデル(その結果は、T細胞活性化の阻害である)を開示する。
ICAM−1に対するアンチセンス核酸は、単独で、または心臓同種移植片移植の研究において白血球機能関連抗原1(LFA−1)に対して特異的なモノクローナル抗体と組み合わせて使用されてきた(Stepkowski,前出)。同様に、抗ICAM−1抗体は、心臓同種移植片を処置するために抗LFA−1抗体と組み合わせて使用されてきた(Stepkowski,前出)。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ラット心臓もしくは腎臓同種移植片モデルにおいてシクロスポリンと共にさらに使用され、上記移植片の生存を長期化する相乗効果を生じた(Stepkowski,前出)。慢性移植片拒絶は、TGF−βのアンタゴニスト(これは、分化、増殖、およびアポトーシスに関与するサイトカインである)を投与することによって処置された(米国特許出願公開番号2003/0180301)。
上記抗CD200抗体は、第2の活性薬剤と組み合わせて使用されるべき場合、または2種以上の異なる抗CD200抗体が使用されるべき場合、上記薬剤は、別個にもしくは一緒に処方され得る。例えば、それぞれの薬学的組成物が、例えば、投与直前に混合され得、一緒に投与され得るか、または例えば、同時にもしくは異なるときに、別個に投与され得る(以下を参照のこと)。
上記のように、組成物は、上記組成物が治療上有効量の抗CD200抗体を含むように処方され得るか、または上記組成物は、治療量以下の量の上記抗体および治療量以下の量の1種以上のさらなる活性薬剤を含み、その結果、上記成分が全体として、哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するために治療上有効であるように、処方され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、2種以上の抗CD200抗体(各々、治療量以下にある)を含み、その結果、上記抗体が組み合わせにおいて、移植片生存を長期化するために治療上有効である濃度にあるように、処方され得る。抗CD200抗体の治療上有効な用量を決定するための方法は、当該分野で公知であり、本明細書に記載される。
(生物学的サンプルおよびサンプル収集)
本明細書に記載される方法において使用するための適切な生物学的サンプルは、任意の生物学的流体、細胞集団、もしくは組織またはその画分を含み、これらは、1個以上の白血球集団を含む。生物学的サンプルは、例えば、被験体(例えば、ヒトのような哺乳動物)から得られる標本であり得るか、またはこのような被験体に由来し得る。例えば、サンプルは、生検によって得られる組織切片、または組織培養物中に配置されるかもしくは組織培養に適合させられる細胞であり得る。生物学的サンプルはまた、生物学的流体(例えば、尿、全血もしくはその画分(例えば、血漿)、唾液、精液、痰、脳脊髄液、涙液、もしくは粘液)であり得る。生物学的サンプルは、所望であれば、特定の細胞タイプを含む画分へとさらに分画され得る。例えば、全血サンプルは、血清へと、もしくは特定の血球タイプ(例えば、赤血球もしくは白血球(白血球(leukocyte)))を含む画分へと分画され得る。所望であれば、生物学的サンプルは、被験体由来の異なる生物学的サンプルの組み合わせ(例えば、組織および流体サンプルの組み合わせ)であり得る。一部の実施形態において、生物学的サンプルは、脾臓組織または脾性免疫細胞集団を含む。
上記生物学的サンプルは、被験体(例えば、同種移植器官(例えば、同種移植の腎臓または心臓)を有するレシピエント哺乳動物)から得られ得る。上記生物学的サンプルを得るための任意の適切な方法が使用され得るが、例示的な方法は、例えば、瀉血、スワブ(例えば、口内スワブ)、洗浄液、もしくは細いニードルの吸引による生検手順が挙げられる。細いニードルで吸引しやすい組織の非限定的な例としては、リンパ節、肺、甲状腺、乳房および肝臓が挙げられる。生物学的サンプルはまた、骨髄から得られ得る。サンプルはまた、例えば、顕微解剖(例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法(laser capture microdissection)(LCM)もしくはレーザーマイクロダイセクション法(laser microdissection(LMD))、膀胱洗浄、スミア(PAPスミア)もしくは乳管洗浄細胞診(ductal lavage)によって集められ得る。
上記生物学的サンプル中の細胞の活性もしくは完全性を保つ、サンプルを得るおよび/もしくは貯蔵するための方法は、当業者に周知である。例えば、生物学的サンプルは、1種以上のさらなる薬剤(例えば、適切な緩衝剤および/もしくはインヒビター(プロテアーゼインヒビターを含む))とさらに接触させられ得、上記薬剤は、上記細胞を保存するか、上記細胞における変化(例えば、容量オスモル濃度もしくはpHにおける変化)を最小限にするか、または上記細胞の細胞表面タンパク質(例えば、GPI結合タンパク質)もしくは表面上のGPI部分を保存するか、それらの変性を最小限にすることが意図される。このようなインヒビターとしては、例えば、キレート化剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレングリコール四酢酸(EGTA))、プロテアーゼインヒビター(例えば、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、アプロチニン、およびロイペプチン)が挙げられる。適切な緩衝剤および全細胞を貯蔵するかもしくは別の方法で操作するための条件は、例えば、Methods in molecular biology,Humana PressのPollardおよびWalker(1997),「Basic Cell Culture Protocols」,第75巻;Practical approach series,Oxford University PressのMasters(2000) 「Animal cell culture:a practical approach」,第232巻;およびMethods in molecular medicine, Humana PressのJones(1996) 「Human cell culture protocols」,第2巻に記載される。
サンプルはまた、干渉物質の存在を排除するかもしくは最小限にするように加工処理され得る。例えば、生物学的サンプルは、目的でない1種以上の材料(例えば、細胞)を除去するように分画もしくは精製され得る。生物学的サンプルを分画もしくは精製するための方法としては、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング、および沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。
(バイオマーカーおよび適用)
本発明者らは、いくつかのバイオマーカーを同定し、本明細書において提供した。そのうちの1種以上における変化は、同種移植片器官を有するレシピエント哺乳動物に投与される抗CD200抗体による、所望の免疫調節効果の生成と一致する。すなわち、上記同定されたバイオマーカーのうちの1種以上における変化は、レシピエント哺乳動物において長期化した同種移植片生存と相関する。上記バイオマーカーは、この節において以下に記載され、実用的な実施例において例示される。
「所望の免疫調節効果」、「抗CD200抗体関連免疫調節効果」および文法的に類似の用語は、本明細書で使用される場合、上記哺乳動物に投与される抗CD200抗体の生物学的活性に帰し得る、哺乳動物における測定可能な所望の免疫学的効果をいう。例えば、本発明者らは、哺乳動物への抗CD200抗体の(例えば、少なくとも1種の免疫抑制剤との組み合わせにおいて)投与後に、調節性T細胞の濃度が増大するのに対して、CD3+CD4+T細胞およびCD3+CD8+T細胞の濃度が同種移植片を有するレシピエント哺乳動物において減少することを観察した。抗CD200抗体の投与の際に、CD11c+(CD49b−)細胞(例えば、CD11c+(CD49b−)抗原提示細胞)によるCD40、MHCクラスII、およびCD80の発現レベルが減少するのに対して、IL−12の細胞内発現レベルはこのサブセットにおいて増大することもまた、観察した。いくつかの免疫細胞集団(例えば、F4/80+CD45+、CD3+CD25+、CD3+CD200R+、およびCD19+CD45+細胞)の濃度のさらなる変化は、抗CD200抗体で処置した同種移植片レシピエント哺乳動物においても観察された。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、本発明者らは、抗CD200抗体(および必要に応じて1種以上の免疫抑制剤)で処置した哺乳動物を、これらバイオマーカーのうちの1種以上における変化(例えば、増大もしくは減少)についてモニターすることが、とりわけ、上記抗CD200抗体が、上記抗体が投与される上記哺乳動物において生物学的効果を生じ得るか否かを決定するために有用であると考える。さらに、上記バイオマーカーのうちの1種以上の変化をモニターすることはまた、上記哺乳動物における免疫調節効果によって、上記疾患において臨床的に意義のある効果を達成するために十分(すなわち、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するために十分)である抗CD200抗体(例えば、サマリズマブ)の用量、すなわち、閾値用量(もしくは投与スケジュール)を同定するために有用である。
従って、本開示によれば、抗CD200抗体(例えば、低下したエフェクター機能を有するかもしくはエフェクター機能を全く有しない改変抗CD200抗体)が、哺乳動物(例えば、ヒト)において所望の免疫調節効果(例えば、抗CD200抗体関連免疫調節効果)を生じたか否かを決定するために、実施者は、抗CD200抗体を投与した哺乳動物に由来する生物学的サンプル中の例えば、調節性T細胞(例えば、CD4+CD25+FoxP3+細胞)の濃度を測定し得る。コントロールサンプル中の上記細胞の濃度と比較して、上記サンプル中の同じ組織学的タイプの細胞の濃度の増大は、上記抗CD200抗体が上記哺乳動物において所望の免疫調節効果を生じたことを示す。いくつかの実施形態において、上記実施者は、上記生物学的サンプル中の上記調節性T細胞の濃度を直接測定する必要はない。例えば、(i)上記抗体を投与した同種移植片レシピエント哺乳動物に由来する生物学的サンプル中の調節性T細胞の濃度および(ii)コントロール細胞濃度についての情報を提供された実施者(例えば、医療専門家または診断科学者もしくは診断技術者)は、上記抗体が、上記ヒトにおいて所望の免疫調節効果を生成したか否かを、情報を使用して(例えば、上記生物学的サンプル中の調節性T細胞の濃度と、上記コントロールサンプル中のこのような細胞の濃度とを比較して)決定し得、ここで上記調節性T細胞のコントロール濃度と比較して、上記生物学的サンプル中の上記調節性T細胞の濃度における増大は、上記抗CD200抗体が上記ヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたことを示す。
同様に、所望の免疫調節効果が、上記哺乳動物において起こったか否かを決定するための方法は、例えば、抗CD200抗体で(および必要に応じて、少なくとも1種の免疫抑制剤で)処置した同種移植片レシピエント哺乳動物から得た生物学的サンプル中のGr−1+CD11b+CD45+細胞の濃度(ここでGr−1+CD11b+CD45+細胞のコントロール濃度と比較して上記Gr−1+CD11b+CD45+細胞の濃度の増大は、上記抗CD200抗体が、上記レシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生じたことを示す)を決定する工程を包含し得る。
所望の免疫調節効果が上記哺乳動物において起こったか否かを決定するための方法は、例えば、抗CD200抗体で(および必要に応じて、少なくとも1種の免疫抑制剤)で処置した同種移植片レシピエント哺乳動物から得た生物学的サンプル中のF4/80+CD45+細胞の濃度(ここでF4/80+CD45+細胞のコントロール濃度と比較して、上記F4/80+CD45+細胞の濃度における低下は、上記抗CD200抗体が上記レシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生じたことを示す)を決定する工程を包含し得る。
所望の免疫調節効果が上記哺乳動物で起こったか否かを決定するための方法は、例えば、抗CD200抗体で(および必要に応じて、少なくとも1種の免疫抑制剤で)処置した同種移植片レシピエント哺乳動物から得られた生物学的サンプル中のCD3+CD25+細胞の濃度を決定する工程を包含し得、ここでCD3+CD25+細胞のコントロール濃度と比較して、上記CD3+CD25+細胞の濃度の減少は、上記抗CD200抗体が上記レシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生じたことを示す。
所望の免疫調節効果が上記哺乳動物において起こったか否かを決定するための方法は、例えば、抗CD200抗体で(および必要に応じて、少なくとも1種の免疫抑制剤で)処置した同種移植片レシピエント哺乳動物から得られた生物学的サンプル中のCD3+CD8+細胞もしくはCD3+CD8+細胞の濃度を決定する工程を包含し得、ここでこれら細胞集団のうちの一方もしくは両方の濃度の、上記細胞のコントロール濃度と比較した減少は、上記抗CD200抗体が上記レシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生じたことを示す。
いくつかの実施形態において、抗CD200抗体(例えば、低下したエフェクター機能を有するかもしくはエフェクター機能を有しない改変抗CD200抗体)がレシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生じたか否か(およびそれによって、上記哺乳動物が、とりわけ、その免疫調節活性を介して、上記哺乳動物の処置に影響を及ぼすために十分な上記抗体の用量を投与されたか)を決定するために、実施者は、抗CD200抗体を投与した哺乳動物に由来する生物学的サンプル中のCD3+CD200R+細胞の濃度を測定し得る。上記生物学的サンプル中のCD3+CD200R+細胞の濃度における、コントロールサンプル中の同じ組織学的タイプの細胞の濃度と比較した増大は、上記抗CD200抗体が上記哺乳動物において所望の免疫調節効果を生じたことを示す。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、本発明者らは、CD3+CD200R+細胞の濃度における増大が、潜在的に、上記抗CD200抗体に対するこれら細胞による代償的応答であると考える。従って、CD3+CD200R+細胞の濃度は、上記抗CD200抗体が投与される上記哺乳動物における抗CD200抗体の免疫調節効果をモニター(検出する)ための間接的なバイオマーカーとして働く。
所望の免疫調節効果がレシピエント哺乳動物において起こったか否かを決定するための方法が、本明細書で開示されるバイオマーカー細胞集団のうちの2つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、もしくは9つ)の分析を伴い得ることは理解される。
特定の細胞集団(例えば、CD4+CD25+FoxP3+調節性T細胞)の濃度を測定するための方法は、当該分野で周知であり、他の方法の中でも、フローサイトメトリーを含む。例えば、Chenら、(2009) Mol Immunol 46(10):1951−1963を参照のこと。いくつかの実施形態において、実施者は、処置後患者(抗CD200抗体が既に投与された患者)から得られた生物学的サンプルを、細胞の特定のサブセットの細胞の濃度について問い合わせ得る(interrogate)。例えば、実施者は、処置後患者に由来する生物学的サンプル中に存在するCD3+CD4+T細胞の濃度および/もしくは活性化CD3+/CD8+T細胞の濃度を決定し得る。これら2つの場合の各々において、所定のサブセットの細胞の濃度における、同じ組織学的タイプの細胞のコントロール濃度と比較した減少は、上記抗CD200抗体が上記ヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたことを示す。
上記のように、抗CD200抗体(例えば、低下したエフェクター機能を有するかもしくはエフェクター機能を有しない改変抗CD200抗体)がヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたか否かを決定することは、上記抗CD200抗体の投与後の患者から得られた生物学的サンプル中の特定のサブタイプの細胞の濃度(処置後のCD4+CD25+FoxP3+調節性T細胞濃度)と、コントロールサンプル中の同じ組織学的タイプの細胞の濃度とを比較することによって、行われ得る。いくつかの実施形態において、コントロールサンプルは、上記患者に上記抗CD200抗体を投与する前に、上記患者から得られる。いくつかの実施形態において、上記コントロールサンプルは、例えば、抗CD200抗体を投与したことがない1名以上(例えば、2名、3名、4名、5名、6名、7名、8名、9名、10名、15名、20名、25名、30名、35名、もしくは40名以上)の健康な個体から得られたサンプルの収集物であり得る(もしくは上記収集物に基づき得る)(例えば、同じ組織学的タイプの細胞のコントロール濃度は、抗CD200抗体を投与したことがない患者から得られた1つ以上のコントロールサンプル中の上記細胞の濃度の平均であり得る)。いくつかの実施形態において、上記コントロールサンプルは、例えば、1以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、もしくは40以上の)同種移植片レシピエント哺乳動物から得られたサンプルの収集物であり得るかもしくは上記収集物に基づき得るが、上記レシピエント哺乳動物は、抗CD200抗体を投与されたことがない。例えば、抗CD200抗体が、上記抗体を投与したヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたか否かを決定するために、実施者は、抗CD200抗体を投与したことがないか、または少なくとも上記ヒトから得た生物学的サンプル中の抗CD200抗体の検出可能なレベルを有しないヒトに存在する同じ組織学的タイプの細胞の処置後濃度と、代表的な濃度もしくは平均濃度とを比較し得る。
いくつかの実施形態において、抗CD200抗体(例えば、低下したエフェクター機能を有するかもしくはエフェクター機能を有しない改変抗CD200抗体)がヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたか否かを決定することは、上記処置後細胞濃度が、ヒトにおいて抗CD200抗体による所望の免疫調節効果の発生の指標となる所定の範囲内に入るか否かを問うことによって行われ得る。いくつかの実施形態において、抗CD200抗体がヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたか否かを決定することは、細胞の所定の組織学的タイプに関する上記処置後細胞濃度が、所定のカットオフ値より上かもしくは下に入るか否かを問うことを包含し得る。カットオフ値は、代表的には、所定の組織学的タイプの細胞の濃度であり、それより上もしくは下は、特定の表現型、すなわち、抗CD200抗体によって生じたヒトにおける所望の免疫調節効果の発生の指標とみなされる。
いくつかの実施形態において、抗CD200抗体(例えば、低下したエフェクター機能を有するかもしくはエフェクター機能を有しない改変抗CD200抗体)が上記ヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたか否か(およびそれによって、上記ヒトがとりわけ、その免疫調節活性を介して上記患者の処置に影響を及ぼすために十分な抗体の用量を投与したか)を決定するために、実施者は、抗CD200抗体を投与した同種移植片レシピエント哺乳動物に由来する生物学的サンプル中の抗原提示細胞(例えば、CD11c+CD49b−細胞)による、CD40、CD80、MHCクラスII、および/もしくは細胞内IL−12の発現を定量し得る。上記生物学的サンプル中のCD11c+CD49b−細胞による、CD40、CD80、もしくはMHCクラスIIの発現レベルにおける、コントロールサンプル中の同じ組織学的タイプの細胞によるその対応する発現レベルと比較した低下は、上記抗CD200抗体が上記レシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生じたことを示す。対照的に、上記生物学的サンプル中のCD11c+CD49b−細胞によるIL−12の細胞内発現レベルにおける、コントロールサンプル中の同じ組織学的タイプの細胞によるその対応する発現レベルと比較した増大は、上記抗CD200抗体が上記ヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたことを示す。
上記のように、実施者は、血液サンプル中の細胞による所定の抗原の発現レベルを直接的に測定する必要はない。例えば、(i)上記抗体を投与した上記レシピエント哺乳動物に由来する生物学的サンプル中のCD11c+CD49b−細胞によるCD40の発現レベル、および(ii)コントロールサンプル中の同じ組織学的タイプの細胞によるCD40の発現レベルについての情報を提供された実施者は、上記抗体が、上記レシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生じたか否かを、情報を使用して、例えば、上記生物学的サンプル中のCD11c+CD49b−細胞によるCD40の発現レベルと、上記コントロールサンプル中のこのような細胞によるCD40の発現レベルとを比較して決定し得、ここで上記生物学的サンプル中の上記CD11c+CD49b−細胞によるCD40発現のレベルにおける、上記コントロールサンプル中の同じ組織学的タイプの細胞によるCD40の発現レベルと比較した低下は、上記抗CD200抗体が所望の免疫調節効果を上記ヒトにおいて生じたことを示す。
いくつかの実施形態において、実施者は、所望の免疫調節効果が上記ヒトにおいて生じたか否かの尺度として、上記レシピエント哺乳動物から得られた生物学的サンプル中の免疫細胞によるSHIP発現のレベルを検出および/もしくは定量し得る。いくつかの実施形態において、上記生物学的サンプルは、血液サンプルである。いくつかの実施形態において、上記生物学的サンプルは、脾臓生検に由来する細胞を含むか、もしくは上記脾臓生検に由来する細胞である。
いくつかの実施形態において、複数の免疫細胞(例えば、T細胞、B細胞、マクロファージ、前述のうちのいずれかのサブセット、または前述のうちの1つ以上を含む集団)によるSHIP発現における、少なくとも10%(例えば、少なくとも15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、もしくは75%以上)の低下は、上記抗CD200抗体が上記ヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたことを示す。
細胞(例えば、脾細胞もしくは白血球(例えば、T細胞))によるSHIP、CD40、CD80、MHCクラスII、および/もしくはIL−12の発現レベルを定量するための適した方法は、当該分野で公知であり、本明細書に記載される。例えば、このような方法としては、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、およびフローサイトメトリー(これらは、タンパク質の発現を定量するために有用である)、またはmRNAの発現を定量するための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)およびノーザンブロッティング分析が挙げられる。例えば、Walkerら、(2009) Exp Neurol 215(1):5−19;Rijkersら、(2008) Mol Immunol 45(4):1126−1135;およびVoehringerら、(2004) J Biol Chem 279(52):54117−54123を参照のこと。一般には、Sambrookら、(1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition,” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubelら、(1992) “Current Protocols in Molecular Biology,” Greene Publishing Associatesを参照のこと。免疫細胞によるSHIPの発現レベルを検出および/もしくは定量するために適した方法は、実用的な実施例においてさらに例示される。
上記のように、いくつかの実施形態において、上記コントロールサンプルは、上記哺乳動物に上記抗CD200抗体を投与する前の、上記被験体レシピエント哺乳動物から得られた生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、上記コントロール発現レベルは、例えば、抗CD200抗体を投与したことがない1名以上の(例えば、2名、3名、4名、5名、6名、7名、8名、9名、10名、15名、20名、25名、30名、35名、もしくは40名以上の)健康な個体から得られた同じ組織学的タイプの細胞による所定の抗原の発現の平均発現レベルに基づき得る。上記コントロール発現レベルは、例えば、同種移植された器官を有するが、抗CD200抗体を投与されたことがない1以上の(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、もしくは40以上の)レシピエント哺乳動物から得られた同じ組織学的タイプの細胞による所定の抗原の平均発現レベルに基づき得る。
いくつかの実施形態において、抗CD200抗体(例えば、減少したエフェクター機能を有するかもしくはエフェクター機能を有しない改変抗CD200抗体)がヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたか否かを決定することは、抗原の処置後発現レベルが、ヒトにおいて抗CD200抗体による免疫調節効果の発生の指標となる所定の範囲内に入るか否かを問うことによって、行われ得る。いくつかの実施形態において、抗CD200抗体がヒトにおいて所望の免疫調節効果を生じたか否かを決定することは、白血球の所定の組織学的タイプによる所定の抗原の処置後発現レベルが、所定のカットオフ値より上もしくは下に入るか否かを問うことを包含し得る。この場合、上記カットオフ値は、代表的には、CD11c+CD49b−細胞による発現(例えば、mRNAもしくはタンパク質発現)のレベルであり、これより上もしくは下は、特定の表現型、すなわち、抗CD200抗体によって生じたヒトにおける所望の免疫調節効果の発生の指標とみなされる。
上記のバイオマーカーベースの方法のうちのいずれも、抗CD200抗体を、レシピエント哺乳動物に、上記レシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生成および/もしくは維持する量および頻度において投与し、それによって、上記哺乳動物における上記同種移植片の生存を長期化する工程を包含し得る。
(処置方法)
本開示はまた、レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化するための方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、上記方法は、それを必要とするレシピエント哺乳動物に、抗CD200抗体を単一薬剤として、上記レシピエント哺乳動物における腎臓同種移植片の生存を長期化するために有効な量において投与する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、それを必要とするレシピエント哺乳動物に、抗CD200抗体を、1種以上の免疫抑制剤と組み合わせて投与し、それによって、同種移植片の生存を長期化する工程を包含し得る。
上記組成物は、被験体(例えば、ヒト被験体)に、一部は投与経路に依存する種々の方法を使用して投与され得る。上記経路は、例えば、静脈内注射もしくは注入(IV)、皮下注射(SC)、腹腔内注射(IP)、もしくは筋肉内注射(IM)であり得る。特定のインヒビター(例えば、低分子)は、被験体に経口投与され得る。
投与は、例えば、局所注入、注射によって、もしくはインプラントによって達成され得る。上記インプラントは、多孔性の、非多孔性の、もしくはゼラチン状の物質(膜(例えば、シリコンゴム膜(sialastic membrane))、もしくは線維を含む)のものであり得る。上記インプラントは、上記被験体への上記組成物の徐放もしくは周期的な放出のために構成され得る。(例えば、米国特許出願公開番号20080241223;米国特許第5,501,856号;同第4,863,457号;および同第3,710,795号;EP488401;およびEP 430539(これらの各々の開示は、それらの全体において本明細書に参考として援用される)を参照のこと)。上記組成物は、例えば、拡散性の、腐食性の、もしくは対流性のシステム(例えば、浸透圧ポンプ、生分解性インプラント、電気核酸(electrodiffusion)システム、電気浸透システム、蒸気圧ポンプ、電解(electrolytic)ポンプ、起沸性ポンプ、圧電性ポンプ、腐食ベースのシステム、もしくは電気化学的システムに基づく移植可能なデバイスによって、上記被験体に送達され得る。
本明細書に記載される抗CD200抗体の適した用量(この用量は、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化し得る)は、種々の要因(例えば、処置されるべき被験体の年齢、性別、および体重、ならびに使用される特定の抗体が挙げられる)に依存し得る。例えば、抗CD200抗体の異なる用量は、腎臓同種移植片を有するレシピエント哺乳動物を処置するために必要とされる抗体の用量と比較して、心臓同種移植片を有する同じ被験体を処置するために必要とされ得る。他の要因としては、例えば、上記被験体に同時にもしくは以前に影響を及ぼしている他の医学的障害、上記被験体の全般的な健康状態、上記被験体の遺伝的素因、食事、投与時間、排出速度、薬物組み合わせ、および上記被験体に投与される任意の他のさらなる治療剤が挙げられ得る。任意の特定の被験体のための特定の投与量および処置レジメンが、処置する医療従事者(例えば、医師もしくは看護師)の判断に依存することはまた、理解されるべきである。
本明細書に記載される抗体は、固定用量として、または1キログラムあたりのミリグラム(mg/kg)用量単位で、投与され得る。いくつかの実施形態において、上記用量はまた、抗体の生成、または上記組成物中の活性抗体のうちの1種以上に対する他の宿主免疫応答を低下もしくは回避するために、選択され得る。限定されることは決して意図しないが、抗体の例示的投与量としては、例えば、1〜100μg/kg、0.5〜50μg/kg、0.1〜100μg/kg、0.5〜25μg/kg、1〜20μg/kg、および1〜10μg/kg、1〜100mg/kg、0.5〜50mg/kg、0.1〜100mg/kg、0.5〜25mg/kg、1〜20mg/kg、および1〜10mg/kgが挙げられる。本明細書に記載される抗体の例示的投与量としては、0.1μg/kg、0.5μg/kg、1.0μg/kg、2.0μg/kg、4μg/kg、および8μg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、4mg/kg、および8mg/kgが挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的組成物は、本明細書に記載される抗体の治療上有効な量を含み得る。このような有効量は、一部は、上記投与される抗体の効果、もしくは上記抗体と1種以上のさらなる活性薬剤(1種より多くの薬剤が使用される場合)との組み合わせ効果に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。本明細書に記載される抗体の治療上有効な量はまた、上記個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに抗体(および1種以上のさらなる活性薬剤)が上記個体において所望の応答(例えば、少なくとも1つの状態パラメーターの改善、例えば、同種移植片拒絶の少なくとも1つの症状の改善)を誘発する能力のような要因に従って変動し得る。治療上有効な量はまた、上記組成物の任意の毒性もしくは有害な効果より、上記治療上有益な効果が勝るものである。
本明細書に記載される抗CD200抗体の適切なヒト用量は、例えば、第I相用量上昇研究においてさらに評価され得る。例えば、van Gurpら、(2008) Am J Transplantation 8(8):1711−1718;Hanouskaら、(2007) Clin Cancer Res 13(2, part 1):523−531;およびHetheringtonら、(2006) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10): 3499−3500を参照のこと。
用語「治療上有効な量」もしくは「治療上有効な用量」、または本明細書で使用される類似の用語は、所望の生物学的応答もしくは医学的応答を誘発する薬剤の量を意味することが意図される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、治療上有効な量の抗CD200抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記組成物は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか、および1種以上の(例えば、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、もしくは11種以上の)さらなる治療剤を含み、その結果、上記組成物は、全体として、治療上有効である。例えば、組成物は、本明細書に記載される抗CD200抗体および免疫抑制剤を含み得、ここで上記抗体および薬剤は、各々、組み合わされた場合に、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するために治療上有効である濃度にある。
このような組成物の毒性および治療効力は、細胞培養物もしくは実験動物(例えば、同種移植片拒絶の動物モデル)における公知の薬学的手順によって決定され得る。これら手順は、例えば、LD50(集団のうちの50%に対して致死的な用量)およびED50(集団のうちの50%に対して治療上有効である用量)を決定するために使用され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、上記用量比は、比LD50/ED50として表され得る。高い治療指数を示す抗CD200抗体が好ましい。毒性副作用を示す組成物は、使用され得るが、このような化合物を罹患組織の部位へ標的化する送達システムの設計に、および正常な細胞への潜在的な損傷を最小限にし、よって、副作用を低下させるために、注意が払われるべきである。
上記細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のために、投与量範囲を処方するにあたって使用され得る。このような抗体の投与量は、一般に、ほとんどもしくは全く毒性がない、ED50を含む上記抗CD200抗体の循環濃度の範囲内にある。上記投与量は、使用される投与形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。用量は、細胞培養物において決定される場合の上記IC50(すなわち、症状の最大半値阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーもしくはELISAによって測定され得る。
「被験体」とは、本明細書で使用される場合、任意の哺乳動物であり得る。例えば、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、サル、ヒヒ、もしくはチンパンジー)、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット、もしくはマウスであり得る。いくつかの実施形態において、上記被験体は、幼児(例えば、ヒトの幼児)である。いくつかの実施形態において、上記被験体は、雌性である。
本明細書で使用される場合、「予防を必要とする」、「処置を必要とする」、もしくは「それを必要とする」被験体とは、適切な医療従事者(例えば、ヒトの場合においては医師、看護師、もしくはナース・プラクティショナー;非ヒト哺乳動物の場合には、獣医師)の判断によって、所定の処置(例えば、抗CD200抗体を含む組成物での処置)から合理的に利益を得る被験体をいう。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物への同種移植片の移植後、少なくとも7日間(例えば、少なくとも8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、もしくは14日間)にわたって上記レシピエント哺乳動物に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物に、少なくとも1日に1回投与され得る。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、連続注入によって、例えば、ポンプによって投与され得る。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記レシピエント哺乳動物への同種移植片の移植後、少なくとも2日間(例えば、少なくとも2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、もしくは14日間)にわたって有効なままであるのに十分大きな用量において投与され得、上記抗体は、有効用量を維持するために必要な頻度で投与される(例えば、単一用量は、14日間にわたって有効なままであるのに十分大きいと思われる(この事象では、単一用量が、14日間ごとに1回必要とされるのみであるか、または上記抗体の有効量が14日間のみ必要とされる場合には、1回のみ)。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体は、上記同種移植片器官の移植前に、上記レシピエント哺乳動物へと投与され得る。例えば、抗CD200抗体は、上記同種移植片器官の移植の前に、例えば、少なくとも1日1回もしくは1週間に1回、レシピエント哺乳動物に投与され得る。
いくつかの実施形態において、上記哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態において、上記同種移植片は、MHC不適合である。いくつかの実施形態において、上記MHC不適合同種移植片は、HLA不適合同種移植片である。いくつかの実施形態において、上記レシピエント哺乳動物は、上記同種移植片器官に対してABO不適合である。
上記ドナー同種移植片器官は、例えば、腎臓、肺、心臓、膵臓、脈管組織、肝臓、皮膚、眼、手、指、胃腸組織、神経組織、筋組織(例えば、平滑筋もしくは骨格筋組織)、骨もしくは軟骨、骨髄(例えば、造血細胞)、結合組織、または赤血球であり得る。いくつかの実施形態において、上記ドナー移植片器官は、完全な器官の一部(例えば、肝臓のうちの1以上の葉、膵臓に由来する島細胞、または眼の角膜もしくは水晶体)であり得る。
いくつかの実施形態において、上記方法は、それを必要とするレシピエント哺乳動物に、抗CD200抗体を、1種以上の(例えば、1種、2種、3種、4種、もしくは5種以上の)免疫抑制剤と組み合わせて投与して、それによって、同種移植片の生存を長期化する工程を包含し得る。上記方法において使用するために適切な免疫抑制剤は、本明細書において記載され、当該分野で公知である。
いくつかの実施形態において、免疫調節処置方法(例えば、血漿交換法、脾臓摘出術、もしくは免疫吸着)は、上記抗CD200抗体治療と組み合わせて使用され得る。
いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、上記1種以上の免疫抑制剤のうちの少なくとも1種での処置の、上記抗CD200抗体の非存在下での少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続期間に対してより短い継続期間を可能にする。例えば、上記レシピエント哺乳動物への上記抗CD200抗体の投与は、少なくとも1種の免疫抑制剤での処置の継続時間を、少なくとも約20%(例えば、少なくとも約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%以上)減少させ得る。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、少なくとも1種の免疫抑制剤の、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するために必要とされる上記抗CD200抗体の非存在下での上記薬剤の量に対して減少した量を可能にする。例えば、上記レシピエント哺乳動物への上記抗CD200抗体の投与は、レシピエント哺乳動物における上記同種移植片器官の増大した生存に影響を及ぼすために必要な、少なくとも1種の免疫抑制剤の量を、約20%(例えば、少なくとも約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%以上)減少させ得る。いくつかの実施形態において、上記抗CD200抗体の投与は、同種移植片器官の生存を長期化するために必要とされる上記抗CD200抗体の非存在下に対して、少なくとも1種の免疫抑制剤の処置のより短い継続期間および減少した量を可能にする。
本明細書で使用される場合、増大した生存は、抗CD200抗体での処置(およびいくつかの実施形態において、上記抗体と1種以上の免疫抑制剤との組み合わせ治療)の非存在下での同種移植片器官生存と比較して、関連する同種移植片器官の生存において、例えば、少なくとも約10%(例えば、少なくとも約15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、もしくは200%を超える)増大を含む。いくつかの実施形態において、単独療法(もしくは1種以上の免疫抑制剤との組み合わせにおいて)としての抗CD200抗体の投与は、処置の非存在下でのレシピエント哺乳動物における器官同種移植片生存と比較して、レシピエント哺乳動物における関連する同種移植片の生存を、少なくとも約1.5倍(例えば、少なくとも約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍以上)増大し得る。生存時間は、例えば、日数単位で、週数単位で、月数単位で、もしくは年数単位で測定され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従う抗CD200抗体の投与は、レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を、少なくとも6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月、もしくは36ヶ月だけ長期化し得る。
いくつかの実施形態において、腎臓同種移植片を有するレシピエント哺乳動物への、単独療法としての抗CD200抗体の投与は、上記同種移植片器官の長期の生存をもたらし得る。同種移植片の長期の生存は、上記同種移植片器官の移植後、例えば、少なくとも約5年、少なくとも約7.5年、少なくとも約10年、もしくは少なくとも約15年以上であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、上記抗CD200抗体を投与した後、上記哺乳動物を上記同種移植片の状態における変化についてモニターする工程を包含し得る。同種移植片生存における改善について哺乳動物をモニターすることは、本明細書で定義されるとおり、移植片拒絶パラメーターにおける変化(例えば、上記疾患の1つ以上の症状における改善)について上記被験体を評価することを意味する。いくつかの実施形態において、上記評価は、投与後、少なくとも1時間、例えば、少なくとも2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、もしくは48時間、または少なくとも1日、2日、4日、10日、13日、20日以上、または少なくとも1週間、2週間、4週間、10週間、13週間、20週間以上、行われる。上記ヒトは、以下の期間のうちの1つ以上において評価され得る:処置開始前;処置の間;もしくは処置の1つ以上の要素が投与された後。評価は、さらなる処置の必要性を評価すること、例えば、投与量、投与頻度、もしくは処置の継続期間が変更されるべきか否かを評価することを包含し得る。上記評価はまた、選択された治療モダリティーを追加もしくは中止する必要性を評価すること(例えば、本明細書に記載される障害のための処置のうちのいずれかを追加もしくは中止すること)を包含し得る。
いくつかの実施形態において、治療的処置の進行および/もしくは有効性をモニターする工程は、処置の前後にCD200発現のレベルをモニターする工程を包含する。例えば、CD200の処置前レベルが確認され得、上記治療の少なくとも1回の施与の後に、CD200のレベルが再び決定され得る。CD200レベルの低下は、有効な処置の指標となり得る(以下を参照のこと)。CD200レベルの測定値は、上記治療の量もしくは投与頻度を増大させるためのガイドとして、実施者によって使用され得る。CD200レベルが直接モニターされ得るか、または代わりに、CD200と相関する任意のマーカーがモニターされ得ることは、当然のことながら理解されるべきである。
いくつかの実施形態において、例えば、腎臓同種移植片を伴う実施形態において、上記方法は、抗CD200抗体での処置の前、処置の間、および/もしくは処置の後に、腎機能をモニターする工程を包含し得る。腎機能をモニターするための適切な方法は、当該分野で公知であり、例えば、上記レシピエント哺乳動物においてヘモグロビン、血清クレアチニン、タンパク尿、血中グルコース、および血清脂質をモニターする工程を包含する。例えば、Marcenら、(2010) NDT Plus 3(supplement 2):ii2−ii8;Fiebigerら、(2004) Health Qual Life Outcomes 2:2;およびTintiら、(2010) Transplant Proc 42(1):4047−4048を参照のこと。他の同種移植片器官(例えば、心臓、肺、肝臓、もしくは皮膚)の機能をモニターするために適した方法はまた、医療分野において周知である。
いくつかの実施形態において、抗CD200抗体がレシピエント哺乳動物において所望の免疫調節効果を生じたことを決定した後に、医療従事者は、免疫調節効果の発生を維持して、それによって、上記同種移植片の生存を長期化するために十分な量および頻度において、上記抗CD200抗体を上記哺乳動物に投与するように選択し得る。ヒトへと抗CD200抗体を治療的に投与するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、米国特許第7,408,041号に記載される。
本明細書に記載される1種以上のバイオマーカーにおける変化を持続させるために十分な量および頻度において、抗CD200抗体をレシピエント哺乳動物に投与することは、有益であると考えられる。所定の細胞集団の発現、発現の変化もしくは濃度の変化を検出するための方法は、当該分野で周知であり(例えば、ウェスタンブロット、免疫組織化学、およびフローサイトメトリー技術)、本明細書に記載される。例えば、ヒトへの抗CD200抗体の投与後に、CD11c+(CD49b−)細胞によるCD40発現のレベルは、レシピエント哺乳動物から得られた生物学的サンプル中に存在する細胞のフローサイトメトリー分析によって決定され得る。処置後のCD11c+(CD49b−)細胞によるCD40発現レベルは、コントロール発現レベルおよび/もしくは上記抗体での処置前の同じ組織学的タイプの細胞のCD40発現のレベルと比較され得、ここで上記細胞によるCD40発現のレベルの低下は、上記細胞によるCD40発現を低下させるために十分な量および頻度において、上記抗CD200抗体を上記レシピエント哺乳動物に投与したことを示す。
反復プロセスを介して、医療従事者は、上記哺乳動物において免疫調節効果の発生を維持するために必要とされる、各用量の投与の適切な用量および頻度を決定し得る。例えば、医療従事者は、レシピエント哺乳動物に、少なくとも2回(例えば、少なくとも3回、4回、5回、6回、7回、もしくは8回以上)、抗CD200抗体を、上記CD11c+CD49b−抗原提示細胞によるCD40の発現のレベルを低下させる(または少なくとも低下させると予測される)量において投与し得る。上記少なくとも2用量は、少なくとも1日(例えば、少なくとも2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、もしくはさらに14日)の時間間隔が空けられるべきである。目的の免疫細胞集団を含む生物学的サンプル(例えば、血液サンプルもしくは組織サンプル(例えば、脾臓組織サンプル))は、上記哺乳動物から、種々の時間において(例えば、第1の抗CD200抗体投与の前に、第1の用量と少なくとも1回のさらなる用量との間に、および第2の用量後の少なくとも1回の生物学的サンプル収集のときに)得られる。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、用量間に少なくとも2回および/もしくは第1の用量が上記レシピエント哺乳動物へ投与された後に少なくとも1回、集められ得る。得られた各生物学的サンプルにおける主題の細胞は、次いで、特定の抗原(例えば、CD40、CD80、MHCクラスII、もしくはIL−12)の発現について問い合わされるか、またはそれらの濃度を決定するために、最終的には、上記抗CD200抗体の量および/もしくは投与頻度が、上記レシピエント哺乳動物において免疫調節効果を維持するために十分であるか否かを決定するために、定量される。
(キット)
本開示はまた、とりわけ、本明細書に記載される抗CD200抗体のうちの1種以上を含む治療用キットを特徴とする。上記抗体は、溶液中に、または例えば、乾燥形態(例えば、凍結乾燥形態もしくはフリーズドライ形態)にあり得る。1種以上の抗CD200抗体の乾燥形態を含むキットはまた、例えば、上記抗体を可溶化するために有用な1種以上の溶液(例えば、薬学的に受容可能な緩衝液、キャリア、賦形剤など)を含み得る。上記治療用キットは、例えば、1種以上の抗CD200抗体を、それを必要とする患者(例えば、炎症性障害に罹患したか、これを有すると疑われるか、またはこれを発症するリスクがある哺乳動物)に送達するための適切な手段を含み得る。いくつかの実施形態において、上記キットは、同種移植された器官を有する哺乳動物への、または上記同種移植片器官が得られた上記ドナー哺乳動物への、上記抗体の送達のための適切な手段を含む。いくつかの実施形態において、上記手段は、哺乳動物への上記溶液の侵襲的な(例えば、血管内(例えば、静脈内)、皮下、もしくは筋肉内)送達に適している。いくつかの実施形態において、上記手段は、上記被験体への上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントの皮下送達に適している。例えば、上記手段は、シリンジもしくは浸透圧ポンプであり得る。いくつかの実施形態において、上記キットは、哺乳動物に投与されるべき抗CD200抗体溶液が充填済みの手段を含む。例えば、治療用キットは、本明細書に記載される水性溶液が充填済みのシリンジ(例えば、上記溶液を含むペン型デバイス)を含み得るか、または上記キットは、ポンプ(例えば、浸透圧ポンプ)および上記ポンプと共に使用するために構成された1つ以上の使い捨てカセット(上記カセットには、本明細書に記載される水性溶液が充填済みである)を含み得る。いくつかの実施形態において、高濃度溶液を送達するための手段は、薬物送達のためのペン型デバイスである。
いくつかの実施形態において、例えば、抗CD200抗体が1種以上の免疫抑制剤と組み合わせて哺乳動物に投与されるべきである実施形態において、上記キットは、1種以上のさらなる免疫抑制剤(例えば、本明細書に記載されるいずれかのもの)を含み得る。例えば、治療用キットは、以下を含み得るが、これらに限定されない:アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、フルダラビン、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、非ステロイド系抗炎症薬、mTORインヒビター(例えば、ラパマイシン)、および/もしくはFK−506。いくつかの実施形態において、上記キットは、1種以上のIL−2インヒビター(例えば、本明細書に記載されるもののうちのいずれか)を含み得る。
以下の実施例は、本発明を例示し、限定するとは解釈されない。
(実施例1.腎臓同種移植片生存を長期化するための単一薬剤治療)
同種移植片拒絶は、一般に、1種以上の免疫抑制剤(例えば、カルシニューリンインヒビター)で処置され、そのうちの多くは、単独でもしくは組み合わせのいずれかで、重篤で有害な薬物相互作用および副作用(脱毛、骨髄消耗、胃腸の不調、掻痒症、血小板減少症、貧血、腎毒性、膵炎、および感染症が挙げられるが、これらに限定されない)を生じ得る。さらに、患者における移植片生存を維持するために、上記1種以上の免疫抑制剤を長期的に、ときには、上記患者の生涯にわたって投与し続けることは、しばしば必要である。従って、現在の免疫抑制治療に代わる選択肢として、レシピエント哺乳動物における移植片の生存を、より少ない有害作用で長期化し得る新たな化合物を同定することは、非常に価値がある。
本研究は、完全にMHC不適合の生命維持腎臓移植マウスモデル(life−supporting renal transplantation mouse model)を使用して、腎臓同種移植片拒絶の予防、遅延、もしくは重篤度の低下のための単独療法として、抗CD200抗体の評価を含んだ。本発明のマウスモノクローナル抗CD200抗体は、マウスCD200に結合し、マウスCD200とそのCD200レセプターとの間の相互作用を阻害する。この抗体の可変領域のアミノ酸配列は、PCT出願公開番号WO 09/014745(特に、例えば、図10、OX90mG2a)(その開示は、その全体において本明細書に参考として援用される)に示される。このマウス抗CD200抗体は、エフェクターなしである(CH2ドメインがD265A置換(Kabatら、(前出)に従う重鎖アミノ酸番号付け)を含む改変IgG2a重鎖定常領域を含む)。上記置換は、上記改変定常領域と、IgG FcレセプターであるFcγRIIB、FcγRIII、FcγRI、およびFcγRIVとの間の相互作用の完全な喪失を生じる。例えば、Baudinoら、(2008) J Immunol 181:6664−6669 (前出)を参照のこと。さらに、上記抗体のFcγRI結合部位を、236位のロイシンをグルタミン酸残基で置換することによって非機能的にした。上記C1q結合部位を、グルタミン酸319、リジン321およびリジン323を、アラニン残基で置換することによって非機能的にした(Steurerら、(1995) J Immunol 155:1165)。さらに、重鎖の298位のアスパラギンをグルタミンに変更して、保存されたN結合型グリコシル化部位を除去した。本開示によれば、上記マウス抗CD200抗体は、重鎖定常領域の非改変形態に対して低下したエフェクター機能を有する、改変重鎖定常領域を含む抗体である。この節において記載される実験で使用されるコントロール抗体は、CD200に結合しないマウスモノクローナル抗体である。上記コントロール抗体は、上記抗CD200抗体のように、CH2ドメインがD265A置換を含み、それによって、上記コントロール抗体を「エフェクターなし」にする改変IgG2a重鎖定常領域を含む。
この節で記載される研究において、BALB/cマウスは、腎臓同種移植片レシピエントであり、C57BL/6マウスは、上記腎臓同種移植片のドナーであった。上記マウスは約10週齢であり、手術時に、体重約22〜23gであった。左腎移植をこの研究において行った。上記レシピエントにおける両側の腎臓摘出後、採取したC57BL/6ドナー移植片を、上記ドナー腎動脈と上記レシピエント腹大動脈との間の端側吻合で血管再生した。上記ドナー腎静脈およびレシピエント下大静脈もまた、繋げた。その後、尿管端端吻合を行った。死をもたらす移植片拒絶は、拒絶のエンドポイントの指標であったが、長期生存移植片を有するマウスを、術後(POD)100日目に安楽死させた。1日の間に行われ得る個々の手術の回数に対する時間的制約を考慮すれば、手術(マウスの実験群内であったとしても)は、数日間にわたって互いにずらされた。しかし、全ての手術を、一貫性を確実にするために同じ顕微外科医(microsurgeon)が行った。
上記研究には、8匹のマウスからなる6群を含み、各マウスは、生命維持腎臓同種移植片を有した。上記群を、以下の用量スケジュールの下で処置し、投与を移植時に開始した:(1)移植片を有するマウスに、75μgの上記抗CD200抗体を、14日間にわたって各日に静脈内投与した;(2)移植片を有するマウスに、75μgのエフェクターなしコントロール抗体(これは、CD200に結合しないが、D265A置換を含む前述の変異を含む)を14日間にわたって各日に静脈内投与した;(3)移植片を有するマウスに、上記抗CD200抗体を14日間にわたって各日に皮下投与した;(4)移植片を有するマウスに、75μgの上記エフェクターなしコントロール抗体を14日間にわたって各日に皮下投与した;(5)移植片を有するマウスに、75μgの上記抗CD200抗体を、7日間にわたって各日に静脈内投与した;および(6)移植片を有するマウスに、75μgの上記コントロール抗体を、7日間にわたって各日に静脈内投与した。
上記実験の結果を、実験群ごとに、表1に示す。
表1に示されるように、上記コントロール抗体で処置した3つの群の各々からの移植片を有するマウスは、移植後40日未満で移植片拒絶の結果として死亡した(群6、群4、および群2のマウスについて、それぞれ、34.1±4.6、39.1±5.3、および37.6±4.4)。対照的に、群1、群3および群5からの全てのマウスは、研究終了時点まで(>100日)生存した。
この実験の結果から、単一薬剤治療として投与した抗CD200抗体は、マウスにおける腎臓同種移植片生存を長期化することが示される。上記結果はまた、制限された継続期間にわたる(例えば、7日〜14日の間にわたって毎日)単一薬剤としての抗CD200抗体の投与が、14日を超えて長期的に投与するまたは上記同種移植片器官が上記レシピエントに存在する継続期間にわたって投与するよりも、上記同種移植片器官を上記宿主における生存のために条件付けするのに有効であることを示す。
(実施例2.予備感作したレシピエントにおける腎臓同種移植片生存を長期化するための単一薬剤治療)
一連の実験(実施例1に記載されるものに類似)を、単一薬剤としての上記の治療用抗CD200抗体が、予備感作させたレシピエント哺乳動物における腎臓同種移植片生存を長期化する能力を評価するために行った。これら実験において、上記予備感作を、上記レシピエント哺乳動物へのドナー脾細胞の事前免疫化によって誘導した。
これら実験のために、BALB/cレシピエントマウスを、C57BL/6マウスドナーから腎臓移植する14日前に、5×106の同じドナーの脾細胞をレシピエントマウスに腹腔内注射することによって、予備感作した(PruittおよびBollingerの方法 (1991) J Surg Res 50(4):350−355を使用)。このモデルを、ヒトにおいて、特に、促進された体液性拒絶反応に関連して、予備感作した移植を摸倣するように設計する。一般に、予備感作は、より早期の同種移植片を受けた結果として起こり得るのみならず、複数回の輸血を受けたことによっても、または妊娠した女性においても引き起こされ得る。このような予備感作法の他に、ABO不適合を伴う同種移植片は、迅速に攻撃されかつ拒絶される。なぜなら、このような攻撃を予防する工程が講じられなければ、上記ABO抗原に対する予め形成された抗体が原因となるからである。
上記研究は、5〜7匹のマウスからなる4群を含み、各々のマウスは、生命維持腎臓同種移植片を有した。上記群を、表2における以下の投与スケジュールの下で処置し、投与は、移植時に開始した。
表3に提供される最初の結果によって実証されるように、群2(予備感作した、上記コントロール抗体で処置した移植片を有するマウス)における評価の下でのマウスのうちの全5匹が、15日より長くは生存しなかった。対照的に、観察下の群1の移植片を有するマウスの平均移植片生存は、40.6±1.4日であった。同様に、群3および群4のマウスの移植片について観察された平均移植片生存時間は、それぞれ、71.8±2.4日および54.3±4.8日であった。これら結果から、単一薬剤としての抗CD200抗体での予備感作した腎臓同種移植片を有するマウスの処置は、上記マウスにおける腎臓同種移植片の生存を長期化させ得ることが示される。上記結果はまた、腎臓同種移植片を有するレシピエント哺乳動物への抗CD200抗体の皮下送達が、治療上価値ある投与経路であることを強調する。
(実施例3.IgG2a 抗CD200抗体およびエフェクターなし抗CD200抗体の治療的等価性)
同種移植片の生存を長期化することにおいて、エフェクター機能を有する抗CD200抗体(この場合には、IgG2a抗体)と比較したエフェクターなし抗CD200抗体の治療効力を評価するために、実験を行った。
この節で記載される研究は、C57BL/6からBALB/c完全MHC不適合マウスへの心臓移植モデルにおける移植片生存を試験した。各実験群には、4〜6匹の動物を含めた。上記実験群のうちのいくつかを、抗体で処置した。抗体1は、マウスCD200に結合し、かつマウスCD200とそのCD200レセプターとの間の相互作用を阻害するマウスモノクローナル抗CD200抗体である。抗体1(実施例1に記載される抗CD200抗体)は、エフェクターなしである。抗体2(実施例1に記載されるコントロール抗体)は、CD200に結合しない、マウスモノクローナル抗体である。抗体2はまた、CH2ドメインがD265A置換を含み、それによって、上記コントロール抗体を「エフェクターなし」にする改変IgG2a重鎖定常領域を含む。抗体3は、抗体1と可変領域を共有するマウスモノクローナル抗体である。抗体3は、重鎖IgG2a定常領域の非改変形態を含み、従って、エフェクター機能を有する。抗体4は、抗体2と可変領域を共有する、コントロールマウスモノクローナル抗体である。抗体4はまた、上記IgG2a重鎖定常領域の非改変形態を含み、従って、エフェクター機能を有する。
各群のマウスを、以下のとおりに処置し、投与を、移植時に開始した:
群1: 移植片を有するマウスは、未処置であった;
群2: 移植片を有するマウスに、シクロスポリンAを用量15mg/kgにおいて上記研究の各日に皮下投与した;
群3:移植片を有するマウスに、シクロスポリンAを用量5mg/kgにおいて上記研究の各日に皮下投与した;
群4:抗体3を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて14日間にわたって1日1回静脈内投与し、同時に、上記マウスに、シクロスポリンAも用量15mg/kgにおいて上記研究の各日に皮下投与した;
群5:抗体4を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて14日間にわたって1日1回静脈内投与し、同時に、上記マウスに、シクロスポリンAも、用量15mg/kgにおいて上記研究の各日に皮下投与した;
群6:抗体1を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて14日間にわたって1日1回静脈内投与し、同時に、上記マウスに、シクロスポリンAも、用量15mg/kgにおいて上記研究の各日に皮下投与した;
群7:抗体1を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて14日間にわたって1日1回静脈内投与し、同時に、上記マウスに、シクロスポリンAも、用量5mg/kgにおいて上記研究の各日に皮下投与した;ならびに
群8:抗体2を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて14日間にわたって1日1回静脈内投与し、同時に、上記マウスに、シクロスポリンAも、用量15mg/kgにおいて上記研究の各日に皮下投与した。
この実験の結果を、表4に示す。
表3に示されるように、群4のマウス(抗体1と15mg/mL/日 CsAの組み合わせ治療で処置されたマウス)の移植片および群5のマウス(抗体3と15mg/mL/日 CsAの組み合わせ治療で処置されたマウス)の移植片は、移植後100日間での屠殺時にレシピエントマウスにおいて生存し続けた。対照的に、未処置レシピエントマウスにおける同種移植片は、平均生存時間8.5日を有した。CsA単独(15mg/mL/日において)で処置したレシピエントマウスの移植片は、平均して、約15日目までしか生存しなかった。いずれかのコントロール抗体(抗体2もしくは抗体4)の投与は、15mg/kg/日のCsAと組み合わせても、同種移植片心臓の生存を約16日目まで維持したに過ぎなかった。
レシピエントマウスにおいて顕著に延長された生存を有することに加えて、群4および群6のマウスにおける心臓移植片は、拍動の定性的評価によって、十分機能していた。すなわち、上記移植片の全てが、強く拍動していたか、または拍動の強度に僅かな減少の徴候しか示さなかった。
この実験の結果から、抗CD200抗体の治療的投与は、上記抗体がエフェクター機能を有するか、欠如しているかに拘わらず、同種移植片の生存を長期化し得ることが示される。上記結果はまた、静脈内投与が、哺乳動物における同種移植片拒絶の処置において、抗CD200抗体にとっての治療上有効な送達経路であることを示す。
(実施例4.抗CD200抗体の投与は、免疫抑制治療の早期の中止を可能にする)
狭い治療的用量範囲であっても、カルシニューリンインヒビター(例えば、シクロスポリンA(CsA)およびFK−506)は、極めて腎毒性であり得る。Calneら、(1978) Lancet 2:1323−1327およびGaston (2009) Clin J Am Soc Nephrol 4(12):2029−2034。治療量以下のレベルのCsAもしくはFK−506での処置は、腎毒性の有意に低いリスクを生じるが、移植片生存に関する治療利益は有意に低下する。例えば、SeronおよびMoreso (2004) Transplant Proc 36:257Sを参照のこと。カルシニューリン治療に付随する制限および副作用を考慮すると、移植片生存を長期化させることに関して高レベルの治療効力を維持すると同時に、これらインヒビターの要件を(用量レベルにおいてであろうと、処置の長さにおいてであろうと)低下させ得る新たな化合物を同定することは、明らかに価値のあることである。
1.
抗CD200抗体の使用によって、CsAが、同種移植片の生存を長期化するためにレシピエント哺乳動物に投与されなければならない時間の長さが減少し得るか否かを評価するために、実験を行った。実施例3に記載されるように、これら研究は、C57BL/6からBALB/c完全MHC不適合マウスへの心臓移植モデルにおける移植片生存を試験した。各実験群には、5匹の動物を含めた。5つの実験群を、以下のとおりに処置し、投与を、移植時に開始した:
群1:抗体1(実施例3から)を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて14日間にわたって1日1回皮下投与し、その後、同じ用量において上記研究の残りにわたって1週間に2回皮下投与した;同時に、上記マウスに、CsAも、用量15mg/kgにおいて42日間にわたって皮下投与した;
群2:抗体1を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて7日間にわたって1日1回皮下投与し、その後、同じ用量において上記研究の残りにわたって1週間に2回皮下投与した;同時に、上記マウスに、CsAも、用量15mg/kgにおいて28日間にわたって皮下投与し、その後、用量5mg/kgにおいて1日1回皮下投与した;
群3:抗体2(実施例3から)を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて14日間にわたって1日1回皮下投与し、その後、同じ用量において上記研究の残りにわたって1週間に2回皮下投与した;同時に、上記マウスに、CsAも、用量15mg/kgにおいて42日間にわたって皮下投与した;
群4:抗体1を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて14日間にわたって1日1回皮下投与し、その後、同じ用量において上記研究の残りにわたって1週間に2回皮下投与した;同時に、上記マウスに、CsAも、用量15mg/kgにおいて28日間にわたって皮下投与し、その後、用量5mg/kgにおいて1日1回皮下投与した;
群5:抗体1を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて14日間にわたって1日1回皮下投与し、その後、同じ用量において上記研究の残りにわたって1週間に2回皮下投与した;同時に、上記マウスに、CsAも、用量15mg/kgにおいて最初の14日間にわたって皮下投与した。
この実験の結果を、表5に示す。
表5に示されるように、抗体2、上記コントロール抗体、およびCsAで処置した群3のマウスの心臓同種移植片は、約17日間という平均生存時間を示した。対照的に、群1のマウス(これらマウスは、上記抗CD200抗体(抗体1)で処置した)の上記同種移植片は、移植後100日での屠殺時にも成長し続けていた。研究全体にわたって15mg/kg/日のCsAと組み合わせて、抗体1で処置されたマウスの移植片はまた、屠殺時(100日)まで成長していた。これは、CsA単独で処置した心臓同種移植片の歴史的平均生存が15.5日であるのとは対照的であった(実施例3、表4を参照のこと)。
群1のマウス(これらマウスは、CsAで42日間にわたって処置されたのみである)の心臓同種移植片はまた、屠殺時に成長し続けていた。同様に、群2のマウス(これら処置群は、29日目に15mg/kgから5mg/kgへとCsAの用量の低下を伴った)の移植片はまた、屠殺時に生存可能なままであった。さらに、群5のマウス(これらは、CsAで14日間にわたってのみ処置した)の移植片は、約35.8日という平均生存時間を示した(生存時間は、15mg/kg/日での長期的なCsA処置の2倍程度長く(実施例3,表4,群2)、5mg/kg/日での長期的なCsA処置の3倍程度長い(実施例3,表4,群3))。
まとめると、これら結果から、抗CD200抗体の投与は、CsAのより高い用量もしくはより高い投与頻度において認められる移植片生存の利益を保持しながら、投与されるCsAの量および/もしくはCsAがレシピエント哺乳動物に投与される時間の長さを減少させるために有効であることが示される。すなわち、上記結果は、抗CD200抗体が、移植片生存を長期化させることに関して、高レベルの治療効力を維持しながら、カルシニューリンインヒビター(例えば、CsA)の必須の治療的用量を低下させるために有用であることを示す。
2.
抗CD200抗体の使用が、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するために必要であるミコフェノール酸モフェチルの継続期間もしくは量を減少させ得るか否かを評価するために、同様に実験を行った。第1に、マウスにおける同種移植片生存を長期化するために必要とされるミコフェノール酸モフェチルの用量および継続期間を決定するために、予備実験を行った。実施例3に記載されるように、これら研究は、C57BL/6からBALB/c完全MHC不適合マウスへの心臓移植モデルにおける移植片生存を試験した。各実験群には、5匹の動物を含めた。3つの実験群を、以下のとおりに処置した:
群1−PE(予備実験):心臓同種移植片を有するマウスに、ミコフェノール酸モフェチルを、用量120mg/kgにおいて、移植時に開始して、上記研究の各日に経口投与した;
群2−PE:心臓同種移植片を有するマウスに、ミコフェノール酸モフェチルを、用量80mg/kgにおいて、移植時に開始して、上記研究の各日に経口投与した;ならびに
群3−PE:心臓同種移植片を有するマウスに、FK−506を、用量16mg/kgにおいて、移植時に開始して、上記研究の各日に経口投与した。
この実験の結果を、以下の表6Aに提供する。
表6Aに示されるように、FK−506レジメン(群3PE)で処置したマウスにおける心臓同種移植片の平均生存時間は、約25.2日であった。ミコフェノール酸モフェチルの高用量(120mg/kg;群1PE)で処置したマウスにおける心臓同種移植片の平均生存時間は、約22.2日であったのに対して、ミコフェノール酸モフェチルの中間用量(80mg/kg;群2PE)で処置したマウスは、それらの心臓同種移植片を約20.2日にわたって維持した。
抗CD200抗体の治療的投与が、心臓同種移植片を長期化するために必要とされる免疫抑制剤の継続期間および/もしくは量を減少するために有効であったか否かを決定するために、以下の実験を、上記C57BL/6からBALB/c完全MHC不適合マウスへの心臓移植モデルを使用して、行った。各実験群には、5匹の動物を含めた。5つの実験群を、以下のとおりに処置し、処置は、移植時に開始した:
群1:抗体1(実施例3から)を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて、14日間にわたって1日1回皮下投与した;同時に、上記マウスに、ミコフェノール酸モフェチルも、80mg/kg/日において、研究全体にわたって経口投与した;
群2:抗体2(実施例3から)を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて、14日間にわたって1日1回皮下投与した;同時に、上記マウスに、ミコフェノール酸モフェチルも、80mg/kg/日において、研究全体にわたって経口投与した;
群3:抗体1(実施例3から)を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて、14日間にわたって1日1回皮下投与した;同時に、上記マウスに、(a)シクロスポリンAを、用量15mg/kg/日において28日間にわたって皮下投与し、(b)ミコフェノール酸モフェチルを、用量80mg/kg/日において研究全体にわたって経口投与した;ならびに
群4:抗体2(実施例3から)を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて、14日間にわたって1日1回皮下投与した;同時に、上記マウスに、(a)シクロスポリンAを、用量15mg/kg/日において28日間にわたって皮下投与し、(b)ミコフェノール酸モフェチルを、用量80mg/kg/日において研究全体にわたって経口投与した。
この実験の結果を、表6Bに示す。
ミコフェノール酸モフェチルに関して、上記抗体2、上記コントロール抗体、および80mg/kg/日のMMFで処置した群1のマウスの心臓同種移植片は、約21日という平均生存時間を示した(これは、MMFのみで処置した心臓移植片の生存時間に類似である(約20.2日;上記の群2PEの結果を参照のこと))。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)およびMMFで処置したマウスの心臓同種移植片は、3倍より長く生存した(約63.4日)。抗CD200抗体で処置したマウスにおける上記増大した同種移植片生存時間はまた、高用量(120mg/kg)のMMFで処置したマウスよりほぼ3倍長かった(表6A,群1PEを参照のこと)。これら結果から、抗CD200抗体の治療的投与は、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存時間を大いに増大させると同時に、MMFの量を減少させるために有効であることが示される。
(実施例5.抗CD200抗体治療の効力のバイオマーカーとしての細胞集団)
拒絶の早期検出は、移植レシピエントのケアにおける医療および研究の主要な焦点である。器官の機能不全が始まる前に同種移植片器官拒絶を検出することは、例えば、1種以上の免疫抑制治療を使用して、この状態の首尾良い処置の機会を提供し得る。化合物が治療上効果的であるか否か、および/または効果的であり続けるか否かを、上記同種移植片器官の機能の不可逆性の喪失を回避するために可能な限り早く決定することは、同様に重要である。早期の決定は、医療従事者に、現在の医薬の用量もしくは頻度を変更する、そして/または上記患者へ新たな治療を処方するための時間および選択肢を提供し得、このことは、移植片拒絶を予防することにおいてより多くの治療的成功を提供し得る。
心臓同種移植片器官を有し、抗CD200抗体で処置したレシピエントマウスにおいて、特定の免疫細胞集団の特徴を研究するために、実験を行った。抗CD200抗体の、少なくとも1種の免疫抑制剤と組み合わせでの投与は、心臓同種移植片の生存を長期化し得る(上記を参照のこと)ので、上記実験は、上記レシピエント哺乳動物において移植促進(pro−graft)生存免疫調節効果を示す細胞集団を特徴付けようとした。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、長期化した移植片生存を示す動物におけるこのような細胞集団の変化は、抗CD200抗体で処置した他のレシピエント哺乳動物における治療効力もしくは治療効力の見込みを決定するために有用なツールであり得ると考えられた
以下の細胞集団を調査した:
(1)CD11c+CD49b−樹状細胞(これは、CD11c/CD49b−ビーズガイドによる細胞ソーティングを使用して選択した樹状細胞である);
(2)CD4+CD25+FoxP3+細胞(これは、調節性T(Treg)細胞である)。Treg細胞は、自己および外来抗原に対する有害な免疫学的反応を抑制する能力を有するT細胞のサブセットである;
(3)Gr−1+CD11b+CD45+細胞は、骨髄系細胞であり、骨髄由来サプレッサ細胞もしくは(MDSC)といわれる[Gabrilovichら、(2007) Cancer Res 67(1):425−426]。これらは、マクロファージ、顆粒球、未成熟樹状細胞、および早期骨髄前駆体を含む不均一な細胞集団である;
(4)F4/80+CD45+細胞(単離された脾細胞集団内のマクロファージ集団);
(5)CD3+CD25+細胞(これらは、リンパ球亜集団である);
(6)CD3+CD8+細胞(これらは、細胞傷害性T細胞である);
(7)CD3+CD4+細胞(これらは、いわゆるヘルパーT細胞である);
(8)CD3+CD200R+細胞(これらは、CD200R陽性T細胞集団である);ならびに
(9)CD19+CD45+細胞(これらは、pro−Bから成熟B細胞(発生の間)および濾胞性樹状細胞の混合集団を表す)。
さらに、CD40、MHCクラスII、CD80、およびIL−12発現を、CD11c+CD49b−樹状細胞集団に対して評価した。
上記の実施例3および実施例4に記載されるように、本研究は、心臓同種移植片レシピエントマウス(上記C57BL/6からBALB/c完全MHC不適合マウスへの心臓移植モデル)を処置することを伴う。各実験群には、3匹の動物を含めた。
マウスの群を、以下のとおりに処置し(上記の実施例4(1)もまた参照のこと)、処置は、移植時に開始した:
群1:抗体2(コントロール抗体,実施例3)を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて、14日間にわたって1日1回静脈内投与した;
群2:抗体1(エフェクター機能を欠く抗CD200抗体,実施例3)を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて、14日間にわたって1日1回静脈内投与した;
群3:移植片を有するマウスに、CsAを、用量15mg/kgにおいて、14日間にわたって上記研究の各日に皮下投与した;
群4:抗体2(実施例3)を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて、14日間にわたって1日1回静脈内投与し、同時に、上記マウスに、CsAも、用量15mg/kgにおいて、14日間にわたって上記研究の各日に皮下投与した;ならびに
群5:抗体1(実施例3)を、各移植片を有するマウスに、用量100μgにおいて、14日間にわたって1日1回静脈内投与し、同時に、上記マウスに、CsAも、用量15mg/kgにおいて、14日間にわたって上記研究の各日に皮下投与した。
14日目に、マウスを屠殺した。上記マウスから脾臓を採取し、フローサイトメトリー法を使用する分析のために、細胞を単離した。上記方法は、検出可能に標識したモノクローナル抗体のパネル(その各々は、所定の抗原に対して特異的であり、かつ異なるフルオロフォアを有する)の使用を採用した。各群の3匹のマウスの各々に由来する細胞集団を、独立して評価した。上記細胞集団の特徴付けの結果を、以下に示す。
(CD11+CD49b−樹状細胞によるCD40発現)
フローサイトメトリーを使用して、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られたCD11+CD49b−細胞(樹状細胞)によるCD40発現のレベルを評価した。CD40は、樹状細胞で見いだされる共刺激分子(例えば、そのCD40リガンドによる結合(engagement)によって樹状細胞活性化を生じる)である。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、抗原提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞)によるCD40のレベルにおける低下、従って、APC活性化における低下は、おそらく、レシピエント哺乳動物における抗移植片免疫応答を阻害するかもしくは低下させる。
この分析の結果(図1および表7Aに示される)は、CD40発現/細胞の相対的レベルの尺度である平均蛍光強度(MFI)の単位で提供される。上記3匹の動物に由来する細胞による発現の平均レベルを、表中に提供し、実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図1および表7Aに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、CD40の平均MFI 12.067を生じた。対照的に、このようなマウスへの抗体1(エフェクター機能を欠く抗CD200抗体)とCsAとの投与は、CD11
+(CD49bでゲーティングした)細胞によるCD40発現における統計的に有意な減少を生じた。発現におけるこの減少は、抗体1+CsA処置マウスにおける移植片生存の長期化と相関した(実施例1を参照のこと)。しかし、CD40発現における減少は、抗体1単独、CsA単独、もしくは抗体2とCsAとの組み合わせで処置した動物から得られたこのタイプの細胞において観察されなかった。これら結果から、CD40発現における低下は、抗CD200抗体とCsAとで処置した心臓同種移植片を有する哺乳動物における増大した同種移植片生存と関連することが示される。
(CD11+CD49b−樹状細胞によるMHCクラスII発現)
フローサイトメトリーを使用して、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られたCD11+CD49b−樹状細胞によるMHCクラスII発現のレベルを評価した。MHCクラスII分子は、種々のAPCで見いだされ、免疫細胞の抗原認識および抗原特異的活性化に関与する。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、APC(例えば、樹状細胞)によるMHCクラスIIのレベルにおける低下、従って、APC活性化における低下は、おそらく、レシピエント哺乳動物における抗移植片免疫応答を阻害するかもしくは低下させる。
この分析の結果(図2および表7Bに示される)は、MHCクラスII発現/細胞の相対的レベルの尺度としてMFI単位で提供される。上記3匹の動物に由来する細胞による発現の平均レベルを、表中に提供し、実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図2および表7Bに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、MHCクラスIIの平均MFI 297を生じた。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)の投与は、同じ組織学的タイプの細胞によるMHCクラスII発現における統計的に有意な低下を生じる(平均MFI 116.33)。同様に、上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプにおけるMHCクラスII発現における統計的に有意な低下を生じた。しかし、MHCクラスII発現における低下は、CsA単独で処置したマウスにおいても、CsAおよび上記コントロール抗体(抗体2)で処置したマウスにおいても観察されなかった。これら結果から、MHCクラスII発現における低下は、抗CD200抗体とCsAとで処置した心臓同種移植片を有する哺乳動物における増大した同種移植片生存と関連することが示される。
(CD11+CD49b−樹状細胞によるCD80発現)
フローサイトメトリーを使用して、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られたCD11+CD49b−樹状細胞によるCD80発現のレベルを評価した。CD80(B7−1ともいわれる)は、種々のAPCによって発現され、T細胞の活性化および生存に必要な共刺激シグナルを提供する。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、APC(例えば、樹状細胞)によるCD80のレベルにおける低下、従って、T細胞活性化における低下は、おそらく、レシピエント哺乳動物における抗移植片免疫応答を阻害するかもしくは低下させる。
この分析の結果を、図3および表7Cに提供し、CD80発現/細胞の相対的レベルの尺度(MFI)として報告する。上記3匹の動物に由来する細胞による発現の平均レベルを、表中に提供し、実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図3および表7Cに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、CD80の平均MFI 約112を生じた。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)もしくはCsAの投与は、同じ組織学的タイプの細胞によるCD80発現において統計的に有意な低下を生じた(それぞれ、平均MFI 50.8、および抗体1とCsAに関しては47.6)。同様に、上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプにおけるCD80発現において統計的に有意な低下を生じた。しかし、CD80発現における低下は、CsAおよび上記コントロール抗体(抗体2)で処置したマウスにおいて観察されなかった。これら結果から、CD11
+CD49b
−樹状細胞によるCD80発現における低下は、抗CD200抗体とCsAとで処置した心臓同種移植片を有する哺乳動物における増大した同種移植片生存と関連することが示される。
(CD11+CD49b−樹状細胞によるIL−12発現)
フローサイトメトリーを使用して、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られたCD11+CD49b−細胞(樹状細胞)によるIL−12発現のレベルを評価した。この分析の結果を、図4および表7Dに提供し、IL−12発現/細胞の相対的レベルの尺度(MFI)として報告する。上記3匹の動物に由来する細胞による発現の平均レベルを、表中に提供し、実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図4および表7Dに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、IL−12の平均MFI 約5.24を生じた。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)の、もしくは抗CD200抗体とCsAとの投与は、同じ組織学的タイプの細胞によるIL−12発現において統計的に有意な増大を生じる。同様に、上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプにおけるIL−12発現において統計的に有意な増大を生じた。しかし、IL−12発現における増大は、CsA単独で処置したマウスでも、CsAと上記コントロール抗体(抗体2)とで処置したマウスでも、観察されなかった。これら結果から、CD11
+CD49b
−樹状細胞によるIL−12発現における増大は、抗CD200抗体で、もしくは抗CD200抗体とCsAとの組み合わせで処置した心臓同種移植片を有する哺乳動物における増大した同種移植片生存と関連することが示される。
(CD4+CD25+FoxP3+細胞)
フローサイトメトリーを使用して、CD4+CD25+FoxP3+細胞のパーセンテージを、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られた脾細胞の全集団内で、評価した。CD4+CD25+FoxP3+細胞は、調節性T(Treg)細胞(自己および外来抗原に対する有害な免疫学的反応を抑制する能力を有するT細胞のサブセット)である。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、このような細胞の濃度における増大は、おそらく、レシピエント哺乳動物における抗移植片免疫応答を阻害するかもしくは低下させる。
この分析の結果を、図5および表7Eに提供し、上記マウスの脾臓から単離されたCD3+T細胞の集団内のCD4+CD25+FoxP3+細胞のパーセンテージの尺度として報告する。上記3匹の動物の各々に由来するこれら細胞の平均パーセンテージを、表中に提供し、各実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図5および表7Eに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、CD4
+CD25
+FoxP3
+細胞の平均パーセンテージ 約5.27%を生じた。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)の投与は、同じ組織学的タイプの細胞のパーセンテージにおいて統計的に有意な増大(13.6%)を生じる。同様に、上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプのパーセンテージにおいて統計的に有意な増大(22.7%)を生じた。しかし、CD4
+CD25
+FoxP3
+細胞のパーセンテージにおける増大はまた、CsAと上記コントロール抗体(抗体2)とで処置したマウスにおいて観察されたが、CsA単独で処置されたマウスにおいては観察されなかった。これら結果から、Tregのパーセンテージにおける増大は、抗CD200抗体で、もしくは抗CD200抗体とCsAとの組み合わせで処置した心臓同種移植片を有する哺乳動物における増大した同種移植片生存と関連することが示される。
(Gr−1+CD11b+CD45+細胞)
フローサイトメトリーを使用して、Gr−1+CD11b+CD45+細胞のパーセンテージを、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られた脾細胞の全集団内で、評価した。Gr−1+CD11b+CD45+細胞は、骨髄系細胞であり、骨髄由来サプレッサ細胞もしくは(MDSCs)といわれ[Gabrilovichら、(2007) Cancer Res 67(1):425−426]、これらは、マクロファージ、顆粒球、未成熟樹状細胞、および早期骨髄前駆体を含む不均一な細胞集団である。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、このようなサプレッサ細胞の濃度における増大は、おそらく、レシピエント哺乳動物における抗移植片免疫応答を阻害するかもしくは低下させる。
この分析の結果を、図6および表7Fに提供し、上記マウスの脾臓から単離されたリンパ球の集団内のGr−1+CD11b+CD45+細胞のパーセンテージの尺度として報告する。上記3匹の動物の各々に由来するこれら細胞の平均パーセンテージを、表中に提供し、各実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図6および表7Fに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、Gr−1
+CD11b
+CD45
+細胞の平均パーセンテージ 約8.81%を生じた。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)の投与は、同じ組織学的タイプの細胞のパーセンテージにおいて統計的に有意な増大(15.8%)を生じる。同様に、上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプのパーセンテージにおいて統計的に有意な増大(35.36%)を生じた。しかし、CD4
+CD25
+FoxP3
+細胞のパーセンテージにおける増大はまた、CsAと上記コントロール抗体(抗体2)とで処置したマウスにおいて観察されたが、CsA単独で処置したマウスにおいては観察されなかった。これら結果から、Gr−1
+CD11b
+CD45
+骨髄系サプレッサ細胞のパーセンテージにおける増大は、抗CD200抗体で、または抗CD200抗体とCsAとの組み合わせで処置された心臓同種移植片を有する哺乳動物における増大した同種移植片生存と関連することが示される。
(F4/80+CD45+細胞)
フローサイトメトリーを使用して、F4/80+CD45+細胞のパーセンテージを、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られた脾細胞の全集団内で、評価した。F4/80+CD45+細胞は、免疫エフェクター細胞であり、これらは、マクロファージ、顆粒球、未成熟樹状細胞、および早期骨髄前駆体を含む不均一な細胞集団である。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、このような細胞の濃度における減少は、おそらく、レシピエント哺乳動物における抗移植片免疫応答を阻害するかもしくは低下させる。
この分析の結果を、図7および表7Gに提供し、上記マウスの脾臓から単離されたリンパ球の集団内のF4/80+CD45+細胞のパーセンテージの尺度として報告する。上記3匹の動物の各々に由来するこれら細胞の平均パーセンテージを、表中に提供し、各実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図7および表7Gに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、F4/80
+CD45
+細胞の平均パーセンテージ 約13.07%を生じた。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)の投与は、同じ組織学的タイプの細胞のパーセンテージにおいて統計的に有意な増加(24.06%)を生じた。上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプのパーセンテージにおいて統計的に有意な減少(2.69%)を生じた。しかし、F4/80
+CD45
+細胞のパーセンテージにおける低下はまた、CsAと上記コントロール抗体(抗体2)とで処置したマウスにおいて、およびCsA単独で処置したマウスにおいても観察された。これら結果から、F4/80
+CD45
+細胞のパーセンテージにおける低下は、抗CD200抗体とCsAとの組み合わせで処置した心臓同種移植片を有する哺乳動物における増大した同種移植片生存と関連することが示される。
(CD3+CD25+細胞)
フローサイトメトリーを使用して、CD3+CD25+細胞のパーセンテージを、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られた脾細胞の全集団内で、評価した。CD3+CD25+細胞は、活性化T細胞サブセットである。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、このような細胞の濃度における低下は、おそらく、レシピエント哺乳動物における抗移植片免疫応答を阻害するかもしくは低下させる。
この分析の結果を、図8および表7Hに提供し、上記マウスの脾臓から単離されたリンパ球の集団内のCD3+CD25+細胞のパーセンテージの尺度として報告する。上記3匹の動物の各々に由来するこれら細胞の平均パーセンテージを、表中に提供し、各実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図8および表7Hに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、CD3
+CD25
+細胞平均パーセンテージ 約28.47%を生じた。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)の投与は、同じ組織学的タイプの細胞のパーセンテージにおいて統計的に有意な低下(15.83%)を生じる。上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプのパーセンテージにおいて統計的に有意な低下(12%)を生じた。しかし、CD3
+CD25
+細胞のパーセンテージにおける低下はまた、CsAと上記コントロール抗体(抗体2)とで処置したマウスにおいて、およびCsA単独で処置したマウスにおいて、観察された。これら結果から、CD3
+CD25
+細胞のパーセンテージにおける低下は、抗CD200抗体とCsAとの組み合わせで処置した心臓同種移植片を有する哺乳動物における増大した同種移植片生存と関連することが示される。
(CD3+CD8+細胞)
フローサイトメトリーを使用して、CD3+CD8+細胞のパーセンテージを、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られた脾細胞の全集団内で、評価した。CD3+CD8+細胞は、細胞傷害性T細胞である。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、このような細胞の濃度における低下は、おそらく、レシピエント哺乳動物における抗移植片免疫応答を阻害するかもしくは低下させる。
この分析の結果を、図9および表7Iに提供し、上記マウスの脾臓から単離されたリンパ球の集団内のCD3+CD8+細胞のパーセンテージの尺度として報告する。上記3匹の動物の各々に由来するこれら細胞の平均パーセンテージを、表中に提供し、各実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図9および表7Iに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、CD3
+CD8
+細胞の平均パーセンテージ 約23.17%を生じた。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)の投与は、同じ組織学的タイプの細胞のパーセンテージにおいて統計的に有意な低下(18.6%)を生じた。上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプのパーセンテージにおいて統計的に有意な低下(15.4%)を生じた。これら結果から、CD3
+CD8
+細胞のパーセンテージにおける低下が、抗CD200抗体で、または抗CD200抗体とCsAとの組み合わせで処置した心臓同種移植片を有する哺乳動物における増大した同種移植片生存と関連することが示される。
(CD3+CD4+細胞)
フローサイトメトリーを使用して、CD3+CD4+細胞のパーセンテージを、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られた脾細胞の全集団内で、評価した。CD3+CD4+細胞は、ヘルパーT細胞である。いかなる特定の理論にも作用機構にも拘束されないが、このような細胞の濃度における低下は、おそらく、レシピエント哺乳動物における抗移植片免疫応答を阻害するかもしくは低下させる。
この分析の結果は、図10および表7Jに提供し、上記マウスの脾臓から単離されたリンパ球の集団内のCD3+CD4+細胞のパーセンテージの尺度として報告する。上記3匹の動物の各々に由来するこれら細胞の平均パーセンテージを、表中に提供し、各実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図10および表7Jに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、CD3
+CD4
+細胞の平均パーセンテージ 約57.5%を生じた。上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプのパーセンテージにおける低下(49.2%)を生じた。上記抗CD200抗体単独の投与は、上記T細胞のパーセンテージにおける僅かな増大を生じた。
(CD3+CD200R+細胞)
フローサイトメトリーを使用して、CD3+CD200R+細胞のパーセンテージを、各マウス(N1、N2、およびN3)から単離された脾細胞の全集団内で、評価した。CD3+CD200R+細胞は、T細胞のCD200R+サブセットである。この分析の結果を、図11および表7Kに示し、上記マウスの脾臓から単離されたリンパ球の集団内のCD3+CD200R+細胞のパーセンテージの尺度として報告する。上記3匹の動物の各々に由来するこれら細胞の平均パーセンテージを、表中に提供し、各実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図11および表7Kに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、CD3
+CD200R
+細胞の平均パーセンテージ 約17.8%を生じた。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)の投与は、同じ組織学的タイプの細胞のパーセンテージにおいて増大(24.8%)を生じた。上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプのパーセンテージにおいて僅かな増大(19.87%)を生じた。
(CD19+CD45+細胞)
フローサイトメトリーを使用して、CD19+CD45+細胞のパーセンテージを、各マウス(N1、N2、およびN3)から得られた脾細胞の全集団内で、評価した。CD19+CD45+細胞は、B細胞のCD45+サブセットである。この分析の結果を、図12および表7Lに提供し、上記マウスの脾臓から単離されたリンパ球の集団内のCD19+CD45+細胞のパーセンテージの尺度として報告する。上記3匹の動物の各々に由来するこれら細胞の平均パーセンテージを、表中に提供し、各実験群内の標準偏差もまた提供する。T検定もまた、上記結果が統計的に有意であるか否かを決定するためにこのデータセットに対して行った。
図12および表7Lに示されるように、心臓同種移植片を有するマウスへの抗体2(上記コントロール抗体)単独の投与は、CD19
+CD45
+細胞の平均パーセンテージ 約28.4667%を生じた。対照的に、抗CD200抗体(抗体1)の投与は、同じ組織学的タイプの細胞のパーセンテージにおいて統計的に有意な低下(15.8333%)を生じた。上記抗CD200抗体とCsAとの投与は、この細胞タイプのパーセンテージにおいて統計的に有意な増大(12%)を生じた。これら結果から、CD19
+CD45
+細胞のパーセンテージにおける低下は、抗CD200抗体で、または抗CD200抗体とCsAとの組み合わせで処置した心臓同種移植片を有する哺乳動物における増大した同種移植片生存と関連することが示される。
(実施例6.同種移植片生存を長期化させるための組み合わせ治療の効力)
実施例4に記載されるように、レシピエント哺乳動物における同種移植片の生存を長期化するために必要とされる免疫抑制剤(例えば、カルシニューリンインヒビター(例えば、FK−506もしくはCsA))での処置の継続期間もしくは上記免疫抑制剤の用量レベルは、上記レシピエント哺乳動物への抗CD200抗体の投与によって減少し得る。カルシニューリンインヒビターおよびミコフェノレート化合物と組み合わせて使用される抗CD200抗体の治療効果を決定するために、実験を行った。
実施例3に記載されるように、これら研究は、C57BL/6からBALB/c完全MHC不適合マウスへの心臓移植モデルにおいて移植片生存を試験した。各実験群には、5匹の動物を含めた。5つの実験群を、以下のとおりに処置した:
群1:移植片を有するマウスに、FK−506を、用量16mg/kg/日において、上記研究の継続期間にわたって経口投与した;
群2:移植片を有するマウスに、抗CD200抗体(抗体1,実施例3)を、用量100μgにおいて、14日間にわたって各日に皮下投与し、同時に、ミコフェノール酸モフェチルを、用量80mg/kg/日において皮下投与した;
群3:移植片を有するマウスに、CD200に結合しないコントロール抗体(抗体2,実施例3)を、用量100μgにおいて、14日間にわたって各日に皮下投与し、同時に、ミコフェノール酸モフェチルを、用量80mg/kg/日において皮下投与した;
群4:移植片を有するマウスに、抗CD200抗体(抗体1,実施例3)を、用量100μgにおいて、14日間にわたって各日に皮下投与し、同時に、(a)ミコフェノール酸モフェチルを、用量80mg/kg/日において経口投与し、かつ(b)FK−506を、用量16mg/kg/日において28日間にわたって経口投与した;ならびに
群5:移植片を有するマウスに、上記コントロール抗体(抗体2,実施例3)を、用量100μgにおいて、14日間にわたって各日に皮下投与し、同時に、(a)ミコフェノール酸モフェチルを、用量80mg/kg/日において経口投与し、かつ(b)FK−506を、用量16mg/kg/日において28日間にわたって経口投与した。
この実験の結果は、表8に示される。
表8に示されるように、上記研究の継続期間(心臓移植片の機能不全まで)にわたるカルシニューリンインヒビターであるFK−506の高用量の投与は、平均移植片生存 約25.2日を生じたに過ぎなかった(群1)。抗CD200抗体とミコフェノール酸モフェチルとの共投与は、移植片生存 約63.4日(群2)を生じた。しかし、抗CD200抗体、ミコフェノール酸モフェチル、およびFK−506の3成分治療は、無期限の移植片生存を生じた(この実験においては、100日での屠殺まで)。対照的には、ミコフェノール酸モフェチル、FK−506、および上記コントロール抗体の3成分治療は、移植片生存 約39.2日(群5)を生じた。群4のレシピエント哺乳動物における増大した器官生存は、群2および群5のマウスにおける移植片の生存と比較して、統計的に有意であった。群2のマウスの移植片の平均生存は、群1および群3のマウスの同種移植片の生存と比較して、統計的に有意であった。顕著なことには、上記抗CD200抗体の投与は、FK−506に伴って必要とされる処置の継続期間の(上記研究全体にわたって毎日からちょうど28日間への)短縮を可能にする。これら結果から、抗CD200抗体は、移植片生存を長期化するために必要とされるカルシニューリンインヒビターでの処置の継続期間を短縮するために有用であることが示される(実施例4(2)もまた参照のこと)。上記結果はまた、抗CD200抗体と、ミコフェノレート化合物(もしくは類似の機能特性を有する化合物)と、カルシニューリンインヒビターとの特定の治療組み合わせが、レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化するために有用であることを示す。
mTORインヒビターであるラパマイシンと組み合わせて使用される抗CD200抗体の治療効果を決定するために、実験を行った。
実施例3に記載されるように、これら研究は、C57BL/6からBALB/c完全MHC不適合マウスへの心臓移植モデルにおいて移植片生存を試験した。各実験群には、5匹の動物を含めた。3つの実験群を、以下のとおりに処置し、処置は、移植時に開始した:
群1:移植片を有するマウスに、ラパマイシンを、用量2mg/kg/日において14日間にわたって経口投与した;
群2:移植片を有するマウスに、抗CD200抗体(抗体1,実施例3)を、用量100μgにおいて、14日間にわたって各日に皮下投与し、同時に、ラパマイシンを、用量2mg/kg/日において14日間にわたって経口投与した;ならびに
群3:移植片を有するマウスに、コントロール抗体(抗体2,実施例3)を、用量100μgにおいて、14日間にわたって各日に皮下投与し、同時に、ラパマイシンを、用量2mg/kg/日において14日間にわたって経口投与した。
この実験の結果を、表9に示す。
表9に示されるように、ラパマイシンを、単独で、またはCD200に結合しないコントロール抗体と組み合わせての投与は、レシピエント動物における平均移植片生存、それぞれ、約42.6日および36.2日を生じた。対照的に、ラパマイシンと抗CD200抗体(群2)との共投与は、無期限の同種移植片生存(これは、群1および群3のマウスの移植片の平均生存に対して統計的に有意であった)を生じた。これら結果から、抗CD200抗体とmTORインヒビター(例えば、ラパマイシン)との特定の組み合わせは、レシピエント哺乳動物における同種移植片器官の生存を長期化するために有用であることが示される。
(実施例7.脾細胞によるSHIP発現に対する抗CD200抗体の効果)
免疫化マウスにおける脾細胞によるSHIP発現に対する抗CD200抗体処置の効果を評価するために、実験を行った。免疫応答を誘導するために、BALB/cマウスを、B6マウスから単離した500万の脾細胞(赤血球を枯渇させた)で免疫化した。免疫化の直後に、上記マウスに、抗体3(上記の実施例3)もしくは抗体4(上記の実施例3)を、用量5mg/kg/日において腹腔内投与した。上記マウスを、14日目に屠殺した。
上記マウスの脾臓を取り出し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で一晩4℃において固定した。次いで、上記脾臓を、リン酸緩衝化食塩水(PBS)(pH7.4)で洗浄し、次いで、30%スクロース溶液中に浸漬した。上記脾臓を、低温保護包埋培地(cryoprotective embedding medium)(至適切断温度(OCT)化合物)中に包埋した。上記脾臓の5〜10μm切片を、ミクロトーム−クリオスタットを使用して切り出し、風乾するためにスライド上に置いた。次いで、上記切片を、15分間にわたって過酸化水素で処理し、続いて、PBSで3回洗浄した。
次いで、上記切片を、30分間にわたって室温で、ブロッキング溶液(3%ウシ血清アルブミン、3%正常ウサギ血清、および0.3% Triton X−100TMをPBS中に含む)とともにインキュベートした。インキュベーションの後、上記切片を、上記ブロッキング溶液中1:100においてヤギポリクローナル抗SHIP1抗体(Santa Cruz Biotechnology;M−14)とともに、4℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、上記切片をPBSで3回洗浄した。次に、上記スライドを、ビオチン化ウサギ抗ヤギ抗体(Vectorstain ABCキット PK−1005)(ブロッキング溶液中1:1000)とともに、1時間にわたって室温でインキュベートし、次いで、PBSで3回洗浄した。
アビジン−ペルオキシダーゼ複合体(ブロッキング溶液中1:200)を、上記切片に1時間にわたって室温で接触させ、次いで、上記切片を再びPBSで3回洗浄した。SHIPタンパク質の存在もしくは量を、上記切片とペルオキシダーゼ基質DABとを約5〜10分間にわたって接触させることによって可視化した。
図13Bに示されるように、同種細胞免疫化は、非免疫化マウスに由来する脾細胞によるSHIP発現(図13Cを参照のこと)と比較して、上記BALB/c脾細胞によるSHIP発現を誘導した(図13Bを参照のこと)。しかし、抗体3の投与は、SHIPの発現を実質的に低下させた(図13Aを参照のこと)。上記に示した各実験群には、3匹のマウスを含めた。各群の代表的写真を提供する。
SHIP1タンパク質は、SH2依存性様式において複合体形成したFcγR2bに結合することが示された。例えば、Murailleら、(2000) Immunol Lett 72(1):7−15を参照のこと。FcγR2b(これは、脾臓の免疫細胞で発現される)はまた、上記実験において使用される抗体3に存在するIgG2aアイソタイプFc領域と複合体形成し得る。従って、本発明者らは、脾細胞におけるSHIP発現レベルに対する任意の効果が、CD200拮抗作用に起因するのではなく、上記マウスに投与される抗体のFc領域に起因し得ると考えられる、と推論した。言い換えると、本発明者らは、抗CD200抗体の観察された治療効果は、標的媒介性(すなわち、CD200−SHIP経路を介する)であったかもしくはFc媒介性(FcγR2b−SHIP経路を介する)であったかを決定しようとした。従って、免疫化マウスに由来する脾細胞によるSHIP発現の抗体依存性低下が、上記抗体のエフェクター機能を必要としたか否かを決定するために、別の実験を行った。野生型BALB/cマウス、ならびにFcγR2b欠損BALB/cマウスを、500万のB6同種脾細胞で免疫化し、続いて、100μgの抗体3もしくは抗体4を投与した。マウスの1群「偽」には、免疫化も抗体処置も受けさせなかった。上記で示した各実験群には、3匹のマウスを含めた。
図14および図15に示されるように、抗体3の投与は、抗体4の投与と比較して、上記脾細胞がFcγR2bを発現したか否かに拘わらず、免疫化マウスにおいてSHIP発現を有意に低下した。これら結果から、抗CD200抗体投与後のSHIP発現における低下は、上記抗体Fc領域とFcレセプターγR2bとの相互作用よりむしろ、CD200拮抗作用に起因することが示される。繰り返すと、本開示は、いかなる理論にも作用機構にも拘束されないが、上記結果はまた、哺乳動物におけるアンタゴニスト抗CD200抗体治療の移植片生存長期化効果が、少なくとも一部は、SHIP発現の調節に由来するという見解を裏付ける。
本開示は、その具体的実施形態を参照しながら記載されてきたが、種々の変更が行われ得、等価物が本開示の真の趣旨および範囲から逸脱することなく置き換わり得ることは、当業者によって理解されるべきである。さらに、多くの改変が、特定の状況、物質、組成物、プロセス、プロセスの工程を、本開示の目的、趣旨および範囲に適合させるために行われ得る。全てのこのような改変は、本開示の範囲内にあると解釈される。