PL205352B1 - Rekombinowane przeciwciało specyficzne dla nowotworu - Google Patents
Rekombinowane przeciwciało specyficzne dla nowotworuInfo
- Publication number
- PL205352B1 PL205352B1 PL367831A PL36783102A PL205352B1 PL 205352 B1 PL205352 B1 PL 205352B1 PL 367831 A PL367831 A PL 367831A PL 36783102 A PL36783102 A PL 36783102A PL 205352 B1 PL205352 B1 PL 205352B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- epcam
- region
- antibodies
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 6
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 abstract description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 abstract 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 89
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 69
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 69
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 46
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 description 31
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 30
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 24
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 23
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 19
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 19
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 19
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 19
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 17
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 16
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 15
- 102100031940 Epithelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 13
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 11
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 11
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 description 4
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 description 4
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 description 4
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 description 4
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 4
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 description 4
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 4
- 102100022949 Immunoglobulin kappa variable 2-29 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 2
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100068676 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gln-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 238000011230 antibody-based therapy Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 102200016293 rs61752141 Human genes 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000134 2-(methylsulfanyl)ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])SC([H])([H])C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 238000012492 Biacore method Methods 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102220532739 SPARC-like protein 1_P9A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000001065 anti-restriction Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229940127130 immunocytokine Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 102200068162 rs121909499 Human genes 0.000 description 1
- 102200057424 rs138789658 Human genes 0.000 description 1
- 102200139516 rs35960830 Human genes 0.000 description 1
- 102220054995 rs373913704 Human genes 0.000 description 1
- 102220041913 rs587780812 Human genes 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 108700008509 tucotuzumab celmoleukin Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowane białko fuzyjne przeciwko EpCAM, które wiąże się specyficznie z ludzką cząsteczką adhezji komórkowej w nabłonku (ang. Epithelial Cell Adhesion Molecule) mające zastosowanie jako czynnik diagnostyczny, prognostyczny i terapeutyczny.
Przez ostatnie lata dokonał się znaczący postęp w rozwoju terapii opartych na przeciwciałach. Na przykład zidentyfikowano nie tylko różne markery specyficzne dla nowotworów, ale także różne przeciwciała, które wiążą się specyficznie z tymi markerami. Przeciwciała mogą zostać zastosowane w celu dostarczenia pewnych cząsteczek, na przykład toksyny albo jednostki stymulującej odporność, na przykład cytokiny, do komórki nowotworowej wytwarzającej marker, jak również w celu selektywnego zabicia komórki nowotworowej (patrz na przykład opisy patentowe US 5,541,087 i US 5,650,150).
Przeciwciało KS-1/4 jest monoklonalnym przeciwciałem pochodzącym od myszy skierowanym przeciwko ludzkiej cząsteczce adhezji komórkowej w nabłonku (EpCAM). EpCAM wytwarzana jest na bardzo niskich poziomach na górnej powierzchni komórkowej pewnych komórek nabłonka. Na przykład EpCAM jest wytwarzana na komórkach jelita, na powierzchni komórkowej stykającej się ze strawionym pokarmem i z dala od krążenia, gdzie nie byłaby dostępna dla wielu białek i komórek układu odpornościowego (Balzar et al. [1999] J. Mol. Med. 77:699-712).
Jednakże w pewnych okolicznościach EpCAM ulega znacznej ekspresji na pewnych komórkach, na przykład komórkach nowotworowych pochodzenia nabłonkowego. Typowo te komórki nowotworowe straciły swoją polarność co powoduje, że EpCAM ulega ekspresji na całej powierzchni komórki. EpCAM jest zatem wygodnym markerem, specyficznym dla nowotworów, służącym do nakierowania na komórki nowotworowe stymulujących odporność jednostek opartych o przeciwciał a (Simon et al. [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2755-2759; Perez et al. [1989] J. Immunol. 142:3662-3667).
Jednak przeciwciała mogą posiadać skojarzoną immunogeniczność w organizmie ssaka. Zjawisko to częściej pojawia się, gdy przeciwciała nie są autologiczne. W konsekwencji skuteczność terapii opartych na przeciwciałach, często z powodu odpowiedzi immunogenicznej skierowana jest przeciwko przeciwciału. Typowo odpowiedź immunogeniczna jest zwiększona, gdy przeciwciało pochodzi w całości albo w części od ssaka innego niż ten, któremu to przeciwciało podano, na przykład gdy przeciwciało pochodzi od myszy, a biorcą jest człowiek.
Odpowiednio pomocne może być zmodyfikowanie przeciwciał pochodzących od myszy, aby bardziej były zbliżone do ludzkich przeciwciał, tak aby ograniczyć albo zminimalizować immunogeniczność przeciwciała pochodzącego od myszy.
Pomimo tego, że rozwinięto wiele różnych podejść, w tym na przykład przeciwciała chimeryczne, humanizacja przeciwciał i opłaszczanie przeciwciał, istnieje zapotrzebowanie w praktyce na przeciwciała, które wiążą się z markerami specyficznymi dla nowotworu, i które zmniejszyłyby immunogeniczność, gdy są podawane człowiekowi. Ponadto istnieje zapotrzebowanie w praktyce na przeciwciała, które dostarczają toksyny albo jednostki stymulujące odporność, na przykład białka fuzyjne albo immunokoniugaty, do markerów specyficznych dla nowotworu w celu selektywnego zabicia komórki nowotworowej.
Wynalazek opiera się o identyfikację rekombinowanych przeciwciał, które specyficznie wiążą się z ludzką EpCAM, ale są mniej immunogeniczne dla ludzi niż ich wzorzec, mysie przeciwciał a przeciwko EpCAM i dotyczy zwłaszcza rekombinowanych przeciwciał KS, w których sekwencje aminokwasów określające jeden lub większą liczbę regionów szkieletowych i/lub regiony określające komplementarność zostały zmodyfikowane w celu ograniczenia ich immunogeniczności dla ludzi.
Istotą wynalazku jest rekombinowane białko fuzyjne przeciwko EpCAM typu przeciwciało-IL2 (interleukina-2), charakteryzujące się tym, że ma sekwencję ciężkiego łańcucha SEQ ID NO: 41 oraz sekwencję lekkiego łańcucha SEQ ID NO: 42 i polepszone własności w zakresie ekspresji białka w komórkach NS/0, powinowactwa wią zania i immunogenicznoś ci.
Terminy „przeciwciało i „immunoglobulina oznaczają tutaj (i) całe przeciwciała (na przykład przeciwciała monoklonalne albo przeciwciała poliklonalne, (ii) ich fragmenty wiążące antygen, w tym na przykład fragment Fab, fragment Fab', (Fab')2, fragment Fv, jednołańcuchowe miejsce wiążące antygen, sFv, (iii) bi-specyficzne przeciwciała i ich fragmenty wiążące antygen, oraz (iv) wielo-specyficzne przeciwciała i ich fragmenty wiążące antygen.
PL 205 352 B1
Terminy „wiąże specyficznie, „specyficznie związany i „wiążąc specyficznie oznaczają tutaj, że przeciwciało posiada powinowactwo wiązania ze szczególnym antygenem przy stężeniu przynajmniej około 106 M-1, korzystnie przynajmniej około 107 M-1, bardziej korzystnie przynajmniej około 108 M-1, a najbardziej korzystnie 1010 M-1.
Terminy „regiony określające komplementarność i „CDR oznaczają tutaj regiony hiperzmienne albo pętle regionu zmiennego immunoglobuliny, które w pierwszej kolejności oddziałują z antygenem. Zarówno zmienny region ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (VH) jak i zmienny region lekkiego łańcucha immunoglobuliny (VL) zawierają trzy CDR umieszczone pomiędzy regionami szkieletowymi, jak przedstawiono na rysunku fig. 1. Na przykład w odniesieniu do sekwencji aminokwasów określającej zmienny region lekkiego łańcucha immunoglobuliny w przeciwciele KS-1/4 jak przedstawiono w SEQ ID NO: 1, CDR są określone poprzez sekwencję aminokwasów od Ser24 do Leu33 (CDR1), od Asp49 do Ser55 (CDR2) i od His88 do Thr96 (CDR3). W odniesieniu do sekwencji aminokwasów określającej zmienny region ciężkiego łańcucha immunoglobuliny w przeciwciele KS-1/4 jak przedstawiono w SEQ ID NO: 2, CDR są określone poprzez sekwencje aminokwasów od Gly26 do Asn35 (CDR1), od Trp50 do Gly66 (CDR2) i od Phe99 do Tyr105 (CDR3). Odpowiednie CDR z innych, opisanych tutaj, przeciwciał przedstawiono na rysunku fig.1A-1C po zestawieniu z odpowiednią sekwencją ciężkiego albo lekkiego łańcucha przeciwciała KS-1/4.
Terminy „region szkieletowy i „FR oznaczają tutaj regiony zmienne regionu immunoglobuliny przyległe do Regionów Określających Komplementarność. Zarówno zmienny region ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (VH) jak i zmienny region lekkiego łańcucha immunoglobuliny (VL) zawierają cztery FR, jak przedstawiono na rysunku fig. 1. Na przykład w odniesieniu do sekwencji aminokwasów określającej zmienny region lekkiego łańcucha immunoglobuliny w przeciwciele KS-1/4 jak przedstawiono w SEQ ID NO: 1, FR są określone poprzez sekwencje aminokwasów od Gln1 do Cys23 (FR1), od Trp34 do Phe48 (FR2), od Gly56 do Cys87 (FR3) i od Phe97 do Lys106 (FR4). W odniesieniu do sekwencji aminokwasów określającej zmienny region ciężkiego łańcucha immunoglobuliny w przeciwciele KS-1/4 jak przedstawiono w SEQ ID NO: 2, FR są określone poprzez sekwencje aminokwasów od Gln1 do Ser25 (FR1), od Trp36 do Gly49 (FR2), od Arg67 do Arg98 (FR3) i od Trp106 do Ser116 (FR4). FR z innych, opisanych tutaj, przeciwciał przedstawiono na rysunku fig. X i Y po zestawieniu z odpowiednią sekwencją ciężkiego albo lekkiego ł a ń cucha przeciwciał a KS-1/4.
Termin „przeciwciało KS oznacza tutaj przeciwciało, które wiąże się specyficznie z tym samym ludzkim antygenem EpCAM wiązanym przez mysie KS-1/4 wytwarzane przez hybrydoma (patrz na przykład Cancer. Res. 1984, 44(2):681-7). Takie przeciwciało KS korzystnie zawiera (i) sekwencję aminokwasów SASSSVSY (aminokwasy 24-31 z SEQ ID NO: 1) określającą przynajmniej fragment sekwencji CDR1 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, (ii) sekwencję aminokwasów DTSNLAS (aminokwasy 49-55 z SEQ ID NO: 1) określającą przynajmniej fragment sekwencji CDR2 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, (iii) sekwencję aminokwasów HQRSGYPYT (aminokwasy 88-96 z SEQ ID NO: 1) określającą przynajmniej fragment sekwencji CDR3 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, (iv) sekwencję aminokwasów GYTFTNYGMN (aminokwasy 26-35 z SEQ ID NO: 2) określającą przynajmniej fragment sekwencji CDR1 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, (v) sekwencję aminokwasów WINTYTGEPTYAD (aminokwasy 50-62 z SEQ ID NO: 2) określającą przynajmniej fragment sekwencji CDR2 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, albo (vi) sekwencję aminokwasów SKGDY (aminokwasy 101-105 z SEQ ID NO: 2) określającą przynajmniej fragment sekwencji CDR3 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny albo jakąkolwiek kombinacje powyższych.
OPIS FIGUR RYSUNKU
Rysunek fig. 1A, 1B i 1C przedstawiają zestawienie odmian lekkich i ciężkich łańcuchów i zgodne sekwencje w przeciwciele KS. Regiony szkieletowe immunoglobuliny (FR1-FR4) są oznaczone jako -. Regiony określające komplementarność immunoglobuliny (CDR-1-CDR3) są oznaczone jako *. Pojedyncze segmenty regionu V lekkiego łańcucha przeciwciała KS są określane jako „VK, przy czym K wiąże się z faktem, że lekki ła ńcuch jest łańcuchem kappa. Pojedyncze segmenty regionu V lekkiego łańcucha przeciwciała KS są określane jako „VH. Aminokwasy, które mogą ulegać substytucji, są oznaczone jako „X w zgodnych sekwencjach.
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
Istotą wynalazku jest rekombinowane białko fuzyjne przeciwko EpCAM typu przeciwciało-IL2 (interleukina-2), które specyficznie wiąże się z ludzką cząsteczką adhezji komórkowej w nabłonku (EpCAM). Przeciwciała według wynalazku mają zmienione zmienne regiony, co skutkuje obniżoną immunogenicznością u ludzi.
PL 205 352 B1
Zmienne regiony przeciwciała według wynalazku są szczególnie użyteczne w kierowaniu przeciwciał i białek fuzyjnych przeciwciał na tkanki nowotworowe, w których EpCAM ulega nadekspresji u pacjentów. W korzystnych realizacjach przeciwciał o wedł ug wynalazku jest przyłączone do cytokiny w celu wytworzenia immunocytokiny.
Sekwencje białkowe według wynalazku
Wynalazek ujawnia rodzinę zmiennego regionu przeciwciała lub sekwencję V regionu, które, jeśli ulegną prawidłowo heterodimeryzacji, wiążą się z ludzką cząsteczką adhezji komórkowej w nabłonku znaną także jako antygen KS lub KSA. Korzystne białka według wynalazku są użyteczne w leczeniu pacjentów jak zostało to opisane. Odpowiednio, korzystne odmiany przeciwciała KS są humanizowane, deimmunizowane, albo jedno i drugie, w celu ograniczenia ich immunogeniczności podczas podawania ludziom. Według wynalazku mysie przeciwciała KS mogą być deimmunizowane lub humanizowane, na przykład za pomocą deimmunizacji, w których potencjalne epitopy limfocytów T są eliminowane lub osłabiane poprzez wprowadzenie mutacji, które obniżają wiązanie epitopów peptydów do cząsteczki MHC klasy II (patrz na przykład opis patentowy WO98/52976 i WO00/34317), lub stosując sposoby w których epitopy limfocytów T nie pochodzące od człowieka są zmutowane w taki sposób, aby odpowiadały ludzkim swoistym epitopom, występującym w ludzkich przeciwciałach (patrz na przykład opis patentowy US 5,712,120).
I Zmienny lekki łańcuch
Rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję zmiennego łańcucha lekkiego immunoglobuliny posiadającą następującą kolejność aminokwasów:
X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C-S-A-S-S-S-V-S-T-X-L-W-Y-X-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-l-X-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-l-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C-H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-X-E-l-K (SEQ ID NO: 3)
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR1 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 1 do 23 z SEQ ID NO: 3, mianowicie X-l-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z aminokwasów z następujących w regionie FR1: Q lub E w pozycji Xaa1; L lub V w pozycji Xaa3; I, T lub S w pozycji Xaa10; M lub L w pozycji Xaa11; S lub A w pozycji Xaa12; A, L lub V w pozycji Xaa13, E lub Q w pozycji Xaa17, K lub R w pozycji Xaa18, V lub A w pozycji Xaa19 i M, L lub I w pozycji Xaa21. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z aminokwasów z następujących w regionie FR1: E w pozycji Xaa1; V w pozycji Xaa3; T lub S w pozycji Xaa10; L w pozycji Xaa11; A w pozycji Xaa12; L lub V w pozycji Xaa13, Q w pozycji Xaa17, R w pozycji Xaa18, A w pozycji Xaa19 i L lub I w pozycji Xaa21.
W kolejnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą CDR1 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 24 do 33 z SEQ ID NO: 3, mianowicie S-A-S-S-S-V-S-T-X-L. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM według wynalazku posiada jeden z następujących aminokwasów w regionie CDR1: M lub I w pozycji Xaa32. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada substytucję aminokwasów w regionie CDR1, na przykład I w pozycji Xaa32.
W kolejnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR2 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 34 do 48 z SEQ ID NO: 3, mianowicie W-Y-X-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-l-X. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR2: Q lub L w pozycji Xaa36; S lub Q w pozycji Xaa41; S, A lub P w pozycji Xaa42; P lub L w pozycji Xaa45; W lub L w pozycji Xaa46; i F lub Y w pozycji Xaa48. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR2: L w pozycji Xaa36; Q w pozycji Xaa41; A lub P w pozycji Xaa42; L w pozycji Xaa45; L w pozycji Xaa46; i Y w pozycji Xaa48.
W kolejnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR3 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 56 do 87 z SEQ ID NO: 3, mianowicie G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-l-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM według wynalazku posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR3: F lub I w pozycji Xaa57; A lub S w pozycji Xaa59; S, D lub T w pozycji Xaa69; I lub T w pozycji Xaa71; I lub T w pozycji Xaa73; S lub N w pozycji Xaa75; M lub L w pozycji Xaa77; A lub P w pozycji Xaa79; A lub F w pozycji Xaa82; i T lub V
PL 205 352 B1 w pozycji Xaa84. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciał o przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR3: I w pozycji Xaa57; S w pozycji Xaa59; D lub T w pozycji Xaa69; T w pozycji Xaa71; T w pozycji Xaa73; N w pozycji Xaa75; L w pozycji Xaa77; P w pozycji Xaa79; F w pozycji Xaa82; i V w pozycji Xaa84.
W kolejnej realizacji rekombinowane przeciwciał o przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR4 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 97 do 106 z SEQ ID NO: 3, mianowicie F-G-G-G-T-K-X-E-l-K. W szczególnoś ci, rekombinowane przeciwciał o przeciwko EpCAM według wynalazku posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR4, na przykład L lub V w pozycji Xaa103. Odpowiednio, rekombinowane przeciwcia ł o przeciwko EpCAM posiada substytucję aminokwasu w regionie FR4, na przykład V w pozycji Xaa103.
II Zmienny ciężki łańcuch
Rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję zmiennego ciężkiego łańcucha immunoglobuliny mającą następującą kolejność aminokwasów:
Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-l-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-N-W-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G-W-l-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G-R-X-X-X-X-X-X-T-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-X-S-K-G-D-Y-W-G-X-G-T-X-V-T-V-S-S (SEQ ID NO: 4)
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR1 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 1 do 25 z SEQ ID NO: 4, mianowicie Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-l-S-C-K-A-S. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z aminokwasów z następujących w regionie FR1: I lub V w pozycji Xaa2; P lub A w pozycji Xaa9; L lub V w pozycji Xaa11; E lub S w pozycji Xaa16 oraz T lub S w pozycji Xaa17. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR1: V w pozycji Xaa2; A w pozycji Xaa9; V w pozycji Xaa11; S w pozycji Xaa16; oraz S w pozycji Xaa17.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR2 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 36 do 49 z SEQ ID NO: 4, mianowicie W-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR2: K lub R w pozycji Xaa38, T lub A w pozycji Xaa40; K lub Q w pozycji Xaa43; K lub E w pozycji Xaa46. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR2: R w pozycji Xaa38, A w pozycji Xaa40; Q w pozycji Xaa43 i E w pozycji Xaa46.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą CDR2 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 50 do 66 z SEQ ID NO: 4, mianowicie W-l-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie CDR2: D lub K w pozycji Xaa63, oraz K lub Q w pozycji Xaa65. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie CDR2: K w pozycji Xaa63 i Q w pozycji Xaa65.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR3 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 67 do 98 z SEQ ID NO: 4, mianowicie R-X-X-X-X-X-X-T-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM według wynalazku posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR3: F lub V w pozycji Xaa68, A, T lub V w pozycji Xaa69; F lub I w pozycji Xaa70; S lub T w pozycji Xaa71, L lub A w pozycji Xaa72, E lub D w pozycji Xaa73; A lub T w pozycji Xaa76; A lub L w pozycji Xaa79, F lub Y w pozycji Xaa80, I lub L w pozycji Xaa83; N lub S w pozycji Xaa84; N lub S w pozycji Xaa85, N, A lub S w pozycji Xaa88, M lub T w pozycji Xaa91; T lub V w pozycji Xaa93. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR3: V w pozycji Xaa68, T lub V w pozycji Xaa69; I w pozycji Xaa70; T w pozycji Xaa71, A w pozycji Xaa72, D w pozycji Xaa73; T w pozycji Xaa76; L w pozycji Xaa79, Y w pozycji Xaa80, L w pozycji Xaa83; S w pozycji Xaa84; S w pozycji Xaa85, A lub S w pozycji Xaa88, T w pozycji Xaa91 i V w pozycji Xaa93.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą CDR3 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 99
PL 205 352 B1 do 105 z SEQ ID NO: 4, mianowicie F-X-S-K-G-D-Y. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie CDR3, na przykład I albo M w pozycji Xaa100. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada substytucję aminokwasów w regionie CDR3, na przykład M w pozycji Xaa100.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR4 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 106 do 116 z SEQ ID NO: 4, mianowicie W-G-X-G-T-X-V-T-V-S-S. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR4: Q albo T w pozycji Xaa108 i S albo T w pozycji X111. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR4: T w pozycji Xaa108 i T w pozycji X111.
III Udoskonalony zmienny lekki łańcuch
W kolejnej realizacji rekombinowane przeciwciał o przeciwko EpCAM posiada sekwencję zmiennego lekkiego łańcucha immunoglobuliny posiadającą następującą kolejność aminokwasów:
X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C-S-A-S-S-S-V-S-Y-M-L-W-Y-Q-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-l-F-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-l-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C-H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-L-E-l-K (SEQ ID NO: 5)
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR1 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 1 do 23 z SEQ ID NO: 5, mianowicie X-l-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z aminokwasów z następujących w regionie FR1: Q lub E w pozycji Xaa1; L lub V w pozycji Xaa3; I lub T w pozycji Xaa10; M lub L w pozycji Xaa11; A lub L w pozycji Xaa13, K lub R w pozycji Xaa18 oraz M lub L w pozycji Xaa21. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z aminokwasów z następujących w regionie FR1: E w pozycji Xaa1; V w pozycji Xaa3; T w pozycji Xaa10; L w pozycji Xaa11; L w pozycji Xaa13, R w pozycji Xaa18 i L w pozycji Xaa21.
W kolejnej korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR1 lekkiego łańcucha immunoglobuliny posiadającą przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR1: Q lub E w pozycji Xaa1, A lub L w pozycji Xaa11 i M lub L w pozycji Xaa21. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR1 lekkiego łańcucha immunoglobuliny mającą przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR1: E w pozycji Xaa1, L w pozycji Xaa11 i L w pozycji Xaa21.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR2 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 34 do 48 z SEQ ID NO: 5, mianowicie W-Y-Q-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-l-F. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR2: S lub Q w pozycji Xaa41; S lub A w pozycji Xaa42; P lub L w pozycji Xaa45; oraz W lub L w pozycji Xaa46. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR2: Q w pozycji Xaa41; A w pozycji Xaa42; L w pozycji Xaa45 i L w pozycji Xaa46.
W kolejnej korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR2 lekkiego łańcucha immunoglobuliny mającą przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR2: S lub A w pozycji Xaa42; P lub L w pozycji Xaa45 i W lub L w pozycji Xaa46. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR2 lekkiego łańcucha immunoglobuliny mającą przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR2: A w pozycji Xaa42; L w pozycji Xaa45 i L w pozycji Xaa46.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR3 lekkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 56 do 87 z SEQ ID NO: 5, mianowicie G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-l-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada jeden z następujących aminokwasów w regionie FR3: F lub I w pozycji Xaa57; S lub D w pozycji Xaa69; S lub T w pozycji Xaa71; I lub T w pozycji Xaa73; M lub L w pozycji Xaa77; A lub P w pozycji Xaa79; A lub F w pozycji Xaa82; oraz T lub V w pozycji Xaa84. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie
PL 205 352 B1
FR3: I w pozycji Xaa57; D w pozycji Xaa69; T w pozycji Xaa71; T w pozycji Xaa73; L w pozycji Xaa77;
P w pozycji Xaa79; F w pozycji Xaa82 i V w pozycji Xaa84.
W kolejnej korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciał o przeciwko EpCAM wedł ug wynalazku posiada sekwencję aminokwasów określającą FR3 lekkiego łańcucha immunoglobuliny mającą przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR3: F lub I w pozycji Xaa57; S lub D w pozycji Xaa69; A lub P w pozycji Xaa79; A lub F w pozycji Xaa82; i T lub V w pozycji Xaa84. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR3 lekkiego łańcucha immunoglobuliny mającą przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR3: I w pozycji Xaa57; D w pozycji Xaa69; P w pozycji Xaa79; F w pozycji Xaa82 i V w pozycji Xaa84.
IV Udoskonalony zmienny ciężki łańcuch
Rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję zmiennego ciężkiego łańcucha immunoglobuliny mającą następującą kolejność aminokwasów:
Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-l-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-N-W-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G-W-l-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G-R-X-X-X-S-L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-l-S-K-G-D-Y-W-G-Q-G-T-S-V-T-V-S-S (SEQ ID NO: 6)
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR1 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 1 do 25 z SEQ ID NO: 6, mianowicie Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-l-S-C-K-A-S. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR1: I lub V w pozycji Xaa2; P lub A w pozycji Xaa9; L lub V w pozycji Xaa11; i T lub S w pozycji Xaa17. Odpowiednio, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM według wynalazku posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR1: V w pozycji Xaa2; A w pozycji Xaa9; V w pozycji Xaa11 i S w pozycji Xaa17.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR1 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny mającą przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR1: I lub V w pozycji Xaa2; P lub A w pozycji Xaa9 oraz L lub V w pozycji Xaa11. Odpowiednio, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM według wynalazku posiada sekwencję aminokwasów określającą FR1 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny mającą przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR1: V w pozycji Xaa2; A w pozycji Xaa9 i V w pozycji Xaa11.
W kolejnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR2 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 36 do 49 z SEQ ID NO: 6, mianowicie W-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR2: K lub R w pozycji Xaa38, T lub A w pozycji Xaa40 i K lub E w pozycji Xaa46. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR2: R w pozycji Xaa38, A w pozycji Xaa40 i E w pozycji Xaa46.
W kolejnej korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR2 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny mającą następujące aminokwasy w regionie FR1, na przykład K lub E w pozycji Xaa46. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR2 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny mającą substytucję aminokwasów w regionie FR1, na przykład E w pozycji Xaa46.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą CDR2 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 50 do 66 z SEQ ID NO: 6, mianowicie W-l-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada jeden z następujących aminokwasów w regionie CDR2: D lub K w pozycji Xaa63 i K lub Q w pozycji Xaa65. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie CDR2: K w pozycji Xaa63 i Q w pozycji Xaa65.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR3 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 67 do 98 z SEQ ID NO: 6, mianowicie R-X-X-X-S-L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM według wynalazku posiada
PL 205 352 B1 przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR3: F lub V w pozycji Xaa68, A lub T w pozycji Xaa69; F lub I w pozycji Xaa70; E lub D w pozycji Xaa73; A lub T w pozycji Xaa76; F lub Y w pozycji Xaa80, I lub L w pozycji Xaa83; N lub S w pozycji Xaa84; N lub S w pozycji Xaa85, N, A lub S w pozycji Xaa88, M lub T w pozycji Xaa91 i T lub V w pozycji Xaa93. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR3: V w pozycji Xaa68, T w pozycji Xaa69; I w pozycji Xaa70; D w pozycji Xaa73; T w pozycji Xaa76; Y w pozycji Xaa80, L w pozycji Xaa83; S w pozycji Xaa84; S w pozycji Xaa85, A lub S w pozycji Xaa88, T w pozycji Xaa91 i V w pozycji Xaa93.
W kolejnej korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM według wynalazku posiada sekwencję aminokwasów określającą FR3 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny mającą przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR3: F lub V w pozycji Xaa68; E lub D w pozycji Xaa73; N lub S w pozycji Xaa84; N lub S w pozycji Xaa85, N lub A w pozycji Xaa88 i T lub V w pozycji Xaa93. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR3 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny mającą przynajmniej jedną z następujących substytucji aminokwasów w regionie FR3: V w pozycji Xaa68; D w pozycji Xaa73; S w pozycji Xaa84; S w pozycji Xaa85; A w pozycji Xaa88 oraz V w pozycji Xaa93.
W korzystnej realizacji rekombinowane przeciwciał o przeciwko EpCAM posiada sekwencję aminokwasów określającą FR4 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, której odpowiadają reszty od 106 do 116 z SEQ ID NO: 6, mianowicie W-G-X-G-T-S-V-T-V-S-S. W szczególności, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada przynajmniej jeden z następujących aminokwasów w regionie FR4, na przykład Q lub T w pozycji Xaa108. Bardziej korzystnie, rekombinowane przeciwciało przeciwko EpCAM posiada substytucję aminokwasu w regionie FR4, na przykład T w pozycji Xaa108.
Odpowiednio, korzystne regiony V zawierają substytucje w domenach FR regionów VH i/lub VK odpowiadających zmiennym regionom w mysim KS-1/4. Ponadto korzystne regiony V według wynalazku nie zawierają insercji i delecji aminokwasów w porównaniu do zmiennych regionów mysiego KS-1/4.
Korzystne odmiany obejmują białka posiadające zmienne regiony z ponad 80% zgodnością/homologią z mysim KS-1/4. Sekwencja aminokwasów zmiennego regionu mysiego KS lub jego fragmentu może być zastosowana jako sekwencja odniesienia dla określenia czy potencjalna sekwencja posiada wystarczające podobieństwo aminokwasów, aby mieć rozsądne oczekiwania co do sukcesu sposobu według wynalazku. Korzystnie sekwencje odmiany są przynajmniej w 70% podobne lub w 60% identyczne, bardziej korzystnie przynajmniej w 75% podobne lub w 65% identyczne, a zwłaszcza w 80% podobne lub w 70% identyczne z FR lub CDR zmiennych lekkiego i ciężkiego łańcucha mysiego KS.
W celu okreś lenia, czy region potencjalnego peptydu posiada wymagane procentowe podobieństwo lub zgodność z sekwencją mysiego KS, potencjalna sekwencja aminokwasów i sekwencja mysiego KS są w pierwszej kolejności zestawiane przy zastosowaniu algorytmu programowania dynamicznego opisanego przez: Smith i Waterman (1981) w J.Mol.Biol. 147:195-197, w połączeniu z matrycą substytucji BLOSUM62 przedstawiona na rysunku fig. 2. wedł ug Henikoff i Henikoff (1992)
PNAS 89:10915-10919. Według wynalazku właściwa wartość dla współczynnika kary dla przerwy insercji (ang. gap insertion penalty) wynosi -12, a właściwa wartość współczynnika kary dla przerwy zasięgu (ang. gap extension penalty) wynosi -4. Programy komputerowe przeprowadzające zestawienia wykorzystują algorytmy Smitha-Watermana i matrycę BLOSUM62, takie jak oprogramowanie GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, Anglia), są komercyjnie dostępne i powszechnie stosowane przez znawców tematu. Jeśli zestawienie pomiędzy potencjalną sekwencją a sekwencją odniesienia zostanie przeprowadzone, można wyliczyć procentową wartość podobieństwa. Pojedyncze aminokwasy z każdej sekwencji są porównywane sekwencyjnie według ich podobieństwa do siebie. Jeśli wartość z matrycy BLOSUM62 odpowiadająca dwóm zestawionym aminokwasom wynosi zero lub przyjmuje wartość ujemną, wartość podobieństwa dla tej pary wynosi zero; w innym przypadku wartość podobieństwa dla pary wynosi 1,0. Pierwotny wynik zgodności jest sumą wyników podobieństwa dla par zestawionych aminokwasów. Pierwotny wynik jest następnie normalizowany poprzez podzielenie go przez liczbę aminokwasów w mniejszej z sekwencji: potencjalnej lub odniesienia. Normalizowany pierwotny wynik jest procentowym podobieństwem. Alternatywnie, aby wyliczyć procent identyczności, zestawione aminokwasy są ponownie porównywane sekwencyjnie. Jeśli aminokwasy nie są identyczne, wartość zgodności dla pary wynosi zero; w innym przypadku wartość zgodności dla pary wynosi 1,0. Pierwotny wynik zgodności jest sumą identycznych zestawionych aminokwasów. Pierwotny wynik jest
PL 205 352 B1 następnie normalizowany poprzez podzielenie go przez liczbę aminokwasów w mniejszej z sekwencji: potencjalnej lub odniesienia. Normalizowany wynik pierwotny jest procentem identyczności. Insercje lub delecje są pomijane w celu wyliczenia procentowego podobieństwa i zgodności. Odpowiednio, współczynniki kary dla przerw nie są stosowane w tych obliczeniach, chociaż są stosowane w początkowym zestawieniu.
Istotą wynalazku są także sposoby wyznaczania ekspresji przeciwciał KS przez komórki takie jak komórki ssaków, komórki owadów, komórki roślin, komórki drożdży, inne komórki eukariotyczne oraz komórki prokariotyczne (patrz przykład 1). W korzystnym sposobie, regiony V przeciwciała KS ulegają ekspresji jako składniki całego ludzkiego przeciwciała, a ekspresja przeciwciała z linii komórek eukariotycznych jest wyznaczana metodą ELISA, która wykrywa ludzki region Fc. Aby precyzyjnie zmierzyć wiązanie przeciwciała KS z EpCAM można zastosować metodę Biacore'a.
Leczenie chorób u ludzi z zastosowaniem białek fuzyjnych przeciwciała KS
Wynalazek ujawnia także sekwencje białek fuzyjnych przeciwciał KS-IL2, które są użyteczne w leczeniu chorób u ludzi, takich jak rak. Pewne białka fuzyjne przeciwciało KS-IL2, takie jak KS-1/4-IL2 (patrz na przykład konstrukcja 3 w przykładzie X), mogą być stosowane w leczeniu pacjentów chorych na raka, z zadziwiająco znikomą odpowiedzią immunologiczną przeciwko przeciwciału.
Odkryto, że podczas leczenia ludzkich nowotworów z zastosowaniem KS-1/4(VH2/VK1)-IL2 obserwuje się nawet mniejszą immunogenniczność niż w przypadku KS-1/4(Konstrukcja 3)-IL2. Szczególnie podczas postępowania klinicznego obserwuje się mniejszą częstotliwość pacjentów z antyidiotypowymi przeciwciałami oraz przeciwciałami skierowanymi przeciwko połączeniu przeciwciało-IL2 lub przeciwko jednostce IL-2 niż w przypadku KS-1/4(Konstrukcja 3)-IL2. Regiony zmienne przeciwciała według wynalazku mogą także być przyłączone do cytokin, na przykład interlukin 1, 2, 6, 10 lub 12; interferonów alfa i beta; YNF i INF gamma. Wynalazek może być bardziej w pełni zrozumiały poprzez odniesienie się do następujących przykładów, które nie są ograniczeniem wynalazku.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Sposoby i odczynniki do ekspresji przeciwciał KS i wyznaczanie ich aktywności wiązania antygenu
IA. Hodowla komórkowa i transfekcja
Następujące ogólne techniki były stosowane w kolejnych przykładach. W celu przejściowej transfekcji plazmid DNA był wprowadzony do 293 komórek ludzkiej nerki poprzez koprecypitację plazmidowego DNA z fosforanem wapnia [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY].
W celu otrzymania stabilnie transfekowanych klonów, plazmidowy DNA był wprowadzony do komórek mysiego mięsaka NS/0 z zastosowaniem elektroporacji. Komórki NS/0 rosły na pożywce Eagle'a w modyfikacji Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą byczą. Około 5x106 komórek było płukanych jednokrotnie stosując PBS i ponownie zawieszonych w 0,5 ml roztworze buforu fosforanowego (PBS). Dziesięć μg liniowego plazmidu DNA było następnie inkubowane z komórkami w Gene Pulser Cuvette (przerwa między elektrodami 0,4 cm, BioRad) przez 10 minut w lodzie. Elektroporazja była przeprowadzona z zastosowaniem Gene Pulser (BioRad) i ustawienia 0,25 V i 500 pF. Pozostawiano komórki w celu regeneracji na 10 minut w lodzie, po czym były one ponownie zawieszone w pożywce wzrostowej a następnie rozłożone na płytce o 96 studzienkach. Stabilnie transfekowane klony ulegały selekcji poprzez wzrost w obecności 100 nM metotreksatu (MTX), który był wprowadzany dwa dni po transfekcji. Komórki były odżywiane co 3 dni 2 do 3 razy, a klony oporne na MTX pojawiały się w 2 do 3 tygodniu. Supernatanty z klonów były analizowane z zastosowaniem ELISA przeciwko ludzkiemu Fc w celu identyfikacji komórek wysoce produktywnych [Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods125:191]. Wysoce produktywne klony były izolowane i namnożone w pożywce zawierającej 100 nM MTX.
IB. Metody ELISA
Trzy różne metody ELISA były stosowane do określenia stężeń białkowych produktów w supernatantach z klonów opornych na MTX i innych badanych próbkach. ELISA anty-huFc była stosowana do pomiaru poziomu białek zawierających ludzki Fc, na przykład chimerycznych przeciwciał. ELISA anty-hu kappa była stosowana w celu pomiaru poziomu lekkich łańcuchów kappa (chimerycznych lub ludzkich immunoglobulin). ELISA anty-muFc była stosowana w celu pomiaru poziomu białek zawierających muFc w badanych próbkach (patrz przykład 1C poniżej).
PL 205 352 B1
ELISA anty-huFc opisano poniżej szczegółowo.
A Powlekanie płytek
Płytki do analizy ELISA były pokrywane stosując AffiniPure kozią IgG przeciwko ludzkiej (H+L) (Jackson Immuno Research) w stężeniu 5 μg/ml w PBS, oraz 100 μΐ/studzienkę na płytce zawierającej 96 studzienek (Nunc-lmmunoplate Maxisorp). Powleczone płytki były przykrywane i inkubowane przez noc w temperaturze 4°C. Płytki były następnie płukane 4 razy z zastosowaniem 0,05% Tween (Tween 20) w PBS, i zablokowane przy użyciu 1% BSA/1% surowicy koziej w PBS, stosując 200 μl/studzienkę. Po inkubacji z blokującym buforem w temperaturze 37°C przez 2 godziny płytki były płukane 4 razy stosując 0,05% Tween w PBS i pozostawione do wyschnięcia na papierowych ręcznikach.
B Inkubacja z zastosowaniem próbek badanych i drugiego przeciwciała
Próbki badane były rozcieńczane do właściwego stężenia w buforze próbek, który zawierał 1% BSA/1% surowicę kozią/0,05% Tween w PBS. Krzywa kalibracji była sporządzona stosując chimeryczne przeciwciało (z ludzkim Fc), stężenie którego było znane. Aby sporządzić krzywą kalibaracji, przygotowano serie rozcieńczeń w buforze próbki tak, aby krzywa kalibracji mieściła się w zakresie od 125 ng/ml do 3,9 ng/ml. Rozcieńczone próbki i wzorce były dodawane na płytkę, 100 μl/studzienkę, a płytka inkubowana w temperaturze 37°C przez 2 godziny.
Po inkubacji płytka była płukana 8 razy stosując 0,05% Tween w PBS. Do każdej studzienki było dodawane 100 μl drugiego przeciwciała, peroksydazy chrzanowej (ang. horse radish peroxidase HRP) - połączonej z IgG przeciwko ludzkiej (Jackson Immuno Reaserch), rozcieńczone około 1:120 000 w buforze próbki. Dokładne rozcieńczenie drugiego przeciwciała musiało być określone dla każdej serii IgG przeciwko ludzkiej połączonej z HRP. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 2 10 godziny płytki były płukane 8 razy stosując 0,05% Tween w PBS.
C Rozwój
Roztwór zawierający substraty był dodawany na płytkę w ilości 100 μl/studzienkę. Roztwór substratów był przygotowywany poprzez rozcieńczenie 30 mg o-dihydrochlorku fenyloenodiaminy (OPD) (1 tabletka) w 15 ml buforu 0,025M kwasu cytrynowego/0,05M Na2HPO4 w pH 5, który zawierał 0,03% bezpośrednio dodanego H2O2. Pozostawiano próbkę w temperaturze pokojowej w ciemności w celu rozwinięcia się koloru. Czas rozwijania był zmieniany w zależności od zmienności serii opłaszczonych płytek, drugiego przeciwciała itp. Śledzono rozwijanie koloru w przypadku krzywej kalibracji w celu określenia momentu zatrzymania reakcji. Reakcja była zatrzymywana poprzez dodanie 4N H2SO4 w ilości 100 μl/studzienkę. Płytka była analizowana przez czytnik płytek, który był ustawiony na 490 nm i 650 nm i zaprogramowany aby odejmować tło OD przy 650 nm od OD przy 490 nm.
ELISA anty-hu kappa przeprowadzano stosując tę samą procedurę jak opisano powyżej, z wyjątkiem sytuacji, gdy drugim zastosowanym przeciwciałem była kozia anty-hu kappa połączona z peroksydazą chrzanową (Southern Biotechnology Assoc. Inc., Birmingham, AL.) stosowana w rozcieńczeniu 1:4000.
Procedura w przypadku ELISA anty-muFc była także podobna, z tym wyjątkiem, że płytki były pokryte AffiniPure kozią IgG przeciwko mysiej (H+L) (Jackson Immuno Research) o stężeniu 5 μg/ml w PBS i w ilości 100 μl/studzienkę; a drugie przeciwciało było kozią anty-mulg, Fcy połączoną z peroksydazą chrzanową (Jackson ImmunoResearch) stosowaną w rozcieńczeniu 1:5000.
1C. Klonowanie antygenu KS (KSA, EpCAM) oraz ekspresja formy rozpuszczalnej jako ludzkiej
EpCAM-mysiej Fc
Messenger RNA (mRNA) był uzyskany z komórek LnCAP stosując Dynabeads mRNA Direct Kit (Dynal, Inc., Lake Success, NY) według instrukcji producenta. Po syntezie pierwszego łańcucha cDNA z użyciem oligo(dT) i odwrotnej transkryptazy, cDNA o całkowitej długości kodujący cząsteczkę adhezji komórkowej w nabłonku (także znaną jako antygen KS lub KSA) był sklonowany stosując łańcuchową reakcję polimerazy (ang. polymerase chain reaction - PCR). Sekwencje primerów PCR były oparte na opublikowanych sekwencjach opisanych przez Perez i Walker (1989) w J. Immunol. 142:3662-3667. Sekwencja sensownego primera jest następująca: TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGCA (SEQ ID NO: 27), a sekwencja primera niesensownego jest następująca: CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT (SEQ ID NO: 28), gdzie pogrubionymi literami zaznaczono kodon inicjacji translacji oraz antykodon kodonu zatrzymania translacji, a podkreślono miejsca restrykcyjne dla Xbal (TCTAGA) i Xhol(CTCGAG). Produkt PCR był sklonowany a właściwa sekwencja KSA była potwierdzona poprzez sekwencjonowanie kilku niezależnych klonów. Sekwencja cDNA KSA z LnCAP była zasadniczo
PL 205 352 B1 identyczna z opublikowaną sekwencją KSA z komórek UCLA-P3 (Perez i Walker, 1989). Jednakże dla reszty aminokwasu o numerze 115, sekwencja nukleotydu z LnCAP raczej była ATG niż ACG (Met zamiast Thr), a dla reszty aminokwasu o numerze 227, sekwencja nukleotydu z LnCAP raczej była ATA niż ATG (Ile zamiast Met).
Wiązanie przeciwciała KS-1/4 z rekombinowanym KSA zostało przedstawione za pomocą immunobarwienia. Otrzymano ekspresję KSA na powierzchni poprzez transfekowanie komórek, na przykład CT26, B16 itp. KSA o całkowitej długości w odpowiednim dla ssaków wektorze ekspresji (pdCs jak opisano w opisie patentowym US 5,541,087), przed immunobarwieniem z przeciwciałem KS-1/4. W celu ekspresji KSA jako rozpuszczalnego antygenu, został usunięty fragment cDNA kodujący przezbłonową domenę KSA. W celu ułatwienia ekspresji, detekcji i oczyszczania, rozpuszczalny KSA był wytwarzany jako KSA-muFc, którego konstrukcja jest opisana następująco. Fragment restrykcyjny Xbal-EcoRI o długości 780 bp kodujący rozpuszczalny KSA był przyłączony do fragmentu Aflll-Xhol kodującego muFc (opis patentowy US 5,726,044) przez łącznikowy fragment:
5' AA TTC TCA ATG CAG GGC 3' (SEQ ID NO: 29)
3' G AGT TAC GTC CCG AAT T 5' (SEQ ID NO: 30)
Fragment Xbal-Xhol kodujący rozpuszczalny KSA-muFc był przyłączony do wektora pdCs. Otrzymany wektor ekspresji, pdCs-KSA-muFc, był stosowany do transfekowania komórek, a stabilne klony wytwarzające KSA-muFc były identyfikowane z zastosowaniem ELISA anty-muFc.
ID. Pomiar wiązania antygenu
KSA-muFc w kondycjonowanej pożywce był w pierwszej kolejności oczyszczany z zastosowaniem chromatografii Protein A według przepisu dostawcy (Repligen, Cambridge, MA). Oczyszczony KSA-muFc był stosowany w celu powleczenia płytek z 96 studzienkami (Nunc-lmmuno plate, Maxisorp) w ilości 5 μg/ml w PBS i 100 μl/studzienkę. Metoda była podobna jak w przypadku procedury ELISA opisanej w przykładzie 1B. W skrócie opłaszczone płytki były przykrywane i inkubowane przez noc w temperaturze 4°C. Płytki były następnie płukane i blokowane. Próbki badane były rozcieńczane do właściwych stężeń w buforze próbki, dodawane na płytki w ilości 100 μl/studzienkę, a płytki inkubowane w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Po inkubacji płytka była płukana 8 razy z zastosowaniem 0,05% Tween w PBS. Do każdej studzienki było następnie dodawane 100 μl drugiego przeciwciała, IgG przeciwko ludzkiej połączona z peroksydazą chrzanową (Jackason Immuno Research), rozcieńczana w stosunku około 1:120 000 w buforze próbki. Płytka była następnie rozwijana i analizowana jak opisano w pPrzykładzie 1B.
IE. Pomiar wartości „on-rate i „off-rate przeciwciał KS-1/4 z EpCAM z zastosowaniem metody
Biacore.
Powinowactwo cząsteczek KS-1/4 i KS-IL2 do antygenu EpCAM było mierzone z zastosowaniem analizy rezonansu powierzchni plazmonowej oddziaływania przeciwciało-antygen przy użyciu aparatu Biacore (Biacore International AB, Uppsala, Szwecja). EpCAM-mysiFc był sprzęgany z czujnikiem CM5 stosując protokół łączenia amin dostarczony przez producenta. KS-1/4 i KS-IL2 w stężeniach wahających się od 25 nM do 200 nM były pominięte przez czujnik, przy czym obserwowano wiązanie się z chipem. Stosując wbudowane procedury dopasowania do krzywej z oprogramowania Biacore, wyliczano wartości „on-rate i „off-rate, stałe asocjacji i dysocjacji.
IF. Pomiar powinowactwa wiązania przeciwciał KS-1/4 z zastosowaniem linii komórkowych wytwarzających EpCAM
125
Oczyszczone przeciwciała KS-1/4 były znakowane jodem 125l stosując standardowe techniki, a wzrastające stężenia znakowanych białek były inkubowane z użyciem EpCAM-pozytywnych linii komórkowych PC-3. Z zastosowaniem analizy Scatchard wygenerowane wygenerowano krzywe wysyconego wiązania i określono stałe dysocjacji.
P r z y k ł a d 2. Klonowanie cDNA kodującego VH i Vk mysiego KS-1/4 i konstrukcja wektora w celu ekspresji przeciwciała KS-1/4 wywodzącego się z hybrydoma
Messenger RNA uzyskany z hybrydoma wytwarzającej mysi KS-1/4 (otrzymanej od R. Reisfeld, Scripps Research Institute) był odwrotnie transkrybowany z oligo(dT) i następnie stosowany jako matryce do PCR w celu powielenia sekwencji kodujących region zmienny ciężkiego łańcucha (VH) i zmienny region lekkiego łańcucha (VK). Primery PCR były oznaczone w oparciu o opublikowane sekwencje (Beavers et al. ibid.). Primery PCR dla VH miały następujące sekwencje:
Vh primer wiodący (5') GACTCGGAGCCCAAGTCTTAGACATC (3') (SEQ ID NO: 31)
Vh primer odwrotny (5') CAAGCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGACGTTC (3') (SEQ ID NO: 32),
PL 205 352 B1 gdzie sekwencje CTCGAG i AAGCTT odpowiadają odpowiednio miejscom restrykcyjnym dla Xholl HindIII względnie stosowanym do przyłączenia VH do wektora ekspresji (patrz poniżej); a sekwencja TAC w primerze odwrotnym mogła wprowadzić GTA, zgodną sekwencję donora składania, w łańcuchu sensownym produktu PCR.
Primery PCR dla VK miały następującą sekwencję:
VK primer wiodący (5') GATCTAGACAAGATGGATTTTCAAGTG (3') (SEQ ID NO: 33)
VK primer odwrotny (5') GAAGATCTTACGTTTTATTTCCAGCTTGG (3') (SEQ ID 5 NO: 34) gdzie sekwencje TCTAGA i AGATCT odpowiadają odpowiednio miejscom restrykcyjnym dla
Xbal i Bglll względnie stosowanym do przyłączenia VK do wektora ekspresji (patrz poniżej); ATG jest kodonem inicjacji translacji lekkiego łańcucha; a sekwencja TAC w primerze odwrotnym mogła wprowadzić GTA, zgodną sekwencję donora składania, w łańcuchu sensownym produktu PCR.
Produkty PCR kodujące VH i VK mysiego przeciwciała KS-1/4 sklonowano do wektora pCRII (lnvitrogen, Carlsbad, CA). Sekwencjonowano kilka klonów VH i VK i określano była właściwą sekwencję dla każdego z nich. Sekwencje VH i VK wstawiono w końcowych etapach do wektora ekspresji pdHL7. Łączenie przebiegało głównie w unikalnych miejscach Xhol i Hindlll w przypadku VH, i w unikalnych miejscach Xbal i Bg1ll/BamHI w przypadku VK (uikalne miejsce Bg1ll w wstawieniu VK i unikalne miejsce BamHI w wektorze mają kompatybilne nakładające się sekwencje). Otrzymana konstrukcja jest nazwana pdHL7-hybridoma chKS-1/4, która już zawiera elementy regulatorowe transkrypcji i sekwencje stałego regionu ludzkiej Ig w celu ekspresji chimerycznych przeciwciał (Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191).
Wektor ekspresji pdHL7 otrzymany był z pdHL2 [Gillies et al. (1991) Hybridoma 10:347-356] po następujących modyfikacjach: w wektorze ekspresji pdHL2 jednostki transkrypcyjne lekkiego łańcucha i ciężkiego łańcucha-cytokiny składały się z sekwencji wzmacniającej gen ciężkiego łańcucha immunoglobuliny i promotora metalotioneiny. W pdHL7 te dwie jednostki transkrypcyjne składały się z promotora sekwencji wzmacniającej CMV (ang. CMV enhancer-promoter) [Boshart et al. (1985) Cell 41:521-530]. DNA kodujący promotora sekwencji wzmacniającej CMV pochodził z fragmentu AfllllHindlll komercyjnie dostępnego pcDNAl (lnvitrogen Corp., San Diego, CA).
P r z y k ł a d 3. Badanie ekspresji mysiego przeciwciała KS-1/4
Przykład ten omawia badania ekspresji przeprowadzone przy użyciu plazmidu ekspresji przeciwciała kodującego sekwencje regionu V ujawnione w opisie patentowym US 4,975,369.
3A. Konstrukcja plazmidu
Aby bezpośrednio porównać chimeryczne przeciwciała, które kodowane są przez sekwencje Hybrydoma KS-1/4 oraz te sekwencje opisane w opisie patentowym US 4,975,369, zsyntetyzowano cDNA kodujący sekwencje VH opisane w opisie patentowym US 4,975,369. Następnie przyłączano go do wektora ekspresji pdHL7 już zawierającego VK z KS-1/4.
W celu skonstruowania sekwencji VH opisanej w opisie patentowym US 4,975,369 otrzymano na drodze całkowitej chemicznej syntezy fragment Ndel-Hindlll kodujący część sekwencji VH. Nakładające się oligonukleotydy były chemicznie syntezowane i łączone ze sobą. Połączone dupleksy były klonowane do wektora Xbal-Hindlll pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA).
Ten DNA koduje sekwencję białkową IQQPQNMRTM z opisu patentowego US 4,975,369. Bezpośrednio od strony 3' kodującej sekwencji znajduje się donorowe miejsce składania rozpoczynające się od gta. ctag znajdujące się od końca 5' górnego łańcucha jest sekwencją nakładającą się dla miejsca klonowania Xbal. Miejsce Xbal zostało stworzone tylko w celu klonowania do polilinkera z wektora pBluescript. Zaraz po nim znajduje się miejsce restrykcyjne Ndel (CATATG). agct na końcu 5' dolnego łańcucha jest sekwencją nakładającą się dla miejsca klonowania Hindlll. Ten lepki koniec Hindlll jest później łączony z miejscem Hindlll w stronie poprzedzającym gen Cy1 [Gillies et al. (1991) Hybrydoma 10:347-356).
Po weryfikacji sekwencji, fragment restrykcyjny Ndel-Hindlll był izolowany. Następnie był on, łącznie z fragmentem Xhol-Ndel kodującym N-terminalną połowę Vh, przyłączany do wektora ekspresji pdHL7 wytrawionego Xhol-Hindlll zawierającego VK z KS-1/4. Otrzymana konstrukcja, pdHL7-'369 chKS-1/4, zawierała VK i VH opisany w opisie patentowym US 4,975,369 (odnoszonego do chKS-1/4 z opisu patentowego US 4,975,369).
3B. Porównanie przeciwciał chKS-1/4 z hybrydoma do chKS-1/4 z opisu patentowego US
4,975,369
PL 205 352 B1
Plazmidowe DNA dla chKS-1/4 z pdHL7-hybrydoma i dla chKS-1/4 z pdHL7-'369 wprowadzono do równoległych komórek 293 ludzkiej nerki za pomocą koprecypitacji z fosforanem wapnia według procedury wspomnianej powyżej. Pięć dni po transfekcji kondycjonowane podłoże badano z zastosowaniem ELISA anty-huFc i kappa ELISA (patrz przykład 1 dla procedur ELISA) a wyniki są podsumowane w tabeli 1.
T a b e l a 1
Przeciwciało_huFc ELISA_Kappa ELISA
Hybrydoma chKS-1/4 254 ng/mL 200 ng/mL
US4,974,369 chKS-1/4 14 ng/mL 0 ng/mL
Wyniki wskazują, że chKS-1/4 z hybrydoma był wytwarzany i wydzielany normalnie, oraz że wydzielane przeciwciało składało się z grubsza równomolowych ilości ciężkich i lekkich łańcuchów, uwzględniając dokładność dwóch różnych metod ELISA. Z drugiej strony tylko niski poziom ciężkiego łańcucha został wykryty w kondycjonowanej pożywce w przypadku chKS-1/4 z US4,975,369, i nie stwierdzono łańcucha kappa związanego z tym przeciwciałem.
Analiza Western blot przeprowadzona była na całkowitych lizatach komórkowych i na kondycjonowanych pożywkach dla dwóch przejściowo transfekowanych linii komórkowych. Procedury analizy Western blot były takie, jak opisano w (Sambrook et al. (1989), supra). W celu przeanalizowania całkowitych lizatów komórkowych, transfekowane komórki poddawano lizie, wirowano w celu usunięcia szczątków, a lizat z ilości równoważnej 5x105 komórek nakładano na rowek. W celu przeanalizowania kondycjonowanej pożywki, produkt białkowy z około 300 μL kondycjonowanej pożywki w pierwszej kolejności oczyszczano stosując chromatografię Protein A Sepharose przed analizą SDS-PAGE w redukujących warunkach. Po przeniesieniu Western blot, przeprowadzono hybrydyzację stosując kozią IgG przeciwko ludzkiej połączoną z peroksydazą chrzanową, Fcy (Jackson Immuno Research), stosowaną w rozcieńczeniu 1:2000.
Przeniesienie Western blot wykazało, że w zastosowanych warunkach, ciężki łańcuch został wykryty w zarówno kondycjonowanej pożywce jak i w lizacie komórkowym w przypadku transfekcji przeprowadzonej z chKS-1/4 z pdHL7-hybrydoma. Wyniki te wskazują, że ciężki łańcuch przeciwciała chKS-1/4 był wytwarzany w komórkach i wydajnie wydzielany (łącznie z łańcuchem lekkim). Z drugiej strony, ciężki łańcuch w przypadku transfekcji przeprowadzonej z chKS-1/4 z pdHL7-'369 został wykryty tylko w lizacie komórkowym, a nie został wykryty w kondycjonowanej pożywce. Wynik ten wskazuje, że chociaż porównywalny poziom ciężkiego łańcucha powstawał we wnętrzu komórki, to jednak nie był on wydzielany. Odkrycie to jest zgodne z danymi z analizy ELISA, które pokazują, że nie było kappa lekkiego łańcucha związanego z małą ilością wydzielanego ciężkiego łańcucha w przypadku przeciwciała chKS-1/4 z US4,975,369. Jest zrozumiałe, że ciężkie łańcuchy immunoglobuliny typowo nie są normalnie wydzielane w przypadku braku lekkich łańcuchów immunoglobuliny [Hendershot et al. (1987) Immunology Today 8:111].
Oprócz powyższych faktów, komórki NS/0 były transfekowane równolegle z użyciem plazmidów pdHL7-Hybrydoma chKS-1/4 i pdHL7-US4,975,369 chKS-1/4. Stabilne klony były selekcjonowane w obecności 100 nM MTX, jak opisano w przykładzie l, a kondycjonowana pożywka z klonów opornych na MTX z płytek o 96 studzienkach była analizowana z zastosowaniem metody ELISA antyhuFc, jak opisano w przykładzie 1. Wyniki zostały podsumowane w tabeli 2.
Całkowita liczba
Przeciwciało analizowanych klonów
Hybrydoma chKS-1/4 80
US4,975,369 chKS-1/4 47
Wartość modalna*
0,1-0,5 μg/mL (41) 0-10 ng/mL (36)
Najwyższy poziom ekspresji*
10-50 μg/mL (4) 0,1 -0,4 μg/mL (4) (* Liczby w nawiasach oznaczają liczbę klonów dla wartości modalnej lub liczbę klonów wytwarzającą najwyższy poziom produktu, jak określono z zastosowaniem metody ELISA anty-Fc)
Przeprowadzając analizę na poziomie 96 studzienek, obserwowano, że większość klonów otrzymanych z konstrukcji pdHL7-hybrydoma chKS-1/4 wytwarzało około 100 ng/ml do 500 ng/mL przeciwciała, z najlepszymi klonami wytwarzającymi około 10-50 μg/mL. Z drugiej strony większość klonów otrzymanych z konstrukcji pdHL7-'369 chKS-1/4 wytwarzała około od 0 ng/mL do 10 ng/mL przeciwciała, z najlepszymi klonami wytwarzającymi około 300-400 ng/mL. W celu zbadania składu
PL 205 352 B1 i właściwości wiązania przeciwciała chKS-1/4 z US4,975,369 konieczne było wyhodowanie klonów, które produkowały przeciwciała na poziomie 300-400 ng/mL. Dwa z tych klonów zostały wybrane do namnożenia. Jednak ich poziomy ekspresji zostały uznane za bardzo niestabilne. W czasie kiedy hodowle wzrastały do 200 mL, poziomy ekspresji obu klonów spadły do około 20 ng/mL, jak zostało to wyznaczone metodą ELISA anty-Fc. Gdy ta sama pożywka była analizowana z zastosowaniem metody ELISA anty-kappa, nie stwierdzono żadnych lekkich łańcuchów kappa, jak to miało miejsce w przypadku przejściowej ekspresji u 293 komórek.
Następujący eksperyment wskazuje na to, że mierzalne ilości łańcucha lekkiego kappa były skojarzone z ciężkim łańcuchem chKS-1/4 z US4,975,369. W skrócie, 50 mL każdej z kondycjonowanych pożywek z każdego klonu było zatężano stosując chromatografię na Protein A. Eluat był analizowany metodą ELISA anty-Fc i ELISA naty-kappa. Jako kontrolę, zastosowano kondycjonowaną pożywkę z klonu wytwarzającego chKS-1/4 z hybrydoma, która była poddana tej samej procedurze i w tym samym czasie. Wyniki ELISA zostały podsumowane w tabeli 3.
T a b e l a 3
Przeciwciało_huFc ELISA_Kappa Elisa
Hybrydoma chKS-1/4 42 μg/mL 44 μg/mL
US4,975,369 chKS-1/4-klon 1 253 ng/mL 0 ng/mL
US4,975,369 chKS-1/4-klon 2 313 ng/mL 0 ng/mL
Rezultaty wskazują, że w rzeczywistości nie było mierzalnych kappa lekkich łańcuchów skojarzonych z ciężkim łańcuchem KS-1/4 z US4,975,369. Ponadto, wykazano, że przeciwciało chKS-1/4 z hybrydoma wiąże antygen KS na poziomie 10-20 ng/mL, podczas gdy przeciwciało z US 4,975,369 z obu klonów i przy zatężeniu do 253 i 313 ng/ml, nadal nie wiązało antygenu KS (patrz przykład 9 pomiar wiązania antygenu KS).
P r z y k ł a d 4. Ekspresja i charakterystyka odmian przeciwciał KS.
Oczekuje się, że mutacje, które znacząco obniżały ekspresję lub powinowactwo przeciwciała do cząsteczki docelowej będą mniej znaczące dla celów terapeutycznych w przypadku zastosowania u ludzi. Niektóre podejścia do redukowania immunogeniczności, takie jak „opłaszczanie, „humanizowanie i „deimmunizacja wymagają wprowadzenia substytucji wielu aminokwasów i mogą zaburzać wiązanie przeciwciała z antygenem (patrz na przykład opis patentowy US 5,639,641; i US 5,585,089; oraz publikacje PCT WO 98/52976; WO 00/34317). W praktyce istnieje zapotrzebowanie na sekwencję klasy przeciwciała, które będą wiązały się z cząsteczką adhezji komórkowej w nabłonku, ale które różnią się od oryginalnych mysich przeciwciał, rozpoznających ten antygen.
Różne kombinacje zmiennych regionów („V) ciężkiego i lekkiego łańcucha KS-1/4 badano na ich zdolność do ekspresji, i ich zdolność do wiązania się z EpCAM. Wyniki te są podsumowane w tabelach 4-6 i opisane poniżej.
T a b e l a 4. Sekwencje zmiennych regionów V ciężkiego i lekkiego łańcucha KS-1/4
Lekkie łańcuchy:
20 30 40 50 60
VK0 QILLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPAR
VK1 QIVLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYILWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPSR
VK6 EIVLTQSPATLSLSPGERVTLTCSASSSVSYMLWYQQKPGQAPKLLIFDTSNLASGIPAR
VK7 QILLLTQSPAIMSASPGRVTMTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPAR
VK8 EIVLTQSPATLSLSPGERVTLTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPAR
PL 205 352 B1
100
VK0
VK1
VK6
VK7
VK8
FSGSGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK
FSGSGSGTSYTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
FSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK
FSGSGSGTSYSLIISSMEPEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK
FSGSGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK
| (SEQ | ID | NO: | 1) |
| (SEQ | ID | NO: | 11 |
| (SEQ | ID | NO: | 7) |
| (SEQ | ID | NO: | 8) |
| (SEQ | ID | NO: | 9) |
Ciężkie łańcuchy:
40
20 30 40 50 lilii
VHO QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
VH1 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
VH2 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
VH2.5 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
VH6 QVQLVQSGAELKKPGESVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTY
VH7 QIQLVQSGAELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
VH369 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
80 90 100 110
II III
VHO ADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLRNE.DMATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQ id N0:2)
VH1 ADDFKGRFTITAETSASTLYLQLNNLRSE . DTATYFCVRFMSKGDYWGQGTSTTVSS (SEQ ID NO:1)
VH2 ADDFKGRFTITAETSASTLYLQLNNLRSE . DTATYFCVRFISKGDYWGQGTSTTVSS (SEQ id NO:22)
VH2.5 ADDFKGRFTITAETSASTLYLQLNNLRSE . DTATYFCVRFISKGDYWGTGTSTTVSS (SEQ ID NO: 19)
VH6 AQKFQGRVTISLDTSASTAYLQLSSLRAE . DTAVYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 17)
VH7 ADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLRSE.DTATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 18)
VH369 ADDFKGRFAFSLETSASTAFŁQIqqpqnmrtMATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQ id NO:35)
PL 205 352 B1
T a b e l a 5. Sekwencje odmian przeciwciała KS-1/4 i odmian CDR3 ciężkiego łańcucha z pojedynczymi insercjami aminokwasów.
VH2 sekwencja częściowa . . . ATYFCVRF I S K GDYWGQG. . . (reszty aminokwasów 92-109 z SEQ ID NO: 22)
| VH2.1: | . . . ATYFCVRF | IIS | K | GDYWGQG. . | . (SEQ | ID | NO: | 36) |
| VH2.2: | . . . ATYFCVRF | IVS | K | GDYWGQG. . | . (SEQ | ID | NO: | 37) |
| VH2.3: | . . . ATYFCVRF | I SAK | GDYWGQG. . | . (SEQ | ID | NO: | 38) | |
| VH2.4: | . . . ATYFCVRF | I S | KTGDYWGQG. . | . (SEQ | ID | NO: | 39) |
T a b e l a 6. Poziomy ekspresji i aktywność wiązania odmian przeciwciała KS-1/4.
| Konstrukcja | Ekspresja | Powinowactwo do EpCAM | ||
| Przejściowa (*) (w ng/mL) | Stabilna (*) (w gg/mL) | Względne wiązanie (**) | Kd (nM) | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Grupa 1 | ||||
| VK0/VH0 (Hybrydoma chKS-1/4) | 10-50 | 1x | 1,0 x 10-9 | |
| VK0/VH'369 ('369 chKS-1/4) | 0,1-0,4 (***) | >>30x | ||
| VK8/VH7 (Konstrukcja 3) | 10-50 | 1,0 x 10'9 | ||
| VK6/VH6 (Konstrukcja 1) | 300 | n.m. | ||
| VK7/VH7 (Konstrukcja 2) | 30 | |||
| VK8/VH7-IL2 | 10-50 | 1,0 x 10-9 | ||
| VK1/VH1-IL2 | 10-50 | 7,9 x 10-9 | ||
| VK1/VH2-IL2 | 10-50 | 3,1 x 10-9 | ||
| Grupa 2 | ||||
| VK8/VH7 (Konstrukcja 3;kontroia) | 1500 | 1x | ||
| VK0/VH1 | 1500 | 8x | ||
| VK1/VH7 | 1500 | 1x | ||
| VK1/VH1 | 1500 | 2x | ||
| VK1/VH2 | 1500 | 1x-2x | ||
| VK1/VH1-IL2 | 1500 | 5x | ||
| VK1/VH2-IL2 | 1500 | 1,5x | ||
| VK1/VH2.5-IL2 | 1500 | 3x-4x | ||
| Grupa 3 | ||||
| VK8/VH7-IL2 (kontrola) | 760 | 1x | ||
| VK1/VH1-IL2 | 350 | 2x |
PL 205 352 B1 cd. tabeli 6
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| VK1/VH2.1-IL2 | 290 | >10x | ||
| VK1/VH2.2-IL2 | 270 | >10x | ||
| VK1/VH2.3-IL2 | 190 | 7x | ||
| VK1/VH2.4-IL2 | 210 | 3x |
(*) Rutynowo osiągnięte poziomy.
(**) „Względne wiązanie jest wyrażone jako krotność przyrostu stężenia białka wymaganego do osiągnięcia równoważnego poziomu wiązania. Stąd większe liczby odzwierciedlają niższe powinowactwo do EpCAM.
(***) Nie wykryto lekkich łańcuchów kappa z zastosowaniem metody ELISA (równoważnych do tła); dlatego funkcjonalne przeciwciał a nie ulegał y ekspresji.
(****) n.m = niemierzalne
W Grupie 2 i Grupie 3, względna aktywność wiązania każ dego białka była normalizowana na próbę kontrolną przedstawioną w pierwszej linijce danej grupy. Metoda ELISA w pierwszej kolejności odzwierciedla wartości „off-rates, oparte o ilość białka związanego po kilku kolejkach płukania. Jest ona stosowana jako szybki test przesiewowy w celu wyeliminowania jednostek słabo wiążących, ale nie jest precyzyjną metodą do pomiaru powinowactwa. W Grupie 3, odmiany VH2: VH2.1-VH2.4 były porównane z VH1 w celu określenia czy insercje aminokwasów mogą skutkować polepszeniem się względnego wiązania.
Sekwencje te są powiązane w następujący sposób. Jak opisano w przykładach, sekwencje VH0 i VK0 pochodzą z amplifikacji PCR z linii komórkowej hybrydoma, która wytwarza oryginalne pochodzące od myszy KS-1/4 (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2). VH'369 jest sekwencją VH ujawnioną w opisie patentowym US 4,975,369. Sekwencje VH1, VH2, VH2.1-2.4, VK1 i VK2 otrzymano albo stosując technologię deimmunizacji, w której potencjalne epitopy limfocytu T są wyeliminowane lub osłabiane poprzez wprowadzenie mutacji, które zmniejszają wiązanie się epitopu peptydu z cząsteczką MHC klasy II, lub zmieniając epitopy limfocytów T nie pochodzące od ludzi w taki sposób, aby odpowiadały ludzkim swojskim epitopom, które są obecne w ludzkich przeciwciałach. Projektowanie tych struktur jest dalej opisane i przeanalizowane poniżej. Konstrukcje z tabeli 6 były wygenerowane poprzez transfekowanie komórek ssaków kombinacjami kwasów nukleotydowych, które wytwarzały odpowiednie regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha V. Sekwencje VH6, VH7, VK6, VK7 i VK8 zostały otrzymane poprzez zmianę reszt powierzchniowych z KS-1/4 z hybrydoma na fragmenty pochodzące od ludzi jak opisano poniżej, w celu usunięcia potencjalnych ludzkich epitopów limfocytu B. Konstrukcje od 1 przez 3 powstały poprzez transfekowanie komórek ssaków kombinacjami kwasów nukleinowych, które wytwarzały regiony VH6, VH7, VK6, VK7 i VK8 ciężkiego i lekkiego łańcucha V jak opisano w tabeli 4 i poniżej.
4A. Charakterystyka przeciwciał KS z mniejszą ilością ludzkich epitopów limfocytów T
Sekwencje VH2.1-VH2.5 zostały stworzone w celu zbadania czy pewne insercje i substytucje aminokwasów w regionie CDR3 ciężkiego łańcucha KS-1/4 mogłyby być tolerowane. Wektory ekspresji dla kombinacji lekkiego i ciężkiego łańcucha VK0/VH1, VK1/VH7, VK1/VH1, VK1/VH2, VK1/VH1-IL2, VK1/VH2-IL2 i VK1/VH2.5-IL2 zostały skonstruowane, a odpowiednie przeciwciała i białka fuzyjne przeciwciało-IL2 wyprodukowane i zbadane metodami opisanymi w poprzednich przykładach.
Szczególnie, sekwencje VH1, VH2, VK1 i VK2 zostały otrzymane na drodze całkowitej syntezy chemicznej. Dla każdej z tych sekwencji serie nakładających się nukleotydów, które pokrywają całe kodujące i komplementarne łańcuchy tych regionów, były chemicznie syntetyzowane, fosforylowane i łączone. Połączone cząsteczki dupleksowe były następnie amplifikowane stosując PCR z właściwymi primerami na końcach fragmentów, wprowadzane do wektora pCRII (lnvitrogen, Carlsbad, CA), a sekwencje weryfikowane. Te fragmenty DNA były następnie wprowadzane do wektora ekspresji pdHL7 we właściwych miejscach w celu stworzenia odpowiednio całkowitego ciężkiego łańcucha („H) i lekkiego łańcucha („L).
Sekwencja VH2.5 była otrzymana z VH2 poprzez modyfikację pojedynczego kodonu w celu otrzymania Thr zamiast Gln w pozycji 108 (tabela 4), stosując standardowe techniki biologii molekularnej.
Przeciwciała te były badane metodą ELISA (tabela 6) oraz z zastosowaniem rezonansu powierzchni plazmonowej (aparat i oprogramowanie Biacore) w celu porównania ich zdolności wiązania się z EpCAM. Uważa się wyniki eksperymentów ELISA jako odzwierciedlające w pierwszej kolejności wartości „off-rate, a nie „on-rate, ale ogólnie będące mniej precyzyjne, tak, że słabe wyniki ELISA
PL 205 352 B1 były ogólnie stosowane w celu wykluczenia pewnych konstrukcji z dalszych etapów. Jednakże przeciwciała, które wykazały dobre wiązanie w teście ELISA muszą być badane dalej.
Wyniki rezonansu powierzchni plazmonowej są następujące:
| Białko fuzyjne | Kon (M-1 s-1) | Koff (s-1) | KD (M) |
| VK8/VH7-IL2 | 3,1 x 105 | 3,2 x 10-4 | 1,0 x 10-9 |
| VK1/VH2-IL2 | 1,7 x 105 | 5,3 x 10-4 | 3,1 x 10-9 |
| VK1/VH1-IL2 | 2,8 x 105 | 2,2 x 10-3 | 7,9 x 10-9 |
Ponieważ wartości „off-rate w przypadku VK1/VH1-IL2 były o wiele szybsze niż w przypadku VK1/VH2-IL2 lub VK8/VH7-IL2, wywnioskowano, że VK1/VH1-IL2 jest mniej przydatnym białkiem.
Biorąc pod uwagę, że VK1/VH1-IL2 i VK1/VH2-IL2 różnią się tylko obecnością metioniny/izoleucyny w VH w pozycji 100 w CDR3, lepsze wartości „off-rate w przypadku VK1/VH1-IL2 w porównaniu z VK1/VH2-IL2 sugerują, że pozycja ta powoduje hydrofobowy kontakt z EpCAM, i że nieznacznie dłuższy boczny łańcuch metioniny powoduje mniej wydajny kontakt. Ze względu na oddziaływania białko-białko uważa się, że hydrofobowe oddziaływania odgrywają ważną rolę w określaniu wartości „off-rate, ale już znacznie mniej znaczącą rolę w określaniu wartości „on-rate.
4B Charakterystyka odmian KS-1/4 z pojedynczymi insercjami aminokwasów
Znaczenie sekwencji CDR3 w regionie V ciężkiego łańcucha dla powinowactwa przeciwciała KS do EpCAM było określone poprzez serię odmian, które zawierały insercje lub substytucje aminokwasów w tym regionie. Sekwencje VH2.1, VH2.2, VH2.3 i VH2.4 zostały wytworzone poprzez manipulacje wektorem ekspresji kodującym VH2 i VK1 stosując standardowe techniki rekombinacji DNA. Otrzymane wektory ekspresji były transfekowane do komórek NS/0, a wydzielane białka przeciwciał oczyszczane jak opisano w poprzednich przykładach.
Odkryto, że odmiany VH1 były podoptymalne w porównaniu do odmian VH2, co wskazuje, że izoleucyna w CDR3 nie może być podstawiona metionina. Kolejnym celem było sprawdzenie, czy insercja aminokwasu w CDR3 może prowadzić do regionu V ciężkiego łańcucha KS-1/4 o lepszej charakterystyce wiązania niż VH1. Dane w tabeli 6 porównują wiązanie VK1/VH2.1, VK1/VH2.2, VK1/VH2.3 i VK1/VH2.4 z VK1/VH1. Odkryto, że właściwie żadna z konstrukcji z insercją aminokwasu w CDR3 VH KS-1/4 nie wykazuje polepszonego wiązania antygenu w porównaniu z VH1, a raczej aktywność wiązania antygenu mutantów z insercją była albo w jakiś sposób zwiększona lub gruntownie obniżona.
Wyniki te wskazują, że insercja aminokwasu w CDR3 ogólnie jest szkodliwa dla aktywności wiązania antygenu w przypadku regionów V ciężkiego łańcucha KS-1/4. Podczas analizy tych danych pojawiły się pewne ogólne wnioski. Szczególnie, że segment aminokwasów z VH KS-1/4 w pozycjach od 84-108, który składał się z aminokwasów Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg-Phe-lle-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr-Trp-Gly-GIn, jest znaczący dla wiązania antygenu przez KS-1/4. Segment ten obejmuje segment szkieletowy: Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg, który jest ogólnie tolerancyjny dla pojedynczych i wielokrotnych substytucji aminokwasów, ale nie jest tolerancyjny dla inercji aminokwasów, które mogą mieć szkodliwy efekt na ekspresję i proces ukształtowania się białka. Ponadto wyniki te sugerują, że korzystnym jest, aby aminokwasy w pozycjach 86, 91, 93, 94 i 95 były aminokwasami hydrofobowymi w przeciwciele, które jest wydajnie wytwarzane i wiąże się z EpCAM.
Insercja aminokwasu w CDR3 segmencie VH, składającego się z Phe-lle-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr, jest ogólnie niekorzystna dla funkcji EpCAM wiązania antygenu przez przeciwciało KS-1/4, choć niektóre insercje mogą być tolerowane jedynie z częściową utratą aktywności. Podobnie substytucja tych pozycji jest także ogólnie niekorzystna dla wiązania antygenu EpCAM, choć pewne insercje mogą być tolerowane jedynie z częściową utratą aktywności.
4C. Konstrukcja aktywnych pochodnych przeciwciał KS-1/4 z mysimi resztami powierzchniowymi zmienionymi na ich ludzkie odpowiedniki
Przeciwciała zostały przygotowane poprzez substytucję aminokwasów w obrębie przeciwciała KS-1/4 przez aminokwasy powszechnie znajdujące się w ludzkich przeciwciałach w celu zmniejszenia immunogeniczności regionów V pochodzących od myszy. Korzystne pochodne KS także zachowują specyficzne powinowactwo do wiązania ludzkiej EpCAM.
Konstrukcja 1. Odkryto, że lekki łańcuch KS-1/4 jest bardziej podobny do ludzkiej jednolitej podgrupy III, a ciężki łańcuch jest bardziej podobny do podgrupy I. W oparciu o te podobieństwa stwoPL 205 352 B1 rzono teoretyczną sekwencję składającą się z jednolitej podgrupy aminokwasów i pochodzących z KS-1/4 regionów CDR i niejednolitych aminokwasów. Dla tej i następnych konstrukcji utworzono trójwymiarowy model stosując Silicon Garphics Workstation i oprogramowanie do modelowania molekularnego BioSym.
Przeglądanie trójwymiarowego modelu ujawniło, że pewne aminokwasy pochodzące od człowieka były zbliżone do CDR i mogły wpływać na ich konformację. W oparciu o tę analizę, w lekkim łańcuchu zmieniono ludzką Ser22, Arg44 i Phe66 z powrotem odpowiednio na Thr, Lys i Tyr. Uważano, że w przypadku ciężkiego łańcucha takie zmiany nie są konieczne. W końcowym projekcie Konstrukcji 1, lekki łańcuch posiadał 18 ludzkich aminokwasów nie występujących w mysim lekkim łańcuchu, a ciężki łańcuch posiadał 22 ludzkie aminokwasy nie występujące w mysim ciężkim łańcuchu. DNA dla ekspresji Konstrukcji 1 został utworzony stosując syntetyczne oligonukleotydy. Białko Konstrukcji 1 było wydajnie wytwarzane, ale odkryto, że jest ponad 10-krotnie mniej aktywne w metodzie wiązania EpCAM.
Konstrukcja 2. Podjęto mniej agresywne podejście zostało przedsięwzięte, za pomocą którego tylko następujące zmiany zostały wprowadzone:
Lekki łańcuch: K18R, A79P
Ciężki łańcuch: P9A, L11V, A76T, N88S, M91T
DNA do ekspresji konstrukcji 2 zostało stworzone stosując syntetyczne oligonukleotydy oraz standardowe techniki rekombinacji DNA. Białko konstrukcji 2 nie było efektywnie wytwarzane. Później odkryto, że połączenie lekkiego łańcucha z konstrukcji 2 i ciężkiego łańcucha z mysiego KS-1/4 nie było wydajnie wytwarzane, podczas gdy połączenie ciężkiego łańcucha z konstrukcji 2 i lekkiego łańcucha z KS-1/4 było wydajnie wytwarzane. Zatem problem defektu ekspresji wydaje się leżeć w lekkim łańcuchu Konstrukcji 2.
Konstrukcja 3. W oparciu o widoczny defekt w ekspresji w przypadku lekkiego łańcucha Konstrukcji 2, został stworzony nowy lekki łańcuch poprzez złączenie N-terminalnego fragmentu lekkiego łańcucha konstrukcji 1 z C-terminalnym fragmentem mysiego lekkiego łańcucha. Zastosowano miejsce Kpnl, które koduje aminokwasy w pozycjach 35 i 36. Gdy ten lekki łańcuch został połączony z ciężkim łańcuchem konstrukcji 2, zaobserwowano wydajną ekspresję oraz nie zaobserwowano żadnego znaczącego spadku wiązania.
Ponieważ konstrukcja 3 skutkowała przeciwciałem o doskonałych właściwościach w znaczeniu ekspresji białka i powinowactwa do antygenu w porównaniu z konstrukcją 1 czy 2, wstawiono sekwencję DNA konstrukcji 3 do pdHL7s-IL2, co prowadziło do pdHL7s-VK8/VH7-IL2, który jest ujawniony jako SEQ ID NO: 40. Do celów ekspresji plazmid ten poddano elektroporacji do mysich komórek mięsaka NS/0 w celu wyprodukowania stabilnie transfekowanej linii komórkowej jak opisano w przykładzie 1A. Pożywka wzięta ze stabilnych klonów była następnie analizowana pod kątem ekspresji metodą ELISA z opłaszczonymi ludzkimi Fc, jak opisano w przykładzie 1B.
Sekwencje aminokwasów ciężkiego i lekkiego łańcucha dla tego przeciwciała białka fuzyjnego są przedstawione odpowiednio w SEQ ID NO: 41 i SEQ ID NO: 42.
Ponadto wiązanie znakowanych jodem VK8/VH7 i VK8/VH7-IL2 z EpCAM ulegającą ekspresji na powierzchni komórek nowotworowych PC-3 było porównane z wiązaniem znakowanego jodem VK0/VH0-IL2, stosując sposoby opisane w przykładzie 1F. W granicach błędu doświadczalnego, zasadniczo identyczne powinowactwa wiązania zostały odkryte dla VK8/VH7 i VK0/VH0, i dla VK8/VH7-IL2 i VK0V/H0-IL2.
4D. Użyteczność zależności pomiędzy strukturą a funkcją w konstruowaniu aktywnych przeciwciał KS-1/4
Podsumowując, aktywności wiązania antygenu dla przeciwciał KS-1/4 i białek fuzyjnych z ujawnionymi sekwencjami regionu V dostarczają wskazówki w projektowaniu sekwencji przeciwciał KS-1/4 dla EpCAM, jak również dla właściwej ekspresji i sekrecji przeciwciał KS-1/4. Zwłaszcza regiony V ciężkiego i lekkiego łańcucha KS-1/4 mogą tolerować substytucje wielu aminokwasów i pozostawać aktywne, pod warunkiem że te substytucje aminokwasowe leżą na zewnątrz CDR. Regiony V lekkiego i ciężkiego łańcucha KS-1/4 generalnie nie tolerują insercji aminokwasów, szczególnie w obrębie CDR lub w regionach szkieletowych pomiędzy CDR.
Na przykład jeśli sekwencja KS-1/4 z hybrydoma zostanie wzięta jako startowa sekwencja „dzikiego typu, dane wskazują, że region V ciężkiego łańcucha może tolerować substytucje aminokwasów w pozycjach 9, 11, 16, 17, 38, 40, 69, 70, 71, 72, 76, 79, 80, 83, 88, 91 i 111 z mniejszą lub bez utraty aktywności. Podobnie lekki łańcuch może tolerować substytucje w pozycjach 1,3, 10, 11, 12,
PL 205 352 B1
13, 17, 18, 19, 21, 25, 41, 42, 59, 71, 73, 75, 77 i 103 z mniejszą lub bez utraty aktywności. Zmiany te znajdują się na zewnątrz CDR w regionach V ciężkiego i lekkiego łańcucha KS-1/4. Siedemnaście całkiem akceptowanych substytucji aminokwasów w ciężkim łańcuchu przedstawia około 21% pozycji aminokwasów poza CDR, i około 68% pozycji aminokwasów poza CDR, dla których przeprowadzono próby substytucji. Podobnie, osiemnaście całkiem akceptowanych substytucji aminokwasów w lekkim łańcuchu przedstawia około 23% pozycji aminokwasów poza CDR, i około 72% pozycji aminokwasów poza CDR, dla których przeprowadzono próby substytucji. Istnieją tylko dwa przykłady substytucji aminokwasów poza CDR, które skutkowały znacząco mniej użytecznym białkiem: substytucja Ala79Pro w lekkim łańcuchu, która miała negatywny wpływ na ekspresję oraz substytucja Q108T w ciężkim łańcuchu, która miała negatywny wpływ na wiązanie antygenu. Zatem substytucje aminokwasów mogą być wprowadzone do sekwencji ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała KS-1/4 poza CDR i istnieje wysokie prawdopodobieństwo, że ta substytucja będzie skutkować aktywnym białkiem.
Mutacje wykorzystujące substytucję aminokwasu w CDR często mają negatywny wpływ na wiązanie antygenu. Na przykład substytucja I100M w ciężkim łańcuchu około 8-krotnie obniża wiązanie. Mutacje, które wykorzystują insercje aminokwasu ogólnie mają negatywny wpływ na użyteczność sekwencji KS-1/4. Na przykład region V ciężkiego łańcucha VH-'369 ma uniemożliwiony proces formowania do właściwego przeciwciała z lekkim łańcuchem, jak to zostało opisane. Mutacje od VH2.1 do 2.4 posiadają insercje aminokwasu w CDR3 regionu V ciężkiego łańcucha, a każda z tych mutacji ma negatywny wpływ na wiązanie antygenu.
P r z y k ł a d 5. Immunogeniczność białka fuzyjnego: przeciwciało KS (Konstrukcja 3)-IL2 u ludzi
W próbie klinicznej z udziałem ludzi, dwudziestu dwóch pacjentów otrzymało jeden lub większą liczbę cykli leczniczych, przy czym każdy cykl obejmował 4-godzinne wlewy dożylne przeciwciała KS (konstrukcja 3)-IL2 przez 3 kolejne dni. Każdy cykl leczenia był rozdzielony miesięczną przerwą (Weber et al. (2001) Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 20:259a). Próbki surowicy były pobierane od każdego pacjenta przed i po każdym cyklu leczenia i badane na reaktywność przeciwciała przeciwko całej cząsteczce przeciwciała KS (konstrukcja 1)-IL2 lub składnika Fc-IL2 (bez regionu Fv). Nie zaobserwowano reaktywności w żadnej z próbek surowicy przed uczuleniem. Wyniki wskazują, że tylko 4 pacjentów doświadczyło jakiejś znaczącej odpowiedzi immunologicznej przeciwko albo samemu regionowi Fv, lub zarówno regionom Fv jak i składnikowi Fc-IL2. Ponadto nie wydaje się, żeby te odpowiedzi były wywołane po kolejnych kontaktach z huKS-IL2.
Uważa się, że zastosowanie białka fuzyjnego przeciwciało-IL2 stanowi bezpośredni test immunogeniczności regionu V, ponieważ jednostka interleukiny-2 posiada efekt adiuwantu. Odpowiednio wyniki wskazują, że KS Przeciwciało (konstrukcja 3) może być podawany ludziom, przy czym tylko w nielicznej grupie osób otrzymujących lek znacząco rozwija się odpowiedź swoista przeciwko białku fuzyjnemu KS przeciwciało (Konstrukcja 3)-IL2. Wyniki te są szczególnie zadowalające przy uwzględnieniu, że KS przeciwciało (Konstrukcja 3) zawiera zmienny region, który jest prawie w całości pochodzenia mysiego, ale tylko z kilkoma resztami aminokwasów zastąpionych odpowiednimi resztami ludzkich aminokwasów.
Claims (1)
- Zastrzeżenie patentoweRekombinowane białko fuzyjne przeciwko EpCAM typu przeciwciało-IL2, znamienne tym, że ma sekwencję ciężkiego łańcucha SEQ ID NO: 41 oraz sekwencję lekkiego łańcucha SEQ ID NO: 42.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28856401P | 2001-05-03 | 2001-05-03 | |
| PCT/US2002/013844 WO2002090566A2 (en) | 2001-05-03 | 2002-05-03 | Recombinant tumor specific antibody and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL367831A1 PL367831A1 (pl) | 2005-03-07 |
| PL205352B1 true PL205352B1 (pl) | 2010-04-30 |
Family
ID=23107653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL367831A PL205352B1 (pl) | 2001-05-03 | 2002-05-03 | Rekombinowane przeciwciało specyficzne dla nowotworu |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6969517B2 (pl) |
| EP (1) | EP1383785B1 (pl) |
| JP (2) | JP4309662B2 (pl) |
| KR (1) | KR100900166B1 (pl) |
| CN (1) | CN100503639C (pl) |
| AT (1) | ATE502053T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002308562B2 (pl) |
| BR (1) | BR0209177A (pl) |
| CA (1) | CA2446087C (pl) |
| DE (1) | DE60239454D1 (pl) |
| DK (1) | DK1383785T3 (pl) |
| ES (1) | ES2361664T3 (pl) |
| HU (1) | HUP0400284A3 (pl) |
| MX (1) | MXPA03009924A (pl) |
| PL (1) | PL205352B1 (pl) |
| PT (1) | PT1383785E (pl) |
| RU (1) | RU2306320C9 (pl) |
| WO (1) | WO2002090566A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA200309380B (pl) |
Families Citing this family (86)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT1037927E (pt) * | 1997-12-08 | 2004-10-29 | Emd Lexigen Res Ct Corp | Proteinas de fusao heterodimericas uteis para imunoterapia de abordagem selectiva e estimulacao imunologica geral |
| US20030105294A1 (en) * | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
| CN1318092C (zh) * | 1998-04-15 | 2007-05-30 | 利思进药品公司 | 含有抗体－细胞因子融合蛋白和血管生成抑制剂的免疫治疗用组合物 |
| PL352332A1 (en) * | 1999-05-19 | 2003-08-11 | Lexigen Pharm Corp | Expression and export of interferon-alpha proteins as fc fusion proteins |
| US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| JP4793971B2 (ja) * | 1999-08-09 | 2011-10-12 | メルク パテント ゲーエムベーハー | 複合サイトカイン−抗体複合体 |
| AU2154401A (en) | 1999-11-12 | 2001-05-30 | Merck Patent Gmbh | Erythropoietin forms with improved properties |
| US20050202538A1 (en) * | 1999-11-12 | 2005-09-15 | Merck Patent Gmbh | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
| CA2399832C (en) | 2000-02-11 | 2011-09-20 | Stephen D. Gillies | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| US7517526B2 (en) | 2000-06-29 | 2009-04-14 | Merck Patent Gmbh | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents |
| CA2440221C (en) | 2001-03-07 | 2013-02-05 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety |
| WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| PL205352B1 (pl) | 2001-05-03 | 2010-04-30 | Merck Patent Gmbh | Rekombinowane przeciwciało specyficzne dla nowotworu |
| US8986944B2 (en) | 2001-10-11 | 2015-03-24 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples |
| US8980568B2 (en) | 2001-10-11 | 2015-03-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample |
| DK1454138T3 (da) * | 2001-12-04 | 2012-02-13 | Merck Patent Gmbh | Immunocytokiner med moduleret selektivitet |
| US20100311954A1 (en) * | 2002-03-01 | 2010-12-09 | Xencor, Inc. | Optimized Proteins that Target Ep-CAM |
| AT502293B1 (de) * | 2002-05-15 | 2008-03-15 | Igeneon Krebs Immuntherapie | Immunogener, monoklonaler antikörper |
| PL211180B1 (pl) | 2002-12-17 | 2012-04-30 | Merck Patent Gmbh | Białko fuzyjne typu przeciwciało-IL2, wektor zawierający sekwencję kwasów nukleinowych kodujących takie białko, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie białko fuzyjne oraz jego zastosowania do wytwarzania leków |
| MXPA05010773A (es) | 2003-04-09 | 2005-12-12 | Neose Technologies Inc | Metodos de glicopegilacion y proteinas/peptidos producidos por los metodos. |
| PT2382990E (pt) | 2003-04-30 | 2014-12-29 | Univ Zuerich | Método para tratamento do cancro usando uma imunotoxina |
| AT500651B9 (de) * | 2003-05-27 | 2010-04-15 | Altropus Gmbh | Aktiv immunisierender antikörper |
| WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
| US20050069521A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins |
| US7297336B2 (en) * | 2003-09-12 | 2007-11-20 | Baxter International Inc. | Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| EP1699822B1 (en) | 2003-12-30 | 2008-04-23 | MERCK PATENT GmbH | Il-7 fusion proteins with antibody portions, their preparation and their use |
| DK1699821T3 (da) * | 2003-12-31 | 2012-07-16 | Merck Patent Gmbh | Fc-ERYTHROPOIETIN-FUSIONSPROTEIN MED FORBEDREDE FARMAKOKINETIKKER |
| AU2005203962C1 (en) | 2004-01-05 | 2012-11-08 | Antisoma Research Limited | Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin |
| WO2005070967A2 (en) | 2004-01-22 | 2005-08-04 | Merck Patent Gmbh | Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation |
| US20050180979A1 (en) * | 2004-02-13 | 2005-08-18 | Micromet Ag | Anti-EpCAM immunoglobulins |
| US7670595B2 (en) | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
| US20080300173A1 (en) | 2004-07-13 | 2008-12-04 | Defrees Shawn | Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1] |
| US20080176790A1 (en) | 2004-10-29 | 2008-07-24 | Defrees Shawn | Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf) |
| DE602005020837D1 (de) | 2004-12-09 | 2010-06-02 | Merck Patent Gmbh | Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität |
| US9029331B2 (en) | 2005-01-10 | 2015-05-12 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| EP1871795A4 (en) | 2005-04-08 | 2010-03-31 | Biogenerix Ag | COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE |
| WO2007008943A2 (en) | 2005-07-08 | 2007-01-18 | Xencor, Inc. | Optimized anti-ep-cam antibodies |
| US20070105755A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| US20070104689A1 (en) | 2005-09-27 | 2007-05-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens |
| WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
| WO2007063825A1 (ja) | 2005-11-29 | 2007-06-07 | Japan Science And Technology Agency | Cd166に対するモノクローナル抗体およびその産生方法 |
| WO2007068488A1 (en) * | 2005-12-15 | 2007-06-21 | Micromet Ag | Domain-grafted antibodies |
| EP1966244B1 (en) * | 2005-12-30 | 2012-03-21 | Merck Patent GmbH | Anti-il-6 antibodies preventing the binding of il-6 complexed with il-6ralpha to gp130 |
| CA2635623C (en) | 2005-12-30 | 2015-02-17 | Michael Super | Anti-cd19 antibodies with reduced immunogenicity |
| ES2384055T3 (es) * | 2005-12-30 | 2012-06-28 | Merck Patent Gmbh | Variantes de la interleucina-12p40 con estabilidad mejorada |
| AR060070A1 (es) | 2006-03-24 | 2008-05-21 | Merck Patent Gmbh | Dominios proteicos heterodimericos obtenidos por ingenieria |
| WO2008003473A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses |
| CA2657621A1 (en) | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting rare cells from a biological sample |
| US20080248959A1 (en) | 2006-07-21 | 2008-10-09 | Neose Technologies, Inc. | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
| WO2008057683A2 (en) | 2006-10-03 | 2008-05-15 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates |
| AU2008237411B2 (en) | 2007-04-03 | 2013-10-03 | Ratiopharm Gmbh | Methods of treatment using glycopegylated G-CSF |
| MX2009013259A (es) | 2007-06-12 | 2010-01-25 | Novo Nordisk As | Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos. |
| EP2626079A3 (en) | 2008-02-27 | 2014-03-05 | Novo Nordisk A/S | Conjungated factor VIII molecules |
| EP2283032A1 (en) * | 2008-04-25 | 2011-02-16 | Merck Patent GmbH | Artificial protein scaffolds |
| EA201171259A1 (ru) | 2009-04-22 | 2012-05-30 | Мерк Патент Гмбх | Антительные гибридные белки с модифицированными сайтами связывания fcrn |
| GB0909904D0 (en) * | 2009-06-09 | 2009-07-22 | Affitech As | Product |
| WO2011032296A1 (en) | 2009-09-21 | 2011-03-24 | Mount Sinai Hospital | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of thyroid cancer |
| SG185100A1 (en) | 2010-05-04 | 2012-11-29 | Paul Walfish | Method for the diagnosis of epithelial cancers by the detection of epicd polypeptide |
| CN102174465A (zh) * | 2011-01-12 | 2011-09-07 | 武汉格蓝丽富科技有限公司 | 一种从组织中分离富集靶细胞的方法 |
| CA2830349C (en) | 2011-03-17 | 2019-07-16 | The University Of Birmingham | Re-directed immunotherapy |
| WO2012158818A2 (en) * | 2011-05-16 | 2012-11-22 | Fabion Pharmaceuticals, Inc. | Multi-specific fab fusion proteins and methods of use |
| CN103998932B (zh) * | 2011-06-29 | 2017-06-06 | 中央研究院 | 使用表面涂层对生物物质的捕获、纯化和释放 |
| MX2014002289A (es) | 2011-08-26 | 2015-03-20 | Merrimack Pharmaceuticals Inc | Anticuerpos fc especificos en tandem. |
| JP6163502B2 (ja) * | 2012-03-02 | 2017-07-12 | アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ | 抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）抗体及びその使用方法 |
| US9494500B2 (en) | 2012-10-29 | 2016-11-15 | Academia Sinica | Collection and concentration system for biologic substance of interest and use thereof |
| TW201444872A (zh) | 2013-03-06 | 2014-12-01 | Merrimack Pharmaceuticals Inc | 抗Ｃ－ＭＥＴ串聯Ｆｃ雙特異性抗體 |
| MX2016004239A (es) * | 2013-10-02 | 2016-11-14 | Viventia Bio Inc | Anticuerpos anti-epcam y métodos de uso. |
| GB201403775D0 (en) | 2014-03-04 | 2014-04-16 | Kymab Ltd | Antibodies, uses & methods |
| EP3126814B1 (en) | 2014-04-01 | 2019-06-12 | Academia Sinica | Methods and systems for cancer diagnosis and prognosis |
| CN105381824B (zh) | 2014-08-26 | 2019-04-23 | 中央研究院 | 收集器架构布局设计 |
| JP6824183B2 (ja) | 2015-03-12 | 2021-02-03 | セセン バイオ，インコーポレイテッド | Ｅｐｃａｍ陽性膀胱癌の処置方法 |
| WO2016145354A1 (en) | 2015-03-12 | 2016-09-15 | Viventia Bio Inc. | Dosing strategies for targeting epcam positive bladder cancer |
| US10676723B2 (en) | 2015-05-11 | 2020-06-09 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US10107726B2 (en) | 2016-03-16 | 2018-10-23 | Cellmax, Ltd. | Collection of suspended cells using a transferable membrane |
| US9567399B1 (en) | 2016-06-20 | 2017-02-14 | Kymab Limited | Antibodies and immunocytokines |
| NZ789594A (en) | 2016-06-20 | 2025-07-25 | Kymab Ltd | Anti-PD-L1 antibodies |
| WO2018083248A1 (en) | 2016-11-03 | 2018-05-11 | Kymab Limited | Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| JP2020520665A (ja) | 2017-05-24 | 2020-07-16 | ノバルティス アーゲー | 抗体−サイトカイングラフト化タンパク質及び癌の治療における使用方法 |
| CA3064435A1 (en) * | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Pandion Therapeutics, Inc. | Targeted immunotolerance |
| CN108503714A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-09-07 | 浙江科途医学科技有限公司 | 一种人白介素2和抗人上皮细胞黏附分子单链抗体融合蛋白及其应用 |
| WO2020048525A1 (en) | 2018-09-07 | 2020-03-12 | Generon (Shanghai) Corporation Ltd. | Bispecific antigen binding proteins and uses thereof |
| KR20210105890A (ko) | 2018-12-17 | 2021-08-27 | 레비토프 리미티드 | 트윈 면역 세포 인게이저 |
| WO2020209645A1 (ko) | 2019-04-11 | 2020-10-15 | (재) 스크립스코리아항체연구원 | 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도 |
Family Cites Families (231)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US73627A (en) * | 1868-01-21 | Improved paint-compound | ||
| US348237A (en) * | 1886-08-31 | richards | ||
| US4196265A (en) | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
| US4522811A (en) | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
| US4469797A (en) | 1982-09-23 | 1984-09-04 | Miles Laboratories, Inc. | Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives |
| US4737462A (en) | 1982-10-19 | 1988-04-12 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β |
| US4966843A (en) | 1982-11-01 | 1990-10-30 | Cetus Corporation | Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US4703008A (en) | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| NZ210501A (en) | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| KR850004274A (ko) | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
| US5082658A (en) | 1984-01-16 | 1992-01-21 | Genentech, Inc. | Gamma interferon-interleukin-2 synergism |
| EP0158198A1 (en) | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| US5807715A (en) | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
| GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
| US4667016A (en) | 1985-06-20 | 1987-05-19 | Kirin-Amgen, Inc. | Erythropoietin purification |
| US4690915A (en) | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
| US5679543A (en) | 1985-08-29 | 1997-10-21 | Genencor International, Inc. | DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi |
| US5643565A (en) | 1985-09-20 | 1997-07-01 | Chiron Corporation | Human IL-2 as a vaccine adjuvant |
| US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
| US4935233A (en) | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
| DE3712985A1 (de) | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
| US5359035A (en) | 1985-12-21 | 1994-10-25 | Hoechst Aktiengesellschaft | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) |
| EP0237019A3 (en) | 1986-03-14 | 1988-03-09 | Toray Industries, Inc. | Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene |
| JPS63267278A (ja) | 1986-03-14 | 1988-11-04 | Toray Ind Inc | インタ−フエロン結合体を暗号化する塩基配列 |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| DK173067B1 (da) | 1986-06-27 | 1999-12-13 | Univ Washington | Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa |
| US4954617A (en) | 1986-07-07 | 1990-09-04 | Trustees Of Dartmouth College | Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes |
| US4894227A (en) | 1986-08-01 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Composition of immunotoxins with interleukin-2 |
| US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| US5508031A (en) | 1986-11-21 | 1996-04-16 | Cetus Oncology Corporation | Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2 |
| US4732683A (en) | 1986-12-02 | 1988-03-22 | Biospectrum, Inc. | Purification method for alpha interferon |
| US5019368A (en) | 1989-02-23 | 1991-05-28 | Cancer Biologics, Inc. | Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy |
| AU600575B2 (en) | 1987-03-18 | 1990-08-16 | Sb2, Inc. | Altered antibodies |
| US5258498A (en) | 1987-05-21 | 1993-11-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins |
| DE3856559T2 (de) | 1987-05-21 | 2004-04-29 | Micromet Ag | Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung |
| US5091513A (en) | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
| EP0294703B1 (en) | 1987-06-10 | 1995-05-10 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Bifunctional antibody constructs and method for selectively destroying cell populations |
| US5064646A (en) | 1988-08-02 | 1991-11-12 | The University Of Maryland | Novel infectious bursal disease virus |
| ATE88900T1 (de) | 1987-09-02 | 1993-05-15 | Ciba Geigy Ag | Konjugate von interferon alpha mit immunglobulinen. |
| CA1338518C (en) | 1987-09-23 | 1996-08-13 | Joyce M. Zarling | Antibody heteroconjugates for the killing of hiv-infected cells |
| NZ226414A (en) | 1987-10-02 | 1992-07-28 | Genentech Inc | Cd4 peptide adhesion variants and their preparation and use |
| ZA888978B (en) | 1987-12-04 | 1990-07-25 | Du Pont | Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxylterminal extension |
| WO1989006692A1 (en) | 1988-01-12 | 1989-07-27 | Genentech, Inc. | Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function |
| CA1341588C (en) | 1988-01-26 | 2009-01-06 | Michel Revel | Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use |
| US5120525A (en) | 1988-03-29 | 1992-06-09 | Immunomedics, Inc. | Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer |
| DE3812605A1 (de) | 1988-04-15 | 1990-06-07 | Leskovar Peter Dipl Ing Dr Hab | Immunregulative stoffe und stoffgemische zur aktiven beeinflussung des krankheitsverlaufes |
| US4975369A (en) * | 1988-04-21 | 1990-12-04 | Eli Lilly And Company | Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen |
| IT1217724B (it) | 1988-05-26 | 1990-03-30 | Ist Naz Ric Sul Cancro | Anticorpo monoclonale specifico per una sequenza di fibronettina espressa in cellule trasformate ibridoma secernente tale anticorpo e impiego dell'anticorpo monoclonale per la diagnosi di tumori |
| IE62463B1 (en) | 1988-07-07 | 1995-02-08 | Res Dev Foundation | Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy |
| US5601819A (en) | 1988-08-11 | 1997-02-11 | The General Hospital Corporation | Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding |
| IL91933A (en) | 1988-10-11 | 1994-12-29 | Univ Southern California | Their immuno-bracelet and isophiles which are beneficial in increasing vascular permeability or blood supply to tumor or otherwise damaged tissue |
| US5457038A (en) | 1988-11-10 | 1995-10-10 | Genetics Institute, Inc. | Natural killer stimulatory factor |
| US5242824A (en) | 1988-12-22 | 1993-09-07 | Oncogen | Monoclonal antibody to human carcinomas |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| US5116964A (en) | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US5225538A (en) | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| US5166322A (en) | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
| IE63847B1 (en) | 1989-05-05 | 1995-06-14 | Res Dev Foundation | A novel antibody delivery system for biological response modifiers |
| US6291158B1 (en) | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for tapping the immunological repertoire |
| US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
| ES2096590T3 (es) | 1989-06-29 | 1997-03-16 | Medarex Inc | Reactivos biespecificos para la terapia del sida. |
| DE69019609T2 (de) | 1989-07-07 | 1995-11-30 | Takeda Chemical Industries Ltd | Proteine und deren Herstellung. |
| US5073627A (en) | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| CA2066612C (en) | 1989-09-20 | 1998-12-08 | Stephen D. Gillies | Method of producing fusion proteins |
| US5856298A (en) | 1989-10-13 | 1999-01-05 | Amgen Inc. | Erythropoietin isoforms |
| JP2983629B2 (ja) | 1989-10-13 | 1999-11-29 | キリン―アムジエン・インコーポレイテツド | エリスロポエチンイソフォーム |
| DE69034249T2 (de) | 1989-12-22 | 2008-05-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Monoklonale Antikörper spezifisch für den zytotoxischen Lymphozyten-Reifefaktor |
| US5314995A (en) | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
| JPH07507440A (ja) | 1990-03-02 | 1995-08-24 | レプリゲン・コーポレーション | 結合親和性を高めた抗体構築物 |
| DE69127749T2 (de) | 1990-03-20 | 1998-04-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York, New York, N.Y. | Chimäre antikörper mit rezeptor-bindenden liganden anstelle ihrer konstanten region |
| US5349053A (en) | 1990-06-01 | 1994-09-20 | Protein Design Labs, Inc. | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses |
| US7253264B1 (en) | 1990-06-28 | 2007-08-07 | Sanofi-Arentideutschland GmbH | Immunoglobulin fusion proteins, their production and use |
| CA2082804A1 (en) | 1990-07-27 | 1992-01-28 | Theodore Maione | Methods and compositions for treatment of angiogenic diseases |
| DE69133036T2 (de) | 1990-11-09 | 2003-02-06 | Stephen D. Gillies | Cytokine immunokonjugate |
| CA2095842A1 (en) | 1990-11-09 | 1992-05-10 | Stephen D. Gillies | Bridging antibody fusion constructs |
| US5650150A (en) | 1990-11-09 | 1997-07-22 | Gillies; Stephen D. | Recombinant antibody cytokine fusion proteins |
| DK0561907T3 (da) | 1990-12-05 | 1999-05-31 | Novo Nordisk As | Proteiner med ændrede epitoper og fremgangsmåder til fremstilling deraf |
| US5709859A (en) | 1991-01-24 | 1998-01-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Mixed specificity fusion proteins |
| GB9105245D0 (en) | 1991-03-12 | 1991-04-24 | Lynxvale Ltd | Binding molecules |
| US6072039A (en) | 1991-04-19 | 2000-06-06 | Rohm And Haas Company | Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest |
| EP0519596B1 (en) | 1991-05-17 | 2005-02-23 | Merck & Co. Inc. | A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
| US5199942A (en) | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
| WO1993003157A1 (en) | 1991-07-29 | 1993-02-18 | Dana Farber Cancer Institute | Plasmids for the rapid preparation of modified proteins |
| EP0601043B1 (en) | 1991-08-30 | 1998-11-25 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Hybrid cytokines |
| US20020037558A1 (en) | 1991-10-23 | 2002-03-28 | Kin-Ming Lo | E.coli produced immunoglobulin constructs |
| US5376367A (en) | 1991-11-22 | 1994-12-27 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising MGF and IL-3 |
| US6627615B1 (en) | 1991-12-17 | 2003-09-30 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for in vivo gene therapy |
| AU687733B2 (en) | 1992-04-01 | 1998-03-05 | Rockefeller University, The | Method for in vitro proliferation of dendritic cell precursors and their use to produce immunogens |
| CA2133409C (en) | 1992-04-01 | 2011-05-24 | Ralph M. Steinman | Method for in vitro proliferation of dendritic cell precursors and their use to produce immunogens |
| ATE311895T1 (de) | 1992-05-26 | 2005-12-15 | Immunex Corp | Neue zytokine die cd30 binden |
| EP0646178A1 (en) | 1992-06-04 | 1995-04-05 | The Regents Of The University Of California | expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host |
| US5614184A (en) | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
| DE69332485T2 (de) | 1992-08-11 | 2003-11-13 | The President And Fellows Of Harvard College, Cambridge | Immunmodulierende peptide |
| DE4228839A1 (de) | 1992-08-29 | 1994-03-03 | Behringwerke Ag | Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren |
| US5639641A (en) * | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
| EP0627932B1 (en) | 1992-11-04 | 2002-05-08 | City Of Hope | Antibody construct |
| EP1757694A3 (en) | 1992-11-05 | 2008-02-27 | Sloan Kettering Institute For Cancer Research | Prostate-specific membrane antigen |
| US5738849A (en) | 1992-11-24 | 1998-04-14 | G. D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them |
| US5543297A (en) | 1992-12-22 | 1996-08-06 | Merck Frosst Canada, Inc. | Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity |
| US6096331A (en) | 1993-02-22 | 2000-08-01 | Vivorx Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents |
| WO1994024267A1 (en) | 1993-04-20 | 1994-10-27 | Robinson, William, S. | Methods and materials for treatment of individuals infected with intracellular infectious agents |
| WO1994024160A2 (en) | 1993-04-21 | 1994-10-27 | Brigham And Women's Hospital | Erythropoietin muteins with enhanced activity |
| US5759551A (en) | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| WO1994025609A1 (en) | 1993-04-28 | 1994-11-10 | Hybritech Incorporated | Method for creating optimized regulatory regions affecting protein expression and protein trafficking |
| CA2161651A1 (en) | 1993-04-29 | 1994-11-10 | Gregory F. Okasinski | Erythropoietin analog compositions and methods |
| US5554512A (en) | 1993-05-24 | 1996-09-10 | Immunex Corporation | Ligands for flt3 receptors |
| CA2125763C (en) | 1993-07-02 | 2007-08-28 | Maurice Kent Gately | P40 homodimer of interleukin-12 |
| GB9316989D0 (en) | 1993-08-16 | 1993-09-29 | Lynxvale Ltd | Binding molecules |
| ZA946122B (en) | 1993-08-17 | 1995-03-20 | Amgen Inc | Erythropoietin analogs |
| CA2182498A1 (en) | 1994-02-01 | 1995-08-10 | William J. Larochelle | Fusion proteins that include antibody and nonantibody portions |
| WO1995028427A1 (en) | 1994-04-15 | 1995-10-26 | Imclone Systems Incorporated | Chimeric interleukin-3/mutein interleukin-6 lymphokine |
| US5639725A (en) | 1994-04-26 | 1997-06-17 | Children's Hospital Medical Center Corp. | Angiostatin protein |
| WO1995029242A1 (en) | 1994-04-26 | 1995-11-02 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin and method of use for inhibition of angiogenesis |
| US5837682A (en) | 1996-03-08 | 1998-11-17 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
| ES2162917T3 (es) | 1994-05-13 | 2002-01-16 | Biovation Ltd | Mejoras en o relativas al suministro de peptidos. |
| CU22615A1 (es) | 1994-06-30 | 2000-02-10 | Centro Inmunologia Molecular | Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos |
| US6429199B1 (en) | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
| NZ292124A (en) | 1994-07-29 | 1998-10-28 | Smithkline Beecham Plc | Il-4 antagonist comprising a fusion of a mutant il-4-antibody fragment |
| US6309853B1 (en) | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US5888773A (en) | 1994-08-17 | 1999-03-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing single-chain Fv molecules |
| US5541087A (en) | 1994-09-14 | 1996-07-30 | Fuji Immunopharmaceuticals Corporation | Expression and export technology of proteins as immunofusins |
| ES2167391T3 (es) | 1994-09-16 | 2002-05-16 | Merck Patent Gmbh | Inmunoconjugados ii. |
| EP1621206A1 (en) | 1994-12-12 | 2006-02-01 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Chimeric cytokines and uses thereof |
| US6485726B1 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
| US6086875A (en) | 1995-01-17 | 2000-07-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of immunogens |
| US5552524A (en) | 1995-01-31 | 1996-09-03 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5691309A (en) | 1995-01-31 | 1997-11-25 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5891680A (en) | 1995-02-08 | 1999-04-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12 |
| ES2225874T3 (es) | 1995-03-10 | 2005-03-16 | Genentech, Inc. | Activacion de receptor mediante gas. |
| US5719266A (en) | 1995-03-17 | 1998-02-17 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| AU5539596A (en) | 1995-04-06 | 1996-10-23 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Anti-obesity agents |
| US6281010B1 (en) | 1995-06-05 | 2001-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus gene therapy vehicle and cell line |
| WO1997000317A1 (en) | 1995-06-07 | 1997-01-03 | Osteosa Inc. | Osteoclast growth regulatory factor |
| AU5893796A (en) | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Novo Nordisk A/S | Modification of polypeptides |
| GB9511935D0 (en) | 1995-06-13 | 1995-08-09 | Smithkline Beecham Plc | Novel compound |
| CA2225454A1 (en) | 1995-06-30 | 1997-01-23 | Thomas Wesley Stephens | Methods for treating diabetes |
| US6406689B1 (en) | 1995-10-03 | 2002-06-18 | Frank W. Falkenberg | Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases |
| US5854205A (en) | 1995-10-23 | 1998-12-29 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic compositions and methods |
| ATE248912T1 (de) | 1995-10-23 | 2003-09-15 | Childrens Medical Center | Therapeutische antiangiogenische zusammensetzungen und verfahren |
| WO1997020062A1 (en) | 1995-12-01 | 1997-06-05 | University Of Massachusetts | Il-12 p40 subunit fusion polypeptides and uses thereof |
| JP4037905B2 (ja) | 1995-12-27 | 2008-01-23 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 半減期の長いｏｂタンパク質誘導体 |
| US5723125A (en) | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
| US6080409A (en) | 1995-12-28 | 2000-06-27 | Dendreon Corporation | Immunostimulatory method |
| US7063958B1 (en) | 1996-01-16 | 2006-06-20 | The Rockefeller University | Nucleic acids db, the receptor for leptin |
| US6750334B1 (en) | 1996-02-02 | 2004-06-15 | Repligen Corporation | CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor |
| WO1997030089A1 (en) | 1996-02-13 | 1997-08-21 | Regents Of The University Of California | Novel antibody-cytokine fusion protein, and methods of making and using the same |
| US5756541A (en) | 1996-03-11 | 1998-05-26 | Qlt Phototherapeutics Inc | Vision through photodynamic therapy of the eye |
| AU2527397A (en) | 1996-03-13 | 1997-10-01 | Protein Design Labs, Inc. | Fas ligand fusion proteins and their uses |
| WO1997034631A1 (en) | 1996-03-18 | 1997-09-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobin-like domains with increased half lives |
| WO1997043316A1 (en) | 1996-05-10 | 1997-11-20 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Physiologically active molecules with extended half-lives and methods of using same |
| CN1136197C (zh) | 1996-05-30 | 2004-01-28 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 新的哒嗪酮衍生物 |
| US5922685A (en) | 1996-06-05 | 1999-07-13 | Powderject Vaccines, Inc. | IL-12 gene therapy of tumors |
| CA2258593A1 (en) | 1996-07-02 | 1998-01-08 | Abraham Nudelman | Retinoyloxy(substituted)alkylene butyrates useful for the treatment of cancer and other proliferative diseases |
| AU4075897A (en) | 1996-08-16 | 1998-03-06 | Roger Lallone | A leptin binding protein and its use in methods for diagnosing and treating abnormalities of the endogenous leptin pathway |
| ES2176574T3 (es) | 1996-09-03 | 2002-12-01 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Utilizacion de anticuerpos bi y triespecificos para la induccion de inmunidad tumoral. |
| US5994104A (en) | 1996-11-08 | 1999-11-30 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Interleukin-12 fusion protein |
| NZ514145A (en) | 1996-12-20 | 2003-08-29 | Amgen Inc | OB fusion protein compositions and methods |
| US6737057B1 (en) | 1997-01-07 | 2004-05-18 | The University Of Tennessee Research Corporation | Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors |
| US6100387A (en) | 1997-02-28 | 2000-08-08 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric polypeptides containing chemokine domains |
| US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
| CA2284726A1 (en) | 1997-04-11 | 1998-10-22 | G.D. Searle & Co. | Antagonistic anti-avb3 integrin antibodies |
| ES2172149T3 (es) * | 1997-04-14 | 2002-09-16 | Micromet Ag | Nuevo metodo para la produccion de receptores de antigeno anti-humano y sus usos. |
| HU226175B1 (en) | 1997-04-17 | 2008-06-30 | Amgen Inc | Human ob protein suspension, process for producing thereof and use for production of pharmaceutical composition |
| AU736549B2 (en) | 1997-05-21 | 2001-08-02 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung | Method for the production of non-immunogenic proteins |
| GB9712892D0 (en) | 1997-06-20 | 1997-08-20 | Eclagen Ltd | Identification of mhc binding peptides |
| AU8182298A (en) | 1997-07-10 | 1999-02-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins |
| CA2296770A1 (en) | 1997-07-14 | 1999-01-28 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins |
| US5873423A (en) * | 1997-07-31 | 1999-02-23 | Briese Industrial Technologies, Inc. | Frustum cutting bit arrangement |
| PT1037927E (pt) | 1997-12-08 | 2004-10-29 | Emd Lexigen Res Ct Corp | Proteinas de fusao heterodimericas uteis para imunoterapia de abordagem selectiva e estimulacao imunologica geral |
| US20030105294A1 (en) | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
| BR9908226A (pt) | 1998-02-25 | 2000-10-24 | Lexigen Pharm Corp | Melhoramento da meia vida de circulação de proteìnas de fusão com base em anticorpo |
| CN1318092C (zh) | 1998-04-15 | 2007-05-30 | 利思进药品公司 | 含有抗体－细胞因子融合蛋白和血管生成抑制剂的免疫治疗用组合物 |
| CN1305387A (zh) | 1998-04-17 | 2001-07-25 | 利思进药品公司 | 通过共同给予前列腺素抑制剂增强抗体－细胞因子融合蛋白介导的免疫应答 |
| WO1999054484A1 (en) | 1998-04-20 | 1999-10-28 | The Regents Of The University Of California | Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof |
| WO1999058662A1 (fr) | 1998-05-14 | 1999-11-18 | Merck Patent Gmbh | Proteine fusionnee |
| DZ2788A1 (fr) | 1998-05-15 | 2003-12-01 | Bayer Ag | Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2. |
| US6620382B1 (en) | 1998-05-22 | 2003-09-16 | Biopheresis Technologies, Llc. | Method and compositions for treatment of cancers |
| KR20010052566A (ko) | 1998-06-03 | 2001-06-25 | 윌리엄 뉴 | 엔도스타틴 단백질을 포함하는 단백질 올리고머 조성물 및이의 사용방법 |
| DK1088084T3 (da) | 1998-06-15 | 2007-01-29 | Gtc Biotherapeutics Inc | Erythropoietin analog-humant serumalbumin fusionsprotein |
| GB9814383D0 (en) | 1998-07-02 | 1998-09-02 | Cambridge Antibody Tech | Improvements relating to antibodies |
| CA2341029A1 (en) | 1998-08-17 | 2000-02-24 | Abgenix, Inc. | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
| DK1107989T3 (da) | 1998-08-25 | 2010-05-25 | Merck Patent Gmbh | Ekspression og eksport af angiostatin og endostatin som immunfusiner |
| US6646113B1 (en) | 1998-09-17 | 2003-11-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants |
| US6335176B1 (en) | 1998-10-16 | 2002-01-01 | Pharmacopeia, Inc. | Incorporation of phosphorylation sites |
| PT1123313E (pt) | 1998-10-23 | 2007-04-30 | Amgen Inc | Métodos e composições para a prevenção e tratamento da anemia |
| CA2342967A1 (en) | 1998-12-08 | 2000-06-15 | Biovation Limited | Modifying protein immunogenicity |
| BR0007414A (pt) | 1999-01-07 | 2001-10-16 | Lexigen Pharm Corp | Expressão e exportação de proteìnas antiobesidade como proteìnas de fusão fc |
| KR20070091691A (ko) | 1999-05-06 | 2007-09-11 | 웨이크 포리스트 유니버시티 | 면역 반응을 유발하는 항원을 동정하기 위한 조성물과 방법 |
| EP1177285A1 (en) | 1999-05-07 | 2002-02-06 | Genentech, Inc. | Chimpanzee erythropoietin (chepo) polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| US6348192B1 (en) | 1999-05-11 | 2002-02-19 | Bayer Corporation | Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells |
| PL352332A1 (en) | 1999-05-19 | 2003-08-11 | Lexigen Pharm Corp | Expression and export of interferon-alpha proteins as fc fusion proteins |
| AU5617900A (en) | 1999-06-17 | 2001-01-09 | Robert C. Gallo | Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor |
| CZ299516B6 (cs) | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
| JO2291B1 (en) | 1999-07-02 | 2005-09-12 | اف . هوفمان لاروش ايه جي | Erythropoietin derivatives |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| US7067110B1 (en) * | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| JP4793971B2 (ja) | 1999-08-09 | 2011-10-12 | メルク パテント ゲーエムベーハー | 複合サイトカイン−抗体複合体 |
| AU2154401A (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-30 | Merck Patent Gmbh | Erythropoietin forms with improved properties |
| US20050202538A1 (en) | 1999-11-12 | 2005-09-15 | Merck Patent Gmbh | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
| CA2399832C (en) | 2000-02-11 | 2011-09-20 | Stephen D. Gillies | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| JP4917232B2 (ja) | 2000-02-24 | 2012-04-18 | フィロジェン ソチエタ ペル アツィオニ | 病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法 |
| US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
| MXPA02011016A (es) | 2000-05-12 | 2004-03-16 | Neose Technologies Inc | Glicopeptidos recombinantes de glucolisacion in vitro. |
| US7517526B2 (en) | 2000-06-29 | 2009-04-14 | Merck Patent Gmbh | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents |
| HUP0401300A3 (en) | 2001-01-18 | 2005-06-28 | Merck Patent Gmbh | Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity |
| ATE400030T1 (de) | 2001-02-19 | 2008-07-15 | Merck Patent Gmbh | Methode zur identifizierung von t-zellepitopen und deren anwendung zur herstellung von molekülen mit reduzierter immunogenität |
| AU2002233340B2 (en) | 2001-02-19 | 2008-05-22 | Merck Patent Gmbh | Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity |
| CA2440221C (en) | 2001-03-07 | 2013-02-05 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety |
| WO2002074783A2 (en) | 2001-03-15 | 2002-09-26 | Merck Patent Gmbh | Modified interferon beta with reduced immunogenicity |
| WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| PL205352B1 (pl) * | 2001-05-03 | 2010-04-30 | Merck Patent Gmbh | Rekombinowane przeciwciało specyficzne dla nowotworu |
| TW544602B (en) * | 2001-08-08 | 2003-08-01 | Hon Hai Prec Ind Co Ltd | Delivery notification system |
| WO2003015697A2 (en) | 2001-08-13 | 2003-02-27 | University Of Southern California | Interleukin-2 mutants with reduced toxicity |
| DK1454138T3 (da) | 2001-12-04 | 2012-02-13 | Merck Patent Gmbh | Immunocytokiner med moduleret selektivitet |
| CN101143221A (zh) | 2002-03-15 | 2008-03-19 | 布赖汉姆妇女医院 | 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药 |
| PL211180B1 (pl) * | 2002-12-17 | 2012-04-30 | Merck Patent Gmbh | Białko fuzyjne typu przeciwciało-IL2, wektor zawierający sekwencję kwasów nukleinowych kodujących takie białko, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie białko fuzyjne oraz jego zastosowania do wytwarzania leków |
| US20050069521A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins |
| EP1699822B1 (en) * | 2003-12-30 | 2008-04-23 | MERCK PATENT GmbH | Il-7 fusion proteins with antibody portions, their preparation and their use |
| DK1699821T3 (da) | 2003-12-31 | 2012-07-16 | Merck Patent Gmbh | Fc-ERYTHROPOIETIN-FUSIONSPROTEIN MED FORBEDREDE FARMAKOKINETIKKER |
| WO2005070967A2 (en) | 2004-01-22 | 2005-08-04 | Merck Patent Gmbh | Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation |
| US7670595B2 (en) | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
| DE602005020837D1 (de) * | 2004-12-09 | 2010-06-02 | Merck Patent Gmbh | Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität |
| US20070104689A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens |
| CA2635623C (en) | 2005-12-30 | 2015-02-17 | Michael Super | Anti-cd19 antibodies with reduced immunogenicity |
| ES2384055T3 (es) | 2005-12-30 | 2012-06-28 | Merck Patent Gmbh | Variantes de la interleucina-12p40 con estabilidad mejorada |
| EP1966244B1 (en) | 2005-12-30 | 2012-03-21 | Merck Patent GmbH | Anti-il-6 antibodies preventing the binding of il-6 complexed with il-6ralpha to gp130 |
| AR060070A1 (es) | 2006-03-24 | 2008-05-21 | Merck Patent Gmbh | Dominios proteicos heterodimericos obtenidos por ingenieria |
| WO2008003473A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses |
-
2002
- 2002-05-03 PL PL367831A patent/PL205352B1/pl unknown
- 2002-05-03 DK DK02769304.3T patent/DK1383785T3/da active
- 2002-05-03 PT PT02769304T patent/PT1383785E/pt unknown
- 2002-05-03 KR KR1020037014151A patent/KR100900166B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-03 JP JP2002587625A patent/JP4309662B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-03 RU RU2003132705/13A patent/RU2306320C9/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-05-03 ES ES02769304T patent/ES2361664T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-03 AU AU2002308562A patent/AU2002308562B2/en not_active Ceased
- 2002-05-03 CA CA2446087A patent/CA2446087C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-03 WO PCT/US2002/013844 patent/WO2002090566A2/en not_active Ceased
- 2002-05-03 AT AT02769304T patent/ATE502053T1/de active
- 2002-05-03 US US10/138,727 patent/US6969517B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-03 DE DE60239454T patent/DE60239454D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-03 HU HU0400284A patent/HUP0400284A3/hu unknown
- 2002-05-03 MX MXPA03009924A patent/MXPA03009924A/es active IP Right Grant
- 2002-05-03 CN CNB02809297XA patent/CN100503639C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-03 EP EP02769304A patent/EP1383785B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-03 BR BR0209177-1A patent/BR0209177A/pt active Search and Examination
-
2003
- 2003-12-02 ZA ZA2003/09380A patent/ZA200309380B/en unknown
-
2005
- 2005-07-01 US US11/174,186 patent/US7459538B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-08-29 US US12/201,935 patent/US7803618B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-03-17 JP JP2009064775A patent/JP4546571B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL205352B1 (pl) | Rekombinowane przeciwciało specyficzne dla nowotworu | |
| CN113166246B (zh) | 一种抗体及其用途 | |
| AU2002308562A1 (en) | Recombinant tumor specific antibody and use thereof | |
| CN115715202B (zh) | 抗体药物缀合物及其制备方法和用途 | |
| US20070292416A1 (en) | De-Immunized Anti-Cd3 Antibody | |
| JP7392200B2 (ja) | グリコシル化ｃｅａｃａｍ５に特異的に結合した抗体 | |
| CN116284408A (zh) | 结合人muc17的抗体、其制备方法及用途 | |
| CN114426580B (zh) | 抗csf-1r抗体及其产品、方法和用途 | |
| TW202428615A (zh) | 抗ｃｄ２４抗體及其用途 | |
| WO2025194412A1 (zh) | 靶向egfr和axl的双特异性抗体及其药物偶联物与应用 | |
| CN116284406A (zh) | 一种pd-1结合蛋白及其应用 | |
| CN114929741A (zh) | 针对lif的抗体及其用途 | |
| CN117886935A (zh) | 抗csf-1r抗体及其应用 | |
| HK40048164B (zh) | 一种抗体及其用途 | |
| CN117866093A (zh) | 抗人b7-h4抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
| HK40090265A (en) | Antibody drug conjugate, preparation method therefor and use thereof | |
| HK40048164A (en) | Antibody and use thereof |