CZ20003099A3 - Zvýąení doby poloviční ľivotnosti cirkulujících fúzních proteinů odvozených od protilátek - Google Patents
Zvýąení doby poloviční ľivotnosti cirkulujících fúzních proteinů odvozených od protilátek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20003099A3 CZ20003099A3 CZ20003099A CZ20003099A CZ20003099A3 CZ 20003099 A3 CZ20003099 A3 CZ 20003099A3 CZ 20003099 A CZ20003099 A CZ 20003099A CZ 20003099 A CZ20003099 A CZ 20003099A CZ 20003099 A3 CZ20003099 A3 CZ 20003099A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibody
- fusion protein
- protein
- heavy chain
- based fusion
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 151
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 151
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 72
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 13
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 12
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 12
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 6
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 6
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 5
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 5
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 claims description 5
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 4
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 claims description 4
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 3
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 claims 4
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 claims 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010242 retro-orbital bleeding Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70514—CD4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Odkazy na související aplikace
Tento zahrnuje odkazem, a nárokuje prioritu a výhody plynoucí z U.S. Provisional Patent Application Seriál Number 60/075 887, která byla zařazena 25 února 1998.
Oblast techniky . -f
Předkládaný vynález se obecně vztahuje k fúzním proteinům. Konkrétněji se předkládaný vynález vztahuje k metodám zvýšení doby poloviční životnosti fúzních proteinů založených na protilátkách.
Dosavadní stav techniky
Použití protilátek pro léčení lidských onemocnění je dobře všeobecně zavedené a s uplatněním genetického inženýrství se stalo ještě propracovanější. Pro zvýšení užitečnosti protilátek se vyvinulo několik technik. Patři mezi ně: (1) tvorba monoklonálních protilátek, kdy se fúzí buněk vytvoří „hybridomy, nebo molekulárním klonováním těžkých (H - heavy) a lehkých (L - light) řetězců z buněk produkujících protilátky; (2) konjugace jiných molekul s protilátkami, aby se tak tyto molekuly dopravily na preferovaná místa in vivo (např. radioizotopy, toxické léky, proteinové toxiny a cytokiny); (3) manipulace s efektorovými funkcemi protilátky s cílem zvýšit nebo snížit biologickou aktivitu; (4) připojení jiného proteinu k protilátkám na genetické úrovni (jako například toxinů a cytokinů), s cílem vytvořit fúzní proteiny založené na protilátce;
(5) spojení jednoho nebo více souborů protilátku spojujících oblastí na genetické úrovni pro produkci bi-specifických protilátek.
Když se spojí proteiny, ať už chemickou nebo genetickou manipulací, je často těžké předpovědět, které vlastnosti rodičovských molekul si konečný produkt zachová. Chemickou konjugací r
β β β β β β e e ο ®β • · ···· * * · může dojít ke spojení na různých místech molekul a obecně dá vzniknout molekulám s různými stupni modifikace, které můžou ovlivnit funkci jednoho nebo obou proteinů. Použití genetických fůzí na druhé straně činí proces spojování konzistentnější a výsledkem je produkce konzistentních koncových produktů, které si zachovají funkci obou proteinových složek. Viz například Gillies et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 1428-1432 (1992); a U.S: Patent No.
650 150.
Užitečnost rekombinantně vzniklých fúzních proteinů založených na protilátce může být omezená jejich rychlým in vívo odstraněním z oběhu. Například se ukázalo, že fúzní proteiny protilátka-cytokin mají výrazně nižší dobu poloviční životnosti in vivo, než samotná protilátka. Při testování řady fúzních proteinů protilátka-cytokin Gillies et al. popsali, že všechny testované fúzní proteiny měly poloviční dobu životnosti a fáze (distribuční fáze) kratší než 1,5 hodiny. Skutečně, koncentrace většiny fúzních proteinů založených na protilátce byla během dvou hodin snížena na 10% koncentrace volných protilátek v séru. Viz Gillies et al., Bioconj. Chem. 4: 230-235 (1993). Je tady tedy nutnost pro metody zvyšující doby poloviční životnosti fúzních proteinů založených na protilátkách cirkulujících in vivo.
Podstata vynálezu
Vynalezla se nová metoda pro zvýšení doby poloviční životnosti in vivo cirkulujících fúzních proteinů založených na protilátkách. Konkrétně předkládaný vynález poskytuje metody pro produkci fúzních proteinů mezi imunoglobuliny s redukovanou vazebnou afinitou k Fc receptoru a druhým, neimunoglobulinovým proteinem. Fúzní proteiny založené na protilátce s omezenou afinitou pro Fc receptory mají významně delší dobu poloviční životnosti při cirkulaci in vivo, než nepřipojený druhý neimunoglobulinový protein.
IgG molekuly interagují s třemi třídami Fc receptorů (FcR) specifických pro IgG třídu protilátek, jmenovitě s FcyRI, FcyRII, FcyRIII. V preferovaném případě obsahuje imunoglobulinová složka (Ig) fúzního proteinu alespoň část konstantní oblasti IgG, která má c e e e c sníženou vazebnou afinitu pro alespoň jeden z receptorů FcyRI, FcyRII, FcyRIII.
V jednom aspektu vynálezu je vazebná aktivita fúzních proteinů pro Fc receptory redukovaná použitím isotypů těžkých řetězců jako fúzních partnerů s redukovanou vazebnou afinitou pro Fc receptory na buňkách. Například u lidských IgGl a IgG3 byla popsána vysoká afinita pro FcyRI, zatímco IgG4 se váže lOx méně a IgG2 se neváže vůbec. Důležité sekvence pro vázbu IgG k Fc receptorům se nachází na CH2 doméně. V preferované formě vynálezu se tak fúzní protein založený na protilátce se zvýšenou doby poloviční životnosti při cirkulaci in vivo získá připojením alespoň CH2 domény IgG2 nebo IgG4 k druhému neimunoglobulinovému proteinu.
V jiném aspektu vynálezu je vazebná afinita fúzních proteinů k Fc receptorům redukovaná vnesením genetické modifikace jedné nebo více aminokyselin v konstantní oblasti těžkých řetězců IgGl nebo IgG3, což zmenší vazebnou afinitu těchto izotypů pro Fc receptory. Takovéto modifikace zahrnují změnu zbytků nezbytných pro kontakt s Fc receptory, nebo změnu jiných, které ovlivňují spojení mezi jinými rezidui těžkého řetězce a Fc receptory díky vyvolaným konformačním změnám. V preferovaném případě se tak fúzní protein založený na protilátce se zvýšenou doby poloviční životnosti při cirkulaci in vivo získá nejprve vnesením mutace, delece nebo inzerce do konstantní oblasti IgGl na pozici jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny Leu234, Leu235, Gly236, Asn297 a Pro13i a potom spojením vzniklého imunoglobulinu, nebo jeho části, s druhým, neimunoglobulinovým proteinem. V jiném preferovaném případě je mutace, delece nebo inzerce vnesena do konstantní oblasti IgG3 na pozici jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny Leu28i, Leu2S2, Gly283, Gly284 , Asn344 a Pro378 a potom spojením vzniklého imunoglobulinu nebo jeho části s druhým neimunoglobulinovým proteinem. Výsledný fúzní protein založený na protilátce má delší dobu poloviční životnosti při cirkulaci in vivo než nepřipojený druhý neimunoglobulinový protein.
V preferované formě je druhá neimunoglobulinová složka fúzního proteinu cytokin. Zde používaný termín „cytokin popisuje proteiny, jejich analoga a jejich fragmenty, které jsou produkovány a sekretovány buňkou a které vyvolávají specifickou odpověď v buňce, c ο β β β β « 6 sc se která má receptor pro tento cytokin. Cytokiny přednostně zahrnují interleukiny, jako například interleukin-2 (IL-2), hematopoetické faktory, jako faktor stimulující růst kolonie granulocytárních mikrofágů (granulocyte-macrophage colony stimulationg factor,
GM-CSF), tumorový nekrózní faktor (tumor necrosis factor, TNF) jako TNFa a lymfokiny, jako například lymfotoxin (lymphotoxin).
Přednostně fúzní protein předkládaného vynálezu protilátka-cytokin vykazuje cytokinovou biologickou aktivitu.
V jiné preferované formě je druhá neimunoglobulinová složka fúzního proteinu ligand vázající protein s biologickou aktivitou. Takovéto ligand vázající proteiny můžou například (1) blokovat interakce receptor-ligand na povrchu buňky, nebo (2) neutralizovat biologickou aktivitu molekuly (například cytokinu) v tekuté fázi krve a tak zabránit jejímu dosažení buněčného cíle. Preferuje se, když ligand vázající proteiny zahrnují CD4, CTLA-4, TNF receptory, nebo receptory interleukinů, jako receptory IL-1 a IL-4. Přednostně fúzní protein protilátka-receptor předkládaného vynálezu vykazuje biologickou aktivitu ligand vázajícího proteinu.
V dalším možném preferovaném případě je druhá neimunoglobulinová složka fúzního proteinu proteinový toxin. Přednostně vykazuje fúzní protein předkládaného vynálezu protilátka-toxin toxickou aktivitu proteinového toxinu.
V preferované formě obsahuje fúzní protein založený na protilátce variabilní oblast specifickou pro cílový antigen a konstantní oblast spojenou peptidovou vazbou s druhým neimunoglobulinovým proteinem. Konstantní oblast může být konstantní oblast normálně spojená s variabilní oblastí, nebo nějaká jiná, například variabilní a konstantní oblasti z různých druhů. Těžký řetězec může zahrnovat CH1, CH2 a/nebo CH3 domény. Termín „fúzní protein také zahrnuje konstrukty s vazebnou oblastí obsahující úseky základní struktury (framework regions) a variabilní oblasti (tj. oblasti určující komplementaritu) z různých druhů, jak je například uvedeno v práci Winter et al., GB 2, 188, 638. Fúzní proteiny založené na protilátce obsahující variabilní oblast přednostně vykazují vazebnou specifitu pro antigen. V ještě další preferované formě fúzní protein založený na protilátce obsahuje lehký řetězec. Vynález tak poskytuje fúzní proteiny, kde jsou
vazebná specifita pro antigen a aktivita protilátky kombinované s potenciální biologickou aktivitou druhého neimunoglobulinového proteinu, jako například cytokinu. Fúzní protein předkládaného vynálezu se může použít pro selektivní transport druhého neimunoglobulinového proteinu k cílové buňce in vivo, takže druhý neimunoglobulinový protein může uplatnit lokalizované biologický účinek.
V jiné preferované formě fúzní protein založený na protilátce obsahuje konstantní oblast těžkého řetězce spojenou peptidovou vazbou s druhým neimunoglobulinovým proteinem, ale neobsahuje variabilní oblast těžkého řetězce. Vynález tak navíc poskytuje fúzní proteiny, které si zachovají potenciální biologickou aktivitu druhého, neimunoglobulinového proteinu, ale které nemají vazebnou specifitu pro antigen a aktivitu protilátky.
V preferovaných formách fúzní proteiny založené na protilátce předkládaného vynálezu dále obsahují sekvence nezbytné pro vázání k Fc chráněným receptorům (Fc protection receptors, FcRp), jako například neonatálnímu intesfinálnímu transportnímu receptoru (FcRn) obsahujícímu beta-2 mikroglobulin.
V preferovaných formách fúzní protein obsahuje dva chimérické řetězce obsahující alespoň část těžkého řetězce a druhý, ne-Ig protein, spojené disulfidovou vazbou.
Vynález také zahrnuje DNA konstrukty kódující výše popsané fúzní proteiny a buněčné linie, například myelomy transfekované těmito konstrukty.
Tyto a další cíle společně s výhodami a vlastnostmi vynálezu zde popsané budou zřejmější z následujících popisů, obrázků a nároků.
Přehled obrázků na výkresech
Výše uvedené a další cíle, vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu a také sám vynález můžou být plně pochopené z následujících popisů preferovaných forem, jsou-li studovány společně s doprovodnými obrázky, kde:
Obr. 1 je homologní seřazení aminokyselinových sekvencí konstantní oblasti Cyl a Cy3 provedené tak, aby se maximalizovala aminokyselinová shodnost a kde jsou nekonzervované aminokyseliny identifikované okénky;
Obr. 2 je homologni seřazení aminokyselinových sekvencí konstantní oblasti Cyl, Cy2 a Cy4, provedené tak, aby se maximalizovala shoda aminokyselin a kde jsou nekonzervované aminokyseliny identifikované okénky;
Obr. 3 je schematické znázornění mapy genetických konstruktů kódujících fúzní protein založený na protilátce ukazující důležitá restrikční místa;
Obr. 4 je sloupcový graf znázorňující vazbu protilátky hu-KS-1/4 a fúzních proteinů založených na protilátce, hu-KSyl-IL a hu-KSY4-IL, k Fc receptorům na myších J774 buňkách za přítomnosti (vyplněné sloupce) nebo nepřítomnosti (tečkované sloupce) přebytku myších IgG;
Obr. 5 je čárový graf znázorňující koncentraci celkových protilátek in vivo v plazmě (volná protilátka a fúzní protein) u hu-KSyl-IL2 (uzavřené kosočtverce) a hu-KSy4-IL2 (uzavřené trojúhelníky) a neporušeného fúzního proteinu u hu-KSyl-ILŽ (otevřené kosočtverce) a hu-KSy4-IL2 (otevřené trojúhelníky) jako funkci času;
Obr. 6 je schematické znázornění protokolu pro konstrukci fúzního proteinu založeného na protilátce s mutací, která snižuje vazebnou afinitu k Fc receptorům;
Obr. 7 je čárový graf znázorňující in vivo koncentraci plasmy intaktního fúzního proteinu hu-KSyl-IL2 (0); mutovaného hu-KSyl-ILŽ (□) a hu-KSy4-IL2 (Δ) jako funkce času.
Podrobný popis vynálezu
Zjistilo se, že fúze druhého proteinu k imunoglobulinu, jako například cytokinu, může změnit strukturu protilátky (čímž se zvýší vazebná afinita pro jeden nebo více na buňku vázaných Fc receptorů) a vést k rychlému odstranění fúzního proteinu založeného na protilátce z oběhu. Předkládaný vynález popisuje fúzní proteiny založené na protilátce se zvýšenou dobou poloviční životnosti při cirkulaci in vivo a zahrnuje produkci fúzních proteinů založených na
| • · · · · · • » · | • · · • · · · | ·· ·· ·- ·· · |
| • · · | • · · · · | • · · · · · |
protilátce (technologií rekombinanatní DNA) s omezenou vazebou afinitou pro jeden nebo více Fc recpetor.
Za prvé se může získat fúzní protein založený na protilátce se zvýšenou dobou poloviční životnosti cirkulace in vivo tvorbou fúzního proteinu s izotypy s omezenou vazebnou aktivitou pro Fc receptor a vynecháním sekvencí z izotypů protilátky, které se vážou k Fc receptorům. Je například známé, že ze čtyř známých izotypů IgG se IgGl (Cyl) a IgG3 (Cy3) váží FcRyl s vysokou afinitou, zatímco IgG4 (Cy4) má lOx nižší vazebnou afinitu a IgG2 (Cy2) se k FcRyl neváže vůbec. Konstrukcí fúzního proteinu s Cy2 konstantní oblastí (Fc oblast) nebo Cy4 Fc oblastí a vyvarováním se konstruktů s Cyl Fc oblastí nebo Cy3 Fc oblastí by se mohl získat fúzní protein založený na protilátce se sníženou vazebnou afinitou pro Fc receptor.
Za druhé se může získat na protilátce založený fúzní protein se zvýšenou dobou poloviční životnosti cirkulace in vivo úpravou sekvencí nezbytných pro vázání k Fc receptorům u isotypů, které mají vazebnou afinitu pro Fc receptor, s cílem snížit nebo vyloučit vazbu. Jak je uvedeno výše, IgG molekuly vzájemně reagují s třemi třídami Fc receptorů (FcR), jmenovitě s FcyRI, FcyRII a FcyRIII. Cyl a Cy3 váží FcyRI s vysokou afinitou, zatímco Cy4 a Cy2 mají sníženou nebo žádnou afinitu k FcyRI. Porovnání Cyl a Cy3 naznačuje, že s výjimkou rozšířeného spojovacího segmentu (extended hinge segment) u Cy3 je homologie aminokyselinové sekvence mezi těmito dvěma izotypy velmi vysoká. Tak je tomu i u těch oblastí, které interagují s Clq fragmentem komplementu a různými třídami FcyR. Obr. 1 znázorňuje porovnání aminokyselinových sekvencí Cyl a Cy3. Ostatní dva izotypy lidského IgG (Cy2 a Cy4) mají odlišnosti v sekvenci, které jsou spojené s vazbou FcR. Obr. 2 porovnává aminokyselinové sekvence Cyl, Cy2 a Cy4. Důležité sekvence pro vázání FcyR jsou LeuLeu-Gly-Gly (zbytky 234 až 237 v Cyl) umístěné v CH2 oblasti sousedící se spojem. Canfield a Morrison, J. Exp. Med 173: 1483-1491 (1991). Tyto sekvenční motivy jsou konzervované u Cyl a Cy3, což je v souladu s jejich společnými biologickými vlastnostmi a možná také ve vztahu k podobnému farmakokinetického chování, když jsou použité pro konstrukci IL-2 fúzních proteinů. Aby se ukázal účinek specifické mutace na vazbu FcR, provedlo se mnoho mutačních analýz, včetně těch, které zahrnovaly zbytky 234-237 a také se spojem
sousedícím ohybovým zbytkem Pro33i, který je nahrazen u IgG4 Ser.
Jiným důležitým strukturním komponentem nezbytným pro účinné vázání FcR je přítomnost k N-konci připojeného glycidového řetězce kovalentně navázaného k Asn297 · Enzymatické odstranění této struktury nebo mutace Asn zbytku účinně zruší nebo alespoň dramaticky sníží vázání ke všem třídám FcyR.
Brumbell et al. předpokládá existenci ochranného receptoru (FcRp), který by zpomaloval katabolizmus cirkulujících protilátek navázáním k Fc části protilátek a který by je nasměroval po pinocytóze do buněk zpět do cirkulace. Brumbell et al., Nátuře 203:1352-1355 (1964). Jako FcRp byl nedávno identifikován beta-2-mikroglobulin, obsahující neonatální intestinální transportní receptor (FcRn). Viz Junghans et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 93:5512-5516 (1996). Sekvence nezbytné pro vázání k tomuto receptoru jsou konzervované u všech čtyřech tříd lidských IgG a jsou umístěné v propojení mezi CH2 a CH3 doménami. Viz Medesan et al., J. Immunol. 158:2211-2217 (1997). Tyto sekvence jsou důležité z hlediska doby poloviční životnosti cirkulujících protilátek in vivo. Viz Mezinárodní PCT publikace WO 97/34631. Preferované na protilátce založené fúzní proteiny tak budou mít sekvence pro vázání k FcRp.
Popsané jsou metody pro syntetizování užitečných forem vynálezu a také testy pro testování jejich farmakokinetických aktivit jak in vitro, tak na preklinických in vivo zvířecích modelech. Preferovaný genový konstrukt kódující chimérický řetězec zahrnuje, při 5'-3' orientaci, DNA úsek, který kóduje alespoň část imunoglobulinu a DNA, která kóduje druhý, neimunoglobulinový protein. Jiný preferovaný genový konstrukt zahrnuje v 5' -3' orientaci DNA segment, který kóduje druhý neimunoglobulinový protein a DNA, která kóduje alespoň část imunoglobulinu. Fúzní gen je sestaven v nebo vložen do expresního vektora pro transfekci vhodných cílových buněk, kde je exprimován.
Vynález je dále objasněn některými následujícími příklady:
Příklad 1 e · · · e β ββ ee
Zlepšení doby poloviční životnosti in vivo cirkulujících fúzních proteinů protilátka-IL-2 výměnou'třídy konstantních oblastí IgG z Cyl na Cy4.
Podle předkládaného vynálezu se může získat fúzní protein založený na protilátce se zvýšenou dobou poloviční životnosti při cirkulaci in vivo konstrukcí fúzních proteinů založených na protilátce s využitím sekvencí z protilátkových izotopů, které mají sníženou nebo žádnou vazebnou afinitu k Fc receptorům.
Pro posouzení, jestli se může zvýšit doba poloviční životnosti fúzního proteinu založeného na protilátce při cirkulaci in vivo využitím sekvencí z izotopů protilátek se sníženou nebo žádnou vazebnou afinitou k Fc receptorům, se porovnaly fúzní protein protilátka-IL-2 s lidskou Cyl konstantní oblastí (Fc oblast) s fúzním proteinem protilátka-IL-2 s lidskou Cy4 Fc oblastí.
1.1 Příprava fúzního proteinu protilátka-IL-2 s Cy4 IgG konstantní oblastí.
Příprava fúzních proteinů protilátka-IL2 s Cyl konstantní oblastí byla popsána již dříve, například v práci Gillies et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 1428-1432 (1992) a U.S. Patent No.
650 150, jenž jé zde zahrnut odkazem.
Pro konstrukci fúzních proteinů protilátka-IL2 s konstantní oblastí Cy4 se modifikoval plazmidový vektor schopný exprimovat fúzní protein humanizovaná protilátka-IL2 (s variabilními oblastmi (V) specifickými pro lidský pankarcinomatický antigen (human pancarcinoma antigen - KSA)) a lidský Cyl těžký řetězec spojený s lidským IL-2 (odstraněním Cyl genového fragmentu a jeho nahrazením odpovídající sekvencí lidského Cy4 genu). Plán některých důležitých restrikčních míst a místo vložení Cy4 genového fragmentu je uveden na obr. 3. Tyto plazmidové konstrukty obsahují časný promotor z cytomegaloviru (CMV) pro transkripci mRNA kódující lehký (L) a těžký (H) řetězec variabilních (V) oblastí odvozených z myší protilátky KS-1/4. Myší V oblasti se polidštily standardními metodami a jejich kódující DNA sekvence se syntetizovaly chemicky.
Na konec každé V oblasti se přidala funkční sestřihová donorová
0« esee «9 ββ oblast, takže se mohla použít pro ve vektorech obsahujících geny H a L řetězce konstantní oblasti. Gen lidského CK lehkého řetězce se včlenil ve, směru (downstream) klonovacího místa pro VL gen a pak následovala jeho endogenní 3' netranslatovaná oblast a polyadenylační místo. Tuto transkripční jednotku následovala druhá nezávislá transkripční jednotka pro fúzní protein těžký řetězec-IL2. Ten je také řízen CMV promotorem. Sekvence kódující VH se umístila proti směru (upstream) DNA kódující Cy těžký řetězec vybraného genu připojeného k sekvencím kódujícím lidský IL-2. Takovéto Cy geny obsahují akceptorová místa sestřihu pro první exon těžkého řetězce (CH1) ve směru od jediného restrikčního místa pro HindlII, běžného u všech lidských Cy genů. Na konec sekvence kódující IL-2 se vložilo 3' netranslatované a polyadenylační místo z SV40. Zbytek vektora obsahoval bakteriální plazmidovou DNA nezbytnou pro množení v E coli a geny značek pro výběr transfekovaných savčích buněk (dyhydrofolát reduktáza - dihydrofolate reductase, dhfr).
Výměna fragmentů Cyl a Cy4 se provedla vyštěpením původní plazmidové DNA obsahující Cyl restrikčními enzymy HindlII a Xhol a purifikací fragmentu o velikosti 7,8 kb elektroforézou na agarósovém gelu. Druhá plazmidová DNA obsahující Cy4 gen se vyštěpila restrikčními enzymy HindlII a Nsil a purifikací se získal fragmentu o velikosti 1,75 kb. Z třetího plazmidu, obsahujícího lidskou IL-2 cDNA a polyA oblast z SV40 připojené ke karboxykonci lidského Cyl genu, se vyštěpil restrikčními enzymy Xhol a Nsil a potom vypurifikoval malý fragment o velikosti 470 bp. Všechny tři fragmenty se spojily dohromady ve zhruba stejném ekvimolárním množství a produkty ligace se použily pro transformaci kompetentních E coli. Transformované kolonie se vyselektovaly pěstováním na růstových miskách obsahujících ampicilin. Správně sestavené rekombinantní plazmidy se identifikovaly restrikční analýzou z transformantů- izolované plazmidové DNA - pro odlišení mezi genovými inzerty Cyl (bez Fsp I) a Cy4 (jedno místo) se použilo štěpení Fsp I. Konečný vektor obsahující zaměněný těžký řetězec Cy4-IL2 se vnesl do myších myelomových buněk a kultivací v médiu s metotrexátem (methotrexate) v koncentraci 0,1 uM se vyselektovaly transfektanty. Buněčné klony exprimující vysoké hladiny fúzního proteinu protilátka-IL2 se namnožily a ze supernantantu kultury se ····«· ·· · ·· ' ·« • · · ···· · · · · • · · ··· ···· · • · · · · · ··· ·· · ·· ··· ·· ···· purifikoval fúzní protein s využitím chromatografie na protein A Sepharose. Čistota a integrita fúzního proteinu Cy4 se určila SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézou. Aktivita IL-2 se určila měřením proliferace T-buněk v proliferačním testu a zjistilo se, že je stejná jako u Cyl konstruktu.
1.2 Vazba Fc receptorů protilátkami a fúzními proteiny protílátka-IL2 s Cyl a Cy4 IgG konstantní oblastí.
Různé myší a lidské buněčné linie exprimují jeden nebo více Fc receptorů. Například myší buněčná linie J774 podobná makrofágům exprimuje FcRyl, který je schopný navázání myších nebo lidských IgG příslušných podtříd. Podobně lidská erytroleukemická (erytroleukemic) buněčná linie K562 exprimuje FcRylI, ale ne FcRyl. Aby se posoudil potenciální příspěvek vazby Fc receptorů na odstraňování fúzních proteinů založených na protilátkách z oběhu, porovnaly se vazebné afinity protilátky, Cyl-IL2 fúzního proteinu a Cy4-IL2 fúzního proteinu k FcRyl u myší buněčné linie J774.
Dva fúzní proteiny protilátka-IL2 popsané v Příkladě 1, hu-KSyl-IL2 a hu-KSy4-IL2, se zředily na 2 ug/ml v PBS obsahujícím 0,1% hovězího sérového albuminu (BSA), společně s 2xl05 J774 buněk v konečném objemu 0,2 ml. Po dvacetiminutové inkubaci na ledu se přidal konjugát FITC-protilidská IgG Fc protilátka (Fab2) a inkubace pokračovala dalších 30 minut. Nenavázané protilátky se odstranily dvojnásobným promytím s PBS-BSA a buňky se analyzovaly na fluorescenčně aktivovaném buněčném rozdružovacím stroji (FACS). Kontrolní reakce obsahovaly stejné buňky smíchané se samotnými druhotnými protilátkami značenými FITC nebo s polidštěnou KSyl protilátkou (bez IL-2).
Jak se očekávalo, vazba fúzního proteinu Cy4-IL2 k J774 buňkám byla významně menší, než vazba fúzního proteinu Cy4-IL2. Viz obr. 4. Oba fúzní proteiny, tedy jak Cy4-IL2, tak Cyl-IL2, však neočekávaně vykazovaly významně vyšší vázbu k buňkám J774 než KSyl protilátka (bez IL-2). To naznačuje, že fúze druhého proteinu, jako například cytokinu, k imunoglobulinu může změnit strukturu protilátky vedoucí ke zvýšení vazebné afinity pro jeden nebo více na buňku navázaných Fc receptorů, což může vést k jejich rychlému odstranění z oběhu.
·· ···· • · · ·· ··♦·
Aby se určilo, jestli větší vázání pozorované u IL-2 fúzních proteinů bylo dané přítomností receptorů IL-2, nebo receptorů FcRyl na buňkách, použil se pro kompetici vazby s Fc receptory přebytek myších IgG (mlgG). Jak je ukázáno na obr. 4, daly se v přítomnosti padesátinásobného molárního přebytku mlgG pozorovat hodnoty pozadí vázání u protilátky a obou fúzních proteinů protilátka-IL2. To naznačuje, že zvýšený signál navázání fúzních proteinů protilátka-IL2 byl dán zvýšeným vázáním k Fc receptorů.
Buněčné linie exprimující Fc receptory jsou užitečné pro testování vazebných afinit možných fúzních proteinů k Fc receptorům s cílem identifikovat fúzní proteiny založené na protilátce se zvýšenou dobou poloviční životnosti in vivo. Kandidátní fúzní proteiny založené na protilátce se můžou testovat výše popsanými metodami. Kandidátní fúzní proteiny založené na protilátce s podstatně sníženou vazebnou aktivitou pro Fc receptor se budou identifikovat jako fúzní proteiny založené na protilátce se zvýšenou dobou poloviční životnosti in vivo.
1.3 Měření doby poloviční životnosti cirkulujících fúzních proteinů protilátka-IL2 s Cyl a Cy4 konstantní oblastí IgG.
Pro zhodnocení toho, jestli použití Fc oblasti IgG izotypu se sníženou afinitou pro Fc receptory zvýší dobu poloviční životnosti při cirkulaci in vivo, se porovnaly fůzní proteiny obsahující Cyl izotyp těžkého řetězce (tj. hu-KSyl-IL2) s fúzními proteiny obsahující Cy4 izotyp těžkého řetězce (tj. hu-KSy4-IL2).
U purifikovaných polidštěných KS-1/4-IL2 fúzních proteinů, obsahující těžké řetězce buď Cyl nebo Cy4 izotypu, se provedla diafiltrací výměna pufru na PBS a dále se zředily na koncentraci asi 100 ug/ml. Přibližně 20 ug fúzního proteinu založeného na protilátce (0,2 ml) se pomalu injikovalo 6-8 týdnů starým Balb/c myším do ocasní žíly. V každé skupině se použily pro injekci čtyři myši.
V různých časových intervalech se umrtveným zvířatům retroorbitálním krvácením (retro-orbital bleeding) odebraly malé vzorky . krve a uchovaly ve zkumavkách s citrátovým pufrem, který zabraňoval srážení. Buňky se odstranily centrifugací v Eppendorf zkumavkách na vysokoobrátkové stolní centrifuze po dobu 5 minut. Mikropipetou se «« ·»·« • · · · ♦ · • · · · · 9 · ·· 999 odebrala plasma a zmrazila při ~70 °C. Koncentrace determinant lidských protilátek v myší krvi se měřila ELISA technikou. Zachytávající protilátka, specifická pro H a L řetězce protilátek, se použila pro zachycení fúzních proteinů ze zředěných vzorků plasmy. Po dvou hodinách inkubace na protilátkou pokrytých 96-ti jamkových destičkách se odstranil nenavázaný materiál trojnásobným promytím ELISA pufrem (0,01% Tween 80 v PBS). Pro druhý inkubační krok se použila buď protilátka proti lidskému Fc (pro detekci jak protilátky, tak intaktního fúzního proteinu), nebo protilátka proti lidskému IL-2 (pro detekci samotného fúzního proteinu). Obě protilátky se konjugovaly s křenovou peroxidázou (HRP). Po jedné hodině inkubace se nenavázané detekční protilátky .odstranily promytím ELISA pufrem a množství navázané HRP se určilo inkubací se substrátem a proměřením na spektrofotometru.
Jak je znázorněné na obr. 5, alfa fáze poloviční životnosti fúzního proteinu hu-KSy4-IL2 byla podstatně delší, než alfa fáze poloviční životnosti fúzního proteinu hu-KSyl-IL2. Zvýšenou poloviční životnost je možné nejlépe doložit podstatně většími koncentracemi hu-KSY4-IL2 fúzního proteinu (3,3 ug/ml) v porovnání s fúzním proteinem hu-KSyl-IL2 (60 ng/ml) zjištěnými v myších po 24 hodinách.
Jak bylo popsáno dříve pro chimérický 14.18-IL2 fúzní protein, hu-KSyl-IL2 protein má rychlou distribuční (alfa) fázi, následovanou pomalejší katabolickou (beta) fází. Viz Gillies et al., al.,
Bioconj. Chem. 4: 230-235 (1993). V práci Gilliese et al. se měřily pouze determinanty protilátky, takže nebylo jasné, jestli toto snížení dané odstraněním intaktního fúzního proteinu nebo odstraněním protilátkové složky fúzního proteinu. V předkládaném příkladě byly vzorky testovány s použitím jak (1) protilátkově specifické ELISA, tak (2) pro fúzní protein specifické ELISA (tj. ELISA, která vyžaduje fyzicky spojené jak protilátkové, tak IL-2 složky). Jak je uvedené u obr. 5, u zvířat injikovaných fúzním proteinem hu-KSyl-IL2 bylo množství cirkulujícího fúzního proteinu nižší, než celkové množství cirkulující protilátky, zejména v časovém intervalu 24 hodin. To naznačuje, že je fúzní protein proteolyticky štěpen in vivo a že uvolněná protilátka dále pokračuje v cirkulaci. Překvapivě u zvířat injikovaných fúzním proteinem
| e« » | o© | ||
| • · | • | ♦ · ·· | • 9 · * |
| • · | • | • · · | 9 9 9 |
| «« | • | 99 9999 |
hu-KSy4-IL2 nebyl výrazný rozdíl mezi množstvím cirkulujícího fúzního proteinu a celkovým množstvím cirkulující protilátky. To naznačuje, že fúzní protein hu-KSy4-IL2 nebyl proteolyticky štěpen u těchto zvířat během 24 hodin, kdy se provádělo měření.
Jak je diskutováno výše, Cyl a Cy3 mají vazebnou afinitu pro Fc receptory, zatímco Cy4 má sníženou vazebnou afinitu a Cy2 nemá vazebnou afinitu pro Fc receptory.,Předložený příklad popsal metody pro produkci fúzních proteinů založených na protilátce s využitím Cy4 Fc oblasti, isotypu IgG s omezenou afinitou pro Fc; receptory a prokázal, že takovýto na protilátce založený fúzní protein má zvýšenou dobu poloviční životnosti při cirkulaci in vivo. Zkušený pracovník může využít tyto metody podobně pro produkci fúzních proteinů založených na protilátce s Cy2 Fc oblastí místo Cy4 oblasti, s cílem zvýšit dobu poloviční životnosti cirkulujících fúzních proteinů. hu-KS-IL2 fúzní protein využívající lidskou Cy2 oblast se může připravit s využitím výměny stejného restrikčního fragmentu a výše uvedených metod pro Cy4-IL2 fúzní protein a testovt s použitím metod zde popsaných, aby se prokázala zvýšená doba poloviční životnosti při cirkulaci. Fúzní proteiny založené na protilátce s Cy2 Fc oblastí nebo s jakoukoliv jinou Fc oblastí s omezenou vazebnou afinitou, nebo bez vazebné afinity pro Fc receptor, zvýší dobu poloviční životnosti při cirkulaci in vivo, v porovnání s fúzními proteiny založenými na protilátce s vazebnou afinitou pro Fc receptor.
Příklad 2
Mutování konstruktů lidského Cyl nebo Cy3 genu u fúzního proteinu založeného na protilátce s cílem zlepšit jejich dobu poloviční životnosti při cirkulaci in vivo.
IgG molekuly interagují při cirkulaci s několika molekulami, včetně proteinových členů systému komplementu (např. Clq fragment) a také se třemi třídami FcR. Důležité zbytky pro vázáni Clq jsou zbytky Glu3i8, Lys320 a Lys322, které jsou lokalizovány v CH2 doménách lidských těžkých řetězců. Tao et al., J. Exp. Med. 178: 661-667 (1993). Aby se odlišilo mezi vázáním FcR a Clq, jako mechanismů pro rychlé odstraňování, nahradili jsme Cyl těžký řetězec za významněji
| • · · · · · • · · | • · * • · · · | ·· ·· • · · |
| • · · | • · · · · | • · · · · |
pozměněnou Cy2 spojovací přilehlou část. Očekávalo se, žé tato mutace ovlivní FcR vázání, ale ne fixaci komplementu. Mutace se dosáhlo klonováním a adaptací malé oblasti mezi spojovací oblastí a začátkem CH2 exonu u zárodečné linie Cyl genu, s využitím překryvné polymerázové řetězové reakce (overlapping polymerase chain reaction, PCR). PCR primery se navrhly tak, aby nahradily novou sekvenci ve spojení dvou sousedních PCR fragmentů přesahujících Pstl - Drdl fragment (viz obr. 6). V prvním kroku se provedly dvě různé PCR reakce s primery 1 a 2 (SEQ ID NO: 5 a 6), nebo primery 3 a 4 (SEQ ID NO: 7 a 8) s využitím Cyl genu jako templátu. Podmínky pro cyklování (35 cyklů) byly následující: 94 °C po dobu 45 vteřin, annealing při 48 °C po dobu 45 vteřin a prodlužování primerů při 72 °C po dobu 1 minuty. Jedna desetina každé primární reakce se společně smíchala a kombinovala s primery 1 a 4 pro amplifikaci pouze kombinovaného produktu obou počátečních PCR produktů. Podmínky pro druhou PCR byly následující: 94 °C po dobu 45 vteřin, annealing při 51 °C po dobu 45 vteřin a prodlužování primerů při 72 °C po dobu 1 minuty. Ke spojení došlo jako výsledek přesahu mezi dvěma individuálními fragmenty (které se spárovaly s koncem druhého po denaturaci) a annealingu. Fragmenty, které tvořily hybridy, se prodloužily působením Taq polymerázy a celý mutovaný produkt se selektivně amplifikoval pomocí vnějších primerů, jak je vidět na obrázku 6. Konečný PCR produkt se klonoval do plazmidového vektora a sekvence se ověřila DNA sekvenční analýzou.
Sestavení mutovaného genu se provedlo ve více krocích. V prvním kroku se klonovací vektor obsahující lidský Cyl gen rozštěpil enzymy Pstl a Xhol, čímž se odstranily nemutované sekvence kódující spoj CH2-CH3. Z Cyl-IL2 vektora popsaného výše se připravil fragment Drdl-Xhol, kódující část CH2, celou oblast CH3 a fúzní kódující sekvence lidského IL-2. Třetí fragment se připravil ze subklonováného PCR produktu štěpením enzymy Pstl a Drdl. Všechny tři fragmenty se purifikovaly elektroforézou na agarózovém gelu a společně v jedné ligační reakci spojily. Ligační produkt se použil pro transformaci kompetentních buněk E. coli a transformované kolonie se identifikovaly kultivací na miskách obsahujících ampicilin. Správně sestavené rekombinantní plazmídy se identifikovaly restrikční analýzou plazmidové DNA z izolovaných e e β ee · • t ·> · c · ···· · • · * · · ♦ ··· ·· i ·· ··· ·· ···· transformantů a mutované geny se ověřily DNA sekvenční analýzou.
Fragment HindlII - Xhol z mutovaného Cyl-IL2 genu se použil pro sestavení úplného expresního vektora pro fúzní protein hu-KS protilátka-IL2.
Aby se posoudilo zvýšení doby poloviční životnosti při cirkulaci in vivo vyvolané mutací aminokyselin důležitých pro vazbu FcR a pro rozlišení mezi vazbou FcR a Clq (jako mechanismů pro rychlé odstranění), porovnala se koncentrace in vivo plasmy mutovaného hu-KSyl-ILŽ s koncentrací plasmy hu-KSyl-IL2 v různých časových intervalech. Jak je vidět na obr. 7, rychlosti odstraňování mutovaného hu-KSyl-IL2 a hu-KSy4-IL2 in vivo byly významně nižší, než rychlosti odstraňování hu-KSyl-IL2. Tyto výsledky naznačují, že fúzní protein založený na protilátce se zvýšenou dobou poloviční životnosti při cirkulaci in vivo se může získat modifikací sekvencí nezbytných pro navázání k Fc recptorům u izotypů, které mají vazebnou afinitu k Fc receptoru. Výsledky dále naznačují, že mechanismy pro rychlé odstranění zahrnují spíše FcR vazbu než Clq vazbu.
Zkušený odborník bude rozumět z výkladu předkládaného vynálezu, že pro snížení vazby k FcR a zvýšení doby poloviční životnosti in vivo cirkulujícího fůzního proteinu založeného na protilátce, se můžou vnést do Cyl nebo Cy3 genů některé jiné mutace. Mutace se můžou navíc vnést i do Cy4 genu s cílem dále snížit vazbu Cy4 fúzních proteinů k FcR. Například další možné mutace zahrnují mutace aminokyselinových zbytků blízkých spojovací oblasti, třeba mutace Pro331, nebo mutace glykosylačního místa připjeného jedním N u všech IgG Fc oblastí. To je lokalizováno na Asn297 ř jako část zjednodušené (canonical) sekvence: Asn-X-Thr/Ser, kde na druhé pozici může být jakákoliv aminokyselina (s možnou výjimkou Pro) a na třetí pozici je buď Thr nebo Ser. Například konzervovaná mutace na aminokyselinu Gin by měla malý účinek na protein, ale zabránila by připojení jakéhokoliv glycidového postranního řetězce. Strategie pro mutace tohoto zbytku může sledovat právě popsaný obecný postup pro přilehlou spojovací oblast. Metody pro vytváření bodových mutací v klonovaných DNA sekvencích jsou odborníkům dobře známé a dostupné pro tento účel jsou komerční soupravy od různých výrobců.
·« « e
Příklad 3
Zvýšení doby poloviční životnosti cirkulujících fúzních proteinů receptor-protilátka
Několik odkazů uvedlo, že Fc část lidského IgG může sloužit jako užitečný nosič pro mnoho ligand vázajících proteinů nebo receptorů, s biologickou aktivitou. Některé z těchto ligand vázajících proteinů se zfázovaly s N-koncem Fc části Ig, jako CD4, CTLA-4 a TNF receptory. Viz například Capon et al., al., Nátuře,
337: 525-531 (1989); Linsley et al., J. Exp. Med. 174: 561-569 (1991); Wooley et al., J. Immunol. 151: 6602-6607 (1993). Zvýšením doby poloviční životnosti cirkulujících fúzních proteinů receptor-protilátka může umožnit proteinovému partneru, který váže ligand (tj. druhý ne-Ig protein) efektivněji (1) blokovat interakce receptor-ligand na povrchu buněk; nebo (2) neutralizovat biologickou aktivitu molekuly (např. cytokinu) v tekuté fázi krve a tak jí zabránit dosažení buněčného cíle. Aby se zhodnotilo, jestli snížení schopnosti fúzního proteinu receptor-protilátka vázat se k IgG receptorům zvýší jejich dobu poloviční životnosti při cirkulaci in vivo, se porovnaly fúzní proteiny receptor-protilátka s lidskými Cyl Fc oblastmi s fúzními proteiny založenými na protilátce s lidskými Cy4 Fc oblastmi.
Pro konstrukci fúzních proteinů CD4-protílátka, se z lidských periferních krevních monocytárních buněk (PBMC) nakloňuje s využitím PCR ektodoména (ectodomain) povrchového receptorů lidské CD4 buňky. Klonovaný CD4 receptor zahrnuje kompatibilní restrikční místa a sestřihová donorová místa popsaná v příkladu 1. Expresní vektor obsahuje jedno Xbal klonovací místo ve směru (downstream) od CMV časného promotoru a lidský Cyl nebo Cy4 gen ve směru od jejich vnitřního HindlII místa. Zbytek plazmidu obsahuje bakteriální genetickou informací pro rozmnožování v E. coli a také gen selekčního markéru dhfr. Ligované DNA se použijí pro transformaci kompetentních bakterií a rekombinantní plazmidy se identifikují restrikční analýzou jednotlivých bakteriálních kolonií. Získaly Se dva plazmidové konstrukty:CD4-Cyl a CD4-Cy4.
Expresní plazmidy se použily pro transfekci myších myelomových buněk elektroporací a transfektanty se vyselektovaly pěstováním es eee· ·· · ·· ·· • · · · · · « • * · · * · £ · * · 9 · ·
·.« 9 9.·» r·· ·· ···· v živném médiu obsahujícím metotrexát (0,1 uM) . Transfektatnty exprimující fúzní proteiny se identifikovaly ELISA analýzou. Pro purifikaci fúzního proteinu (vazbou na protein A Sepaharose a následným vymytím) se pak namnožily v kultuře. Purifikované proteiny v elučním chromatografickém pufru se dialyzovaly proti PBS a zředily na konečnou koncentraci 100 ug/ml. Myším Balb/c se injikovalo 0,2 ml (20 ug) buď CD4-Cyl nebo CD4-Cy4 fúzního proteinu a podle popisu v překladech 1.3 se testovala farmakokinetika. CD4-Cy4 protein měl významně vyšší dobu poloviční životnosti než fúzní protein CD4-Cyl.
Ekvivalenty
Vynález může být včleněn do jiných specifických forem bez toho, aby se vzdálil od svého ducha nebo svých základních charakteristik.
Výše uvedené formy vynálezu by se tedy měly uvažovat ve všech ohledech spíše jako vysvětlující než jako omezení vynálezu zde popsaného. Oblast vynálezu je tedy ukázaná spíše připojenými nároky než výše uvedenými příklady a všechny změny, které jsou v rámci smyslu a rozsahu rovnocenné nárokům jsou zde také zahrnuté.
Claims (26)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Na protilátce založený fúzní protein se zvýšenou dobou poloviční životnosti cirkulace obsahující alespoň část imunoglobulinového (Ig) těžkého řetězce s podstatně omezenou vazebnou afinitou pro Fc receptor, kdy zmíněná část těžkého je spojená s druhým, ne-Ig proteinem a zmíněný fúzní protein založený na protilátce má delší dobu poloviční životnosti při cirkulaci in vivo, než nepřipojený druhý ne-Ig protein.
- 2. Fúzní protein založený na protilátce nároku 1, kde zmíněná část těžkého řetězce obsahuje alespoň CH2 doménu konstantní oblasti IgG2 nebo IgG4.
- 3. Fúzní protein založený na protilátce nároku 1, kde zmíněná část těžkého řetězce obsahuje alespoň část konstantní oblasti IgGl s mutací nebo delecí v jedné nebo více aminokyselinách vybraných ze skupiny obsahující Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Asn297 a Pro33i
- 4. Fúzní protein založený na protilátce nároku 1, kde zmíněná část těžkého řetězce obsahuje alespoň část konstantní oblasti IgG3 s mutací nebo delecí v jedné nebo více aminokyselinách vybraných ze skupiny skládající se z Leu28i, Leu2B2, Gly2e3, Gly2s4r Asn341 a Pro37B.
- 5. Fúzní protein založený na protilátce nároku 1, kde má zmíněná část těžkého řetězce dále vazebnou afinitu pro imunoglobulin chránící receptor.
- 6. Fúzní protein založený na protilátce nároku 1, kde má zmíněná část těžkého řetězce podstatně sníženou vazebnou afinitu pro Fc receptor vybraný ze skupiny FcyRI, FcyRII, FcyRIZI.·♦ ♦ ·* '·* * · « · · · · · · · · ··· · · · · » · ·« · ·» ··· ·· ····
- 7. Fúzní protein založený na protilátce nároku 1, kde je zmíněný druhý ne-Ig protein vybraný ze skupiny skládající se z cytokinu, ligand vázajícího proteinu a proteinového toxinu.
- 8. Fúzní protein založený na protilátce nároku 1, kde je zmíněný cytokin vybrán ze skupiny skládající se z tumorového nekrotického faktoru, interleukinu a lymfokinu.
- 9. Fúzní protein založený na protilátce nároku 8, kde zmíněný tumorový nekrotický faktor je tumorový nekrotický faktor alfa.
- 10. Fúzní protein založený na protilátce nároku 8, kde zmíněný interleukin je interleukin-2.
- 11. Fúzní protein založený na protilátce nároku 8, kde zmíněný lymfokin je lymfotoxin nebo kolonie stimulující faktor.
- 12. Fúzní protein založený na protilátce nároku 11, kde zmíněný faktor stimulující kolonie je faktor stimulující růst kolonie granulocytárních mikrofágů (granulocyte-macrophage colony stimulationg factor).
- 13. Fúzní protein založený na protilátce nároku 1, kde je zmíněný ligand vázající protein vybraný ze skupiny skládající se z CD4, CTLA-4, TNF receptoru a interleukinového receptoru.
- 14. Metoda zvýšení doby poloviční životnosti na protilátce založeného fúzního proteinu při cirkulaci, zahrnující krok připojení alespoň části Ig těžkého řetězce k druhému, ne-Ig proteinu, přičemž zmíněná část těžkého řetězce podstatně snižuje vazebnou afinitu pro Fc receptor, čímž se vytvoří fúzní protein založený na protilátce s delší dobou poloviční životnosti při cirkulaci in vivo, než u nepřipojeného druhého ne-Ig protein.
- 15. Metoda nároku 14, kde zmíněná část těžkého řetězce zahrnuje alespoň CH2 doménu konstantní oblasti IgG2 nebo IgG4.2<J
ť • A • A • ee e A • • · • · 6 • A • •e A A A A ·· • A • • · • • A A • · • A A • A A «Α A A A A· · A - 16. Metoda zvýšení doby poloviční životnosti cirkulujícího fúzního proteinu založeného na protilátce zahrnující tyto kroky:(a) vnesení mutace nebo delece jedné nebo více aminokyselin konstantní oblasti IgGl, přičemž zmíněná aminokyselina je vybraná ze skupiny leu234, Leu235, Gly236, Gly237 , Asn297 a Pro33i; tím se vytvoří Ig těžký řetězec s podstatně sníženou vazebnou afinitou pro Fc receptor; a (b) připojení alespoň části těžkého řetězce kroku (a) k druhému ne-Ig proteinu a tím vytvoření fúzního proteinu založeného na protilátce s delší dobou poloviční životnosti při cirkulaci in vivo, než u nepřipojeného druhého ne-Ig proteinu.
- 17. Metoda zvýšení doby poloviční životnosti při cirkulaci fúzního proteinu založeného na protilátce skládající se z těchto kroků:(a) vnesení mutace nebo delece jedné nebo více aminokyselin konstantní oblasti IgG3, přičemž zmíněná aminokyselina je vybraná ze skupiny Leu234 , Leu235, Gly236, Gly237 , Asn297 a Pro33i; tím se vytvoří Ig těžký řetězec s podstatně sníženou vazebnou afinitou pro Fc receptor; a (b) připojení alespoň části těžkého řetězce kroku (a) k druhému ne-Ig proteinu a tím vytvoření fúzního proteinu založeného na protilátce s delší dobou poloviční životnosti při cirkulaci in vivo, než . u nepřipojeného druhého ne-Ig proteinu.
- 18. Metoda nároku 14, 16 nebo 17, kde má zmíněná část těžkého řetězce dále vazebnou afinitu pro imunoglobulinový ochranný receptor.
- 19. Metoda nároku 14, 16 nebo 17, kde má zmíněná část těžkého řetězce podstatně sníženou afinitu pro Fc receptor vybraný ze skupiny skládající se z FcyRI, FcyRII, FcyRIII.
4« • • ·· • • • • • • · • • • • • ♦ · • · • • • • • • • • • • • • • • ·· * ·· «·· ·· - 20. Metoda nároku 14, 16 nebo 17, kde je zmíněný druhý ne-Ig protein vybrán ze skupiny skládající se z cytokinu, ligandvázajícího proteinu a proteinového toxinu.
- 21. Metoda nároku 14, 16 nebo 17, kde je zmíněný cytokin vybrán ze skupiny skládající se z tumorového nekrotického faktoru, interleukinu a lymfokinu,
- 22. Metoda nároku 21, kde zmíněný tumorový nekrotický faktor je tumorový nekrotický faktor alfa.
- 23. Metoda nároku 21, kde zmíněný interleukin je interleukin-2._
- 24 . Metoda nároku 21,_kdezmíněnýlymfokinje—lymfotoxinnebo--kolonie stimulující faktor.
- 25. Na protilátce založený fúzní protein nároku 24, kde zmíněný kolonie stimulující faktor je faktor stimulující růst kolonie granulocytárních mikrofágů.
- 26. Metoda nároku 14, 16 nebo 17, kde je zmíněný ligand vázající protein vybraný ze skupiny skládající se z CD4, CTLA-4, TNF receptoru a interleukinového receptoru.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7588798P | 1998-02-25 | 1998-02-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20003099A3 true CZ20003099A3 (cs) | 2002-04-17 |
Family
ID=22128576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20003099A CZ20003099A3 (cs) | 1998-02-25 | 1999-02-24 | Zvýąení doby poloviční ľivotnosti cirkulujících fúzních proteinů odvozených od protilátek |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1060194A1 (cs) |
| JP (1) | JP2002505086A (cs) |
| CN (1) | CN1204147C (cs) |
| AU (1) | AU758240B2 (cs) |
| BR (1) | BR9908226A (cs) |
| CA (1) | CA2320403A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20003099A3 (cs) |
| HU (1) | HUP0100813A3 (cs) |
| NO (1) | NO20004218L (cs) |
| PL (1) | PL199659B1 (cs) |
| WO (1) | WO1999043713A1 (cs) |
Families Citing this family (146)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030109680A1 (en) | 2001-11-21 | 2003-06-12 | Sunol Molecular Corporation | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| US5986065A (en) | 1997-03-10 | 1999-11-16 | Sunol Molecular Corporation | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| US20060235209A9 (en) | 1997-03-10 | 2006-10-19 | Jin-An Jiao | Use of anti-tissue factor antibodies for treating thromboses |
| US7749498B2 (en) | 1997-03-10 | 2010-07-06 | Genentech, Inc. | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| PT1037927E (pt) | 1997-12-08 | 2004-10-29 | Emd Lexigen Res Ct Corp | Proteinas de fusao heterodimericas uteis para imunoterapia de abordagem selectiva e estimulacao imunologica geral |
| US6528624B1 (en) | 1998-04-02 | 2003-03-04 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
| US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
| US6242195B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-06-05 | Genentech, Inc. | Methods for determining binding of an analyte to a receptor |
| US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
| US7183387B1 (en) | 1999-01-15 | 2007-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
| KR20060067983A (ko) | 1999-01-15 | 2006-06-20 | 제넨테크, 인크. | 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체 |
| US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| AU778611B2 (en) | 1999-08-09 | 2004-12-16 | Merck Patent Gmbh | Multiple cytokine-antibody complexes |
| GB9926084D0 (en) * | 1999-11-03 | 2000-01-12 | King S College London | Recombinant fusion molecules |
| JP2003514552A (ja) | 1999-11-12 | 2003-04-22 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態 |
| ES2269366T3 (es) * | 2000-02-11 | 2007-04-01 | Merck Patent Gmbh | Mejoramiento de la vida media en circulacion de proteinas de fusion basadas en anticuerpos. |
| IL151348A0 (en) | 2000-04-13 | 2003-04-10 | Univ Rockefeller | Enhancement of antibody-mediated immune responses |
| PT1294401E (pt) | 2000-06-29 | 2007-11-09 | Merck Patent Gmbh | Aumento das respostas imunológicas mediadas por proteínas de fusão anticorpo-citoquina por tratamento combinado com agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas |
| DE10045591A1 (de) * | 2000-09-15 | 2002-04-04 | Klaus Pfizenmaier | Ortsspezifische, antikörpervermittelte Aktivierung proapoptotischer Zytokine - AMAIZe (Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine) |
| AU2011253690C1 (en) * | 2000-12-12 | 2018-01-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
| US7658921B2 (en) | 2000-12-12 | 2010-02-09 | Medimmune, Llc | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
| CA2431600C (en) | 2000-12-12 | 2012-04-17 | Medimmune, Inc. | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
| US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US20030133939A1 (en) | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| HUP0303428A2 (hu) | 2001-03-07 | 2004-01-28 | Merck Patent Gmbh. | Expressziós eljárás hibrid izotípusú antitestcsoportot tartalmazó fehérjékhez |
| US6992174B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| PL205352B1 (pl) | 2001-05-03 | 2010-04-30 | Merck Patent Gmbh | Rekombinowane przeciwciało specyficzne dla nowotworu |
| TWI338009B (en) * | 2001-10-29 | 2011-03-01 | Genentech Inc | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| KR100988180B1 (ko) | 2001-12-04 | 2010-10-18 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 조절된 선택성을 갖는 면역시토카인 |
| DK1495055T3 (da) * | 2002-04-18 | 2013-11-11 | Genencor Int | Produktion af funktionelle antistoffer i filamentøse svampe |
| US7132100B2 (en) | 2002-06-14 | 2006-11-07 | Medimmune, Inc. | Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations |
| US8968730B2 (en) | 2002-08-14 | 2015-03-03 | Macrogenics Inc. | FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof |
| US8946387B2 (en) | 2002-08-14 | 2015-02-03 | Macrogenics, Inc. | FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof |
| WO2004035752A2 (en) * | 2002-10-15 | 2004-04-29 | Protein Design Labs, Inc. | ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS |
| US7217797B2 (en) * | 2002-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
| US7217798B2 (en) | 2003-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of Fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis |
| CN100432105C (zh) | 2002-12-17 | 2008-11-12 | 默克专利有限公司 | 与gd2结合的小鼠14.18抗体的人源化抗体(h14.18)以及其与il-2的融合 |
| US7960512B2 (en) | 2003-01-09 | 2011-06-14 | Macrogenics, Inc. | Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same |
| EP2368578A1 (en) | 2003-01-09 | 2011-09-28 | Macrogenics, Inc. | Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same |
| AU2004239244C1 (en) | 2003-05-06 | 2015-04-23 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Clotting factor-Fc chimeric proteins to treat hemophilia |
| TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
| JP2005073528A (ja) * | 2003-08-28 | 2005-03-24 | Genetics Inst Llc | 生物学的系における生物学的組織への血球の接着を阻害する方法、ならびにその方法に使用するための組成物 |
| CN100467488C (zh) | 2003-12-30 | 2009-03-11 | 默克专利有限公司 | Il-7融合蛋白 |
| CN1902222A (zh) | 2003-12-31 | 2007-01-24 | 默克专利有限公司 | 具有改善药物代谢动力学的Fc－促红细胞生成素融合蛋白质 |
| US8420087B2 (en) | 2004-01-05 | 2013-04-16 | Antisoma Research Limited | Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin |
| EP1810035A4 (en) | 2004-11-10 | 2010-03-17 | Macrogenics Inc | GENERATION OF FC ANTIBODY REGIONS FOR EFFECTOR FUNCTION |
| DE602005020837D1 (de) | 2004-12-09 | 2010-06-02 | Merck Patent Gmbh | Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität |
| US9889197B2 (en) | 2005-04-15 | 2018-02-13 | Macrogenics, Inc. | Covalently-associated diabody complexes that possess charged coil domains and that are capable of enhanced binding to serum albumin |
| US11254748B2 (en) | 2005-04-15 | 2022-02-22 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
| ES2707152T3 (es) | 2005-04-15 | 2019-04-02 | Macrogenics Inc | Diacuerpos covalentes y usos de los mismos |
| US9963510B2 (en) | 2005-04-15 | 2018-05-08 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
| US9284375B2 (en) | 2005-04-15 | 2016-03-15 | Macrogenics, Inc. | Covalent diabodies and uses thereof |
| SI2298815T1 (sl) | 2005-07-25 | 2015-08-31 | Emergent Product Development Seattle, Llc | Zmanjšanje števila celic b z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na cd37 in cd20 |
| LT2573114T (lt) | 2005-08-10 | 2016-10-10 | Macrogenics, Inc. | Atpažinimas ir konstravimas antikūnų su variantinėmis fc sritimis ir jų panaudojimo būdai |
| MX2008015524A (es) | 2006-06-12 | 2009-01-13 | Trubion Pharmaceuticals Inc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
| EP2032159B1 (en) | 2006-06-26 | 2015-01-07 | MacroGenics, Inc. | Combination of fcgammariib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof |
| HUE030269T2 (en) | 2006-06-26 | 2017-04-28 | Macrogenics Inc | FC RIIB-specific antibodies and methods for their use |
| ES2352561T3 (es) * | 2006-06-30 | 2011-02-21 | Conaris Research Institute Ag | Dímeros de sgp 130fc mejorados. |
| US8652466B2 (en) | 2006-12-08 | 2014-02-18 | Macrogenics, Inc. | Methods for the treatment of disease using immunoglobulins having Fc regions with altered affinities for FcγRactivating and FcγRinhibiting |
| TW200907056A (en) * | 2007-03-28 | 2009-02-16 | Astrazeneca Ab | New method |
| PE20140196A1 (es) | 2007-08-09 | 2014-03-19 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpos anti-cd37 |
| EP2219672B1 (en) | 2007-11-09 | 2016-02-17 | Peregrine Pharmaceuticals, Inc. | Anti-vegf antibody compositions and methods |
| WO2009117030A2 (en) | 2007-12-19 | 2009-09-24 | Macrogenics, Inc. | Improved compositions for the prevention and treatment of smallpox |
| JP2011509675A (ja) | 2008-01-18 | 2011-03-31 | メディミューン，エルエルシー | 部位特異的コンジュゲーションのためのシステイン操作抗体 |
| WO2009123894A2 (en) | 2008-04-02 | 2009-10-08 | Macrogenics, Inc. | Her2/neu-specific antibodies and methods of using same |
| MX2010010387A (es) | 2008-04-02 | 2010-10-15 | Macrogenics Inc | Anticuerpos especificos para el complejo de bcr y metodos para el uso de los mismos. |
| CN102099377A (zh) | 2008-04-11 | 2011-06-15 | 新兴产品开发西雅图有限公司 | Cd37免疫治疗剂及其与双功能化学治疗剂的联合 |
| TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
| EP2373689A1 (en) | 2008-12-12 | 2011-10-12 | MedImmune, LLC | Crystals and structure of a human igg fc variant with enhanced fcrn binding |
| KR101468271B1 (ko) * | 2009-03-19 | 2014-12-03 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 개량된 항체분자를 함유하는 의약 제제 |
| EP2233500A1 (en) | 2009-03-20 | 2010-09-29 | LFB Biotechnologies | Optimized Fc variants |
| CA2759333A1 (en) | 2009-04-22 | 2010-10-28 | Merck Patent Gmbh | Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites |
| US20120134984A1 (en) | 2009-06-01 | 2012-05-31 | Olga Lubman | Molecules with extended half-lives and uses thereof |
| AU2010270979B2 (en) | 2009-06-22 | 2015-04-23 | Medimmune, Llc | Engineered Fc regions for site-specific conjugation |
| AU2010303415B2 (en) | 2009-10-07 | 2015-02-19 | Macrogenics, Inc. | Fc region-containing polypeptides that exhibit improved effector function due to alterations of the extent of fucosylation, and methods for their use |
| EP2507267B1 (en) | 2009-12-02 | 2016-09-14 | Acceleron Pharma, Inc. | Compositions and methods for increasing serum half-life of fc fusion proteins |
| AR080428A1 (es) | 2010-01-20 | 2012-04-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos |
| WO2011109400A2 (en) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | Macrogenics,Inc. | Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof |
| PH12012501751A1 (en) | 2010-03-04 | 2012-11-12 | Macrogenics Inc | Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof |
| UA112062C2 (uk) | 2010-10-04 | 2016-07-25 | Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх | Cd33-зв'язувальний агент |
| TWI504609B (zh) | 2010-11-23 | 2015-10-21 | Glaxo Group Ltd | 抗原結合蛋白質 |
| BR112013013003A2 (pt) | 2010-11-24 | 2016-08-09 | Glaxo Group Ltd | proteína de ligação de antígeno, e, composição farmacêutica |
| CA2824279A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Cephalon Australia Pty Ltd | Modified antibody with improved half-life |
| CN103476795B (zh) | 2011-03-29 | 2016-07-06 | 罗切格利卡特公司 | 抗体Fc变体 |
| EA201892619A1 (ru) | 2011-04-29 | 2019-04-30 | Роше Гликарт Аг | Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2 |
| KR102030531B1 (ko) | 2011-05-21 | 2019-10-10 | 마크로제닉스, 인크. | 탈면역화된 혈청-결합 도메인 및 혈청 반감기를 연장하기 위한 그것의 용도 |
| US8883982B2 (en) | 2011-06-08 | 2014-11-11 | Acceleron Pharma, Inc. | Compositions and methods for increasing serum half-life |
| WO2013014208A2 (en) | 2011-07-27 | 2013-01-31 | Glaxo Group Limited | Antigen binding constructs |
| LT2771022T (lt) | 2011-10-11 | 2020-12-10 | Viela Bio, Inc. | Cd40l-specifiniai iš tn3 kilę karkasai ir jų naudojimo būdai |
| CA3111357A1 (en) | 2011-12-23 | 2013-06-27 | Pfizer Inc. | Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor |
| SMT202100621T1 (it) | 2012-07-13 | 2022-01-10 | Roche Glycart Ag | Anticorpi bispecifici anti-vegf/anti-ang-2 e loro impiego nel trattamento delle malattie vascolari oculari |
| BR112015002091A2 (pt) * | 2012-08-02 | 2017-12-12 | Hoffmann La Roche | método para a produção de um polipeptídeo, polipeptídeo, uso de um polipeptídeo e composição |
| US20140044675A1 (en) * | 2012-08-10 | 2014-02-13 | Roche Glycart Ag | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof |
| WO2014029752A1 (en) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Glaxo Group Limited | Anti lrp6 antibodies |
| TWI635098B (zh) | 2013-02-01 | 2018-09-11 | 再生元醫藥公司 | 含嵌合恆定區之抗體 |
| US9487587B2 (en) | 2013-03-05 | 2016-11-08 | Macrogenics, Inc. | Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof |
| SMT202100464T1 (it) | 2013-03-14 | 2021-11-12 | Macrogenics Inc | Molecole bispecifiche che sono immunoreattive con cellule effettrici immunitarie che esprimono un recettore di attivazione |
| AR095432A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-10-14 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Proteínas de unión a antígeno |
| UA116479C2 (uk) | 2013-08-09 | 2018-03-26 | Макродженікс, Інк. | БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ |
| US11384149B2 (en) | 2013-08-09 | 2022-07-12 | Macrogenics, Inc. | Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof |
| EP2840091A1 (en) | 2013-08-23 | 2015-02-25 | MacroGenics, Inc. | Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof |
| EP2839842A1 (en) | 2013-08-23 | 2015-02-25 | MacroGenics, Inc. | Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof |
| NZ760289A (en) | 2014-02-06 | 2023-05-26 | Hoffmann La Roche | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof |
| GB201403775D0 (en) | 2014-03-04 | 2014-04-16 | Kymab Ltd | Antibodies, uses & methods |
| TWI701042B (zh) | 2014-03-19 | 2020-08-11 | 美商再生元醫藥公司 | 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物 |
| US20170267780A1 (en) | 2014-05-16 | 2017-09-21 | Medimmune, Llc | Molecules with altered neonate fc receptor binding having enhanced therapeutic and diagnostic properties |
| EP3157945A4 (en) | 2014-06-20 | 2017-11-22 | F. Hoffmann-La Roche AG | Chagasin-based scaffold compositions, methods, and uses |
| JP6640834B2 (ja) | 2014-08-11 | 2020-02-05 | デリニア， インコーポレイテッド | 自己免疫疾患の処置のために調節性ｔ細胞を選択的に活性化させる改変ｉｌ−２変異体 |
| SG11201702544WA (en) | 2014-09-29 | 2017-04-27 | Univ Duke | Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm |
| PL3699198T3 (pl) | 2014-11-17 | 2025-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Sposoby leczenia nowotworów z wykorzystaniem dwuswoistego przeciwciała cd3xcd20 |
| TWI805046B (zh) | 2015-02-27 | 2023-06-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途 |
| WO2016161010A2 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors |
| GB201506389D0 (en) * | 2015-04-15 | 2015-05-27 | Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W | Site-specific antibody-drug conjugates |
| GB201506393D0 (en) * | 2015-04-15 | 2015-05-27 | Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W | Site-specific antibody-drug conjugates |
| EP3328427B1 (en) | 2015-07-27 | 2024-05-29 | The General Hospital Corporation | Antibody derivatives with conditionally enabled effector function |
| CN108699145A (zh) | 2015-09-02 | 2018-10-23 | 伊缪泰普有限公司 | 抗lag-3抗体 |
| TWI799366B (zh) | 2015-09-15 | 2023-04-21 | 美商建南德克公司 | 胱胺酸結骨架平臺 |
| SG10202002577XA (en) | 2015-09-21 | 2020-04-29 | Aptevo Res & Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
| KR20210016479A (ko) | 2015-12-04 | 2021-02-15 | 노파르티스 아게 | 항체 시토카인 그라프트된 조성물 및 면역조절을 위한 사용 방법 |
| US20170204154A1 (en) | 2016-01-20 | 2017-07-20 | Delinia, Inc. | Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases |
| PE20190353A1 (es) | 2016-04-15 | 2019-03-07 | Macrogenics Inc | Moleculas de union b7-h3 novedosas, conjugados anticuerpo-farmaco de los mismos y metodos de uso de los mismos |
| TWI784957B (zh) | 2016-06-20 | 2022-12-01 | 英商克馬伯有限公司 | 免疫細胞介素 |
| US9567399B1 (en) | 2016-06-20 | 2017-02-14 | Kymab Limited | Antibodies and immunocytokines |
| CN110198729A (zh) | 2016-09-09 | 2019-09-03 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 卷曲蛋白的选择性肽抑制剂 |
| JP7213180B2 (ja) * | 2016-10-19 | 2023-01-26 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 免疫コンジュゲートを製造するための方法 |
| WO2018083248A1 (en) | 2016-11-03 | 2018-05-11 | Kymab Limited | Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods |
| MX2019005400A (es) | 2016-11-08 | 2019-08-05 | Delinia Inc | Variantes de il-2 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. |
| EP3620531A4 (en) | 2017-05-02 | 2021-03-17 | National Center of Neurology and Psychiatry | METHOD OF PREDICTION AND EVALUATION OF THERAPEUTIC EFFECT IN DISEASES RELATING TO IL-6 AND NEUTROPHILS |
| JOP20190271A1 (ar) | 2017-05-24 | 2019-11-21 | Novartis Ag | بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة |
| EA201992765A1 (ru) | 2017-05-24 | 2020-03-25 | Новартис Аг | Белки на основе антител с привитым цитокином и способы их применения в лечении рака |
| BR112020007309A2 (pt) | 2017-10-14 | 2020-09-29 | Cytomx Therapeutics, Inc. | anticorpos, anticorpos ativáveis, anticorpos biespecíficos e anticorpos ativáveis biespecíficos e métodos de uso dos mesmos |
| SG11202005732XA (en) | 2017-12-19 | 2020-07-29 | Xencor Inc | Engineered il-2 fc fusion proteins |
| PT3844189T (pt) | 2018-08-31 | 2025-01-29 | Regeneron Pharma | Estratégia de dosagem que mitiga a síndrome de libertação de citocinas para anticorpos bisepecíficos contra cd3/c20 |
| CN112142847B (zh) * | 2019-02-22 | 2023-05-05 | 武汉友芝友生物制药股份有限公司 | 改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用 |
| CA3146471A1 (en) | 2019-08-06 | 2021-02-11 | James K. Kranz | Compositions comprising anti-bcma antigen binding proteins for treating bcma-mediated diseases or disorders |
| KR20220114595A (ko) * | 2019-12-17 | 2022-08-17 | 암젠 인크 | 치료에서의 사용을 위한 이중 인터류킨-2/tnf 수용체 효현제 |
| BR112023024804A2 (pt) | 2021-05-28 | 2024-02-15 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Terapias de combinação para tratar câncer |
| JP2024530643A (ja) | 2021-08-03 | 2024-08-23 | グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド | バイオ医薬組成物および安定同位体標識ペプチドマッピング法 |
| CA3233953A1 (en) | 2021-10-05 | 2023-04-13 | Matthew Bruce | Combination therapies for treating cancer |
| CA3241017A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Robert Ferris | Combination therapies for hiv infections and uses thereof |
| CN119300858A (zh) | 2022-04-29 | 2025-01-10 | 23和我公司 | 抗原结合蛋白 |
| CN119790068A (zh) | 2022-08-25 | 2025-04-08 | 葛兰素史克知识产权发展有限公司 | 抗原结合蛋白及其用途 |
| AR130792A1 (es) | 2022-10-20 | 2025-01-22 | Glaxosmithkline Intellectual Property No 3 Ltd | Proteínas de unión a antígeno |
| CN120112311A (zh) | 2022-11-02 | 2025-06-06 | Viiv保健英国第五有限公司 | 抗原结合蛋白 |
| WO2025114862A1 (en) | 2023-11-27 | 2025-06-05 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Il-33 binding antibodies |
| WO2025125137A1 (en) | 2023-12-11 | 2025-06-19 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Baff specific antibodies |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9511935D0 (en) * | 1995-06-13 | 1995-08-09 | Smithkline Beecham Plc | Novel compound |
| WO1997033617A1 (en) * | 1996-03-13 | 1997-09-18 | Protein Design Labs, Inc. | Fas ligand fusion proteins and their uses |
-
1999
- 1999-02-24 CZ CZ20003099A patent/CZ20003099A3/cs unknown
- 1999-02-24 HU HU0100813A patent/HUP0100813A3/hu unknown
- 1999-02-24 CN CN99803277.8A patent/CN1204147C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-02-24 CA CA002320403A patent/CA2320403A1/en not_active Abandoned
- 1999-02-24 PL PL342497A patent/PL199659B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-02-24 EP EP99908399A patent/EP1060194A1/en not_active Ceased
- 1999-02-24 BR BR9908226-8A patent/BR9908226A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-02-24 JP JP2000533463A patent/JP2002505086A/ja active Pending
- 1999-02-24 AU AU27842/99A patent/AU758240B2/en not_active Ceased
- 1999-02-24 WO PCT/US1999/003966 patent/WO1999043713A1/en active IP Right Grant
-
2000
- 2000-08-23 NO NO20004218A patent/NO20004218L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20004218L (no) | 2000-10-24 |
| WO1999043713A1 (en) | 1999-09-02 |
| AU758240B2 (en) | 2003-03-20 |
| HK1036286A1 (en) | 2001-12-28 |
| BR9908226A (pt) | 2000-10-24 |
| EP1060194A1 (en) | 2000-12-20 |
| NO20004218D0 (no) | 2000-08-23 |
| PL199659B1 (pl) | 2008-10-31 |
| PL342497A1 (en) | 2001-06-04 |
| AU2784299A (en) | 1999-09-15 |
| HUP0100813A3 (en) | 2003-08-28 |
| CN1291995A (zh) | 2001-04-18 |
| CN1204147C (zh) | 2005-06-01 |
| HUP0100813A2 (hu) | 2001-06-28 |
| JP2002505086A (ja) | 2002-02-19 |
| CA2320403A1 (en) | 1999-09-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20003099A3 (cs) | Zvýąení doby poloviční ľivotnosti cirkulujících fúzních proteinů odvozených od protilátek | |
| US20090088561A1 (en) | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins | |
| US10570188B2 (en) | Method for producing monomeric and multimeric molecules and uses thereof | |
| CN111372947B (zh) | 在体内从单特异性抗体产生多特异性抗体的方法 | |
| JP2025094049A (ja) | 改善された単鎖可変断片のための材料及び方法 | |
| JP2008538926A (ja) | 切断可能なリンカーを有する一本鎖抗体 | |
| EP1366067A2 (en) | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety | |
| AU2002248571A1 (en) | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety | |
| WO2007044887A2 (en) | Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies | |
| TR201808458T4 (tr) | FC-reseptör bazlı afinite kromatografisi. | |
| CA2582157A1 (en) | Methods and compositions for improving recombinant protein production | |
| TW201932142A (zh) | 自單特異性抗體產生多特異性抗體之方法 | |
| AU2017381656B2 (en) | Re-use of enzymes in in vitro glycoengineering of antibodies | |
| CN119685431A (zh) | 用于体外糖工程化抗体的方法 | |
| US20210206806A1 (en) | Peptidic linker with reduced post-translational modification | |
| JP7440516B2 (ja) | 切断多価多量体 | |
| WO2019178539A1 (en) | Bispecific antibodies | |
| KR20240111783A (ko) | 면역 반응을 위한 강화된 다중특이성 결합제를 포함하는 조성물 | |
| US20210253741A1 (en) | Bispecific antibodies | |
| MXPA00008312A (es) | Metodos para mejorar la vida media en circulacion de proteinas de fusion a base de anticuerpo | |
| KR20240113488A (ko) | 신규 항-il-36r 항체 |