KR20120030383A - 변형된 ＦｃＲｎ 결합 자리를 갖는 항체 융합 단백질 - Google Patents

변형된 ＦｃＲｎ 결합 자리를 갖는 항체 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

변형된 FcRn 결합 자리를 갖는 항체 융합 단백질 및 이를 인코딩하는 핵산 분자가 개시된다. 항체 융합 단백질은 2 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 이때 제 1 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상에 연결되는 생물학적으로, 바람직하게는 치료학적으로 활성인 분자를 포함한다. 제 2 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함한다. 폴리펩티드 사슬 중 하나는, FcRn 결합의 감소 또는 손실을 야기하나 상기 항체 융합 단백질의 혈청 반감기의 상당한 감소를 야기하지는 않는, 불변 부위에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 각각 구축된 Fc-IFNβ 분자에 관한 것이다. 또한, 상기 융합 단백질의 제조 방법 및 상기 융합 단백질의 투여에 의해 경감되는 질환 및 병태의 치료를 위한 융합 단백질의 사용 방법이 개시된다.

Description

변형된 ＦｃＲｎ 결합 자리를 갖는 항체 융합 단백질{ANTIBODY FUSION PROTEINS WITH MODIFIED FCRN BINDING SITES}
본 발명은 변형된 FcRn 결합 자리를 갖는 항체 융합 단백질 및 이를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 항체 융합 단백질은 2 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 이때 제 1 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상에 연결된 생물학적으로, 바람직하게는 치료학적으로 활성인 분자를 포함한다. 제 2 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함한다. 폴리펩티드 사슬 중 하나는, FcRn 결합의 감소 또는 손실을 야기하나 상기 항체 융합 단백질의 혈청 반감기의 상당한 감소를 야기하지 않는 불변 부위에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 각각 구축되는 Fc-IFNβ 융합 단백질에 관한 것이다.
관심 단백질을 면역글로불린 불변 부위에 연결하는 항체 융합 단백질은 면역글로불린 부분의 존재와 연계된 이점뿐 아니라 연결된 단백질의 생물학적 활성 둘 다를 가진다. 그러한 융합 단백질의 창조는 관심 단백질의 효율적인 생산 및 분비를 보장하는데 도움이 된다. 더욱이, 이들 융합 단백질은 종종 현저한 치료학적 이점인 증가된 순환 반감기와 같은 신규한 특성을 나타낸다.
성인 포유동물에서, FcRn (신생아 Fc 수용체로도 공지되어 있음) 은, 분해 (degradation) 로부터 IgG 아이소타입의 항체에 결합하고 이를 인양하는 보호성 수용체로서 작용함으로써 혈청 항체 수준을 유지하는데 핵심 역할을 한다. IgG 분자는 내피 세포에 의해 세포내흡수되고, 이들이 FcRn 에 결합하는 경우, 순환으로 재활용된다. 대조적으로, FcRn 에 결합하지 않는 IgG 분자는 세포로 들어가고 이들이 분해되는 라이소좀 경로로 향하게 된다. His435 가 알라닌으로 돌연변이된 IgG1 변이체는 FcRn 결합의 선택적 손실을 야기하고 혈청 반감기를 현저하게 감소시킨다 (Firan et al., 2001, International Immunology 13:993).
IgG 분자의 Fc 부분은 2 개의 동일한 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 각 폴리펩티드 사슬은 이의 FcRn 결합 자리를 통해 단일 FcRn 분자와 맞물리게 된다 (Martin et al., 1999, Biochemistry 38:12639). 이전 연구는 각 Fc 부분이 혈청 지속을 위해 둘 다의 FcRn 결합 자리를 요구함을 나타낸다. 야생형 FcRn-결합 폴리펩티드 사슬 및 돌연변이된 비-FcRn-결합 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종이량체성 Fc 단편은 동종이량체성 야생형 Fc 단편과 비교하여 현저히 감소된 혈청 반감기를 갖는다 (Kim et al ., 1994, Scand . J. Immunol . 40:457-465). 오직 하나의 FcRn 결합 자리를 포함하는 그러한 이종이량체성 Fc 단편은 동종이량체성 야생형 Fc 단편보다 덜 효율적으로 재활용되고 분해를 위해 우선적으로 라이소좀으로 수송된다 (Tesar et al., 2006, Traffic 7:1127). 이들 관측은 IgG 항체 또는 이들의 Fc 부분을 포함하는 FcRn 결합 파트너를 포함하는 치료학적으로 유효한 적용에 직접적으로 관계된 것이다. 예를 들어 미국 특허 제 7,348,004 호는, 구체적으로 온전한 FcRn 결합을 요구하거나, 심지어는 증가된 혈청 반감기 및 증강된 생물학적가용능과 같은 이의 향상된 생물학적 특성을 위해 증강된 FcRn 결합을 요구하는 융합 단백질을 기재하고 있다.
보다 최근의 연구에서는 식세포에서의 FcRn 발현이 확인되었고 IgG-매개 식세포작용에서 FcRn 의 신규한 역할을 제시하고 있다 (Vidarsson et al., 2006, Blood 108:3573). IgG-옵소닌화된 병원체는 FcRn 에 의해 식포로 세포내함입되고 (internalization), 식세포에 의한 섭식 및 파괴를 위해 항원을 표지하기 위한 유효 수단을 제공한다. H435A 돌연변이를 갖는 IgG1 변이체는 현저하게 감소된 옵소닌화 활성을 나타낸다.
발명의 개요
본 발명은 FcRn 결합을 감소시키거나 제거하는 항체 융합 단백질의 구성성분인 면역글로불린 불변 부위 폴리펩티드 사슬 중 하나에서 돌연변이를 갖는 항체 융합 단백질이 돌연변이를 갖지 않는 상응하는 융합 단백질에 비해 필적할만한 생물학적 특성, 예컨대 연장된 순환 반감기를 나타내는 놀라운 발견에 부분적으로 기초하고 있다. 더욱이, IgG-매개 식세포작용에서 FcRn 의 주어진 역할은 (FcRn 결합을 감소시키는 돌연변이를 갖는 항체 융합 단백질이 고려됨), 감소된 면역원성을 야기하는 낮은 옵소닌작용 활성을 가질 수 있다는 것이다.
본 발명은 FcRn 결합을 감소시키는 FcRn 결합 자리에서의 돌연변이를 갖는 가용성이고 생물학적으로 활성인 항체 융합 단백질의 발현 방법 및 발현을 위한 조성물을 제공한다. 융합 단백질은 2 개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 제 1 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상에 연결되는 생물학적 활성 분자를 포함하고, 제 2 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함한다. 폴리펩티드 사슬 중 하나의 면역글로불린 불변 부위의 일부의 아미노산 서열은 제 2 폴리펩티드 사슬의 면역글로불린 불변 부위의 일부의 아미노산 서열과, FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함한다는 점에서 상이하다. 차이점은 아미노산 결실, 삽입, 치환 또는 변형일 수 있다. 하나의 구현예에서, 차이점은 면역글로불린의 불변 부위 내의 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436 및 439 와 같은 특정 위치에서의 아미노산 치환이다. 바람직한 구현예에서, 아미노산 치환은 H435, 바람직하게는 H435A 위치이다.
본 발명은 생물학적 활성 분자가 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상에 연결되는 융합 단백질에 관한 것이다. 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 불변 부위의 아미노-말단에 연결될 수 있다. 대안적으로는, 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 불변 부위의 카르복시-말단에 연결될 수 있다. 추가의 구현예에서, 융합 단백질은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상의 2 개의 폴리펩티드 사슬에 연결된 2 개의 생물학적 활성 분자를 포함할 수 있다.
본 발명은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 면역글로불린 불변 부위의 일부가 Fc 단편일 수 있음이 고려된다. 다양한 구현예에서, Fc 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 의 Fc 단편이다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 폴리펩티드 사슬 중 하나 이상에서 면역글로불린 가변 부위를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 Fc-융합 단백질은, Fc 부분이 하나 또는 둘 모두의 CH2-CH3 사슬의 C- 또는 N-말단을 통해 치료학적으로 유효한 분자, 바람직하게는 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 사이토카인, 성장 인자 또는 성장 호르몬, 기타 치료학적으로 유효한 폴리펩티드, 화학적 소분자 또는 핵산에 융합되는 분자이며, 이때 오직 하나의 CH2-CH3 사슬이 각각의 면역글로불린 사슬의, 바람직하게는 완전한 융합 단백질의 FcRn 결합을 제거하거나 감소시키기 위해 돌연변이된다. 융합 단백질의 성질에 따라, 생물학적 활성 분자가 융합되는 면역글로불린 사슬을 돌연변이시키는 것이 보다 유리할 수 있거나, 네이키드 면역글로불린 사슬을 돌연변이시키는 것이 유리할 수 있다. 본 발명의 이들 Fc 융합 단백질은 동종이량체일 수 있거나 (2 개의 생물학적 활성 분자가 항체 Fc 부분에 융합되는 경우, 하나의 분자는 항체 부분의 각각의 중쇄로), 오직 하나의 생물학적 활성 분자가 항체 또는 Fc 부분 각각의 2 개의 중쇄 중 하나에 융합되는 경우 이종이량체일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 치료학적 분자로서 임의의 생물학적 활성 분자의 사용을 고려하고 있다. 예를 들어, 생물학적 활성 분자는 인간 인터페론, 예컨대 인터페론-β (IFNβ) 일 수 있다. 접힘을 향상시키고 응집을 감소시키기 위해, 인터페론-β 서열은 천연의 성숙한 인터페론-β 에 상응하는 17, 50, 57, 130, 131, 136 및 140 위치 중 하나 이상의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 변경은 아미노산 치환일 수 있다. 하나의 구현예에서, 아미노산 치환은 C17S, C17A, C17V, C17M, F50H, L57A, L130A, H131A, K136A, H140A 및 H140T 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 기타 사이토카인 또는 성장 인자, 예컨대 에리스로포이에틴이다. 바람직한 구현예에서, IFNβ 분자는 FcRn 돌연변이된 면역글로불린 각각의 Fc 부분의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 특별히 바람직한 구현예는 (이량체성) Fc-IFNβ 융합 단백질이며, 이때 하나의 임의로 변형되는 IFNβ 분자는 제 1 면역글로불린 CH2-CH3 사슬의 불변 부위의 C- 또는 임의로는 N-말단, 바람직하게는 C-말단에 융합되고, 제 2 CH2-CH3 면역글로불린 사슬은 IFNβ 가 부족하고, FcRn 결합을 방지하거나 감소시키는 돌여변이는 제 1 또는 제 2 CH2-CH3 사슬에서 위치하고, 바람직하게는 그러한 네이키드 사슬에서, 돌연변이는 435 위치, 구체적으로는 H435A 에서 실행된다. 그러한 바람직한 Fc 융합 분자는 이종이량체이다. 더욱이, 추가로 바람직한 Fc-IFNβ 융합 단백질은 이들의 구조적 특징 외에도 IgG2 또는 IgG4 의 CH2-CH3 부위에 커플링된 IgG1 경첩 부위를 갖는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하고 발현하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 양태는 생물학적 활성 분자 및 FcRn 결합을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은, 생물학적 활성 분자 및 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제 1 핵산, 및 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함하는 제 2 폴리펩티드를 인코딩하는 제 2 핵산의 조성물에 관한 것이다. 핵산 서열 중 하나는 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 돌연변이는 불변 부위에서 하나 이상의 위치, 예를 들어 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436 및 439 위치에서 아미노산 치환이며, 이때 잔기의 번호화는 Kabat 에 따른 EU 인덱스의 번호화이다. 추가의 구현예에서, 아미노산 치환은 435 위치, 구체적으로는 H435A 위치이다. 다른 양태에서, 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 조성물은 복제 가능한 발현 벡터 내로 혼입될 수 있고, 이후 이는 숙주 세포로 도입될 수 있고 숙주 세포 게놈과 재조합되고 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있다. 복제 가능한 발현 벡터는 상기 언급된 핵산 또는 핵산 조성물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된 핵산 또는 핵산 조성물을 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
이에 본 발명은 상기 언급된 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 의도하는 용도 또는 투여 방식에 따라, 고체 또는 액체의 약학적으로 허용가능한 담체는 약학 조성물 중에서 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 상기 언급된 임의의 융합 단백질의 투여에 의해 경감되는 질환 또는 병태를 갖는 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 질환 또는 병태는 바이러스성 감염이다. 다른 구현예에서, 질환 또는 병태는 빈혈증인 반면, 다른 구현예에서 질환 또는 병태는 다발성 경화증이다.
요약하면, 본 발명은 하기 주제에 관한 것이다:
Figure pct00001
2 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질, 이때 제 1 폴리펩티드 사슬은 생물학적으로 활성인 분자 및 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함하고, 제 2 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함하고, 폴리펩티드 사슬 중 하나는 FcRn 결합 자리에서의 돌연변이를 포함함.
Figure pct00002
면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 각각 포함하는 제 1 및 제 2 중쇄 도메인을 포함하는 항체 융합 단백질, 이때 상기 제 1 또는 제 2 중쇄 도메인 중 하나 이상은 생물학적 활성 분자에 융합되고, 상기 제 1 또는 제 2 중쇄 도메인 중 오직 하나는 불변 부위 내의 아미노산 서열의 돌연변이를 포함하고, 이때 돌연변이는 FcRn 결합의 부분적 또는 완전한 손실을 야기하고, 융합 단백질의 혈청 반감기의 감소 또는 상당한 감소는 야기하지 않음. 항체 융합 단백질의 혈청 반감기의 상당한 감소는 본 발명에 따라 하나 이상의 위치, 바람직하게는 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 및 447 위치에서, 가장 바람직하게는 435 위치에서 FcRn 결합 자리 돌연변이를 갖지 않는 융합 단백질의 혈청 반감기의 10 % 초과, 바람직하게는 5 % 초과, 가장 바람직하게는 3 % 초과의 감소임.
Figure pct00003
각각의 단백질 또는 항체 융합 단백질, 이때 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 불변 부위의 아미노-말단 또는 면역글로불린 불변 부위의 카르복시-말단 에 연결됨.
Figure pct00004
각각의 단백질 또는 항체 융합 단백질, 이때 제 1 및 제 2 중쇄 도메인은 생물학적 활성 분자를 포함함.
Figure pct00005
항체 Fc 단편인 항체 융합 단백질 또는 각각의 단백질, 이때 제 1 및 제 2 중쇄 도메인은 경첩 부위를 포함하는 CH2 및 CH3 도메인이고 따라서 상기 Fc 단편을 구성함.
Figure pct00006
대안적으로, 항체 융합 단백질, 이때 제 1 및/또는 제 2 중쇄 도메인은 항체 가변 도메인을 포함하고 따라서 항체 표적의 결합을 허용하는 완전한 전장 항체를 형성함.
Figure pct00007
각각의 단백질 또는 항체 융합 단백질, 이때 면역글로불린은 IgG, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 임.
Figure pct00008
바람직한 항체 융합 단백질, 이는 항체의 Fc 단편 또는 부분이며, 이때 (i) 제 1 및 제 2 중쇄 도메인은 경첩 부위를 포함하는 IgG 의 CH2 및 CH3 도메인이고 Fc 단편을 구성하고; (ii) 제 1 중쇄 도메인은 이의 C-말단을 통해 생물학적 활성 분자에 융합되고; (iii) 제 2 중쇄 도메인은 생물학적 활성 분자에 융합되지 않고 따라서 Fc 이종이량체성 융합 단백질을 형성함. 이러한 구현예에서, FcRn 결합의 손실 또는 감소를 야기하는 돌연변이는, 생물학적 활성 분자에 융합되지 않은 중쇄 도메인에서 위치할 수 있거나, 생물학적 활성 분자에 융합되는 중쇄 도메인에서 위치할 수 있음.
Figure pct00009
각각의 단백질 또는 항체 융합 단백질, 이때 생물학적으로 활성이고 치료학적으로 유효한 분자는 인간 인터페론이고, 사이토카인, 예컨대 인터페론 또는 인터루킨, 성장 인자, 예컨대 에리스로포이에틴 또는 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬임. 본 발명에 따라 가장 바람직한 것은 Fc 분자 중 오직 하나의 중쇄에만 융합되는, 바람직하게는 Fc 분자의 C-말단에 융합되는 인터페론-β(IFNβ) 분자를 포함하는 각각의 Fc 융합 단백질임.
Figure pct00010
각각의 항체 융합 단백질, 바람직하게는 Fc 융합 단백질, 이때 인간 IFNβ 의 아미노산 서열은 천연 성숙 인간 IFNβ 에 상응하는 위치 17, 50, 57, 130, 131, 136 및 140 위치에서 변경되고, 바람직하게는 치환됨. 바람직하게는, Fc-IFNβ 는 C17S, C17A, C17V, C17M, F50H, L57A, L130A, H131A, K136A, H140A 및 H 140T 와 같은 IFNβ 서열 내의 하나 이상의 위치에서 치환됨.
Figure pct00011
천연의 또는 변형된 IFNβ 에 융합되지 않는 중쇄에서 FcRn 돌연변이를 포함하는 각각의 Fc 단편 또는 이의 역, 이때 FcRn 돌연변이는 천연의 또는 변형된 IFNβ 에 융합되는 사슬에서 수행되고, 이때 둘 모두에서 대안적으로 Fc 융합 단백질의 경첩 부위는 IgG 중쇄로서 상이한 IgG, 예를 들어, 각각의 Fc 융합 분자로부터 유래하고, 이때 경첩 부위는 IgG1 로부터 유래하고 CH2-CH3 중쇄는 IgG2 또는 IgG4 로부터 유래함.
Figure pct00012
(i) IgG 불변 부위의 일부 이상에 융합되는 생물학적 활성 분자를 포함하는 제 1 중쇄 도메인을 인코딩하는 핵산, 및 (ii) 생물학적 활성 분자에 융합되지 않는 IgG 불변 부위의 일부 이상을 포함하는 제 2 중쇄 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 상기 및 하기에 기재되는 바와 같은 항체 융합 단백질을 제조하기에 적합한 핵산 조성물, 이때 상기 IgG 불변 부위 또는 이의 일부 중 하나만이 FcRn 결합의 부분적 또는 완전한 손실을 야기하는 돌연변이를 포함함.
Figure pct00013
각각의 단백질 또는 항체 융합 단백질, 바람직하게는 각각의 Fc 융합 단백질, 가장 바람직하게는 기재되는 바와 같은 Fc-IFNβ 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
Figure pct00014
질환, 예컨대 바이러스성 감염, 빈혈증, 암 또는 다발성 경화증의 치료에 사용되는, 기재된 바와 같은 각각의 단백질 또는 항체 융합 단백질, 바람직하게는 각각의 Fc 융합 단백질, 가장 바람직하게는 Fc-IFNβ 융합 단백질 또는 상기 약학 조성물.
도 1A-1D 는 생물학적 활성 분자 (원형) 가 항체의 Fc 하위단위에 어떻게 연결될 수 있는지를 개략적으로 도시하며, 여기서 경첩 (작은 직사각형), CH2 도메인 및 CH3 도메인 (큰 직사각형) 을 나타낸다. Fc 하위단위 중 하나는 FcRn 결합 자리 (다이아몬드형) 에서 돌연변이를 포함한다. 생물학적 활성 분자는 Fc 하위단위의 N-말단 (도 1A 및 1B) 또는 C-말단 (도 1C 및 1D) 에 연결될 수 있다.
도 2A-2F 는 2 개의 생물학적 활성 분자가 항체의 Fc 하위단위에 연결될 수 있는 방식의 부분집합을 도시한다. Fc 하위단위 중 하나는 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함한다. 2 개의 생물학적 활성 분자는 동일하거나 상이할 수 있다 (검정색 원 또는 흰색 원).
도 3A-3H 는 중쇄의 불변 부위 (직사각형) 및 가변 부위 (점묘법으로 표현한 직사각형) 을 포함하는 항체에 어떻게 연결될 수 있는지를 나타낸다. 항체 융합 단백질은 단일 가변 부위 (도 3A-3D) 를 포함할 수 있거나, 또는 항체 융합 단백질은 2 개의 가변 부위 (도 3E-3H) 를 포함할 수 있다. 중쇄 중 하나는 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함한다.
도 4A-4F 는 2 개의 생물학적 활성 분자가 중쇄의 불변 부위 (직사각형) 및 가변 부위 (점묘법으로 표현한 직사각형) 를 포함하는 항체에 어떻게 연결될 수 있는지를 나타낸다. 2 개의 생물학적 활성 분자는 동일하거나 상이할 수 있다 (검은색 원 또는 흰색 원). 중쇄 중 하나는 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함한다.
도 5A-5D 는 생물학적 활성 분자가 온전한 면역글로불린, 예컨대 IgG 에 연결될 수 있는 부분집합을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄의 불변 부위는 직사각형으로 나타내고 가변 부위는 점묘법으로 표현한 직사각형으로 나타낸다. 중쇄 중 하나는 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함한다. 생물학적 활성 분자는 중쇄 (도 5A 및 5B) 또는 경쇄 (도 5C 및 5D) 에 연결될 수 있다.
도 6A-6F 는 2 개의 생물학적 활성 분자가 온전한 면역글로불린, 예컨대 IgG 에 어떻게 연결될 수 있는지를 도시한다. 중쇄 중 하나는 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함한다. 생물학적 활성 분자는 중쇄 (도 6A 및 6B) 또는 경쇄 (도 6C 및 6D) 에 연결될 수 있다. 대안적으로는, 생물학적 활성 분자 중 하나는 중쇄에 연결될 수 있고 다른 생물학적 활성 분자는 경쇄에 연결될 수 있다 (도 6E 및 6F).
도 7A-7F 는 2 개의 상이한 생물학적 활성 분자가 온전한 면역글로불린, 예컨대 IgG 에 어떻게 연결될 수 있는지를 도시한다. 중쇄 중 하나는 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함한다.
도 8 은 환원 조건 (좌측 패널) 및 비-환원 조건 (중간 패널) 하에서 293T 세포에서 인간 Fcγ4h 사슬 및 인간 Fcγ4h-링커-DI-IFNβ 사슬의 일시적인 공동발현에 의해 생산되는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 좌측 패널에서, 레인 2 는 Fcγ4h 사슬 및 Fcγ4h-링커-DI-IFNβ 사슬 둘 모두가 발현되는 것을 나타내는 반면, 레인 1 은 Fcγ4h 이 단독으로 발현되는 것을 나타내는 대조군이다. 중간 패널에서, 인간 Fcγ4h 사슬 및 인간 Fcγ4h-링커-DI-IFNβ 사슬의 일시적인 공동발현은 비-환원 조건 하에서 분석되었다. Fcγ4h 사슬의 2중의 샘플 (1a 및 1b 로 라벨링한 2 개의 레인) 또는 Fcγ4h 사슬 및 Fcγ4h-링커-DI-IFNβ 사슬을 공동발현하는 2중의 샘플 (2a 및 2b 로 라벨링한 2 개의 레인) 을 분석하였다. 우측 패널은 2 개의 안정적으로 트랜스펙션된 클론으로부터 Fc 및 Fc-IL-2 사슬의 공동 발현 (3 및 4 로 라벨링된 2 개의 레인) 이 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE 상에서 네이키드 Fc 동종이량체 : Fc/Fc-IL2 이종이량체 : Fc-IL2 동종이량체의 정상적인 예측 비를 제공함을 나타낸다.
도 9 는 비-환원 조건 하에서 Fcγ4h 사슬 및 Fcγ4h-링커-DI-IFNβ 사슬을 공동발현하는 수많은 안정적인 NSO 클론으로부터 조건화 배지의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 모든 클론은 Fcγ4h 동종이량체 및 Fcγ4h/Fcγ4h-IFNβ 이종이량체를 생산하였으나, Fcγ4h-IFNβ동종이량체는 거의 생산하지 않거나 전혀 생산하지 못하였다.
도 10 은 세포변성 효과 (CPE) 저해 검정에서 H435A 치환 (삼각형) 을 포함하는 정제된 Fcγ4h-모노-L-DI-IFNβ (정사각형) 및 Fcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체의 생물학적 활성을 나타낸다. 인간 폐 상피 암종 주 A549 를 뇌심근염바이러스 (EMCV) 에 대한 숙주로서 사용하였다. Rebif (원형) 를 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 11 은 정맥내로 투여되는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ (다이아몬드형) 및 huFcγ4h(H435A)/huFcγ4h-L-DI-IFNβ 이종이량체 형태로 H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체 (정사각형) 의 약물동태학 특성을 비교한다. 마우스 (n=3) 에 25 μg 의 총 단백질/마우스로 정맥내 주입하였다. 주입 단백질의 혈청 농도를 상이한 시점에서 항-hu Fc ELISA 에 의해 측정하였다.
도 12 는 정맥내로 투여되는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ (다이아몬드형) 및 huFcγ4h(H435A)/huFcγ4h-L-DI-IFNβ 이종이량체 형태로 H435A 치환을 포함하는 huFc4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체 (정사각형) 의 약물동태학적 특성을 비교한다. 마우스 (n=3) 에 25 μg 의 총 단백질/마우스로 정맥내 주입하였다. 주입 단백질의 혈청 농도를 상이한 시점에서 항-hu (H&L) 포획 및 항-hu IFNβ 검출로 이루어진 ELISA 에 의해 측정하였다.
도 13 은 피하로 투여되는 huFc4γh-모노-L-DI-IFNβ (다이아몬드형) 및 huFcγ4h(H435A)/huFcγ4h-L-DI-IFNβ 이종이량체 형태로 H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체 (정사각형) 의 약물동태학적 특성을 비교한다. 마우스 (n=3) 에 50 μg 의 총 단백질/마우스로 피하 주입하였다. 주입 단백질의 혈청 농도를 상이한 시점에서 항-hu Fc ELISA 에 의해 측정하였다.
도 14 는 피하로 투여되는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ (다이아몬드형) 및 huFcγ4h(H435A)/huFcγ4h-L-DI-IFNβ 이종이량체의 형태로 H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체 (정사각형) 의 약물동태학적 특성을 비교한다. 마우스 (n=3) 에 50 μg 의 총 단백질/마우스로 피하 주입하였다. 주입 단백질의 혈청 농도를 상이한 시점에서 항-hu (H&L) 포획 및 항-hu IFNβ 검출로 이루어진 ELISA 에 의해 측정하였다.
도 15 는 부스트 주입에 따른 H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체 (다이아몬드형) 또는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ (원형) 으로 면역화한 마우스의 항체 역가를 비교하였다. 마우스 항체 역가를 ELISA 에 의해 측정하였다.
도 16 은 환원 조건 하에서 정맥내 약물동태학 연구로부터 마우스 혈청 샘플의 웨스턴 블롯 분석이다. 상부 좌측: 항-hu Fc 로 탐침된 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ; 하단 좌측: 항-hu Fc 로 탐침된 H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체; 상부 우측: 항-hu IFNβ 로 탐침된 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ; 하단 우측: 항-hu IFNβ 로 탐침된 H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체.
도 17 은 환원 조건 하에서 피하 약물동태학 연구로부터 마우스 혈청 샘플의 웨스턴 블롯 분석이다. 상부 좌측: 항-hu Fc 로 탐침된 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ; 하단 좌측: 항-hu Fc 로 탐침된 H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체; 상부 우측: 항-hu IFNβ로 탐침된 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ; 하단 우측: 항-hu IFNβ 로 탐침된 H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체.
발명의 상세한 설명
정의
본원에서 고려되는 치료학적 또는 조성물의 "유효량" 또는 "약학적 유효량" 은 예를 들어 질환 증상의 중증도를 감소시키는데 원하는 효과를 내는데 충분한 양이다. 약학적 유효량은 치료될 대상체 및 질환 병태, 대상체의 체중 및 나이, 질환 병태의 중증도, 투여 방식 등에 의존적일 것이다. 예를 들어, 본 발명의 특정 조성물은 그러한 치료에 적용 가능한 합당한 이점/위험도 비를 생성하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "핵산" 은 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태 중 하나로 2 개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 중합체를 지칭하고, 이에는 DNA 및 RNA 가 포함된다. DNA 는 예를 들어 플라스미드 DNA, 예비-응축된 DNA, PCR 생성물, 벡터 (P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 염색체 DNA, 또는 이들 군의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. RNA 는 mRNA, tRNA, rRNA, tRNA, vRNA 및 이의 조합 형태일 수 있다. 핵산에는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 포함하는 핵산이 포함되고, 이는 합성, 자연 발생 및 비-자연 발생하는 것이며, 이는 참조 핵산과 같은 유사한 결합 특성을 갖는다. 그러한 유사체의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 및 헵티드 핵산 (PNA) 이 포함되나, 이로써 한정되지 않는다. "뉴클레오티드" 는 데옥시리보스 (DNA) 또는 리보스 (RNA), 당, 질소성 염기, 및 포스페이트 기 또는 이의 유사체를 포함한다. 뉴클레오티드는 포스페이트 기를 통해 함께 연결된다. "염기" 에는 퓨린 및 피리미딘이 포함되며, 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신 및 천연 유사체, 및 퓨린 및 피리딘의 합성 유도체가 추가로 포함되며, 신규 반응성 기, 예컨대 아민, 알콜, 티올, 카르복실레이트 및 알킬할라이드를 배치하는 변형체가 포함되나, 이로써 한정되지 않는다.
용어 "소분자" 는 1 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자를 지칭한다. 소분자는 자연적으로 발생하거나 합성된 임의의 다양한 분자일 수 있다. 생물학적 활성 분자는 유기 소분자, 무기 소분자, 당 분자, 지질 분자 등일 수 있다. 소분자는 약물일 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한 부형제" 는 약학 생성물을 제형화하는데 사용되는 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 운반체, 예컨대 액체 또는 고체 충전재, 희석제, 부형제 또는 용매를 지칭한다. 각각의 부형제는 대상 조성물 및 이의 성분과 양립할 수 있고 환자에게 해롭지 않다는 점에서 "허용가능" 해야만 한다. 약학적으로 허용가능한 부형제로서 제공될 수 있는 물질의 몇몇 예로는 하기가 포함된다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글로코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말형 트래거캔쓰; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예컨대 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-미포함 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) 포스페이트 완충 용액; 및 (21) 약학 제형중에 사용되는 기타 비독성 양립가능한 물질.
항체 융합 단백질
관심 단백질을 면역글로불린 불변 부위, 예를 들어 면역글로불린 Fc 부위에 연결하는 항체 융합 단백질은, 면역글로불린 부분의 존재와 연계되어 있는 이점뿐 아니라 연결된 단백질의 생물학적 활성 둘 모두를 갖는다. 그러한 융합 단백질은 생물학적 활성 분자 단독과 비교하여 증강된 안정성 및 증가된 생물이용가능성을 나타낸다. 추가로, Fc 단편의 존재는 단백질 생산을 현저히 개선시킬 수 있다. 이는, 부분적으로는 융합 단백질의 Fc 부분이 융합 단백질의 효율적인 분비를 위해 지정되기 때문에 발생하고, 부분적으로는 융합 단백질이 숙주 세포로부터 용이하게 분비되도록, 융합 단백질이 면역글로불린을 천연적으로 발현하는 숙주 세포로부터 분비되고 이에서 생산될 수 있기 때문에 발생하는 것으로 여겨진다. 마지막으로, Fc 단편은 또한 융합된 폴리펩티드의 정제에서 보조제로 활용될 수 있다.
성인 포유동물에서, FcRn 은 IgG 에 결합하고 인양하는, 분해로부터의 보호성 수용체로서 작용한다. 수많은 연구가 FcRn 결합에 대한 친화도와 항체의 혈청 반감기 사이의 상호관계를 지지한다. 놀랍게도, 본 발명은, 돌연변이를 갖지 않는 상응하는 융합 단백질에 필적할만한 생물학적 특성, 예컨대 연장된 순환 반감기를 나타내는, FcRn 결합을 감소시키는 돌연변이를 갖는 항체 융합 단백질을 제공한다. 또한, FcRn 에 대한 친화도를 감소시키는 돌연변이를 갖는 항체 융합 단백질로 고려되는 IgG 매개 옵소닌작용에서 FcRn 의 주어진 역할은 감소된 면역원성을 나타낼 수 있다는 것이다.
결과적으로, 본 발명은 2 개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 항체 융합 단백질을 제공한다. 제 1 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상에 연결되는 생물학적 활성 분자를 포함하고, 제 2 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함한다. 폴리펩티드 사슬 중 하나의 면역글로불린 불변 부위의 일부의 아미노산 서열은 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함한다는 점에서 제 2 폴리펩티드 사슬의 면역글로불린 불변 부위의 일부의 아미노산 서열과 상이하다.
또한, 본 발명은 FcRn 결합을 감소시키는 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 갖는, 가용성의 생물학적으로 활성인 항체 융합 단백질을 발현하는 조성물 및 발현 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 FcRn 결합을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상 및 생물학적으로 활성 분자를 포함하는 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 다른 양태에서 본 발명은, 생물학적 활성 분자 및 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제 1 핵산, 및 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함하는 제 2 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제 2 핵산의 조성물에 관한 것이다. 핵산 서열 중 하나는 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함한다.
또한 본 발명은, 본 발명의 항체 융합 단백질의 유효량을 포유동물에게 투여함으로써, 항체 융합 단백질의 투여에 의해 경감되는 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
항체 융합 단백질의 구조적 변이체
본 발명은 2 개의 폴리펩티드 사슬으로 이루어진 항체 융합 단백질을 개시한다. 제 1 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상에 연결되는 생물학적 활성 분자를 포함하고, 제 2 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함한다. 폴리펩티드 사슬 중 하나는 FcRn 결합에서 돌연변이를 포함한다.
도 1 은 생물학적 활성 분자가 면역글로불린 불변 부위, 예를 들어 항체의 Fc 하위단위에 연결될 수 있는 방식의 부분집합을 도시한다. 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 불변 부위의 N-말단 (도 1A 및 1B) 또는 면역글로불린 불변 부위의 C-말단 (도 1C 및 1D) 에 연결될 수 있다. 생물학적 활성 분자는 FcRn 결합에서 돌연변이를 갖는 면역글로불린 불변 부위에 연결되거나, 돌연변이를 갖지 않는 면역글로불린 불변 부위에 연결될 수 있다.
항체 융합 단백질은 2 개 이상의 생물학적 활성 분자를 포함할 수 있다. 도 2 에 도시된 바와 같이, 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 불변 부위의 N-말단 (도 2A) 또는 면역글로불린 불변 부위의 C-말단 (도 2B) 에 연결될 수 있거나, 생물학적 활성 분자 중 하나는 면역글로불린 불변 부위의 N-말단에 연결될 수 있고 제 2 의 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 불변 부위의 C-말단 (도 2C) 에 연결될 수 있다. 2 개의 생물학적 활성 분자는 동일하거나 상이할 수 있다. 도 2D 내지 2F 는 2 개의 상이한 생물학적 활성 분자가 면역글로불린 불변 부위에 어떻게 연결될 수 있는지를 도시한다.
또한, 본 발명은 펩티드 사슬 중 하나 이상은 항체 가변 도메인을 포함하는 2 개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 항체 융합 단백질을 특징으로 한다. 도 3 은 생물학적 활성 분자가 항체 가변 도메인으로 이루어지는 면역글로불린 부위에 연결될 수 있는 방식의 부분집합을 도시한다. 생물학적 활성 분자는 항체 가변 도메인으로 이루어진 폴리펩티드 사슬 중 하나의 N-말단 또는 C-말단 중 하나에 연결될 수 있다 (도 3A 내지 3D). 대안적으로는, 둘 모두의 펩티드 사슬은 항체 가변 도메인을 포함할 수 있다 (도 3E 내지 3H).
도 4 는 2 개의 생물학적 활성 분자가 중쇄의 불변 부위 및 가변 부위를 포함하는 항체에 어떻게 연결될 수 있는지를 나타낸다. 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 부위의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단에 연결될 수 있다 (도 4A 내지 4C). 상이한 생물학적 활성 분자가 면역글로불린 부위에 연결될 수 있다 (도 4D 내지 4F).
본 발명의 융합 단백질은 온전한 항체, 예를 들어 IgG 에 연결된 생물학적 활성 분자를 포함할 수 있다. 도 5 는 생물학적 활성 분자가 항체에 연결될 수 있는 방식의 부분집합을 도시한다. 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다 (도 5A 및 5B). 대안적으로는, 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다 (도 5C 및 5D).
도 6 은 2 개의 생물학적 활성 분자가 온전한 항체에 어떻게 연결될 수 있는지를 도시한다. 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다 (도 6A 및 6B). 대안적으로는, 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다 (도 6C 및 6D). 생물학적 활성 분자 중 하나는 면역글로불린 중쇄에 연결될 수 있고, 제 2 의 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 경쇄에 연결될 수 있다 (도 6E 및 6F). 도 7 은 상이한 생물학적 활성 분자가 온전한 항체에 어떻게 연결될 수 있는지를 나타낸다 (도 7A 내지 7F).
항체 융합 단백질의 생물학적 특성
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 항체 융합 단백질은 돌연변이를 갖지 않는 상응하는 융합 단백질에 필적할만한 생물학적 특성, 예컨대 연장된 순환 반감기를 입증할 수 있다. 예를 들어, 도 11 내지 15 는, H435A 돌연변이를 갖는 인간 Fcγ4-IFNβ 가, 생체내 돌연변이를 갖지 않는 인간 Fcγ4-IFNβ 와 유사한 혈청 안정성을 나타냄을 입증한다. 마우스에 정맥내로 주입된 H435A 돌연변이를 갖는 Fcγ4-IFNβ 는, 돌연변이를 갖지 않는 항체 융합 단백질과 유사한 순환 반감기를 나타냈다 (도 11 및 12). 유사하게, 마우스에 피하로 주입된 H435A 돌연변이를 갖는 Fcγ4-IFNβ 는, 돌연변이를 갖지 않는 항체 융합 단백질과 유사한 순환 반감기를 나타냈다 (도 13 및 14).
본 발명의 항체 융합 단백질의 유도체가 고려되고, 이는 치환, 부가, 및/또는 결실/결단에 의한 이들의 아미노산 서열 변경, 또는 기능적으로 등가의 분자를 생성하는 화학적 변형의 도입에 의해 제조될 수 있다. 임의의 단백질 서열에서 특정 아미노산이, 단백질 활성에 반대로 영향 미치지 않으면서 기타 아미노산으로 치환될 수 있음이 당업자에게 숙지되어 있을 것이다. 그러한 변화로부터 생성되는 유도체, 유사체 또는 변이체 및 그러한 유도체의 사용은 본 발명의 범위 내에 있다.
FcRn 결합 자리 돌연변이
본 발명은 Fc 를 포함하는 하나의 폴리펩티드 사슬의 Fc 결합 자리에서 돌연변이를 갖는 항체 융합 단백질을 제공한다. Fc 를 포함하는 기타 폴리펩티드 사슬이 FcRn 에 대한 고유 결합 친화도를 보유하는 반면, 돌연변이는 FcRn 수용체에 대한 항체 융합 단백질의 감소된 결합 친화성을 야기한다. 감소된 결합은 106 M-1 미만의 친화도 상수 KA 를 갖는 낮은 친화도를 특징으로 한다. 필요한 경우, FcRn 결합은 결합 조건을 다양하게 함으로써 감소될 수 있다. 결합 조건, 예컨대 결합에 허용되는 분자의 농도, 용액의 등장 강도, 온도, 시간은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
FcRn 수용체에 결합하는 IgG 의 Fc 일부 부위는 X-선 결정학에 기초하여 기재되었다 (Burmeister et al., 1994, Nature 372:379). FcRn 결합에 포함되는 IgG 잔기는 Fc 부위의 CH2-CH3 도메인 접점에 위치한다. 주요 접촉 자리는 CH2 도메인의 아미노산 잔기 248, 250-257, 272, 285, 288, 290, 291, 308-311 및 314 이고, CH3 도메인의 아미노산 잔기 385-387, 428 및 433-436 이다.
이러한 지식을 이용하여, 항체 융합 단백질의 Fc 단편은 자리-지정 돌연변이생성과 같은 익히 인식되어 있는 절차에 따라 변형되어 FcRn 에 대한 감소된 친화도를 갖는 변형된 항체 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 변형은 치환, 부가 및/또는 결실/결단일 수 있다. 예를 들어, 항체 융합 단백질의 면역글로불린 불변 부위는 IgG1 Fc 단편에서 히스톤에 상응하는 435 위치에서 변경을 포함할 수 있다. 아미노산 변경은 당업계에 공지된 방법을 통해 히스톤을 알라닌 (H435A) 으로 대체할 수 있다.
435 위치에서의 변경 외에도, 본 발명에는 또한 다른 변경된 잔기를 갖는 항체 융합 단백질이 고려된다. 예를 들어, 항체 융합 단백질은 233, 234, 235, 236, 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 및 447 위치 중 하나 이상에서 변경될 수 있으며, 이때 IgG Fc 부위에서 잔기의 번호화는 Kabat et al 의 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 에 기재된 바와 같은 EU 인덱스의 번호화이다. FcRn 에 대한 결합을 감소시키거나 저지하는 변형의 예로는 하기가 포함된다 (이에 한정되지 않음): E233A, L234A, L235A, G236A, I253A, S254A, R255A, K288A, S415A, H433A, H435A, Y436A. FcRn 결합을 감소시키는 돌연변이일 수 있는 상기 목록에 기재되지 않은 추가의 아미노산 잔기 또한 고려된다. 더욱이, 상기 특정 위치에서 야생형 아미노산을, 알라닌 외에도 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 돌연변이는 단일적으로 도입될 수 있거나, 그러한 돌연변이의 2 개, 3 개 또는 그 이상의 조합이 함께 도입될 수 있다. 더욱이, 항체 융합 단백질의 폴리펩티드 사슬 중 하나가 FcRn 결합을 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있거나 둘 모두의 폴리펩티드 사슬이 돌연변이될 수 있다. 본원에 기재되는 임의의 돌연변이는 생물학적 활성 분자에 관계없이 사용될 수 있다.
면역글로불린 부위
본 발명의 항체 융합 단백질은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함한다. 온전한 면역글로불린은 공유결합으로 연계되어 있는 4 개의 단백질 사슬 - 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄를 포함한다. 또한, 각각의 사슬은 하나의 가변 부위 및 하나의 불변 부위로 이루어져 있다. 면역글로불린 아이소타입에 따라, 중쇄 불변 부위는 3 개 또는 4 개의 불변 부위 도메인 (예: CH1 , CH2, CH3, CH4) 및 경첩 부위를 포함한다. 도메인은 하기와 같이 순차적으로 명명된다: CH1-경첩-CH2-CH3(-CH4).
면역글로불린 불변 부위의 일부는 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE 의 일부를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 면역글로불린은 IgG 이다. 다른 구현예에서, 면역글로불린은 IgG1 이다. 다른 구현예에서, 면역글로불린은 IgG2 이다. 다른 구현예에서, 면역글로불린은 IgG3 이며, 다른 구현예에서, 면역글로불린은 IgG4 이다. 적절한 면역글로불린 중쇄 불변 부위의 선택은 미국 특허 제 5,541,087 호 및 제 5,726,044 호에 상세히 논의되어 있다. 특정 결과를 달성하기 위해 특정 면역글로불린 부류 및 하위부류로부터 특정 면역글로불린 중쇄 불변 부위 서열의 선택은 당업자의 재량 내인 것으로 고려된다.
면역글로불린 불변 부위의 일부는 전체 중쇄 불변 부위, 또는 이의 단편 또는 유사체를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 면역글로불린 불변 부위의 일부는 Fc 단편이다. 예를 들어, 면역글로불린 Fc 단편은 하기를 포함할 수 있다: 1) CH2 도메인; 2) CH3 도메인; 3) CH4 도메인; 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인; 5) CH2 도메인 및 CH4 도메인; 6) CH3 도메인 및 CH4 도메인; 또는 7) 면역글로불린 경첩 부위 및/또는 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인 및/또는 CH4 도메인의 조합. 하나의 구현예에서, 면역글로불린 Fc 부위는 적어도 면역글로불린 경첩 부위를 포함하는 반면, 다른 구현예에서 면역글로불린 Fc 부위는 하나 이상의 면역글로불린 불변 중쇄 부위, 예를 들어 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, Fc 부위, 임의로는 CH4 도메인을 생성하는데 사용되는 면역글로불린의 유형에 의존적이다. 다른 구현예에서, Fc 부위는 경첩 부위, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 바람직하게는 CH1 도메인은 결핍되는 반면, 다른 구현예에서 Fc 부위는 경첩 부위 및 CH2 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 부위는 경첩 부위 및 CH3 도메인을 포함한다.
면역글로불린 Fc 단편은 임의의 면역글로불린 부류로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 부류는 IgG (IgGγ1) (γ 하위부류 1, 2, 3, 또는 4) 일 수 있다. 면역글로불린의 기타 부류, 예컨대 IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε), 및 IgM (Igμ) 또한 사용될 수 있다. 적절한 면역글로불린 중쇄 불변 부위의 선택은 미국 특허 제 5,541,087 호 및 제 5,726,044 호에 상세히 논의되어 있다. 당업자는 특정 결과를 달성하기 위해 특정 면역글로불린 부류 및 하위부류로부터 특정 면역글로불린 중쇄 불변 부위를 어떻게 선택하는지 숙지하고 있을 것임을 이해한다.
융합 단백질의 생성에 사용되는 Fc 단편이 특정 적용에 적합하게 될 수 있음을 고려한다. 예를 들어, Fc 단편은 면역글로불린 γ1 아이소타입 또는 이의 변이체로부터 유래될 수 있다. Fc 단편 서열으로서 인간 γ1 을 사용하는 것은 다양한 이점을 갖는다. 예를 들어, 면역글로불린 γ1 아이소타입으로부터 유래되는 Fc 단편은 간을 표적으로 하는 융합 단백질을 원하는 경우 사용될 수 있다. 추가로, 항체 융합 단백질이 생물약제학적으로 사용되는 경우, Fcγ1 도메인은 융합 단백질에 효과기 기능 활성을 부여할 수 있다. 효과기 기능 활성은 생물학적 활성, 예컨대 태반 이동 및 증가된 혈청 반감기를 포함한다. 면역글로불린 Fc 단편은 또한 항-Fc ELISA 에 의한 검출을 제공하고 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 단백질 A ("Protein A") 에 결합하는 것을 통해 정제된다.
대안적으로는, 항체 융합 단백질의 Fc 단편은 면역글로불린 γ4 아이소타입으로부터 유래된다. 면역글로불린 γ4 아이소타입이 효과기 기능을 매개하는데 비효과적이고 Fcγ 수용체에 대해 매우 감소된 결합을 나타내기 때문에, Fc 부위로서 면역글로불린 γ4 를 갖는 항체 융합 단백질이 포유동물에게 투여시 감소된 면역 효과기 기능 및 증강된 순환 반감기를 나타낼 수 있음이 고려된다.
면역글로불린 Fc 단편은 다수의 면역글로불린 부류 또는 하위부류를 조합할 수 있다. 예를 들어, 상기 단편은 IgG1 경첩 부위 및 IgG2 CH2 및 CH3 도메인을 조합할 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제 7,148,326 호 참조). 몇몇 구현예에서, 미국 특허 출원 공보 제 2007/0287170 호에 기재된 바와 같이, 도메인의 일부는 상이한 아이소타입으로부터 조합되어 변경된 이량체화 특성을 갖는 가닥 교환 조작 도메인 ("SEED") 을 창출한다.
하나의 구현예에서, 항체 융합 단백질은 하나 이상의 항체 가변 도메인을 포함한다. 항체 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인일 수 있다.
본 발명에 사용되는 면역글로불린 불변 부위의 일부는 돌연변이 또는 이의 유사체를 포함할 수 있거나, 화학적으로 변형된 면역글로불린 불변 부위 (예: 페그화된 것 (pegylated)) 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 당업자는 익히 공지되어 있는 분자 생물학 기술을 이용하여 그러한 변이체를 제조할 수 있다.
생물학적 활성 분자
본 발명은 2 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 항체 융합 단백질에 관한 것이다. 제 1 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상에 연결되는 생물학적 활성 분자를 포함하고, 제 2 폴리펩티드 사슬은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 포함한다. 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 불변 부위의 아미노-말단에 연결될 수 있다. 다르게는, 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 불변 부위의 카르복시 말단에 연결될 수 있다. 구현예에서, 제 2 폴리펩티드 사슬은 또한 생물학적 활성 분자를 포함할 수 있다.
본 발명에는 포유동물에게 투여되는 경우 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 임의의 생물학적 활성 분자의 사용이 고려된다. 생물학적 활성 분자에는 폴리펩티드, 핵산, 소분자가 포함되나, 이로써 한정되지 않는다. 생물학적 활성 분자의 다른 예에는 호르몬, 항바이러스제, 항상성제, 펩티드, 단백질, 화학요법제, 비타민, 보조인자, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 효소성 핵산, 안티센스 핵산, 3중 형성 올리고뉴클레오티드 및 압타머가 포함되나, 이로써 한정되지 않는다.
사이토카인
하나의 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 사이토카인이다. 사이토카인은 림프구를 포함하는, 세포의 성장 및 성숙을 지지하는 인자이다. 사이토카인의 예에는 인터루킨-I (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 림포카인 저해 인자, 대식세포 콜로니 자극 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 줄기 세포 인자, 종양 괴사 인자, 과립구 콜로니 자극 인자 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자가 포함되나, 이로써 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 인간 인터페론, 예를 들어 인터페론-β 를 포함할 수 있다. 인터페론-β 부분은 야생형의 성숙한 인간 인터페론-β 단백질일 수 있거나, 또는 야생형의 성숙한 인간 인터페론-β 와 60% 이상, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 서열일 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성 분자는, 예를 들어 융합 단백질의 단백질 접힘 특성을 향상시키기 위해, 응집을 감소시키기 위해, 또는 단백질 발현을 향상시키기 위해, 하나 이상의 돌연변이를 갖는 인간 인터페론-β 부분을 혼입할 수 있다. 예를 들어, 항체 융합 단백질의 인터페론-β 부분은 천연의 성숙한 인터페론-β 에 상응하는 17, 50, 57, 130, 131, 136 및 140 위치 중 1, 2, 3, 4 개 또는 그 이상의 변경을 포함할 수 있다. 이들 위치에서 아미노산 변경은 당업계에 공지된 방법을 통해 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 변형에 의해 생성될 수 있다. 이들 잔기에서 도입되는 변경은 비-공유결합적 응집을 경감시키는 것으로 여겨진다. 하나의 예에서, 시스테인은 17 위치에서 세린 (C17S), 알라닌 (C17A), 발린 (C17V) 또는 메티오닌 (C17M) 중 하나로 대체된다. 몇몇 구현예에서, 페닐알라닌은 50 위치에서 히스티딘 (F50H) 으로 대체된다. 몇몇 구현예에서, 루신은 57 위치에서 알라닌 (L57A) 로 대체되는 반면, 다른 구현예에서, 루신은 130 위치에서 알라닌 (L130A) 으로 대체된다. 몇몇 구현예에서, 히스티딘은 131 위치에서 알라닌 (H131A) 으로 대체되는 반면, 다른 구현예에서 라이신은 136 위치에서 알라닌 (K136A) 으로 대체된다. 몇몇 구현예에서, 히스티딘은 140 위치에서 알라닌 (H140A) 또는 트레오닌 (H140T) 중 하나로 대체된다. 특정 아미노산 치환을 열거하였으나, 본 발명은 이들 변경에 한정되지 않는다. 융합 단백질에 적절한 특성을 부여할 수 있는 임의의 적합한 아미노산이 천연의 성숙한 인터페론-β 의 17, 50, 57, 130, 131, 136 및 140 위치에서 본래의 아미노산 잔기 대신에 치환될 수 있다. 또한, 본 발명에는 본원에 개시된 바와 같이 17, 50, 57, 130, 131, 136 및 140 위치에서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 변경의 조합을 갖는 항체 융합 단백질의 인터페론-β 부분이 고려된다.
성장 인자
하나의 구현예에서, 생물학적 활성제는 성장 인자이다. 생물학적 활성 분자는 세포 성장 및 증식을 유도할 수 있는 임의의 작용제일 수 있다. 성장 인자의 예에는 간세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 케라틴세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 종양 성장 인자-α, 표피세포 성장 인자, VEGF, 인슐린 성장 인자 및 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II 가 포함되나, 이로써 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 적혈구의 증식을 유도할 수 있는 임의의 작용제이다. 본 발명에서 고려되는 생물학적 활성 분자의 하나의 예는 인간 에리스로포이에틴이다.
호르몬
하나의 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 호르몬이다. 호르몬은 세포 성장, 기능 및 대사를 변경한다. 호르몬의 예에는 뇌하수체 호르몬, 예를 들어 코리온 고나도트로핀, 코신트로핀, 메노트로핀, 소마토트로핀, 요오르티코트로핀, 프로티렐린, 티로트로핀, 바소프레신, 라이프레신; 부신 호르몬, 예를 들어 베클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손, 덱사메타손, 트리암시놀론; 췌장 호르몬, 예를 들어 글루카곤, 인슐린; 부갑상선 호르몬, 예를 들어 디히드로키스테롤; 갑상선 호르몬, 예를 들어 칼시토닌, 티로글로불린, 테리파라티드 아세테이트; 스테로이드 호르몬, 예를 들어 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 프로게스틴, 안드로겐, 테트라히드로데속시카리코스테론; 위장관 호르몬: 콜레시스토키닌, 엔테로글리칸, 갈라닌, 가스트린, 펜타가스트린, 테트라가스트린, 모틸린, 펩티드 YY 및 세크레틴이 포함되나, 이로써 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 인간 성장 호르몬이다.
핵산
하나의 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA 이다. 예를 들어, 생물학적 활성 분자는 RNA 간섭, 예컨대 안티센스 RNA, 단 간섭 RNA (siRNA) 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 및 단 헤어핀 RNA (shRNA) 에 사용되는 핵산 분자일 수 있다. 핵산 분자는 약 6 내지 약 60 개의 뉴클레오티드 길이여야만 한다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, 핵산 분자는 약 15 내지 약 50, 약 25 내지 약 45, 또는 약 30 내지 약 40 개의 뉴클레오티드 길이이다.
올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA 또는 이의 혼합물 또는 유도체 또는 변형체일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 분자의 안정성, 혼성 등을 향상시키기 위해 염기 부분, 당 부분 또는 포스페이트 골격에서 변형될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 다른 첨부되는 기, 예컨대 폴리펩티드 (예: 생체내 표적 숙주 세포 수용체용), 또는 세포막을 통과하는 수송을 촉진하는 작용제 (예: [Letsinger et al., (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:6553]; [Lemaitre et al., (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:648]; 및 WO 88/09810 참조), 또는 혈-뇌 장벽 (예: WO 89/10134 참조), 혼성화-촉발 절단제 (예: [Krol et al., (1988) BioTechniques 6:958] 참조) 또는 삽입성 작용제 (예: [Zon (1988) Pharm . Res . 5:539] 참조) 를 포함할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 올리고뉴클레오티드는 다른 분자, 예를 들어 폴리펩티드, 혼성화 촉발 가교-결합제, 수송제 또는 혼성화-촉발 절단제에 공액될 수 있다.
소분자
또한, 본 발명에는 생물학적 활성 분자로서 임의의 치료학적 소분자 또는 약물의 사용이 고려된다. 생물학적 활성 분자는 예를 들어 지질 분자일 수 있다. 생물학적 활성 분자는 당 분자일 수 있다. 생물학적 활성 분자는 유기 소분자 또는 무기 소분자일 수 있다.
변형된 항체 융합 단백질의 제조
본 발명은 통상적인 재조합 DNA 방법론을 활용하여 본 발명의 실시에 유용한 항체 융합 단백질을 생성할 수 있음을 이해한다. 항체 융합 구축물은 바람직하게는 DNA 수준에서 생성되고, 생성된 DNA 는 발현 벡터로 통합되고, 본 발명의 융합 단백질을 제조하기 위해 발현된다.
본 발명은 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 포함하는 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상에 연결되는 생물학적 활성 분자를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 하나의 구현예에서, 돌연변이는 면역글로불린 불변 부위의 435 위치에서 히스티딘을 알라닌 (H435A) 으로 대체하는 코돈 치환이다. 또한, 본 발명은 하기의 핵산 조성물을 제공한다: 제 1 핵산은 생물학적 활성 분자 및 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 인코딩하고; 제 2 핵산은 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 인코딩함. 핵산 중 하나는 FcRn 결합에 영향 미치는 돌연변이를 갖는 면역글로불린 불변 부위를 인코딩한다. 하나의 구현예에서, 돌연변이는 면역글로불린 불변 부위의 435 위치에서 히스티딘을 알라닌 (H435A) 으로 대체하는 코돈 치환이다. 또한, 핵산은 당업계에 공지된 추가 서열 또는 요소 (예: 프로모터, 인헨서, 폴리 A 서열 또는 친화도 태그) 를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 및 핵산 조성물은 당업계에 익히 공지되어 있는 재조합 기술을 사용하여 용이하게 합성될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 예를 들어 자동화 DNA 합성기의 사용에 의해 표준 방법에 의해 합성될 수 있다.
재조합 단백질 제조를 위해, 핵산 또는 핵산 조성물은 적절한 발현 운반체, 즉 벡터로 삽입되고, 이는 삽입되는 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필수 요소를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터" 는 숙주 세포로 혼입되고 숙주 세포 게놈과 재조합되고 숙주 세포 게놈으로 통합되는데 적임의 뉴클레오티드 서열 또는 에피좀으로서 자율적으로 복제하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미하는 것으로 이해된다. 그러한 벡터에는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스, 벡터 등이 포함된다. 바이러스 벡터의 비제한적 예에는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연계된 바이러스가 포함된다.
유용한 발현 벡터는 pdCs 이고 (Lo et al., (1988) Protein Engineering 11 :495), 이의 전사는 인간 거대세포바이러스 및 SV40 폴리아데닐화 신호의 인헨서/프로모터를 이용한다. 사용되는 인간 거대세포바이러스의 인헨서 및 프로모터 서열은 [Boshart et al., (1985) Cell 41:521] 에 제공되고 있는 서열의 -601 내지 +7 뉴클레오티드로부터 유래된다. 또한, 벡터는 선별 마커로서 디히드로엽산 환원효소 유전자 돌연변이체를 포함한다 (Simonsen and Levinson (1983) Proc . Nat . Acad . Sci USA 80:2495).
적절한 단리된 숙주 세포는 본 발명의 DNA 서열 내에 형질감염되거나 트랜스펙션될 수 있고, 표적 단백질의 발현 및/또는 분비에 이용된다. 본 발명에 사용되는 예시적인 단리된 숙주 세포는 불멸 하이드리도마 세포, NS/0 골수종 세포, 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포 및 COS 세포가 포함된다.
항체 융합 단백질의 사용 방법
본 발명은 또한 FcRn 결합 자리에서 돌연변이를 갖는 항체 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 제공한다. 용어 "약학적으로 허용가능한 부형제" 는 업계에서 인식되어 있는 약학 생성물을 제형화하는데 사용되는 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 운반체, 예컨대 액체 또는 고체 충전재, 희석제, 부형제 또는 용매를 지칭한다. 각각의 부형제는 대상체 조성물 및 이의 성분과 양립가능하고 환자에게 해롭지 않다는 점에서 "허용가능" 해야만 한다. 적합한 약학 담체의 예에는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin] 에서 기재되는 것이 있다. 부형제의 예에는 (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말형 트래거캔스; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예컨대 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-미포함 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) 포스페이트 완충제 용액; 및 (21) 약학 제형에서 사용되는 기타 비독성의 양립가능한 물질이 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 특정 분자와 양립가능한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해 직접적으로 (예: 조직 유전자자리에 주입, 이식 또는 국소 투여에 의한 바와 같이 국지적으로) 또는 전신적으로 (예: 비경구 또는 경구적으로) 포유동물에게 제공될 수 있다. 조성물이 비경구적으로, 예컨대 정맥내, 피하, 안구, 복강내, 근내, 구강, 직장, 질, 안와내, 뇌내, 두개내, 척수내, 심실내, 척추강내, 낭내, 관절내, 비강내, 또는 에어로졸 투여에 의해 제공되는 경우, 조성물은 바람직하게는 수성 또는 생리학적으로 양립가능한 플루이드 현탁액 또는 용액 부분을 포함한다. 따라서, 담체 또는 운반체는 환자에게 원하는 조성물을 전달하는 것 외에도 환자의 전해질 및/또는 부피 균형에 반대 영향을 미치지 않도록 생리학적으로 허용가능하다. 따라서, 작용제에 대한 플루이드 매질은 정상적인 생리 식염수를 포함할 수 있다.
본 발명은 그러한 병태를 갖는 포유동물에게 본 발명의 DNA, RNA 또는 단백질을 투여함으로써 다양한 암, 바이러스성 질환, 기타 질환, 관련 병태 및 이의 원인을 치료하는 방법을 제공한다. 관련 병태에는 염증성 병태 또는 자가면역 질환, 예컨대, 다발성 경화증, 관절염, 건선, 홍반 루푸스; 다양한 악성물, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 호치킨 질환, 기저 세포 암종, 자궁경부 이형성증 및 골육종; 하기를 포함하는 다양한 바이러스성 감염: 바이러스성 간염, 대상 포진 및 포진, 유두종 바이러스, 바이러스성 뇌염, 및 결핵; 빈혈; 및 지혈 장애가 포함되나, 이로써 한정되지 않는다.
본 발명의 융합 단백질의 최적 투여량은 치료될 질환 및 부작용의 존재에 의존적일 것이다. 최적 용량은 일상 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 투여 당 용량은 0.1 mg/㎡ - 100 mg/㎡, 1 mg/㎡ - 20 mg/㎡, 및 2 mg/㎡ - 6 mg/㎡ 의 범위일 수 있다. 융합 단백질의 투여는 주기적인 1회분 주입일 수 있거나, 외부 저장소 (예: 정맥내 백으로부터) 또는 내부 (예: 생물침식가능한 이식) 로부터 연속적인 정맥내 또는 복강내 투여에 의한 것일 수 있다. 더욱이, 본 발명의 융합 단백질 또한 복수의 상이한 생물학적 활성 분자와 함게 의도되는 수령기에 투여될 수 있음이 고려된다. 그러나, 융합 단백질과 다른 분자의 최적 조합, 투여 방식, 용량은 당업계 수준 내에서 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있음이 고려된다.
또한, 본 발명의 항체 융합 단백질이 상기 질환 또는 병태를 치료하기 위한 하나 이상의 다른 공지된 작용제와 조합으로 질환 또는 병태를 갖는 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있음이 고려된다.
실시예
실시예 1: huFc γ4h-모노-L- DI - IFN β 의 발현을 위한 DNA 서열의 구축
huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ (huFcγ4 경첩 돌연변이체-링커 단량체성 탈-면역화된 인터페론-β) 항체 융합 단백질은 인간 Fcγ4h 사슬 및 인간 Fc-γ4h-링커-DI-IFNβ 사슬로 이루어진 이종이량체이다. 인간 Fcγ4h 사슬 및 인간 Fc-γ4h-링커-DI-IFNβ 사슬을 공동발현시킴으로써 포유동물 세포에서 단백질을 생산하였고, 이의 전사 단위를 단일 플라스미드 또는 2 개의 별개의 플라스미드 내에 포함시켰다.
huFcγ4h (huFcγ4 경첩 돌연변이체) 를 인코딩하는 DNA 는 인간 IgG4 게놈 서열로부터 유래하였고 이후 반(half)-분자 형성을 최소화하기 위해 변형된 γ1 경첩 부위를 포함하도록 조작하였다. 경첩 부위에서 공유결합성 디술피드 결합을 형성하지 않는 IgG4 반 분자의 형성은 이미 보고되어 있다 (Angal et al. (1993) Mol . Immunol. 30:105).
인간 면역글로불린-감마 4 ( Fc γ4) 의 Fc 단편을 인코딩하는 DNA 서열의 구축
인간 IgG4 를 인코딩하는 게놈 서열을 HeLa 세포로부터 단리되는 세포성 DNA 로부터 수득하였다. 서열을, CH3 부위에서 3 개의 아미노산 잔기의 차이를 제외하고는 GenBank 에서 공보되어 있는 IgG4 서열 - 유전자자리 HUMIGCD2 (Accession K01316) 로 고도로 보존하였다. 공보된 서열은 R409, E419, V422 을 포함하는 반면, 본 서열은 K409, Q419, I422 을 포함했다. 흥미롭게도, K409 및 Q419 는 또한 인간 IgG1, IgG2 및 IgG3 에서 발견되고; I422 는 인간 IgG3 에서 발견된다. 기타 IgG 하위부류로부터 아미노산 치환으로 이루어진 그러한 알로타입의 결정요인은 아이소알로타입으로 공지되어 있고, 인간 IgG4 유전자의 아이소알로타입은 이미 보고되어 있다 (Brusco et al., (1998) Eur . J. Immunogenetics 25:349-355). Fcγ4 단편의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 에 나타낸다.
SEQ ID NO : 1 : huFc γ 4 의 펩티드 서열 (γ4 경첩 부위는 밑줄로 표시하고, K409, Q419, I422 는 볼드체로 표시함)
Figure pct00015
Fc γ 4 의 경첩 부위의 변형
반-분자의 형성을 최소화하기 위해, 아미노산 서열
Figure pct00016
를 갖는 γ4 경첩 부위를 아미노산 서열
Figure pct00017
을 갖는 변형된 γ1 경첩 부위로 대체하였다 (Lo et al., (1998) Protein Engineering 11 :495-500) (미국 특허 제 7,148,321 호).
Fcγ4 의 경첩 부위를 변형하기 위해, 천연 γ4 경첩 엑손 (볼드체) 을 포함하는 AflII - StuI 단편
Figure pct00018
을 보통 경쇄와 짝을 이루는 Cys 잔기를 제거한, Cys 내지 Ser 치환 (밑줄) 을 갖는 변형된 γ1 경첩 엑손 (볼드체) 을 포함하는 상응하는 AflII - StuI 단편
Figure pct00019
Figure pct00020
으로 대체하였다. γ1 및 γ4 엑손 둘 모두에서 StuI 자리가 C-메틸화되고 StuI 제한 엔도뉴클레아제가 메틸화에 민감하기 때문에, 둘 모두의 플라스미드는 이들이 StuI 효소로 소화되기 전에 박테리아의 DNA 사이토신 메틸라제 (DCM) 음성 가닥으로부터 단리되어야만 했다. 변형된 γ1 경첩 부위를 갖는 생성된 Fcγ4 를 Fcγ4h 로 지정하였다 (γ4h: 감마-4 경첩 돌연변이체).
IFN -β 의 클로닝 및 탈-면역화
성숙한 IFN-β 에 대한 코딩 서열을 인간 태반 DNA (Sigma, Poole, UK) 로부터 PCR 증폭시켰다. IFN-β 클론을 확인하기 위해 클로닝된 PCR 생성물을 서열화하고, 이의 아미노산 서열을 GenBank 에서 공보되어 있는 야생형 IFN-β 서열 - 유전자자리 XM_005410 로 완전히 매칭하였다.
탈-면역화된 IFN-β (DI-IFNβ) 는 강력한 T 헬퍼 세포 에피토프를 제거하기 위한 3 개의 아미노산 치환 (L57A, H131A, H 140A), 및 공유결합적 응집을 최소화하기 위한 하나의 아미노산 치환 (C17S) 을 포함한다. DI-IFNβ 을 인코딩하는 DNA 를 포유동물 발현 벡터 pdCs-huFc 로 클로닝하였고 (Lo et al., (1998) Protein Engineering 11 :495-500), 이는 IFN-β 서열이 아미노산 서열 G4SG4SG3SG 을 갖는 15 개의 아미노산 가요성 링커를 통해 인간 Fcγ4h 의 C-말단에 융합되도록 변형된 것이었다. 링커-DI-IFNβ 를 L-DI-IFNβ 로서 나타내고, 이의 서열은 SEQ ID NO: 2 (링커 (밑줄), 및 C17S, L57A, H131A, 및 H140A (볼드체)) 에 나타낸다.
SEQ ID NO : 2 : L-DI-IFNβ 의 펩티드 서열
Figure pct00021
분비를 위한 단일 펩티드로서 게놈 리더의 적합화
마우스 면역글로불린 경쇄 유전자로부터 게놈 신호 펩티드 서열 (438-bp) 을 huFcγ4h 및 huFcγ4h-L-DI-IFNβ 사슬 둘 모두의 분비를 위해 사용하였다. 신호 펩티드의 -2 아미노산 잔기 (-1 아미노산은 신호 펩티드의 C-말단 잔기임) 를 인코딩하는 유전자 서열을 신호 펩티드의 말단을 인코딩하는 DNA 가 CTTAAGC 이도록 세린 잔기에서 루신 잔기까지 (AGC 내지 TTA) 돌연변이생성하는 반면, CTTAAG 는 생성된 AflII 자리였다 (Lo et al., (1998) Protein Engineering 11:495-500). 또한, 코작 공통 서열 CCACCATGG 를 ATG 에서 전사 시작을 위한 최적의 리보솜 결합을 위해 도입하였다 (Kozak et al., (1986) Cell 44:283-292). 이는 서열
Figure pct00022
을 생성하기 위해 AAG 내지 GAG 로부터 시작 코돈 후 제 1 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성되는데, 여기서 코작 공통 서열은 밑줄로 표시하고 TCTAGA 는 XbaI 자리이다. 따라서, 신호 펩티드는 초기 코돈 후 제 1 아미노산 잔기에서 치환을 포함하고 -2 위치에서 아미노산 잔기에서 다른 치환을 포함한다. 신호 펩티드가 세포 내에서 신호 펩티다제에 의해 절단되고 분비 단백질에서 나타나지 않기 때문에, 이들 돌연변이는 Fcγ4h 및 Fcγ4h-L-DI-IFNβ 생성물의 아미노산 조성물에 영향 미치지 않는다.
huFc γ4h 및 huFc γ4h-L- DI - IFN β 사슬의 펩티드 및 DNA 서열
전체 huFcγ4h 및 huFcγ4h-L-DI-IFNβ 사슬에 대한 코딩 부위를 완전히 서열화하였다. huFcγ4h 및 huFcγ4h-L-DI-IFNβ 사슬의 펩티드 및 DNA 서열을 SEQ ID NO: 3 내지 SEQ ID NO: 6 로 나타냈다. huFcγ4h 및 L-DI-IFNβ 을 인코딩하는 DNA 단편의 라이게이션을 촉진하기 위해, SmaI 자리를 인간 IgG4 (GenPept 에서 유전자자리 CAC20457), 및 IgG1 및 IgG2 에서도 발견되는 PGK 서열을 사용하여 창출하였고 (Lo et al. (1998) Protein Engineering 11:495-500); 또한 CH3 의 C-말단 잔기에서 라이신 내지 알라닌 치환을 접합에서 잠재적인 절단을 최소화하기 위해 도입하였다. 중요하게도, CH3-L-DI-IFNβ 접합에서 생성 서열은 임의의 잠재적인 T 세포 에피토프를 창출하지 않았다.
SEQ ID NO : 3: huFcγ4h 의 펩티드 서열 (신호 펩티드 (밑줄))
Figure pct00023
SEQ ID NO : 4: 시작 코돈 번역에서부터 정지 코돈 번역까지의 huFcγ4h 사슬의 DNA 서열 (상부 경우에서의 코딩 서열 및 하부 경우에서의 비-코딩 서열)
Figure pct00024
Figure pct00025
SEQ ID NO : 5: huFcγ4h-L-DI-IFNβ 의 펩티드 서열 (신호 펩티드 및 CH3 말단에서 K 내지 A 치환을 밑줄로 표시하고; L-DI-IFNβ 는 볼드체로 표시함)
Figure pct00026
SEQ ID NO : 6: 시작 코돈 번역에서 정지 코돈 번역까지의 huFcγ4h-L-DI-IFNβ 사슬의 DNA 서열 (상부 경우에서의 코딩 서열 및 하부 경우에서의 비-코딩 서열)
Figure pct00027
실시예 2: γ 4 에서 H435A 치환을 포함하는 huFcv4h -모노-L- DI - IFN β 변이체의 발현을 위한 DNA 서열의 구축
γ4 에서 H435A 치환 (Kabat 번호화) 을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체의 발현을 위한 DNA 서열을 구축하였다. 이들은 이종이량체 huFcγ4h(H435A)/huFcγ4h-L-DI-IFNβ huFcγ4h/huFcγ4h(H435A)-L-DI-IFNβ 및 huFcγ4h(H435A)/huFcγ4h(H435A)-L-DI-IFNβ 를 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 네이키드 huFcγ4h 사슬 또는 huFcγ4h-L-DI-IFNβ 융합 단백질 사슬에서 H435A 치환을 인코딩하는 CAC 코돈에서 GCG 까지의 돌연변이를, 정방향 프라이머
Figure pct00028
(이때, GCG 는 알라닌 치환을 인코딩함), 및 역방향 프라이머
Figure pct00029
( SEQ ID NO: 13) (이때, CGC 는 알라닌 치환의 항-코돈임) 를 사용하여, 돌연변이생성 프라이머로 오버래핑 PCR 에 의해 도입하였다 (Daugherty et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:2471 -2476).
실시예 3: 융합 단백질의 발현
huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 이종이량체를 인간 Fcγ4h 사슬 및 인간 Fcγ4h-링커-DI-IFNβ 사슬을 공동발현시킴으로써 포유동물에서 생산하였고, 이의 전사 단위를 단일 플라스미드 또는 2 개의 별개의 플라스미드에 포함시켰다. 단백질 발현의 신속한 분석을 위해, 리포펙타민 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 사용하여 일시적인 트랜스펙션에 의해, 플라스미드 pdCs-Fcγ4h 및 pdCs-Fc Fcγ4h-링커-DI-IFNβ 또는 변이체를 인간 신장 293T 세포 (GenHunter Corporation, Nashville, TN) 에 도입하였다.
마우스 골수종 NS/0 및 중국 햄스터 난소 세포를 사용하여 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 이종이량체를 발현하는 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 수득하였다. 높은 수준의 발현을 위해, 인간 Fcγ4h 사슬 및 인간 Fcγ4h-링커-DI-IFNβ 사슬 전사 단위 둘 다를 포함하는 플라스미드 pdC 를 전기천공법에 의해 마우스 골수종 NS/0 세포로 도입하였다. NS/0 세포를 10% 열-불활성화되는 소태아 혈청, 2 mM 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium) 에서 성장시켰다. 약 5×106 세포를 PBS 로 1회 세척하고 0.5 ㎖ 의 PBS 로 재현탁하였다. 이후, 10 μg 의 선형화된 플라스미드 DNA 를 10 분 동안 얼음 상에서 Gene Pulser Cuvette (0.4 cm 전극 간극, BioRad) 에서 세포와 함께 인큐베이션하였다. 0.25 V 및 500 μF 에서 세팅되는 Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) 를 사용하여 전기천공법을 수행하였다. 세포를 얼음 상에서 10 분 동안 회수한 후, 이들을 성장 배지에서 재현탁하고 2 개의 96 웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 100 nM 메토트렉세이트 (MTX) 의 존재 하에 이들의 성장에 의해 선별하였고, 이는 2 일후-트랜스펙션 성장 배지에 첨가하였다. 세포를 2 내지 3 회 더 매 3 일마다 공급하였고, MTX-내성 클론이 2 내지 3 주안에 나타났다. 클론으로부터의 상청액을 고 생산자를 확인하기 위해 항-Fc ELISA 에 의해 검정하였다. 고 생산 클론을 단리하고 100 nM MTX 을 포함하는 성장 배지에서 번식시켰다. 통상 사용되는 성장 배지는 H-SFM 또는 CD 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 였다.
겔 전기영동에 의한 일상적 분석을 위해, 배지로 분비되는 huFc-IFNβ 융합 단백질을 Protein A Sepharose 비드 (Repligen, Cambridge, MA) 상에서 포획한 후, β-머캅토에탄올과 같은 환원제의 존재 또는 부재 하에서 단백질 샘플 완충제에서 샘플을 끓임으로써 용리하였다. 샘플을 SDS-PAGE (나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 로 분석하고, 단백질 밴드를 쿠마시 염색으로 가시화하였다. 도 8 은 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 이 293T 세포에서 인간 Fcγ4h 사슬 및 인간 Fcγ4h-링커-DI-IFNβ 의 일시적인 공동발현에 의해 생산됨을 나타낸다. 환원 조건 (좌측 패널) 하의 SDS-PAGE 분석의 레인 2 는, Fcγ4h 사슬 및 Fcγ4h-링커-DI-IFNβ사슬 둘 모두가 발현되고, 네이키드 Fc 가 융합 단백질 보다 높은 수준에서 발현됨을 나타낸다. 이들 2 개의 사슬은 이들 수준에서 공동발현되는 경우, 하나는 비환원 겔이 이항식의 a2 + 2ab + b2 (이때, a 및 b 는 환원된 겔에서 보여지는 바와 같이 각각 네이키드 Fc 사슬 및 융합 단백질 사슬의 상대적인 발현 수준임) 에 따르는 네이키드 Fc 동종이량체 : Fc/Fc-IFNβ 이종이량체 : Fc-IFNβ 동종이량체의 비를 나타내야만 함이 예측된다. 놀랍게도, 비-환원 조건 (중간 패널) 하의 SDS-PAGE 분석은, Fc-IFNβ 동종이량체 ("(Fc-X)2") 가 거의 생산되지 않음을 나타내고, Fc 및 Fc-IL-2 의 공동 발현으로 수득되는 보다 정상적인 패턴 (a2 + 2ab + b2 에 따른 비) 과 매우 대조적으로 비-환원 조건 (우측 패널) 하에서 또한 분석하였다. Fcγ4h 사슬 및 Fcγ4h-링커-DI-IFNβ 사슬을 공동발현하는 안정적인 클론은 Fc-IFNβ 동종이량체의 유사한 결핍을 가지고 (도 9), 이는 세포에서 Fc-IFNβ 동종이량체의 생산이 불리하고, 대개 IFNβ 그 자체가 응집하는 경향이 있기 때문에 단백질 접힘으로 인한 것임을 제시한다.
실시예 4: huFc γ4h-모노-L- DI - IFN β의 정제
Fc-포함 융합 단백질의 정제를 단백질 A 에 대한 Fc 단백질 부분의 친화도에 기초하여 수행하였다. 간단하게, 융합 단백질을 포함하는 세포 상청액을 예비-평형화된 Protein A Sepharose 컬럼에 적재하고 컬럼을 동일한 완충제 (150 mM 인산나트륨, 100 mM NaCl, 중성 pH) 에서 광범위하게 세척하였다. 결합된 단백질을 동일한 완충제에서 저 pH (pH 2.5 - 3) 에서 용리하고 용리 분획을 즉시 중성화하였다. huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 이종이량체를 Cibacron Blue 3GA (Blue Sepharose Fast Flow 컬럼; Pharmacia) 에 대한 IFNβ 단백질의 친화도에 기초하여 Fcγ4h 동종이량체로부터 용이하게 분리할 수 있었다. 발현된 융합 단백질을 포함하는 배양 상청액을 1 M NaCl로 조정하고 완충제 A (완충제 A: 20 mM 인산나트륨 (pH 7.2) 1 M NaCl) 로 예비-평형화된 Blue Sepharose Fast Flow 컬럼 상에 적재하였다. 컬럼을 완충제 A 의 10 컬럼 부피, 및 이어서 완충제 A : 완충제 B (완충제 B: 20 mM 인산 나트륨 (pH 7.2), 50% (v/v) 에틸렌 글리콜) 의 1 : 1 혼합물의 15 컬럼 부피로 세척하였다. 100% 완충제 B 중에서 이종이량체를 용리하고 1 ㎖ 의 분획을 0.5 ㎖ 완충제 A 를 포함하는 튜브로 수집하였다. 정제된 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 를 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 로 분석하고 항-IFNβ 항체로 탐침된 웨스턴 블롯에 의해 추가로 확인하였다.
실시예 5: FcRn 결합을 저지하는 단일 치환을 포함하는 면역글로불린- 및 huFc-모노- 리간드 변이체의 발현
Fc-SEED (WO2007/110205 참조) 로부터 유래되는 huFc-모노-L-DI-IFNβ 변이체를 huFc-AG2(H435A)/huFc-GA2-L-DI-IFNβ 형태로 제조하였다. 제조된 추가의 변이체는 IgG 하위부류 및 리간드 변이체, 예컨대 huFcγ1(H435A)/huFcγ1-IL2 및 탈면역화된 KS-γ1(H435A)/KS-γ1-IL2, 면역사이토카인으로 공지되어 있는 전체 IgG 융합 단백질 부류 (Davis et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:297-308) 를 포함한다.
H43 외에도, H310 또한 FcRn 결합에 관계된 것으로 보고되었다 (Kim et al. (1999) Eur . J. Immunol . 29:2819-2825). 따라서, H310A 치환을 포함하는 다른 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체를 huFcγ4h(H310A)/huFcγ4h-L-DI-IFNβ이종이량체 형태로 제조하였다.
실시예 6. 세포-기반 생물검정에서 huFc - IFN β 단백질 활성
Fc-IFNβ 융합 단백질의 활성을 항바이러스 검정에서 측정하였다. 바이러스 복제는 종종 세포에 대해 독성이고, 세포변성 효과 (CPE) 로서 공지된 효과인 세포 용균을 야기한다. 인터페론은 바이러스 증식을 저해하는 경로에 작용하고, CPE 로부터 세포를 보호한다. IFNβ 의 항바이러스 활성은 문헌 ["Lymphokines and Interferons : A Practical Approach," edited by M.J. Clemens, A.G. Morris, and AJ. H. Gearin, I.R.L. Press, Oxford, 1987] 에 기재된 바와 같이 CPE 가 감소되는 정도 (CPER) 를 측정함으로써 검정될 수 있었다. H435A 치환을 포함하는 정제된 Fcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 및 Fcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체의 항바이러스 활성을 뇌심근염바이러스 (EMCV; ATCC # VR 129B) 에 대한 숙주 세포로서 인간 폐 상피 암종 주 A549 (ATCC # CCL-185) 를 사용하는 Rebif 와 비교하였다. 유효 투여량 (ED50) 을 50% CPER (즉, 50% 의 세포가 보호됨) 로 야기된 단백질의 양으로서 세팅하고, 감염되지 않은 대조군 세포에 대해 측정하였다. 몰 기준으로, 둘 모두의 Fcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 및 Fcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체는 이러한 CPE 검정에서 적어도 Rebif 만큼 강력한 것으로 밝혀졌다 (도 10).
실시예 7. huFc - IFN β 단백질의 약물동태학
huFc-IFNβ 이종이량체성 융합 단백질 및 변이체의 약물동태학 (PK) 을 Balb/c 마우스 (n=3) 에서 측정하였다. 정맥내 투여를 위해, 25 μg 의 이종이량체성 융합 단백질을 각 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입하였다. 혈액을 헤파린-코팅된 튜브 내로 주입 (t = 0 분) 직후 수집하고 레트로-오르비탈 출혈에 의해 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간 후-주입하였다. 경피 투여를 위해, 50 μg 의 이종이량체성 융합 단백질을 마우스당 주입하였다. 혈액을 레트로-오르비탈 출혈에 의해 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 및 96 시간 후-주입으로 헤파린-코팅된 튜브로 수집하였다. 세포를 원심분리 (12,500 g 에서 4 분) 에 의해 제거하고 혈장에서 융합 단백질의 농도를, 항-(H&L) (AffiniPure Goat 항-Human IgG (H+L), Jackson lmmuno Research Laboratories, West Grove, PA) 포획 및 항-Fc (HRP-공액된 (Fab')2 이량체 염소 항-인간 IgG Fc, Jackson lmmuno Research Laboratories, West Grove, PA) 검출로 이루어진 항-huFc ELISA, 및 항-(H&L) 포획 및 항-huIFNβ (염소 항-인간 IFNβ 바이오틴화됨, R&D Systems, Minneapolis, MN) 검출로 이루어진 항-huFc-IFNβ ELISA 에 의해 측정하였다. 더욱이, 순환 융합 단백질의 온전도를 항-huFc 항체 또는 항-huIFNβ 항체로 탐침된 PK 혈청 샘플의 면역블롯에 의해 확인하였다.
도 11 및 12 는 각각 항-huFc ELISA 및 항-huFc-IFNβ ELISA 에 의해 측정시, 정맥내로 투여되는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 및 huFc4h(H435A)/huFcγ4h-L-DI-IFNβ 이종이량체 형태로 H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체의 약물동태학적 특성을 비교한다. huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 는 48 시간의 순환 반감기를 갖고, 이는 IFNβ 의 반감기 (분 단위) 보다 몇배 긴 것이다. 놀랍게도, H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체는 46 시간의 순환 반감기를 갖고, 이는 실험적 오류범위 내에서 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 의 순환 반감기와 본질적으로 동일하다. 또한, H435A 변이체는 야생형의 약 ⅔ 의 AUC (곡선 아래 면적) 를 갖고, 이는 IFNβ 의 수백배이다. 구체적으로, 항-huFc-IFNβ ELISA 는 융합 단백질을 검출하였고 IFNβ 부분의 N-말단 Fc 또는 C-말단 없이 임의의 절단된 단편이 아니다. 더욱이, 탐침기로서 항-huFc 항체 또는 항-hulFNβ 항체 중 하나를 이용하는 환원 조건 하에서 정맥내 PK 샘플의 웨스턴 블롯 분석으로, 융합 단백질이 생체내 온전히 유지됨을 확인하였다 (도 17). 도 17 의 상부 좌측 구획에서, 상부 화살표는 huFcγ4h-L-DI-IFNβ 폴리펩티드 사슬을 나타내고, 하단 화살표는 huFcγ4h 사슬을 나타낸다. 유사하게, 도 17 의 하단 좌측 구획에서, 상부 화살표는 huFcγ4h-L-DI-IFNβ 폴리펩티드 사슬을 나타내고, 하단 화살표는 huFcγ4h(H435A) 사슬을 나타낸다.
도 16 및 13 은 피하 투여되는 동일한 2 개의 분자의 약물동태학적 특성을 비교한다. huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 및 H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체는 유사한 순환 반감기를 갖고, 이는 IFNβ 의 그것에 비해 수배 긴 것이다. 놀랍게도, H435A 치환을 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체는 46 시간의 순환 반감기를 갖고, 이는 실험적 오류범위 내에서 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 의 순환 반감기와 본질적으로 동일하다. 또한, H435A 변이체는 야생형의 약 ⅔ 의 AUC (곡선 아래 면적) 를 가지며, 이는 IFNβ 의 수백배이다. 항-hu Fc ELISA 및 항-hu IFNβ ELISA 는 융합 단백질 분자의 2 개의 말단을 검출하였다. 더욱이, 탐침기로서 항-hu Fc 항체 또는 항-hu IFNβ 항체 중 하나를 사용하는 환원 조건 하의 피하 PK 샘플의 웨스턴 블롯 분석은, 융합단백질이 생체내에서 온전히 유지됨을 확인한다 (도 15). 도 15 의 상부 좌측 패널에서, 상부 화살표는 huFcγ4h-L-DI-IFNβ 폴리펩티드 사슬을 나타내고, 하단 화살표는 huFcγ4h 사슬을 나타낸다. 유사하게, 도 15 의 하단 좌측 패널에서, 상부 화살표는 huFcγ4h-L-DI-IFNβ 폴리펩티드 사슬을 나타내고, 하단 화살표는 huFcγ4h(H435A) 사슬을 나타낸다.
실시예 8. FcRn 결합을 저지하는 단일 치환을 포함하는 면역글로불린- 및 huFc-모노- 리간드 변이체의 감소된 면역원성
오직 하나의 폴리펩티드 사슬의 FcRn 결합을 저지하는 단일 치환을 포함하는 면역글로불린- 또는 huFc-모노-리간드 변이체의 감소된 면역원성을 입증하기 위해, 마우스를 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 또는 H435A 돌연변이를 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체로 면역화시켰다. 항체 역가를 면역화 후 적절한 시간에서 비교하였다.
암컷의 2 개의 군, 8주령 Balb/C 마우스 (군 당 5 마리의 마우스) 를 각각 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 또는 H435A 돌연변이를 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체의 33 μg/마우스로 피하 주사하였다. 제 15 일에, 마우스에, huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 또는 H435A 돌연변이를 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체의 33 μg/마우스의 피하 부스트 주입하였다. 마우스 항체 역가를 ELISA 에 의해 제 26 일에 측정하였다. 이는, 4℃ 에서 PBS 에서 밤새 인큐베이션 후 PBS 0.05% Tween 으로 세척함으로써, 1 μg 의 염소 항-마우스 IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, cat # 115-005-062) 로 96-웰 플레이트의 웰을 코팅하는 것으로 이루어졌다. 다음으로, 염소 항-마우스 IgG (H+L)-코팅된 플레이트를 1% 밀크로 블로킹하고, PBS 0.05% Tween 으로 4 회 세척하고, 건조시키고, -20℃ 에서 저장하였다. 마우스 항체를 포획하기 위해, 혈청을 1 : 1000 으로 초기에 희석한 후 PBS 0.05% Tween 에서 1:2 로 연속 희석하고 37℃ 에서 1 시간 동안 염소 항-마우스 IgG (H+L)-코팅된 웰에 첨가하였다. 이어서, 웰을 PBS 0.05% Tween 로 4 회 세척하였다. 면역원, huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 또는 H435A 돌연변이를 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체를, PBS 0.05% Tween 중 1:20,000 희석액의 F(ab)2 Goat 항-hu-IgG-Fc-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, cat # 109-036-098) 및 0.5 ㎍/㎖ 에서 첨가함으로써 포획된 항체를 검출하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션 한 후 PBS 0.05% Tween 으로 4 회 세척하였다. 신호 검출을 100 ㎕ 의 3',3',5',5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 을 사용하여 수행하고, 15 분 후, 100 ㎕ 의 2N H2SO4 로 반응을 정지시켰다.
도 15 는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 또는 H435A 돌연변이를 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체로 면역화된 마우스의 항체 역가를 비교한다. H435A 돌연변이 (다이아몬드형) 를 포함하는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체를 갖는 마우스는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ (원형) 으로 면역화된 마우스보다 낮은 역가를 갖고, 이는 변이체가 감소된 면역원성을 가짐을 나타내는 것이다. 군 사이의 비교는 쌍별비교시험 (Paired-t-test) 을 이용한 Sigma-Plot 에 의해 분석하였다. 2 개의 군 사이의 차이점은 통계학적으로 유의하였다 (정규성 시험: p=0.288, t=5.422, 자유 정도 7 (p=<0.001 )).
실시예 9. 생체외 T 세포 검정에 의한 면역원성 측정
H435A 돌연변이를 포함하는 huFc-모노-리간드 변이체가 야생형 사본 보다 적은 면역생성도인 것을 보여주기 위해, 본 발명자들은 단핵구 유래된 수지상 세포 (DC) 의 배양 및 성숙, DC 상의 항원 적재 및 제시, CD4+ T 세포에서 항원-유도된 반응의 측정을 포함하는 인간 T 세포 증식 검정을 이용하였다. 건강한 공여자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 DC 및 자가조직 T 세포 공급원으로서 제공하였다. 전형적으로, PBMC 를 leukopack 샘플로부터 Ficoll-Hypaque 구배에 의해 단리하고 단핵구를 MACS CD14 단리 키트 (Miltenyi Biotec Inc. Auburn, CA) 를 사용하여 정제하고, 5 일 동안 GM-CSF 및 IL-4 와 함께 배양하였다. 미성숙 DC 를 상이한 항원, 예컨대 파상풍 변성독소뿐 아니라 H435A 돌연변이를 갖는 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체, huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 으로 적재하였다. IFNβ 가 매우 강력한 면역억제 효과를 갖기 때문에, huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 및 huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체는, 보다 열에 민감한 IFNβ 부분이 보다 열 안정적인 Fc 가 이의 천연 형태로 남아 있는 동안 불활성화되도록 적당한 고온에서 열처리되어야만 했다. 이러한 선별적 불활성화를 위한 유용한 온도 범위는 56 내지 65℃ 이다. 대안적으로는, 불활성 IFNβ 부분을 포함하는 융합 단백질을 아미노산 치환을 통해 재조합적으로 제조할 수 있다.
DC 를 24 시간 동안 항원으로 인큐베이션한 후, DC 성숙을 유도하기 위해 이들을 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2 로 24 시간 동안 자극하였다. MACS CD4 단리 키트 (Miltenyi Biotec Inc. Auburn, CA) 를 사용하는 동일한 인간 PBMC 로부터 제조된 자가조직성 CD4+ T 세포를 CellTrace CFSE 증식 키트 (Invitrogen) 를 사용하여 숙시니미딜 에스테르 (CFSE) 및 카르복시플루오레세인 디아세테이트로 라벨링하였다. 이어서, DC 및 T 세포를 6 내지 7 일 동안 공동 배양한 후, 분열 T 세포의 % 를 FACS 상에서 측정하였다. huFcγ4h-모노-L-DI-IFNβ 변이체로부터 DC-제시된 펩티드에 의해 자극되는 자가조직성 T 세포 증식은 상응하는 야생형 Fc 융합 단백질에 대한 것들보다 낮은 것으로 예측되었다.
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gaatgagact attgttgaga acctcctggc taatgtctat catcagataa 1680 accatctgaa gacagtcctg gaagaaaaac tggagaaaga agatttcacc aggggaaaac 1740 tcatgagcag tctgcacctg aaaagatatt atgggaggat tctggcctac ctgaaggcca 1800 aggagtacag tgcctgtgcc tggaccatag tcagagtgga aatcctaagg aacttttact 1860 tcattaacag acttacaggt tacctccgaa actga 1895 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human y4 hinge region <400> 7 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified human y1 hinge region <400> 8 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AfIII-StuI fragment containing the native y4 hinge exon <400> 9 cttaagcgag tccaaatatg gtcccccatg cccatcatgc ccag 44 <210> 10 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified AfIII-StuI fragment containing the native y4 hinge exon <400> 10 cttaagcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cag 53 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genomic Leader <400> 11 tctagaccac catggag 17 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gctctgcaca acgcgtacac gcagaagag 29 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 ctcttctgcg tgtacgcgtt gtgcagagcc 30

Claims (26)

  1. 면역글로불린 불변 부위의 일부 이상을 각각 포함하는 제 1 및 제 2 중쇄 도메인을 포함하는 항체 융합 단백질로서, 상기 제 1 또는 제 2 중쇄 도메인 중 하나 이상이 생물학적 활성 분자에 융합되고, 상기 제 1 또는 제 2 중쇄 도메인 중 오직 하나가 불변 부위 내의 아미노산 서열의 돌연변이를 포함하고, 이때 돌연변이는 FcRn 결합의 부분적 또는 완전한 손실을 야기하는 항체 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 돌연변이가 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 및 447 위치 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기 치환인 항체 융합 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서, 돌연변이가 H435 의 하나 이상 치환인 항체 융합 단백질.
  4. 제 2 항에 있어서, 돌연변이가 H435A 인 항체 융합 단백질.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 분자가 면역글로불린 불변 부위의 아미노-말단에 연결되는 항체 융합 단백질.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 분자가 면역글로불린 불변 부위의 카르복시-말단에 연결되는 항체 융합 단백질.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 중쇄 도메인이 생물학적 활성 분자를 포함하는 항체 융합 단백질.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 중쇄 도메인이 경첩 부위를 포함하는 CH2 및 CH3 도메인이고 Fc 단편을 구성하는 항체 융합 단백질.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 중쇄 도메인이 항체 가변 도메인을 포함하여 전장 항체를 형성하는 항체 융합 단백질.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린이 IgG 인 항체 융합 단백질.
  11. 제 10 항에 있어서, IgG 가 IgG1, IgG2 또는 IgG4 인 항체 융합 단백질.
  12. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 제 1 및 제 2 중쇄 도메인이 경첩 부위를 포함하는 IgG 의 CH2 및 CH3 도메인이고 Fc 단편을 구성하고;
    (ii) 제 1 중쇄 도메인이 이의 C-말단을 통해 생물학적 활성 분자에 융합되고;
    (iii) 제 2 중쇄 도메인이 생물학적 활성 분자에 융합되지 않는
    이종이량체성 항체 융합 단백질.
  13. 제 12 항에 있어서, FcRn 결합의 손실 또는 감소를 야기하는 돌연변이가 생물학적 활성 분자에 융합되지 않는 중쇄 도메인에 위치하는 항체 융합 단백질.
  14. 제 12 항에 있어서, FcRn 결합의 손실 또는 감소를 야기하는 돌연변이가 생물학적 활성 분자에 융합되는 중쇄 도메인에 위치하는 항체 융합 단백질.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 분자가 사이토카인, 성장 인자, 성장 호르몬 및 치료학적으로 유효한 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 융합 단백질.
  16. 제 15 항에 있어서, 생물학적 활성 분자가 인간 인터페론 또는 인간 에리스로포이에틴인 항체 융합 단백질.
  17. 제 16 항에 있어서, 인간 인터페론이 인터페론-β (IFNβ) 인 항체 융합 단백질.
  18. 제 15 항에 있어서, 인간 IFNβ 의 아미노산 서열이 변경되는 항체 융합 단백질.
  19. 제 18 항에 있어서, IFNβ 서열이 천연 성숙 인간 IFNβ 에 상응하는 17, 50, 57, 130, 131, 136 및 140 위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함하는 항체 융합 단백질.
  20. 제 19 항에 있어서, 아미노산 치환이 C17S, C17A, C17V, C17M, F50H, L57A, L130A, H131A, K136A, H140A 및 H140T 로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 항체 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자.
  22. (i) IgG 불변 부위의 일부 이상에 융합되는 생물학적 활성 분자를 포함하는 제 1 중쇄 도메인을 인코딩하는 핵산, 및
    (ii) 생물학적 활성 분자에 융합되지 않는 IgG 불변 부위의 일부 이상을 포함하는 제 2 중쇄 도메인을 인코딩하는 핵산 (이때, 상기 IgG 불변 부위 또는 이의 일부 중 오직 하나가 FcRn 결합의 부분적 또는 완전한 손실을 야기하는 돌연변이를 포함함)
    을 포함하는, 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 항체 융합 단백질을 제조하는데 적합한 핵산 조성물.
  23. 제 21 항에 따른 핵산을 포함하는 복제가능한 발현 벡터.
  24. 제 23 항에 따른 발현 벡터, 또는 제 22 항의 (i) 에 따른 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터 및 제 22 항의 (ii) 에 따른 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  25. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 항체 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  26. 암, 바이러스 감염, 빈혈증 또는 다발성 경화증의 치료에 사용되는 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 항체 융합 단백질 또는 제 25 항에 따른 약학 조성물.
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