KR100900166B1

KR100900166B1 - 재조합 종양 특이적 항체 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR100900166B1
Application number: KR1020037014151A
Authority: KR
Inventors: 길리즈스티븐디; 로킨밍; 쳰슈치
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2001-05-03
Filing date: 2002-05-03
Publication date: 2009-06-02
Also published as: PL205352B1; PL367831A1; RU2003132705A; US7459538B2; WO2002090566A3; JP2009131284A; JP4546571B2; CA2446087A1; EP1383785B1; DE60239454D1; RU2306320C9; US7803618B2; EP1383785A4; US20100174056A1; AU2002308562B2; US20050244418A1; PT1383785E; CN1520421A; MXPA03009924A; ES2361664T3

Abstract

본 발명은 인간 상피 세포 접착 분자에 특이적으로 결합하는 일군의 항체를 제공한다. 상기 항체에는 개질된 가변부, 보다 구체적으로 개질된 골격부가 포함되며, 이는 인간에게 투여되는 경우 이들의 면역원성을 감소시킨다. 적절한 부분에 커플링되는 경우, 상기 항체는 암의 진단, 예후 및 처치에 사용될 수 있다.

종양 특이적 항체, 인간 상피 세포 접착 분자

Description

재조합 종양 특이적 항체 및 이들의 용도 {RECOMBINANT TUMOR SPECIFIC ANTIBODY AND USE THEREOF}

관련 출원

본 출원은 2001. 5. 3. 일자로 출원한 미국 특허 출원 제 60/288,564 호를 우선권으로 청구하며, 그 개시는 본원에 참고문헌으로 도입된다.

본 발명은 일반적으로 재조합 항체에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 인간 상피 세포 접착 분자 (human Epithelial Cell Adhesion Molecule) 에 특이적으로 결합하는 재조합 항체, 및 진단제, 예후제 및 치료제로서의 이들의 용도에 관한 것이다.

수년간 항체 기재 치료의 개발에 있어서 상당한 진전이 있어왔다. 예를 들어, 연구자들은 다양한 암 특이적 마커 뿐만 아니라, 이들 마커에 특이적으로 결합하는 다양한 항체를 동정하였다. 항체는 특정 분자, 예를 들어 독소 또는 면역 자극 부분, 예를 들어 시토카인을 마커를 발현하는 암 세포에 전달하여 암 세포를 선택적으로 죽이는데 사용될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제 5,541,087 호; 및 제 5,650,150 호 참고).

KS-1/4 항체는 인간 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 에 대해 만들어진 마우스 유래 모노클로날 항체이다. EpCAM 은 특정 상피 세포의 정단 (apical) 표면 상에서 매우 낮은 수준으로 발현된다. 예를 들어, EpCAM 은 면역계 세포 및 대부분의 단백질에 접근가능하지 않을, 소화 음식물 쪽을 향하며 순환계에서 먼 세포 표면 상의 장 세포에서 발현된다 (Balzar 등 [1999] J. Mol. Med. 77: 699-712).

그러나 특정 조건 하에서, EpCAM 은 특정 세포, 예를 들어 상피 기원의 종양 세포 상에서 고발현된다. 전형적으로, 상기 종양 세포는 EpCAM 이 세포의 전체 표면에 걸쳐 발현되는 결과, 이들의 극성을 소실하게 된다. 따라서, EpCAM 은 종양 세포에 대해 항체 기재 면역 자극 부분을 전달하기 위해 편리한 종양 특이적 마커이다 (Simon 등 [1990] Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 2755-2759; Perez 등 [1989] J Immunol. 142: 3662-3667).

그러나, 항체는 숙주 포유류에서 관련 면역원성을 가질 수 있다. 이는 항체가 자가유래가 아닌 경우 더 잘 일어난다. 결과적으로, 항체 기재 치료법의 유효성은 종종 항체에 대해 나타나는 면역원성 반응에 따른다. 면역원성 반응은 전형적으로, 항체가 숙주 포유류와 상이한 포유류에서 전체적으로 또는 부분적으로 유래되는 경우, 예컨대 항체가 마우스에서 유래되고 수여자가 인간인 경우 증가된다. 따라서, 마우스 유래 항체의 면역원성을 감소시키거나 최소화하기 위해, 마우스 유래 항체를 인간 항체에 보다 가깝게 개질하는 것이 유용할 수 있다.

예를 들어 키메라성 항체, 항체 인간화 및 항체 피복 (veneering) 을 포함하 는 다양한 접근법이 개발되어 왔지만, 인간에게 투여되는 경우 감소된 면역원성을 가지며 암 특이적 마커에 결합하는 항체가 당분야에서 요구되고 있다. 또한, 종양 세포를 선택적으로 죽이기 위해, 암 특이적 마커에 예를 들어 면역 콘쥬게이트 또는 융합 단백질로서 독소 또는 면역 자극 부분을 전달하는 항체가 당분야에서 요구되고 있다.

본 발명의 개요

본 발명은 부분적으로, 인간 EpCAM 에 특이적으로 결합하지만, 주형인 쥐과 항-EpCAM 항체에 비해 인간에서의 면역원성이 더 적은 재조합 항체의 동정에 기반한다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 골격부 및/또는 상보성 결정부를 정의하는 아미노산 서열이 개질되어 인간에서의 이들의 면역원성이 감소된 재조합 KS 항체를 제공한다.

본원에서 사용되는 용어 "항체" 및 "면역글로불린" 은 (i) 온전한 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체), (ii) 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')₂ 단편, Fv 단편, 단일쇄 항체 결합 부위, sFv 를 포함하는 이들의 항원 결합부 (iii) 2-특이적 (bi-specific) 항체 및 이들의 항원 결합부, 및 (iv) 다중-특이적 항체 및 이들의 항원 결합부를 의미하는 것으로 이해된다.

본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하다", "결합이 특이적이다" 및 "특이적 결합" 은 항체가 특정 항원에 대해 약 10⁶ M^-1 이상, 보다 바람직하게는 약 10⁷ M^-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 10⁸ M^-1 이상, 가장 바람직하게는 약 10¹⁰ M^-1 이상의 결합 친화도를 갖는 것을 의미하는 것으로 이해된다.

본원에서 사용되는 용어 "상보성 결정부" 및 "CDR" 은 항원과 일차적으로 상호작용하는 면역글로불린 가변부의 고가변부 또는 루프를 의미하는 것으로 이해된다. 면역글로불린 중쇄 가변부 (V_H) 및 면역글로불린 경쇄 가변부 (V_L) 는 둘 다, 도 1 에 나타낸 바와 같이 골격부 사이에 배치된 3 개의 CDR 을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 1 에 나타낸 바와 같은 KS-1/4 항체의 면역글로불린 경쇄 가변부를 정의하는 아미노산 서열을 참조하여, CDR 은 Ser24 부터 Leu33 (CDR1), Asp49 부터 Ser55 (CDR2), 및 His88 부터 Thr96 (CDR3) 의 아미노산 서열에 의해 정의된다. 서열 번호 2 에 나타낸 바와 같은 KS-1/4 항체의 면역글로불린 중쇄 가변부를 정의하는 아미노산 서열을 참조하여, CDR 은 Gly26 부터 Asn35 (CDR1), Trp50 부터 Gly66 (CDR2), 및 Phe99 부터 Tyr105 (CDR3) 의 아미노산 서열에 의해 정의된다. 본원에 기재된 다른 항체의 해당 CDR 은 해당 KS-1/4 중쇄 또는 경쇄 서열과의 정렬 뒤에 도 1A-1C 에 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "골격부" 및 "FR" 은 상보성 결정부에 인접한 면역글로불린 가변부 영역을 의미하는 것으로 이해된다. 면역글로불린 중쇄 가변부 (V_H) 및 면역글로불린 경쇄 가변부 (V_L) 는 둘 다 도 1 에 나타낸 바와 같이 4 개의 FR 을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 1 에 나타낸 바와 같은 KS-1/4 항체의 면역글로불린 경쇄 가변부를 정의하는 아미노산 서열을 참조하여, FR 은 Gln1 부터 Cys23 (FR1), Trp34 부터 Phe48 (FR2), Gly56 부터 Cys87 (FR3), 및 Phe97 부터 Lys106 (FR4) 의 아미노산 서열에 의해 정의된다. 서열 번호 2 에 나타낸 바와 같은 KS-1/4 항체의 면역글로불린 중쇄 가변부를 정의하는 아미노산 서열을 참조하여, FR 은 Gln1 부터 Ser25 (FR1), Trp36 부터 Gly49 (FR2), Arg67 부터 Arg98 (FR3), 및 Trp106 부터 Ser116 (FR4) 의 아미노산 서열에 의해 정의된다. 본원에 기재된 다른 항체의 해당 FR 은 해당 KS-1/4 중쇄 또는 경쇄 서열과의 정렬 뒤에 도 X 및 Y 에 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "KS 항체" 는 하이브리도마에 의해 발현되는 쥐과 항체 KS-1/4 에 의해 결합되는 동일한 인간 EpCAM 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하는 것으로 이해된다 (예를 들어, Cancer Res. 1984, 44 (2):681-7 참고). KS 항체는 바람직하게는 하기를 포함한다: (i) 면역글로불린 경쇄 CDR1 서열의 일부 이상을 정의하는 아미노산 서열 SASSSVSY (서열 번호 1 의 아미노산 24-31), (ii) 면역글로불린 경쇄 CDR2 서열의 일부 이상을 정의하는 아미노산 서열 DTSNLAS (서열 번호 1 의 아미노산 49-55), (iii) 면역글로불린 경쇄 CDR3 서열의 일부 이상을 정의하는 아미노산 서열 HQRSGYPYT (서열 번호 1 의 아미노산 88-96), (iv) 면역글로불린 중쇄 CDR1 서열의 일부 이상을 정의하는 아미노산 서열 GYTFTNYGMN (서열 번호 2 의 아미노산 26-35), (v) 면역글로불린 중쇄 CDR2 서열의 일부 이상을 정의하는 아미노산 서열 WINTYTGEPTYAD (서열 번호 2 의 아미노산 50-62), 또는 (vi) 면역글로불린 중쇄 CDR3 서열의 일부 이상을 정의하는 아미노산 서열 SKGDY (서열 번호 2 의 아미노산 101-105), 또는 상기물의 임의 조합.

하나의 측면에 있어서, 본 발명은 EpCAM 에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 제공하며, 여기서 상기 항체는 그 일부가 면역글로불린 V_L도메인에서 골격부를 정의하는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 골격부 (FR1) 는 서열 번호 5 의 아미노산 잔기 1-23 에 의해 정의되며, 여기서 Xaa1 은 Q 또는 E 이거나, Xaa3 은 L 또는 V 이거나, Xaa1O 은 I 또는 T 이거나, Xaa11 은 M 또는 L 이거나, Xaa13 은 A 또는 L 이거나, Xaa18 은 K 또는 R 이거나, Xaa21 은 M 또는 L 인데, 단 Xaa1, Xaa3, Xaa1O, Xaa11, Xaa13, Xaa18, 또는 Xaa21 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열 번호 1 에서 해당 위치에서의 아미노산과 동일하지 않다. 각각의 위치에서의 아미노산은 표준 1 문자 코드로 나타낸다.

또다른 구현예에 있어서, 골격부 (FR2) 는 서열 번호 5 의 아미노산 잔기 34-48 에 의해 정의되며, 여기서 Xaa41 은 S 또는 Q 이거나, Xaa42 는 S 또는 A 이거나, Xaa45 는 P 또는 L 이거나, Xaa46 은 W 또는 L 인데, 단 Xaa41, Xaa42, Xaa45, 또는 Xaa46 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열 번호 1 에서 해당 위치에서의 아미노산과 동일하지 않다.

또다른 구현예에 있어서, 골격부 (FR3) 는 서열 번호 5 의 아미노산 잔기 56-87 에 의해 정의되며, 여기서 Xaa57 은 F 또는 I 이거나, Xaa69 는 S 또는 D 이거나, Xaa71 은 S 또는 T 이거나, Xaa73 은 I 또는 T 이거나, Xaa77 은 M 또는 L 이거나, Xaa79 는 A 또는 P 이거나, Xaa82 는 A 또는 F 이거나, Xaa84 는 T 또는 V 인데, 단 Xaa57, Xaa69, Xaa71, Xaa73, Xaa77, Xaa79, Xaa82, 또는 Xaa84 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열 번호 1 에서 해당 위치에서의 아미노산과 동 일하지 않다.

또다른 측면에 있어서, 본 발명은 EpCAM 에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 제공하며, 여기서 상기 항체는 그 일부가 면역글로불린 V_L 도메인에서 골격부를 정의하는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 골격부 (FR1) 는 서열 번호 6 의 아미노산 잔기 1-25 에 의해 정의되며, 여기서 Xaa2 는 I 또는 V 이거나, Xaa9 는 P 또는 A 이거나, Xaa11 은 L 또는 V 이거나, 또는 Xaa17 은 T 또는 S 인데, 단 Xaa2, Xaa9, Xaa11 또는 Xaa17 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열 번호 2 에서 해당 위치에서의 아미노산과 동일하지 않다.

또다른 구현예에 있어서, 골격부 (FR2) 는 서열 번호 6 의 아미노산 잔기 36-49 에 의해 정의되며, 여기서 Xaa38 은 K 또는 R 이거나, Xaa40 은 T 또는 A 이거나, Xaa46 은 K 또는 E 인데, 단 Xaa38, Xaa40, Xaa46 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열 번호 2 에서 해당 위치에서의 아미노산과 동일하지 않다.

또다른 구현예에 있어서, 골격부 (FR3) 는 서열 번호 6 의 아미노산 잔기 67-98 에 의해 정의되며, 여기서 Xaa68 은 F 또는 V 이거나, Xaa69 는 A 또는 T 이거나, Xaa70 은 F 또는 I 이거나, Xaa73 은 E 또는 D 이거나, Xaa76 은 A 또는 T 이거나, Xaa80 은 F 또는 Y 이거나, Xaa83 은 I 또는 L 이거나, Xaa84 는 N 또는 S 이거나, Xaa85 는 N 또는 S 이거나, Xaa88 은 N, A 또는 S 이거나, Xaa91 은 M 또는 T 이거나, Xaa93 은 T 또는 V 인데, 단 Xaa68, Xaa69, Xaa70, Xaa73, Xaa76, Xaa80, Xaa83, Xaa84, Xaa85, Xaa88, Xaa91 또는 Xaa93 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열 번호 2 에서 해당 위치에서의 아미노산과 동일하지 않다. 또다른 구현예에 있어서, 골격부 (FR4) 는 서열 번호 6 의 아미노산 잔기 106-116 에 의해 정의되며, 여기서 Xaa1O8 은 Q 또는 T 이다.

또다른 구현예에 있어서, 면역글로불린 V_L 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 FR1 서열을 포함한다: (i) 서열 번호 9 의 아미노산 잔기 1-23; 및 (ii) 서열 번호 8 의 아미노산 잔기 1-23. 또다른 구현예에 있어서, 면역글로불린 V_H 도메인은 서열 번호 18 의 아미노산 잔기 1-25 로 정의되는 FR 서열 또는 서열 번호 18 의 아미노산 잔기 67-98 로 정의되는 FR 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, V_L 도메인은 서열 번호 9 의 아미노산 1-106 으로 정의되는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 V_H 도메인은 서열 번호 18 의 아미노산 1-116 으로 정의되는 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 항체는 임의로, 예를 들어 하기를 포함하는 CDR 서열의 일부 이상을 정의하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: (i) 서열 번호 1 의 아미노산 잔기 24-31; (ii) 서열 번호 1 의 아미노산 잔기 49-55; 및/또는 (iii) 서열 번호 1 의 아미노산 잔기 88-96. 유사하게는, 항체는 임의로, 예를 들어 하기를 포함하는 CDR 서열의 일부 이상을 정의하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: (i) 서열 번호 2 의 아미노산 잔기 26-35; (ii) 서열 번호 2 의 아미노산 잔기 50-62; 및/또는 (iii) 서열 번호 2 의 아미노산 잔기 101-105.

또다른 구현예에 있어서, 항체는 항체-시토카인 융합 단백질의 항원 타겟팅부를 포함한다. 시토카인은 바람직하게는 인터류킨이며, 보다 바람직하게는 인 터류킨-2 이다.

또다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체의 일부 이상을 코딩하는 발현 벡터를 제공한다. 바람직한 구현예에 있어서, 발현 벡터에는 서열 번호 40 에 나타낸 뉴클레오티드 서열이 포함된다.

또다른 측면에 있어서, 본 발명은 EpCAM 의 과발현에 관련된 질환 (예를 들어, EpCAM 이 질환을 갖지 않는 조직에 비해 질환 조직에서 더 높은 수준으로 존재하는 질환) 을 갖는 인간 환자의 진단, 예후 및/또는 처치 방법을 제공한다. 상기 방법에는 상기 진단, 예후 또는 처치를 필요로 하는 개체에게 하나의 본 발명의 항체를 투여하는 것이 포함된다.

항체는 임의로 이에 부착된 진단제 및/또는 치료제를 포함한다. 상기 제제는 항체에 융합되어 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 이와는 달리, 상기 제제는 항체에 화학적으로 커플링되어 면역 콘쥬게이트를 생성시킬 수 있다. 상기 제제에는, 예를 들어 독소, 방사선표지, 시토카인, 조영제 등이 포함될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 항체는 시토카인에 융합 단백질로서 융합된다. 바람직한 시토카인에는 바람직하게는 인터류킨, 예컨대 인터류킨-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 및 IL-18, 조혈 인자, 예컨대 과립구-대식구 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 및 에리트로포이에틴, 종양 괴사 인자 (TNF), 예컨대 TNFα, 림포카인, 예컨대 면역독소, 대사 과정의 조절자, 예컨대 렙틴, 인터페론, 예컨대 인터페론 α, 인터페론 β, 및 인터페론 γ, 및 케모카인이 포함된다. 바람직 하게는, 항체-시토카인 융합 단백질은 시토카인의 생물학적 활성을 나타낸다.

도면의 설명

도 1A, 1B 및 1C 는 KS 항체의 경쇄 및 중쇄 변이형 및 공통 서열의 정렬을 나타낸다. 면역글로불린 골격부 (FR1-FR4) 는 - 로 나타낸다. 면역글로불린 상보성 결정부 (CDR1-CDR3) 는 * 로 나타낸다. 개별 KS 항체 경쇄 V 영역 절편은 "VK" 로 나타내며, 여기서 K 는 경쇄가 카파 사슬임을 나타낸다. 개별 KS 항체 중쇄 V 영역 절편은 "V_H" 로 나타낸다. 공통 서열에서 치환가능한 아미노산은 "X" 로 나타낸다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 인간 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 제공한다. 본 발명의 바람직한 항체는 인간에서 면역원성을 감소시키는 변형된 가변부를 갖는다. 본 발명의 항체 가변부는 특히 인간 환자에서 EpCAM 을 과발현하는 종양 조직에 대해 항체 및 항체 융합 단백질을 타겟팅하는데 유용하다. 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 항체는 시토카인에 융합되어 면역 시토카인을 생성한다.

본 발명의 단백질 서열

본 발명은 적절히 헤테로이합되는 (heterodimerized) 경우, 또한 KS 항원 또는 KSA 로도 알려져 있는 인간 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 에 결합하는 일군의 항체 가변부 또는 V 영역 서열을 개시하고 있다. 본 발명의 바람직한 단백질은 본원에 기재된 바와 같이 인간 환자의 처치에 유용하다. 따라서, 바람직한 KS 항체 변이형은 인간에게 투여되는 경우 이들의 면역원성을 감소시키기 위해, 인간화되거나, 탈면역화 (deimmunized) 되거나, 또는 둘 다이다. 본 발명에 따라, 쥐과 KS 항체는, 예를 들어 MHC 클래스 II 분자에 대한 펩티드 에피토프의 결합을 감소시키는 돌연변이의 도입에 의해 잠재적 T 세포 에피토프가 약화되거나 제거되는 탈면역화 방법을 이용하거나 (예를 들어 WO98/52976, 및 WO00/34317 참고), 또는 비인간 T 세포 에피토프가 인간 항체에 존재하는 인간 자가 에피토프에 대응하도록 돌연변이되는 방법을 이용하여 (예를 들어, U.S. 특허 제 5,712,120 호 참고) 탈면역화되거나 인간화될 수 있다.

I. 가변 경쇄

재조합 항-EpCAM 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 가변 경쇄 서열을 갖는다:

X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C-S-A-S-S-S-V-S-T-X-L-W-Y-X-

Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-X-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-

X-I-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C-H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-X-E-I-K (서열 번호 3).

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 3 의 잔기 1 내지 23, 즉 X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C 로 나타내는, 면역글로불린 경쇄 FR1 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa1 위치에서 Q 또는 E; Xaa3 위치에서 L 또는 V; Xaa1O 위치에서 I, T 또는 S; Xaa11 위치에 서 M 또는 L; Xaa12 위치에서 S 또는 A; Xaa13 위치에서 A, L 또는 V; Xaa17 위치에서 E 또는 Q, Xaa18 위치에서 K 또는 R, Xaa19 위치에서 V 또는 A; 및 Xaa21 위치에서 M, L 또는 I. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa1 위치에서 E; Xaa3 위치에서 V; Xaa1O 위치에서 T 또는 S; Xaa11 위치에서 L; Xaa12 위치에서 A; Xaa13 위치에서 L 또는 V; Xaa17 위치에서 Q, Xaa18 위치에서 R, Xaa19 위치에서 A; 및 Xaa21 위치에서 L 또는 I.

또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 3 의 잔기 24 내지 33, 즉 S-A-S-S-S-V-S-T-X-L 로 나타내는, 면역글로불린 경쇄 CDR1 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 CDR1 영역에 하나의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa32 위치에서 M 또는 I. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 CDR1 영역에 아미노산 치환, 예를 들어 Xaa32 위치에서 I 를 갖는다.

또다른 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 3 의 잔기 34 내지 48, 즉 W-Y-X-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-X 로 나타내는, 면역글로불린 경쇄 FR2 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa36 위치에서 Q 또는 L; Xaa41 위치에서 S 또는 Q; Xaa42 위치에서 S, A 또는 P; Xaa45 위치에서 P 또는 L; Xaa46 위치에서 W 또는 L; 및 Xaa48 위치에서 F 또는 Y. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR2 영역에서 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa36 위치에서 L; Xaa41 위치에서 Q; Xaa42 위치에서 A 또는 P; Xaa45 위치에서 L; Xaa46 위치에서 L; 및 Xaa48 위치에서 Y.

또다른 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 3 의 잔기 56 내지 87, 즉, G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C 로 나타내는, 면역글로불린 경쇄 FR3 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa57 위치에서 F 또는 I; Xaa59 위치에서 A 또는 S; Xaa69 위치에서 S, D 또는 T; Xaa71 위치에서 I 또는 T; Xaa73 위치에서 I 또는 T; Xaa75 위치에서 S 또는 N; Xaa77 위치에서 M 또는 L; Xaa79 위치에서 A 또는 P; Xaa82 위치에서 A 또는 F; 및 Xaa84 위치에서 T 또는 V. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa57 위치에서 I; Xaa59 위치에서 S; Xaa69 위치에서 D 또는 T; Xaa71 위치에서 T; Xaa73 위치에서 T; Xaa75 위치에서 N; Xaa77 위치에서 L; Xaa79 위치에서 P; Xaa82 위치에서 F; 및 Xaa84 위치에서 V.

또다른 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 3 의 잔기 97 내지 106, 즉 F-G-G-G-T-K-X-E-I-K 로 나타내는, 면역글로불린 경쇄 FR4 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 FR4 영역에 하나 이상의 하기 아미노산, 예를 들어 Xaa103 위치에서 L 또는 V 를 갖는다. 따라서, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 FR4 영역에 아미노산 치환, 예를 들어 Xaa103 위치에서 V 를 갖는다.

II. 가변 중쇄

재조합 항-EpCAM 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 가변 중쇄 서열을 갖는다:

Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-I-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-N-

W-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G-W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G-R-X-X-

X-X-X-X-T-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-X-S-K-G-D-

Y-W-G-X-G-T-X-V-T-V-S-S (서열 번호 4)

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 4 의 잔기 1 내지 25, 즉 Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-I-S-C-K-A-S 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 FR1 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa2 위치에서 I 또는 V; Xaa9 위치에서 P 또는 A; Xaa11 위치에서 L 또는 V; Xaa16 위치에서 E 또는 S; 및 Xaa17 위치에서 T 또는 S. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa2 위치에서 V; Xaa9 위치에서 A; Xaa11 위치에서 V; Xaa16 위치에서 S; 및 Xaa17 위치에서 S.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 4 의 잔기 36 내지 49, 즉 W-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 FR2 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa38 위치에 K 또는 R; Xaa40 위치에 T 또는 A; Xaa43 위치에 K 또는 Q; 및 Xaa46 위치에 K 또는 E. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa38 위치에 R; Xaa40 위치에 A; Xaa43 위치에 Q; 및 Xaa46 위치에 E.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 4 의 잔기 50 내지 66, 즉 W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 CDR2 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 CDR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa63 위치에 D 또는 K; 및 Xaa65 위치에 K 또는 Q. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 CDR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa63 위치에 K; 및 Xaa65 위치에 Q.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 4 의 잔기 67 내지 98, 즉 R-X-X-X-X-X-X-T-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 FR3 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa68 위치에 F 또는 V, Xaa69 위치에 A, T 또는 V; Xaa70 위치에 F 또는 I; Xaa71 위치에 S 또는 T; Xaa72 위치에 L 또는 A; Xaa73 위치에 E 또는 D; Xaa76 위치에 A 또는 T; Xaa79 위치에 A 또는 L; Xaa80 위치에 F 또는 Y; Xaa83 위치에 I 또는 L; Xaa84 위치에 N 또는 S; Xaa85 위치에 N 또는 S; Xaa88 위치에 N, A 또는 S; Xaa91 위치에 M 또는 T; 및 Xaa93 위치에 T 또는 V. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치 환을 갖는다: Xaa68 위치에 V, Xaa69 위치에 T 또는 V; Xaa70 위치에 I; Xaa71 위치에 T; Xaa72 위치에 A; Xaa73 위치에 D; Xaa76 위치에 T; Xaa79 위치에 L; Xaa80 위치에 Y; Xaa83 위치에 L; Xaa84 위치에 S; Xaa85 위치에 S; Xaa88 위치에 A 또는 S; Xaa91 위치에 T; 및 Xaa93 위치에 V.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 4 의 잔기 99 내지 105, 즉 F-X-S-K-G-D-Y 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 CDR3 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 CDR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산, 예를 들어 Xaa1O0 위치에 I 또는 M 을 갖는다. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 CDR3 영역에 아미노산 치환, 예를 들어 Xaa1O0 위치에 M 을 갖는다.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 4 의 잔기 106 내지 116, 즉 W-G-X-G-T-X-V-T-V-S-S 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 FR4 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR4 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa108 위치에 Q 또는 T; 및 X111 위치에 S 또는 T.

보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR4 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa108 위치에 T; 및 X111 위치에 T.

III. 정련된 가변 경쇄

또다른 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 가변 경쇄 서열을 갖는다:

X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C-S-A-S-S-S-V-S-Y-M-L-W-Y-Q-

Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-F-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-

X-I-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C-H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-L-E-I-K (서열 번호 5)

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 5 의 잔기 1 내지 23, 즉 X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C 로 나타내는, 면역글로불린 경쇄 FR1 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa1 위치에 Q 또는 E; Xaa3 위치에 L 또는 V; Xaa1O 위치에 I 또는 T; Xaa11 위치에 M 또는 L; Xaa13 위치에 A 또는 L; Xaa18 위치에 K 또는 R; 및 Xaa21 위치에 M 또는 L. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa1 위치에 E; Xaa3 위치에 V; Xaa1O 위치에 T; Xaa11 위치에 L; Xaa13 위치에 L; Xaa18 위치에 R; 및 Xaa21 위치에 L.

또다른 바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는 면역글로불린 경쇄 FR1 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다: Xaa1 위치에 Q 또는 E; Xaa11 위치에 A 또는 L; 및 Xaa21 위치에 M 또는 L. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 치환을 갖는 면역글로불린 경쇄 FR1 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다: Xaa1 위치에 E; Xaa11 위치에 L; 및 Xaa21 위치에 L.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 5 의 잔기 34 내지 48, 즉 W-Y-Q-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-F 로 나타내는 면역글로불린 경쇄 FR2 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa41 위치에 S 또는 Q; Xaa42 위치에 S 또는 A; Xaa45 위치에 P 또는 L; 및 Xaa46 위치에 W 또는 L. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa41 위치에 Q; Xaa42 위치에 A; Xaa45 위치에 L; 및 Xaa46 위치에 L.

또다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 FR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는 면역글로불린 경쇄 FR2 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다: Xaa42 위치에 S 또는 A; Xaa45 위치에 P 또는 L; 및 Xaa46 위치에 W 또는 L. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR2 영역에 하나 이상의 하기 치환을 갖는 면역글로불린 경쇄 FR2 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다: Xaa42 위치에 A; Xaa45 위치에 L; 및 Xaa46 위치에 L.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 5 의 잔기 56 내지 87, 즉 G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C 로 나타내는, 면역글로불린 경쇄 FR3 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa57 위치에 F 또는 I; Xaa69 위치에 S 또는 D; Xaa71 위치에 S 또는 T; Xaa73 위치에 I 또는 T; Xaa77 위치에 M 또는 L; Xaa79 위치에 A 또는 P; Xaa82 위치에 A 또는 F; 및 Xaa84 위치에 T 또는 V. 보다 바람직하게는, 재조합 항- EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa57 위치에 I; Xaa69 위치에 D; Xaa71 위치에 T; Xaa73 위치에 T; Xaa77 위치에 L; Xaa79 위치에 P; Xaa82 위치에 F; 및 Xaa84 위치에 V.

또다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는 면역글로불린 경쇄 FR3 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다: Xaa57 위치에 F 또는 I; Xaa69 위치에 S 또는 D; Xaa79 위치에 A 또는 P; Xaa82 위치에 A 또는 F; 및 Xaa84 위치에 T 또는 V. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 치환을 갖는 면역글로불린 경쇄 FR3 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다: Xaa57 위치에 I; Xaa69 위치에 D; Xaa79 위치에 P; Xaa82 위치에 F; 및 Xaa84 위치에 V.

IV. 정련된 가변 중쇄

Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-I-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-N-

W-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G-W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G-R-X-X-

X-S-L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-I-S-K-G-D-Y-

W-G-Q-G-T-S-V-T-V-S-S (서열 번호 6)

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 6 의 잔기 1 내지 25, 즉 Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-I-S-C-K-A-S 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 FR1 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게 는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa2 위치에 I 또는 V; Xaa9 위치에 P 또는 A; Xaa11 위치에 L 또는 V; 및 Xaa17 위치에 T 또는 S. 따라서, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa2 위치에 V; Xaa9 위치에 A; Xaa11 위치에 V; 및 Xaa17 위치에 S.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는 면역글로불린 중쇄 FR1 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다: Xaa2 위치에 I 또는 V; Xaa9 위치에 P 또는 A; 및 Xaa11 위치에 L 또는 V. 따라서, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하나 이상의 하기 치환을 갖는 면역글로불린 중쇄 FR1 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다: Xaa2 위치에 V; Xaa9 위치에 A; 및 Xaa11 위치에 V.

또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 6 의 잔기 36 내지 49, 즉 W-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 FR2 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa38 위치에 K 또는 R; Xaa40 위치에 T 또는 A; 및 Xaa46 위치에 K 또는 E. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa38 위치에 R; Xaa40 위치에 A; 및 Xaa46 위치에 E.

또다른 바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 하기 아미노산, 예를 들어 Xaa46 위치에 K 또는 E 를 갖는, 면역글로불린 중쇄 FR2 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR1 영역에 아미노산 치환, 예를 들어 Xaa46 위치에 E 를 갖는, 면역글로불린 중쇄 FR2 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 6 의 잔기 50 내지 66, 즉 W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 CDR2 를 정의한는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 CDR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa63 위치에 D 또는 K; 및 Xaa65 위치에 K 또는 Q. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 CDR2 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa63 위치에 K; 및 Xaa65 위치에 Q.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 6 의 잔기 67 내지 98, 즉 R-X-X-X-S-L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 FR3 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는다: Xaa68 위치에 F 또는 V; Xaa69 위치에 A 또는 T; Xaa70 위치에 F 또는 I; Xaa73 위치에 E 또는 D; Xaa76 위치에 A 또는 T; Xaa80 위치에 F 또는 Y; Xaa83 위치에 I 또는 L; Xaa84 위치에 N 또는 S; Xaa85 위치에 N 또는 S; Xaa88 위치에 N, A 또는 S; Xaa91 위치에 M 또는 T; 및 Xaa93 위치에 T 또는 V. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 갖는다: Xaa68 위치에 V; Xaa69 위치에 T; Xaa70 위치에 I; Xaa73 위치에 D; Xaa76 위치에 T; Xaa80 위치에 Y; Xaa83 위치에 L; Xaa84 위치에 S; Xaa85 위치에 S; Xaa88 위치에 A 또는 S; Xaa91 위치에 T; 및 Xaa93 위치에 V.

또다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 아미노산을 갖는 면역글로불린 중쇄 FR3 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다: Xaa68 위치에 F 또는 V; Xaa73 위치에 E 또는 D; Xaa84 위치에 N 또는 S; Xaa85 위치에 N 또는 S; Xaa88 위치에 N 또는 A; 및 Xaa93 위치에 T 또는 V. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR3 영역에 하나 이상의 하기 치환을 갖는 면역글로불린 중쇄 FR3 을 정의하는 아미노산 서열을 갖는다: Xaa68 위치에 V; Xaa73 위치에 D; Xaa84 위치에 S; Xaa85 위치에 S; Xaa88 위치에 A; 및 Xaa93 위치에 V.

바람직한 구현예에 있어서, 재조합 항-EpCAM 항체는 서열 번호 6 의 잔기 106 내지 116, 즉 W-G-X-G-T-S-V-T-V-S-S 로 나타내는, 면역글로불린 중쇄 FR4 를 정의하는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR4 영역에 하나 이상의 하기 아미노산, 예를 들어 Xaa108 위치에 Q 또는 T 를 갖는다. 보다 바람직하게는, 재조합 항-EpCAM 항체는 FR4 영역에 아미노산 치환, 예를 들어 Xaa108 위치에 T 를 갖는다.

따라서, 바람직한 V 영역에는 쥐과 KS-1/4 가변부에 대응하는 V_H 및/또는 VK 영역의 FR 도메인에서의 치환이 포함된다. 또한, 본 발명의 바람직한 V 영역에는 쥐과 KS-1/4 가변부에 대해 아미노산의 삽입 또는 결실은 포함되지 않는다.

바람직한 변이형에는 쥐과 KS-1/4 과 80% 초과의 동일성/상동성을 갖는 가변 부를 갖는 단백질이 포함된다. 쥐과 KS 가변부 또는 이들의 일부의 아미노산 서열은 후보 서열이 본 발명의 방법에서 적절한 성공 예측도를 갖기 위해 충분한 아미노산 유사성을 보유하는지 여부를 결정하기 위한 참조 서열로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 변이형 서열은 쥐과 KS 가변 중쇄 또는 경쇄 FR 또는 CDR 에 대해 70% 이상 유사하거나 60% 이상 동일하며, 보다 바람직하게는 75% 이상 유사하거나 65% 이상 동일하고, 가장 바람직하게는 80% 유사하거나 70% 동일하다.

후보 펩티드 영역이 쥐과 KS 서열에 대해 필요한 유사성 또는 동일성 백분율을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 후보 아미노산 서열 및 쥐과 KS 서열을 먼저 문헌 [Henikoff 및 Henikoff (1992) PNAS 89: 10915-10919] 의 도 2 에 기재된 BLOSUM62 치환 매트릭스와 함께 문헌 [Smith 및 Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197] 에 기재된 다이나믹 프로그래밍 알고리즘을 이용하여 정렬한다. 본 발명을 위해, 갭 삽입 페널티를 위해 적절한 값은 -12 이며, 갭 확장 페널티를 위해 적절한 값은 -4 이다. Smith-Waterman 알고리즘 및 BLOSUM62 매트릭스를 이용하여 정렬을 수행하는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 GCG 프로그램 스위트 (GCG program suite (Oxford Molecular Group, Oxford, England)) 가 시판되고 있으며, 당분야의 숙련자에게 널리 이용되고 있다. 일단 후보 및 참조 서열이 정렬되면, 유사성 백분율 스코어를 계산할 수 있다. 각 서열의 개별 아미노산을 각각에 대한 이들의 유사성에 따라 순차적으로 비교한다. 2 개의 정렬된 아미노산에 대응하는 BLOSUM62 매트릭스의 값이 0 이거나 또는 음수인 경우, 한쌍의 유사성 스코어는 0 이며; 그렇지 않은 경우 한쌍의 유사성 스코어는 1.0 이다. 미가공 유사성 스코어는 정렬된 아미노산의 한쌍의 유사성 스코어들의 합이다. 이어서 미가공 스코어를 후보 또는 참조 서열 중 더 적은 아미노산 수로 나누어 표준화한다. 표준화된 미가공 스코어가 유사성 백분율이다. 이와는 달리, 동일성 백분율을 계산하기 위해서는, 각 서열의 정렬된 아미노산을 다시 순차 비교한다. 아미노산이 동일하지 않은 겨우, 한쌍의 동일성 스코어는 0 이고; 그렇지 않은 경우, 한쌍의 동일성 스코어는 1.0 이다. 미가공 동일성 스코어는 동일한 정렬 아미노산의 합이다. 이어서 미가공 스코어를 후보 또는 참조 서열 중 더 적은 아미노산 수로 나누어 표준화한다. 표준화된 미가공 스코어가 동일성 백분율이다. 삽입 및 결실은 유사성 및 동일성의 백분율 계산을 위해서는 무시된다. 따라서, 갭 페널티는 상기 계산에 사용되지 않지만, 초기 정렬에는 사용된다.

본 발명에는 또한 세포, 예컨대 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포, 기타 진핵 세포 또는 원핵 세포로부터 KS 항체의 발현을 분석하기 위한 방법이 개시되어 있다 (실시예 1 참고). 바람직한 방법에 있어서, KS 항체 V 영역은 온전한 인간 항체의 성분으로서 발현되며, 진핵 세포주로부터 항체의 발현은 인간 Fc 영역을 검출하는 ELISA 에 의해 분석된다. EpCAM 에 대한 KS 항체의 결합을 정확히 정량하기 위해서는, Biacore 분석이 이용될 수 있다.

KS 항체 융합 단백질로의 인간 질환 처치

본 발명에는 또한 인간 질환, 예컨대 암의 처치에 유용한 KS 항체-IL2 융합 단백질의 서열이 개시된다. 특정 KS 항체-IL2 융합 단백질, 예컨대 KS-1/4-IL2 (예를 들어, 실시예 X 에서의 구축물 3 참고) 는 항체에 대해 놀랍도록 적은 면역 반응을 나타내며, 암을 가진 인간 환자의 처치에 사용될 수 있다.

KS-1/4 (VH2/VK1)-IL2 로의 인간 암 치료 도중, KS-1/4 (구축물 3)-IL2 에서보다 적은 면역원성이 나타남이 발견되었다. 구체적으로 임상 시험 도중, KS-1/4 (구축물 3)-IL2 에서보다 항개별특이형 (anti-idiotypic) 항체, 및 항체-IL2 결합 또는 IL-2 부분에 대해 얻어진 항체의 빈도가 낮은 환자를 얻었다. 본 발명의 항체 가변부는 또한 다른 시토카인, 예를 들어 인터류킨 1, 2, 6, 10 또는 12; 인터페론 알파 및 베타; TNF, 및 INF 감마에 융합될 수 있다. 본 발명은 하기 비제한적 실시예를 참조하여 보다 자세히 이해될 수 있다.

실시예 1. KS 항체 발현, 및 이들의 항원 결합 활성의 분석을 위한 방법 및 시약

1A. 세포 배양 및 트랜스펙션

하기 일반 기법을 후속 실시예에 사용하였다. 일과성 트랜스펙션을 위해, 플라스미드 DNA 를 플라스미드 DNA 와 인산칼슘의 공침에 의해 인간 신장 293 세포 내로 도입하였다 [Sambrook 등, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY].

안정적으로 트랜스펙션된 클론을 수득하기 위해, 플라스미드 DNA 를 전기천공에 의해 마우스 골수종 NS/0 세포 내로 도입하였다. NS/0 세포를 10% 소 태아 혈청이 보강된 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium) 에서 배양하였다. 약 5 ×10⁶ 세포를 PBS 로 1 회 세척하고 0.5 ml 인산염 완충 액 (PBS) 중에 재현탁하였다. 이어서, 10 ㎍ 의 선형화된 플라스미드 DNA 를 세포와 함께, Gene Pulser Cuvette (0.4 cm 전극 갭, BioRad) 에서 10 분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 0.25 V 및 500 μF 로 세팅된 Gene Pulser (BioRad) 를 이용하여 전기천공을 수행하였다. 세포를 얼음 상에서 10 분 동안 방치한 후 회수하고, 이들은 성장 배지 중에 재현탁한 후 2 개의 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 트랜스펙션 2 일 후 도입되는 100 nM 메토트렉세이트 (MTX) 의 존재 하 성장에 의해 선택하였다. 세포를 매 3 일 마다 2 내지 3 회 배지를 갈아주었고, MTX-내성 클론은 2 내지 3 주 후에 나타났다. 클론의 상청액을 항-인간 Fc ELISA 로 분석하여, 고생산자를 동정하였다 [Gillies 등 (1989) J. Immunol. Methods 125: 191]. 고생산 클론을 단리하고, 100 nM MTX 를 함유하는 성장 배지 중에서 증식시켰다.

1B. ELISA

3 개의 상이한 ELISA 를 이용하여, MTX-내성 클론 및 기타 시험 표본의 상청액 중 단백질 산물의 농도를 결정하였다. 항-huFc ELISA 를 이용하여, 인간 Fc-포함 단백질, 예컨대 키메라성 항체의 양을 측정하였다. 항-hu 카파 ELISA 를 이용하여, (키메라성 또는 인간 면역글로불린의) 카파 경쇄의 양을 측정하였다. 항-muFc ELISA 를 이용하여, 시험 표본 중 muFc-포함 단백질의 양을 측정하였다 (하기 실시예 1C 참고).

항-huFc ELISA 를 하기에 상세히 설명한다.

A. 플레이트 코팅

ELISA 플레이트를 PBS 중 5 ㎍/ml 의 AffiniPure 염소 항-인간 IgG (H+L) (Jackson Immuno Research) 로, 96-웰 플레이트 (Nunc-Immuno plate Maxisorp) 에 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 코팅된 플레이트의 뚜껑을 덮고, 4℃ 에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 중 0.05% Tween (Tween 20) 으로 4 회 세척하고, PBS 중 1% BSA/1% 염소 혈청 200 ㎕/웰로 블로킹하였다. 블로킹 완충액과 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS 중 0.05% Tween 으로 4 회 세척하고, 종이 타월 상에 탭핑하여 건조하였다.

B. 시험 표본 및 2 차 항체와의 인큐베이션

시험 표본을 PBS 중 1% BSA/1% 염소 혈청/0.05% Tween 을 함유하는 표본 완충액 중에 적절한 농도로 희석하였다. 농도를 아는 (인간 Fc 를 갖는) 키메라성 항체로 표준 곡선을 작성하였다. 표준 곡선을 작성하기 위해, 표준 곡선 범위 125 ng/ml 내지 3.9 ng/ml 을 나타내도록 표본 완충액 중에 연속 희석하였다. 희석된 표본 및 표준물을 100 ㎕/웰로 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후, 플레이트를 PBS 중 0.05% Tween 으로 8 회 세척하였다. 이어서, 각각의 웰에 표본 완충액 중에 약 1:120,000 배 희석된, 2 차 항체인 홀스 래디쉬 페록시다아제 (HRP) 가 접합된 항-인간 IgG (Jackson Immuno Research) 100 ㎕ 을 첨가하였다. 2 차 항체의 정확한 희석도는 각각의 HRP-접합 항-인간 IgG 로트 (lot) 에 대해 결정되어야 한다. 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS 중 0.05% Tween 으로 8 회 세척하였다.

C. 발색

기질 용액을 플레이트에 100 ㎕/웰씩 첨가하였다. 기질 용액은 30 mg 의 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 (OPD) (1 정제) 를 바로 첨가되는 0.03% H₂O₂ 를 포함하는 15 ml 의 0.025M 시트르산/0.05M Na₂HPO₄ 완충액 (pH5) 내로 용해시켜 제조되었다. 암실에서 실온 하에 30 분 동안 발색시켰다. 발색 시간은 코팅된 플레이트, 2 차 항체 등의 로트 차이에 따라 변화시켰다. 표준 곡선에서의 발색을 관찰하여, 반응을 중단시킬 시점을 결정하였다. 반응은 4N H₂SO₄ 100 ㎕/웰의 첨가에 의해 중단되었다. 플레이트를 490 nm 및 650 nm 둘 다에서 세팅되고, 490 nm 에서의 OD 로부터 650 nm 에서의 OD 를 감산하도록 프로그래밍된 플레이트 탐독기로 확인하였다.

사용되는 2 차 항체가 1:4000 배 희석되어 사용되는 홀스 래디쉬 페록시다아제가 접합된 염소 항-hu 카파 (Southern Biotechnology Assoc. Inc., Birmingham, AL) 였다는 것을 제외하고는, 항-hu 카파 ELISA 도 상술된 바와 동일한 절차를 따랐다.

ELISA 플레이트를 PBS 중 5 ㎍/ml 의 AffiniPure 염소 항-쥐과 IgG (H+L) (Jackson Immuno Research) 로 100 ㎕/웰씩 코팅하고; 2 차 항체가 1:5000 배 희석하여 사용된 홀스 래디쉬 페록시다아제가 접합된 염소 항-muIgG, Fcγ(Jackson ImmunoResearch) 였다는 것을 제외하고는 항-muFc ELISA 를 위한 절차도 또한 유사하였다.

1C. KS 항원 (KSA, EpCAM) 의 클로닝 및 인간 EpCAM-쥐과 Fc 로서 가용성 형 태의 발현

메신저 RNA (MRNA) 를 제조자의 지시에 따라 Dynabeads mRNA Direct Kit (Dynal, Inc., Lake Success, NY) 를 이용하여 LnCAP 세포로부터 제조하였다. 올리고(dT) 및 역전사효소로의 제 1 쇄 cDNA 의 합성 후, 상피 세포 접착 분자 (또한 KS 항원 또는 KSA 로도 공지됨) 를 코딩하는 전장 cDNA 를 연쇄 중합 반응 (PCR) 에 의해 클로닝하였다. PCR 프라이머의 서열은 문헌 [Perez 및 Walker (1989) J. Immunol. 142: 3662-3667] 에 기재된 공개 서열을 기준으로 하였다. 센스 프라이머의 서열은 TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGCA (서열 번호 27) 이고, 논센스 프라이머의 서열은 CTCGAG TTATGCATTGAGTTCCCT (서열 번호 28) 이며, 번역 개시 코돈 및 번역 정지 코돈의 안티코돈은 진하게 나타내고, 절단 부위 XbaI (TCTAGA) 및 XhoI (CTCGAG) 은 밑줄을 그었다. PCR 산물을 클로닝하고, 정확한 KSA 서열을 여러개 개별 클론의 서열분석으로 확인하였다. LnCAP 으로부터 KSA 의 cDNA 서열은 UCLA-P3 세포로부터 KSA 의 공개된 서열 (Perez 및 Walker, 1989) 과 본질적으로 동일하였다. 그러나, 아미노산 잔기 번호 115 에서, LnCAP 의 뉴클레오티드 서열은 ACG 가 아닌 ATG 였고 (Thr 대신 Met), 아미노산 잔기 번호 277 에서, LnCAP 의 뉴클레오티드 서열은 ATG 가 아닌 ATA 였다 (Met 대신 Ile).

재조합 KSA 로의 KS-1/4 항체의 결합을 면역염색으로 나타내었다. KSA 의 표면 발현은 세포, 예컨대 CT26, B16 등을 적합한 포유류 발현 벡터 (pdCs, U.S. 특허 번호 제 5,541,087 호에 기재된 바와 같음) 내 전장 KSA 로 트랜스펙션한 후, KS-1/4 항체로 면역염색하여 수득하였다. 가용성 항원으로서의 KSA 의 발현을 위해, KSA 의 막통과 (transmembrane) 도메인을 코딩하는 cDNA 부분을 결실시켰다. 발현, 검출 및 정제를 촉진하기 위해, 가용성 KSA 를 그 구축이 하기에 설명되는 KSA-muFc 로서 발현시켰다. 가용성 KSA 를 코딩하는 780 bp XbaI-EcoRI 절단 단편을 muFc 를 코딩하는 AflII-XhoI 단편 (U.S. 특허 번호 제 5,726,044 호) 에 하기 링커-어댑터를 통해 결찰하였다:

5' AA TTC TCA ATG CAG GGC 3' (서열 번호 29)

3' G AGT TAC GTC CCG AAT T 5' (서열 번호 30)

가용성 KSA-muFc 를 코딩하는 XbaI-XhoI 단편을 pdCs 벡터에 결찰하였다. 생성 발현 벡터인 pdCs-KSA-muFc 를 사용하여 세포를 트랜스펙션하고, KSA-muFc 를 발현하는 안정적 클론을 항-muFc ELISA 로 동정하였다.

1D. 항원 결합의 측정

조건화 배지 중 KSA-muFc 를 먼저 공급자의 프로토콜에 따라 단백질 A 크로마토그래피 (Repligen, Cambridge, MA) 에 의해 정제하였다. 정제된 KSA-muFc 를 이용하여 96 웰 플레이트 (Nunc-Immuno plate, Maxisorp) 를 PBS 중 5 ㎍/ml 로 100 ㎕/웰씩 코팅하였다. 분석은 실시예 1B 에 기재된 ELISA 절차와 유사하였다. 간략하게, 코팅된 플레이트의 뚜껑을 덮고, 4℃ 에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고 블로킹하였다. 시험 표본을 표본 완충액 중에 적절한 농도로 희석하고, 100 ㎕/웰씩 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS 중 0.05% Tween 으로 8 회 세척하였다. 이어서, 각각의 웰에 표본 완충액 중 약 1:120,000 배로 희석된 2 차 항체인 홀스 래디쉬 페록시다아제가 접합된 항-인간 IgG (Jackson Immuno Research) 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 발색시키고, 실시예 1B 에 기재된 대로 확인하였다.

1E. Biacore 분석을 이용한 EpCAM 으로부터 KS-1/4 항체의 온-속도 (on-rates) 및 오프-속도 (off-rates) 의 측정

항원 EpCAM 에 대한 KS-1/4 및 KS-IL2 분자의 친화도를 Biacore 기계 (Biacore International AB, Uppsala, Sweden) 를 이용하는 항체-항원 상호작용의 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정하였다. EpCAM-쥐과Fc 를 제조자가 공급하는 아민 커플링 프로토콜을 이용하여 CM5 센서 칩에 커플링하였다. 이어서 25 nm 내지 200 nM 의 다양한 농도의 KS-1/4 및 KS-IL2 를 칩에 흘려보내, 칩으로의 결합을 관찰하였다. Biacore 소프트웨어의 고유 곡선조정 절차를 이용하여, 온-속도, 오프-속도, 결합 상수 및 해리 상수를 계산하였다.

1F. EpCAM 을 발현하는 세포주를 이용한 KS-1/4 항체의 결합 친화도 측정

정제된 KS-1/4 항체를 표준 기법을 이용하여 ¹²⁵I 로 요오드화시키고, 증가 농도의 표지된 단백질을 EpCAM 양성 세포주 PC-3 과 인큐베이션하였다. 포화 결합 곡선을 생성시키고, 해리 상수를 Scatchard 분석에 의해 결정하였다.

실시예 2. 마우스 KS-1/4 의 V _H 및 V _K 를 코딩하는 cDNA 의 클로닝, 및 KS-1/4 하이브리도마-유래 항체 발현용 벡터의 구축

마우스 KS-1/4 발현 하이브리도마로부터 제조된 메신저 RNA (R. Reisfeld, Scripps Research Institute 에서 입수) 를 올리고(dT) 로 역전사시킨 후 PCR 용 주형으로 사용하여, 중쇄 가변부 (V_H) 및 경쇄 가변부 (V_K) 를 코딩하는 서열을 증폭하였다. PCR 프라이머는 공개 서열 (Beavers 등, ibid.) 을 기준으로 고안하였다. V_H 에 대한 PCR 프라이머는 하기 서열을 가졌다:

V_H 전방 프라이머 (5') GACTCGAGCCCAAGTCTTAGACATC (3') (서열 번호 31)

V_H 후방 프라이머 (5') CAAGCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGACGTTC (3') (서열 번호 32)

여기서, CTCGAG 및 AAGCTT 서열은 각각 발현 벡터 (하기 참고) 내로 V_H 를 결찰하기 위해 사용되는 XhoI 및 HindIII 절단 부위를 나타내며; 및 후방 프라이머에서의 TAC 는 PCR 산물의 센스 사슬 중에, 스플라이스 (splice) 공여자 공통 서열인 GTA 를 도입시킬 것이다.

V_K 에 대한 PCR 프라이머는 하기 서열을 가졌다:

V_K 전방 프라이머 (5') GATCTAGACAAGATGGATTTTCAAGTG (3') (서열 번호 33)

V_K 후방 프라이머 (5') GAAGATCTTACGTTTTATTTCCAGCTTGG (3') (서열 번호 34)

여기서, TCTAGA 및 AGATCT 서열은 각각 발현 벡터 (하기 참고) 내로 V_K 를 결찰하기 위해 사용되는 XbaI 및 BglII 절단 부위를 나타내며; ATG 는 경쇄의 번역 개시 코돈이고; 및 후방 프라이머에서의 TAC 는 PCR 산물의 센스 사슬 중에, 스플라이스 공여자 공통 서열인 GTA 를 도입시킬 것이다.

마우스 KS-1/4 항체의 V_H 및 V_K 를 코딩하는 PCR 산물을 pCRII 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하였다. 몇몇 V_H 및 V_K 클론을 서열분석하고, 각각의 공통 서열을 결정하였다. V_H 및 V_K 서열을 발현 벡터 pdHL7 내로 차례로 삽입하였다. 결찰은 V_H 에 대해 유일한 XhoI 및 HindIII 부위, 및 V_K 에 대해 유일한 XbaI 및 BglII/BamHI 부위를 이용하였다 (V_K 삽입물 중에 유일한 BglII 및 벡터 중에 유일한 BamHI 은 호환성 돌출부를 갖는다). 생성 구축물을 pdHL7-하이브리도마 chKS-1/4 로 부르며, 이들은 이미 키메라성 항체의 발현을 위한 전사 조절 요소 및 인간 Ig 불변부 서열을 포함하고 있다 (Gillies 등, (1989) J. Immunol. Methods 125: 191).

발현 벡터 pdHL7 은 pdHL2 [Gillies 등, (1991) Hybridoma 10: 347-356] 에서 유래되었고, 하기 개질을 갖는다: 발현 벡터 pdHL2 에 있어서, 경쇄 및 중쇄-시토카인을 위한 전사 단위는 중쇄 면역글로불린 유전자의 인핸서 (enhancer) 및 메탈로티오나인 프로모터로 이루어졌다. pdHL7 에 있어서, 상기 2 개의 전사 단위는 CMV 인핸서-프로모터 [Boshart 등, (1985) 세포 41: 521-530] 로 이루어졌다. CMV 인핸서-프로모터를 코딩하는 DNA 는 시판 pcDNAI (Invitrogen Corp., San Diego, CA) 의 AflIII-HindIII 단편에서 유래되었다.

실시예 3. 쥐과 KS-1/4 항체의 발현 연구

상기 실시예에서는 U.S. 특허 제 4,975,369 호에 개시된 V 영역 서열을 코딩하는 항체 발현 플라스미드를 이용하여 수행되는 발현 연구가 논의된다.

3A. 플라스미드 구축

하이브리도마 KS-1/4 서열 및 U.S. 특허 제 4,975,369 호에 기재된 서열에 의해 코딩되는 키메라성 항체를 직접 비교하기 위해, U.S. 특허 제 4,975,369 호에 기재된 VH 서열을 코딩하는 cDNA 를 합성하였다. 이어서, 이것을 이미 KS-1/4 의 V_K 를 포함하는 pdHL7 발현 벡터 내로 결찰하였다.

U.S. 특허 제 4,975,369 호에 기재된 V_H 서열을 구축하기 위해, V_H 서열의 일부를 코딩하는 NdeI-HindIII 단편을 완전 화학적 합성에 의해 수득하였다. 겹치는 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하여 결찰하였다. 이어서, 결찰된 2 중체 (duplex) 를 XbaI-HindIII pBluescript 벡터 (Stratagene, LaJolla, CA) 내로 서브클로닝하였다.

상기 DNA 는 U.S. 특허 제 4,975,369 호의 단백질 서열 IQQPQNMRTM 를 코딩한다. 코딩 서열의 바로 3' 은 gta 로 시작하는 스플라이스 공여자 부위이다. 상부 사슬의 5' 말단 ctag 는 XbaI 클로닝 부위를 위한 돌출부이다. XbaI 부위는 pBluescript 벡터의 폴리링커 내로의 클로닝만을 위해 생성되었다. 이는 NdeI 절단 부위 (CATATG) 직후이다. 하단 사슬의 5' 말단 agct 는 HindIII 클로닝 부위를 위한 돌출부이다. 상기 HindIII 접착 말단 (sticky end) 은 후에 Cγl 유전자 [Gillies 등, (1991) Hybridoma 10: 347-356] 에 선행하는 인트론 중 HindIII 부위로 결찰된다.

서열 확인 후, NdeI-HindIII 절단 단편을 단리하였다. 이어서, V_H 의 N- 말단 절반을 코딩하는 XhoI-NdeI 단편과 함께 상기물을 XhoI-HindIII 로 소화된, KS-1/4 의 V_K 를 포함하는 pdHL7 발현 벡터로 결찰하였다. V_K 및 V_H 를 포함하는 생성 구축물 pdHL7-'369 chKS-1/4 는 U.S. 특허 제 4,975,369 에 기재되어 있다 (US 4,975,369 chKS-1/4 로 불림).

3B. 하이브리도마 chKS-1/4 및 US 4,975,369 chKS-1/4 항체의 비교

플라스미드 DNA pdHL7-하이브리도마 chKS-1/4 및 pdHL7-'369 chKS-1/4 를 상기 언급된 인산칼슘 공침 절차에 의해 인간 신장 293 세포 내로 병행 도입하였다. 트랜스펙션 5 일 후, 조건화 배지를 항-huFc ELISA 및 카파 ELISA (ELISA 절차는 실시예 1 참고) 에 의해 분석하고, 결과를 표 1 에 요약하였다.

항체	huFc ELISA	카파 ELISA
하이브리도마 chKS-1/4	254 ng/mL	200 ng/mL
US 4,975,369 chKS-1/4	14 ng/mL	0 ng/mL

상기 결과는, 하이브리도마 chKS-1/4 가 정상적으로 발현 및 분비되고, 분비된 항체는 대략 동일몰량의 중쇄 및 경쇄로 이루어져 있음을 2 개의 상이한 ELISA 의 정확도 내에서 나타내었다. 반면에, 단지 낮은 수준의 중쇄만이 US 4,975,369 chKS-1/4 항체에 대한 조건화 배지 중에서 검출되었고, 이는 카파 경쇄와 연합되지 않았다.

웨스턴 블롯 분석을 2 개의 일과성 트랜스펙션된 세포주의 전체 세포 용해액 및 조건화 배지 상에서 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위한 절차는 문헌 [Sambrook 등, (1989), supra] 에 기재되어 있다. 전체 세포 용해액을 분석하 기 위해, 트랜스펙션된 세포를 용해시키고, 원심분리하여 파편을 제거하고, 5 ×10⁵ 세포의 동등물로부터의 용해액을 레인 당 적용하였다. 조건화 배지를 분석하기 위해, 300 ㎕ 의 조건화 배지로부터의 단백질 산물을 먼저 단백질 A 세파로오스 크로마토그래피로 정제한 후, 환원 조건 하에 SDS-PAGE 하였다. 웨스턴 블롯 전달 후, 블롯을 1:2000 배로 희석되어 사용된 홀스래디쉬 페록시다아제가 접합된 염소 항-인간 IgG, Fcγ(Jackson ImmunoResearch) 와 혼성화하였다.

웨스턴 블롯 전달은, 사용된 조건 하에 중쇄가 pdHL7-하이브리도마 chKS-1/4가 트랜스펙션된 용해된 세포 및 조건화 배지 둘 다에서 검출됨을 나타내었다. 상기 결과는, chKS-1/4 항체의 중쇄가 세포 내에서 생산되어 (경쇄와 함께) 효율적으로 분비됨을 나타내었다. 반면, pdHL7-'369 chKS-1/4 가 트랜스펙션된 중쇄는 조건화 배지가 아닌 세포 용해액에서만 검출되었다. 상기 결과는, 비록 상당 수준의 중쇄가 세포 내에서 생산되지만, 이것이 분비되지 않음을 나타내었다. 상기 발견은, US 4,975,369 chKS-1/4 항체 중 소량의 분비 중쇄와 연합된 카파 경쇄가 없다는 것을 나타내는 ELISA 데이타와 일치되었다. 면역글로불린 중쇄는 전형적으로 면역글로불린 경쇄의 부재 하에서는 정상적으로 분비되지 않는 것으로 이해된다 [Hendershot 등, (1987) Immunology Today 8: 111].

상기에 덧붙여, NS/0 세포를 플라스미드 pdHL7-하이브리도마 chKS-1/4 및 pdHL7-US 4,975,369 chKS-1/4 로 병행하여 전기천공에 의해 트랜스펙션하였다. 실시예 1 에 기재된 바와 같이 안정한 클론을 100 nM MTX 의 존재 하에 선택하고, 96-웰 플레이트 중 MTX-내성 클론의 조건화 배지를 실시예 1 에 기재된 바와 같이 항-huFc ELISA 로 분석하였다. 결과를 표 2 에 요약하였다.

항체	스크리닝된 클론의 총 수	모드^*	최고 발현 수준^*
하이브리도마 chKS-1/4	80	0.1-0.5 ㎍/mL (41)	10-50 ㎍/mL (4)
US 4,975,369 chKS-1/4	47	0-10 ng/mL (36)	0.1-0.4 ㎍/mL (4)
*괄호 안의 번호는 모드에서의 클론 번호 또는 항-Fc ELISA 로 결정된 최고 산물 수준을 나타내는 번호를 나타낸다.

96 웰 단계에서 스크리닝되는 경우, pdHL7-하이브리도마 chKS-1/4 구축물로 수득되는 클론의 대부분은 약 100 ng/mL 내지 500 ng/mL 의 항체를 생산하며, 최고 클론은 약 10-50 ㎍/mL 을 생산하였다. 반면, pdHL7-'369 chKS-1/4 구축물로 수득되는 클론의 대부분은 약 0 ng/mL 내지 10 ng/mL 의 항체를 생산하며, 최고 클론은 약 300-400 ng/mL 을 생산하였다. US 4,975,369 chKS-1/4 항체의 조성 및 결합 특성을 검사하기 위해, 300-400 ng/mL 을 생산하는 클론을 배양할 필요가 있었다. 상기 클론 중 2 개를 증식을 위해 선택하였다. 그러나, 이들의 발현 수준은 매우 불안정한 것으로 나타났다. 배양물을 200 mL 까지 성장시킨 시점에서, 두 클론의 발현 수준은 항-Fc ELISA 에 의해 분석된 바에 따르면 약 20 ng/mL 로 떨어졌다. 동일한 조건화 배지를 항-카파 ELISA 로 분석한 경우, 293 세포에서 일과성 발현의 경우에서와 같이 카파 경쇄는 검출되지 않았다.

하기 실험은 검출가능한 카파 경쇄가 US 4,975,369 chKS-1/4 중쇄와 연합되지 않았음을 나타내었다. 간략하게, 50 mL 의 각각의 클론으로부터의 각각의 조건화 배지를 단백질 A 크로마토그래피로 농축하였다. 용출액을 항-Fc ELISA 및 항-카파 ELISA 로 분석하였다. 대조군으로서, 하이브리도마 chKS-1/4 생성 클론으로부터의 조건화 배지를 동일한 방식으로 처리하고 동시에 분석하였다. ELISA 결과를 표 3 에 요약하였다.

항체	huFc ELISA	카파 ELISA
하이브리도마 chKS-1/4	42 ㎍/mL	44 ㎍/mL
US 4,975,369 chKS-1/4-클론 1	253 ng/mL	0 ng/mL
US 4,975,369 chKS-1/4-클론 2	313 ng/mL	0 ng/mL

상기 결과는 검출가능한 카파 경쇄가 US 4,975,369 chKS-1/4 중쇄와 연합되지 않았음을 나타내었다. 또한, 하이브리도마 chKS-1/4 항체는 KS 항원에 10-20 ng/mL 에서 결합하는 반면, 두 클론으로부터 253 및 313 ng/mL 로 농축된 US 4,975,369 항체는 여전히 KS 항원에 결합하지 않음을 나타내었다 (KS 항원에 대한 결합의 측정에 대해서는 실시예 9 참고)

실시예 4. 변이형 KS 항체의 발현 및 특징분석

표적 분자에 대한 항체의 발현 또는 친화도를 현저히 감소시키는 돌연변이는 인간에서의 치료적 목적을 위해 덜 효과적일 것으로 기대된다. 면역원성을 감소시키기 위한 일부 접근법, 예컨대 "피복", "인간화" 및 "탈면역화" 에는 여러 아미노산 치환의 도입이 관여되며, 항원에 대한 항체의 결합을 손상시킬 수 있다 (예컨대, U.S. 특허 제 5,639,641 호; 및 제 5,585,089 호; 및 PCT 공개 번호 WO 98/52976; WO 00/34317 참고). 상피 세포 접착 분자에 결합할 것이지만, 상기 항원을 인식하는 본래 마우스 모노클로날 항체와는 구별되는 항체 서열군들이 당분야에서 요구되고 있다.

KS-1/4 중쇄 및 경쇄 가변 ("V") 영역의 다양한 조합이 이들의 발현되는 능 력 및 이들의 EpCAM 에 대한 결합능에 대해 시험되었다. 상기 결과를 표 4-6 에 요약하고 하기에 나타내었다.

상기 서열들은 하기와 같이 관련되었다. 실시예들에 나타낸 바와 같이, VH0 및 VK0 서열은 본래 마우스-유래 KS-1/4 를 발현하는 하이브리도마 세포주로부터의 PCR 증폭에서 유래되었다 (서열 번호 1 및 서열 번호 2). VH-'369 는 U.S. 특허 제 4,975,369 호에 개시된 VH 서열이다. 서열 VH1, VH2, VH2.1-2.4, VK1, 및 VK2 는 MHC 클래스 II 분자에 대한 펩티드 에피토프의 결합을 감소시키는 돌연변이의 도입에 의해, 또는 비인간 T 세포 에피토프를 인간 항체에 존재하는 인간 자가 에피토프에 대응하도록 변화시킴으로써 잠재적 T 세포 에피토프가 제거되거나 약화되는 탈면역화 기술을 이용하여 유도되었다. 상기 구축물의 고안은 하기에 추가로 설명 및 분석되었다. 표 6 의 구축물은 대응 중쇄 및 경쇄 V 영역을 발현하는 핵산의 조합으로 포유류 세포를 트랜스펙션시켜 생성되었다. 서열 VH6, VH7, VK6, VK7, 및 VK8 은 잠재적 인간 B 세포 에피토프를 제거하기 위한 목적으로, 하이브리도마 KS-1/4 의 표면 잔기를 하기에 설명되는 인간 대응부로 변화시켜 생성되었다. 구축물 1 내지 3 은 하기 및 표 4 에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 V 영역 VH6, VH7, VK6, VK7, 및 VK8 을 발현하는 핵산의 조합으로 포유류 세포를 트랜스펙션시켜 생성되었다.

4A. 더 적은 인간 T 세포 에피토프를 갖는 KS 항체의 특징분석

서열 VH2.1-VH2.5 를 제조하여, KS-1/4 중쇄 CDR3 의 영역 내 특정 아미노산 삽입 및 치환이 관용될 수 있는지 여부를 시험하였다. 경쇄 및 중쇄 조합 VKO/VH1, VK1/VH7, VK1/VH1, VK1/VH2, VK1/VH1-IL2, VK1/VH2-IL2, 및 VK1/VH2.5-IL2 에 대한 발현 벡터를 구축하고, 선행 실시예에 기재된 방법에 따라 대응 항체 및 항체-IL2 융합 단백질을 발현 및 시험하였다.

구체적으로, 서열 VH1, VH2, VK1, 및 VK2 를 완전 화학적 합성에 의해 수득하였다. 각각의 상기 서열에 대해, 상기 영역의 전체 코딩 및 상보 사슬에 걸친 일련의 겹치는 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하고, 인산화시켜 결찰하였다. 이어서, 결찰된 2 중체 분자를 단편 말단에 대해 적절한 프라이머로 PCR 증폭하여, pCRII 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 도입하고 서열을 확인하였다. 이어서, 상기 DNA 단편을 적절한 부위에서 발현 벡터 pdHL7 내로 도입하여, 완전한 중쇄 ("H") 및 경쇄 ("L") 를 각각 생성시켰다.

서열 VH2.5 는 표준 분자 생물학 기법을 이용하여, 위치 108 에서 Gln 이 아닌 Thr 을 얻도록 하는 단일 코돈 개질에 의해 VH2 에서 유래되었다 (Table 4).

항체를 ELISA (Table 6) 및 표면 플라스몬 공명 (Biacore 기계 및 소프트웨어) 을 이용하여 시험하고, EpCAM 에 결합하는 이들의 능력에 대해 비교하였다. ELISA 실험의 결과는 주로 오프-속도 (온-속도는 아님) 를 반영하며 일반적으로 덜 정확한 것으로 간주되었고, 상기의 열등한 ELISA 결과는 일반적으로 추가 고려로부터 특정 구축물을 배제하는데 사용되었다. 그러나, ELISA 시험에서 우수한 결합을 나타내는 항체는 추가로 특징분석될 필요가 있었다.

표면 플라스몬 공명 분석의 결과는 하기와 같았다:

융합 단백질	k_on (M^-1 s^-1)	k_off (s^-1)	K_D (M)
VK8/VH7-IL2	3.1 ×10⁵	3.2 ×10^-4	1.0 ×10^-9
VK1/VH2-IL2	1.7 ×10⁵	5.3 ×10^-4	3.1 ×10^-9
VK1/VH1-IL2	2.8 ×10⁵	2.2 ×10^-3	7.9 ×10^-9

VK1/VH1-IL2 의 오프-속도가 VK1/V2-IL2 또는 VK8/VH7-IL2 보다 훨씬 더 빠르므로, VK1/VH1-IL2 는 덜 유용한 융합 단백질로 간주되었다.

VK1/VH1-IL2 및 VK1/VH1-IL2 가 CDR3 내 V_H 위치 100 에서 메티오닌/이소류신만이 다르다는 것을 고려하면, VK1/VH2-IL2 에 비해 증강된 VK1/VH1-IL2 의 오프-속도는 상기 위치가 EpCAM 과의 소수성 접촉을 만들고, 약간 더 긴 메티오닌 측쇄가 덜 효과적인 접촉을 만든다는 것을 시사하였다. 단백질-단백질 상호작용 분야에 있어서, 소수성 상호작용은 오프-속도의 결정에 주요한 역할을 하지만, 온-속도의 결정에는 덜 중요한 역할을 한다고 일반적으로 여겨진다.

4B. 단일 아미노산 삽입을 갖는 KS-1/4 변이형의 특징분석

EpCAM 에 대한 KS 항체의 친화도를 위한 중쇄 V 영역 내 CDR3 서열의 중요성을 상기 영역 내에 아미노산 삽입 또는 치환을 포함하는 일련의 변이형으로 결정하였다. 서열 VH2.1, VH2.2, VH2.3, 및 VH2.4 는 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 VH2 및 VK1 을 코딩하는 발현 벡터의 조작으로 생성시켰다. 생성 발현 벡터를 NS/0 세포 내로 트랜스펙션시키고, 선행 실시예에 기재된 바와 같이 분비된 항체 단백질을 정제하였다.

VH1 변이형이 VH2 변이형에 비해 차선인 것으로 나타나서, CDR3 내 이소류신이 메티오닌으로 치환될 수 없는 것으로 나타났다. 다음 목표는 CDR3 내 아미노산의 삽입으로 VH1 보다 나은 결합 특징을 갖는 KS-1/4 중쇄 V 영역이 얻어질 수 있는지 여부를 시험하는 것이었다. 표 6 의 데이타는 VK1/VH2.1, VK1/VH2.2, VK1/VH2.3, 및 VK1/VH2.4 와 VK1/VH1 의 결합을 비교하였다. KS-1/4 V_H CDR3 에 아미노산 삽입을 갖는 구축물은 VH1 에 비해 개선된 항원 결합을 나타내지 않았고, 삽입 돌연변이의 항원 결합 활성은 약간 감소되거나 현저히 감소된 것으로 나타났다.

상기 결과는, CDR3 내 아미노산의 삽입이 KS-1/4 중쇄 V 영역의 항원 결합 활성에 일반적으로 해롭다는 것을 나타내었다. 상기 데이타가 분석되는 경우, 몇몇 일반적 결론이 도출된다. 구체적으로, 아미노산 Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg-Phe-Ile-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln 으로 이루어진 위치 84 내지 108 의 KS-1/4 V_H 아미노산 절편은 KS-1/4 항원 결합을 위해 중요하였다. 상기 절편에는 일반적으로 단일 및 다중 아미노산 치환에 관용적이지만, 발현 및 조합에 해로운 효과를 가질 수 있는 아미노산 삽입에는 관용적이지 않은, 골격 절편인 Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg 이 포함된다. 또한, 데이타는 아미노산 위치 86, 91, 93, 94, 및 95 에 있어서, 효율적으로 발현되고 EpCAM 에 결합하는 항체를 위해 소수성 아미노산을 갖는 것이 바람직함을 나타낸다.

Phe-Ile-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr 으로 이루어진 V_H CDR3 절편 내 아미노산의 삽입은, 일부 삽입이 단지 약간의 활성 손실과 함께 관용될 수 있기는 하지만, 일반적으로 KS-1/4 항체의 EpCAM 항원 결합 기능에 해롭다. 유사하게, 일부 삽입이 단지 약간의 활성 손실과 함께 관용될 수 있기는 하지만, 상기 위치의 치환도 또한 일반적으로 EpCAM 항원의 결합에 해롭다.

4C. 이들의 인간 대응부로 전환된 마우스 표면 잔기를 갖는 KS-1/4 항체의 활성 유도체 구축

마우스-유래 V 영역의 면역원성을 최소화하기 위해, 인간 항체에서 일반적으로 발견되는 아미노산으로 KS-1/4 항체 내 아미노산을 치환하여 항체를 제조하였다. 바람직한 KS 유도체는 또한 인간 EpCAM 에 대한 특이적 결합 친화도를 보 유하였다.

구축물 1. KS-1/4 경쇄는 인간 공통 서브그룹 III 에 가장 가깝고, 중쇄는 서브그룹 I 에 가장 가까운 것으로 나타났다. 상기 유사성에 근거하여, 인간 공통 서브그룹 아미노산 및 KS-1/4-유래 CDR 및 비공통 아미노산으로 이루어진 가상 서열을 만들었다. 상기 및 하기 구축물에 대해, Silicon Graphics Workstation 및 BioSym 분자 모델링 소프트웨어를 이용하여 3 차원 모델을 만들었다.

3 차원 모델의 조사에서, 특정 인간 유래 아미노산이 CDR 에 가깝고, 이들의 배좌에 영향을 줄 수 있는 것으로 나타났다. 상기 분석에 근거하여, 경쇄에서, 인간 Ser22, Arg44, 및 Phe66 을 각각 Thr, Lys, 및 Tyr 로 변화시켰다. 중쇄에서, 상기 변화는 불필요하다고 여겨졌다. 구축물 1 을 위한 최종 고안에 있어서, 경쇄는 마우스 경쇄에서는 나타나지 않는 18 개 인간 아미노산을 가졌고, 중쇄는 마우스 중쇄에서는 나타나지 않는 22 개 인간 아미노산을 가졌다.

구축물 1 의 발현을 위한 DNA 를 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 만들었다. 구축물 1 단백질은 효율적으로 발현되었지만, EpCAM 결합 분석에서 10 배 덜 활성인 것으로 나타났다.

구축물 2. 단지 하기 변화만을 도입하여, 덜 적극적인 접근법을 취했다:

경쇄: K18R, A79P

중쇄 : P9A, L11V, A76T, N88S, M91T

구축물 2 의 발현을 위한 DNA 를 합성 올리고뉴클레오티드 및 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 만들었다. 구축물 2 단백질은 효율적으로 발현되지 않았다. 구축물 2 중쇄 및 마우스 KS-1/4 경쇄의 조합은 효율적으로 발현되는 반면, 구축물 2 경쇄 및 마우스 KS-1/4 중쇄의 조합은 효율적으로 발현되지 않는 것이 추가로 발견되었다. 따라서, 발현 결함은 구축물 2 의 경쇄에 있는 것으로 나타났다.

구축물 3. 구축물 2 경쇄의 현저한 발현 결함에 근거하여, 구축물 1 경쇄의 N-말단부와 마우스 경쇄의 C-말단부를 융합하여 새로운 경쇄를 구축하였다. 위치 35 및 36 에서 아미노산을 코딩하는 KpnI 부위를 이용하였다. 상기 경쇄를 구축물 2 중쇄와 조합하는 경우, 효율적인 발현이 관찰되었고, 유의미한 결합 손실은 관찰되지 않았다.

구축물 3 을 구축물 1 또는 2 와 비교하는 경우, 항원에 대한 친화도 및 단백질 발현의 관점에서 더 우수한 특성을 갖는 항체가 얻어지므로, 구축물 3 의 DNA 서열 을 pdHL7s-IL2 내로 삽입하여, 서열 번호 40 에 개시된 pdHL7s-VK8/VH7-IL2 를 얻었다. 발현 목적을 위해, 상기 플라스미드 DNA 를 마우스 골수종 세포 NS/0 내로 전기천공하여 실시예 1A 에 기재된 바와 같이 안정적으로 트랜스펙션된 세포주를 얻었다. 이어서, 안정한 클론으로부터 취한 배양 배지를 실시예 1B 에 기재된 바와 같이, 인간 Fc 가 코팅된 ELISA 에서 항체 발현에 대해 분석하였다. 상기 항체 융합 단백질에 대한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 각각 서열 번호 41 및 서열 번호 42 에 나타낸다.

또한, PC-3 종양 세포의 표면 상에 발현되는 EpCAM 에 대한 요오드화 VK8/VH7 및 VK8/VH7-IL2 의 결합을 실시예 1F 에 기재된 방법을 이용하여, 요오드화 VKO/VHO-IL2 의 결합과 비교하였다. 실험 오차 내에서, VK8/VH7 및 VKO/VHO 에 대해, 및 VK8/VH7-lL2 및 VKO/VHO-IL2 에 대해 본질적으로 동일한 결합 친화도가 관찰되었다.

4D. 활성 KS-1/4 항체의 구축에 유용한 구조-기능 상관관계

함께 고려하면, 개시된 V 영역 서열을 갖는 KS-1/4 항체 및 융합 단백질의 항원 결합 활성은 KS-1/4 항체의 적절한 발현 및 분비 뿐만 아니라, EpCAM 에 대한 KS-1/4 항체의 서열 고안에 지침을 제공한다. 특히, KS-1/4 중쇄 및 경쇄 V 영역은 다중 아미노산 치환을 관용하고 활성을 보유할 수 있는데, 단 상기 아미노산 치환은 CDR 밖에 있다. KS-1/4 중쇄 및 경쇄 V 영역은 일반적으로, 특히 CDR 또는 CDR 사이의 골격부 내의 아미노산 삽입을 관용하지 않는 것으로 나타난다.

예를 들어, 하이브리도마 KS-1/4 서열을 출발점인 "야생형" 서열로 잡는 경우, 데이타는 중쇄 V 영역이 위치 9, 11, 16, 17, 38, 40, 69, 70, 71, 72, 76, 79, 80, 83, 88, 91 및 111 에서 활성 손실이 없거나 매우 적고, 아미노산 치환을 관용할 수 있음을 나타낸다. 유사하게는, 경쇄는 위치 1, 3, 10, 11, 12, 13, 17, 18, 19, 21, 41, 42, 59, 71, 73, 75, 77, 및 103 에서 활성 손실이 없거나 매우 적고, 아미노산 치환을 관용할 수 있다. 상기 변화는 KS-1/4 중쇄 및 경쇄 V 영역의 CDR 밖에 있다. 17 개의 명확히 허용가능한 중쇄 아미노산 치환은 약 21% 의 CDR 밖의 아미노산 위치를 나타내며, 약 68% 의 CDR 밖의 아미노산 위치에서 아미노산 치환이 시도되었다. 유사하게는, 18 개의 명확히 허용가능한 경쇄 아미노산 치환은 약 23% 의 CDR 밖의 아미노산 위치를 나타내며, 약 72% 의 CDR 밖의 아미노산 위치에서 아미노산 치환이 시도되었다. 유의미하게 덜 유용한 단백질을 만들어내는 CDR 밖의 아미노산 치환의 예는 단지 2 개 뿐이었다: 발현에 부정적 효과를 갖는 것으로 나타난 경쇄에서의 치환 Ala79Pro; 및 항원 결합에 부정적 효과를 갖는 것으로 나타난 중쇄에서의 치환 Q108T. 따라서, 아미노산 치환은 CDR 밖의 KS-1/4 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 내로 도입될 수 있고, 치환이 활성 단백질을 만들어낼 가능성이 높다.

CDR 에서의 아미노산 치환이 관여되는 돌연변이는 종종 항원 결합에 부정적 영향을 갖는다. 예를 들어, 중쇄에서의 치환 I100M 은 결합을 약 8 배 감소시킨다. 아미노산의 삽입이 관여되는 돌연변이는 일반적으로 KS-1/4 서열의 유용성에 부정적 영향을 갖는다. 예를 들어, VH-'369 중쇄 V 영역은 본원에 기재된 바와 같이 경쇄와 함께 적절한 항체로 조합될 수 없다. VH2.1 내지 2.4 돌연변이는 중쇄 V 영역의 CDR3 내 아미노산 삽입을 가지며, 각각의 상기 돌연변이는 항원 결합에 부정적 영향을 갖는다.

실시예 5. 인간에서 KS 항체 (구축물 3)-IL2 융합 단백질의 면역원성

인간 임상 시험에 있어서, 22 명의 환자가 하나 이상의 처치 요법을 받았고, 각각의 처치 요법은 KS 항체 (구축물 3)-IL2 의 3 회의 연속적인 1 일 4 시간 정맥내 주입을 포함하였다. 각각의 처치 요법은 1 달 간격으로 분리되었다 (Weber 등, (2001). Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 20: 259a.). 혈청 표본을 각각의 처치 요법 전후에 각 환자로부터 얻고, 전체 KS 항체 (구축물 3)-IL2 분자 또는 Fc-IL2 성분 (Fv 영역 없음) 에 대한 항체 반응성에 대해 시험하였다. 접종 전 혈청 중 어디에서도 반응성이 관찰되지 않았다. 상기 결과는 4 명의 환자만이 Fv 영역 단독, 또는 Fv 영역 및 Fc-IL2 성분 둘 다에 대해 임의의 유의미한 면역 반응을 경험함을 나타내었다. 또한, 상기 반응은 huKS-IL2 에 대한 후속 노출시 상승하지 않는 것으로 나타났다.

인터류킨-2 부분이 보강 효과를 가지므로, 항체-IL2 융합 단백질의 이용에는 V 영역의 면역원성에 대한 특히 엄격한 시험이 포함되는 것으로 여겨진다. 따라서, 상기 결과는 KS 항체 (구축물 3) 가 단지 소수의 수여자만이 KS 항체 (구축물 3)-IL2 융합 단백질에 대한 항체 반응을 뚜렷이 나타내며, 인간에게 투여될 수 있음을 나타내었다. 상기 결과는 특히 KS 항체 (구축물 3) 가 기원이 거의 모두 쥐과이고 대응 인간 아미노산 잔기로 치환된 소수의 아미노산 잔기만을 갖는 가변부를 포함한다는 점에서 매우 고무적이다.

동등물

본 발명은 그 요지 또는 본질적 특징을 벗어나지 않고 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 구현예는 본원에 기재된 본 발명을 제한하는 것이 아니라 모든 측면에서 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 즉 본 발명의 범위는 상기 기술이 아닌 첨부되는 청구범위에 의해 제시되며, 청구범위의 동등성 범위 및 의미 내에 속하는 모든 변화가 본원에 포함되는 것으로 의도된다.

참고문헌 도입

본원에 개시된 각각의 특허 문헌 및 과학 출판물의 개시는 그 전문이 본 출 원에 참고문헌으로서 도입된다.

<110> Lexigen Pharmaceuticals Corp. <120> Recombinant Tumor Specific Antibody And Use Thereof <130> LEX-019PC <150> US 60/288,564 <151> 2001-05-03 <160> 42 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KS VK mouse <400> 1 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KS VH mouse <400> 2 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable light chain sequence in the EpCAM antibody <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> wherein Xaa at position 1 is a glutamic acid <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> wherein Xaa at position 3 is a valine <220> <221> UNSURE <222> (10) <223> wherein Xaa at position 10 is a threonine or a serine <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> wherein Xaa at position 11 is a leucine <220> <221> UNSURE <222> (12) <223> wherein Xaa at position 12 is an alanine <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> wherein Xaa at position 13 is a leucine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (17) <223> wherein Xaa at position 17 is a glutamine <220> <221> UNSURE <222> (18) <223> wherein Xaa at position 18 is an arginine <220> <221> UNSURE <222> (19) <223> wherein Xaa at position 19 is an alanine <220> <221> UNSURE <222> (21) <223> wherein Xaa at position 21 is a leucine or an isoleucine <220> <221> UNSURE <222> (32) <223> wherein Xaa at position 32 is an isoleucine <220> <221> UNSURE <222> (36) <223> wherein Xaa at position 36 is a leucine <220> <221> UNSURE <222> (41) <223> wherein Xaa at position 41 is a glutamine <220> <221> UNSURE <222> (42) <223> wherein Xaa at position 42 isan alanine or a proline <220> <221> UNSURE <222> (45) <223> wherein Xaa at position 45 is a leucine <220> <221> UNSURE <222> (46) <223> wherein Xaa at position 46 is a leucine <220> <221> UNSURE <222> (48) <223> wherein Xaa at position 48 is a tyrosine <220> <221> UNSURE <222> (57) <223> wherein Xaa at position 57 is an isoleucine <220> <221> UNSURE <222> (59) <223> wherein Xaa at position 59 is a serine <220> <221> UNSURE <222> (69) <223> wherein Xaa at position 69 is an aspartic acid or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (71) <223> wherein Xaa at position 71 is a threonine <220> <221> UNSURE <222> (73) <223> wherein Xaa at position 73 is a threonine <220> <221> UNSURE <222> (75) <223> wherein Xaa at position 75 is an asparagine <220> <221> UNSURE <222> (77) <223> wherein Xaa at position 77 is a leucine <220> <221> UNSURE <222> (79) <223> wherein Xaa at position 79 is a proline <220> <221> UNSURE <222> (82) <223> wherein Xaa at position 82 is a phenylalanine <220> <221> UNSURE <222> (84) <223> wherein Xaa at position 84 is a valine <220> <221> UNSURE <222> (103) <223> wherein Xaa at position 103 is a valine <400> 3 Xaa Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Pro Gly 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Thr Xaa 20 25 30 Leu Trp Tyr Xaa Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Xaa Xaa Ile Xaa 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Xaa Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Xaa Tyr Xaa Leu Xaa Ile Xaa Ser Xaa Glu Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 100 105 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain sequence in the EpCAM antibody <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> wherein Xaa at position 2 is an isoleucine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> wherein Xaa at position 9 is a proline or an alanine <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> wherein Xaa at position 11 is a leucine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (16) <223> wherein Xaa at position 16 is a glutamic acid or a serine <220> <221> UNSURE <222> (17) <223> wherein Xaa at position 17 is a threonine or a serine <220> <221> UNSURE <222> (38) <223> wherein Xaa at position 38 is a lysine or an arginine <220> <221> UNSURE <222> (40) <223> wherein Xaa at position 40 is a threonine or an alanine <220> <221> UNSURE <222> (43) <223> wherein Xaa at position 43 is a lysine or a glutamine <220> <221> UNSURE <222> (46) <223> wherein Xaa at position 46 is a lysine or a glutamic acid <220> <221> UNSURE <222> (63) <223> wherein Xaa at position 63 is an aspartic acid or a lysine <220> <221> UNSURE <222> (65) <223> wherein Xaa at position 65 is a lysine or a glutamine <220> <221> UNSURE <222> (68) <223> wherein Xaa at position 68 is a phenylalanine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (69) <223> wherein Xaa at position 69 is an alanine, a threonine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (70) <223> wherein Xaa at position 70 is a phenylalanine or an isoleucine <220> <221> UNSURE <222> (71) <223> wherein Xaa at position 71 is a serine or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (72) <223> wherein Xaa at position 72 is a leucine or an alanine <220> <221> UNSURE <222> (73) <223> wherein Xaa at position 73 is a glutamic acid or an aspartic acid <220> <221> UNSURE <222> (76) <223> wherein Xaa at position 76 is an alanine or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (79) <223> wherein Xaa at position 79 is an alanine or a leucine <220> <221> UNSURE <222> (80) <223> wherein Xaa at position 80 is a phenylalanine or a tyrosine <220> <221> UNSURE <222> (83) <223> wherein Xaa at position 83 is an isoleucine or a leucine <220> <221> UNSURE <222> (84) <223> wherein Xaa at position 84 is an asparagine or a serine <220> <221> UNSURE <222> (85) <223> wherein Xaa at position 85 is an asparagine or a serine <220> <221> UNSURE <222> (88) <223> wherein Xaa at position 88 is an asparagine, an alanine or a serine <220> <221> UNSURE <222> (91) <223> wherein Xaa at position 91 is a methionine or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (93) <223> wherein Xaa at position 93 is a threonine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (100) <223> wherein Xaa at position 100 is an isoleucine or a methionine <220> <221> UNSURE <222> (108) <223> wherein Xaa at position 108 is a glutamine or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (111) <223> wherein Xaa at position 111 is a serine or a threonine <400> 4 Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Lys Lys Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Xaa Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Gly Xaa Gly Leu Xaa Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Xaa Phe 50 55 60 Xaa Gly Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Ser Xaa Ser Thr Xaa Xaa 65 70 75 80 Leu Gln Xaa Xaa Xaa Leu Arg Xaa Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Phe Xaa Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Xaa Gly Thr Xaa Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light sequence consensus <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> wherein xaa at position 1 is a glutamine or a glutamic acid <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> wherein Xaa at position 3 is a leucine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (10) <223> wherein Xaa at position 10 is an isoleucine or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> wherein Xaa at position 11 is a methionine or a leucine <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> wherein Xaa at position 13 is an alanine or a leucine <220> <221> UNSURE <222> (18) <223> wherein Xaa at position 18 is a lysine or an arginine <220> <221> UNSURE <222> (21) <223> wherein Xaa at position 21 is a methionine or a leucine <220> <221> UNSURE <222> (41) <223> wherein Xaa at position 41 is a serine or a glutamine <220> <221> UNSURE <222> (42) <223> wherein Xaa at position 42 is a serine or an alanine <220> <221> UNSURE <222> (45) <223> wherein Xaa at position 45 is a proline or a leucine <220> <221> UNSURE <222> (46) <223> wherein Xaa at position 46 is a tryptophan or a leucine <220> <221> UNSURE <222> (57) <223> wherein Xaa at position 57 is a phenylalanine or an isoleucine <220> <221> UNSURE <222> (69) <223> wherein Xaa at position 69 is a serine or an aspartic acid <220> <221> UNSURE <222> (71) <223> wherein Xaa at position 71 is a serine or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (73) <223> wherein Xaa at position 73 is an isoleucine or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (77) <223> wherein Xaa at position 77 is a methionine or a leucine <220> <221> UNSURE <222> (79) <223> wherein Xaa at position 79 is an alanine or a proline <220> <221> UNSURE <222> (82) <223> wherein Xaa at position 82 is an alanine or a phenylalanine <220> <221> UNSURE <222> (84) <223> wherein Xaa at position 84 is a threonine or a valine <400> 5 Xaa Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Ala Xaa Xaa Ser Xaa Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Xaa Val Thr Xaa Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Thr Met 20 25 30 Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Xaa Xaa Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Xaa Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Xaa Tyr Xaa Leu Xaa Ile Ser Ser Xaa Glu Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy sequence consensus <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> wherein Xaa at position 2 is an isoleucine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> wherein Xaa at position 9 is a proline or an alanine <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> wherein Xaa at position 11 is a leucine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (17) <223> wherein Xaa at position 17 is a threonine or a serine <220> <221> UNSURE <222> (38) <223> wherein Xaa at position 38 is a lysine or an arginine <220> <221> UNSURE <222> (40) <223> wherein Xaa at position 40 is a threonine or an alanine <220> <221> UNSURE <222> (46) <223> wherein Xaa at position 46 is a lysine or a glutamic acid <220> <221> UNSURE <222> (63) <223> wherein Xaa at position 63 is an aspartic acid or a lysine <220> <221> UNSURE <222> (65) <223> wherein Xaa at position 65 is a lysine or a glutamine <220> <221> UNSURE <222> (68) <223> wherein Xaa at position 68 is a phenylalanine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (69) <223> wherein Xaa at position 69 is an alanine or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (70) <223> wherein Xaa at position 70 is a phenylalanine or an isoleucine <220> <221> UNSURE <222> (73) <223> wherein Xaa at position 73 is a glutamic acid or an aspartic acid <220> <221> UNSURE <222> (76) <223> wherein Xaa at position 76 is an alanine or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (80) <223> wherein Xaa at position 80 is a phenylalanine or a tyrosine <220> <221> UNSURE <222> (83) <223> wherein Xaa at position 83 is an isoleucine or a leucine <220> <221> UNSURE <222> (84) <223> wherein Xaa at position 84 is an asparagine or a serine <220> <221> UNSURE <222> (85) <223> wherein Xaa at position 85 is an asparagine or a serine <220> <221> UNSURE <222> (88) <223> wherein Xaa at position 88 is an asparagine, an alanine or a serine <220> <221> UNSURE <222> (91) <223> wherein Xaa at position 91 is a methionine or a threonine <220> <221> UNSURE <222> (93) <223> wherein Xaa at position 93 is a threonine or a valine <220> <221> UNSURE <222> (108) <223> wherein Xaa at position 108 is a glutamine or a threonine <400> 6 Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Xaa Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Xaa Phe 50 55 60 Xaa Gly Arg Xaa Xaa Xaa Ser Leu Xaa Thr Ser Xaa Ser Thr Ala Xaa 65 70 75 80 Leu Gln Xaa Xaa Xaa Leu Arg Xaa Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Xaa Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vk6 light chain <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VK7 light chain <400> 8 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VK8 light chain <400> 9 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Thr 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KS de-immunized VK1 <400> 11 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Pro Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 12 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KS de-immunized VK2 <400> 12 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Pro Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser 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antisense primer <400> 28 ctcgagttat gcattgagtt ccct 24 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker-adapter <400> 29 aattctcaat gcagggc 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker-adapter <400> 30 gagttacgtc ccgaatt 17 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH forward primer <400> 31 gactcgagcc caagtcttag acatc 25 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH reverse primer <400> 32 caagcttacc tgaggagacg gtgactgacg ttc 33 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK forward primer <400> 33 gatctagaca agatggattt tcaagtg 27 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK reverse primer <400> 34 gaagatctta cgttttattt ccagcttgg 29 <210> 35 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH369 heavy chain <400> 35 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 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cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 660 cagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagaccctct 720 agaatgaagt tgcctgttag gctgttggtg ctgatgttct ggattcctgg tgaggagaga 780 gggaagtgag ggaggagaat ggacagggag caggagcact gaatcccatt gctcattcca 840 tgtatctggc atgggtgaga agatgggtct tatcctccag catggggcct ctggggtgaa 900 tacttgttag agggaggttc cagatgggaa catgtgctat aatgaagatt atgaaatgga 960 tgcctgggat ggtctaagta atgccttaga agtgactaga cacttgcaat tcactttttt 1020 tggtaagaag agatttttag gctataaaaa aatgttatgt aaaaataaac gatcacagtt 1080 gaaataaaaa aaaaatataa ggatgttcat gaattttgtg tataactatg tatttctctc 1140 tcattgtttc agcttcctta agcgagatcg tgctgaccca gtcccccgcc accctgtccc 1200 tgtcccccgg cgagcgcgtg accctgacct gctccgcctc ctcctccgtg tcctacatgc 1260 tgtggtacca gcagaagcca ggatcctcgc ccaaaccctg gatttttgac acatccaacc 1320 tggcttctgg attccctgct cgcttcagtg gcagtgggtc tgggacctct tactctctca 1380 taatcagcag catggaggct gaagatgctg ccacttatta ctgccatcag cggagtggtt 1440 acccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa acgtaagatc ccgcaattct 1500 aaactctgag ggggtcggat gacgtggcca ttctttgcct aaagcattga gtttactgca 1560 aggtcagaaa agcatgcaaa gccctcagaa tggctgcaaa gagctccaac aaaacaattt 1620 agaactttat taaggaatag ggggaagcta ggaagaaact caaaacatca agattttaaa 1680 tacgcttctt ggtctccttg ctataattat ctgggataag catgctgttt tctgtctgtc 1740 cctaacatgc cctgtgatta tccgcaaaca acacacccaa gggcagaact ttgttactta 1800 aacaccatcc tgtttgcttc tttcctcagg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt 1860 cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 1920 cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa 1980 ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac 2040 cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca 2100 tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt agagggagaa 2160 gtgcccccac ctgctcctca gttccagcct gaccccctcc catcctttgg cctctgaccc 2220 tttttccaca ggggacctac ccctattgcg gtcctccagc tcatctttca cctcaccccc 2280 ctcctcctcc ttggctttaa ttatgctaat gttggaggag aatgaataaa taaagtgaat 2340 ctttgcacct gtggtttctc tctttcctca atttaataat tattatctgt tgtttaccaa 2400 ctactcaatt tctcttataa gggactaaat atgtagtcat cctaaggcgc ataaccattt 2460 ataaaaatca tccttcattc tattttaccc tatcatcctc tgcaagacag tcctccctca 2520 aacccacaag ccttctgtcc tcacagtccc ctgggccatg gtaggagaga cttgcttcct 2580 tgttttcccc tcctcagcaa gccctcatag tcctttttaa gggtgacagg tcttacggtc 2640 atatatcctt tgattcaatt ccctgggaat caaccaaggc aaatttttca aaagaagaaa 2700 cctgctataa agagaatcat tcattgcaac atgatataaa ataacaacac aataaaagca 2760 attaaataaa caaacaatag ggaaatgttt aagttcatca tggtacttag acttaatgga 2820 atgtcatgcc ttatttacat ttttaaacag gtactgaggg actcctgtct gccaagggcc 2880 gtattgagta ctttccacaa cctaatttaa tccacactat actgtgagat taaaaacatt 2940 cattaaaatg ttgcaaaggt tctataaagc tgagagacaa atatattcta taactcagca 3000 atcccacttc tagggtcgac gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 3060 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 3120 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 3180 tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 3240 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 3300 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 3360 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 3420 gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 3480 tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 3540 caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 3600 cagagctctc tggctaacta cagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac 3660 tcactatagg gagacccaag ctcctcgagg ctagaatgaa gttgcctgtt aggctgttgg 3720 tgctgatgtt ctggattcct ggtgaggaga gagggaagtg agggaggaga atggacaggg 3780 agcaggagca ctgaatccca ttgctcattc catgtatctg gcatgggtga gaagatgggt 3840 cttatcctcc agcatggggc ctctggggtg aatacttgtt agagggaggt tccagatggg 3900 aacatgtgct ataatgaaga ttatgaaatg gatgcctggg atggtctaag taatgcctta 3960 gaagtgacta gacacttgca attcactttt tttggtaaga agagattttt aggctataaa 4020 aaaatgttat gtaaaaataa acgatcacag ttgaaataaa aaaaaaatat aaggatgttc 4080 atgaattttg tgtataacta tgtatttctc tctcattgtt tcagcttcct taagccagat 4140 ccagttggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctgga gagacagtca agatctcctg 4200 caaggcttct gggtatacct tcacaaacta tggaatgaac tgggtgaagc agactccagg 4260 aaagggttta aagtggatgg gctggataaa cacctacact ggagaaccaa catatgctga 4320 tgacttcaag ggacggtttg ccttctcttt ggaaacctct accagcactg cctttttgca 4380 gatcaacaat ctcagaagtg aggacacggc tacatatttc tgtgtaagat ttatttctaa 4440 gggggactac tggggtcaag gaacgtcagt caccgtctcc tcaggtaagc tttctggggc 4500 aggccaggcc tgaccttggc tttggggcag ggagggggct aaggtgaggc aggtggcgcc 4560 agccaggtgc acacccaatg cccatgagcc cagacactgg acgctgaacc tcgcggacag 4620 ttaagaaccc aggggcctct gcgccctggg cccagctctg tcccacaccg cggtcacatg 4680 gcaccacctc tcttgcagcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct 4740 ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg 4800 aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg 4860 ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca 4920 gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg 4980 acaagagagt tggtgagagg ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc 5040 agcgctcctg cctggacgca tcccggctat gcagtcccag tccagggcag caaggcaggc 5100 cccgtctgcc tcttcacccg gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggtc 5160 ttctggcttt ttccccaggc tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa cccaggccct 5220 gcacacaaag gggcaggtgc tgggctcaga cctgccaaga gccatatccg ggaggaccct 5280 gcccctgacc taagcccacc ccaaaggcca aactctccac tccctcagct cggacacctt 5340 ctctcctccc agattccagt aactcccaat cttctctctg cagagcccaa atcttgtgac 5400 aaaactcaca catgcccacc gtgcccaggt aagccagccc aggcctcgcc ctccagctca 5460 aggcgggaca ggtgccctag agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga 5520 cacgtccacc tccatctctt cctcagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct 5580 cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt 5640 ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt 5700 ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt 5760 ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa 5820 ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg 5880 gacccgtggg gtgcgagggc cacatggaca gaggccggct cggcccaccc tctgccctga 5940 gagtgaccgc tgtaccaacc tctgtcccta cagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca 6000 ccctgccccc atcacgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca 6060 aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca 6120 actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc 6180 tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg 6240 aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtccccgggt aaagccccaa 6300 cttcaagttc tacaaagaaa acacagctgc aactggagca tctcctgctg gatctccaga 6360 tgattctgaa tggaattaac aactacaaga atcccaaact caccaggatg ctcacattca 6420 agttctacat gcccaagaag gccacagagc tcaaacatct ccagtgtcta gaggaggaac 6480 tcaaacctct ggaggaagtg ctaaacctcg ctcagagcaa aaacttccac ttaagaccta 6540 gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatcc gaaacaacat 6600 tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga attcctaaac agatggatta 6660 ccttttgtca aagcatcatc tcaacactaa cttgataatt aagtgctcga gggatccaga 6720 catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg 6780 ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattagaa gctgcaataa 6840 acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga 6900 ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtatg gctgattatg atcctgcctc 6960 gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 7020 gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 7080 ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 7140 ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac 7200 cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 7260 actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 7320 tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 7380 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 7440 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 7500 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 7560 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct 7620 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 7680 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 7740 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 7800 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 7860 ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 7920 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 7980 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 8040 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 8100 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 8160 agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 8220 gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 8280 agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 8340 cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 8400 ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 8460 cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt 8520 cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 8580 ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 8640 tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 8700 catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 8760 gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata 8820 gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 8880 tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 8940 catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 9000 aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 9060 attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 9120 aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 9180 aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 9240 ttcaagaatt ccgatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact 9300 agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta 9360 accattagaa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag 9420 gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtatg 9480 gctgattatg atctaaagcc agcaaaagtc ccatggtctt ataaaaatgc atagctttcg 9540 gaggggagca gagaacttga aagcatcttc ctgttagtct ttcttctcgt agaccttaaa 9600 ttcatacttg attccttttt cctcctggac ctcagagagg acgcctgggt attctgggag 9660 aagtttatat ttccccaaat caatttctgg gaaaaacgtg tcactttcaa attcctgcat 9720 gatccttgtc acaaagagtc tgaggtggcc tggttgattc atggcttcct ggtaaacaga 9780 actgcctccg actatccaaa ccatgtctac tttacttgcc aattccggtt gttcaataag 9840 tcttaaggca tcatccaaac ttttggcaag aaaatgagct cctcgtggtg gttctttgag 9900 ttctctactg agaactatat taattctgtc ctttaaaggt cgattcttct caggaatgga 9960 gaaccaggtt ttcctaccca taatcaccag attctgttta ccttccactg aagaggttgt 10020 ggtcattctt tggaagtact tgaactcgtt cctgagcgga ggccagggtc ggtctccgtt 10080 cttgccaatc cccatatttt gggacacggc gacgatgcag ttcaatggtc gaaccatgag 10140 ggcaccaagc tagctttttg caaaagccta ggcctccaaa aaagcctcct cactacttct 10200 ggaatagctc agaggccgag gcggcctcgg cctctgcata aataaaaaaa attagtcagc 10260 catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg gagttagggg cgggatgggc ggagttaggg 10320 gcgggactat ggttgctgac taattgagat gcatgctttg catacttctg cctgctgggg 10380 agcctgggga ctttccacac ctggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc 10440 tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac accctaactg acacacattc caca 10494 <210> 41 <211> 579 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain-IL2 <400> 41 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Thr Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Pro 435 440 445 Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu 450 455 460 Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro 465 470 475 480 Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala 485 490 495 Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu 500 505 510 Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 515 520 525 Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly 530 535 540 Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile 545 550 555 560 Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser 565 570 575 Thr Leu Thr <210> 42 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 42 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr 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Claims

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하기를 포함하는 재조합 항-EpCAM 항체:

(a) (i) 항체의 경쇄 CDR1 서열을 정의하는, 서열 번호 1 의 아미노산 잔기 24-31, (ii) 항체의 경쇄 CDR2 서열을 정의하는, 서열 번호 1 의 아미노산 잔기 49-55, 및 (iii) 항체의 경쇄 CDR3 서열을 정의하는, 서열 번호 1 의 아미노산 잔기 88-96 를 포함하고, (iv) 추가로 면역글로불린 경쇄 골격부를 정의하고 서열 번호 9 의 아미노산 잔기 1-23 로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및

(b) (i) 항체의 중쇄 CDR1 서열을 정의하는, 서열 번호 2 의 아미노산 잔기 26-35, (ii) 항체의 중쇄 CDR2 서열을 정의하는, 서열 번호 2 의 아미노산 잔기 50-62, 및 (iii) 항체의 중쇄 CDR3 서열을 정의하는, 서열 번호 2 의 아미노산 잔기 101-105 를 포함하고, 추가로 (i) 서열 번호 18 의 아미노산 잔기 1-25; 및 (ii) 서열번호 18 의 아미노산 잔기 67-98 로 이루어진 군으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 골격부를 정의하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
제 19 항에 있어서, 상기 경쇄가 서열 번호 9 의 아미노산 잔기 1-106 을 포함하는 재조합 항-EpCAM 항체.
제 19 항에 있어서, 상기 중쇄가 서열 번호 18 의 아미노산 잔기 1-116 을 포함하는 재조합 항-EpCAM 항체.
서열 번호 9 의 아미노산 잔기 1-106 으로 정의된 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄, 및 서열 번호 18 의 아미노산 잔기 1-116 으로 정의된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄를 포함하는 재조합 항-EpCAM 항체.
제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 발현 벡터.
제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 상기 항체에 융합된 시토카인을 포함하는 재조합 항-EpCAM 항체.
제 24 항에 있어서, 시토카인이 IL-2 인 재조합 항-EpCAM 항체-시토카인 융합 단백질.
제 25 항에 있어서, 서열 번호 41 의 중쇄 및 서열 번호 42 의 경쇄를 갖는 재조합 항-EpCAM 항체-시토카인 융합 단백질.
제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, EpCAM 과발현과 관련된 질환 치료용 약제.
제 24 항에 따른 항체-시토카인 융합 단백질을 포함하는, EpCAM 과발현과 관련된 질환 치료용 약제.