JP2004523754A - T細胞エピトープの識別方法および低減された免疫原性を有する分子の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、コンピュータ支援の方法によって、ペプチド中のMHCクラスII分子結合サイトに対する潜在的なT細胞エピトープ値を計算することを含む、生体ホスト中で免疫反応を生じさせるT細胞エピトープを識別する新規な手法に関する。本発明は、さらに、ホスト(好ましくは、ヒト)に曝された時に免疫反応を誘導する生物学的分子(とりわけ、タンパク質および抗体)の製造方法に関する。この方法によって、本来免疫原性の分子においてその配列中の潜在的なT細胞エピトープが低減または除去され、所与の種の免疫系に曝された時に免疫原性を有しないか、対応する修飾されていない実体と比較して免疫原性が低減された分子を製造することができる。したがって、本発明はさらに、本発明による方法によって得られる新規な生物学的分子に関する。
【0002】
(発明の背景)
多くのペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の治療での使用は、哺乳動物、特に人間におけるそれらの免疫原性のために制約を受ける。例えば、免疫抑制を受けていない患者にマウス抗体を投与する場合、そうした患者の大多数は、ヒト抗マウス抗体(HAMA)を作ることによって導入された外来物質に免疫反応を示す(例えば、Schroff,R.W.et al(1985)Cancer Res.45:879−885;Shawler,D.L.et al(1985)J.Immunol.135:1530−1535)。2つの重大な結果がある。第1は、患者の抗マウス抗体が、治療用抗体または免疫複合体と、これらが例えば腫瘍に結合してその治療機能を果たす機会を得る前に、結合してこれらを除去することがあるという点である。第2に、患者がマウス抗体へのアレルギー反応を深め、将来さらに何らかのマウス免疫グロブリンに曝された時アナフィラキシーショックを起こす危険があり得るという点である。
【0003】
いくつかの方法がHAMA問題に対処すべく用いられ、この結果、治療用モノクローナル抗体の人体での使用が可能になっている(例えばWO−A−8909622およびEP−A−0239400、EP−A−0438310、WO−A−9109967を参照)。これらの組換えDNA手法は、一般に最終的な抗体構成体においてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終構成体中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった[Issacs J.D.(1990) Sem.Immunol.2:449,456;Rebello,P.R.et al(1999)Transplantation 68:1417−1420]。
【0004】
これらの方法論に共通する特徴は、ヒト抗体タンパク質の中に存在するのと同一のアミノ酸残基(アミノ酸残基配列の顕著な特徴領域でもよい)を、通常げっ歯類に由来する治療用抗体に導入することであった。異なる種の抗体分子中の構造的(および機能的)保存度が比較的高いため、抗体については、この方法が可能である。しかし、治療用途に使えると考えられるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質については、ホスト種(例えばヒト)に治療用タンパク質について構造上の同族体が存在しない場合もあり、このような方法は適用できない。さらに、これらの方法は、ヒトアミノ酸残基配列の一般的な導入は再モデル化された抗体に免疫原性を与えないであろうということを前提としていた。しかし、ある短いペプチド配列(「T細胞エピトープ」)は、細胞内でのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され得るものであり、続いて、T−細胞の活性化を起動すべく主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子によって提示されることが知られている。MHCクラスIIによって提示されたペプチドの結果として、T細胞のこのような活性化は、次いで、例えば、B細胞の直接の刺激による抗体応答を引き起こし、そうした抗体を産生する。したがって、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から潜在的なT細胞エピトープを除去することが望ましいであろう。ヒトに由来する、しかも人体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、人体内で免疫反応を引き起こすことがある。顕著な例としては、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子[Wadhwa,M.et al(1999)Clin.Cancer Res.5:1353−1361]やインターフェロンアルファ2[Russo,D.et al(1996)Bri.J.Haem.94:300−305;Stein,R.et al(1988)New Engl.Med.318:1409−1413]の治療上の使用が挙げられる。
【0005】
タンパク質からのT細胞エピトープの除去は以前にも開示されている(例えば、WO 98/52976、WO 00/34317を参照)。先行技術に開示された一般的な方法は、次のステップを含む:
(a)ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること;
(b)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドのMHC分子への結合を測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の1つまたは複数の潜在的なT細胞エピトープを識別すること;
(c)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドのMHC分子への結合を測定したT細胞エピトープ活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なT細胞エピトープ内の1つまたは複数のアミノ酸を用いて修飾した新規な配列変異体を設計する。このような配列変異体は、そのような新しい潜在的なT細胞エピトープが、設計ごとに、T細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように修飾されないのであれば、配列変化によって新しい潜在的なT細胞エピトープの生成を回避する方法で作成される。
(d)組換えDNA技術によってそのような配列変異体を構築し、所望の特性を備えた1つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること。
【0006】
合成ペプチドとの組合せで、ヒトまたは実験動物の末梢血試料から得られたT細胞クローンと結合し得る組換えMHC分子の可溶性複合体を開発する他の技術が、当技術分野で使用され[Kern,F.et al(1998)Nature Medicine 4:975−978;Kwok,W.W.et al(2001)TRENDS in Immuology 22:583−588]、さらにエピトープ識別戦略において開発されるかもしれない。
【0007】
潜在的T細胞エピトープ(potential T−cell epitopes)は、MHCクラスII分子に結合する能力を備えた任意のアミノ酸残基配列として一般に定義される。このようなT細胞エピトープは、MHC結合を確立することで測定できる。「T細胞エピトープ」は、暗黙的にMHC分子に結合する際、T細胞レセプター(TCR)によって認識され、少なくとも原理的には、これらT細胞の活性化を引き起こし得るエピトープを意味する。しかし、MHCクラスII分子に結合することが判明しているある種のペプチドはタンパク質配列において保持されているものと通常理解されており、このようなペプチドは、最終タンパク質が投与される有機体内で免疫寛容となる。
【0008】
本発明は、治療目的で同種(autologous)の有機体に導入された可溶性タンパク質は、免疫反応を引き起こし、その可溶性タンパク質に結合する宿主抗体の進行をもたらしうるという、実際ある現実を克服することを想定している。とりわけ1つの例を挙げれば、このタンパク質が内生的に生産されるという事実にもかかわらずある割合のヒト患者が抗体を作るインターフェロンアルファ2である[Russo,D.et al(1996);Stein,R.et al(1988)]。
【0009】
MHCクラスII分子は、ヘルパーT細胞の選択および活性化に中心的な役割を果たす高度に多型的なタンパク質のグループである。ヒトの白血球抗原グループDR(HLA−DR)はこのグループタンパク質で優越的なアイソタイプで、本発明の主な着目点である。しかしながら、アイソタイプHLA−DQおよびHLA−DPも同様の機能を果たし、したがって本発明は、これらにも等しく適用可能である。MHC HLA−DR分子はホモダイマーであり、その各「半分」はα鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーである。各ヘテロダイマーは、9〜20個の範囲のアミノ酸長のペプチドに結合するリガンド結合領域を有するが、結合溝に収容できるのは最高9〜11個のアミノ酸である。リガンド結合領域は、α鎖の1〜85個のアミノ酸およびβ鎖の1〜94個のアミノ酸が含まれる。DQ分子は、相同的な(homologous)構造を有することが最近示されており、DP族タンパク質も非常に類似していると予想される。ヒトでは、およそ70種類の異なるDRアロタイプが知られており、DQについては30種類の異なるアロタイプが、また、DPについては47種類の異なるアロタイプが知られている。各個人は2〜4個のDR対立遺伝子、2個のDQおよび2個のDP対立遺伝子を有する。多数のDR分子の構造が解明されており、それらの構造は、ペプチドの疎水性残基(ポケット残基)と結合する多数の疎水性ポケットを有する開放端のペプチド結合溝を指している[Brown et al Nature(1993)364:33;Stern et al(1994)Nature 368:215]。クラスII分子の様々なアロタイプを識別する多型は、ペプチド結合溝内の様々な異なるペプチド結合表面に寄与し、集団レベルで外来タンパク質を認識し病原性有機体への免疫反応を引き起こす能力に関する最大の柔軟性を保証する。
【0010】
リガンド結合領域には相当な量の多型が存在し、これは異なる地理的な集団および民族グループ内で区別される「ファミリー」を備えている。この多型は、ペプチド結合領域の結合特性に影響し、したがって、DR分子の異なる「ファミリー」は、幾分かは重複があるかもしれないが、異なる配列特性を備えたペプチドに対して特異性を有するであろう。この特異性は、Th細胞エピトープの認識(クラスII T細胞反応)を決定し、これは最終的には、Th細胞エピトープが由来するのと同じタンパク質上に存在するB細胞エピトープに対する抗体反応を駆動する原因となる。したがって、個人におけるタンパク質への免疫反応は、その個人のHLA−DRアロタイプのペプチド結合特異性によって決まるT細胞エピトープ認識によって重大な影響を受ける。したがって、世界的な人口レベルにおいてタンパク質またはペプチド内のT細胞エピトープを識別するためには、HLA−DRアロタイプのできるだけ多様なセット(それにより、世界人口のできるだけ高い割合をカバーする)の結合特性を考慮することが望ましい。
【0011】
免疫反応誘導の主要な要因は、MHCクラスII分子上で提示を介してT細胞活性を刺激し得るペプチドがタンパク質内に存在することである。したがって、免疫原性を除去するか低減するためには、T細胞エピトープを識別しタンパク質から除去することが望ましい。
【0012】
非修飾生物学的分子は、種々多数の宿主細胞型を用い、それ自体は当技術分野でよく知られている遺伝子組換え法により製造できる。しかし、増強された特性を備えた前記生物学的分子の類似体が継続的に必要とされている。強化が望まれている点としては前記治療剤の発現および精製のための別スキーム及び精製の様式(modality)が含まれるが、また特に、タンパク質の生物学的特性における改良も含まれる。ヒトに投与した際のインビボ特性の改善は特に必要である。この点では、対象とするヒトに免疫反応を引き起こす可能性が低減されているか可能性のない選択された生物学的分子の提供が強く望まれている。そのようなタンパク質は、対象とするヒトの体内で増加した循環時間を示すことが期待され、そうした生物学的分子について多数の例が示されている慢性または再発性の疾病状態において特に有益であろう。
【0013】
(発明の概要)
したがって、本発明は以下の2種の一般的な態様に関する:
(a)MHCクラスII分子の世界的に多種多様な数のT細胞エピトープを識別し計算するための便利かつ有効な計算方法、および、この知識に基づいた、改善された特性を備えた生物学的分子の新しい配列変異体の設計および構築、並びに
(b)新規な、特にヒトに、特に治療目的で投与される生物学的に活性な分子;前記の生物学的分子は本発明によれば、免疫原性が修飾されたポリペプチド、タンパク質または免疫グロブリン(抗体)であり、これらは本発明の方法によって製造され、修飾によりこれら生物学的分子は、対象とするヒトに投与された時に免疫反応を誘発する傾向が低減されたものである。
【0014】
特に、本発明は、本発明による方法によって得られ、その結果、インビボで使用した際に、実質的に非免疫原性であるか非修飾の相当物に比較して免疫原性が低減されたタンパク質をもたらす、ヒト由来または非ヒト由来の治療上の有益性の高い何種類かの一般によく知られたタンパク質および抗体の修飾に関する。本発明の新規な方法によって修飾された分子は、対象とするヒトの体内で増加した循環時間を示すことが期待され、いくつかの適応症に当てはまるような慢性または再発性の疾病状態において特に有益であろう。本発明は特定の実施形態として、また、本発明方法の効果を示すために、インビボでの強化された特性を示すと期待される前記分子の修飾形を提供する。免疫原性が修飾された、つまり、免疫原性が低下したこれらの分子は、医薬組成物において使用できる。このような修飾された分子を本発明では「免疫原性において」修飾されたと呼ぶ。
【0015】
T細胞エピトープを部分的に計算手段によって識別する方法は、理論的なT細胞エピトープ値を計算し、かつしたがってタンパク質内のペプチドを結合する潜在的なMHCクラスII分子を識別するために利用することができる;ここで、結合サイトは、タンパク質内のアミノ酸サイトの配列を含む。次いで、識別されたペプチドを、タンパク質の治療上の価値を実質的に低減せずに、むしろおそらくは増強するように修飾することができる。この計算方法は、知られているアミノ酸残基配列を有するタンパク質領域を選択すること、所定の均一サイズを有し、少なくとも3個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)を選択された領域から連続的に採取すること、採取されたセグメントの各々についてMHCクラスII分子結合スコアを計算すること、およびそのセグメントについて計算されたMHCクラスII分子結合スコアに基づいて、前記サンプリングされたセグメントのうち修飾に適した少なくとも1つを識別することを含む。実質的にタンパク質の治療上の有用性を低減させずに、ペプチドに対するMHCクラスII結合総合スコアを変更することができる。
【0016】
本発明の1つの態様において、選択されたアミノ酸残基セグメントについてのMHCクラスII結合スコアは、ペプチドの採取されたアミノ酸残基セグメント中に存在する各疎水性アミノ酸残基側鎖に対して割り当てられた値を合計することにより計算される。グラフとしての概観を得るためには、その合計値をセグメントの中間点付近の単一のアミノ酸残基に割り当てることができる。この操作をペプチド領域または対象とする領域において重複するセグメント(ウィンドウ)の各々について繰り返す。存在する芳香族側鎖のそれぞれに割り当てられる値は、個々の疎水性脂肪族側鎖に割り当てられる値の約2分の1である。疎水性脂肪族側鎖は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン中に存在するものである。芳香族側鎖はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンに存在するものである。芳香族側鎖に割り当てられる好ましい値は約1で、疎水性脂肪族側鎖に対しては約2である。もっとも、他の値を利用することもできる。
【0017】
したがって、第1の態様では、本発明は、
インビトロまたはインシリコ技術を用いるか、または生物アッセイを用いてペプチドのMHC分子への結合を測定することを含むステップにより、生物学的分子のアミノ酸配列内の1つまたは複数の潜在的なT細胞エピトープペプチドを識別するのに適した計算に基づく方法であって、前記方法が次のステップを含む方法を提供する:
(a)公知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること;
(b)選択された領域から少なくとも3つのアミノ酸残基によって構成される所定の一定サイズの重複するアミノ酸残基セグメントを連続して採取すること;
(c)前記採取されたアミノ酸残基セグメント中に存在する疎水性のアミノ酸残基側鎖各々に対し割り当てられた値を合計することにより、前記採取されたセグメントの各々について、MHCクラスII分子結合スコアを計算すること;および
(d)そのセグメントについて計算されたMHCクラスII分子結合スコアに基づいて、採取されたセグメントのうち修飾に適した少なくとも1つを識別し、実質的にペプチドの治療上の有用性を低減させずにペプチドに対するMHCクラスII結合総合スコアを変更すること。
【0018】
特定の実施形態では、本発明は、ステップ(c)を、12−6ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンドコンホメーション(ligand conformational)エネルギー項を含むように修正されたベームスコアリング関数(Boehm scoring function)を用い、
(1)MHCクラスII分子モデルの第1のデータベースを提供すること;
(2)前記MHCクラスII分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第2のデータベースを提供すること;
(3)前記第1のデータベースからモデルを選択すること;
(4)前記第2のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること;
(5)採取された各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること;
(6)採取された各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること;および
(7)場合によっては、前記各モデルと各骨格についてステップ(1)〜(5)を繰り返すことによって実行する方法に関する。
【0019】
さらに別の実施形態では、採取された各配列の結合スコアは、(i)MHCクラスII分子モデルの第1のデータベースを提供すること;(ii)前記MHCクラスII分子について許されるペプチド骨格の第2のデータベースを提供すること;(iii)各骨格の各位置で、20個のアミノ酸の各々について許されるアミノ酸側鎖コンホメーションの第3のデータベースを与えること;(iv)前記第1のデータベースからモデルを選択すること;(v)前記第2のデータベースから許されるペプチド骨格を選択すること;(vi)前記第3のデータベースから、各採取されたセグメントの中にあるアミノ酸残基側鎖をそれらの許されるコンホメーションと共に識別すること;(vii)各許されるコンホメーションにおいて各採取されたセグメントに存在するすべての側鎖について最適な結合親和性の値を決定すること;(viii)前記各骨格に対しステップ(v)から(vii)を繰り返し、最適の結合スコアを決定すること;および、(ix)前記各モデルに対しステップ(iv)から(viii)を繰り返すことにより計算される。
【0020】
上記3つのデータベースは結合して1つのデータベースとできること、あるいは、いずれか2つのデータベースは結合して1つの組合せデータベースとできることが理解されるべきである。採取するアミノ酸残基セグメントの長さは変えることができる。好ましくは、採取するアミノ酸残基セグメントは、約10個から約15個のアミノ酸残基、より好ましくは約13個のアミノ酸残基から構成される。
【0021】
採取するアミノ酸残基セグメントは、重複の程度を変えることができる。好ましくは、採取するアミノ酸残基セグメントは実質的に重複する。最も好ましくは、連続する採取アミノ酸残基セグメントは、1個のアミノ酸残基以外のすべてで互いに重複する。すなわちn残基を有するアミノ酸残基セグメントでは、n−1残基が、次の連続する採取アミノ酸残基セグメントと重複する。
【0022】
したがって、本発明は、より詳細には、さらに次のさらに好適な実施形態に関する:
・各芳香族側鎖に対して割り当てられる値が各疎水性脂肪族側鎖に対し割り当てられる値の約2分の1である、上記に従い特定される方法;
・採取するアミノ酸残基セグメントが13個のアミノ酸残基によって構成される、上記に従い特定される方法;
・連続する採取アミノ酸残基セグメントが1〜5個のアミノ酸残基重複する、上記に従い特定される方法;
・連続する採取アミノ酸残基セグメントは互いに実質的に重複する、上記に従い特定される方法;
・連続する採取アミノ酸残基セグメント中のアミノ酸残基のうちの1個以外のすべては重複する、上記に従い特定される方法。
【0023】
第2の基本的態様では、本発明は、様々な生物学的分子において1個または複数のT細胞エピトープを除去した修飾形(ここで、前記修飾は上記および特許請求の範囲に記載した方法によって達成することができる)を提供する。こうした分子は、上に挙げた先行技術に記載されるような方法でも製造できるが、本発明の方法によって得られた分子は増強された特性を示す。先行技術の教示では、予測されたT細胞エピトープは、非ヒト由来およびヒト由来の両方の治療用抗体または非抗体タンパク質の1次配列内の妥当な(judicious)アミノ酸置換によって除去される。
【0024】
本発明は、インビボで増強された特性を示すと予想されるタンパク質および免疫グロブリンの修飾形を提供する。
【0025】
したがって、本発明の目的は、親分子から誘導される免疫原性において修飾された生物学的分子の製造方法であって、修飾された分子は前記親分子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有しており、所与の種の免疫系に曝された時、親分子に比較して低減された免疫原性を示し;(i)親生物学的分子またはその一部のアミノ酸配列を決定すること;(ii)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドのMHC分子への結合を測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の1個または複数の潜在的なT細胞エピトープを識別すること;(iii)T細胞エピトープ配列の活性または数および/または前記生物学的分子から誘導されるペプチドを結合することができるMHC分子アロタイプの数(これらはインビトロもしくはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドをMHC分子に結合させることにより、またはペプチド−MHC複合体をT細胞に結合させることにより測定される)を実質的に低減するか除去するように修飾して、本来識別されたT細胞エピトープ配列内の少なくとも1個のアミノ酸残基を変更することにより新規な配列変異体を設計すること;(iv)組換えDNA技術によってそのような配列変異体を構成し、所望の特性を備えた1つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること;および(v)場合によってはステップ(ii)〜(iv)を繰り返すことを含み、ここで、ステップ(ii)によるT細胞エピトープ配列の識別が上記および下記に特定される方法によって達成されるものである方法を提供することである。
【0026】
本発明によるステップ(iii)の特定の実施形態は以下に要約されるステップに関する:
・本来存在するT細胞エピトープ配列のいずれかにおいて1〜9個のアミノ酸残基が変更されている、上記に従い特定される方法;
・本来存在するT細胞エピトープ配列のいずれかにおいて1個のアミノ酸残基が変更されている、上記に従い特定される方法;
・変更が、同族体タンパク質配列に関して、および/またはインシリコモデリング技術において行われる、上記に従い特定される方法;
・アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、付加または欠失させるものである、上記に従い特定される方法;
・前記生物学的分子の生物活性を回復するために、特定のアミノ酸の置換、欠失または付加によるさらに一層の変更が行われる、上記に従い特定される方法。
【0027】
ステップ(ii)を例外として、ここに開示する方法の他のステップは、当業者によく知られた方法および技術により達成できる。修飾された生物学的分子は好ましくは組換え技術により調製されるので、対応するDNA構成体は、ステップ(i)の方法によって識別されたアミノ酸残基の交換の完了後にアミノ酸配列から推定された。ここに使用される組換え技術は、当技術分野ではよく知られている(例えばSambrook et al.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,USA))。
【0028】
本発明によって得られる生物学的分子は、好ましくはペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片または融合タンパク質である。本発明はさらに、同一または同様の生物学的および/または薬理学的活性を有する前記分子の修飾、変種、変異体、断片、誘導体、グリコシル化されていないもの、部分的にまたは完全にグリコシル化された形式をさらに含む。
【0029】
本方法において開示される方法は特定の生物学的分子に限定されないが、発明の特定の実施形態では、当技術分野で知られており治療上の有用性および有益性を示す分子が好ましくは提供される。したがって、本発明の目的は、親分子に由来した免疫原性において修飾された生物学的分子を提供することであり、ここで修飾された分子は、上記または後述する本発明による方法によって得られ、前記親のそれと異なるアミノ酸配列を有し、所与の生物種の免疫系に曝された時、親分子に比較して低減された免疫原性を示す。
【0030】
前記方法によって得られる特に興味深い生物学的分子は以下の群から選択される:
(a)モノクローナル抗体:
抗−40kD糖タンパク質抗原抗体KS1/4、
抗GD2抗体14.18
抗−Her2抗体4D5(マウス)およびヒト化された変型(Herceptin(登録商標))、
抗−Her1(EGFR)抗体c225およびh425
抗−IL−2R(抗−Tac)抗体(Zenapax(登録商標))、
抗−CD52抗体(CAMPATH(登録商標))、
抗−CD20抗体(C2B8、Rituxan(登録商標);Bexxar(登録商標))、
ヒトのC5補体タンパク質に向けられた抗体
(b)ヒトタンパク質
sTNF−R1、sTNF−R2、sTNFR−Fc(Enbrel(登録商標))、
タンパク質C、acrp30、リシンA、CNTFRリガンド
スブチリシン、GM−CSF、ヒト卵胞刺激ホルモン(h−fsh)
β−グルコセレプロシダーゼ、GLP−1、アポリポタンパク質A1、
レプチン(ヒト肥満タンパク質)、KGF、G−CSF、
BDNF、EPO、IL−1Rアンタゴニスト。
【0031】
本発明の第3の基本的態様は、免疫原性において修飾されていない親の生物学的分子に由来するT細胞エピトープ配列に関する。これらのエピトープは好ましくは13merペプチドである。これらのペプチド内では、連続する9個のアミノ酸残基を有する配列が好まれる。したがって、そのようなエピトープおよび配列へのアクセスを提供することが本発明の別の目的である。本発明は、より詳細には以下のものに関する:
・同一の生物活性を有するが免疫原性の低減された生物学的分子を調整するための方法として記載されるいずれかの方法によって識別される親の免疫原性において非修飾の生物学的分子のアミノ酸配列内での潜在的なT細胞エピトープペプチドの使用;
・前記T細胞エピトープが13merペプチドである潜在的なT細胞エピトープペプチドの対応する使用;
・親の非修飾分子と比較して、同一の生物学活性を有する、免疫原性の低減された生物学的分子の調整により上記に特定される13mer T細胞エピトープの連続する少なくとも9個のアミノ酸残基からなるペプチド配列の使用。
【0032】
(図面の簡単な説明)
図1 本発明の計算方法の1つの態様を示すフローチャートである
図2 本発明を実施する計算方法のためのデータベース生成を示すフローチャートである
図3 潜在的なT細胞エピトープ用のペプチドのプロファイルを描くためにデータベース問合せ(database interrogation)を示すフローチャートである
図4 本発明の計算方法を示す別のフローチャートである
図5 グルタミン酸デカルボキシラーゼ(MW:65000)アイソフォーム(GAD 65)のT−細胞エピトープ可能性指数(T−cell epitope likelihood index)対アミノ酸残基座標(位置)のプロットである
図6 エリスロポエチン(EPO)についてのT−細胞エピトープ可能性指数対アミノ酸残基座標(位置)のプロットである
図7 ヒト化された抗A33モノクローナル抗体軽鎖についてのT−細胞エピトープ可能性指数対アミノ酸残基座標(位置)のプロットである
図8 ヒト化された抗A33モノクローナル抗体重鎖についてのT−細胞エピトープ可能性指数対アミノ酸残基座標(位置)のプロットである。
【0033】
図5〜8において、実線(−)は、図1において示されるフローチャートに従った計算方法によって計算されたT細胞エピトープ指数を描いている。また、点線(…)は、本発明の別の態様である図3において示されるフローチャートに従った計算方法によって計算されたT細胞エピトープの予測数を描いている。
【0034】
(発明の詳細な説明)
「T細胞エピトープ」という用語は、本発明についての理解によれば、然るべき程度にMCH II分子(またはヒト以外の種におけるその等価物)を結合可能で、T細胞を刺激するおよび/または(必ずしも測定可能な程度に活性化せずに)T細胞を複合体中でMHC IIに結合可能であるアミノ酸配列を意味する。
【0035】
本明細書および添付する特許請求の範囲において「ペプチド」という用語は、2個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸はペプチド結合(以下に定義される)によって互いに連結される。ペプチドの生物学的生産に関わる20個の異なる天然アミノ酸が存在し、これらが任意の数、任意の順序で連結して、ペプチド鎖または環を形成する。ペプチドの生物学的生産で使用される天然アミノ酸はすべてL‐配置である。合成ペプチドは、L−アミノ酸、D−アミノ酸またはこれら2種の異なる配置のアミノ酸の様々な組合せを使用して従来の合成方法を用いて調製できる。ペプチドによっては数単位のアミノ酸しか含まないものもある。短いペプチド、例えばアミノ酸単位が10個未満のものは、時に「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは多数のアミノ酸残基、例えば100個以上を含み「ポリペプチド」と呼ばれる。従来、「ポリペプチド」は3個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖と考えられ、「オリゴペプチド」は通常、特に「短い」タイプのポリペプチドと見なされる。したがって、本願では「ポリペプチド」へのどのような言及もオリゴペプチドを含むと理解される。さらに、「ペプチド」へのどのような言及もポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。アミノ酸の個々の異なる配置は異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成することができるポリペプチドの数、したがって異なるタンパク質の数は、実際上無制限である。
【0036】
これまでに使用し以下に使用する「免疫原性の低減された」という用語は、相対的な用語であり、本発明によって修飾された分子と比較して、同じタイプの種に生体内で曝露された時にそれぞれの本来の出所分子が示す免疫原性と関連する。本発明において「修飾されたタンパク質」という用語は、T細胞エピトープの数が低減され、したがって所与の種の免疫系に曝露された時、親タンパク質に対して誘発される免疫原性が低減されたタンパク質をいう。本発明において「非修飾タンパク質」という用語は、「修飾されたタンパク質」と比較して「親」タンパク質をいうもので、多数のT細胞エピトープを有し、したがって、所与の種の免疫系に曝された時、修飾されたタンパク質に比べ強い免疫原性を有する。
【0037】
「アルファ炭素(Cα)」はペプチド鎖中の炭素水素(CH)部分の炭素原子である。「側鎖」はCαへの吊り下がり(ペンダント)基であり、ペプチドの寸法と比較して著しく変動幅の広い物理的な寸法を有する、単純もしくは複雑な基または部分を含むことができる。
【0038】
T細胞エピトープは、特定のT細胞エピトープのMHCクラスII分子への結合にとって重要なアミノ酸残基を考慮することによる、本発明の計算方法を用いて識別できる。一度識別されると、その配列中のキーアミノ酸残基の変異などの変更によって、識別された潜在的なT細胞エピトープは、アミノ酸残基配列から取り除くか削除することができる。T細胞エピトープを含みそうな領域におけるペプチドの配列に対して行われ、全結合スコアをより小さくする欠失、付加または置換による任意の修飾は、アミノ酸残基配列の免疫原性をより小さくする効果があるであろう。場合によっては、MHCクラスII分子へのあるペプチドの結合を増強することが望ましいかもしれない。例えば、自己免疫疾患に罹患している個体では、T細胞エピトープを含むと知られている自己抗原(autoantigen)領域のペプチド類似体でこうした個体を治療すれば、ある種の自己抗原に対する寛容が回復することができることが提案されている。自然なエピトープは、通常MHCクラスII分子への適度な親和性を有するが、一方でペプチド類似体はMHCクラスII分子に相対的により高い親和性を有するようになる。この高い親和性は、この高親和性エピトープを発現するこうしたT細胞を取り除くか、またはそれらをアネルギー性にする(anergise)免疫監視の促進において重要である。T細胞エピトープへのこの修飾はさらにペプチドのタンパク質レベルで行うことも可能であり、全タンパク質を、治療剤として投与することもできる。
【0039】
タンパク質やポリペプチドの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第1に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は平面構造であり実質的に置換アミドである。「アミド」は以下の基を含む有機化合物の任意の基である。
【0040】
【化1】
隣接アミノ酸のCαを連結する平面状ペプチド結合は以下に示すように表すことができる:
【0041】
【化2】
O=CおよびC−N原子は比較的剛性な平面内にあるので、これらの軸の周りに自由な回転は生じない。このため、破線によって模式的に描いた平面は時として「アミド平面」または「ペプチド平面」と呼ばれ、この平面にはペプチド骨格の酸素(O)、炭素(C)、窒素(N)および水素(H)原子が載る。このアミド平面の相対する両隅にはCα原子が位置する。ペプチド平面すなわちアミド平面内では、O=CおよびC−N原子の周りの回転が実質的にないので、ポリペプチド鎖はCα原子を連結する一連の平面状ペプチド結合を含む。
【0042】
ポリペプチドまたはタンパク質の全体構造または立体構造を規定する上で重要な役割を果たす第2の要因は、共通なCα連結の周りの各アミド平面の回転角である。「回転角」および「ねじり角」という用語は以下では同義語と見なされる。アミド平面にO、C、NおよびH原子が載ると仮定すると(立体構造によってはこれらの原子のうちいくつかは平面から若干ずれるかもしれないが、これは通常有効な仮定である)、これらの回転角はNとRポリペプチドの骨格の立体構造、つまり隣接残基間に存する構造を定義する。これらの2つの角度はφおよびψとして知られている。したがって、1組の角度、φiおよびψi(ここで添字iはポリペプチド鎖の特定の残基を表す)はポリペプチドを有効に規定する。
【0043】
角度φおよびψを定義するのに使用される慣用規則、すなわち、所与のポリペプチドについてのアミド平面が角度0を形成する参照ポイント、並びに角度φの定義および角度ψの定義は、文献に定義される。例えば、Ramachandran et al.Adv.Prot.Chem.23:283−437(1968)、特に285−94ページ参照(これらのページは言及によって本願に組み込まれる)。
【0044】
本発明の方法は任意のタンパク質に適用することができ、ヒトでは、MHCクラスII分子結合溝の主要なポケット1アンカー位置が、特定のアミノ酸側鎖に対してよく設計された特異性を有するという発見に部分的に基づいている。このポケットの特異性は、MHCクラスII分子のベータ鎖の位置86でのアミノ酸の同一性によって決定される。このサイトはポケット1の底に位置し、このポケットに収容され得る側鎖の大きさを決定する(Marshall,K.W.、J.Immunol.、152:4946−4956(1994))。この残基がグリシンである場合、すべての疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸(疎水性脂肪族は以下のものである:バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン、また芳香族は以下のものである:フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン)は、ポケット内に収容され得る(芳香族側鎖が優先される)。このポケット残基がバリンである場合、このアミノ酸側鎖はポケット内部に突出するので、収容できるペプチド側鎖のサイズを制限する(例えば疎水性脂肪族側鎖だけが収容可能である)。したがって、アミノ酸残基配列において、疎水性脂肪族および芳香族側鎖を有するアミノ酸が存在する場合にはいつでも、MHCクラスII制限T細胞エピトープが存在する可能性がある。しかし、側鎖が疎水性脂肪族である場合は、芳香族側鎖の場合と比較して、(全人口において、ポケット1タイプの分布がほぼ均一であると定すれば)T細胞エピトープに関連する可能性はおよそ2倍である。
【0045】
本発明を具体化する計算方法は、以下のようにT細胞エピトープを含むペプチド領域の可能性を特徴づける:
(1)予め定義した長さのペプチドセグメントの1次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。(2)疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約2倍を割り当てる(例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値2を、芳香族側鎖に対しては値1を割り当てる)。(3)ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント(ウィンドウ)に対する値の合計を、セグメント(ウィンドウ)の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、サンプリングされたセグメント(ウィンドウ)の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、サンプリングされた各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント(ウィンドウ)内に存在するT細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。(4)上記ステップ3に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。(5)予め定義した値(例えば値1)のスコアを有する配列のすべての部分は、T細胞エピトープを含むと認められ、必要であれば、修飾することができる。
【0046】
本発明のこの特定の実施態様は、T細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、MHCクラスII結合特性を修飾する可能性を有する。
【0047】
本発明の別の実施態様によれば、MHCクラスII対立遺伝子モデルによりペプチドの相互作用を考慮に入れたより精巧な計算方法を使用して、T細胞エピトープをより高精度で予想できる。
【0048】
特にこの実施態様によるペプチド内に存在するT細胞エピトープの計算上の予想では、すべての公知のMHCクラスII分子の構造に基づく少なくとも42個のMHCクラスII対立遺伝子のモデルの構築が考えられ、T細胞エピトープの計算による識別におけるこれらのモデルの使用、相対的なペプチド骨格アルファ炭素(Cα)位置の知られた変わりやすさを考慮に入れるための各モデルのペプチド骨格のライブラリーの構築、ペプチドとMHCクラスII分子との間の相互作用において重要な位置での20個のアミノ酸置換各々のための各モデルを備えた各骨格ドック(dock)のアミノ酸側鎖コンホメーションのライブラリーの構築、および特定のMHCクラスII分子に収容(dock)された特定のペプチドについての最適な骨格および側鎖コンホメーション選択のための、これら骨格および側鎖コンホメーションライブラリーの使用、並びにこの相互作用からの結合スコアの誘導が考えられる。
【0049】
MHCクラスII分子のモデルは相同モデリングによって、ブルックヘブン(Brookhaven)タンパク質データバンク(「PDB」)で見出された多数の同様の構造から誘導できる。これらは、エネルギー最小化のためのCHARMm力場(Molecular Simulations Inc.、San Diego、Ca.から入手可能)と共に、シミュレートされたアニーリング機能を組み込んだ半自動的な相同モデリングソフトウェア(Modeller,Sali A.& Blundell TL.、1993.J.Mol.Biol 234:779−815)によって形成できる。別のモデリング方法も同様に利用できる。
【0050】
本願の方法は、MHCクラスII分子の小さな集合について結合溝内の各位置での各アミノ酸選択肢の実験により得た結合データのライブラリーを使用する他の計算方法(Marshall,K.W.、et al.、Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids、1(3):157−162)(1995)や溝内の特定タイプの結合ポケットの結合特性を定義するために実験による同様の結合データを使用し(ここでもまたMHCクラスII分子の比較的小さな部分集合を使用する)次いでこのポケットライブラリーからポケットタイプを「混合およびマッチング」して人為的に別の「仮想的な」MHCクラスII分子を生成するさらに別の計算方法(Sturniolo T.、et al.、Nat.Biotech、17(6):555−561(1999)と著しく異なる。先行技術は両方とも分析が複雑である点および多数のペプチド変異体を合成する必要がある点の不利益を被り、少数のMHCクラスII分子しか実験的に走査できない。したがって、第1の先行技術の方法は少数のMHCクラスII分子の予想しかできない。第2の先行技術の方法は、異なるクラスII対立遺伝子間においては、1個の分子中で類似したアミノ酸で裏打ちされているポケットは同じ結合特性を持つという仮定も前提としており、ポケットライブラリーに含まれるポケットを含むそうしたMHCクラスII分子だけが「仮想的に」生成されるという欠点をさらに有する。本明細書に述べるモデリング手法を使用すれば、任意の数およびタイプのMHCクラスII分子の構造を推定でき、したがって全集団を代表する対立遺伝子を特異的に選択できる。さらに、走査されるMHCクラスII分子の数は、複雑な実験によって追加データを生成する必要以上にさらにモデルを生成することにより増加させることができる。
【0051】
骨格ライブラリーの使用により、走査されている様々なペプチドについて、特定のMHCクラスII分子に収容された時のCα原子位置における変化を考慮に入れることができる。この点もまた、上記の先行技術における計算方法(これらは特定のポケット中でアミノ酸結合を走査するため単純化されたペプチド骨格の使用に依存している)と対照的である。これらの単純化された骨格は、「実際の」ペプチドで見つかる骨格構成の代表ではないであろうし、その結果、ペプチド結合の予想が不正確になる。本発明の骨格ライブラリーは、タンパク質データバンク内で見出されるMHCクラスII分子に結合するすべてのペプチドの骨格を重ね、結合溝内に位置する11個のアミノ酸各々のCα原子間の2乗平均平方根(RMS)偏差を記録することにより生成される。このライブラリーは、より大きな変動の可能性までも考慮に入れるために、少数(現在13個)の適切な利用可能なマウスおよびヒト構造から誘導できる一方、各C”−αについてのRMS数値は、50%増加する。その後、各アミノ酸の平均のCα位置が決定され、その半径がその位置でのRMS偏差プラス50%と等しい球がこの点のまわりに描かれる。この球体は許容されるCα位置をすべて表す。
【0052】
最小のRMS偏差を有するCα(これは、上記のポケット1中のアミノ酸であり、結合溝中の11個の残基の位置2と等価である)を動かして、球体は3次元的にグリッド化され、次いでグリッド内の各頂点はそのアミノ酸のCαのために可能な位置として使用される。結果として得られるアミド平面は、引き続きアミノ酸へのペプチド結合に対応し、これらのCαの各々にグラフトされ、次のCαを位置付けるためにφおよびψ角を所定の間隔で回転させる。引き続きCαがCαに対して「許容される位置の球」内にある場合にはジペプチドの向きが許容され、それが球の外部になる場合には、ジペプチドは拒絶される。その後、先行するCαのあらゆる組合せから9個の後続Cαがすべて位置付けられるまで、ペプチドがポケット1 Cα「種子」から成長するように後続Cα位置の各々についてこのプロセスを繰り返す。次いで、ポケット1の前の単一Cαについてこのプロセスをもう一度繰り返して結合溝内に位置する骨格Cα位置のライブラリーを生成する。
【0053】
生成された骨格の数はいくつかの要因に依存する:「許容される位置の球」の大きさ;ポケット1位置の「1次球」のグリッドの精密さ;後続Cαを位置付けるために用いるφおよびψの段階的回転角の精密さ。このプロセスを使用すると、大きな骨格ライブラリーを生成できる。骨格ライブラリーが大きい程、MHCクラスII分子の結合溝内の特定のペプチドに対して最もよく適合するものが見つかる可能性は大きくなる。各対立遺伝子について、結合領域のアミノ酸との衝突により、必ずしもすべての骨格がMHCクラスII分子のすべてのモデルに収容されるのには適さないため、その対立遺伝子によって収容され得る骨格を含むライブラリーの部分集合が生成される。骨格ライブラリーの使用は、MHCクラスII分子モデルと共に、各許容される骨格に収容される各MHCクラスII分子について結合溝の各位置の各アミノ酸の許容される側鎖コンホメーションからなる徹底的なデータベースを作成する。このデータセットは、単純な立体的重なり関数を用いて生成され、ここで、MHCクラスII分子は骨格と結合し、アミノ酸側鎖は所望の位置で骨格上にグラフトされる。各々の側鎖の回転可能な結合を設定した間隔で段階的に回転させ、得られる原子位置は注目する結合に依存する。原子と結合溝の側鎖の原子との相互作用が注目され、位置は次の基準によって許容されるか拒絶される:ここまでに位置付けられたすべての原子の重なりの合計は、予め決めた値を超過してはならない。
【0054】
したがって、コンホメーション探索の厳格性は、結合の段階的回転で用いる間隔と全重なりについて予め決めた限界の関数である。特定のポケットが剛性であると知られている場合、この後者の値は小さくなり得るが、ポケット側鎖の位置に比較的柔軟性があると知られている場合は、比較的緩和である。したがって、許容は結合溝ポケット内の柔軟性における変化を模倣するようになすことができる。次いで、MHCクラスII分子の各々に収容された時、このコンホメーション探索を各骨格のすべての位置にあるすべてのアミノ酸について繰り返し、側鎖コンホメーションの徹底的なデータベースを作成する。
【0055】
適切な数式を用いて、上記骨格/側鎖コンホメーションの大きなデータベースの走査により経験的に導き出されるペプチドリガンドコンホメーションと組み合うMHCクラスII分子モデル間の結合エネルギーを評価する。したがって、9〜20アミノ酸の範囲で長さが変化する(もっとも、長さは各走査に対しては一定にしておく)可能なペプチドに、以下の計算を施すことにより、タンパク質を潜在的なT細胞エピトープについて走査する:MHCクラスII分子をその分子に許容されるペプチド骨格とともに選択し、所望のペプチド配列に対応する側鎖をグラフトする。骨格上の特定の位置での原子の識別および特定の側鎖に関する原子間距離データを、そのアミノ酸の許容される各コンホメーションについて集める(上記データベースから得られる)。これを骨格に沿って各側鎖に対して繰り返し、スコアリング関数を用いてペプチドスコアを導く。その骨格のための最良のスコアを保持し、選択されたモデルについて各許容される骨格に対してこのプロセスを繰り返す。すべての許容される骨格から得られたスコアを比較し、最高のスコアをそのMHCクラスIIモデル中の所望のペプチドについてのペプチドスコアであると見なす。次いで、このプロセスを、走査されているタンパク質に由来するあらゆる可能なペプチドを備えた各モデルについて繰り返し、ペプチド対モデルのスコアを表示する。
【0056】
本発明の状況では、結合親和性計算のために提示される各リガンドは、上に議論されるようなペプチドまたはタンパク質から選択されるアミノ酸断片である。したがって、リガンドは、公知の配列のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られ、長さがおよそ9〜20個のアミノ酸である選択されたアミノ酸伸張物である。「アミノ酸」および「残基」という用語は以下においては同義語と見なされる。リガンドは、骨格ライブラリーから得た骨格上にグラフトされて検査されるペプチドの連続アミノ酸の形をしており、ペプチド骨格のC”−α原子の座標を介して、MHCクラスII分子モデルライブラリーから得られるMHCクラスII分子の結合溝中に位置し、各側鎖に対して許容されるコンホメーションは許容されるコンホメーションデータベースから選択される。関連する原子同一性および原子間距離もこのデータベースから検索し、ペプチド結合スコアを計算するために使用する。MHCクラスII結合ポケットへの高い結合親和性を備えたリガンドには、部位指図突然変異生成に対する候補としてフラグが立てられる。フラグが立てられたリガンド(したがって対象タンパク質)でアミノ酸置換を行い、これはその後、結合親和性を予め定義した閾値以下に低減する変更を決定するためにスコアリング関数を使用して再試験する。次いで、これらの変更を対象タンパク質に組み入れ、T細胞エピトープを除去する。
【0057】
MHCクラスII分子のペプチドリガンドと結合溝の間は、非共有結合性の相互作用(水素結合、静電気的相互作用、疎水性(親油性)相互作用およびファンデアワールス相互作用を含むが、これらに限定されない)を含む。これらは、以下に詳細に述べるペプチドスコアリング関数に含まれている。水素結合は極性または帯電基間で形成され得るもので、2つの他の原子によって共有された水素原子からなる非共有結合であることが理解されるべきである。水素受容体が部分的に負帯電を有する一方で、水素供与体の水素は正電荷を有する。ペプチド/タンパク質相互作用のために、水素結合供与体は、水素と結合した窒素または酸素もしくは窒素に結合した水素のいずれでもよい。水素結合受容体原子は水素と結合していない酸素、水素が全く結合しておらず1個か2個の結合がある窒素、または1つの結合のみある硫黄でもよい。水素を結合した酸素またはイミン窒素(例えばC=NH−)などのある種の原子は、水素受容体とも供与体ともなり得る。水素結合エネルギーは3〜7kcal/molの範囲であり、ファンデアワールス結合よりはるかに強いが共有結合よりは弱い。水素結合はまた指向性が強く、供与体原子、水素原子および受容体原子が同一直線上にある場合に最も強い。静電的結合は反対荷電のイオン対間で形成され、相互作用の強さはクーロンの法則による原子間の距離の二乗に反比例する。イオン対間の最適距離は約2.8Åである。タンパク質/ペプチド相互作用では、静電的結合がアルギニン、ヒスチジンまたはリジンとアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩との間で形成され得る。それらは水素結合と強さがほぼ似ているが、結合の強さはイオン化基のpKaおよび媒体の誘電率に依存するであろう。
【0058】
親油性(脂肪親和性)相互作用は、タンパク質とペプチドリガンド間に生じる良好な疎水性−疎水性接触である。通常、これらは結合溝のポケット内に埋没したペプチドの疎水性アミノ酸側鎖間に、それらが溶媒に露出しないように生じる。疎水性残基の溶媒への露出は、周囲の溶分子が互いに水素結合を強いられ、かご状のクラスレート構造を形成するので非常に不利である。結果として生じるエントロピーの減少は非常に不利である。
【0059】
脂肪親和性の強い原子は、極性でもなく水素受容体でもない硫黄や非極性の炭素原子などである。
【0060】
ファンデアワールス結合は3〜4Å離れた原子間で見られる非特異的な結合である。これは水素結合や静電的結合より弱く特異性も低い。原子のまわりの電荷分布は時間とともに変化し、どの瞬間でも、電荷分布は対称ではない。電荷分布におけるこの一時的な非対称性は、近隣の原子にも同様の非対称性を引き起こす。この結果生じる原子間引力は、ファンデアワールス接触距離で最大に達するが、約2Å〜約1Åに至ると非常に急速に低減する。
【0061】
逆に、原子間の隔たりが接触距離未満になるとともに、原子の外殻電子雲が重なるため、強い斥力が支配的になる。引力は静電的結合や水素結合に比べて比較的弱いが(約0.6Kcal/mol)、斥力は特に、ペプチドリガンドがタンパク質に成功裡に結合するかどうか決する上で非常に重要であろう。
【0062】
1つの実施形態では、ベーム(Boehm)スコアリング関数(SCORE1手法)が結合定数を評価するために使用される(Boehm,H.J.、J.Comput Aided Mol.Des.、8(3):243−256(1994)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。別の実施形態では、スコアリング関数(SCORE2手法)が、T細胞エピトープを含むリガンドの指標として結合親和力を評価するために使用される(Boehm,H.J.、J.Comput Aided Mol.Des.、12(4):309−323(1998)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。しかし、上記の文献に記述されているベーム(Boehm)スコアリング関数は、タンパク質へのリガンドの結合親和力を評価するために使用されるが、この場合、リガンドがタンパク質に成功裡に結合することが既に知られており、タンパク質/リガンド複合体はその構造が解明されタンパク質データバンク(「PDB」)の中に存在するものである。したがって、スコアリング関数は、陽性であることが知られた結合データを利用して開発されている。陽性および陰性バインダー間の区別を考慮に入れるために、方程式に反発項を加えなければならない。さらに、結合エネルギーのより満足な評価は、上記のベーム(Boehm)関数の領域ベースのエネルギー項を用いるのではなく対同士の方法で脂肪親和性の強い相互作用を計算することで達成される。したがって、好ましい実施形態では、結合エネルギーは修正されたベーム(Boehm)スコアリング関数を使用して評価される。修正されたベーム(Boehm)スコアリング関数では、タンパク質とリガンド間の結合エネルギー(ΔGbind)は、以下のパラメーターを考慮して評価される:リガンド(ΔGo)の並進エントロピーと回転エントロピーの全面的な喪失による結合エネルギーの低減;少なくとも1個のパートナーが中性である、理想的な水素結合からの寄与(ΔGhb);摂動のないイオン間相互作用(ΔGionic)からの寄与;脂肪親和性リガンド原子と脂肪親和性受容体原子の間の脂肪親和性相互作用(ΔGlipo);リガンド中の内部自由度の凍結による結合エネルギーの喪失、つまり、各C−C結合の周りの回転自由度が低減する(ΔGrot);タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギー(EvdW)。これらの項を考慮すると方程式1が与えられる:
(ΔGbind)=(ΔGo)+(ΔGhbxNhb)+(ΔGionicxNionic)+(ΔGlipoxNlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)
式中、Nは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、1つの実施形態では、ΔGo、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipoおよびΔGrotは、それぞれ5.4、−4.7、−4.7、−0.17および1.4の値を与えられる定数である。
【0063】
Nhbは方程式2:
Nhb=Σh-bondsf(ΔR,Δα)×f(Nneighb)×fpcs
によって計算される。
【0064】
f(ΔR,Δα)は、理想状態からの水素結合の大きな偏差を説明し、方程式3によって計算されるペナルティ関数である:
f(ΔR,Δ−□)=f1(ΔR)×f2(Δα)
ここで、f1(ΔR)=1(ΔR<=TOLの場合)、
または =1−(ΔR−TOL)/0.4(ΔR<=0.4+TOLの場合)、
または =0(ΔR>0.4+TOLの場合)。
さらに、f2(Δα)=1(Δα<30°の場合)
または =1−(Δα−30)/50(Δα<=80°の場合)
または =0(Δα>80°の場合)。
【0065】
TOLは水素結合長さ(=0.25Å)で許容される偏差、
ΔRはH−O/N水素結合長さの理想的な値(=1.9Å)からの偏差、
Δαは水素結合角度∠N/O-H,O/Nの理想的な値(=180°)からの偏差、
f(Nneighb)は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式4:
f(Nneighb)=(Nneighb/Nneighb,0)α(ここで、α=0.5)
によって計算される。
【0066】
Nneighbは任意の所与のタンパク質原子に5Åより接近している非水素タンパク質原子の数であり、
Nneighb,0=定数25である。
【0067】
fpcsは1つの水素結合当たり極性接触表面積を考慮に入れた関数であり、したがって強い水素結合と弱い水素結合を区別し、その値は次の基準によって決定される:
fpcs=β(Apolar/NHB<10Å2の場合)、
またはfpcs=1(Apolar/NHB>10Å2の場合)
Apolarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
NHBは水素結合の数であり、
βは定数=1.2である。
【0068】
修正されたベーム(Boehm)スコアリング関数の実行のためには、イオン相互作用からの寄与、ΔGionicを上記水素結合からの寄与と同様の方法で計算する(同じ幾何学依存性が仮定されるため)。
【0069】
Nlipo項は方程式5によって計算される:
Nlipo=ΣILf(rIL)
f(rIL)はすべての脂肪親和性リガンド原子について、1また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてLであり、以下の基準により計算される:
f(rIL)=1(rIL<=R1f(rIL)=(rIL−R1)/(R2−R1)でR2<rIL>R1の場合、
f(rIL)=0(rIL>=R2の場合)。
【0070】
ここで、R1はr1vdw+rL vdw+0.5および
R2=R1+3.0であり、
r1vdwは、原子1のファンデアワールスの半径であり、
rL vdwは、原子Lのファンデアワールスの半径である。
【0071】
Nrotはアミノ酸側鎖の回転可能な結合の数であり、非環式のsp3−sp3結合およびsp3−sp2結合の数である。末端CH3またはNH3の回転は考慮に入れない。
【0072】
最後の項Evdwは方程式6によって計算される:
Evdw=ε1ε2((r1 vdw+r2 vdw)12/r12−(r1 vdw+r2 vdw)6/r6)。
【0073】
ここでε1とε2は原子同一性に依存する定数であり、
r1 vdw+r2 vdwはファンデアワールスの原子半径であり、
rは1対の原子間の距離である。
【0074】
方程式6に関して、1つの実施形態では、定数ε1とε2はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる:C:0.245、N:0.283、O:0.316、S:0.316(つまり、炭素、窒素、酸素および硫黄のそれぞれの原子について)。方程式5および6については、ファンデアワールスの半径はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる:C:1.85、N:1.75、O:1.60、S:2.00Å。
【0075】
タンパク質リガンド相互作用についての現時点での理解の制約内ではあるが、上記の方程式に現われるすべての所定の値および定数がすべて決定されることは理解されるべきである(特に本願で試みられている計算のタイプについて)。したがって、分子相互作用のモデリングの分野における進歩の結果、このスコアリング関数がさらに精緻化された場合には、これらの値および定数を変更することが可能で、したがって、リガンドへのタンパク質の結合エネルギーを評価する項において所望の結果を与える適当な数値を使用してもよく、したがって、本発明の範囲内である。
【0076】
上記のように、スコアリング関数は、側鎖コンホメーション、原子同一性および原子間の距離のデータベースから抽出されたデータに適用される。本発明を説明する目的のために言えば、このデータベースに含まれるMHCクラスII分子の数は42個のモデルと4つの解決された構造である。本発明の計算方法の構築はモジュール化された性質を有するため、新しいモデルを加えペプチド骨格ライブラリーと側鎖コンホメーション関数を用いて走査するだけで、上記のペプチドスコアリング関数によって処理できる追加のデータセットを作成できることは上記の説明から明らかである。これにより、走査されたMHCクラスII分子のレパートリーを容易に増加させることが可能になり、あるいは、データが入手できる場合には構造および関連データを置き換えて、既存の対立遺伝子のより正確なモデルを作成することができる。
【0077】
利用可能ないくつかの精巧な方法論と比較して、上記のスコアリング関数は比較的単純であるが、計算が非常に急速に実行される、ということが理解されるべきである。また、目的が、選択されたMHCクラスIIタンパク質の結合溝に収容される各ペプチドについて真の結合エネルギーそれ自身計算するものではないことも理解されるべきである。根本的な目的は、選択されたタンパク質の1次構造(すなわち、アミノ酸配列)に基づいてT細胞エピトープの位置を予想する助けとして相対的な結合エネルギーデータを得ることである。比較的高い結合エネルギー、すなわち選択された閾値以上の結合エネルギーは、リガンド中のT細胞エピトープの存在を示唆するだろう。次いで、リガンドに少なくとも1回のアミノ酸置換を施し、結合エネルギーを再計算すればよい。計算が迅速性を有するため、ペプチド配列のこれらの操作はコストに見合う利用可能なコンピューターハードウェアにおいてプログラムのユーザインターフェース内で対話形式に実行できる。したがって、コンピューターハードウェアへの大きな投資は要求されない。
【0078】
同じ目的のために他の利用可能なソフトウェアを使用できるかもしれないことは当業者には明白であろう。特に、タンパク質結合サイト内にリガンドをドッキングさせ得るより精巧なソフトウェアを、エネルギー最小化と共に使用してもよい。ドッキングソフトウェアの例は次の通りである:DOCK(Kuntz et al.、J.Mol.Biol.、161:269−288(1982))、LUDI(Boehm,H.J.、J.Comput Aided Mol.Des.、8:623−632(1994))およびFLEXX(Rarey M.、et al.、ISMB、3:300−308(1995))。分子モデリングおよび操作ソフトウェアの例としては:AMBER(Tripos)およびCHARm(Molecular Simulations Inc.)。これらの計算方法の使用は、必要な計算を行うために要求される処理時間の長さにより本発明方法の処理能力を厳しく制限するだろう。しかし、本発明の方法によって「陽性なバインダー」であると判明したペプチドについて結合エネルギーのより正確な計算結果を得るために「第2のスクリーン」として、このような方法を使用し得るというのもあり得ることである。
【0079】
洗練された分子の機械的または分子の動的な計算のための処理時間の制限は、これらの計算を行うソフトウェアの設計およびコンピューターハードウェアの現在の技術制限の両者によって決まる。将来的には、より効率的なコードが書かれ、さらにコンピュータープロセッサー速度の持続的な増加によって、より扱いやすい時間枠内でそのような計算を行うことが実現可能になるかもしれない。巨大分子に適用されるエネルギー関数および折り畳まれたタンパク質構造内で起こる様々な相互作用についての考慮に関するさらに詳しい情報は以下に見られる:Brooks,B.R.,et al.、J.Comput.Chem.、4:187−217(1983)。一般的なタンパク質−リガンド相互作用に関するさらに詳細な情報は以下に見られる:Dauber−Osguthorpe et al.、proteins4(1):31−47(1988)。その内容の全体は言及によって本願に組み入れられる。有用な背景的事項は、例えば以下に見られる:Fasman,G.D.、ed.、Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation、Plenum Press、New York、ISBN:0−306 4313−9。
【0080】
本発明の予測方法は、様々なMHCクラスII分子への親和性が予め実験的に測定されている多数のペプチドを含むデータセットに対して較正することができる。
【0081】
本方法の好適実施形態によれば、各ペプチド/MHCクラスII対について数値スコアを算出する方法である、ここに記載した具体的予測方法のうちのいずれも、また他のコンピュータに基づくペプチド−MHCクラス相互作用予測方法のいずれも、様々なMHCクラスII分子へのその親和性が予め実験的に測定されている多数のペプチドを含むデータセットに対して較正される。実験データと計算値を比較することにより、すべての実験的に測定したT細胞エピトープが正確に予測されることが知られているカット値(cut of value)を決定できる。
【0082】
具体的には、コンピュータによる数値スコアは、データセット中の各ペプチド/MHCクラスII対について計算される。スコアは、より高いスコアで結合の可能性がより大きく表されるように計算される。実験的に見出されるペプチド/MHCクラスII対についてのコンピュータに基づく最低スコアは、分割値(cut−off)と見なされる。この分割スコアを有意に下回るコンピュータに基づくスコアはすべて非結合なペプチド/MlICクラスII対を表わすと考えられ、他方、この分割スコア以上のコンピュータに基づくスコアは潜在的な結合ペプチド/MHCクラスII対を表わす。一般に、所与のコンピュータに基づくスコアリングアルゴリズムでは、分割値以上のスコアを与えるが、現実に結合しないペプチド/MHCクラスIIの組合せもあるであろう。したがって、本方法のこの好適実施形態は偽陽性を生じるかもしれないが、偽陰性を生じることは全くないか稀にしかない。
【0083】
最終目標がタンパク質から変異によってT細胞エピトープの大部分またはすべてを除去することである場合、本方法のこの分割に基づく実施形態は特に有用である。具体的には、本発明の方法のより好ましい実施形態によれば、T細胞エピトープの大部分またはすべては、タンパク質から以下のように取り除かれる。タンパク質配列は潜在的なT細胞エピトープについてコンピュータに基づくアルゴリズムによって走査される。個々の潜在的なT細胞エピトープは、MHCクラスIIに結合する可能性が高いほど、より大きなスコアを与えられる。分割スコアより大きなスコアを有する各ペプチドセグメントを、変異セグメントのスコアが分割値未満であるように変化させる。変異は、タンパク質活性がその所与の目的に必要な活性未満に低減しないように優先的に選択される。そのコンピュータで予測されたT細胞エピトープの大部分またはすべてを欠く、多重変異させたタンパク質が設計される。このような多重変異タンパク質を「脱免疫(DeImmunized)タンパク質」と呼ぶ。
【0084】
脱免疫タンパク質は標準的方法によって合成される。例えば、脱免疫タンパク質をコードする人工DNA配列を、合成オリゴヌクレオチドから組み立て、発現ベクターにライゲートし、脱免疫タンパク質の発現を促進する要素に機能的に結合させる。次いで、脱免疫タンパク質を標準的方法によって精製する。生じる脱免疫タンパク質は本来のT細胞エピトープが除去されるそのような変異がなされたアミノ酸を含む。さらに、脱免疫タンパク質は、しばしば、T細胞エピトープであることがアルゴリズムによって予側されるが、実際にはT細胞エピトープではないセグメント中に変異がなされたアミノ酸を含むであろう。しかし、誤って予測されたエピトープ中の変異からは著しく有害な結果は生じない。これは、変異がタンパク質活性にほとんど影響を及ぼさないように選択されるためである。さらに、タンパク質中に新しいB細胞エピトープを導入する可能性からも有害な結果は生じない。これは、T細胞エピトープが欠けていることから、修飾されたタンパク質に対するB細胞応答が防止されるためである。
【0085】
治療目的のためにMHCクラスII結合を強化する修飾を目的として、脱免疫のために考えられる様々なペプチドへの上記方法論の適用を以下に例示する。
【0086】
本発明は、実質的にここに開示されたものと同一の1次アミノ酸配列を有し、定義された生物学的および/または薬学的活性を有する任意の生物学的分子に適用し得るものであり、したがって、遺伝子工学的手段または他の方法によって得られる分子を含むであろう。「生物学的分子」という用語は、本発明では、生物学的機能を有しており、生物学、薬学または医薬上の効果または活性を引き起こす分子に使用される。好ましくは、本発明による生物学的分子はペプチド、ポリペプチド、タンパク質である。この中でタンパク質、免疫グロブリンが好まれる。本発明はさらに基本的に同一の生物活性を有するが免疫原性は同様である(低減された)、特定のポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、免疫グロブリンの変異体および他の修飾形を含む。さらに、sFv、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFcなどの抗体の断片、およびタンパク質の生物学上有効な断片を含む。ヒト起源の抗体またはヒト化された抗体はヒトにおいて、それ自体、非ヒト抗体と比較して、免疫原性を示さないか示すとしても低く、免疫原性エピトープも含まないか数がより少ない。しかし、それらの中にはヒトにおいて顕著な免疫反応を誘発することが示されたものもあるため、こうした分子についても脱免疫の必要がある。さらに望ましくない、または、あまりにも強い免疫反応を誘発する抗原は、本発明の方法によって修飾することができ、免疫原性は低減されているが抗原(例えば、ワクチン)としての使用するための強さは十分に有する抗原を得ることができる。
【0087】
分子によっては、レプチンのように、他の哺乳類出所から識別されたものでも、本発明の開示のペプチド配列の多くを共通して有し、開示されたリストにおけるのと実質的に同一の配列を持つペプチド配列の多くを共通して有するものもある。したがって、そのようなタンパク質配列は、等しく本発明の範囲に入る。
【0088】
本発明は、タンパク質からの1個または複数の潜在的なT細胞エピトープ活性の実質的な低減または除去をもたらす位置で少なくとも1個のアミノ酸残基の置換がなされた、本発明による生物学的分子の類似体に関する。
【0089】
実施例の表において識別される潜在的なMHCクラスIIリガンドのいずれかにおける特定点で1個または複数のアミノ酸を置換することで、ヒト受容者に治療剤として投与された時に免疫原性が低下する分子を得ることができる。アミノ酸置換は、好ましくは、予測されたペプチド配列内の適切な各点で行い、T細胞エピトープ活性の実質的な低減または除去を達成する。実際上、適切な点は、MHCクラスII結合溝内にもたらされる疎水性ポケットのうちの1つの内部で結合するアミノ酸残基と好ましくは一致するであろう。MHC結合間隙内の他のポケット領域内での結合と一致する位置のペプチド中のアミノ酸残基も考えられ、本発明の範囲に入る。
【0090】
所与の潜在的なT細胞エピトープ内の単一のアミノ酸置換が、エピトープを除去する最も好ましい経路であることが理解される。単一のエピトープ内での置換の組合せも考えられ、例えば、個別に定義されたエピトープが互いに重複する場合には特に適している。さらに、アミノ酸置換は、所与のエピトープ内において1個でも、または単一のエピトープ内における組合せでも、MHCクラスII結合溝に関して「ポケット残基」と一致しない位置であってもペプチド配列内の任意点で行うことができる。そのような置換はすべて本発明の範囲内に入る。
【0091】
特に、リストに挙げたペプチド内でなされた置換と組合せて行う場合、上に識別されたペプチド内以外のアミノ酸置換を考えることもできる。例えば、変異分子の構造または生物活性を回復するために変更を考えてもよい。所望の活性を有し、開示するペプチドのうちのいずれかの変化と組み合わせる変異体をもたらす本発明による分子からの特定のアミノ酸残基の欠失または付加を含むそのような補償のための変化および変化は、本発明の範囲に入る。
【0092】
別の態様では、本発明は、免疫原性を低減した前記生物学的分子をコードする核酸に関する。遺伝子構成体および遺伝子産物を生成する方法は当技術分野においてよく知られている。最後の態様としては、本発明は、本発明で開示された方法によって得ることのできる前記生物学的分子を含む医薬組成物、並びに修飾された分子および医薬組成物を使用するヒトの治療的処置方法に関する。
【0093】
以下の例からわかるように、本発明においてこれまでに述べた計算方法は、任意のペプチドにおいてT細胞エピトープがどこで見つかるかを示す非常によい指標を提供する。したがって、これは、もし1個以上アミノ酸残基によって変更すればT細胞エピトープを削除する効果があり、したがってペプチドの治療上の価値を増大させるアミノ酸残基配列領域の識別を可能にする。この方法によって、増強された特性および薬学的価値を有するペプチド、タンパク質、免疫グロブリンおよび融合タンパク質その他の生物学的分子を製造できる。
【0094】
これまでの記載およびその例は、説明を目的としたものであり限定的な意味に解してはならない。また、当業者には、本発明の技術思想および範囲内でさらに別の変更を行うことも可能かつ容易なことであろう。
【0095】
(実施例1)
この例は、自己抗原グルタミン酸デカルボキシラーゼアイソフォーム(GAD 65;MW:65.000)(これはタイプI糖尿病の発症に関係する)のT細胞エピトープ見込みプロファイルを示す。この特定のタンパク質は、T細胞エピトープの親和性を増加させる潜在的な目標となり、さらに比較的長いペプチド(585アミノ酸残基)であるためにT細胞エピトープ見込み指数を示すために良い例となり、したがってプロファイルのための比較的大きな試料サイズを与える。
【0096】
図5にGAD65についてのT細胞エピトープ見込みプロファイルを示す。実線は、図1に示す計算方法を使用して計算したT細胞エピトープ指数を表わし、点線は、図3および4に示す計算方法を使用して予測したT細胞エピトープ指数を表わす。
【0097】
(実施例2)
この例は、エリスロポエチン(EPO)のT細胞エピトープ見込みプロファイルを示す。エリスロポエチンは赤血球数を増大させる静脈内(IV)投与薬剤として広く使用されている193アミノ酸残基長のサイトカインである。これは、治療価値を有するが、特にIV投与ルートを使用する際に不適当であるか、望ましくない免疫反応を引き起こすおそれがあり、したがって、その潜在的なT細胞エピトープが識別されれば、脱免疫によって有益となり得る生物学的薬剤の良い例を表わす。
【0098】
EPOについてのT細胞エピトープ見込みプロファイルを図6に示す。実線は、図1に示す計算方法を使用して計算したT細胞エピトープ指数を表わし、点線は、図3および4に示す計算方法を使用して予測したT細胞エピトープ指数を表わす。
【0099】
(実施例3)
図7および8は、A33抗原に対するマウスヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖についてのT細胞エピトープ指数を示す。後者は95%超の腸癌の表面で発現される膜貫通糖タンパク質であり、したがって、癌治療剤としての可能性を有する。
【0100】
図7および8では、実線は、図1に示す計算方法を使用して計算したT細胞エピトープ指数を表わし、点線は、図3および4に示す計算方法を使用して予測したT細胞エピトープ指数を表わす。
【0101】
(実施例4(レプチン))
これらの治療上価値のある分子のうちの1つは、「レプチン」と呼ばれるヒトの肥満タンパク質である。レプチンは脂肪量を維持するホメオスタシス機構に関わる146アミノ酸残基のシグナル伝達性の分泌タンパク質である(例えばWO 00/40615、WO 98/28427、WO 96/05309)。タンパク質(およびそのアンタゴニスト)は、糖尿病、高血圧症およびコレステロール代謝の治療のために重要な治療上の可能性を示す。このタンパク質は組換え技術によって多くの様々な宿主T細胞タイプを使用して生産することができる。レプチンのアミノ酸配列は、以下の通りである(1文字コードで表わす):
【0102】
【表1】
免疫原性が修飾されていないヒト肥満タンパク質(レプチン)の配列の一部であって、潜在的なMHCクラスII結合活性を有するアミノ酸配列は、本発明の方法によって識別された以下の群から選択される:
【0103】
【表2】
上に挙げたペプチド配列のうちのいずれも、免疫原性のない、または低減された配列を得るために1個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾するために使用することができる。
【0104】
【表3】
(実施例5(Il−lRアンタゴニスト))
IL−1は様々な組織に対する多面発現効果を有する重要な炎症および免疫調整サイトカインであるが、慢性関節リウマチおよび局所的組織損害を伴う他の疾病に関連した病理的態様の原因ともなっている。IL−1の作用を阻害できるIl−1受容体アンタゴニストが精製され、遺伝子がクローン化されている[Eisenburg S.P.et al(1990)Nature,343:341−346;Carter,D.B.et al(1990)Nature,344:633−637]。他にもIL−1Ra分子が提供されている[例えば、米国特許第5,075,222号]。Il−lRaのアミノ酸配列は、以下の通りである(1文字コードで表わす):
【0105】
【表4】
免疫原として修飾されていないIL−lRaの配列の一部であり、潜在的なMHCクラスII結合活性を有するアミノ酸配列は、以下の群から選択される:
【0106】
【表5】
免疫原性を有しないか低減された配列を得るために、上に挙げたペプチド配列のうちのいずれかを用いて1個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾することができる。潜在的なT細胞エピトープの除去をもたらす置換は以下の通りである。
【0107】
【表6】
(実施例6(BDNF))
別の治療上有益な分子は、ヒト脳由来神経栄養因子(BDNF:brain−derived neutrophic factor)である。BNDFはタンパク質の神経成長因子ファミリーの糖タンパク質である。成熟した119個のアミノ酸糖タンパク質は、神経細胞集団の生存を促進する神経成長因子を産生するために、より大きな前駆体のプロセシングで得られる[Jones K.R.& Reichardt,L.F.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.87:8060−8064]。そのような神経細胞はすべて中枢神経系に位置するか、これに直接に接続するものである。BNDFの組換え調製により、該タンパク質の治癒力を神経再生の促進および変性疾患の治療のために検討することが可能になった。
【0108】
ヒト脳由来神経栄養因子(BDNF)のアミノ酸配列は、以下の通りである(1文字コードで表わす):
【0109】
【表7】
他の研究によっても、修飾BNDF分子[米国特許第5,770,577号]および組換えBNDF分子の商用生産への手法[米国特許5,986,070号]が提供されている。
免疫原として修飾されていないヒト脳由来神経栄養因子(BDNF)の配列の一部であり、潜在的なMHCクラスII結合活性を有するアミノ酸配列は、以下の群から選択される:
【0110】
【表8】
免疫原性を有しないか低減された配列を得るために、上に挙げたペプチド配列のうちのいずれかを用いて1個または複数のアミノ酸を交換することにより、上記ペプチド配列のいずれもが修飾することができる。
【0111】
ヒト脳由来神経栄養因子(BDNF)(WT=野生型)の潜在的なT細胞エピトープの除去をもたらす置換は以下の通りである。
【0112】
【表9】
【0113】
【表10】
(実施例7(EPO))
別の治療上有益な分子は、エリスロポエチン(EPO)である。EPOは赤血球前駆細胞の赤血球への成熟に関わる糖タンパク質ホルモンである。天然に存在するEPOは、胎児期の肝臓によって、および成人の腎臓によって生産され、血中を循環して骨髄中の赤血球の生産を刺激する。貧血は、腎臓からのEPOが減少することによる、ほとんど常に腎不全の結果である。組換えEPOは慢性腎不全からくる貧血の治療において効果的であるとされている。ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列1〜165を有する組換えEPO(哺乳類細胞の中で発現されたもの)[Jacobs,K.et al(1985)Nature,313:806−810;Lin,F.−K.et al(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7580−7585]は、いずれも末端にシアル酸残基を含む3個のN結合、および1個のO結合オリゴ糖鎖を含む。後者は、肝アシアロ糖タンパク質結合タンパク質による循環系からのEPOの迅速除去を回避し得る際に重要である。
EPOのアミノ酸配列は、以下の通りである(1文字コードで表わす):
【0114】
【表11】
免疫原として修飾されていないヒトエリスロポエチン(EPO)の配列の一部であり、潜在的なMHCクラスII結合活性を有するアミノ酸配列は、以下の群から選択される:
【0115】
【表12】
ヒトエリスロポエチン(EPO)(WT=野生型)の潜在的なT細胞エピトープの除去をもたらす置換は以下の通りである。
【0116】
【表13】
【0117】
【表14】
(実施例8(G−CSF))
顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)は重要な造血性サイトカインであり、好中球の増加が有益と思われる適応症の治療に現在使用されている。これらは癌療法、様々な感染症、および敗血症のような関連症状を含む。骨髄移植用造血細胞のエクスビボ(ex vivo)での増殖においても、G−CSFは単独で、あるいは他の化合物およびサイトカインと組み合わせて使用される。
【0118】
2種のヒトG−CSFが、一般にこのサイトカインに認識されている。1つは177個のアミノ酸のタンパク質であり、他方は174個のアミノ酸のタンパク質であり[Nagata et al.(1986),EMBO J.5:575−581]、174アミノ酸形態は、インビボで最大の特異的生物活性を有することが判明した。組換えDNA技術は、商用規模の量でのG−CSFの生産を可能にし、そのために真核および原核の両宿主細胞発現系が利用されている。
【0119】
顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)のアミノ酸配列は、以下の通りである(1文字コードで表わす):
【0120】
【表15】
G−CSFの他のポリペプチド類似体およびペプチド断片は、サイト特異的アミノ酸置換およびまたは化学的付加物による修飾によって修飾された形を含め、以前に開示されている。したがって、米国特許第4,810,643号は、特定のCys残基を別のアミノ酸で置換した類似体、および第1の(N−末端)位置にAla残基を有するG−CSFを開示する。EP 0 335 423は、G−CSF活性を有するポリペプチド中の少なくとも1個のアミノ基の修飾を開示する。EP 0 272 703は、N−末端の近くでアミノ酸を除去または置換したG−CSF誘導体を開示する。EP 0 459 630は、Cys 17およびAsp27をSer残基に置換したG−CSF誘導体を開示する。EP 0 243 153は、組換え生成物の収率を増すために、少なくとも1個の酵母KEX2プロテアーゼプロセッシングサイトの不活性化により修飾されたG−CSFを開示し、米国特許第4,904,584号は、リジンが変更されたタンパク質を開示する。WO 90/12874はCysに変更された変種をさらに開示し、オーストラリア特許文献AU 10948/92は、原核生物の発現の後の分子フォールディングを支援するためにG−CSF分子のいずれかの末端にアミノ酸を付加して例を開示する。AU 76380/91は、G−CSF 174アミノ酸形の位置50〜56、および177アミノ酸形のうちの53〜59の位置におけるG−CSF変異体を開示する。さらに特にHis残基での変更も開示されている。
【0121】
免疫原として修飾されていないヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の配列の一部であり、潜在的なMHCクラスII結合活性を有するアミノ酸配列は、以下の群から選択される:
【0122】
【表16】
免疫原性を有しないか低減された配列を得るために、上に挙げたペプチド配列のうちのいずれかを用いて1個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾することができる。
【0123】
ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)(WT=野生型)の潜在的なT細胞エピトープの除去をもたらす置換は以下の通りである。
【0124】
【表17】
(実施例9(KGF))
別の有益な分子は、ケラチノサイト成長因子(KGF)である。KGFはタンパク質の繊維芽細胞増殖因子(FGF)/ヘパリン結合成長因子ファミリーのメンバーである。これは主に肺中で発現される分泌型糖タンパク質で、ケラチノサイトおよび他の上皮細胞の成長を刺激することにより傷の治癒を促進する[Finch et al (1989),Science 24:752−755;Rubin et al (1989),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:802−806]。糖タンパク質の成熟(被加工)形は163個のアミノ酸残基を含み、特別の細胞系の培養後、調整した培地から分離でき[Rubin et al,(1989)上掲箇所]、あるいは組換え技術を用いて製造できる[Ron et al(1993)J.Biol.Chem.268:2984−2988]。
【0125】
このタンパク質は、多数の重要な疾病および傷修復において、上皮細胞成長の刺激する治療上の価値がある。この開示は特に163個のアミノ酸残基の成熟(被加工)形であるヒトKGFタンパク質に関する。他にもKGF分子を提供した例はあり[例えば米国、6,008,328;WO90/08771;]修飾されたKGFも含まれる[Ron et al(1993)、上掲箇所;WO9501434]。しかし、このような教示は、タンパク質の免疫原性に対するT細胞エピトープの重要性を認識していないし、本発明のスキームによる特定の制御された方法で、こうした性質に直接影響を及ぼすとは想定されていなかった。
【0126】
ケラチノサイト成長因子(KGF)のアミノ酸配列は、以下の通りである(1文字コードで表わす):
【0127】
【表18】
免疫原として修飾されていないヒトケラチノサイト成長因子(KGF)の配列の一部であり、潜在的なMHCクラスII結合活性を有するアミノ酸配列は、以下の群から選択される:
【0128】
【表19】
免疫原性を有しないか低減された配列を得るために、上に挙げたペプチド配列のうちのいずれかを用いて1個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾することができる。
【0129】
ヒトケラチノサイト成長因子(KGF)(WT=野生型)の潜在的なT細胞エピトープの除去をもたらす置換は以下の通りである。
【0130】
【表20】
(実施例10(可溶性TNF RI)
sTNF−RI(可溶性腫瘍壊死因子レセプタータイプI)は、これまでに記載例のあるヒト腫瘍壊死因子レセプターの誘導体であり[Gray,P.W.et al(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.87:7380−7384;Loetschere,H.et al,(1990)Cell 61:351−359;Schall,T.J.et al(1990)Cell 61:361−370]、未処置のレセプターの細胞外領域を含み、およそ30KDa分子量を示す。別の可溶性TNF阻害剤、特に40KDa形も知られている[米国特許第6,143,866号]。可溶性型は腫瘍壊死因子アルファと高い親和性で結合し、サイトカインの細胞毒素活性をインビトロで阻害する。腫瘍壊死因子レベルが過大となって病態的な結果を惹起している場合には、sTNF−RIの組換体の製造は、疾病の治療に重要な治療上の価値を有する。悪液質、敗血症および慢性関節リウマチなどを含む自己免疫疾患などの症状が、sTNF−RIのこうした治療剤の標的となり得る。Brewerら(米国特許第6,143,866号)を含む他の人たちは修飾されたsTNF−RI分子を提供している。
潜在的ヒトMHCクラスII結合活性を有するヒト30KDa sTNF−RI中のペプチド配列:
【0131】
【表21】
免疫原性を有しないか低減された配列を得るために、上に挙げたペプチド配列のうちのいずれかを用いて1個または複数のアミノ酸を交換することにより修飾することができる。
【0132】
(実施例11(可溶性TNF−R2))
可溶性腫瘍壊死因子レセプター2(sTNF−R2)はこれまでに記載例のあるヒト腫瘍壊死因子レセプター2の誘導体であり[Smith,C.A.et al(1990)Science 248:1019−1023;Kohno,T.et al(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.87:8331−8335;Beltinger,C.P.et al(1996)Genomics 35:94−100]、未処置のレセプターの細胞外領域を含む。可溶性型は腫瘍壊死因子と高い親和性で結合し、サイトカインの細胞毒素活性をインビトロで阻害する。腫瘍壊死因子レベルが過大となって病態的な結果を惹起している場合には、TNF−R2の組換体の製造は、疾病の治療に重要な治療上の価値を有する。エタナーセプト(ethanercept)と名付けられた特別の組換え製剤は、慢性関節リウマチの治療のための臨床的な承認を獲得しており、これおよび他の同様の薬剤は悪液質、敗血症および自己免疫疾患その他の症状の治療に有益である。エタナーセプトは、ヒトIgG1分子のFc領域と組み合わさったヒトTNFR2分子の細胞外の領域を含む二量体の融合タンパク質である。二量体の分子は934個のアミノ酸を含む[米国特許第5,395,760号;米国特許第5,605,690号;米国特許第5,945,397号;米国特許再発行第36,755号]。
【0133】
潜在的ヒトMHCクラスII結合活性を有するヒトTNFR2タンパク質中のペプチド配列は以下の通りである。
【0134】
【表22】
(実施例12(β−GCR))
ベータ−グルコセレブロシダーゼ(b−D−グルコシル−N−アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ(E.C.3.2.1.45))は、497個のアミノ酸残基からなる単量体糖タンパク質である。この酵素は糖脂質グルコセレプロシドのグルコースとセラミドへの加水分解を触媒する。GCR活性の欠乏は、ゴーシェ病と呼ばれるリソソーム蓄積症をもたらす。疾病は、肝臓、脾臓、骨髄および他の器官に蓄積するグルコセレブロシド充満−組織マクロファージ(glucocerebroside engorged tissue macrophages)の蓄積によって特徴付けられる。この疾病は、重篤さにより段階があり、血液に関する問題はあるが神経には関わらないタイプlから神経に広範囲に関与する誕生後初期に現われるタイプ2があり、例外なく進行的で2歳以内に致死する。タイプ3疾病もいくつかの分類によって認められ、やはり神経への関与を示す。従来、ゴーシェ病の唯一の有用な治療法はヒト胎盤(アルグセラーゼ(alglucerase)として知られている)に由来したGCRの投与であったが、最近では、組換えGCR(「セレダーゼ(Ceredase)および「セレザイム(Cerezyme)」)製剤が、タイプIの治療に効果があることが示されている[Niederau,C.et al(1998)Eur.J.Med.Res.3:25−30]。
【0135】
潜在的ヒトMHCクラスII結合活性を有するヒトGCR中のペプチド配列は以下の通りである。
【0136】
【表23】
【0137】
【表24】
(実施例13(タンパク質C))
タンパク質Cは、血液凝固の調節に関わるビタミンK依存セリンプロテアーゼである。このタンパク質はトロンビンによって活性化され、活性化されたタンパク質Cを生じ、これが凝固カスケードにおいて因子VaおよびVIIIaを分解する。タンパク質Cは単鎖の前駆体として肝臓内で発現され、一連のプロセシングイベントを経て、ジスルフィド結合によって互いに連結された軽鎖および重鎖を含む分子となる。タンパク質Cは、トロンビンによる重鎖のN−末端からのテトラデカペプチドの開裂によって活性化される。タンパク質Cの医薬製剤は本来の形か活性化された形で、血管疾患に罹患している患者の治療、またはタンパク質Cの中の好転的欠乏に効果がある。したがって、こうした患者は、血栓症の発作、または、敗血症、移植手術、妊娠、重篤な火傷、大手術または他の大きな外傷に伴うタンパク質C欠乏症に罹患した個体を含む。タンパク質Cはまた、遺伝的にタンパク質C欠乏である個人の治療において使用される。この開示は特に、155個のアミノ酸残基の軽鎖および262個のアミノ酸残基の重鎖を含む成熟した(プロセシングされた)ヒトタンパク質C[Foster,D.C.et al(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:4673−4677;Beckman,R.J.et al(1985)Nucleic Acids Res.13:5233−5247]に関する。他にも、活性化されたタンパク質Cの処方および使用方法を含むタンパク質C分子が提供されている[米国特許第6,159,468号;米国特許第6,156,734号;米国特許第6,037,322号;米国特許第5,618,714号]。潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するヒトタンパク質C重鎖中のペプチド配列は以下の通りである:
【0138】
【表25】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するヒトタンパク質C軽鎖中のペプチド配列は以下の通りである:
【0139】
【表26】
(実施例14(スブチリシン))
スブチリシンは、経済的および産業上かなり重要なプロテアーゼ酵素クラスである。これらは、洗剤または化粧品成分として、または織物その他の産業および消費者用製品の生産で使用できる。特定のヒト対象を細菌スブチリシンに曝すと、各人に望ましくない過敏反応を惹起することがある。増強された特性、特にタンパク質の生物学的特性が改良されたスブチリシン類似体が必要とされている。この点では、ヒト対象で免疫反応を引き起こす能力が低減されているか、存在しないスブチリシンが強く望まれている。細菌、真菌またはほ乳動物およびヒトを含む脊椎動物源を含めた他の起源から識別されたスブチリシンタンパク質は、本発明で開示するペプチド配列の多くを共有し、また、開示するリストのものと実質的に同一の配列を含む多くのペプチド配列を共有している。したがって、そのようなタンパク質配列は、等しく本発明の範囲に入る。他にも、修飾されたスブチリシンを含むスブチリシン分子が提供されている[米国特許第5,700,676号;米国特許第4,914,031号;米国特許第5,397,705号;米国特許第5,972,682号]。
【0140】
潜在的なMHCクラスII結合活性を有するB.lentusスブチリシン中のペプチド配列は以下の通りである:
【0141】
【表27】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するB.amyloliquefaciensスブチリシン中のペプチド配列は以下の通りである:
【0142】
【表28】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するB.subtilisスブチリシン中のペプチド配列は以下の通りである:
【0143】
【表29】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するB.licheniformisスブチリシン中のペプチド配列は以下の通りである:
【0144】
【表30】
(実施例15(CNTFのリガンド))
本発明は、人体内における毛様神経栄養因子(CNTF)レセプター複合体のためのヘテロダイマーリガンドを含むタンパク質サブユニットの修飾形を提供する。レセプター複合体は、CNTFおよびカルディオトロフィン(cardiotrophin)様サイトカイン(CLC)と可溶性レセプターサイトカイン様因子1(CLF)とを含むヘテロダイマー複合体を含む少なくとも2個のリガンドによって活性化される[Elson G.C.A.et al(2000)Nature Neuroscience 3:867−872]。CLCはサイトカインのIL−6ファミリーのタンパク質で、新規ニューロトロフィン(neurotrophin)−1/B細胞刺激因子−3として知られている[Senaldi,G.et al(1999)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96:11458−11463、米国特許第5,741,772号]。CLCはサイトカインタイプIレセプターファミリーのタンパク質と相同であり[Elson,G.C.A.et al(1998)Journal of Immunol.161:1371−1379]、NR6としても識別されている[Alexander W.S.et al(1999)Curr.Biol.9:605−608]。CLCとCLFの会合によって形成されたヘテロダイマーは直接CNTFRと相互作用することが示され、このようにして形成された三量体複合体は、gp130やLIFRのようなCNTFR複合体の他の認識された成分を発現する細胞内のシグナルイベントを刺激することができる。[上掲、Elson G.C.A.et al(2000)]。
【0145】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するヒトCLCの中のペプチド配列は以下の通りである:
【0146】
【表31】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するヒトCLFの中のペプチド配列は以下の通りである:
【0147】
【表32】
(実施例16(卵胞刺激ホルモン))
本発明は、1個または複数のT細胞エピトープが除去されたヒトhFSHの修飾形を提供する。hFSHは2個の糖タンパク質サブユニットを含む二量体の構造の糖タンパク質ホルモンである。このタンパク質は、ヒトの不妊処置の治療に使用されており、このタンパク質の組換え形は多くの治験の対象物であった[Out,H.J.et al(1995)Hum.Reprod.10:2534−2540;Hedon,B.et al(1995)Hum.Reprod.10:3102−3106;Recombinant Human FSH study Group(1995)Fertil.Steril.63:77−86;Prevost,R.R.(1998)Pharmacotherapy 18:1001−1010]。
【0148】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するヒトhFSH中のペプチド配列は以下の通りである:
【0149】
【表33】
(実施例16(リシンA))
本発明は、1個または複数のT細胞エピトープが除去されたリシン毒素A鎖(RTA)の修飾形を提供する。リシンは本来トウゴマの種子から分離された細胞毒素で、タイプIIリボソーム不活性化タンパク質(RIP)の例である。天然に存在する成熟タンパク質は、262個のアミノ酸残基を有するリシンB鎖とジスルフィド結合している267個アミノ酸残基のRTAを含むヘテロダイマーである。B鎖はガラクトシドへの結合親和性を有するレクチンである。天然のタンパク質はB鎖によって細胞を結合することができ、エンドサイトーシスによって細胞内に入る。細胞内では、ジスルフィド結合の還元によってRTAはB鎖から開放され、未知のメカニズムによって細胞質へエンドソームから放出される。細胞質では、毒素はN−グリコシラーゼ特異的作用によってリボソームを分解し、タンパク質翻訳および細胞死の停止を急激にもたらす。特定の細胞集団の除去が必要な場合、RTAおよび他のRIPの極端な細胞毒性が癌および他の疾病を治療するための実験的治療で使用されるようになっている。RTAと結合した抗体分子を含む免疫毒分子が生産され、多数の治験で使用されている[Ghetie,M.A.et al(1991)Cancer Res. 51:5876−5880;Vitetta,E.S.et al(1991)Cancer Res.51:4052−4058;Amlot,P.L.et al(1993)Blood 82:2624−2633;Conry,R.M.et al(1995)J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.18:231−241;Schnell,R.et al(2000)Leuckaemia 14:129−135]。免疫毒において、抗体領域は所望の標的細胞の表面に結合し、RTAへは化学的な架橋によりまたは組換え融合タンパク質として結合し得る。
【0150】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するリシン毒素鎖中のペプチド配列は以下の通りである:
【0151】
【表34】
(実施例17(脂肪細胞補体関連タンパク質(adipocyte complement−related protein))
本発明は、1個または複数のT細胞エピトープが除去されたヒトまたはマウスAcrp30の修飾形に提供する。Acrp30はおよそ30kDaの豊富に存在する血清タンパク質であり、もっぱら脂肪細胞内で発現する[Scherer,P.E.et al(1995)J.Biol.Chem.270:26746−26749]。ヒトの遺伝子Acrp30タンパク質配列は、例えば、米国特許第5,869,330号において開示されている。タンパク質の分泌はインシュリンによって増強され、タンパク質量は肥満対象において減少する。タンパク質は、エネルギーバランスの調節、特に脂肪酸代謝の調節に関わる。開裂されたN−末端シグナル、他のタンパク質への認識された相同性を有しない領域、コラーゲン様領域および球状領域を含む4つの配列領域が、マウスおよびヒトのタンパク質中で識別されている。球状領域はプロテアーゼ処理によってマウスタンパク質から取り除かれ、gAcrp30を生じ得る。マウスgAcrp30製剤は医薬特性を有し、高脂肪給餌の投与または脂肪のi.v注入後におけるマウス血清中の増加した遊離脂肪酸量を減少させることが示された[Fruebis,J.et al(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2005−2010]。
【0152】
潜在的なマウスMHCクラスII結合活性を有するマウスAcrp30中のペプチド配列は以下の通りである:
【0153】
【表35】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するヒトAcrp30中のペプチド配列は以下の通りである:
【0154】
【表36】
(実施例18(抗C5抗体))
本発明は、ヒトのC5補体タンパク質に対する特異的結合性を有するモノクローナル抗体の修飾形を提供する。本発明は1個または複数のT細胞エピトープが除去された修飾された抗体を提供する。C5補体タンパク質に対する結合特異性を備えた抗体は、C5転換酵素の開裂活性化をブロックし、それにより、炎症誘発性(pro−inflammatory)成分C5aおよびC5b−9の生産を阻害する。
【0155】
補体システムの活性化は、多数の急性・慢性疾患の病因において重要な寄与をする因子であリ、また、C5レベルにおける補体カスケードの阻害は、これらのうちのいくつかについて治療手段としての大きな可能性を提示する[Morgan B.P.(1994)Eur.J.Clin.Invest.24:219−228]。多数の抗C5抗体およびそれらを治療用途において使用する方法は当技術分野において記載されている[Wurzner R.et al(1991)Complement Inflamm.8:328−340;Thomas,T.C.et al(1996)Molecular Immunology 33:1389−14012;米国特許第5,853,722号;米国特許第6,074,64号]。5G1.1と呼ばれる抗体[上掲Thomas,T.C.et al(1996)]および単一鎖ヒト化変異体は、心肺のバイパスや慢性関節リウマチを含む多数の疾病症状に対する治験が進行中である[Fitch,J.C.K.et al(1999)Circulation 100:2499−2506]。本発明は、5G1.1[上掲Thomas,T.C.et al]と呼ばれる抗C−5抗体内に識別された配列を開示する。開示された配列は、MHCクラスII結合可能性の故に潜在的なT細胞エピトープである抗体配列の軽鎖および重鎖の両方の可変領域に由来する。開示は、さらに単一鎖および「ヒト化された」5G1.1抗体変異体[上掲Thomas,T.C.et al(1996)]のタンパク質配列内の潜在的なエピトープを識別する。
【0156】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有する抗体5G1.1の重鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである:
【0157】
【表37】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有する抗体5G1.1の軽鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである:
【0158】
【表38】
(実施例19(抗CD20抗体))
本発明は、ヒトのCD20抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体の修飾形を提供する。CD20は、B細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)の90%以上を含むB細胞前駆体および成熟B細胞上で発現するB細胞特異的表面分子である。CD20のモノクローナル抗体および放射免疫コンジュゲートの標的はNHLの新しい治療法として出現した。顕著な例としてはモノクローナル抗体2B8[Reff,M.E.et al(1994)Blood 83:435−445]およびB1[米国特許第6,090、365号]が含まれる。2B8の可変領域がクローン化され、ヒト定常領域と組み合わされてC2B8と呼ばれるキメラ抗体が製造されており、これはアメリカではRituxan(商標)として[米国特許第5,776,456号]、またヨーロッパではMabThera(登録商標)(rituximab)として市場に出ている。C2B8はNHLおよび他のB細胞疾患の治療に有益な治療剤として認められている[Maloney,D.G.et al(1997)J.Clin.Oncol.15:3266−3274;Maloney,D.G.et al(1997)Blood 90:2188−2195]。B1抗体は、NHL治療剤として同様に使用のための登録が達成されているが、この事例では、分子(Bexxar(商標))は131I放射免疫コンジュゲートである。もっとも、本来の(コンジュゲート化されていない)抗体は、リンパ腫および難治白血病の治療のための自己由来の骨髄移植治療法のためにex vivoで有用性を有する[Freedman,A.S.et al(1990),J.Clin.Oncol.8:784]。C2B8(rituximab)およびBexxar(商標)のような抗体の成功にもかかわらず、増強された特性を有する抗CD20類似体は今なお必要とされている。
【0159】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有する抗体2B8の重鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである:
【0160】
【表39】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有する抗体2B8の軽鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである:
【0161】
【表40】
(実施例20)
本発明は、ヒトのIL−2レセプターに対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体の修飾形を提供する。モノクローナル抗体は抗Tacと呼ばれ、修飾形では1個または複数のT細胞エピトープが除去されている。抗Tac抗体は、TおよびBのリンパ細胞の表面上で発現されるヒト高親和性IL−2レセプターのアルファサブユニット(p55−アルファ、CD25またはTac)に高い特異性をもって結合する。抗体結合は、IL−2がレセプターを結合し、T細胞活性化を達成する能力を阻害する。抗Tac抗体がIL−2アンタゴニストとして働く能力は、器官移植拒絶の治療において重要な臨床的可能性を有する。マウス抗体を使用する臨床的研究では、患者において高い割合でHAMA応答が生じるため、従来の免疫抑制剤を上回る長期の効果は期待されていないが、腎臓移植を経験した患者には当初ある程度有益であった[Kirkham,R.L.et al (1991)Transplantation 51:107−113]。タンパク質のかなりの部分がヒトの抗体遺伝子から識別されたタンパク質配列を含むように組換えられた「ヒト化された」抗Tac抗体が開発されている[Queen,C.et al(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86:10029−10033;米国特許第5,530,101号;米国特許第5,585,089号;米国特許第6,013,256号]。「ヒト化された」抗Tac(Zenapax(商標)またはダクリズマブ(daclizumab))は、腎臓移植拒絶の抑制および急性移植片対宿主病の管理のための免疫抑制剤として治験を受けてきた[Anasetti,C.et al(1994),Blood 84:1320−1327;Anasetti,C.et al(1995)Blood 86:Supplement 1:62a;Eckhoff,D.E.et al(2000)Transplantation 69:1867−1872;Ekberg,H.et al(1999)Transplant Proc.31:267 268]。
【0162】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するマウス抗−Tac抗体の重鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである:
【0163】
【表41】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するマウス抗−Tac抗体の軽鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである:
【0164】
【表42】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するヒト化抗−Tac抗体の重鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである:
【0165】
【表43】
潜在的なヒトMHCクラスII結合活性を有するヒト化抗−Tac抗体の軽鎖可変領域内のペプチド配列は以下の通りである:
【0166】
【表44】
(実施例21(14.18抗体))
特に断らない限り、可変重鎖および軽鎖中のアミノ酸はすべてKabatら(1991年)(免疫学的に興味のあるタンパク質の配列、米国保健福祉省)に従ってナンバリングしている。潜在的なT細胞エピトープは、エピトープの最初のアミノ酸を重鎖および軽鎖の最初のアミノ酸から線状に数えて番号を付けている。
【0167】
1.マウス・サブグループフレームワークとの比較
マウス14.18のVH(重鎖)およびVK(軽鎖)のアミノ酸配列を、Kabatマウス重鎖および軽鎖サブグループ(Kabat et al.,1991)についてコンセンサス配列と比較した。14.18VHはマウス重鎖サブグループII(A)に割り当てることができる。14.18VHの配列を配列番号1に示す。このサブグループについてのコンセンサス配列との比較は、位置81でのヒスチジン(通常グルタミン)、位置82aでのリジン(通常セリンまたはアスパラギン)、位置93でのバリン(通常アラニン)および位置94でのセリン(通常アルギニン)がこのサブグループについて異常(atypical)であることを示す。位置19、40および66での残基もこのサブグループではしばしば見出されるが、抗体結合および構造への影響は小さいと考えられる。14.18VKはマウスカッパ鎖サブグループIlに割り当てることができる。このサブグループについてコンセンサス配列との比較は、位置49のヒスチジンがこのサブグループでは異常なことを示す。この残基は最も普通にはチロシンである。
【0168】
2.ヒトフレームワークとの比較
マウス14.18VHおよびVKのアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系VH(Tomlinson et al.,J.Mol.Biol.,(1992)227:776−798)のディレクトリーの配列およびVK(Cox et al.,Eur.J.Immunol.1994,1−4−:827−836)配列、そしてさらにヒト生殖細胞系J領域配列(Routledge et al.,In「Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man」,Clark,M.ed.Academic Titles,Nottingham,UK,pp13−44,1993)と比較した。14.18VHに対し選択される参照ヒトフレームワークは、ヒトJH6を有するDP25とした。この生殖細胞系配列は、アミノ酸が変更されていない再配置された成熟抗体遺伝子中に見出された。フレームワーク3としては、成熟したヒト抗体29の配列を用いた。この配列は、CDR3の直近に隣接しているマウス配列と同一である。14.18VKに対し選択される参照ヒトフレームワークは、DPK22とした。この生殖細胞系配列は、アミノ酸が変更されていない再配置された成熟抗体遺伝子中に見出された。フレームワーク2としては、成熟したヒト抗体163.5配列を使用した。この配列は、CDR2の直近に隣接しているマウス配列と同一である。J領域配列はヒトJK2とした(Routledge et al.,1993)。
【0169】
3.「張り合わせ」配列の形成
参照ヒトフレームワーク配列の識別に続いて、14.18VHおよびVKフレームワーク内の一定の異なったアミノ酸残基を、ヒト参照フレームワーク配列の対応するアミノ酸に変更した。抗体構造および結合のために重要と考えられる残基はこの方法では除外し変更しなかった。この段階で保持されたマウス残基は大部分、非表面性の埋没残基で、例えばN−末端の残基(これは最終抗体のCDRに近い)から離れている。この方法により、表面の残基が主としてヒト性となり埋没残基が元のマウス配列内となるので「張り合わせ」(「veneered」)抗体に広く類似した配列を生じる。
【0170】
4.ペプチドスレッディング分析
マウスおよび張り合わせ14.18VHおよびVK配列を本発明による方法を用いて分析した。アミノ酸配列はすべての可能な13merに分割する。引き続いて、13merペプチドをHLA−DRアロタイプ結合溝モデルに提示し、各対立遺伝子について各ペプチドに対し結合スコアを割り当てる。ペプチドの各ポケット結合側鎖についてコンホメーションスコアを計算する。このスコアは立体的な重なり、結合溝内のペプチドと残基間に起こり得る水素結合、ペプチドとポケット残基の間の静電的相互作用および優先的な接触に基づく。次いで、各側鎖のコンホメーションを変更し、スコアを再計算する。最も高いコンホメーションスコアを決定し、次いで、結合溝疎水性残基、非溝の親水性残基、および結合溝に嵌まり込む残基の数に基づいて結合スコアを計算する。NMCクラスIIに知られている結合剤は、ほとんど偽陰性のない高い結合スコアを達成する。したがって、この分析で重要な結合スコアを達成するペプチドは潜在的なT細胞エピトープであると考えられる。ペプチドスレッディング分析の結果を、マウスおよび張り合わせ配列について表1に示す。
【0171】
【表45】
5.潜在的なT細胞エピトープの除去
エピトープを構成する特定のペプチドにおいてアミノ酸置換を行うことにより潜在的なT細胞エピトープを除去する。置換は、可能な場合には同様の物理化学的特性のアミノ酸を挿入することにより行った。しかし、いくつかの潜在的なエピトープを除去するために、異なる大きさ、電荷または疎水性のアミノ酸に置換する必要があってもよい。結合に影響を及ぼし得るCDR内で変更を行う必要がある場合には、特定のアミノ酸置換を伴うまたは伴わない変異体を作る必要がある。置換するアミノ酸残基の線形的な番号は、Kabat番号に従い括弧内に示す。潜在的なT細胞エピトープは、13merの最初の残基の線形的な番号によって示す。
【0172】
張り合わせ14.18重鎖可変領域からT−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった:
1.残基41(Kabat番号41)のプロリンをイソロイシンに置換し、CDR2の残基50のアラニンのロイシンへの置換と組み合わせることで、残基番号43における潜在的なエピトープが除去される
2.(1)に代えて、残基45(Kabat番号45)のロイシンをトレオニンに、および残基41(Kabat番号41)のプロリンを置換することで、位置43における潜在的なエピトープが除去される
3.CDR2の残基66(Kabat番号65)のグリシンをセリンに置換し、残基68(Kabat番号67)のアラニンをバリンに置換することで、位置58における潜在的なエピトープが除去される。セリンはヒトおよびマウス抗体配列の位置に見出される
4.残基70(Kabat番号69)のロイシンをイソロイシンに置換することで、位置62における潜在的なエピトープに結合するMHCアロタイプの数が11から4に低減される
5.残基72(Kabat番号71)のバリンをアラニンに置換することで、位置62における潜在的なエピトープが除去される。この位置におけるアミノ酸の大きさは重要であり、アラニンはバリンと大きさおよび疎水性の点で類似している
6.残基91(Kabat番号87)のセリンをトレオニンに置換することで、位置81および84における潜在的なエピトープが除去される。
【0173】
張り合わせ14.18軽鎖可変領域から潜在的なT−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった:
1.残基32(Kabat番号27e)のアルギニンをセリンに置換することで、位置27における潜在的なエピトープが除去される。この残基はCDR2内にあるが、セリンはしばしばマウスおよびヒト抗体においてtWs位置に見出される。CDR外で潜在的なエピトープを除去する変更はない
2.残基54(Kabat番号49)のヒスチジンをチロシンに置換することで、位置43における潜在的なエピトープが除去される。チロシンはマウスおよびヒト抗体において位置49に最も高頻度に見出されるアミノ酸である
3.位置43における潜在的なエピトープを除去するため、(2)に代えて、残基51(Kabat番号46)のロイシンをメチオニンに置換する。メチオニンはロイシンと大きさおよび疎水性の点で類似している
4.残基88(Kabat番号83)のロイシンをメチオニンに置換することで、位置86における潜在的なエピトープが除去される
5.CDRH3において残基102(Kabat番号96)のロイシンをトレオニンに置換し、この際に残基105(Kabat番号100)のグリシンのグルタミンへの組み合わせにより、位置97における潜在的なエピトープに結合するMHCアロタイプの数が11から5に低減される
6.位置97における潜在的なエピトープを除去するため、(5)に代えて、残基102(Kabat番号96)のロイシンをプロリンに置換する
7.残基110(Kabat番号104)のロイシンをバリンに置換することで、位置100における潜在的なエピトープが除去される。
【0174】
6.脱免疫配列の設計
脱免疫された重鎖および軽鎖配列を、潜在的なT細胞エピトープの除去に必要な変更を参考とし、また抗体構造および結合に肝要と思われるフレームワーク残基を考慮して設計した。張り合わせ配列に基づく脱免疫配列に加え、マウス配列に基づくVHおよびVKそれぞれについて追加的な配列を設計し、マウスペプチドのスレッディング(MoPT)変型(version)と名付けた。この変型については、T−細胞エピトープを除去するためにマウス配列に直接変更を行ったが、結合に有害であると考えられないCDR外の変更のみである。この脱免疫配列変型では表面(B−細胞)エピトープを除去する試みは行わなかった。
【0175】
この主要な脱免疫化VHは、上記第5項における1,3,4,5および6の置換を含み、潜在的T細胞エピトープは含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するために、さらに4個の脱免疫化VHSを設計した。変型2は、同じ潜在的T細胞エピトープを別の置換(上記2.5節の2)で除去した変型1の代替物である。主要な脱免疫化配列(14.18DIVH1)に行われた累積的な変更および残っている潜在的なT細胞エピトープを表2に詳しく示す。マウススレッディド変型を、比較のために含む。
【0176】
【表46】
主要な脱免疫化VKは、上記第5項の置換1,2,4,6および7を含む。主要な脱免疫化VKは、潜在的なT細胞エピトープは含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するためさらに5個の脱免疫化VKSを設計した。変型2は、位置43の潜在的T細胞エピトープを別の置換を用いて除去した変型1の代替物である。変型3は、別の置換(上記2.5節の6)で除去した代替物であり、位置97における潜在的なエピトープに結合するMHCアロタイプの数が11から5に低減する。主要な脱免疫化配列(14.18DIVK1)に行われた累積的な変更および残っている潜在的なT細胞エピトープを表3に詳しく示す。
【0177】
【表47】
修正エピトープ変型の配列:
【0178】
【表48】
【0179】
【表49】
(実施例22(KS抗体))
1.マウスサブグループフレームワークとの比較
マウスKS VHおよびVKのアミノ酸配列を、Kabatマウス重鎖および軽鎖サブグループ(Kabat、1991年)についてのコンセンサス配列と比較した。マウスKS VHはサブグループのいずれにも割り当てることができないが、サブグループII(A)およびV(A)に近似している。異常な残基は、通常はバリンである位置2、通常グルタミン酸である46、通常トレオニンである68に見出される。残基69はより一般的にはロイシンまたはイソロイシンである。82bでは、セリンが最もしばしば見出される。マウスKS VKはサブグループVI(「図2」に割り当てることができる。異常な残基は、一般には両方ともロイシンである46および47に見出される。残基58は異常である、この位置で通常見出されるのはロイシンまたはバリンのいずれかである。
【0180】
2.ヒトフレームワークとの比較
マウスKS VHおよびVKのアミノ酸配列をヒト生殖細胞系VH(Tomlinson et al、1992年)およびVK(COX et al、1994)配列ディレクトリ、およびさらにヒト生殖細胞系J領域配列(Routledge et al、1993年)配列と比較した。KS VHに対して選択される参照ヒトフレームワークはヒトJH6を有するDP10とした。この生殖細胞系配列は、アミノ酸変更を持たない再配置された成熟抗体遺伝子で見出される。KS VKに対して選択される参照ヒトフレームワークはB1とした。フレームワーク−2としては、成熟したヒト抗体IMEV配列を使用した(Kabat et al、1991における)。この配列は、CDR2の直近に隣接しているマウス配列と同一である。J領域配列はヒトJK4とした。この生殖細胞系配列は再配置された成熟抗体軽鎖としては見つかっていない。
【0181】
3.「張り合わせ」配列の形成
参照ヒトフレームワーク配列の識別に続いて、425VHおよびVKフレームワーク内の一定の異なったアミノ酸残基を、ヒト参照フレームワーク配列の対応するアミノ酸に変更した。抗体構造および結合のために重要と考えられる残基はこの方法では除外し変更しなかった。この段階で保持されたマウス残基は大部分、非表面性の埋没残基で、例えばN−末端の残基(これは最終抗体中のCDRに近い)から離れている。この方法により、表面の残基が主としてヒト性となり埋没残基が元のマウス配列内となるので「張り合わせ」(「veneered」)抗体に広く類似した配列を生じる。
【0182】
4.ペプチドスレッディング分析
マウスおよび張り合わせKS VHおよびVK配列を本発明による方法を用いて分析した。アミノ酸配列はすべての可能な13merに分割する。引き続いて、13merペプチドをHLA−DRアロタイプ結合溝モデルに提示し、各対立遺伝子について各ペプチドに対し結合スコアを割り当てる。ペプチドの各ポケット結合側鎖についてコンホメーションスコアを計算する。このスコアは立体的な重なり、結合溝内のペプチドと残基間に起こり得る水素結合、ペプチドとポケット残基の間の静電的相互作用および優先的な接触に基づく。次いで、各側鎖のコンホメーションを変更し、スコアを再計算する。最も高いコンホメーションスコアを決定し、次いで、結合溝疎水性残基、非溝の親水性残基、および結合溝に嵌まり込む残基の数に基づいて結合スコアを計算する。MHCクラスIIに対する既知の結合剤であるペプチドは、ほとんど偽陰性のない高い結合スコアを達成する。したがって、この分析でかなりの結合スコアを達成するペプチドは潜在的なT細胞エピトープであると考えられる。マウスおよび張り合わせ配列のためのペプチドスレッディング分析の結果を表1に示す。
【0183】
【表50】
5.潜在的なT細胞エピトープの除去
エピトープを構成する特定のペプチドにおいてアミノ酸置換を行うことにより潜在的なT細胞エピトープを除去する。置換は、可能な場合には同様の物理化学的特性のアミノ酸を挿入することにより行った。しかし、いくつかの潜在的なエピトープを除去するために、異なる大きさ、電荷または疎水性のアミノ酸に置換する必要があってもよい。結合に影響を及ぼし得るCDR内で変更を行う必要がある場合には、特定のアミノ酸置換を伴うまたは伴わない変異体を作る必要がある。置換するアミノ酸残基の番号付けは、Kabatに従う。潜在的なT細胞エピトープは、13merの最初の残基の線形的な番号によって示す。
【0184】
張り合わせKS重鎖可変領域からT−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった:
1.残基38(Kabat番号38)のリジンをアルギニンに置換することで、残基番号30における潜在的なエピトープが除去される
2.残基72(Kabat番号71)のロイシンをアラニンに、および残基70(Kabat番号69)のフェニルアラニンをイソロイシン置換することで、残基番号62における潜在的なエピトープが除去される。Kabat番号69のイソロイシンおよびKabat番号71のアラニンは、ヒト生殖細胞系 VH配列DP10に見出される
3.残基79(Kabat番号78)のアラニンをロイシンに置換することで、残基番号78における潜在的なエピトープが除去される
4.残基91(Kabat番号87)のメチオニンをトレオニンに置換することで、残基番号89における潜在的なエピトープが除去される
5.CDRH3において、イソロイシン残基100(Kabat番号96)をメチオニンに置換することで、残基番号98における潜在的なエピトープが除去される。CDRH3外にはこの潜在的なエピトープを除去する変更はない。
【0185】
張り合わせKS軽鎖可変領域から潜在的なT−細胞エピトープを除去するために必要なアミノ酸置換は、以下の通りであった:
1.残基32(Kabat番号33)のメチオニンをイソロイシンに置換することで、残基番号27における潜在的なエピトープが除去される。この残基はCDR2の内にある。イソロイシンはヒト抗体で一般にこの位置に見出される
2.残基(Kabat番号3)のロイシンをバリンに置換することで、位置1の残基における潜在的なエピトープが除去される
3.残基59(Kabat番号60)のアラニンをセリンに置換することで、残基番号51における潜在的なエピトープが除去される。
【0186】
6.脱免疫配列の設計
脱免疫された重鎖および軽鎖領域配列を、潜在的なT細胞エピトープの除去に必要な変更を参考とし、また抗体構造および結合に肝要と思われるフレームワーク残基を考慮して設計した。張り合わせ配列に基づく脱免疫配列に加え、マウス配列に基づくVHおよびVKそれぞれについて追加的な配列を設計し、マウスペプチドのスレッディング(MoPT)変型(version)と名付けた。この変型については、T−細胞エピトープを除去するためにマウス配列に直接変更を行ったが、結合に有害であると考えられないCDR外の変更のみである。この脱免疫配列変型では表面(B−細胞)エピトープを除去する試みは行わなかった。主要な脱免疫化VHは、上記第5項の置換1〜5を含み、さらに残基43(Kabat番号43)の変更を含む。マウス配列に見られるリジンでヒトフレームワーク由来のグルタミンを置き換えた。リジンは正電荷を持ち、したがってグルタミンとは著しく異なる。この領域はVH/VL接点を含んでもよい。主要な脱免疫VHは潜在的なT細胞エピトープを含まない。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するためさらに4個の脱免疫化VH配列を設計した。主要な脱免疫化配列(KSDIVHv1)に行われた累積的な変更および残っている潜在的なT細胞エピトープを表2に詳しく示す。
【0187】
【表51】
主要な脱免疫化VKは、上記第5項の置換1〜3を含む。必要な様々な置換の抗体結合に対する影響を試験するためさらに3個の脱免疫化VK配列を設計した。主要な脱免疫化配列(KSDIVKv1)およびに行われた累積的な変更および残っている潜在的なT細胞エピトープを表3に詳しく示す。
【0188】
【表52】
修飾されたエピトープ変型の配列:
【0189】
【表53】
【0190】
【表54】
【図面の簡単な説明】
【0191】
【図1】本発明の計算方法の1つの態様を示すフローチャートである。
【図2】本発明を実施する計算方法のためのデータベース生成を示すフローチャートである。
【図3】潜在的なT細胞エピトープ用のペプチドのプロファイルを描くためにデータベース問合せ(database interrogation)を示すフローチャートである
【図4】本発明の計算方法を示す別のフローチャートである。
【図5】グルタミン酸デカルボキシラーゼ(MW:65000)アイソフォーム(GAD 65)のT−細胞エピトープ見込み指数(T−cell epitope likelihood index)対アミノ酸残基座標(位置)のプロットである。
【図6】エリスロポエチン(EPO)についてのT−細胞エピトープ見込み指数対アミノ酸残基座標(位置)のプロットである。
【図7】ヒト化された抗A33モノクローナル抗体軽鎖についてのT−細胞エピトープ見込み指数対アミノ酸残基座標(位置)のプロットである。
【図8】ヒト化された抗A33モノクローナル抗体重鎖についてのT−細胞エピトープ見込み指数対アミノ酸残基座標(位置)のプロットである。
Claims (21)
- インビトロまたはインシリコ技術を用いるか、または生物アッセイを用いてペプチドのMHC分子への結合を測定することを含むステップにより、生物学的分子のアミノ酸配列内の1つまたは複数の潜在的なT細胞エピトープペプチドを識別するのに適した方法であって、前記方法が次のステップ:
(a)公知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること;
(b)選択された領域から少なくとも3つのアミノ酸残基によって構成される所定の一定サイズの重複するアミノ酸残基セグメントを連続して採取すること;
(c)前記採取されたアミノ酸残基セグメント中に存在する疎水性のアミノ酸残基側鎖各々に対し割り当てられた値を合計することにより、前記採取されたセグメントの各々について、MHCクラスII分子結合スコアを計算すること;および
(d)そのセグメントについて計算されたMHCクラスII分子結合スコアに基づいて、採取されたセグメントのうち修飾に適した少なくとも1つを識別し、実質的にペプチドの治療上の有用性を低減させずにペプチドに対するMHCクラスII結合総合スコアを変更すること
を含む方法。 - ステップ(c)を、12−6ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンドコンホメーション(ligand conformational)エネルギー項を含むように修正されたベームスコアリング関数(Boehm scoring function)を用い、
(1)MHCクラスII分子モデルの第1のデータベースを提供すること;
(2)前記MHCクラスII分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第2のデータベースを提供すること;
(3)前記第1のデータベースからモデルを選択すること;
(4)前記第2のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること;
(5)採取された各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること;
(6)採取された各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること;および
(7)場合によっては、前記各モデルと各骨格についてステップ(1)〜(5)を繰り返すことによって実行する、請求項1に記載の方法。 - 各芳香族側鎖に割り当てられる値が、各疎水性脂肪族側鎖に割り当てられる値の約2分の1である請求項1または2に記載の方法。
- 採取されるアミノ酸残基セグメントが13個のアミノ酸残基によって構成されている請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 連続的な採取されるアミノ酸残基セグメントが1〜5個のアミノ酸残基で重複している請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 連続的な採取されるアミノ酸残基セグメントが互いに実質的に重複している請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 連続的な採取されるアミノ酸残基セグメントが1個のアミノ酸残基以外重複している請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 親分子から誘導される免疫原性において修飾された生物学的分子の製造方法であって、修飾された分子は前記親分子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有しており、所与の種の免疫系に曝された時、親分子に比較して低減された免疫原性を示し、該方法は;(i)親生物学的分子またはその一部のアミノ酸配列を決定すること;(ii)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドのMHC分子への結合を測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の1個または複数の潜在的なT細胞エピトープを識別すること;(iii)T細胞エピトープ配列の活性または数および/または前記生物学的分子から誘導されるペプチドを結合することができるMHC分子アロタイプの数(これらはインビトロもしくはインシリコ技術を用いるか生物アッセイを用いてペプチドをMHC分子に結合させることにより、またはペプチド−MHC複合体をT細胞に結合させることにより測定される)を実質的に低減するか除去するように修飾して、本来識別されたT細胞エピトープ配列内の少なくとも1個のアミノ酸残基を変更することにより新規な配列変異体を設計すること;(iv)組換えDNA技術によってそのような配列変異体を構成し、所望の特性を備えた1つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること;および(v)場合によってはステップ(ii)〜(iv)を繰り返すことを含み、ここで、ステップ(ii)によるT細胞エピトープ配列の識別が請求項1〜7のいずれかに特定される方法によって達成されるものであることを特徴とする方法。
- 本来存在するT細胞エピトープ配列のいずれかにおいて、1〜9個のアミノ酸残基が変更される請求項8に記載の方法。
- 本来存在するT細胞エピトープ配列のいずれかにおいて、1個のアミノ酸残基が変更される請求項9に記載の方法。
- アミノ酸の変更が、同族体タンパク質配列に関して行われる請求項8に記載の方法。
- アミノ酸の変更が、インシリコモデリング技術に関して行われる請求項8に記載の方法。
- アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、付加または欠失させるものである請求項8から12のいずれかに記載の方法。
- 前記生物学的分子の生物活性を回復するために、さらに一層の変更が行われる請求項8から13のいずれかに記載の方法。
- さらに一層の変更が特定のアミノ酸の置換、欠失または付加により行われる請求項14に記載の方法。
- 免疫原性が低減されたポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体またはその断片を調製するための請求項8から15のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質または抗体が以下の群:
(a)モノクローナル抗体
抗−40kD糖タンパク質抗原抗体KS 1/4、
抗GD2抗体14.18
抗−Her2抗体4D5(マウス)およびヒト化された変型(Herceptin(登録商標))、
抗−IL−2R(抗−Tac)抗体(Zenapax(登録商標))、
抗−CD52抗体(CAMPATH(登録商標))、
抗−CD20抗体(C2B8、Rituxan(登録商標);Bexxar(登録商標))、
ヒトのC5補体タンパク質に向けられた抗体
(b)ヒトタンパク質
sTNF−R1、sTNF−R2、sTNFR−Fc(Enbrel(登録商標))、
タンパク質C、acrp30、リシンA、CNTFRリガンド
スブチリシン、GM−CSF、ヒト卵胞刺激ホルモン(h−fsh)
β−グルコセレブロシダーゼ、GLP−1、アポリポタンパク質A1、
から選択される請求項16に記載の方法。 - 請求項1から17のいずれかに記載の方法によって得られ、親と異なるアミノ酸配列を有し、所与の生物種の免疫系に曝された時、親分子に比較して低減された免疫原性を示す、親分子から誘導される免疫原性の修飾された生物学的分子。
- 請求項1から7のいずれかに記載の方法により識別された免疫原性の修飾されていない生物学的親分子のアミノ酸配列内にある潜在的T細胞エピトープの、低減された免疫原性を有するが、所望の生物活性は維持されている生物学的分子の製造のための使用。
- 前記T細胞エピトープが13merペプチドである請求項19に記載の潜在的T細胞エピトープ配列の使用。
- 修飾されていない親分子と比較して免疫原性が低減され、生物活性を有する生物学的分子を調製するための、請求項19に特定される13mer T細胞エピトープの少なくとも9個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド配列の使用。
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